ÅÉÓÁÃÙÃÇ ÓÔÇ ÌÏÑÉÁÊÇ ÌÉÊÑÏÂÉÏËÏÃÉÁ

Transcript

1 ÅÉÓÁÃÙÃÇ ÓÔÇ ÌÏÑÉÁÊÇ ÌÉÊÑÏÂÉÏËÏÃÉÁ ΝΙΚΟΛΑΟΣ ΣΙΑΦΑΚΑΣ Οι µοριακές µέθοδοι της σύγχρονης Μικροβιολογίας αποτελούν ένα σύνολο τεχνικών που αποσκοπούν στην ανίχνευση, το χειρισµό και τη διερεύνηση του γενετικού υλικού των παθογόνων µικροβίων. Στο άρθρο που ακολουθεί αναπτύσσονται µε λεπτοµέρειες τα στάδια του θεµελιώδους δόγµατος της Βιολογίας: Αντιγραφή του DNA Μεταγραφή σε RNA Μετάφραση σε δοµικές και λειτουργικές πρωτεΐνες των µικροοργανισµών. Οπότε γίνεται ευκολότερα η συσχέτιση των σταδίων αυτών µε την εφαρµογή των µοριακών τεχνικών στο εργαστήριο. Έτσι η PCR είναι µια µέθοδος αντιγραφής του γενετικού υλικού του µικροβίου η µεταγραφή του DNA σε mrna έχει εφαρµογή στην ΤΜΑ (transcription mediated amplification) και την NASBA (nucleic acid sequence based amplification). Η µετάφραση του mrna στα ριβοσώµατα όπου συντίθεται η πολυπεπτιδική αλυσίδα, χρησιµοποιείται στην παραγωγή ανοσογόνων πολυπεπτιδίων για την παρασκευή εµβολίων. Η αντίστροφη µεταγραφή εφαρµόζεται στην ανίχνευση RNA ιών. Αναφέρονται επίσης διαφορές µεταξύ προκαρυωτικών και ευκαρυωτικών οργανισµών, στη ροή της γενετικής πληροφορίας, καθώς και αποκλίσεις από το κεντρικό δόγµα της Βιολογίας στις περιπτώσεις αντίστροφης µεταγραφής (π.χ. στους RNA ιούς). (Λέξεις ευρετηρίου: πολλαπλασιαµός του DNA, αντιγραφή γενετικού κώδικα, µεταγραφή, µετάφραση, παραγωγή πρωτεΐνης). Εισαγωγή Αντιγραφή DNA 1,2

2 58 Εφαρµοσµένη Κλινική Μικροβιολογία

3 Περίοδος B, Τόµος 14, Τεύχος 2, Escherichia coli Μεταγραφή 1,2

4 60 Εφαρµοσµένη Κλινική Μικροβιολογία Μετάφραση 1,2

5 Περίοδος B, Τόµος 14, Τεύχος 2, Χαρακτηριστικές διαφορές στη ροή της γενετικής πληροφορίας µεταξύ προκαρυωτικών και ευκαρυωτικών οργανισµών Αποκλίσεις από το κεντρικό δόγµα της Βιολογίας που παρατηρούνται σε παθογόνους µικροοργανισµούς

6 62 Εφαρµοσµένη Κλινική Μικροβιολογία Τι σηµαίνει το κεντρικό δόγµα της Βιολογίας στις µοριακές µεθόδους της σύγχρονης ιαγνωστικής Παράδειγµα

7 Περίοδος B, Τόµος 14, Τεύχος 2, in vitro ιεύθυνση Επικοινωνίας: Νικόλαος Σιαφάκας Λέκτορας ιαγνωστικής Ιολογίας Εργαστήριο Κλινικής Μικροβιολογίας «Αττικού» Νοσοκοµείου Τηλ.: Summary N. SIAFAKAS DNA, RNA. Replication - transcription - translation Clinical Microbiology Laboratory Medical School ATTIKON General Hospital, University of Athens Applied Clinical Microbiology In the following review article the fundamental DNA and RNA structure and function is presented in detail, so that the principles and application of essential biotechnological achievements, such as PCR (an in vitro enzymatic target amplification technique), or nucleic acid sequence based amplification (NASBA) and transcription mediated amplification (TMA) used in diagnostic Microbiology are better understood. (Key words: DNA function, the genetic code, molecular biotechnology). ΒΙΒΛΙΟΓΡΑΦΙΑ 1. Alberts B, Johnson A, Lewis J, Raff M, Roberts K, Walter P 2. Madigan M, Martinko J 3. Knipe DM, Howley PM, Griffin DE, Lamb RA, Martin MA, Roizman B, Straus SE 4. Stanway G, Brown F, Christian P, Hovi T, Hyypia T, King AMQ, Knowles NJ, Lemoin SM, Minor PD, Pallansch MA, Palmenberg AC, Skern T 5. Siafakas N, Markoulatos P, Levidiotou-Stefanou S

8 64 Εφαρµοσµένη Κλινική Μικροβιολογία Nix WA, Oberste MS, Pallansch MA Leitch EC, Harvala H, Robertson I, Ubillos I, Templeton K, Simmonds P 8. Bartlett JMS, Stirling D Sarrazin C 25 (Suppl 3) 10. Compton J Van Damme P, Van Herck K Cann AJ 13. Becker P, Hufnagle W, Peters G, Hermann M Staphylococcus aureus 67 Αίτηση εγγραφής µέλους της Εταιρείας Κλινικής Μικροβιολογίας ΥΠΟ ΕΙΓΜΑ ΑΙΤΗΣΗΣ ΕΓΓΡΑΦΗΣ ΜΕΛΟΥΣ

9 ΙΩΣΗΦ ΠΑΠΑΠΑΡΑΣΚΕΥΑΣ H αλυσιδωτή αντίδραση της πολυµεράσης (Polymerase Chain Reaction - PCR), είναι µια ενζυµατική αντίδραση, που ανήκει στις µεθόδους ανίχνευσης του DNA µέσω πολλαπλασιασµού του στόχου. Ο τελικός σκοπός είναι ο εκθετικός πολλαπλασιασµός ενός συγκεκριµένου τµήµατος DNA που αποτελεί το στόχο της αντίδρασης. Η µεθοδολογία αυτή, που έχει περιγραφεί εδώ και περίπου µια 20ετία, έχει πλέον λάβει µια σηµαντική θέση στην καθηµερινή κλινική διαδικασία, τόσο στη διαγνωστική Μικροβιολογία, όσο και σε άλλες ειδικότητες της Ιατρικής. Στην ανασκόπηση που ακολουθεί θα γίνει προσπάθεια να αναφερθούν οι κυριότερες αρχές της PCR, σε σχέση µε την ίδια την αντίδραση, την επιλογή του στόχου και του κλινικού δείγµατος, τη βελτιστοποίηση των παραµέτρων της τεχνικής και την ερµηνεία του αποτελέσµατος. Επίσης θα συζητηθούν περιπτώσεις που µεταβάλλουν την ευαισθησία και την ειδικότητα της µεθόδου, θα αναφερθούν τα σηµαντικότερα στοιχεία της υλικοτεχνικής υποδοµής και της ροής της εργασίας. (Λέξεις ευρετηρίου: αλυσιδωτή αντίδραση της πολυµεράσης, DNA, πολλαπλασιασµός, διάγνωση). Εισαγωγή in vitro

10 66 Εφαρµοσµένη Κλινική Μικροβιολογία Η αρχή της µεθόδου in vitro in vitro in vivo in vitro Η διαδικασία της αντίδρασης Εικόνα 1

11 Περίοδος B, Τόµος 14, Τεύχος 2, Εικόνα 3 Εικόνα 2 Εικόνα 4

12 68 Εφαρµοσµένη Κλινική Μικροβιολογία Εικόνα 5 Εικόνα 7 Εικόνα 6 Παραλλαγές της διαδικασίας

13 Περίοδος B, Τόµος 14, Τεύχος 2, Bartonella henselae Tropheryma whipplei Τα χηµικά αντιδραστήρια

14 70 Εφαρµοσµένη Κλινική Μικροβιολογία in vitro Thermus aquaticus Η θερµοκρασία υβριδισµού των εναρκτήριων αλληλουχιών

15 Περίοδος B, Τόµος 14, Τεύχος 2, Η επιλογή του DNA στόχου Η επιλογή και επεξεργασία του κλινικού δείγ- µατος, η αποµόνωση του DNA Chlamydophila pneumoniae

16 72 Εφαρµοσµένη Κλινική Μικροβιολογία C. pneumoniae, Αναλυτική ευαισθησία, διαγνωστική ευαισθησία και διαγνωστική ειδικότητα

17 Περίοδος B, Τόµος 14, Τεύχος 2, Τα ψευδώς θετικά αποτελέσµατα ως αποτέλεσµα επιµόλυνσης

18 74 Εφαρµοσµένη Κλινική Μικροβιολογία Τα ψευδώς αρνητικά αποτελέσµατα ως αποτέλεσµα αναστολής Η εµφάνιση και αποτύπωση του τελικού προϊόντος πολλαπλασιασµού

19 Περίοδος B, Τόµος 14, Τεύχος 2, Η υλικοτεχνική υποδοµή και η ροή της εργασίας

20 76 Εφαρµοσµένη Κλινική Μικροβιολογία

21 Περίοδος B, Τόµος 14, Τεύχος 2, Αντί συµπερασµάτων ιεύθυνση Επικοινωνίας: Ιωσήφ Παπαπαρασκευάς Λέκτορας Μικροβιολογίας Εργαστήριο Μικροβιολογίας, Ιατρική Σχολή, Εθνικό και Καποδιστριακό Πανεπιστήµιο Αθηνών Μικράς Ασίας 75, 11527, Γουδί, Αθήνα Summary JOSEPH PAPAPARASKEVAS Principles of PCR and hybridization Department of Microbiology, Medical School, National and Kapodistrian University of Athens Applied Clinical Microbiology Polymerase Chain Reaction is an enzymatic target amplification technique. It repli-

22 78 Εφαρµοσµένη Κλινική Μικροβιολογία cates a target DNA molecule to levels where it can be easily detected. During the two decades since it was introduced in every day clinical practice, it has developed into the mainstay technique of most molecular microbiology laboratories. In the following review, the main principles of PCR will be discussed, with respect to method procedure, target and clinical specimen selection and preparation, reaction optimization, amplicon detection, etc. In addition issues like analytical versus diagnostic sensitivity will be discussed, as well as laboratory design and work flow. (Key words: Polymerase Chain Reaction, DNA, amplification, diagnosis). ΕΠΙΛΕΓΜΕΝΗ ΒΙΒΛΙΟΓΡΑΦΙΑ 1. Kleppe K, Ohtsuka E, Kleppe R, Molinaux R, Khorana HG Mullis KB and Faloona FA Mullis KB Eisenstein BI Lyons J 69(Suppl 1) 6. Green ED, Waterston RH Tompkins LS Matthews RC, Burnie JP Relman DA Naber SP O Leary JJ, Engels K, Dada MA Raj GV, Moreno JG, Gomella LG Teba L Kiechle FL Kiechle FL, Holland-Staley CA Garcia JG, Ma SF 33(Suppl 1) 17. Hunt JL 132

23 Ν. ΣΠΑΝΑΚΗΣ Τα τελευταία χρόνια έχει πραγµατοποιηθεί µια επανάσταση στις τεχνολογίες εφαρµογών της αλυσιδωτής αντίδρασης πολυµεράσης, µε την ενσωµάτωση της δυνατότητας παρακολούθησης της πορείας της αντίδρασης σε πραγµατικό χρόνο (Real Time). Το γεγονός αυτό επιτρέπει την ταχύτερη αξιολόγηση των αποτελεσµάτων της αντιγραφής του γενετικού υλικού, καθώς επίσης και την αύξηση της ευαισθησίας και της ειδικότητας των αντιδράσεων σε σχέση µε την προς ανίχνευση νουκλεοτιδική αλληλουχία. Επιπλέον διευκολύνεται σε µεγάλο βαθµό ο ποσοτικός προσδιορισµός των γενετικών αλληλουχιών και των αντιγράφων RNA που παράγονται είτε είτε. Η αρχή λειτουργίας των τεχνικών Real Time PCR βασίζεται στη χρήση ειδικών ιχνηθετών κατά τη διενέργεια της αντίδρασης, οι οποίοι υβριδίζουν µε το παραγόµενο προϊόν και µέσω εκποµπής φθορισµού υποδεικνύουν την ποσότητα του παραγόµενου προϊόντος της αντίδρασης. Οι βασικές τεχνολογίες Real Time PCR ανάλογα µε τον χρησιµοποιούµενο ιχνηθέτη είναι: 1) η τεχνολογία απλών χρωστικών πρόσδεσης σε δίκλωνο DNA (SYBR Green), 2) η τεχνολογία των ιχνηθετών υδρολύσεως-υβριδισµού (Taqman), 3) η τεχνολογία ιχνηθετών υβριδισµού (Beacon, Scorpion) και 4) η τεχνολογία γειτονικών ιχνηθετών. Σε όλες τις περιπτώσεις ο εκπεµπόµενος φθορισµός συλλέγεται από ειδικές οπτικές διατάξεις των συσκευών Real Time PCR σε κάθε κύκλο της αντίδρασης και µεταφέρεται σε διαξονικά διαγράµµατα. Εάν παραχθεί προϊόν σε κάθε κύκλο σχεδιάζεται από το λογισµικό της συσκευής η αύξηση της παραγόµενης ποσότητας συναρτήσει των κύκλων πολλαπλασιασµού. Με τη χρήση ειδικών πρότυπων διαλυµάτων µπορεί να υπολογιστεί η αρχική ποσότητα DNA ή RNA στο υπό εξέταση δείγµα. Εφαρµογές που έχουν ήδη αναπτυχθεί, υπολογίζουν το ιικό φορτίο µε µεγάλη ακρίβεια, έτσι ώστε να αξιολογείται η αποτελεσµατικότητα της θεραπείας σε ειδικές περιπτώσεις ιογενών λοιµώξεων (π.χ. HIV κ.ά.). Επίσης, σε ερευνητικό επίπεδο, υπολογίζεται µε µεγάλη ακρίβεια η ποσότητα του παραγόµενου mrna σε µελέτες έκφρασης ογκογονιδίων σε καρκινικούς ιστούς. Στην ανασκόπηση που ακολουθεί γίνεται περιγραφή των διαφορετικών τεχνολογιών και αναφέρονται τα πλεονεκτήµατα, τα µειονεκτήµατα, καθώς και οι εφαρµογές της καθεµιάς. (Λέξεις ευρετηρίου: τεχνικές real time PCR, εφαρµογές, πλεονεκτήµατα, µειονεκτήµατα).

24 80 Εφαρµοσµένη Κλινική Μικροβιολογία Εισαγωγή in vitro in vivo in vitro Αρχή λειτουργίας Real Time PCR Τεχνολογίες Real Time PCR Σχήµα 1

25 Περίοδος B, Τόµος 14, Τεύχος 2, Πλεονεκτήµατα µειονεκτήµατα

26 82 Εφαρµοσµένη Κλινική Μικροβιολογία Κινητική των Real Time PCR Πίνακας 1 α) SYBR Green β) Taqman γ) Beacon, Scorpion δ) Adjacent probes

27 Περίοδος B, Τόµος 14, Τεύχος 2, Σχήµα 2α Πλεονεκτήµατα και µειονεκτήµατα Real Time PCR Σχήµα 2 β Σχήµα 3

28 84 Εφαρµοσµένη Κλινική Μικροβιολογία Συµπέρασµα ιεύθυνση Επικοινωνίας: Ν. Σπανάκης, PhD Παπαδιαµάντη 26, Πεντέλη Τηλ , Fax: Summary N. SPANAKIS Real time molecular diagnostics Department of Microbiology, Medical School, National and Kapodistrian University of Athens Applied Clinical Microbiology Over the last decade, it has been a revolution in the field of molecular diagnostics as real time techniques have been applied and expanded the use of PCR techniques. This evolution has contributed to faster molecular applications, as well as to better sensitivity and specificity of results. In addition, quantitative determinations of RNA produced by PCR are facilitated by the use of Real Time techniques. The function of Real Time techniques is based on the use of specific probes combined with a fluorophore that hybridize with the produced amplicon. The basic technologies of Real Time PCR techniques are: the SYBR Green agents, the hydrolyzing-hybridization probes (Taqman), the hybridization probes (Beacon, Scorpion) and the adjacent probes. The fluorescence emitted from fluorophores in cases of hybridization with the amplicon is measured by an optical device on the top of the PCR tubes, during the PCR thermodynamic cycles. The raw absorbance data are then compared with the absorbances with control samples

29 Περίοδος B, Τόµος 14, Τεύχος 2, which are forming a standard curve (concentration of PCR product vs cycle in thermodynamic reaction). The result is the qualitative or quantitative determination of DNA or RNA concentration in the original sample. Qualitative or quantitative applications have been applied for the evaluation of therapeutic schemes of viral infections. Additionally, in several research applications, quantitative mrna determinations are used in studying the expression of oncogenes in cancer tissues. In the following review, there is a description of different Real Time PCR technologies, along with the advantages, disadvantages and the application of each technology. (Key words: real time PCR, techniques, molecular diagnostics). ΒΙΒΛΙΟΓΡΑΦΙΑ 1. Clementi M, Clementi M, Menzo S, Manzin A, Bagnarelli P 140(9) 2. Orlando C, Pinzani P, Pazzagli M 36(5) 3. Didenko VV 31(5) 4. Ivnitski D, O Neil DJ, Gatusso A, Schlicht R, Calidonna M, Fisher R 35(4) 5. Gunson RN, Bennett S, Maclean A, Carman WF 43(4) Προς τους Συνδροµητές µας Παρακαλούµε να µας ενηµερώνετε εγκαίρως για οποιαδήποτε αλλαγή στη διεύθυνση την οποία µας έχετε δηλώσει για την αποστολή του περιοδικού «Εφαρµοσµένη Κλινική Μικροβιολογία και Εργαστηριακή ιαγνωστική»

30 ΛΟΥΚΙΑ ΖΕΡΒΑ Η ηλεκτροφόρηση εναλλασσόµενου ηλεκτρικού πεδίου (Pulsed Field Gel Electrophoresis, PFGE) α- ποτελεί την πρότυπη µέθοδο µοριακής τυποποίησης των βακτηρίων. Βασίζεται στο συνδυασµό µεθοδολογίας ανάλυσης πολυµορφισµού µήκους µε περιοριστική ενδονουκλεάση (Restriction Fragment Length Polymorphism, RFLP) και ηλεκτροφόρησης σε ένα ηλεκτρικό πεδίο, του οποίου η κατεύθυνση αλλάζει διαδοχικά, κατά τη διάρκεια της ηλεκτροφόρησης (PFGE). Οι δύο κατευθύνσεις του ηλεκτρικού πεδίου βρίσκονται υπό γωνία 120. Με την εφαρµογή της µεθόδου RFLP, το χρωµόσωµα τέµνεται από µία ενδονουκλεάση σε ένα σχετικά µικρό αριθµό τµηµάτων DNA, ενώ, στη συνέχεια, µε τη διενέργεια της PFGE επιτυγχάνεται ο διαχωρισµός τους σύµφωνα µε το µοριακό τους µέγεθος. Η ηλεκτροφορητική αυτή ανάλυση αποτελεί το γενετικό αποτύπωµα ενός στελέχους που εξετάζεται, δηλαδή το γονότυπό του. Η τυποποίηση στελεχών που αποµονώθηκαν σε συγκεκριµένο τόπο και χρόνο και η σύγκριση των γονοτύπων τους, µπορεί να υποστηρίξει ή να αποκλείσει την επιδηµιολογική σχέση µεταξύ των ασθενών από τους οποίους προέρχονται. (Λέξεις ευρετηρίου: ηλεκτροφόρηση εναλλασσόµενου ηλεκτρικού πεδίου, ανάλυση πολυµορφισµού µήκους µε περιοριστική ενδονουκλεάση, τυποποίηση, γονότυπος, επιδηµιολογία). Εισαγωγή

31 Περίοδος B, Τόµος 14, Τεύχος 2, Mέθοδοι µοριακής τυποποίησης Α ρ χ ή τ η ς µ ε θ ό δ ο υ P u l s e d F i e l d G e l Electrophoresis (PFGE)

32 88 Εφαρµοσµένη Κλινική Μικροβιολογία Η διαδικασία της PFGE 8 Τα ένζυµα που χρησιµοποιούνται στην PFGE

33 Περίοδος B, Τόµος 14, Τεύχος 2, Εικόνα 1 Εικόνα 2.

34 90 Εφαρµοσµένη Κλινική Μικροβιολογία Πίνακας 1. Βακτήριο Enterococcus. Clostridium difficile Clostridium perfringens Staphylococcus. Streptococcus. Streptococcus pneumoniae Acinetobacter. Bacteroides. Campylobacter. Coxiella burnetii Enterobacter. Escherichia coli Haemophilus influenzae Legionella pneumophila Neisseria. Περιοριστική ενδονουκλεάση Sma, Apa Sma, Sac, Sst, Nru Sma, Sac Sma, Csp, Sst, Sgr Sma Sma, Apa Sma, Apa Not Sma, Sal Not Xba, Spe Xba, Not, Sfi Sma, Rsr Sfi, Not Spe, Not, Bgl Τεχνική της ηλεκτροφόρησης σε εναλλασσό- µενο πεδίο

35 Περίοδος B, Τόµος 14, Τεύχος 2, Ο δείκτης του µοριακού µεγέθους Η εξασφάλιση της καλής απόδοσης της PFGE Staphylococcus aureus Η συνολική χρονική διάρκεια της µεθόδου

36 92 Εφαρµοσµένη Κλινική Μικροβιολογία Η µεθοδολογία ανάλυσης των αποτελεσµάτων Η ερµηνεία των αποτελεσµάτων Εικόνα 3

37 Περίοδος B, Τόµος 14, Τεύχος 2, : Πίνακας 2 Κατηγορία Αριθµός γενετικών διαφορών σε σύγκριση µε τον επιδηµικό κλώνο Αριθµός διαφορετικών ζωνών σε σύγκριση µε τον επιδηµικό κλώνο Επιδηµιολογική ερµηνεία

38 94 Εφαρµοσµένη Κλινική Μικροβιολογία Σχήµα 1

39 Περίοδος B, Τόµος 14, Τεύχος 2, Σχήµα 2. Συµπεράσµατα Σχήµα 3

40 96 Εφαρµοσµένη Κλινική Μικροβιολογία ιεύθυνση Επικοινωνίας: Λουκία Ζέρβα Ρίµινι 1, Χαϊδάρι, Αθήνα Τηλ , Fax: Summary LOUKIA ZERVA Molecular Typing Methods: Pulsed Field Gel Electrophoresis (PFGE) Laboratory of Clinical Microbiology, Attikon Hospital, University of Athens Applied Clinical Microbiology Pulsed Field Gel Electrophoresis (PFGE) represents the gold standard methodology for molecular typing of bacterial isolates. According to this analysis strains are incubated with a rare cutting restriction endonuclease resulting in the digestion of chromosomal DNA in a few fragments (Restriction Fragment Length Polymorphism, RFLP). This is followed by electrophoresis in a pulsed field (PFGE) with a 120 reorientation angle and ramping of switch intervals. The restriction profile of an isolate and its electrophoretic separation provide the genetic fingerprint or genotype of the strain. The comparison of genotypes of isolates in association with a standard epidemiological survey supports or excludes their epidemiological interrelationship. (Key words: Pulsed Field Gel Electrophoresis, Restriction Fragment Length Polymorphism, typing, genotype, epidemiology). ΒΙΒΛΙΟΓΡΑΦΙΑ 1. Singh A, Goering RV, Simjee S, Foley SL, Zervos MJ Blanc SS 4 3. Tenover FC, Arbeit RD, Goering RV, Mickelsen PA, Murray BA, Persing DH, Swaminathan B Andrei A, Zervos MJ Birren B, Lai E 6. Schwartz DC, Cantor CR Chu G, Vollrath D, Davis RW 234(4783) 8. Herschleb J, Ananiev G, Schwartz DC 2 9. Persing D, Tenover FC, Versalocic J, Tang Y-W, Unger ER, Relman DA, White TJ 10. Swaminathan B, Barrett TJ, Hunter SB, Tauxe RV and the CDC PulseNet Task Force van Belkum A, van Leeuwen W, Kaufman ME, Cookson B, Forey F, Etienne J, Goering R, Tenover F, Steward C, O Brien F, Grubb W,

41 Περίοδος B, Τόµος 14, Τεύχος 2, Tassios P, Legakis N, Morvan A, El Solh N, de Reych R, Struelens M, Salmenlinna S, Vuopio- Varkila J, Kooistra M, Talens A, Witte W, Verbrugh H Staphylococcus aureus Sma Murchan S, Kaufman ME, Deplano A, de Ryck R, Struelens M, Elsberg Zinn C, Fussing V, Salmenlinna S, Vuopio_Varkila J, El Solh N, Cuny C, Witte W, Tassios PT, Legakis N, van Leeuwen W, Vindel A, Laconcha I, Garaizar J, Haeggman S, Olsson-Liljequist B, Ransjo U, Coombes G, Cookson B Staphylococcus aureus Mulvey MR, Chui L, Ismail J, Louie L, Murphy C, Chang N, Alfa M and the Canadian Committee for the standardization of molecular methods Staphylococcus aureus Tassios PT, Chadjichristodoulou C, Lambiri M, Kansouzidou-Kanakoudi A, Sarandopoulou Z, Kourea-Kremastinou J, Tzouvelekis LS, Legakis NJSalmonella Lebessi E, Dellagrammaticas H, Tassios PT, Tzouvelekis LS, Ioannidou S, Foustoukou M, Legakis NJ Klebsiella pneumoniae Psichogiou M, Tassios PT, Avlamis A, Stefanou I, Kosmidis C, Platsouka E, Paniara O, Xanthaki A, Toutouza M, Daikos GL, Tzouvelekis LS Klebsiella pneumoniae Maniatis AN, Pournaras S, Kanellopoulou M, Kontos F, Dimitroulia E, Papafrangas E, Tsakris A Enterococcus faecium Vourli S, Perimeni D, Makri A, Polemis M, Voyiatzi A, Vatopoulos A Kalocheretis P, Baimakou E, Zerbala S, Papaparaskevas J, Makriniotou I, Tassios PT, Iatrou C, Kouskouni E, Zerva L Spiliopoulou I, Zografou S, Goula A, Dimitracopoulos G, Christofidou M Salmonella Enterica Ribot EM, Fitzgerald C, Kubota K, Swaminathan B, Barrett TJ Campylobacter jejuni Petinaki E, Kontos F, Miriagou V, Maniati M, Hatzi F, Maniatis An Stathi A, Papaparaskevas J, Zachariadou L, Pangalis A, Legakis NJ, Tseleni-Kotsovili A, Hellenic Strep-EURO Study Group, Tassios PT Streptococcus pyogenes Gerner-Smith P, Graves LM, Hunter S, Swaminathan B 36

42 ÅÖÁÑÌÏÃÅÓ ÔÙÍ ÌÏÑÉÁÊÙÍ ÔÅ ÍÉÊÙÍ ÓÔÇÍ ÊËÉÍÉÊÇ ÄÉÁÃÍÙÓÔÉÊÇ ΜΥΡΤΩ ΧΡΙΣΤΟΦΙ ΟΥ Στην ανασκόπηση που ακολουθεί παρουσιάζονται τα πλεονεκτήµατα και µειονεκτήµατα από την εφαρµογή των µοριακών τεχνικών, µε σκοπό την καλύτερη προσέγγιση της διάγνωσης των λοιµώξεων. Οι µοριακές τεχνικές δίνουν τη δυνατότητα πολλαπλασιασµού του στόχου (ειδικό τµήµα DNA ή RNA του µικροοργανισµού, PCR, RT-PCR, nested PCR, PCR) ή του σήµατος της αντίδρασης (b-dna) µε αποτέλεσµα να έχουν µεγάλη ειδικότητα και ευαισθησία. Μειονέκτηµα των ανωτέρω µεθόδων είναι ότι ανάλογα µε τη λοίµωξη και τον υπεύθυνο µικροοργανισµό, απαιτούνται ειδικά αντιδραστήρια, δηλαδή ειδικοί εκκινητές, σε αντίθεση µε τις συµβατικές µεθόδους-καλλιέργεια. Παράλληλα όµως εξασφαλίζεται µεγάλη ειδικότητα. Επίσης, η µεγάλη ευαισθησία των µοριακών τεχνικών οδηγεί µερικές φορές σε ψευδώς θετικά αποτελέσµατα. Εντούτοις, η ποσοτικοποίησή τους (b-dna, Real-time PCR) συµβάλλει σε αρκετές περιπτώσεις στην ορθή ερµηνεία των αποτελεσµάτων. Οι εγκεκριµένες εφαρµογές της PCR ( ) στο κλινικό διαγνωστικό εργαστήριο, αφορούν την ανίχνευση των νουκλεϊνικών οξέων των ιών, των µυκοβακτηριδίων, χλαµυδίων και γονοκόκκου. Στην ελληνική και ξένη βιβλιογραφία αναφέρεται µεγάλος αριθµός PCR, που θεωρητικά µπορεί να αφορά κάθε µικροοργανισµό (Βακτήρια-, Ιούς -, Μύκητες-, Πρωτόζωα- ) και κάθε κλινικό υλικό (ΕΝΥ, αρθρικό υγρό, οφθαλµικό υγρό). Επίσης, στη διάγνωση των βακτηριακών λοιµώξεων σε στείρα κλινικά υλικά δοκιµάζεται η ευρέος φάσµατος 16S. Η ειδικότητα και ευαισθησία των ανωτέρω µοριακών τεχνικών ποικίλλει. Η εφαρµογή των µοριακών τεχνικών στο κλινικό εργαστήριο είναι χρήσιµη σε πολλές περιπτώσεις και µπορεί να βοηθήσει συµπληρώνοντας τις συµβατικές µεθόδους στη διάγνωση, παρακολούθηση, πρόγνωση και έλεγχο πολλών λοιµώξεων. Εφόσον εφαρµοστούν οι σωστές προδιαγραφές σε επιστηµονικό προσωπικό, εργαστηριακούς χώρους, αναλώσιµα υλικά και αντιδραστήρια, δύνανται να δώσουν υψηλής ποιότητας αποτελέσµατα. (Λέξεις ευρετηρίου: µοριακές τεχνικές, διάγνωση λοιµώξεων, PCR).

43 Περίοδος B, Τόµος 14, Τεύχος 2, Εισαγωγή in vitro Εφαρµογή PCR και άλλων µοριακών τεχνικών στη διάγνωση των λοιµώξεων

44 100 Εφαρµοσµένη Κλινική Μικροβιολογία (FDA approved Food and Drug Αdministration approved HBV, HCV, ΗΙV, CMV HPV in house Ιογενείς λοιµώξεις in vitro ιάγνωση ιογενών λοιµώξεων µε µοριακές τεχνικές - ΗΒV, HCV, CMV, HPV

45 Περίοδος B, Τόµος 14, Τεύχος 2,

46 102 Εφαρµοσµένη Κλινική Μικροβιολογία Βακτηριακές λοιµώξεις ιάγνωση βακτηριακών λοιµώξεων µε µοριακές τεχνικές Mycobacterium spp, Chlamydia trachomatis, 16S rrna

47 Περίοδος B, Τόµος 14, Τεύχος 2, rdna Chlamydia trachomatis PCR Chlamydia trachomatis rrνα rrna rrna rrna

48 104 Εφαρµοσµένη Κλινική Μικροβιολογία ιεύθυνση Επικοινωνίας: Μυρτώ Χριστοφίδου Εργαστήριο Μικροβιολογίας, Ιατρικό Τµήµα, Πανεπιστήµιο Πατρών Ρίον - Πάτρα christof@med.upatras.gr Τηλ.: / Summary MYRTO CHRISTOFIDOU Molecular techniques in the diagnosis and management of infectious diseases Department of Microbiology, School of Medicine, University of Patras Applied Clinical Microbiology In parallel to conventional methods, moleculare techniques are advancing rapidly during the last two decades gaining an important place in all aspects of diagnosis and management, mainly in bacterial and viral diseases but also in mycotic and protozoan infections. Although nucleic acid-based methods offer increased sensitivity and specificity over traditional microbiological techniques reducing the time of diagnosis, standard approaches still form the backbone of work in a diagnostic laboratory. The introduction of moleculare methods bring new, but not overwhelming challenges for good laboratory design and conscientious working practices, contamination can be avoided, while quality results are usually generated. (Key words: moleculare techniques, PCR, clinical diagnosis, infectious disease). ΒΙΒΛΙΟΓΡΑΦΙΑ 1. Μa T Powledge T Mullis K, Fallona F Χριστοφίδου Μ, ηµητρακόπουλος Γ Χριστοφίδου Μ, Αθανασιάδου Α, Αναστασίου Ε., ηµητρακόπουλος Γ Christofidou M, Athanassiadou A, Skoutelis A, Anastassiou ED Osborn M, Lok A Tseliou P, Spiliotakara A, Dimitracopoulos G, Christofidou M Hatziyannis SJ, Vassilopoulos D Papatheodoridis GV, Hadjiyannis SJ

49 Περίοδος B, Τόµος 14, Τεύχος 2, Richter S 12. Christofidou M, Jelastopulu E, Economides G, Spiliopoulou I, Siagris D, Labropoulou-Karatza C, Anastassiou ED, Dimitracopoulos G 8(1) 13. Christofidou M, Labropoulou-Karatza C, Dimitracopoulos G, Spiliopoulou I Zein N Siagris D, Labropoulou-Karatza C, Christofidou M, Goumenos D, Thomopoulos K, Lekkou A, Gogos C, Vlachojannis J Μackay ΙΜ 14(3) 17. Bosch F, Xavier F, Manos M, Munoz N et al Papillomavirus 87(11) 18. Mayrand M, Duarte-Franco E, Rodrigues I et al Papillomavirus Fegou E, Jelastopoulou E, Sevdali M, Anastassiou ED, Dimitracopoulos G, Spiliopoulou I Mycobacterium tuberculosis Fegou E, Jelastopoulou E, Nicolaou S, Sevdali M, Anagnostou S, Kanavaki S, Dimitracopoulos G, Spiliopoulou I Mycobacterium tuberculosis Petinaki E, Dalekos N Μαλλή Ε, Πετεινάκη Ε rrna 13(1) 23. Kalogianni P, Goura S, Aletras A. J, Christopoulos T. K, Chanos M. G, Christofidou M, Skoutelis A, Ioannou PC, Panagiotopoulos E 361(2) 24. Furrows S, Ridgway G 7

50 ΕΦΗ ΠΕΤΕΙΝΑΚΗ Ο ρόλος του κλινικού µικροβιολογικού εργαστηρίου είναι η ταυτοποίηση του αιτιολογικού παράγοντα της λοίµωξης µε στόχο την εφαρµογή αιτιολογικής θεραπείας. Ο υπεύθυνος µικροοργανισµός ελέγχεται για την ευαισθησία του σε διάφορα αντιµικροβιακά φάρµακα µε δοκιµασίες, κατά βάση φαινοτυπικές, και ο κλινικός ιατρός, λαµβάνοντας υπόψιν το αντιβιόγραµµα σε συνδυασµό µε την εστία της λοίµωξης, εφαρµόζει την καταλληλότερη αντιµικροβιακή θεραπεία. Σήµερα, πέρα από τις κλασικές φαινοτυπικές µεθόδους, εφαρµόζονται, στο κλινικό εργαστήριο, και µοριακές µέθοδοι, που στοχεύουν στη γρήγορη και αξιόπιστη ανίχνευση γονιδίων αντοχής. Στο άρθρο που ακολουθεί, αναλύονται οι περιπτώσεις στις οποίες οι µοριακές µέθοδοι βοηθούν σηµαντικά στον έλεγχο της ευαισθησίας των µικροοργανισµών. (Λέξεις ευρετηρίου: µηχανισµοί αντοχής, µοριακές µέθοδοι, επιδηµιολογικός έλεγχος, ευαισθησία µικροοργανισµών). Εισαγωγή vim

51 Περίοδος B, Τόµος 14, Τεύχος 2, Α. Ταχεία ανίχνευση µηχανισµών αντοχής meca van vim in house

52 108 Εφαρµοσµένη Κλινική Μικροβιολογία katg inha rpob Helicobacter pylori Β. Χαρακτηρισµός στελεχών µε οριακή αντοχή S. aureus meca vanc, D, E Acinetobacter vim Γ. Προσδιορισµός νέων µηχανισµών αντοχής

53 Περίοδος B, Τόµος 14, Τεύχος 2, Klebsiella. Επιδηµιολογική επιτήρηση της µικροβιακής αντοχής 23S rrna cfr Staphylococcus sciuri S. aureus S. epidermidis Συµπεράσµατα ιεύθυνση Επικοινωνίας: Έφη Πετεινάκη Εργαστήριο Μικροβιολογίας, Ιατρικό Τµήµα Πανεπιστηµίου Θεσσαλίας Summary E. PETINAKI Detection of resistance mechanisms using molecular methods Microbiology Laboratory, The Medical School University of Thessalia Applied Clinical Microbiology The role of the clinical microbiological laboratory is to identify the causative microorganism and to apply the appropriate therapy. Until now, conventional tests, such as disk diffusion agar, determination of MICs etc, are used for antimicrobial susceptibility testing of the microorganisms. Recently, molecular methods are introduced in the

54 110 Εφαρµοσµένη Κλινική Μικροβιολογία routine laboratory, in order to detect accurately the mechanisms of resistance of the microorganisms to antimicrobial agents. (Key words: molecular methods, resistance mechanisms epidemiology, susceptibility testing). ΒΙΒΛΙΟΓΡΑΦΙΑ 1. Clinical and Laboratory Standards Institute 2. Hougardy N, Louahabi A, Goffinet P 54(8-9) 3. Petrich AK, Luinstra KE, Groves D, Chernesky MA, Mahony JB 13(4) 4. Zhu LX, Zhang ZW, Liang D, Jiang D, Wang C, Du N, Zhang Q, Mitchelson K, Cheng J 51(10) 5. Volkmann H, Schwartz T, Bischoff P, Kirchen S, Obst U 56(2) 6. Neonakis IK, Gitti Z, Baritaki M, Kourbeti IS, Baritaki S, Petinaki E, Maraki S, Krambovitis E, Spandidos DA 26 (8) 7. Abdelaal A, El-Ghaffar HA, Zaghloul MH, El Mashad N, Badran E, Fathy A 8(1) 8. Somoskovi A, Dormandy J, Mitsani D, Rivenburg J, Salfinger M 44(12) 9. Lacoma A, Garcia-Sierra N, Prat C, Ruiz-Manzano J, Haba L, Rosés S, Maldonado J, Domínguez J 46(11) 10. Hillemann D, Rüsch-Gerdes S, Richter E 45(8) 11. Nishizawa T, Suzuki H, Umezawa A, Muraoka H, Iwasaki E, Masaoka T, Kobayashi I, Hibi T 45(2) 12. Raymond J, Burucoa C, Pietrini O, Bergeret M, Decoster A, Wann A, Dupont C, Kalach N 12(2) 13. Petinaki E, Kontos F, Maniatis AN 50(6) 14. Bersos Z, Maniati M, Kontos F, Petinaki E, Maniatis AN 53(4) 15. Giakkoupi P, Tzouvelekis LS, Daikos GL, Miriagou V, Petrikkos G, Legakis NJ, Vatopoulos AC

55 Περίοδος B, Τόµος 14, Τεύχος 2, (1) 16. Ikonomidis A, Ntokou E, Maniatis AN, Tsakris A, Pournaras S 46(1) 17. Petinaki E, Guérin-Faublée V, Pichereau V, Villers C, Achard A, Malbruny B, Leclercq R 52(2) 18. Tsakris A, Kristo I, Poulou A, Themeli-Digalaki K, Ikonomidis A, Petropoulou D, Pournaras S, Sofianou D 47(2) 19. Mendes RE, Deshpande LM, Castanheira M, DiPersio J, Saubolle MA, Jones RN Kehrenberg C, Schwarz S 50 ΣΥΝΕ ΡΙΑ - ΣΕΜΙΝΑΡΙΑ August September September September September September September ASM/ESCMID Conference September October 2009

56 ΙΡΙΣ ΣΠΗΛΙΟΠΟΥΛΟΥ Μέθοδοι τυποποίησης βακτηρίων έχουν εφαρµοσθεί στη µελέτη της εξέλιξης των µικροοργανισµών, σε κλινικές µελέτες, στην ταξινόµηση και στην επιδηµιολογική διερεύνηση λοιµωδών νοσηµάτων. Είναι απαραίτητο στη διάρκεια έξαρσης λοιµωδών νοσηµάτων σε περιορισµένη κλίµακα ή σε µεγαλύτερη έκταση (επιδηµία) να καθορίζονται οι κλώνοι (στελέχη που προέρχονται από κοινό µητρικό κύτταρο) των βακτηρίων που ενέχονται σε αυτές. Ο καθορισµός των κλώνων βοηθά στην ανεύρεση της πηγής διασποράς των βακτηρίων και εποµένως στην αντιµετώπιση της έξαρσης και στην πρόληψη των λοιµωδών νόσων. Οι µέθοδοι τυποποίησης που εφαρµόζονται βασίζονται στο φαινότυπο των βακτηρίων και στο γονότυπο. Οι φαινοτυπικές µέθοδοι είναι ο βιότυπος, το αντιβιόγραµµα και ο ορότυπος των βακτηρίων, εφαρµόζονται σε κάθε διαγνωστικό εργαστήριο και δίνουν τα πρώτα στοιχεία για την εµφάνιση βακτηριακών στελεχών που µπορεί να διασπείρονται και σχετίζονται γενετικά. Στις επιδηµιολογικές µελέτες πρέπει να εφαρµόζονται γονοτυπικές µέθοδοι, ώστε να καθορίζονται οι κλώνοι που ενέχονται σ αυτές. Οι µοριακές µέθοδοι που θα επιλεγούν πρέπει να έχουν σταθερότητα, επαναληψιµότητα, καλή διαχωριστική ικανότητα και να τυποποιούν όλα τα βακτήρια που µελετώνται. Για το σκοπό αυτό εφαρµόζονται µέθοδοι που βασίζονται στην ανάλυση του χρωµοσωµικού DNA των βακτηρίων, ώστε να υπάρχει σταθερότητα αποτελεσµάτων. Η αλυσιδωτή αντίδραση της πολυµεράσης (PCR), η ηλεκτροφόρηση σε παλλόµενο ηλεκτρικό πεδίο (PFGE) και η µονοτοπική ή πολυτοπική ανάλυση νουκλεοτιδικής αλληλουχίας (MLST) είναι οι µοριακές µέθοδοι µε την ευρύτερη εφαρµογή που πληρούν, σε διαφορετικό βαθµό η κάθε µια, τα προαναφερθέντα κριτήρια. Η επιλογή της µεθόδου εξαρτάται εκτός από τον εξοπλισµό και την εξειδίκευση κάθε εργαστηρίου και από την έκταση της επιδηµιολογικής µελέτης. Στο άρθρο που ακολουθεί θα αναφερθεί ειδικότερα η διαδικασία προσέγγισης στην επιδηµιολογική διερεύνηση µε τα παραδείγµατα της µελέτης των λοιµώξεων από ανθεκτικούς στη methiciillin σταφυλοκόκκους, ανθεκτικούς στα γλυκοπεπτίδια εντεροκόκκους και πολυανθεκτικά gram-αρνητικά βακτηρίδια. (Λέξεις ευρετηρίου: επιδηµιολογία, αντοχή µικροοργανισµών, τυποποίηση βακτηρίων, PCR, PFGE, MLST).