UNIVERZA V LJUBLJANI FAKULTETA ZA FARMACIJO KATARINA BRATINA

Transcript

1 UNIVERZA V LJUBLJANI FAKULTETA ZA FARMACIJO KATARINA BRATINA PRIMERJAVA DOLOČANJA ENCIMOV ASPARTAT TRANSFERAZE (AST) IN ALANIN TRANSFERAZE (ALT) PRI HEPATITISU IN ALKOHOLNI JETRNI CIROZI COMPARISON OF DETERMINING THE ENZYME ASPARTATE- AMINOTRANSFERASE AND ALANINE-AMINOTRANSFERASE IN HEPATITIS AND ALCOHOLIC LIVER CHIRROSIS DIPLOMSKA NALOGA VISOKOŠOLSKI STROKOVNI ŠTUDIJ LABORATORIJSKE BIOMEDICINE Ljubljana, 2010

2 Zahvala Iskreno se zahvaljujem prof. dr. Jošku Osredkarju, mag. farm. za mentorstvo. Hvala za koristne napotke in pomoč pri nastajanju diplomske naloge. Zahvaljujem se tudi dr. Mariji Sollner Dolenc in doc. dr. Iztoku Grabnarju, mag. farm. za pregled diplomske naloge. Zahvaljujem se vsem svojim najbližjim za podporo in finančno pomoč pri študiju pa tudi prijateljem, ki so kakorkoli pripomogli k nastanku moje diplomske naloge.

3 Diplomsko nalogo sem opravljala pod vodstvom prof. dr. Joška Osredkarja, mag. farm., spec. med. biokem., na Kliničnem inštitutu za klinično kemijo in biokemijo, v Univerzitetnem kliničnem centru v Ljubljani. Meritve so bile opravljene v Encimskem laboratoriju v Univerzitetnem kliničnem centru v Ljubljani. Izjava Izjavljam, da sem diplomsko nalogo samostojno izdelala pod mentorstvom prof. dr. Joška Osredkarja, mag. farm., višjega svetnika. Ljubljana, oktober 2010 Predsednica diplomske komisije: dr. Marija Sollner Dolenc. Član diplomske komisije: dr.iztok Grabnar, mag farm.

4 POVZETEK V diplomski nalogi smo primerjali določitev encimov aspartat aminotransferaze (AST) in alanin aminotransferaze (ALT) pri hepatitisu in alkoholni jetrni cirozi. Zanimalo nas je, ali obstajajo razlike v razmerju AST/ALT encimov pri hepatitisu in alkoholni jetrni cirozi ter med spoloma pri cirozi jeter. Izhodišče za izračun razmerja so nam predstavljale vrednosti encimov pridobljene s kinetično metodo. S tem izračunom smo skušali prispevati k večji specifičnosti pri interpretaciji rezultatov. Statistično smo ugotovili, da o domnevni razliki v razmerju AST/ALT encimov med spoloma ne moremo trditi ničesar, saj so te razlike med njima zgolj naključne. Pri alkoholni jetrni cirozi je aritmetična sredina razmerja AST/ALT enaka 2,12. S tem smo potrdili domnevno trditev AST/ALT>1. Vrednosti za hepatitis odstopajo od pričakovanih (AST/ALT<1). Aritmetična sredina razmerja AST/ALT znaša 1,91. Do odstopanj je prišlo zaradi razmeroma majhne populacije preiskovancev. T-test je pokazal, da so razlike med razmerjem AST/ALT pri alkoholni cirozi in hepatitisu zgolj slučajne, tako da o razlikah med njima ne moremo trditi ničesar. Povzamemo lahko, da je določanje razmerja AST/ALT nezadosten pokazatelj alkoholne jetrne ciroze ter hepatitisa in da na podlagi naših ugotovitev ne moremo sklepati na značilnost populacije. Ključne besede: Aspartat aminotransferaza, alanin aminotransferaza, alkoholna jetrna ciroza, hepatitis. I

5 ABSTRACT In this thesis, we have compared the determination of enzyme aspartate aminotransferase (AST) and alanine aminotransferase (ALT) in hepatitis and alcoholic liver cirrhosis. We investigated whether there are differences in the ratio of AST / ALT enzymes in hepatitis and alcoholic liver cirrhosis and between the sexes in liver cirrhosis. AST/ALT ratio was calculated from enzyme values obtained by kinetic method. With this method we seek to contribute to greater specificity in the interpretation of results. Statistically, we found that alleged differences in AST/ALT ratio between genders cannot be confirmed nor denied. In alcoholic liver cirrhosis, the average ratio of AST / ALT is 2,12. With this, we have confirmed the alleged claim of AST / ALT > 1. Values for hepatitis are deviating from the expected (AST / ALT <1). The average ratio of AST / ALT amounted to 1,91. This deviation is a consequence of a relatively small population of subjects. T-test showed that differences between the average ratio of AST / ALT in alcoholic cirrhosis and hepatitis are random, meaning that we cannot claim anything about them. It can be concluded that the determination of the ratio of AST / ALT is inadequate indicator of alcoholic liver cirrhosis and hepatitis and that on the basis of our findings, we cannot infer on the characteristics of the population. Key words: Aspartate aminotransferase, alanine aminotransferase, alcoholic liver cirrhosis, hepatitis II

6 SEZNAM OKRAJŠAV AF alkaline phosphatase: alkalna fosfataza AK aminokislina ALT alanine aminotransferase: alanin aminotransferaza AST aspartate aminotransferase: aspartat aminotransferaza ATP adenosine 5'-triphosphate: adenozin-5'-trifosfat ATP7b ATPase, Cu++ transporting, beta polypeptide: protein Wilsonove bolezni CHC Intrahepatic cholangiocarcinoma: Intrahepatični holangiocelularni rak CPU centralno procesna enota CT computed tomography: računalniška tomografija DNK deoksiribonukleinska kislina E encim EDTA antikoagulant, kelator dvovalentnih kovinskih ionov EP kompleks encim-produkt ES kompleks encim-substrat Fe železo HAV hepatitis A HBs-antigen plaščni antigen virusa hepatitisa B HBV hepatitis B HCC hepatocellular carcinoma: hepatocelularni rak HCV hepatitis C HDL high-density lipoproteins: lipoproteini visoke gostote HDV hepatitis D HEV hepatitis E HGV hepatitis G IDL intermediate-density lipoproteins: lipoproteini srednje gostote IFCC international Federation of Clin. Chemistry: mednarodno združenje za klinično kemijo in laboratorijsko medicino INR international normalized ratio: mednarodno urejeno razmerje ISE Ilmenauer Systemeinrichtungen: fotometrični merilni sistem LDL low-density lipoprotein: lipoproteini nizke gostote MDH malat dehidrogenaza MR magnetic resonance: magnetna resonanca III

7 N 1,2 NAD + NADH non-a non-g P PCR število meritev nikotinamidadenindinukleotid reduktiran nikotinamidadenindinukleotid neznani virusi ki povzročajo hepatits produkt polymerase chain reaction: verižna reakcija s polimerazo R1 reagent 1 R2 reagent 2 RNK ribonukleinska kislina S substrat SD standardni odklon TIBC povprečno sipanje dveh vzorcev total iron blooding capacity: celotna sposobnost vezave Fe TRIS HMAM človeško protitelo proti mišjemu reagentu VLDL very-low-density lipoprotein: lipoproteini zelo nizke gostote γgt gamaglutamilna transpeptidaza povprečno razmerje AST/ALT IV

8 VSEBINSKO KAZALO 1 UVOD JETRA ANATOMIJA JETER HISTOLOGIJA JETER FUNKCIJA JETER BOLEZNI JETER Virusni hepatitis Hepatitis B Hepatitis C Alkoholna ciroza jeter DIAGNOSTIKA JETRNIH OBOLENJ ENCIMI ZGRADBA IN FUNKCIJA ENCIMOV MEHANIZEM DELOVANJA DELITEV ENCIMOV Aminotransferaze (AST, ALT) AST ALT RAZMERJE JETRNIH ENCIMOV NAMEN DELA MATERIALI IN METODE VZOREC REAGENTI REAGENTI ZA DOLOČANJE AST REAGENTI ZA DOLOČANJE ALT METODA KINETIČNA METODA Namen Princip Natančnost Analitična občutljivost Analitična specifičnost STATISTIČNA ANALIZA Deskriptivna statistika V

9 T-test EKSPERIMENTALNI DEL POSTOPEK DELA REZULTATI IN RAZPRAVA REZULTATI MERITEV DOLOČANJA KATALITIČNE KONCENTRACIJE AST, ALT ENCIMOV PRI ALKOHOLNI JETRNI CIROZI REZULTATI MERITEV DOLOČANJA KATALITIČNE KONCENTRACIJE AST, ALT ENCIMOV PRI HEPATITISU SKLEP LITERATURA PRILOGA VI

10 KAZALO SLIK Slika 1: Grafični prikaz energije v odvisnosti od reakcijske koordinate Slika 2: Shematični prikaz delovanja aminotransferaz Slika 3: Analizator Roche/Hitachi Slika 4: Grafični prikaz primerjave aritmetičnih sredin aktivnosti encimov AST in ALT ter razmerja AST/ALT za moške in ženske pri alkoholni cirozi jeter Slika 5: Grafični prikaz odstotka primerov nad zgornjo mejo za AST in ALT encime pri alkoholni cirozi jeter za moške in ženske Slika 6: Grafični prikaz presežka zgornje meje za AST in ALT encime pri alkoholni cirozi jeter za moške in ženske Slika 7: Grafični prikaz primerjave skupnih (moški in ženske) aritmetičnih sredin aktivnosti encimov AST in ALT ter razmerja AST/ALT pri alkoholni cirozi jeter Slika 8: Grafični prikaz odstotka primerov nad zgornjo mejo za AST in ALT encime pri alkoholni cirozi jeter za moške in ženske skupaj Slika 9: Grafični prikaz presežka zgornjih mej za AST in ALT encime pri alkoholni cirozi jeter za moške in ženske skupaj Slika 10: Grafični prikaz primerjave aritmetičnih sredin aktivnosti encimov AST in ALT ter razmerja AST/ALT pri hepatitisu B,C Slika 11: Grafični prikaz odstotka primerov nad zgornjo mejo za AST in ALT encime pri hepatitisu B,C Slika 12: Grafični prikaz presežka zgornjih mej za AST in ALT encime pri hepatitisu B,C.. 42 Slika 13: Grafični prikaz primerjave aritmetičnih sredin aktivnosti encimov AST in ALT ter razmerja AST/ALT med alkoholno jetrno cirozo in hepatitisom Slika 14: Grafični prikaz odstotka primerov nad zgornjo mejo za AST in ALT encime pri alkoholni jetrni cirozi in hepatitisu Slika 15: Grafični prikaz presežka zgornjih mej za AST in ALT encime pri alkoholni jetrni cirozi in hepatitisu KAZALO ENAČB Enačba 1: Enačba za izračun standardnega odklona Enačba 2: Enačba za izračun aritmetične sredine Enačba 3: Enačba za izračun povprečnega sipanja dveh vzorcev Enačba 4: Enačba za izračun spremenljivke t Enačba 5: Enačba za izračun stopnje prostosti VII

11 KAZALO PREGLEDNIC Preglednica 1: Osnovne značilnosti virusnih hepatitisov... 7 Preglednica 2: Standardna klasifikacija encimov Preglednica 3: Serumske koncentracije AST, ALT encimov pri alkoholni cirozi za moške Preglednica 4: Serumske koncentracije AST, ALT encimov pri alkoholni cirozi za ženske.. 35 Preglednica 5: Serumske koncentracije AST, ALT encimov pri alkoholni cirozi za moške in ženske Preglednica 6: Serumske koncentracije AST, ALT encimov pri hepatitisu B in hepatitisu C 41 Preglednica 7: Rezultati meritev določanja katalitične koncentracije AST, ALT v serumu pri alkoholni cirozi jeter za moške Preglednica 8: Rezultati meritev določanja katalitične koncentracije AST, ALT v serumu pri alkoholni cirozi jeter za ženske Preglednica 9: Rezultati meritev določanja katalitične koncentracije AST, ALT v serumu pri hepatitisu B, C VIII

12 1 UVOD 1.1 JETRA ANATOMIJA JETER Jetra (hepar) so največja žleza v človeškem telesu. Pri odraslem človeku tehtajo od 1500 g do 2000 g, pri dojenčku pa so razmeroma večje. So mehak, temno rdeč organ, ki ima obliko tristrane piramide z zaobljenimi robovi, razen spodnjega roba, ki je oster [1]. Ležijo v desnem zgornjem kvadrantu trebušne votline, natančneje tik pod prepono, na desni strani zgornjega abdomna, desno od želodca. V njihovi bližini je žolčnik, kjer se skladišči žolč. Zgornja ploskev jeter je konveksna in se prilagaja preponi, spodnja pa konkavna in se dotika drugih organov [2]. Srpasta jetrna vez (ligamantum falciforme) deli jetra na večji desni jetrni reženj (lobus hepatis dexter) in manjši levi reženj (lobus hepatis sinister), ob enem pa pritrja jetra na sprednjo trebušno steno [1]. Jetra imajo dvojno oskrbo s krvjo. Oskrbujeta jih dve glavni krvni žili, portalna vena in hepatična arterija. Portalna vena (portae hepatis), zbira kri iz želodca, vranice, tankega in debelega črevesa ter trebušne slinavke. S portalno vensko krvjo v jetra pritekajo ogljikovi hidrati, peptidi in aminokisline, hormoni, nekatere maščobe in druge snovi. Jetra s krvjo iz portalne vene dobijo 75 % kisika. Hepatična arterija (proper hepatic artery) se odcepi iz celiakalnega debla in dovaja v jetra arterijsko kri, bogato s kisikom. Preskrbi preostalih 25 % kisika [3]. Tako portalna vena kot tudi hepatična arterija vstopata v jetra skozi jetrno lino (porta hepatis) in se v jetrih mešata. Venska kri odteka iz jeter po jetrnih venah (v. hepaticae), ki se vlivajo v spodnjo votlo veno [1]. Iz jeter odteka tudi žolč, po žolčnih kapilarah nato po večjih kanalih, ki se združujejo v jetrni vod. Iz desnega jetrnega režnja izhaja desni jetrni vod (dutcus hepaticus dexter), iz levega režnja pa levi jetrni vod (dutcus hepaticus sinister). Po izstopu iz jetrne line se združita v skupni jetrni vod (dutcus hepeticum communis). Ko se skupnemu jetrnemu vodu pridruži še žolčnikovo izvodilo (dutcus cysticus) nastane žolčevod (dutcus choledochus) [4]. 1

13 1.1.2 HISTOLOGIJA JETER Jetrni parenhim v 90 % tvorijo jetrne celice hepatociti. Te imajo poliploidna jedra, včasih tudi dve na celico. Citoplazmo imajo bogato z mitohondriji, endoplazmatskim retikulumom, lizosomi, peroksisomi in glikogenskimi zrnci. Združujejo se v radialno urejene plošče, ki med seboj anastomozirajo. V središču je centralna vena. Med ploščami so jetrni sinusoidi, katerih stena je iz nesklenjenih endoteljskih celic s porami in Kupfferjevih celic, ki fagocitirajo bakterije in endotoksine. Med omenjenimi celicami in hepatociti se nahaja Dissejev prostor (intersticij), v katerem so Ito celice. Te se krčijo in širijo pod vplivom vazoaktivnih snovi in uravnavajo sinusoidni krvni pretok. V primerjavi z ostalimi kapilarami v telesu sinusoidna stena nima bazalne membrane in je fermentirana. To omogoča neposreden stik hepatocita s krvjo. V Dissejev prostor se tako zliva vsebina sinusoidov, v njem pa hepatociti prosto komunicirajo s plazmo. Omejene s tesnimi stiki med sinusoidi nastajajo tudi žolčne kapilare, ki imajo na svojih stenah aktivni transportni sistem za prenos bilirubina in žolčnih kislin iz hepatocitov. Vsaka parenhimska jetrna celica ima 3 površine: sinusoidno (neposredni stik s krvjo), kanalikularno (žolčni kanalikul omejuje med seboj sosednja hepatocita) in lateralno (tesno medsebojno stikanje hepatocitov) [5]. Ekskrecijski jetrni sistem se začne z žolčnimi kanalikuli, ti se združujejo v žolčne duktule, več duktulov pa v interlobularne žolčne vode (v portalnih poljih). Vodi po velikosti naraščajo in se v porti združijo v ekstrahepatična izvodila. Osnovna morfološka enota jeter je jetrni lobulus ali režnjič. Predstavlja šesterokotni del parenhima, ki obdaja centralno veno [6]. Na obrobju režnjiča ležijo portalna polja (portalne triade), ki jih sestavljajo portalna vena, hepatična arterija in žolčni vod [3]. V lobulusu so hepatociti radialno razporejeni okrog centralne vene, med njimi pa so sinusoidi. Jetrni acinus je mikrocirkulacijska enota jeter, kjer so hepatociti združeni v koncentrične cone s centrom v terminalnem aferentnem žilju (triade), periferijo pa predstavljajo deli lobulusa. Tako razdelimo acinus na tri funkcionalne cone, glede na oksigenacijo: cona ena (hepatociti okoli triade), cona tri (parenhimske celice okrog centralne vene) in cona dve (celice med obema conama). Hepatociti v 1. coni so prvi preskrbljeni z oksigenirano krvjo ter so tako odpornejši proti strupom in nekrozi ter se prvi regenerirajo. Celice v ostalih dveh conah pa so bolj občutljive in se ne regenerirajo v takem obsegu [6]. 2

14 1.1.3 FUNKCIJA JETER Funkcija jeter v telesu je večkratna, od presnovnih nalog pa vse do čiščenja krvi in odpadkov, ki pridejo v jetra preko krvi. Metabolizem Ogljikovih hidratov Pri metabolizmu ogljikovih hidratov imajo jetra nalogo, da vzdržujejo stalno koncentracijo glukoze v krvi. Ta se doseže z dvema postopkoma. Kadar je v krvi previsoka koncentracija glukoze, se odvečna shranjuje v jetrih v obliki glikogena, v kolikor pa je koncentracija majhna, pride do glikogenolize in glukoneogeneze. Omenjena procesa regulira koncentracija substratov in produktov ter hormonov [1]. Lipidov V jetrih poteka β-oksidacija maščobnih kislin, sinteza fosfolipidov, ketonskih teles, holesterola ter lipogeneza (sinteza maščob iz proteinov in ogljikovih hidratov). Večina holesterola se pretvori v žolčne soli, preostali del pa se vgradi v lipoproteine. Jetra razgrajujejo hilomikronske ostanke in s holesterolom zasičene HDL ter sintetizirajo lipoproteine VLDL, ki se pretvarjajo naprej v LDL, IDL in HDL. V jetrih poteka tudi pretvorba ogljikovih hidratov in proteinov v maščobe [1]. Aminokislin in proteinov V jetrih poteka interkonverzija in oksidativna deaminacija AK. Deaminirane AK se porabijo kot vir energije ali za sintezo ogljikovih hidratov in maščob. Z interkonverzijo se sintetizirajo proteini, kreatin, glutation, tvorijo se tudi neesencialne AK, ki jih v telesu primanjkuje. Plazemske beljakovine, albumini, globulini in fibrinogen, tvorijo jetrne celice iz AK, ki pridejo v jetra po krvnem obtoku [1]. V citosolu hepatocita potekajo reakcije transaminacije, v katerih se α-amino skupine različnih AK prenesejo na α-ketoglutarat, da nastane glutamat in α-keto kislina (encim je transaminaza ali aminotransferaza).glutamat se prenese v mitohondrij, kjer potekajo reakcije oksidativne deaminacije. Od glutamata se odstrani amino skupina in se usmeri v cikel uree, nastali α-ketoglutarat pa v citratni cikel (encim je glutamat dehidrogenaza). Detoksifikacija amoniaka: jetra detoksificirajo amoniak v ciklu uree, zato zelo povečana koncentracija amoniaka v krvi ponavadi kaže na hudo poškodbo hepatocitov [6]. 3

15 Hormonov Pri metabolizmu hormonov gre za razgradnjo inzulina in glukagona. Inaktivirajo in izločajo se tudi tiroidni in steroidni hormoni. Okvara jeter tako povzroči prekomerno koncentracijo in aktivnost teh hormonov [1]. Izločanje Jetra izločajo žolč, ki omogoča prebavo in absorbcijo maščob ter izločanje žolčnih kislin, odvečnega holesterola, maščobnih kislin, bilirubina, lecitina in elektrolitov. Z žolčem se izločajo tudi inaktivirani hormoni in telesu tuje spojine [1]. Akumulacija V jetrih se shranjujejo vitamini A, D, K, B12, shranjena količina pa zadostuje za več mesecev. V jetrih je v obliki feritina shranjena največja količina železa v telesu. Odvečno železo v krvni cirkulaciji se tako veže na apoferitin [1]. Inaktivacija tujih snovi V jetrih se uniči biološka aktivnost zdravil, strupov in aditivnih hranil. Vodotopne snovi se izločajo z urinom in žolčem, lipidotopne pa se najprej pretvorijo v vodotopne [1]. Hematopoeza Jetra v otroštvu ali pri določenih patoloških pojavih delujejo tudi kot krvotvorni organ, kjer gre za ektramedularno hematopoezo [1] BOLEZNI JETER Mnoga obolenja jeter spremlja zlatenica kot izraz povečane ravni bilirubina v sistemu. Bilirubin je posledica razgradnje hemoglobina mrtvih rdečih krvničk. Jetra ga navadno odstranijo iz krvi in izločijo z žolčem. Hepatitis ali vnetje jeter lahko povzročajo različni dejavniki. Med vzroke za nastanek hepatitisa prištevamo okužbe, pretirano uživanje alkohola, razna zdravila, kemične snovi in strupe, motnje v presnovi (npr. hemokromatoza) ali celo spremenjen lasten imunski odziv (avtoimuni hepatitis). Najpogostejši vzrok je okužba s hepatotropnimi virusi (virusi hepatitisa A, B, C, D, E in G), lahko pa tudi z različnimi drugimi virusi, ki poleg značilnih bolezenskih znakov, ob tem povzročajo tudi vnetje jeter (npr. virus Ebstein-Barr ob infekcijski mononukleozi, virus noric, virus herpes simpleks ) [7]. 4

16 Ciroza jeter ali jetrna odpoved je kronična bolezen jeter, pri kateri se jetrno tkivo nadomešča z vezivnim tkivom. Jetra otrdijo in se skrčijo, s tem pa je njihovo delovanje moteno. Jetrna ciroza je nasledek različnih drugih jetrnih bolezni, nastaja pa tudi pod vplivom strupov [8]. Rak jeter (predvsem hepatocelični karcinom in holangiokarcinom ter metastatski raki, navadno iz drugih delov gastrointestinalnega trakta). Hepatocelularni rak (HCC) tvorijo celice, ki so podobne hepatocitom. Pojavi se večinoma v cirotično ali posthepatitično spremenjenih jetrih (v %). Predstavlja 90 % vseh primarnih jetrnih malignih tumorjev in je pogostejši pri moških kot pri ženskah. Med dejavnike, ki jih povezujemo z rakom jeter prištevamo: cirozo, kot posledico virusnega hepatitisa, alkoholizma ali nekaterih metabolnih bolezni; kronično infekcijo z virusom hepatitisa B ali C; steroide v kontraceptivih, v anabolih in androgenih; nekatere škodljive snovi kot sta torotrast in vinil-klorid ter membranozno obstrukcijo vene kave. Incidenca raka jeter je v svetu zelo različna; pri nas je 1,0 na pri ženskah in 2,4 na pri moških. Intrahepatični holangiocelularni rak (CHC) je mnogo redkejši in zraste pretežno v necirotičnih jetrih (v 70 %). Vzroki za nastanek niso znani, pojav tega raka pa povezujejo z intrahepatično litiazo, s sklerozantnim holangitisom, s Carolijevo boleznijo, z nekaterimi parazitozami (klonorhiaza, opistorhiaza) in s torotrastom. Poznamo še mešane oblike HCC in CHC in prognostično ugodnejšo obliko fibrolamelarni hepatocelularni karcinom [9]. Wilsonova bolezen je avtosomno recesivno dedna bolezen, pri kateri se kopiči baker v odvečnih količinah v jetrih, možganih in roženici. Bolezen povzroča mutacija gena 13 q14-q21, ki kodira beljakovino Wilsonove bolezni (ATP7b). Beljakovina Wilsonove bolezni je bakrova črpalka, ki je odgovorna za transport bakra v hepatocitu in njegovo izločanje z žolčem. Pri mutaciji ATP7b ne more delovati, zato se baker kopiči v hepatocitih in drugih organih [8]. Okvare jetrne strukture ob rojstvu prizadenejo zlasti žolčna izvodila. Čista holedohusa je razvojna nepravilnost jetrnega voda, kar ovira odtekanje žolča pri novorojenčkih. Treba jo je odstraniti (prirojene bolezni) [8]. 5

17 Razen alkohola in virusnih jetrnih bolezni okvarijo jetra prirojene okvare, bakterijske in parazitne okužbe, prekrvavitvene motnje, presnovne bolezni in avtoimunska dogajanja [8] Virusni hepatitis Opredelitev: Virusni hepatitis je akutno in kronično vnetje jeter, ki ga povzroča okužba z virusi hepatitisa A, B, C, D, E in G ter z drugimi neznanimi, ki jih imenujemo non-a non-g [3]. Bolezenski znaki: Bolezenski znaki so pri večini virusnih hepatitisov enaki. Začnejo se nenadoma, spremlja pa jih slabost, bruhanje, izguba apetita, splošno slabo počutje, vročina, lahko se pojavi temno obarvan urin, rumena obarvanost kože, sluznic in beločnice, kar imenujemo zlatenica. Ker so v začetnem obdobju bolezenski znaki podobni, ne moremo sklepati na vrsto virusa, ki je bolezen povzročil. Pogosto okužba poteka brez očitnih bolezenskih znakov in okuženi za okužbo sploh ne vedo. V serumu se pred pojavom znakov bolezni lahko določi povečano aktivnost encimov transmitaz (AST, ALT) in alkalne fosfataze. Gre za nespecifičen pokazatelj okvare jeter, saj se njihova aktivnost lahko poveča tudi pri drugih boleznih. Ker pride do okvare jeternih celic, se poveča koncentracija bilirubina. Tudi to ni značilno le za virusne okužbe jeter, ampak je tako kot povečana aktivnost jetrnih encimov nespecifičen pokazatelj bolezni jeter [7]. Diagnoza: Za natančnejšo diagnozo uporabljamo različne specifične in občutljive preizkuse, s katerimi dokazujemo prisotnost virusnih beljakovin, specifičnih protiteles proti virusnim beljakovinam in virusnih nukleinskih kislin: deoksiribonukleinske kisline (DNK) ali ribonukleinske kisline (RNK) [10]. Zdravljenje: Po okužbi z virusom hepatitisa A (HAV) in hepatitisa E (HEV) bolniki popolnoma ozdravijo in nimajo posledic, medtem ko okužba z virusom hepatitisa B (HBV), virusom hepatitisa C (HCV), virusom hepatitisa D (HDV) in redko z virusom hepatitisa G (HGV) lahko preide v kronično obliko bolezni. Zdravljenje se razlikuje glede na tip virusnega hepatitisa [7]. 6

18 Preglednica 1: Osnovne značilnosti virusnih hepatitisov Virusni Kronična Vir okužbe Pot prenosa Način prenosa Ig zaščita Cepivo hepatitis okužba Fekalnooralno človeka na človeka okužena voda/hrana, s A Blato ne da da Kri in nekatere spolni stik, okužene izpostavljena B druge telesne igle, transfuzija, z da da da koža/sluznica tekočine matere na otroka Kri in nekatere okužene igle, izpostavljena ni C druge telesne transfuzija, spolni stik, da ne koža/sluznica učinkovita tekočine z matere na otroka transfuzija, okužene Kri in nekatere izpostavljena igle, spolni stik, D druge telesne da ne ne koža/sluznica transfuzija, z matere na tekočine otroka E Blato fekalno, blato okužena voda/hrana ne ne ne kri, transfuzija, G transplantirani Kri redko ne ne transplantacija organi Hepatitis B Opredelitev: Hepatitis B povzroča okužba z virusom hepatitisa B in je lahko akuten in kroničen. Kronični hepatitis B pomeni dokazano kronično okužbo z zvišanjem aminotransferaz, ki traja najmanj šest mesecev [3]. Pogostost in prenos okužbe: Sodijo, da ima kar tretjina ljudi na svetu v krvi znake pretekle ali sveže okužbe z virusom hepatitisa B in da je 350 milijonov ljudi kronično okuženih. Vsako leto se pojavi približno 4 milijone novih akutnih primerov, približno milijon ljudi pa umre za kroničnimi posledicami, tj. jetrno cirozo in jetrnim rakom. Virus hepatitisa B je majhen, okrogel DNA virus iz družine Hepadna virusov. Nahaja se v krvi, slini, spermi, vaginalnih izločkih, urinu in mleku doječe matere. Najpogostejši način prenosa je spolni stik. Med intravenoznimi uživalci drog se hepatitis B širi zaradi souporabe igel, ki so onesnažene z okuženo krvjo. Na podoben način se okužba prenaša pri tetoviranju oziroma uporabi okuženih predmetov za prebadanje kože. Možen je tudi prenos okužbe od matere, ki je nosilka virusa hepatitisa B na otroka v času nosečnosti in pri porodu [7]. 7

19 Bolezenski znaki: Okužba s HBV najpogosteje poteka v prikriti obliki, brez povečanih jeter in zlatenice, pogosto so povišani le biokemični kazalci okvare jeter. Zgodi pa se, da tudi biokemični kazalci niso povišani in okužbo lahko dokažemo le s specifičnimi serološkimi testi. Le % okužb spremljajo značilni bolezenski znaki. Približno 10 % oseb, ki prebolijo okužbo, in večina otrok, ki se okužijo ob rojstvu, postane trajnih nosilcev virusov in so vse življenje kužni. Trajni nosilci se lahko počutijo popolnoma zdrave, nekaterim pa okužba povzroča težave. Ti bolniki imajo kronični hepatitis B, ki lahko preide v kronično cirozo ali rak jeter [10]. Diagnoza: Za dokazovanje okužbe z virusom hepatitisa B, spremljanje poteka bolezni in samo zdravljenje uporabljamo biokemične, serološke in virusne teste, ter histološki pregled jeter. Med biokemičnimi testi ima osrednjo vlogo serumska aktivnost aminotransferaz. Virološki testi vključujejo serološke teste kvalitativnega in kvantitativnega določanja antigenov in protiteles HBV ter meritve koncentracije HBV DNA. Sestavni del diagnostike je tudi jetrna biopsija s katero spremljamo učinek zdravljenja bolnikov s kronično okužbo s HBV. Na podlagi izvida lahko ocenimo gradus nekroze in vnetja ter stadij fibroze in ciroze [3]. Zaščita: V Sloveniji je določeno obvezno cepljenje proti hepatitisu B za vse otroke. Prav tako se cepljenje priporoča vsem zdravstvenim in drugim delavcem, kakor tudi dijakom in študentom, ki so pri opravljanju svojega dela oz. praktičnem pouku izpostavljeni možnostim okužbe s HBV. Zaradi možnosti prenosa virusa z matere na otroka je obvezno testiranje vseh nosečnic na prisotnost HBs-antigena v prvem tromesečju nosečnosti in ponovitev v tretjem tromesečju pri tistih, pri katerih v prvem testiranju nismo dokazali HBs-antigena. Prav tako v Sloveniji že od leta 1960 obvezno testirajo krvodajalce na prisotnost HBs antigena. V zadnjem času pa je uvedeno še dodatno testiranje z zelo občutljivimi molekularnogenetskimi metodami, s katerimi se neposredno dokazuje virus z uporabo metod zaznavanja pomnoženih nukleinskih kislin virusa. Z uvedbo teh metod je možnost, da se»spregleda«okužene osebe, izredno majhna. Tveganje se lahko zmanjša tudi z omejitvijo števila partnerjev, izogibanjem mamilom in z ukrepi za varno spolnost [7]. 8

20 Zdravljenje: Za zdravljenje akutnega hepatitisa B ni zdravila. Obstajata pa dve odobreni zdravili za kronični hepatitis B, to sta interferon alfa-2b in lamivudin [3] Hepatitis C Opredelitev: Hepatitis C povzroča okužba z virusom hepatitisa C [3]. Pogostost in prenos okužbe: Ocenjujejo, da je z virusom hepatitisa C okuženih približno 3 % svetovnega prebivalstva. Virus hepatitisa C je RNA virus iz družine flavivirus. Glavni načini prenosa tega virusa, ki se nahaja v krvi, slini, semenski tekočini in solzah, je predvsem s krvjo. Prenos okužbe je mogoč tudi z okuženimi iglami med intravenoznimi uživalci drog, pri akupunkturi, pri dializnih bolnikih, po presaditvah organov in med zdravstvenimi delavci z naključnim vbodom z okuženo iglo. Okužbe so pogostejše tudi pri ljudeh, ki pogosteje menjavajo spolne partnerje. Možnost prenosa s tesnimi stiki med družinskimi člani, pri souporabi pribora za osebno nego, je zelo majhna. Prav tako se virus ne prenaša z običajnimi družabnimi stiki. Možnost prenosa okužbe z matere na otroka je majhna [10]. Bolezenski znaki: Okužene osebe, ki nimajo značilnih znakov bolezni, navadno odkrijemo slučajno pri sistematskih pregledih. Težave tistih, ki imajo znake bolezni, so navadno neznačilne in le redki morajo poiskati zdravniško pomoč. Bolezenski znaki so podobni kot pri drugih vrstah hepatitisa, le da so blažji. Pri približno 80 % okuženih preide nezdravljena okužba v kronično obliko, zato je možnost za nastanek jetrne ciroze ali raka na jetrih še veliko večja kot pri okužbi s HBV. Prav zaradi tega je pomembno, da se okužba odkrije čim prej, da dobi bolnik ustrezno zdravljenje [8]. Diagnoza: Če ima bolnik značilen potek bolezni, se okužbo takrat dokaže s preiskavo krvi. Pri ostalih, ki so brez znakov okužbe, se le-to ugotovi slučajno (npr. pri krvodajalskih akcijah ali pri pregledu krvi nosečnic). Določajo se protitelesa proti virusu HCV, nato lahko tej preiskavi sledi določitev virusne nukleinske kisline [7]. Zaščita: Cepiva proti HCV še ni. Povsod podpirajo laboratorijska testiranja, ki naj bi pripomogla k čim bolj natančni opredelitvi narave bolezni in uvajanju čim bolj ustreznih zaščitnih ukrepov. Tveganje se lahko zmanjša z omejitvijo števila partnerjev, izogibanjem mamilom in z ukrepi za varno spolnost [8]. 9

21 Zdravljenje: Zdravljenje akutnega hepatitisa C je običajno simptomatsko. Pri kronični obliki uporabljamo interferon alfa, pegiliran interferon (rekombinantna oblika) in ribavirin (protivirusno zdravilo). Bolnike oskrbujejo praviloma v specializiranih ambulantah, kjer skušajo s krvnimi preiskavami ugotoviti uspešnost zdravljenja in izginotje povzročitelja iz krvi. Zdravljenje je dolgotrajno, glede na podtip virusa lahko traja od 24 do 48 tednov. Analiza uspešnosti zdravljenja je še zlasti pomembna, saj kronični hepatitis C lahko napreduje v jetrno cirozo ali v primarni rak jeter [8] Alkoholna ciroza jeter Opredelitev: Jetrna ciroza je posledično kronično obolenje jeter, ki okvari njihovo normalno zgradbo. Gre za razraščanje veziva in sekundarno propadanje hepatocitov ter njihovo nadomeščanje z maščobnim tkivom, vezivom ali hialino degeneracijo [8]. Ciroza jeter je morfološko enoten odgovor jetrnega parenhima na kronično in ponavljajočo se okvaro. Opredelimo jo kot brazgotinsko fazo jetrne bolezni, za katero je značilno: fibrozna septa (brazgotinsko, vezivno tkivo), vozlički jetrnega parenhima, ki nastanejo z regeneracijo z brazgotino zamenjanega parenhima, spremembe zajemajo celotna jetra.[11]. Vzroki za nastanek jetrne ciroze: Jetrna ciroza je posledica različnih drugih jetrnih bolezni, nastaja pa tudi pod vplivom strupov. Je značilna bolezen alkoholikov, ki se razvije po desetletjih prekomernega uživanja alkohola, pri čemer se dnevna količina alkohola razlikuje od osebe do osebe. Gre za najpogostejše stanje, ki pri nas povzroča alkoholno toksično okvaro jeter. Sledijo ji še kronični virusni hepatitisi (predvsem B in C), vse pogosteje pa prihaja tudi do ugotavljanja kroničnih presnovnih motenj, ki z leti povzročijo propad jetrnega tkiva [12]. Pri kroničnih presnovnih motnjah je najpogostejše obolenje bolezen zamaščenih jeter. Ta le v malo primerih privede do ciroze. Povezana je s prekomerno telesno težo, preveč maščobami v krvi in sladkorno boleznijo. Prirojena in dedno pogojena je motnja presnove železa hemokromatoza, ki zaradi kopičenja železa v jetrih pripelje do ciroze [8]. Redkejši vzrok ciroze so imunsko povzročena okvara jetrnih celic (avtoimunski hepatitis) in imunsko povzročeno vnetje oz. propad notranjih jetrnih žočevodov (primarni sklerozirajoči holangitis in primarna biliarna jetrna ciroza). Jetrno cirozo lahko povzroči tudi dolgotrajna motnja odtoka žolča iz jeter (zaradi kamnov ali zožitev žolčevodov) in dolgotrajno otekanje 10

22 jeter zaradi slabšega odtoka krvi iz jeter (pri trombozi jetrnih ven ali desnostranskem srčnem popuščanju) [8]. Bolezenski znaki: Bolezenski znaki ciroze niso specifični. Bolezen se razvija dolgo in do zadnjega stadija ni kliničnih pokazateljev te bolezni. Ugotovimo jo naključno s kliničnim pregledom bolnika. Pri 40 % bolnikov se bolezen ne kaže in jo odkrijejo šele z obdukcijo. Razvoj simptomov in znakov je tesno povezan z odpovedjo funkcije jetrnega parenhima, pojavom portalne hipertenzije ter patofizioloških mehanizmov, ki posegajo v delovanje vseh organskih sistemov [2]. Splošni znaki: utrujenost, izguba energije, slabo počutje, mišični krči, izguba apetita ter telesne teže, amenoreja in sterilnost pri ženskah in subfebrilnost [3]. Specifični znaki: kožne spremembe Na koži se pojavijo rdeči madeži iz katerih se širijo krvne žile v obliki pajčevine. Na dlaneh je viden palmarni eritem in kontraktura dlanske aponevroze Duputytrenova kontraktura. Koža je slabo poraščena, pojavljajo se tudi podkožne krvavitve zaradi motenj v strjevanju krvi. Ob pojavu zlatenice je koža rumenkasta. ascites z napetim trebuhom in izbočenim popkom Je znak nenapovedane bolezni in predstavlja najpogostejše zaplete pri jetrni cirozi. Z nastankom regerenatornih vozličev v jetrih pride do sprememb krvnega obtoka, ki se kažejo kot povišan tlak v drobnih kapilarah. Vse to vodi v iztopanje tekočin in posledično do značilnega trebuha žabje oblike. endokrine motnje Kažejo se z izgubo dlak, ginekomastijo, palmernim eritemom, hipogonatizem z impotenco in atrofijo testisov. bakterijske okužbe Okužbe so pri bolnikih s cirozo pogoste in so posledica oslabljenega imunskega sistema. Ob vstopu v bolnišnico ima % bolnikov bakterijsko okužbo ali pa jo dobijo med 11

23 hospitalizacijo. Najpogostejše bakterijske okužbe so: okužbe sečil, spontani bakterijski peritonitis, okužbe dihal, bakteriemija [3]. delirium tremens ali alkoholni bledež To je stanje pri alkoholikih pri katerem gre za možganski sindrom. Označujejo ga sočasne motnje zavesti, pozornosti, mišljenja, zaznavanja, spominjanja, čustvovanja, psihomotorične aktivnosti idr. Stopnja izrazitosti alkoholnega bledeža lahko sega od blagih do zelo hudih oblik. Nastane pri kroničnem in kontinuiranem pitju večjih količin alkohola in nenadnem prenehanju pitja, pri osebi, ki redno uživa alkohol. krvavitev iz prebavil Bolniki lahko krvavijo iz požiralnikovih varic ali portalne hipertenzivne gastropatije. Pogosto imajo taki bolniki tudi peptično razjedo na dvanajstniku. edemi nog tahipneja (pospešeno in oteženo dihanje) hipotoničnost nevropsihične spremembe z motnjami govora, evforijo, depresijo, mišično rigidnostjo in krči motnje zavesti primarna jetrna koma sekundarna jetrna koma [13]. Diagnoza: Večina oseb z alkoholno jetrno cirozo zdravniku zanika prekomerno uživanje alkohola, zato je dokazovanje te bolezni običajno zapleten proces. Pri postavitvi diagnoze se zdravnik opira na fizični pregled in anamnezo, krvne teste, urinske preiskave, kvantitativne teste delovanja jeter, ultrazvočno preiskavo jeter, biopsijo jeter ter laparoskopijo [3]. Zdravljenje: Zdravljenje zapletov jetrne ciroze je le delno uspešno. Zaenkrat je edini način dokončnega zdravljenja jetrne ciroze presaditev jeter. Za ta poseg se odločimo pri mlajših od 65 let, pri katerih se je pojavil vsaj en zaplet bolezni in/ali kažejo znake pomembno motene jetrne funkcije [3]. 12

24 1.1.5 DIAGNOSTIKA JETRNIH OBOLENJ Diagnoza jetrnih bolezni je zapleten proces. Za posamezne oblike bolezni obstaja le malo kliničnih znakov v začetni fazi bolezni, njihovo zgodnje odkrivanje pa je odločilnega pomena. Med klinično pomembne metode za ugotavljanje bolezenskih sprememb na jetrih spadajo neagresivne preiskave kot so ultrazvok, računalniška tomografija (CT), magnetna resonanca (MR) in PCR. Morfološke spremembe jeter dokažemo s histološkimi in citološkimi preparati na podlagi prej opravljene biopsije. Med invazivne postopke spadata tudi angiografija in laparaskopija, ki omogoča pregled peritonealne votline. Biokemični testi so pomembno dopolnilo tem metodam, saj služijo za odkrivanje, ocenjevanje in spremljanje nepravilnosti v delovanju jeter. Globalno funkcijo jeter s temi testi težko izmerimo, saj imajo jetra veliko funkcionalno rezervo. Testi ne pokažejo motnje ali pa so odstopanja od normale pri raznih okvarah razmeroma majhna. Testi niso visoko specifični, nekateri tudi niso visoko senzitivni. Noben jetrni test ni specifičen le za eno jetrno bolezen. Vrednost enega testa nam namreč še ne določa diagnoze bolezni. Količine nekaterih snovi, ki jih merimo, so lahko spremenjene tudi zaradi patoloških dogajanj izven jeter torej testi niso specifični samo za jetrne bolezni. Pomembno je torej, da jetrne teste uporabljamo v kombinacijah, saj tako povečamo njihovo specifičnost in občutljivost. Jetrni testi, ki ocenjujejo izločevalno in biosintetsko sposobnost oz. funkcijsko sposobnost: koncentracija faktorjev strjevanja krvi v serumu koncentracija albuminov in globulinov v serumu koncentracija bilirubina v serumu in urinu Jetrni testi, ki nakazujejo na holestazo ali okvaro hepatocitov, so encimski testi: aktivnost aminotransferaz (ALT in AST) v serumu aktivnost γ-glutamil transpeptidaze v serumu aktivnost alkalne fosfataze v serumu [6] 13

25 1.2 ENCIMI Opredelitev: Encimi so visoko specializirani proteini. To pomeni, da imajo visoko katalitično moč in visoko specifičnost. So biokatalizatorji, saj omogočajo reakcije v blagih pogojih (temperatura, ph, tlak). Lahko so specifični (delujejo samo na en substrat) ali nespecifični (delujejo na določeno funkcionalno skupino večih substratov) [14] ZGRADBA IN FUNKCIJA ENCIMOV Encimi spadajo med velike globularne beljakovine z značilno tridimenzionalno obliko in specifično površinsko obliko. Ta jim omogoča, da med vsemi molekulami najdejo pravi substrat. Večina encimov je zgrajena iz dveh delov. Beljakovinskega, ki mu pravimo apoencim ter nebeljakovinskega, ki mu pravimo kofaktor. Celoten encim je holoencim. Nekateri encimi so lahko zgrajeni samo iz beljakovine, medtem ko nekateri brez kofaktorja ne morejo delovati. Kofaktor je lahko kovinski ion ali kompleksna organska spojina, ki jo imenujemo koencim. Kovinski ioni pomagajo katalizirati reakcijo tako, da ustvarijo most med encimom in substratom. Koencimi delujejo tako, da sprejemajo atome, ki jih oddaja substrat ali oddajajo atome, ki jih substrat sprejema. Nekateri koencimi delujejo tudi kot nosilci elektronov: sprejemajo jih iz substrata in oddajajo molekulam v naslednjih reakcijah. Največkrat so koencimi pridobljeni iz vitaminov. Posebna izjema so encimi RNK ali ribocimi, ki jih sestavlja RNK namesto beljakovin. Ribocimi katalizirajo le izrezovanje RNK [14] MEHANIZEM DELOVANJA V živi celici stalno potekajo kemijske reakcije, kjer prihaja do trkov med atomi in molekulami. Da pride do tega je pomembna oblika delcev, njihova hitrost, ki je odvisna od temperature in tlaka ter količine energije. Končen rezultat je spajanje in razcepljanje kemijskih vezi med atomi. Energijo, ki med tem nastaja imenujemo aktivacijska energija. V našem organizmu sta temperatura in tlak prenizka zato so potrebni encimi, da pospešijo kemijske reakcije. To počnejo na dva načina: lahko zbližajo molekuli dveh reaktantov in ju pravilno orientirajo, da lahko reagirata; lahko pa tudi znižajo aktivacijsko energijo na ta način, da omogočijo večjo cepitev molekul, ki imajo veliko notranjo energijo. Pri tem se temperatura in pritisk v celici ne spremenita. 14

26 Delovanje encima se začne tako, da povišana substrata prideta v stik z določenim delom encimske površine, ki jo imenujemo aktivni center. Nastane začasna zveza med encimom in substratom, ki ji pravimo kompleks encim-substrat. Nadalje se molekula substrata spremeni, da se razporedijo obstoječi atomi ali se razcepi molekula substrata ali pa nastane kombinacija z molekulo drugega substrata. Spremenjena molekula substrata, ki je končni produkt reakcije, se loči od encima po tem, da ne odgovarja več aktivnemu centru in načinu. Encim je nespremenjen in prost ter reagira z drugo molekulo substrata. Na eno molekulo lahko deluje več encimov in pri vsaki reakciji je produkt drugačen [14]. Nekatalizirana kemijska reakcija: S P Encimsko katalizirana kemijska reakcija: E + S ES EP E + P E Encim S Substrat P Produkt ES kompleks encim-substrat EP kompleks encim-produkt Slika 1: Grafični prikaz energije v odvisnosti od reakcijske koordinate 15

27 1.2.3 DELITEV ENCIMOV Encimi v celici se delijo na: membranske encime (AF) citoplazemske encime (AST, ALT) organelnospecifične encime (1/3 AST) inkretorne encime sektretorne encime [15] Standardna klasifikacija encimov Preglednica 2: Standardna klasifikacija encimov [15] Klas. Število EC 1 EC 2 EC 3 EC 4 EC 5 EC 6 Skupina oksireduktaze transferaze hidrolaze liaze izomeraze ligaze Tip kemijske reakcije oksidacija in redukcija Prenos funkcionalnih skupin (npr. amino, acetilna in fosfatna skupina) z ene molekule na drugo razcep vezi s hidrolizo odstranitev skupin atomov brez hidrolize prerazporeditev atomov v molekuli spajanje dveh molekul ob uporabi energije iz ATP Reakcijska shema AH + B A + BH (reduciran) A + O AO (oksidiran) AB + C A + BC AB + H 2 O AOH + BH RCOCOOH RCOH + CO 2 ali [X-A-B-Y] [A=B + X-Y] AB BA X + Y + ATP XY + ADP + Pi Primeri encimov citokromoksidaza, laktatdehidrogenaza, peroksidaza acetatkinaza, alanindeaminaza Lipaza izocitraza, oksalatdekarboksilaza glukoza-fosfat izomeraza acetil-coa sintetaza, DNA-ligaza 16

28 Aminotransferaze (AST, ALT) Aminotransferaza je encim, ki katalizira prenos amino skupine iz molekule darovalca na prejemnika te molekule. Donator (donor) molekule je aminokislina, medtem ko je prejemnik (akceptor) navadno molekula alfa-2 keto kisline. Nastane glutamat, ki se kasneje porabi v ciklu uree, alfa-ketoglutarat pa vstopi v citratni cikel. Aminotransferaze se imenujejo tudi transaminaze. Določanje njihove koncentracije v krvi se uporablja v diagnostične namene, predvsem za prepoznavanje in sledenje akutnih hepatocelularnih bolezni. Dva od bolj znanih encimov v tej skupini sta aspartat aminotransferaza in alanin aminotransferaza [15]. Slika 2: Shematični prikaz delovanja aminotransferaz 17

29 AST Trivialno ime: aspartat aminotransferaza Sistematično ime: L-aspartat 2 oksoglutarat aminotransferaza Staro ime: GOT glutamat oksalacatat transferaza Koda: EC AST je encim, ki katalizira reverzibilno reakcijo transaminacije med asparaginsko kislino in 2 oksoglutarno kislino. Ketokislina prehaja v aminokislino in na ta način pride do prepletanja metabolizma ogljikovih hidratov in dušikovih snovi [17]. Porazdelitev AST po organih: največ ga je v jetrih, srčni in skeletni mišici; v manjših koncentracijah se nahaja v kostnem mozgu, ledvicah, pankreasu, pljučih in eritrocitih; ne najdemo ga v kosteh in zobni sklenini [16]. Celična porazdelitev: 40 % ga je v citoplazmi in 60 % v mitohondrijih, zato AST odraža predvsem mitohondrijsko okvaro hepatocitov. Izoencima se razlikujeta po hitrosti gibanja v elektroforeznem polju, v občutljivosti do različnih ph in temperature [16]. Diagnostični pomen določanja aktivnosti AST v serumu: Kadar pride do poškodb tkiva posameznih organov se iz celic sprosti AST, ki prehaja v kri. Pomembno je določanje pri: srčnemu infarktu angini pektoris miokarditisu perikarditisu mišični distrofiji bolezni jeter in žolčnih vodov [16]. 18

30 Referenčne vrednosti: Pričakovane vrednosti v skladu z metodo IFCC (merjeno pri 37 C). U/L μkat/l moški do 40 do 0,67 ženske do 32 do 0,53 Vsak laboratorij naj bi preučil ali so referenčne vrednosti primerne njegovi populaciji pacientov in jih po potrebi prilagodil. Na Kliničnem inštitutu za klinično kemijo in biokemijo imajo naslednje referenčne vrednosti: do 0,52 μkat/l za moške in ženske [17] ALT Trivialno ime: alanin aminotransferaza Sistematično ime: L-alanin 2 oksoglutarat aminotransferaza Staro ime: GPT glutamat piruvat transaminaza Koda: EC ALT je encim, ki katalizira reverzibilno reakcijo med alaninom in 2 oksoglutarno kislino. Ima pomembno vlogo v metabolizmu aminokislin, proteinov in ogljikovih hidratov [17]. Porazdelitev ALT po organih: več ALT je v jetrih, manj se ga nahaja v skeletnih mišicah, srcu, ledvicah, pankreasu in v eritrocitih. Celična porazdelitev: ALT je prisoten v citoplazmi celic in zato že najmanjša poškodba ali sprememba v prepustnosti celične membrane povzroči prehod encimov v izven celično tekočino [16]. Diagnostični pomen določanja aktivnosti ALT v serumu: Diagnostične vrednosti ima ALT pri boleznih jeter in žolčnih vodov: Akutni virusni hepatitis: Tu imamo zelo velik porast aktivnosti ALT (tudi do x). Povišano aktivnost določimo tako kot ALT, tudi do tri tedne pred ostalimi kliničnimi in 19

31 laboratorijskimi znaki bolezni. Aktivnost ALT je vedno večja od aktivnosti AST. Tekom bolezni aktivnost ALT pada skupaj s koncentracijo bilirubina. Kronični hepatitis: Vrednosti ALT so normalne ali rahlo zvišane. Ciroza jeter: Aktivnost ALT se poveča do 5 6 x. Akutna/kronična vnetja pankreasa ali karcinom pankerasa: Povečana aktivnost ALT ja posledica poškodb celic pankreasa in jeter. Srčni infarkt ali mišična distrofija: Aktivnost ALT je običajno normalna. Ker je v miokardu manjša vsebnost ALT in manjša maksimalna aktivnost, ne preseže relativne vrednosti oz. je aktivnost ALT odvisna od obsega poškodovanega tkiva [16]. Referenčne vrednosti: Pričakovane vrednosti v skladu z metodo IFCC (merjeno pri 37 C). U/L μkat/l Moški do 41 do 0,68 Ženske do 33 do 0,55 Vsak laboratorij naj bi preučil ali so referenčne vrednosti primerne njegovi populaciji pacientov in jih po potrebi prilagodil. Na Kliničnem inštitutu za klinično kemijo in biokemijo imajo naslednje referenčne vrednosti: do 0,56 μkat/l za moške in ženske [17]. 20

32 1.2.4 RAZMERJE JETRNIH ENCIMOV V serumu so aminotransferaze normalno prisotne v nizkih koncentracijah, za ALT je mejna vrednost 0,56 μkat/l, za AST pa 0,52 μkat/l. Poškodbe jetrnih celic prizadenejo celične membrane, ki postanejo bolj permeabilne, kar povzroči izhajanje encimov v krvni obtok in povečanje serumske koncentracije aminotransferaz. Stopnja povečane aktivnosti encimov še ne pomeni posledično enake stopnje nekroze hepatocitov, saj lahko kakršnakoli poškodba hepatocitov pomeni povišanje koncentracij teh encimov. Po drugi strani pa hiter upad koncentracij nakazuje na nekrozo, ki se je ustavila. Pri zvečani aktivnosti aminotransferaz je kliničnega pomena posamezno zvečanje aktivnosti ALT ali AST, zvečanje aktivnosti obeh encimov hkrati ter medsebojno razmerje med zvečanjem njunih aktivnosti (AST : ALT) [6]. Poenostavljena delitev zvečanja aktivnosti ALT in AST v klinični praksi: blago zvečanje: zvečanje manj kot 5 x nad normalo srednje zvečanje: zvečanje 5 15 x nad normalo močno zvečanje: zvečanje več kot 15 x nad normalo Vzroki blagega zvečanja ALT in AST: Jetrni vzroki ALT >AST ALT<AST kronični hepatitis C alkoholna jetrna bolezen kronični hepatitis B alkoholna steatoza hemokromatoza ciroza nealkoholna steatoza (zamaščenost jeter) avtoimunski hepatitis Wilsonova bolezen akutni virusni hepatitis (A E, EBV, CMV) zdravila, strupi pomanjkanje alfa-1-antitripsina celiakija Izven jetrni vzroki hemoliza prekomerni telesni napori miopatija pljučna embolija 21

33 AST in ALT sta povišana skoraj pri vseh jetrnih boleznih, največkrat se večata paralelno. Pri večini akutnih in kroničnih virusnih hepatitisov prevladuje zvečanje aktivnosti ALT. Pri alkoholnem hepatitisu pa ima razmerje AST:ALT, ki je večje od 2, diagnostično vrednost. Alkoholna okvara namreč povzroči pomanjkanje piridoksin-5-fosfata, ki je pomemben koencim reakcij transaminacij. Razmerje AST:ALT, ki je manjše kot 2, pa nakazuje na virusni hepatitis. Aktivnost AST je povečana tudi pri cirozi in to ne glede na njen vzrok. AST prevladuje tudi pri izven jetrnih vzrokih povišanja aktivnosti encimov. Tako je pri prekomerni fizični aktivnosti AST več kot 3-krat povišana (v tem primeru moramo za potrditev diagnoze opraviti še test kreatin-kinaze), pri poškodbi mišic in rabdomiolizi je ALT le minimalno povišana, pri hemolizi pa je AST več kot 15-krat povišana (testirati moramo še aktivnost laktat-daehidrogenaze). Zdravila, domača zdravila in čaji so pogost vzrok zvečane aktivnosti jetrnih encimov pri starejši populaciji. Med zdravili so najpogostejši: paracetamol, amoksicilin, flukonazol, heparin, izoniazid, nesteroidna protivnetna zdravila, sulfonamidi. Med rastlinskimi oz. alternativnimi zdravili prevladujejo encijan, kitajski čaj, germander. Tudi prepovedane droge kot so anabolni steroidi, kokain, ecstazy in strupi (ogljikov tetraklorid, kloroform, dimetilformamid, gobe, toluen) lahko povečajo aktivnost aminotransferaz. Močno zvečana koncentracija AST in ALT nakazuje na hudo jetrno okvaro ali nekrozo. Najpogostejši vzroki so akutni virusni hepatitisi, zdravila in strupi, redkejši pa avtoimuni hepatitis, fulminatna Wilsonova bolezen in obstrukcija žolčevoda. Pri naključnem odkritju blago in zmerno povišanih aktivnosti aminotransferaz pri asimptomatskem bolniku gre lahko za laboratorijsko napako, zato je potrebno testiranje najprej ponoviti. Če so testi ponovno patološki, je potrebno dodatno testiranje. Povišanje koncentracije aminotransferaz torej ni specifično samo za okvare jetrnih celic. AST je prisotna tudi v drugih tkivih in se poveča tudi npr. pri miokardnem infarktu. Jetrne bolezni so najpogostejši vzrok zvišanja aktivnosti aminotransferaz, vendar se encima lahko zvišata tudi pri hudih fizičnih naporih, pri hemolizi in mišični poškodbi [6]. 22

34 2 NAMEN DELA Namen diplomske naloge je primerjati določitev dveh jetrnih encimov aspartat amintransferaze in alanin aminotransferaze pri hepatitisu in alkoholni jetrni cirozi. Pri interpretaciji rezultatov imamo težave zaradi manjše specifičnosti teh dveh določitev, zato bomo uporabili izračun razmerja teh dveh encimov. Ugotovili bomo kolikšna je diagnostična občutljivost uporabljenega izračuna. Osnovo nam bo predstavljala v literaturi objavljena metoda, ki temelji na reverzibilni reakciji transaminacije med asparaginsko kislino in 2 oksoglutarno kislino pri encimu AST ter na reverzibilni reakciji med alaninom in 2 oksoglutarno kislino pri ALT. Raziskovalne hipoteze: Razmerje encimov AST/ALT bo zaradi poškodb celic pri alkoholizmu večje kot pri hepatitisu. Predvidevamo različnost razmerja AST/ALT encimov pri hepatitisu in alkoholni cirozi jeter. Predvidevamo različnost razmerja AST/ALT med moškimi in ženskami pri alkoholni jetrni cirozi. 23

35 3 MATERIALI IN METODE 3.1 VZOREC Analizirali smo rezultate meritev aktivnosti encimov AST, ALT v vzorcih seruma. Analiziran vzorec nehemoliziranega seruma je stabilen 3 dni pri sobni temperaturi in 7 dni pri 4 C. Vzorci so bili odvzeti v letu 2009 na Kliničnem inštitutu za klinično kemijo in biokemijo, Njegoševa 4/Ι Ljubljana. Obravnavali smo skupino 222 pacientov, ki so prišli na zdravniški pregled ter so jim bile odkrite povišane vrednosti jetrnih encimov. Podatke smo vnesli v Microsoft Office Excel in jih razdelili na 2 skupini oseb. Osebe z alkoholno jetrno cirozo ter osebe s kroničnim virusnim hepatitisom C in kroničnim hepatitisom B. 3.2 REAGENTI REAGENTI ZA DOLOČANJE AST R1.(posoda 1 in 1a) TRIS pufer: 100mmol/L. ph 7.8; L-aspartat:300 mmol/l, NADH (kvas): 0.23mmol/L; MDH (prašičja srce) 0,53 U/mL (8,83 μkat/l); LDH (mikroorganizmi) 0,75 U/mL (12,5 μkat/l); konzervans. Pri določanju AST z aktivacijo piridoksal fosfata pa R1 vsebuje še piridoksal fosfat 120μmol/L. R2. (posoda 2) α-ketoglutarat: 75 mmol/l; konzervans [18] REAGENTI ZA DOLOČANJE ALT R1.(posoda 1 in 1a) TRIS pufer: 125mmol/L, ph 7.3; L-alanin:625 mmol/l, NADH (kvas): 0.23mmol/L; LDH (mikroorganizmi) 0,15 U/mL (25,0 μkat/l); konzervans. Pri določanju ALT z aktivacijo piridoksal fosfata pa R1 vsebuje še piridoksal fosfat 120μmol/L. R2. (posoda 2) α-ketoglutarat: 94 mmol/l; konzervans [19]. 24

36 3.3 METODA K metodam določanja encimov prištevamo dvotočkovne metode in kinetične metode. Dvotočkovne so zastarele, manj zanesljive od aparature, lahko pa so celo pristranske, zato se jih ne poslužujemo v taki meri kot kinetičnih. Slednje temeljijo na spreminjanju maksimalne hitrosti encimske reakcije na časovno enoto (μkat/l; 1U/L = 0,01667 μkat/l). To metodo smo izbrali tudi pri analizi naših vzorcev [20] KINETIČNA METODA Za določanje encimov AST, ALT uporabljamo kinetično metodo. Ta je standardizirana iz strani IFCC -International Federation of Clin. Chemistry (Mednarodno združenje za klinično kemijo in laboratorijsko medicino). Metoda temelji na določanju maksimalne hitrosti encimske reakcije na časovno enoto in nam podaja signifikantne razlike v encimski aktivnosti ter podatke o stabilnosti encima. Na podlagi te metode izvajamo»in vitro«test za kvantitativno določanje encimov v serumu. Analize potekajo na Roche/Hitachi analizatorju, kjer encimi aminotransferaz katalizirajo prenos amino skupine iz molekule darovalca na prejemnika te molekule. Darovalec molekule je aminokislina, medtem ko je prejemnik navadno molekula alfa-2 keto kisline. Nastane glutamat ter alfa-ketoglutarat. Optični test izvajamo preko indikatorske reakcije, ki koristi absorpcijske lastnosti. V procesu reakcij se NADH oksidira v NAD + [20]. Z vdorom računalništva v znanost je tudi področje encimske kinetike dobilo nove razsežnosti. Največji dosežki so bili narejeni pri zajemanju in analizi kinetičnih podatkov, ki so omogočili popolnejšo izrabo aparatur za izvajanje, predvsem hitrih kinetičnih poskusov Namen»In vitro«test se uporablja za kvantitativno določanje alanin aminotransferaz in aspartat aminotransferaz v človeškem serumu ali plazmi. Test je namenjen tudi kot pomoč pri ocenjevanju poškodb jeter zaradi hepatitisa ali alkoholne ciroze jeter. Rezultate je treba interpretirati v povezavi z drugimi metodami in v skladu z standardnimi kliničnimi smernicami za upravljanje Princip Encima AST in ALT lahko določamo z ali brez aktivacije piridoksal fosfata. Zaradi tega pride do razlik pri samem principu določanja encimov. 25

37 AST IFCC brez aktivacije piridoksal fosfata α-ketoglutarat + L- aspatrat AST L-glutamat + oksalacatat AST je encim, ki katalizira reverzibilno reakcijo transaminacije med asparaginsko kislino in 2-oksoglutarno kislino. Ketokislina prehaja v aminokislino in na ta način pride do prepletanja metabolizma ogljikovih hidratov in dušikovih snovi. oksalacetat + NADH + H + MDH L-malat + NAD + Indikatotska reakcija je redukcija oksalacetata, ki jo katalizira malatna dehidrogenaza (MDH). Redukcija poteče ob prisotnosti NADH, ki oksidira v NAD +. Zmanjšanje fotometrično določenega NADH je proporcionalno povečanju nastajanja oksalacetata in s tem aktivnosti AST [18]. AST IFCC z aktivacijo piridoksal fosfata L- aspartat + piridoksal fosfat-encim kompleks oksalacetat + piridoksamin fosfat-encim kompleks α- ketoglutarat + piridiksamin fosfat-encim kompleks L-glutamat + piridoksal fosfat encim kompleks Piridoksal fosfat je koencim, ki prenese amino skupino iz ene aminokisline (aspartat) na drugo aminokislino (glutamat) preko ustreznih α ketokislin. Dodajanje piridoksal fosfata v reakcijo zagotavlja maksimalno katalitsko aktivnost encima, medtem ko dodatek α ketoglutarata povzroči sproščanje piridoksal fosfata in tako reaktivacijo transaminaznih reakcij. Povečanje oksalacetata se določi z indikatorsko reakcijo, ki jo katalizira malat dehidrogenaza. oksalacetat + NADH + H + MDH malat + NAD + Indikatoska reakcija je redukcija oksalacetata, ki jo katalizira malatna dehidrogenaza (MDH). Redukcija poteče ob prisotnosti NADH, ki oksidira v NAD +. Zmanjšanje fotometrično določenega NADH je proporcionalno povečanju nastajanja oksalacetata in s tem aktivnosti AST [18]. 26

38 ALT brez aktivacije piridoksal fosfata α-ketoglutarat + L-alanin ALT L- glutamat + piruvat AST je encim, ki katalizira reverzibilno reakcijo med alaninom in 2 oksoglutarno kislino. Ima važno vlogo v metabolizmu aminokislin, proteinov in ogljikovih hidratov. piruvat + NADH + H + LDH L- laktat + NAD + Indikatorska reakcija je redukcija piruvata do laktata, ki jo katalizira laktatna dehidrogenaza (LDH). Iztočasno se ekvivalentna količina NADH oksidira v NAD +. Zmanjšanje fotometrično določenega NADH je proporcionalno povečanju nastajanja oksalacetata in s tem aktivnosti AST [19]. ALT z aktivacijo piridoksal fosfata L- alanin + piridoksal fosfat encim kompleks piruvat + piridoksamin fosfat encim kompleks α- ketoglutarat + piridoksamin fosfat-encim kompleks L- glutamat + piridoksal fosfat encim kompleks Piridoksal fosfat je koencim, ki prenese amino skupino iz aminokisline (alanin) k ustrezni α keto kislini, α ketoglutarat (s čimer se pretvori v L glutaminsko kislino). Istočasno se alanin pretvori v piruvat. Dodajanje piridoksal fosfata zagotavlja maksimalno katalitično aktivnost, med tem ko dodajanje α ketoglutarata povzroči ponovno osvoboditev piridoksal fosfata in s tem reaktivira transminazno reakcijo. Povečanje piruvata se določi z indikatorsko reakcijo, ki jo katalizira laktat dihidrogenaza. piruvat + NADH + H + LDH L- laktat + NAD + NADH oksidira v NAD +. Zmanjšanje fotometrično določenega NADH je proporcionalno povečanju nastajanja oksalacetata in s tem aktivnosti AST [19]. 27

39 Natančnost Ponovljivost je bila določena z uporabo človeških vzorcev in kontrolnih vzorcev v notranjem protokolu (znotraj serije = 21, med serijo = 10) [18, 19]. AST AST IFCC brez aktivacije piridoksal fosfata Znotraj serije Med serijo Vzorec Vrednost CV Vrednost CV U/L μkat/l [%] U/L μkat/l [%] Človeški serum 58 0,97 1,8 58 0,97 13,2 Precitrol-N 32 0,53 2,1 32 0,53 3,2 Precitrol-A 124 2,07 1, ,07 1,8 AST IFCC z aktivacij piridoksal fosfata Znotraj serije Med serijo Vzorec Vrednost CV Vrednost CV U/L μkat/l [%] U/L μkat/l [%] Človeški serum 143 2,38 0, ,68 2,9 Precinorm U 81 1,35 4,0 74 1,23 3,4 Precipat U 174 2,90 0, ,68 1,9 ALT ALT IFCC brez aktivacije piridoksal fosfata Znotraj serije Med serijo Vzorec Vrednost CV Vrednost CV U/L μkat/l [%] U/L μkat/l [%] Človeški serum 42 0,70 1,6 42 0,70 4,4 Precinorm U 59 0,98 2,9 55 0,92 3,7 Precipat U 129 2,15 0, ,17 3,3 28

40 AST IFCC z aktivacijo piridoksal fosfata Znotraj serije Med serijo Vzorec Vrednost CV Vrednost CV U/L μkat/l [%] U/L μkat/l [%] Človeški serum 48 0,80 1,8 40 0,67 3,2 Precitrol-N 61 1,02 2,9 55 0,92 2,1 Precitrol-A 131 2,18 1, ,07 0, Analitična občutljivost Spodnja meja detekcije je za AST in ALT enaka in znaša 4 U/L (0,07 μkat/l). Meja detekcije predstavlja najnižjo izmerljivo vrednost različno od nič. Določi se jo kot standard SD [18, 19] Analitična specifičnost Metoda analitične specifičnosti pomeni, da je metoda specifična 100 ± 10 %. Študije so pokazale, da določene sestavine vplivajo na sam rezultat metode: Zlatenica: ne vpliva na rezultat meritev do I indeksa = 60 za konjugiran in nekonjugiran bilirubin (približna koncentracija konjugiranega in nekonjugiranega bilirubina znaša 60 mg/dl ali 1026 μmol/l) Lipemija: ne vpliva na rezultat meritev do L indeksa = 500. Lipemija lahko povzroči šibko absorpcijo, ki je posledica povečane absorbance. Hemoliza: ne vpliva na rezultate meritev pri AST encimih do vrednosti H indeksa=25 ( približna koncentracija hemoglobina znaša 25 mg/dl ali 16 μmol/l) ter pri ALT encimih do vrednosti H indeksa=60 ( približna koncentracija hemoglobina znaša 60 mg/dl ali 37 μmol/l) Hidroksikobalamin (vitamin B12a) pri terapevtskih ravneh povzroča znatno nizke rezultate. Izoniazid (hidrazid izonikotinske kisline, ki se uporablja kot tuberkulostatik): je vzrok nenormalno nizkih rezultatov AST, ALT encimov. V zelo redkih primerih gamopatije zlasti tipa IgM lahko pride do nezanesljivosti rezultata. Pri diagnosticiranju rezultatov moramo upoštevati bolnikovo anamnezo [18, 19]. 29

41 3.3.2 STATISTIČNA ANALIZA Statistika je znanost zbiranja, organiziranja in interpretacije numeričnih dejstev, ki jih imenujemo podatki. Pri statistični analizi smo uporabili deskriptivno statistiko, kjer smo izračunali standardni odklon in aritmetično sredino ter izračun t- testa Deskriptivna statistika Opisna ali deskriptivna statistika se ukvarja z zbiranjem in opisovanjem podatkov. Standardni odklon oz. standardna deviacija Standardni odklon je statistični kazalec, največkrat uporabljen za merjenje statistične razpršenosti enot. Z njim je moč izmeriti, kako razpršene so vrednosti, vsebovane v populaciji. Definiran je tudi kot pozitivni kvadratni koren variance. ² 1 Enačba 1: Enačba za izračun standardnega odklona Aritmetična sredina Izračunamo jo kot povprečje vrednosti spremenljivke na vzorcu ali populaciji. Enačba 2: Enačba za izračun aritmetične sredine T-test S pomočjo t-testa smo primerjali srednji vrednosti razmerja AST/ALT encimov med hepatitisom in alkoholno jetrno cirozo, ter med spoloma pri jetrni cirozi. Ugotavljali smo, ali so razlike naključne (velja ničelna hipoteza, H 0 ) ali statistično dokazane (velja alternativna hipoteza, H 1 ). Zaradi različnega števila meritev in različne variance skupin smo za izračun uporabili naslednje enačbe. 30

42 = povprečno sipanje dveh vzorcev SD 1,2 = standardni odklon N 1,2 = število meritev Enačba 3: Enačba za izračun povprečnega sipanja dveh vzorcev = povprečno sipanje dveh vzorcev 1,2 = povprečna vrednost N 1,2 = število meritev Enačba 4: Enačba za izračun spremenljivke t 1 1 Enačba 5: Enačba za izračun stopnje prostosti Izračunane t vrednosti smo primerjali s tabelarnimi vrednostmi (95% verjetnost). ; 5 % ničelna hipoteza (H 0 ) 31

43 4 EKSPERIMENTALNI DEL 4.1 POSTOPEK DELA Za zbiranje in pripravo vzorcev uporabljamo posebne epruvete ali zbiralne zabojčke. Le vzorci seruma, plazme (Heparin ali EDTA plazma), so preizkušeni ter imajo ugotovljene spremenljivke. Če serum/plazma vsebuje strdke ali celice jih je potrebno ločiti od seruma/plazme v roku 8 ur pri sobni temperaturi oz. 48 urah pri 2 8 C. Tipi navedenih vzorcev, so bili testirani z epruvetami, ki so bile dostopne na trgu v času preizkušanja, kar pomeni, da lahko nekatere epruvete drugih proizvajalcev vsebujejo različne materiale, ki bi lahko v nekaterih primerih vplivali na rezultate testov. Pri procesiranju vzorcev v primarnih epruvetah (za odvzemanje vzorcev) je potrebno upoštevati navodila proizvajalcev. Vzorce, ki vsebujejo usedlino je potrebno pred izvedbo testa centrifugirati. Stabilnost: 24 ur na C 7 dni na C (z P-5-P aktivacijo) 7 dni na 2 8 C Določanje brez aktivacije piridoksal fosfata: Če serum/plazma vsebuje strdke ali celice jih je potrebno ločiti od seruma/plazme v roku 8 ur pri sobni temperaturi oz. 48 urah pri 2 8 C [18, 19]. Pravilno pripravljene vzorce prenesemo iz Sprejema biološkega materiala v Encimski laboratorij. Tam sledi triažiranje vzorcev. To je prvi segment laboratorija. Vsak vzorec je označen s črtno kodo, ki jo presvetlimo in na osnovi parametrov, ki nam jih izpiše računalnik ugotovimo katera je zahtevana preiskava za posamezen vzorec. Sledi priprava računalnika na samo analizo in na novo serijo vzorcev. Nato preverimo analizator, če je očiščen in če so bili odstranjeni vsi stari vzorci. Vstavimo reagente in kontrolni material. Za kontrolo kakovosti se uporabljajo kontrolni materiali kot so: Kalibrator: C.f.a.s. (Calibrator for avtomated system), Cat. No , Kontrole: precinorm U, e.g. Cat. No Precinorm U plus, Cat. No , ; Precipath U, e.g. Cat. No , Precipath U, plus, Cat. No , ,9 % NaCl splošna laboratorijska oprema [18,19]. 32

44 Vsak laboratorij ima prilagojene kontrolne intervale in meje zaznave glede na individualne zahteve laboratorija. Pridobljene vrednosti se morajo nahajati znotraj določenih meja. V primeru, da se vrednosti nahajajo zunaj meja, mora laboratorij sprejeti in vzpostaviti korektivne ukrepe. Sledi pravilno vstavljanje vzorcev v analizator in zagon analizatorja. Ta samodejno opravi vse analize in izda izvid s pomočjo tiskalnika. Optimalni pogoji določanja AST Optimalni pogoji določanja ALT Temperatura 37 C Temperatura 37 C TRIS HMAM 80 mmol/l TRIS HMAM 100 mmol/l P-P 0,10 mmol/l P-P 0,10 mmol/l L- aspartat 240 mmol/l L- alanin 500 mmol/l NADH 0,18 mmol/l NADH 0,18 mmol/l MDH 7,0 μkat/l LDH 20,0 μkat/l ph 7,8 ph 7,5 Vzorec 50 μl Vzorec 50 μl Delavna raztopina 500 μl delavna raztopina 500 μl Λ 334 nm Λ 334 nm ΣNADH 6180 L/molcm ΣNADH 6180 L/molcm Analizator Roche/Hitachi 917 Analizator Roche/Hitachi 917 je v celoti avtomatiziran, diskreten računalniški sistem, ki omogoča prožno in učinkovito delovanje 24 ur na dan. Analizator opravlja široko paleto analiz na vzorcih seruma, urina, plazme in cerebrospinalne tekočine. Gre za»in vitro«test, ki temelji na kvantitativnem in kvalitativnem določanju sestave vzorca. Slika 3: Analizator Roche/Hitachi 917 Analizator Roche/Hitachi 917 je sestavljen iz dveh enot: analitične enote in upravljalne enote. Analitična enota sestoji iz ISE sistema (Ilmenauer Systemeinrichtungen) fotometričnega merilnega sistema in CPU- centralno procesnih enot [21]. 33

45 5 REZULTATI IN RAZPRAVA Jetra so vzdržljiv organ, ki deluje s približno tretjino svoje zmogljivosti. Različni dejavniki so vzrok za številne jetrne bolezni kot so ciroza jeter, tumor jeter, ciste na jetrih, vnetje jeter, hepatitis, povečana jetra in zamaščena jetra. Za te bolezni je značilno, da se pokažejo zelo pozno, ker so jetra organ brez živcev, ki bi prevajali bolečino. Pokazatelji prisotnosti bolezni jeter so v primeru zvišanja jetrni encimi, ki pomagajo pospešiti kemijske reakcije v jetrih. V diplomski nalogi smo želeli primerjati določitev jetrnih encimov AST in ALT pri bolnikih s hepatitisom in alkoholno cirozo jeter. Pri interpretaciji rezultatov imamo težave zaradi manjše specifičnosti teh dveh določitev, zato smo uporabili izračun razmerja teh dveh encimov. Skušali smo ugotoviti kolikšna je diagnostična občutljivost uporabljenega izračuna. Na Kliničnem inštitutu za klinično kemijo in biokemijo, Njegoševa 4/Ι Ljubljana je bilo v obdobju od do odkritih 222 oseb obolelih za alkoholno jetrno cirozo in hepatitisom. 198 oseb z alkoholno jetrno cirozo in 12 oseb s hepatitisom. Zaradi večjega števila vzorcev pri alkoholni cirozi smo imeli možnost osebe ločiti po spolu. 146 moških in 52 ženskih vzorcev. Pod primere oseb okuženih s hepatitisom spadajo osebe s hepatitisom B in osebe s hepatitisom C. Iz naših podatkov lahko upravičeno sklepamo, da je delež obolelih za alkoholno jetrno cirozo v letu 2009 večji od deleža okuženih z virusnim hepatitisom B in C. Razvidno je, da je število moških z alkoholno jetrno cirozo skoraj 3-krat večje kot pri ženskah. Pri primerjavi določanja jetrnih aminotransferaz smo se opirali na izračune razmerja AST/ALT encimov. Znotraj posameznih skupin smo rezultate meritev katalitične koncentracije encimov AST, ALT najprej statistično uredili. Izračunali smo povprečno starost preiskovancev, aritmetično sredino vrednosti za AST in ALT encime, aritmetično sredino razmerja AST/ALT encimov, odstotek pacientov, ki odstopajo od zgornje meje AST, ALT encimov in kolikšen je presežek preiskovancev. Mejne vrednosti, ki veljajo na Kliničnem inštitutu za klinično kemijo in biokemijo so za AST= 0,52 μkat/l ter za ALT= 0,56 μkat/l. Vrednosti so enake za moške in ženske. Tabele z rezultati meritev določanja katalitične koncentracije AST, ALT encimov za moške in ženske za alkoholno jetrno cirozo ter za hepatitis se nahajajo v prilogi št.,1 prilogi št. 2 in prilogi št

46 5.1 REZULTATI MERITEV DOLOČANJA KATALITIČNE KONCENTRACIJE AST, ALT ENCIMOV PRI ALKOHOLNI JETRNI CIROZI Preglednica 3: Serumske koncentracije AST, ALT encimov pri alkoholni cirozi za moške Bolezen Alkoholna ciroza jeter Št. primerov 146 Povprečna starost 61,4 Povprečni AST [μkat/l] 1,74 Povprečni ALT [μkat/l] 0,93 Povprečje AST/ALT [μkat/l] 2,03 Odstotek primerov nad 0,52 μkat/l [%] 85,6 Za koliko presegajo 0,52 μkat/l [%] 278,3 Odstotek primerov nad 0,56 μkat/l [%] 44,5 Za koliko presegajo 0,56 μkat/l [%] 122,3 Moški z alkoholno cirozo jeter so imeli blago zvečano srednjo vrednost AST encimov 1,74 μkat/l ter blago zvečano srednjo vrednost ALT encimov 0,93 μkat/l. Aritmetična sredina razmerja AST/ALT encimov je 2,03 μkat/l. V skupini moških bolnikov je povprečni odstotek primerov, ki presegajo zgornjo mejo 0,52 μkat/l 85,6 %. Presegajo za 278,3 %. Pri bolnikih s povišanimi vrednostmi ALT encimov je povprečen odstotek tistih, ki presegajo zgornjo mejo 0,56 μkat/l nekoliko nižji in sicer 44,5 %.Vrednosti presegajo zgornjo mejo za 122,3%. Preglednica 4: Serumske koncentracije AST, ALT encimov pri alkoholni cirozi za ženske Bolezen Alkoholna ciroza jeter Št. primerov 52 Povprečna starost 63 Povprečni AST [μkat/l] 1,47 Povprečni ALT [μkat/l] 0,69 Povprečje AST/ALT [μkat/l] 2,38 Odstotek primerov nad 0,52 μkat/l [%] 88,2 Za koliko presegajo 0,52 μkat/l [%] 305,4 Odstotek primerov nad 0,56 μkat/l [%] 41,2 Za koliko presegajo 0,56 μkat/l [%] 195,63 35

47 Primerjava določanja encimov aspartat aminotransferazee (AST) in alaninn aminotransferaze (ALT) pri hepatitisu in alkoholni cirozi jeter Ženske vrednosti so v primerjavi z moškimi nižje. Aritmetična sredina vrednosti AST encimov znaša 1,47 μkat/l, medtem ko je aritmetična sredina vrednosti ALT encimov 0,69 μkat/l. Srednja vrednost razmerja AST/ALT je za 0,35 μkat/ll večje od razmerja pri moških in znašaa 2,38 μkat/l. V skupini ženskih bolnic s povišanimii vrednostmi AST encimov je povprečni odstotek tistih, ki presegajo zgornjo mejo 0,52 μkat/ /L 88,2 %. Presegajo za 305,4 %. Pri bolnicah s povišanimii vrednostmi ALT jih 44,5 % presega 0,56 μkat/l. Presežek znaša 122,3 %. 3,0 2,5 2,0 [μkat/l] 1,5 1,0 Moški Ženske 0,5 0,0 AST ALT AST/ALT Slika 4: Grafični prikaz primerjave aritmetičnih sredin aktivnosti encimov AST in ALT ter razmerja AST/ALT za moške in ženske pri alkoholni cirozi jeter [%] Odstotek primerov nad 0,52μkat/L Odstotek primerov nad 0,56μkat/ /L (AST) (ALT) Moški Ženske Slika 5: Grafični prikaz odstotka primerov nad zgornjo mejo za AST in ALT encime pri alkoholni cirozi jeter za moške in ženske 36

48 Primerjava določanja encimov aspartat aminotransferazee (AST) in alaninn aminotransferaze (ALT) pri hepatitisu in alkoholni cirozi jeter [%] Moški Ženske Presežek 0, 52μkat/L (AST) Presežek 0,56μkat/L (ALT) Slika 6: Grafični prikaz presežka zgornje meje za AST in ALT encime pri alkoholni cirozi jeter za moške in ženske Izračuni t-testa: X 1, X 2 SD N Moški 2,03 1, Ženske 2,38 1,32 52 T 1,71 ; t t (S = 95%, ν =13) = 2,16 ničelna hipoteza (H 0 ) t=1,71 Pri iskanju razlik v aritmetičnih sredinah razmerja AST/ALT med moškoo in žensko obolelo populacijo smo uporabili izračuna t-testa. Ker je izračunana t vrednost nižja od tabelarne vrednosti t-testa, lahko zaključimo, da gre zgolj za slučajno in ne za statistično razliko (ničelna hipoteza). To pomeni, da je razlika med moškimi preiskovanci obolelimi za jetrno cirozo in skupino ženskih preiskovank naključna. Ker je nesmiselno reči, da smo ničelno hipotezo obdržali s 5% tveganjem lahko povemo, da o osnovnih razlikah med množicami ne moremo trditii ničesar. Zaključimo lahko, da za razliko 37

49 razmerja AST/ALT encimov med alkoholno jetrno cirozo in hepatitisom ne moremo trditi ničesar. Problem bi rešili z večjim številom preiskovancev, saj bi tako dobili zanesljivejše rezultate in bi lahko bolje predstavili populacijo. Omeniti moramo, da skupini glede na število primerov nista primerljivi med seboj. Moških obolelih za cirozo je skoraj 3-krat več kot žensk. V obeh primerih je razmerje encimov AST/ALT >2, kar je diagnostične vrednosti. Alkoholna okvara namreč povzroči pomanjkanje piridoksin-5-fosfata, ki je pomemben koencim reakcij transaminacij. Prihaja do močnih poškodb hepatocitov, kar lahko privede do nekroze [6]. Že dokazano razmerje AST/ALT>1, ki kaže na alkoholno bolezen jeter v našem primeru lahko potrdimo. Preglednica 5: Serumske koncentracije AST, ALT encimov pri alkoholni cirozi za moške in ženske skupaj Bolezen Alkoholna ciroza jeter Št. primerov 198 Povprečna starost 62 Povprečni AST [μkat/l] 1,67 Povprečni ALT [μkat/l] 0,87 Povprečje AST/ALT [μkat/l] 2,12 Odstotek primerov nad 0,52 μkat/l [%] 85,9 Za koliko presegajo 0,52 μkat/l [%] 260,89 Odstotek primerov nad 0,56 μkat/l [%] 43,7 Za koliko presegajo 0,56 μkat/l [%] 118,7 Pri alkoholni cirozi jeter je bilo v raziskavo vključenih 198 oseb s povprečno starostjo 62 let. Aritmetična sredina vrednosti AST encimov znaša 1,67 μkat/l, medtem ko je srednja vrednost ALT encimov 0,87 μkat/l. Aritmetična sredina AST/ALT encimov je 2,12 μkat/l. Iz teh podatkov vidimo, da srednja vrednost AST in ALT encimov, presegata pričakovane vrednosti. Aritmetična sredina vrednosti AST encima je večja od ALT encima, kar nakazuje na alkoholno jetrno cirozo. Pri zdravem človeku so vrednosti ALT višje od vrednosti AST in s tem velja, da je tudi razmerje ALT/AST > 1. Obratno razmerje značilno za cirozo jeter pomeni, da postane vrednost AST večja od vrednosti ALT in tako je razmerje AST/ALT > 1 ali ALT/AST <1 [22]. 38

50 Primerjava določanja encimov aspartat aminotransferazee (AST) in alaninn aminotransferaze (ALT) pri hepatitisu in alkoholni cirozi jeter V skupini bolnikov s povišanimi vrednostmi AST encimov je povprečni odstotek tistih, ki presegajo zgornjo mejo 0,52 μkat/l 85,9 %. Presežek znaša 260,89 %. Pri bolnikih s povišanimi vrednostmi ALT encimov je odstotek tistih, ki presegajo zgornjo mejo 0,56 μkat/l nekolikoo nižji in sicer 43,7 %. Vrednosti presegajo zgornjo mejo za 118,7 %. 2,5 2,0 [μkat/l] 1,5 1,0 0,5 0,0 AST ALT AST/ /ALT Slika 7: Grafični prikaz primerjave skupnih (moški in ženske) aritmetičnih sredin aktivnosti encimov AST in ALT ter razmerja AST/ /ALT pri alkoholni cirozi jeter Slika 8: Grafični prikaz odstotka primerov nad zgornjo mejo za AST in ALT encime pri alkoholni cirozi jeter za moške in ženskee skupaj 39

51 Primerjava določanja encimov aspartat aminotransferazee (AST) in alaninn aminotransferaze (ALT) pri hepatitisu in alkoholni cirozi jeter Slika 9: Grafični prikaz presežka zgornjih mej za AST in ALT encime pri alkoholni cirozi jeter za moške in ženske skupaj 40

52 5.2 REZULTATI MERITEV DOLOČANJA KATALITIČNE KONCENTRACIJE AST, ALT ENCIMOV PRI HEPATITISU Preglednica 6: Serumske koncentracije AST, ALT encimov pri hepatitisu B in hepatitisu C Bolezen Hepatitis B, hepatitis C Št. primerov 12 Povprečna starost 55 Povprečni AST [μkat/l] 1,99 Povprečni ALT [μkat/l] 0,90 Povprečje AST/ALT [μkat/l] 1,91 Odstotek primerov nad 0,52 μkat/l [%] 66,7 Za koliko presegajo 0,52 μkat/l [%] 438,46 Odstotek primerov nad 0,56 μkat/l [%] 58,3 Za koliko presegajo 0,56 μkat/l [%] 127,81 Pri hepatitisu smo dobili naslednje rezultate. Povprečna starost 12 bolnikov s hepatitisom, ki smo jih vključili v preiskavo je 55 let. Aritmetična sredina vrednosti AST encimov je 1,99 μkat/l in presega normalno vrednost 0,52 μkat/l skoraj za 4-krat. Govorimo o blagem zvišanje AST encima. Aritmetična sredina vrednosti ALT encimov znaša 0,90 μkat/l. Opazimo povečani aktivnosti AST in ALT encimov v krvi. Za hepatitis B in hepatitis C velja, da serumske aminotransferaze kažejo različno dinamiko. ALT lahko hitro poraste in nato tudi hitro pade, celo do normalne vrednosti, ali pa ostane povišan cel čas bolezni [3]. Pri hepatitisu B, C sta povišana AST in ALT, ALT močneje [3]. Za infekcijski hepatitis velja razmerje AST/ALT<1. Naši rezultati kažejo ravno nasprotno, močneje povišan AST ter posledično povišano aritmetično sredino razmeja AST/ALT, ki znaša 1,91 μkat/l. V skupini bolnikov s povišanimi vrednostmi AST encimov je povprečni odstotek tistih, ki presegajo zgornjo mejo 0,52 μkat/l 66,7 %. Presegajo za 446,83 %. Pri bolnikih s povišanimi vrednostmi ALT encimov je povprečen odstotek tistih, ki presegajo zgornjo mejo 0,56 μkat/l nekoliko nižji in znaša 58,3 %.Vrednosti presegajo zgornjo mejo za 127,81 %. Glede na velika odstopanja naših rezultatov od pričakovanih, se lahko sklicujemo na relativno majhno populacijo obolelih za hepatitisom B in hepatitisom C. Nepoznani so nam podatki o bolnikovem predhodnem stanju, o tem, kateri pregled je bolnik opravil. Iz naših rezultatov torej ne moremo sklepati na značilnost populacije. 41

53 Primerjava določanja encimov aspartat aminotransferazee (AST) in alaninn aminotransferaze (ALT) pri hepatitisu in alkoholni cirozi jeter Slika 10: Grafičnii prikaz primerjave aritmetičnih sredin aktivnosti encimov AST in ALT ter razmerja AST/ALT pri hepatitisu B,C Slika 11: Grafični prikaz odstotka primerov nad zgornjo mejo za AST in ALT encime pri hepatitisu B,,C Slika 12: Grafični prikaz presežka zgornjih mej za AST in ALT encime pri hepatitisu B,C 42

54 Primerjava določanja encimov aspartat aminotransferazee (AST) in alaninn aminotransferaze (ALT) pri hepatitisu in alkoholni cirozi jeter 5.3 PRIMERJAVAA REZULTATOV MERITEV DOLOČAN NJA KATALITIČNE KONCENTRACIJE AST, ALT ENCIMOV PRI ALKOHO LNI JETRNI CIROZI IN HEPATITISU Slika 13: Grafičnii prikaz primerjave aritmetičnih sredin aktivnosti encimov AST in ALT ter razmerja AST/ /ALT med alkoholno jetrno cirozoo in hepatitisom Slika 14: Grafični prikaz odstotka primerov nad zgornjo mejo za AST in ALT encime pri alkoholni jetrni cirozi in hepatitisu Slika 15: Grafični prikaz presežka zgornjih mej za AST in ALT encime pri alkoholni jetrni cirozi in hepatitisu 43