Rekombinacija DNK TRANSPOZICIJOM

Transcript

1 Rekombinacija DNK TRANSPOZICIJOM

2 Rekombinacija DNK transpozicijom Transpozicija je proces premeštanja specifičnih sekvenci molekula DNK (pokretnih genetičkih elemenata ili transpozona) sa jednog na drugo mesto u okviru jednog ili dva molekula DNK. Enzimi koji vrše transpoziciju nazivaju se transpozaze.

3 Pokretni genetički elementi Neki naučnici pokretne genetičke elemente dele u 4 grupe: transpozoni, plazmidi, bakteriofagi i molekularni paraziti, u koje spadaju introni koji sami sebe iskrajaju.

4 Otkriće transpozona Barbara McClintock ( )

5 Barbara McClintock ( ) 40 godina prošlog veka otkrila kontrolne elemente kod kukuruza tokom ispitvanja mozaicizma u boji zrna kukuruza

6 Barbara McClintock ( ) Disocijatore (Dissociator - Ds) i Aktivatore (Activator - Ac) koji mogu da menjaju pozicije u hromozomu

7 Barbara McClintock ( ) Za otkriće mobilnih genetičkih elemenata, godine dobija Nobelovu nagradu za fiziologiju ili medicinu Prva i do sada jedina žena dobitnik nepodeljene Nobelove nagrade za fiziologiju ili medicinu

8 Otkriće transpozona Posle kukuruza, pokretni genetički elementi nazvani insercione sekvence (engl. insertion sequences) otkriveni su kod bakterija krajem šezdesetih godina prošlog veka.

9 Terminologija transpozona Pokretni (mobilni) genetički elementi Skoči geni (eng. jumping genes) Lutajući geni (eng. roving genes) Kontrolni elementi (eng. controlling elements) Kasete (eng. cassettes) Transpozoni (eng. transposons)

10 Nastanak transpozona Hipoteza sebičnih gena po kojoj su transpozoni parazitske DNK ili hromozomalni paraziti koji ne doprinose adaptabilnosti ćelije domaćina Transpozoni zahvaljujući svojoj sposobnosti indukovanja genetičkih rearanžmana kao i sposobnosti aktiviranja ekspresije gena pored kojih se ugrađuju doprinose ukupnom adaptabilnom potencijalu ćelije domaćina.

11 Uloga pokretetnih (mobilnih) genetičkih elemenata Aktiviranje gena (primer kod zevka aktivira gene koji kodira za pigment koji daje crvenu boju cvetova) Spontane mutacije Genetički rearanžmani Horizontalni transfer genetičkih informacija

12 Opšte odlike Kod bakterija - Transpozoni često poseduju gene čiji su proteinski produkti odgovorne za razvoj rezistencije na određene antibiotike Generalno - Ćelija mora da suprimira transpoziciju u cilju očuvanja genetičke stabilnosti

13 Opšte odlike Pomeranje mobilnih elemenata sa jednog na drugo mesto može da se odigra sa ili bez njegovog dupliranja Često dupliciranje ciljnog mesta (2-20bp)

14 Insercija transpozona u određeni gen ili njegovu regulatornu sekvencu može potpuno da izmeni ili blokira funkciju gena. Inaktivacija gena insercionom mutacijom. Ako se transpozon insertuje u regulatorne sekvence može povećati ili smanjiti nivo transkripcije.

15 Drosophila Kvasac Kukuruz Čovek

16 U genomima ječma i kukuruza preko 70% sekvence, a kod čoveka preko 50% genoma, pripada transpozonima ili fosilnim ostacima transpozona transpozoni koji su izgubili sposobnost transpozicije

17 Podela mobilnih genetičkih elemenata Na osnovu organizacije i mehanizma transpozicije

18 DNK transpozoni Prisustvo kraćih (25bp) ili dužih (nekoliko stotina bp) terminalnih invertovanih ponovaka na oba kraja transpozona koje sadrže i sekvence koju prepoznaju specifične rekombinaze, transpozaze Gen koji kodira transpozazu Mogu sadržati i još nekoliko gena: geni koji kodiraju proteine regulatore transpozicije. Mnogi bakterijski DNK transpozoni nose gene čiji proteinski produkti odgovorni za razvoj rezistencije na jedan ili više antibiotika

19 Podela DNK transpozona Autonomni transpozoni Terminalne invertovane ponovke + gen za transpozazu Neautonomni transpozoni - Sadrže terminalne invertovane ponovke i mutiran gen za transpozazu - Ako u ćeliji nema autonomnih transpozona ovi transpozoni ostaju bez mogućnosti za transpoziciju

20 Retrotranspozoni slični virusima i retrovirusi (LTR retrotranspozoni) Na krajevima poseduju duge terminalne ponovke (eng. long terminal repeats, LTR) Gen koji kodira za integrazu (transpozaza) i gen koji kodira za reverznu transkriptazu Tokom transpozicije stvara se RNK intermedijer

21 poli-a retrotranspozoni Nemaju iste krajeve na 5 kraju nalazi se 5 netranslatirajući region 5 UTR (eng. untranslated region) a na 3 kraju 3 UTR + niz AT parova poli-a sekvenca Gen ORF 1 (eng. Open Reading Frame 1, ORF 1) kodira RNK vezujući protein Gen ORF 2 kodira protein koji poseduje reverzno transkriptaznu i endonukleaznu aktivnost Neautonomni polia retrotranspozoni ne poseduju kompletni 5 UTR.

22

23 Seci i lepi mehanizam transpozicije DNK transpozoni LTR retrotranspozoni Retrovirusi

24 Seci i lepi mehanizam transpozicije Transpozaza se vezuje za terminalne invertovane ponovke na krajevima transpozona i to na svakom kraju po jedan ili dva molekula transpozaze Transpozaze i transpozon grade stabilan protein - DNK kompleks SINAPTIČKI KOMPLEKSA ILI TRANSPOZOZOM

25 Seci i lepi mehanizam transpozicije Kompleks omogućava isecanje (eksciziju) transpozona i štiti nastale slobodne krajeve transpozona od dejstva ćelijskih nukleaza. Transpozaze obično istovremeno seku oba lanca molekula DNK generišući jednolančane prekide tako da se oba lanca završavaju sa slobodnom 3 - OH gupom

26

27 Seci i lepi mehanizam transpozicije Oslobođeni transpozon i molekuli transpozaza u sinaptičkom kompleksu putuju duž molekula DNK i pronalaze ciljnu sekvencu u koju će se ugraditi (insertovati) transpozon

28 Mehanizam insercije sastoji se od nukleofilnog napada slobodnog 3 -kraja transpozona na fosfoestarsku vezu ciljne sekvence DNK

29 Seci i lepi mehanizam transpozicije Oba 3 kraja transpozona OH grupom napadaju ciljnu DNK i to na rastojanju od 2 do 9 nukleotida (najčešće 2, 5 ili 9). Kao posledica raskidanja dve fosfoestarske veze u ciljnoj sekvenci DNK i formiranja novih fosfoestarskih veza sa 3- krajevima transpozona stvaraju se jednolančane DNK pukotine. Dupliciranje ciljnog mesta korišćenjem klasičnih enzima, DNK polimeraze i DNK ligaze

30 Praznina u molekulu DNK nastala isecanjem transpozona biva popunjena mehanizmina homologne ili nehomologne rekombinacije

31 Replikativni mehanizam DNK transpozicije

32 Replikativni mehanizam DNK transpozicije Start rekombinacije kao i kod seci i lepi mehanizma Transpozaza se vezuje za terminalne invertovane ponovke na krajevima transpozona Transpozaze i transpozoni grade stabilan DNK protein kompleks SINAPTIČKI KOMPLEKSA ILI TRANSPOZOZOM

33 Replikativni mehanizam DNK transpozicije Nakon delovanja transpozaza i formiranja 3 slobodnih krajeva transpozon ne napušta svoje originalno mesto u molekulu DNK već za njega ostaje vezan svojim 5 krajevima 3 -krajevi transpozona napadaju ciljnu DNK (eng. DNA strand transfer reaction) u okviru istog ili drugog molekula DNK.

34 Replikativni mehanizam DNK transpozicije 3 krajevi kovalentno se vezuju za ciljnu DNK dok 5 krajevi transpozona ostaju vezani za host sekvencu DNK. Na taj način formira se rani rekombinovani intermedijer koji se naziva dvostruko razgranati molekul DNK (engl. doubly branched DNA molecule)

35 Replikativni mehanizam DNK transpozicije U sledećem koraku rekombinacione reakcije, slobodni 3 -OH krajevi ciljne sekvence DNK postaju prajmeri za DNK sintezu kojom se duplicira sekvenca transpozona. Replikaciona reakcija generiše dve kopije transpozona. Formira se novi kružni kasni rekombinovani intermedijer koji se naziva KOINTEGRAT.

36 Replikativni mehanizam DNK transpozicije Razrešenje kointegrata vrši se rekombinacijom DNK specifičnoj za mesto korišćenjem enzima resolvaza. Ako su dva molekula DNK linearna razrešenje kointegrata uz duplikaciju transpozona za posledicu često ima i genetičke rearanžmane molekula DNK, kao što su delecije ili inverzije (rearanžman transpozona).

37 Elementi Tc1/Mariner Najzastupljeniji DNK transpozoni eukariota Različiti članovi izolovani u različitim vrstama Tc element kod C. elegans Mariner kod Drosophila

38 Tc1/Mariner elementi Autonomni transpozoni dužine od 1,5 kb do 2,5 kb Transpozaza pripada DDE familiji enzima Mehanizam transpozicije seci i lepi Jednostavnost strukture i mehanizma transpozicije u osnovu uspešnosti i rasprostranjenosti ovih transpozona

39 Tc1/Mariner elementi Praznina u molekulu DNK nastala isecanjem elemenata Tc1/Mariner popunjava se: a) reparacionom sintezom DNK koja rezultira ugradnjom nekoliko dodatniih baznih parova koji predstavljaju otiske ili tragove (footprints) putovanja transpozona duž genom b) direktnim spajanjem krajeva

40 Mnogi transpozoni ove grupe su mrtvi jer nose mutacije u genu za transpozazu

41 LTR retrotranspozoni i retrovirusi transposon insertion

42 Retrotranspozoni slični virusima i retrovirusi Seci i lepi mehanizam transpozicije Rekombinacija ovih retroelemenata uključuje i sintezu RNK intermediera

43 Retrotranspozoni slični virusima i retrovirusi Transkripcija LTR retrotranspozona (ili retrovirusa), korišćenjem ćelijske RNK pol II (RNK pol domaćina). Tranksripcija počinje sa promotora koji se nalazi u okviru sekvence LTR.

44 Retrotranspozoni slični virusima i retrovirusi Sinteza molekula cdnk procesom reverzne transkripcije

45 Retrotranspozoni slični virusima i retrovirusi Enzim integraza prepoznaje molekul cdnk i seče nekoliko nukleotida sa 3 krajeva lanaca molekula cdnk Integraza vrši inserciju 3 kraja retrotranspozona u DNK domaćina koristeći seci i lepi mehanizam transpozicije.

46 Retrotranspozoni slični virusima i retrovirusi DNK polimeraza i DNK ligaza domaćina kompletiraju rekombinacionu reakciju pri čemu dolazi do dupliciranja ciljnog mesta.

47

48 Dugi terminalni ponovci (eng. Long Terminal Repeats, LTR) Svaka sekvenca LTR retrotranspozona sličnih virusima i retrovirusa sastoji se iz tri dela: na 3 -kraju nalazi se region U3 (eng. unique 3 end, U3) na 5 -kraju nalazi se region U5 (eng. unique 5 end, U5) između ova dva regiona nalazi se region R (eng. repeat, R)

49 Zato što transkripcija kojom se formira RNK intermedier počinje UNUTAR jedne od LTR, transkribovana RNK ne nosi informaciju za kompletnu sekvencu LTR Specijalnim mehanizmom, tokom reverzne transkripcije sintetiše se kompletna cdnk Rekonstrukcija LTRs je vrlo važna za prepoznavanje cdnk od strane integraze tokom rekombinacije

50 Retrovirusi su RNK virusi koji poseduju najmanje četiri gena Gen gag kodira glavni strukturalni protein (unutrašnji antigen). Proteazu koja učestvuje u procesu maturacije virusnih partikula kodira gen pro. Gen pol kodira protein koji ima funkciju reverzne transkriptaze i integraze. Virusne površinske glikoproteine i transmembranske proteine kodira gen env.

51 Retrovirusna RNK Na samim krajevima RNK region R U5 sekvenca na 5 kraju U3 sekvenca na 3 kraju Kodiraju kontrolne elemente

52 Retrovirusna RNK Između regiona U5 i prvog strukturnog gena gag nalazi se sekvenca koja se naziva vezujuće mesto za prajmer (eng. primer-binding site, PBS). Između poslednjeg strukturnog gena env i regiona U3 nalazi se polipurinski niz. Virusna RNK Vezujuće mesto za prajmer Polipurinski niz

53 Sinteza cdnk Sintezu lanca DNK vrši enzim reverzna transkriptaza (RT) Prva uloga: RNK zavisna DNK polimeraza Sinteza počinje na vezujućem mestu za prajmer Prajmer za sintezu molekula DNK je trnk domaćina U 5-3 pravcu kopira se region U5 i jedan region R

54 Sinteza cdnk Kompletiranjem sinteze DNK, nastaje dvolančani hibrid DNK RNK Enzima RT dejujući kao RNazaH degraduje segment RNK virusa u okviru novonastalog hibrida

55 Sinteza cdnk Degradacijom regiona U5 i jednog R virusne RNK gubi se i dvolančani hibrid. U tim okolnostima, kompleks RT sa jednolančanom DNK vezanom za prajmer (trnk) vrši prvi skok i premešta se na 3 -kraj virusne RNK. Molekuli RNK i DNK međusobno se prepoznaju zahvaljujući komplementarnosti segmenata R.

56 Sinteza cdnk Enzim RT ponovo pokazuje aktivnost RNK zavisne DNK polimeraze i započinje sintezu DNK u 5 pravcu koristeći ostatak virusne RNK kao matricu.

57 Sinteza cdnk Dolaskom do kraja virusne RNK, RT ponovo menja svoju ulogu i kao RNazaH degraduje ostatak virusne RNK izuzev polipurinskog niza. Nakon delovanja RNazeH, od matrice RNK ostao samo PPT. PPT

58 Sinteza cdnk Enzim RT ima ulogu i DNK zavisne DNK polimeraze. Početak sinteze drugog lanca DNK započinje pomoću polupurinskog niza (PPT) kao prajmera. Elongacijom prajmera kopiraju se segmenti U3, R, U5 i PBS sekvence već sintetisanog lanca DNK

59 Sinteza cdnk Nakon završetka sinteze, RT još jednom dobija ulogu RNazeH i degradira sekvencu PPT i trnk koja je služila kao prajmer u sintezi prvog lanca DNK Sada se hibridni molekul sastoji samo od lanaca DNK.

60 Sinteza cdnk Na osnovu komplementarnosti sekvenci (PBS) dolazi do zatvaranja dvolančanog molekula DNK u kružni intermedijer.

61 Sinteza cdnk Vezujuće mesto za prajmer na novosintetisanom lancu DNK postaje mesto otpočinjanja sinteze molekula DNK. Elongacijom 3 kraja prajmera, RT kao DNK zavisna DNK polimeraza kompletira sintezu drugog lanca DNK uključujući i sekvencu LTR na njenom kraju.

62 Sinteza cdnk Nakon kompletiranja prve sekvence LTR, a samim tim i završetkom sinteze drugog lanca DNK, RT pravi treći skok na lanac DNK koji je do tada služio kao matrica za sintezu drugog lanca DNK. Prajmer za sintezu DNK ponovo je mesto PBS. Elongacijom 3 -kraja prajmera kompletira se i druga sekvenca LTR (na prvosintetisanom lancu DNK).

63 Sinteza cdnk Na ovaj način kompletirana je sinteza dvolančanog molekula DNK (cdnk) sa sekvencama LTR na oba svoja kraja. Tako nastao molekul cdnk prepoznaje enzim integraza koja ugrađuje virusnu cdnk u genom domaćina Virus HIV je retrovirus

64 Retrotranspozoni slični virusima Retrotranspozoni slični virusima su odlika svih eukariotskih genoma. Najpoznatiji su LTR retrotranspozoni kvasca, elementi Ty (eng. Transposons in Yeast, Ty). Ultrastrukturne analize ukazale su da se elementi Ty pakuju u virusima slične partikule, ali nikada ne napuštaju ćeliju.

65 DDE familija enzima Analizom strukture većeg broja enzima DNK transpozaza i retrovirusnih integraza utvrđeno je postojanje konzerviranog domena. To je katalitički domen koji poseduje tri konzervirane aminokiseline: dva aspartata (D) i jedan glutamat (E) po kojima je dobio i naziv DDE domen, a na osnovu čega je i familija proteina dobila ime DDE familija.

66 DDE familija enzima DNK transpozaze i retroviralne integraze Pored katalitičkog, ovi enzimi obično poseduju još dva domena: domen za vezivanje sa molekulom DNK i domen za ostvarivanje interakcija protein protein. Svi enzimi članovi familije DDE aktivni su jedino u sinaptičkom kompleksu sa DNK, odnosno transpozozomu.

67 Poli-A retrotranspozoni transpozoni kičmenjaka

68 LINE sekvence 17% genoma čoveka čine poli-a retrotranspozoni koji se nazivaju LINE sekvence (eng. Long Interspersed Nuclear Element, LINE) kopija LINE sekvenci u genomu čoveka. Najpoznatija LINE sekvenca čoveka je L1 element sa preko kopija od kojih je samo mali broj (ne više od kopija) sa kompletnom sekvencom.

69 SINEs Enzime LINE transpozona koriste i neautonomni poli-a retrotranspozoni koji se nazivaju SINE sekvence (eng. Short Interspersed Nuclear Elements, SINE). Tipična dužina SINE sekvenci kreće se od 100 bp do 400 bp. Najpoznatije SINE sekvence kod čoveka su elementi Alu. Procenjuje se da ih ima u više od kopija i da zauzimaju 11% genoma čoveka

70 Poli-A retrotranspozoni Dugo se smatralo da poli-a retrotranspozoni nemaju nikakvu ulogu u genomu čoveka i svrstavani su u deo genoma koji se nazivao smeće DNK (eng. junk DNA). Uloga u procesu evolucije genoma, kroz insercije, genske konverzije i rekombinacije. Uloga ovih elemenata u regulaciji ekspresije gena na nivou transkripcije, u procesima utišavanja gena, kao i u fenomenu RNK interferencije. Do sada je otkriveno 34 bolesti čoveka koje su posledica insercionih mutacija nastalih transpozicijom poli A retrotranspozona (Hemohilija A posledica aktivnosti L1 elemenata tokom embriogeneze)

71 Poli-A retrotranspozoni Tokom transpozicije LINE elemenata stvara se RNK intermedijer. Mehanizam transpozicije Reverse Splicing. Sekvenca ciljne DNK, u mestu insercije LINE elemenata, predstavlja prajmer za sintezu molekula cdnk (eng. target site primed reverse transcription).

72 Mehanizam Reverse Splicing Transpozicija poli-a retrotranspozona započinje njegovom transkripcijom posredovanom RNK pol II. Promotor je smešten u 5 UTR, a sinteza molekula irnk počinje od prvog nukleotida sekvence elementa.

73 Mehanizam Reverse Splicing Novosintetisana LINE irnk napušta jedro i translatira se ORF 1 - RNK vezujući protein. ORF 2 - protein koji poseduje reverzno trankriptaznu i endonukleaznu aktivnost. LINE irnk Translacija LINE irnk ORF 1 i ORF 2 proteini

74 Mehanizam Reverse Splicing ORF 1 i ORF 2 proteini vezuju se za 3 kraj LINE irnk. Kompleks od dva proteina i LINE irnk vraća se u jedro. LINE irnk ORF 1 i ORF 2 proteini Ciljna DNK

75 Kompleks prepoznaje timinom bogate sekvence DNK komplementarnim sparivanjem sa poli-a krajem irnk. Protein ORF2 vrši jednolančani prekid u timinom bogatoj sekvenci za koju se komplementarno vezuje poli-a niz LINE irnk. Ciljna DNK Jednolančani prekid ciljne DNK Formiranje hibrida RNK-DNK

76 Mehanizam Reverse Splicing Slobodan 3 OH kraj ciljne DNK predstavlja prajmer koji koristi protein ORF2 koji poseduje RT aktivnost i otpočinje sintezu prvog lanca molekula cdnk. Sinteza prvog lanca cdnk

77 Mehanizam Reverse Splicing Nakon sinteze jednog lanca cdnk, hibrid DNK-RNK biva meta nukleazne aktivnosti proteina ORF2 koji vrši degradaciju molekula RNK.

78 Mehanizam Reverse Splicing Mehanizam kojim se odvija sinteza drugog lanca molekula cdnk nije dovoljno poznat. Kompletirana cdnk ima sposobnost integracije u ciljnu sekvencu bogatu timinom u okviru molekula DNK.

79

80 Regulacija aktivnosti transpozona

81 Regulacija aktivnosti transpozona Kod eukariota kod eukariota Transpozoni biraju ciljna mesta na molekulu DNK u regionima koja se mogu definisati kao manje škodljiva za ćeliji - sigurne luke (skloništa) za transpozone (eng. safe havens for transposons) Uloga malih regulatornih molekula RNK u kontroli transpozicije kod sisara (piwi RNK u polnim ćelijama)

82 Regulacija aktivnosti transpozona kod prokariota Kontrola broja kopija transpozona u ćeliji Kontrola transpozicije zaštitom mesta insercije

83 Kontola broja kopija transpozona Familija IS4 transpozona ima mogućnost kontrole broja svojih kopija u jednoj ćeliji. Predstavnik ove familije je Tn10, veličine od 9.3 kb, koji koristi seci i lepi mehanizam transpozicije, i pripada klasi mešovitih transpozona. U osnovi ove kontrole je upotreba antisens RNK u regulaciji ekspresije gena za transpozazu. Leva IS10 Desna IS10

84 Na svojim krajevima Tn10 poseduje insercione sekvence suprotne polarnosti. U bakterijskom hromozomu pored Tn10 detektovano je i prisustvo samostalnih insercionih sekvenci - mini transpozoni. Postoje dve kopije gena za transpozazu (po jedna u svakoj IS), ali je samo kopija u desnoj IS funkcionalna. Transpozon Tn10 i mini transpozon IS10R su autonomni transpozoni, a mini transpozon IS10L je neautonomni transpozon. Transpozaza prepoznaje terminalne invertovane sekvence i u Tn10 i u mini transpozonima. Gen za transpozazu Geni čiji su prot. produkti odgovorni za razvoj rezistencije na tetraciklinske antibiotike Gen za transpozazu Leva IS10 Desna IS10

85 Blizu kraja IS10R nalaze se dva promotora na suprotnim stranama molekula DNK. P IN unutrašnji promotor - omogućava prepisivanje gena za transpozazu P OUT - spoljašnji promotor prepisuje kratku sekvencu ka kraju transpozona antisense RNK dužine od stotinak nukleotida IS10 desna antisens RNK P out P in irnk za transpozazu

86 Prvih 36 baza irnk za transpozazu i antisens RNK su komplementarne. Komplementarnost u sekvencama daje mogućnost hibridizacije P IN i P OUT transkripata i formiranja kompleksa RNK-RNK. U okviru komplementarnog segmenta u irnk nalazi se i kodon za inicijaciju translacije (kodon ATG). 36 nukleotida

87 Visok nivo kopija Tn10 u ćeliji Često formiranje hibrida RNK RNK. Pojava hibridizacije sprečava translaciju enzima transpozaze i to blokiranjem vezivanja ribozoma za irnk.

88 Nizak nivo kopija Tn10 u ćeliji Hibridizacija P IN i P OUT transkripata je retka. Molekul irnk slobodan za asembliranje ribozoma i otpočinjanje translacije enzima transpozaze.

89 Tn10 Istraživanja su pokazala da je transpozicija Tn10 u sprezi sa replikacijom bakterijske DNK. Tokom kratkog perioda neposredno nakon prolaska replikacione mašinerije u kome je bakterijska DNK hemimetilovana, česta je transpozicija Tn10.

90 Tn10 U okviru konsenzusnog regiona -10 P IN nalazi se sekvenca 5 GATC3 (mesto dam ) u kojoj adenin metiluje enzim D-adenin metilaza. Kada su mesta dam hemimetilovana, RNK polimeraza se većim afinitetom vezuje za promotor. Mesto dam je detektovano i u regionu krajeva IS koje prepoznaje transpozaza. Afinitet vezivanja transpozaze za unutrašnje krajeve IS značajno je povećano kada su mesta dam hemimetilovana.

91 Tn10 Hemimetilovana DNK - efikasnija ekspresija gena za transpozazu - efikasnije vezivanje transpozaze za IS Tn10. Transpozicija Tn10 najfrekventnija neposredno nakon replikacije DNK.

92 Tn10 Insercija Tn10 u ciljno mesto odvija se mehanizmom seci i lepi. Dvolančani prekid DNK u mestu ekscizije Tn10 reparira se mehanizmom homologne rekombinacije.. Kao rezultat HR, odnosno rekombinacione de novo sinteze DNK, na mestu iskrajanja transpozona opet se sintetiše sekvenca transpozona. Nereplikativnim mehanizom transpozicijom dobija se replikativni rezultat dve kopije transpozona. Dvolančani prekid Ciljno mesto Seci i lepi mehanizam transpozicije Reparacija dvolančanog prekida

93 Kontrola transpozicije zaštitom mesta insercije Određene vrste transpozona kontrolu svoje aktivnosti ostvaruju putem izbora ciljne sekvence u kojoj će se odigrati transpozicija. Drugim rečima, neke sekvence su imune na inserciju transpozona. Primer ovog vida kontrole transpozicije je transpozicija bakteriofaga Mu.

94 Bakteriofag Mu Lizogeni bakteriofag Mu veličine od ~40 kb sa 35 gena. DNK transpozon Tokom litičkog ciklusa, fag Mu replikativnim mehanizmom izvrši preko 100 reakcija/h - najaktivniji poznati transpozon. Zbog česte insercije u bakterijski genom i indukcije insercionih mutacija dobio je i svoje ime Mutator (Mu).

95 Fag Mu Slično drugim transpozonima, transpozon Mu pokazuje malu selektivnost za mesto svoje insercije. Pored bakterijske DNK, mesto insercije može biti i sama fagna DNK, što bi bilo fatalno po aktivnost fagnih gena i životni ciklus faga. Transpozon Mu razvio je mehanizam kojim štiti fagnu DNK od insercije fagnog DNK transpozona.

96 Samo dva gena kodiraju proteine koji učestvuju u transpoziciji: gen A koji kodira protein MuA i gen B koji kodira protein MuB. Protein MuA transpozaza iz familije DDE proteina Protein MuB ATP-azni protein koja stimuliše aktivnost proteina MuA

97 4 subjed. MuA transpozaze vezuju se za krajeve faga Mu. Protein MuB (u kompleksu sa ATP) vezuje se nespecifično za sekvencu DNK u kojoj će se insertovati fag Mu. Protein protein interakcija proteina MuA i MuB obezbeđuje vezivanje formiranog sinaptičkog kopleksa za mesto insercije na molekulu DNK.

98 Kontrola transpozicije zaštitom mesta insercije Vezani za krajeve transpozona, proteini MuA štite sekvencu fagne DNK u dužini od 15 kb od vezivanja proteina MuB. U slučaju da se protein MuB veže za fagnu DNK u okolini transpozona, protein MuA će stimulisati hidrolizu molekula ATP. Bez ATP, protein MuB gubi afinitet vezivanja za molekul DNK i disocira sa nje. Na ovaj način, 15 kb duga sekvenca fagne DNK otporna je na inserciju transpozona.

99 V(D)J REKOMBINACIJA

100 Urođeni (nespecifična otpornost) i stečeni (specifična otpornost) imunitet. Stečeni imunitet ima kompleksnu ulogu da pored ostalog, prepoznaje i uništava viruse, bakterije i patogene eukariote. Prepoznaju ogroman broj stranih antigena epitopa. Stečeni imunitet : humoralni i ćelijski imunitet. Specijalizovane ćelije - limfociti B i T.

101 V(D)J REKOMBINACIJA V(D)J rekombinacija je proces kojim ćelije imunskog sistema kičmenjaka proizvode različita antitela i T ćelijske receptore. Proizvodnja ovih specifičnih proteina moguća je programiranim DNK rearanžmanima koji nastaju kao posledica rekombinacionih reakcija sličnih transpoziciji.

102 Antitela Glavna karakteristika antitela je njihova sposobnost vezivanja za antigene, koji su i indukovali njihovu sintezu posredstvom antigenih determinanti ili epitopa. Na temelju tog kriterijuma, antitela predstavljaju grupu različitih molekula koji su svrstani u imunoglobuline (γ globulini) koji se sastoje od pet klasa IgG, IgA, IgM, IgD i IgE. Ove klase međusobno se razlikuju po molekulskoj strukturi, težini, naelektrisanju, aminokiselinskoj sekvenci i vrsti prisutnog ugljenog hidrata.

103 Imunoglobulini imaju istu osnovnu građu. Četiri polipeptidna lanca Struktura koja ima izgled latiničnog slova Y. Laki lanci - L ak Teški lanci - H ak Sve lance karakteriše varijabilni (V) region na N- kraju i konstantni (C) region na C-kraju proteina. Deo antitela koji stupa u interakciju sa antigenim determinantama naziva se vezujuće mesto za antigen a formiraju ga varijabilni domeni lakog i teškog lanca imunoglobulina. Antitela

104 Kappa lokus miša Region genoma koji kodira lake lance antitela. 300 genskih segmenata koji kodiraju različite varijante varijabilnog domena lakog lanca (V L domen). 4 genska segmenta koji kodiraju kratki proteinski region (J region) 1 genski segment za konstantni domen lanca (C L domen)

105 V(D)J rekombinacijom moguća je fuzija između bilo kog V L i J segmenta Posledica ove rekombinacije varijanti lakog lanca antitela Ovaj segment povezuje se sa C L kodirajućem regionom tokom obrade primarnog transkripta

106 V(D)J REKOMBINACIJA Teške lance antitela miša kodira region sastavljen od 100 V regiona, 12 D (eng. for diversity, D) regiona i 4 J regiona. Slično lakim lancima, jedan region kodira konstantni domen teškog lanca (C H domen). V(D)J rekombinacijom moguće je stvoriti različitih proteinskih sekvenci teškog lanca

107 Kombinacija varijanti lakog lanca antitela i varijanti teškog lanca antitela za rezultat ima mogućnost proizvodnje ogromnog broja antitela. Uključujući sve poznate postranslacione modifikacije proteinskih lanaca i uzimajući u obzir stopu mutabilnosti za date genske lokuse, procenjuje se da je moguće proizvesti oko 7.2 x 10 7 različitih antitela.

108 Sve sekvence koje kodiraju proteine čiji transkripti učestvuju u proizvodnji antitela i T ćelijskih receptora na svojim krajevima poseduju rekombinacione signalne sekvence i to kao invertovane ponovke. Na svojim krajevima ove sekvence sadrže konzervisane motive: 7-mer (7 bp) i 9-mer (9 bp) za vezivanje rekombinaza.

109 Rekombinaza odgovorna za prepoznavanje i sečenje rekombinacionih signalnih sekvenci sastoji se od 2 proteinske subjedinice RAG1 i RAG2 (eng. recombination activating gene, RAG) i funkcioniše slično enzimima transpozazama. Oni prepoznaju par rekombinacionih signalnih sekvenci, vezuju se za konzervirane motive i formiraju kompleks protein DNK.

110 Proteinski kompleks nehomologne rekombincije

111 V(D)J rekombinacija Proteini koji su odgovorni za nehomologo spajanje krajeva često vrše adiciju ili deleciju nekoliko bp, čime završetak procesa V(D)J rekombinacije čine sličnim procesu transpozicije Tc1/Mariner tranpozona. Protein RAG 1 pokazuje neke osobine transpozaza proteinske familije DDE. Dokazi da se V(D)J rekombinacija, ključni molekularno-biološki mehanizam imunskog sistema kičmenjaka razvio iz mehanizma DNK transpozicije.