QUANTA Lite TM h-ttg Screen Για In Vitro Διαγνωστική Χρήση CLIA σύνθετος: ψηλός

Transcript

1 QUANTA Lite TM h-ttg Screen Για In Vitro Διαγνωστική Χρήση CLIA σύνθετος: ψηλός Σκοπό Χρήση Το QUANTA Lite TM h-ttg Screen είναι μια ενζυμική ανοσοπροσροφητική ανάλυση (ELISA) για την ημιποσοτική ανίχνευση των IgA και IgG αντισωμάτων σε τρανσγλουταμινάση ανθρώπινου ιστού (h-ttg) σε ανθρώπινο ορό. Η παρουσία αυτών των αντισωμάτων μπορεί να χρησιμοποιηθεί σε συνδυασμό με κλινικά ευρήματα και άλλες εργαστηριακές δοκιμασίες για τη διάγνωση κοιλιακής νόσου με επάρκεια IgA και έλλειψη IgA όπως και της ερπητοειδούς δερματίτιδας. Περιληψη Και Αρχη Μεθοδου Η κοαιλιοκάκη ή η εντεροπάθεια ευαίσθητη στην γλουτένη είναι μια χρόνια κατάσταση, στην οποία ως κύριο χαρακτηριστικό περιλαμβάνεται το φούσκωμα και η χαρακτηριστική ιστολογική «λείανση» του εντερικού βλεννογόνου υμένα, έχοντας ως αποτέλεσμα ένα σύνδρομο δυσαπορρόφησης. Η ακριβής αιτιολογία της ασθένειας παραμένει άγνωστη, αλλά η γλιαδίνη ή το αλκοολούχο διαλυτό κλάσμα της γλουτένης του σίτου είναι σαφέστατα ο τοξικός παράγοντας. 1 Αρχικά, χρησιμοποιούνταν μια σειρά από πολλαπλές βιοψίες εντέρου για τη διάγνωση της κοιλιακής νόσου και των σχετικών διαταραχών. Πιο πρόσφατα, ορολογικές εξετάσεις έχουν προταθεί για έναν εξεταζόμενο πληθυσμό ασθενών με εντοπισμένη εντεροπάθεια ευαίσθητη στην γλουτένη, καθώς και για την διατήρηση υπό έλεγχο μιας διαιτητικής συμβιβαστικότητας. 2-5 Η Ευρωπαϊκή Επιτροπή για την Παιδιατρική Γαστρεντερολογία και Διατροφή (ESPGAN) έχει συστήσει τη χρήση ορολογικών δεικτών όπως η γλιαδίνη, καθώς και η ρετικουλίνη και τα ενδομυϊκά αντισώματα, για να μειώσουν τον αριθμό των εντερικών βιοψιών που χρειάζονται για να βγει μια διάγνωση. 6 Το αντιγόνο ενδομυΐου αναγνωρίστηκε ως το ένζυμο διασταυρούμενης σύνδεσης πρωτεΐνης, γνωστό ως τρανσγλουταμινάση ιστού (ttg). 7,8 Οι ειδικές για αντιγόνο διαδικασίες ELISA οι οποίες περιλαμβάνουν ttg προσφέρουν μια αξιόπιστη, αντικειμενική εναλλακτική λύση στις παραδοσιακές αναλύσεις με βάση ανοσοφθορισμό που συμπεριλαμβάνουν λεπτά τμήματα οισοφάγου πρωτευόντων θηλαστικών ως υπόστρωμα Η διαδικασία ELISA μπορεί να προσαρμοστεί σε μεγάλους και μικρούς αριθμούς δειγμάτων. Εντός των τελευταίων δύο ετών, το ανθρώπινο αντιγόνο ttg παρήχθη με τη βοήθεια της ανασυνδυασμένης τεχνολογίας. Το ανασυνδυασμένο ανθρώπινο αντιγόνο μπορεί να παρουσιάζει ορισμένα πλεονεκτήματα σε σύγκριση με το πιο παραδοσιακό αντιγόνο ήπατος ινδικού χοιριδίου. 9,10,13 Δύο πιο πρόσφατες εξελίξεις στην οροδιαγνωστική της κοιλιακής νόσου είναι η χρήση αμιγούς τρανσγλουταμινάσης ανθρώπινου ιστού απομονωμένης από ερυθρά, και η χρήση δοκιμασιών ικανών να ανιχνεύσουν την τρανσγλουταμινάση ιστού τάξης IgG. Η χρήση αμιγούς ttg ανθρώπινων ερυθρών αντί για ινδικού χοιριδίου ή ανασυνδυασμένου παραγόμενου ανθρώπινου αντιγόνου προσφέρει το πλεονέκτημα της εύκολης κάθαρσης και αποτελεσμάτων σε παρασκευές ελεύθερες μολυσματικών πρωτεϊνών βακτηρίων, εντόμων ή άλλης προέλευσης. 14,15,16,17 Οι αναλύσεις ttg ELISA ανθρώπινου αντιγόνου οι οποίες παρουσιάζονται στη βιβλιογραφία φαίνεται ότι λειτουργούν καλά σε σύγκριση με τις πιο παραδοσιακές δοκιμασίες με βάση αντιγόνο ινδικού χοιριδίου. 9,10,13-16 Τα κιτ αντισώματος γλιαδίνης τάξης IgG χρησιμοποιούνται εδώ και αρκετό καιρό, κυρίως για την αξιολόγηση των ατόμων με έλλειψη IgA. Αρκετοί ερευνητές κατέδειξαν την κλινική χρησιμότητα της ανίχνευσης των αντισωμάτων τάξης IgG στην ttg. 10,13,14 Σε μία μελέτη, η ευαισθησία της δοκιμασίας αυξήθηκε από 91.5% για αντίσωμα IgA μόνο στο 98.5% όταν εξετάστηκαν τα αποτελέσματα και των δύο IgA και IgG. 10 Η Ερπητοειδής Δερματίτιδα (DH) είναι μία νόσος του δέρματος η οποία, όπως και η κοιλιακή νόσος, προκαλείται από την κατανάλωση πρωτεΐνης σιταριού. Η πλειοψηφία των ασθενών με DH έχουν ατροφία λαχνών στη νήστιδα ίδια με εκείνη που απαντάται στην κοιλιακή νόσο και η αυστηρή διατροφή ελεύθερη γλουτένης βελτιώνει τις βλάβες του εντέρου και του δέρματος. 18,19 Οι τρέχουσες οροδιαγνωστικές μέθοδοι όπως οι αναλύσεις EMA και ttg παρουσιάζουν απογοητευτικά αποτελέσματα στις δοκιμές για DH, με εύρος ευαισθησιών από μόνο 60-75% 20,21 συγκριτικά με ευαισθησίες 95% και υψηλότερες που έχουν αναφερθεί για κοιλιακή νόσο. Το QUANTA Lite TM h-ttg Screen είναι μια ευαίσθητη και ειδική δοκιμασία διαλογής για κοιλιακή νόσο και μια σχετική αναταραχή ερπητοειδούς δερματίτιδας. Επιτρέπει την ταυτόχρονη ανίχνευση και των δύο αντισωμάτων IgA και IgG σε ένα επιλεκτικά απαμιδωμένο συνθετικό πεπτίδιο και h-ttg και επιτρέπει την ανίχνευση της κοιλιακής νόσου ακόμα και με συνυπάρχουσα έλλειψη IgA. Αρχη Μεθοδου Το κεκαθαρμένο φυσικό ανθρώπινο αντιγόνο από είναι συνδεδεμένο στα πηγαδάκια της μικροπλάκας από πολυστυρένιο υπό συνθήκες όπου διατηρούνται οι φυσικοχημικές ιδιότητες του. Προαραιωμένοι πρότυποι οροί ελέγχου (controls) και αραιωμένα δείγματα ασθενών προσθέτονται στα πηγαδάκια επιτρέποντας στα h-ttg IgΑ ή IgG αντισώματα να συνδεθούν με το ακινητοποιημένο αντιγόνο. Μη αντιδρώντα αντισώματα ξεπλένονται και προσθέτεται αντι ανθρώπινο IgA και IgG αντίσωμα συνδεδεμένο με ένζυμο. Η δεύτερη επώαση επιτρέπει την σύνδεση του αντι ανθρώπινου IgA και IgG αντισώματος με τα σχηματισμένα συμπλέγματα αντισώματος ακινητοποιημένου αντιγόνου. Στη συνέχεια η προσθήκη υποστρώματος υπεροξειδάσης προκαλεί χρωματική αλλαγή ανάλογη με τη συγκέντρωση των αντισωμάτων. Μετά τη διακοπή της ενζυματικής παραγωγής χρώματος, η παρουσία ή η απουσία αντισωμάτων συγκρίνεται με την οπτική πυκνότητα των πρότυπων αναφοράς. Αντιδραστηρια 1. Πλάκα μικροκοιλοτήτων πολυστυρενίου ELISA επικαλυμμένη με αντιγόνο τρανσγλουταμινάση ανθρώπινου ιστού, (12-1 x 8 κοιλότητες), με θήκη σε αλουμινένια συσκευασία που περιέχει αφυγραντικά 1

2 2. ELISA Negative Αρνητικός πρότυπος ορος ελέγχου (1 φιαλίδιο 1.2ml αραιωμένου διαλύματος χωρίς ανθρώπινα IgA και IgG αντισώματα h-ttg) 3. h-ttg Screen ELISA Low Positive (χαμηλό θετικό), 1 φιαλίδιο ρυθμιστικού διαλύματος που περιέχει συντηρητικό και αντισώματα ανθρώπινου IgA και IgG ορού σε ανασυνδυασμένο ανθρώπινο h-ttg, προαραιωμένο, 1.2ml 4. h-ttg Screen ELISA High Positive (υψηλό θετικό), 1 φιαλίδιο ρυθμιστικού διαλύματος που περιέχει συντηρητικό και αντισώματα ανθρώπινου IgA και IgG ορού σε ανασυνδυασμένο ανθρώπινο h-ttg, προαραιωμένο, 1.2ml 5. HRP Sample Diluent, 1 φιαλίδιο χρώματος ροζ, που περιέχει Tris ρυθμιστικό αλατούχο διάλυμα, Tween 20, σταθεροποιητές πρωτεΐνης και συντηρητικό, 50ml 6. HRP Wash Concentrate, 1 φιαλίδιο των 40x συμπυκνωμάτων χρώματος κόκκινου, που περιέχει Tris ρυθμιστικό αλατούχο διάλυμα και Tween 20, 25ml. Ανατρέξτε στο Τμήμα Μεθόδων για οδηγίες αραίωσης. 7 HRP Conjugate h-ttg IgG/IgA (αίγας), αντι-ανθρώπινη IgG και IgA, 1 φιαλίδιο άχρωμο, που περιέχει ρυθμιστικό διάλυμα, σταθεροποιητές πρωτεΐνης και συντηρητικό, 10ml 8. TMB Chromogen, 1 φιαλίδιο που περιέχει σταθεροποιητές, 10 ml 9. HRP Stop Soulution, 0.344M θειικό οξύ, 1 φιαλίδιο άχρωμο, 10ml Προσοχή 1. ΠΡΟΕΙΔΟΠΟΙΗΣΗ: Αυτό το προϊόν περιέχει ένα χημικό (0.02% chloramphenicol) στο αραιωτικό δείγματος, στους ορούς ελέγχου και στο σύζευγμα, το οποίο είναι γνωστό στην Πολιτεία της Καλιφόρνιας ότι προκαλεί καρκίνο. 2. Όλα τα αντιδραστήρια ανθρώπινης προέλευσης κατά τη διάρκεια της προετοιμασίας των μαρτύρων αυτού του προϊόντος έχουν ελεγχθεί και είναι αρνητικά για αντισώματα έναντι HIV, HBsAg, HCV όπως ορίζεται από τους κανονισμούς του FDA. Καμία μέθοδος πάντως δεν είναι σε θέση να αποκλείσει την παντελή απουσία μολυσματικών παραγόντων όπως και για HIV, HBV, HCV. Γι αυτό και όλοι οι ανθρώπινης προέλευσης μάρτυρες θα πρέπει να χρησιμοποιούνται ως δυνητικά μολυσματικά υλικά Το αζίδιο του νατρίου χρησιμοποιείται ως συντηρητικό. Το αζίδιο του νατρίου είναι δηλητήριο και μπορεί να είναι τοξικό σε περίπτωση κατάποσης. Το αζίδιο νατρίου μπορεί να αντιδράσει με μολύβδινες ή χάλκινες σωληνώσεις με αποτέλεσμα την πρόκληση δυνητικά εκρηκτικών μεταλλικών ενώσεων αζιδίων. Αν για την απόρριψη του αντιδραστηρίου χρησιμοποιούνται λεκάνες απόπλυσης, η συγκέντρωση των αζιδίων μπορεί να αποφευχθεί ξεπλένοντας με άφθονο νερό. 4. Το σύζευγμα περιέχει μια δηλητηριώδη/διαβρωτική χημική ουσία η οποία μπορεί να είναι τοξική εάν γίνει κατάποσή της σε μεγάλες ποσότητες. Aποφύγετε πιθανά εγκαύματα αποφεύγετε επαφή με τα μάτια και το δέρμα. 5. Το TMB χρωμογόνο περιέχει μία ερεθιστική ουσία που μπορεί να είναι επικίνδυνη εάν την εισπνεύσετε εάν καταποθεί ή εάν απορροφηθεί από το δέρμα. Αποφύγετε κάποιο τραυματισμό, την εισπνοή, κατάποση και επαφή με το δέρμα ή τα μάτια. 6. Το διάλυμα διακοπής της αντίδρασης (Stop Solution) περιέχει θειικό οξύ το οποίο είναι δηλητηριώδες, διαβρωτικό και τοξικό. Για να αποφύγετε χημικά εγκαύματα αποφύγετε την επαφή του με το δέρμα και τα μάτια. 7. Να χρησιμοποιείτε τον κατάλληλο προστατευτικό εξοπλισμό όταν δουλεύετε με τα αντιδραστήρια. 8. Αντιδραστήρια που έχουν χυθεί πρέπει να καθαρίζονται αμέσως. Τηρείτε όλους τους ομοσπονδιακούς, εθνικούς και τοπικούς περιβαλλοντικούς κανονισμούς για την απόρριψη αποβλήτων. Ειδικα Μετρα 1. Αυτό το προϊόν είναι γδια διαγνωστική χρήση In Vitro. 2. Η αντικατάσταση συστατικών με διαφορετικά από τα παρεχόμενα σε αυτό το σύστημα μπορεί να οδηγήσει σε ανακριβή αποτελέσματα. 3. Ανεπαρκές πλύσιμο της μικροπλάκας ή αναποτελεσματική αφαίρεση των διαλυμάτων στα ενδιάμεσα στάδια μπορεί να επηρεάσει την ακρίβεια της μεθόδου. 4. Η λειτουργία αυτής της μεθόδου σε αυτόματο αναλυτη καί άλλες συσκευές διανομής, μπορεί να δώσει διαφορετικά αποτελέσματα απο αυτά που αποκτώνται στη χειρωνακτική διαδικασία. Είναι στήν ευθύνη του κάθε εργαστηρίου να καθορίσει τις αποδεκτές τιμές και όρια της αυτόματης διαδικασίας. 5. Μια ποικιλία παραγόντων μπορεί να επηρεάσει την απόδοση της μεθόδου: Η θερμοκρασία των αντιδραστηρίων, η θερμοκρασία του εργαστηριακού χώρου, η ακρίβεια και επαναληψιμότητα του πιπεταρίσματος, η πλύση και η αφαίρεση των διαλυμάτων από τη μικροπλάκα, η ποιότητα του φωτόμετρου, οι χρόνοι επώασης. Προσεκτική τήρηση της διαδικασίας είναι απαραίτητη για ακριβή και επαναλήψιμα αποτελέσματα. 6. Συνιστάται η ακριβής τήρηση του πρωτοκόλλου. 7. Ανεπαρκής συντήρηση της μικροπλάκας (κλείσιμο της αχρησιμοποίητης πλάκας) μπορεί να προκαλέσει αποδομή του συνδεδεμένου αντιγόνου και αποτελέσματα χαμηλής ακρίβειας. 8. Μη αποδεκτές χαμηλές τιμές απορρόφησης μπορεί να παρατηρηθούν αποδύο η περισσότερες χρήσεις της σφαιρίνης απο το ίδιο φιαλίδιο. Είναι σημαντικό να ακολουθείτε τις οδηγίες χρήσης της σφαιρίνης. 9. Χημική μόλυνση της σφαιρίνης μπορεί να προέλθει απο ανεπαρκή καθαρισμό των τμημάτων διανομής των αναλυτών. Κατάλοιπα απο εργαστηριακά χημικά όπως φορμαλίνη, χλωρίνη, εθανόλη, η απορρυπαντικά θα προκαλέσουν υποβιβασμό της σφαιρίνης με το χρόνο. Συνιστάται ο καθαρισμός των οργάνων και συσκευών μετα τη χρήση χημικών καθαριστικών. 2

3 Αποθήκευση 1. Αποθηκεύσατε τα αντιδραστήρια στους 2-8 ο C. Να μήν παγώνουν. Είναι σταθερά για χρήση μέχρι τη λήξη τους εάν αποθηκεύονται συμφωνα με τις οδηγίες. 2. Οι μη χρησιμοποιούμενες σειρές επικαλυμένων με αντιγόνο πηγαδιών πρέπει να ασφαλίζονται στην αλουμινένια συσκευασία τους, η οποία περιέχει απορροφητικό υγρασίας, και να φυλάσονται στούς 2-8 ο C. 3. Το αραιωμένο διάλυμα πλύσης είναι σταθερό για μία εβδομάδα στούς 2-8 ο C. Δείγματα Η διαδικασία μπορεί να πραγματοποιηθεί μόνο με δείγματα ορού. Η προσθήκη αζιδίου η άλλων συντηριτικών στο υποό έλεγχο δείγμα μπορεί να επιρεάσει τα αποτελέσματα. Μικροβιακή μόλυνση, θέρμανση η δείγματα περιέχοντα ορατά ξένα στοιχεία δέν πρέπει να χρησιμοποιούνται. Αιμολυθέντα η λιπαιμικά δείγματα η ορός πρέπει να αποφεύγονται. Μετά τη συλλογή του δείγματος, ο ορός θα πρέπει να διαχωρίζεται άμεσα από το ολικό αίμα.clsi (NCCLS) Document H18-A3 προτείνει τις παρακάτω συνθήκες συντήρησης και αποθήκευσης των δειγμάτων: Τα δείγματα πρέπει να διατηρούνται σε θερμοκρασία δωματίου όχι περισσότερο από 8 ώρες. Σε περίπτωση που η δοκιμασία δεν πραγματοποιηθεί άμεσα, τότε τα δείγματα μπορούν να διατηρηθούν σε θερμοκρασία συντήρησης (2 8 ο C ) μέχρι 48 ώρες. Για μεγαλύτερο διάστημα, τα δείγματα θα πρέπει να καταψυχθούν στους 20 ο C. Τα κατεψυγμένα δείγματα πρέπει να αναμιχθούν καλά μετά την απόψυξη και πριν από την εξέταση. 23 Διαδικασία Υλικά που παρέχονται 1 h-ttg Screen ELISA μικροπλάκα (12-1x8 πηγαδάκια), με βάση 1 1.2ml αραιωμένος ELISA Negative Αρνητικός πρότυπος ορός ελέγχου (έτοιμος προς χρήση) 1 1.2ml αραιωμένος h-ttg Screen Low Θετικός πρότυπος ορός ελέγχου (έτοιμος προς χρήση) 1 1.2ml αραιωμένος h-ttg Screen High Ρυθμιστής (έτοιμος προς χρήση) 1 50ml HRP Sample Diluent, HRP Αραιωτικό δείγματος 1 25ml HRP Wash Concentrate, HRP Συμπύκνωμα πλύσης, 40x συμπυκνωμάτων 1 10ml HRP h-ttg IgG/IgA Conjugate, HRP Σύζευγμα IgG και IgA (αίγας), 1 10ml TMB Chromogen, TMB Χρωμογόνο 1 10ml HRP Stop Solution, HRP Διάλυμα διακοπής, 0.344M θεεινικό οξύ Αντιδραστήρια και εξοπλισμός που δεν συμπεριλαμβάνονται Μικροπιπέτες ρυθμιζόμενου όγκου 5, 100, και 500 μl Απορριπτόμενα ρύγχη για μικροπιπέττες Σωληνάρια για την διάλυση δειγμάτων των ασθενών όγκου 4 ml Αποσταγμένο ή μη ιονισμένο νερό 1L δοχείο για το διάλυμα HRP Wash Concentrate (Διάλυμα πλυσίματος) Φωτόμετρο μέτρησης της μικροπλάκας με δυνατότητα φίλτρου στα 450 και 620 nm Μεθοδολογια Πριν ξεκινήσετε 1. Όλα τα αντιδραστήρια και τα δείγματα θα πρέπει να βρίσκονται σε θερμοκρασία δωματίου (20 26 C) και να έχουν αναδευτεί καλά. 2. Αραιώστε το συμπυκνωμένο HRP διάλυμα πλύσεων 1:40 προσθέτοντας το περιεχόμενο του φιαλιδίου σε 975 ml απεσταγμένου νερού. Σε περίπτωση που δέν θα χρησιμοποιήσετε ολόκληρη τη μικροπλάκα μπορείτε να χρησιμοποιήσετε μικρότερη ποσότητα ετοιμάζοντας 2 ml συμπυκνωμένου Wash και 78 ml απεσταγμένου νερού για κάθε 16 πηγαδάκια. Το αραιωμένο υπόστρωμα είναι σταθερό για μία εβδομάδα στους 2-8 C. 3. Ετοιμάστε τις αραιώσεις 1:101 των δειγμάτων υπό εξέταση προσθέτοντας 5 μl ορού σε 500μl αραιωτικό δείγματος. Η προετοιμασία των δειγμάτων θα πρέπει να γίνεται εντός 8 ωρών. Οι θετικος και ο αρνητικός πρότυποι οροί δεν χρειάζονται αραίωση. 4. Για την αποτελεσματικότερη ακρίβεια των αποτελεσμάτων προτείνεται η εις διπλούν τοποθέτηση όλων των διαλυμάτων αναφοράς, πρότυπων ορών ελέγχου και δειγμάτων. Συνιστάται η επανάληψη της εξέτασης των δειγμάτων. Διαδικασία 1. Όλα τα αντιδραστήρια και τα δείγματα θα πρέπει να βρίσκονται σε θερμοκρασία δωματίου (20 26 C) και να έχουν αναδευτεί καλά. Υπολογίστε τον απαραίτητο αριθμό πηγαδιών που απαιτούνται, και φυλάξτε τις υπόλοιπες στην ειδική θήκη την οποία θα πρέπει να την κλείσετε καλά ώστε να προστατέψετε την μικροπλάκα από την υγρασία. 2. Προσθέστε 100 μl πρότυπων ορών ελέγχου, υψηλού, χαμηλού, αρνητικού και των υπό έλεγχο αραιωμένων δείγματων στις προκαθορισμένες θέσεις. Καλύψτε την μικροπλάκα και επωάστε για 30 λεπτά σε θερμοκρασία δωματίου. Ο χρόνος επώασης ξεκινάει με τη προσθήκη του τελευταίου δείγματος. 3. Πλύση: Ξεπλύνετε καλά κάθε πηγαδάκι από τα περιεχόμενα. Προσθέστε µL αραιωμένου ρυθμιστικού διαλύματος πλύσης HRP σε όλα τα πηγαδάκια και ξεπλύνετε. Επαναλάβετε τη διαδικασία δύο ακόμα φορές, για τρεις πλύσεις συνολικά. Αναποδογυρίστε την μικροπλάκα και τινάξτε την σε απορροφητικό υλικό για να αφαιρέσετε το εναπομείναν υγρό κατόπιν της τελικής 3

4 πλύσης. Είναι σημαντικό κάθε πηγαδάκι να είναι εντελώς άδειο μετά από κάθε πλύση. Ακολουθήστε την ίδια διαδικασία για την πλύση όπως και για την προσθήκη των δειγμάτων. 4. Προσθέστε 100 μl HRP h-ttg IgG/IgA συζεύγματος σε όλες τις πηγαδάκια. Το σύζευγμα πρέπει να αφαιρεθεί από τα φιαλίδια χρησιμοποιώντας τυπικές ασηπτικές συνθήκες και καλές εργαστηριακές πρακτικές. Αφαιρέστε από το φιαλίδιο την ποσότητα συζεύγματος που είναι απαραίτητη για την ανάλυση. ΠΡΟΣ ΑΠΟΦΥΓΗ ΕΝΔΕΧΟΜΕΝΗΣ ΜΙΚΡΟΒΙΟΛΟΓΙΚΗΣ Ή/ΚΑΙ ΧΗΜΙΚΗΣ ΜΟΛΥΝΣΗΣ, ΔΕΝ ΠΡΕΠΕΙ ΠΟΤΕ ΝΑ ΕΙΣΑΓΕΤΕ ΞΑΝΑ ΣΤΟ ΦΙΑΛΙΔΙΟ ΤΗΝ ΠΟΣΟΤΗΤΑ ΣΥΖΕΥΓΜΑΤΟΣ ΠΟΥ ΔΕΝ ΧΡΗΣΙΜΟΠΟΙΗΘΗΚΕ. Πραγματοποιήστε επώαση στα πηγαδάκια για 30 λεπτά, όπως στο βήμα Πλύση: Επαναλάβετε το βήμα Προσθέστε 100 μl TMB χρωμογόνου. Επωάστε τη μικροπλάκα για 30 λεπτά σε σκοτεινό μέρος. 7. Προσθέστε 100µL διαλύματος διακοπής αντίδρασης (HRP Stop Solution) σε κάθε πηγαδάκι. Ακολουθήστε την ίδια διαδικασία και πρόγραμμα του πρόσθετου διαλύματος διακοπής της αντίδρασης (HRP Stop Solution) όπως χρησιμοποιήθηκε για το χρωμογόνο TMB. Τινάξτε ελαφρά την μικροπλάκα με το δάκτυλο, για να αναμιχθούν εκτενώς τα πηγαδάκια. 8. Η μέτρηση της οπτικής πυκνότητας των δειγμάτων θα πρέπει να γίνει εντός μίας ώρας από το τέλος της διαδικασίας, σε φωτόμετρο στα 450 nm με φίλτρο αναφοράς 620 nm προαιρετικά. Ποιοτικός έλεγχος 1. Οι θετικοί και ο αρνητικός πρότυποι οροί ελέγχου θα πρέπει να χρησιμοποιούνται σε κάθε ανοσοενζυμική διαδικασία έτσι ώστε να εξασφαλίζεται ότι τα αντιδραστήρια και οι διαδικασίες λειτουργούν σωστά. 2. Οι θετικοί και ο αρνητικός πρότυποι οροί ελέγχου είναι ήδη αραιωμένοι. Γι αυτό το λόγο δεν μπορούν να χρησιμοποιηθούν ως μέτρο ελέγχου της διαδικασίας αραίωσης των δειγμάτων. 3. Επιπλέον κατάλληλοι οροί, μάρτυρες, θα μπορούσαν να χρησιμοποιηθούν από δείγματα ρουτίνας τα οποία θα αποθηκεύονται στη βαθιά κατάψυξη. πολιτειακών και\ ή των ομοσπονδιακών κανονισμών ή επικυρωμένων οργανισμών. Μπορείτε να ετοιμάσετε επιπλέον απαραίτητο ορό μάρτυρα διαιρώντας σε ίσα μέρη τα δείγματα ανθρώπινου ορού που βρίσκεται στα πηγαδάκια και φυλάσσοντας στους -20 C. 4. Για να θεωρηθούν τα αποτελέσματα έγκυρα θα πρέπει να ισχύουν τα παρακάτω κριτήρια. Στη περίπτωση που κάποιο κριτήριο δεν ισχύσει τότε θα πρέπει να επαναληφθεί η διαδικασία. α. Η απορρόφηση του υψηλού θετικού πρότυπου ορού ελέγχου (high positive) θα πρέπει να είναι μεγαλύτερη από την απορρόφηση του χαμηλού θετικού πρότυπου ορού ελέγχου (low positive) η οποία θα πρέπει να είναι μεγαλύτερη από την απορρόφηση του αρνητικού πρότυπου ορού ελέγχου. β. Η απορρόφηση του υψηλού θετικού πρότυπου ορού ελέγχου (high positive) θα πρέπει να είναι μεγαλύτερη από 1.0 ενώ η απορρόφηση του αρνητικού πρότυπου ορού ελέγχου δεν θα πρέπει να υπερβαίνει το 0.2. γ. Η απορρόφηση του χαμηλού θετικού πρότυπου ορού ελέγχου (low positive) θα πρέπει είναι μεγαλύτερη από το διπλάσιο της απορρόφησης του αρνητικού πρότυπου ορού ελέγχου ή μεγαλύτερη από δ. Ο αρνητικός και ο υψηλός έλεγχοι δείχνουν την εγκυρότητα της διαδικασίας. Ο υψηλός θετικός δέν αντιστοιχεί στό σημείο αποκοπής της μεθόδου. ε. Ο χρήστης μπορεί να απευθυνθεί στό έγγραφο C24-A3 toυ CLSI (NCCLS) για περισσότερα στοιχεία του ποιοτικού ελέγχου. 24 Υπολογισμός Αποτελεσμάτων Ο μέσος όρος απορροφητικότητας (O.A.) για κάθε διπλό δείγμα πρέπει πρώτα να υπολογισθεί. Η αντίδραση για κάθε δείγμα μπορεί μετά να υπολογισθεί διαιρώντας το μέσο όρο απορροφητικότητας του δείγματος με το μέσο όρο απορροφητικότητας του h-ttg Screen ELISA Low, και πολλαπλασιάζοντας το αποτέλεσμα με την τιμή του h-ttg Screen ELISA Low. Η τιμή του h-ttg Screen ELISA Low σε (units) φαίνεται στην ετικέτα του φιαλιδίου. Τιμή δείγματος Ο.A. δείγματος (μονάδες) = X h-ttg Screen oρού ελέγχου O.A. h-ttg Screen ορού ελέγχου (μονάδες) Η αντιδραστικότητα σχετίζεται με την ποσότητα του παρόντος αντισώματος σε ένα μη-γραμμικό τρόπο. Ενώ οι αυξήσεις και οι μειώσεις στις συγκεντρώσεις των αντισωμάτων του ασθενή θα αντικατοπτρίσουν μια ανταποκρινόμενη άνοδο ή πτώση στην αντιδραστικότητα, η αλλαγή δεν είναι ανάλογη (π.χ. ένας διπλασιασμός της συγκέντρωσης του αντισώματος δεν θα διπλασιάσει την αντιδραστικότητα). Αν απαιτείται ακριβέστερη ποσοτικοποίηση των αντισωμάτων του εξεταζόμενου, πρέπει να γίνουν διαδοχικές αραιώσεις του δείγματος και η τελευταία αραίωση που θα μετρηθεί ως θετική στην ανάλυση θα αναφερθεί ως ισχύς διαλύματος αντισωμάτων του ασθενούς. Ανάλυση και Αξιολόγηση Αποτελεσμάτων Κάθε εργαστήριο πρέπει να καθορίσει τίς δικές του τιμές αναφοράς βάσει τών τεχνικών, ελέγχων και πλυθισμού κ.λ.π. Το δείγμα μπορεί να χαρακτηρισθεί σάν αρνητικό η θετικό. Mονάδες Αρνητικό <20 θετικά >20 4

5 1. Ενα θετικό αποτέλεσμα δείχνει τη παρουσία h-ttg IgA και/ή IgG αντισωμάτων καί την πιθανότητα εντεροπαθειας ευαίσθητη στη γλουτένη, όπως η κοιλιοκάκη και η ερπητοειδής δερματίτιδα. Εάν απαιτείται επιβεβαίωση της έλλειψης IgA, το δείγμα πρέπει να αναλυθεί εκ νέου με μια ποσοτική δοκιμασία IgA. 2. Το αρνητικό αποτέλεσμα δείχνει τη απουσία αντισωμάτων h-ttg IgA ή IgG στάθμής κάτω του ορίου ανίχνευσης. 3. Συστήνεται τα αποτελέσματα να συνοδεύονται με την πληροφορία «τα ακόλουθα αποτελέσματα προέκυψαν με INOVA QUANTA Lite TM h-ttg Screen ELISA. Οι τιμές gliadin πεπτίδιο και h-ttg Ig G/A που προκύπτουν απο διαφορετικούς κατασκευαστές δέν είναι συγκρίσιμες. Οι τιμές δέν μπορούν να συσχετισθούν με τόν τελικό τίτλο. Το μέγεθος των αναφερόμενων επιπέδων αντίσωμα δεν μπορεί να συσχετιστεί με ένα τίτλο τελικού σημείου.» Περιορισμοί της Μεθόδου 1. Ένα αρνητικό αποτέλεσμα σε έναν ασθενή χωρίς θεραπεία, δεν αποκλείει εντελώς την εντεροπάθεια με ευαισθησία στη γλουτένη. 2. Είναι δυνατή η ύπαρξη ψευδών θετικών (υψηλά επίπεδα αντισωμάτων χωρίς χαρακτηριστικά ιστολογικά ευρήματα). Άλλες ειδικές κοιλιακές οροδιαγνωστικές δοκιμασίες όπως η δοκιμασία ενδομυΐου (EMA) και παραγόμενα από γλιαδίνη πεπτίδια (DGP)μπορούν να εκτελεστούν για την επιβεβαίωση των θετικών ευρημάτων. Τα επίπεδα IgA ορού μπορούν επίσης να μετρηθούν για τον έλεγχο των ελλείψεων IgA. 3. Αυτή η δοκιμή εντοπίζει ταυτόχρονα τα αντισώματα IgA και IgG. Αν είναι προτιμότερος ο ξεχωριστός καθορισμός συγκεκριμένων αντισωμάτων IgA ή IgG, η INOVA προσφέρει ξεχωριστά κιτ IgA και IgG ELISA (QUANTA Lite TM h-ttg IgA και QUANTA Lite TM h-ttg IgG) για αυτόν τον σκοπό. 4. Τα αποτελέσματα αυτής της ανάλυσης πρέπει να χρησιμοποιηθούν σε συνδυασμό με κλινικά ευρήματα και άλλες ορολογικές εξετάσεις. 5. Τα αποτελέσματα αυτής της μεθόδου δέν έχουν ελεγχθεί σάν ακριβεί γιά δείγματα εκτός ορού. 6. Η απόδοση της ανάλυσης αυτής δεν έχει προσδιοριστεί για τον παιδιατρικό πληθυσμό. Αναμενόμενες Τιμές Φυσιολογικές Τιμές 381 τυχαία ασυμπτωματικά, υγιή άτομα που διέμεναν στις ΗΠΑ δοκιμάστηκαν για αντισώματα σε h-ttg. Από αυτούς, 269 δότες ήταν γνωστό ότι κυμαίνονταν σε ηλικία από 14 έως 78 ετών και υμπεριλάμβαναν 141 άνδρες και 128 γυναίκες. 8 δείγματα (2.1%) ήταν πάνω από την οριακή τιμή των 20 μονάδων. 7 δείγματα ήταν θετικά με τιμές 20.3, 20.4, 22.1, 22.6, 23.3, 28.4 και 32.4 μονάδες. Τα διαρκέστε θετικά ήταν 54.9 και 39.0 μονάδες και πιστεύεται ότι είναι ενδεικτικά πραγματικής κοιλιακής νόσου λόγω του γεγονότος ότι τα αποτελέσματα IgA h-ttg ήταν 72.4 μονάδες αντίστοιχα. Η μέση τιμή των 381 δειγμάτων ήταν 8.6 μονάδες. Η τυπική απόκλιση των δειγμάτων ήταν 4.4 μονάδες. Η μέση τιμή είναι 2.5 τυπικές αποκλίσεις κάτω από την οριακή τιμή των 20 μονάδων. Ειδικά χαρακτηριστικά απόδοσης Μελέτη Aληλεπίδρασης 125 δείγματα από 4 εργαστήρια αναφοράς κοιλιακής νόσου εξετάστηκαν εσωτερικά τόσο με την QUANTA Lite TM h-ttg IgA και QUANTA Lite TM h-ttg IgG και QUANTA Lite TM h-ttg Screen ELISA. Παρακάτω παρατίθενται αυτά τα αποτελέσματα, συν τα 381 φυσιολογικά. Ένα δείγμα θεωρήθηκε θετικό από τις επιβεβαιωτικές αναλύσεις εάν υπήρχε θετικό αποτέλεσμα σε οποιαδήποτε από τις 2 επιβεβαιωτικές αναλύσεις (το αποτέλεσμα δεν ήταν απαραίτητο να είναι θετικό και στις σοι δύο αναλύσεις). Ένα δείγμα θεωρήθηκε αρνητικό από τις επιβεβαιωτικές αναλύσεις εάν υπήρχε αρνητικό αποτέλεσμα και στις σοι τρία επιβεβαιωτικές αναλύσεις. QUANTA Lite h-ttg IgA ή IgG Θετικός Αρνητικός Σύνολο QUANTA Lite h-ttg Screen Θετικός 52 13* 65 Αρνητικός Σύνολο Ποσοστό συμφωνίας θετικών: 52/52 (100%), 95% Διάστημα Εμπιστοσύνης (CI): 93.2% - 100% Ποσοστό συμφωνίας αρνητικών: 441/454 (97.1%), 95% Διάστημα Εμπιστοσύνης (CI): 95.2% % Γενική συμφωνία: 493/506 (97.4%), 95% Διάστημα Εμπιστοσύνης (CI): 96.7% % *Από τα 13 δείγματα που βρέθηκαν θετικά σε Εξέταση h-ttg/, αλλά αρνητικά και στα δύο κιτ h-ttg και h- ttg, 7 ήταν από την κανονική μελέτη. Από τους άλλους 6 ασθενείς, τρεις είναι ασθενείς με κοιλιακή νόσο που ακολουθούν διατροφή ελεύθερη γλουτένης, δύο είναι συγγενείς 1 ου βαθμού και ο τελευταίος είναι υγιής. Και τα 13 δείγματα έχουν τιμές κάτω από 30 μονάδες. Κλινικές μελέτες Δείγματα κλινικά καθοριζόμενα ως ασθενείς με κοιλιακή νόσο, ασθενείς με κοιλιακή νόσο με έλλειψη IgA, ασθενείς με λανθάνουσα κοιλιακή νόσο, ασθενείς με κοιλιακή νόσο που ακολουθούν διατροφή ελεύθερη γλουτένης, συγγενείς πρώτου βαθμού ασθενούς με κοιλιακή νόσο, άτομα ελέγχου με έλλειψη IgA, ασθενείς με ερπητοειδή δερματίτιδα ή ασθενείς χωρίς κοιλιακή νόσο εξετάστηκαν και στα δύο με χρήση του QUANTA Lite TM h-ttg Screen. Παρακάτω παρατίθεται μια σύνοψη των κλινικά προσδιορισμένων δειγμάτων συν από τα δείγματα φυσιολογικού εύρους που αναφέρονται παραπάνω. 5

6 Ομάδα ασθενών # Θετικά h-ttg % κοιλιακή χωρίς θεραπευτική αγωγή % Ελλιπή για IgA κοιλιακής νόσου % κοιλιακή, διατροφή ελεύθερη γλουτένης % συγγενείς 1 ου βαθμού % Eρπητοειδούς Δερματίτιδας % Ασθένεια έλεγχοι % Φυσιολογικά * 2.4% * 1 από τους 10 θετικούς ασθενείς βρέθηκε ότι ήταν θετικοί στις μεμονωμένες αναλύσεις h-ttg ELISA και επίσης θετικοί για ttg με την ανάλυση RIA υγρής φάσης. Εξέταση Κοιλιακής h-ttg ELISA Performance με Κοιλιακή Διάγνωση: Diagnosis* Θετικός Αρνητικός Σύνολο κοιλιακή χωρίς θεραπευτική αγωγή και Ελλιπή για IgA νόσου (συγγενείς 1 ου βαθμού Έλεγχοι ασθενειών και υγιείς έλεγχοι) QUANTA LITE Θετικός h-ttg Screen Αρνητικός Σύνολο * Δεν συμπεριλαμβάνονται οι 33 ασθενείς με κοιλιακή νόσο με διατροφή ελεύθερη γλουτένης. Ευαισθησία: 87.8% (36/41), 95% Διάστημα Εμπιστοσύνης (CI): 73.8% % Ειδίκευση: 97.1% (462/476), 95% Διάστημα Εμπιστοσύνης (CI): 95.1% % Ευαισθησία - Η συνολική ευαισθησία για κοιλιακή νόσο υπολογίζεται με την ομαδοποίηση των αποτελεσμάτων για όλους τους κοιλιακούς ασθενείς εκτός από εκείνους που ακολουθούν ήδη διατροφή ελεύθερη γλουτένης. Ο συνολικός αριθμός ασθενών με κοιλιακή νόσο είναι 41 από τους οποίους οι 36 ή το 87.8% ήταν θετικοί. Ειδίκευση - Η ειδικότητα μπορεί να υπολογιστεί ομαδοποιώντας τα 414 φυσιολογικά άτομα, τα 44 άτομα ελέγχου της νόσου και τους 18 συγγενείς πρώτου βαθμού. Αυτή η ομάδα έχει σύνολο 476 δείγματα. Από αυτά, 14 δείγματα ήταν θετικά για ειδικότητα 97.1%. Μελέτη-Aληλεπίδρασης Για την αξιολόγηση πιθανών προβλημάτων διασταυρωμένης αντιδραστικότητας με άλλα αυτοαντισώματα, αναλύθηκαν με το κιτ QUANTA Lite TM h-ttg Screen διάφορα δείγματα υψηλού τίτλου θετικά για αυτοαντισώματα. Συνολικά, αναλύθηκαν 44 δείγματα. Πολλά από τα δείγματα ήταν τα υψηλά θετικά ελέγχου από άλλα κιτ δοκιμών αντισωμάτων INOVA QUANTA Lite TM. Οι ειδικότητες περιλάμβαναν Chromatin (4), Centromere (4), GBM (4), SS-B (4), RNP (5), Scl-70 (6), Jo-1 (5), Sm (4), SS-A (4) et TPO (4). Η μέση τιμή αυτών των 44 δειγμάτων ήταν 5.27 μονάδες. Όλα τα δείγματα ήταν αρνητικά στην QUANTA Lite TM Εξέταση Κοιλιακής h-ttg.η μέση τιμή είναι 4.6 τυπικές αποκλίσεις κάτω από την οριακή τιμή των 20 μονάδων. Ενδοεργαστηριακή ακρίβεια Η απόδοση εντός της ανάλυσης για το QUANTA Lite TM h-ttg Screen αξιολογήθηκε εξετάζοντας 9 δείγματα 5 φορές συνολικά. Αυτή η δοκιμασία εκτελέστηκε από ένα μόνο χειριστή στην INOVA Diagnostics χρησιμοποιώντας μία παρτίδα του κιτ. Τα αποτελέσματα συνοψίζονται παρακάτω. Απόδοση εντός της ανάλυσης του QUANTA Lite TM h-ttg Screen ELISA Μέσες Μονάδες Τυπική απόκλιση Συντελεστής διακύμανσης % Η διακύμανση μεταξύ των αναλύσεων αξιολογήθηκε ελέγχοντας εις διπλούν ένα σύνολο 12 δειγμάτων αναλύθηκαν 6 φορές κατά την περίοδο 5 ημερών. Αυτή η δοκιμασία εκτελέστηκε από ένα μόνο χειριστή στην INOVA Diagnostics χρησιμοποιώντας μία παρτίδα του κιτ. Μία περίληψη των αποτελεσμάτων της μελέτης εμφανίζεται παρακάτω. Απόδοση ανάμεσα των αναλύσεων για το QUANTA Lite TM h-ttg Screen ELISA Μέσες Μονάδες Τυπική απόκλιση Συντελεστής διακύμανσης %

7 Διακύμανση από παρτίδα σε παρτίδα Ο έλεγχος διακύμανσης από παρτίδα σε παρτίδα διενεργήθηκε στην INOVA Diagnostics από 2 διαφορετικούς χειριστές χρησιμοποιώντας τρεις διαφορετικές παρτίδες του κιτ σε τρεις διαφορετικές ημέρες. Μία περίληψη των αποτελεσμάτων της μελέτης εμφανίζεται παρακάτω. Υψηλός Μέρος 1 Μέρος 2 Μέρος 3 Μέσες Μονάδες Std Dev %CV High Θετικός Έλεγχος Θετικός Θετικός Θετικός Θετικός Θετικός Θετικός Θετικός Θετικός Αντιδραστήριο Κενό Αρνητικός Έλεγχος Αρνητικός Αρνητικός Αρνητικός Αρνητικός

8 Βιβλιογραφία 1. Trier JS: Celiac Sprue. New England Journal of Medicine 325: , Troncone R and Ferguson A: Antigliadin antibodies. J Pediatr Gastroenterol Nutr 12: , McMillan SA, Haughton DJ, et al.: Predictive value for celiac disease of antibodies to gliadin, endomysium and jejunum in patients attending for jejunal biopsy. BMJ 303: , Lindh E, Ljunghall S, et al.: Screening for antibodies against gliadin in patients with osteoporosis. Journal of Internal Medicine 241: , Burgin-Wolff A, Gaze H, et al.: Antigliadin and antiendomysium antibody determination for celiac disease. Arch Dis Child 66: , Working Group of European Society of Paediatric Gastroenterology and Nutrition. Revised criteria for diagnosis of celiac disease. Arch Dis Child 65: , Dieterich W, Ehnis T, Bauer M, et al.: Identification of tissue transglutaminase as the autoantigen of celiac disease. Nature Medicine 3: , Sollid LM, Molberg O, McAdam S, Lundin K, et al.: Autoantibodies in celiac disease: tissue transglutaminase guilt by association? Gut 41: , Beutner EH, et al. A case of dermatitis herpetiformis with IgA endomysial antibodies but negative direct immunofluorescent findings. J Am Acad Dermatol 43: 329, Sardy M, et al.: Recombinant human tissue transglutaminase ELISA for the diagnosis of gluten-sensitive enteropathy. Clin Chem 45: 2142, Sblattero D, et al.: Human recombinant tissue transglutaminase ELISA : an innovative diagnostic assay for celiac disease. Am J Gastroenterology 95: 1253, Sugai E, et al.: Tissue transglutaminase antibodies in celiac disease: assessment of a commercial kit. Am J Gastro 95: , Lampasona V, et al.: Tissue transglutaminase and combined screening for celiac disease and type 1 diabetesassociated autoantibodies. Lancet 352: , Hansson T, et al.: Antibody reactivity against human and guinea pig tissue transglutaminase in children with celiac disease. J Pediatric Gastroenterology and Nutrition 30: 379, Andersson AS, et al.: Inhibition of endomysial staining with human tissue transglutaminase. Ninth International Symposium on Celiac Disease. J Pediatric Gastroenterology and Nutrition 31: S16, Axiö-Frekricksson UB, et al.: Differences in human and guinea pig tissue transglutaminase. Ninth International Symposium on Celiac Disease. J Pediatric Gastroenterology and Nutrition 31: S16, Signorini M, et al.: Human erythrocyte transglutaminase: Purification and preliminary characterization. Biological Chemistry 369: 275, Stober W: Gluten-sensitive enterophy: A nonallergic immune hypersensitivity of the gastrointestional tract. J. Allergy Clin. Immunol. July , Smecuol E, et al.: Permeability, Zonulin Production, and Enteropathy in Dermatitis Herpetiformis. Clinical Gastroenterology and Hepatology 3: , Beutner EH, et al.: Sensitivity and Specificity of IgA-class antiendomysial antibodies for dermatitis herpetiformis and findings relevant to their pathogenic significance. Journal of the American Academy of Dermatology 15: , Porter WM, et al.: Tissue Transglutaminase Antibodies in Dermatitis Herpetiformis Correspondence. Gastroenterology 117: , Biosafety in Microbiological and Biomedical Laboratories. Centers for Disease Control and Prevention/National Institutes of Health, Fifth Edition, CLSI (NCCLS). Procedures for the Handling and Processing of Blood Specimens; Approved Guidline-Third Edition. CLSI Document H18-A3, Vol 24(38), CLSI (NCCLS). Statistical Quality Control for Quantitative Measurement Procedures: Principles and Definitions; Approved Guideline- 3rd edition NCCLS Document C24-A3, Vol. 26(25), Κατασκευαστής: INOVA Diagnostics, Inc Old Grove Road San Diego, CA United States of America Aντιπροσωπευτικός: Medical Technology Promedt Consulting GmbH Altenhofstrasse 80 D St. Ingbert, Germany Tel.: Fax.: Technical Service April 2008 Revision GRC0 8