EDITOVANJE RNK DEZAMINACIJOM ADENOZINA U INOZIN

Transcript

1 EDITOVANJE RNK DEZAMINACIJOM ADENOZINA U INOZIN Nakon transkripcije, novosintetisana RNK podleže brojnim modifikacijama koje utiču na krajnji produkt gena protein ili molekul RNK. Za razliku od splajsovanja, koje dovodi do rearanžmana originalne RNK na velikoj skali, editovanjem RNK uvode se rearanžmani na maloj skali slično "search and replace" operaciji, selektivno se jedan nukleotid prevodi u drugi ili se inseriraju ili deletiraju pojedinačni nukleotidi. Editovanje RNK je, dakle, posttranskripcioni proces promene sekvence u molekulu RNK, tako da se sekvenca RNK razlikuje od sekvence gena. Alternativno obrada RNK i editovanje RNK omogućavaju stvaranje različitih setova proteina i RNK od ograničenog broja gena u genomu, tako da višestruko povećavaju informacioni potencijal genoma. Sa saznanjem da broj gena u genomima eukariota ne može objasniti razlike u njihovoj biološkoj složenosti i da je broj gena mnogo manji nego što se mislilo pre sekvenciranja kompletnih genoma, jasno je da složenost eukariota, posebno viših, uveliko zavisi od posttranskripcionih i posttranslacionih mehanizama koji stvaraju različite produkte od jednog gena, povećavajući raznovrsnost transkriptoma i proteoma neophodnu za složene strukturne, enzimske i regulatorne uloge. 1. UKRATKO O RAZLIČITIM TIPOVIMA EDITOVANJA RNK Editovanje irnk, rrnk i trnk je opisano kod velikog broja organizama, počev od bakterija do čoveka. Prvi primer editovanja RNK, koje podrazumeva inserciju ili deleciju uridina (U), opisan je godine kod irnk preipisane sa mitohondrijskog gena coxii kod praživotinje tripanozome. Malo nakon toga, otkriveni su drugi tipovi editovanja RNK, i postalo je jasno da je reč o fenomenu koji je široko rasprostranjen u sva tri domena živih origanizama. U transkriptima mitohondrijskih i hloroplastnih gena kod biljaka, široko je zastupljena konverzija citidina (C) u U (editovanje C-u-U), a manje je česta konverzija U u C (editovanje U-u-C). Editovanje C-u-U dešava se i u rrnk male subjedinice mitohondrijskih ribozoma Dictyostelium discoideum. Kod ameboidne praživotinje Physarum polycephalum opisani su različiti tipovi editovanja mitohondrijskih irnk i rrnk: insercija većeg broja C, insercija dinukleotida CU, GU, UA, AA, UU i GC, kao i delecija AAA. Insercija većeg broja guanozina (G) opisana je u irnk prepisanoj da negativnog lanca RNK virusa. Kod sisara su opisane dve vrste editovanja i to tipa nukleotidnih supstitucija. Prvi opisani tip bila je dezaminacija C u U, katalizovana APOBEC1 citidin dezaminazom, na primeru irnk prepisane sa gena za apolipoprotein E (APOE). Editovanje C-u-U u APOE irnk je tkivno specifično i dovodi do promene kodona za glutamin u stop kodon. U ćelijama creva APOE pre irnk edituje se dezaminacijom C u kodonu CAA na poziciji u egzonu 26, čime nastaje stop kodon UAA. Kao posledica editovanja pre irnk, apolipoprotein B sintetisan u ćelijama creva sadrži aminokiseline (izoforma APOB48). U ćelijama jetre se ne dešava 1

2 editovanje pre-irnk, tako da se kodon CAA prevodi u glutamin, a sintetisani apolipoprotein B ima aminokiseline (izoforma APOB100). Apolipoprotein B učestvuje u metabolizmu lipida. Duža forma proteina, prisutna u ćelijama jetre, učestvuje u transportu endogeno sintetisanih triglicerida i holesterola, dok kraća forma, eksprimirana u ćelijama creva, učestvuje u transportu lipida unetih hranom do različitih tkiva. Drugi, i najčešći, tip editovanja u ćelijama sisara je dezaminacija adenozina (A) u inozin (I) u dvolančanoj RNK (dsrnk), poznato kao editovanje A-u-I (slika 1). Ovu reakciju katalizuje familija adenozin dezaminaza koje deluju na RNK (eng. adenosine deaminases acting on RNA, ADARs) (slika 2). Tokom evolucije kičmenjaka došlo je do značajnog povećanja zastupljenosti editovanja A-u-I, naročito u nervnom sistemu, tako da je fenomen editovanih i višestruko editovanih transkripata najčešći u nervnom sistemu čoveka. Proteini ADARs se kod sisara, preferencijalno eksprimiraju u nervnom sistemu, pri čemu se ADARB2 eksprimira samo u mozgu. PoreĎenjem zastupljenosti editovanja u različitim tkivima čoveka pokazano je da je ono retko u krvi, mišićima i pankreasu (1%), da je zastupljeno sa 8,2% u prostati, 12,8% u timusu, i generalno je tri puta češće u moždanom u odnosu na ostala tkiva. Kroz modifikacije transkripata koji kodiraju proteine uključene u brzu transmisiju nervnog impulsa, kao što su jonski kanali koji se otvaraju ili zatvaraju kao odgovor na vezivanje liganda, editovanje RNK omogućava da informacija iz sredine moduliše genetičku i epigenetičku informaciju. Transportne RNK, takoďe, podležu editovanju i to različitim tipovima promene nukleotida. Kod ameboidne praživotinje Acanthamoeba castellanii opisano je editovanje 5'-kraja mitohondrijskih trnk. Editovanje A-u-I u trnk, katalizovano familijom adenozin dezaminazama koje deluju na trnk (eng. adenosine deaminases acting on trna, ADATs), opisano je kod eukariota, ali i kod Escherichie coli. ADAT1 edituje A 37 (u blizini antikodona) u trnk Ala, dok heterodimeri ADAT2-ADAT3 edituju A 34 na kolebljivoj (eng. wobble) poziciji antikodona u odreďenoj grupi molekula trnk. Smatra se da su geni za ADARs tokom evolucije nastali od gena za ADATs. 2. EDITOVANJA ADENOZINA U INOZIN (A-U-I) 2.1. Adenozin dezaminaze koje deluju na RNK Editovanje A-u-I podrazumeva hidrolitičku dezaminaciju A u I, katalizovanu enzimima familije ADARs (slika 1). Inozin se u pogeldu saprivanja baza ponaša kao G (slika 1). Ovi enzimi su originalno identifikovani u jajnim ćelijama i embrionima Xenopus laevis, kada su opisani kao proteini koji odmotavaju dvolančane RNK. Prvi otkriveni gen kod sisara je bio ADAR u genomu čoveka (ranije označavan kao ADAR1), u kome su zatim identifikovana jod dva gena, ADARB1 i ADARB2 (ranije označavani kao ADAR2 i ADAR3, redom). Ortolozi gena za ADARs su evoluciono očuvani kod kičmenjaka, a samo nekoliko je identifikovano kod beskičmenjaka. Drosophila melanogaster ima jedan gen označen kao dadar, koji je sličan sa ADARB1, dok Cenorabditis elegans ima dva gena, c.e.adar-1 i c.e.adar-2. U genomima biljaka, gljiva i kvasaca nisu identifikovani geni za ADARs. 2

3 Enzimi familije ADARs se odlikuju zajedničkim funkcionalnim domenima (slika 2). Poseduju dva do tri vezivna domena za dvolančanu RNK (eng. dsrna-binding domain, dsrbd), dužine oko 65 aminokiselina, pomoću kojih ostvaruju direktne kontakte i vezuju se za dvolančanu RNK. Na C-kraju sadrže katalitički dezaminazni domen. Prema katalitičkom modelu za dezaminazni domen, pretpostavlja se da se ciljni A iz unutrašnjosti RNK heliksa okreće (eng. base flipping) u aktivni centar enzima. ADAR na N-kraju sadrži dva Z-DNK-vezivna domena, označena kao Zα and Zβ, od kojih se samo Zα ima vezivni kapacitet. Njihove funkcije nisu sasvim jasne. S obzirom da se Z-DNK struktura stabilizuje prolaznom negativnom superspiralizacijom uzvodno od aktivne RNK polimeraze, smatra se da bi Zα domen mogao da vezuje ADAR na mesto gde se odigrava transkripcija, što bi proteinu omogućilo da obavi editovanje pre splajsovanja. Zα domen se vezuje i za dvolančane RNK koje imaju Z strukturu i podležu editovanju A-u-I. Neke dvolančane RNK spontano formiraju Z strukturu. Smata se da Z-DNK-vezivni domen specifično povećava afinitet za kratke dvolančane RNK, kao što su sirnk. Kod virusnih RNK Z struktura se formira tokom tranksripcije, i to bi proteinu ADAR moglo omogućiti da efikasno modifikuje virusne RNK. ADARB2 na N-kraju poseduje domen bogat argininom (R), koji vezuje jednolančanu RNK, ali njegov biološki značaj u ADARB2 još nije poznat. Manje zastupljena izoforma ADARB1, takoďe, sadrži R domen. Slika 1. Dezaminacija adenozina u inozin katalizovana enzimima ADAR: a) adenozin se hidrolitičkom dezaminacijom prevodi u inozin; b) adenozin se bazno sparuje sa uridinom; c) inozin se bazno sparuje sa citidinom. 3

4 ADAR i ADARB1 su funkcionalno aktivni kao homodimeri, koji se formiraju interkcijama protein-protein izmeďu monomera, nezavisno od dvolančane RNK. Prilikom prepoznavanja supstrata dsrbd u homodimerima funkcionišu kooperativno. ADARB2 ne formira homodimere. Skoro sve reakcije editovanja se pripisuju aktivnostima enzima ADAR i ADARB1, dok ADARB2 ne pokazuje dezaminaznu aktivnost in vitro. Iako su funkcionalne osobine dezaminaznog domena očuvane kod ADARB2, smatra se da je odsustvo njegove katalitičke aktivnosti upravo vezano za nemogućnost dimerizuje. Funkcija ADARB2 je za sada nepoznata. Smatra se da bi mogao delovati kao repesor aktivnosti ADAR i ADARB1 vezujući se za njihove potencijalne supstrate a da ih ne edituje. ADAR i ADARB1 se eksprimiraju u mnogim tkivima, dok se ADARB2 eksprimira samo u mozgu. Kao rezultat alternativnog korišćenja promotora i egzona ADAR daje dve izoforme proteina: izoformu pune dužine (ADARp150 ili ADARL) i kraću izoformu okrenjenu na N-kraju (ADARp110 ili ADARS) (slika 2). ADARp150 se transkribuje sa promotora inudukovanog interferonom, i pojačano se eksprimira nakon ćelijskog stresa ili virusne infekcije. Druge dve ADAR irnk se prepisuju sa dva konstitutivna promotora i alternativno se splajsuju preskakanjem egzona sa start kodonom. Sinteza proteina sa njih se inicira sa nizvodnog kodona za Met usled čega se sintetiše kraća izoforma ADARp110. Slika 2. Familija proteina ADARs: a) Članovi familije ADARs kod kičmenjaka i beskičmenjaka. Zα i Zβ vezivni domeni za Z konformaciju DNK, dsrbd vezivni domen za dvolančanu RNK, R vezivni domen za jednolančanu RNK bogat argininom. Za ADARs čoveka prikazane su dužine proteina i pozicije gena na hromozomima. dadar Drosophile je veoma sličanu ADARB1 sisara. C. elegans ima dva proteina c.e.ada1 i c.e.ada2. b) Alternativna obrada i izoforme ADAR: ADARp150 se eksprimira sa interferon/dvolančana RNK inducibilnog promotora, a egzon E1A, koji sadrži start kodon, splajsuje se sa egzonom E2. ADARp110 se eksprimira sa jednog od dva konstitutivna promotora, a egzon E1B ili E1C slajsuju se sa egzonom E2 koji sadrži start start kodon. 4

5 ADARp150 uglavnom lokalizuje u citoplazmi, što je verovatno uslovljeno lokalizacijom njegovih ciljnih molekula (na primer, virusne dsrnk ili dsrnk koje su prekursori sirnk). ADARp110 i ADARB1 lokalizuju u nukleusu. Interesantno je da se ADARp110 i ADARB1 akumuliraju u nukleolusu, verovatno, kroz interakciju dsrbd sa rrnk ili snornk. Značaj lokalizacije u nukleolusu nije poznat, ali se pretpostavlja da bi ADARp110 i ADARB1 mogli da se čuvaju u nukleolusu odakle bi se pomerali u nukleoplazmu kada se pojave dvolančani RNK supstrati Specifičnost enzima ADAR za supstrat ADARs stupaju u interkaciju sa dvolančanim supstratima RNK pomoću domena dsrbd. Strukturne osobine dvolančanog heliksa RNK su takve da su funkcionalne grupe koje odreďuju specifičnost sekvence smeštene duboko u unutrašnjosti molekula, tako da se proteini ADARs ne vezuju za svoje supstrate prepoznajući specifičnu sekvencu. Umesto toga, editorska aktivnost proteina ADARs odreďena je strukturom i stabilnošću dvolančanog supstrata RNK. Supstrati za ADARs su intramolekulske i intermolekulske dvolančane strukture RNK duže od 20 bp (što odgovra dvolančanoj zavojnici RNK sa dva okreta), a njihova sekundarna struktura diktira selekciju mesta editovanja. U prilog ovome govori stepen i specifičnost editovanja supstrata različitih dužina. Visoka efikasnost i (neselektivno) editovanje većeg broja A dešava se u perfektno komplementarnim dvolančanim RNK dužim od 100 bp (slike 5 i 6). Sam proces editovanja dovodi do destabilizacije (odmotavanja) RNK supstrata, i verovatno se odvija do trenutka kada enzim ne može dalje da prepozna supstrat kao dvolančanu RNK. Suprotno, u kraćim dvolančanim RNK dužine 20 do 30 bp ili dugim ali parcijalno komplementarnim dvolančanim RNK sa pogrešno sparenim bazama, jednolančanim izbočinama i petljama specifično se edituje samo nekoliko A. Dezaminacija samo nekoliko A u takvim supstratima menja njegovu strukturu i smanjuje njegovu stabilnost ispod praga koji prepoznaju proteini ADARs. Neka mesta editovanja u RNK mogu biti supstrat za ADAR ili ADARB1, dok su neka preferencijalni supstrat za ADAR ili ADARB1. Ovo ukazuje da se specifičnost za supstrat može razlikovati izmeďu funkcionalnih formi ADARs, verovatno usled različitog broja i meďusobne udaljenosti dsrbd. Oni verovatno omogućavaju razlikovanje dvolančanih RNK različite strukture i stabilnosti. Različita mesta selekcije za ADAR i ADARB1 mogu, takoďe, biti posredovana i funkcionalnom interkacijom izmeďu monomera ADAR i ADARB1, s obzirom da takve interakcije verovatno pozicioniraju specifične A u dezaminazni centar. Efikasnost editovanja supstrata (broj prevedenih A-u-I) varira u zavisnosti od vrste supstrata, faze razvića i fizioloških uslova, tako da editovanjem može biti obuhvaćeno 0 do 100% populacije molekula. Ovo dozvoljava istovremeno prisustvo različitih produkata, kao i promenu populacije produkata kao odgovor na izmenjene uslove sredine. 5

6 3. FIZIOLOŠKA ULOGA EDITOVANJA A-U-I Fenotipske promene opisane kod različitih model organizama sa mutacijama u genima za ADARs, ukazuju da njihova inaktivacija ima značajne fiziološke posledice. D. melanogaster sa homozigotnom delecijom dadar ispoljava promene vezane za centralni nervni sistem, kao što su gubitak koordinacije kretanja i neurodegeneracija zavisna od starosti. Sojevi C. elegans sa homozigotnom delecijom oba gena za ADARs, c.e.adar-1 i c.e.adar-2, imaju poremećaj hemotaksije. Knockout miš za Adarb1 umire nekoliko nedelja nakon roďenja. Karakterišu ga epileptički napadi, vezani za povećan influks jona Ca 2+ uzrokovanog needitovanim mestom Q/R u irnk za GluR-B, usled čega dolazi do umiranja neurona. Inaktivacija Adar kod miša je letalna tokom embrionalnog razvića, usled poremećene eritropoeze i sveprisutne apoptoze. Heterozigotne mutacije u genu ADAR, koje se nasleďuju autozomno dominantno, dovode do poremećaja pigmentacije kože (dyschromatosis symmetrica hereditaria). Poremećaji u editovanju RNK vezuju se i za bolesti centralnog nervnog sistema i maligne bolesti. Smatra se da smanjenje efikasnosti editovanja mesta Q/R u irnk za GluR-B dovodi do smrti motoneurona kod bolesnika sa sporadičnom amiotrofičnom lateralnom sklerozom, do apoptotoze neurona prilikom ishemije uzrokovane srčanim udarom ili poremećajem cirkulacije u mozgu, a moglo bi biti povezano i sa epilepsijom. Postoje indikacije da je imbalans u editovanju RNK vezan za razne neuropsihijatrijske bolesti. Pokazano je da je obrazac editovanja 5-HT 2C R irnk značajno izmenjen u prefrontalnom korteksu samoubica, pacijenata sa depresijom i šizofrenijom, dok, dok je obrayac editovanja TPH2 irnk iymenjen kod samoubica. Značajno smanjenje nivoa editovanja Alu sekvenci opisano je kod različitih vrsta malignih bolesti, i ono je delemično posledica smanjene aktivnosti svih enzima ADARs. MeĎutim, uzročna veza hipoeditovanja i maligne transformacije nije poznata. 4. EFEKTI EDITOVANJA A-U-I Inicjalno se smatralo da su supstrati za ADARs samo protein-kodirajući regioni irnk, kada dolazi do promene kodona i funkcije proteina. Takve irnk formiraju kratke dvolančane regione (30-70 bp) sparivanjem egzona i sekvence introna, označene kao ECS (eng. editing-sitecomplementary sequence) (slika 4). U formiranoj dvolančanoj strukturi dezaminaciji se izlaže A sa tačno odreďenog mesta. Danas je ovakvo shvatanje prevaziďeno jer je nekoliko naučnih timova godine objavilo da se najveći broj mesta editovanja nalazi u sekvencama koje ne kodiraju proteine. Naime, uspostvailo se da su najčešća mesta editovanja A-u-I duge (>100 bp), parcijalno komplementarne dvolančane RNK koje formiraju invertovani ponovci Alu i LINE, smešteni u intronima i netranslatirajućim regionima irnk. U ovim dvolančanim strukturama RNK edituje se veći broj, uglavnom odreďenih A, što za rezultat ima promenu lokalne i opšte stabilnosti dvolančane RNK. Na primer, editovanje A iz baznog para A-U dovodi do formiranja kolebljivog baznog para I-U i destabilizacije strukture dvolančane RNK. Neka mesta editovanja uključuju A iz poglešnog baznog para A-C, tako da se formira stabilan bazni par I-C i stabilnija dvolančana RNK. Kod ljudi se više hiljada irnk edituje u elementima Alu, a editovanje drugih elemenata SINE je pokazano i kod drugih organizama. Biološki značaj široko zastupljenog 6

7 globalnog editovanja A-u-I u nekodirajućim ponovljenim elemenatima je još uvek misterija. Smatra se da bi moglo biti značajno za posttranskripcionu regulaciju ekspresije gena, utičući na transport, lokalizaciju, stabilnost i translaciju ciljnih irnk. Editovanje tačno odreďenog A u kratkim dvolančanim RNK je danas pozato kao editovanje specifično za mesto, dok je editovanje većeg broja A u dugim dvolančanim nekodirajućim RNK poznato kao hipereditovanje ili promiskuitetno editovanje. Poslednjih pet godina je, takoďe, postalo poznato da postoje brojne interakcije procesa editovanja RNK sa procesom RNK interferencije (RNKi) i biogenezom mikrornk (mirnk). Editovanje RNK reguliše obradu i ekspresiju zrelih mirnk, edituje mirnk menjajući tako grupu ciljnih irnk koje se utišavaju, dok ADARp150 zarobljava sirnk smanjujući tako efikasnost RNKi. Efekat dezaminacije A-u-I je dvostruki: 1) editovanje A-u-I menja informacioni sadržaj molekula RNK, s obzirom da se I preferencijalno sparuje sa C, tako da ga mašinerije za translaciju i splajsovanje interpretitraju kao G; 2) editovanje A-u-I menja trodimenzionalnu strukturu i stabilnost dvolančane RNK stvaranjem ili uklanjanjem jednolančanih izbočina (eng. bulges), a sama trodimenzionalna struktura dvolančane RNK odreďuje njenu interakciju sa raznim RNK-vezivnim proteinima Generisanje diverziteta proteoma i transkriptoma Regulacija funkcije proteina sa ADAR (rekodiranje sekvence proteina) Editovanje A-u-I specifično za mesto dešava se u dvolančanoj RNK nastaloj sparivanjem sekvence egzona oko mesta editovanja i susedne sekevnce introna, ECS, pre splajsovanja (slika 4). Nastali I, zbog sparivanja sa C, se od strane ribozoma interpretiraju kao G (slika 1). Zbog ovakvog načina sparivanja I, editovanje u kodirajućem regionu za protein može da dovede do zamene aminokiseline i stvaranja nove izoforme proteina. Nastala izoforma proteina može imati izmenjenu funkcionalnost, čime se povećava raznovrsnost funkcija proteina kodiranih jednim genom (slika 3a). Slika 3. Efekti editovanja A-u-I u trsanskriptima koji kodiraju proteine: a) Promene kodona koje mogu nastati usled editovanja A-u-I, zasnovane na interpretaciji I kao G od strane translacione mašinerije. Aminokiseline su grupisane prema naelektrisanju i hidrofobnosti. b) Nastanak alternativno 7

8 splajsovanih izoformi pomoću editovanja RNK. Savijena linija označava granice introna koji se iskraja u odsustvu editovanja RNK. Isprekidane linije označavaju alternativno splajsovane forme nastale usled editovanja RNK. Editovanje RNK može fomrirati novo 5'- ili 3'- mesto splajsovanja, ili eliminisati mesto grananja ili 3'-mesto splajsovanja. Editovanju A-u-I specifičnom za mesto podleže oko tridesetak pre-irnk prepisanih sa gena za proteine, uglavnom eksprimiranih u centralnom nervnom sistemu. One kodiraju receptore za neurotransmitere ili jonske kanale. Primeri kod sisara su irnk za subjedinice AMPA receptora, serotoninski receptor 2C (5-HT 2C R), kanal za kalijum Kv1.1 i receptori za GABA. Kod D. melanogaster je opisano editovanje transkripata za Na-kanale, a kod lignje kanala za kalijum Kv1.1A. Poslednjih godina opisano je editovanje i drugih proteina koji se specifično eksprimiraju u neuronima. MeĎu njima su triptofan hidroksilaza 2 odgovorna za sintezu serotonima u mozgu, RNK-vezivni proteini HuB i HuD i regulator alternativnog splajsovanja NOVA1. Pored ćelijskih gena, mesto-specifičnom editovanju podležu i transkripti prepisani sa virusnih genoma, kao što je, na primer, gen za antigen hepatitis delta virusa. L-glutamat je predominantni ekscitatorni neurotransmiter u nervnom sistemu kičmenjaka, a receptori za glutamat su važni za sinaptičku plastičnost i složene funkcije, kao što su memorija i učenje. AMPA (L-α-amino-3-hidroksi-5-metil-4-izoksazolproprionat) receptor za glutamat, koji je ujedno i jonski kanal za kalcijum, posreduje u brzoj ekscitatornoj transmisiji u neuronima CNS-a i sastoji se od 4 subjedinice, označene kao GluR-A do D. Njihove pre-irnk sadrže ukupno osam mesta editovanja A-u-I. Esencijalnu ulogu ima editovanje kodona za glutamin (Q) u egzonu 11 pre-irnk za subjedinicu GluR-B. Kodon CAG za glutamin menja se u kodon CUG za arginin (R), a mesto editovanja se označava kao Q/R (slika 4a). 8

9 Slika 4. Funkcionalne promene u proteinu usled editovanja A-u-I: a) receptor za glutamat, subjedinica GluR-B. b) receptor za sertonin 5HT 2C R. Q/R mesto je jedno od retkih mesta koje se edituje sa efikasnošću od 100%. Reakciju katalizuje ADARB1, a Q/R editovanje bitno menja propustljivost receptora AMPA za jone Ca 2+ : prisustvo R čini kanal nepropustljivim za Ca 2+, dok prisustvo genomski kodiranog Q dozvoljava influks Ca 2+ u ćelije. Aminokiseline Q ili R smeštene su u domenu petlje GluR-B koja je okrenuta ka samom jonskom kanalu. Q/R mesto editovanja, takoďe, utiče i na tetramerizaciju i unutarćelijski transport subjedinica receptora. Neurotransmiter serotonin ima važnu ulogu u fiziološkim procesima i ponašanju, kao što su cirkadijalni ritam, kontrola emocija, ponašanje vezano za hranu i drugo. irnk za 5-HT 2C R se edituje na 5 specifičnih mesta u egzonu 5 i ona su označena kao mesta A, B, C, D i E (slika 4b). Egzon 5 kodira drugu unutarćelijsku petlju koja je domen za kuplovanje sa G proteinom (slika 4b). Kratka dvolančana RNK sa izbočinama i petljama, koja je supstrat za ADARs, formira se parcijalnim sparivanjem sekvence egzona i nizvodne sekvence introna. Različite kombinacije editovanja ovih 5 mesta dovode do promene tri kodona (AUA za Ile na poziciji 156, AAU za Asn na poziciji 158 i AUU za Ile na poziciji 160) u mogućih šest novih, dovodeći do ekspresije čak 24 izoforme receptora. Izoforme se odlikuju različitom funkcionalnošću u pogledu kuplovanja sa G proteinom, potencijacije sa serotoninom i afinitetom za vezivanje liganada, obrasca splajsovanja i eksprimiranja receptora na površini ćelije. 1)Potpuno editovana izoforma (5-HT 2C R-VGV) ima 20 puta manju potencijaciju sa serotoninom, 5 puta smanjeno kuplovanje sa G proteinom i 6 puta manje efikasno vezivanje agonista, u poreďenju sa needitovanom izoformom (5-HT 2C R-INI). 2) Obrazac editovanja kontrloiše količinu 5-HT 2C R irnk koja kodira protein pune dužine kroz modulaciju selekcije alternativnih mesta splajsovanja. IzmeĎu tri alternativna 5'-mesta splajsovanja (GU1, GU2 i GU3), samo korišćenje GU2 daje zrelu irnk koja kodira funkcionalni protein 5-HT 2C R pune dužine. Needitovana pre-irnk se uglavnom splajsuje korišćejem mesta GU1, što rezultuje okrnjenim nefunkcionalnim proteinom, ako se uopšte translatira. MeĎutim, većina editovanih pre-irnk se splajsuje u mestu GU2. Dakle, ukoliko je editovanje neefikasno, povećan nivo splajsovanja u mestu GU1 deluje kao kontrolni mehanizam za smanjenje sinteze 5-HT 2C R-INI, čime se ograničava odgovor na serotonin. 3) Editovanje RNK kontroliše krajnji fiziološki output konstitutivno aktivnih receptora utičući na ekspresiju 5-HT 2C R na površini ćelije. 5-HT 2C R-VGV, koji pokazuje najniži nivo konstitutivne aktivnosti, se u potpunosti eksprimira na površini ćelije u bazalnim uslovima i brzo internalizuje u prisustvu agonista. Suprotno, izofroma 5-HT 2C R-INI konstitutivno internalizuje i akumulira se u endozomima. Neka mesta se specifično edituju sa ADAR, neka sa ADARB1, dok neka ne pokazuju specifičnost prema jednom ili drugom enzimu. Na primer, Q/R mesto u GluR-B i mesto D u 5-HT 2C R ekskluzivno se edituju sa ADARB1, dok se mesta A i B 5-HT 2C R selektivno edituju sa ADAR. Triptofan hidroksliaza (TPH) katalizuje prvi korak u biosintezi serotonina, i predstavlja rate-limiting enzim za sintezu ovog neurotransmitera. Postoje dve forme enzima TPH1 i TPH2 kodirane različitim genima. TPH1 se predominantno eksprimira u perifernim tkivima, dok se 9

10 TPH2 eksprimira samo u mozgu. Dve alternativno splajsovne forme TPH2 transkripta u mozgu čoveka (TPH2A i TPH2B) se ekstenzivno edituju, tako da kodiraju veliki broj proteinskih izoformi koje se razlikuju u katalitičkim osobinama. Generalno, editovane forme imaju manju enzimsku aktivnost. Editovanje irnk koje kodiraju receptore GABA B i GABA A utiče na asembliranje subjedinica, kinetiku i eksprimiranje receptora na površini ćelije. Familija proteina Hu su RNK-vezivni proteini uključeni u posttranskripcionu regulaciju ekspresije gena. Oni se preferncijalno vezuju za elemente ARE (eng. AU-rich element) u 3'-UTR-ovima ciljnih irnk i regulišu njihov transport, stabilnost ili translaciju. Proteini HuB i HuD (kodirani genima ELAVL2 i ELAVL4, redom) imaju važnu ulogu u proliferaciji i diferencijaciji neurona. Transkripti ELAVL2 i ELAVL4 podležu editovanju specifičnom za mesto u regionima koji kodiraju RNK-vezivne domene RRM, što može menjati njihov afinitet za supstrat. Protein NOVA1 se specifično eksprimira u neuronima gde reguliše alternativno splajsovanje preko 700 egzona velikog broja gena. Editovanje specifično za mesto prevodi kodon za Ser na poziciji 383 u kodon za Gly u okviru nestrukturisanog regiona proteina izmeďu dva RNK-vezivna domena KH. Interesantno je da ovaj region gena NOVA1 pokazuje mali stepen evolucione očuvanosti, ali je mesto editovanja visoko očuvano meďu amniotama. Editovanje transkripta NOVA1 ne menja efikasnost editovane izoforme proteina u odnosu na needitovanu u pogledu regulacije alternativnog splajsovanja ciljnih transkripata, već utiče na stabilnost proteina editovana izoforma proteina ima duži poluživot, i time globalno veću aktivnost. Ovaj primer pokazuje da proteinske izoforme koje imaju iste katalitičke osobine ili iste osobine u pogledu vezivanja za supstrat, ipak mogu biti funkcionalno različite ako su različito regulisane Promena mesta splajsovanja Regioni introna mogu, takoďe, podleći editovanju, i to može bitno uticati na splajsovanje, jer mašinerija za splajsovanje interpretira I kao G. Upravo zbog toga, editovanje A-u-I ima potencijal da kreira 5 -mesto splajsovanja, da kreira ili eliminiše i 3 -mesto splajsovanja i eliminiše mesto grananja (slika 3b). Na primer visokokonzervisana sekvenca GU u 5'-mestu splajsovanja može biti kreirana usled editovanja (AU IU=GU), kao i visokokonzervisana sekvenca AG u 3'-mestu splajsovanja (AA AI=AG). Slično, editovanje AG u 3'-mestu splajsovanja (AG IG = GG) može eliminsati ovo mesto. Najbolje proučen primer je sopstvena regulacija ADARB1, koji edituje sopstvenu intronsku dvolančanu RNK kreirajući alternativno 3'-mesto splajsovanja. Translacijom alternativno splajsovane ADARB1 irnk stvara se okrnjeni protein koji ne sadrži RNK-vezivne domene i dezaminazni domen, usled promene faze čitanja, tako da kriranje novog 3'-mesta splajsovanja dovodi do represije ekspresije ADAR2. Editovanje može imati efekat na kinetiku splajsovanja. Ovaj efekat se postiže destabilizacijom dvolančanih regiona RNK u intronima, što mašineriji za splajsovanje omogućava bolji pristup RNK supstratu. Model je podržan preferencijalnim splajsovanjem 10

11 editovanih transkripata u mozgu ADARB1 knockout miša. U skladu sa ovim pretpostavlja se da bi Z-DNK-vezivni domen u ADARp150 (slika 2) mogao služiti za lokalizaciju ovog proteina na aktivnim mestima transkripcije, gde je Z-DNK konformacija stabilizovana negativnom superspiralizacijom uzvodno od aktivne RNK polimeraze. Na ovaj način, ADAR ima šansu da deluje na pre-irnk pre splajsovanja Editovanje RNK vs. mutacije Editovanje RNK ima nekoliko prednosti u odnosu na mutacije u molekulima DNK. Kao i u slučaju alternativne obrade, različitom regulacijom postiže se da editovanjem RNK bude obuhvaćeno 0 do 100% populacije transkripata, kao i da ono bude prostorno i vremenski kontrolisano. Sa druge strane, mutacije u genomu fiksiraju heterogenost molekula na tačno 50%, ili heterogenost potpuno izostaje. Znači, za razliku od mutacija u molekulu DNK, editovanje A-u-I obično ostavlja proporciju originalnih transkripata, što omogućava stvaranje nove funkcije bez uništavanja originalne, koja može biti neophodna za preživljavanje. Na primer, editovanje subjedinica receptora AMPA, receptora 5-HT2C i GABA je regulisano tokom razvića. TakoĎe, kombinatorna editovanja subjedinice GluR-B i receptora 5-HT2C stvara veliki broj editovanih izoformi koje su različito distribuirane u različitim regionima mozga, doprinoseći tako složenoj regulaciji brojnih i funkcionalno različitih produkata istog gena. Neki primeri ukazuju da editovanje A-u-I može umanjiti efekat ili korigovati mutacije G u A, jer nakon takve tranzicije, nukleotid A može postati mesto editovanja A-u-I. Tokom vremena, selektivni pritisak može povećati učestalost editovanja na tom mestu, olakšavajući tranziciju u originalni genomski G. Mesto Q/R (CAG CIG) u GluR-B se kompletno edituje kod miša i čoveka, i moglo je evoluirati kao mutacija koja se koriguje editovanjem skorije tokom evolucije. U prilog tome govore činjenice da se izmenjeni fenotip ADARB1 knockout miša može spasiti kreiranjem genomske A u G mutacije u mestu Q/R u GluR-B, i da u genomima riba i žaba postoji kodon CGG za R. Editovanje A-u-I i editovanje C-u-U su najčešće forme editovanja kod životinja, što bi moglo objasniti visoku učestalost A/G i C/T varijanti u njihovim genomima Globalno editovanje nekodirajuće RNK U poli-a frakciji RNK izolovanoj iz mozga pacova zapažen je veliki procenat zastupljenosti I, što se nije moglo objasniti editovanjem oko 30 poznatih transkripata prepisanih sa gena za proteine. Ova nepodudarnost je inicirala globalno pretraživanja potencijalnih mesta editovanja u kodirajućim i nekodirajućim regionima bioinformatičkim pristupom. Bioinformatičko pretraživanje potencijalnih mesta editovanja zasnovano je na sledećem: 1) poravnavanje sekvenci gena sa sekvencama cdnk ili EST (eng. expressed sequence tag), nakon čega se potencijalna mesta editovanja identifikuju kao mesta na kojima se u genomskoj sekvenci nalazi A, a u sekvenci cdnk ili EST G; 2) pronalaženje mesta sa grupisanim promenama A u G, na ograničenoj udaljenosti, tako da ona mogu da naprave dvolančanom RNK sa sekundarnom strukturom drška-petlja. Ovakvim pristupom identifikovan je mnogo veći broj mesta editovanja A-u-I nego što se očekivalo, a najveće iznenaďenje je bilo da su skoro sva nova mesta editovanja u transkriptomu čoveka ( mesta u oko gena) identifikovana u 11

12 nekodirajućim regionima gena, uglavnom intronima, koji se sastoje od invertovanih elemenata Alu (u 90% slučajeva) i LINE (u 10% slučajeva) (slika 5a). Predikcija izvedena na osnovu bioinformatičkog pretraživanja je ukazala da bi više od 85% pre-irnk moglo da se edituje, i to u 90% slučajeva u intronima, a ostatak u netranslatirajućim regionima. Sličnom strategijom pretraživanja koja je bila ograničena na kodirajuće regione, identifikovano je svega nekoliko potencijalnih mesta editovanja. Globalna analiza transkriptoma je pokazala i da se oko 70% genoma transkribuje sa oba lanca DNK, dajući sense i antisense transkripte. Najveći broj parova sense i antisense transkripta se koordinisano prepisuje, što ukazuje da bi antisense transkripti mogli da učestvuju u kontroli sense transkripata. Nije poznato koliko se često sense i antisense transkripti sparuju u ćelijama sisara in vivo formirajući dvolančanu intermolekularnu RNK. Ukoliko je njihovo formiranje in vivo često, očekivalo bi se da oni budu supstrat za ADARs. Bioinformatička pretraživanja sense i antisense sekvenci EST čoveka pokazala su da je editovanje A-u-I ograničeno na intramolekularne dvolančane RNK koje formiraju inverzno orjentisani ponovljeni elementi, bilo u sense ili antisense transkriptu (slika 5a). Invezno orjentisani ponovljeni elementi Alu predominantno formiraju intramolekularne dvolanačane strukture RNK i njihova interkacija sa ADARs može sprečiti formiranje intermolekularih dvolančanih RNK. Razdaljina izmeďu elementa Alu i najbližeg invertovanog elementa je kritična determinanta za verovatnoću da će dati element biti editovan.zajedno, rezultati bioinformatičkih pretraživanja ukazuju da su najčešći supstrati za ADAR nekodirajuće sekvence transkriptoma, i to dvolančane RNK formirane sparivanjem invertovanih ponovljenih elementa Alu u nekodirajućim regionima gena, a da je rekodiranje proteina kao rezultat editovanja A-u-I mnogo reďe. Ako globalno editovanje nekodirajućih ponovljenih elemenata Alu u transkriptomu čoveka ima biološki značaj, za očekivati je da isto važi i za druge organizme. Ponovljeni elementi Alu su karaktristika genoma primata, ali u genomima drugih organizama postoje drugi tipovi elemenata SINE, za koje se smatra da imaju zajedničko poreklo sa elementima Alu. Bioinfomratička analiza editovanja A-u-I sekvenci EST miša pokazala je da je editovanje elemenata SINE reďe u odnosu na transkriptom čoveka, barem za jedan red veličine. Značajno smanjenje u učestalosti editovanja u transkriptomu miša može se objasniti manjom dužinom elemenata SINE (150 bp, u odnosu na 300 bp za Alu), kao i većim stepenom meďusobne homologije elemenata Alu u odnosu na elemente SINE u mišjem genomu. Skrining editovanja A-u-I u transkriptomu pacova, kokoške i vinske mušice, potvrdilo je da su nekodirajuće ponovljene sekvence glavni supstrati za ADARs, ali da je učestalost editovanja mnogo veća u transkriptomu čoveka, pri čemu je 90% ovog povećanja vezano je za editovanje elemnata Alu u Pol II transkriptima. Dakle, iako postoji varijabilnost u učestalosti editovanja kod različitih organizama, editovanje A-u-I nekodirajućih ponovljenih elemenata u molekulima RNK je široko rasprostranjen fenomen. Smatra se da bi globalno editovanje ponovljenih sekvenci u nekodirajućim regionima RNK moglo posttranskripciono kontrolisati ekspresiju gena na različite načine. Na primer, promene A-u-I mogu promeniti mesta splajsovanja. TakoĎe, nekoliko ćelijskih procesa vezano 12

13 je za specifično prepoznavanje i funkcionisanje na jednolančanoj ili dvolančanoj RNK koja je obogaćena inozinom. Takvi procesi su nuklearna retencija i degradacija transkripta Egzonizacija elemenata Alu Mnogi geni sadrže egzone čije sekvence odgovaraju sekvencama Alu, te se smata da su nova mesta splajsovanja nastala editovanjem intramolekulske dvolančane RNK formirane sparivanjem inverotvanih elemenata Alu u intronima (slika 5b). U sekvencama cdnk čoveka identifikovano je nekoliko primera isključivanja ili uključivanja egzona Alu usled editovanja A-u-I, i smatra se da bi modulisanje splajsovanja na ovaj način moglo biti široko rasprostranjen fenomen. Smatra se, čak, da je egzonizacija Alu sekvenci bila glavna pokretačka snaga evolucije čoveka, jer su upravo one omogućile da se oprobavaju različite forme proteina sa novim funkcijama, od kojih su opstale one koje su davale selektivnu prednost Nuklearna retencija transkripta Afinitetnom hromatografijom u kojoj je korišćena sintetička RNK bogata inozinima izolovan je protein p54 nrb. Ovaj protein lokalizje u nukleusu, gde obavlja veći broj funkcija: stupa u interakciju sa faktorom splajsovanja PSF i matrinom 3 (proteinom nuklearnog matriksa), i "hvata" hipereditovane RNK polioma virusa u nukleusu. Pokazano je da editovanjem A-u-I i drugi transkripti mogu biti zadržani u nukleus, tako da bi p54 nrb mogao imati ulogu u nuklearnoj retenciji hipereditovanih RNK. Na primer, duga dvolančana RNK formirana izmeďu elemenata Alu u 3'-UTR-u irnk za katjonski transporter aminokiselina 2 (Cat2) je mesto vezivanja za p54 nrb, što dovodi do njene retencije u nuklearnim pegama (eng. nuclear speckles) (slika 5c). U uslovima stresa, Ctn2 irnk se posttranskripciono seče i de novo poliadeniluje na alternativnom mestu, dovodeći do stvaranja Cat2 irnk koja se trasnportuje u citoplzmu i translatira u protein. Faktori koji dovode do sečenja i de novo adenilacije Cat2 irnk nisu poznati. Opšta uloga editovanja inverotvanih ponovaka u nuklearnoj retenciji takvih transkripata je ipak dovedena u pitanje, jer je pokazano da se irnk koje sadrže dvolančane RNK eksportuju u citoplazmu, integrišu u polizome i efikasno transltiraju nezavisno od statusa editovanja Degradacija transkripta U ćeliji je identifikovana ribonukleaza koja specifično prepoznaje RNK koje sadrže I i preferencijalno seče oba lanca dvolančane RNK sa većim brojem baznih parova I-U. Kao potencijalni protein sa ovom funkcijom identifikovana je Tudor stafilokokalna nukleaza (Tudor-SN), koja ima različite ulogu u životu irnk u ćelijama sisara, uključujući transkripciju, splajsovanje i degradaciju. Smatra se da editovanje A-u-I dvolančanih RNK nastalih sparivnjem invertovanih elemenata Alu i LINE može dovesti do degradacije pre-irnk sa Tudor -SN, čime bi se kontrolisao nivo ekspresije gena koje nose ponovljene sekvence Alu i LINE (slika 5d). 13

14 Slika 5. Editovanje invertovanih ponovljenih elemenata Alu i LINE u transkriptima i potencijalni mehanizmi regulacije ekspresije takvih transkripata: a) editovanje intramolekularnih dvolančanih RNK nastalih sparivanjem invertovanih elemenata Alu i LINE; b) modulisanje mesta splajsovanja egzonizacija elemenata Alu; c) nuklearna retencija transkripta; d) degradacija transkripta sa Tudor-SN. Objašnjenje u tekstu. 14