Multifaktorsko dedovanje Prof. dr. Damjan Glavač Oddelek za molekularno genetiko, Medicinska fakulteta Korytkova 2, 1000 Ljubljana E-pošta: damjan.glavac@mf.uni-lj.si Tel: 543 7184, Faks: 543 7181 Kompleksne bolezni : vpliv genov in okolja Redke Preprosta genetika Visoko tveganje gensko Pogoste Kompeksna genetika Manjše tveganje okoljsko Cistična fibroza Hemokromatoza Zvišan krvni tlak.. Vedenjske motnje Rak Nalezljive bolezni 1
Multifaktorialno dedovanje okolje gen 3 Dedni dejavniki gen 1 gen 2 okolje okolje Preko 60% populacije je lahko prizadete zaradi multifaktorialne bolezni v življenju Koronarna arterijska bolezen Genetski dejavniki: Polimorfizem lipoproteina Angiotensin I Polimorfizem v LDL receptorju Vpliv okolja: Fizična aktivnost Holesterol v hrani Kajenje Analiza genetske vezave Zdrav Zdrav Bolan Bolan Analiza genetske vezave je statistična naloga: To je verjetnost, da bomo opazili vezavo med genetskim označevalcem in boleznijo oz. - bolezenskim genom. To verjetnost merimo z LOD score. Vezava: v družini, ki jo poznamo gledamo, kaj se s kromosomom oz. segmenti kromosoma dogaja skozi generacije. Ker so nekateri člani družine oboleli smo posebej pozorni na tiste dele kromosoma, ki so obolelim članom družine skupni, saj je najbolj verjetno, da bo v tem predelu našli mesto bolezenskega gena. Problemi in omejitve: Potrebujemo več 100 bolnikov in svojcev, da bi lahko prišli v bližino bolezenskega gena; to pomeni v območje približno 1 milijon baznih parov ali 1cM. Potrebujemo vsaj 3000 genetskih označevalcev torej na vsak milijon baznih parov vsaj enega glede na velikost človeškega genoma. Potrebujemo informativne označevalce 2
x Kromosomske rekombinacije Nekaj generacij Več 100 generacij 3
10-150 kb Razlike med populacijami Kvantitativne Morfološke Fiziološke Biokemične Kvalitativne Krvne skupine Encimi DNA polimorfizmi 4
Hardy Weinberg ovo ravnotežje Hardy Weinbergov zakon pojasnjuje ugotovitev, da relativna razmerja različnih genotipov ostajajo nespremenjena iz generacije v generacijo. V sistemu dveh alelov A in a so namreč možni trije genotipi AA, Aa in aa. Če je frekvenca nekega alela v populaciji p in je frekvenca drugega alela enaka q, je verjetnost, da ima oseba genotip AA enaka p 2, verjetnost, da ima oseba genotip Aa 2pq in verjetnost, da ima oseba genotip aa q 2. Poznavanje razmerij različnih genotipov (p 2, 2pq in q 2) nam pomaga izračunati različne genotipe v populaciji, če poznamo frekvenco enega od homozigotov (navadno enega od redkejših npr. za recesivne bolezni) Matematično pri Hardy-Weinberg-ovem ravnotežju torej velja : p 2 + 2pq + q 2 = 1. Hardy Weinberg ovo ravnotežje V nekaterih področjih severne Afrike se kar 9 % populacije Afričanov rodi z obliko srpastocelične anemije (alel ss). Znano je, da mutacija na enem alelu gena, ki povzroča srpastocelično anemijo pomeni tudi heterozigotno prednost in odpornost na malarijo. Izračunaj kolikšen odstotek te populacje je odporen na malarijo? Če torej upoštevamo obe enačbi p+q =1 in p 2 + q 2 =1. Označimo 9% = 0,09 = ss = q 2. Iz tega sledi, da je q=kvadratni koren od 0,09 = 0,3 in če upoštevamo enačbo p+q=1 iz nje sledi, da je p = 1-q = 0,7. Ker iščemo heterozigote, potem velja: 2pq = 2x(0,7x0,3) = 0,42=42%. Torej imamo 42% heterozigotov in tolikšen % populacije je odporen na malarijo. 5
Razmerje skupnih alelov in sorodstveni odnos Sorodstveni odnos Enojajčni (MZ) dvojčki Dvojajčni (DZ) dvojčki Sorodniki 1. generacije Sorodniki 2. generacije Sorodniki 3. generacije Razmerje skupnih alelov 1 1/2 1/2 1/4 1/8 Genetska analiza kvalitativnih lastnosti Ali ima velikost otroka, kakršnokoli zvezo s tem kako velika sta mama in oče (starša)? Pozitivna korelacija - večji, ko so starši, večji so otroci? 0 ni korelacije, 1 popolno pozitivna korelacija -1 je negativna korelacija 6
Skladnost pojavnosti bolezni pri dvojčkih -konkordanca Če je nagnjenost k bolezni manj kot 100% pri enojajčnih dvojčkih je to dokaz, da igrajo močno vlogo pri razvoju bolezni okoljski dejavniki. Večja skladnost med enojajčnimi dvojčki in dvojajčnimi dvojčki je močan dokaz za genetsko povezanost z boleznijo Konkordanca in tveganje - primer shizofrenije Skupna DNA 100% 50% Sorodniki 1. generacije 25% 12.5% identical twins fraternal twins children siblings parents half siblings grandchildren nephews/nieces uncles/aunts 1st cousins general population 0% 10% 20% 30% 40% 50% 7
Konkordanca in diskordanca Konkordanca - skladnost, ujemanje enaki fenotipskih znaki pri dvojčkih v genetiki pomeni skladnost pojavljanja fenotipskih znakov. Izražena je od stopnje 0 do 1, oziroma od 0% do 100%. Za ocenitev vpliva genetskih dejavnikov pomagajo raziskave na eno in dvojajčnih dvojčkih. Enojajčni dvojčki imajo skoraj enak genetski zapis medtem, ko dvojajčni dvojčki izvirajo iz dveh zarodkov in delijo 50% genetskega zapisa. O konkordanci govorimo, če za določeno bolezen zbolita oba dvojčka. Če je razlika v pogostosti zbolevanja med dvojčki, je to diskordanca. Diskordanca - neujemanja navaja na delež, ki ga ima lahko vpliv okolja. Relativno tveganje za pojav bolezni Relativo tveganje (λ r ) merimo z opazovanjem, kako se bolezen pojavlja v pri sorodnikih osebe, ki mu določamo tveganje za bolezen (propozitčlan družine ali bolnik, zaradi katerega se opravlja genska analiza družine ) in kako v splošni populaciji Relativo tveganje (λ r ) je : λ r = pojavnost bolezni pri sorodnikih obolelega pojavnost bolezni v celotni populaciji λ r = 1 pomeni, da propozit nima nič večje tveganje za bolezen, kot katerakoli druga oseba izbrana naključno iz populacije 8
Skladnost pojavnosti bolezni pri dvojčkih - konkordanca Če je nagnjenost k bolezni manj kot 100% pri enojajčnih dvojčkih je to dokaz, da igrajo določeno vlogo pri razvoju bolezni tudi okoljski dejavniki. Večja skladnost med enojajčnimi dvojčki in dvojajčnimi dvojčki pa je na drugi strani precej močen dokaz za genetsko povezanost z boleznijo. Analiza standardne genetske vezave pri kompleksnih boleznih odpove Standardna vezava (parametrična metoda) se zanaša na predpostavko specifične oblike dedovanja in nato prešteje rekombinantne in nerekombinantne potomce v družinah zato, da določi, če obstaja dokaz za genetski označevalec, ki je vezan na bolezenski gen. Kompleksne bolezni niso povzročene s specifično mutacijo v enem genu, ki se deduje s specifično mendelskim vzorcem dedovanja predpostavljanje vzorca pri vezavi postane zato problematično. 9
Neparametrične metode Število lokusov ali vpliv okolja ne moremo določiti Zanašamo se na predpostavko, da bosta sorodnika imela skupne alele, ki povzročajo bolezen. Pregledujemo, kako pogosto je določen predel genoma podedovan od skupnega prednika znotraj rodovnika? Manj močna kot parametrične metode ( npr. klasična analiza genetske vezave) Manj občutljiva zelo veliko primerov je potrebnih, da je nakazana vezava Manj natančna lahko ugotovimo samo večje predela genoma za kandidatno vezavo. Asociacija in genetska vezava z asociacijo testiramo, če bolezen in določeni alel izkazujeta povezanost pojavnosti v populaciji z analizo genetske vezave testiramo, če bolezen in določeni alel izkazujeta povezanost prenosa znotraj družine Asociacija Genetska vezava 1,4 2,2 4,4 1,1 1,2 3,3 3,3 1,4 2,3 2,4 4,4 2,4 1,2 1,4 1,4 1,4 10
Metoda prizadetih bližnjih sorodnikov Predpostavi na osnovi verjetnosti, da si pri specifičnem DNK označevalcu bližnji sorodniki delijo: 0 alelov pri 25% primerov 1 alel pri 50% primerov 2 alela pri 25% primerov 1,2 1,2 1,2 2,4 1,4 0 skupnih alelov 1 skupni alel 2 skupna alela Neuravnotežena vezava (ang. linkage disequilibrium) homologi Mutacija, ki povzroča a bolezen Rekombinacija Polimorfni označevalci v regiji Osebe z boleznijo bodo imele enake alele pri označevalcih v tej regiji 11
Neuravnotežena vezava (ang. linkage disequilibrium) Homologi Po preteku večih generacij Mutacija, ki povzroča a bolezen Rekombina ombinacija Polimorfni označevalci v regiji Osebe z boleznijo bodo imele enake alele pri označevalcih v tej regiji Asociacijske študije asociacija je skupno pojavljanje dveh dednih lastnosti ali značilnosti z večjo pogostnostjo, kot bi bilo pričakovati na podlagi verjetnosti (npr. krvna skupina 0 in peptični ulkus itd ) Asociacija znotraj populacije ( ne kartiranje genskega lokusa znotraj družin ) Iščemo specifični alel, ki je običajno najden v večjem odstotku med bolnimi Zelo pomembna je izbira kontrolnih skupin Če gre dejansko za asociacijo, se bo običajno pojavila z enim specifičnim alelom za celotno preučevano populacijo 12
Študije primeri bolezni/ kontrole Primeri (bolniki z boleznijo) so primerjani s kontrolami (osebe brez bolezni, ki se ujemajo v letih, etnični pripadnosti in okoljskih faktorjih pogosto partnerji bolnikov Z nepovezanimi boleznimi in se ujemajo v letih, dejavnostih in etnični pripadnosti) Problem pri kontrolnih študijah: 1. Potrjevanje nagnjenosti-je odraz razlike v verjetnosti, da bo bolan sorodnik zaznan v primerjavi z bolanimi sorodniki v kontroli 2. Izbira kontrole Primer asociacijske študije Celotna populacija bolan zdrav 13
Vezava z boleznijo 1,4 2,4 2,4 1,4 1,2 2,2 2,3 1,2 2,3 1,4 4,4 2,2 Genotipizacija obeh skupin za označevalce v genomu Npr. označevalec W 2,4 2,3 1,4 2,2 2,4 4,4 4,4 2,4 1,4 2,2 2,4 4,4 1 2 3 4 1 2 3 4 Ni vezave 1 2 3 4 Asociacijska študija - označevalci 3,3 2,4 1,2 2,3 3,3 4 1 3 2,3 3,3 2,2 2 Določimo genotipe npr. označevalec Q 1 2 3 4 2,4 2,2 1,4 1,2 2,4 4,4 1,4 Among the affecteds,, see more of allele 3 4 vezava 3 1 2 2,4 1,4 1,2 2,4 14
Asociacija in frekvenca alela v populaciji General Population Bolna populacija Allele 1 Allele 2 Allele 3 Allele 4 Kakšna je asociacija bolezni z alelom 1? Asociacija in frekvenca alela v populaciji Splošno (vse rase) populacije Prizadete populacije Alel 1 Alel 2 Alel 3 Alel 4 Povezava z alelom 1, temelji na stratifikaciji populacije Izgleda kot, da je alel 1 povezan z boleznijo vendar je samo bolj pogost pri populaciji belcev, ki imajo zato tudi pogosteje to bolezen 15
Asociacijske študije Pri študiju bolnikov s trombozo smo imeli 120 bolnikov s trombozo in 120 kontrol. Našli smo variacijo v enem nukleotidu protrombinskega gena (SNP) pri 23 bolnikih in 4 kontrolah (97 bolnikov in 116 kontrol pa ni imelo te variacije. Kolikšna je verjetnost, za osebo s to variacijo, da bo razvila trombozo? Relativno tveganje = [(23)(116)]/[(4)(97)] = ~ 7 tveganje, da oseba z variacijo v protrombinskem genu razvije trombozo je približno 7 krat večje Študij obolelih bližnjih sorodnikov Če je označevalec vezan z genom za bolezen ali z genom za razvoj kvantitativne lastnosti, potem bosta imela bolna sorodnika bolezenski alel in bosta oba imela označevalske alele pogosteje kot pričakovano. 1,2 2,3 2,3 2,2 2,4 1,2 2,4 2,4 2,4 # aleli 0 1 2 Skupno opaženo 0.60.40 pričakovano.25.50.25 16
Primeri Kandidatni predeli genoma za IBD Dedni dejavniki; UC (λ=8-15) CD (λ=20-30) 16 predelov genoma, 7 genov 17
Kandidatni geni za IBD Chr gene function reference disease 16q NOD2/CARD15 muramyl-dipeptide (peptidoglycan) recognition protein Hugot et al., Nat Genet, 2001, Ogura et al., Nat Genet, 2001, CD 10q23 DLG5 maintainance of epithelial integrity Stoll et al., Nat Genet, 2004 UC and CD 9q32-q33 TLR4 lipopolysaccharide binding protein gene Torok et al., Clin Immunol,2004 UC and CD 19p13.3- p13.2 ICAM-1 adhesion-ligand for lymphocyte function-associated (LFA) antigens Jewel et al.,inflamm Bowel Dis, 2004 UC and CD 5q31 OCTN/SLC22A4 &SLC22A5 cation transporter Peltekova et al., Nat Genet, 2004 CD SLC22A 4 HLA/LTalfa MDR 1 TLR4 DLG5 NOD2 ICAM-1 Zakaj je MDR1 dober kandidatni gen za IBD knock-out miš razvije pod določenimi pogoji stanje, ki je zelo podobno IBD (Panwala, 1998) ugotovljeno zmajšano izražanje MDR1 v primeru biopsij kolona IBD bolnikov SNP v eksonu 26 (C3434T) povezan z izražanjem MDR1 pri drugih boleznih funkcijski SNP-ji v MDR1 genu povezani z infiltracijo limfocitov pri CRC (Potocnik et al., 2001) 7q je kandidatno področje genoma za IBD 18