Ingineria genică. 1. Bazele tehnico-materiale ale ingineriei genice

Transcript

1 Ingineria genică 1 Ingineria genică Ingineria genică poate fi definită drept ansamblu de metode şi tehnici prin care este posibilă manipularea materialului genetic la nivel celular şi molecular pentru a obńine pe căi netradińionale produşi utili omului şi genotipuri noi, având la bază tehnologia moleculelor recombinate (hibride) de ADN. Ingineria genică se profilează ca direcńie ştiinńifică şi tehnologică în anii '70. ApariŃia ei a fost determinată, în primul rând, de aprofundarea cunoştinńelor de genetică la nivel celular şi molecular, de dezvoltarea cunoştinńelor privind materialul genetic al organismelor vii, şi anume: descoperirea mecanismelor principale de transmitere a informańiei ereditare: transformańia (A. Avery, C. MacLeod, M. MacCarty, 1944) prin intermediul fragmentelor de ADN; sexducńia (J. Lederberg, E. Tatum, 1946) prin conjugarea bacteriilor şi transducńia (J. Lederberg, 1952) cu ajutorul fagilor; descoperirea structurii moleculei de ADN (J. Watson, F. Crick, 1953); descoperirea şi izolarea enzimelor de restricńie şi legare a fragmentelor de ADN (H. Smith, 1970); descoperirea fenomenului transcripńiei inverse a informańiei genetice de la ARN la ADN (H. Temin, S. Mizutani, D. Baltimor, 1970); descoperirea sintezei chimice a genelor (A. Kornberg, 1967; H. Khorana, 1970, 1976). 1. Bazele tehnico-materiale ale ingineriei genice Datorită cercetărilor de genetică moleculară, a fost posibilă cunoaşterea structurii de profunzime a unor gene şi genomuri, fapt ce a condus la elaborarea tehnologiei ADN-ului recombinat şi la transferul de gene peste barierele de specie. Tehnica recombinării genetice în vitro include trei etape principale: 1) extragerea sau sinteza chimică a ADN-ului din diferite specii; 2) construirea unei molecule hibride (recombinate) de ADN; 3) reintroducerea moleculei recombinate de ADN într-o celulă vie pentru reproducerea şi expresia ei (fig. 1). Fig 1. Etapele principale ale ingineriei genice.

2 Ingineria genică 2 Extragerea ADN-ului se produce utilizându-se o serie de enzime specifice, în primul rând, cele de restricńie, capabile să rupă molecula de ADN în anumite locuri. Enzima de restricńie extrasă din Escherichia coli Eco RI recunoaşte următoarea secvenńă de nucleotide: G AATTC CTTAA G. Restrictazele reprezintă instrumentul de bază al ingineriei genice, deoarece au capacitatea unică de a tăia molecula de ADN în anumite sectoare (loci). Prima restrictază a fost obńinută din bacteriile Haemophillus influenzae serotipul α şi se folosea pentru fragmentarea ADN-ului virusului SV-40 şi cartarea lui (Kelly, Smith, 1970). Nu toate restrictazele se utilizează în ingineria genică, ci doar acele care au următoarele proprietăńi: pot tăia molecula de ADN în fragmente discrete; posedă o specificitate de acńiune înaltă (taie molecula de ADN într-o anumită succesivitate site -ul de recognińie); pot forma, în rezultatul restricńiei, margini lipicioase la capetele fragmentului de ADN (această proprietate nu este caracteristică tuturor restrictazelor); pot fi izolate relativ uşor în stare pură din mediul incubańional. La repartińia ADN-ului este implicată ADN-ligaza, care poate lega unele fragmente de restricńie. Acestea şi alte enzime stau la baza obńinerii moleculelor recombinate de ADN (fig.2). Pentru transferul genelor de la unele organisme la altele sunt utilizańi vectorii (moleculele speciale de ADN ce transferă informańia genetică dintr-o celulă în alta) reprezentańi prin plasmide, virusuri, liposomi, ADN mitocondrial şi ADN cloroplastic. Sistemele vectoriale, utilizate pentru transferul informańiei străine în celulele (organismele) gazdă, trebuie să corespundă următoarelor cerinńe: inofensivitatea vectorului; multiplicarea rapidă în celula-gazdă şi lipsa posibilităńilor de multiplicare în celulele altor organisme; prezenńa unui număr restrâns de situri de recognińie; prezenńa genelor marker pentru selectarea de clone după moleculele recombinate de ADN; izolarea relativ uşoară, clonarea şi expresia în celulele (organismele) străine. În calitate de vectori, plasmidele au căpătat o răspândire deosebită. Plasmidele reprezintă nişte molecule inelare de ADN specifice bacteriilor. Ele pot exista autonom şi determină unele caractere ale bacteriilor, cum ar fi: capacitatea de conjugare, rezistenńa la antibiotice, agresivitatea. Plasmidele necesare pentru transferul de gene trebuie să posede un număr restrâns de regiuni sensibile la acńiunea enzimelor de restricńie. În acest caz, se poate realiza ruperea şi apoi inserńia de ADN exogen în plasmid. Primul plasmid bacterian, folosit ca vector pentru transferul de gene, a fost cel notat psc 101, realizat de S. Cohen (1973).

3 Ingineria genică 3 Fig.2. ObŃinerea moleculelor recombinate de ADN: A) metoda ligazică; B) metoda terminală. Ca vector plasmidic, la plante se foloseşte plasmidul Ti (Tumour inducing) de la bacteria Agrobacterium tumefaciens, care condińionează formarea tumorilor pe tulpinile a numeroase specii de plante dicotiledonate. A doua tehnică de introducere a unei gene într-o bacterie foloseşte ca vector un bacteriofag (fagul leambda λ), al cărui genom (10-50 gene) integrează gena străină. Ea se va sintetiza întocmai ca şi celelalte gene ale virusului, dacă acesta din urmă se va replica în celula bacteriană. Pentru celulele eucariote animale, vectorii virali care se folosesc sunt, de regulă, virusul tumoral SV-40 şi virusul papiloma bovin (BPV). Se crede că vectorii virali vor putea fi utilizańi şi la plante. Un tip particular de vectori reprezintă liposomii, picături foarte mici de lipide produse artificial, în care pot fi incluse gene, precum şi diferite medicamente, enzime etc. Genomul mitocondriilor şi cloroplastelor este similar celui bacterian şi, ca urmare, se crede că el va putea fi utilizat pentru transferul unor gene la organismele eucariote. Celulelor utilizate în experimentele ingineriei genice le sunt înaintate o serie de cerinńe care au menirea de a asigura securitatea investigańiilor ştiinńifice. Conform Regulilor despre molecule recombinate de ADN celulele-gazdă trebuie să satisfacă următoarele cerinńe: capacitatea sporită de implicare în investigańiile ştiinńifice;

4 Ingineria genică 4 incapacitatea de sinteză a anvelopei protectoare în afara laboratorului; capacitatea lizării ADN-ului său în afara laboratorului; imposibilatatea transferului informańiei ereditare altor organisme; imposibilitańea poluării mediului înconjurător în rezultatul transformării şi/sau transfecńiei. În prezent, de rând cu E. coli, în calitate de obiecte de studiu (celule gazdă), se utilizează bacilul fânului (Bacillus subtilis), celulele de drojdii, culturile de celule şi Ńesuturi vegetale şi animale, culturile de protoplaşti. După obńinerea moleculelor recombinate de ADN, ele trebuie transferate în celulele (organismele) procariote sau eucariote pentru funcńionarea lor ulterioară (replicarea şi transmiterea informańiei ereditare). De menńionat că, în cazul operării cu genele organismelor eucariote, genele eucariotelor superioare, de regulă, nu se manifestă în celulele procariote, iar genele eucariotelor inferioare se manifestă doar parńial. Iată de ce, în aceste experimente se acordă o deosebită atenńie direcńiei transferului de informańie ereditară a moleculelor recombinate, adică: de la celula procariotă în celulele pro- sau eucariote şi invers, de la celula eucariotă în eu- sau procariote. Moleculele recombinate ale procariotelor funcńionează uşor în celulele procariote (în calitate de repliconi). Sunt descrise şi cazuri de funcńionare a genelor procariotelor în celulele eucariotelor. K. Merril şi colab. (1971), In. Hors şi colab. (1975) au demonstrat posibilitatea transferului genei β-galactozidazei din E. coli în fibroblastele umane ale unui bolnav de galactozimie cu ajutorul fagului λ (galactozimia este o boală autozomială recesivă ce provoacă dereglarea metabolismului ca rezultat al lipsei enzimei 1-D-galactozo-1- fosfaturidiltransferazei). Expresia genelor eucariotelor în celulele procariote, de asemenea, este posibilă. Devis (1976) a transferat gena histidinei drojdiilor în E. coli cu ajutorul fagilor. Astăzi se obńin pe scară largă produse ale organismelor eucariote în baza bacteriilor (hormoni, interferoni etc.). InformaŃia ereditară străină (a moleculei recombinate), care pătrunde în celula (organismul) gazdă, este protejată pe diferite căi: metilarea ADN-ului (virusurile); transferul moleculei liniare de ADN în formă circulară (fagul λ); blocarea sistemului de restricńii al celulei-gazdă (fagul T3); acńiunea restrictazelor. În acelaşi timp, celula-gazdă îşi protejează informańia ereditară prin diferite mecanisme: acńiunea restrictazelor specifice; metilarea ADN; acńiunea vecinătăńii epigenetice; acńiunea nespecifică a nucleazelor celulare; protecńia mecanică prin membranele celulare; acńiunea proteinelor histonice şi nehistonice;

5 Ingineria genică 5 acńiunea interferonului. 2. Realizările ingineriei genice Datorită cercetărilor în tehnologia ADN-ului recombinat, au fost elaborate metode de transfer de gene în celulele procariote, care pot sintetiza multe proteine utile. Astfel, a devenit posibilă producerea şi chiar comercializarea pe scară largă a unor hormoni (insulina, somatostatina, somatotropina), a interferonului, a preparatelor de diagnosticare etc. a) ObŃinerea insulinei umane şi a altor hormoni. Din 60 de milioane de diabetici, circa 4 milioane necesită un tratament cu insulină. În 1916, E. Sharpy-Schafer a descoperit că insulina este secretată de celule care alcătuiesc insulele Langherhans din pancreas, ceea ce l-a determinat să numească hormonul insulină. În 1921, F. Banting şi H. Best, la Toronto, au izolat din pancreasul de câine hormonul insulină, demonstrând acńiunea lui antidiabetică. În 1923, firma farmaceutică americană Eli Lilly pune deja în vânzare prima insulină animală (în prezent, pentru a obńine circa 100 grame de insulină, este nevoie de 800 kg de pancreas de bou (greutatea medie a unui pancreas de bou este de grame)). Insulina umană este alcătuită din două catene polipeptidice A şi B, compuse respectiv din 21 şi 30 de aminoacizi, a căror secvenńă a fost stabilită în 1955 de F. Sanger. În perioada , trei grupe de cercetători (americani, germani şi chinezi) au reuşit sinteza artificială a insulinei prin intermediul a 170 de reacńii chimice, lucru ce făcea imposibilă producerea insulinei pe cale industrială. Noile tehnologii industriale de obńinere a insulinei umane au fost posibile odată cu extragerea genei insulinei (W. Gillbert şi colaboratorii săi, 1980) şi crearea moleculelor recombinate de ADN în baza plasmidelor (fig.3). Fig.3. Schema obńinerii insulinei umane.

6 Ingineria genică 6 Moleculele recombinate de ADN sunt transferate în colibacili (Escherichia coli), unde are loc realizarea informańiei genetice codificate în molecula de ADN. Paralel cu proteinele specifice bacteriei, se sintetizează şi insulina. Pentru a proteja insulina umană (ea nu este proprie colibacililor şi este distrusă de enzimele bacteriene), în molecula recombinată de ADN se încadrează, pe lângă gena insulinei, şi o genă reglatoare care codifică o proteină specifică colibacililor (de exemplu galactozidaza). Ca rezultat al manifestării informańiei genetice a moleculei recombinate de ADN, se obńine o catenă polipeptidică hibridă, din care mai apoi se separă insulina. Datorită utilizării tehnologiei ADN-ului recombinat, se obńin aproximativ 200 grame de insulină de pe 1 m 3 de mediu de cultură, adică tot atâta cât se poate extrage din aproape 1600 kg de pancreas de bou sau porc. Probele clinice efectuate cu insulina umană, produsă prin tehnici de inginerie genică, au demonstrat că ea nu are efecte secundare şi că poate fi comercializată, adică folosită la tratarea bolnavilor de diabet (din 1982 în SUA, din 1983 în Marea Britanie). Un hormon de mare importanńă biologică este hormonul de creştere sau somatotropina (HGH Human Growth Hormone), secretat de lobul anterior al hipofizei. Molecula hormonului cuprinde 191 de aminoacizi. AbsenŃa lui provoacă nanismul hipofizar, ce are o frecvenńă de per milion de persoane. Tratamentul cu acest hormon se realizează începând cu vârsta de 4-5 ani şi până la puberitate, în doze de minimum 6 mg pe săptămână per persoană. Somatrotopina este un hormon cu o specificańie înaltă şi nu poate fi utilizat de la animale. Din hipofiza unui cadavru se extrag doar 4-6 mg de hormon, heterogen şi impurificat. Iată de ce, producerea acestui hormon prin tehnici de inginerie genică prezintă un interes deosebit. Sinteza acestui hormon pe cale artificială s-a început cu producerea de ADNc (ADNul copie) cu ajutorul revers-transcriptazei, având ca matrice ARNm din hipofize (transcripńie inversă). Acesta a fost clonat, apoi tăiat cu enzime de restricńie pentru obńinerea secvenńei nucleotidice corespunzătoare somatotropinei, cu excepńia fragmentului ce determină primii 23 de aminoacizi. Fragmentul în cauză era clonat separat, ca rezultat al unei sinteze chimice, apoi cele două segmente unite, la ele se adăugă segmente reglatoare şi pe baza plasmidelor se obńine plasmidiul recombinat cu gena HGH (a somatotropinei). Colibacilii, primind acest plasmid recombinat, sintetizau somatotropina (la 1 litru de mediu de cultură se obńine 2,0-2,5 mg somatotropină). În prezent, cu ajutorul bacteriilor recombinate sunt obńinuńi şi alńi hormoni, de exemplu, thimopoietina ce conńine 49 de aminoacizi şi este secretată de timus. În ce priveşte hormonii cu molecule mai mici (sub 20 de aminoacizi), este preferabilă sinteza lor pe cale chimică. b) ObŃinerea interferonilor. Interferonii sunt produşi de celule specializate pentru lupta împotriva infecńiilor virale. Ei au fost descoperińi în 1957 de F. Isaacs şi I. Lindenmann la Institutul NaŃional de Cercetări Medicale de lângă Londra. Interferonii reprezintă nişte substanńe proteice (din de aminoacizi) şi sunt produşi în cantităńi infime de celula animală sau umană, când un virus pătrunde în organism. Există mai multe tipuri de interferoni: interferonul leucocitar (α), interferonul fibroblastelor (β) şi interferonul limfocitelor T sau interferonul imun (γ). Ei pot fi obńinuńi prin tehnici clasice (din celulele sanguine şi din fibroblaste) şi prin tehnici de recombinare genică. Pentru a obńine interferon din celulele sanguine sau din fibroblastele cultivate, acestea sunt infectate cu un virus, iar după 24 de ore prin centrifugare şi purificare se izolează din

7 Ingineria genică 7 mediul de cultură. Dintr-un litru de sânge se poate extrage până la 1 mkg (10-3 grame) de interferon. În 1980, savanńii americani W. Gilbert şi C. Weissmann şi japonezul T. Taniguki au produs interferonul uman cu ajutorul unor colibacili cu genomul modificat. Celulele de E. coli nu pot transforma predecesorul interferonului în interferon activ, de aceea, inińial, complexul de ADN, format dintr-o regiune nucleotidică reglatoare şi o regiune ce determină structura interferonului, este supus acńiunii enzimelor de restricńie, care taie molecula de ADN aproximativ la frontiera acestor două catene (genei interferonului nu-i ajunge un triplet ATG). Codonul omis (ATG) este anexat prin sinteză chimică. Gena interferonului se încadrează în continuare într-un plasmid, care se transferă în E. coli. Astfel, colibacilii sintetizează interferonul uman. Dintr-un litru de suspensie de E. coli (circa celule) se pot extrage până la 5 mg de interferon (adică de 5000 de ori mai mult decât din 1 litru de sânge). Tehnicile de inginerie genică permit obńinerea preparatelor hibride de interferon cu un spectru larg de acńiune. c) Transferul de gene în celulele vegetale şi animale. Tehnicile de recombinare genetică permit transferul genelor importante în celulele de plante şi animale, iar în rezultat se obńin plante şi animale transgenice. Pentru transferul de gene la plante sunt utilizate bacteriile Agrobacterium tumerfaciens (descoperite în 1907 de E. Smith şi C. Townsend), care provoacă formarea unor tumori cancerogene (crown gall) pe tulpinile unor plante (la speciile din 93 de familii de dicotiledonate). Plasmidul Ti (tumor inducing) descoperit la A.tumefaciens cauzează tumori la plante prin transferul unui segment de ADN (ADN-T) din plasmid în celulele vegetale. Strategia pentru transferul genelor cu ajutorul plasmidului Ti în celula vegetală include: introducerea segmentului de ADN-T într-un plasmid de E. coli; introducerea în plasmidul format a genei necesare şi a genei marker (gena pentru rezistenńă la canamicină); introducerea plasmidului recombinat în Agrobacterium tumerfaciens; infecńia cu A.tumerfaciens a plantelor respective; selectarea plantelor transformate (fig.4). Pentru realizarea transferului de gene în celula vegetală este utilizată metoda culturilor de celule şi Ńesuturi în vitro. Firma americană Monsanto comercializează deja plante transgenice (transformate) de cartof, rezistente la gândacul de Colorado. O realizare remarcabilă în domeniul transferului de gene în celula animală o constituie şoarecii transgenici. Gena hormonului de creştere de la şobolan a fost transferată prin microinjecńii în cele două nuclee ale ovulului proaspăt fecundat de la şoarece (în fiecare nucleu câte circa 600 copii ale genei hormonului de creştere). Ovulele fecundate (170) au fost implantate în oviductul unei femele-receptor. În consecinńă, s-au obńinut 21 de şoricei. La 6 dintre ei s-a constatat o cantitate mărită a hormonului de creştere (de de ori). Aceşti şoricei aveau o creştere mult mai rapidă şi prezentau greutăńi corporale superioare animalelor-martor.

8 Ingineria genică 8 Fig.4. Transferul de gene cu ajutorul plasmidului Ti în celula vegetală.