Uravnavanje encimske aktivnosti Uvod Mehanizmi encimske katalize Inhibicija encimov Modulacija aktivnosti alosteričnih encimov Uravnavanje encimske aktivnosti: - uravnavanje koncentracije encimov - spreminjanje encimskega okolja - aktivacija encimov s proteolitičnim razcepom (prebava, strjevanje krvi) - alosterična modulacija encimske aktivnosti - kovalentna modifikacija encima spremenjena encimska aktivnost - sinteza specifičnih proteinskih encimskih inhibitorjev
Mehanizmi encimske katalize Kompleks ES stabilizirajo šibke interakcije Sledi razcep ES in nastanek vezi po različnih mehanizmih, ki vključujejo prehodni nastanek kovalentnih vezi MEHANIZMI - približanje in orientacija (praktično vedno!) - splošna in specifična kislinsko-bazna kataliza - kovalentna kataliza - kataliza s kovinskimi ioni
POSPEŠITEV REAKCIJE LE ZARADI PRIBLIŽANJA IN ORIENTACIJE
Mehanizem encimskih reakcij: Specifična/splošna kislinsko-bazna kataliza primer: razcep amida encim Specifična!!! Splošna!!! Encim: -OH, B in AH!
Kislinsko-bazna kataliza: Specifična - proton donor in proton akceptor je molekula H 2 O Splošna - proton donor in proton akceptor je druga molekula (šibke organske kisline in šibke baze) Večina encimskih reakcij poteka po mehanizmu splošne kislinsko-bazne katalize Aktivna mesta encimov vsebujejo aminokislinske ostanke, ki so šibke kisline in šibke baze Povečanje hitrosti reakcije za 100 100.000 krat
Aminokislinski ostanki, ki lahko sodelujejo v splošni kislinskobazni katalizi
pk vrednosti ak, ki sodelujejo v splošni kislinsko bazni katalizi (pozor: vrednost pk R se lahko zelo spremeni, ko je AK vpeta v polipeptidno verigo ZARADI BLIŽINE DRUGIH SKUPIN INDUKTIVNI EFEKT) aminokislina pk 1 pk 2 pk R! His 1,82 9,17 6,00 Asp 1,88 9,60 3,65 Glu 2,19 9,67 4,25 Lys 2,18 8,95 10,53 Cys 1,96 10,28 8,18 Tyr 2,20 9,11 10,07 pk 1 in pk 2 sta pomembna le kadar je AK na N ali C koncu!
Kovalentna kataliza Med encimom in substratom nastane prehodna kovalentna vez Primer: hidroliza vezi med A in B Katalizator: encim z nukliofilno skupino X: se prehodno kovalentno veže na substrat Reakcija je hitrejša, če ta pot poteka preko nižje energijske bariere kot nekatalizirana reakcija
Primer kovalentne in kislinsko-bazne katalize: razcep peptidne vezi 1. stopnja: kovalentna kataliza 2. stopnja: kislinsko-bazna kataliza H 2 O H + R 2 NH 2 R 1 COOH
katalitična kaskada pri tripsinu (analogno je pri kimotripsinu) -OH skupina Ser postane veliko reaktivnejša zaradi bližine in orientacije His in Asp (induktivni efekt!)
Kataliza s kovinskimi ioni Kovinski ioni so ali trdno vezani na encim ali prihajajo iz okolja Ionske in/ali koordinativne vezi med ionom in substratom orientirajo substrat v položaj za reakcijo in stabilizirajo prehodno stanje Lahko pride do izmenjave elektronov med kovinskim ionom in substratom (oksidoredukcijska reakcija) Približno ena tretjina encimov potrebuje kovinski ion za svojo aktivnost Primer: metaloproteinaze
Modulatorji encimske aktivnosti Aktivatorji encimska aktivnost Inhibitorji ecimska aktivnost - reverzibilna inhibicija - kompetitivna - akompetitivna - mešana (npr. nekompetitivna) - ireverzibilna inhibicija
Encimska inhibicija - uporaba Inhibitorji encimov pomembne farmacevtske učinkovine (npr. aspirin inhibira sintezo prostaglandinov) Uporaba inhibitorjev pri študiju mehanizma encimskih reakcij Uporaba inhibitorjev pri študiju metaboličnih poti E 1 E 2 E 3 A B? C D Inhibitor encima E 2, kopičenje vmesnega produkta B, Sklepamo lahko, da poteka zaporedje reakcij preko B in E 2
Kompetitivna inhibicija Reverzibilna inhibicija Inhibitor se veže s šibkimi interakcijami na encim! Akompetitivna inhibicija Mešana (nekompetitivna) inhibicija
Kompetitivna inhibicija S in I sta si podobna in se vežeta na isto mesto, a nikoli sočasno!
Kompetitivna inhibicija brez inhibitorja z inhibitorjem V max se ne spremeni K m se poveča (zmanjša se afiniteta za S)
Kompetitivna inhibicija (spremenjena K m ) dvojni recipročni diagram -1/αK m
Akompetitivna inhibicija (spremenjena K m in V max ) dvojni recipročni diagram
Mešana inhibicija (spremenjena K m in V max ) dvojni recipročni diagram K i = X K i a = X a
Poseben primer mešane kompeticije: nekompetitivna inhibicija (spremenjena V max, K m pa ne!) dvojni recipročni diagram K i = K i V max Vmax se zmanjša V i max Bakrov ion (uporablja se CuSO 4 ) je nekompetitivni inhibitor katalaze. K m = K i m K m se ne spremeni
DIAGNOSTIČNI DIAGRAMI ZA RAZLIČNE VRSTE INHIBICIJE Kompetitivna inhibicija Nekompetitivna inhibicija Akompetitivna inhibicija Mešana inhibicija
Ireverzibilna inhibicija inhibitor se ireverzibilno veže v aktivnem mestu encima; vez je kovalentna Primer: reakcija kimotripsina ali acetilholin-esteraze (v aktivnem mestu je Ser) z diizopropilfluorofosfatom (DIFP) serin, Ser ENCIM JE TRAJNO OKVARJEN!
Spojine, kot so nekateri pesticidi... se ireverzibilno vežejo na encim acetilholin-esterazo (AChE), ki hidrolizira nevrotransmitor acetilholin pesticid živčni bojni strup Živčni bojni strupi in večina pesticidov so ireverzibilni inhibitorji AChE! acetiholin + voda ocetna kislina + holin, encim = AChE (serinska hidrolaza)
Inhibitorji so lahko strupi kako postopati ob zastrupitvah? Pri reverzibilnih inhibitorjih uvesti substrat v visoki koncentraciji Pri ireverzibilnih inhibitorjih uvesti sredstvo, ki veže inhibitor z večjo afiniteto kot encim
Uravnavanje encimske aktivnosti Glede na potrebe celice se encimska aktivnost poveča ali zmanjša uravnavanje encimske aktivnosti Uravnavanje poteka na več ravneh in na več načinov: - uravnavanje koncentracije encimov - aktivacija encimov s proteolitičnim razcepom (prebava, strjevanje krvi, delovanje hormonov...) - kovalentna modifikacija encima spremenjena encimska aktivnost - alosterična modulacija encimske aktivnosti - sinteza specifičnih proteinskih encimskih inhibitorjev
Koncentracija encima vpliva na hitrost reakcije v 0 E v 0 E i koncentracija encima [E] Glede na potrebe celice se sintetizira več encima več substrata se pretvori v produkt v določenem času - višja encimska aktivnost Konstitutivni in inducibilni encimi!
Aktiviranje encima s proteolitičnim razcepom: z neaktivnega encima (zimogen/proencim/-ogen) se odcepi določen peptidni del aktivni encim Primer: aktiviranje prebavnih proteolitičnih encimov tripsina in kimotripsina
Uravnavana aktivacija in izločanje zimogenov Stryer
Kaskada v procesu strjevanja krvi Kaskada zaradi pomnoževanja učinka močno poveča učinkovitost procesa! Hemofilija: mutiran faktor VIII (hemofilija A, 80%) ali mutiran faktor IX (hemofilija B, 20%). Večina faktorjev strjevanja je serinskih proteinaz. Končno faktorja X in V cepita protrombin v aktivno proteinazo trombin, ta pa odcepi dele fibrinogena, da nastane fibrin, ki polimerizira. Stryer
Hemofilija - napaka v procesu strjevanja krvi fibrinogen fibrin V a trombinogen trombin
Hemofilija med monarhi Evrope http://biology.clc.uc.edu/courses/bio105/sex-link.htm
Alosterična modulacija encimske aktivnosti Alosterični encimi več podenot (katalitska, regulatorna) Aktivnost uravnavajo alosterični modulatorji (majhne molekule) Modulatorji se vežejo (šibke interakcije) na regulatorno podenoto sprememba konformacije regulatorne podenote spremamba konformacije katalitske podenote sprememba na aktivnem mestu spremenjena encimska aktivnost Modulatorji so aktivatorji ali inhibitorji Modulatorji: substrat (homotropična modulacija) ali druge molekule (heterotropična modulacija). Za regulacijo je bistvena heterotropična modulacija. homotropična modulacija heterotropična modulacija
Dve vrsti modulatorjev alosteričnih encimov heterotropična alosterija! K 0,5 + K 0,5 K 0,5 - modulatorji vplivajo na K m S modulatorji vplivajo na V max S M M
Regulatorni encim shematski prikaz aktivacije encima z vezavo aktivatorja M na regulatorno podenoto katalitska podenota regulatorna podenota
Aspartat transkarbamoilaza (ATCaza) je alosterični encim -Sodeluje v zgodnjih stopnjah sinteze pirimidinskih nukleotidov -Ima 12 polipeptidnih enot, tako regulatorne (rdeča in rumena), kot katalitične (modra in vijolična) - Alosterični modulatorji se vežejo na regulatorne podenote
Dve konformaciji ATCaze Vezava CTP na regulatorne enote stabilizira manj aktivno stanje T Stryer, Biochemistry
Alosterični regulatorji ATCaze uravnavajo ravnotežje za prehod iz T v R obliko ATP je pozitivni alosterični efektor (velikokrat!). Inhibicija s povratno zvezo! CTP stabilizira T (manj aktivno) stanje
INHIBICIJA S POVRATNO ZVEZO (FEED-BACK INHIBITION) Sinteza Ile iz Thr poteka v 5 stopnjah, ki jih katalizira 5 encimov (E 1 -E 5 ) L-izolevcin (Ile) je negativni alosterični modulator E 1 ( treonin-dehidrataze, TDH). (Ile) K i K i za vezavo Ile na alosterično (modulatorsko) mesto TDH določa koncentracijo Ile. [ TDH].[ Ile] ; [ TDH Ile] K i [ TDH] [ Ile] [ TDH Ile]
Shema pozitivne alosterične modulacije encimske aktivnosti: substrat A aktivira encim, ki pretvarja B C ali E F substrat lahko izbere pot ( A D ali A F)
Izoencimi so značilni način uravnavanja v različnih tkivih in razvojnih stanjih Stryer: -Izencimi (izocimi) so encimi, ki se razlikujejo v aminokislinskem zaporedju, a katalizirajo isto reakcijo -Imajo drugačne kinetične parametre in odgovarjajo na različne signale (modulatorje). -Primer: laktatna dehidrogenaza izoencimi se razlikujejo v vrstah in sestavi podenot dnevi pred (-) in po rojstvu (+) H 4 H 3 M H 2 M 2 HM 3 M 4 H 4 je izražen v srcu, deluje v aerobnih pogojih, predvarja laktat v piruvat ( hrana za srce), piruvat je alosterični negativni modulator; M 4 je izražen v mišici in jetrih, v anaerobnih pogojih pretvarja piruvat v laktat (glikoliza), piruvat ni modulator. H in M imata 75% aminokislin enakih (75% identičnost).
Kovalentna modifikacija encima spremenjena encimska aktivnost Vrste kovalentne modifikacije encimov fosforilacija ADP-ribozilacija adenilacija uridilacija metilacija
Primer uravnavanja encimske aktivnosti s kovalentno modifikacijo (fosforilacijo) Adrenalin β-adrenergični receptor camp aktivirana metabolična pot: koncentracija glukoze adrenalin (epinefrin) Encimi, ki fosforilirajo proteine so kinaze kinaze fosforilacija proteinov kofein inhibira fosfodiesterazo fosfodiesteraza Razgradnja camp inaktivacija razgradnja glikogena glukoza
Primer uravnavanja encimske aktivnosti s fosforilacijo encima: razgradnja glikogena E = glikogenska fosforilaza E kinaza camp kinaze fosforilacija proteinov (glikogen fosforilaze) razgradnja glikogena z glikogen fosforilazo glukoza Aktivnost glikogenske fosforilaze je uravnavana s fosforiliranjem / defosforiliranjem encima
Aktivacija glikogen fosforilaze s fosforiliranjem fosforilaza-fosfataza deaktivira glikogen fosforilazo fosforilaza-kinazo aktivira zunanji signal (camp)
Uravnavanje razgradnje glikogena (kadar potrebujemo glukozo) Takšno uravnavanje je pogosto preko encimske kaskade, kar poveča učinkovitost (pomnoževanje učinka)!
Glikogen fosforilaza v mišici je uravnavana preko številnih mehanizmov
Proteinske kinaze sestavljajo družino proteinov Prepoznavna sekvenca na substratu
Nekateri encimi uporabljajo več različnih regulatornih mehanizmov Glikogen sintaza je lahko fosforilirana na najmanj 9 mestih in to z različnimi kinazami. Fosforilacija INAKTIVIRA glikogen sintazo.
Kinaze običajno delujejo v kaskadah, kar poveča njihovo učinkovitost, ker se signal pomnožuje. Včasih jih v kaskade pomaga organizirati ogrodni protein, ki jih drži skupaj. ogrodni protein pomnoževanje signala P Kinase 1 Kinase 2 Kinase 3 P P Phosphorylation Fosforilacijska kaskada Cascade
Uravnavanje encimske aktivnosti s sintezo specifičnih inhibitorjev Značilno za proteinaze, ki morajo biti strogo uravnavane, drugače razpad celic. Znani naravni inhibitorji proteinaz - proteini trdno in specifično vezani na izbrani encim preprečijo njegovo delovanje. Inhibicija je uravnavana na genski ravni z regulacijo sinteze inhibitorjev v celici. PRIMER 1: α 1 -antitripsin v pljučih. Tobačni dim oksidira ključni Met v tem proteinu, ki zato ne deluje - ne inhibira tripsina. Prevelika aktivnost tripsina v pljučih uničuje pljučno tkivo. Posledica: kronični bronhitis in emfizem pri kadilcih. PRIMER 2: pankreatični antitripsin PRIMER 3: Stefin (odkrit na IJS), inhibira katepsine
Regulatorni encimi- povzetek -Regulatorni encimi uravnavajo aktivnosti metaboličnih poti. -Če gre za uravnavanje s povratno zanko (feed back mehanizem), končni produkt reakcije inhibira prvo encimsko stopnjo. -Aktivnosti alosteričnih encimov so naravnavane z reverzibilno vezavo specifičnega modulatorja na regulatorno mesto. -Modulator je lahko substrat ali drug metabolit (največkrat!). -Kinetične zakonitosti alosteričnih encimov ponazarjajo kooperativne interakcije med podenotami encima. -Nekateri regulatorni encimi spreminjajo svojo aktivnost s kovalentno modifikacijo, pri čemer je najpogostejša fosforilacija določenih aminokislinskih ostankov. -Mnogi proteolitski encimi se sintetizirajo kot prekurzorji(cimogeni), ki se kasneje aktivirajo s proteolitsko cepitvijo. -Najpomembnejši encimi so uravnavani preko več regulatornih mehanizmov u različnimi efektorji, kar omogoča koordinacijo aktivnosti različnih med seboj povezanih signalnih poti.