Bakterije mlečne kiseline ULOGA STARTERA U PROCESIMA FERMENTACIJE

Transcript

1 FERMENTACIJA Bakterije mlečne kiseline ULOGA STARTERA U PROCESIMA FERMENTACIJE UVOD BAKTERIJE MLEČNE KISELINE HALLMARK industrije mleka Komercijalni značaj dairy fermentation industry druga po redu proizvodnja (nakon proizvodnje alkoholnih pića) Ključnu ulogu imaju prvenstveno rodovi Lactococcus, Leuconostoc, Lactobacillus, Streptococcus, Pediococcus Veliki istraživački napor naučne zajednice ka spoznaji fiziologije, biohemizma i genetičkog make up BMK u odnosu na industrijski (TEHNOLOŠKI) VAŽNA SVOJSTVA: produkcija mlečne kiseline, proteoliza proteina mleka (kazein), osetljivost na bakteriofage, kao i druga svojstva koja determinišu ultimativni kvalitet finalnih proizvoda produkcija egzopolisaharida, metabolizam citrata produkcija aromogenih jedinjenja, sinteza bakteriocina OVA SVOJSTVA su PLASMID BORNE UVOD GENE CLONING SYSTEM stabilna i kontrolisana ekspresija svih dairying relevant genes po njihovoj inserciji u hromozom bakterijskog domaćina Tokom zadnjih 25 godina PROMENE snažno i definisano tržište automatizacija i racionalizacija industrije mleka; potrošač osetljiv na mnoga HEALTH and ENVIRONMENTAL ISSUES, uz zahtev većeg i bolje Informisanog izbora OPTIMIZACI JA FERMENTACIJE kroz starter kulture stabilnih performansi 1

2 UVOD Izuzetna finansijska pomoć EU kroz sponzorisanje tzv. LONG TERM RESEARCH kroz nekoliko sukcesivnih programa pod kapom BIOTECHNOLOGY PROGRAMME 56 laboratorija iz 42 istraživačke institucije participirale u integrisanom STARLAB projektu 1. Cell engineering of L. lactis 2. LAB with modified proteolytic properties in milk fermentation 3. Control of bacteriophage development in LAB 4. The molecular biology and genetics of thermophilic LAB 5. LAB as cell factories for the production and delivery of mucosal immunogens 6. Carbon catabolite control in food grade lactobacilli LAB INDUSTRIAL PLATFORM POTRAGA KONVENCIONALNE METODE POBOLJŠANJA vremenski duge screening protokole u cilju selekcije sojeva ili mutanata postojećih sojeva koji ispoljavaju nova i/ili poboljšana svojstva Praktična aplikacija upotreba BACTERIOPHAGE INSENSITIVE MUTANTS (BIM) u industriji sira I dalje opstaje i koristi se za povećanje GENETIČKOG POOL a starter kultura (zamerke: duge, zahtevne proceedure i teško za predvideti kako će se selekcionisani sojevi pokazati u komercijalnoj praksi) Kasne te aplikacija rekombinantne DNA tehnologije; modifikacija sojeva na veoma precizan način i generisanje customdesigned kultura sa specijalizovanim funkcijama PROBIOTIC ACTIVE SUBSTANCE Naidu, Bidlack and Clemens, 1999 celularni kompleks BMK 2

3 ZAŠTO? Najstariji način konzervisanja hrane PRINCIP PROBE I POGREŠKE kiselokoagulišući sirevi preteča svih ostalih vrsta sireva Mikrobna fermentacija hrane 6000 BC Prvobitni cilj konzervisanje: mikrobna konverzija UH do kiseline i/ili alkohola; potrošnja kiseonika, produkcija antimikrobnih sastojaka supresija rasta MO kvara MIKROBIOLOŠKA STABILNOST PROIZVODA plus DODATNI KVALITET WHY FERMENTED PRODUCTS? Nutritivna vrednost probavljivost/svarljivost, sadržaj esencijalnih nutrijenata Predigestija proteina, UH bolja tolerancija jogurta kod laktoza intolerantnih osoba Fermentisana mleka izvor biološki aktivnih komponenti BMK (probiotici), njihovi metabolički produkti, ili komponente koje nastaju po digestiji proteina mleka aktivnošću indogenih enzima mleka : peptidi sa opoidnom, antikancerogenom, antihipertenzivnom, imunomodulatornom aktivnošću Represija patogena i MO kvara: sniženje ph na osnovu produkcije organskih kiselina, kompeticija za hranjive materije, snižavanje redoks potencijala, produkcija specifičnih inhibitornih jedinjenja bakteriocini Statistika Bulletin No. 35 IDF 22 kg po glavi stanovnika (prosečna godišnja potrošnja fermentisanih proizvoda u Evropi) 8,5 biliona kg fermentisanog mleka/godini 10 8 CFU/g 8,5 x BMK 4 x g 3400 tone ćelija BMK godišnje u Evropi (fermentisana mleka) 3

4 SLED TEHNOLOŠKIH POSTUPAKA U PROIZVODNJI FERMENTISANIH PROIZVODA Definicija Starter kultura mikrobni preparat; sadrži veliki broj ćelija najmanje jedne vrste MO; sa namerom se dodaje termički obrađenom supstratu kako bi dobili fermentisani proizvod i to ubrzavanjem i kontrolisanjem procesa fermentacije (metabolička aktivnost) Proizvodnja fermentisanih proizvoda BIOPROCESIRANJE Spontane fermentacije aktivnost autohtonih sojeva poreklom iz sirovine i okruženja početak tradicionalne biotehnologije ПРАВИЛНИК О КВАЛИТЕТУ ПРОИЗВОДА ОД МЛЕКА И СТАРТЕР КУЛТУРА (Објављен у Службеном гласнику Републике Србије, број 33 од 18. маја године) ПРАВИЛНИК О КВАЛИТЕТУ ПРОИЗВОДА ОД МЛЕКА И СТАРТЕР КУЛТУРА (Објављен у Службеном гласнику Републике Србије, број 33 од 18. маја године) Члан 72. Стартер културе су културе једног или више сојева, једне врсте или више сојева, две или више врста микроорганизама, које својом активношћу усмеравају технолошки процес производње ферментисаних производа од млека и истовремено им дају одређена сензорска својства. Постоје два типа стартер култура, и то: мезофилни и термофилни. Члан 73. Стартер културе могу бити течне, лиофилизоване или смрзнуте. 4) да 1 g лиофилизоване културе намењене за директну ферментацију од млека и производа од млека садржи најмање 3 х10 10 живих ћелија (cfu g); 5) да 1 g дубоко смрзнуте културе намењене за директну ферментацију млека и производа од млека садржи најмање 9 х10 9 живих ћелија (cfu g). 4

5 PODELA SELEKCIONISANE I PRECIZNO DEFINISANE predvidljiva i ponovljiva stopa acidifikacije, i razvijanja specifičnih senzornih karakteristika KONTROLA PROCESA FERMENTACIJE I DOBIJANJE PROIZVODA STANDARDNOG KVALITETA; mono i mešovite kulture, mezofilne i termofilne, 2 tipa bakterija producenti kiseline i producenti aromatičnih materija NEDEFINISANE, TRADICIONALNE KULTURE prirodne, wild type BMK; iniciraju proces u odsustvu komercijalnih startera; neponovljivost ukusa kod tradicionalnih proizvoda NSBMK ne predstavljaju deo starter flore, ali se u velikoj biomasi uspostavljaju tokom perioda zrenja, kao sekundarna flora Historija Zemlja 4,5 biliona godina stara, BMK 3 biliona godina populacija BMK se progresivno širi pojavom sisara pre 65 miliona godina uzgajanje stoke pre 8000 godina praksa proizvodnja fermentisane hrane prvi slikovni zapis na steli iz doba Ptolomeja u Starom Egiptu Biblija patrijarh Avram pred tri anđela iznosi grušano mleko (Genesis VIII) Dostupnost genomskih sekvenci BMK baca novo svetlo na evoluciju ovih MO kroz mleko kao supstrat (mikrosredinu habitat ekosistem); gubitak i inaktivacija gena PLUS horizontalni transfer gena PLUS metabolička simplifikacija 5

6 Historija Homer Odiseja prvi proizvođač sira Polyfemus (Aristotel, Varro, Columella) Rimske legije instrumental širenja tehnologije izrade sireva CASEALE zasebne prostorije u rimskim kućama Srednji vek manastiri, veliki feudalni posjedi Doba Renesanse sir nije zdrav, popularnost se vraća početkom 19. veka sistematska upotreba starter kultura sredinom XX stoleća /Christian Hansen fermentacija sa selekcionisanim intestinalnim MO Shirota Institute for Research on Protective Bacteria industrijska primena probiotskih MO posle godine BMK Grupa Gram pozitivnih, nesporogenih MO funkcionalno povezanih na osnovu sposobnosti da produkuju mlečnu kiselinu tokom homoili heterofermentacije; fakultativno anaerobni sa fermentativnim metabolizmom Katalaza negativni /u retkim slučajevima aktivnost pseudokatalaze Morfološki oblici koka, štapića, kokobacili, hemoorganotrofi Slabo proteolitični i lipolitični, kompleksni nutritivni zahtevi (purinske i pirimidinske baze, AK, vit B grupe) Ključ za diferencijaciju BMK i komparacija sa sadašnjom taksonomijom Rod Oblik Katalaza Redukcija Fermentacija Sadašnji rodovi nitrata Betabacterium štapić hetero Lactobacillus Weisella Thermobacterium štapić homo Lactobacillus Streptobacterium štapić homo, hetero Lactobacillus Carnobacterium Streptococcus koka homo Streptococcus Enterococcus Lactococcus Vagococcus Betacoccus koka hetero Leuconostoc Oenococcus Weisella Microbacterium štapić + + homo Brochothrix Tetracoccus koka + + homo Pediococcus Tetragenococcus 6

7 Glavne filogenetske grupe BMK BMK Mezofili (5 o C 45 o C); ph 4,0 4,5 (ph 9,6; ph 3,2) S. thermophilus, by Broadbent Pediococcus spp. Leuconostoc spp. Enterococcus faecalis Lb. casei, by Broadbent Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus, by Broadbent Industrijska primena BMK Starter kulture, pomoćne starter kulture Zaštitne kulture Probiotici funkcionalna hrana GRAS status ( Generally Recognised As Safe ); FOOD GRADE organisms QPS koncept ( Qualified Presumption of Safety ) (Evropa) 1/19/

8 Mehanizmi antagonizma BMK Antagonizam inhibicija drugih (MO kvara ili patogenih vrsta) organizama putem kompeticije za hranjive materije, ili produkcijom metabolita sa antimikrobnim delovanjem Mikrobna interferencija efikasni nespecifični mehanizam kontrole uobičajen za sve populacije i sredine (niše) uključujući i namirnice; inhibicija rasta određenih MO od strane drugih članova habitata i to na osnovu kompeticije za hranjive materije, ostvarivanja nepovoljne sredine te kompeticije za adheziona mesta 1/19/ Metabolički produkti BMK sa antimikrobnim svojstvima Produkt Organske kiseline Mlečna kiselina Sirćetna kiselina Glavni target organizmi Truležne i Gram negativne bakterije, pojedine plesni Truležne bakterije, klostridije, pojedini kvasci i plesni Hidrogen peroksid Enzimi Laktoperoksidaza sistem sa H 2O 2 Lizozim (tehnologija rekombinantne DNK) Patogeni i MO kvara posebno u namirnicama bogatim na sadržaju belančevina Patogeni i MO kvara (mleko i proizvodi od mleka) Nepoželjni Gram pozitivni MO Metaboliti male molekulske mase Reuterin (3 OH propionaldehid) Diacetil Masne kiseline Široki spektar bakterija, kvasci i plesni Gram negativne bakterije Različite bakterije 1/19/2016 Bakteriocini nizin Pojedine BMK i Gram pozitivne bakterije, posebno sporogeni MO 23 STARTERI 8

9 KOMPONENTE STARTERA Mozzarella sir S. thermophilus, Lb. delbruecki, ili Lb. helveticus Švajcarski sirevi S. thermophilus, Lb. helveticus, Propionibacterium shermani JOGURTNA KULTURA MODEL UDRUŽENOG RASTA PROTOKOOPERACIJA, METABIOZA ACIDIFIKACIJA RAZVIJANJE UKUSA RAZVIJANJE TEKSTURE produkcija egzopolisaharida Screening testovi pogodnost BMK kao startera Posebni atributi Stopa acidifikacije Rezistencija na bakteriofage, Stabilnost tehnoloških karakteristika Promovisanje teksture/ arome Kompatibilnost sa drugim sojevima Proteolitička aktivnost 9

10 GENERALNI KRITERIJUMI ZA STARTER KULTURE 1. BEZBEDNOST 1.1. Starter organizam ne posjeduje aktivnost patogena i/ili toksičnu aktivnost 1.2. Nisu nosioci prenosivih gena koji kodiraju svojstvo rezistencije na ANT 2. TEHNOLOŠKA EFIKASNOST 2.1. Starter MO dominiraju nad popratnom mikroflorom 2.2. Starter MO ispoljavaju potrebnu metaboličku aktivnost 3. EKONOMSKI ASPEKT 3.1. Propagacija kultura mora biti isplativa sa ekonomske tačke gledišta 3.2. Mogućnost konzervisanja postupcima zamrzavanja ili sušenje zamrzavanjem uz mali (zanemarljiv) gubitak aktivnosti 3.3. Važna biotehnološka svojstva su stabilna pod definisanim uslovima skladištenja u periodu od nekoliko meseci 3.4. Upotreba kultura što je moguće jednostavnija GENERALIZOVANA SCHEMA FERMENTACIJE HEKSOZA KOD BMK homofermentacija GENERALIZOVANA SCHEMA FERMENTACIJE HEKSOZA KOD BMK heterofermentacija 10

11 PEP / zavisni PTS sistem LAKTOZA PERMEAZA/β GALAKTOZIDAZA SISTEM PROTEOLITIČKi SISTEM LAKTOKOKA 11

12 PEPTIDAZE BMK METABOLIZAM CITRATA BMK BAKTERIOCINI Heterogena grupa antimikrobnih proteina i peptida koji deluju antagonistički primarno prema blisko srodnim vrstama MO Klasifikacija (Klaenhammer, 1988) Klasa I (lantibiotici; mali, termostabilni, sadrže neuobičajene AK) Klasa II: IIa pediocinu slični bakteriocini sa antilisterija efektom; IIb dvokomponentni bakteriocini; IIc ostali bakteriocini Klasa III veliki (>30kDa) termolabilni proteini Klasa IV kompleksni bakteriocini koji sadrže ugljenohidratnu i/ili lipidnu komponentu 12

13 1/19/ In vitro ispitivanje produkcije bakteriocina 1/19/ MEHANIZMI BORBE PROTIV BAKTERIOFAGA TEHNOLOŠKE MERE Primena startera sa sojevima neosetljivim na fage, odnosno koji nisu homologni Aseptični sistemi propagacije Primena fag inhibitornih medija Rotacija startera Kondicioniranje vazduha Izbegavanje generisanja aerosola Čišćenje/hlorisanje CIP sistem Segragacija starter soba od proizvodne opreme Odgovarajući dizajn postrojenja SELEKCIJA izlaganje koktelu bakteriofaga GENETSKI INŽENJERING 13

14 INDUSTRIJSKA APLIKACIJA BMK Lactococcus spp. (mleko) Lactobacillus spp. (mleko, meso, povrće, žitarice) Leuconostoc spp. (povrće, mleko) Pediococcus spp. (povrće, meso) Oenococcus oeni (vino) Streptococcus thermophilus (mleko) Probiotski efekat, proizvodnja industrijskih hemikalija i bioloških produkata biopolimeri, enzimi, etanol i mlečna kiselina; oralni nosači za digestivne enzime i antigene u sastavu vakcina Determinacija sekvenci genoma reprezentativne kolekcije BMK Prvi kompletni genom L. lactis subsp. lactis IL403 Lactococcus spp. Prethodna Lancefield grupa N streptokoka 7 vrsta, 2 subvrste i 1 biovar Lc. lactis 2 subvrste i 1 biovar Lc. lactis subsp. lactis; Lc. lactis subsp. cremoris; Lc. lactis subsp. lactis biovar diacetylactis Habitat zelene biljke; prirodni habitat za Lc. lactis subsp. cremoris nije potvrđen Fosfoenolpiruvat fosfotransferaza sistem (PEP PTS) omogućava uspešno preuzimanje i fermentaciju La prepoznatljiv habitat danas za većinu laktokoka čine proizvodi od mleka 14

15 Lactococcus spp. cont. Homofermentativni, mikroaerofilni, Gram pozitivni, rast pri 10 o C, ali ne i pri 45 o C, produkuju L (+) mlečnu kiselinu Morfologija: ovoidne ćelije, pojedinačno, u parovima ili lancima nemoguće razlikovati od Leuconostoc, Streptococcus i Enterococcus spp. Lc. lactis subsp. lactis biovar diacetylactis posjeduje citrat permeazu mogućnost iskorištavanja citrata i produkcije diacetila svojstvo kodirano genima lociranim na plazmidu nestabilna karakteristika varijetet Lc. lactis subsp. lactis Lactococcus spp. cont. Lactococcus spp. cont. 15

16 Lactococcus spp. cont. Lactococcus spp. cont. Važna biotehnološka svojstva katabolizam La, produkcija proteinaza i rezistencija na bakteriofage, ali i druge karakteristike metabolizam saharoze, galaktoze, manoze, glukoze, utilizacija citrata, DNA restrikcija i modifikacija, produkcija bakteriocina, rezistencija na anorganske ione kodirana genima lokalizovanim na plazmidima Spontani gubitak plazmida učestale kultivacije u mleku ili promena uslova kultivacije genetski nestabilne karakteristike Veoma zahtevni po pitanju hranjivih materija proteini, peptidi, specifične AK, derivati nukleinskih kiselina, vit Lactococcus spp. cont. [proteolitička aktivnost] Koncentracija izoleucina, leucina, valina, histidina, metionina <1mg/L 2% konačne gustine ćelija zavisne odvlastititog proteolitičkog sistema Proteinaze ćelijskog zida, ekstracelularne peptidaze, Opp transportni sistem, transportni sistem za peptide (di i tripeptide) i AK i intracelularne peptidaze Ključni enzim proteinaze (PI ili PIII tip proteinaza PrtP) raskidanje više od 40% peptidnih veza u više od 100 različitih oligopeptida Divlji sojevi laktokoka 1 4 AK za rast; veća aktivnost konvertaza AK 16

17 Lactococcus spp. cont. [glikolitička aktivnost] Lac plazmid geni koji kodiraju katabolizam La simultani katabolizam GLU i GAL La se preuzima putem fosfoenol piruvat (PEP) zavisnog fosfotransferaza sistema (PEP PTS) GAL se katabolizuje putem TAGATOZA puta simultano tokom katabolizma GLU u okviru Embden Mayerhof ovog ciklusa sa završnim produktom piruvatom, koji se potom redukuje aktivnošću laktat dehidrogenaza do laktata Lactococcus spp. cont. [metabolizam citrata] Ključni enzim CitP metaboliziranje citrata do aromogenih komponenti: diacetil, acetoin, 2,3 butandiol, octena kiselina i CO 2 Bakteriocini laktokoka mali termostabilni proteini sa inhibitornom aktivnošću ka blisko srodnim bakterijama NIZIN komercijalna upotreba, širi antimikrobni spektar, uključujući i L. monocytogenes; lantibiotik US FDA odobrena upotreba nizina u prevenciji kasnog nadimanja sira uzrokovanog klostridijama Lactobacillus spp. Gram pozitivni, nesporogeni štapići ili kokobacili Striktno fermentativni, aerotolerantni ili anaerobni, acidofilni, kompleksni hranidbeni zahtevi (UH, AK, peptidi, esteri MK, soli, derivati nukleinskih kiselina, vitamini) Homofermentativni (>85% mlečna kiselina) ili heterofermentativni (mlečna kiselina, ugljen dioksid, etanol, i/ili octena kiselina u ekvimolarnim količinama) 17

18 Lactobacillus spp. Beijerinck, Orla Jensen, Thermobacterium, Streptobacterium, Betabacterium Bergey s Manual of Systematic Bacteriology (Kandler and Weiss, 1986) (phenotype based nomenclatura) 1. Obligatno homofermentativni 2. Fakultativno heterofermentativni 3. Obligatno heterofermentativni (phylogeny based nomenclatura) 1. Lactobacillus delbrueckii grupa 2. Lactobacillus casei/pediococcus grupa 3. Leuconostoc grupa Lactobacillus spp. 16S rrna sekvenca gena diverzitet roda godine 12 novih vrsta ( Taksonomske promene kontinuirano traju 44 vrste i 11 subvrsta u vrsta i 15 subvrsta u vrsta i 27 subvrsta u decembru ivrsta i 27 subvrsta Primena molekularnih metoda genus i species specifični prajmeri genomi nekoliko laktobacila u potpunosti sekvencionisani: Lactobacillus acidophilus NCFM; Lactobacillus brevis ATCC367; Lactobacillus gasseri ATCC3323; Lactobacillus johnsonii NCC533; Lb. plantarum WCFS1 Lactobacillus spp. 18

19 Streptococcus thermophilus, Leuconostoc spp. Genetički sličan Streptococcus salivarius Razlikovanje od ostalih streptokoka i laktokoka rezistencija na visoke temperature, sposobnost rasta pri 52 o C, fermentacija ograničenog broja UH; proteolitički malo aktivan, iako poseduje brojne proteolitičke enzime Leuc. mesenteroides subsp. cremoris i Leuc. lactis Mezofilne heterofermentativne koke Ne hidrolizuje arginin; zahtevaju vit B grupe za rast Metabolizuju citrat; u kombinaciji sa laktokokama u procesima kada je poželjna produkcija diacetila i CO 2 Enterococcus spp. Lancefield ova grupa D (fekalne) streptokoke Revizija roda Schleifer i Killper Balz; gram pozitivne koke, u parovima, katalaza negativne, homofermentativni metabolizam; L+ izomer mlečne kiseline Pro et Contra: indikatori fekalne kontaminacije; sirevi mediteranskog područja prisutni u značajnom broju; probiotici kod ljudi i životinja E. faecium SF68, E. faecium PR88; rasejavači gena rezistencije na ANT Zastupljenost enterokoka u sirevima CFU/g 19

20 Bifidobacterium spp. Familija Actinomycetaceae; enzim fruktoza 6 fosfat fosfoketolaza; visok G+C sadržaj u DNA (55 57 mol%) filogenetski pripadaju actinomyces subdiviziji BMK Taksonomija i nomenklatura u razvoju polifazni pristup u diferenciranju vrsta Prirodni habitat intestinalni trakt ljudi i životinja B. bifidum, B. longum i B. animalis Probiotici GENETIČKO POBOLJŠANJE STARTERA TRADICIONALNE STRATEGIJE GENETIČKOG POBOLJŠANJA MUTACIJA I SELEKCIJA METODE PRIRODNOG TRANSFERA GENA TRANSDUKCIJA, KONJUGACIJA, TRANSFORMACIJA, ELEKTROPORACIJA GENETSKI INŽENJERING TEHNOLOGIJA REKOMBINANTNE DNK GENETIČKO POBOLJŠANJE STARTERA PRIMERI NA FAGE REZISTENTNI TRANSKONJUGATI VISOKO EFIKASNI U SITUACIJAMA PHAGE CRISIS 60 kb konjugativni plazmid pmrc01 kodira genetičke determinante za lacticin 3147 (BMK, Staphylococcus, Clostridium, Listeria) Ekspresija Bacillus subtilis proteaze Lactococcus spp. Cheddar sir mutant soj laktokokoka termoinducibilni profag indukcija faga sa lizom startera i oslobađanje intracelularnih enzima Metabolički inženjering Lac derivati Lb. delbrueckii subsp. bulgaricus; ekspresija gena odgovornih za produkciju egzopolisaharida u sojeve laktokoka; izmenjeni metabolički fluks u cilju povećane produkcije diacetila Genetičke delecije u cilju poboljšanja probiotskih svojstava delecija D laktat dehidrogenaze (ldhl) gena kod L. johnsoni 20

21 KEFIR 109 laktokoka, Leuconostoc spp., termofilnih laktobacila, kvasaca, bakterija sirćetne kiseline; od filame ntoznih plesni Geotrichum candidum IRINA SAKHAROVA i BEK MIRZA BACHOROV NIKOLAJ BALANDOV 21