1892. Ivanovski, filtrabilni uzročnik mozaične bolesti duvana Bejerink, potvrdio eksperimente Ivanovskog Lefler i Froš, filtrabilni

Transcript

1

2 1892. Ivanovski, filtrabilni uzročnik mozaične bolesti duvana Bejerink, potvrdio eksperimente Ivanovskog Lefler i Froš, filtrabilni uzročnik slinavke i šapa Landštajner i Poper, filtrabilni uzročnik dečije paralize Nazvani terminom virusi živi otrov Tvort i Derel, otkriće bakteriofaga virusa koji napadaju bakterije

3 Najmanji i najjednostavniji mikroorganizmi Nemaju ćelijsku građu acelularni Virusna čestica virion Ubrajaju se u žive organizme jer poseduju genetičku informaciju za sopstvenu reprodukciju Na granici veličine makromolekula ( nm)

4 Van ćelije metabolički inertni (neaktivni) Obligatni intracelularni paraziti - u ćeliji koriste metabolički aparat (enzime, ribozome) i energiju domaćina za sopstvenu reprodukciju 1 čestica virusa može dati preko hiljadu novih virusnih čestica

5 Nukleinska kiselina (DNK ili RNK) Kapsid, proteinske prirode, izgrađen iz strukturnih jedinica kapsomera Nukleinska kiselina i kapsid grade nukleokapsid Kod nekih virusa postoji dodatni omotač poreklom od citoplazmatične membrane domaćina i specifičnih virusnih proteina U nukleokapsid mogu biti upakovani enzimi neophodni za inicijalne faze infekcije; sintetišu se i pakuju u ćeliji prethodnom domaćinu

6 DNK ili RNK jednolančana ili dvolančana, cirkularna ili linearna, neki RNK genomi su segmentirani Proteinski omotač kapsid Izgrađen od kapsomera Kubna, spiralna ili kompleksna simetrija Kompleksna tipična za bakteriofage Spiralna tipična za biljne viruse Animalni virusi imaju najveću varijabilnost u simetriji kapsida

7 Ikosaedarna simetrija papova virus (dsdnk) polio virus (+ssrnk) Adenovirus (dsdnk)

8

9 Bakteriofag T4 Bakteriofag λ Bakteriofag Mu

10 Najčešće animalni virusi, kubne ili spiralne simetrije Na površini se uočavaju šiljci, virusni glikoproteini Kod influenca virusa: hemaglutinin (H), vezuje se za ćelijske receptore neuraminidaza (N), enzim koji olakšava oslobađanje iz ćelije Influenca virus

11 DNK virusi Virusi metanogena i halofila imaju sličnu morfologiju kao T4 fag i linearnu dsdnk Virusi hipertermofilnih Archaea (Sulfolobus, Pyrococcus) imaju neobičnu morfoligiju i linearnu ili cirkularnu dsdnk PAV1 virus hipertermofilne Archaea roda Pyrococcus, ima kratak rep

12 DNK virusi hipertermofilnih Archaea roda Sulfolobus

13 Prema domaćinu: (bakterijski, animalni, biljni i virusi gljiva) Prema nukleinskim kiselinama: Prema načinu replikacije Klasifikacija u taksonomske kategorije najviše se koristi kod animalnih virusa, najčešće do nivoa familija; familija dobija ime sa nastavkom viridae, rod ima nastavak virus, a vrsta dobija naziv prema bolesti koju izaziva.

14 + lanac RNK služi kao irnk - lanac RNK je matrica za sintezu irnk (komplementaran je irnk) + lanac DNK je istog smisla kao i irnk, tj. služi kao matrica za sintezu lanca (dvolančana replikativna forma), a onda - lanac DNK služi kao matrica za sintezu irnk

15 Uloga u početnim fazama infekcije DNK polimeraza ili RNK polimeraza Reverzna transkriptaza (retrovirusi) Lizozim (bakteriofagi) Sintetišu se u prethodnom domaćinu i pakuju u kapsid

16 Elektronska mikroskopija (moć razdvajanja nm) determinacija morfologije virusnih čestica (veličina nm) Imunološke metode reakcije antigen-antitelo korisne za identifikaciju virusa u ćelijama i tkivima i za određivanje srodnosti i klasifikaciju virusa Izolacija nukleinskih kiselina i proteina biohemijske metode izučavanja Izučavanje interakcije virusa i ćelije domaćina gajenje virusa na bakterijama domaćinima

17

18 Adsorpcija Penetracija Replikacija sinteza nukleinske kiseline sinteza proteina kapida Sazrevanje (maturacija) Oslobađanje iz ćelije

19 Adsorpcija na specifične receptore Kod bakteriofaga ulazi nukleinska kiselina Animalni i biljni virusi ulaze sa kapsidom (translokacijom, endocitozom, fuzijom membrane sa dodatnim omotačem virusa, posredstvom insekata) i nukleinska kiselina se oslobađa u ćeliji

20 Pakovanje nukleinske kiseline u kapsid Sklapanje kapsida self assembly proces, ponekad učestvuju šaperoni Oslobađanje lizom ćelije Prolaskom kroz citoplazmatičnu membranu bez lize Pupljenjem (virusi sa omotačem)

21 Posle adrsorpcije neko vreme nema zrelih virusnih čestica period eklipse. Period eklipse traje do pojave prvih zrelih virusa u ćeliji Eklipsa i sazrevanje čine latentni period Latentni period traje do oslobađanja prvih virusa iz ćelije

22

23 T2, T4 λ (lambda) φx174 M13, fd MS2 φ6

24 Virulentni virusi Sa domaćinom isključivo ulaze u litički ciklus Rezultat razmnožavanja po pravilu je liza ćelije i oslobađanje velikog broja fagnih partikula Na bakterijskom tepihu daju svetle plake Umereni virusi Sa domaćinom ulaze u litički ili lizogeni ciklus Rezultat litičkog ciklusa je liza ćelije i oslobađanje velikog br. fagnih partikula Rezultat lizogenog ciklusa je lizogena bakterija u kojoj je virus u stanju profaga; lizogena bakterija se umnožava i svaka ćerka ćelija u sebi nosi profag (1 kopiju virusne DNK) Profag je integrisan u hromozom domaćina (λ fag) ili je ekstrahromozomalna DNK (P1 fag) Na bakterijskom tepihu daju mutne plake Lizogena indukcija prelazak iz lizogenog u litički ciklus Lizogena konverzija domaćin stiče nova svojstva kodirana genima profaga (pr. Corynebacterium diphteriae)

25 Genom dvolančana linearna DNK sa terminalnim ponavljanjem, kodira 250 proteina, kapsid kompleksan, 25 proteina Kompleksne simetrije: glava izduženi ikosaedar, kontraktilan repić sa dugim kukicama Virulentni virus: sa domaćinom stupa u litički ciklus, lizira ćeliju i oslobađa se oko 100 virusnih čestica

26 Rani proteini (preko 20): nukleaze (isecaju DNK domaćina), DNK polimeraza, enzim za sintezu 5-hidroksimetilcitozina, enzim za kovalentnu modifikaciju RNK polimeraze domaćina tako da transkribuje virusne gene (rane gene prepoznaje bez σ faktora) Srednji proteini: novi σ faktori za kasne gene Kasni proteini: proteini kapsida i lizozim

27 Replikacija genoma u linearnoj formi Formiranje konkatemera rekombinacijom (džinovski molekuli DNK) Pakovanje u glavu dok nije puna headhful mehanizam (staje više od veličine genoma) Terminalno ponavljanje (pojedini geni su duplirani i nalaze se na oba kraja genoma) i cirkularna permutacija (koji će geni biti ponovljeni zavisi od mesta zasecanja, na različitim fragmentima to su različiti geni)

28 Umereni virus, sa domaćinom može ući u lizogeni ili litički ciklus Kompleksan kapsid: glava i nekontraktilni rep bez kukica Genom linearna dvolančana DNK sa jednolančanim komlementarnim krajevima (12 nukleotida, cos mesta = cohesive sites ), u ćeliji se cirkularizuje

29 Litički ciklus: Faza replikacije virusa Faza maturacije virusa Liza ćelije i oslobađanje novih viriona Lizogeni ciklus: Virusna DNK je profag integrisan u hromozom domaćina Ćelija je lizogena, imuna na ponovnu infekciju istim tipom virusa Ekspresija virusnog represora CI sprečava ekspresiju drugih gena i ulazak u litički ciklus Lizogena indukcija prelazak iz lizogenog u litički ciklus

30 U početku se sintetišu rani proteini uključeni i u litički i u lizogeni ciklus Ključna uloga dva represora Cro represor, kada ga ima dovoljno fag ulazi u litički ciklus CI represor λ faga, ključan za održavanje virusa u lizogenom ciklusu

31 Replikacija DNK virusa θ replikacija, kasnije rolling circle pakovanje isecanjem cos mesta

32 Za lizogeni ciklus neophodni proteini Int (integraza, omogućava ugradnju profaga u hromozom domaćina), CII i CIII, CI. Potrebno da se sintetiše λ represor (CI) i zaustavi transkripciju svih gena osim sopstvenog CI represor λ faga Stabilno vezan za operatorska mesta virusnih gena 1. Onemogućena je sinteza proteina neophodnih za litički ciklus - virus ulazi u lizogeni ciklus. 2. Ukoliko dođe do ponovne infekcije istorodnim tipom faga, represor se odmah vezuje za operatorska mesta njegovih gena i sprečava njihovu ekspresiju, a to znači imunost na ponovnu infekciju.

33 Kada se CI represor sintetiše i veže za operatorska mesta, zaustavlja se ekspresija ranih gena Pomoću Int proteina (mesto specifična nukleaza/integraza) genom λ se integriše u hromozom, mehanizam integracije rekombinacija specifična za mesto

34 Protein CII je rani protein, neophodan je za sintezu represora CI i ulazak u lizogeni ciklus. Njegova stabilnost zavisi od količine ćelijskih proteza koje ga razgrađuju odmah po sintezi. Energetsko stanje u ćeliji dobro, intenzivan metabolizam Ima dovoljno proteaza, nema CII, nema ni CI represora Litički ciklus Energetsko stanje u ćeliji loše, metabolizam usporen Nema dovoljno proteaza, CII je stabilan, CI represor se sintetiše Lizogeni ciklus

35 Izvlačenje profaga iz hromozoma domaćina i prelazak u litički ciklus, omogućeno razgradnjom λ represora. Za izvlačenje profaga neophodan je produkt xis gena ekscizionaza) Spontan proces se retko dešava, ali je moguće indukovati ga agensima koji oštećuju DNK (UV, X, γ zračenje, hemijski mutageni). U slučaju oštećenja DNK dolazi do indukcije SOS odgovora (razgranja represora koji drže zaključane SOS gene) međutim, razgrađuje se i CI represor λ faga. Skidanje CI represora ima za posledicu otključavanje litičkih gena faga, tj. prelazak u litički ciklus.

36 cirkularna + ss-dnk, ~ 5400 nt geni koji se preklapaju ( overlapping genes ), fenomen da sa istog nukleotidnog zapisa transkripcija različitih gena može da započne sa različitih mesta i iz različitih okvira čitanja kodirano 11 proteina ikosaedarni kapsid, 60 kapsomera (25 nm veličine)

37 Replikacija zavisna od enzima domaćina Replikativna ds forma, teta replikacija Transkripcija minus lanca daje policistronske irnk Formiranje genoma - replikacija po tipu kotrljajućeg obruča Pakovanje i oslobađanje lizom ćelije

38

39 Cirkularna + ss-dnk Filamentozni fagi Adsorbuju se na seks pilus (F + ćelije E. coli su domaćini) Pakovanje u kapsid pri izlasku iz ćelije (pupljenjem, ne ubija ćeliju domaćina) Nema lize ćelija nema plaka, već prosvetljenja na tepihu bakterija

40 Bakteriofag MS2 Ikosaedarni kapsid (25 nm) + ss RNK genom od 3569 nt (RNK se koristi kao irnk) Geni koji se preklapaju kodiraju 4 proteina: RNK replikazu (deo), protein kapsida, maturacioni protein i protein za lizu ćelije domaćina Adsorbuje se na seks pilus F + ćelije E.coli φ6 bakteriofag Segmentirani dvolančani RNK genom Parazitira na Pseudomonas syringae

41 Dva ili više virusa inficiraju jednu ćeliju Tokom mešovite infekcije mutantnim virusima iste vrste moguća je: rekombinacija (nasledni materijal se rekombinuje, promena na nivou genotipa) komplementacija (kombinuju se proteini dobijeni iz različitih mutanata, promena na nivou fenotipa; komplementacija dopuna) T4 fag raste na E. coli C i K12 linijama. Mutanti u lokusu rii ne rastu na E.coli K12. U mešovitoj infekciji različitim mutantima u rii lokusu dolazi do pojave plaka na E.coli K12. Fagi iz pojedinačne plake prilikom sledeće infekcije: ne rastu na E.coli K12 komplementacija rastu na E.coli K12 - rekombinacija

42 Bakterije sintetišu enzime - restrikcione endonukleaze Seku dvolančanu DNK virusa (stranu DNK) na specifičnim sekvencama (ssdnk i RNK virusi nisu osetljivi) Bakterijska DNK je modifikovana i nije osetljiva na sopstvene restrikcione enzime Bakterije poseduju specifične restrikciono-modifikacione sisteme (npr. E.coli linije K i B imaju, E. coli C nema restrikciono-modifikacioni sistem) Virusi se brane od restrikcionih endonukleaza metilacijom ili glikozilacijom svoje DNK, tj. istim tipom modifikacije koji postoji u DNK domaćina. Npr. T4 fag: modifikacija citozina u 5-hidroksimetil citozin