Geni in regulacija njihovega prepisa

Transcript

1 Geni in regulacija njihovega prepisa regulacija encimske aktivnosti indukcija in represija pozitivna in negativna kontrola, atenuacija globalna kontrola dvokomponentni sistemi pogovor bakterij

2 Regulacija sinteze in aktivnosti proteinov V celici ločimo dve vrsti regulacije: - regulacijo aktivnosti že sintetiziranih proteinov - regulacijo sinteze proteinov konstitutivno izraženi geni inducibilni geni

3 Regulacija encimov na različnih nivojih produkt regulacija encimske aktivnosti protein C protein D translacija transkripcija gen A gen B gen C gen D

4 Regulacija encimske aktivnosti Obstaja več mehanizmov regulacije encimske aktivnosti: aktivacija s posttranslacijsko cepitvijo proteina kovalentna modifikacija proteina (npr. dodajanje acilne skupine, AMP, ADP, fosfata, metilne skupine) deaktivacija z razgradnjo proteina mehanizem povratne zanke (pozitivna in negativna)

5 Mehanizem povratne zanke substrat intermediat 1 intermediat 2 intermediat 3 Končni produkt metabolne poti inhibitorno deluje na prvi encim v metabolni poti. Na ta način je zelo učinkovito regulirana koncentracija metabolitov v celici (npr. aminokislin). intermediat n produkt

6 Povratna zanka - alosteričen učinek

7 Regulacija transkrpicije: represija in indukcija represija encima indukcija encima

8 Genska represija (negativna kontrola) Neaktiviran represor omogoča sintezo proteina. Prisotnost korepresorja prepreči, kar negativno vpliva, na sintezo proteina.

9 Genska represija (negativna kontrola) Prisotnost represorja prepreči, negativno vpliva, na sintezo proteina. Induktor deaktivira represor, sprosti negativno kontrolo in tako omogoči sintezo proteina.

10 Genska indukcija (pozitivna kontrola) Brez induktorja ni možna vezava aktivatorskega proteina na RNA polimerazo, kar slednji onemogoča vezavo na DNA. Aktivatorski protein za razliko od represorja pozitivno vpliva na sintezo proteina.

11 Genska indukcija (pozitivna kontrola) Mesto za vezavo aktivatorja je lahko v neposredni bližini mesta za vezavo RNA polimeraze. Lahko pa je oddaljeno nekaj 100 bp od mesta za vezavo RNA polimeraze.

12 Regulacija translacije - atenuacija Višek triptofana, transkripcija zaustavljena. Regija 2 in 3 se ne moreta pariti. Pomankanje triptofana, transkripcija poteka.

13 DNA regulatorni proteini Regulacijo prepisa DNA vršijo regulatorni proteini, ki imajo specifične interakcije z regulatorno regijo tarčnega gena. Običajno so regulatorni proteini dimeri, ki se vežejo na invertirane sekvence DNA.

14 DNA regulatorni proteini cinkovi-prsti levcinska zadrga Cink interagira z dvema cisteinoma in dvema histidinoma vsaka 7. amino kislina v delu proteina, ki skrbi za interakcije med regulatornimi proteini, je levcin

15 Regulacija več genov - katabolna represija Če sta v gojišču na voljo dva vira koncentracija laktoza glukoza rast na glukozi rast na laktozi ogljika, potem običajno zasledimo preferenčno rast na enem viru ogljika, kar imenujemo diauksična rast. Represijo genov, ki so odgovorni za izrabo drugega vira ogljika imenujemo čas katabolna represija.

16 Lac operon, prototip genske regulacije RNA polimeraza cap laci P i P O lacz lacy laca mrna mrna inhibitor Z Y A O P LacI Pi LacZ LacY LacA Cap mesto vezave represorja promotor RNA polimeraze gen za represor promotor za LacI gen za beta-galaktozidazo gen za laktozno permeazo gen za tioglikozid transacetilazo gen za sintezo CAP proteina (aktivator)

17 Lac operon, ko v mediju ni prisotne laktoze RNA polimeraza inhibitor laci P i P O lacz lacy laca mrna inhibitor

18 Lac operon, ko je v mediju prisotna laktoza RNA polimeraza laci P i P O lacz lacy laca mrna mrna inhibitor Z Y A laktoza

19 Lac operator v primeru, ko sta v mediju prisotna glukoza in laktoza cap camp Cap RNA polimeraza počasen prepis brez camp-cap laci P i P O lacz lacy laca mrna mrna Cap inhibitor Z Y A glukoza camp camp Ko je v mediju prisotna glukoza je vedno tudi izrabljena. Ostali sistemi za izrabo sladkorjev morajo biti inducirani. Ko je v mediju veliko glukoze, je konc. camp nizka. Če se konc. glukoze zmanjša se poveča konc. camp, kar omgoča vezavo camp na CAP protein, le ta pa stimulira vezavo RNA polimeraze na DNA in bistveno večji prepis genov za metabolizem laktoze.

20 Dvokomponentni regulacijski sistemi ligand senzor vezava liganda P His avtofosforilacija senzorja RNA polimeraza Asp P promotor operator gen Asp P odzivni regulator Asp P His prenos fosfata iz histidina senzorja na aspartat odzivnega regulatorja

21 Nekateri dvokomponentni regulacijski sistemi v mikrobnih celicah sistem okoljski signal senzorska kinaza odzivni regulator Arc O 2 ArcB ArcA Nar NO 3-, NO - 2 NarX, NarQ NarL Ntr NH + 4 NrII NrI Pho regulon P i PhoR PhoB porinski reg. ozmotski pritisk EnvZ OmpR Evg nizka temp. EvgS EvgA Tox ph, temp., ozmoza ToxS ToxR Bvg temp., nikotinskak. BvgS BvgA

22 Quorum zaznava gostote bakterij Quorum zaznava je vrsta globalne kontrole mikroorganizmov, kjer je okoljski signal gostota bakterijske kulture. Bakterija ima encim za sintezo feromona (npr. aciliranega homoserin laktona). Feromon difundira iz celice. Njegova koncentracija postane znatna šele pri zelo gosti kulturi. celica proizvaja feromon celice začnejo agregirati celični agregat

23 Kako se bakterije pogovarjajo? Veliko signala pomeni veliko celic v okolici, čas za spremembo obnašanja! produkcija ekstracelularnih signalnih molekul - feromonov detekcija povišane celične koncentracije preko membranskih in citoplazmatskih receptorjev sprememba transkripcijskega vzorca in sprememba obnašanja

24 Kemijska narava signalnih molekul - feromonov G - bakterije G + bakterije homoserin laktoni peptidi O H N H O O 3-oxo-C6-HSL iz Vibrio fischeri H-Tyr-Ile-Asn- NH O S O O NH Asp Phe Leu Me Me Ciklični peptid iz S. aureus Druge signalne molekule: γ-butirolaktoni, quinoloni, furanoni

25 biofilm bioluminescenca sporulacija ekstracelularni encimi Kateri procesi so regulirani s quorum zaznavo? plodno telesce virulenca antibiotiki bakteriocini transfer genetskega materiala

26 Globalna kontrola sinteze proteinov Organizirani sočasni kontroli več različnih genov v organizmu pravimo globalna ali integralna kontrola. sistem signal število reguliranih genov katabolna represija ciklični AMP >300 aerobna respiracija prisotnost O 2 >50 anaerobna respiracija odsotnost O 2 70 toplotni šok temperatura 36 asimilacija dušika pomankanje NH + 4 >12 oksidativni stres oksidanti >30 SOS odgovor poškodovana DNA >20

27 Globalana kontrola signal citoplazmatska membrana signalni intermediat primarni nivo regulacija genov ekspresija induciranih genov sekundarni nivo regulacije genov

28 Mikrobna genetika mutacije homologna genska rekombinacija: transformacija transdukcija konjugacija nehomologna genska rekombinacija primerjalana genomika

29 Mutacije in mutanti Mutacija je dedna sprememba, ki se prenaša iz generacije v generacijo. Mutant je organizem, ki nosi dedno spremembo. Gene pišemo z malo črko, npr. hisc, reca. Proteine, ki nastanejo iz gena pišemo z veliko črko, npr. HisC, RecA Fenotip mutante označujemo z oznako + ali - npr. His + (organizem lahko naredi histidin) ali pa His - (organizem ne more narediti histidina).

30 Vrste mutacij Tihe mutacije: spremenjena je tretja baza kodona (ohrani se isto aminokislina) Nesmiselne mutacije: formiranje stop kodona, nekompleten protein Zamenjava aminokisline: spremenjena prva baza kodona Pogojno letalne mutante: npr. rast pri 30 o C, odsotnost rasti pri 40 o C Sprememba bralnega okvirja: popolnoma spremenjene aminokisline Revartante: povratna mutacija, ki povzroči nastanek divjega seva

31 Vrste mutacij Supresorske mutacije: vrne fenotip divjega seva (sprememba je lahko v istem genu, vendar ne na istem mestu kot revartanta, lahko je v drugem genu, ki komplementira mutiran gen, kar vrne fenotip) Delecije: izguba večjega števila nukleotidov Insercije: vgradnja večjega števila nukleotidov Translokacije: premikanje večjega dela DNA med različnimi lokacijami na kromosomu Inverzije: zamenjana orientacija DNA segmenta

32 Spontana frekvenca mutacij DNA DNA RNA protein ~ /bp ~10-5 /bp ~ 10-4 /bp Biološka ura: 10-9 mutacij/bp/leto spontana frekvenca mutacij v populaciji celic je ~ 10-6 na generacijo spontana frekvenca transpozicij je ~ 10-4 na generacijo spontana frekvenca mutacij RNA virusov je ~ 10-3 na generacijo mutatorski geni povečajo stopnjo mutacij za ~ x

33 Inducirana naključna mutageneza sredstvo učinkovanje sprememba analogi baz spremenjeno parjenje A : T T analog : G G : C HNO 2 deaminacija A in C A : T G : C NH 2 OH reakcija s C G : C A : T etilmetansulfonat dodajanje CH 3 na G G : C A : T etidijev bromid interkalacija mikroinsercije, mikrodelecije mitomicin povezava DNA vijačnic delecije UV pirimidinski dimeri delecije X-žarki prosti radikali delecije

34 Točkasta mutageneza Omogočajo zamenjavo ene same aminokisline v proteinu tako, da na mutiranem mestu v genu dodamo oligonukleotidni začetnik z nepopolnim parjenjenjem nukleotidov. Uporabljamo v biotehnologiji za pridobivanje željenih mutiranih proteinov.

35 Kasetna mutageneza Željeni del DNA lahko nadomestimo z mutiranim. Z vgradnjo genske kasete v izbrani gen na plazmidu po homologni rekombinaciji s kromosomalnim genom onsposobimo gen, obenem pa lahko vnesemo željene gene in molekularne markerje.

36 Horizontalni prenos genov Za razliko od prenosa genov iz generacije v generacijo (vertikalni prenos genov) pri horizontalnem prenosu prehaja do izmenjave (rekombinacije) genov znotraj iste generacije. Ločimo: homologno gensko rekombinacijo nehomologno gensko rekombinacijo

37 Homologna genska rekombinacija prokariontov Pri prokariontih so homologni fragmenti DNA lahko transportirani med celicami in s homologno rekombinacijo integrirani v gostiteljevo DNA. Trije najpomembnejši procesi homologne rekombinacije so: transformacija (prenos proste DNA) transdukcija (prenos DNA z virusi) konjugacija (prenos plazmidne DNA med celicami)

38 Homologna genska rekombinacija

39 Homologna genska rekombinacija

40 Rec A in SOS odgovor na DNA poškodbo

41 Genska transformacija

42 Transformacija - vnos tuje DNA NucA Nuclease? EA EC FA ATP ADP

43 Načini vnosa tuje DNA Frekvenco vnosa povečamo s Ca 2+ ioni in nizko temperaturo. DNA lahko vnesemo z elektroporacijo. Pri evkariontih DNA transformiramo z virusi, endocitozo, elektroporacijo in balističnimi izstrelki obloženimi z DNA.

44 Litični in lizogeni cikel bakteriofagov

45 Indukcija temperiranega faga

46 Specializirana transdukcija

47 Fagna konverzija bakterija fag protein ali fenotip Escherichia coli φfc3208, λ enterohemolizin, rezistenca na serum Shigella flexneri sf6, sfii O-antigen acetilaza, glukozil-transferaza Salmonella enterica Gifsy-2, superoksid dismutaza, neuraminadaza Vibrio cholerae CTXφ, VPIφ kolera toksin, TCP pilini Pseudomonas aeruginosa φctx citotoksin Clostridium botulinum C1 neurotoksin Staphylococcus aureus NA, TSST-1 enterotoksin, šok sindrom C. diphtheriae β-fag diftereja toksin

48 Plazmidi plazmid je izven kromosomska DNA podvojuje se neodvisno od kromosomske DNA. nima proteinskega plašča plazmidi imajo dvojnovijačno DNA, večinoma krožno vsebujejo od 1 do 100 kb, so supernaviti encime za replikacijo plazmid večinsko dobi od gostitelja. Število kopij varira od 1 do 100 na celico. plazmidi, ki so transportirani v celico morajo biti kompatibilni z že obstoječimi plazmidi v celici, sicer so izločeni. plazmide, ki se lahko vgradijo v kromosom, imenujemo episome

49 Vrste plazmidov rezistenčni (R) plazmidi: kodirajo zapis za odpornost na antibiotike, težke kovine, bakteriocine plazmidi s fiziološkimi funkcijami: npr. razgradnja oktanov, herbicidov, nastanek acetona, butanola, nodulacija, izraba laktoze in saharoze, produkcija pigmentov virulenčni plazmidi: imajo zapis za invazivnost: npr. koagulaze, hemolizin, eneterotoksin, K-antigen, tvorba tumorjev

50 R 100 (rezistenčni plazmid) Kodira zapis za rezistenco na: - živo srebro (mer) - sulfonamide (sul) - tetracikline (tet) -streptomicin(str) - kloramfenikol (clm)

51 F-plazmid gen tra orit oris inc rep funkcija transfer začetek za transfer začetek replikacije inkompatibilnost replikacija IS3, IS2, Tn/1000 (transpozoni) potencialna mesta vgradnje v gostiteljski kromosom

52 Konjugacija Informacija za konjugacijo je kodirana na plazmidu. Za konjugacijo so potrebni pili, ki skrbijo za vezavo donorske in recipientske celice, in jih imajo samo donorski sevi. Ko sta celici stabilizirani pride do fuzije obeh membran in do prehoda DNA.

53 Prenos DNA pri konjugaciji Za prenos DNA je potrebna sinteza DNA tako v donorju kot v akceptorju. Po končanem procesu ima vsaka celica eno kopijo plazmida. Akceptorska celica po ekspresiji plazmidnih genov lahko postane donorska.

54 Mobilizacija kromosoma Po integraciji F plazmida v kromosom postane tak sev Hfr ali sev z visoko sposobnostjo rekombinacije. Pri konjugaciji Hfr seva, poleg plazmida, potuje v recipientsko celico tudi del kromosoma, v katerega je vgrajen F plazmid.

55 Plazmidi in virulenčni faktorji Veliko virulenčnih faktorjev (npr. toksinov, bakteriocinov), ki omogočajo bakteriji vezavo in kolonizacijo gostitelja je kodiranih na plazmidih. Virulenčne faktorje poleg plazmidov najdemo tudi na mobilnih genskih elementih (npr. transpozoni in bakteriofagi) ter na kromosomih.

56 Transpozicija - nehomologna rekombinacija Transpozicija omogoča premikanje genov po kromosomu. Pojavlja se s frekvenco 10-5 do 10-7 na generacijo. Po kromosomu se lahko premikajo le tisti geni, ki imajo transpozabilne elemente. Ločimo: konzervativno transpozicijo (transpozon se izreže in vstavi na novo mesto) replikativno transpozicijo (transpozon se podvoji, parentalni ostane na istem mestu, hčerinski se vgradi na novo lokacijo na kromosomu).

57 Konzervativna transpozicija

58 Replikativna transpozicija

59 Mutageneza s transpozoni Če se transpozon naključno vgradi v gen ga deaktivira. Za izolacijo mutant uporabljamo transpozonske gene, ki kodirajo zapis za rezistenco na antibiotike (vgradnja pomeni rezistenco na antibiotik). Najbolj običajno uporabljamo Tn10, ki ima marker za tetraciklinsko rezistenco ali Tn5 z rezistenco na kanamicin in neomicin. gen A gen B gen C gen D IS IS transpozon

60 Integroni Nekateri transpozoni vsebujejo poleg genov za rezistenco na antibiotike še druge gene (genske kasete). Na genskih kasetah je lahko veliko genov za rezistenco na antibiotike. Najbolj poznan je Tn7 integron. inti1 P atti aadb sull inti1 P atti sull aadb integraza promotor mesto vgradnje rezist. na sulfonamide genska kaseta/rezistenca na aminoglikozilirane antibiotike

61 Kaj vemo o genomu E.coli kromosom ima bp kromosom ima bralnih okvirjev (88 % genoma), za okrog 35 % genskih produktov še vedno ne poznamo fiziološke funkcije 1 % genoma predstavljajo geni za trna 0.5 % genoma so visoko ponavljajoče se sekvence, ki ne kodirajo proteinov 10 % genoma predstavljajo regulatorne sekvence (promotorji, operatorji, začetek podvojevanja, konci podvojevanja DNA) geni so bodisi organizirani v klastre-operone (npr. hisg, hisd, hisc, hisb, hish, hisa, hisf, hisi, hise), ali pa razmetani po kromosomu (npr. arg geni) okrog 70 % genov je monocistronskih, 6 % je policistronskih

62 Kaj vemo o genomu E.coli na obeh vijačnicah je približno enako število operonov na kromosomu je 10 insercijskih elementov IS na kromosomu je do 30 % fagnih sekvenc na genomu obstaja več patogenih otokov približno 20 % celotnega genoma je E.coli pridobila s horizontalnim genskim prenosom

63 Primerjava genov pri različnih mikroorganizmih

64 Transportni sistemi Mycoplasma pneumoniae

65 Transportni sistemi Haemophilus influenzae

66 Genomika Genomika je disciplina, ki se ukvarja z mapiranjem, sekvenciranjem in analizo genoma. S primerjavo znanih sekvenc lahko določimo potrebne in zadostne pogoje za opravljanje določenega procesa. Določimo oziroma sklepamo lahko na: konzervativne in variabilne regije v genomu urejenost in grupiranje genov metabolne poti regulatorne mehanizme ortologne proteinskih družin (obstja okrog 100 ortolognih proteinskih družin, med katerimi je možen horizontalen genski prenos)

67

68 Postopki pri delu z DNA čipom populacijo celic običajno podvržemo okoljskemu faktorju in počakamo da sistem pride v stacionarno stanje ekstrahiramo mrna in jo reverzno prepišemo (mrna je hitro razgrajena, zato je potreben reverzen prepis, žal ta ni kvantitativen) fluorescentno označimo cdna (ker je vezava fluorofora odvisna od dolžine in sestave DNA ni možno kvantitativno določanje koncentracije) hibridizacija cdna na DNA čip (DNA čip je lahko narejen poljubno in vsebuje ORF ali poznane gene) posnamemo vzorec (vzbujamo z laserjem, detektiramo s CCD kamero) interpretacija dobljenega vzorca (težavna, ker hibridizacija ni kvantitativna)

69 Uporaba DNA čipov proučevanje fiziologije organizmov proučevanje ekologije organizmov odkrivanje genov diagnoza bolezni odkrivanje novih zdravil toksikološke raziskave

70 Molekularno kloniranje molekularna orodja vektorji izolacija ustreznega klona uporaba kloniranja

71 Genski inženiring Genski inženiring so postopki izolacije, manipulacije in ekspresije genetskega materiala s katerim proučujemo mehanizme genske replikacije, ekspresije in jih uporabljamo za produkcijo različnih koristnih produktov. Aplikativni uporabi genskega inženiringa pravimo tudi biotehnologija.

72 Molekularno kloniranje 1. Izbira ustreznega DNA fragmenta. DNA je lahko genomska, fragmentirana z restrikcijskimi encimi, DNA sintetizirana iz RNA, sintetiziranan s PCR ali sintetična DNA. 2. spajanje izbranega DNA fragmentov v vektor za kloniranje 3. prenos vektorja za kloniranje v izbrane gostitelje, pomnoževanje vektorja za kloniranje, ustvarjanje genske knjižnice 4. izolacija in čiščenje ustreznega klona 5. pomnoževanje izbranega klona

73 Iskanje ustreznega gena za kloniranje Gen, ki ga želimo klonirati je potrebno dobiti v relativno visokem številu (> 10 6 ), saj je vgradnja gena v vektor stohastični proces. Željeni gen za kloniranje lahko v ustrezni koncentraciji dobimo s: PCR pomnoževanjem izbranega gena iz poznane mrna sekvence z reverzno transkripcijo in PCR pomnoževanjem iz poznane proteinske sekvence s kemijsko sintezo DNA

74 Molekularna orodja - molekularne škarje Restrikcijski encimi so visokospecifične endonukleaze, ki režejo na izbranih mestih v DNA sekvenci. Za rezanje z restrikcijskimi encimi potrebujemo os simetrije okrog katere režejo restrikcijski encimi. Odrezani konci so lahko lepljivi ali pa topi. EcoRI PstI SmaI

75 Molekularna orodja - molekularno DNA lepilo DNA konce, ki jih dobimo z restrikcijskimi encimi je potrebno med seboj zlepiti ali ligirati. Zato uporabljamo encim DNA ligazo. DNA ligaza zlepi 5 fosfatni konec z 3 hidroksilnim koncem sosednjih nukleotidov.

76 Ustvarjanje rekombinantnih DNA molekul restrikcijsko mesto G A A T T C C T T A A G restrikcijsko mesto G A A T T C C T T A A G G A A T T C C T T A A lepljivi konec G G C T T A A A A T T C G A A T T C G donorska DNA G C T T A A G A A T T C C T T A A gostiteljeva DNA G donorska DNA G A A T T C C T T A A G gostiteljeva DNA

77 Ostala molekularna orodja fosfataze kinaze ssdna nukleaze DNA polimeraze RNA nukleaze RNA ligaze reverzne transkriptaze

78 Vektorji za molekularno kloniranje plazmidi bakteriofagi (M13, lambda) kozmidi (plazmidni vektorji s kohezivnimi konci iz bakteriofaga lambda) evkariontski virusi (adenovirusi, SV40, vakcinia, retrovirusi, bakulovirusi) sintetični kromosomi (HAC, YAC, BAC)

79 Specifični vektorji za molekularno kloniranje fuzijski vektorji (fuzija želejenega gena z drugim genom) ekspresijski vektorji (velika ekspresija kloniranega gena) sekrecijski vektorji (izboljšano izločanje proteinov) taksi ( shuttle ) vektorji (prenos DNA med nesorodnimi organizmi)

80 Plazmidi kot vektorji so majhni enostavna manipulacija DNA je krožna in zelo stabilna imajo neodvisno replikacijo od gostiteljevega krmosoma v celici so lahko v več kopijah prisotnost selekcijskih markerjev olajša detekcijo in selekcijo

81 Prototip plazmida za kloniranje - pbr322 je majhen, 4361 bp običajno kopij v gostitelju lahko dosežemo kopij enostavna izolacija zaradi supernavitja DNA inserti so lahko veliki do 10kb znana je njegova DNA sekvenca ima več mest za enkratno cepljenje s PstI, SalI, EcoRI, HindII, BamHI ima gen za rezistenco na ampicilin in tetraciklin, s transformacijo gre enostavno v gostitelja

82 Kloniranje s pbr322 Amp R Tc R BamHI restrikcija tuja DNA BamHI restrikcija DNA ligaze transformanta rezistentna na tetraciklin in ampicilin transformanta občutljiva na tetraciklin, rezistentna na ampicilin

83 Bakteriofag lambda kot vektor za kloniranje neesencialni del Za kloniranje ima divji sev lambde preveč restrikcijskih mest. V rekombinantnem fagu (npr. Charon 4A) donorska DNA pakiranje DNA je število restrikcijskih mest manjše. Lahko kloniramo večje fragmente kot pri plazmidih. Uspešnost transdukcije je večja kot uspešnost transformacije. infektivni fag

84 Bakteriofag M13 kot vektor za kloniranje EcoRI KpnI Smai BamHI Xbal SalI PstI...G A A T T C G A G C T C G G T A C C C G G G G A T C C T C T A G A G T C G A C C T G C A G... polilinkerska sekvenca lacz Bakteriofag M13 ima polilinkersko sekvenco (večje število enkratnih restrikcijskih mest. Polilinkerska sekvenca ne spremeni bralnega okvirja za prepis lacz gena. Če pride do vgradnje DNA segmenta se bralni okvir poruši in s tem sinteza LacZ.

85 Fuzijski vektor Spojimo, fuziramo dva gena, zaradi lažje izolacija ali detekcije izbranega genskega produkta. kontrolira Ptac promotor, ob dodatku glukoze pride do indukcije male uporaben za izolacijo fuzija inaktivira lacz mesto za začetek podvojevanja vektorja amp rezistenca na antibiotik

86 Sintetični kvasni kromosom (YAC) kot vektor za kloniranje TEL ARS CEN Not I Not I URA3 klonirana DNA TEL Kvasni kromosom, ki ga uporabljamo za kloniranje mora vsebovati: -mesto za začetek replikacije (ARS) - telomerazo (TEL) - centromero (CEN) - mesto za kloniranje (Not I) - selekcijski marker (npr. gen za uracil URA3) V YAC kromosom lahko kloniramo relativno velike segmente DNA od 250 do 1000 kb.

87 Velikost klonirane DNA pri različnih vektorjih vektor velikost (kb) plazmid < 15 bakteriofag < 90 sintetični bakterijski kromosom sintetični kvasni kromosom

88 Selekcija rekombiniranih celic Pri rekombinaciji tuje DNA dobimo tri vrste celic: celice, ki nimajo vgrajenega vektorja (npr. celice so občutljive za antibiotik) celice ki imajo vgrajen vektor, vendar nimajo želejene DNA (npr. celice rezistentne na antibiotik, brez nove fenotipske lastnosti) celice, ki imajo vgrajen vektor in željeno DNA (npr. celice rezistentne na antibiotik, imajo novo fenotipsko lastnost)

89 Selekcija ustreznega klona Željeno transformanto dobimo bodisi preko spremenjenega fenotipa ali spremenjenega genotipa: iskanje, ko je gen ekspresiran: uporabimo gostitelja, ki je mutiran za klonirani gen, kar omogoča rast samo transformantam. Alternativno uporabljamo protitelo za izbrani protein. iskanje, ko gen ni ekspresiran: uporabimo označene DNA ali RNA probe za željeni gen in naredimo hibridizacijo s klonirano DNA

90 Praktična uporaba genskega inženirstva - biotehnologija metabolni inženiring rekombinantne vakcine produkcija proteinov sesalcev transgene živali in rastline okoljska biotehnologija genska regulacija in genska terapija

91 Metabolni inženiring inkorporacija genov za večji razpon substratov na katerih organizem raste genetska sprememba metabolnih poti več produktov manj biomase

92 Proizvodnja rekombinantnih humanih proteinov protein inzulin α-1-antitripsin epidermijski rastni faktor humani rastni hormon eritropoetin faktor IX interlevkini a, b, g interlevkini urogastron funkcija uravnavanje krvnega sladkorja proteazni inhibitor rast epitelijskih celic rast celic stimulira rast krvnih celic strjevanje krvi protivirusna terapija stimulacija imunskega sistema kontrola gastrointestinalne sekrecije

93 Rekombinantne vakcine produkcija antigenov (npr. hepatitis B) uporaba spremenjenih virusov (npr. vakcinija virus za črne koze, steklino) uporaba gensko spremenjenih bakterij (npr. Salmonella typhi) produkcija antigenskih epitopov (npr. M13)

94 Uporaba rekombinantne tehnologije v kmetijstvu toleranca na herbicide rezistenca na škodljivce (Baciullus thurigiensis) kontrola patogenih gliv (Pseudomonas fluorescens) rezistenca na viruse utišanje genov gostitelja fiksacija dušika

95 Gensko spremenjena hrana

96 Nekatere od potencialnih koristi GMO povečana hranilna vrednost in obstojnost hrane povečana odpornost na škodljivce eliminacija alergenov produkcija farmacevtskih učinkovin bioremediacija toksinov in eksploziv produkcija biorazgradljive plastike zmanjševanje produkcije polutantov

97 Nekatere od potencialnih nevarnosti GMO neželjen prenos toksičnih genov med vrstami nepričakovani rezultati rekombinacije zmanjševanje biološke pestrosti navzkrižna kontaminacija med GMO in ne-gmo nezmožnost dolgoročne napovedi vpliva GMO na okolje

98 Sproščanje GMO v okolje Predno spustimo GMO v okolje moramo odgovoriti na naslednja vprašanja: ali lahko GMO preživi izven laboratorija ali se lahko razmnožuje z nemodificiranimi predstavniki iste vrste ali ima GMO selekcijsko prednost pred ostalimi organizmi v okolju ali lahko prihaja do horizontalnega prenosa genov ali se GMO lahko premika v okolju