Doc. dr Snežana Marković

Transcript

1 REPARACIJA DNK. REKOMBINACIJA DNK. Doc. dr Snežana Marković Institut za biologiju i ekologiju Prirodno-matematički fakultet Univerzitet u Kragujevcu

2 REPARACIJA OŠTEĆENIH MOLEKULA DNK Mutacija svaka promena u molekulu DNK koja zaostane posle replikacije i prenese se na narednu generaciju ćelija; somatske i germinativne. Mutacije: supstitucije, delecije, insercije, dinamičke mutacije (nestabilnost broja ponovljenih sekvenci). Efekti su ćutljivi, korisni ili štetni. Enzimi reparacije. Struktura DNK bitna za reparaciju. Tabela 5-2. Nasledni sindromi sa oštećenjem u DNK reper sistemu Naziv Fenotip Enzim ili proces koji je oštećen MSH2, 3, 6, MLH1, kancer debelog creva mismatch reper PMS2 Kseroderma kancer kože, ćelijska osetljivost na UV, reper isecanjem nukleotida pigmentosum (KP) grupe A-G neurološki poremećaji KP varijanta ćelijska osetljivost na UV translezije sinteze pomoću DNK polimeraze σ Ataksijatelangiektazija leukemija, limfomi, ćelijska osetljivost na γ-zračenje, nestabilnost genoma ATM protein, protein kinaza aktivirana dvolančanim prekidima BRCA-2 kancer dojki i materice reper pomoću homologe rekombinacije Werner sindrom prevremeno starenje, kancer na nekoliko mesta, nestabilnost genoma pomoć (accessory) 3'-egzonukleaze i DNK helikaze Bloom sindrom kancer na nekoliko mesta, zakržljao rast, nestabilnost genoma pomoć (accessory) DNK helikaze u replikaciji Fanconi anemija kongenitalne abnormalnosti, leukemija, Reper interlančanih ukrštanja grupe A-G nestabilnost genoma 46 BR pacijent hiperosetljivost na DNK-oštećujuće agense, nestabilnost genoma DNK ligaza I

3 Spontane promene nukleotida koje zahtevaju DNK reparaciju oksidaciona oštećenja (crvene strelice) hidrolitički napadi (plave strelice) metilacije pomoću metil grupe S-adenosilmetionina kao donora (zelene strelice). Depurinacije i deaminacije nukleotida Depurinacijom se može osloboditi guanin i adenin iz DNK. Deaminacija prevodi citozin u uracil, ali se deaminacije takođe javljaju i na drugim bazama.

4 1. REPARACIJA NESPARENIH NUKLEOTIDA (mismatch repair) Pogrešno ugrađen nukleotid na pravilnih Sistem za zamenu pogrešno sparenih (nesparenih) nukleotida mismatch repair ( puta povećana tačnost) Razlikovanje roditeljskog od novosintetisanog lanca Kod E. coli sistem od 9 proteina Dam metilaza metilacija A u okviru 5 -GATC- 3 MutS prepoznaje neispravne bazne parove, vezuje ih MutH specifična endonukleaza vezuje se za 5 - GATC-3 MutL povezuje MutS i MutH prekid lanca Egzonukleaza I seče u 3 5 smeru, uzvodno; helikaze, SSB proteini, DNK pol. III i DNK ligaza popunjavaju praznine. Nizvodna greška - egzonukleaza VII (u oba smera) ili protein RecJ (5 3 ). Popravka G-T parova; neefikasno za C-C parove.

5

6 2. REPARACIJA ISECANJEM BAZA (eksciziona reparacija) Spontana dezaminacija (C U, A hipoksantin) Metilacija (sa S-adenozilmetionima na A 3-metiladenin, na G 7-metilguanin) Jonizujuće zračenje pogrešno sparivanje baza Enzimi DNK glikozidaze prepoznaju deaminovane, alkilovane i dr. modifikovane baze u DNK i isecaju ih hidrolizom N-glikozidne veze ostaju AP mesta (apurinic, apyrimidinic) Uracil glikozidaza (prepoznaje U samo u DNK) Hipoksantin glikozidaza AP endonukleaze egzonukleaze DNK pol. I DNK ligaza

7 3. REPARACIJA ISECANJEM NUKLEOTIDA Oštećenja koja dovode do distorzije dvolančane zavojnice UV zračenje dimeri timina i timin-citozina Kod E. coli enzim ABC endonukleaza eksciziona endonukleaza (trimer, produkti gena uvra, uvrb, uvrc) katalizuje hidrolizu dve fosfodiestarske veze DNK polimeraza I i DNK ligaza.

8

9 4. DIREKTNA REPARACIJA Direktno, bez uklanjanja baza Direktna reparacija interlančanih ciklobutanskih pirimidinskih dimera direktna fotoreaktivacija pomoću enzima DNK fotoliaze DNK fotoliaze od dva kofaktora, hromofora (aktiviraju se svetlošću): (1) FADH 2 i (2) 5,10- meteniltetrahidrofolat ili 5- deazoflavin Enzim O 6 -metilguanin- DNK metiltransferaza katalizuje prenos alkil grupe sa O 6 -alkilguanina na sopstveni Cys

10 5. POSTREPLIKATIVNA (rekombinativna) REPARACIJA reparacija dvolančanih prekida DNK pol. III nailazi na oštećene nukleotide nastavlja polimerizaciju iza njih Kao rezultat replikacije nastaje jedan neoštećeni dvolančani molekul DNK i drugi koji naspram oštećenja u lancu ima prazninu Praznina se popunjava nakon replikacije procesom rekombinacije genetičkog materijala Kod E. coli uz učešće RecA nukleaze. NEHOMOLOGNO SPAJANJE KRAJEVA

11 6. SOS ODGOVOR transleziona reparaciona sinteza Velike lezije DNK zaustavlja se replikacija ubrzana produkcija SOS proteina (UvrA, UvrB, DNK pol. II, IV, V, UmuC, UmuD, RecA, LexA) replikacija se odvija veliki broj mutacija u novosintetisanim lancima DNK letalni ishod ili preživljavanje LexA je represor za SOS gene oštećenja DNK RecA se vezuje za jednolančane DNK lance autoproteoliza LexA transkripcija SOS gena reparacija DNK oštećenja LexA represor za SOS gene

12 GENETIČKA REKOMBINACIJA GR proces u kome dolazi do rearanžiranja genetičke informacije između dva ili unutar jednog molekula DNK Homologna (opšta) i mesto-specifi specifična rekombinacija HOMOLOGNA REKOMBINACIJA g. Robin Holidej Homologna rekombinacija fizička razmena homolognih sekvenci između dva molekula DNK Homologne sekvence identične ili skoro identične sekvence u molekulima DNK Aleli različite varijante homolognih sekvenci Razmena genetičkog materijala doprinosi raznovrsnosti i evoluciji organizama Homologna rekombinacija prokariota kao osnovni mehanizam za reparaciju dvolančanih prekida Mejotička rekombinacija eukariota - Crossing over razmena homolognih segmenata DNK između nesestrinskih hromatida u kasnoj profazi I mejoze.

13 Dva homologna hromozoma ulaze u proces razmene genetskog materijala; prekid u dvostrukim zavojnicama i povezivanje sa krajevima suprotnog hromozoma. Mesto izmene bilo gde u okviru homolognih hromozoma. Na mestu izmene formira se heterodupleks (hiljade bp.) Nukleotidne sekvence se ne menjaju na mestu razmene genetičkog materijala

14 Reparacioni model homologne rekombinacije iniciran dvolančanim prekidom 1. dvolančani prekid u jednom molekulu DNK poravnjanje dva homologna molekula DNK 2. u dvolančanom prekidu se stvaraju jednolančani krajevi invazivni lanci 3. jedan invazivni lanac se sparuje sa homologom sekvencom dvolančane DNK invazija i razmena lanaca; jednolančani prekid u intaktnoj DNK 4. Reparaciona sinteza invazivnih lanaca DNK matrice su intaktni lanci ; D petlja 5. Holidejeva veza mesto ukrštenih DNK lanaca; Holidejeva struktura - rekombinacioni intermedijer

15 6. migracija grana kretanje Holidejeve veze duž rekombinacionog (Holidejevog ) intermedijera; istovremeno raskidanje baznih parova u originalnim DNK i formiranje identičnih, ili skoro identičnih bp u H. intermedijeru; heterodupleks - deo u kojem su spareni lanci različitih originalnih DNK

16 7. razrešenje Holidejeve strukture nastaju dva produkta sa krosingoverom (dva DNK molekula sa delom originalnih i delom rekombinovanih lanaca); uvode se dva jednolančana prekida u Holidejevoj vezi na mestu ukrštanja dva molekula DNK; izomerizacija H. Intermedijera (A) Inicijelno formirana struktura sadrži dva ukrštena (unutar) lanca i dva neukrštena (spolja) lanca. (B) Izomerizacijom Holidejevog čvora nastaje otvorena, simetrična struktura. (C) Dalja izomerizacija može interkonvertovati ukrštene i neukrštene lance, rezultujući strukturom koja je ista kao ona prikazana pod (A). Razrešavanjem H. intermedijera nastaju hromozomi sa razmenjenim genetičkim materijalom, ili se može završiti razmena bez crosingovera.

17 Enzimi rekombinacije (E. coli) RecBCD put: RecBCD (produkt SOS gena recb, recc, recd) iniciran dvolančanim prekidom, mestimično odvija dvolančanu zavojnicu i stvara jednolančane invazivne krajeve; nukleazna i helikazna aktivnost; χ mesto mesto krosovera RecA se vezuje za invazivni lanac, nastaje filament (5-3 DNK-RecA polimer) koji vrši pretraživanje komplementarne sekvence u homolognoj DNK, razmena lanaca, formiranje H. intermedijera trostruki ili četvorostruki intermedijer Proteini RuvA i RuvB prepoznavanje H. struktura i regulišu migraciju grana Protein RuvC resolvaza (nukleaza) za razrešenje H. veza Topoizomeraze, SSB proteini, DNK pol. I i III, DNK ligaza Rad51 humani analog RecA proteina

18 Enzimski-katalizovana migracija dvostruke grane u Holidejevom intermedijeru. U E. coli, tetramer RuvA proteina (zeleno) i dva heksamera RuvB proteina (plavosivo) se vezuju za otvorenu formu intermedijera. RuvB protein koristi energiju ATP hidrolize da bi brzo pomerio tačku ukrštanja zajedno sa sparenim DNK zavojnicama, izdužujući region heterodupleksa kao što je pokazano. Postoje dokazi da slični proteini imaju ovakvu funkciju u vertebratima

19 2. MESTO-SPECIFIČNE REKOMBINACIJE Određeni regioni hromozoma sa specifičnim redosledom nukleotida Rezultat je promena redosleda gena i dodavanje novih informacija u genomu Mobilni genetski elementi (od nekoliko stotina do desetine hiljada bp.) Virusi Veliki deo ponavljajućih sekvenci genoma (više od 45% ukupnog genoma) Biološki ciljevi različiti kod različitih vrsta; evolucione promene Mobilni elementi kodiraju enzime za sopstveno kretanje i sadrže specijalna mesta na kojima ovi enzimi deluju. Mnogi elementi nose druge gene (virusi kodiraju zaštitne proteine koji im omogućavaju da egzistiraju van ćelije, kao i esencijalne virusne enzime; geni za otpornost na antibiotike). Mesto-specifična rekombinacija (1) Transpoziciona mesto-specifična rekombinacija - prekid krajeva mobilnih DNK segmenata ugrađenih u hromozome i prilepljivanje ovih krajeva na jednom od mnogih različitih nehomologih DNK mesta. (2) Konzervativna mesto-specifična rekombinacija - stvaranje veoma kratkih heterodupleks sparivanja, kratka DNK sekvenca koja je ista u donorskom i akceptorskom DNK molekulu.

20 Transpozoni mobilni genetički elementi Transpozicija premeštanje DNK sekvenci na novu poziciju u genomu. U bakterija: prosti transpozoni (nukleotidni niz + informacija za transpozazu) složeni transpozoni ( ǁ + dodatni geni) Kratki ponovci na krajevima DNK transpozona; akceptorsko mesto; transpozaza, DNK polimeraza Retrotranspozoni (RNK transpozoni): transkripcija, reverzna transkripcija, rekombinacija

21 Tabela 5-3. Glavne klase transpozona Odlike klase i Geni u kompletnim struktura elementima DNK-transpozoni kodiraju transpozazu kratki invertovani ponovci na svakom kraju Retrovirusu-slični kodiraju reversnu retotranspozoni transkriptazu i liče na direktno ponavljajući retroviruse dugi terminalni ponovci (LTRs) na krajevima Neretrovirusni kodiraju reversnu retrotranspozoni transkriptazu Poli A na 3' kraju RNK transkripta; 5' kraj je obično tup Način kretanja kreću se kao DNK, bilo da se isecaju ili prate replikativni put kreću se pomoću RNK intermedijera produkovanog pomoću promotora u LTR kreću se pomoću RNK intermedijera koji se obično produkuje pomoću susednog promotora Primeri P element (Drosophila) Ac-Ds (kukuruz) Tn3 i IS1 (E.coli) Tam3 (zevalica) Copia (Drosophila) Ty1 (kvasac) THE-1 (human) Bs1 (kukuruz) F elemenat (Drosophila) L1 (human) Cin4 (kukuruz) Ovi elementi su dugi od 1000 do nukleotidnih parova; svaka familija sadrži mnogo članova, a samo su neki pomenuti ovde. Osim transpozona, postoje virusi koji mogu da se kreću u i iz hromozoma domaćina; ovi virusi se odnose na prve dve klase transpozona.

22 DNK Transpozoni Konzervativna (cut and paste) transpozicija. DNK-transpozoni mogu biti prepoznati u hromozomima pomoću «invertovane ponavljajuće DNK sekvence» (crveno) na njihovim krajevima. Eksperimenti pokazuju da su ove sekvence, kraće i od 20 nukleotida, potrebne za kretanje DNK između njih, i to pomoću transpozaza udruženih sa ovim elementom. Seci i zalepi kretanje DNK-transpozona sa jednog hromozomskog mesta na drugo, dešava se kada transpozaza drži dve invertovane DNK sekvence zajedno, formirajući DNK petlju. Insercija u ciljni hromozom, katalizovana transpozazom, javlja se na slučajnom mestu kroz stvaranje lepljivih prekida u ciljnom hromozomu (crvene strelice). Kao rezultat, mesto insercije je obeleženo kao kratak direkni ponovak ciljne DNK sekvence. Mada je prekid u donorskom hromozomu (zeleno) ponovo zalepljen, prekid i reper proces obično menjaju DNK sekvencu, izazivajući mutacije na originalnom mestu isečenog transpozona.

23 DNK Transpozoni Replikativna (copy and paste) transpozicija. U toku replikativne transpozicije, DNK sekvenca transpozona se kopira pomoću DNK replikacije. Krajnji produkti su DNK molekuli koji su identični originalnom donoru i ciljnom DNK molekulu koji sadrži insertovani transpozon.

24 RNK Transpozoni Retrovirusi (HIV virus). Ćelijski ciklus retrovirusa. Genom retrovirusa se sastoji od RNK molekula od oko 8500 nukleotida; dva ovakva molekula se pakuju u svaku virusnu partikulu. Enzim reverzna transkriptaza najpre pravi DNK kopiju virusne RNK, a zatim drugi lanac DNK predstavlja dvolančanu kopiju RNK genoma. Integracija dvolančane DNK u hromozom domaćina je katalizovana enzimom integrazom koji kodira virusni genom. Ova integracija zahteva sintezu novih viralnih RNK molekula pomoću RNK polimeraze ćelije domaćina, enzim koji prepisuje informaciju sa DNK na RNK.

25 Reverzna transkriptaza. (A) Trodimenzionalna struktura enzima iz HIVa (humani AIDS virus) određena pomoću x-kristalografije. (B) Model pokazuje aktivnost enzima na RNK matrici. Zapaziti da polimerazni domen (žuto u B) pravi kovalentni napad na RNAse H (H za hibridni) domenu (crveno) i razgrađuje RNK lanac u RNK/DNK zavojnici. Ova aktivnost pomaže polimerazi da pretvori inicijalnu hibridnu zavojnicu u DNK dvostruku zavojnicu.

26 RNK Transpozoni (retroelementi) Retrotranspozicija premeštanje retroelemenata kroz genom RNK kopija se sintetiše procesom transkripcije Reverzna transkriptaza prevodi irnk u komplementarnu cdnk; polimeraza sintetiše drugi lanac DNK Insercija novosintetisanog segmenta DNK u neki deo genoma Dve kopije retrotranspozona RNK transpozoni kod eukariota: 1. LTR elementi na krajevima imaju duge ponovljene sekvence Endogeni retrovirusi retrovirusi integrisani u genom; mogu da proizvedu nove viruse, ili su inaktivisani; u genomu čoveka Retrotranspozoni slični endogenim virusima, zastupljeni kod beskičmenjaka, biljaka, gljiva i jednoćelijskih eukariota 2. elementi sa polia repom (retropozoni) LINE dugi rasuti nuklearni elementi, imaju gen za reverznu transkriptazu (L1 element kod čoveka) SINE kratki rasuti nuklearni elementi, nemaju gen za reverznu transkriptazu (Alu elementi primata zauzimaju 10.5% genoma)

27 Konzervativna mesto-specifična rekombinacija Integracija genoma λ faga u hromozom E. coli: bez formiranja H. intermedijera; integraza (reverzibilna endonukleaza). Insercija cirkularnog DNK molekula bakteriofaga λ u bakterijski hromozom. U ovom primeru mesto-specifične rekombinacije, λ integraza se vezuje za specifično «vezujuće mesto» DNK sekvence na svakom hromozomu, gde se prave preseci koji drže zajedno kratke homologe DNK sekvence. Integraza zatim zamenjuje partnerske lance i razlaže ih u formu heterodupleksa koji su dugi sedam baznih parova. Reakcije četvorolančanih prekida i sparivanja su neophodne, i za svaku od njih, energija prekinute fosfodiestarske veze se čuva u privremenoj kovalentnoj vezi između DNK i enzima, tako da se ponovno spajanje DNK lanaca javlja bez potrebe za ATPom ili DNK ligazom.

28 Ćelijski ciklus bakterofaga λ. Dvolančana DNK λ genoma sadrži nukleotidnih parova i kodira različitih proteina. Kada λ DNK uđe u ćeliju, spajaju se krajevi praveći kružni DNK molekul. Bakteriofag se može umnožavati u E.coli mehanizmom lize, koji uništava ćeliju, ili može ući u latentnu profagnu fazu. Oštećenje ćelije koje izaziva λ profag dešava se kada profag izađe iz hromozoma domaćina i pređe u litički rast (zelene strelice). lazak i izlazak λ DNK u hromozom domaćina se realizuje pomoću konzervativne mestospecifične rekombinacije, a katalizovano je integrazom iz λ faga.