ΕΡΕΥΝΗΤΙΚΟ ΠΡΩΤΟΚΟΛΛΟ ΤΙΤΛΟΣ «Αξιολόγηση της κλινικής σημασίας της πραγματικού χρόνου αλυσιδωτής αντίδρασης πολυμεράσης (real time polymerase chain reaction PCR) σε νοσηλευόμενους ασθενείς με μη αντιρροπούμενη κίρρωση ήπατος και ισχυρή υποψία λοίμωξης» ΚΥΡΙΟΙ ΕΡΕΥΝΗΤΕΣ: 1. Καθηγητής Σπυρίδων Π. Ντουράκης. Β Πανεπιστημιακή Παθολογική κλινική Εθνικού και Καποδιστριακού Πανεπιστημίου Αθηνών 2. Αναπληρώτρια Καθηγήτρια Αιμιλία Χατζηγιάννη Β Πανεπιστημιακή Παθολογική Κλινική Εθνικού και Καποδιστριακού πανεπιστημίου Αθηνών 3. Επίκουρος Καθηγήτρια Αλεξάνδρα Αλεξοπούλου. Β Πανεπιστημιακή Παθολογική Κλινική Εθνικού και Καποδιστριακού πανεπιστημίου Αθηνών 4. Επίκουρος Καθηγήτρια Mικροβιολογίας Γεωργία Βρυώνη, Μικροβιολογικό εργαστήριο Ιατρικής Σχολής Εθνικού και Καποδιστριακού πανεπιστημίου Αθηνών 5. Πανεπιστημιακός υπότροφος Λαρίσα Βασίλιεβα. Β Πανεπιστημιακή Παθολογική κλινική Εθνικού και Καποδιστριακού πανεπιστημίου Αθηνών 6. Ειδικευόμενη Παθολογίας Ηλιάνα Μάνη. Β Πανεπιστημιακή Παθολογική κλινική Εθνικού και Καποδιστριακού πανεπιστημίου Αθηνών 1
Εισαγωγή Η λοίμωξη είναι η συχνότερα εντοπιζόμενη αιτία της Οξείας επί χρονίας ηπατικής ανεπάρκειας (ΟΕΧΗΑ, Acute on Chronic Liver Failure - ACLF) στο υτικό κόσμο. Επίσης, η λοίμωξη σε ασθενείς που πάσχουν από μη αντιρροπούμενη κίρρωση (ΜΑΚ) ήπατος σχετίζεται με αυξημένη θνητότητα (30% τον πρώτο μήνα, 60% στο έτος), οδηγεί σε μη αναστρέψιμη επιδείνωση της ηπατικής λειτουργίας έως και στο 62% και καθιστά τον ασθενή ακατάλληλο για μεταμόσχευση ήπατος. Η επίπτωση της λοίμωξης στους νοσηλευόμενους κιρρωτικούς ασθενείς εκτιμάται στο 25-35% και είναι ακόμη συχνότερη σε αυτούς που παρουσιάζουν αιμορραγία πεπτικού (35-66%). Στην εν λόγω κατηγορία ασθενών, συχνά καθυστερεί η διάγνωση της λοίμωξης καθώς τα συνήθη κλινικά και εργαστηριακά ευρήματα λοίμωξης μπορεί μα μην είναι σαφη. Η καθυστέρηση στη διάγνωση και έναρξη της κατάλληλης θεραπείας οδηγεί σε επιπλέον αύξηση της θνητότητας. Τα διαθέσιμα μέσα διάγνωσης της λοίμωξης υστερούν τόσο σε ευαισθησία όσο και σε ειδικότητα. Η ευαισθησία των αιμοκαλλιεργειών είναι χαμηλή, καθώς ακόμα και στους σηπτικούς ασθενείς είναι μόλις 11-40%. Ακόμα χαμηλότερη είναι η ευαισθησία στην ανίχνευση μυκηταιμίας. Επιπλέον, ο χρόνος απάντησης είναι 24-48 ώρες και τα αποτελέσματα της ευαισθησίας στα αντιβιοτικά καθυστερούν περισσότερο. Τα αποτελέσματα των βιοδεικτών της σήψης, είναι συνήθως διαθέσιμα προ των μικροβιολογικών εξετάσεων, υστερούν όμως σε ευαισθησία και ειδικότητα. Οι ευρύτερα χρησιμοποιούμενοι βιοδείκτες είναι η C αντιδρώσα πρωτεΐνη (C-reactive protein, CRP) και ο αριθμός των λευκών αιμοσφαιρίων. Όμως αμφότεροι παρουσιάζουν αύξηση 2
σε πληθώρα άλλων μη λοιμωδών καταστάσεων όπως αυτοάνοσες παθήσεις, νεοπλάσματα, οξύ έμφραγμα του μυοκαρδίου κλπ. Τελικά, η ευαισθησία της CRP για την ανίχνευση της βακτηριαιμίας εκτιμάται στο 95% αλλά η ειδικότητα της μόλις στο 15%. Καλύτερα είναι τα αποτελέσματα για την προκαλσιτονίνη. Η ευαισθησία και ειδικότητα της εκτιμώνται στο 75% και 79% αντίστοιχα, όμως και αυτή αυξάνεται σε καταστάσεις όπως η βαριά συμφορητική καρδιακή ανεπάρκεια, η οξεία παγκρεατίτιδα και οι λοιμώξεις από ιούς και παράσιτα. Οι μοριακές τεχνικές φιλοδοξούν να αποτελέσουν ταχύ και αξιόπιστο τρόπο τεκμηρίωσης της λοίμωξης. Επιπλέον, μπορούν να μειώσουν το χρόνο μέχρι την έναρξη της κατάλληλης αντιβιοτικής αγωγής, παρέχοντας έγκαιρα πληροφορίες για την ύπαρξη πολυανθεκτικών στελεχών. Σκοπός της μελέτης: 1) Η παρούσα εργασία αποτελεί προοπτική μελέτη του ρόλου της real time PCR στην έγκαιρη διάγνωση της λοίμωξης. Στο πλαίσιο αυτό θα πραγματοποιηθεί και σύγκριση της ευαισθησίας και ειδικότητάς της με αυτή των συμβατικών αιμοκαλλιεργειών. 2) Επιπλέον, θα μελετηθεί η επίπτωση των λοιμώξεων από πολυανθεκτικά και πανανθεκτικά βακτήρια αλλά και μύκητες και θα αξιολογηθεί η επίδραση στην επιβίωση της τροποποίησης της αντιμικροβιακής αγωγής βάσει των αποτελεσμάτων της real time PCR. 3
Ασθενείς και μεθόδοι : Πρόκειται για προοπτική μελέτη στην οποία θα ενταχθούν περίπου 55 κιρρωτικοί ασθενείς από την Β Παθολογική κλινική του Πανεπιστημίου Αθηνών σε διάρκεια 2 ετών. Κριτήρια επιλογής: 1) Ασθενείς, ανεξαρτήτως φύλου, φυλής, κοινωνικο-οικονομικής κατάστασης και αιτιολογίας ηπατικής νόσου, με αποδεδειγμένη μη αντιρροπούμενη κίρρωση ιστολογικώς, απεικονιστικώς ή/και κλινικώς (σημεία πυλαίας υπέρτασης και ηπατικής ανεπάρκειας), για τους οποίους η υποψία λοίμωξης είναι ισχυρή. Στην κατηγορία αυτή υπάγονται ασθενείς που είτε πληρούν τα κριτήρια συστηματικής φλεγμονώδους αντίδρασης, είτε εισάγονται λόγω μειζόνων επιπλοκών της υποκείμενης νόσου, δηλαδή ασθενείς που παρουσιάζουν πρωτοεμφανιζόμενη ασκιτική συλλογή, ηπατική εγκεφαλοπάθεια, κιρσορραγία ή/και ACLF. 2) Ηλικία άνω των 18 Κριτήρια αποκλεισμού: 1. Ανοσοκατασταλμένοι (χρόνια λήψη κορτικοστεροειδών, λήψη ανοσοκασταλτικών, λοίμωξη από HIV) 2. Μεταμοσχευμένοι 4
Σχεδιασμός: Η μελέτη θα πραγματοποιηθεί στη Β Παθολογική κλινική του Πανεπιστημίου Αθηνών στο Ιπποκράτειο νοσοκομείο. Οι συμμετέχοντες, αφού ενημερωθούν για το σκοπό της μελέτης, θα δώσουν γραπτά τη συγκάταθεσή τους, θα υποβληθούν σε λήψη ιστορικού και στον απαιτούμενο εργαστηριακό έλεγχο. είγματα αίματος και ασκιτικού υγρού θα συλλεγούν κατά την εισαγωγή από όλους τους ασθενείς με μη αντιρροπούμενη κίρρωση ήπατος και ισχυρή υποψία λοίμωξης. Θα ακολουθήσει έναρξη εμπειρικής αντιβιοτικής αγωγής, σύμφωνα με τις ιεθνείς Συστάσεις. Στην περίπτωση ταυτοποίησης του υπεύθυνου μικροοργανισμού και καθορισμού τις ευαισθησίας του στα αντιβιοτικά στις συμβατικές καλλιέργειες η αγωγή θα τροποποιείται ανάλογα. Αν δεν υπάρχει θετική καλλιέργεια, η αγωγή θα τροποποιείται βάσει των αποτελεσμάτων της real time PCR στην μια ομάδα και θα μείνει όπως έχει με βάσει την εμπειρική αγωγή στην άλλη. Θα γίνει σύγκριση της θνητότητας, της παραμονής στο νοσοκομείο και των επιπλοκών στις δύο αυτές ομάδες. Για τη συμβατική καλλιέργεια αίματος και ασκιτικού υγρού θα χρησιμοποιηθούν φιάλες για αερόβια και αναερόβια βακτήρια BD Bactec. Τα δείγματα αίματος θα συλλέγονται σε 3 φιάλες (αερόβια και αναερόβια για τις αιμοκαλλιέργειες και 1 φιάλη αναερόβιων για την real time PCR). Η ίδια διαδικασία θα ακολουθηθεί και για το ασκιτικό υγρό στις περιπτώσεις που αυτό είναι διαθέσιμο. Τα δείγματα θα επωάζονται σε κλίβανο στους 37ºC έως τη μεταφορά τους στο μικροβιολογικό εργαστήριο της Ιατρικής Σχολής του Εθνικού και Καποδιστριακού Πανεπιστημίου Αθηνών για την real time PCR. Το αντιδραστήριο που θα χρησιμοποιηθεί για την real time PCR είναι το Film Array Blood Culture Identification Kit. 5
Συλλογή στοιχείων: Κατά την ένταξη θα πραγματοποιείται λήψη ιστορικού και κλινική εξέταση. Θα καταγραφούν πλήρη δημογραφικά στοιχεία, ονοματεπώνυμο, τηλέφωνο επικοινωνίας, ηλικία, φύλο, αιτιολογία της ηπατικής νόσου, στάδιο κατά Child-Pugh και κατά MELD, παρουσία ασκίτη ή / και αυτόματης βακτηριακής περιτονίτιδας, ηπατικής εγκεφαλοπάθειας, τυχόν κατάχρηση αιθυλικής αλκοόλης, δείκτης μάζας σώματος, είδος/ εστία λοίμωξης, μικρόβιο που απομονώθηκε, ΑΜΒ αγωγή που χορηγήθηκε κατά την νοσηλεία, τυχόν προηγηθείσα ή τρέχουσα χημειοπροφύλαξη, προηγούμενες νοσηλείες, εργαστηριακός έλεγχος ρουτίνας (έλεγχος πηκτικότητας αίματος, βιοχημεία ήπατος, ουρία, κρεατινίνη) και οι συν-νοσηρότητες (Charson Morbidity score). Θα καταγραφούν επίσης τα είδη των μικροοργανισμών, η ευαισθησία τους στα αντιβιοτικά, η μέθοδος με την οποία αποκτήθηκαν τα ανωτέρω στοιχεία (αιμοκαλλιέργειες ή real time PCR), η ταχύτητα με την οποία αποκτήθηκαν με τις 2 μεθόδους και η έκβαση της νοσηλείας. Η μελέτη θα ενισχυθεί οικονομικά από την Ελληνική Εταιρεία Μελετης του Ηπατος. Βιβλιογραφία: 1. Bunchorntavakul C, Chamroonkul N, Chavalitdhamrong D. Bacterial infections in cirrhosis: A critical review and practical guidance. World J Hepatol 2016; 8:307-21. 6
2. Alexopoulou A, Vasilieva L, Agiasotelli D, Siranidi K, Pouriki S, Tsiriga A, et al. Extensively drug-resistant bacteria are an independent predictive factor of mortality in 130 patients with spontaneous bacterial peritonitis or spontaneous bacteremia. World J Gastroenterol 2016; 22:4049-56. 3. Arvaniti V, D'Amico G, Fede G, Manousou P, Tsochatzis E, Pleguezuelo M, et al. Infections in patients with cirrhosis increase mortality four-fold and should be used in determining prognosis. Gastroenterology 2010; 139:1246-56. 4. Jalan R, Fernandez J, Wiest R, Schnabl B, Moreau R, Angeli P, et al. Bacterial infections in cirrhosis: a position statement based on the EASL Special Conference 2013. J Hepatol 2014; 60:1310-24. 5. Schmitz RP, Keller PM, Baier M, Hagel S, Pletz MW, Brunkhorst FM. Quality of blood culture testing - a survey in intensive care units and microbiological laboratories across four European countries. Crit Care 2013; 17:R248. 6. Vincent JL, Brealey D, Libert N, Abidi NE, O'Dwyer M, Zacharowski K, et al. Rapid Diagnosis of Infection in the Critically Ill, a Multicenter Study of Molecular Detection in Bloodstream Infections, Pneumonia, and Sterile Site Infections. Crit Care Med 2015; 43:2283-91. 7. Bacconi A, Richmond GS, Baroldi MA, Laffler TG, Blyn LB, Carolan HE, et al. Improved sensitivity for molecular detection of bacterial and Candida infections in blood. J Clin Microbiol 2014; 52:3164-74. 8. Bloos F, Bayer O, Sachse S, Straube E, Reinhart K, Kortgen A. Attributable costs of patients with candidemia and potential implications of polymerase chain 7
reaction-based pathogen detection on antifungal therapy in patients with sepsis. J Crit Care 2013; 28:2-8. 9. Bloos F, Sachse S, Kortgen A, Pletz MW, Lehmann M, Straube E, et al. Evaluation of a polymerase chain reaction assay for pathogen detection in septic patients under routine condition: an observational study. PLoS One 2012; 7:e46003 10. Yanagihara K, Kitagawa Y, Tomonaga M, Tsukasaki K, Kohno S, Seki M, et al. Evaluation of pathogen detection from clinical samples by real-time polymerase chain reaction using a sepsis pathogen DNA detection kit. Crit Care 2010; 14:R159. 11. Dark P, Blackwood B, Gates S, McAuley D, Perkins GD, McMullan R, ey al. Accuracy of LightCycler( ) SeptiFast for the detection and identification of pathogens in the blood of patients with suspected sepsis: a systematic review and meta-analysis. Intensive Care Med 2015; 41:21-33. 8