QUANTA Lite TM M Για In Vitro Διαγνωστική Χρήση CLIA σύνθετος: ψηλός

Transcript

1 QUANTA Lite TM M Για In Vitro Διαγνωστική Χρήση CLIA σύνθετος: ψηλός Σκοπό Χρήση Το QUANTA Lite TM M2 EP (MIT3) αποτελεί μια ανοσοπορροφητική ανάλυση συνδεδεμένη με ένζυμο (ELISA) για τον ημιποσοτικό εντοπισμό αντισωμάτων IgG έναντι Αντιμιτοχόνδρια σε ανθρώπινο ορό. Η παρουσία των αντισωμάτων σε συνδυασμό με άλλα κλινικά ευρήματα μπορεί να βοηθήσει στη διάγνωση προτωπαθών χολικών κιρρώσεων. Περιληψη Και Αρχη Μεθοδου Η πρωτοπαθής χολική κίρρωση (PBC) είναι μια χρόνια νόσος του ήπατος που χαρακτηρίζεται από την καταστροφή των μικρών ενδοηπατικών χοληφόρων. Η προοδευτική καταστροφή των χοληφόρων οδηγεί σε αυξανόμενη λειτουργική βλάβη του ήπατος, η οποία, με την πάροδο του χρόνου, μπορεί να οδηγήσει σε ηπατική ανεπάρκεια και στην ανάγκη για μεταμόσχευση ήπατος. 1, 2 Η αιτιολογία της PBC είναι άγνωστη, αν και ένας γενετικός παράγοντας καθώς και άλλοι παράγοντες μπορεί να είναι σημαντικοί για την ανάπτυξη της 1, 3, 4 νόσου. Η πρωτοπαθής χολική κίρρωση (PBC) εμφανίζεται συνήθως μεταξύ των ηλικιών 30 και 65 και επηρεάζει πιο συχνά τις γυναίκες από ό,τι τους άνδρες (εκτιμώμενος λόγος γυναικών/άνδρες = 9:1). 3, 4 Η συχνότητα της PBC σε συγγενείς πρώτου βαθμού πασχόντων από PBC κυμαίνεται από 1.3 έως 6.4%. 4, 5 Η PBC εμφανίζεται σε όλες τις φυλές και η κατανομή της είναι παγκόσμια. Έχουν αναφερθεί μεγάλες διαφορές στην γεωγραφική κατανομή της PBC, από εκτιμήσεις της τάξης του 2 ανά 100,000 στην Ιαπωνία και την Αυστραλία έως 40 ανά στις Η.Π.Α. 3, 6 Οι οροδιαγνωστικές αναλύσεις είναι σημαντικά βοηθήματα για την αναγνώριση και τη διάγνωση της PBC, καθώς πολλά αντισώματα που σχετίζονται με την PBC είναι παρόντα πριν την εμφάνιση των συμπτωμάτων. 7-9 Αντι-μιτοχονδριακά αντισώματα (AMA), ανιχνευόμενα μέσω έμμεσης ανάλυσης ανοσοφθορισμού (IFA), αποτελούν τον κλασικό οροδιαγνωστικό δείκτη της PBC. 10 Αν και έχουν αναφερθεί AMA σε ποσοστό μέχρι 90-95% των ασθενών με PBC, η συχνότητα της ανίχνευσης μπορεί να είναι σημαντικά χαμηλότερη. 11 Η ανίχνευση AMA μέσω ανάλυσης IFA εξαρτάται σε μεγάλο βαθμό από την ικανότητα του παρατηρητή, καθώς και από την παρουσία άλλων αντισωμάτων η οποία μπορεί να εμποδίσει ή να προκαλέσει σύγχυση κατά την ερμηνεία των σχημάτων IFA. Πρώιμες μελέτες περιέγραψαν 9 υποτύπους μιτοχονδριακών αντιγόνων, οριζόμενων ως M1-M9. 12 Τα κύρια αυτοαντιγόνα που στοχεύονται από ορούς ασθενών με PBC αναγνωρίζουν το κλάσμα αντιγόνου M2. Τα κύρια συστατικά του αντιγόνου M2 βρέθηκε ότι είναι μέλη του συμπλόκου 1-οξο-οξυ αφυδρογονάση. Τα ειδικά αντιγόνα αναγνωρίστηκαν ως οι υπομονάδες E2 του συμπλόκου πυροσταφυλική αφυδρογονάση (PDC-E2), του συμπλόκου 2-οξο-οξυ αφυδρογονάση διακλαδιζόμενης αλυσίδας (BCOADC-E2) και του συμπλόκου 2-οξο γλουταρική αφυδρογονάση (OGDC-E2). 13 Η αναγνώριση αυτών των αντιγόνων επέτρεψε την ανάπτυξη των αναλύσεων ELISA. Οι δοκιμασίες ELISA έχει καταδειχθεί ότι είναι περισσότερο ευαίσθητες από τις IFA Η πρώτη γενιά δοκιμασιών αντι-m2 ELISA χρησιμοποίησε PDC-E2 ως το κύριο υπόστρωμα για την ανίχνευση αντισωμάτων ειδικών για PBC. Ενώ το 80-90% των ασθενών με ιστολογικά αποδεδειγμένη PBC έχουν αντισώματα αντι-pdc-e2, περίπου το 10% των ασθενών με PBC αντιδρούν μόνο σε BCOADC- E2 ή/και OGDC-E2. 18,19 Οι Gershwin και Leung ανέπτυξαν και κατοχύρωσαν με δίπλωμα ευρεσιτεχνίας έναν κλώνο υβριδίου τριπλής έκφρασης ( MIT3 ) ο οποίος εκφράζει τα ανοσοκυρίαρχα επίτοπα των PDC-E2, BCOADC-E2 και OGDC-E2. 11, 15, 16, 19 Η ανάλυση ELISA με βάση MIT3 καταδείχθηκε ότι έχει βελτιωμένη απόδοση έναντι της IFA ή των συμβατικών δοκιμασιών ELISA με βάση PDC-E2 και ανίχνευσε AMA σε πάνω από δύο τρίτα των ορών από AMA αρνητικούς (μέσω IFA) ασθενείς με PBC. 15, 16 Εφόσον η παρουσία AMA μπορεί να προηγείται της ανάπτυξης συμπτωματικής νόσου, η ικανότητα για ακριβέστερη αναγνώριση της παρουσίας των δεικτών για PBC μπορεί να συνεισφέρει στην πιο έγκαιρη διάγνωση και θεραπεία και να επιβραδύνει την πρόοδο της νόσου. 7,8,9 Αρχη Μεθοδου Κεκαθαρμένο από συγγένειες ανασυνδυασμένο αντιγόνο (MIT3) που περιέχει ανοσοκυρίαρχα μέρη PDC-E2, BCOADC-E2 και OGDC-E2 δεσμεύεται στα πηγαδάκια μιας μικροπλάκας πολυστυρενίου υπό συνθήκες οι οποίες διατηρούν το αντιγόνο στην αμιγή του κατάσταση. Προαραιωμένοι οροί ελέγχου και αραιωμένοι οροί ασθενούς προστίθενται σε ξεχωριστά πηγαδάκια, επιτρέποντας στα παρόντα μιτοχονδριακά αυτοαντισώματα να δεσμευθούν στο ακινητοποιημένο αντιγόνο. Μη αντιδρώντα αντισώματα ξεπλένονται και προσθέτεται αντι ανθρώπινο IgG αντίσωμα συνδεδεμένο με ένζυμο. Η δεύτερη επώαση επιτρέπει την σύνδεση του αντι ανθρώπινου IgG αντισώματος με τα σχηματισμένα συμπλέγματα αντισώματος ακινητοποιημένου αντιγόνου. Στη συνέχεια η προσθήκη υποστρώματος υπεροξειδάσης προκαλεί χρωματική αλλαγή ανάλογη με τη συγκέντρωση των αντισωμάτων. Μετά τη διακοπή της ενζυματικής παραγωγής χρώματος, η παρουσία ή η απουσία αντισωμάτων συγκρίνεται με την οπτική πυκνότητα των πρότυπων αναφοράς. Αντιδραστηρια 1. Μικροπλάκα πολυστυρενίου ELISA επικαλυμμένη με κεκαθαρμένο ανασυνδυασμένο αντιγόνο MIT3, (12-1 x 8 κοιλότητες), με θήκη σε αλουμινένια συσκευασία που περιέχει αφυγραντικά 2. ELISA Negative Αρνητικός πρότυπος ορος ελέγχου (1 φιαλίδιο 1.2ml αραιωμένου διαλύματος χωρίς ανθρώπινα αντισώματα M2) 1

2 3. M2 EP (MIT3) ELISA Low Positive (χαμηλό θετικό), 1 φιαλίδιο ρυθμιστικού διαλύματος που περιέχει συντηρητικό και αντισώματα ανθρώπινου ορού σε ανασυνδυασμένο ανθρώπινο M2, προαραιωμένο, 1.2ml 4. M2 EP (MIT3) ELISA High Positive (υψηλό θετικό), 1 φιαλίδιο ρυθμιστικού διαλύματος που περιέχει συντηρητικό και αντισώματα ανθρώπινου ορού σε ανασυνδυασμένο ανθρώπινο M2, προαραιωμένο, 1.2ml 5. HRP Sample Diluent, 1 φιαλίδιο χρώματος ροζ, που περιέχει Tris ρυθμιστικό αλατούχο διάλυμα, Tween 20, σταθεροποιητές πρωτεΐνης και συντηρητικό, 50mL 6. HRP Wash Concentrate, 1 φιαλίδιο των 40x συμπυκνωμάτων χρώματος κόκκινου, που περιέχει Tris ρυθμιστικό αλατούχο διάλυμα και Tween 20, 25mL. Ανατρέξτε στο Τμήμα Μεθόδων για οδηγίες αραίωσης. 7. HRP Conjugate IgG (αίγας), αντι-ανθρώπινη IgG, 1 φιαλίδιο χρώματος μπλε, που περιέχει ρυθμιστικό διάλυμα, σταθεροποιητές πρωτεΐνης και συντηρητικό, 10mL 8. TMB Chromogen, 1 φιαλίδιο που περιέχει σταθεροποιητές, 10mL 9. HRP Stop Soulution, 0.344M θειικό οξύ, 1 φιαλίδιο άχρωμο, 10mL Προσοχή 1. ΠΡΟΕΙΔΟΠΟΙΗΣΗ: Αυτό το προϊόν περιέχει ένα χημικό (0.02% chloramphenicol) στο αραιωτικό δείγματος, στους ορούς ελέγχου και στο σύζευγμα, το οποίο είναι γνωστό στην Πολιτεία της Καλιφόρνιας ότι προκαλεί καρκίνο. 2. Όλα τα αντιδραστήρια ανθρώπινης προέλευσης κατά τη διάρκεια της προετοιμασίας των μαρτύρων αυτού του προϊόντος έχουν ελεγχθεί και είναι αρνητικά για αντισώματα έναντι HIV, HbsAg, HCV όπως ορίζεται από τους κανονισμούς του FDA. Καμία μέθοδος πάντως δεν είναι σε θέση να αποκλείσει την παντελή απουσία μολυσματικών παραγόντων όπως και για HIV, HBV, HCV. Γι αυτό και όλοι οι ανθρώπινης προέλευσης μάρτυρες θα πρέπει να χρησιμοποιούνται ως δυνητικά μολυσματικά υλικά Το αζίδιο του νατρίου χρησιμοποιείται ως συντηρητικό. Το αζίδιο του νατρίου είναι δηλητήριο και μπορεί να είναι τοξικό σε περίπτωση κατάποσης. Το αζίδιο νατρίου μπορεί να αντιδράσει με μολύβδινες ή χάλκινες σωληνώσεις με αποτέλεσμα την πρόκληση δυνητικά εκρηκτικών μεταλλικών ενώσεων αζιδίων. Αν για την απόρριψη του αντιδραστηρίου χρησιμοποιούνται λεκάνες απόπλυσης, η συγκέντρωση των αζιδίων μπορεί να αποφευχθεί ξεπλένοντας με άφθονο νερό. 4. Το σύζευγμα περιέχει μια δηλητηριώδη/διαβρωτική χημική ουσία η οποία μπορεί να είναι τοξική εάν γίνει κατάποσή της σε μεγάλες ποσότητες. Aποφύγετε πιθανά εγκαύματα αποφεύγετε επαφή με τα μάτια και το δέρμα. 5. Το TMB χρωμογόνο περιέχει μία ερεθιστική ουσία που μπορεί να είναι επικίνδυνη εάν την εισπνεύσετε εάν καταποθεί ή εάν απορροφηθεί από το δέρμα. Αποφύγετε κάποιο τραυματισμό, την εισπνοή, κατάποση και επαφή με το δέρμα ή τα μάτια. 6. Το διάλυμα διακοπής της αντίδρασης (Stop Solution) περιέχει θειικό οξύ το οποίο είναι δηλητηριώδες, διαβρωτικό και τοξικό. Για να αποφύγετε χημικά εγκαύματα αποφύγετε την επαφή του με το δέρμα και τα μάτια. 7. Να χρησιμοποιείτε τον κατάλληλο προστατευτικό εξοπλισμό όταν δουλεύετε με τα αντιδραστήρια. 8. Αντιδραστήρια που έχουν χυθεί πρέπει να καθαρίζονται αμέσως. Τηρείτε όλους τους ομοσπονδιακούς, εθνικούς και τοπικούς περιβαλλοντικούς κανονισμούς για την απόρριψη αποβλήτων. Ειδικα Μετρα 1. Αυτό το προϊόν είναι γδια διαγνωστική χρήση In Vitro. 2. Η αντικατάσταση συστατικών με διαφορετικά από τα παρεχόμενα σε αυτό το σύστημα μπορεί να οδηγήσει σε ανακριβή αποτελέσματα. 3. Ανεπαρκές πλύσιμο της μικροπλάκας ή αναποτελεσματική αφαίρεση των διαλυμάτων στα ενδιάμεσα στάδια μπορεί να επηρεάσει την ακρίβεια της μεθόδου. 4. Η λειτουργία αυτής της μεθόδου σε αυτόματο αναλυτη καί άλλες συσκευές διανομής, μπορεί να δώσει διαφορετικά αποτελέσματα απο αυτά που αποκτώνται στη χειρωνακτική διαδικασία. Είναι στήν ευθύνη του κάθε εργαστηρίου να καθορίσει τις αποδεκτές τιμές και όρια της αυτόματης διαδικασίας. 5. Μια ποικιλία παραγόντων μπορεί να επηρεάσει την απόδοση της μεθόδου: Η θερμοκρασία των αντιδραστηρίων, η θερμοκρασία του εργαστηριακού χώρου, η ακρίβεια και επαναληψιμότητα του πιπεταρίσματος, η πλύση και η αφαίρεση των διαλυμάτων από τη μικροπλάκα, η ποιότητα του φωτόμετρου, οι χρόνοι επώασης. Προσεκτική τήρηση της διαδικασίας είναι απαραίτητη για ακριβή και επαναλήψιμα αποτελέσματα. 6. Συνιστάται η ακριβής τήρηση του πρωτοκόλλου. 7. Ανεπαρκής συντήρηση της μικροπλάκας (κλείσιμο της αχρησιμοποίητης πλάκας) μπορεί να προκαλέσει αποδομή του συνδεδεμένου αντιγόνου και αποτελέσματα χαμηλής ακρίβειας. 8. Μη αποδεκτές χαμηλές τιμές απορρόφησης μπορεί να παρατηρηθούν αποδύο η περισσότερες χρήσεις της σφαιρίνης απο το ίδιο φιαλίδιο. Είναι σημαντικό να ακολουθείτε τις οδηγίες χρήσης της σφαιρίνης. 9. Χημική μόλυνση της σφαιρίνης μπορεί να προέλθει απο ανεπαρκή καθαρισμό των τμημάτων διανομής των αναλυτών. Κατάλοιπα απο εργαστηριακά χημικά όπως φορμαλίνη, χλωρίνη, εθανόλη, η απορρυπαντικά θα προκαλέσουν υποβιβασμό της σφαιρίνης με το χρόνο. Συνιστάται ο καθαρισμός των οργάνων και συσκευών μετα τη χρήση χημικών καθαριστικών. 2

3 Αποθήκευση 1. Αποθηκεύσατε τα αντιδραστήρια στους 2-8 ο C. Να μήν παγώνουν. Είναι σταθερά για χρήση μέχρι τη λήξη τους εάν αποθηκεύονται συμφωνα με τις οδηγίες. 2. Οι μη χρησιμοποιούμενες σειρές επικαλυμένων με αντιγόνο πηγαδιών πρέπει να ασφαλίζονται στην αλουμινένια συσκευασία τους, η οποία περιέχει απορροφητικό υγρασίας, και να φυλάσονται στούς 2-8 ο C. 3. Το αραιωμένο διάλυμα πλύσης είναι σταθερό για μία εβδομάδα στούς 2-8 ο C. Δείγματα Η διαδικασία μπορεί να πραγματοποιηθεί μόνο με δείγματα ορού. Η προσθήκη αζιδίου η άλλων συντηριτικών στο υποό έλεγχο δείγμα μπορεί να επιρεάσει τα αποτελέσματα. Δεν πρέπει να χρησιμοποιούνται δείγματα που έχουν επιμολυνθεί με μικρόβια, έχουν υποστεί θερμική επεξεργασία ή περιέχουν ορατά σωματίδια. Έντονα αιμολυμένος, ικτερικός ή λιπαιμικός ορός ή δείγματα πρέπει να αποφεύγονται. Μετά τη συλλογή του δείγματος, ο ορός θα πρέπει να διαχωρίζεται άμεσα από το ολικό αίμα. NCCLS Document H18-A3 προτείνει τις παρακάτω συνθήκες συντήρησης και αποθήκευσης των δειγμάτων: Τα δείγματα πρέπει να διατηρούνται σε θερμοκρασία δωματίου όχι περισσότερο από 8 ώρες. Σε περίπτωση που η δοκιμασία δεν πραγματοποιηθεί άμεσα, τότε τα δείγματα μπορούν να διατηρηθούν σε θερμοκρασία συντήρησης (2 8 ο C ) μέχρι 48 ώρες. Για μεγαλύτερο διάστημα, τα δείγματα θα πρέπει να καταψυχθούν στους 20 ο C. Τα κατεψυγμένα δείγματα πρέπει να αναμιχθούν καλά μετά την απόψυξη και πριν από την εξέταση. Διαδικασία Υλικά που παρέχονται 1 M2 EP (MIT3) ELISA μικροπλάκα (12-1x8 πηγαδάκια), με βάση 1 1.2ml αραιωμένος ELISA Negative Αρνητικός πρότυπος ορός ελέγχου (έτοιμος προς χρήση) 1 1.2ml αραιωμένος M2 EP (MIT3) Low Θετικός πρότυπος ορός ελέγχου (έτοιμος προς χρήση) 1 1.2ml αραιωμένος M2 EP (MIT3) High Ρυθμιστής (έτοιμος προς χρήση) 1 50ml HRP Sample Diluent, HRP Αραιωτικό δείγματος 1 25ml HRP Wash Concentrate, HRP Συμπύκνωμα πλύσης, 40x συμπυκνωμάτων 1 10ml HRP Conjugate, HRP Σύζευγμα IgG (αίγας), 1 10ml TMB Chromogen, TMB Χρωμογόνο 1 10ml HRP Stop Solution, HRP Διάλυμα διακοπής, 0.344M θεεινικό οξύ Αντιδραστήρια και εξοπλισμός που δεν συμπεριλαμβάνονται Μικροπιπέτες ρυθμιζόμενου όγκου 5, 100, και 500 μl Απορριπτόμενα ρύγχη για μικροπιπέττες Σωληνάρια για την διάλυση δειγμάτων των ασθενών όγκου 4 ml Αποσταγμένο ή μη ιονισμένο νερό 1L δοχείο για το διάλυμα HRP Wash Concentrate (Διάλυμα πλυσίματος) Φωτόμετρο μέτρησης της μικροπλάκας με δυνατότητα φίλτρου στα 450 και 620 nm Μεθοδολογια Πριν ξεκινήσετε 1. Όλα τα αντιδραστήρια και τα δείγματα θα πρέπει να βρίσκονται σε θερμοκρασία δωματίου (20 26 C) και να έχουν αναδευτεί καλά. 2. Αραιώστε το συμπυκνωμένο HRP διάλυμα πλύσεων 1:40 προσθέτοντας το περιεχόμενο του φιαλιδίου σε 975 ml απεσταγμένου νερού. Σε περίπτωση που δέν θα χρησιμοποιήσετε ολόκληρη τη μικροπλάκα μπορείτε να χρησιμοποιήσετε μικρότερη ποσότητα ετοιμάζοντας 2 ml συμπυκνωμένου Wash και 78 ml απεσταγμένου νερού για κάθε 16 πηγαδάκια. Το αραιωμένο υπόστρωμα είναι σταθερό για μία εβδομάδα στους 2-8 C. 3. Ετοιμάστε τις αραιώσεις 1:101 των δειγμάτων υπό εξέταση προσθέτοντας 5 μl ορού σε 500μl αραιωτικό δείγματος. Η προετοιμασία των δειγμάτων θα πρέπει να γίνεται εντός 8 ωρών. Οι θετικος και ο αρνητικός πρότυποι οροί δεν χρειάζονται αραίωση. 4. Για την αποτελεσματικότερη ακρίβεια των αποτελεσμάτων προτείνεται η εις διπλούν τοποθέτηση όλων των διαλυμάτων αναφοράς, πρότυπων ορών ελέγχου και δειγμάτων. Συνιστάται η επανάληψη της εξέτασης των δειγμάτων. Διαδικασία 1. Όλα τα αντιδραστήρια και τα δείγματα θα πρέπει να βρίσκονται σε θερμοκρασία δωματίου (20 26 C) και να έχουν αναδευτεί καλά. Υπολογίστε τον απαραίτητο αριθμό πηγαδιών που απαιτούνται, και φυλάξτε τις υπόλοιπες στην ειδική θήκη την οποία θα πρέπει να την κλείσετε καλά ώστε να προστατέψετε την μικροπλάκα από την υγρασία. 2. Προσθέστε 100 μl πρότυπων ορών ελέγχου, υψηλού, χαμηλού, αρνητικού και των υπό έλεγχο αραιωμένων δείγματων στις προκαθορισμένες θέσεις. Καλύψτε την μικροπλάκα και επωάστε για 30 λεπτά σε θερμοκρασία δωματίου. Ο χρόνος επώασης ξεκινάει με τη προσθήκη του τελευταίου δείγματος. 3. Πλύση: Ξεπλύνετε καλά κάθε πηγαδάκι από τα περιεχόμενα. Προσθέστε µL αραιωμένου ρυθμιστικού διαλύματος πλύσης HRP σε όλα τα πηγαδάκια και ξεπλύνετε. Επαναλάβετε τη διαδικασία δύο ακόμα φορές, για τρεις πλύσεις συνολικά. Αναποδογυρίστε την μικροπλάκα και τινάξτε την σε απορροφητικό υλικό για να αφαιρέσετε το εναπομείναν υγρό κατόπιν της τελικής 3

4 πλύσης. Είναι σημαντικό κάθε πηγαδάκι να είναι εντελώς άδειο μετά από κάθε πλύση. Ακολουθήστε την ίδια διαδικασία για την πλύση όπως και για την προσθήκη των δειγμάτων. 4. Προσθέστε 100 μl HRP IgG συζεύγματος σε όλες τις πηγαδάκια. Το σύζευγμα πρέπει να αφαιρεθεί από τα φιαλίδια χρησιμοποιώντας τυπικές ασηπτικές συνθήκες και καλές εργαστηριακές πρακτικές. Αφαιρέστε από το φιαλίδιο την ποσότητα συζεύγματος που είναι απαραίτητη για την ανάλυση. ΠΡΟΣ ΑΠΟΦΥΓΗ ΕΝΔΕΧΟΜΕΝΗΣ ΜΙΚΡΟΒΙΟΛΟΓΙΚΗΣ Ή/ΚΑΙ ΧΗΜΙΚΗΣ ΜΟΛΥΝΣΗΣ, ΔΕΝ ΠΡΕΠΕΙ ΠΟΤΕ ΝΑ ΕΙΣΑΓΕΤΕ ΞΑΝΑ ΣΤΟ ΦΙΑΛΙΔΙΟ ΤΗΝ ΠΟΣΟΤΗΤΑ ΣΥΖΕΥΓΜΑΤΟΣ ΠΟΥ ΔΕΝ ΧΡΗΣΙΜΟΠΟΙΗΘΗΚΕ. Πραγματοποιήστε επώαση στα πηγαδάκια για 30 λεπτά, όπως στο βήμα Πλύση: Επαναλάβετε το βήμα Προσθέστε 100 μl TMB χρωμογόνου. Επωάστε τη μικροπλάκα για 30 λεπτά σε σκοτεινό μέρος. 7. Προσθέστε 100µL διαλύματος διακοπής αντίδρασης (HRP Stop Solution) σε κάθε πηγαδάκι. Ακολουθήστε την ίδια διαδικασία και πρόγραμμα του πρόσθετου διαλύματος διακοπής της αντίδρασης (HRP Stop Solution) όπως χρησιμοποιήθηκε για το χρωμογόνο TMB. Τινάξτε ελαφρά την μικροπλάκα με το δάκτυλο, για να αναμιχθούν εκτενώς τα πηγαδάκια. 8. Η μέτρηση της οπτικής πυκνότητας των δειγμάτων θα πρέπει να γίνει εντός μίας ώρας από το τέλος της διαδικασίας, σε φωτόμετρο στα 450 nm με φίλτρο αναφοράς 620 nm προαιρετικά. Ποιοτικός έλεγχος 1. Οι θετικοί και ο αρνητικός πρότυποι οροί ελέγχου θα πρέπει να χρησιμοποιούνται σε κάθε ανοσοενζυμική διαδικασία έτσι ώστε να εξασφαλίζεται ότι τα αντιδραστήρια και οι διαδικασίες λειτουργούν σωστά. 2. Οι θετικοί και ο αρνητικός πρότυποι οροί ελέγχου είναι ήδη αραιωμένοι. Γι αυτό το λόγο δεν μπορούν να χρησιμοποιηθούν ως μέτρο ελέγχου της διαδικασίας αραίωσης των δειγμάτων. 3. Επιπλέον κατάλληλοι οροί, μάρτυρες, θα μπορούσαν να χρησιμοποιηθούν από δείγματα ρουτίνας τα οποία θα αποθηκεύονται στη βαθιά κατάψυξη. πολιτειακών και\ ή των ομοσπονδιακών κανονισμών ή επικυρωμένων οργανισμών. Μπορείτε να ετοιμάσετε επιπλέον απαραίτητο ορό μάρτυρα διαιρώντας σε ίσα μέρη τα δείγματα ανθρώπινου ορού που βρίσκεται στα πηγαδάκια και φυλάσσοντας στους -20 C. 4. Για να θεωρηθούν τα αποτελέσματα έγκυρα θα πρέπει να ισχύουν τα παρακάτω κριτήρια. Στη περίπτωση που κάποιο κριτήριο δεν ισχύσει τότε θα πρέπει να επαναληφθεί η διαδικασία. α. Η απορρόφηση του υψηλού θετικού πρότυπου ορού ελέγχου (high positive) θα πρέπει να είναι μεγαλύτερη από την απορρόφηση του χαμηλού θετικού πρότυπου ορού ελέγχου (low positive) η οποία θα πρέπει να είναι μεγαλύτερη από την απορρόφηση του αρνητικού πρότυπου ορού ελέγχου. β. Η απορρόφηση του υψηλού θετικού πρότυπου ορού ελέγχου (high positive) θα πρέπει να είναι μεγαλύτερη από 1.0 ενώ η απορρόφηση του αρνητικού πρότυπου ορού ελέγχου δεν θα πρέπει να υπερβαίνει το 0.2. γ. Η απορρόφηση του χαμηλού θετικού πρότυπου ορού ελέγχου (low positive) θα πρέπει είναι μεγαλύτερη από το διπλάσιο της απορρόφησης του αρνητικού πρότυπου ορού ελέγχου ή μεγαλύτερη από δ. Ο αρνητικός και ο υψηλός έλεγχοι δείχνουν την εγκυρότητα της διαδικασίας. Ο υψηλός θετικός δέν αντιστοιχεί στό σημείο αποκοπής της μεθόδου. ε. Ο χρήστης μπορεί να απευθυνθεί στό έγγραφο C24-A2 toυ NCCLS για περισσότερα στοιχεία του ποιοτικού ελέγχου. 21 Υπολογισμός Αποτελεσμάτων Ο μέσος όρος απορροφητικότητας (O.A.) για κάθε διπλό δείγμα πρέπει πρώτα να υπολογισθεί. Η αντίδραση για κάθε δείγμα μπορεί μετά να υπολογισθεί διαιρώντας το μέσο όρο απορροφητικότητας του δείγματος με το μέσο όρο απορροφητικότητας του M2 EP (MIT3) ELISA Low, και πολλαπλασιάζοντας το αποτέλεσμα με την τιμή του M2 EP (MIT3) ELISA Low. Η τιμή του M2 EP (MIT3) ELISA Low σε (units) φαίνεται στην ετικέτα του φιαλιδίου. Τιμή δείγματος Ο.A. δείγματος (μονάδες) = X M2 EP (MIT3) oρού ελέγχου (μονάδες) O.A. M2 EP (MIT3) ορού ελέγχου Η αντιδραστικότητα σχετίζεται με την ποσότητα του παρόντος αντισώματος σε ένα μη-γραμμικό τρόπο. Ενώ οι αυξήσεις και οι μειώσεις στις συγκεντρώσεις των αντισωμάτων του ασθενή θα αντικατοπτρίσουν μια ανταποκρινόμενη άνοδο ή πτώση στην αντιδραστικότητα, η αλλαγή δεν είναι ανάλογη (π.χ. ένας διπλασιασμός της συγκέντρωσης του αντισώματος δεν θα διπλασιάσει την αντιδραστικότητα). Αν απαιτείται ακριβέστερη ποσοτικοποίηση των αντισωμάτων του εξεταζόμενου, πρέπει να γίνουν διαδοχικές αραιώσεις του δείγματος και η τελευταία αραίωση που θα μετρηθεί ως θετική στην ανάλυση θα αναφερθεί ως ισχύς διαλύματος αντισωμάτων του ασθενούς. Ερμηνεία των Αποτελεσμάτων Η τεχνική ELISA είναι πολύ ευαίσθητη και ικανή να ανιχνεύει μικρές διαφορές στον ασθενή πλυθησμό. Οι κατωτέρω είναι ενδεικτικές τιμές. Κάαθε εργαστήριο πρέπει να καθορίσει τίς δικές του τιμές αναφοράς βάσει τών τεχνικών, ελέγχων, πλυθισμού κ.λ.π. Τα δείγματα ερμηνεύονται ως αρνητικά, ισότιμα ή θετικά σύμφωνα με τον παρακάτω πίνακα: 4

5 Μονάδες Αρνητικό < 20 Ισότιμο Θετικό Ενα θετικό αποτέλεσμα δείχνει τη παρουσία μιτοχονδριακών αντισωμάτων καί την πιθανότητα πρωταπαθούς χολικής κίρρωσης. 2. Το αρνητικό αποτέλεσμα δείχνει τη απουσία μιτοχονδριακών αντισωμάτων ή στάθμής κάτω του ορίου αποκοπής. 3. Συστήνεται τα αποτελέσματα να συνοδεύονται με την πληροφορία «τα ακόλουθα αποτελέσματα προέκυψαν με INOVA QUANTA Lite TM M2 EP (MIT3) ELISA. Οι τιμές M2 EP (MIT3) που προκύπτουν απο διαφορετικούς κατασκευαστές δέν είναι συγκρίσιμες. Οι τιμές δέν μπορούν να συσχετισθούν με τόν τελικό τίτλο. Το μέγεθος των αναφερόμενων επιπέδων IgG δεν μπορεί να συσχετιστεί με ένα τίτλο τελικού σημείου.» Περιορισμοί της Μεθόδου 1. Η παρουσία ανοσοσυμπλεγμάτων ή άλλων συσσωμάτων ανοσοσφαιρινών στο δείγμα, μπορεί να αύξηση το επίπεδο της μη ειδικής σύνδεσης και να δώσει ψευδώς θετικά αποτελέσματα. 2. Δεν ήταν όλοι οι ασθενείς με κύρια χολική κίρρωση θετικοί για μιτοχονδριακά αντισώματα. 3. Τα αποτελέσματα αυτής της μεθόδου θα πρέπει να χρησιμοποιούνται σε συνδυασμό με κλινικά ευρήματα και άλλες ορολογικές εξετάσεις. 4. Τα αποτελέσματα αυτής της μεθόδου δέν έχουν ελεγχθεί σάν ακριβεί γιά δείγματα εκτός ορού. Αναμενόμενες Τιμές Ο επιπολασμός της PBC κυμαίνεται από 2 ανά 100,000 στην Ιαπωνία και στην Αυστραλία έως 40 ανά 100,000 στις Η.Π.Α. 3,6 Ενώ τα αντι-μιτοχονδριακά αντισώματα πιστεύεται γενικά ότι είναι παρόντα στο 90-95% των ασθενών με PBC, η συχνότητα των ανιχνευόμενων αντισωμάτων εξαρτάται από την κοόρτη υπό μελέτη, και η ευαισθησία μπορεί να είναι χαμηλή μέχρι και 72%. 11 Η ειδικότητα των AMA με την IFA για PBC εμπίπτει στο εύρος από 95-97%. 11 Φυσιολογικές Τιμές Αντισώματα αντι-m2 (MIT3) σε ασυμπτωματικά υγιή άτομα Εξετάστηκε ομάδα 520 ασυμπτωματικών, υγιών ατόμων για τον εντοπισμό αντισωμάτων M2 EP(MIT3), χρησιμοποιώντας την Quanta Lite TM M2 EP (MIT3) ELISA. Δεδομένα σχετικά με την ηλικία και το φύλο ήταν διαθέσιμα για 299 από τα δείγματα. Οι ηλικίες κυμαίνονταν μεταξύ ετών. Εξετάστηκαν 150 άνδρες και 149 γυναίκες. Η μέση τιμή γι αυτόν τον πληθυσμό ήταν 7.6 μονάδες, η διάμεσος ήταν 6.0 μονάδες. Η ειδικότητα της ανάλυσης ήταν 98.5% (512/520) για τα φυσιολογικά άτομα. Δύο θετικά δείγματα έδειξαν καθαρά σχήματα AMA με την εξέταση IFA. Ειδικά χαρακτηριστικά απόδοσης Η συχνότητα των αντισωμάτων M2 (MIT3) που ανιχνεύθηκαν με την ανάλυση QUANTA Lite TM M2 EP (MIT3) ELISA σε ένα σύνολο 980 δειγμάτων καθορισμένων για PBC (978) ή PBC/αυτοάνοση ηπατίτιδα (AIH) (2) που συγκεντρώθηκαν από διάφορες κλινικές κοόρτες, παρουσιάζεται στον Πίνακα 1. Δείγματα με AIH, γνωστή AMA-αρνητική PBC ή δείγματα ασθενών με μη επιβεβαιωμένη υποψία νόσου αποκλείστηκαν. Η συνολική ευαισθησία της ανάλυσης ήταν 87.3% (856/980). Η ειδικότητα της ανάλυσης ήταν 98.7% (590/598). Η θετική προβλεπόμενη τιμή ήταν 99.1% και η αρνητική προβλεπόμενη τιμή ήταν 82.6%. Η μέση και διάμεση τιμή για όλα τα δείγματα που δεν προέρχονταν από πάσχοντες από PBC ή PBC/AIH ήταν 7.5 και 5.9 μονάδες αντιστοίχως. Πίνακα 1: Ευαισθησία του QUANTA Lite TM M2 EP (MIT3) ELISA N=1578 QUANTA Lite TM M2 EP (MIT3) ELISA Ομάδα ασθενών n= Θετικό iσότιμο aρνητικό PBC (967) or PBC/AIH (13) υγιή άτομα ελέγχου (520); Πρωτοπαθής σκληρυντική χολαγγειίτιδα-psc (47), άτομα ελέγχου με άλλη νόσο (31) Ευαισθησία: 87.3% (856/980); 95% Διάστημα Εμπιστοσύνης (CI): 85.1% to 89.4% Ειδικότητα: 98.7% (590/598); 95% CI: 97.4% to 99.4% Μελέτη Aληλεπίδρασης Οροί από 155 ασθενείς με ηπατική νόσο διαφορετική από PBC (70 AIH, 46 PSC, 8 AIH/PSC) και αυτοάνοση ή μολυσματική νόσο (3 LKM-1, 2 SLA, 3 GPA, 3 χρωματίνη, 3 ASCA, 2 Sm, 2 RNP, 2 SS-A, 2 SS-B, 2 Scl- 70, 2 Jo-1, 1 SLE, 2 HCV, 2 με υποψία ηπατικής νόσου διαφορετικής από PBC) εξετάστηκαν με την QUANTA Lite TM M2 EP (MIT3) ELISA με σκοπό την αξιολόγηση της ειδικότητας της ανάλυσης. Κανένας από τους ορούς με αυτοάνοση ή μολυσματική νόσο δεν ερμηνεύθηκε ως θετικός με την QUANTA Lite TM M2 EP (MIT3) ELISA. Πέντε AIH δείγματα ήταν θετικά, αλλά αυτά ενδέχεται να έχουν ένα μη διαγνωσμένο ή εξελισσόμενο σύνδρομο AIH/PBC. Όλα τα δείγματα AIH ή AIH/PSC αποκλείστηκαν από τον υπολογισμό της ειδικότητας. 5

6 Ακρίβεια και Επαναληψιμότητα Η απόδοση εντός της ανάλυσης αξιολογήθηκε εξετάζοντας 6 δείγματα 6 φορές συνολικά. Πίνακας 2: Απόδοση εντός της ανάλυσης του QUANTA Lite TM M2 EP (MIT3) A B C D E F Μέσες Μονάδες Τυπική απόκλιση Συντελεστής διακύμανσης % Η απόδοση εντός της ανάλυσης αξιολογήθηκε ελέγχοντας εις διπλούν 5 δείγματα, τον υψηλό θετικό ορό ελέγχου (HPC) του κιτ και τον αρνητικό ορό ελέγχου (NC) δύο φορές καθημερινά (μία φορά το πρωί και μία φορά το απόγευμα) για 3 ημέρες. Πίνακας 3: Απόδοση ανάμεσα των αναλύσεων για το QUANTA Lite TM M2 EP (MIT3) HPC NC A B C D E Μέσες Μονάδες Τυπική απόκλιση Συντελεστής διακύμανσης % Βιβλιογραφία 1. Kaplan, M. M. Primary biliary cirrhosis. N Engl J Med 335, (1996). 2. Heathcote, E. J. Management of primary biliary cirrhosis. The American Association for the Study of Liver Diseases practice guidelines. Hepatology 31, (2000). 3. Feld, J. J. & Heathcote, E. J. Epidemiology of autoimmune liver disease. J Gastroenterol Hepatol 18, (2003). 4. Talwalkar, J. A. & Lindor, K. D. Primary biliary cirrhosis. Lancet 362, (2003). 5. Jones, D. E., Watt, F. E., Metcalf, J. V., Bassendine, M. F. & James, O. F. Familial primary biliary cirrhosis reassessed: a geographically-based population study. J Hepatol 30, (1999). 6. Kim, W. R. et al. Epidemiology and natural history of primary biliary cirrhosis in a US community. Gastroenterology 119, (2000). 7. Metcalf, J. V. et al. Natural history of early primary biliary cirrhosis. Lancet 348, (1996). 8. Kisand, K. E. et al. The follow-up of asymptomatic persons with antibodies to pyruvate dehydrogenase in adult population samples. J Gastroenterol 36, (2001). 9. Prince, M., Chetwynd, A., Newman, W., Metcalf, J. V. & James, O. F. Survival and symptom progression in a geographically based cohort of patients with primary biliary cirrhosis: follow-up for up to 28 years. Gastroenterology 123, (2002). 10. Walker, J. G., Doniach, D., Roitt, I. M. & Sherlock, S. Serological Tests in Diagnosis of Primary Biliary Cirrhosis. Lancet 39, (1965). 11. Muratori, P. et al. 'True' antimitochondrial antibody-negative primary biliary cirrhosis, low sensitivity of the routine assays, or both? Clin Exp Immunol 135, (2004). 12. Berg, P. A. & Klein, R. Mitochondrial antigens and autoantibodies: from anti-m1 to anti-m9. Klin Wochenschr 64, (1986). 13. Fussey, S. P., Guest, J. R., James, O. F., Bassendine, M. F. & Yeaman, S. J. Identification and analysis of the major M2 autoantigens in primary biliary cirrhosis. Proc Natl Acad Sci USA 85, (1988). 14. Vergani, D. & Bogdanos, D. P. Positive markers in AMA-negative PBC. Am J Gastroenterol 98, (2003). 15. Miyakawa, H. et al. Detection of antimitochondrial autoantibodies in immunofluorescent AMA-negative patients with primary biliary cirrhosis using recombinant autoantigens. Hepatology 34, (2001). 16. Moteki, S. et al. Use of a designer triple expression hybrid clone for three different lipoyl domain for the detection of antimitochondrial autoantibodies. Hepatology 24, (1996). 17. Fritzler, M. J. & Manns, M. P. Anti-mitochondrial autoantibodies. Clin Appl Immunol Rev 3, (2002). 18. Nishio, A., Keeffe, E. B. & Gershwin, M. E. Immunopathogenesis of primary biliary cirrhosis. Semin Liver Dis 22, (2002). 19. Leung, P. S. et al. Use of designer recombinant mitochondrial antigens in the diagnosis of primary biliary cirrhosis. Hepatology 15, (1992). 20. Biosafety in Microbiological and Biomedical Laboratories, Fourth Edition, HHS Pub#(CDC) , (CDC/NIH, 1999). 21. Internal Quality Control: Principles and Definitions, Approved Guidline, NCCLS Doc C24-A2 (National Committee for Clinical Laboratory Standards, 1991). Κατασκευαστής: INOVA Diagnostics, Inc Old Grove Road San Diego, CA United States of America Technical Service November 2005 Revision GRC0 Aντιπροσωπευτικός: Medical Technology Promedt Consulting GmbH Altenhofstrasse 80 D St. Ingbert, Germany Tel.: Fax.: