Κωδικός Προϊόντος: ,

Transcript

1 QUANTA Lite aps/pt IgG ELISA (αντι-φωσφατιδυλσερίνη και προθρομβίνη) QUANTA Lite aps/pt IgM ELISA (αντι-φωσφατιδυλσερίνη και προθρομβίνη) Για In Vitro διαγνωστική χρήση Πολυπλοκότητα κατά CLIA: Υψηλή Κωδικός Προϊόντος: , Σκοπός χρήσης Τα κιτ QUANTA Lite aps/pt IgG ή/και QUANTA Lite aps/pt IgM είναι ημιποσοτικές και ποιοτικές ενζυμικές ανοσοπροσροφητικές αναλύσεις (ELISA) για την ανίχνευση των αντισωμάτων τάξης IgG και IgM στο σύμπλοκο φωσφατιδυλσερίνης/προθρομβίνης (PS/PT) στον ορό ή το πλάσμα. Για χρήση ως βοηθήματα στη διάγνωση ορισμένων αυτοάνοσων θρομβωτικών διαταραχών, όπως το αντιφωσφολιπιδικό σύνδρομο (APS) και εκείνες που είναι δευτερεύουσες στο συστηματικό ερυθηματώδη λύκο ή άλλες παρόμοιες με το λύκο διαταραχές, σε συνδυασμό με άλλα εργαστηριακά και κλινικά ευρήματα. Περίληψη και επεξήγηση της δοκιμασίας Τα αντισώματα αντιφωσφολιπιδίων (apl) αντιπροσωπεύουν μια μεγάλη ομάδα ανοσοσφαιρινών μεγάλης κλινικής σημασίας λόγω της σχέσης τους με την αρτηριακή ή/και τη φλεβική θρόμβωση, την επαναλαμβανόμενη διακοπή κύησης, τις νευρολογικές διαταραχές, την πνευμονική αρτηριακή υπέρταση και τη θρομβοπενία. 1 Τα αντισώματα έναντι αντικαρδιολιπινών (ACA) που ανιχνεύονται από την ανάλυση ELISA και τα κύτταρα λύκου (LA) που ανιχνεύονται από τις δοκιμασίες πήξεως αποτελούν τις πάγιες και πιο τυποποιημένες δοκιμασίες για τη διάγνωση του αντιφωσφολιπιδικού συνδρόμου (APS). Η οικογένεια των apl έχει επεκταθεί πρόσφατα, ώστε να συμπεριλάβει μια ετερογενή ομάδα αυτοαντισωμάτων, η ειδικότητα των οποίων κατευθύνεται έναντι των πρωτεϊνών δέσμευσης φωσφολιπιδίων ή προς το σύμπλοκό τους με τα φωσφολιπίδια. 2-5 Μεταξύ των πρωτεϊνών δέσμευσης φωσφολιπιδίων, εκείνη που έχει μελετηθεί καλύτερα είναι η β 2 -γλυκοπρωτεΐνη I (β 2 GPI). Η β 2 GPI παράγει τους κρυπτικούς επίτοπους για τη δέσμευση των ACA που εμφανίζονται, όταν η β 2 GPI δεσμεύεται σε αρνητικά φορτισμένα φωσφολιπίδια, όπως η καρδιολιπίνη, ή ακινητοποιούνται σε ακτινοβολημένες πλαστικές πλάκες ELISA. 6 Αρκετές μελέτες έχουν επισημάνει τη σπουδαιότητα και την υψηλότερη ειδικότητα 7-11 της ανάλυσης του αντισώματος αντι-β 2 GPI από την ELISA ως εναλλακτική ανάλυση σε σχέση με τη συμβατική ανάλυση ELISA ACA και αυτή η μέθοδος έχει γίνει αποδεκτή από την κλινική κοινότητα. Η προθρομβίνη (Παράγοντας II) είναι μια άλλη πρωτεΐνη δέσμευσης φωσφολιπιδίων με μοριακό βάρος , που εμφανίζεται σε φυσιολογικό πλάσμα σε συγκέντρωση περίπου 2,5μmol/L. Η προθρομβίνη αναπτύσσει μια προπηκτική δραστηριότητα μέσω ενός συμπλόκου προθρομβινάσης, ενεργοποιώντας τη μετατροπή του ινωδογόνου σε ινώδες. 12 Έχει αποδειχτεί ότι τα LA κατευθύνονται έναντι πολλών πρωτεϊνών πλάσματος, συμπεριλαμβανομένης της β 2 GPI και της προθρομβίνης. 13,15 Το 1995, ο Arvieux κ.α. 16 κατέδειξαν ότι τα apt μπορούν να ανιχνευτούν από τη μέθοδο ELISA σε θετικά δείγματα κυττάρων λύκου (LA) με τη χρήση ακτινοβολημένων πλακών χρησιμοποιώντας παρόμοιο τρόπο με την ανάλυση αντιβ 2 GPI. Υπέθεσαν την εξής αναλογία με την αντι-β 2 GPI: Τα apt θα μπορούσαν να αναγνωρίσουν κρυπτικούς επίτοπους ή νεοεπίτοπους που δημιουργούνται, όταν η προθρομβίνη αλληλεπιδρά με ανιονικές τασιενεργές ουσίες. Υπάρχουν κάποιες αναφορές που αφορούν τον επιπολασμό των apt σε ασθενείς με αντιφωσφολιπιδικά αντισώματα (apl). Ο Arvieux κ.α. 16 ανέφεραν έναν επιπολασμό της τάξης του 55,4% σε ασθενείς θετικούς στα LA. Ο Galli κ.α. 17 εντόπισαν apt σε ποσοστό 58% των ασθενών που έπασχαν από APS. O Petri κ.α. ανέφεραν αρχικά ότι τα apt είχαν πιθανή προγνωστική αξία για τα θρομβωτικά επεισόδια σε 100 ασθενείς που έπασχαν από ΣΕΛ. 18 Ο Horbach κ.α. 19 ερεύνησαν την κλινική σπουδαιότητα των apt σε175 ασθενείς που έπασχαν από ΣΕΛ και βρήκαν ότι τόσο τα apt IgG όσο και τα apt IgM εντοπίζονταν συχνότερα σε ασθενείς με ιστορικό θρόμβωσης και σχετίζονταν με τη φλεβική και όχι με την αρτηριακή θρόμβωση. Οι τίτλοι των apt IgM ήταν σημαντικά υψηλότεροι σε ασθενείς που έπασχαν από θρόμβωση σε σχέση με τους ασθενείς που δεν έπασχαν από θρόμβωση, ενώ δεν υπήρχαν διαφορές στους τίτλους των apt IgG μεταξύ των δύο ομάδων. Ο Vaarala κ.α. 20 κατέδειξαν μια προβλεπόμενη τιμή αύξησης της τάξης του 2,5-άκις του κινδύνου εμφράγματος του μυοκαρδίου ή του καρδιακού θανάτου σε μεσήλικες άνδρες με υψηλά επίπεδα apt. Η σχέση μεταξύ των apt και των LA έχει μελετηθεί ευρέως. Το 1988, ο Fleck κ.α. 21 κατέδειξαν ότι τα apt παρουσίαζαν δραστηριότητα LA. Έχει αποδειχτεί, επίσης, ότι τα αντισώματα που είναι υπεύθυνα για τη δραστηριότητα LA δεσμεύονται στην προθρομβίνη σε ορισμένες πειραματικές συνθήκες. 14,22 Επιπλέον, ο Bevers κ.α. 14 κατέδειξαν ότι η προθρομβίνη ήταν απαραίτητη για τον καθορισμό της δραστηριότητας LA σε θετικά δείγματα πλάσματος LA με μειωμένα κατά 11/16 ACA υποδηλώνοντας ότι τουλάχιστον το 69% της δραστηριότητας LA εξαρτάται από αντισώματα δέσμευσης προθρομβίνης. Ο μηχανισμός με τον οποίο δρουν αυτά τα αντισώματα παραμένει ασαφής. 'Έχει θεωρηθεί ότι τα apt αναστέλλουν την απελευθέρωση προστακυκλίνης ενδοθηλιακών κυττάρων μέσω θρομβίνης και ότι τα apt αναστέλλουν την ενεργοποίηση της πρωτεΐνης C. 2 Πρόσφατα έχει θεωρηθεί ότι η προθρομβίνη δεσμεύεται σε ανιονικά φωσφολιπίδια που εκτίθενται στα ενδοθηλιακά κύτταρα και ότι τα apt ενεργοποιούν τα ενδοθηλιακά κύτταρα και φέρουν προπηκτικές ουσίες μέσω της προθρομβίνης. 23 Ο Bertolaccini κ.α. 24 εξέτασαν την παρουσία των apt IgG και IgM μέσω της μεθόδου ELISA σε ασθενείς που έπασχαν από ΣΕΛ. Αυτά τα αντισώματα εντοπίστηκαν σε ποσοστό 28% των ασθενών που έπασχαν από ΣΕΛ, με ποσοστό 18% θετικών ασθενών σε IgG και 14% θετικών ασθενών σε IgM, ενώ 4% των ασθενών βρέθηκαν θετικοί τόσο σε IgG όσο και IgM. Αυτή η ομάδα ανέφερε την ύπαρξη συσχέτισης μεταξύ της παρουσίας των apt και της εμφάνισης αγγειακών επεισοδίων, καθώς ποσοστό 53% των ασθενών που έπασχαν από ΣΕΛ και στους οποίους βρέθηκαν apt, είχαν ιστορικό θρομβωτικού επεισοδίου. Αυτή η μελέτη 24 ανέφερε, επίσης, την ύπαρξη συσχέτισης μεταξύ των apt και της παρουσίας αντισωμάτων ACA και αντι-β 2 GPI, αν και οι συντάκτες δηλώνουν ότι η μέθοδος apt ELISA δεν πρέπει να θεωρείται ως υποκατάστατο των συμβατικών αναλύσεων LA, ACA ή β 2 GPI. Τα τελευταία χρόνια έχει δημιουργηθεί μια σαφέστερη εικόνα όσον αφορά την κλινική συνάφεια των αντισωμάτων apt. Είναι γνωστό πλέον ότι τα αντισώματα σχετίζονται σε μεγάλο βαθμό με το αντιφωσφολιπιδικό σύνδρομο και τα LA στην πραγματικότητα κατευθύνονται σε ένα σύμπλοκο ανιονικών φωσφολιπιδίων, όπως η φωσφατιδυλσερίνη και η προθρομβίνη (PS/PT) και όχι μόνο στην PT. Αυτά τα δεδομένα παρατίθενται σαφώς σε ένα πρόσφατο άρθρο αναθεώρησης. 25 Αρκετές μελέτες έχουν καταδείξει ότι οι αναλύσεις αντι-ps/pt παρουσιάζουν σημαντική κλινική συνάφεια και σχετίζονται σε μεγαλύτερο βαθμό με τα κλινικά χαρακτηριστικά του αντιφωσφολιπιδικού συνδρόμου και των κυττάρων λύκου

2 Αρχές της διαδικασίας Τα κιτ QUANTA Lite aps/pt (αντι-φωσφατιδυλσερίνη/προθρομβίνη) IgG και QUANTA Lite aps/pt IgM αποτελούν ενζυμικές αναλύσεις ανοσοπροδιορισμού (ELISA) για την ανίχνευση αντισωμάτων IgG και IgM σε ανθρώπινο ορό ή πλάσμα στο σύμπλοκο φωσφατιδυλσερίνης/προθρομβίνης με χρήση της τεχνικής τύπου ELISA σάντουιτς. Οι κοιλότητες της πλαστικής πλάκας μικροκοιλοτήτων επικαλύπτονται με εξευγενισμένο σύμπλοκο PS/PT και, στη συνέχεια, σταθεροποιούνται. Κατά την επώαση ο ορός που περιέχει αντισώματα PS/PT IgG ή IgM δεσμεύει την PS/PT. Η μη δεσμευμένη πρωτεΐνη αφαιρείται με πλύση και στις κοιλότητες προστίθεται σύζευγμα σημασμένο με υπεροξειδάση αγριοραπανιού (HRP) αντι-ανθρώπινου IgG ή IgM. Μετά από την επώαση το μη δεσμευμένο σύζευγμα αφαιρείται με πλύση. Στη συνέχεια, προστίθεται ένα υπόστρωμα υπεροξειδάσης, το οποίο αλλάζει χρώμα λόγω της παρουσίας του συζευγμένου ενζύμου. Μετά από τη διακοπή της ενζυμικής παραγωγής του έγχρωμου παραγώγου η παρουσία ή η απουσία του αντισώματος προθρομβίνης καθορίζεται φασματοφωτομετρικά μετρώντας και συγκρίνοντας την ένταση του χρώματος που αναπτύσσεται στις κοιλότητες του ασθενή με την ένταση μιας καμπύλης βαθμονόμησης πέντε σημείων. Αντιδραστήρια Πλάκα μικροκοιλοτήτων πολυστυρενίου ELISA επικαλυμμένη με εξευγενισμένο αντιγόνο PS/PT (12-1 x 8 κοιλότητες) με θήκη σε αλουμινένια συσκευασία που περιέχει αφυγραντικά 2. Αρνητικός Έλεγχος ELISA, 1 φιαλίδιο ρυθμιστικού διαλύματος που περιέχει συντηρητικό και ανθρώπινο ορό χωρίς IgG ανθρώπινα αντισώματα έναντι της PS/PT, προαραιωμένο 1,2mL 3. Έλεγχος aps/pt IgG ELISA, 1 φιαλίδιο ρυθμιστικού διαλύματος που περιέχει συντηρητικό και αντισώματα IgG 4. Βαθμονομητής A aps/pt IgG ELISA, 1 φιαλίδιο ρυθμιστικού διαλύματος που περιέχει συντηρητικό και αντισώματα IgG 5. Βαθμονομητής B aps/pt IgG ELISA, 1 φιαλίδιο ρυθμιστικού διαλύματος που περιέχει συντηρητικό και αντισώματα IgG 6. Βαθμονομητής C aps/pt IgG ELISA, 1 φιαλίδιο ρυθμιστικού διαλύματος που περιέχει συντηρητικό και αντισώματα IgG 7. Βαθμονομητής D aps/pt IgG ELISA, 1 φιαλίδιο ρυθμιστικού διαλύματος που περιέχει συντηρητικό και αντισώματα IgG 8. Βαθμονομητής E aps/pt IgG ELISA, 1 φιαλίδιο ρυθμιστικού διαλύματος που περιέχει συντηρητικό και αντισώματα IgG 9. HRP Σύζευγμα aps/pt IgG (αίγας), αντι-ανθρώπινο, 1 φιαλίδιο χρώματος μπλε που περιέχει ρυθμιστικό διάλυμα, σταθεροποιητές πρωτεΐνης και συντηρητικό, 10mL 10. HRP Αραιωτικό δείγματος (Sample Diluent Plus), 1 φιαλίδιο χρώματος ροζ, που περιέχει Tris ρυθμιστικό αλατούχο διάλυμα, Tween 20, ασβέστιο ς πρωτεΐνης ασβεστίου και συντηρητικό, 50mL 11. HRP Διάλυμα Πλύσης (HRP Wash Buffer Plus), 1 φιαλίδιο των 40x συμπυκνωμάτων χρώματος κόκκινου, που περιέχει Tris ρυθμιστικό αλατούχο διάλυμα, Tween 20 και ασβέστιο, 25mL. Ανατρέξτε στην ενότητα "Μέθοδος" για οδηγίες σχετικά με την αραίωση. 12. TMB Χρωμογόνο, 1 φιαλίδιο που περιέχει σταθεροποιητές, 10mL 13. HRP Διάλυμα διακοπής, 0,344M θειικό οξύ, 1 φιαλίδιο άχρωμο Ή Πλάκα μικροκοιλοτήτων πολυστυρενίου ELISA επικαλυμμένη με εξευγενισμένο αντιγόνο PS/PT (12-1 x 8 κοιλότητες) με θήκη σε αλουμινένια συσκευασία που περιέχει αφυγραντικά 2. Αρνητικός Έλεγχος ELISA, 1 φιαλίδιο ρυθμιστικού διαλύματος που περιέχει συντηρητικό και ανθρώπινο ορό χωρίς IgM ανθρώπινα αντισώματα έναντι της PS/PT, προαραιωμένο 1,2mL 3. Έλεγχος aps/pt IgM ELISA, 1 φιαλίδιο ρυθμιστικού διαλύματος που περιέχει συντηρητικό και αντισώματα ανθρώπινου IgM ορού έναντι της PS/PT, προαραιωμένο, 1,2mL 4. Βαθμονομητής A aps/pt IgM ELISA, 1 φιαλίδιο ρυθμιστικού διαλύματος που περιέχει συντηρητικό και αντισώματα IgM 5. Βαθμονομητής B aps/pt IgM ELISA, 1 φιαλίδιο ρυθμιστικού διαλύματος που περιέχει συντηρητικό και αντισώματα IgM 6. Βαθμονομητής C aps/pt IgM ELISA, 1 φιαλίδιο ρυθμιστικού διαλύματος που περιέχει συντηρητικό και αντισώματα IgM 7. Βαθμονομητής D aps/pt IgM ELISA, 1 φιαλίδιο ρυθμιστικού διαλύματος που περιέχει συντηρητικό και αντισώματα IgM 8. Βαθμονομητής E aps/pt IgM ELISA, 1 φιαλίδιο ρυθμιστικού διαλύματος που περιέχει συντηρητικό και αντισώματα IgM 9. HRP Σύζευγμα aps/pt IgM (αίγας), αντι-ανθρώπινο, 1 φιαλίδιο χρώματος πράσινο που περιέχει ρυθμιστικό διάλυμα, σταθεροποιητές πρωτεΐνης και συντηρητικό, 10mL 10. HRP Αραιωτικό δείγματος (Sample Diluent Plus), 1 φιαλίδιο χρώματος ροζ, που περιέχει Tris ρυθμιστικό αλατούχο διάλυμα, Tween 20, ασβέστιο ς πρωτεΐνης ασβεστίου και συντηρητικό, 50mL 11. HRP Διάλυμα Πλύσης (HRP Wash Buffer Plus), 1 φιαλίδιο των 40x συμπυκνωμάτων χρώματος κόκκινου, που περιέχει Tris ρυθμιστικό αλατούχο διάλυμα, Tween 20 και ασβέστιο, 25mL. Ανατρέξτε στην ενότητα "Μέθοδος" για οδηγίες σχετικά με την αραίωση. 12. TMB Χρωμογόνο, 1 φιαλίδιο που περιέχει σταθεροποιητές, 10mL 13. HRP Διάλυμα διακοπής, 0,344M θειικό οξύ, 1 φιαλίδιο άχρωμο Προειδοποιήσεις 1. ΠΡΟΕΙΔΟΠΟΙΗΣΗ: Αυτό το προϊόν περιέχει ένα χημικό (0,02% chloramphenicol) στο αραιωτικό δείγματος, στους ορούς ελέγχου, στους βαθμονομητές και στο σύζευγμα, το οποίο είναι γνωστό στην Πολιτεία της Καλιφόρνιας ότι προκαλεί καρκίνο. 2. Όλα τα αντιδραστήρια ανθρώπινης προέλευσης που χρησιμοποιούνται κατά την προετοιμασία των ελέγχων αυτού του προϊόντος έχουν ελεγχθεί και είναι αρνητικά για αντισώματα έναντι HIV, HBsAg, HCV με εγκεκριμένες από τον FDA μεθόδους. Ωστόσο, καμία μέθοδος ελέγχου δεν μπορεί να προσφέρει πλήρη διασφάλιση για την απουσία των HIV, HBV, HCV ή άλλων μολυσματικών παραγόντων. Για αυτόν το λόγο, ο Έλεγχος aps/pt ELISA, οι βαθμονομητές aps/pt ELISA και ο Αρνητικός Έλεγχος ELISA πρέπει να τυγχάνουν της ίδιας μεταχείρισης με ένα πιθανώς μολυσματικό προϊόν. 29 2

3 3. Το αζίδιο του νατρίου χρησιμοποιείται ως συντηρητικό. Το αζίδιο του νατρίου είναι δηλητήριο και δύναται να είναι τοξικό σε περίπτωση κατάποσης ή απορρόφησης μέσω του δέρματος ή των ματιών. Το αζίδιο νατρίου μπορεί να αντιδράσει με μολύβδινες ή χάλκινες σωληνώσεις με αποτέλεσμα την πρόκληση δυνητικά εκρηκτικών μεταλλικών ενώσεων αζιδίων. Ξεπλύντε τις λεκάνες απόπλυσης εάν χρησιμοποιούνται για την απόρριψη του αντιδραστηρίου, με άφθονο νερό ώστε να αποφευχθεί η συγκέντρωση των αζιδίων. 4. Το HRP σύζευγμα περιέχει μια διαλυτή δηλητηριώδη/διαβρωτική χημική ουσία, η οποία μπορεί να είναι τοξική εάν γίνει κατάποσή της σε μεγάλες ποσότητες. Για την πρόληψη πιθανών χημικών εγκαυμάτων αποφύγετε την επαφή με τα μάτια και το δέρμα. 5. Το χρωμογόνο TMB περιέχει μία ερεθιστική ουσία που μπορεί να είναι επικίνδυνη εάν εισπνευσθεί, καταποθεί ή απορροφηθεί από το δέρμα. Για τη πρόληψη τραυματισμού, αποφύγετε την εισπνοή, την κατάποση ή την επαφή με το δέρμα ή τα μάτια. 6. Το HRP διάλυμα διακοπής της αντίδρασης (Stop Solution) αποτελείται από ένα αραιωμένο διάλυμα θειικού οξέως. Αποφύγετε την έκθεση σε βάσεις, μέταλλα ή άλλα μείγματα που δύνανται να αντιδράσουν με οξέα. Το θειικό οξύ είναι δηλητήριο και διαβρωτικό και επομένως μπορεί να είναι τοξικό εάν καταποθεί. Για την πρόληψη χημικού εγκαύματος, αποφύγετε την επαφή με το δέρμα και τα μάτια. 7. Να χρησιμοποιείτε τον κατάλληλο ατομικό προστατευτικό εξοπλισμό όταν δουλεύετε με τα αντιδραστήρια που παρέχονται. 8. Αντιδραστήρια που έχουν χυθεί πρέπει να καθαρίζονται αμέσως. Τηρείτε όλους τους ομοσπονδιακούς, εθνικούς και τοπικούς περιβαλλοντικούς κανονισμούς για την απόρριψη αποβλήτων. Προφυλάξεις 1. Αυτό το προϊόν είναι για In Vitro διαγνωστική χρήση. 2. Η αντικατάσταση συστατικών με διαφορετικά από τα παρεχόμενα σε αυτό το σύστημα μπορεί να οδηγήσει σε ανακριβή αποτελέσματα. 3. Το ημιτελές ή το αναποτελεσματικό πλύσιμο και η ανεπαρκής αφαίρεση των υγρών από τις κοιλότητες των ταινιών ELISA θα προκαλέσει ενδεή ακρίβεια ή/και υψηλά ποσοστά παρασιτικών αποτελεσμάτων. 4. Η προσαρμογή αυτής της ανάλυσης για χρήση σε αυτόματο επεξεργαστή δειγμάτων και άλλων συσκευές διαχείρισης, ολική ή μερική, μπορεί να αποφέρει διαφορετικά αποτελέσματα δοκιμασίας από αυτά που αποκτώνται στη χειροκίνητη διαδικασία. Είναι ευθύνη του εκάστοτε εργαστηρίου να επιβεβαιώσει ότι οι αυτόματες διαδικασίες του αποφέρουν αποτελέσματα δοκιμασιών εντός των αποδεκτών ορίων. 5. Μια ποικιλία παραγόντων μπορεί να επηρεάσει την απόδοση της ανάλυσης. Αυτοί περιλαμβάνουν την αρχική θερμοκρασία των αντιδραστηρίων, τη θερμοκρασία του εργαστηριακού χώρου, την ακρίβεια και επαναληψιμότητα της τεχνικής του πιπεταρίσματος, την επιμελή πλύση και την αφαίρεση των διαλυμάτων από τις κοιλότητες των ταινιών ELISA, το φωτόμετρο που χρησιμοποιείται για τη μέτρηση των αποτελεσμάτων και τη διάρκεια των χρόνων επώασης κατά τη διάρκεια της ανάλυσης. Προσεκτική τήρηση της συνοχής είναι απαραίτητη για τη λήψη ορθών και επαναλήψιμων αποτελεσμάτων. 6. Συνιστάται η ακριβής τήρηση του πρωτοκόλλου. 7. Το ημιτελές επανασφράγισμα της συσκευασίας με φερμουάρ, η οποία περιέχει ταινίες μικροκοιλοτήτων και αφυγραντικά, θα οδηγήσει στον εκφυλισμό του αντιγόνου και σε ελάχιστα ποσοστά ακριβείας. 8. Μη αποδεκτές χαμηλές τιμές απορρόφησης μπορεί να παρατηρηθούν έπειτα από δύο ή περισσότερες χρήσεις από το ίδιο φιαλίδιο HRP συζεύγματος έπειτα από μια χρονική περίοδο. Είναι σημαντικό να ακολουθείτε όλες τις προτεινόμενες οδηγίες χρήσης του HRP συζεύγματος για την αποτροπή αυτού του φαινομένου. 9. Χημική μόλυνση του HRP συζεύγματος μπορεί να προέλθει από ανεπαρκή καθαρισμό ή ανεπαρκές ξέβγαλμα του εξοπλισμού ή των οργάνων. Κατάλοιπα από κοινά εργαστηριακά χημικά όπως η φορμαλίνη, η χλωρίνη, η αιθανόλη ή τα απορρυπαντικά θα προκαλέσουν εκφυλισμό του HRP συζεύγματος με το χρόνο. Ξεπλύνετε διεξοδικά όλο τον εξοπλισμό ή τα όργανα μετά τη χρήση χημικών καθαριστικών/απολυμαντικών. Συνθήκες αποθήκευσης 1. Αποθηκεύστε όλα τα αντιδραστήρια του κιτ στους 2-8 C. Να μην καταψύχονται. Τα αντιδραστήρια είναι σταθερά μέχρι την ημερομηνία λήξης, όταν η αποθήκευση και ο χειρισμός τους γίνονται σύμφωνα με τις οδηγίες. 2. Οι αχρησιμοποίητες επικαλυμμένες με αντιγόνο ταινίες μικροκοιλοτήτων πρέπει να επανασφραγίζονται στην αλουμινένια συσκευασία τους, η οποία περιέχει αφυγραντικά, και να φυλάσσονται στους 2-8 C. 3. Το αραιωμένο ρυθμιστικό διάλυμα πλύσης είναι σταθερό για μία εβδομάδα στους 2 8 C. Συλλογή δείγματος Αυτή η διαδικασία μπορεί να διεκπεραιωθεί με ένα δείγμα ορού ή πλάσματος. Η προσθήκη αζιδίου ή άλλων συντηρητικών στα δείγματα της δοκιμασίας μπορεί να επηρεάσει αρνητικά τα αποτελέσματα. Δεν πρέπει να χρησιμοποιούνται δείγματα που έχουν επιμολυνθεί με μικρόβια, έχουν υποστεί θερμική επεξεργασία ή περιέχουν ορατά σωματίδια. Έντονα αιμολυμένος ή λιπαιμικός ορός ή δείγματα πρέπει να αποφεύγονται. Το Έγγραφο CLSI (NCCLS) H18-A3 προτείνει τις παρακάτω συνθήκες αποθήκευσης των δειγμάτων: 1) Τα δείγματα πρέπει να διατηρούνται σε θερμοκρασία δωματίου όχι περισσότερο από 8 ώρες. 2) Αν η ανάλυση δεν ολοκληρωθεί εντός 8 ωρών, το δείγμα πρέπει να ψυχθεί σε θερμοκρασία 2-8 C. 3). Αν η ανάλυση δεν ολοκληρωθεί εντός 48 ωρών ή αν το δείγμα προορίζεται για αποστολή, το δείγμα πρέπει να ψυχθεί σε θερμοκρασία -20 C ή χαμηλότερη. Τα κατεψυγμένα δείγματα πρέπει να αναμιχθούν καλά μετά την απόψυξη και πριν από την εξέταση. Διαδικασία Υλικά που παρέχονται πλάκα μικροκοιλοτήτων aps/pt IgG ELISA (12-1x8 κοιλότητες) με βάση 1 προαραιωμένος Αρνητικός Έλεγχος ELISA 1,2mL 1 προαραιωμένος Έλεγχος aps/pt IgG ELISA 1,2mL 1 προαραιωμένος βαθμονομητής A aps/pt IgG ELISA 1,2mL 1 προαραιωμένος βαθμονομητής B aps/pt IgG ELISA 1,2mL 1 προαραιωμένος βαθμονομητής C aps/pt IgG ELISA 1,2mL 1 προαραιωμένος βαθμονομητής D aps/pt IgG ELISA 1,2mL 1 προαραιωμένος βαθμονομητής E aps/pt IgG ELISA 1,2mL 1 HRP Αραιωτικό Δείγματος (HRP Sample Diluent Plus) 50mL 1 HRP Διάλυμα Πλύσης (HRP Wash Buffer Plus) 25mL, 40x συμπυκνώματα 1 HRP Σύζευγμα aps/pt IgG (αίγας), αντι-ανθρώπινο IgG, 10mL 1 TMB Χρωμογόνο 10mL 1 HRP Διάλυμα διακοπής, 0,344M θειικό οξύ, 10mL Ή 3

4 πλάκα μικροκοιλοτήτων aps/pt IgM ELISA (12-1x8 κοιλότητες) με βάση 1 προαραιωμένος Αρνητικός Έλεγχος ELISA 1,2mL 1 προαραιωμένος Έλεγχος aps/pt IgM ELISA 1,2mL 1 προαραιωμένος βαθμονομητής A aps/pt IgM ELISA 1,2mL 1 προαραιωμένος βαθμονομητής B aps/pt IgM ELISA 1,2mL 1 προαραιωμένος βαθμονομητής C aps/pt IgM ELISA 1,2mL 1 προαραιωμένος βαθμονομητής D aps/pt IgM ELISA 1,2mL 1 προαραιωμένος βαθμονομητής E aps/pt IgM ELISA 1,2mL 1 HRP Αραιωτικό Δείγματος (HRP Sample Diluent Plus) 50mL 1 HRP Διάλυμα Πλύσης (HRP Wash Buffer Plus) 25mL, 40x συμπυκνώματα 1 HRP Σύζευγμα aps/pt IgM (αίγας), αντι-ανθρώπινο IgG, 10mL 1 TMB Χρωμογόνο 10mL 1 HRP Διάλυμα διακοπής, 0,344M θειικό οξύ, 10mL Υλικά που απαιτούνται αλλά δεν παρέχονται Μικροπιπέτες για παράδοση όγκου 5, 100, και 500µL Απορριπτόμενα ρύγχη για μικροπιπέτες Σωληνάρια δοκιμασίας για τη διάλυση δειγμάτων των ασθενών όγκου 4mL Απιονισμένο ή αποσταγμένο νερό Δοχείο 1L για το αραιωμένο HRP Διάλυμα Πλύσης Συσκευή ανάγνωσης πλάκας μικροκοιλοτήτων με δυνατότητα μέτρησης ΟΠ 450nm (και 620nm για ενδείξεις διπλού μήκους κύματος) Μέθοδος Πριν ξεκινήσετε 1. Επάγετε όλα τα αντιδραστήρια και τα δείγματα σε θερμοκρασία δωματίου (20-26 o C) και αναδεύστε καλά. 2. Αραιώστε το συμπυκνωμένο HRP Διάλυμα Πλύσης (HRP Wash Buffer Plus) κατά 1:40 προσθέτοντας το περιεχόμενο του φιαλιδίου συμπυκνωμένου HRP Διάλυμα Πλύσης (HRP Wash Buffer Plus) σε 975mL αποσταγμένου ή απιονισμένου νερού. Σε περίπτωση που δεν θα χρησιμοποιήσετε ολόκληρη την πλάκα εντός αυτής της περιόδου μπορείτε να ετοιμάσετε μικρότερη ποσότητα προσθέτοντας 2,0mL του συμπυκνώματος σε 78mL αποσταγμένου ή απιονισμένου νερού για κάθε 16 κοιλότητες που θα χρησιμοποιηθούν. Το αραιωμένο ρυθμιστικό διάλυμα είναι σταθερό για μια εβδομάδα στους 2 8 C. 3. Ετοιμάστε μια αραίωση 1:101 του κάθε δείγματος ασθενούς προσθέτοντας 5µL του δείγματος σε 500µL HRP αραιωτικού δείγματος (HRP Sample Diluent Plus). Τα αραιωμένα δείγματα θα πρέπει να χρησιμοποιηθούν εντός 8 ωρών από την προετοιμασία. ΝΑ ΜΗΝ ΑΡΑΙΩΝΟΝΤΑΙ οι βαθμονομητές aps/pt IgG ή IgM, ο Έλεγχος aps/pt IgG ή IgM ELISA και ο Αρνητικός Έλεγχος ELISA. 4. Ο προσδιορισμός της παρουσίας ή της απουσίας των αντισωμάτων φωσφατιδυλσερίνης/προθρομβίνης απαιτεί δύο κοιλότητες για καθέναν από τους βαθμονομητές και τους ορούς ελέγχου και μία ή δύο κοιλότητες για κάθε δείγμα ασθενούς. Συνιστάται η επανάληψη της εξέτασης των δειγμάτων. 5. Προετοιμασία της πρότυπης καμπύλης: Για τα σημεία A έως E της πρότυπης καμπύλης 5 σημείων, χρησιμοποιήστε ΠΡΟΑΡΑΙΩΜΕΝΟ βαθμονομητή A έως E aps/pt IgG ή IgM ELISA απευθείας από το φιαλίδιο. Η πρότυπη καμπύλη πέντε σημείων έχει τις ακόλουθες τιμές Σημείο PS/PT IgG ή IgM μονάδες A Προαραιωμένος βαθμονομητής A aps/pt IgG ή IgM ELISA 150,0 B Προαραιωμένος βαθμονομητής Β aps/pt IgG ή IgM ELISA 75,0 C Προαραιωμένος βαθμονομητής C aps/pt IgG ή IgM ELISA 37,5 D Προαραιωμένος βαθμονομητής D aps/pt IgG ή IgM ELISA 18,75 E Προαραιωμένος βαθμονομητής E aps/pt IgG ή IgM ELISA 9,4 Διαδικασία ανάλυσης 1. ΟΛΑ ΤΑ ΑΝΤΙΔΡΑΣΤΗΡΙΑ ΘΑ ΠΡΕΠΕΙ ΝΑ ΕΠΑΧΘΟΥΝ ΣΕ ΘΕΡΜΟΚΡΑΣΙΑ ΔΩΜΑΤΙΟΥ (20-26 C) ΠΡΙΝ ΑΠΟ ΤΗΝ ΕΝΑΡΞΗ ΤΗΣ ΑΝΑΛΥΣΗΣ. Τοποθετήστε τον απαραίτητο αριθμό μικροκοιλοτήτων/ταινιών στη βάση. Επιστρέψτε άμεσα τις αχρησιμοποίητες ταινίες στη θήκη που περιέχει αφυγραντικά και σφραγίστε ώστε να μειώσετε την έκθεση σε υδρατμούς. 2. Προσθέστε στις μικροκοιλότητες100µl από καθέναν από τους πέντε βαθμονομητές, από τα αραιωμένα δείγματα ασθενών, τον Αρνητικό Έλεγχο ELISA και τον Έλεγχο aps/pt IgG ή aps/pt IgM ELISA. ΣΗΜΕΙΩΣΗ: Οι βαθμονομητές aps/pt IgG ή aps/pt IgM, ο Έλεγχος aps/pt IgG ή aps/pt IgM ELISA και ο Αρνητικός Έλεγχος ELISA είναι προαραιωμένοι και έτοιμοι για χρήση. Καλύψτε τις κοιλότητες και επωάστε για 30 λεπτά σε θερμοκρασία δωματίου σε επίπεδη επιφάνεια. Ο χρόνος επώασης ξεκινάει με τη προσθήκη του τελευταίου δείγματος. 3. Πλύση: Ξεπλύνετε καλά κάθε κοιλότητα από τα περιεχόμενα. Προσθέστε µL αραιωμένου ρυθμιστικού διαλύματος πλύσης HRP σε όλες τις κοιλότητες και, στη συνέχεια, ξεπλύνετε. Επαναλάβετε τη διαδικασία δύο ακόμα φορές, για τρεις πλύσεις συνολικά. Αναποδογυρίστε την πλάκα και τινάξτε την σε απορροφητικό υλικό, για να αφαιρέσετε το εναπομείναν υγρό κατόπιν της τελικής πλύσης. Είναι σημαντικό κάθε κοιλότητα να είναι εντελώς άδεια μετά από κάθε πλύση. Ακολουθήστε την ίδια διαδικασία για την πλύση που χρησιμοποιήθηκε και για την προσθήκη των δειγμάτων. 4. Προσθέστε 100μL HRP συζεύγματος aps/pt IgG ή aps/pt IgM σε κάθε κοιλότητα. Το σύζευγμα πρέπει να αφαιρεθεί από τα φιαλίδια χρησιμοποιώντας τυπικές ασηπτικές συνθήκες και καλές εργαστηριακές πρακτικές. Αφαιρέστε από το φιαλίδιο μόνο την ποσότητα συζεύγματος που είναι απαραίτητη για την ανάλυση. ΠΡΟΣ ΑΠΟΦΥΓΗ ΕΝΔΕΧΟΜΕΝΗΣ ΜΙΚΡΟΒΙΟΛΟΓΙΚΗΣ Ή/ΚΑΙ ΧΗΜΙΚΗΣ ΜΟΛΥΝΣΗΣ, ΔΕΝ ΠΡΕΠΕΙ ΠΟΤΕ ΝΑ ΕΙΣΑΓΕΤΕ ΞΑΝΑ ΣΤΟ ΦΙΑΛΙΔΙΟ ΤΗΝ ΠΟΣΟΤΗΤΑ ΣΥΖΕΥΓΜΑΤΟΣ ΠΟΥ ΔΕΝ ΧΡΗΣΙΜΟΠΟΙΗΘΗΚΕ. Πραγματοποιήστε επώαση στις κοιλότητες για 30 λεπτά, όπως στο βήμα Πλύση: Επαναλάβετε το βήμα Προσθέστε 100µL TMB χρωμογόνου σε κάθε κοιλότητα και επωάστε σε θερμοκρασία δωματίου για 30 λεπτά σε σκοτεινό μέρος. 7. Προσθέστε 100µL HRP διαλύματος διακοπής αντίδρασης (Stop Solution) σε κάθε κοιλότητα. Ακολουθήστε την ίδια διαδικασία και πρόγραμμα για την προσθήκη HRP διαλύματος διακοπής της αντίδρασης (Stop Solution), όπως χρησιμοποιήθηκε για το TMB χρωμογόνο. Τινάξτε ελαφρά την πλάκα με το δάκτυλο, για να αναμιχθούν εκτενώς οι κοιλότητες. 8. Μετρήστε την απορρόφηση (ΟΠ) κάθε κοιλότητας στα 450nm εντός μίας ώρας από τη διακοπή της αντίδρασης. Εάν απαιτούνται διχρωματικές μετρήσεις, τα 620nm δύνανται να χρησιμοποιηθούν ως μήκος κύματος αναφοράς. 4

5 Έλεγχος ποιότητας 1. Οι βαθμονομητές aps/pt IgG ή aps/pt IgG IgM, ο Έλεγχος aps/pt IgG ή aps/pt IgM ELISA και ο Αρνητικός Έλεγχος ELISA θα πρέπει να χρησιμοποιηθούν για κάθε παρτίδα δειγμάτων, ώστε να διασφαλιστεί ότι όλα τα αντιδραστήρια και οι διαδικασίες αποδίδουν κατάλληλα. 2. Να σημειωθεί ότι εφόσον οι βαθμονομητές aps/pt IgG ή IgM, ο Έλεγχος aps/pt IgG ή aps/pt IgM ELISA και οι Αρνητικοί Έλεγχοι ELISΑ είναι προαραιωμένοι, δεν προβλέπουν διαδικαστικές μεθόδους σχετιζόμενες με την αραίωση των δειγμάτων. 3. Επιπλέον έλεγχοι δύναται να χρησιμοποιηθούν σύμφωνα με τις κατευθυντήριες γραμμές ή απαιτήσεις των τοπικών, πολιτειακών ή/και ομοσπονδιακών κανονισμών ή επικυρωμένων οργανισμών. Επιπλέον κατάλληλος ορός ελέγχου μπορεί να ετοιμαστεί διαιρώντας τα συγκεντρωμένα δείγματα ανθρώπινου ορού και αποθηκεύοντας τα στους < -20 C. 4. Για να είναι έγκυρα τα αποτελέσματα της δοκιμασίας, πρέπει να πληρούνται όλα τα κριτήρια που παρατίθενται παρακάτω. Εάν κάποιο από αυτά τα κριτήρια δεν πληρούται, η δοκιμασία πρέπει να θεωρηθεί άκυρη και η ανάλυση πρέπει να επαναληφθεί. α. Η απορρόφηση του προαραιωμένου βαθμονομητή A aps/pt IgG ή aps/pt IgM ELISA πρέπει να είναι υψηλότερη από την απορρόφηση του προαραιωμένου Ελέγχου aps/pt IgG ή I aps/pt gm ELISA, η οποία πρέπει να είναι υψηλότερη από την απορρόφηση του προαραιωμένου Αρνητικού Ελέγχου ELISA. β. Ο προαραιωμένος βαθμονομητής A aps/pt IgG ή I aps/pt IgM ELISA πρέπει να έχει απορρόφηση μεγαλύτερη από 1,0, ενώ η απορρόφηση του προαραιωμένου Αρνητικού Ελέγχου ELISA δεν μπορεί να είναι πάνω από 0,2. γ. Η απορρόφηση του Ελέγχου aps/pt IgG ή aps/pt IgM ELISA πρέπει να είναι τουλάχιστον κατά δύο φορές μεγαλύτερη από την απορρόφηση του Αρνητικού Έλεγχου ELISA ή πρέπει να έχει τιμή μεγαλύτερη από 0,25. δ. Η συγκέντρωση του Ελέγχου ELISA πρέπει να βρίσκεται εντός του εύρους που αναφέρεται στην ετικέτα του. ε. Ο χρήστης θα πρέπει να ανατρέξει στο Έγγραφο CLSI (NCCLS) C24-A3 για επιπρόσθετη καθοδήγηση επί των καταλλήλων πρακτικών ΠΕ. Υπολογισμός των αποτελεσμάτων 1. Καθορίστε τη μέση τιμή για όλες τις διπλές μετρήσεις. 2. Κάντε γραφική αναπαράσταση της μέσης απορρόφησης της καμπύλης βαθμονομητή για την ανάλυση IgG ή IgM σε σύγκριση με το λογάριθμο των συγκεντρώσεών τους. Χρησιμοποιήστε μια γραμμή γραφικής αναπαράστασης καμπύλης με τη βέλτιστη προσαρμογή. Μπορεί να χρησιμοποιηθεί εναλλακτικά γραφική αναπαράσταση καμπύλης/καμπύλης. Οι μονάδες PS/PT που έχουν εκχωρηθεί στους βαθμονομητές αναγράφονται στο φιαλίδιο του βαθμονομητή. 3. Καθορίστε την άγνωστη συγκέντρωση PS/PT IgG ή IgM σε μονάδες PS/PT IgG ή IgM από τον άξονα "X" μετρώντας την αντίστοιχη απορρόφηση στον άξονα "Y". 4. Οι αρνητικές τιμές κυμαίνονται ανάμεσα σε 0-30 μονάδες. Τα θετικά αποτελέσματα είναι μεγαλύτερα από 30 μονάδες. Ερμηνεία των αποτελεσμάτων Η ανάλυση ELISA είναι πολύ ευαίσθητη στην τεχνική και είναι ικανή να ανιχνεύσει ακόμα και μικρές διαφορές στον πληθυσμό των ασθενών. Οι τιμές που φαίνονται παρακάτω είναι ενδεικτικές τιμές μόνο. Κάθε εργαστήριο θα πρέπει να καθορίσει το δικό του φυσιολογικό εύρος τιμών βασισμένο πάνω στις δικές του τεχνικές, ελέγχους, εξοπλισμό και πληθυσμό ασθενών σύμφωνα με τις δικές του καθορισμένες διαδικασίες. Το δείγμα μπορεί τότε να ταξινομηθεί ως αρνητικό ή θετικό σύμφωνα με τον παρακάτω πίνακα. Μονάδες Αρνητικό 30 Θετικό > Ένα θετικό αποτέλεσμα υποδηλώνει την παρουσία αντισωμάτων PS/PT IgG ή IgM και υποδεικνύει την πιθανότητα ορισμένων αυτοάνοσων θρομβωτικών διαταραχών, όπως το APS ή εκείνες που είναι δευτερεύουσες στο συστηματικό ερυθηματώδη λύκο ή άλλες παρόμοιες με το λύκο θρομβωτικές διαταραχές. 2. Ένα αρνητικό αποτέλεσμα δηλώνει ότι δεν υπάρχει αντίσωμα PS/PT IgG ή IgM ή ότι υπάρχουν επίπεδα συγκέντρωσης κάτω από το όριο ανίχνευσης των οριακών τιμών ανάλυσης. 3. Συνιστάται η συμπερίληψη της παρακάτω δήλωσης στα αποτελέσματα που καταγράφονται από το εργαστήριο: Τα παρακάτω αποτελέσματα λήφθηκαν με την ανάλυση INOVA QUANTA Lite aps/pt IgG ή QUANTA Lite aps/pt IgM ELISA. Οι τιμές PS/PT IgG ή IgM που λήφθηκαν με μεθόδους ανάλυσης διαφορετικών κατασκευαστών δεν μπορούν να χρησιμοποιηθούν εναλλακτικά. Περιορισμοί της διαδικασίας 1. Η κλινική σπουδαιότητα των αντισωμάτων PS/PT IgG ή IgM σε ασθένειες εκτός του ΣΕΛ ή του APS δεν έχει πιστοποιηθεί. 2. Όταν εντοπιστούν αρνητικοί τίτλοι PS/PT IgG ή IgM παρουσία των κλινικών ενδείξεων, ίσως χρειαστεί δοκιμασία για κύτταρα λύκου, αντικαρδιολιπίνη, αντι-β 2 ή άλλη πρόσθετη δοκιμασία. 3. Δεν μπορεί να πραγματοποιηθεί διάγνωση μόνο βάσει των αποτελεσμάτων PS/PT IgG ή IgM. Αυτά τα αποτελέσματα πρέπει να ερμηνεύονται σε συνδυασμό με φυσικά ευρήματα. 4. Δεν πρέπει να ξεκινήσει θεραπεία μόνο λόγω της ύπαρξης ενός θετικού τίτλου PS/PT IgG ή IgM. Πρέπει επίσης να υπάρχουν υποστηρικτικές κλινικές ενδείξεις. 5. Αναμένεται ότι μερικά δείγματα είναι δυνατόν να βρεθούν θετικά σε αντικαρδιολιπίνη ή/και αντι-β 2 GPI, αλλά αρνητικά σε PS/PT IgG ή IgM. Η δοκιμασία αντι-β 2 GPI αποτελεί έναν ειδικό δείκτη του κινδύνου θρόμβωσης. Η δοκιμασία αντικαρδιολιπίνης μπορεί να παράγει ψευδή θετικά αποτελέσματα λόγω της διασταυρούμενης αντιδραστικότητας της με το dsdna ή τα αντισώματα συγκεκριμένων μολυσματικών νόσων. Ομοίως, ασθενείς που πάσχουν από APS μπορούν να βρεθούν θετικοί σε PS/PT, αλλά αρνητικοί σε κύτταρα λύκου, αντικαρδιολιπίνη ή αντι-β Τα χαρακτηριστικά επιδόσεων της ανάλυσης δεν έχουν διαπιστωθεί για μεσοκυττάριες ουσίες εκτός του ορού και του πλάσματος. 7. Αυτές οι αναλύσεις προορίζονται για In Vitro χρήση. 5

6 Ειδικά χαρακτηριστικά απόδοσης και κλινικές μελέτες Σύνοψη κλινικών μελετών Η απόδοση των κιτ QUANTA Lite aps/pt IgG και QUANTA Lite aps/pt IgM εκτιμήθηκε σε μία εξωτερική και μία εσωτερική μελέτη. Παρακάτω παρουσιάζονται συνδυασμένα αποτελέσματα. Αριθμός θετικών (%) Ομάδα ασθενών Αρ. δειγμάτων PS/PT IgG PS/PT IgM IgG ή/και IgM Φυσιολογικοί (1,2%) 4 (1,6%) 7 (2,8%) Κύτταρα λύκου Θετικοί (LAC) (87,5%) 19 (79,2%) 24 (100%) Αντιφωσφολιπιδικό σύνδρομο (APS) (46,5%) 34 (47,9%) 48 (67,6%) Ρευματοειδής αρθρίτιδα Νόσος του Crohn Ελκώδης κολίτιδα Κοιλιοκάκη Αρνητικοί σε LAC (12,5%) 1 (12,5%) Αριθμός θετικών (%) Μολυσματική νόσος (CMV, τοξοπλάσμωση, ερυθρά, HSV, HBV, HCV) Σύφιλη Θετικοί σε αντισώματα ακτίνης H. pylori Η συνδυασμένη χρήση των PS/PT IgG και IgM εντόπισε και τα 24 γνωστά θετικά δείγματα κυττάρων λύκου καθώς και ποσοστό 67,6% των ασθενών που έπασχαν από APS. Μόνο 3 από τα 247 φυσιολογικά δείγματα και μηδέν από τους άλλους 52 ελέγχους ασθενειών πιστοποιήθηκαν ως θετικοί στο κιτ IgG για ειδικότητα της τάξης του 99% (3/299). Μόνο 4 από τα 247 φυσιολογικά δείγματα και 1 από τους άλλους 52 δότες ορού ελέγχου πιστοποιήθηκαν ως θετικοί στο κιτ IgM για ειδικότητα της τάξης του 98,3% (5/299). Κλινική συμφωνία με τη β₂ GPI Έγινε σύγκριση των κιτ QUANTA Lite aps/pt IgG και QUANTA Lite IgM με τις εγκεκριμένες αναλύσεις 510(k) για την ανίχνευση β 2 GPI IgG και β 2 GPI IgM. Τα δείγματα που ελέγχθηκαν περιλάμβαναν 71 ασθενείς που έπασχαν από APS, 24 ασθενείς θετικούς σε κύτταρα λύκου και 85 φυσιολογικούς από ένα σύνολο 180 δειγμάτων. Τα αποτελέσματα συνοψίζονται παρακάτω. IgG aps/pt + - IgG ** β 2 GPI - 16* 116 *Ένα από τα 16 δείγματα ήταν θετικό σε LAC και τα υπόλοιπα 15 αφορούσαν ασθενείς που έπασχαν από APS **Και τα δέκα δείγματα προέρχονταν από την ομάδα ασθενών που έπασχαν από APS IgM aps/pt + - IgM * β 2 GPI - 25** 120 *Ένα από αυτά τα δείγματα ήταν φυσιολογικό και 6 προέρχονταν από την ομάδα ασθενών που έπασχαν από APS **Είκοσι δύο δείγματα ήταν θετικά σε APS και 3 ήταν θετικά σε LAC Η συνολική συμφωνία αφενός του κιτ PS/PT IgG και αφετέρου του IgM με τα κιτ β 2 GPI είναι 85,6% και 82,2%. Τα περισσότερα από τα ασύμβατα αποτελέσματα οφείλονται στην υψηλότερη ευαισθησία των κιτ PS/PT IgG και IgM για τα θετικά δείγματα σε LAC και κυρίως για τους ασθενείς που έπασχαν από APS, αν και υπήρχαν ασθενείς με APS, οι οποίοι βρέθηκαν θετικοί σε β₂ GPI αλλά αρνητικοί σε PS/PT. Τα κιτ PS/PT IgG και IgM εντόπισαν όλα τα θετικά σε LAC δείγματα καθώς και τους περισσότερους από τους ασθενείς που έπασχαν από APS. Παρατηρήθηκε ότι η πλειοψηφία των ασθενών που έπασχαν από APS ήταν θετική σε PS/PT ή/και σε β 2 GPI. Σύγκριση μεθόδων Έγινε σύγκριση των κιτ aps/pt IgG και aps/pt IgM με τα κιτ β₂ GPI IgG και β₂ GPI IgM με χρήση 62 δειγμάτων συνολικά για τη σύγκριση των κιτ IgG και 63 δειγμάτων για τη σύγκριση των κιτ IgM. Τα δείγματα που επιλέχθηκαν απέδωσαν τιμές εντός του γραμμικού εύρους της ανάλυσης. Τα αποτελέσματα εμφανίζονται παρακάτω με υπολογισμό των θετικών και αρνητικών δειγμάτων καθώς και των σχετικών συμφωνιών. IgG aps/pt ELISA Θετικά Αρνητικά Σύνολο IgG ß 2 GPI ELISA Θετικά Αρνητικά Σύνολο Ποσοστό συμφωνίας θετικών 65% Ποσοστό συμφωνίας αρνητικών 83,7% Σχετική συμφωνία 77,8% 6

7 IgM aps/pt ELISA Θετικά Αρνητικά Σύνολο IgG ß 2 GPI ELISA Θετικά Αρνητικά Σύνολο Ποσοστό συμφωνίας θετικών 81,3% Ποσοστό συμφωνίας αρνητικών 76,6% Σχετική συμφωνία 77,8% Ακρίβεια και επαναληψιμότητα Σε έξι διαφορετικές ημέρες ελέγχθηκαν οχτώ δείγματα σε έξι αντίγραφα με τη μέθοδο aps/pt IgG ELISA. Συνολικός αρ.= 36. Παρακάτω συνοψίζονται τα αποτελέσματα τιμής μονάδας. Τιμή μονάδων IgG 1,4 139,3 79,3 36,8 22,2 8,3 53,8 1,7 Τυπική απόκλιση εντός της ανάλυσης 0,1 6,8 4,9 2,5 1,7 0,8 3,4 0,1 %CV 8,1 4,9 6,2 6,7 7,8 9,9 6,4 7,1 Τυπική απόκλιση μεταξύ των αναλύσεων 0,2 4,2 3,3 1,6 1,2 0,4 2,3 0,1 %CV 12,0 3,0 4,2 4,5 5,3 5,2 4,2 8,3 Στις ίδιες έξι ημέρες ελέγχθηκαν οχτώ άλλα δείγματα σε έξι αντίγραφα με τη μέθοδο aps/pt IgM ELISA. Συνολικός αρ.= 36. Παρακάτω συνοψίζονται τα αποτελέσματα τιμής μονάδας. Τιμή μονάδων IgΜ 3,1 153,2 75,8 36,0 18,2 9,8 58,2 3,2 Τυπική απόκλιση εντός της ανάλυσης 0,2 5,9 3,3 1,7 0,7 0,6 2,6 0,2 %CV 5,8 3,8 4,4 4,6 3,8 6,3 4,5 6,4 Τυπική απόκλιση μεταξύ των αναλύσεων 0,3 4,3 2,4 1,1 0,5 0,4 2,1 0,2 %CV 9,9 2,8 3,2 3,0 2,6 3,8 3,6 7,4 Γραμμικό εύρος aps/pt IgG: 5,1-150 μονάδες aps/pt IgM: 3,6-150 μονάδες Για δείγματα με τιμές που ξεπερνούν τις 150 μονάδες, το αποτέλεσμα αναφέρεται ως >150 μονάδων ή θετικό. Για δείγματα με τιμές κατώτερες των 5,1 μονάδων για IgG ή κατώτερες των 3,6 μονάδων για IgM, το αποτέλεσμα αναφέρεται ως <5,1 ή <3,6 ή αρνητικό. QUANTA Lite είναι σήμα κατατεθέν της INOVA Diagnostics, Inc Copyright 2010 All Rights Reserved 7

8 Βιβλιογραφία 1. Hughes GRV. The antiphospholipid syndrome: ten years on. Lancet 342:341-4, Roubey R. Autoantibodies to Phospholipid-Binding Plasma Proteins: A New View of Lupus Anticoagulant and Other Antiphospholipid Antibodies. Blood 84: , McNeil HP, et al. Anti-phospholipid antibodies are directed against a complex antigen that includes a lipidbinding inhibitor of coagulation: beta 2-glycoprotein I (apolipoprotein H). Proc Natl Acad Sci USA 87:4120-4, Galli M, et al. Anticardiolipin antibodies (ACA) directed not to cardiolipin but to a plasma protein cofactor. Lancet 335:1544-7, Matsuura E, et al. Anticardiolipin cofactor(s) and differential diagnosis of autoimmune disease. 6. Matsuura E, et al. Anticardiolipin antibodies recognize β2-glycoprotein I structure altered by interacting with oxygen modified solid phase surface. J Exp. Med. 179:457-62, Roubey RA, et al. Comparison of an enzyme-linked immunosorbent assay for antibodies to β2 Glycoprotein I and a conventional anticardiolipin immunoassay. Arthritis Rheum 39:1606-7, McNally T, et al. Increased levels of β2 Glycoprotein I antigen and β2 Glycoprotein I binding antibodies are associated with a history of thromboembolic complications in patients with SLE and primary antiphospholipid syndrome. Br J Rheumatol 34:1031-6, Teixido M, et al. Anti β2 Glycoprotein I antibodies: a useful marker for the antiphospholipid syndrome. Br J Rheumatol 36:113-6, Amengual O, et al. Specificity of ELISA for antibody to β2 Glycoprotein I in patients with antiphospholipid syndrome. Br J Rheumatol 35: , Lewis S, et al. Standardized measurement of major immunoglobulin class (IgG, IgA and IgM) antibodies to β2 Glycoprotein I in patients with antiphospholipid syndrome. J Clin Lab Analysis 12:293-97, Mann KG, et al. Surface-dependent reactions of the vitamin K-dependent enzyme complexes. Blood 76:1-16, Galli M, et al. Kaolin clotting time and dilute Russell s viper venom time distinguish between prothrombindependent and β2 glycoprotein I-dependent antiphospholipid antibodies. Blood 86:617-23, Bevers EM, et al. Lupus anticoagulant IgG s (LA) are not directed to phospholipids only, but to a complex of lipid bound human prothrombin. Thromb Haemost 66:629-32, Perpimkul P, et al. Functional and binding studies of the roles of prothrombin and β2 Glycoprotein I in the expression of lupus anticoagulant activity. Blood 83: , Arvieux J, et al. Development of an ELISA for autoantibodies to prothrombin showing their prevalence in patients with Lupus Anticoagulant. Thromb Haemost 74:1120-5, Galli M. Non β2-glycoprotein I cofactors for antiphospholipid antibodies. Lupus 5:388-92, Petri M, et al. Anti-plasma protein antibodies are predictive of thrombotic events (TE). Arthritis Rheum 37:S 281, Horbach D, et al. Lupus anticoagulant is the strongest risk factor for both venous and arterial thrombosis in patients with systemic lupus erythematosus. Thromb Haemost 76:916-24, Vaarala O, et al. Antibodies to prothrombin imply a risk of myocardial infarction in middle-aged men. Thromb Haemost 75:456-9, Fleck RA, et al. Anti-prothrombin antibodies and the Lupus Anticoagulant. Blood 72:512-9, Oosting JD, et al. Antiphospholipid antibodies directed against a combination of phospholipids with Prothrombin, Protein C, or Protein S: an explanation for their pathogenic mechanism?. Blood 81: , Arnout J. The pathogenesis of the antiphospholipid syndrome: a hypothesis based on parallelisms with heparin-induced thrombocytopenia. Thromb Haemost 75:536-41, Bertolaccini M, et al. Autoantibodies to human prothrombin and clinical manifestations in 207 patients with systemic lupus erythematosus. J Rheumatol 25: , Amengual O, et al. Specificities, properties and clinical significance of antiprothrombin antibodies. Arthritis Rheum 48:886-95, D Agnillo P, et al. Prothrombin binds to the surface of apototic, but not viable cells and serves as a target of Lupus Anticoagulant antibodies. J of Immunol 170: , Atsumi T. et al. Association of autoantibodies against the phosphatidylserine-prothrombin complex with manifestations of the antiphospholipid syndrome and with presence of lupus anticoagulant. Arthiritis Rheum 43: , Atsumi T. Antiprothrombin antibodies are they worth assaying? Thrombosis Research 114: , Biosafety in Microbiological and Biomedical Laboratories. Centers for Disease Control and Prevention/National Institutes of Health, Fifth Edition,

9 Κατασκευαστής: INOVA Diagnostics, Inc Old Grove Road San Diego, CA United States of America Technical Service (U.S. & Canada Only) : Technical Service (Outside the U.S.) : support@inovadx.com Aντιπροσωπευτικός: Medical Technology Promedt Consulting GmbH Altenhofstrasse 80 D St. Ingbert, Germany Tel.: Fax.: GRC December 2010 Revision 0 9