Purificarea și caracterizarea enzimelor Alegerea sursei enzimatice Etape Prepararea extractului Metode de separare fizică / concentrare dializa ultrafiltrarea centrifugarea Separarea cromatografica verificarea purității monitorizarea activității enzimatice Imobilizarea enzimelor
R.Blasco,P.J. Aparicio, F. Castillo, Archives of Microbiology,1995, 4,248 253 2.1. Prepararea extractului 2. Purificarea și caracterizarea enzimelor Alegerea sursei plante microorganisme tutun muscată Spanac nitroreductaza Procariote (archea, eubacterii) Eucariote Drojdii Fungi ciuperci tirozinaza E.Wilson,Spinach enzyme break down explosives, Chem. Eng. News, 1998, 76 (33),40
2.1. Alegerea sursei Organism model în biologia plantelor genom mic 114.5 Mb/125 Mb total 5 cormozomi Alegerea sursei http://oregonstate.edu/ plante Arabidopsis thaliana glicozil transferaza origine animală Tehnologia ADN-ului recombinat bacterii, fungi Ficat de porc esteraza Ficat de cal Alcool dehidrogenaza
2.1. Alegerea sursei Organisme marine superioare (mușchi) macrou Atka http://fishes-images.blogspot.ro/ creveți Botan http://wdfw.wa.gov/fishing crap http://www.iowadnr.gov/ transglutaminaza păstrăv curcubeu scoici Saint-Jacques http://www.dpi.nsw.gov.au/ http://barnegatshellfish.org/ Kevin Ahern's Biochemistry
2.1. Alegerea sursei Organisme marine superioare proteaze Crab de noroi http://www.sea-ex.com/ sardină pion portocaliu http://www.fao.org/figis/ doradă http://www.seafoodsource.com/ calcan http://www.fooduniversity.com/ amilază Pește roșu de adîncime http://www.bim.ie/media/bim/
chimotripsina 2.1. Alegerea sursei Organisme marine superioare cod atlantic http://blog.turners-seafood.com/ Rac de râu http://www.river2seausa.com/ crevete alb http://oceana.org/marine-life/ Bacterii asociate cu bureți marini (act. extracelulară) capelinul arctic http://nergard.no/sites/ pepsină Bureți marini http://www.sciencewithmyrt.com/ A.Feby, S. Nair, AdvBiosciBiotech, 2010, 1,330-337 bacterii heterotrofe (apa de mare)
2.1. Surse de enzime din plante/animale utilizate în tehnologiile alimentare Enzima Sursa Actiunea asupra alimentelor -amilaza Semnițele cerealelor (grâu, orz) Hidroliza amidonului la oligozaharide -amilaza Cartofii dulci Hidroliza amidonului la maltoza papaina bromelaina Latexul necopt al fructului de papaya Tulpina sau sucul de ananas Hidroliza proteinelor alimentare sau din industria alcoolului Hidroliza proteinelor musculare sau din țesutul conjunctiv Aplicații În industria alimentară Fabricarea pâinii Fabricarea berii Fabricarea siropului din malț Frăgezirea cărnii, prevenirea tulburării berii Frăgezirea cărnii ficina latexul smochinelor Asemeni bromelainei Asemeni papainei și bromelainei Cost mare de producție
2.1. Surse de enzime din plante/animale utilizate în tehnologiile alimentare Enzima Sursa Actiunea asupra alimentelor Tripsina Pancreas bovin/porcin Hidroliza proteinelor alimentare Aplicații În industria alimentară Producerea de hidrolizate pentru aromatizarea mâncării (înlocuiește proteinazele microbiene) Chimozina Stomacul vițeilor Hidroliza k-caseinei Coagularea laptelui în industria brânzeturilor Pepsina Stomacul bovinelor Asemeni chimozinei și hidroliza generală a caseinelor din lapte Lipaza Esterază Laringele caprelor sau mieilor Hidroliza trigliceridelor Lipoxigenaza Soia Oxidarea acizilor grași nesaturați din făinuri Se găsește alaturi de chimozină în cheag Intensificarea aromelor în brânzeturi: modificarea funcțiilor grăsimilor prin transesterificare Îmbunătățire a aluatului de pâine
2.1. Surse de enzime din plante/animale utilizate în tehnologiile alimentare Enzima Sursa Actiunea asupra alimentelor Lizozima Albușul de ou Hidroliza peretelui polizaharidic al celulei bacteriene Lactoperoxidaza Zer-stomacul bovinelor tinere Oxidarea tiocianatului la hipotiocianat (OSCN - ) Aplicații În industria alimentară Prevenirea defectelor de umflare din brânză de către bacterii care formează spori Sterilizarea la rece a laptelui Localizarea enzimelor - enzime solubilizate în diferite lichide biologice (sânge, urină, lichid cerebrospinal, citoplasmă, mediu cultură microbiană); - enzime fixate pe diverse structuri tisulare și subcelulare
Markeri enzimatici Localizare într-o formațiune subcelulară
2.1. Surse de enzime - microorganismele biology-igcse.weebly.com Invertaza Intracelulară Saccharomyces β-galactozidaza Intracelulară drojdie Extracelulară Candida și Streptomyces Extracelulară mucegaiuri
2.2. Metode de separare fizică / concentrare ultrasonicarea Ruperea membranelor celulare Omogenizarea extractului cicli inghetare-dezghetare distrugerea enzimatica a membranei celulare
2.2. Metode de separare fizică / concentrare ultrasonicare celulele procariote eucariote țesuturi animale zgomotoasă reproductibilitatea (denaturare)
2.2. Metode de separare fizică / concentrare presa franceza Omogenizatorul Manton-Gaulin celulele bacteriene P = 20.000 psi (1360 atm) V min = 40mL samples scumpă zgomotoasă timp îndelungat funcționare/curățare http://slideplayer.com/
2.2. Prepararea extractului cicli inghetare-dezghetare distrugerea membranei celulare - Utilizarea lizozimului - Utilizarea detergentilor joy-of-bioprocess.blogspot.com celulele bacteriene animale + ieftină reproductibilitatea (denaturare) www.plospathogens.org
A. Precipitarea la ph = pi Papaina (papaia) pi = 8,85 Ureaza (fasole) pi = 5-5,1 (1) subtilizină Carlsberg (2) enzimă din Bacillus sușa (3) enzimă din Bacillus sp. (4) enzimă din Bacillus sp. filmus (5) enzimă din Bacillus firmus (6) enzimă din Bacillus sacchariticus EP0220921A3
B. Precipitarea cu (NH 4 ) 2 SO 4 Precipitarea fracțiunilor care contin HSA a) Inainte de adaugarea sarii; b) Suspensie de precipitat proteic in solutie 85% de sulfat de amoniu; c) Precipitat proteic - centrifugare 60 min la 5000 rpm. precipitat Precipitarea extractului de cucumisină (serin protează din pepene galben) Gagaoua M, Hafid K (2016) Three Phase Partitioning System, an Emerging Non- Chromatographic Tool for Proteolytic Enzymes Recovery and Purification. Biosens J, 5:134 doi:10.4172/2090-4967.1000134
B. Precipitarea cu NH 4 (SO 4 ) 2
C. Precipitarea cu PEG M C, Madhusudhan, Kv, Raghavarao & Nene, Sanjay. (2008). Integrated process for extraction and purification of alcohol dehydrogenase from Baker s yeast involving precipitation and aqueous two phase extraction. Biochemical Engineering Journal. 38. 414-420.
D. Precipitarea cu solventi organici Acetona Kalikreina urinară porcină fracționare cu 50-75 % acetonă Tschesche H., Mair G., Förg-Brey B., Fritz H. (1976) Isolation of Procine Urinary Kallikrein. In: Sicuteri F., Back N., Haberland G.L. (eds) Kinins. Advances in Experimental Medicine and Biology, vol 70. Springer, Boston, MA EtOH M. A. Mariño, S. Freitas and E. A. Miranda, Brazilian Journal of Chemical Engineering, 32, 02, 325-333, 2015
1.3. Dializa Amestec supus dializei difuzie A enzima B Sac de dializa Molecule mici Solutie tampon
Saci de dializa (esteri celuloza) http://static.coleparmer.com/ http://www.spectrumlabs.com/ https://www.thermofisher.com/ https://www.thermofisher.com/
https://www.gbiosciences.com https://schoolworkhelper.net/
Ultrafiltrarea 2. Purificarea și caracterizarea enzimelor Membrane semipermeabile - Acetat de celuloza - Nylon - polivinilidena N 2 (presiune) Mai rapida decat dializa Concentrarea probei Solutia de enzimă supusa concentrarii Sticla sinterizata Magnet pentru agitare Membrana http://www.sigmaaldrich.com/ Agitator magnetic Ultrafiltrat
Ultrafiltrarea Membrane semipermeabile/centrifugare http://www.emdmillipore.com/ Membrane semipermeabile -presiunewww.ebay.tv www.fishersci.com
Centrifugarea Precede operatii sonicare precipitare r Separarea M forma densitate natura solventului Viteze mici < 6000 rpm Particule mai mari nucleu celulele roșii
Centrifugarea m 0 (1 v ) 2 r = fv = f dr dt Viteza de sedimentare v = dr dt = m 0 (1 v ) 2 r Coeficientul de sedimentare f s = v 2 r = m 0 (1 v ) f
Ultracentrifugarea Viteze mari > 20000 rpm Organite celulare mitocondrii reticulul endoplasmatic 1 Svedberg = 1S = 1 x 10-13 s Hemoglobina 4,5 S Mioglobina 1,8 S
Ultracentrifugarea 2. Purificarea și caracterizarea enzimelor http://image.slidesharecdn.com/ http://www.biologydiscussion.com/ http://www.visionlearning.com/
Ultracentrifugarea 2. Purificarea și caracterizarea enzimelor https://www.slideserve.com/nira
Diferențe între ser și plasmă anticoagulant