ΕΘΝΙΚΟ ΚΑΙ ΚΑΠΟΔΙΣΤΡΙΑΚΟ ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟ ΑΘΗΝΩΝ ΙΑΤΡΙΚΗ ΣΧΟΛΗ Α ΚΑΡΔΙΟΛΟΓΙΚΗ ΚΛΙΝΙΚΗ ΚΑΙ ΟΜΩΝΥΜΟ (Α' ΚΑΡΔΙΟΛΟΓΙΚΟ ΑΙΜΟΔΥΝΑΜΙΚΟ) ΕΡΓΑΣΤΗΡΙΟ ΔΙΕΥΘΥΝΤΗΣ:

ΕΘΝΙΚΟ ΚΑΙ ΚΑΠΟΔΙΣΤΡΙΑΚΟ ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟ ΑΘΗΝΩΝ ΙΑΤΡΙΚΗ ΣΧΟΛΗ Α ΚΑΡΔΙΟΛΟΓΙΚΗ ΚΛΙΝΙΚΗ ΚΑΙ ΟΜΩΝΥΜΟ (Α' ΚΑΡΔΙΟΛΟΓΙΚΟ ΑΙΜΟΔΥΝΑΜΙΚΟ) ΕΡΓΑΣΤΗΡΙΟ ΔΙΕΥΘΥΝΤΗΣ: Καθηγητής ΔΗΜΗΤΡΙΟΣ ΤΟΥΣΟΥΛΗΣ Ο ρόλος του ινωδογόνου και των γενετικών του πολυμορφισμών στον κίνδυνο στεφανιαίας: επίδραση στη διαδικασία της πήξεως σε ασθενείς με συμπτώματα σταθερής στηθάγχης Ν. Παπαγεωργίου, Δ. Τούσουλης, Γ. Χατζής, Α. Μπριασούλης, Μ. Κοζανίτου, Α. Μήλιου, Ε. Ανδρουλάκης, Μ. Χαρακίδα, Γ. Σιάσος, Κ. Τούτουζας, Κ. Τεντολούρης, Ζ. Παλλαντζά, Χ. Στεφανάδης ΑΘΗΝΑ 2014

ΕΙΣΑΓΩΓΗ

ΣΤΕΦΑΝΙΑΙΑ ΝΟΣΟΣ: 1 η ΑΙΤΙΑ ΘΑΝΑΤΟΥ ΣΤΙΣ ΑΝΕΠΤΥΓΜΕΝΕΣ ΧΩΡΕΣ Roger et al. Circulation. 2011;123(4):e18-e209.

Ινωδογόνο και καταρράκτης πήξης Tousoulis et al. Blood Rev. 2011 Nov;25(6):239-45.

Ο ρόλος του ινωδογόνου (?)

Tousoulis et al. Blood Rev. 2011 Nov;25(6):239-45. Papageorgiou et al. Hellenic J Cardiol. 2010 Jan-Feb;51(1):1-9.

Tousoulis et al. Blood Rev. 2011 Nov;25(6):239-45. Papageorgiou et al. Hellenic J Cardiol. 2010 Jan-Feb;51(1):1-9.

ΓΕΝΕΤΙΚΟΙ ΠΟΛΥΜΟΡΦΙΣΜΟΙ ΤΟΥ ΙΝΩΔΟΓΟΝΟΥ Ο G455A πολυμορφισμός αποτελεί ισχυρό παράγοντα κινδύνου για την εμφάνιση καρδιαγγειακής νόσου. Shammaa DM et al. Mol Biol Rep. 2007 May 12; [Epub ahead of print] Ο G455A πολυμορφισμός είναι εξαιρετικά συχνός σε ασθενείς με αγγειακά εγκεφαλικά επεισόδια. Kessler C et al. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 1997 Nov;17(11):2880-4 O G58A πολυμορφισμός έχει συσχετιστεί με τον κίνδυνο εμφάνισης εμφράγματος του μυοκαρδίου. Μannila MN et al. Thromb Haemost. 2005 Mar;93(3):570-7

ΣΚΟΠΟΣ Στην παρούσα μελέτη εξετάσαμε την επίδραση των rs180070(g455a) και rs2070011(a58a) πολυμορφισμών του ινωδογόνου στη διαδικασία της πήξης και τον κίνδυνο ΣΝ σε άτομα υπό διερεύνηση για ΣΝ

ΣΧΕΔΙΑΣΜΟΣ ΤΗΣ ΜΕΛΕΤΗΣ 422 Ασθενείς με ΣΝ 699 άτομα? σταθερή στηθάγχη Εισαγωγή (στεφ/α-δοκιμασία κοπώσεως) Στατιστική ανάλυση αποτελεσμάτων 277 Υγιή άτομα Αιμοληψία (αποθήκευση-μετρήσεις)

ΚΡΙΤΗΡΙΑ ΕΙΣΑΓΩΓΗΣ Σταθερή στηθάγχη. Στεφανιαία νόσος 1 ή 2 ή 3 αγγείων (>50% στένωση). Ατομικό ιστορικό ελεύθερο οξέος στεφανιαίου συνδρόμου τους τελευταίους 2 μήνες. ΚΡΙΤΗΡΙΑ ΑΠΟΚΛΕΙΣΜΟΥ Κακοήθειες Συστηματική φλεγμονώδης νόσος ή λοίμωξη. Ηπατική ή νεφρική βλάβη. Ατομικό ιστορικό πνευμονικής εμβολής ή εν τω βάθει φλεβικής θρόμβωσης. Παθήσεις αίματος. Καρδιακή ανεπάρκεια. Ηλικία >75 ετών.

ΜΕΘΟΔΟΙ

ΓΟΝΟΤΥΠΙΚΗ ΑΝΑΛΥΣΗ G455A (PCR) Forward primer....5'-gaacattttaccttatgtgaattaagg-3... Reverse primer:...5 -GAAGCTCCAAGAAACCATCC-3... Περιοριστικό ένζυμο: HaeIII ΓΟΝΟΤΥΠΙΚΗ ΑΝΑΛΥΣΗ G58A (PCR) Forward primer:...5'-tgcaacagcttatcggaagc-3... Reverse primer:...5 -GTGGAATAAACACCAGAGAG-3... Περιοριστικό ένζυμο: AciI

G455A G58A

ΒΙΟΧΗΜΙΚΕΣ ΜΕΤΡΗΣΕΙΣ - Τα επίπεδα ινωδογόνου μετρήθηκαν με την μέθοδο Clauss. - Τα επίπεδα του διαλυτού μορίου scd40l μετρήθηκαν με την ανοσοενζυμική μέθοδο διπλού αντισώματος ELISA. - Τα επίπεδα D-dimer μετρήθηκαν με κατάλληλη τεχνική πηξεομετρίας.

ΣΤΑΤΙΣΤΙΚΗ ΑΝΑΛΥΣΗ Οι ποιοτικές μεταβλητές παρουσιάζονται σε σχετικές συχνότητες, ενώ οι συνεχείς μεταβλητές εξετάστηκαν για την ομαλή κατανομή με τη δοκιμασία Kolmogorov Smirnov. Οι μεταβλητές Όλες οι που αναλύσεις είχαν κανονική έγιναν κατανομή με τηπαρουσιάστηκαν χρήση του λογισμικού σαν μέση τιμή±τυπική SPSS απόκλιση 18.0 (SPSS (SD), ενώ Inc., οι μεταβήτές Chicago, που δεν IL). είχαν κανονική κατανομή υπεβλήθησαν σε λογαριθμική μετατροπή για την ανάλυση και παρουσιάζονται στην μη-λογαριθμική μορφή ως διάμεσες τιμές (25 75ο εκατοστημόριο). Οι γονότυποι και οι συχνότητες των αλληλίων συγκρίθηκαν μεταξύ των ομάδων με τη δοκιμασία του Χ 2 (chi-square test), Ως ενώ στατιστικά στατιστική ανάλυση σημαντικές βασιζόμενη στη θεωρήθηκαν δοκιμασία των Cochran's οι διαφορές/συσχετίσεις και Mantel Haenszel χρησιμοποιήθηκαν μεταξύ των για την εκτίμηση του λόγου των πιθανοτήτων (OR) [95% διάστημα αξιοπιστίας (CI)], για την ανάπτυξη ΣΝ σαν ομάδων με p < 0.05 αποτέλεσμα της επίδρασης των 2 πολυμορφισμών και του ινωδογόνου. Ο λόγος των πιθανοτήτων ήταν εξομοιωμένος ως προς το φύλο, ηλικία, κάπνισμα, υπερλιπιδαιμία, υπέρταση και σακχαρώδη διαβήτη. Σταδιακή πολυπαραγοντική ανάλυση πραγματοποιήθηκε με τους μετρούμενους βιοχημικούς παράγοντες ως εξαρτημένες μεταβλητές και τους παράγοντες κινδύνου, τους πολυμορφισμούς σαν ανεξάρτητες μεταβλητές. Συγκρίσεις μεταξύ των συνεχόμενων μεταβλητών πραγματοποιήθηκαν με τη χρήση του unpaired Student s t-test ή της μη παραμετρικής δοκιμασίας Mann-Whitney. Εξετάσαμε αν οι συχνότητες των γονοτύπων πληρούσαν την ισορροπία των Hardy Weinberg με τη χρήση της δοκιμασίας του Χ 2. Παράλληλα η ανισορροπία σύνδεσης (LD) μεταξύ των 2 πολυμορφισμών εξετάστηκε και με τη βοήθεια κατάλλήλου λογισμικού όπως αυτό έχει περιγραφεί από τους Rodriguez και συνεργάτες [321]. Περαιτέρω λογιστική παλινδρόμηση πραγματοποιήθηκε για να εξεταστούν οι πιθανές συσχετίσεις μεταξύ των βιοχημικών παραγόντων και των κλινικών εκδηλώσεων/βεβλαμμένα αγγεία. Στατιστικά σημαντικές θεωρήθηκαν οι τιμές με p<0.05. Για τον σκοπό της στατιστικής ανάλυσης χρησιμοποιήθηκε το στατιστικό πακέτο SPSS έκδοση 18.0 (SPSS, Chicago, IL).

ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ

Δημογραφικά χαρακτηριστικά των ατόμων της μελέτης Ομάδα ελέγχου Άτομα 277 422 Ηλικία (έτη) 62.7±9.97 64.0±9.96 p=ns Φύλο (άρρενα) (%) 158 (57.0) 226 (53.5) p=ns Υπέρταση, N (%) 165 (59.5) 320 (75.8) p<0.001 Υπερλιπιδαιμία, N (%) 151 (54.5) 287 (68.0) p=0.001 Σακχαρώδης διαβήτης, N (%) 56 (20.2) 161 (38.2) p<0.001 Κάπνισμα, N (%) 138 (49.8) 249 (59.0) p=0.020 Κλάσμα εξώθησης (%) 61.8±5.54 51.2±9.82 p<0.001 Ινωδογόνο (mg/dl) 376.2±99.0 436.8±131.0 p<0.001 D-Dimer (mg/l) $ 2.46 [2.28-2.60] 2.60 [2.40-2.70] p<0.001 Παράγων V (%) 113.2±23.1 121.0±24.0 p=0.002 Παράγων X (%) 108.7±22.4 103.8±23.6 p=0.05 FMD (%) 6.26±3.23 3.86±2.35 p<0.001 Γονοτυπική κατανομή 58GG, N (%) 99 (38.1) 128 (37.7) 58GA, N (%) 114 (43.8) 151 (44.5) 58AA, N (%) 47 (18.1) 60 (17.8) 455GG, N (%) 148 (54.4) 209 (50.6) 455GA, N (%) 103 (37.8) 171 (41.4) 455AA, N (%) 21 (7.8) 33 (8.0) Υπολειπόμενο μοντέλο 58AA, N (%) 47 (18.1) 60 (17.8) *p=ns 58GG+58GA, N (%) 213 (81.9) 279 (82.2) 455AA, N (%) 21 (7.8) 33 (8.0) p=ns 455GG+455GA, N (%) 251 (92.2) 380 (92.0) Όλες οι τιμές εκφράστηκαν σαν μέση τιμή ±SD (τυπική απόκλιση). ΣΝ: στεφανιαία νόσος, FMD: αγγειοδιαστολή προκαούμενη από τη ροή, NS: μη σημαντικό, $ Οι τιμές εκφράστηκαν σαν διάμεσος (25 75ο εκατοστημόριο), *58AA vs 58GG+58GA, 455AA vs 455GG+455GA με τη δοκιμασία του X 2 ΣΝ

Επίδραση του G455A πολυμορφισμού στα επίπεδα ινωδογόνου Τα ομόζυγα άτομα 455AA χαρακτηρίζονται από αυξημένα επίπεδα ινωδογόνου τόσο στην ομάδα ελέγχου, όσο και στην ομάδα της στεφανιαίας νόσου.

Επίδραση του G58A πολυμορφισμού στα επίπεδα ινωδογόνου Ο πολυμορφισμός G58A δεν είχε σημαντική επίδραση στα επίπεδα ινωδογόνου και στις 2 ομάδες τις μελέτης.

Επίδραση του G455A πολυμορφισμού στα επίπεδα D-dimers Τα ομόζυγα άτομα 455AΑ είχαν υψηλότερα επίπεδα D-dimers συγκριτικά με τους φορείς του G αλληλίου στην ομάδα της στεφανιαίας νόσου.

Επίδραση του G58A πολυμορφισμού στα επίπεδα D-dimers Τα ομόζυγα άτομα 58AΑ είχαν υψηλότερα επίπεδα D-dimers συγκρτικά με τους φορείς του G αλληλίου στην ομάδα της στεφανιαίας νόσου.

Συσχέτιση μεταξύ αιμοστατικών παραγόντων και κλινικών εκδηλώσεων/ έκτασης νόσου. ΣΝ (α) ΟΕΜ (α) Στεφανιαία αγγεία (Ένα/Περισσό τερα) (α) ΣΝ (β) ΟΕΜ (β) Στεφανιαία αγγεία (Ένα/Περισσότ ερα) (β) Ινωδογόνο 1.005 [1.003-1.003 [1.001-1.001 [0.999-1.005 [1.002-1.002 [1.000-1.001 [0.999- (mg/dl) 1.007] 1.005] 1.003] 1.007] 1.004] 1.003] p<0.001 p=0.001 p=0.362 p<0.001 p=0.015 p=0.395 D-dimer 1.001 [1.001-1.000 [1.001-1.001 [1.000-1.001 [1.000-1.000 [1.001-1.000 [0.999- (μg/l) 1.002] 1.001] 1.001] 1.001] 1.001] 1.001] p<0.001 p=0.083 p=0.669 p=0.033 p=0.418 p=0.970 Τα δεδομένα παρουσιάζονται σαν αναλογία πιθανοτήτων με 95% C I (διάστημα εμπιστοσύνης, Wald test). (β): μη εξομειωμένες OR, (β): εξομειωμένες OR για την ηλικία, το φύλο, υπέρταση, σακχαρώδη διαβήτη, κάπνισμα, υπερλιπιδαιμία, τους G455A και G48A πολυμορφισμούς, ΣΝ: στεφανιαία νόσος, ΟΕΜ: οξύ έμφραγμα μυοκαρδίου.

Βασικά χαρακτηριστικά ανάλογα των τριτημορίων των επιπέδων του ινωδογόνου Μεταβλητή 1ο τριτημόριο (<347 mg/dl) N=198 2ο τριτημόριο (347 443 mg/dl) N=195 3ο τριτημόριο (>443 mg/dl) N=196 Ηλικία (χρόνια) 59±11.2 61.8±11 62.3±10.6 0.010 Φύλο (άρρενα %) 74.4 73.7 77.1 0.700 Κάπνισμα, n (%) 50.9 48.1 48.4 0.860 Υπερλιπιδαιμία, n (%) 60.3 57.7 64.5 0.430 Υπέρταση, n (%) 56.9 63.8 68.2 0.090 Σακχαρώδης διαβήτης, n (%) 16.1 26.3 27.4 0.020 Γονοτυπική κατανομή rs180070 GG, n (%) 55.4 53.3 46.9 <0.001 rs180070 GA, n (%) 40.7 39.7 35.4 rs180070 AA, n (%) 3.80 7.10 17.7 Γονοτυπική κατανομή rs2070011 GG, n (%) 36.2 35.8 35.7 0.670 rs2070011 GA, n (%) 41.4 46.1 48.4 rs2070011 AA, n (%) 22.4 18.2 15.8 Τα δεδομένα παρουσιάζονται σαν μέση τιμή ±SD ή σαν ποσοστό των ατόμων (%), οι τιμές του p βασίζονται στη στατιστική ανάλυση με ANOVA για κανονικής κατανομής παραμέτρους και στη δοκιμασία του X 2 για κατηγορικές μεταβλητές.

Επιδράσεις του ινωδογόνου και των πολυμορφισμών του στον κίνδυνο ΣΝ Συνολικός πληθυσμός OR [95% CI], p* rs180070aa γονότυπος 3.20 [1.01-10.1], p=0.049 rs2070011 AA γονότυπος 1.10 [0.68-1.76], p=0.700 Επίπεδα ινωδογόνου 3.90 [1.70-9.40], p=0.002 (>443 mg/dl συγκριτικά με <347 mg/dl) Επίπεδα ινωδογόνου 1.02 [0.46-2.24], p=0.970 (347-443 mg/dl συγκριτκά με <347 mg/dl) CI=διάστημα εμπιστοσύνης, *εξομείωση για ηλικία, φύλο, κάπνισμα, υπερλιπιδαιμία, υπέρταση, σακχαρώδης διαβήτης και υψηλής ευαισθησίας C-αντιδρώσα πρωτεΐνη.

Η ομοζυγωτία ΑΑ του G455A xαρακτηρίστηκε από υψηλότερα επίπεδα scd40l (p=0.019) στο γενικό πληθυσμό. Ο G58A πολυμορφισμός δεν είχε καμία επίδραση στα επίπεδα scd40l στις υποομάδες της μελέτης. Η παρουσία του A αλληλίου (rs180070 και rs2070011) δε συσχετίστηκε όμως με την αγγειογραφική έκταση της νόσου [(OR: 1.36, 95%CI (0.63 2.95) p=0.434] και [OR:0.99, 95%CI (0.56-1.78,) p=0.995] αντίστοιχα, καθώς και την εμφάνιση οξέος εμφράγματος του μυοκαρδίου [OR:1.87, 95%CI (0.37 8.9), p=0.46] και [OR: 0.75, 95%CI (0.39-1.43), p=0.378] αντίστοιχα.

Τα επίπεδα D-dimers σε σχέση με τα επίπεδα ινωδογόνου Τα επίπεδα D-dimer ήταν υψηλότερα στην υποομάδα με τα υψηλότερα επίπεδα ινωδογόνου συγκριτικά με τις υποομάδες των ενδιαμέσων και των χαμηλών επιπέδων ινωδογόνου

ΣΥΖΗΤΗΣΗ

Α) Η 455AA ομοζυγωτία έχει ισχυρή επίδραση στα επίπεδα του ινωδογόνου τόσο σε υγιή όσο και σε άτομα με ΣΝ. Έναρξη της αθηροσκλήρωσης σε υγιή Καυκάσια άτομα, ενώ προάγει περαιτέρω την αθηροσκληρωτική διαδικασία σε ασθενείς με γνωστή ΣΝ. Ο G455A αποτελεί σημαντικό αθηρογόνο παράγοντα, αφού πέραν της επίδρασης στα επίπεδα του ινωδογόνου, έχει σημαντική επίδραση στα επίπεδα D-Dimers. Το ινωδογόνο (και όχι ο G455A) είναι ένας ανεξάρτητος προγνωστικός παράγοντας ΣΝ, παρά το γεγονός πως ο G455A τροποποιεί το προθρομβωτικό προφίλ και τη φλεγμονώδη διεργασία σε αυτές τις υποομάδες.

Β) Αναφορικά με G58A πολυμορφισμό, δείξαμε πως οι 58AA ομοζυγώτες δεν έχουν αυξημένα επίπεδα ινωδογόνου, όμως είναι σε θέση να τροποποιούν τα επίπεδα D-dimer προωθώντας την αθηροσκληρωτική διαδικασία που χαρακτηρίζει τους ασθενείς με ΣΝ.

ΣΥΜΠΕΡΑΣΜΑΤΑ

Α) Το ινωδογόνο αποτελεί ένα μείζων παράγοντα κινδύνου για ΣΝ και μάλιστα ο κίνδυνος αυξάνεται ανάλογα με τα επίπεδα του ινωδογόνου. Επιπλέον, η AA ομοζυγωτία του rs180070 αποτελεί έναν επιπλέον παράγοντα κινδύνου για ΣΝ μέσω της επίδρασης στη διαδικασία της πήξης. Τα υψηλά επίπεδα ινωδογόνου (>443 mg/dl) αποτελούν τον πιο αξιόπιστο, ανεξάρτητο προγνωστικό δείκτη για ΣΝ.

B) Οι ακριβείς μηχανισμοί μέσω των οποιών οι παρόντες πολυμορφισμοί και παράγοντες ασκούν τις βιολογικές τους επιδράσεις παραμένουν άγνωστοι και υπό διερεύνηση. Για τον επαναδιαχωρισμό των ενδιάμεσου από τους υψηλού κινδύνου ασθενείς για ΣΝ, η χρήση πολλαπλών βιοδεικτών όπως του ινωδογόνου και της hscrp, απαιτεί περαιτέρω τεκμηρίωση μέσα από μεγάλης κλίμακας μελέτες.

ΕΥΧΑΡΙΣΤΩ!