Visoko specializirani proteini in mala skupina katalitičnih molekul RNA biološki katalizatorji Katalizirajo kemijske reakcije v živih organizmih - pospeševanje do 10 6-10 16 x Zmanjšajo E a, ne vplivajo na ΔG 0 Kontrola poteka vitalnih kemijskih reakcij uravnavanje metabolizma Zelo specifični ENIMI Kataliza poteka v aktivnem (katalitičnem) mestu Pomembni v diagnostiki in različnih industrijskih panogah ZGRADBA ENIMV Aktivni samo v nativni konformaciji M = 12.000 1.000.000 Da Enostavni in sestavljeni proteinski del kofaktor (anorganski ion ali kompleksna (metalo)organska molekula koencim) -prost - kovalentno vezan (prostetična skupina) oloencim NEKATERI ENIMI IN NJIVI KFAKTRJI Encim: Kofaktor: itokrom oksidaza Fe 2+ ali Fe 3+ Katalaza Peroksidaza Alkoholna dehidrogenaza Zn 2+, NAD + Ureaza Ni 2+ Acetil-oA karboksilaza Sukcinat dehidrogenaza Propionil-oA karboksilaza oa FAD biotin
INTERNAINALNA KLASIFIKAIJA ENIMV Št. Razred Tip reakcije 1. KSIDREDUKTAZE Prenos elektronov 2. TRANSFERAZE Prenos skupin 3. IDRLAZE Reakcije hidrolize 4. LIAZE Adicija skupin na dvojno vez, ali tvorba dvojne vezi z odstranjevanjem skupin 5. IZMERAZE Prenos skupin znotraj molekule 6. LIGAZE Tvorba -, -S, - in -N vezi s kondenzacijo in sproščanjem ATP-ja glukoza fosfotransferaza ATP + D-glukoza ADP + D-glukoza-6-fosfat Klasifikacijsko število: 2.7.1.1. Št. razreda (transferaza) Št. podrazreda (fosfotransferaza) Glukoza kot akceptor fosfatne skupine Fosfotransferaze z -skupino kot akceptorjem KSIDREDUKTAZE - PRIMER NAD + NAD + + 3-3 - laktat NAD + NAD + + piruvat Laktat dehidrogenaza (L-laktat: NAD + oksidoreduktaza) 1.1.2.3.
TRANSFERAZE - PRIMER (d-nmp) n + d-ntp (d-nmp) n+1 + PP i DNA polimeraza (Deoksinukleotid trifosfat: DNA deoksinukleotidiltransferaza) 2.7.7.7. IDRLAZE - PRIMER 3 2 2 N + ( 3 ) 3 + 2 3 + 2 2 N + ( 3 ) 3 acetilholin acetat holin Acetilholinesteraza (Acetilholin acetilhidrolaza) 3.1.1.7. LIAZE - PRIMER 2 + 2 2 3 karbonska kislina Karboanhidraza (Karbonatna hidrolaza) 4.2.1.1.
IZMERAZE - PRIMER 2 P 3 2-2 P 3 2-2 Dihidroksiaceton fosfat Gliceraldehid 3-fosfat Trioza fosfat izomeraza (D-gliceraldehid-3-fosfat ketoizomeraza) 5.3.1.1. LIGAZE- PRIMER 3 - ATP - 2 - + 2 piruvat oksaloacetat Piruvat karboksilaza (Piruvat: 2 ligaza) 6.4.1.1.
UVD V ENIMSK KINETIK E + S ES E+P itrost reakcije je definirana kot količina produkta ki nastane, ali količina substrata, ki se razgradi v enoti časa. Monomolekularne reakcije: v = ds/dt = k*s k = v/s (s -1 ) reakcija 1. reda. Bimolekularne reakcije: v = k*s 1* S 2 k = v/s 1 S 2 (M -1 s -1 ) reakcija 2. reda. Pri encimih zveza med v in [S] ni linearna pri visokih [S] prihaja do nasičenja - reakcija 0. reda. (Ena od razlik med encimi in kemičnimi katalizatorji!) SPREMEMBA PRSTE ENERGIJE ΔG sprememba proste energije v kemijskem procesu ΔG 0 standardna sprememba proste energije (pri 1 atm, 25, in začetnih koncentracijah reaktantov 1 M) V biokemiji: ΔG 0 (p 7.0) Povezana je s konstanto ravnotežja! A + B + D K eq = [][D]/[A][B] ΔG 0 = ΔG 0 + RT ln K eq V ravnotežju je ΔG 0 = -RT ln K eq SPREMEMBA PRSTE ENERGIJE ΔG 0 = -RT ln K eq ΔG 0 nam da informacijo o smeri reakcije: ΔG 0 = 0 ΔG 0 <0 ΔG 0 >0 Reaktanti in produkti imajo enak nivo energije. Reakcija je v ravnotežju. Reaktanti imajo višji energenski nivo od produktov. V reakciji se sprošča energija, dokler ne doseže ravnotežja. Reaktanti imajo nižji energenski nivo od produktov. Reakcija rabi dodatno energijo, da bi stekla.
Primer: RAČUNANJE PRSTE ENERGIJE Glukoza 6-fosfat glukoza 6-fosfoizomeraza Fruktoza 6-fosfat Zmešamo 1 M glukoza 6-fosfata in 1 M fruktoza 6-fosfata pod standardiziranimi pogoji; izmerimo konc. reaktantov v ravnotežju: K eq = [Fruktoza 6-fosfat]/[Glukoza 6-fosfat] = 0.67 / 1.33 M M = 0.5. ΔG 0 = -RT ln K eq = (-8.315 J/mol)(298 K) ln 0.5 = +1718 kj/mol. Reakcija rabi dodatno energijo, da bi stekla (je endergona!) SMER IN ITRST ENIMSKE REAKIJE Razlika med ΔG in ΔE a elotna sprememba proste energije reakcije je povezana z ravnotežno konstanto K r: ΔG 0 = - RT.ln K r (smer reakcije!) Aktivacijska energija je povezana s konstanto hitrosti reakcije: k = k max.e -Ea/RT (hitrost reakcije!) pomba: ni povezave med K r in k!! Encim = katalizator: zmanjša aktivacijsko energijo E a Prehodno stanje Prosta energija, G Aktivacijska energija, E a ΔG nespremnjena! Aktivacijska energija E a z encimom Prosta energija, ΔG Reakcijske koordinate
Vpliv temperature na ΔG in E 0 Vpliv encima na ΔG in E 0 Prosta energija, G Prosta energija, G G (S ), T 2 G (S ), T 1 G (S ) G (P ), T 2 G (P ), T 1 Reakc. koordinate Prehodno stanje Prehodno stanje E (nekatalizirano) a nekatal. Prehodno stanje (katalizirano) E a katal. G (P ) Reakc. koordinate KATALITIČNE LASNSTI ENIMV (PVZETEK) 1. Zvišujejo hitrost reakcije z zniževanjem E a 2. V reakciji se ne porabljajo in/ali spreminjajo 3. Ne vplivajo na ravnotežje reakcije 4. Navadno delujejo tako, da tvorijo prehodni kompleks z reaktantom in stabilizirajo prehodno stanje ČASVNI PTEK ENIMSK KATALIZIRANE REAKIJE Produkt Koncentracija ES E Substrat Čas
MIAELIS-MENTENVA TERIJA Leonor Michaelis Maud Menten MIAELIS-MENTENV GRAF itrost reakcije v o (frakcija V max ) 2,0 1,5 1,0 0,5 V max območje reakcij ničelnega reda (nasičenje) območje prehoda območje reakcij prvega reda 0,0 0 1 2 3 4 5 K m Koncentracija substrata (n x K m ) ZAČETNA ITRST REAKIJE v 0 v 0 = -d[p]/dt (t 0) Koncentracija produkta Čas
MIAELIS-MENTENVA ENAČBA k 1 E + S ES E+P k 3 k 2 k 4 MM enačba: V max [S] v 0 = K m + [S] E encim S substrat P produkt k 1,2,3,4 - hitrostne konstante Pogoji: - zanemarimo pretvorbo P v E in ES - [ES] je v dinamičnem ravnotežju MIAELIS-MENTENVA KNSTANTA K m k 1 E + S ES E+P k 2 k 3 Če je k 2 >> k 3 (k 3 je zanemarljiva), je K m = K d kompleksa ES! k 2 + k 3 K m = k 1 Pri večini encimov: K m = 10-1 10-8 M K m = k 2 k 1 Če je k 2 >> k 3, je K m mera za afiniteto med E in S! MAKSIMALNA ITRST (V max ) V max teoretična maksimalna hitrost encimsko katalizirane reakcije pri določeni koncentraciji encima V max = k 3.[E] t -je konstanta - v se asimptotično približuje V max
PRETVRBEN ŠTEVIL (k kat ) IN KATALITIČNA UČINKVITST k kat /K m k kat je število molekul S, ki jih pretvori 1 mol E v časovni enoti (pri nasičenju E s S, to je [S]>>[E]) Je mera za katalitično učinkovitost. Če velja M-M model (nasičenost E z S): k 3 = k kat = V max /E t Katalitična učinkovitost = k kat /K m cena za učinkovitost encima! PRIMERI VREDNSTI K m, k kat IN k kat /K m ENIM: K m (M) k kat (s) k kat /K m (s -1 M -1 ) Katalaza 1.1 40.000.000 40.000.000 Karboanhidraza 0.012 1.000.000 83.000.000 Acetilholinesteraza 0.00009 14.000 160.000.000 PVZETEK: V max, K m in k kat so glavni parametri za vrednotenje učinkovitosti encimsko katalizirane reakcije določamo jih eksperimentalno! LINEWEAVER-BURKV GRAF (DVJNI REIPRČNI GRAF) 2,0 1 K m 1 1 =. + V 0 V max [S] V max 1/V 0 (mmol/min) -1 1,5 1,0-1/K m 0,5 1/V max -4-2 0 2 4 6 8 1/[S] (M -1 )
EADIE-FSTEE-JEV GRAF v 0 /[S] 14 12 10 8 6 naklon = -1/Km 4 V max 2 0 1 2 3 4 5 6 7 8 V 0 ANES-V GRAF 2,0 1,5 [S]/v 0 1,0 naklon = -1/V max -K m 0,5-4 -2 0 2 4 6 8 [S] MERJENJE ENIMSKE AKTIVNSTI Merjenje pri standardnih/optimalnih pogojih Določimo v 0 = Δ[P]/Δ t Encimska enota (EU=enzyme unit): Enota za enc. aktivnost: Katal, ekvivalent E ali beljakovin, ki spremeni 1 mol S/sek (velika enota) Druge definicije (napr. 1mmol S/min)
DEJAVNIKI, KI VPLIVAJ NA ENIMSK AKTIVNST 1. [S] 2. [E] 3. p 4. T 5. Efektorji: aktivatorji in inhibitorji VPLIV KNENTRAIJE ENIMA 14 12 10 v 0 8 6 4 2 0 1 2 3 4 5 6 7 8 [E] VPLIV p 50 p optimum 40 30 pepsin v 0 20 tripsin 10 0 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 p
VPLIV TEMPERATURE 50 temperaturni optimum 40 30 v 0 20 10 0 0 20 40 60 80 100 temperatura ( ) EFEKTRJI INIBITRJI AKTIVATRJI Reverzibilni -Kompetitivni -Nekompetitivni -Mešani -Antikompetitivni Ireverzibilni Slow-binding KMPETITIVNA INIBIIJA AKTIVN MEST SUBSTRAT KMPETITIVNI INIBITR ENIM
KMPETITIVNA INIBIIJA Ks kcat E + S ES E + P + I EI Ki KMPETITIVNA INIBIIJA 1/V 0 (mmol/min) -1 2,0 S + I S 1,5 1,0-1/K m 0,5-1/K eff. 1/V max = 1/Veff. -4-2 0 2 4 6 8 1/[S] (M -1 ) NEKMPETITIVNA INIBIIJA AKTIVN MEST SUBSTRAT AKTIVN MEST SUBSTRAT ENIM ENIM NEKMPETITIVNI INIBITR REGULATRN MEST NEKMPETITIVNI INIBITR
NEKMPETITIVNA INIBIIJA Ks kcat E + S ES E + P + + I I EI Ki Ks EIS Ki NEKMPETITIVNA INIBIIJA 1/V 0 (mmol/min) -1 2,0 1,5 1,0 1/V eff. S + I S -1/K m = 0,5-1/K eff. 1/V max -4-2 0 2 4 6 8 1/[S] (M -1 ) MEŠANA INIBIIJA Ks kcat E + S ES E + P + + I I EI Ki1 Ks EIS Ki2
1/V eff. MEŠANA INIBIIJA 1/V 0 (mmol/min) -1 2,0 S + I 1,5 1,0 S -1/K m 0,5 1/V max -4-2 0 2 4 6 8-1/K eff. 1/[S] (M -1 ) ANTIKMPETITIVNA INIBIIJA Km Vm E+S ES E+P + I EIS Ki ANTIKMPETITIVNA INIBIIJA 1/V 0 (mmol/min) -1 2,0 1,5 1,0 S + I S -1/K eff. -1/K m = 0,5 1/Vmax 1/V eff. -4-2 0 2 4 6 8 1/[S] (M -1 )
DLČANJE K i DIXNV GRAF Nekompetitivni inhibitor: -K i 1/V 0 (mmol/min) -1 2,0 1,5 1,0 0,5 S3 S2 S1-4 -2 0 2 4 6 8 [I] (μm) Kompetitivni inhibitor: 1/V 0 (mmol/min) -1 2,0 1,5 1,0 0,5 S3 S2 S1 -K i -4-2 0 2 4 6 8 [I] (μm) IREVERZIBILNA INIBIIJA Ireverzibilni inhibitor tvori kovalentne ali močne nekovalentne vezi z encimom Acetilholinesteraza 2 3 F P 3 3 3 Acetilholinesteraza 2 3 P 3 3 3 + F DIFP (živčni strup) kovalentna vez INIBIIJA S SUBSTRATM v 0 =V max v 0 B A B A A B Aktivno mesto Encim Konc. substrata, [S]
AKTIVN MEST ENIMA Aktivno mesto encima vezavna regija za substrat, tukaj steče razgradnja S v P - specifičnost za substrat (absolutna ali skupinska) - relativno mala, 3D regija v encimu - substrat se na začetku veže v aktivno mesto s šibkimi, nekovalentnimi vezmi produkta encim Kompleks encim-substrat MDELI VEZAVE ENIM-SUBSTRAT 1. Model ključa in ključavnice (E. Fischer, 1890) 2. Model induciranega prileganja (D. Koshland, 1958) 3. Model analoga prehodnega stanja DRG ZLMAZA 1. BREZ ENIMA Substrat (železni drog) Prehodno stanje (zviti drog) Produkt (zlomljen drog) 2. ENIM, KMPLEMENTAREN SUBSTRATU 3. ENIM, KMPLEMENTAREN PREDNEM STANJU (Drog-zvijazozlomaza)
BLIKE KATALIZE Kataliza proces, s katerim se povečuje hitrost dosezanja ravnotežja kemijske reakcije Tipi katalize: 1. Zmanjšanje entropije pri tvorbi ES 2. Vpliv bližine in orientacije 3. Napetosti, zvijanje vezi 4. Desolvatacija kompleksa ES 5. Kislinsko-bazna kataliza 6. Kovalentna kataliza 7. Kataliza s kovinskim ionom ZMANJŠANJE ENTRPIJE PRI TVRBI ES Substrat Substrat Encim Prosto gibanje S in E: Neurejenost večja entropija Vezava E in S: Urejenost manjša entropija VPLIV BLIŽINE IN RIENTAIJE Reaktanti se morajo približati in pravilno orientirati, da bi reakcije stekla.
NAPETSTI, ZVIJANJE VEZI V ES Elektrostatska destabilizacija v ES DESLVATAIJA KMPLEKSA ES 2 Substrat Substrat Encim Solvatacija (idratacija) Desolvatacija kompleksa ES KISLINSK-BAZNA KATALIZA Proces, pri katerem prenos + ali - v prehodnem stanju zniža prosto energijo prehodnega stanja. R N R' + R + N R' 2 R + N R' + N + R + 2 NR' Encim: donor in akceptor +! R R'
KATALIZA S KVINSKIM INM 30% encimov deluje s pomočjo kovinskih ionov (Mg 2+, Mn 2+, u 2+, Zn 2+, Fe 3+...), ki lahko: - pravilno orientirajo substrat v aktivnem centru (koordinativne vezi) - stabilizirajo negativno nabite substrate - sodelujejo v reakcijah oksidacije in redukcije (prenos elektronov) - ionizirajo vodo Primer: citokromi yt c + yt a yt c + yt a Fe 2+ Fe 3+ Fe 3+ Fe 2+ KVALENTNA KATALIZA Proces tvorbe kovalentne vezi med nukleofilno funkcionalno skupino encima in substratom. Nastane zelo reaktiven prehodni intermediat. Primer: serinske proteaze E (Ser) + RN R' E (Ser) R' + RN 2 kovalentni intermediat E (Ser) R' + 2 E (Ser) R' +
PRIMER MEANIZMA ENIMSKEGA DELVANJE - AETILLINESTERAZA Acetilholinesteraza (AhE): - deluje na postsinaptičnih membranah holinergičnih sinaps - razgrajuje nevrotransmiter acetilholin do acetata in holina, ter tako ustavi prenašanje živčnih impulzov - inhibitorji AhE se uporabljajo pri zdravljenju Alzheimerjeve bolezni M = 70.000 Da K m = 0.00009 mol/l k cat = 14.000 s k cat /K m = 160.000.000 s -1 M -1 AhE MEANIZEM DELVANJA AhE STRUKTURA PERIFERN ANINSK MEST ANINSK MEST KATALITIČN MEST
Acetat + 2 2 olin AhE AKTIVN MEST N + Periferno anionsko mesto ( - ) n 2 nm Aktivni "žep" 3 ˇ 2 -- 2 N N Acetilholin N + 3 3 AhE Katalitično mesto ( - ) n Anionsko mesto MEANIZEM RAZGRADNJE AETILLINA Acetilholin Me Me N + Me Me - N 2 N Nukleofilni napad Me Me N + Me Me - N + 2 N Tetrahederska prehodna oblika Glu Ser is Glu Ser is olin Me Me N + Me - 2 Glu N Ser Acetat Me is N Me Me Me N + Glu 2 - Ser Me N + N is : 2 Acetilacija serina AhE INIBITRJI Uporabni v: -zdravljenju neuromuskularnih motenj (glavkom, Alzheimerjeva bolezen, myasthenia gravis) - kot pesticidi -kot bojni strupi Reverzibilni: -prehodna vezava v aktivni center (vglavnem na anionsko mesto ali na periferno anionsko mesto) Ireverzibilni: -Kovalentna vezava na -skupino v katalitičnem mestu (fosforilacija ali karbamoilacija)
AhE INIBITRJI Fizostigmin 2 N 3 N 3 N 3 Physostigma venenosum Inhibira AhE z mehanizmom karbamoilacije: karbamoilni ester je veliko bolj stabilen od acetata. Uporaben pri zdravljenu glavkoma, myastheniae gravis, Alzheimerjeve bolezni. Takrin N 2 Reverzibilna vezava na anionsko mesto. N AhE INIBITRJI Pesticidi: Karbaril N 3 Malation 3 P S S 3 3 3 Bojni strupi: Sarin 3 F 3 3 P 3