MOLEKULARNE OSNOVE ĆELIJE. Milena Ćurčić

Transcript

1 MOLEKULARNE OSNOVE ĆELIJE Milena Ćurčić

2

3 - RAZVIĆE EMBRIONA - OPLOĐENJE - DIFERENCIJACIJA

4 OBLIK ĆELIJA

5 - Membranski sistem ćelije Struktura ćelijske membrane

6 Ćelijska membrana Struktura ćelijske membrane: - lipidi (fosfolipidi, holesterol) - proteini (integralni, periferni) (transportni, receptori, enzimi, strukturni proteini) -Glikokaliks -Transport kroz ćelijsku membranu

7 - Bazofilna (ribozomi, RNK) - Acidofilna (mitohondrije)

8 CITOSKELET - Mikrofilamenti - intermedijalni filamenti - mikrotubuli

9 - Ćelijski korteks, ektoplazma

10 ĆELIJSKE ORGANELE - Nemembranske - Membranske organele

11 - Centriole - Ribozomi - diplozom - pericentriolski materijal - centrozom

12 -Endoplazmatični retikulum - Granulisani ER - sinteza proteina za sekreciju ili za potrebe same ćelije - Glatki ER - biosinteza lipida - unutarćelijski transport - sinteza holesterola, fosfolipida lipida membrane, učestvuje u metabolizmu glikogena - Sarkoplazmatični retikulum

13 - Goldžijev aparat - sinteza ugljenih hidrata - pakovanje, usmeravanje, - modifikacija proteina i lipida sintetisanih u ER - Primarni - Sekundarni - Tercijarni lizozom -Formirajuća ili cis strana i maturirajuća ili trans strana -Sadrži hidrolazne enzime za intracelularnu digestiju - autoliza - Različiti enzimi: peroksidaze, oksidaze, katalaze -U metabolizmu vodonik peroksida, detoksikaciji toksičnih supstanci

14 - Spoljašnja mitohondrijska membrana - porini - Unutrašnja mitohondrjska membrana - Kardiolipini - kontaktna mesta -Lanac za transport elektrona i kompleksi za sintezu ATP

15 - oblik, veličina, položaj jedra - Struktura jedra: jedrov omotač, nukleoplazma, nukleoskelet

16 - Hromatin - Različiti nivoi kondenzovanja lanca DNK

17 STRUKTURA NUKLEINSKIH KISELINA Nukeotid azotna baza, šećer, fosforna kiselina Nukleozid - azotna baza i šećer vezani N-glikozidnom vezom - Denaturacija DNK

18 OSNOVNA DOGMA MOLEKULARNE BIOLOGIJE - kod, kodon, antikodon

19 MEHANIZAM REPLIKACIJE KOD EUKARIOTA Replikacija je semikozervativna i semidiskontinuirana, bidirekciona Replikacija počinje istovremeno na mnogo mesta u hromozomu i završava se za nekoliko sati ARS (autonomously replicating sequences) elementi - mesta početka replikacije, oko 300 bp sa evolutivno očuvanim nizovima nukleotida; u kvascu oko 400 ARS; Replikativni počeci se nalaze u intervalu kb - genom čoveka ima rep. poč. Replikon region ARS gde započinje replikacija; replikator i inicijator Sukcesivno aktiviranje ARS Regulatorni proteini Inicijator - kompleks od šest proteina koji prepoznaje oridžin (ORC - origin recognation complex). ORC prepoznaje konzervativnu sekvencu u replikatoru kvasca (A elemenat), i manje konzervisan B region; ORC se vezuje i hidrolizuje ATP; ORC regrutuje replikacione proteine do replikatora.

20 5 vrsta DNK polimeraza: α, β, γ, δ i ε (poznato još 10tak polimeraza). Replikacija mitohondrijske DNK (γ) Reparacija oštećene DNK (β) Replikacija hromozomske DNK (α, δ i ε) DNK pol α od više subjedinica, primaza, polimeraza; sinteza lanca u 5-3 smeru; nema egzonukleaznu aktivnost; + PCNA (proliferating cell nuclear antigen) klema, egzonukleaza DNK pol δ i ε glavne replikaze DNK pol δ iseca prajmer; egzonukleazna aktivnost Replikacioni faktori RFA (uloga SSB proteina) i RFC (formiranje aktivnih repl. kompleksa)

21 D N K p o l i m e r a z e b a k t e r i j e E. C o l i D N K p o l i m e r a z e e u k a r i o t a P o l I U k l a n j a n j e p oč e t n i c u, r e p e r D N K p o l α s i n t e z a p r a j m e r a z a v r e m e D N K r e p l i k a c i j e P o l I I D N K r e p e r P o l I I I R e p l i k a c i j a P o l I V D N K r e p e r, T L S ( T r a n s L e s i o n S y n t h e s i s ) p o l β o s n o v n i r e p e r e k s c i z i o n i p o l γ m i t o h o n d r ij a l n a D N K r e p l i k a c i j a i r e p e r p o l δ D N K r e p l i k a c i j a, o s n o v n i e k c i z i o n i r e p e r P o l V p o l ε T L S D N K r e p l i k a c i j a, o s n o v n i e k c i z i o n i r e p e r p o l θ D N K k r o s l i n k i n g a p o l ζ T L S r e p e r p o l λ r e p e r v e z a n z a m e j o z u p o l µ s o m a t s k e h i p e r m u t a c i j e p o l κ T L S p o l η T L S

22 Eukariotski hromozomi se replikuju samo jednom u ćelijskom ciklusu Hromozomalna DNK replikacija se dešava za vreme S faze ćelijskog ciklusa; svaki bazni par svakog hromozoma replikuje se samo jednom u toku eukariotske ćelijske deobe. Potrebni uslovi dovoljan broj replikatora mora biti aktiviran na svakom hromozomu replikatori nakon replikacije, bilo da su učestvovali u inicijaciji replikacije ili da su pasivno replicirani, moraju da ostanu inaktivni do sledeće ćelijske deobe. Replikatorska selekcija - proces identifikacije sekvence koja će inicirati replikaciju (u G1 fazi); spajanje multiproteinskog kompleksa na svakom replikatoru u genomu i formiranje pre-replikativnog kompleksa; aktivacija pojedinih ORI u S fazi (DNK rasplitanje i regrutacija DNK polimeraza). Pre-replikativni kompleks (prerc) upravlja inicijacijom replikacije kod eukariota. prepoznavanje replikatora od strane inicijatora (ORC); ORC od 6 proteina, vezuje ATP, prepoznaje replikator i regrutuje druge proteine za replikaciju. ORC regrutuje dva proteina Cdc6 i Cdt1 (punjači helikaze). ORC, Cdc6 i Cdt1 regrutuju eukariotske helikaze u viljušci (Mcm2-7 kompleks). Formiranje prerc ne mora da dovede obavezno do otvaranja originalne DNK. PreRC inicira replikaciju preko dve kinaze Cdk i Ddk; inaktivne u G1, aktivne u S fazi; aktivirane kinaze se vezuju za prerc i replikatorne proteine i fosforilišu ih; povezivanje dodatih replikacionih proteina oridžina i iniciranje replikacije. Novi proteini: tri eukariotske DNK polimeraze i brojni proteini potrebni za njihovu regrutaciju; DNK pol ε i δ se vezuju, a zatim se vezuje DNK pol α primaza; sinteza prvog RNK prajmera; punjača klizeće kleme RF-C koji vezuje klizeću klemu PCNA oko kompleksa prajmer matrica.

23

24 Regulacija replikacije kod Eukariota Regulacija formiranja i aktivacije prerc putem ciklin zavisne kinaze Cdks; (i) Cdks su potrebne za aktivaciju prerc da bi započela DNK replikacija; (ii) Cdk aktivnost inhibira formiranje novih prerc. Visoka Cdk aktivnost je potrebna za postojanje prerc kompleksa za otpočinjanje replikacije, ali ne dozvoljava formiranje prerc. Niska Cdk aktivnost je stimulativna za formiranje novih prerc ali je neadekvatna da otpočne DNK replikaciju inicijacijom novoformiranih prerc. Čvrsta povezanost između prerc uloge, Cdk nivoa i faze ćelijskog ciklusa - eukariotski genom se replikuje samo jednom u ćelijskom ciklusu.

25 Replikacija DNK u telomerama Uklanjanje prajmera sa 3 kraja matrice za lanac koji zaostaje ne može da se sintetiše 5 kraj 3 krajevi linearnih molekula DNK su jednolančani (12-16 bp) i oko 1000 umnožaka kratkog nukleotidnog niza sa mnogo G Telomeraza ribonukleoproteinski kompleks; RNK sadrži segment komplementaran nizu u telomeri i taj segment služi kao matrica za sintezu 3 krajeva lanaca DNK (proces sličan reversnoj transkripciji)

26 TRANSKRIPCIJA KOD EUKARIOTA Modifikacija (obrada primarnih transkripata) RNK Transkripcija i translacija vremenski i prostorno odvojeni procesi

27 U jedrima eukariota: RNK pol I, RNK pol II i RNK pol III (po 2 velike i 12 malih subjedinica) RNK pol u organelama RNK pol II transkribuje strukturne gene; RNK pol kvasca (RPB1-10; RPB1 sadrži CTD rep bogat OH grupama na Ser) RNK pol I transkribuje velike rrnk (18S, 28S i 5.8S) RNK pol III transkribuje trnk, malu rrnk (5S) i snrnk Različiti promotori za RNK pol Transkripcioni faktori specifično prepoznaju nizove nukleotida u promotoru, vezuju RNK pol za promotor, tačna inicijacija transkripcije Promotori za RNK pol I i II su uzvodno od mesta početka transkripcije, a za RNK pol III unutar strukturnih gena

28 Хумане РНК полимеразе Полимеразе Локација Продукт РНК пол I Нуклеолус 18S, 28S, 5.8S ррнк РНК пол II Нуклеоплазма хнрнк/ирнк У1, У2, У4, У5 снрнк РНК пол III Нуклеоплазма трнк 5S РНК, У6 снрнк, 7SL РНК Мит РНК пол Митохондрије Све мит РНК

29 PROMOTORI ZA RNK POL II Konstitutivni geni sadrže GC blok Geni koji se eksprimiraju samo u nekim tkivima najčešće ne sadrže GC blok, već imaju TATA blok na -20 do 30 nukleotida (tačnost inicijacije i efikasnost transkripcije) CCAAT blok na -70 do -90 nukleotida Četiri elementa konsenzusne sekvence u sastavu osnovnog promotora za Pol li BRE element prepoznaje TFIIB faktor TATA element prepoznaje TBP Inicijator (Inr) - prepoznaju TAF proteini TFIID kompleksa. Nizvodni promotorski element DPE - prepoznaju TAF proteini TFIID kompleksa. Pojačivači, prigušivači i insulatori

30 PROMOTORI RNK POL I Strukturno specificni za vrstu organizma rrnk geni u više kopija Dva niza nukleotida +6 do -31 nukleotid -187 do -107 nukleotid

31 PROMOTORI ZA RNK POL III Unutar strukturnih gena 5S geni promotor u okviru +40 do +80 nukleotida Geni za trnk A i B blok od po 10-tak nukleotida

32 Za inicijaciju transkripcije neophodno je otvaranje hromatina hipersenzitivna mesta DNK se u toku transkripcije namotava oko nukleozoma (kao oko kalema) omogućavajući pristup RNK pol Destabilizacija nukleozoma ispred RNK pol, a njihovo formiranje iza enzima

33 Transkripcija kod eukariota Inicijacija Osnovni transkripcioni faktori (TFIIB, D, E, F, H, A) Preinicijacioni kompleks RNK pol II čiji CTD nije fosforilisan može da inicira transkripciju. Elongacija Elongacija transkripcije nakon fosforilacije CTD Elongacioni faktori TEFb stimuliše elongaciju; poseduje kinaznu aktivnost, stimuliše elongaciju preko fosforilacije CTD repa Pol II. hspt5 regrutuje enzime za dodavnje 5 kape TAT-SF1 protein regrutuje komponente splajsozoma. Terminacija Specifični nizovi nukleotida ili specifične sekundarne strukture Signal za adenilaciju AAUAAA, transkripcija se nastavlja i do 1000 nukleotida nakon toga PoliA polimeraza dodaje polia rep Nakon terminacije transkripcije fosfataze recikliraju RNK pol II u nefosforilisani oblik.

34 Regulacija inicijacije transkripcije na tkivno specifičan način Geni se eksprimiraju tkivno- i vremenski-specifično Regulatorni i inducibilni TF vezuju se za pojačivače Ubrzavanje ili usporavanje transkripcije Hormoni preko svojih receptora deluju kao TF preko elemenata odgovora (RES) Komunikacija TF preko aktivacionih domena Insulatori - segmenti u DNK koji funkcionalno izdvajaju pojedine gene ili grupe gena; ograničavaju delovanje pojačivača ili utišivača i sprečavaju da se njihov uticaj proširi van željenih regiona. Membranski receptori - tirozinske kinaze EGF Dimerizacija Autofosforilacija P P P P P P Signalni put kroz ćeliju Jedro Aktivacija transkripcionih faktora

35

36 PRODUKTI TRANSKRIPCIJE RNK POLIMERAZOM II Heterogene nuklearne RNK (hnrnk) Ribonukleoproteinski kompleksi (RNP) Male jedarne RNK (snrnk ili U-RNK) Proteini hnrnk ili irnk OBRADA TRANSKRIPATA KOVALENTNIM MODIFIKACIJAMA Elongacija i terminacija transkripcije i obrada irnk su međusobno povezani i koordinisani procesi. Svi enzimi uključeni u obradu RNK reaguju sa CTD repom Pol II, zamenjuju inicijatorne transkripcione faktore sa enzimima koji dodaju 5 kapu i vrše splajsovanje irnk, faktorima za poliadenilaciju i kidanje irnk. 5 kapa, pozitivno naelektrisana, bitna za vezivanje za ribozom Na 5 kraj hnrnk dodaje se 7-metil-guanozin (5-5 trifosfatnim mostom vezan za prvi ribonukleotid) Metilacija 2 OH grupe prve (nekad i druge) riboze u nizu Metilacija N 6 atoma purinskog prstena ako je prva baza adenin Na 3 kraju 3 -poli(a) rep Na hnrnk poli(a)polimeraza dodaje A nukleotida Signal za poliadenilaciju je AAUAAA Endonukleaza hidrolizuje prim.tr. 15 nukl. nizvodno od signala za poliadenilaciju, a zatim deluje poli(a)polimeraza uz ATP

37

38 OBRADA TRANSKRIPATA ISECANJEM INTRONA hnrnk je nestabilna i samo mali deo izbegne degradaciju (oko 5%) Obrada hnrnk do irnk traje oko 30 min Introni i egzoni Obrada transkripata isecanjem introna (RNA splicing) u jedru

39 Dužina introna od 100 do 1000 nukleotida GU na 5 kraju (donori), a AG na 3 kraju (akceptori) Komplementarni snrnk u snrnp česticama Formiranje RNK-RNK hibrida Prekidanje lanca u granicama introna i spajanje egzona

40 snrnk (U-RNK) U1-RNK su komplementarne graničnim nizovima introna U2-RNK su komplementarne nizovima unutar introna U4-RNK su komplementarne signalu za poliadenilaciju U5-RNK su komplementarne 3 krajevima introna snrnp (U1-RNP, U2-RNP, U4-RNP,..) Za obradu hnrnk Za transport RNK iz jedra u citoplazmu Pakovanje ribozoma u nukleolusu Splajsozomi (50-60S) od hnrnk, U-RNK i proteina Prva faza: presecanje veze između I i E i formiranje 2,5 -fosfodiestarske veze između G (5 kraja I) i A (u okviru I) omča Druga faza: iskrajanje I i spajanje E; energija tranesterifikacije Proteini koji imaju ključnu ulogu u regulaciji splajsovanja i ulogu aktivatora u regulaciji alterantivnog splajsovanja su familija SR proteina Proteini SR familije poseduju dva domena: Domen preko koga se vezuju za RNK sekvencu (eng. RNA recognition motif, RRM). Domen bogat argininskim i serinskim ostacima (RS motiv) preko koga interaguju sa komponentama splajsozoma, regrutujući ih na susedno splice mesto. Proteini represori alternativnog splajsovanja Transport zrelih irnk kroz jedrove pore u citoplazmu Proteini koji markiraju zrelu irnk su SR proteini (ostaju vezani za zrelu irnk) i proteini koji se specifično vezuju samo za egzon-egzon granice.

41

42 Introni genetiča fleksibilnost ćelije Alternativna obrada transkripata Intra- i intermolekulske obrade transkripata Zrela irnk može sadržati sve egzone ili može biti alterantivno obrađena Preskakanjem egzona Produžavanjem egzona Zadržavanjem sekvence introna Alterantivnim korišćenjem dva egzona - zrela irnk je smeša dve različite irnk. Editovanje RNK - proces u kome se menjaju sekvence na nivou informacione RNK (irnk). Mesto-specifičnom deaminacija C ili A Insercijom ili delecijom U uz pomoć vodič RNK molekula (grna).

43 TRANSLACIJA - AKTIVACIJA AMINOKISELINA (AK) Aminoacil-tRNK sintetaze specifične za AK

44

45

46 INICIJACIJA TRANSLACIJE KOD EUKARIOTA Start signal je AUG Metionin u inicijatorskoj trnk (Met-tRNK i Met ) nije formilovan Inicijacioni kompleks Binarni kompleks (eif-2 i GTP) Ternarni kompleks (eif-2, GTP, Met-tRNK i Met ) Mala subjedinica ribozoma (40S) sa eif-3 irnk, eif-4, uz hidrolizu ATP

47 Mala (40S) subjedinica se vezuje pomoću eif-4 za irnk (za 5 kapu) pomera se duž čeonog niza do prvog start kodona Prepoznavanje AUG kodona omogućeno je sparivanjem sa antikodonom inicijatorske trnk Velika subjedinica se vezuje kada se oslobode eif-2 i eif-3 uz pomoć eif-5 Stavranje kompletnog ribozoma (80S) u blizini start kodona i inicijatorska trnk se vezuje za kompletno P mesto, uz hidrolizu GTP

48 INICIJACIONI FAKTORI EUKARIOTA eif-1, eif-2, eif-3, eif-4a, eif-4b učestvuju u formiranju 40S inicijacionog kompleksa eif-5 - uklanja prethodne faktore eif4c povezuje ribozomske subjedinice eif-3 stimuliše disocijaciju ribozoma eif-6 vezivanjem za 60S sprečava reasocijaciju ribozoma

49 TERMINACIJA TRANSLACIJE Stop kodon (UAA, UAG, UGA) se nađe u A mestu, za koje se vezuje terminacioni faktor Prokarioti: RF-1, RF-2, RF-3 RF-1 prepoznaje stop kodone UAA i UAG RF-2 prepoznaje stop kodone UAA i UGA RF-3 vezuje GTP i stimuliše aktivnost prva dva faktora Eukarioti: erf Pri vezivanju terminacionih faktora stimulisana je hidrolitička aktivnost peptidil transferaze (hidroliza veze između trnk i sintetisanog polipeptidnog lanca) Hidrolizom GTP dobija se energija za oslobađanje terminacionih faktora Izbacivanje trnk, disocijacija irnk sa ribozoma

50

51 PRATIOCI PROTEINA Obrada polipeptidnog lanca biološki aktivan oblik Nativna konformacija, kovalentne modifikacije, lokalizacija u ćeliji, udruživanje sa drugim polipeptidnim lancima Pratioci proteina - PROTEINI TOPLOTNOG STRESA (heat shock proteins - HSP) Sprečavaju agregaciju i pogrešno savijanje novosintetisanih proteina Omogućuju uju transport kroz biološke membrane Omogućuju udruživanje polipeptida u oligomere Omogućuju disagregaciju, odvijanje i ponovno savijanje u nativni oblik Protein u odvijenom (O), ispravno savijenom (S) i pogrešno savijenom obliku (A/D) HSP imaju ATPaznu i odvijajuću aktivnost i stimulišu prelaz polipeptidnih lanaca iz A/D u O i O u S oblik HSP70 (monomeri, vezuju se za proteine u toku sinteze ) i HSP60 (oligomeri, vezuju se za nepravilno savijene ili dentaurisane proteine)

52 Endoplazmatski retikulum granulirani i negranulirani Goldžijev kompleks Proteini kao gradivni elementi ćelije, proteini enzimi, proteini organela, proteini za export Proteinsko pakovanje u ER (glikozilacija, stvaranje S-S mostova) Signalna sekvenca polipeptida sa amino kraja, hidrofobna Proteozomi ili lizozomi razgradnja nepravilno savijenih proteina (izloženi hidrofobni segmenti; ubikvitin)

53

54

55 POSTRANSLACIONE MODIFIKACIJE PROTEINA Kovalentne modifikacije: Proteolitičko uklanjanje vodećeg metionina (formilmetionina) Ograničena proteoliza (preproteini proteini; tripsin, himotripsin) Odstranjivanje signalnih peptida na NH 2 kraju (transmembranski i sekretorni proteini) pomoću peptidaza Digestija poliproteina pomoću proteaza (hormoni) Modifikacije aminokiselinskih bočnih grupa (fosforilacije, acetilacije, glikozilacije, hidroksilacije, metilacije, ADP-ribozilacije, i sl.) regulatorni značaj Ne modifikuju se: Ala, Gly, Ile, Leu, Met, Val Vezivanje koenzima (biotin, piridoksal fosfat)