9 RUTINNÉ BIOCHEMICKÉ VYŠETRENIA

Transcript

1 9 Rutinné biochemické vyšetrenia RUTINNÉ BIOCHEMICKÉ VYŠETRENIA V nasledujúcom texte sú v abecednom poradí zoradené analyty organické zložky, ktoré sa najčastejšie v klinickej chémii stanovujú. Anorganické zložky a základné vyšetrenie moču sú uvedené až na konci tejto časti. Pre každý analyt je na úvod stručne uvedený jeho klinický význam. Analytické metódy boli vybrané tak, aby ukázali niektoré bežne používané princípy a postupy analýzy. 9.1 Albumín Albumín v organizme reguluje plazmový objem (reguluje koloidne-osmotický tlak plazmy), plní transportnú funkciu (prenáša vyššie karboxylové kyseliny, lipidy, aminokyseliny, hormóny, ale aj liečivá a toxické látky) a tiež funkciu rezervoára bielkovín (aminokyselín). Stanovenie v sére/plazme Albumín sa v slabo kyslom prostredí vyskytuje vo forme katiónu, ktorý môže viazať aniónové farbivo obsahujúce skupinu SO 3 H za vzniku komplexu. Na stanovenie albumínu sa používajú také farbivá, ktoré s ním tvoria komplexy ľahšie ako s inými bielkovinami prítomnými v sére alebo plazme. Vlnová dĺžka absorpčného maxima vzniknutého komplexu albumín - farbivo je väčšia ako vlnová dĺžka absorpčného maxima samotného farbiva a je pritom mimo oblasti, kde absorbuje bilirubín a hemoglobín. Na kalibráciu sa musí použiť ľudský albumín, pretože afinita farbív k albumínu zvierat je odlišná. S brómkrezolovým purpurom, 5,5 -dibróm-o-krezolsulfonftaleín, BCP (žltý) tvorí albumín pri ph 5,2 v prítomnosti povrchovo aktívnej látky Brij 35 zelený komplex, ktorého sfarbenie sa meria pri vlnovej dĺžke 600 nm. BCP nie je vhodný na stanovenie albumínu v plazme (fibrinogén zvyšuje výsledky stanovenia). Pri stanovení interferuje zvýšený bilirubín a hemoglobín. Albumín + BCP albumín-bcp. S brómkrezolovou zelenou, 3,3,5,5 -tetrabróm-m-krezolsulfonftaleín, BCG (žlto-zelený) tvorí albumín pri ph 4,2 komplex (zeleno-modrý), ktorého sfarbenie sa meria pri vlnovej dĺžke 628 nm. Zhodnosť tejto metódy je horšia ako pri použití BCP. Albumín + BCG albumín-bcg.

2 9 Rutinné biochemické vyšetrenia 185 Stanovenie v moči Stanovenie stopových koncentrácií albumínu v moči sa vykonáva imunoturbidimetriou alebo imunonefelometriou. So špecifickou protilátkou (Ab) proti ľudskému albumínu vzniká precipitát imunokomplexu (Ab-albumín) a meria sa napr. turbidancia inkubačnej zmesi pri 340 nm. 9.2 Alkalické fosfatázy (ALP) ALP sú skupina enzýmov, ktoré súvisia s činnosťou pečene, rastom kostí a placenty. Nárast aktivity ALP sa pozoruje pri poruchách pečene, kostných nádoroch, nádoroch v pečeni. Zníženie ALP indikuje skorbut, chorobu z ožiarenia, ťažkú anémiu a pod. ALP katalyzujú hydrolýzu takmer všetkých typov monoesterov kyseliny trihydrogénfosforečnej v alkalickom prostredí (optimálne ph je 8-10) na fosfát a zodpovedajúci alkohol, fenol a pod. R-O-PO(OH) 2 + H O ALP R-OH + H PO Reakcia je založená na prenose fosfátovej skupiny z donoru na akceptor; akceptor musí obsahovať v molekule OH skupinu. V uvedenej reakcii je akceptorom fosfátovej skupiny voda. Reakcia prenosu fosfátovej skupiny (transfosforylácie) prebieha vo vode pomerne pomaly, preto sa ako transfosforylačné tlmivé roztoky používajú aminoalkoholy, napr. N-metyl-D-glukamín (MEG), 2-amino-2-metyl-1-propanol. Stanovenie katalytickej koncentrácie ALP v sére s 4-nitrofenylfosfátom v transfosforylačných roztokoch (MEG alebo 2-amino-2-metyl-1-propanol) Reakciu hydrolýzy 4-nitrofenylfosfátu a prenos jeho fosfátovej skupiny na transfosforylačný roztok (R -OH, ph 10,1-10,2) katalyzuje enzým ALP: 1 O 2 N-C 6 H 4 -O-PO(OH) 2 + R -OH ALP O N-C H -OH + R -O-PO(OH) Mierou aktivity enzýmu (katalytickej koncentrácie) je množstvo vznikajúceho žltého 4- nitrofenolátu. Jeho absorbancia sa meria pri vlnovej dĺžke nm. Stanovenie sa vykonáva fotometricky kinetickou metódou alebo metódou konštantného času po zastavení enzýmovej reakcie inhibítorom ALP (roztok EDTA/NaOH blokuje aktívne centrá enzýmu). Postup: Reakciu možno štartovať sérom aj substrátom. Pri štartovaní sérom a kinetickom meraní sa postupuje takto: k inkubačnému roztoku vytemperovanému na 37 o C sa pridá 20 μl séra a po lag-fáze 30 s sa meria absorbancia 4- nitrofenolátu pri vlnovej dĺžke 405 nm po dobu 180 s. Inkubačný roztok obsahuje: MEG 350 mmol/l, ph 10,1 NaCl mmol/l (aktivátor ALP), MgCl2 0,5 mmol/l (ióny Mg aktivujú enzým a chránia ho pred tepelnou denaturáciou) a 4-nitrofenylfosfát 15 mmol/l.

3 9 Rutinné biochemické vyšetrenia 186 Celkovú aktivitu ALP tvoria aktivity jednotlivých izoenzýmov pochádzajúcich z rôznych orgánov a tkanív (izoenzým pečeňový, kostný, obličkový, placentárny, črevný). Indikáciou na zistenie aktivity izoenzýmov môže byť napr. nejasné zvýšenie celkovej aktivity ALP (zisťuje sa pôvod zvýšenia). Kostný izoalp je rýchlejšie a vo väčšom rozsahu inaktivovaný zohriatím na teplotu 56 o C než pečeňový. Na inhibíciu črevného a placentárneho izoalp sa používa L-fenylalanín. Diagnosticky významná hodnota Q sa vypočíta ako pomer aktivity ALP po tepelnej inaktivácii s L-fenylalanínom (ALP ZF ) k aktivite ALP pred tepelnou inaktiváciou inhibítorom L- fenylalanínom (ALP F). Zohriatím séra na 56 o C sa prakticky úplne inaktivuje kostná frakcia izoalp, pričom pečeňový izoalp je inaktivovaný minimálne. Na vylúčenie vplyvu črevného izoalp sa používa jeho inhibícia L-fenylalanínom v zohriatom aj nezohriatom sére. 9.3 Aminotransferázy (transaminázy) Aminotransferázy sú skupina vnútrobunkových enzýmov, ktoré sa v organizme zúčastňujú na metabolizme dusíka (aminokyselín). Pri poškodení pečene, srdcových ochoreniach a ochorení kostného svalstva sa pozorujú zvýšené hodnoty týchto enzýmov v krvi. Veľký význam má mitochondriálna aspartátaminotransferáza, ktorej zvýšenie poukazuje na ťažké poškodenie hepatocytov. Aminotransferázy sú enzýmy, ktoré katalyzujú vnútornú premenu aminokyselín a 2 oxokyselín prenosom aminoskupiny. Ide o dva enzýmy: aspartátaminotransferáza (AST) a alanínaminotransferáza (ALT). Ako koenzým pri prenose aminoskupiny pôsobí pyridoxal-5 -fosfát (P5P). P5P sa naviaže na apoenzým (AST, ALT), prijme aminoskupinu z aspartátu alebo alanínu (vytvorí sa väzba enzýmpyridoxamín-5 -fosfát) a prenesie ju na 2-oxoglutarát za vzniku L-glutamátu. Dvojica 2- oxoglutarát/l-glutamát sa uplatňuje ako akceptor aminoskupiny a produkt vo všetkých reakciách prenosu aminoskupiny. AST, Aspartát: 2-oxoglutarátaminotransferáza Tento enzým katalyzuje reakciu L-aspartátu a 2-oxoglutarátu za vzniku oxalacetátu a L-glutamátu. AST prenosom aminoskupiny na oxokyselinu vytvára predpoklady pre vstup oxokyseliny do Krebsovho cyklu a metabolizáciu aminokyseliny na močovinu. Stanovenie katalytickej koncentrácie AST s NADH podľa IFCC Princípom stanovenia je konverzia L-aspartátu a 2-oxoglutarátu účinkom enzýmu AST na oxalacetát a L-glutamát: OOC-(CHNH 2 )-CH 2 -COO + OOC-CO-CH 2 -CH 2 -COO P5P AST, - - AST, P5P OOC-(CHNH 2 )-CH 2 -CH 2 -COO + - OOC-CO-CH -COO -. 2 L-aspartát + 2-oxoglutarát AST, P5P L-glutamát + oxalacetát.

4 9 Rutinné biochemické vyšetrenia 187 Oxalacetát sa potom redukuje pôsobením NADH na L-malát za katalytického účinku enzýmu malátdehydrogenáza (MD). Meria sa pokles absorbancie NADH pri vlnovej dĺžke 339 nm (NAD + pri tejto vlnovej dĺžke žiarenia neabsorbuje). - - OOC-CO-CH 2 -COO + NADH + H + MD - OOC-CH(OH)-CH - 2 -COO + NAD +. + Oxalacetát + NADH + H L-malát + NAD + MD. Postup: Reakčná zmes má zloženie: TRIS 80 mmol/l, ph 7,65, L-aspartát 240 mmol/l, NADH 0,18 mmol/l, P5P 0,1 mmol/l, MD 10 μkat/l, LD 15 μkat/l. Zmes sa vytemperuje na 37 o C. K 2 ml reakčnej zmesi sa pridá 0,2 ml séra a 300 s sa predinkubuje pri 37 o C. (Pri tejto predinkubácii dochádza k odstráneniu endogénneho pyruvátu prítomného v sére jeho redukciou na L- laktát. Táto reakcia je katalyzovaná laktátdehydrogenázou (LD): Endogénny - OOC-CO-CH + LD NADH + H OOC-CH(OH)-CH 3 + NAD +. Endogénny pyruvát + NADH + H + LD L-laktát + NAD +. V tejto fáze AST nereaguje, pretože do reakcie chýba jeden reaktant a to 2-oxoglutarát. Sérum okrem pyruvátu obsahuje aj endogénnu LD. Ak by sa pyruvát v predinkubačnej dobe neodstránil, NADH by po naštartovaní reakcie 2-oxoglutarátom reagoval nielen s oxalacetátom, ale aj s týmto endogénnym pyruvátom, čím by sa falošne zvyšovali výsledky stanovenia AST). Potom sa pridá 0,2 ml 2-oxoglutarátu 144 mmol/l, zmes sa dôkladne premieša a po lag-fáze 90 s sa meria absorbancia po dobu 180 s (namerať treba najmenej 6 hodnôt). Katalytická aktivita AST je úmerná poklesu absorbancie pri 339 nm. Enzýmy MD a LD musia byť v reakčnej zmesi v dostatočnom nadbytku, aby celé enzýmové stanovenie záviselo len od katalytickej aktivity AST. ALT, L-alanín: 2-oxoglutarátaminotransferáza Enzým katalyzuje reakciu L-alanínu a 2-oxoglutarátu za vzniku pyruvátu a L-glutamátu. Stanovenie katalytickej koncentrácie ALT s NADH podľa IFCC Princípom stanovenia je konverzia L-alanínu a 2-oxoglutarátu účinkom enzýmu ALT na pyruvát a L-glutamát: - - OOC-(CHNH 2 )-CH 3 + OOC-CO-CH 2 -CH 2 -COO - P5P ALT, - - ALT, P5P OOC-(CHNH 2 )-CH 2 -CH 2 -COO + - OOC-CO-CH. 3 L-alanín + 2-oxoglutarát ALT, P5P L-glutamát + pyruvát.

5 9 Rutinné biochemické vyšetrenia 188 Pyruvát sa potom redukuje s NADH na L-laktát za katalytického účinku enzýmu laktátdehydrogenáza (LD). Meria sa pokles absorbancie NADH pri vlnovej dĺžke 339 nm. - OOC-CO-CH 3 + NADH + H + LD - OOC-CH(OH)-CH 3 + NAD +. + Pyruvát + NADH + H L-laktát + NAD + LD. Postup: Postup stanovenia je podobný ako u AST, len s tým rozdielom, že v reakčnej zmesi sa použije len jeden enzým, a to LD v dostatočnom nadbytku. V predinkubačnej fáze sa podobne ako pri stanovení AST najskôr odstráni endogénny pyruvát: Endogénny - OOC-CO-CH + LD NADH + H OOC-CH(OH)-CH 3 + NAD +. Potom sa naštartuje vlastné stanovenie ALT pridaním 2-oxoglutarátu a prebehnú už uvedené reakcie: - OOC-(CHNH 2 )-CH OOC-CO-CH 2 -CH 2 -COO - ALT, P5P ALT, P5P - OOC-(CHNH 2 )-CH 2 -CH 2 -COO OOC-CO-CH 3. OOC-CO-CH LD NADH + H OOC-CH(OH)-CH 3 + NAD α-amyláza α-amyláza je enzým tvorený pankreasom a slinnými žľazami, časť vzniká aj v pečeni. Enzým katalyzuje štiepenie polysacharidov za vzniku dextrínov až maltózy. V sére a moči možno stanoviť dva izoenzýmy, slinný a pankreatický, ktoré svojimi aktivitami odrážajú stav tkaniva, z ktorého pochádzajú. Zvýšená aktivita pankreatického izoenzýmu sa pozoruje pri akútnej pankreatitíde a zvýšená aktivita slinného izoenzýmu pri ochoreniach slinných žliaz. Fotometrické stanovenie α-amylázy Enzým α-amyláza katalyzuje hydrolýzu definovaného oligosacharidu označeného 4-nitrofenolom za vzniku nižších oligosacharidov s naviazaným 4-nitrofenolom. Ak je do reakcie zaradený aj enzým α-glukozidáza, štiepením vznikajú voľné oligosacharidy, glukóza a 4-nitrofenol. Stanovenie je založené na meraní absorbancie uvoľneného 4-nitrofenolu pri vlnovej dĺžke 405 nm. Vyšší oligosacharid-4-nitrofenol α -amyláza, α -glukozidáza α -amyláza, α -glukozidáza nižšie oligosacharidy + glukóza + 4-nitrofenol.

6 9 Rutinné biochemické vyšetrenia 189 Stanovenie izoenzýmov α-amylázy Na stanovenie izoenzýmov α-amylázy sa používajú separačné alebo inhibičné metódy. Zo separačných metód je najrozšírenejšia elektroforéza v agarózovom géli, kde sa α-amyláza rozdelí na pankreatický (1-2 frakcie) a slinný (1-2 frakcie) izoenzým. Ďalšie separačné metódy sú: izoelektrická fokusácia, gélová filtrácia a ionexová chromatografia. V inhibičných metódach sa využíva inhibícia slinnej izo-α-amylázy účinkom špecifického inhibítora (glykoproteín z obilných zŕn). Aktivita α-amylázy je potom úmerná aktivite pankreatického izoenzýmu. 9.5 Bielkoviny Bielkoviny plnia v organizme rôzne funkcie. Sú zdrojom pre výstavbu a obnovu buniek a tkanív, tvoria súčasť enzýmov a niektorých hormónov. Podieľajú sa na imunitných reakciách, zrážaní krvi, transportných procesoch, sú zdrojom výživy a energie, podieľajú sa na udržiavaní acidobázickej rovnováhy a koloidne-osmotického tlaku. Celkové bielkoviny Referenčná metóda (Kjeldahlova metóda) Je založená na stanovení celkového dusíka v bielkovinách. Najskôr sa v určitom podiele vzorky séra stanoví celkový dusík. Potom sa v rovnakom podiele z tej istej vzorky vyzrážajú bielkoviny kyselinou trichlóroctovou a po ich oddelení odstredením sa v supernatante stanoví nebielkovinový dusík. Dusík v bielkovinách sa potom vypočíta ako rozdiel: Dusík v bielkovinách = celkový dusík nebielkovinový dusík. Metóda sa používa na stanovenie celkových bielkovín v sérach určených na kontrolu presnosti analytických metód a na stanovenie bielkovín vo vzorkách, ktoré sa používajú na prípravu štandardných roztokov. Metóda je časovo veľmi náročná, a preto sa v rutinnej praxi nepoužíva. Odporúčaná metóda s biuretovým činidlom Princípom stanovenia je reakcia bielkovín a peptidov (zložiek obsahujúcich minimálne dve peptidové väzby -CO-NH-) s biuretovým činidlom. Biuretové činidlo je alkalický roztok iónov Cu 2+, vínanu sodno-draselného a KI. Zložky s dvoma a viacerými peptidovými väzbami poskytujú s biuretovým činidlom červenofialový komplex, ktorého absorpčné maximum je pri vlnovej dĺžke 545 nm. minimálne 2 -CO-NH- + biuretové činidlo červenofialový komplex. Na kalibráciu sa používa ľudský sérový albumín alebo sérum, v ktorom bola stanovená koncentrácia bielkovín Kjeldahlovou metódou.

7 9 Rutinné biochemické vyšetrenia Pri stanovení bielkovín v lipemickom sére (sérum zakalené tukmi) vytvárajú tuky s Cu iónmi z biuretového činidla zrazeniu Cu 2+ -mydiel. Vznikajúci zákal interferuje pri fotometrickom stanovení bielkovín, preto sa tuky najskôr oddelia extrakciou do acetónu. Pridaný acetón súčasne vyzráža bielkoviny. Zrazenina bielkovín sa oddelí od supernatantu odstredením. Supernatant sa odstráni a vyzrážané bielkoviny sa rozpustia priamo v roztoku biuretového činidla. Metódy na separáciu, identifikáciu a stanovenie jednotlivých bielkovín Metódy na separáciu bielkovín Na rutinné účely je vhodná separácia bielkovín elektroforézou na acetylcelulózových fóliách alebo elektroforézou na agarovom alebo agarózovom géli (časť 7.4). Rozdelené frakcie bielkovín sa porovnajú s elektroforeogramom séra zdravého človeka, analyzovaného na tej istej vrstve. V prípade patologického nálezu sa vykoná cielené stanovenie jednotlivých bielkovín imunochemickými metódami. Na obr je uvedený elektroforeogram a denzitometrický záznam sérových bielkovín. Na zázname sú vyznačené najvýznamnejšie frakcie sérových bielkovín. Na obr sú uvedené najvýznamnejšie bielkoviny, ktoré tieto jednotlivé frakcie tvoria. Klinický význam: pokles frakcie albumínu svedčí o chronickom ochorení obličiek. Zvýšená frakcia α- alebo γ-globulínov sa pozoruje pri zápalových ochoreniach. Zvýšené β-globulíny sa pozorujú pri chronickom ochorení obličiek a u diabetikov. Znížené alebo chýbajúce γ-globulíny poukazujú na náchylnosť k infekciám. Metódy na identifikáciu bielkovín Na identifikáciu bielkovín sa najčastejšie používajú imunofixácie a imunoelektroforéza (časť 7.6). Metódy majú vysokú rozlišovaciu schopnosť a citlivosť. Sú významné hlavne pri identifikácii monoklonálnych imunoglobulínov (paraproteínov) a Bence-Jonesovej bielkoviny. Imunofixačné metódy sú v porovnaní s imunoelektroforézou citlivejšie, časovo menej náročné, jednoduchšie sa interpretujú a sú vhodné aj na identifikáciu monoklonálnych proteínov. Paraproteíny sa označujú tiež ako M-gradient. Na elektroforeograme bielkovín tvoria v oblasti β- až γ-globulínov úzky vrchol, označovaný ako M-gradient. Paraproteíny a Bence-Jonesova bielkovina sú imunoglobulíny, ktoré majú odlišne usporiadanú štruktúru. Paraproteíny sú obvykle zložené z kompletných molekúl. Podľa toho, ktorá časť molekuly imunoglobulínu má zmenené poradie aminokyselín v reťazci, môžu sa vyskytovať paraproteíny s ľahkými reťazcami lambda a paraproteíny s ľahkými reťazcami kappa (napr. IgG-λ, IgG-κ, IgA-λ a IgA-κ). Patraproteíny môžu byť tvorené aj nekompletnými molekulami monoklonálnych imunoglobulínov: príkladom je Bence-Jonesova bielkovina, tvorená len ľahkými reťazcami lambda a kappa. Vyskytuje sa v krvi aj moči pri ťažkých ochoreniach spôsobených poruchou syntézy imunoglobulínov. V krvi sú teda prítomné neúplné molekuly imunoglobulínu a pretože majú malú molovú hmotnosť, prechádzajú do moču. V sére zdravých jedincov sa paraproteíny nevyskytujú. Vyskytujú sa pri mnohopočetnom myelome a Waldenströmovej makroglobulinemii (malígny rast atypických lymfocytov produkujúcich jeden typ monoklonálneho IgM). Môžu sa vyskytovať aj paraproteíny s nekompletnou molekulou tvorenou len ťažkými reťazcami (tzv. Franklinova choroba).

8 9 Rutinné biochemické vyšetrenia 191 Špecifické metódy na stanovenie koncentrácie jednotlivých bielkovín Bielkoviny možno stanoviť kvantitatívnymi imunometódami uvedenými v časti 7.6. Z nich sa najčastejšie využíva radiálna imunodifúzia podľa Manciniovej a elektroimunodifúzia podľa Laurella. Okrem toho sa používajú aj imunoturbidimetrické a imunonefelometrické metódy. Uvedené techniky umožňujú stanovenie prakticky všetkých bielkovín za predpokladu, že je k dispozícii príslušné monovalentné antisérum potrebnej kvality a že koncentrácia stanovovanej bielkoviny je vyššia ako 10 mg/l. Na stanovenie bielkovín s koncentráciou nižšou ako 10 mg/l sú uvedené techniky už málo citlivé, a preto sa na ich stanovenie používajú imunometódy s označeným reaktantom (ELISA, FIA a RIA). Tieto metódy sú vhodné na stanovenie IgE, IgD, α -fetoproteínu, β -mikroglobulínu a iných. 1 2 Reaktanty (bielkoviny) akútnej fázy Sú to bielkoviny, ktorých koncentrácia rýchlo a výrazne stúpa pri akútnych zápalových ochoreniach (C-reaktívny proteín, α1-antitrypsín, α1-kyslý glykoproteín, haptoglobín, ceruloplazmín, fibrinogén), pri infarkte myokardu (C-reaktívny proteín, haptoglobín) a pri nádorových ochoreniach (α1-antitrypsín, α1-kyslý glykoproteín, haptoglobín, ceruloplazmín). Výnimkou je transferín, ktorého hodnota naopak pri dlhotrvajúcich a ťažkých ochoreniach klesá. Na stanovenie tohto typu bielkovín sa používa predovšetkým imunoturbidimetria. 9.6 Bilirubín a estery bilirubínu Bilirubín nie je jednotná látka, v skutočnosti je to celá skupina tetrapyrolov. Kvantitatívne prevažuje v krvi bilirubín IXa. Zvýšené hodnoty sa zistia pri poškodení hepatocytov vírusmi, toxínmi, pri nadprodukcii bilirubínu (anémia) a pri dedičných poruchách. Bilirubíny možno podľa ich vlastností a výskytu v plazme (podľa IFCC) rozdeliť na: o Bilirubín (označoval sa ako nekonjugovaný, neesterifikovaný, nepriamo reagujúci bilirubín, nepriamy bilirubín) reaguje s diazóniovými soľami len v prítomnosti akcelerátorov ako sú kofeín a alkohol. Je naviazaný na albumín nekovalentnými väzbami a nerozpustný vo vode. Akcelerátory uvoľnia bilirubín z väzby bilirubín-fosfolipid-albumín a rozpustia ho. o Estery bilirubínu (označovali sa ako konjugovaný, tzv. priamo reagujúci bilirubín s diazóniovými soľami, priamy bilirubín) reagujú s diazóniovými soľami okamžite, bez akcelerátora. Estery bilirubínu sú mono- a diglukuronidy bilirubínu a estery bilirubínu viazané na fosfolipidy a albumín.

9 9 Rutinné biochemické vyšetrenia 192 Stanovenie kopulačnou reakciou s diazóniovou soľou V súčasnosti je medzinárodne odporúčaná IFCC metóda na stanovenie celkového bilirubínu vychádzajúca v podstate z pôvodnej metódy Jendrassika a Grofa opísanej v r Stanovenie je založené na kopulačnej reakcii bilirubínu s diazotovanou kyselinou sulfanilovou v kyslom prostredí, pri ktorej vzniká červený azobilirubín: Bilirubín + kyselina sulfanilová + NaNO + HCl 2 akcelerátor červený azobilirubín. Azobilirubín je azofarbivo, ktoré má vlastnosti acidobázického indikátora v slabokyslom a neutrálnom roztoku je červený, v silno alkalickom prostredí je modrý. Namiesto kyseliny sulfanilovej možno použiť napr. 2,4-dichlóranilín (DCA). Obvykle sa stanovuje celkový bilirubín (s akcelerátorom), pri zvýšenom obsahu aj priamy bilirubín (bez akcelerátora). Stanovenie celkového bilirubínu: v reakčnej kyvete sa zmieša roztok kyseliny sulfanilovej v HCl s roztokom akcelerátora (zmes kofeínu, octanu sodného a benzoanu sodného) a vzorkou. Pridá sa roztok dusitanu sodného a po 5-10 min sa zmeria absorbancia červeného azobilirubínu pri vlnovej dĺžke nm. Ak sa na stanovenie použije modrá forma azobilirubínu, po prebehnutí kopulácie sa pridá alkalický tlmivý roztok (ph 12, NaOH s vínanom sodno-draselným) a meria sa absorbancia pri vlnovej dĺžke nm. Stanovenie priameho bilirubínu: Vykonáva sa bez akcelerátora zastavením diazotačnej reakcie prídavkom kyseliny askorbovej obvykle po 10 min. Kyselina askorbová rozloží diazóniovú soľ potrebnú na kopuláciu, a tým zastaví reakciu. V priebehu 10 min zreagujú priame formy bilirubínu. Ak by sa reakcia nechala prebiehať dlhšie, postupne by reagovali aj ďalšie formy bilirubínu. Merať možno buď priamo červenú formu v kyslom prostredí, alebo v alkalickom prostredí modrú formu azobilirubínu. 9.7 Glukóza Glukóza ako najdôležitejší monosacharid je základným zdrojom energie. Ak prevyšuje jej prísun spotrebu, glukóza sa ukladá vo forme glykogénu. Pri poklese koncentrácie glukózy dochádza k spätnému odbúravaniu glykogénu. V krvi je koncentrácia glukózy regulovaná viacerými hormónmi. Inzulín znižuje koncentráciu glukózy tvorbou glykogénu; glukagón a adrenalín zvyšujú koncentráciu glukózy odbúravaním glykogénu. Ďalšie hormóny, ktoré tiež zvyšujú koncentráciu glukózy, sú glukokortikoidy, rastový hormón a hormóny štítnej žľazy. Glukóza je najčastejšie stanovovaný analyt, pretože poruchy metabolizmu sacharidov sa vyskytujú veľmi často a môžu viesť k závažným poškodeniam organizmu. Hypoglykémia (glukóza < 3,8 mmol/l) je príznak ochorenia pankreasu, vrodených porúch metabolizmu glukózy a pečeňových karcinómov. Hyperglykémiou (glukóza > 7,8 mmol/l) sa prejavuje diabetes, ťažká infekcia, tumor mozgu, ale vyskytuje sa aj pri podávaní tiazidových diuretík a neuroleptík.

10 9 Rutinné biochemické vyšetrenia 193 Stanovenie s glukózaoxidázou (GOD), peroxidázou (POD) a oxidačnou kopuláciou (kondenzáciou) Princípom metódy je oxidácia glukózy katalyzovaná enzýmom GOD, pričom vzniká kyselina glukonová a peroxid vodíka: Glukóza + O 2 + H O GOD kyselina glukonová + H O Reakciou vzniknutý H 2 O 2 sa použije na oxidačnú kopuláciu 4-aminoantipyrínu s fenolom (katalyzovaná peroxidázou POD), pri ktorej vzniká červeno sfarbené chinónimínové farbivo. Meria sa absorbancia vzniknutého chinónimínového farbiva pri vlnovej dĺžke 500 nm. R-NH 2 + C 6 H 5 -OH + 2 H 2 O POD R-N=C H =O + 4 H O H 2 O 2 možno stanoviť aj amperometricky Clarkovou elektródou (časť 7.7). Stanovenie s hexokinázou (HK) a glukóza-6-fosfátdehydrogenázou (G6PD) Enzým hexokináza katalyzuje fosforyláciu glukózy (aj iných sacharidov): Glukóza + ATP HK glukóza-6-fosfát + ADP. Reakciou vzniknutý glukóza-6-fosfát sa potom oxiduje s NAD glukóza-6-fosfátdehydrogenáza: + Glukóza-6-fosfát + NAD glukonolakton-6-fosfát + NADH + H + G6PD. + v prítomnosti katalyzátora Koncentrácia glukózy sa vypočíta z prírastku absorbancie vznikajúceho NADH meranej pri vlnovej dĺžke 340 nm. 9.8 γ-glutamyltransferáza (GGT) GGT je takmer špecifický enzým pečene a žlčových ciest, kde je jeho aktivita najvyššia. GGT sa používa napr. na diagnostikovanie a monitorovanie priebehu hepatitídy. Stanovenie katalytickej koncentrácie GGT podľa IFCC GGT katalyzuje reakciu prenosu aminoskupiny (γ-glutamyl) na aminokyselinu, alebo peptid. Pri stanovení GGT metódou podľa IFCC tento enzým katalyzuje reakciu glycylglycínu s L-γglutamyl-3-karboxy-4-nitroanilidom za vzniku dvoch produktov: 5-amino-2-nitrobenzoátu a L-γglutamyl-glycylglycínu. 5-amino-2-nitrobenzoát je intenzívne žlto sfarbený a jeho množstvo sa stanovuje fotometricky meraním absorbancie pri 405 nm. Rýchlosť zmeny absorbancie je priamo úmerná katalytickej koncentrácii enzýmu GGT. L-γ-glutamyl-3-karboxy-4-nitroanilid + glycylglycín GGT GGT L-γ-glutamyl-glycylglycín + 5-amino-2-nitrobenzoát.

11 9 Rutinné biochemické vyšetrenia Cholesterol a jeho frakcie HDL a LDL Cholesterol je súčasťou membrán všetkých živočíšnych buniek, je základnou látkou biosyntézy steroidných hormónov a žlčových kyselín. V krvi je viazaný do lipoproteínových komplexov, asi 70 % cholesterolu je vo forme esterov. Zvýšená koncentrácia cholesterolu je najznámejší a najzávažnejší rizikový faktor rozvoja arteriosklerózy. Zvyčajne sa stanovuje celkový cholesterol (voľný a jeho estery) a jeho frakcie HDL-cholesterol (high density lipoprotein cholesterol) a LDL-cholesterol (low density lipoprotein cholesterol). Menej často sa stanovuje VLDL-cholesterol (very low density lipoprotein cholesterol). Označenie frakcií HDL, LDL a VLDL vzniklo z delenia lipoproteínov odstreďovaním na základe ich rozdielnej hustoty. Enzýmové stanovenie celkového cholesterolu oxidačnou kopuláciou Pôsobením detergentov (PEG) sa uvoľní cholesterol z väzby na lipoproteíny. Pretože v sére sa asi 70 % cholesterolu vyskytuje vo forme esterov, pred stanovením celkového cholesterolu je potrebné tieto estery najskôr hydrolyzovať. Estery cholesterolu sa hydrolyzujú za katalytického účinku enzýmu cholesterolesteráza (CHE), pričom sa uvoľňuje cholesterol: Estery cholesterolu + H O 2 CHE cholesterol + vyššie karboxylové kyseliny. Cholesterol (voľný a vzniknutý hydrolýzou esterov) sa oxiduje za katalytického účinku enzýmu cholesteroloxidáza (CHO), pričom vzniká peroxid vodíka: Cholesterol + O 2 CHO -cholesten-3-on + H2O 2. 4 Reakciou vzniknutý H O 2 2 sa použije na oxidačnú kopuláciu 4-aminoantipyrínu s fenolom (katalyzovaná peroxidázou POD), pri ktorej vzniká červeno sfarbené chinónimínové farbivo. Meria sa absorbancia vzniknutého chinónimínového farbiva pri vlnovej dĺžke 500 nm. R-NH 2 + C 6 H 5 -OH + 2 H 2 O POD R-N=C H =O + 4 H O Stanovenie HDL-cholesterolu Na oddelenie HDL-cholesterolu od LDL- a VLDL-frakcie sa používajú rôzne spôsoby: o LDL-frakcia a VLDL-frakcia sa vyzráža precipitačným činidlom (kyselina fosfovolfrámová a chlorid horečnatý) a v supernatante sa stanoví HDL-cholesterol ako pri prechádzajúcej metóde (stanovenie celkového cholesterolu). o LDL- a VLDL-frakcia vytvára s dextránsulfátom a α-cyklodextrínom v slabo alkalickom prostredí v prítomnosti Mg2+ vo vode rozpustné komplexy, v ktorých je reaktivita cholesterolu nízka (neinterferujú pri stanovení HDL-cholesterolu). o Na oddelenie HDL cholesterolu sa použijú špecifické protilátky, ktoré s LDL- a VLDLfrakciou tvoria rozpustné imunokomplexy. Tieto imunokomplexy nereagujú v nasledujúcich enzýmových reakciách s CHE a CHO, a preto ich nie je nutné z reakčnej zmesi odstraňovať. Postup je podobný ako pri stanovení celkového cholesterolu.

12 9 Rutinné biochemické vyšetrenia 195 Stanovenie LDL-cholesterolu Na oddelenie LDL cholesterolu od HDL- a VLDL-frakcie sa používajú špecifické protilátky naviazané na latexové častice, ktoré s HDL- a VLDL- frakciou tvoria imunokomplexy Po oddelení latexových častíc odstredením sa v supernatante stanoví LDL-cholesterol. Postup stanovenia je podobný ako pri metóde na stanovenie celkového cholesterolu Cholínesteráza Cholínesteráza je skupina enzýmov, ktoré katalyzujú štiepenie esterov cholínu. Znížená aktivita sa vyskytuje pri ochorení pečene, pri otrave organofosfátmi a pri infarkte myokardu. Fotometrické stanovenie Cholínesteráza štiepi substrát butyryltiocholínjodid na tiocholín a butyrát. Tiocholín potom reaguje s kyselinou ditio-bis-nitrobenzoovou (DTNB) za vzniku žlto sfarbenej kyseliny 5-merkapto-2-nitrobenzoovej, ktorej absorbancia sa meria pri vlnovej dĺžke 420 nm. Butyryltiocholín + H O 2 cholínesteráza tiocholín + butyrát Tiocholín + DTNB 5-merkapto-2-nitrobenzoová kyselina Imunoglobulíny Imunoglobulíny sú súčasťou γ-globulínovej a čiastočne β-globulínovej frakcie bielkovín a sú nositeľom látkovej imunity. Súčasné zvýšenie všetkých imunoglobulínov sa pozoruje u infekcií - je to imunitná odpoveď organizmu na infekciu. Zníženie imunoglobulínov má za následok náchylnosť na infekciu. Imunoglobulíny IgA, IgD, IgE, IgG a IgM sa stanovujú v sére po ich rozdelení napr. dvojrozmernou imunoelektroforézou, imunofixáciami, alebo sa stanovujú individuálne pomocou špecifických protilátok proti jednotlivým imunoglobulínom. Rýchle stanovenie jednotlivých imunoglobulínov umožňuje imunoturbidimetria, imunonefelometria a ELISA. Imunoturbidimetrické stanovenie imunoglobulínov Imunoturbidimetrické stanovenie je založené na reakcii jednotlivých imunoglobulínov so špecifickou protilátkou proti príslušnému ľudskému imunoglobulínu (napr. stanovenie IgG s kozím antisérom proti ľudskému IgG). Pri reakcii vzniká precipitát príslušného imunokomplexu. Meria sa turbidancia inkubačnej zmesi pri 340 nm.

13 9 Rutinné biochemické vyšetrenia Kreatinín Koncentrácia kreatinínu v krvi je úmerná množstvu svalovej hmoty a v podstate nepodlieha väčším zmenám s výnimkou ochorenia obličiek, kedy stúpa. Používa sa na vyšetrenie funkcie obličiek. Zvýšená hodnota poukazuje na zníženú glomerulárnu filtráciu pri akútnom zlyhaní obličiek, pri pokročilom diabete, traumách a popáleninách. Znížené hodnoty nemajú praktický význam. Stanovenie Jaffého reakciou Princípom fotometrického stanovenia v sére aj moči je reakcia kreatinínu s alkalickým roztokom kyseliny pikrovej, pri ktorej vzniká červenooranžový komplex kreatinínu s pikrátom v pomere 1:1. Z množstva kreatinínu v sére a moči sa počíta kreatinínová clearance ako test na funkciu obličiek. Jaffého reakcia nie je špecifická, interferuje napr. bilirubín, pyruvát, kreatín. Enzýmové stanovenie Kreatinín sa hydrolyzuje vodou za katalytického pôsobenia enzýmu kreatinínáza na kreatín. Kreatín sa hydrolyzuje v prítomnosti ďalšieho enzýmu kreatínáza na sarkozín a močovinu. Sarkozín sa potom oxiduje na glycín, táto reakcia je katalyzovaná sarkozínoxidázou. Reakciou vzniknutý H 2 O 2 sa použije na oxidačnú kopuláciu (kondenzáciu) 4-aminoantipyrínu s fenolom (katalyzovaná peroxidázou POD), pri ktorej vzniká červeno sfarbené chinónimínové farbivo. Meria sa absorbancia vzniknutého chinónimínového farbiva pri vlnovej dĺžke 550 nm rovnovážnou alebo kinetickou metódou. Pri stanovení neinterferuje bilirubín, chylózne sérum a rôzne chromogény. U pacientov zaradených v transplantačnom programe a na hemodialýze sa musí použiť enzýmové stanovenie. Kretinín + H O Kreatín + H 2 O 2 kreatinínáza kreatínáza Sarkozín + O 2 + H O R-NH 2 + C 6 H 5 -OH + 2 H 2 O kreatín sarkozín + močovina sarkosínoxidáza glycín + HCOH + H O POD R-N=C H =O + 4 H O Kreatínkináza (CK) Enzým kreatínkináza sa nachádza v bunkách kostného svalu, mozgu a srdcového svalu. Zvýšená aktivita CK sa pozoruje pri ochorení kostného svalstva, zvýšenej telesnej námahe a infarkte myokardu. Molekula CK sa skladá z dvoch podjednotiek označovaných B a M. Celková aktivita CK je tvorená aktivitou troch izoenzýmov CK-MM (hlavne kostné svalstvo), CK-MB (srdcové svalstvo) a CK-BB (mozgové tkanivo, črevá, prostata). Celkovú aktivitu CK v krvnom sére tvorí predovšetkým CK-MM, len malý podiel CK-MB a izoenzým CK-BB prakticky nie je prítomný (zdraví jedinci). Ak aktivita CK-MB a celková aktivita CK prevyšuje horné referenčné medze a ak podiel aktivity CK-MB je 6 % celkovej aktivity CK, potom s veľkou pravdepodobnosťou ide o infarkt myokardu.

14 9 Rutinné biochemické vyšetrenia 197 Stanovenie celkovej aktivity CK Kreatínkináza (ATP-Kreatín N-fosfotransferáza) katalyzuje konverziu kreatínfosfátu a adenozíndifosfátu (ADP) na kreatín a adenozíntrifosfát (ATP). Vzniknutý ATP reaguje s glukózou za katalytického účinku enzýmu hexokináza (HK), pričom vzniká ADP a glukóza-6-fosfát. Katalytická koncentrácia CK sa potom vyhodnotí detekčnou reakciou, pri ktorej reaguje glukóza-6-fosfát s NADP + za vzniku NADPH. Táto reakcia je katalyzovaná enzýmom glukóza-6-fosfátdehydrogenáza (G6PD). Rýchlosť redukcie NADP + na NAD PH je funkciou katalytickej koncentrácie CK. Meria sa absorbancia pri vlnovej dĺžke 339 nm (absorbuje len NADPH). Katalytická koncentrácia CK je úmerná prírastku absorbancie NADPH. Kreatínfosfát + ADP CK keratín + ATP Glukóza + ATP HK glukóza-6-fosfát + ADP + Glukóza-6-fosfát + NADP glukonolakton-6-fosfát + NADPH + H + G6PD. Postup: Reakčná zmes obsahuje: imidazol ako tlmivý roztok, Mg 2+ a N-acetylcysteín ako aktivátory reakcie, adenozínmonofosfát (AMP) blokujúci interferencie myokinázy. Reakčná zmes sa vytemperuje na 37 C a pridá sa vzorka (sérum alebo plazma). Reakcia sa štartuje substrátom (kreatínfosfát) a po lag-fáze 120 s sa meria absorbancia po dobu 120 s pri 339 nm (absorbuje len NADPH). Katalytická koncentrácia CK je úmerná prírastku absorbancie. Enzým myokináza (adenylátkináza, AK) katalyzuje reakciu: 2 ADP AK ATP + AMP. Pretože enzým AK je endogénnou zložkou séra, táto reakcia by mohla spôsobiť interferencie pri stanovení a falošne zvyšovať hodnotu CK. Ak je v reakčnej zmesi nadbytok AMP, rovnováha reakcie sa posunie v smere vzniku ADP. Stanovenie izoenzýmu CK-MB Pri stanovení CK-MB sa využíva imunoinhibícia. Protilátky proti CK-M inhibujú celkovú aktivitu izoenzýmu CK-MM (má hlavný podiel na celkovej aktivite CK) ako aj podjednotky CK- M izoenzýmu CK-MB. Aktivita sa potom stanoví ako pri celkovej CK. Nameraná aktivita neinhibovanej podjednotky CK-B určuje aktivitu CK-MB. CK-MM + CK-MB (podjednotka CK-M a CK-B) + anti-ck-m inhibovaná (CK-MM a podjednotka CK-M) + aktívna podjednotka CK-B.

15 9 Rutinné biochemické vyšetrenia Kyselina močová Kyselina močová je konečným produktom metabolizmu purínov. Vzniká rozpadom bunkových jadier potravy, ale aj vlastného organizmu. Zvýšené hodnoty sa objavujú pri dne a zvýšenom metabolizme nukleoproteínov (leukémia). Enzýmové stanovenie v sére/plazme Stanovenie je založené na oxidácii kyseliny močovej kyslíkom katalyzovanej enzýmom urikáza. Pri reakcii vzniká alantoín a peroxid vodíka. Kyselina močová + 2 H 2 O + O urikáza alantoín + CO + H O Koncentráciu kyseliny močovej možno určiť meraním poklesu absorbancie pri vlnovej dĺžke 290 nm (absorbuje kyselina močová). Druhá možnosť je stanovenie vznikajúceho H 2 O 2 (vznik chinónimínového farbiva reakciou 4-aminoantipyrínu a derivátu fenolu s enzýmom POD a meranie absorbancie pri vlnovej dĺžke 500 nm, podobne ako pri stanovení glukózy alebo cholesterolu). Pri stanovení kyseliny močovej interferuje bilirubín a kyselina askorbová, ktoré sa nachádzajú vo vzorkách ako endogénne zložky o koncentrácii porovnateľnej s koncentráciou kyseliny močovej. Obidve zložky môžu spotrebovávať H 2 O 2 na svoju oxidáciu (bilirubín na biliverdín a kyselina askorbová na kyselinu dehydroaskorbovú). Preto sa do reakčnej zmesi pridáva bilirubínoxidáza a askorbátoxidáza. V tomto prípade sa bilirubín a kyselina askorbová oxidujú kyslíkom, nie H2O Kyslé fosfatázy (ACP) Enzým ACP je tvorený rozsiahlou skupinou tkanivovo špecifických izoenzýmov (pečeňový, kostný, prostatový, erytrocytárny, trombocytárny, leukocytárny). Významný je predovšetkým prostatový izoenzým ACP (označuje sa ACPP), ktorého zvýšená aktivita indikuje karcinóm prostaty. ACP katalyzuje hydrolýzu monoesterov kyseliny o-fosforečnej v kyslom prostredí. Reakcia je zhodná s reakciou alkalickej fosfatázy (ALP), odlišuje sa len hodnotou ph (optimálne ph 5,1). R-O-PO(OH) 2 + H O ACP R-OH + H PO Stanovenie ACP je založené na podobnej reakcii ako stanovenie ALP: O 2 N-C 6 H 4 -O-PO(OH) 2 + R -OH ACP O N-C H -OH + R -O-PO(OH) Reakciou hydrolýzy 4-nitrofenylfosfátu pri ph 5,1 vzniká 4-nitrofenolát. Absorbancia vznikajúceho žltého 4-nitrofenolátu sa meria pri vlnovej dĺžke 405 nm.

16 9 Rutinné biochemické vyšetrenia 199 Na stanovenie nie je možné použiť kinetickú metódu, pretože aktivita ACP je nízka. Stanovenie sa vykonáva fotometricky metódou konštantného času po zastavení enzýmovej reakcie inhibítorom ACP (roztok EDTA/NaOH blokuje aktívne centrá enzýmu). Ako substrát enzýmovej reakcie sa používa aj 1-naftylfosfát. Hydrolýzou 1-naftylfosfátu vzniká 1-naftol, ktorý sa kopulačnou reakciou s diazóniovou soľou prevedie na azofarbivo. Vznikajúce azofarbivo možno merať aj kinetickou metódou. Na stanovenie izoenzýmov sa využívajú inhibičné metódy. Napr. prídavkom L-vínanu sa inhibuje prostatový a leukocytárny izoenzým. Najskôr sa stanoví celková aktivita ACP (bez inhibítora), potom sa stanoví aktivita po inhibícii s L-vínanom a aktivita prostatového izoenzýmu sa zistí z rozdielu týchto dvoch aktivít. Na stanovenie sa používajú aj imunochemické metódy pomocou antiséra obsahujúceho špecifické protilátky proti ľudskému ACPP Laktát Kyselina mliečna (laktát) vzniká z kyseliny pyrohroznovej pri anaeróbnej glykolýze. Zvýšené hodnoty sa pozorujú vtedy, keď tkanivá nemajú k dispozícii dostatok kyslíka na vstup kyseliny mliečnej do Krebsovho cyklu, alebo keď je tento vstup obmedzený (zvýšená svalová aktivita, poruchy cirkulácie, dýchania, šokové stavy, poruchy pečene). V mozgovomiechovom moku sa zvýšené hodnoty laktátu zistia pri hnisavých zápaloch mozgových blán. Enzýmové stanovenie s L-laktátdehydrogenázou (LD) L-laktát sa oxiduje s NAD + na pyruvát za katalytického pôsobenia enzýmu LD. Meria sa nárast absorbancie NADH pri vlnovej dĺžke 340 nm. L-laktát + NAD + LD pyruvát + NADH + H +. Pretože rovnováha tejto reakcie je normálne posunutá vľavo, pracuje sa v intervale ph 9-10 a s nadbytkom NAD +. Na posunutie rovnováhy vpravo sa do reakčnej schémy zahrnie aj ALT a L-glutamát. ALT katalyzuje reakciu pyruvátu s L-glutamátom, čím sa odčerpáva pyruvát a rovnováha reakcie oxidácie L-laktátu sa posúva vpravo. L-glutamát + pyruvát ALT L-alanín + 2-oxoglutarát Laktátdehydrogenáza (LD) LD je cytoplazmový enzým vyskytujúci sa v mnohých tkanivách (pečeň, obličky, srdcové a kostné svaly, nádorové bunky). V krvnom sére sa vyskytuje niekoľko izoenzýmov LD, ktoré sa môžu stanoviť po ich rozdelení elektroforézou alebo imunoinhibičnými metódami. Zvýšená aktivita LD súvisí s rôznymi chorobnými stavmi (infarkt myokardu, anémia, leukémia, ochorenie pečene, tumory).

17 9 Rutinné biochemické vyšetrenia 200 Stanovenie katalytickej koncentrácie LD s NAD+ podľa IFCC Enzým LD katalyzuje oxidáciu L-laktátu s NAD + na pyruvát: + L-laktát + NAD pyruvát + NADH + H + LD. Postup: Ako tlmivý roztok sa používa N-metyl-D-glukamín (MEG), ph 9,4. Reakcia sa štartuje roztokom NAD +, zmes sa dôkladne premieša a po lag-fáze 90 s sa meria absorbancia po dobu 180 s (namerať najmenej šesť bodov) pri vlnovej dĺžke 339 nm. Pri 339 nm absorbuje len NADH. Katalytická koncentrácia LD je úmerná prírastku absorbancie pri 339 nm Lipáza Enzým lipáza katalyzuje postupnú hydrolýzu triacylglycerolov na glycerol a vyššie karboxylové kyseliny. Zvýšená aktivita enzýmu sa pozoruje pri akútnom zápale pankreasu. Fotometrické stanovenie Fotometrické stanovenie využíva syntetický substrát (napr. 1,2-diacylglycerol) a sekvenciu reakcií s enzýmami lipáza, kolipáza, monoglyceridlipáza, glycerolkináza a L-α-glycerolfosfátoxidáza. Produktom reakcie je H 2 O 2, ktorý v prítomnosti enzýmu POD oxiduje 4-aminoantipyrín na chinónimínové farbivo (meria sa jeho absorbancia pri vlnovej dĺžke 550 nm). Iná možnosť je využiť HO 2 2 na oxidáciu leukobáz a merať absorbanciu takto vzniknutých produktov Močovina (urea) Močovina vzniká v pečeni ako jeden z hlavných produktov metabolizmu bielkovín. Jej hlavný podiel sa vylučuje močom, malé množstvo sa vylučuje potom. Zvýšená koncentrácia sa pozoruje pri viac ako 50 % znížení glomerulárnej filtrácie (pri normálnom príjme proteínov), pri obmedzenom prekrvení obličiek, v prípade obličkových kameňov a nádorov, pri nadmernom príjme proteínov. Znížené hodnoty sa pozorujú pri zníženom príjme proteínov, pri dedičných poruchách syntézy proteínov a pri ťažkých ochoreniach pečene. Enzýmové stanovenie s NADH + Enzým ureáza hydrolyzuje močovinu na CO a NH : 2 4 NH 2 -CO-NH 2 + H O + NH 3 + H 2 O NH + OH -. 4 CO + 2 NH 2 ureáza 2 3

18 9 Rutinné biochemické vyšetrenia Vzniknutý NH 4 reaguje s 2-oxoglutarátom a NADH za katalytického pôsobenia enzýmu glutamátdehydrogenáza (GLD): L-glutamát + NAD 2 NH + 2-oxoglutarát + 2 NADH GLD + H O. Meria sa pokles absorbancie NADH pri 340 nm metódou end-point alebo kinetickou metódou. Enzýmové stanovenie s ISE Na stanovenie močoviny v sére sa používajú aj jednoúčelové analyzátory vybavené napr. ureázou imobilizovanou na membráne ISE (časť 7.7) Triacylglyceroly Triacylglyceroly obsahujú glycerol, na ktorý sú esterickou väzbou viazané tri vyššie karboxylové kyseliny (prevažne C 16 -C 18 ). V krvnom sére sú, podobne ako cholesterol, súčasťou lipoproteínov a slúžia predovšetkým na zaistenie energie. Zvýšená koncentrácia je rizikovým faktorom arteriosklerózy. Enzýmové stanovenie Triacylglyceroly sa hydrolyzujú v prítomnosti enzýmu lipáza na glycerol a zodpovedajúce vyššie karboxylové kyseliny. Glycerol sa potom fosforyluje za katalytického účinku enzýmu glycerolkináza na glycerol-3-fosfát. Glycerol-3-fosfat sa oxiduje pôsobením enzýmu glycerolfosfátoxidáza na dihydroxyacetónfostát. Vzniknutý H 2 O 2 sa využije v reakcii vzniku červeného chinónimínového farbiva. Meria sa absorbancia pri vlnovej dĺžke 500 nm. Triacylglyceroly + 3 H O Glycerol + ATP Glycerol-3-fosfát + O 2 glycerolkináza R-NH 2 + C 6 H 5 -OH + 2 H 2 O lipáza glycerolfosfátoxidáza glycerol + 3 vyššie karboxylové kyseliny glycerol-3-fosfát + ADP dihydroxyacetónfosfát + H 2 2O 2 POD R-N=C H =O + 4 H O Pri jednostupňových metódach takto reaguje nielen glycerol uvoľnený z triacylglycerolov, ale aj voľný glycerol (endogénny) prítomný v biologickej vzorke; stanoví sa teda celkový glycerol. Ak sa celý vyššie uvedený postup analýzy zrealizuje bez prídavku enzýmu lipáza, možno meraním absorbancie stanoviť voľný glycerol vo vzorke. Množstvo triacylglycerolov sa potom vypočíta ako rozdiel: Triacylglyceroly = celkový glycerol voľný glycerol.

19 9 Rutinné biochemické vyšetrenia Troponín T Troponín sa spolu s ďalšími bielkovinami podieľa na štruktúre priečne pruhovaného svalu a má vplyv na reguláciu kontrakcie srdcového svalu. U človeka boli opísané tri formy troponínu T, z nich jedna je špecifická pre srdce a dve pre kostné svalstvo. Troponín T má špecifický význam pre včasné stanovenie infarktu myokardu. (Iné markery infarktu myokardu sú CK, CK-MB, LD a myoglobín). Dôkaz a diferenciácia troponínu T zo srdcového svalu od troponínu T z kostného svalstva sa dosiahne pomocou špecifických monoklonálnych protilátok proti troponínu T zo srdca. Testy sú založené na sendvičovej technike s využitím komplexu streptavidín/biotín. Princíp rýchleho diagnostického testu bol uvedený v časti 7-6. Stanovenie metódou ELISA Používa sa dvojica monoklonálnych protilátok Ab 1 a Ab 2 proti troponínu T. Protilátka Ab1 je označená biotínom (obr. 9-1). Druhá protilátka je označená peroxidázou Ab 2 POD. Na stene mikroskúmavky je naviazaný streptavidín. Tetrametylbenzidín + H 2 O 2 Benzidínová modrá Difenyldichinón POD Troponín T Biotín Ab 2 Ab 1 Streptavidín Obr. 9-1 Princíp detekcie pri stanovení troponínu T sendvičovou metódou ELISA Imunoreakciou Ab, troponínu T a Ab 1 2POD vznikne sendvičový komplex. Po vymytí zvyšku reagentov sa pridá H 2 O 2 a vhodný chromogén (napr. tetrametylbenzidín). Chromogén sa oxiduje na príslušné farbivo (v príklade je to benzidínová modrá, ktorá sa v kyslom prostredí zmení na červené difenyldichinóny s absorpčným maximom pri vlnovej dĺžke 405 nm). Ako chromogén sa môže použiť tiež ABTS (amónna soľ kyseliny 2,2 -azino-bis(3-etylbenzotiazolín-6-sulfónovej).

20 9 Rutinné biochemické vyšetrenia Sodík a draslík Na + tvorí hlavný podiel katiónov v plazme. Asi 95 % sa vylučuje močom, zvyšok potom a stolicou. Sodík a draslík sa stanovujú vo všetkých telových tekutinách, najčastejšie v sére. Stanovenie Na a K plameňovou atómovou emisnou spektrometriou (FAES) Na stanovenie Na sa využíva jeho základná spektrálna čiara 589 nm, stanovenie K využíva jeho základnú čiaru 768 nm. Vzorka sa riedi roztokom LiCl alebo CsCl, ktoré sa uplatňujú ako spektrálne pufre (stabilizuje ionizačnú efektívnu teplotu plameňa). Li plní v skutočnosti aj funkciu vnútorného štandardu. Vzorka sa obvykle riedi 50 až 200 krát. Riediaci roztok niekedy obsahuje aj povrchovoaktívnu látku (Brij 35) na zlepšenie atomizácie. Stanovenie Na a K iónovo-selektívnymi elektródami Na stanovenie Na + sa využíva elektróda so sklenou membránou, na stanovenie K + elektróda s kvapalnou membránou s valinomycínom (časť 7.2). Použitím ISE sa nestanovuje koncentrácia Na +, ale jeho aktivita, ktorej hodnota je ovplyvnená aktivitou všetkých elektrolytov v roztoku. Potenciometrické stanovenie môže byť priame (na stanovenie sa použije nezriedená vzorka krvi, plazmy, séra), alebo nepriame (meria sa zriedená vzorka). Priamou potenciometriou sa stanoví množstvo Na + vo vodnej fáze plazmy alebo séra. Sérum obsahuje okrem vody aj bielkoviny a lipidy, ktoré zaberajú významnú časť objemu vzorky. Z tohto dôvodu priama potenciometria poskytuje vyššie výsledky ako FAES a nepriama potenciometria. Priama potenciometria stanovuje skutočnú fyziologicky účinnú koncentráciu, nezávislú od koncentrácie bielkovín a lipidov; z tohto pohľadu sa priama potenciometria javí ako klinicky užitočnejšia metóda. Neprejavuje sa u nej napr. vplyv chylozity, ktorý znižuje koncentráciu Na a K pri stanovení metódou FAES Horčík a vápnik Horčík sa v organizme zúčastňuje všetkých reakcií, pri ktorých dochádza k prenosu fosfátovej skupiny. Všetky reakcie, ktorých sa zúčastňuje ATP, majú za substrát komplex ATP s horčíkom. Zvýšenie aj zníženie množstva Mg sa pozoruje napr. pri poruchách obličiek. Vápnik sa v organizme nachádza buď ako voľný, alebo viazaný do komplexov s bielkovinami (albumínom) alebo anorganickými aniónmi. Z hľadiska biologického účinku je zaujímavý voľný vápnik. Zvýšené hodnoty Ca (aj celkového) možno zistiť u pacientov s karcinómom. Stanovenie celkového Ca a Mg v sére metódou atómovej absorpčnej spektrometrie (AAS) Na stanovenie celkového vápnika a horčíka je vhodná AAS. Používa sa plameň acetylén/vzduch a meria sa čiara vápnika 422 nm a čiara horčíka 285 nm. Vzorka séra sa zriedi (1:50) roztokom

21 9 Rutinné biochemické vyšetrenia LaCl 3 v HCl (spektrálny pufer), ktorý uvoľní Mg a Ca z komplexov s fosfátmi a súčasne zriedi viskózne bielkoviny. Stanovenie voľného Ca a Mg iónovo-selektívnymi elektródami Stanovenie voľného Ca sa vykonáva ISE s membránou selektívnou na Ca. Pretože sa meria aktivita Ca 2+, je stanovenie ovplyvňované predovšetkým koncentráciou Na + a K + (iónovou silou). Používa sa priama potenciometria (meranie nezriedenej vzorky). Ak sa použije nepriama potenciometria, pri ktorej sa vzorka riedi, stanoví sa celkový vápnik. Stanovenie voľného Mg 2+ sa vykonáva ISE s membránou selektívnou na Mg 2+ podobne ako pri Ca 2+. Spektrofotometrické stanovenie Mg s Magonom V alkalickom (ph 9,5) a čiastočne nevodnom (50 % etanol) prostredí reaguje Magon s iónmi Mg 2+ za vzniku červeno sfarbeného komplexu, ktorého absorbancia sa meria pri vlnovej dĺžke 505 nm. Magon je 1-(2-hydroxyazo)-2-naftol-3-(2,4-dimetyl)-karboxyanilid. Spektrofotometrické stanovenie Mg s Calmagitom V čiastočne nevodnom alkalickom prostredí reaguje Mg 2+ s Calmagitom za vzniku červeno sfarbeného komplexu, ktorého absorbancia sa meria pri vlnovej dĺžke 540 nm. Calmagit je kyselina 3-hydroxy-4-(2-hydroxy-5-metylfenylazo)-1-naftalénsulfónová. Stanovenie Mg enzýmovou UV metódou s hexokinázou (HK) a glukóza-6-fosfátdehydrogenázou (G6PD) Mg 2+ a enzým hexokináza katalyzujú fosforyláciu glukózy (aj iných sacharidov): Glukóza + ATP 2+ HK, Mg glukóza-6-fosfát + ADP. Reakciou vzniknutý glukóza-6-fosfát sa potom oxiduje s NAD + glukóza-6-fosfátdehydrogenáza: v prítomnosti katalyzátora + Glukóza-6-fosfát + NAD glukonolakton-6-fosfát + NADH + H + G6PD. Koncentrácia Mg 2+ sa vypočíta z prírastku absorbancie NADH meranej pri 340 nm. Spektrofotometrické stanovenie Ca s o-krezoftaleínkomplexónom (CPC) V čiastočne nevodnom alkalickom prostredí reaguje Ca 2+ s CPC za vzniku červeno sfarbeného komplexu, ktorého absorbancia sa meria pri vlnovej dĺžke 580 nm. CPC je 3,3 -bis[[bis(karboxy-metyl)amino]-metyl]- 5,5 -dimetylfenolftaleín.

22 9 Rutinné biochemické vyšetrenia 205 Spektrofotometrické stanovenie Ca s Arzénazo III Arzénazo III (kyselina 1,8-dihydroxynaftalén-3,6-disulfo-2,7-bis(azo-1)benzén-2-arzínová) vytvára v imidazolovom tlmivom roztoku (ph 6) s Ca 2+ modro sfarbený komplex, ktorého absorbancia sa meria pri vlnovej dĺžke 650 nm Chloridy Chloridový anión je hlavný anión v mimobunkovej tekutine. Z buniek obsahujú najviac chloridov erytrocyty, najmenej svalové bunky. Spolu s Na + sa podieľa na regulácii osmotického tlaku. Zmeny v koncentrácii Cl - sú vo väčšine prípadov súbežné so zmenami v koncentrácii Na +, pretože podliehajú rovnakej regulácii. Coulometrické stanovenie chloridov Koncentrácia Cl- sa stanoví z množstva elektrického prúdu potrebného na uvoľnenie takého množstva Ag+, ktoré je práve potrebné na prevedenie Cl- na nerozpustný AgCl (časť 7.2). Stanovenie chloridov iónovo-selektívnou elektródou V automatických analyzátoroch sa používa priama potenciometria s ISE Fosfor Fosfor sa v ľudskom organizme nachádza ako kyselina fosforečná a jej deriváty. Celkový fosfor možno rozdeliť na: o fosfor rozpustný v kyselinách. Ide o fosfor, ktorý zostane v supernatante po deproteinácii séra kyselinou trichlóroctovou. Jeho súčasťou je aj tzv. anorganický fosfor, o fosfolipidy ide o zložky obsahujúce fosfor, ktoré sa extrahujú z plazmy organickými rozpúšťadlami, o fosfoproteíny zrazenina po deproteinácii kyselinou trichlóroctovou obsahuje fosfoproteíny aj fosfolipidy. Stanovenie anorganického fosforu s molybdénanom amónnym Anorganický fosfor sa stanovuje v supernatante po deproteinácii séra kyselinou trichlóroctovou. Princípom stanovenia je reakcia fosforečnanov s molybdénanom amónnym podľa schémy: (NH 4) 3PO MoO 3 (NH 4) 3PO 4(MoO 3) 12.

23 9 Rutinné biochemické vyšetrenia 206 Reakciou vzniká žltý komplex (NH 4) 3PO 4(MoO 3) 12, ktorého absorbancia sa meria pri vlnovej dĺžke 340 nm. Komplex sa môže ďalej zredukovať na fosfomolybdénovú modrú (absorbancia sa potom meria pri vlnovej dĺžke nm). Stanovenie fosfolipidov po mineralizácii Po deproteinácii séra kyselinou trichlóroctovou sa k zrazenine bielkovín obsahujúcej aj fosfolipidy pridá zmes HClO4 a HNO3 a opatrne sa zohreje na kúpeli. Zrazenina sa rozpustí, roztok sa odfarbí a zo zmesi unikajú biele dymy. Vzniknutý anorganický fosfor sa stanoví s molybdénanom amónnym. Enzýmové stanovenie fosfolipidov Enzým fosfolipáza D uvoľňuje anorganický fosfor z fosfolipidov (hydrolýza). Reakciou vznikne cholín, ktorý sa oxiduje enzýmom cholínoxidáza na betaín a vzniká peroxid vodíka. Peroxid vodíka sa využíva na oxidačnú kopuláciu 4-aminoantipyrinu s fenolom na chinónimínové farbivo. Oxidačná kopulácia je katalyzovaná enzýmom peroxidáza. Meria sa absorbancia chinónimínového farbiva pri vlnovej dĺžke 500 nm. Fosfolipidy + H O Cholín + 2 O D fosfolipáza cholínoxidáza cholín + H PO betaín + H O R-NH 2 + C 6 H 5 -OH + 2 H 2 O POD R-N=C H =O + 4 H O V tab. 9-1 sú uvedené referenčné a odporúčané metódy pre niektoré analyty.