Σύγχρονη Προσέγγιση στην Προεμφυτευτική Γενετική Διάγνωση (PGD (PGD)) Το παρόν Χριστίνα Βρεττού Ε.ΔΙ.Π. Εργαστήριο Ιατρικής Γενετικής Πανεπιστημίου Αθηνών Διευθύντρια: Καθηγήτρια Σοφία Κίτσιου Κίτσιου--Τζέλη
Γενετική Διάγνωση σε προεμφυτευτικό επίπεδο Διαδικασία με την οποία εντοπίζονται και μεταφέρονται στη μήτρα τα γενετικά φυσιολογικά έμβρυα που γονιμοποιούνται εξωσωματικά (IVF) Πλεονέκτημα έναντι προγεννητικής διάγνωσης (ΠΔ): αποφυγή διακοπής εγκυμοσύνης
Γενετική Διάγνωση σε Προεμφυτευτικό επίπεδο Preimplantation Genetic Diagnosis PGD - υψηλής επικινδυνότητας Έλεγχος γνωστών γενετικών διαταραχών που φέρουν οι υποψήφιοι γονείς Μονογονιδιακά Νοσήματα Αυτοσωματικά υπολειπόμενα Αυτοσωματικά επικρατητικά Φυλοσύνδετα Χρωμοσωμικές Ανωμαλίες Αριθμητικές Δομικές Preimplantation Genetic Sceening PGS - χαμηλής επικινδυνότητας Έλεγχος εμβρύων για ανευπλοειδίες σε ζευγάρια με φυσιολογικό καρυότυπο με στόχο τη βελτίωση της επιτυχίας της IVF
Ενδείξεις για την εφαρμογή PGD Κίνδυνος μεταβίβασης σοβαρής γενετικής διαταραχής Σε συνδυασμό με Υπογονιμότητα Ενδοιασμοί για διακοπή κύησης Ιστορικό πολλαπλών διακοπών κυήσεων μετά από προγεννητική διάγνωση Ηθικές-- θρησκευτικές αναστολές Ηθικές Xρόνια ασθένεια της συζύγου
Πηγές Γενετικού Υλικού στην PGD & PGS 10 και 20 πολικό σωμάτιο Βλαστομερίδιο Κύτταρα από βλαστοκύστη 1η ημέρα 3η ημέρα 5η ημέρα
Κέντρο Υποβοηθούμενης Αναπαραγωγής Αξιολόγηση του περιστατικού ΗΜΕΡΑ 1 2 3 ΩοληψίαΩοληψίαΓονιμοποίηση Βιοψία 4 5 6 Εργαστήριo Εργαστήρι o Γενετικής Αξιολόγηση του περιστατικού και γενετική συμβουλή Επιλογή πρωτοκόλλου ή Σχεδιασμός πρωτόκολλου διάγνωσης Γενετική διάγνωση ανά ωάριο/έμβρυο Μεταφορά των υγιών εμβρύων Προγεννήτικη διάγνωση και παρακολούθηση παιδιών
Μονογονιδιακά Νοσήματα Η PGD μπορεί να εφαρμοστεί για οποιοδήποτε μονογονιδιακό νόσημα ΠΡΟΫΠΟΘΕΣΗ Να υπάρχει γενετική διάγνωση Γνωστός ο γενετικός τόπος που ευθύνεται για την εμφάνιση του νοσήματος στη συγκεκριμένη οικογένεια
Μεθοδολογία PGD για μονογονιδιακό νόσημα Πολλαπλό PCR (multiplex (multiplex PCR) Γονίδιο άμεση διάγνωση Βιοψία εμβρύου p q Πολυμορφικές θέσεις ανάλυση σύνδεσης σύνδεσης--έμμεση διάγνωση (linkage analysis) Πολυμορφικές περιοχές (SNPs ή μικροδορυφορικές αλληλουχίες)) αλληλουχίες Π Φ γονίδιο Μητέρα φορέας Π Φ Ποιες είναι οι χρήσιμες (πληροφοριακές);; (πληροφοριακές) Πατέρας φορέας
Στρατηγική ανάπτυξης νέου πρωτοκόλλου Εύρεση in silico του υπεύθυνου γονιδίου, των γονεϊκών μεταλλάξεων και εντοπισμός πολυμορφικών θέσεων που είναι σε σύνδεση (linked) με το γονίδιο Σχεδιασμός in silico της multiplex PCR μέσω λογισμικών Ανάλυση σύνδεσης (linkage analysis) των πολυμορφικών αλληλουχιών στην οικογένεια για τον εντοπισμό των πληροφοριακών πολυμορφισμών Βελτιστοποίηση της μεθόδου σε αραιωμένο γενομικό DNA από τα μέλη της οικογένειας Εκτίμηση της αξιοπιστίας και της ευαισθησίας της μεθόδου σε DNA από μεμονωμένα λεμφοκύτταρα των υποψήφιων γονέων (σύμφωνα με τις προδιαγραφές του PGD Consortium της ESHRE (Thornhill et al. 2005) Κλινική εφαρμογή
Εμπειρία του Εργαστηρίου Ιατρικής Γενετικής Έλεγχος Μονογονιδιακών νοσημάτων Κοινά 1. Λιγότερο κοινά και Σπάνια 2. 3. 4. β-μεσογειακή Αναιμία (β-thal) και αιμοσφαιρινοπάθειες (ΗbS) Κυστική Ινωση (CF) Νωτιαία Μυϊκή Ατροφία (SMA) α-μεσογειακή Αναιμία (α-thal) Άλλα 9. 10. 11. 12. 13. 14. 15. 16. 17. 18. 19. 20. 21. 22. 23. 24. 25. 26. 27. 28. 29. 30. 31. Μυοτονική Δυστροφία τύπου 1 (DM1) Γλυκογονίαση τύπου ΙV (GSD-IV) Συγγενής Αμαύρωση Leber (LCA) Αυτοσωματική υπολειπόμενη πολυκυστική νόσος των νεφρών (ARPKD) Αυτοσωματική επικρατητική πολυκυστική νόσος των νεφρών (ADPKD) Νευροινωμάτωση τύπου 1 (NF1) Σπαστική Παραπληγία 3Α Σύνδρομο Marfan Σκελετική Δυσπλασία HEM-Greenberg Οζώδης Σκλήρηνση Tuberous Sclerosis Μυοπάθεια σχετιζόμενη με το γονίδιο RYR1 Νόσο Pelizaeus-Merzbacher Νόσο Huntington Αναιμία Fanconi Νόσο FABRY Εξώστωση Κώφωση Retinitis Pigmentosa RHO Οστεοπόρωση ψευδογλοίωμα LRP5 HLA τυποποίηση για εύρεση ιστοσυμβατού αδελφού ως δότη HLA & β-μεσογειακή Αναιμία 32. HLA & β-μεσογειακή Αναιμία & Σιδηροβλαστική Αναιμία HLA & Κοκκιωματώδης νόσος 33. HLA & Blackfan Diamond HLA & ανεπάρκεια CD40L Φυλοσύνδετα ή φυλοεξαρτώμενα 5. Μυϊκή Δυστροφία Duchenne (DMD) 6. Σύνδρομο ευθραυστου Χ (Fragile X) 7. Συγγενής Λιποειδής Υπερπλασία των Επινεφριδίων (CLAH) 8. Σύνδρομο Alport
PGD για γνωστές χρωμοσωμικές ανωμαλίες στην οικογένεια (High risk PGD) Αμοιβαίες μεταθέσεις (reciprocal translocations) Μεταθέσεις ακροκεντρικών χρωμοσωμάτων 13, 14, 15, 21, 22 (Robertsonian translocations) translocations)
Έλεγχος χρωμοσωμικών ανωμαλιών με Fluores Fluore scent In Situ Hybridization - FISH Έλεγχος χρωμοσωμάτων σε μεσοφασικούς πυρήνες εμβρυϊκών κυττάρων με DNA ανιχνευτές σημασμένους με φθοριοχρώματα Δυνατότητα ελέγχου έως και 10 10--12 θέσεις στο γονιδίωμα Φυσιολογικό Χρωμοσώματα 22 13 16 18 21 Τρισωμία 22
Έλεγχος Χρωμοσωμάτων με FISH Xρωμοσωμικοί ανιχνευτές εκατέρωθεν της θέσης θραύσης και για τα δυο χρωμοσώματα που εμπλέκονται στη μετάθεση Αμοιβαίες Μεταθέσεις (reciprocal translocations) Κοινοί ανιχνευτές που χρησιμοποιούνται για τα συγκεκριμένα χρωμοσώματα Μεταθέσεις ακροκεντρικών χρωμοσωμάτων (Robertsonian translocations) (13, 14, 15, 21, 22)
PGD χρωμοσωμικών ανωμαλιών με Πολλαπλό PCR (multiplex (m ultiplex PCR) Πολύ περιορισμένη εφαρμογή (Fiorentino et al 2010, 2010, Traversa et al 2010)) 2010 πολλαπλασιασμός πληροφοριακών πολυμορφικών μικροδορυφορικών αλληλουχιών ταυτόχρονα με φθορίζον πολλαπλό PCR εκατέρωθεν της θέσης θραύσης και για τα δυο χρωμοσώματα που εμπλέκονται στη μετάθεση Αμοιβαίες Μεταθέσεις (reciprocal translocations) Κατά μήκος των χρωμοσωμάτων που μετατίθενται Μεταθέσεις ακροκεντρικών χρωμοσωμάτων (Robertsonian translocations) (13, 14, 15, 21, 22)
Quantitative Real Time PCR Ποσοτικό PCR πραγματικού χρόνου Πολλαπλασιάζονται ταυτόχρονα 4 χρωμοσωμικές περιοχές στο κάθε χρωμόσωμα Ελέγχονται όλα τα χρωμοσώματα Ταχεία διάγνωση 4 h Περιορισμένη Εφαρμογή Treff et al, 2012 Werner et al, 2014
Συγκριτικός Γενομικός Υβριδισμός σε μικροσυστοιχίες Comparative Genomic Hybridization acgh Πολλές παραλλαγές Α) ολιγονουκλεοτιδίων (array-cgh) Β) βακτηριδιακών συνθετικών χρωμοσωμάτων BAC-arrays Γ) βιβλιοθηκών DNA συμπληρωματικών στα χρωμοσώματα (Chromosome libraries). Δ) Ολιγονουκλεοτιδίων για σημειακές αλλαγές κατά μήκος ολόκληρου του γονιδιώματος (SNP-microarrays) Εμπορικά διαθέσιμες πλατφόρμες Agilent Nimblegen Affymetrix Illumina
H acgh στην PGD DNA από το κύτταρο βιοψίας Έλεγχος όλων των χρωμοσωμάτων Πολλαπλασιασμός του DNA WGA DNA κυτάρου Σήμανση με Cy3 Υβριδισμός DNA αναφοράς Σήμανση με Cy5 Ανίχνευση φθορισμού Scanning Λογισμικό Λόγος Cy3/Cy5
Αξιολόγηση μεθόδων στην PGD για χρωμοσωμικές διαταραχές FISH Αξιόπιστα αποτελέσματα Τεχνικά απαιτητική acgh Ελέγχει και τα 24 χρωμοσώματα Πολύ αποτελεσματική Υψηλό κόστος Για μικρές μεταθέσεις <10Μb θα πρέπει να εξασφαλίζεται ότι στο κομμάτι που μετατίθεται περιέχονται τουλάχιστο 15 ανιχνευτές
Preimplantation Genetic Screening (PGS) Η PGS προτείνεται σε ζευγάρια με φυσιολογικό καρυότυπο όταν: 1. προχωρημένη ηλικία της υποψήφιας μητέρας 2. πολλές παλίνδρομες κυήσεις 3. περισσότερες από τρεις αποτυχημένες προσπάθειες IVF 4. στην IVF χρησιμοποιείται βιοψία όρχεος Kanavakis & Traeger Traeger--Synodinos Synodinos,, J Med Genet, 2002 Harton et al, al, Hum Reprod 2011
Preimplantation Genetic Screening (PGS) Αφορά περίπου το 60% των κύκλων που πραγματοποιούνται παγκοσμίως Υπάρχει μεγάλος προβληματισμός για την αξιοπιστία και τη χρησιμότητα της PGS (αύξηση της επιτυχίας της IVF) Hum Reprod. 2010
Οι πιθανές αιτίες για την αποτυχία της PGS Το βλαστομερίδιο που αναλύεται (έμβρυο 8 κυττάρων) δεν αντιπροσωπεύει πάντα το υπόλοιπο έμβρυο (φαινόμενο μωσαϊκισμού) Με FISH δεν είναι δυνατό να ελεγχθούν όλα τα χρωμοσώματα Η βιοψία μπορεί να βλάψει το έμβρυο Mastenbroek S et al. Hum. Reprod. Update 2011;17:454-466
Η σημερινή εικόνα για την PGS Η acgh είναι η προτεινόμενη μέθοδος στην PGS Αξιόπιστη μέθοδος - Έλεγχος και των χρωμοσωμάτων με εκατοντάδες χιλιάδες ανιχνευτές Υψηλό κόστος Προβληματισμός Η δυνατότητα εντοπισμού ακόμα και μικρών διπλασιασμών ή ελλειμμάτων κατά μήκος των χρωμοσωμάτων ξεφεύγει από τους στόχους του ελέγχου της PGS και δημιουργεί διαγνωστικά διλήμματα (δεν έχει γίνει κάποια μελέτη για τον καθορισμό των κριτηρίων αξιολόγησης τέτοιων ευρημάτων) 24
Προοπτικές για την PGS Δεν έχει ακόμα αποσαφηνιστεί η συμβολή της PGS με acgh στην επιτυχία της IVF Πολλές ανομοιογενείς μελέτες με διαφορετικό σχεδιασμό και εκτίμηση διαφορετικών παραμέτρων Η PGS σε βιοψία κυττάρων από βλαστοκύστεις με κρυοσυντήρηση των εμβρύων και μεταφορά σε επόμενο κύκλο φαίνεται να έχει καλύτερα ποσοστά επιτυχίας της IVF Σημαντική ίσως σταθεί η συμβολή από Τυχαιοποιημένες Κλινικές Μελέτες (Random Clinical Trials) που βρίσκονται σε εξέλιξη : 1. Γυναίκες από 38-41 ετών με συζύγους με σοβαρή υπογονιμότητα (Instituto Valenciano de Inferilidad, Spain) 2.Έλεγχος πολικών σωματίων σε γυναίκες >38 ετών (ESHRE) 3. Βιοψία βλαστοκύστεων και ανάλυση ολόκληρου του γονιδιώματος με NGS (Reprogenetics, US) Lee et al, The clinical effectiveness of preimplantation genetic diagnosis for aneuploidy in all 24 chromosomes (PGD-A): systematic review. Hum Reprod 2014
Εξωτερικός Έλεγχος ποιότητας στην PGD - PGS EQA Schemes for PGD Διαγνώσεις που βασίζονται σε μοριακές μεθόδους - United Kingdom National External Quality Assessment Service (UKNEQAS) UK NEQAS Διαγνώσεις που βασίζονται στην FISH Cytogenetic European Quality Assessment (CEQA) Διαγνώσεις που βασίζονται σε συστοιχίες (Pilot) UKNEQAS and CEQA
ΚΛΙΝΙΚΗ ΕΦΑΡΜΟΓΗ Στοιχεία από European Society of Human Reproduction and Embryology (ESHRE) 1997-2014 (124 συνεργαζόμενα κέντρα) Συνολικοί κύκλοι 58.485 PGD PGS Γεννήσεις 42,3% 57,7% 8.966 ESHRE The current status of PGD and PGS. Special interest group Reproductive Genetics Munich-Germany, 29 June 2014
16 χρόνια κλινικής εφαρμογής PGD στο Εργαστήριο Ιατρικής Γενετικής (1997--2013) (1997 >500 ζευγάρια ενημερώθηκαν 70 60 50 40 30 20 >650 κύκλοι* 10 0 19 97 19 98 19 99 20 00 20 01 20 02 20 03 20 04 20 05 20 06 20 07 20 08 20 09 ~460 (70%) κύκλοι κατέληξαν σε εμβρυομεταφορά >130 εγκυμοσύνες >170 φυσιολογικά νεογνά *Κύκλος: Εξωσωματική Γονιμοποίηση IVF - σε συνδυασμό με ΠΓΔ