notch1 hes1 MKN-45 مقدمه اردبيل ايران (Ph.D) Notch MTT RT-PCR ATRA ATRA

Transcript

1 7931 تابستان 06( )پياپی 4 شماره 71 جلد كومش- نازيال يل ع (Ph.D) صالحي حسين (M.Sc) پاسندي شريفي مرضيه (Ph.D) اماني مجتبي (M.D) شکري سميرا (M.Sc) نياپور 3 (Ph.D) * نياپور يا سلوله و شناسي جنين تحقيقاني آزمايشگاه 1- ايران اردبيل ايران اردبيل اردبيل پزشکي علوم دانشگاه دانشجويي تحقيقات کميته 2- ايران اردبيل اردبيل پزشکي علوم دانشگاه پزشکي دانشکده بيوشيمي گروه 3- ايران اصفهان اصفهان پزشکي علوم دانشگاه پزشکي دانشکده تشريحي علوم گروه 4- اردبيکل پزشککي علکوم دانشکگاه پزشککي دانشکده پاتولوژي و تشريحي علوم گروه بنيادي چكيده APL MTT G1 RT-PCR MTT RT-PCR µm 10 G1 مقدمه داشتن خاطر به و هستند A ويتامين مشتقات از رتينوئيدها a.niapour@arums.ac.ir تلفن: مسئول نويسنده * دريافت: تاريخ 1394/12/3 پذيرش: تاريخ 1394/7/4

2 اثرات اسيد رتينوئيک تمام ترانس بر القا آپوپتوز عملکرد مهم در تنظيم تمايز و تکثير سلولي اهميت ويژهاي در درمان و پيشگيري از سکرطان دارنکدا از ميکان آنکالو هکاي طبيعککي رتينوئيکک دها اسکک يد رتينوئيککک تمکک ام تکک رانس نازيال نياپور و همکاران (All-trans retinoic acid :) حيا يت بکه عنکوان ي کک فکاکتور در تعديل تکثير تمکايز بلکو و آپوپتکوز سکلولهکا و همچنين به عنوان مورفوژن در روند تکوين جنکين محسکو ميشود ] 1 2 [ا اثکرات خکود را از طريکق اتصکال بکه رسکتتورهاي اسکيد رتينوئي کک (Retinoic acid receptor: RAR) و رسکتتورهاي X اسکيد رتينوئي کک (Retinoic X receptor: RXR) اعمال ميکند ] 3 [ا از ديدگاه باليني بکه دليکل توانک ايي در القکاي تمک ايز پروميولوسک يتهک ا بک ه گرانولوسيتها اولين بار در سال 1997 به عنوان ي کک هکد دارويکککي در درمکککان لوسکککمي پروميوليتيکککک حکککاد (Acute promyeloid leukemia: APL) بهککار بکرده شکد و بعدها به عنکوان اولکين عامکل القاکننکدهي تمکايزي مکوثر در گرديد ] 4 [ا توانايي بافته يا بنيادي سرطان در حوزهي تمکايز درمکاني اسکتفاده در القا تمايز و جلوگيري از تکثير بنيادي سکرطاني در چنکدين نکو از سکرطانهکاي جامد مثل تيروئيد پوست پروستات پستان و گردن رحم به اثبات رسيده است ] 1 [ا مطالعکات محققکان نشکان داده است که بکا توفکس سکيکل سکلولي در فکاز و G 0 /G 1 کاهش بيان factor) VEGF (Vascular endothelial growth تکثير سکرطاني معکده ردهي سکلولي BGC-823 را مهار ميکند ] 5 [ا سرطان معده چهارمين سرطان شايع و دومين علت مر ع يل و ميرهاي مرتبط با سرطان در جهان ميباشد ] 6 [ا رغم پيشرفت در تکنولوژيه يا شيميدرماني پاي ني حيات جراحي و توسعهي مکواد بيماران مبتال به سرطان پيشرفتهي معکده بوده و بقاي پنج ساله کمتر از بيست درصکد دارنکد ] 7 [ا بنابراين درک بهتر از مکانيسکمهکا و ت ييکرات مولککولي طکي بيماريزايي سرطان معده از نقطه نظر درماني به منظور طراحي و بهکار بردن مواد موثر بر مسيرهاي چندگانهي پيامرساني در بيولکوژي سکرطان حکائز اهمي تک پيامرساني مهم مسير پيامرساني اسکتا يککي از مسکيرهاي است که در طي روند تکوين فعال بوده و نقش حيا يت را در بسکياري از فراينکدهاي درون سلولي شامل آپوپتوز تکثير و تمکايز سکلولي دارد ] 9 [ا در پستانداران چهار نو گيرنده ناچ و پنج ليگاند شامل دو ليگاند از خانوادهي (1-4) Jagged1-2 و سکه ليگاند از خانوادهي شبه دلتا DLL4) (DLL1, DLL3, وجکود داردا اتصال رستتورها به ليگاندهاي اختصاصي سکب انداختن يک سري از واکنشه يا پروتئوليتي کک آخکرين بکرش از طريکق کمکتلکس آنزيمکي بکه راه مکيشکود ککه γ-secretase ميانجيگري ميشودا پيامد مجمو واکنشهکاي پروتئوليتيکک رهاسازي فسمت داخل سلولي تحکت عنکوان NICD ( Extracellular Domain) NICD وارد هسته شکده و بکا اتصکال بکه به سيتوپالسم ميشودا CSL (CBF1, Lag-1 )Suppressor of Hairless, بيان خکانوادهي ژنه يا Hes1, 3,5 (hairy enhancer of split) هد شامل Hey و (Hes-related) را فعال و تنظيم ميکند ] 10 9 [ا به اين ترتيک مسير پيامرساني موج مهار تمايز و حفک و تکثيکر ژن هد براي مسير را در حف روده تعي ني ] [ا رستتور مسير پيامرساني است که بنيادي و پروژنيتور ميشکود ] 10 [ا ژن سيگنالينگ Hes1 1 ي کک است و نقش مهمکي بنيادي عصبي سکلولهکاي پکيشسکاز سرنوشت سلولها و آپوپتوز آنهکا ايفکا مکيکنکد 1 و 1-3 نيز يکي از مهمترين رسکتتورها در استا برخکي شکواهد حکاکي از ايکن Hes1 ميشکوند ] 10 7 [ا در دسکتگاه گکوارش در موکوس معدهي انسکان بيکان 1 بکه همکراه افزايش بيان ژن Hes1 در کنترل تعداد و سرنوشت بنيادي روده نقش داردا همچنکين مطالعکات اخيکر نشکان داده است که رستتورهاي برخي سرطانها ايفا ميکنندا مسکير و ليگاندهايش نقش مهمکي را در سکيگنالينگ بکا 1 رشد تهاجم و متاستاز سکرطان معکده ارتبکاا دارد ] [ا Hes1 و 1 بيان با تکثير سرطاني و ر زايي سرطان مرتبط است به طوري که محققان در مطالعهاي اثبکات کردند بيان ژنه يا سرطان و 1 Hes1 CSCs( )Cancer stem cells; بسيار در سکلولهکاي بنيکادي باالسکت و بيکان

3 1395 کومش جلد 17 شماره 4 )پياپي 60( تابستان 1 است ] 7 [ا پاي ني در با بيان باالي رستتور سرطاني نسبت به بافت نرمال بيشتکر بودن ميزان بقاي بيماران مبتال به سرطان معده و ليگاند -1 Jagged-1 نسبت بکه بيماران منفي از نظر بيان اين رستتور و ليگاند نشان ميدهد که احتمکاال و -1 Jagged-1 بکه عنکوان مارکرهکاي بکارز تشخيصي در سرطان معده محسو شده و ميتوانند به عنکوان اهدا درماني منحصر به فرد در درمان اين نو سرطان به کار روند ] 13 [ا لذا شيوهه يا پيامرساني درمان سرطانه يا درمکاني متعکددي بکه منظکور مهکار و جلوگيري از پيشرفت سرطان در حوزهي مختلس بهکار رفته استا کاربرد داروهکاي مهارکنندهي گاما سککرتاز بکه عنکوان داروي شکيميدرمکاني متداولترين شيوه درمان براي مهار فعاليت مسير پيکامرسکاني در چند سال اخير بوده استا اما به خکاطر عکوار جانبي و مقاومت دارويي مشاهده شده روشهکاي ديگکري از جمله استفاده از ترکيبات موثر در تمايز درمکاني جهکت مهکار مسير پيشنهاد شدهاند ] 14 [ا برخي شواهد حاکي اسکت از آن است ککه بيکان ککاهش APL را در Jagged1 ميدهد ] 15 [ا با توجه به اثر مهکارکننکدگي در رونکد تکثير سلولي در ردهه يا مختلس اثر آن بر کاهش بيکان ليگانکد مسکير پيکامرسکاني APL در مطالعهي حاضر به بررسي اثر رتينوئي کک حيات سرطاني بکه ويکژه در اسکيد بکر سلولي روند ت ييرات چرخه سکلولي و القکا آپوپتکوز و همچنين ت ييرات بيان ژنه يا سرطاني معده رده سلولي مواد و روشها,. در آزمايشگاه جنينشناسي و در سکلولهکاي پرداخته شده استا کليهي مراحل آزمايش بنيادي و آزمايشکگاه بيولوژي سلولي و مولکولي وافع در دانشکده پزشکي دانشکگاه علوم پزشکي اردبيل صورت گرفتا در ايکن بررسکي از ردهي سلولي سرطان معده استفاده شدا اين ردهي سلولي از بانک سلولي انستيتوپاستور ايران به صکورت ويکال منجمکد شده خريکداري گرديکد و پکس از وو در فالسکک حکاوي محکککيط کشکککت DMEM بکککا مقکککدار گلکککوکز بکککاال (Gibco: ) سککرم جنککين گککاوي %10 Gibco:10270) آنتکيبيوتي کک درصکد ي کک (FBS; (Pen/strep; گلوتامکس( Gibco: ) ( Gibco: و در انکوباتور شرکت Memmert آلمان در دمکاي C 37 و فشکار دياکسيدکربن %5 نگهداري و کشت شدندا MTT جهکت بررسکي اثکر سميت اسيد رتينوئيک تمام ترانس بر ميزان بقاي سکلولهکاي سکرطان معکده ردهي از تکني کک MTT (3-(4,5- dimethlthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide) اسکتفاده شکده اسکتا سکنجشMTT روش ي کک رنگسنجي و بر پايه تبديل نمک زرد رنگ تترازوليکوم MTT به محصول فورامازان بنفش رنگ توسکط آنکزيم سوکسکينات دهيدروژناز ميزان ميتوکندريايي ميباشدا ايکن تبکديل فقکط توسکط زنده انجام ميشود و ميزان فورامازان توليد شده بکا زنده رابطه مسکتقيم داردا بکه طکور خالصکه سلول درون هر چاهک ظرو کشت 96 خانه پلي تک شدندا پس از گذشت 24 ساعت از انکوباسيون سکلولهکا بکا غلظککککتهکککک اي مختلککککس از اسککککيد رتينوئيکککک ک و 25 ميکروموالر( 2/5((Sigma: R2625) تيمار شدندا 49 ساعت بعکد از مواجهکه بکا اسکيد رتينوئيکک تعکويض محکيط صکورت گرفکتا در نهايکت در روز پکنجم انکوباسيون 190μ L از محيط کشت همراه با 20 μl محلول MTT (Sigma: M2128) که با غلظت 5 تهيکه شکده mg/ml بود به هر چاهک اضافه شد و به مدت 4 ساعت در انکوباتور نگهداري شدا پس از اتمکام زمکان انکوباسکيون مکايع رويکي برداشکته شکد و 200μL حکالل متوفکسکننکدهي ديمتيکل سولفوکسايد K ) (DMSO; Merck: چاهک اضافه گرديدا سنجش MTT در طول مکو بکه درون هکر 570 nm به روش استکترومتري BioTek) (Synergy HT, انجکام شکد ] [ا اطالعکات الزم در مورد تکثير سلولها را ميتوان از توزيع سلولهکا در مراحکل

4 اثرات اسيد رتينوئيک تمام ترانس بر القا آپوپتوز مختلس چرخهي سلولي بهدست آوردا در جمعيته يا سکلولي که به طور فعال در حال تقسيم هستند کسر بزرگي از سلولها در فکاز نازيال نياپور و همکاران (Synthesis) S هسکتندا در حکالي ککه جمعيتکي از سلولها که بهصورت فعال تزايد نميکنند درصد فابل توجهي از سکلولهکا در فکاز ) 0 G 1 /G 0 (Gap 1 /Gap هسکتندا جمعي تک فاز سلولي دچار آپوپتوز نيز داراي DNA فطعه فطعه هستند که در Sub-G1 فرار ميگيرنکد ] 19 [ا بکه منظکور بررسکي کمکي محتواي DNA سلولها و توزيکع چرخکهي سکلولي در گکروه تيمار و جمعيت سلولي گکروه شکاهد از آنکاليز فلوسکيتومتري استفاده شدا بدين منظور سلول تحت تيمار با غلظت از 10µM تيمار فرار گرفتا پس از ستري شدن مدت زمان سلولها تريتسينه و جدا شدند و به مکدت ده دفيقکه بکا سرعت 1900 دور در دفيقه (rpm) سکانتريفوژ شکدندا سکتس سکلولهکا بکا (Phosphate buffer saline) PBS - مجدد سانتريفوژ شدندا به منظور فيکساسيون سلولي شستشکو و 4 از ml اتانول %70 به آرامي به سلولها اضافه گرديد و در دماي 4 C به مدت 4 ساعت نگهداري شدندا ستس سکلولهکاي فکيکس شده در دماي C 4 به مدت 5 دفيقه و با دور 3000 در دفيقکه سانتريفوژ Germany) (Sigma 3-30K, شدند و بار ديگر بکا - PBSشستشو داده شدندا در مرحلهي آخر هسته سلولها بکا محلککول carboxamidinesigma:d8417) 10 µg/ml, Triton X % in PBS) با منافذ 30 µm به لولهه يا شدندا با استفاده از يک رنگآميزي شدند و پس از عبور از فيلترهايي مخصوص فلوسکيتومتري منتقکل فلوسيتومتر space, (Partec CyFlow Germany) فازه يا بررسي سلولها انجام شکدا توزيکع سکلولهکا در مختلس چرخه سلولي به وسکيلهي نکرمافکزار Partec FlowMaxآناليز شد ] 19 [ا کاستازها از خانوادهي سيستئين پروتئازهکا هسکتند و نقکش اساسکي در آپوپتوز پستانداران ايفا مکيکننکدا کي تک DAPI(2-(4-amidinophenyl)-1H -indole-6- Caspase- Glo 3/7 kit (Promega: G8090) اندازهگيري فعاليت کاستازهاي 3 و 7 بر مبناي طي سک يککک روش بککراي سکنجي لومينسانس ميباشد و حکاوي بکافر ليکزکننکدهي سکلولهکاي پستانداران در شرايط کشکت و ي کک سوبسکتراي فلوئورسکنت بککراي آسککتارتيک اسککيد اسککتا ميککزان نشککر لومينسککانس نشاندهندهي ميزان فعاليت کاستاز 3 و 7 در گکروه کنترل و گروه تيمار است ] 17 [ا بکه منظکور اجکراي سکنجش تعداد سرطاني در هکر چاهکک از ظکرو کشت 6 خانکه فکرار داده شکدا پکس از گذشکت 24 سکاعت سلولها با غلظت 10 µm رتينوئيک اسيد تمام ترانس تيمار و به مکدت 49 سکاعت در انکوبکاتور نگهکداري شکدندا بعکد از انکوباسيون سلولها در ي کک ميکروتيکو جمکعآوري و بکه مدت 10 دفيقه با سرعت 2000 rpm سکانتريفوژ گرديکدا بکه منظور حذ کامل تريتسين بار ديگر پالک سکلولي بکا - PBS شستشو داده شدا تعکداد سکلولهکا در گکروه تيمکار و کنتکرل شمارش گرديدا به تعکداد سکلول در حجکم 50 µl از محيط کشت به همراه 50 µl از مخلوا کيت به داخل چاهکک پليت مخصوص لومينسانس منتقل گرديدا پس از گذشت ي کک ساعت پليت با دستگاه پليتخوان BioTek) (Synergy HT, در طول مکو Emission 570 nm و Excitation 490 nm فرائت گرديدا اين کار در فواصل زماني يک ساعته بکه مکدت سه ساعت تکرار شدا RT-PCR نسکککخهبکککرداري واکک نش زنجيک رهاي پليمريزاسک يون بک ه صک ورت معککککوس transcription-( Reverse )polymerization chain reaction: RT-PCR حساسترين تکنيکه يا تعي ني استا در اين بررسي با استفاده از اين تکني کک و در گرفتندا براي بررسي بيان ژنه يا سلول به کمک يکککي از بيان ژنها از روي RNA آنها سرطاني مکورد ارزيکا يب بيکان ژنهکاي فکرار مورد نظر ابتکدا RNA ککل TRIZOL (Invitrogen: ) و طبق دستورالعمل شرکت سازنده استخرا و غلظت RNA استخرا شده با دستگاه نکانودرا مقدار scientific( )Thermo تعيکين RNA از 2µg براي سنتز cdna شکدا وارد واکنش 40 تکايي شک دا سککنتز cdna بککا اسککتفاده از کيککت شککرکت فرمنتککاز

5 1395 کومش جلد 17 شماره 4 )پياپي 60( تابستان ReverseAid TM First Strand cdna Synthesis )Fermentas: K1622 ( ادامه DNA از 50ng و طبق دستورالعمل آن انجام گرفتا در حاصل براي واکنش زنجيکرهاي پليمکراز )PCR( استفاده شدا واکنش زنجيکرهاي پليمکراز حکاوي ي کک واحد DNA پليمراز 1µL از هر کدام از پرايمرهاي پيشکرو و پسککرو اختصاصککي 0/5µL از 0/75µL dntp mix X PCR buffer از 2/5µL Mgcl2 از 10 و در حجکم 24µL انجام گرفتا همه موارد مربکوا بکه واککنش PCR از شکرکت سيناژن خريداري شدندا واکنش PCR بکا اسکتفاده از دسکتگاه ترمکال سکايکلر BioRAD مکدل 100T انجکام شکدا بعکد از دناتوراسيون اوليه به مکدت 5 دفيقکه در دمکاي C 94 تکثيکر براي 30 سيکل انجام گرفت که هر سيکل مشتمل بر 45 ثانيه در دماي C 94 براي دناتوراسيون 45 ثانيه در دماي مربکوا به فاز اتصال و 45 ثانيه در دماي C 72 جهت فاز گسترش و يک مرحله گسترش نهايي در دماي C 72 به مدت 10 دفيقکه بودا محصول واکنش روي ژل آگار %1/2 محتکوي اتيديوم برومايد در بافر )x اين ترتي که يک ميکروليتر 10ng/ml TBE(0/5 9µL الکتروفورز گرديدا بکه از محصول PCR مربوا به هکر گکروه بکا Loading dye مخلوا گشته و به چاهکک ژل آگارز منتقل گرديدا يک چاهک نيز به نشکانگر انکدازه DNA اختصاص داده شدا دستگاه به جريان الکتريسيته وصل شکد و ولتاژ آن بر روي 100 ولت به مدت 20 دفيقه تنظکيم گرديکدا در نهايت عکسبرداري از باندهاي به دست آمده در دسکتگاه Gel Doc (Uvitech) و بکه کمکک نکور UV صکورت گرفکت ] 20 [ا در جدول يک ليست پرايمرهاي مورد اسکتفاده انکدازه محصول PCR دماهاي اتصال و همچنين شمارهه يا No( )Accession آورده شده استا از برنامه Image J 1/5 و پروتوکل دانسيتومتري جهت کمي کردن بانده يا استفاده شدا شدت بانده يا ژنه يا دستيا يب نسکخه PCR هد نسبت به ژن خانگي )Housekeeping( نرمال گرديدا ستس نمودار مربوا به ميزان بيان ژن با استفاده از اطالعات بکه دسکت آمکده از نکر مافکزار Image J رسم شدا نتايج به صورت ميکانگين ± خطکاي معيکار ميانگين بيان و ارزش احتمالي کمتر از 0/05 معنيدار در نظر گرفته شدا جهت بررسکي نتکايج حاصکل از آزمکايش MTT assay از آزمون آناليز واريانس يک طرفکه و تسکت تکميلکي توکي بهره گرفته شدا نتايج مربوا بکه ديگکر آزمکايشهکا بکا استفاده از آنکاليز آمکاري آماري Student s t-test SPSS نسخه 21 انجام شدا توسکط نکرمافکزار Gene gapdh جدول 1 ا توالي پرايمرها و اندازه فطعات تکثيري شماره هاي دستيا يب Size (bp) Annealing Temperature(ºC) و شرايط PCRا Primer Sequence (5 toward 3 ) F: CATCACCATCTTCCAGGAGC R:CCTGCTTCACCACCTTCTTG F: CGCCTACCTCTGCTTCTGCCT R: GGCAGGTGGGGTCGTGGTAG F: CGACACCGGATAAACCAAAG R: CGGTACTTCCCCAGCACAC Accession No. NM_ NM_ NM_ نتايج )Viability( به روش MTT ميزان حيات سرطاني اندازهگيري شدا اين تست ميکزان فعاليت متابوليکي سلولها را نشان ميدهدا شدت جکذ نکور بر حسک نکانومتر در گکروه کنتکرل معکادل 0/754±0/015 نانومتر بودا ميزان OD در گروه تيمار شده با غلظتهکاي µm 2/5 25 و نسبت بکه گکروه کنتکرل کاهش داشت به طوريکه کمترين دانسکيته نکوري در غلظکت 10µM و معادل 0/460±0/015 نانومتر فرائت شدا مقايسکه ميانگين جذ گروهه يا تيمار شده با ميکانگين جکذ گکروه کنترل نشاندهنکده اخکتال آمکاري معنکادار بکين آنهکا بکود ) P<0/001 (ا با توجه به ککاهش ميکزان حيکات سکلولهکاي

6 ا( اثرات اسيد رتينوئيک تمام ترانس بر القا آپوپتوز سرطاني شدن تقريبي نمودار حيات از غلظت 2/5 تا 10 ميکروموالر و خطي سرطاني از غلظت 10 تا 25 ميکرومکککککککککککککککککککککککککککککککککککوالر دوز از 10µM به عنوان غلظت مکورد نظکر بکراي ادامکه آزمايشات مد نظر فرار گرفت )شکل 1 (ا جمعت سلولي در فاز G1 نازيال نياپور و همکاران از 34/79±2/92 درصد در گکروه کنترل به 45/56±1/29 درصد افکزايش پيکدا ککرد ککه ايکن تفاوت به لحکا آمکاري معنکيدار بکود ) P<0/001 (ا توزيکع جمعت سلولي در فاز S چرخه سلولي بين گروهه يا تيمکار و کنتککرل تقريبککا يکسککان بککودا لککيکن در مرحلککه G2/M (Gap2/Mitosis) از 39/1±0/11 درصکد گکروه کنتکرل بکه 26/91±1/91 در گروه کاهش يافتا اين ت ييکرات نشانگر انباشت بيشتر سلولها در فاز G1 به دنبال تيمکار بکا است که بکه خکر ککاهش جمعي تک سکلولي در فکاز G2/M صورت پذيرفته است )شکل 3 شکل 1 ا تاثير غلظت هاي 25 و 20 µm 2/ از بر ميزان حيات سلول هاي به روش MTTا * تفاوت آماري معني دار )0.001>P ) در مقايسه با گروه کنترلا $ تفاوت آماري معني دار )0.05>P ) در مقايسه با غلظت فبل از خود تصوير 2 : بررسي ميزان فعاليت کاستاز هاي 3 و 7 ا اثر Caspase-Glo غلظت 10µM از در القاي آپوپتکوز در رده سلولي با استفاده از کيت Caspase-Glo 3/7 مورد ارزيا يب فرار گرفتا با استفاده از اين کيت فعاليت آنکزيمهکاي کاستاز 3 و 7 به عنوان دو کاستاز کليدي در روند آپوپتکوز در غلظت وکر شده بررسي شدا ميانگين جکذ لومينيسکانس در گروه کنترل معادل 2407±79 و در گکروه تيمکار بکا 4536/455±291/165 نانومتر ثبت گرديدا مقايسه ميکانگين جذ گروهه يا تيمار شده با ميکانگين جکذ گکروه کنتکرل نشاندهنده اختال آمکاري معنکادار بکين ايکن دو گکروه بکود )0/001>P( و بيکانگر تک اثير آپوپتوتي کک از طريکق افزايش فعاليت آنزيمه يا کاستاز 3 و 7 ميباشد )شکل 2 (ا 10µM اثکر بر روند چرخه سلولي در رده سکلولي از بکا استفاده از تکنيک فلوسيتومتري مورد ارزيکا يب فکرار گرفکتا نتايج فلوسايتومتري نشان داد که پيرو تيمار با اسيد رتينوئيک * وجود تفاوت آماري معني دار )0.001>P( در مقايسه با گروه کنترل پيامرسان RT-PCR بيکان ژنهکاي و از مسکير بررسکي شکدا RNA بکه روش دسکتي و بکا استفاده از ترايزول اسکتخرا شکد و مقکدار آن بکا اسکتفاده از نانودرا تعيين گرديدا در تصوير به ترتي A4 از سمت چپ ستون اول تصوير الکتروفورز RNA اسکتخرا شکده را نشکان ميدهد که دو باند 19 و 29 بعدي بانده يا مربوا به S در آن مشهود استا ستونه يا و gapdh کنترل و نشان مکيدهکد )تصکوير تصوير 4 بيان نيمه کمي ژنه يا A4 (ا را در گکروه فسکمت B از و gapdh نسبي بيان ژن را نسبت بکه نشان ميدهدا نتايج حکاکي از آن اسکت ککه ميکانگين و در گروه تيمار از گروه کنترل است )0/05>P( )تصوير با ا( B4 کمتر

7 1395 کومش جلد 17 شماره 4 )پياپي 60( تابستان آگاروز در گروه اي کنترل (Con) و اسيد رتينوئيک (RA) نشان داده شده استا فسمت B از تصوير 4 بيان نيمه کمي ژن هاي و را نسبت به gapdh نشان مي دهدا Ladنشانگر مولکولي bp( 100( شرکت Vivantisو RT- کنترل منفي فافد آنزيم نسخه برداري * وجود تفاوت آماري معنادار (0.05>P) در مقايسه با گروه کنترلا معکوسا A 3 ا شکل B C Population histogram و فلوسايتومتري در سرطاني معده رده ا فسمت A و B به ترتي روند ت ييرات چرخه سلولي را در گروه هاي کنترل و تيمار با را نشان داده استا در هر هيستوگرام از چپ به راست به ترتي پيک اول مربوا به مرحلهG1 دوم S و پيک آخر مرحله G2/M چرخه سلولي را نشان ميدهدا نتايج کمي هيستوگرام هاي پيشين به صورت نمودار ستوني در C فسمت نشان داده شده استا ( P<0.05 )در مقايسه با گروه کنترل. شکل 4 ا نتايج :RT-PCR در * وجود تفاوت آماري فسمت A به ترتي معنادار از سمت چپ به راست الکتروفورز RNA و بيان ژنهاي gapdh و روي ژل ع يل بحث و نتيجهگيري سرطان معده يکي از سرطانه يا شکايع در جهکان اسکتا رغم توسعهي راهکارهاي درماني جديکد در جلکوگيري از پيشرفت سرطان و کنترل آن هکمچنکان ميکزان مکر و ميکر بيماران مبتال به سرطان معده باال ميباشدا مسکير پيکامرسکاني در پيشرفت سکرطان معکده حکائز اهمي تک طوريکه بيان رستتور -1 در اسکت بکه سرطاني معکده نسبت به بافت نرمال باالتر ميباشد ] 13 [ا همچنين تحقيقکات بيشتري نشان دادهاند که ت ييرات ژنتيکي در مسير پيامرساني باعث انتقال سرطان به مراحل پيشرفتهتکر مکيشکود و جهش در انکوژنها ژنه يا سرکوبگر تومور و ژنه يا سيکل سلولي را القا ميکند ] 10 [ا مسير پيامرساني داروهاي مهارکنندهه يا A ترميم بکه اختصاصي اين مسير پاسخ مکيدهکدا از نظر بيولوژيکي يکي از متابوليته يا فعال ويتامين ميباشد که در روند تکثير و تمايز سکلولي در سکلولهکاي بنيکادي سکرطان نقکش داردا اثکرات در القکات تمکايز سرطاني مختلس و به ويژه لوسمي پروميولتيک حاد )APL( مطالعه شده استا بر اساس شکواهد بکه دسکت آمکده استفاده از باعث بهبود %95 از بيماران APL ميشودا اين امر از طريکق القکات تمکايز و اثکرات ضکد تکثيکري اسکيد رتينوئيک همراه با القات آپوپتوز فراهم ميشود ] 21 [ا عالوه بر اين مطالعات حيواني نيز نشان داده اسکت ککه باعکث مهار رشد تومور و گسترش سرطان پروستات شده و در نهايت باعث سرکو تومور ميشود ] 22 [ا نقش مهارکنندگي در روند تکثير سلولي در ردهه يا معده مختلس,(MGC80-3,, BGC823, SGC-7901) رسيده استا مطالعات Liu بهوسيله تنظيم افزايشي سکط گيرنکده سکرطاني به اثبات و همکارانش نشان داد که RARα مکانع از رشکد A

8 HEY اثرات اسيد رتينوئيک تمام ترانس بر القا آپوپتوز سرطاني معده ميشود ] 23 [ا نتايج حاصل از مطالعه حاضر با روشMTT نيز در امتدا يافتههکاي مقکاالت پيشکين است و مشاهده شد که کاهش بقات سکرطاني معکده ردهي در غلظککت 10μM از بککيشتککرين مقککدار برخوردار بودا مسير پيامرسان اسکيد رتينوئي کک و نازيال نياپور و همکاران در دوره جنيني با يکديگر در ارتباا بوده و در تکثيکر و تمکايز سلولي نقش به سزايي دارندا به طوريکه در بافته يا نرمکال در طي مرحله جنيني تنظيم تمايز دودمانه يا سکلولي و در سلولهکاي بکال تعکديل تمکايز را بکر عهکده دارد ] 24 [ا ميتواند به عنوان يک مهارکنندهي چرخکهي سکلولي عمل نمايد به طوري که بررسيه يا محققان نشان داده اسکت که در ميلوئيد و سکلولهکاي کارسکينوماي تخمدان سيکل سلولي را در فاز G0/G1 متوفس ککرده اسکت ] 5 [ا در مطالعه ديگري نشان داده شده اسکت ککه بکه صورت وابسته به دوز سرطاني معکده ردهي BCG- را در فاز 823 G0/G1 متوفس کرد ] 5 [ا در تائيد اين مطالعات نتايج ما نيز نشان داد که توانسکته در غلظکت 10μM باعث تجمع معنيدار سکلولهکاي سکرطاني در مرحلکه از G1 چرخه سلولي شودا همچنين در اين مطالعه اثر غلظت 10μM از در القات آپوپتوز در با استفاده از کيت 3/7Caspase-Glo سرطاني معده ردهي مورد ارزيا يب فرار گرفتا با استفاده از اين کيت فعاليت آنزيمه يا کاستاز 3 و 7 به عنوان دو کاستاز کليدي در رونکد آپوپتکوز در غلظکت وکر شده بررسي شد که ميزان فعاليت کاستاز در گکروه تيمکار تقريبا دو برابر گروه کنترل بود که بيانگر اثر بر القکات آپوپتوز و مهار تکثير سرطاني معده استا محققکان نشان دادند که بيکان و سرطان باالست و هد فکرار دادن در سکلولهکاي بنيکادي CSCs را کاهش دهد ] 7 [ا مطالعات Mying مکيتوانکد تعکداد و همککارانش در مورد تکاثير اسکيد رتينوئي کک در تنظکيم سکلولهکاي بنيکادي گليوبالستوم نشان داده اسکت ککه مسکير پيکامرسکاني برجستهترين مسير پاسخدهنده به RA ميباشد و تنظيم کاهشي مسير بر اساس تنظيم کاهشي اعضاي خانواده و HES و انجام ميشودا به اين منظور ميزان بيان ژنه يا با اسکتفاده از تکني کک RT-PCR و در گکروه تيمکار بکا مورد بررسي فرار گرفت ککه مبکين ککاهش بيکان ژن نسبت به گروه کنترل در معکده نيکز بکود و بنکابراين در امتکداد يافتکههکاي همکارانشان است ] 25 [ا سکرطاني Mying Murata تمايزي بر که بيان و و همکارانش در بررسي اثر EC و F9 در F9 به اين نتيجه رسکيدند پيرو مواجهه با رتينوئيک اسيد به طور فابل توجهي کاهش يافته است ] 26 [ا در مطالعه ما نيز بيان ژنه يا و پيرو تيمار با رتينوئي کک ککاهش معنکک يداري را نشککان دادا از طککر ديگککر اسککتفاده از مهارکنندهه يا آنزيم گامکا سککرتاز مثکل DAPT (N-[N-(3,5- Difluorophenacetyl)-L-alanyl]-S-phenylglycine t-butyl فاز )ester سب توفس چرخهي سلولهکاي سکرطاني T-ALL در G1 از يافتهه يا شده و بيان ژنه يا notch و hes را کاهش داد ] 27 [ا مطالعکه حاضکر و مقکاالت مشکابه ديگکر چنکين استنباا ميشود که احتماال عالوه بر مسکير متعکار پيامرساني خود از طريق ايجاد ت ييراتي در مسير پيامرسکاني نيز ميتواند اثرات ضد تکثيري آپوپتوتيک و تمکايزي خود را اعمکال کنکدا البتکه تائيکد ايکن مهکم مسکتلزم انجکام بررسيه يا دستکاريه يا دفيقتر در ردهه يا مختلس سکرطاني و ژنتيکي مسيرهاي پيامرسان داخل سلولي استا در مطالعه حاضر مشخص گرديد خود را از طريق کاهش ميزان در رده حيات که اثکر سکميت سلولي و القاي آپوپتکوز اعمال مينمايدا همچنکين بکا بررسکيهکاي تائيدي معلوم شد که اين ماده اثکرات آپوپتوتي کک طريق افزايش فعاليت کاستاز 3 7 و کاهش بيان ژن خکود را از و همچنين ت يير درصد سکلولهکا در فازهکاي مختلکس چرخکه سلولي اعمال مينمايدا ايکن مطالعکه درک جديکدي از اثکرات سيتوتوکسيک اين ماده بر روي سرطاني معده فراهم آورده استا در آخر خاطر نشان ميشکود ککه ايکن يافتکههکا محدود به يک رده از به بررسيه يا بيشتر ضرورت داردا سرطاني معده ميباشد و نيکاز

9 1395 کومش جلد 17 شماره 4 )پياپي 60( تابستان [13] Sethi N, Dai X, Winter CG, Kang Y. Tumorderived JAGGED1 promotes osteolytic bone metastasis of breast cancer by engaging notch signaling in bone cells. Cancer Cell 2011; 19: [14] Lee HW, Kim SJ, Choi IJ, Song J, Chun KH. Targeting signaling by gamma-secretase inhibitor I enhances the cytotoxic effect of 5-FU in gastric cancer. Clin Exp Metastasis 2015; 32: [15] Grieselhuber NR, Klco JM, Verdoni AM, Lamprecht T, Sarkaria SM, Wartman LD, Ley TJ. signaling in acute promyelocytic leukemia. Leukemia 2013; 27: [16] Niapour N, Mohammadi-Ghalehbin B, Golmohammadi MG, Gholami MR, Amani M, Niapour A. An efficient system for selection and culture of Schwann cells from adult rat peripheral nerves. Cytotechnology [17] Niapour N, Niapour A, Milan HS, Amani M, Salehi H, Najafzadeh N, Gholami MR. All trans retinoic acid modulates peripheral nerve fibroblasts viabilityand apoptosis. Tissue Cell 2015; 47: [18] Schippers KJ, Martens DE, Pomponi SA, Wijffels RH. Cell cycle analysis of primary sponge cell cultures. In Vitro Cell Dev Biol Anim 2011; 47: [19] Bohlooli S, Bohlooli S, Aslanian R, Nouri F, Teimourzadeh A. Aqueous extract of Agrostemma githago seed inhibits caspase-3 and induces cell-cycle arrest at G1 phase in AGS cell line. J Ethnopharmacol 2015; 175: [20] Niapour N, Taghipour Z, Salehi H, Bagheri A, Rouhani A, Talebi M, et al. Isolation and identification of mesenchymal and neural crest characteristics of dental pulp derived stem cells. Koomesh 2015; 16: [21] Zhu B, Smith J, Yarmush ML, Nahmias Y, Kirby BJ, Murthy SK. Microfluidic enrichment of mouse epidermal stem cells and validation of stem cell proliferation in vitro. Tissue Eng Part C Methods 2013; 19: [22] Lee JH, Yoon JH, Yu SJ, Chung GE, Jung EU, Kim HY, et al. Retinoic acid and its binding protein modulate apoptotic signals in hypoxic hepatocellular carcinoma cells. Cancer Lett 2010; 295: [23] Liu S, Wu Q, Chen ZM, Su WJ. The effect pathway of retinoic acid through regulation of retinoic acid receptor alpha in gastric cancer cells. World J Gastroenterol 2001; 7: [24] Zhang J, Niu C, Ye L, Huang H, He X, Tong WG, et al. Identification of the haematopoietic stem cell niche and control of the niche size. Nature 2003; 425: [25] Ying M, Wang S, Sang Y, Sun P, Lal B, Goodwin CR, et al. Regulation of glioblastoma stem cells by retinoic acid: role for pathway inhibition. Oncogene 2011; 30: [26] Murata K, Hattori M, Hirai N, Shinozuka Y, Hirata H, Kageyama R, et al. Hes1 directly controls cell proliferation through the transcriptional repression of p27kip1. Mol Cell Biol 2005; 25: [27] Uyttendaele H, Marazzi G, Wu G, Yan Q, Sassoon D, Kitajewski J. 4/int-3, a mammary proto-oncogene, is an endothelial cell-specific mammalian gene. Development 1996; 122: تشكر و قدردانی هزينهه يا مربوا به ايکن مطالعکه از محکل اعتبکار طکر تحقيقاتي مصو دانشگاه علکوم پزشککي اردبيکل بکه شکماره 9223 و پاياننامه دانشجويي بکه شکماره 9227 /ا/د مصکو دانشگاه علوم پزشکي اردبيل تامين گرديده استا منابع [1] Jin J, Li X, Xing L, Chang Y, Wu L, Jin Z, et al. Addition of all-trans-retinoic acid to omeprazole and sucralfate therapy improves the prognosis of gastric dysplasia. J Int Med Res 2015; 43: [2] Cheng B, Martinez AA, Morado J, Scofield V, Roberts JL, Maffi SK. Retinoic acid protects against proteasome inhibition associated cell death in SH-SY5Y cells via the AKT pathway. Neurochem Int 2013; 62: [3] Soprano DR, Qin P, Soprano KJ. Retinoic acid receptors and cancers. Annu Rev Nutr 2004; 24: [4] Ju J, Wang N, Wang X, Chen F. A novel all-trans retinoic acid derivative inhibits proliferation and induces differentiation of human gastric carcinoma xenografts via up-regulating retinoic acid receptor beta. Am J Translat Res 2015; 7: [5] Zhang JP, Chen XY, Li JS. Effects of all-transretinoic on human gastric cancer cells BGC-823. J Dig Dis 2007; 8: [6] Siegel R, Naishadham D, Jemal A. Cancer statistics, CA Cancer J Clin 2012; 62: [7] Yan B, Liu L, Zhao Y, Xiu LJ, Sun DZ, Liu X, et al. Xiaotan Sanjie decoction attenuates tumor angiogenesis by manipulating -1-regulated proliferation of gastric cancer stem-like cells. World J Gastroenterol 2014; 20: [8] Brzozowa M, Mielanczyk L, Michalski M, Malinowski L, Kowalczyk-Ziomek G, Helewski K, et al. Role of signaling pathway in gastric cancer pathogenesis. Contemp Oncol 2013; 17: 1-5. [9] Du X, Cheng Z, Wang YH, Guo ZH, Zhang SQ, Hu JK, Zhou ZG. Role of signaling pathway in gastric cancer: a meta-analysis of the literature. World J Gastroenterol 2014; 20: [10] Katoh M, Katoh M. signaling in gastrointestinal tract (review). Int J Oncol 2007; 30: [11] Yuan R, Ke J, Sun L, He Z, Zou Y, He X, et al. HES1 promotes metastasis and predicts poor survival in patients with colorectal cancer. Clin Exp Metastasis 2015; 32: [12] Li LC, Peng Y, Liu YM, Wang LL, Wu XL. Gastric cancer cell growth and epithelial-mesenchymal transition are inhibited by gamma-secretase inhibitor DAPT. Oncol Lett 2014; 7:

10 Koomesh Summer 2016, 17 (4): Effects of all trans retinoic acid on apoptosis induction and, genes expression in gastric cancer cell line Nazila Niapour (M.Sc) 1, Samira Shokri (M.D) 2, Mojtaba Amani (Ph.D) 3, Marzieh Sharifi Pasandi (MSc) 3, Hossein Salehi (Ph.D) 4, Ali Niapour (Ph.D) *1 1 Research Laboratory for Embryology and Stem Cells, Department of Anatomical Sciences, School of Medicine, Ardabil University of Medical Sciences, Ardabil, Iran. 2 - Student Research Committee, Ardabil University of Medical Sciences, Ardabil, Iran 3 Dept. of Biochemistry, School of Medicine, Ardabil University of Medical Sciences, Ardabil, Iran 4 Dept. of Anatomical Sciences, School of Medicine, Isfahan University of Medical Sciences, Isfahan, Iran (Received: 26 Sep 2015; Accepted: 22 Feb 2016) Introduction: Gastric cancer is one of the most common and lethal malignancies in the world. All-trans retinoic acid () has been widely used to treat cancers, most notably for the acute promyelocytic leukemia (APL) - as a differentiation inducer. signaling plays important roles in cell proliferation and apoptosis. Aberrant activation of notch signaling pathway has been stated in different malignancies including gastric cancer. The aim of this study was to assess the possible effects of on cellular viability, cell cycle shift and apoptosis induction of gastric cell line. Moreover, alterations of and gene expression profiles after treatment have been considered. Materials and Methods: Human gastric carcinoma cells () were treated with increasing concentrations of (2.5, 5, 10, 15, 20, 25 µm). The viability of cells was determined with 3-(4, 5- dimethlthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide (MTT) assay. Caspase-Glo 3/7 assay kit was applied to measure the apoptosis. Flow-cytometry was employed to distinguish cells in different phases of cell cycle. Expression profiles for the and genes were evaluated by reverse transcriptase PCR (RT- PCR). Results: MTT assay showed that could diminish cell line viability rate; the most effective dose was 10 µm. Concentrations higher than 10 µm of had no significant effect on reducing cancerous cell viability. Furthermore, treatment significantly amplified caspase3/7activation. Flow-cytometry analyses showed significant accumulation of cells in G1 phase of cell cycle in treated group in compare to control. Following treatment with, showed a significant reduction in and genes profile expression. Conclusion: According to our findings, could exert its cytotoxic effects on gastric cancer MKN- 45 cell line through reducing cellular viability and inducing apoptosis. Remaining at G1 phase of cell cycle and reducing and gene expressions suggest the antiproliferative activity of. Keywords: Stomach Neoplasm,, Apoptosis, Signal transduction, Receptors, * Corresponding author. Tel: a.niapour@arums.ac.ir 120