ASIMILACIJA AZOTA, SUMPORA I FOSFORA

Transcript

1 ASIMILACIJA AZOTA, SUMPORA I FOSFORA

2 Više biljke, kao autotrofni organizmi, mogu da sintetišu organske supstance iz neorganskih, koje usvajaju uglavnom iz zemljišta. Inkorporacija mineralnih elemenata (nutrijenata, hranljivih supstanci za biljke) u organska jedinjenja kao što su pigmenti, enzimski kofaktori, lipidi, nukleinske kiseline i aminokiseline, tj. jedinjenja koja su od krucijalnog značaja za život biljaka, označava se terminom asimilacija nutrijenata. Asimilacija ugljenika u organska jedinjenja (šećere i druge ugljene hidrate) obavlja se u procesu fotosinteze. Za biljke je, međutim, od velikog značaja i asimilacija azota, sumpora i fosfora.

3 Procesi redukcije nitrata i nitrita i redukcije sulfata i sulfita, koji su deo asimilacije azota i sumpora kod viših biljaka, zajedno sa fotosintezom čine najvažnije metaboličke procese kod biljaka. Smatra se da ti procesi čine biljke autotrofima i da su specifični za biljke. Asimilacija azota i sumpora zahtevaju niz biohemijskih reakcija koje spadaju u reakcije sa velikim energetskim zahtevima (za njih se troši mnogo molekula ATP-a).

4 Za asimilaciju azota iz nitrata (NO - 3 ), pri čemu se azot u formi nitrata konvertuje u energijom bogatiju formu nitrita (NO - 2 ), a zatim u energijom još bogatiju formu amonijuma (NH + 4 ) i najzad u amidni oblik (NH 2 ) azota u sastavu glutamina, potrebna je energija ekvivalentna onoj koju sadrži 12 molekula ATP po jednom atomu azota koji se asimiluje. Za proces biološke fiksacije azota (konverzija N 2 u NH 3 ), kod biljaka koje zahvaljujući simbiozi sa bakterijama diazotrofima imaju tu mogućnost, zajedno sa potonjom asimilacijom amonijaka u aminokiseline potreban je utrošak energije ekvivalentne onoj koju sadrži 16 molekula ATP, po svakom atomu azota koji se asimiluje. 2- Za asimilaciju SO 4 u aminokiselinu cistein, posredstvom dva puta pronađena kod biljaka, troši se ekvivalent energije koji sadrži 14 molekula ATP. Asimilacija drugih nutrijenata, a naročito katjona kao što su Ca 2+, Mg 2+ i Mo 6+, zahteva formiranje kompleksa sa organskim jedinjenjima (Ca 2+ se vezuje za pektine ćelijskog zida, Mg 2+ za hlorofil, a Mo 6+ za enzime kao što su nitrat reduktaza i nitrogenaza), koji su veoma stabilni. Uklanjanje nutrijenata iz tih kompleksa obično dovodi do gubitka funkcije organskih jedinjenja koja su u kompleksu sa nutrijentima.

5

6 Asimilacija azota U biosferi se nalazi više različitih oblika azota: kao gas, molekularni N 2 (oko 78%) u atmosferskom vazduhu, u obliku - neorganskih jona NO 3 i NH + 4 ulazi u sastav zemljišta, kao sastojak mnogih organskih jedinjenja rasprostranjen je u celom živom svetu. Svi oblici azota se u prirodi neprekidno transformišu jedan u drugi i te promene su povezane u ciklus azota. Za većinu živih organizama najveći rezervoar azota (vazduh) nije direktno dostupan. Snabdevanje azotom iz atmosfere podrazumeva raskidanje izuzetno stabilne trostruke kovalentne veze između dva atoma azota u molekulu gasovitog azota, kako bi nastali amonijum (NH 4 + ) i nitratni (NO 3 - ) joni. Te hemijske reakcije su poznate pod nazivom fiksacija azota i mogu da se odvijaju i industrijskim (Haber-Bosch-ov proces proizvodnje amonijaka) i prirodnim (električna pražnjenja u atmosferi, fotohemijske reakcije i biološka fiksacija) putem.

7

8

9 Više biljke dobijaju azot isključivo iz zemljišta na kome žive. Blizu 90% azota u zemljištu se nalazi u obliku organskih azotnih jedinjenja. Različite bakterije i gljivice razlažu organska jedinjenja u procesu mineralizacije ili amonifikacije, pri čemu se obrazuje amonijak. Amonijumovi joni su podložni hemosintetičkoj oksidaciji koju obavljaju bakterije: Nitrosomonas oksiduje NH 4 + u NO 2 - Nitrobacter oksiduje NO 2 - u NO 3 - Nitrat koji na taj način nastaje, sa nitratom koji potiče iz drugih izvora (veštačka đubriva i dr.), predstavlja najvažniji oblik azota koji biljke primaju. Količina nitrata u zemljištu nije stabilna - gravitaciona voda spira nitrate u dublje slojeve zemljišta, zbog čega oni postaju nedostupni za biljku (u okeanima se to takođe dešava povremeno, ali, naravno, na drugi način) Denitrifikacija (Micrococcus denitrificans - prevodi nitrate u molekulski N 2 i vraća azot u atmosferu).

10 Kad se azot fiksira u amonijum i nitrat, on ulazi u ciklus azota i može da pređe kroz više organskih i neorganskih formi pre nego što se ponovo vrati u oblik molekularnog azota. Biljkama i životinjama je dostupan azot u obliku nitrata i amonijuma. Ukoliko količina usvojenih (korenom) nitrata prevazilazi kapacitet biljke da ih asimiluje, nitrati se akumuliraju u biljci i ona može i da ih skladišti i da ih transportuje iz tkiva u tkivo bez štetnih posledica. Međutim, prevelike količine nitrata u biljkama imaju štetne efekte na biljojede. Akumulacija amonijum jona u biljkama je toksična i za biljke i za biljojede. Oni su dekuplujući agensi u fotosintezi i disanju (rasipaju gradijent protona na tilakoidnim membranama i unutrašnjim membranama mitohondrija). Zbog toga ih biljke ili asimiluju blizu mesta usvajanja ili deponuju u vakuolama.

11 Biološka redukcija nitrata i nitrita Biljke usvajaju nitrate iz zemljišta, korenom, aktivnim transportom kroz ćelijske membrane. Transport pripada sekundarnom aktivnom transportu kotransporteri obavljaju simport protona i nitrata iz apoplasta u citoplazmu. NO 3 - mora da se redukuje da bi se asimilovao, a redukcija se odvija u dva stupnja: 1) nitrat se najpre redukuje u nitrit, a zatim se 2) nitrit redukuje u amonijumov jon. Ove procese, koji pretstavljaju prvi korak u asimilaciji azota, katalizuju dva enzima, nitratna i nitritna reduktaza.

12 Gde se u biljci odigrava biološka redukcija nitrata i nitrita? Redukcija nitrata može da se obavi u korenu, gde se izgrađuju aminokiseline i amidi, koji se u stablo transportuju putem ksilema. Nitratni jon može i da bude transportovan u listove, u kojima se onda obavljaju redukcija nitrata i sinteza organskih jedinjenja. Dva ekstremna primera su biljke Lupinus albus i Xanthium strumarium. Kod prve se više od 90% usvojenih nitrata redukuje u korenu, a korenovi druge vrste gotovo uopšte ne redukuju nitrat, nego se ovaj jon transportuje u listove. Kod jedne iste biljke raspodela asimilacije azota između korena i lista može da varira, zavisno od stadijuma razvića ili nekih spoljašnjih činilaca. Pri niskoj koncentraciji nitrata (oko 1 mol m -3 ), kakva se obično nalazi u prirodi, asimilacija u korenu je znatna u odnosu na list. Pri većoj koncentraciji nitrata (oko 20 mol m -3 ), koja se postiže primenom đubriva, asimilacija u listovima se značajno povećava i može da prevaziđe onu u korenu.

13 U korenu se deo aminokiselina koristi za sinteze proteina, a deo se transportuje ksilemom u nadzemne delove biljke. Razlikuju se dve grupe biljaka po tome u kom organskom obliku pretežno transportuju azot ksilemom: 1) biljke kod kojih su glavni transportni oblik azota amidi (asparagin i glutamin) i 2) biljke koje transportuju azot u obliku ureida (alantoin, alantoinska kiselina i citrulin).

14 1) Redukcija nitrata u nitrite Redukcija nitrata u nitrite dešava se uvek u citoplazmi (bez obzira na to da li se odvija u ćelijama korena ili ćelijama lista). Reakciju katalizuje enzim nitratna reduktaza (NR). Donor elektrona za redukciju nitrata može biti redukovani NADPH ili NADH. Izoforme NR se razlikuju po tome da li elektrone primaju samo od NADH ili i od NADH i od NADPH (ove druge su zastupljene u tkivima koja nisu zelena, tkivima korena napr.) NR je dimer, sastavljen iz dve identične subjedinice, od kojih svaka nosi po 3 prostetične grupe: FAD (flavin adenin dinukleotid), hem (u sastavu citohroma b 557 ) i molibdenski kofaktor (MoCo; molibden vezan za pterin). Domeni polipeptida za koje se vezuju prostetične grupe razdvojeni su domenima koji ih spajaju (spojnice I i II), koji su veoma varijabilni po primarnoj strukturi. Na enzimu postoje dva aktivna mesta za jedno (na C-terminusu) vezuje se NAD(P)H, a za drugo (na N-terminusu) nitrat. NR funkcioniše kao elektron-transportni lanac prenosi 2 elektrona sa NAD(P)H, na FAD, zatim na gvožđe hema, pa na molibden MoCo, koji prima ta dva elektrona i redukuje nitrat do nitrita. Redukciju nitrata inhibiraju cijanid i azid (inhibitori disanja).

15

16 NR je inducibilan enzim (supstratna indukcija enzima). Nitrati, svetlost, citokinini (grupa biljnih hormona) i ugljeni hidrati učestvuju u regulaciji aktivnosti nitratne reduktaze na transkripcionom i translacionom nivou. Nitrati stimulišu ekspresiju gena za NR (supstratna indukcija enzima), a svetlost i nivoi šećera u ćeliji utiču na aktivnost ovog enzima posredstvom fosforilacije i defosforilacije.

17

18 Dnevni (cirkadijalni) ritam asimilacije azota

19 2) Redukcija nitrita u amonijum NO 2 - je veoma reaktivan i potencijalno toksičan jon, pa se iz citoplazme odmah transportuje u plastide, gde se redukuje do amonijum jona. Redukciju nitrita obavlja enzim nitritna reduktaza (NiR). Ovaj enzim se nalazi isključivo u plastidima, i to u hloroplastima ćelija lista i u proplastidima ćelija korena. Nitritna reduktaza obavlja prenos 6 elektrona na nitrit, pri čemu se ne pojavljuju međuprodukti, nego se odmah dobija amonijumov jon. NiR je monomerni protein sa dve prostetične grupe: 4Fe-4S centar i sirohem (specijalizovani hem). Donor elektrona je redukovani feredoksin (Fd red ) koji elektrone dobija ili od P700, u fotosintezi, ili od NADPH koji nastaje u oksidativnom pentoznom ciklusu. U ćelijama korena, gde nema hloroplasta i redukovanog feredoksina, ulogu donora ima protein sličan feredoksinu koji elektrone prima od NAD(P)H koji nastaje u procesu disanja. Geni za NiR nalaze se u jedru, a enzim se sintetiše u citoplazmi. Nitrati i svetlost indukuju ekspresiju gena za NiR, a aspasagin i glutamin utiču na represiju tih gena.

20 sirohem

21

22 Asimilacija amonijumovih jona Azot se ugrađuje u organska jedinjenja samo u obliku amonijumovih jona, koje biljka ili usvaja iz zemljišta ili dobija redukcijom nitrata i nitrita. Značajan izvor amonijum jona kod C-3 biljaka je fotorespiracija. Amonijum joni mogu biti i proizvod katabolizma azotnih jedinjenja. Akumulirani amonijum joni su toksični za fotosintezu, pa se onda odmah asimiluju ili se deponuju u vakuoli. Asimilacija amonijum jona u azotna organska jedinjenja uvek ide preko amonokiselina. Za sintezu aminokiselina potrebni su: amonijum joni, ketokiseline, ATP i reduktanti. Biosinteza aminokiselina zavisi od fotosinteze i disanja. Primarna sinteza aminokiselina podrazumeva cikličan proces u kojem se amonijum grupa vezuje za glutaminsku kiselinu pri čemu nastaje glutamin, koji opet transaminacijom (uz prisustvo α keto glutarne kiseline) može da da dve glutaminske kiseline. Za proces su potrebni ATP i dva enzima glutamin sintetaza (GS) i glutamat sintaza (GOGAT) koji čine sistem GS/GOGAT. Pošto je glutaminska kiselina prva aminokiselina koja nastaje asimilacijom amonijum jona, ona se naziva primarnom aminokiselinom. Ona i glutamin su davaoci NH 2 grupe za sve ostale aminokiseline, kao i izvor organskog azota za sintezu složenijih organskih azotnih jedinjenja.

23

24 GOGAT elektrone prima od NAD(P)H u plastidima tkiva koja ne fotosintetišu (u korenu) ili od redukovanog feredoksina u hloroplastima tkiva koja fotosintetišu (u listu). Postoje najmanje dva sistema GS/GOGAT u biljnim ćelijama. Jedan ima izoenzim GS2, koji se nalazi u plastidima ćelija listova i korena. Taj enzim koristi ATP iz fotosinteze (ili glikolize u korenovima) i amonijum jone koji nastaju redukcijom nitrita ili u fotorespiraciji. GS2 ima visok afinitet ka amonijum jonima, vezuje ih i sprečava njihovo štetno dejstvo na fotosintezu. Drugi GS/GOGAT sistem ima izoenzim GS1 koji se nalazi u citoplazmi, koristi ATP iz glikolize i amonijum jone koji se usvajaju iz zemljišta ili nastaju u katabolizmu azotnih organskih jedinjenja. GS se nalazi i u citoplazmi i u plastidima, ali je kontrola ekspresije gena za te različito locirane enzime različita. Svetlost i nivoi ugljenih hidrata utiču na ekspresiju GS koje su aktivne u plastidima, dok ne utiču značajno na citosolnu GS. Kad se jednom asimiluje u glutamat i glutamin, azot se ugrađuje u druge aminokiseline u reakcijama transaminacije koje katalizuju enzimi aminotransferaze (prenose amino grupe). Aminotransferaze imaju kao kofaktor piridoksal fosfat (vitamin B6) i nalaze se u: citoplazmi, mitohondrijama, hloroplastima, peroksizomima i glioksizomima.

25

26

27 Sve aminokiseline nastaju transaminacijom iz 3 ketokiseline (piruvat, oksaloacetat i α ketoglutarat) ili od intermedijera u metabolizmu ugljenih hidrata (glikolat, PEP i eritrozo-4-fosfat). Piruvat alanin, valin, leucin i izoleucin cijanogeni glukozidi Oksaloacetat asparaginska kiselina, lizin, treonin i metionin purin, alkaloidi, etilen, poliamini α ketoglutarat glutaminska kiselina, arginin, prolin, hidroksiprolin, ornitin, citrulin 5-ALA, pirimidin, alkaloidi, osmoprotektanti, strukturni proteini ćelijskog zida Glikolat glicin, serin, cistein (fotorespiracija) purin Eritrozo-4-fosfat i PEP fenilalanin, tirozin, triptofan (put šikiminske kiseline) indolna jedinjenja, auksini, sekundarni metaboliti, fenolna jedinjenja, flavonoidi, alkaloidi, lignin

28 Asimilacija sumpora U prirodi postoji i kruženje sumpora (ciklus sumpora). Sumpor se u zemljištu nalazi u obliku različitih mineralnih soli i organskih jedinjenja. Sumporni gasovi se nalaze u atmosferi. Industrijalizacija i sagorevanje fosilnih goriva dovode do aerozagađenja sumpornim jedinjenjima kao što su SO 2 i H 2 S, koji u dodiru sa vodom grade sumpornu kiselinu i dospevaju u zemljište preko kisele kiše. Svi ovi oblici sumpora su dostupni biljkama (čak i SO 2 koji ulazi kroz stome, može se iskoristiti, ali u velikim dozama dovodi do propadanja tkiva jer se konvertuje u sumpornu kiselinu) i one ih mogu koristiti. Sumpor ulazi u sastav većeg broja organskih jedinjenja koja su od vitalnog značaja za biljke: aminokiseline cistein i metionin, CoA, vitamini tiamin i biotin, sulfolipidi, proteini koji sadrže fero-sumporni centar i učestvuju u prenošenju elektrona, glutation itd. Za funkcionisanje proteina od naročitog su značaja disulfidne veze. Sulfatni jon je najčešći oblik sumpora koji biljka usvaja iz zemljišta.

29

30 Biološka redukcija sulfata i sulfita Usvajanje sulfata (SO 4 2- ) iz zemljišta u ćelije korena je aktivan proces, pripada sekundarnom aktivnom transportu i u njemu učestvuje kotransporter koji obavlja simport protona (niz gradijent koncentracije) i sulfata (uz gradijent koncentracije). Sulfati se akumuliraju u vakuolama ili podležu procesu redukcije, koja prethodi asimilaciji u organska jedinjenja. Biološka redukcija sulfata je analogna redukciji nitrata i samo su biljke u stanju da je obave. Iako je samo 0,2% redukcije CO 2 i 20 puta manja od redukcije nitrata, ona je isto toliko važna kao i druge dve biološke redukcije i pripada procesima koji su bitni za autortofiju biljaka.

31

32 Sulfatni jon je inertan i njegovoj redukciji prethodi aktivacija (vezivanje za ATP), a zatim sledi njegova redukcija prvo do sulfita (2 elektrona), pa potom redukcija sulfita do sulfida (6 elektrona). Dva ključna jedinjenja u procesu redukcije sulfata do sulfida su APS i PAPS. Veliki značaj ima i tripeptid (Glu-Cys-Gly) glutation, koji je i transportni oblik asimilovanog, organskog sumpora. Asimilacija sulfida podrazumeva vezivanje za serin (zamenu acetil grupe SH grupom), pri čemu nastaje aminokiselina cistein. Cistein se konvertuje u metionin. Cistein je toksičan u većim količinama i odmah se ugrađuje u organska jedinjenja, pre svih u glutation.

33 Redukcija sulfata i sulfita dešava se u hloroplastima ćelija lista (mezofilnih kod C-3 biljaka, a ćelija sare provodnih snopića kod C-4 biljaka) i plastidima ćelija korena. Listovi su aktivniji u asimilaciji sumpora od korenova, zato što fotosinteza obezbeđuje velike količine redukovanog feredoksina (donor elektrona), a fotorespiracija znatne količine serina (iz kojeg nastaje cistein). Asimilovani sumpor se iz listova transportuje floemom do mesta u biljci gde je intenzivna sinteza proteina (vrhovi stabla i korena, plodovi itd), uglavnom u obliku glutationa.

34 Asimilacija fosfora Kao i u slučaju azota i sumpora, u prirodi postoji ciklus fosfora. Fosfor se usvaja iz zemljišta u obliku fosfata (HPO 4 2- ), sekundarnim aktivnim transportom (kotransporteri obavljaju simport fosfata i protona). Za razliku od azota i sumpora, fosfor se asimiluje u organska jedinjenja kao fosfat, bez prethodne redukcije. Prvi stupanj usvajanja fosfora je vezivanje fosfata za inozitol (estarske veze sa svih 6 OH grupa inozitola), pri čemu nastaje fitinska kiselina. Soli fitinske kiseline sa kalcijumom i magnezijumom su fitini. Fitini se nalaze u većim količinama u semenima i plodovima biljaka i predstavljaju rezervu neorganskog fosfata i dvovalentnih katjona. Prvo organsko jedinjenje koje sadrži fosfate i ima metaboličku funkciju je ATP. Sinteza ATP-a obavlja se kod biljaka: u hloroplastima (fotosintetička fosforilacija), mitohondrijama (oksidativna fosforilacija i Krebsov ciklus) i citoplazmi (glikoliza). Fosfati učestvuju u estarskim i anhidridnim vezema, koje pri hidrolizi oslobađaju veliku energiju, zbog čega se smatraju najvažnijim načinom transformacije i prenosa energije u ćeliji. Fosfor ulazi u sastav mnogih važnih organskih jedinjenja: nukleotida i nukleinskih kiselina, fosfolipida, fosforilisanih šećera, koenzima (NAD, NADP i FAD). Fosfati mogu imati i regulatornu funkciju u nekim metaboličkim procesima (kao što je sinteza skroba, na primer).

35

36

37 BIOLOŠKA FIKSACIJA AZOTA Ima značajno mesto u ciklusu azota. Podrazumeva redukciju atmosferskog azota (N 2 ) do amonijum jona (NH 4 + ). Sposobnost biološke fiksacije azota ograničena je isključivo na prokariotske organizme, ali neke više biljke, zahvaljujući simbiozi sa njima, mogu da koriste proizvode fiksacije N 2. U ovakvoj simbiozi mikroorganizmi obavljaju redukciju atmosferskog azota, a biljka-domaćin prihvata amonijum jon, asimiluje ga i mikroorganizme snabdeva organskim jedinjenjima. Organizmi koji fiksiraju atmosferski azot nazivaju se diazotrofima. Diazotrofi pripadaju različitim taksonima i, osim fiksacije azota, nemaju mnogo zajedničkih osobina. Među njima se nalaze cijanobakterije, aktinomicete i bakterije različitih rodova, autotrofne i heterotrofne, anaerobne i aerobne. Dele se u dve osnovne grupe: slobodni diazotrofi (obligatni aerobi, aerobi, fakultativni anaerobi, obligatni anaerobi) simbiotički diazotrofi - Rhizobium, Bradyrhizobium, Azorhizobium simbioza sa biljkama iz reda Fabales (leguminoze: grašak, pasulj, bob, soja, kikiriki, naut, detelina, lucerka); Frankia (aktinomiceta) simbioza sa drvećem i žbunjem (aktinoriza); Nostoc, Anabaena (cijanobakterije) - simbioza sa biljkama iz rodova Cycas i Ceratozamia, Azolla (paprat), Anthoceros (mahovina) i mnogim lišajima.

38

39 Frankia alni - Alnus glutinosa (Betulaceae) aktinoriza

40 Slobodni diazotrofi koji ne žive u anaerobnim uslovima moraju za fiksaciju N 2 da obezbede takve uslove kako bi proces fiksacije mogao da se odvija. Cijanobakterije (Nostoc, Anabaena, Calothrix) mogu da fiksiraju azot i kao slobodni oblici. Kod njih se anaerobni uslovi obezbeđuju prostornim razdvajanjem fiksacije N 2. U njihovim specijalizovanim ćelijama, heterocistama, se odvija fiksacija azota. Heterociste imaju zadebljale ćelijske zidove, nepropustljive za O 2. U njihovim membranskim sistemima nema PSII, pa pri transportu elektrona ne proizvode kiseonik i obavljaju samo ciklični transport elektrona, sintetišući samo ATP. Heterociste nemaju enzime reduktivnog pentoznog ciklusa, ali je oksidativni pentozni ciklus vrlo aktivan u njemu nastaje NADPH koji predaje elektrone feredoksinu, neposrednom donoru elektrona za fiksaciju azota. N 2 ulazi u heterociste kroz plazmodezme, a O 2 koji tako uđe, odmah se troši u veoma intenzivnom procesu disanja. Kod ovih diazotrofa svetlost je uslov za fiksaciju azota, kao i za fotosintezu u drugim ćelijama.

41 Simbiotički diazotrofi Simbioza između leguminoza i rizobija nije obavezna. Bakterije (tri roda - Rhizobium, Bradyrhizobium, Azorhizobium) koje fiksiraju azot, a ulaze u simbiozu sa biljkama, žive inače (u odsustvu biljaka-domaćina i pri dobroj snabdevenosti zemljišta azotom) kao heterotrofni, slobodni oblici u zemljištu i tada ne fiksiraju azot. Biljke-domaćini mogu da rastu i bez simbioze sa diazotrofima i njihovo klijanje nije pod kontrolom simbionata. Ako na zemljištu raste biljka koja je njihov potencijalni domaćin i ako je količina azota u zemljištu mala, onda dolazi do specifičnog oblika simbioze, koja podrazumeva infekciju biljke bakterijama i formiranje posebnih organa na korenovima biljke (kvržice, nodule). Fiksacija azota kod leguminoza dešava se, prema tome, samo u nodulama na korenovima biljaka. Infekcija bakterijama i formiranje nodula su nezavisni procesi koji se dešavaju paralelno, a diazotrofi indukuju biljke da formiraju nodule na korenovima. Većina vrsta navedena tri roda diazotrofa ima svoje specifične domaćine po kojima dobijaju i ime. Uspostavljanje simbioze zahteva razmenu signala između potencijalnih simbionata.

42

43 U razmeni signala ulogu imaju specifični biljni i bakterijski geni biljni nodulin (Nod) geni koji se eksprimiraju samo u nodulama i bakterijski nodulacioni (nod) geni koji učestvuju u formiranju nodula. Svi nod geni osim jednog su inducibilni. Proces formiranja simbioze počinje hemotaksijom rizobija ka korenovima biljke domaćina. Ovaj lokomotorni pokret bakterija izazvan je hemijskim supstancama koje korenovi u određenoj fazi razvića biljke oslobađaju u zemljište (flavonoidi i betaini). Te supstance aktiviraju prvo nodd gen, a on dalje aktivira sve ostale nod gene. Proizvodi aktivnosti nod gena su proteini koji učestvuju u biosintezi Nod faktora. Nod faktori su derivati ugljeno-hidratnih komponenti bakterijskog ćelijskog zida, lipo-oligosaharidi, i oni su specifični za biljku-domaćina. Nod faktori deluju kao povratni signali na korenske dlačice i ćelije kore korena. Nod faktori aktiviraju lektine (strukturne proteine ćelijskog zida biljaka koji imaju funkciju u prepoznavanju ćelija) u ćelijskim zidovima korenskih dlačica leguminoza, a ovi prepoznaju i olakšavaju vezivanje specifičnih rizobija koje mogu da uđu u simbiozu sa tom vrstom leguminoza. Slede dva procesa koji se dešavaju paralelno: formiranje infekcione niti i formiranje nodula. U formiranje nodula umešano je nekoliko grupa biljnih hormona citokinini, auksini i giberelini koje sintetišu rizobije, kao sekundarne metabolite.

44 Kada infekciona nit dođe do primordije nodule, bakterije izlaze iz niti, povećavaju svoju veličinu, prestaju da se dele i opstaju u ćelijama nodule kao endosimbiotske organele, bakteroidi, obavijene peribakteroidnom membranom. Leghemoglobin se sintetiše istovremeno sa formiranjem bakteroida.

45

46 Biljni hormoni, čiju sintezu određuju bakterijski geni, regulišu procese dediferencijacije, deobe i rediferencijacije ćelija korena, koje rezultiraju formiranjem prvo primordija nodula, a zatim i nodula. U morfološkim (vaskularni elementi i meristemski centar) i biohemijskim promenama koje se dešavaju tokom formiranja nodula imaju ulogu i proteini nodulini (enzimi i transporteri), koji su kodirani biljnim Nod genima (ne eksprimiraju se kad nema infekcije rizobijama). Nodule mogu biti izdužene (indeterminantne) ili loptaste (determinantne) u zavisnosti od toga da li u njima postoji aktivan meristemski centar ili ne.

47 Indeterminantne nodule su sastavljene iz 3 tkiva: meristemskog, provodnog i parenhimskog. Meristemsko tkivo nalazi se na vrhu izdužene nodule. Provodno i parenhimsko tkiva su organizovana u periferno postavljene kortikalne slojeve i centralno postavljeno tkivo koje sadrži bakteroide. U diferenciranim nodulama, u centralnom delu, razlikuje se 5 razvojnih zona, koje su rezultat produžene aktivnosti nodule: I. meristemsko tkivo II. zona infekcije III. zona rane simbioze IV. zona kasne simbioze V. senescentna zona Fiksacija azota odvija se samo u zoni kasne simbioze. Determinantne nodule gube meristemsko tkivo ubrzo posle infekcije i dalje rastu samo na osnovu povećanja volumena ćelija. One su loptaste i sve ćelije u nodulama su u istoj fazi razvića. Karakteristične su za biljne simbionte poreklom iz tropskih krajeva.

48 Leghemoglobin je produkt kasnih Nod gena. Nalazi se u citoplazmi inficiranih ćelija nodule, a funkcija mu je da veže O 2, transportuje ga do bakteroida (kojima je kiseonik potreban za disanje) i obezbedi anaerobne uslove unutar nodula (ima veoma visok afinitet za vezivanje kiseonika).

49 Redukcija N 2 Biološka redukcija N 2 odigrava se na isti način kod svih diazotrofa. U reakciji iz jednog molekula azota nastaju dva molekula NH 3, a redukuju se i 2 protona do molekulskog vodonika. Enzim koji učestvuje u katalizi reakcije je nitrogenaza. Nitrogenaza je zapravo enzimski kompleks koji se sastoji iz dva enzima: Protein I = molibdo-fero protein (MoFe-protein) sastoji se iz 4 subjedinice, od kojih svaka sadrži 2 atoma molibdena i različit broj Fe-S kompleksa. Protein II = fero-protein (Fe-protein) sastoji se iz 2 subjedinice i sadrži 4 Fe-S kompleksa. Nitrogenaza je osetljiva na kiseonik. U aerobnoj sredini oba proteina u sastavu nitrogenaze se ireverzibilno inaktiviraju. Zbog toga je uslov za fiksaciju N 2 da se reakcija odvija u anaerobnoj sredini ili u sredini u kojoj je nivo kiseonika veoma nizak.

50 Uslovi za funkcionisanje nitrogenaze: 1. Adekvatni donori elektrona 2. Velika količina ATP 3. Anaerobna sredina

51 Donor elektrona za redukciju azota je redukovani feredoksin. Fd red redukuje prvo Fe-protein, za šta je potreban utrošak ATP i prisustvo Mg 2+, a zatim on redukuje MoFe-protein. Akceptor elektrona su N 2 i protoni, a proizvod reakcije su amonijak i molekulski vodonik. Redukcija protona se neizbežno dešava uporedo sa redukcijom azota, pa se reakcija može predstaviti dvema jednačinama: N 2 + 6e ATP + 6H + 2H + + 2e - + 4ATP 2NH 3 +12ADP + 12P i H 2 + 4ADP + 4P i Nitrogenaza može da prenese elektrone na različite supstrate, ali u prirodnim uslovima akceptori elektrona su N 2 i H +. Redukcija acetilena u etilen, koju takođe može da katalizuje ovaj enzim, koristi se kao kriterijum za dokazivanje nitrogenazne funkcije kod potencijalnih diazotrofa. Smisao redukcije protona do molekulskog vodonika još nije razjašnjen. Proces redukcije azota do amonijaka je energetski skup proces za prenos svakog elektrona troše se 2 molekula ATP.

52

53 U nodulama biljke-domaćina energija potrebna za disanje bakteroida i za fiksaciju azota potiče iz metaboličkih procesa biljke. Amonijak koji nastaje u nodulama kao proizvod redukcije azota, pošto je toksičan, mora odmah da se asimiluje u organska jedinjenja, a ta organska jedinjenja se transportuju ksilemom u listove. Postoje dva tipa leguminoza (na osnovu toga koja azotna jedinjenja sintetišu u nodulama i transportuju ksilemom): leguminoze koje u kvržicama asimiluju amonijak u amide (uglavnom glutamin i asparagin) koristeći sistem GS/GOGAT leguminoze koje u kvržicama asimiluju amonijak u ureide (alontoinska kiselina, alantoin i citrulin) ova jedinjenja se u listovima katabolizuju u amonijak, a zatim opet asimiluju u glutamin (sistem GS/GOGAT). S obzirom na to da energiju i za fiksaciju azota i asimilate za rastenje bakterija obezbeđuje biljka-domaćin, postoji povezanost procesa biološke redukcije azota sa fotosintezom. Korenovi sa nodulama predstavljaju jedan od uvira sa najvećom snagom privlačnog centra. Nodule, sa druge strane, obezbeđuju veliki deo redukovanog azota za biljku i tako je čine nezavisnom od količine azota u zemljištu. Značaj fiksacije azota i simbioze leguminoza i diazotrofa je u tome da se zahvaljujući njima zemljište obogaćuje azotom, što je od velikog značaja za poljoprivredu.

54

55