QUANTA Lite TM ttg ELISA (Τρανσγλουταμινάση ιστού) Για In Vitro διαγνωστική χρήση Πολυπλοκότητα κατά CLIA: υψηλή

Transcript

1 QUANTA Lite TM ttg ELISA (Τρανσγλουταμινάση ιστού) Για In Vitro διαγνωστική χρήση Πολυπλοκότητα κατά CLIA: υψηλή Σκοπός χρήσης Η ανοσοενζυμική μέθοδος QUANTA Lite TM ttg χρησιμοποιείται για τον ημιποσοτικό προσδιορισμό αντισωμάτων IgA στον ιστό τρανσγλουταμινάσης (ενδομυϊκό) στον ανθρώπινο ορό. Η ανίχνευση αυτών των αντισωμάτων βοηθά στην διάγνωση συγκεκριμένων γλουτενών ευαίσθητων εντεροπαθειών, όπως η κοιλιοκάκη και η ερπητοειδής δερματίτιδα. Περίληψη και επεξήγηση της δοκιμασίας Η κοιλιοκάκη και η ερπητοειδής δερματίτιδα, οι δύο αναγνωρισμένες μορφές της ευαίσθητης εντεροπάθειας γλουτένης (GSE), χαρακτηρίζονται από χρόνια φλεγμονή του εντερικού βλεννογόνου αδένα και ισοπέδωση του επιθηλίου ή θετικής "λαχνωτής ατροφίας". 1,2 Μη-ανεκτικότητα στη γλουτένη, την πρωτεΐνη του σιταριού, της σίκαλης και του κριθαριού προκαλούν GSE. Οι ασθενείς με κοιλιοκάκη μπορεί να υποφέρουν από διάρροια, γαστρεντερικά προβλήματα, αναιμία, κόπωση, ψυχιατρικά προβλήματα, και άλλες διάφορες παρενέργειες ή μπορεί να είναι χωρίς συμπτώματα. 2 Η ερπητοειδής δερματίτιδα είναι μια δερματική ασθένεια που σχετίζεται με την GSE. Όλοι οι ασθενείς με GSE έχουν αυξημένο κίνδυνο για λέμφωμα. 3 Μια δίαιτα χωρίς γλουτένη ελέγχει τη GSE και τα σχετιζόμενα με αυτή προβλήματα. Γύρω στο 1950 η ανακάλυψη ότι η γλουτένη προκαλεί κοιλιοκάκη έκανε ικανή τη θεραπεία με την επιβολή των ασθενών σε δίαιτα χωρίς γλουτένη. Μετά την ανάπτυξη μιας μεθόδου, κατά την οποία γίνεται η λήψη μικρών βιοψιών του εντέρου, οι γιατροί μπόρεσαν να ελέγξουν για λαχνωτή ατροφία. Ενώ η θετική λαχνωτή ατροφία μπορεί να συμβεί σε άλλες διαταραχές, η GSE μπορεί να αποδειχθεί με το να ακολουθηθούν τα αρχικά κριτήρια της Ευρωπαϊκής Κοινότητας για Παιδιατρική Γαστρεντερολογία και Διατροφή (ESPGAN). Αυτά τα κριτήρια θέλουν περίπου ένα χρόνο αυστηρών μελετών για: α) μια αρχική θετική βιοψία του εντέρου, β) 6 μήνες με διατροφή χωρίς γλουτένη, γ) μια αρνητική δεύτερη βιοψία του εντέρου, δ) πρόκληση της γλουτένης για 6 μήνες, ε) μια θετική τρίτη βιοψία του εντέρου. Η ανάπτυξη των εξετάσεων του ορού για τρία διαφορετικά αντισώματα του ισότυπου IgA 3 έκανε ικανή την παραγωγή πιο γρήγορων, διορθωμένων κριτηρίων ESPGAN για την κοιλιοκάκη, όπως αναφέρθηκε το Αυτές οι εξετάσεις περιλαμβάνουν αντισώματα ενδομυΐου IgA (ΕΜΑ), 4 αντισώματα αντιγλιαδίνης (AGA) και αντισώματα αντιρετικουλίνης R1 (ARA). Τα διορθωμένα κριτήρια ESPGAN θέλουν: α) μια και μοναδική θετική βιοψία του εντέρου και β) επίδειξη τουλάχιστον δύο από τις τρεις τάξεις των αντισωμάτων IgA, που αναφέρθηκαν πιο πάνω. Από τότε, διάφορες μελέτες έχουν επιδείξει ότι οι εξετάσεις IgA EMA έχουν εξειδίκευση άνω του 99% για την GSE και μεγαλύτερη ευαισθησία από τις εξετάσεις ARA ή AGA Εφόσον το IgA ΕΜΑ εξαφανίζεται όταν οι ασθενείς με κοιλιοκάκη ή ερπητοειδή δερματίτιδα μένουν πιστοί σε μια διατροφή χωρίς γλουτένη, εξετάσεις για αυτά τα αντισώματα βοηθούν επίσης στον έλεγχο της προσκόλλησης των ασθενών στην δίαιτά τους. 4,5,12 Πρόσφατα, το αντιγόνο ενδομυΐου έχει αναγνωριστεί ως το πρωτεϊνικό ένζυμο διασταύρωσης-σύζευξης γνωστό ως τρανσγλουταμινάση ιστού (ttg). 14,15 Οι μέθοδοι ειδικού αντιγόνου ELISA που έχει ενσωματωμένο το ttg παρέχουν μια αξιόπιστη, αντικειμενική, εναλλακτική στις βασισμένες στον ανοσοφθορισμό παραδοσιακές μεθόδους λύσεις, ενσωματώνοντας τις λεπτές τομές οισοφάγου θηλαστικών ως υπόστρωμα. Η διαδικασία ELISA μπορεί να προσαρμοστεί και με μεγάλο και με μικρό αριθμό των δειγμάτων των ασθενών. Αρχή μεθόδου Ένα κεκαθαρμένο αντιγόνο τρανσγλουταμινάσης ιστού από ινδικό χοιρίδιο δεσμεύεται στα πηγαδάκια μιας μικροπλάκας πολυστυρενίου, υπό συνθήκες οι οποίες διατηρούν το αντιγόνο στην αμιγή του κατάσταση. Προαραιωμένοι οροί ελέγχου και αραιωμένοι οροί ασθενούς προστίθενται σε ξεχωριστά πηγαδάκια, επιτρέποντας στα παρόντα αντισώματα ttg να δεσμευθούν στο ακινητοποιημένο αντιγόνο. Μη αντιδρώντα αντισώματα ξεπλένονται και προσθέτεται αντι ανθρώπινο IgA αντίσωμα συνδεδεμένο με ένζυμο σε κάθε πηγαδάκι. Η δεύτερη επώαση επιτρέπει την σύνδεση του αντι ανθρώπινου IgA αντισώματος με τα σχηματισμένα συμπλέγματα αντισώματος ακινητοποιημένου αντιγόνου. Μετά την απομάκρυνση τυχόν μη αντιδρώντων αντισωμάτων αντι-ανθρώπινου IgA, η υπόλοιπη δραστηριότητα ενζύμων μετριέται με προσθήκη υποστρώματος χρωμογόνου και μέτρηση της χρωματικής αλλαγής που πραγματοποιείται. Η ανάλυση μπορεί να αξιολογηθεί φασματοφωτομετρικά με τη σύγκριση του χρώματος που αναπτύσσεται στα πηγαδάκια του ασθενή με το χρώμα στα πηγαδάκια ελέγχου. Αντιδραστήρια 1. Πλάκα μικροκοιλοτήτων πολυστυρενίου ELISA επικαλυμμένη με αντιγόνο ttg, (12-1 x 8 κοιλότητες), με θήκη σε αλουμινένια συσκευασία που περιέχει αφυγραντικά 2. Αρνητικός ορός ελέγχου ELISA, 1 φιαλίδιο ρυθμιστικού διαλύματος που περιέχει συντηρητικό και ανθρώπινο ορό χωρίς ανθρώπινα αντισώματα σε ttg, προαραιωμένο 1,2ml 3. ttg ELISA χαμηλό θετικό, 1 φιαλίδιο ρυθμιστικού διαλύματος που περιέχει συντηρητικό και και αντισώματα σε ttg, προαραιωμένο, 1,2mL 4. ttg ELISA υψηλό θετικό, 1 φιαλίδιο ρυθμιστικού διαλύματος που περιέχει συντηρητικό και και αντισώματα σε ttg, προαραιωμένο, 1,2mL 1

2 5. HRP Αραιωτικό δείγματος, 1 φιαλίδιο χρώματος ροζ, που περιέχει Tris ρυθμιστικό αλατούχο διάλυμα, Tween 20, σταθεροποιητές πρωτεΐνης και συντηρητικό, 50mL 6. HRP Συμπύκνωμα πλύσης, 1 φιαλίδιο των 40x συμπυκνωμάτων χρώματος κόκκινου, που περιέχει Tris ρυθμιστικό αλατούχο διάλυμα και Tween 20, 25mL. Ανατρέξτε στην ενότητα των Μεθόδων για οδηγίες αραίωσης. 7. HRP Conjugate IgA (αίγας), αντι-ανθρώπινη IgA, 1 φιαλίδιο κίτρινου χρώματος που περιέχει ρυθμιστικό διάλυμα, σταθεροποιητές πρωτεΐνης και συντηρητικό, 10mL 8. TMB Χρωμογόνο, 1 φιαλίδιο που περιέχει σταθεροποιητές, 10mL 9. Διάλυμα διακοπής HRP, 0,344M θειικό οξύ, 1 φιαλίδιο άχρωμο, 10mL Προσοχή 1. ΠΡΟΕΙΔΟΠΟΙΗΣΗ: Αυτό το προϊόν περιέχει ένα χημικό (0,02% chloramphenicol) στο αραιωτικό δείγματος, στους ορούς ελέγχου και στο σύζευγμα, το οποίο είναι γνωστό στην Πολιτεία της Καλιφόρνιας ότι προκαλεί καρκίνο. 2. Όλα τα ανθρώπινα υλικά που χρησιμοποιήθηκαν στην προετοιμασία των πρότυπων ορών για αυτό το προϊόν έχουν εξεταστεί και βρέθηκαν αρνητικά για αντισώματα HIV, HBsAg και HCV από εγκεκριμένες μεθόδους FDA. Καμία μέθοδος πάντως δεν είναι σε θέση να αποκλείσει την παντελή απουσία μολυσματικών παραγόντων όπως και για HIV, HBV, HCV. Για αυτό το λόγο, οι οροί ελέγχου ttg ELISA χαμηλού θετικού, ttg ELISA υψηλού θετικού και ο ορός αρνητικού ελέγχου ELISA θα πρέπει να μεταχειρίζονται με τον ίδιο τρόπο όπως ένα πιθανώς μολυσματικό προϊόν Το αζίδιο του νατρίου χρησιμοποιείται ως συντηρητικό. Το αζίδιο του νατρίου είναι δηλητήριο και μπορεί να είναι τοξικό σε περίπτωση κατάποσης. Το αζίδιο νατρίου μπορεί να αντιδράσει με μολύβδινες ή χάλκινες σωληνώσεις με αποτέλεσμα την πρόκληση δυνητικά εκρηκτικών μεταλλικών ενώσεων αζιδίων. Αν για την απόρριψη του αντιδραστηρίου χρησιμοποιούνται λεκάνες απόπλυσης, η συγκέντρωση των αζιδίων μπορεί να αποφευχθεί ξεπλένοντας με άφθονο νερό. 4. Το HRP σύζευγμα περιέχει μια δηλητηριώδη/διαβρωτική χημική ουσία η οποία μπορεί να είναι τοξική εάν γίνει κατάποσή της σε μεγάλες ποσότητες. Για να αποφύγετε πιθανά εγκαύματα, αποφεύγετε επαφή με τα μάτια και το δέρμα. 5. Το TMB χρωμογόνο περιέχει μία ερεθιστική ουσία που μπορεί να είναι επικίνδυνη εάν την εισπνεύσετε εάν καταποθεί ή εάν απορροφηθεί από το δέρμα. Για να αποφύγετε κάποιο τραυματισμό, αποφεύγετε την εισπνοή, κατάποση και επαφή με το δέρμα ή τα μάτια. 6. Διάλυμα διακοπής HRP περιέχει θειικό οξύ. Αποφύγετε την έκθεση σε βάσεις, μέταλλα ή άλλα συστατικά που μπορεί να αντιδράσουν με οξέα. Το θειικό οξύ είναι δηλητήριο και διαβρωτικό και μπορεί να είναι τοξικό εάν καταποθεί. Για να αποφύγετε χημικά εγκαύματα αποφύγετε την επαφή του με το δέρμα και τα μάτια. 7. Να χρησιμοποιείτε τον κατάλληλο προστατευτικό εξοπλισμό όταν δουλεύετε με τα αντιδραστήρια. 8. Αντιδραστήρια που έχουν χυθεί πρέπει να καθαρίζονται αμέσως. Τηρείτε όλους τους ομοσπονδιακούς, εθνικούς και τοπικούς περιβαλλοντικούς κανονισμούς για την απόρριψη αποβλήτων. Ειδικά μέτρα 1. Αυτό το προϊόν είναι για διαγνωστική χρήση In Vitro. 2. Η αντικατάσταση συστατικών με διαφορετικά από τα παρεχόμενα σε αυτό το σύστημα μπορεί να οδηγήσει σε ανακριβή αποτελέσματα. 3. Ανεπαρκές πλύσιμο της μικροπλάκας ή αναποτελεσματική αφαίρεση των διαλυμάτων από τα πηγαδάκια ELISA μπορεί να προκαλέσει μειωμένη ακρίβεια και έντονο παρασκήνιο. 4. Η λειτουργία αυτής της μεθόδου σε αυτόματο αναλυτή και άλλες συσκευές διανομής, μπορεί να δώσει διαφορετικά αποτελέσματα από αυτά που λαμβάνονται στη χειρωνακτική διαδικασία. Αποτελεί ευθύνη του κάθε εργαστηρίου να αξιολογεί ότι η αυτόματη διαδικασία δίνει αποτελέσματα δοκιμασίας εντός των αποδεκτών ορίων. 5. Η απόδοση της ανάλυσης επηρεάζεται από μια ποικιλία παραγόντων. Η θερμοκρασία των αντιδραστηρίων, η θερμοκρασία του εργαστηριακού χώρου, η ακρίβεια και επαναληψιμότητα του πιπεταρίσματος, η πλύση και η αφαίρεση των διαλυμάτων από τα πηγαδάκια ELISA, η ποιότητα του φωτόμετρου, οι χρόνοι επώασης. Η προσοχή στη συνάφεια είναι σημαντική για την ακρίβεια και επαναληψιμότητα των αποτελεσμάτων. 6. Συνιστάται η ακριβής τήρηση του πρωτοκόλλου. 7. Ανεπαρκές κλείσιμο της συσκευασία που περιέχει ταινίες μικροκοιλοτήτων και αφυγραντικά μπορεί να προκαλέσει αποδομή του συνδεδεμένου αντιγόνου και αποτελέσματα χαμηλής ακρίβειας. 8. Μη αποδεκτές χαμηλές τιμές απορρόφησης μπορεί να παρατηρηθούν από δύο ή περισσότερες χρήσεις της σφαιρίνης από το ίδιο φιαλίδιο. Είναι σημαντικό να τηρούνται όλες οι συνιστώμενες διαδικασίες χειρισμού συζεύγματος HRP. 9. Χημική λοίμωξη του συζεύγματος HRP μπορεί να προέλθει από ανεπαρκή καθαρισμό ή ανεπαρκές ξέπλυμα του εξοπλισμού ή των οργάνων. Κατάλοιπα από εργαστηριακά χημικά όπως φορμαλίνη, χλωρίνη, αιθανόλη, η απορρυπαντικά θα προκαλέσουν υποβιβασμό της σφαιρίνης με το χρόνο. Συνιστάται ο καθαρισμός των οργάνων και συσκευών μετά τη χρήση χημικών καθαριστικών. Αποθήκευση 1. Αποθηκεύστε τα αντιδραστήρια στους 2-8 C. Μην τα καταψύχετε. Είναι σταθερά για χρήση μέχρι τη λήξη τους εάν αποθηκεύονται σύμφωνα με τις οδηγίες. 2. Οι μη χρησιμοποιημένες σειρές επικαλυμμένων με αντιγόνο πηγαδιών πρέπει να ασφαλίζονται στην αλουμινένια συσκευασία τους,η οποία περιέχει απορροφητικό υγρασίας, και να φυλάσσονται στους 2-8 C. 2

3 3. Το αραιωμένο διάλυμα πλύσης είναι σταθερό για μία εβδομάδα στους 2-8 C. Δείγματα Η διαδικασία μπορεί να πραγματοποιηθεί μόνο με δείγματα ορού. Η προσθήκη αζιδίου ή άλλων συντηρητικών στα δείγματα της δοκιμασίας μπορεί να επηρεάσει αρνητικά τα αποτελέσματα. Δεν πρέπει να χρησιμοποιούνται δείγματα που έχουν επιμολυνθεί με μικρόβια, έχουν υποστεί θερμική επεξεργασία ή περιέχουν ορατά σωματίδια. Αιμολυθέντα ή λιπαιμικά δείγματα ή ορός πρέπει να αποφεύγονται. Μετά τη συλλογή του δείγματος, ο ορός θα πρέπει να διαχωρίζεται άμεσα από το ολικό αίμα. Το NCCLS Document Η18-Α συνιστά τις ακόλουθες συνθήκες φύλαξης για τα δείγματα: 1) Φυλάξτε τα δείγματα σε θερμοκρασία δωματίου όχι περισσότερο από 8 ώρες. 2) Εάν η διαδικασία δεν ολοκληρωθεί μέσα σε 8 ώρες, καταψύξτε το δείγμα στους 2-8 C. 3) Εάν η διαδικασία δεν ολοκληρωθεί μέσα σε 48 ώρες ή απαιτείται η αποστολή του δείγματος, καταψύξτε στους 20 C ή χαμηλότερα. Τα κατεψυγμένα δείγματα πρέπει να αναμιχθούν καλά μετά την απόψυξη και πριν από την εξέταση. Διαδικασία Υλικά που παρέχονται 1 ttg ELISA μικροπλάκα (12-1x8 πηγαδάκια) με βάση 1 1,2mL προαραιωμένος ELISA αρνητικός ορός ελέγχου 1 1,2mL προαραιωμένος ttg ELISA χαμηλός θετικός 1 1,2mL προαραιωμένος ttg ELISA υψηλός θετικός 1 50mL HRP Αραιωτικό δείγματος 1 25mL HRP Συμπύκνωμα πλύσης, 40x συμπυκνωμάτων 1 10mL HRP Σύζευγμα IgA (αίγας), αντι-ανθρώπινη IgA 1 10mL TMB Χρωμογόνο 1 10mL HRP Διάλυμα διακοπής, 0,344M θειικό οξύ Πρόσθετος εξοπλισμός που απαιτείται και δεν συμπεριλαμβάνεται Μικροπιπέτες ρυθμιζόμενου όγκου 5, 100, και 500 μl Ρύγχη μικροπιπετών Σωληνάρια για την διάλυση δειγμάτων των ασθενών όγκου 4 ml Αποσταγμένο ή απιονισμένο νερό 1L δοχείο για το διάλυμα HRP Wash Concentrate (Συμπύκνωμα πλύσης) Φωτόμετρο μέτρησης της μικροπλάκας με δυνατότητα φίλτρου στα 450nm (και 620nm για μετρήσεις διπλής κυματομορφής) Μέθοδος Πριν ξεκινήσετε 1. Όλα τα αντιδραστήρια και τα δείγματα θα πρέπει να βρίσκονται σε θερμοκρασία δωματίου (20-26 o C) και να έχουν αναδευτεί καλά. 2. Αραιώστε το συμπυκνωμένο HRP διάλυμα πλύσεων 1:40 προσθέτοντας το περιεχόμενο του φιαλιδίου σε 975mL αποσταγμένου νερού. Σε περίπτωση που δεν θα χρησιμοποιήσετε ολόκληρη τη μικροπλάκα μπορείτε να χρησιμοποιήσετε μικρότερη ποσότητα ετοιμάζοντας 2,0mL συμπυκνώματος και 78mL αποσταγμένου ή απιονισμένου νερού για κάθε 16 πηγαδάκια. Το αραιωμένο ρυθμιστικό διάλυμα είναι σταθερό για μία εβδομάδα στους 2-8 o C. 3. Ετοιμάστε τις αραιώσεις 1:101 των δειγμάτων υπό εξέταση προσθέτοντας 5µL ορού σε 500µL HRP αραιωτικό δείγματος. Τα αραιωμένα δείγματα πρέπει να χρησιμοποιούνται εντός 8 ωρών από τη στιγμή της προετοιμασίας τους. ΜΗΝ ΑΡΑΙΩΝΕΤΕ τους ορούς ttg ELISA χαμηλού θετικού, ttg ELISA υψηλού θετικού και ELISA αρνητικού ελέγχου. 4. Ο προσδιορισμός της παρουσίας ή της απουσίας ttg χρησιμοποιώντας αυθαίρετες μονάδες απαιτεί δύο κοιλότητες για καθέναν από τους τρεις ορούς ελέγχου, και μία ή δύο κοιλότητες για κάθε δείγμα ασθενούς. Συνιστάται η επανάληψη της εξέτασης των δειγμάτων. Διαδικασία 1. ΟΛΑ ΤΑ ΑΝΤΙΔΡΑΣΤΗΡΙΑ ΠΡΕΠΕΙ ΝΑ ΒΡΙΣΚΟΝΤΑΙ ΣΕ ΘΕΡΜΟΚΡΑΣΙΑ ΔΩΜΑΤΙΟΥ (20 26 C) ΠΡΙΝ ΑΠΟ ΤΗΝ ΕΝΑΡΞΗ ΤΗΣ ΑΝΑΛΥΣΗΣ. Τοποθετήστε τον απαιτούμενο αριθμό μικροκοιλοτήτων/ταινιών στη θήκη. Επιστρέψτε αμέσως τις μη χρησιμοποιημένες ταινίες στο σάκο που περιέχει τα αφυγραντικά μέσα και σφραγίστε καλά για να ελαχιστοποιήσετε την έκθεση σε υδρατμούς. 2. Προσθέστε 100µL προαραιωμένων ορών ελέγχου, ttg ELISA χαμηλού θετικού, ttg ELISA υψηλού θετικού, ELISA αρνητικού και τα αραιωμένα δείγματα ασθενών στα πηγαδάκια. Καλύψτε τα πηγαδάκια και επωάστε για 30 λεπτά σε θερμοκρασία δωματίου σε οριζόντια επιφάνεια. Ο χρόνος επώασης ξεκινάει με την προσθήκη του τελευταίου δείγματος. 3. Πλύση: Ξεπλύνετε καλά κάθε πηγαδάκι από τα περιεχόμενα. Προσθέστε µL αραιωμένου ρυθμιστικού διαλύματος πλύσης HRP σε όλα τα πηγαδάκια και ξεπλύνετε. Επαναλάβετε τη διαδικασία δύο ακόμα φορές, για τρεις πλύσεις συνολικά. Αναποδογυρίστε την μικροπλάκα και τινάξτε την σε απορροφητικό υλικό για να αφαιρέσετε το εναπομείναν υγρό κατόπιν της τελικής πλύσης. Είναι σημαντικό κάθε πηγαδάκι να είναι εντελώς άδειο μετά από κάθε πλύση. Ακολουθήστε την ίδια διαδικασία για την πλύση όπως και για την προσθήκη των δειγμάτων. 3

4 4. Προσθέστε 100μL HRP IgA συζεύγματος σε όλα τα πηγαδάκια. Το σύζευγμα πρέπει να αφαιρεθεί από τα φιαλίδια χρησιμοποιώντας τυπικές ασηπτικές συνθήκες και καλές εργαστηριακές πρακτικές. Αφαιρέστε από το φιαλίδιο την ποσότητα συζεύγματος που είναι απαραίτητη για την ανάλυση. ΠΡΟΣ ΑΠΟΦΥΓΗ ΕΝΔΕΧΟΜΕΝΗΣ ΜΙΚΡΟΒΙΟΛΟΓΙΚΗΣ Ή/ΚΑΙ ΧΗΜΙΚΗΣ ΜΟΛΥΝΣΗΣ, ΔΕΝ ΠΡΕΠΕΙ ΠΟΤΕ ΝΑ ΕΙΣΑΓΕΤΕ ΞΑΝΑ ΣΤΟ ΦΙΑΛΙΔΙΟ ΤΗΝ ΠΟΣΟΤΗΤΑ ΣΥΖΕΥΓΜΑΤΟΣ ΠΟΥ ΔΕΝ ΧΡΗΣΙΜΟΠΟΙΗΘΗΚΕ. Πραγματοποιήστε επώαση στα πηγαδάκια για 30 λεπτά, όπως στο βήμα Πλύση: Επαναλάβετε το βήμα Προσθέστε 100µL TMB χρωμογόνου σε κάθε πηγαδάκι και επωάστε τη μικροπλάκα για 30 λεπτά σε σκοτεινό μέρος σε θερμοκρασία δωματίου. 7. Προσθέστε 100µL διαλύματος διακοπής αντίδρασης (HRP Stop Solution) σε κάθε πηγαδάκι. Ακολουθήστε την ίδια διαδικασία και πρόγραμμα του πρόσθετου διαλύματος διακοπής της αντίδρασης (HRP Stop Solution) όπως χρησιμοποιήθηκε για το χρωμογόνο TMB. Τινάξτε ελαφρά την μικροπλάκα με το δάκτυλο, για να αναμιχθούν εκτενώς τα πηγαδάκια. 8. Η μέτρηση της οπτικής πυκνότητας σε κάθε πηγαδάκι στα 450nm θα πρέπει να γίνει εντός μίας ώρας από το τέλος της διαδικασίας. Αν επιθυμείτε βιοχρωματικές μετρήσεις, μπορείτε να χρησιμοποιήσετε κυματομορφή αναφοράς 620nm. Ποιοτικός έλεγχος 1. Οι πρότυποι οροί ttg ELISA χαμηλού θετικού, ttg ELISA υψηλού θετικού και ELISA αρνητικού ελέγχου θα πρέπει να χρησιμοποιούνται σε κάθε ανοσοενζυμική διαδικασία έτσι ώστε να εξασφαλίζεται ότι τα αντιδραστήρια και οι διαδικασίες λειτουργούν σωστά. 2. Σημειώστε ότι εφόσον το ttg ELISA χαμηλό Θετικό (Low Positive), το ttg ELISA Υψηλο Θετικό (High Positive) και το ELISA Αρνητικό (Negative Control) είναι προ-αραιωμένα, δεν ελέγχουν τις διαδικαστικές μεθόδους που σχετίζονται με την αραίωση των δειγμάτων. 3. Μπορεί να απαιτείται η ανάλυση πρόσθετων ορών ελέγχου, σύμφωνα με τις οδηγίες ή τις απαιτήσεις των τοπικών ή/και εθνικών διατάξεων ή των οργανισμών διαπίστευσης. Πρόσθετοι κατάλληλοι οροί ελέγχου μπορούν να ανασυσταθούν διαιρώντας σε υποπολλαπλάσια δείγμα ανθρώπινου ορού πολλαπλών δοτών και αποθηκεύοντας σε θερμοκρασία < -20 C. 4. Για να είναι έγκυρα τα αποτελέσματα της δοκιμασίας, πρέπει να ικανοποιούνται όλα τα κριτήρια που παρατίθενται παρακάτω. Εάν κάποιο από αυτά τα κριτήρια δεν ικανοποιείται, η δοκιμασία πρέπει να θεωρηθεί άκυρη και η ανάλυση πρέπει να επαναληφθεί. α. Η απορροφητικότητα του προ-αραιωμένου ttg ELISA υψηλού θετικού πρέπει να είναι μεγαλύτερη από την απορροφητικότητα του προ-αραιωμένου ttg ELISA χαμηλού θετικού, του οποίου η απορροφητικότητα πρέπει να είναι μεγαλύτερη από αυτή του προ-αραιωμένου ELISA αρνητικού ελέγχου. β. Το προ-αραιωμένο ttg ELISA υψηλού θετικού πρέπει να έχει O.A. μεγαλύτερο από 1,0, ενώ η απορροφητικότητα του προ-αραιωμένου ELISA αρνητικού ελέγχου δεν μπορεί να είναι μεγαλύτερη από το 0,2. γ. Η απορροφητικότητα του ttg ELISA χαμηλού θετικού πρέπει να είναι δύο φορές μεγαλύτερη από αυτή του ELISA αρνητικού ελέγχου ή πάνω από 0,25. δ. Ο ορός ELISA αρνητικού ελέγχου και ο ttg ELISA υψηλού θετικού έχουν σκοπό να ελέγχουν για ουσιαστική αποτυχία αντιδραστηρίου. Ο ttg ELISA υψηλού θετικού δεν θα εξασφαλίσει ακρίβεια στο όριο της ανάλυσης. ε. Ο χρήστης μπορεί να ανατρέξει στο έγγραφο C24-A του NCCLS για περισσότερα στοιχεία του ποιοτικού ελέγχου. Υπολογισμός αποτελεσμάτων Ο μέσος όρος απορροφητικότητας (O.A.) για κάθε διπλό δείγμα πρέπει πρώτα να υπολογισθεί. Η αντίδραση για κάθε δείγμα μπορεί μετά να υπολογισθεί διαιρώντας το μέσο όρο απορροφητικότητας του δείγματος με το μέσο όρο απορροφητικότητας του ttg ELISA χαμηλού θετικού. Το αποτέλεσμα πολλαπλασιάζεται με το πλήθος των μονάδων που αντιστοιχεί στο ttg ELISA χαμηλού θετικού που φαίνεται στην ετικέτα. Ο.A. δείγματος Τιμή δείγματος = Χ ttg ELISA Χαμηλού θετικού (μονάδες) ttg ELISA O.A. Χαμηλού θετικού (μονάδες) Η αντιδραστικότητα σχετίζεται με την ποσότητα του παρόντος αντισώματος με ένα μη-γραμμικό τρόπο. Ενώ οι αυξήσεις και οι μειώσεις στις συγκεντρώσεις των αντισωμάτων του ασθενή θα αντικατοπτρίσουν μια ανταποκρινόμενη άνοδο ή πτώση στην αντιδραστικότητα, η αλλαγή δεν είναι ανάλογη (π.χ. ένας διπλασιασμός της συγκέντρωσης του αντισώματος δεν θα διπλασιάσει την αντιδραστικότητα). Αν απαιτείται ακριβέστερη ποσοτικοποίηση των αντισωμάτων του εξεταζόμενου, πρέπει να γίνουν διαδοχικές αραιώσεις του δείγματος και η τελευταία αραίωση που θα μετρηθεί ως θετική στην ανάλυση θα αναφερθεί ως ισχύς διαλύματος αντισωμάτων του ασθενούς. Ερμηνεία των αποτελεσμάτων Η ανάλυση ELISA είναι πολύ ευαίσθητη στην τεχνική και είναι ικανή να ανιχνεύσει ακόμα και μικρές διαφορές στους πληθυσμούς των ασθενών. Οι τιμές που φαίνονται παρακάτω είναι ενδεικτικές τιμές μόνο. Κάθε εργαστήριο πρέπει να καθιερώσει το δικό του εύρος φυσιολογικών τιμών με βάση τις δικές του τεχνικές, ορούς ελέγχου, εξοπλισμό και πληθυσμό ασθενών σύμφωνα με τις εσωτερικές καθιερωμένες διαδικασίες του εργαστηρίου. 4

5 Το δείγμα μπορεί τότε να χαρακτηρισθεί ως αρνητικό,ασθενές θετικό, μέτρια θετικό ή ισχυρά θετικό σύμφωνα με τον παρακάτω πίνακα. Μονάδες Αρνητικό <20 Ασθενές θετικό Μέτριο έως ισχυρό θετικό >30 1. Ένα θετικό αποτέλεσμα δείχνει τη παρουσία ttg αντισωμάτων και την πιθανότητα εντεροπάθειας ευαίσθητη στη γλουτένη, όπως η κοιλιοκάκη και η ερπητοειδής δερματίτιδα. 2. Το αρνητικό αποτέλεσμα δηλώνει ότι δεν υπάρχει αντίσωμα ttg ή συγκεντρώσεις κάτω από την οριακή τιμή για αρνητικό δείγμα της ανάλυσης. 3. Συνιστάται τα αποτελέσματα που δίνονται από το εργαστήριο να περιλαμβάνουν τη δήλωση: Τα ακόλουθα αποτελέσματα ελήφθησαν με χρήση του INOVA QUANTA Lite TM ttg ELISA. Τιμές ttg που λαμβάνονται με μεθόδους ανάλυσης διαφορετικών κατασκευαστών ενδέχεται να μην μπορούν να χρησιμοποιηθούν εναλλακτικά. Το μέγεθος των αναφερόμενων επιπέδων IgA δεν μπορεί να συσχετιστεί με ένα τίτλο τελικού σημείου." Όρια της διαδικασίας 1. Η παρουσία ανοσοσυμπλόκων ή άλλων συναθροίσεων ανοσοσφαιρίνης στο δείγμα του ασθενούς μπορεί να προκαλέσει αυξημένα επίπεδα μη ειδικής δέσμευσης και να δώσει ψευδή θετικά αποτελέσματα αυτής της ανάλυσης. 2. Ένα αρνητικό αποτέλεσμα ttg σε έναν ασθενή που δεν έχει κάνει θεραπεία δεν εξαιρεί την εντεροπάθεια την ευαίσθητη στη γλουτένη. Αυτό το εύρημα μπορεί συχνά να εξηγηθεί από επιλεκτική ανεπάρκεια IgA, ένα σχετικά συχνό εύρημα της κοιλιακής νόσου. Η INOVA παρέχει ένα κιτ ttg IgG για εξέταση αυτών των ασθενών (QUANTA Lite TM h-ttg IgG ELISA). 3. Τα αποτελέσματα αυτής της ανάλυσης πρέπει να χρησιμοποιούνται σε συνδυασμό με τα κλινικά ευρήματα και άλλες οροδιαγνωστικές δοκιμασίες. 4. Τα χαρακτηριστικά απόδοσης αυτής της ανάλυσης δεν έχουν τεκμηριωθεί για μήτρες διαφορετικές από ορό. Αναμενόμενες τιμές Η ικανότητα της μεθόδου QUANTA Lite TM ttg ELISA να ανιχνεύει αντισώματα IgA ιστού τρανσγλουταμινάσης αξιολογήθηκε σε σύγκριση με ένα άλλο τεστ ανίχνευσης ανοσοφθορισμού για αντισώματα ενδομυΐου (EMA), καθώς επίσης και με σύγκριση αποτελεσμάτων με πραγματικές κλινικές διαγνώσεις σε τρεις εξωτερικές κλινικές αξιολογήσεις και μια εσωτερική μελέτη.. Εύρος φυσιολογικών τιμών Εξετάστηκε ένας συνολικός αριθμός από 202 τυχαία κανονικά δείγματα. Ο πληθυσμός περιείχε 106 άνδρες και 96 γυναίκες ηλικίας από 15 έως 72. Μόνο 2 δείγματα (1%) βρέθηκαν θετικά. Και τα δύο θετικά δείγματα ήταν εβδομαδιαία αντιδραστικά στις 21 και 24 μονάδες. Η οριακή τιμή 20 μονάδων εφαρμόζεται τόσο σε παιδιατρικούς όσο και σε ενηλίκους πληθυσμούς. Ευαισθησία και εξειδίκευση Εξετάστηκαν συνολικά 99 δείγματα τόσο από το QUANTA Lite ttg ELISA όσο και από έμμεση δοκιμασία ανοσοφθορισμού για αντισώματα ενδομυΐου. Τα αποτελέσματα συνοψίζονται παρακάτω: Ενδομύιο από ανοσοφθορισμό ** Σχετική ευαισθησία 98,5% QUANTA Lite ttg ELISA Σχετική εξειδίκευση 94,1% - 1* 32 Σχετική αποτελεσματικότητα 96,7% * Αυτός ο ασθενής είχε ένα τίτλο ενδομυΐου 1:2, ήταν αρνητικός σε γλιαδίνη IgA και εβδομαδιαία θετικός σε γλιαδίνη IgG. Ο ασθενής έπασχε από κοιλιακή νόσο αλλά έκανε διατροφή χωρίς γλουτένη. ** Και τα δύο αυτά δείγματα ήταν ισχυρά θετικά για γλιαδίνη IgG και IgA. Κλινική ευαισθησία και εξειδίκευση Το κιτ αντισωμάτων QUANTA Lite TM ttg ELISA αξιολογήθηκε σε τρεις εξωτερικές κλινικές μελέτες και μία εσωτερική κλινική μελέτη. Ο ακόλουθος πίνακας συνοψίζει τα ευρήματα τόσο των εξωτερικών όσο και των εσωτερικών μελετών. Ομάδα ασθενών Αρ. Αρ. Θετικών (%) Κοιλιακή νόσος (100) θεραπεία με δίαιτα 10 1* (10) Εερπητοειδής δερματίτιδα 8 8 (100) θεραπεία με δίαιτα 1 0 Φλεγμονώδης νόσος των εντέρων 9 1** (11) Διαταραχές GI πλην της κοιλιακής νόσου 20 0 Παιδιατρική 58 0 SLE 15 1 (6,6) Φυσιολογικά 239 2*** (0,8) 5

6 * Αυτός ο ένας θετικός ασθενής ήταν επίσης θετικός για αντισώματα ενδομυΐου σε 1:10 και ήταν γνωστό πως δεν ήταν απολύτως συνεπής σε δίαιτα χωρίς γλουτένη. ** Αυτός ο ασθενής βρέθηκε θετικός για αντισώματα ενδομυΐου σε τίτλο 1:40 και ήταν επίσης θετικός για αντισώματα γλιαδίνης IgA και IgG. *** Αυτά τα δύο δείγματα ήταν εβδομαδιαία θετικά στις 21 και 24 μονάδες. Μελέτη αλληλεπίδρασης Το κιτ QUANTA Lite ttg ELISA δοκιμάστηκε με 25 δείγματα με υψηλά επίπεδα άλλων αυτο-αντισωμάτων όπως τα ANA, dsdna, ENA και άλλα. Κανένα δεν βρέθηκε να αντιδρά. Η μέση τιμή γι αυτήν την ομάδα ήταν 5,2 μονάδες, με ένα εύρος 2-13 μονάδων. Ακρίβεια και επαναληψιμότητα Η ακρίβεια και η επαναληψιμότητα της δοκιμασίας μετρήθηκε με την εξέταση έξι διπλών, ένα ισχυρώς θετικό, μέτρια θετικό και ένα αρνητικό δείγμα σε έξι ξεχωριστές αναλύσεις. Η μέση αντιδραστικότητα του ισχυρώς θετικού ήταν 102,3 μονάδες, του ασθενώς θετικού ήταν 50,1 μονάδες, ενώ η μέση τιμή για το αρνητικό ήταν 17,8. Η τυπική απόκλιση και ο συντελεστής της απόκλισης για κάθε δείγμα συνοψίζονται παρακάτω. Αρνητικό Ισχυρό θετικό Μέτριο θετικό SD CV SD CV SD CV Συνολικά 0,69 3,9% 2,47 2,4% 1,53 3,1% Εντός της ανάλυσης 0,60 3,3% 2,4 2,4% 1,34 2,7% Μεταξύ αναλύσεων 0,65 3,7% 1,78 1,7% 1,46 2,9% Βιβλιογραφία 1. Meuweisse GW. Diagnostic criteria in celac disease. Acta Paediatr Scand 59:461, Walker-Smith JA, Guandalini S, Schmitz J, Shmerling DH, Visakorpi JK. Revised criteria for diagnosis of celiac disease: Report of working group of Euorpean Society of Pediatric Gastroenterology and Nutrition (ESPGAN). Arch Diseases of Childhood 65: , Chorzelski TP, Beutner EH, Zalewski TK, et al. editors. Serologic diagnosis of celiac disease. Boca Raton (FL): CRC Press, Chorzelski TP, Sulej J, Tcherzewska H, et al. IgA class endomysium antibodies in dermatitis herpetiformis and celiac disease. Ann NY Acad Sci 420: , Volta U, Molinar N, De Franchis R, et al. Correlation between IgA antiendomysial antibodies and subtotal villous atrophy in dermatitis herpetiformis. J Clin Gastroenterol 14: , Valdimarsson T, Franzen L, Grodzinsky E, Skogh T, Strom M. Is small bowel biopsy necessary in adults with suspected celiac disease and IgA anti-endomysial antibodies? 100% positive predictive value for celiac disease in adults. Digestive Diseases and Science 41: 83-87, Unsworth FJ. Serologic diagnosis of gluten sensitive enteropathy. J Clin Path 49: , Volta U, Molinaro M, Fusconi M, Cassani F, Bianchi FB. IgA antiendomysial antibody test: A step forward in celiac disease screening. Digestive Diseases and Science 36: , Wilfang S, Knauss M, Stern M. IgA endomysiumantikorper. Montsschr Kinderkeilkd 140: , Muscart-Lemone F, Van den Broek J, Cadranel S, Colombel JF. Serologic aspects of celiac disease. Acta Gastro-Enterologica Belgica 55: , Grodzinsky E, Hed J, Skogh T. IgA antiendomysium antibodies have a high predictive value for celiac disease in asymptomatic patients. Allergy 49: , Sategna-Guidetti C, Pulitano R, Grosso S, Ferfoglia G. Serum IgA antiendomysium antibody titers as a marker of intestinal involvement and diet compliance in adult celiac sprue. J Clin Gastroenterol 17: , Catassi C. Screening of coeliac disease. In: Maki M, Collin P, Visakorpi JK. editors. Coeliac disease. Tampere (Finland): Coeliac Disease Study Group; p , Dieterich W, Ehnis T, Bauer M, et al. Identification of tissue transglutaminase as the autoantigen of celiac disease. Nature Medicine 3: , Sollid LM, Molberg O, McAdam S, Lundin K, et al. Autoantibodies in coeliac disease: tissue transglutaminase guilt by association? Gut 41: , Biosafety in Microbiological and Biomedical Laboratories. Center for Disease Control/National Institute of Health, 1999, 2007, Fifth Edition. Κατασκευαστής: INOVA Diagnostics, Inc Old Grove Road San Diego, CA United States of America Technical Service GRC October 2009 Revision 7 Aντιπροσωπευτικός: Medical Technology Promedt Consulting GmbH Altenhofstrasse 80 D St. Ingbert, Germany Tel.: Fax.: