VAJE IZ BIOFARMACIJE S FARMAKOKINETIKO

Transcript

1 FAKULTETA ZA FARMACIJO KATEDRA ZA BIOFARMACIJO IN FARMAKOKINETIKO M. Bogataj, M. Kerec, I. Grabnar, S. Primožič, A. Mrhar VAJE IZ BIOFARMACIJE S FARMAKOKINETIKO SKRIPTA Ljubljana, 2001

2 KAZALO 1. vaja: PORAZDELITVENI KOEFICIENT vaja: KONSTANTA IONIZACIJE vaja: ANTACIDI vaja: DIFUZIJA IZ POLTRDNIH DERMALNIH FARMACEVTSKIH OBLIK vaja: VEZAVA NA ALBUMINE vaja: BIOADHEZIJA vaja: METODA REZIDUALOV vaja: FARMAKOKINETIČNA SIMULACIJA vaja: HITROST ABSORPCIJE...55 Izdala Katedra za biofarmacijo in farmakokinetiko Fakultete za farmacijo Univerze v Ljubljani. 1

3 1. vaja: PORAZDELITVENI KOEFICIENT Če damo neko spojino (učinkovino) v zmes dveh topil, ki se med seboj ne mešata, se bo razporedila med obe topili v določenem koncentracijskem razmerju. Porazdelitveni koeficient je definiran kot razmerje koncentracij učinkovine med organsko in vodno fazo v ravnotežnem stanju in je konstanta za učinkovino v določenem sistemu topil pri konstantnih zunanjih pogojih. Termodinamski porazdelitveni koeficient (P T ) je definiran kot razmerje molskih ulomkov topljenca v organski fazi ((x i ) o ) in vodni fazi ((x i ) v ): (x i ) o P T = (1) (x i ) v Termodinamskega porazdelitvenega koeficienta ne smemo zamenjevati z običajnim izrazom za porazdelitveni koeficient (P), ki predstavlja razmerje molarnih koncentracij: C o P = (2) C v kjer je C o koncentracija učinkovine v organski in C v koncentracija učinkovine v vodni fazi v ravnotežnem stanju. Enačba 2 velja, kadar je učinkovina v enaki obliki v organski in vodni fazi, kar pomeni, da ne pride do asociacije, niti do disociacije molekul, v nobeni od faz. Če kateri od teh dveh procesov poteče, je potrebno to upoštevati tudi pri izračunu porazdelitvenega koeficienta. Za učinkovine, ki so šibke kisline in ionizirajo (in disociirajo) samo v vodni fazi, do asociacije pa ne pride v nobeni fazi, velja naslednja enačba: [HA] o P n = (3) [HA] v + [A - ] v kjer je P n navidezni porazdelitveni koeficient, [HA] o koncentracija neionizirane oblike v organski fazi, [HA] v in [A - ] v pa koncentraciji neionizirane ter ionizirane oblike v vodni fazi. Navidezni porazdelitveni koeficient dobimo, če izračunamo razmerje izmerjenih koncentracij po stresanju obeh faz, pri določenem ph vodne faze. Pravi porazdelitveni koeficient P pa predstavlja razmerje koncentracij neioniziranih oblik učinkovine v organski in vodni fazi: [HA] o P = (4) [HA] v Podobni enačbi lahko napišemo tudi za šibke baze. 2

4 Pravi porazdelitveni koeficient lahko izračunamo iz navideznega, če poznamo ph vodne faze, pri katerem je bil določen in konstanto ionizacije oz. pka vrednost učinkovine. Naslednji enačbi sta izpeljani iz enačb 3 in 4 in Henderson- Hasselbachove enačbe: za šibke kisline: P = P n (1 + Ka/[H+ ]) = P n ( ph-pka ) (5) za šibke baze: P = P n (1 + [H+ ]/Ka) = Pn (1 +10 pka-ph ) (6) DOLOČANJE PORAZDELITVENEGA KOEFICIENTA Porazdelitveni koeficient lahko določamo računsko in eksperimentalno: računsko določanje porazdelitvenega koeficienta: - računanje po Hanschu - računanje po Rekkerju eksperimentalno določanje porazdelitvenega koeficienta: - porazdelitvena metoda - kromatografske metode: HPLC TLC Računsko določanje porazdelitvenega koeficienta Računske metode za določanje porazdelitvenega koeficienta temeljijo na aditivnosti in predpostavljajo, da je lipofilnost molekule enaka vsoti hidrofobnih prispevkov posameznih strukturnih fragmentov (substituent) te molekule. Prispevki substituent k lipofilnosti molekule so odvisni tudi od okolja v katerem se substituente nahajajo. Med različnimi pristopi, ki so jih različni avtorji uporabljali za izračun porazdelitvenega koeficienta, sta se izkazala kot najbolj uporabna pristopa Hanscha in Rekkerja. Eksperimentalno določanje porazdelitvenega koeficienta 1. PORAZDELITVENA METODA Postopek določanja porazdelitvenega koeficienta s porazdelitveno metodo poteka tako, da učinkovino raztopimo v vodi ali v pufru znane ph vrednosti in stresamo z enakim ali različnim volumnom organskega topila. Če je za izvedbo poskusa ugodnejše, lahko učinkovino raztopimo v organskem topilu in nato dodamo vodno fazo. Po vzpostavitvi ravnotežja določimo koncentracijo učinkovine v vodni in organski fazi in izračunamo porazdelitveni koeficient. Poleg opisane klasične izvedbe poznamo tudi različne modifikacije porazdelitvene metode. Kot organsko topilo se najpogosteje uporablja n-oktanol, zaradi njegove podobnosti s strukturami bioloških sistemov (lipofilna veriga in polarna skupina). Dobre strani uporabe n-oktanola so topnost mnogih organskih spojin v tem topilu, nizek parni tlak pri sobni temperaturi in 3

5 možnost spektroskopskega določanja vsebnosti učinkovin v oktanolu v UV področju. Tudi večina računskih metod temelji na eksperimentalnih podatkih, ki so bili določeni v sistemih z oktanolom; na sistem oktanol/voda se tako nanašajo Hanscheve hidrofobne konstante (π) in Rekkerjeve fragmentne konstante (f). Uporaba n-oktanola pri porazdelitveni metodi ima tudi nekatere slabe strani, ker se del vode porazdeli v oktanolno fazo, v manjši meri pa tudi oktanol v vodno, sam postopek je sorazmerno dolgotrajen, učinkovine se lahko adsorbirajo na steklo, pri klasični izvedbi metode pa potrebujemo tudi sorazmerno veliko količino učinkovin in oktanola. Iz izmerjenih koncentracij učinkovine v organski in vodni fazi v ravnotežju izračunamo navidezni porazdelitveni koeficient, za učinkovine, ki v vodni fazi disociirajo, pa lahko, ob upoštevanju ph vodne faze in pka učinkovine, iz enačb 5 in 6 izračunamo tudi pravi porazdelitveni koeficient. Če namesto n-oktanola uporabimo druga organska topila, velja med porazdelitvenimi koeficienti organsko topilo/voda za dve različni topili (Ι, ΙΙ) naslednja zveza: a,b konstanti log P ΙΙ = a log P Ι + b (7) 2. KROMATOGRAFSKE METODE Pri kromatografskih metodah se učinkovina porazdeli med stacionarno in mobilno fazo, ki imata različno lipofilnost. Iz eksperimentalno dobljenih rezultatov kromatografskih metod lahko izračunamo parameter, ki predstavlja merilo lipofilnosti učinkovine, za serijo učinkovin pa lahko poiščemo tudi korelacijo med tem parametrom in porazdelitvenim koeficientom oktanol/voda. 2.a. Tekočinska kromatografija visoke ločljivosti (HPLC) Za določanje porazdelitvenega koeficienta se uporablja obratno fazna HPLC, kjer predstavlja stacionarna faza lipofilno, mobilna pa hidrofilno komponento sistema, v katerem se porazdeljuje učinkovina. Stacionarna faza je silikagel, ki ima na hidroksilne skupine vezane alkilne verige, mobilno fazo pa predstavljata voda oz. pufer in organski modifikator (npr. metanol). Merimo retencijske čase za učinkovino (t R ) in za spojino, ki se ne retenira (t 0 ) in izračunamo kapacitivnostni faktor učinkovine (k'), ki je merilo lipofilnosti učinkovine: t R - t 0 k' = (8) t 0 Korelacija med kapacitivnostnim faktorjem in porazdelitvenim koeficientom oktanol/voda (P) je naslednja: kjer sta p in q konstanti. log k' = p log P + q (9) 4

6 Porazdelitveni koeficient P lahko izračunamo na različne načine, najpogosteje se uporabljata metoda analogne vrste in metoda z določanjem "log Kw". Metoda analogne vrste Kapacitivnostni faktor določimo čim večjemu številu strukturno podobnih učinkovin, za katere poznamo vrednost porazdelitvenega koeficienta oktanol/voda, da so tako zajete vse možne interakcije med učinkovino in mobilno ter stacionarno fazo. S pomočjo dobljene korelacije med kapacitivnostnim faktorjem in porazdelitvenim koeficientom (enačba 9), nato izračunamo porazdelitveni koeficient nove učinkovine. Metoda "log Kw" V mobilni fazi spreminjamo delež vodne faze v čim širšem možnem intervalu (npr %) in za vsako uporabljeno mobilno fazo določimo kapacitivnostni faktor učinkovine. Z ekstrapolacijo določimo vrednost kapacitivnostnega faktorja za mobilno fazo, ki bi vsebovala 100% vode in kjer velja: log k' = log Kw. Vrednost "log Kw" je merilo za porazdelitev učinkovine med lipofilno stacionarno fazo in vodno fazo brez dodatkov organskih topil, in zato bolje opredeli lipofilnost učinkovine kot kapacitivnostni faktor, določen ob uporabi mobilne faze, ki vsebuje tudi organsko topilo. Na enak način, kot pri prej opisani metodi analogne vrste, pa lahko tudi tukaj določimo korelacijo med log Kw in log P, ter izračunamo porazdelitveni koeficient oktanol/voda za novo učinkovino. 2.b. Tankoplastna kromatografija (TLC) Za določanje porazdelitvenega koeficienta uporabljamo obratno fazno TLC, torej predstavlja stacionarna faza lipofilno, mobilna pa hidrofilno komponento sistema, v katerem se učinkovina porazdeljuje. Pri TLC določamo retencijske faktorje učinkovine (Rf) v določenem sistemu mobilne in stacionarne faze, ter iz njih izračunamo parameter "Rm" po naslednji enačbi: Rm = log ((1/Rf) -1) (10) Podobno kot pri HPLC, lahko, za serijo strukturno podobnih spojin, poiščemo korelacijo med logaritmom porazdelitvenega koeficienta oktanol/voda (log P) in parametrom Rm, ter nato izračunamo vrednost porazdelitvenega koeficienta za novo učinkovino. LITERATURA: 1. Martin A. et al., Physical pharmacy, Lea &Febiger, Philadelphia, London, Wells J.I., Pharmaceutical preformulation: The physicochemical properties of drug substances, Ellis Horwood, Chichester,

7 NALOGE 1. Kisli učinkovini smo s porazdelitveno metodo določili vrednost navideznega porazdelitvenega koeficienta oktanol/voda (pufer) 0,50 pri ph 3,5 in 0,16 pri ph 4,0. Ali bi pri ph 1,5 s to metodo določili pravi ali navidezni porazdelitveni koeficient in zakaj? (R: Navidezni porazdelitveni koeficient, ker je razlika med pka (=1,74) in ph majhna.) mg učinkovine raztopimo v 100 ml pufra s ph 3,0. 1 ml dobljene raztopine redčimo z istim pufrom na 25 ml in 20 ml te raztopine stresamo z 20 ml n- oktanola. Ko se vzpostavi ravnotežje med vodno in oktanolno fazo, odpipetiramo 3 ml vodne faze, jo redčimo s pufrom ph 3,0 do 25 ml in v tej raztopini določimo koncentracijo učinkovine 0,5 mg/l. Izračunaj porazdelitveni koeficient učinkovine in ugotovi ali je pravi ali navidezni, če je konstanta ionizacije učinkovine pka = 3,31! (R: Navidezni porazdelitveni koeficient; P n = 1,4) 3. Kisli učinkovini določimo navidezni porazdelitveni koeficient 0,7 v sistemu n- oktanol/pufer. Izračunaj pravi porazdelitveni koeficient učinkovine, če je v vodni fazi (pufru) 25% učinkovine ionizirane! (R: P = 0,93) 4. V sistemu n-oktanol / voda smo določali porazdelitveni koeficient učinkovine pri ph vrednostih 2, 3, 4, 5, 6, 7 in 9, ter ugotovili naslednjo linearno odvisnost (r=0,998): Pn -1 = 0,36 + 2,25 * 10-5 *[H + ] -1 Ugotovi ali je učinkovina kisla ali bazična, ter izračunaj njeno konstanto ionizacije ter pravi porazdelitveni koeficient! Ali smo pri ph 4,0 eksperimentalno določili pravi ali navidezni porazdelitveni koeficient? 6

8 NAVODILA ZA EKSPERIMENTALNO DELO Določanje porazdelitvenega koeficienta n-oktanol/voda za fenobarbiton, barbiton in sulfacetamid-na Fenobarbiton: Natehtamo mg substance, jo raztopimo v majhnem volumnu etanola v 50 ml merilni bučki in dopolnimo z vodo do oznake. Dobljeno raztopino redčimo z vodo 5ml/50ml. 15 ml te raztopine nato dodamo v lij ločniku 15 ml n-oktanola in stresamo 30 minut. Vodnima raztopinama pred in po stresanju izmerimo absorbanci pri valovni dolžini 270 nm. Barbiton: Natehtamo mg substance, jo raztopimo v majhnem volumnu etanola v 50 ml merilni bučki in dopolnimo z vodo do oznake. Dobljeno raztopino redčimo 5ml/50ml. 15 ml te raztopine nato dodamo v liju ločniku 15 ml n-oktanola in stresamo 30 minut. Vodni raztopini pred in po stresanju redčimo 1/5 z vodo in jima izmerimo absorbanci pri valovni dolžini 220 nm. Sulfacetamid-Na: Natehtamo mg substance in jo raztopino v 50 ml vode. 15 ml te raztopine dodamo v liju ločniku 15 ml n-oktanola in stresamo 30 minut. 1 ml preostale raztopine redčimo z vodo na 100 ml. Enako redčimo tudi vodno fazo po stresanju z n- oktanolom, nato pa obema raztopinama izmerimo absorbanco pri 256 nm. Iz dobljenih rezultatov izračunamo porazdelitvene koeficiente (P) vseh treh substanc in poiščemo korelacijo med P in RSA (relativna specifična absorpcija - sorazmerna konstanti hitrosti absorpcije) ter med log P in log RSA. Vrednosti RSA: - fenobarbiton: 3,3 - barbiton: 2,5 - sulfacetamid-na: 0,6 7

9 2. vaja: KONSTANTA IONIZACIJE Konstanta ionizacije predstavlja merilo kislosti oz. bazičnosti spojin (učinkovin). Namesto "konstanta ionizacije" se pogosto uporablja izraz "konstanta disociacije", vendar pomena obeh izrazov nista popolnoma enaka. Veliko večkomponentnih sistemov namreč lahko disociira (se loči - razdruži na komponente), ne da bi pri tem nastali ioni - tak primer je sistem encim-substrat, v nekaterih primerih pa lahko učinkovine ionizirajo (nastanejo ioni), ne da bi pri tem prišlo do disociacije, npr. dipolarni ioni (zwitterioni). Ionizacija šibkih kislin je predstavljena v enačbi 1: HA H + + A (1) konstanta ionizacije Ka pa je definirana z enačbo 2: a(h + ) a(a - ) Ka T = (2) a (HA) Oznake a(h + ), a(ha) in a(a - ) pomenijo aktivnosti vodikovih ionov ter neionizirane in ionizirane oblike kisline. Konstanta ionizacije, izražena z enačbo 2 se zato imenuje tudi termodinamska konstanta ionizacije (Ka T ). V enačbi 3 so namesto aktivnosti uporabljene koncentracije, ki so označene z oglatimi oklepaji ([H + ], [HA], [A - ]), Ka C pa pomeni koncentracijsko konstanto ionizacije: [H + ] [A ] Ka C = (3) [HA] Z uporabo aktivnosti zajamemo medsebojne privlake med ioni in nepopolno hidratacijo ionov v raztopinah z visoko koncentracijo. Čim nižja je koncentracija, manjše so interakcije in pri neskončnem razredčenju postane koncentracijska konstanta ionizacije enaka termodinamski. Vendar pa lahko vseeno uporabljamo izraz za koncentracijsko konstanto ionizacije, kadar so koncentracije v raztopinah manjše kot 0,01 mol/l in so prisotni samo enovalentni ioni. Konstanta ionizacije je odvisna od temperature, zato ob podatku za vrednost konstante vedno navajamo tudi temperaturo, pri kateri je bila določena. 8

10 DOLOČANJE KONSTANTE IONIZACIJE Določanje konstante ionizacije temelji na neki lastnosti učinkovine (absorpcija svetlobe, porazdelitev med organsko in vodno fazo, topnost...), ki je različna za ionizirano in neionizirano obliko. Izjema je potenciometrična metoda, kjer lahko koncentracije ionizirane in neionizirane oblike direktno izračunamo iz dobljenih eksperimentalnih rezultatov. Najpogosteje uporabljane metode so naslednje: 1. potenciometrična 2. spektrofotometrična 3. topnostna 4. porazdelitvena 5. HPLC 6. druge metode: konduktometrična, termometrična metoda, Ramanova spektrometrija POTENCIOMETRIČNA METODA Postopek določanja poteka tako, da raztopino učinkovine, znane koncentracije, titriramo z močno kislino ali bazo in merimo razliko potencialov med elektrodo, katere potencial se spreminja s koncentracijo vodikovih ionov (običajno steklena elektroda) in referenčno elektrodo, s konstantnim potencialom (običajno kalomelova elektroda). Razlika potencialov je merilo za aktivnost vodikovih ionov v raztopini. Postopek običajno poteka tako, da s ph-metrom direktno merimo ph vrednost v raztopini po dodajanju močne kisline ali baze. Optimalna koncentracija učinkovine je 0,01 mol/l. S potenciometrično metodo dobimo dobre rezultate za pka vrednosti med 2,5 in 11, interval pa lahko nekoliko razširimo z upoštevanjem aktivnosti ali z uporabo drugih elektrod. Pravilo, ki se ga moramo pri potenciometričnih določitvah konstante držati, če želimo dobiti točne rezultate je, da mora biti vrednost pka večja od negativnega logaritma koncentracije: pka > - log C. Pri optimalni koncentraciji 0,01 mol/l lahko torej določamo vrednosti pka večje od 2. Problem pri tej metodi lahko predstavljajo slabo topne učinkovine, s katerimi ne moremo doseči dovolj visoke koncentracije. Računanje: Iz začetne koncentracije učinkovine in dodatkov kisline ali baze pri titraciji izračunamo koncentraciji ionizirane in neionizirane oblike, vrednosti ph pa merimo med poskusom. Konstanto ionizacije lahko izračunamo z enačbo 4 ali 5: učinkovina je šibka kislina: pka = ph + log ([HA]/[A - ]) (4) učinkovina je šibka baza: pka = ph + log ([BH + ]/[B]) (5) 9

11 2. SPEKTROFOTOMETRIČNA METODA Spektrofotometrična metoda temelji na različni absorpciji svetlobe ionizirane in neionizirane oblike raztopljene učinkovine. Metodo lahko uporabimo, kadar: učinkovina absorbira svetlobo v UV ali vidnem področju, in se absorpcija molekularne oblike in iona razlikuje v valovni dolžini in / ali intenziteti Postopek določanja poteka v naslednjih stopnjah: 1. posnamemo UV ali vidna spektra ionizirane in neionizirane oblike: učinkovino raztopimo v pufrih z dovolj nizko in z dovolj visoko ph vrednostjo, tako da je prisotna samo ionizirana ali neionizirana oblika 2. izberemo analitsko valovno dolžino, pri kateri je razlika med absorbancama ionizirane in neionizirane oblike največja 3. pripravimo raztopine učinkovine enakih koncentracij, v pufrih različnih ph vrednosti, in izmerimo absorbance pri izbrani valovni dolžini najprej določimo približno vrednost konstante ionizacije, tako, da izvedemo meritve na širokem ph intervalu, med ph popolnoma ionizirane in ph popolnoma neionizirane oblike ph interval zožimo na vrednosti: ph = pka + 0, 0.2, 0.4, 0.6 in izmerimo absorbance. 4. izmerimo tudi absorbanci popolnoma ionizirane in popolnoma neionizirane oblike raztopinama iste koncentracije, pri isti valovni dolžini. Na sliki so prikazani UV spektri bazične učinkovine pri različnih ph: 10

12 Iz spektrov je razvidno, da je učinkovina popolnoma protonirana pri ph 4, v neprotonirani obliki pa je pri ph 10. Analitska valovna dolžina je 310 nm. Vrednost pka izračunamo po naslednjih enačbah: učinkovina je šibka kislina: A I - A pka = ph + log (6) A - A N učinkovina je šibka baza: A - A N pka = ph + log (7) A I - A kjer je A absorbanca učinkovine v pufru določene ph vrednosti, A N absorbanca neionizirane in A I absorbanca ionizirane oblike. 3. TOPNOSTNA METODA Topnostna metoda temelji na različni topnosti ionizirane in neionizirane oblike učinkovine v vodnem mediju. To pomeni, da topnostno metodo lahko uporabljamo za določanje konstante ionizacije učinkovin, pri katerih je topnost odvisna od njihove ionizacije oz. od ph medija. Metoda je primerna za učinkovine, ki so zelo slabo topne. Postopek izvedemo tako, da določimo topnost učinkovine v pufrih različnih ph vrednosti. Presežek učinkovine mešamo v pufru toliko časa, da se vzpostavi ravnotežje med raztopljeno in neraztopljeno učinkovino. Neraztopljeni del odfiltriramo, bistri nasičeni raztopini pa določimo koncentracijo učinkovine in ph. Postopek izvajamo pri konstantni temperaturi in ionski moči. Vrednost pka lahko izračunamo po naslednjih enačbah: učinkovina je šibka kislina: učinkovina je šibka baza: S = S 0 + (S 0 Ka (1/[H + ])) (8) pka = ph - log ((S/S 0 ) - 1) (9) S = S 0 + ((S 0 /Ka) [H+ ]) (10) pka = ph + log ((S/S 0 ) - 1) (11) kjer pomeni S 0 topnost neionizirane oblike učinkovine in S topnost učinkovine pri določenem ph vodnega medija (za šibke kisline: S = [HA]+ [A - ]) 11

13 4. PORAZDELITVENA METODA Porazdelitvena metoda temelji na različnem porazdeljevanju ionizirane in neionizirane oblike učinkovine med organsko in vodno fazo. Običajno predpostavimo, da učinkovina ionizira v vodni fazi in da se v organsko fazo porazdeljuje samo neionizirana oblika. V vodni fazi imamo torej ravnotežje med ionizirano in neionizirano obliko, v organski pa imamo samo neionizirano obliko, ki je v ravnotežju z neionizirano obliko učinkovine v vodni fazi. Postopek poteka tako, da določimo navidezni porazdelitveni koeficient učinkovine pri različnih ph vodne faze. Učinkovino raztopimo v vodni fazi (ali organski) in jo stresamo z organsko (vodno) fazo toliko časa, da se učinkovina porazdeli med obe fazi in se vzpostavi ravnotežje. Določimo ravnotežni koncentraciji učinkovine v organski in vodni fazi in izračunamo navidezni porazdelitveni koeficient za serijo pufrnih raztopin z različnimi ph. Konstanto ionizacije izračunamo po naslednjih enačbah: učinkovina je šibka kislina: učinkovina je šibka baza: pka = ph - log ((P/P n ) - 1) (12) pka = ph + log ((P/P n ) - 1) (13) kjer sta P pravi in P n navidezni porazdelitveni koeficient. 5. HPLC HPLC metoda temelji na različnem porazdeljevanju ionizirane in neionizirane oblike učinkovine med stacionarno in mobilno fazo, pri čemer lahko pride do porazdelitve obeh oblik v obe fazi. Določamo kapacitivnost učinkovine pri različnih ph mobilne faze. Za šibko kislino lahko izračunamo konstanto ionizacije s pomočjo naslednje enačbe: k n ' + k i ' (Ka/[H + ]) k' = (14) 1 + Ka/[H + ] kjer je k' kapacitivnost učinkovine, k i ' kapacitivnost ionizirane oblike in k n ' kapacitivnost neionizirane oblike. LITERATURA: A. Albert, E. P. Serjeant, The Determination of Ionization Constants, A Laboratory Manual, Chapman and Hall, London, New York,

14 NALOGE 1. Izpelji enačbo, ki prikazuje odvisnost topnosti od ph za bazo (kislino)! 2. V litru puferne raztopine s ph 3 se raztopi 1,2 mg kisle učinkovine, če pa ph dvignemo na 5 se je v 1 litru raztopi 3,2 mg. ph raztopin se po dodatku učinkovine ne spremeni. Izračunaj konstanto ionizacije učinkovine in topnost njene neionizirane oblike! Molekulska masa učinkovine je 118. (R: S 0 = 1,18 mg/l; pka = 4,77) 3. Opiši princip določanja konstante ionizacije s topnostno metodo! 4. Kakšen je osnovni princip določanja konstante ionizacije s spektrofotometrično metodo? Navedi stopnje dela! 5. Pripravili smo raztopine kisle učinkovine enakih koncentracij v pufrih z različnimi ph in na spektrofotometru izmerili absorbance teh raztopin, ki so podane v tabeli. S pomočjo navedenih podatkov oceni interval v katerem leži pka in nato izračunaj točno vrednost pka! ph A 0,105 0,103 0,501 0,809 0,807 (R: Interval: 3-7; pka = 4,89; A I = 0,808; A N = 0,104; A = 0,501) 6. Iz 5 M raztopine HCl želimo pripraviti raztopino HCl s ph = 1,9. Katera od naslednjih redčenj so pravilna: a) 25ml/100ml in 10ml/100ml b) 5ml/10ml in 5ml/100ml c) 1ml/100ml in 10ml/100ml in 25ml/100ml d) 25ml/50ml in 5ml/10ml in 1ml/100ml e) 2ml/10ml in 25ml/100ml in 10ml/100ml (R: d) 7. Kako bi iz 1,12 mol/l raztopine učinkovine pripravili 4,48 mmol/l raztopino? Navedi dva načina redčenja ter vrsto in volumne uporabljene steklovine! (R: npr.: 1/25 + 1/10 ali 1/50 + 2/10; 1 ml osnovne raztopine vzamemo s polnilno pipeto, damo v 25 ml merilno bučko in dopolnimo do oznake, od te raztopine vzamemo 1 ml s polnilno pipeto, ) 8. Konstanto ionizacije učinkovine, ki vsebuje kisle funkcionalne skupine smo določali s spektrofotometrično metodo in dobili rezultate, ki so prikazani v tabeli. Ugotovi koliko konstant ima učinkovina v testiranem ph območju in izračunaj njihove vrednosti! ph 0, A 0,011 0,009 0,323 0,610 0,609 0,822 1,121 1,120 13

15 NAVODILA ZA EKSPERIMENTALNO DELO 1. Določanje konstante ionizacije borne kisline s potenciometrično metodo Pripravimo 100 ml 10-2 M vodne raztopine H 3 BO 3 (M(borne kisline)=61.8) in ji izmerimo ph. Med mešanjem z magnetnim mešalom dodajamo po 0,1 ml 1M NaOH in po vsakem dodatku izmerimo ph vrednost. Postopek zaključimo po desetih dodatkih NaOH. Konstanto izračunamo po Henderson-Hasselbachovi enačbi iz podatkov, ki jih dobimo po vsakem dodatku baze. Kot rezultat podamo povprečno vrednost konstante ionizacije. 2. Določanje konstante ionizacije diazepama s spektrofotometrično metodo Pripravimo 25 ml M raztopine diazepama (M(diazepama)=284) v metanolu. Po 1 ml te raztopine redčimo na 50 ml z 1M HCl in 0,1M NaOH, posnamemo UV spektra in iz spektrov določimo valovno dolžino, pri kateri bomo izvajali meritve. Nato redčimo po 1 ml osnovne raztopine do 50 ml s puferskimi raztopinami naslednjih ph vrednosti: 2.8, 3.1, 3.4, 3.8 in 4.2. Vsem vzorcem izmerimo ph na phmetru in absorbance na spektrofotometru. Absorbanco protonirane oz. neprotonirane oblike določimo z redčitvijo 1 ml osnovne raztopine na 50 ml z 1M HCl in oz. 0,1M NaOH. Konstanto ionizacije izračunamo za vsako meritev posebej in podamo rezultat kot povprečje vseh izračunanih vrednosti. 14

16 3. vaja: ANTACIDI Antacidi so zdravila, ki po peroralni aplikaciji vežejo želodčno kislino. Najpogostejši mehanizmi delovanja antacidov so nevtralizacija HCl, adsorpcija HCl in mehanska zaščita sluznice pred delovanjem HCl in prebavnih sokov. Dober antacid nevtralizira samo odvečno želodčno kislino in vzdržuje ph želodca med 3 in 5. V tem ph področju prebavni encimi ustrezno delujejo in ne povzročajo korozivnih poškodb na sluznici. Če antacid v večji meri nevtralizira želodčno kislino in so ph vrednosti višje, pride do povečanega nastajanja HCl (sekundarna hipersekrecija HCl), verjetno zaradi povečanega sproščanja gastrina in histamina, hkrati pa je moteno tudi proteolitično delovanje želodčnega soka zaradi inaktivacije pepsina in katepsina. Antacidi se uporabljajo pri povečanem izločanju želodčne kisline in pri ulkusni bolezni, dajejo pa se običajno 1 uro po jedi ali med dvema obrokoma. Pri sočasnem jemanju antacidov in drugih zdravil lahko pride do medsebojnih interakcij. Delitev antacidov po Tomiću je naslednja: - alkalijske soli - zemljoalkalijske soli, oksidi in hidroksidi - silikati - aluminijeve soli in hidroksidi - bizmutove soli Alkalijske soli Po peroralni aplikaciji nevtralizirajo želodčno kislino. Kot antacidi se uporabljajo hidrogenkarbonati, laktati, citrati in acetati natrija in kalija. Ker se absorbirajo lahko povzročijo splošno alkalozo, ker se kation dalj časa zadrži v organizmu, anion pa se metabolizira in hitro izloči. natrijev hidrogenkarbonat Nevtralizira želodčno kislino, ph želodca se lahko dvigne na 7 ali več. Učinek je hiter in kratkotrajen. Pri nevtralizaciji se sprošča CO 2, ki razteza želodec in tako lahko ublaži spazme in bolečino, lahko pa povzroči tudi perforacijo želodčnega ulkusa. Zaradi visokega ph in zaradi sproščenega CO 2 pride do močne sekundarne sekrecije HCl. Natrijev hidrogenkarbonat povzroča splošno alkalozo. kalijev hidrogenkarbonat Ima enak učinek kot natrijev hidrogen karbonat; daje se ga, če je za bolnika kalij kot kation bolj ustrezen od natrija. 15

17 Zemljoalkalijske soli, oksidi in hidroksidi Po peroralni aplikaciji nevtralizirajo želodčno kislino. Iz prebavnega trakta se le malo absorbirajo in ne povzročajo splošne alkaloze. magnezijev oksid, magnezijev hidroksid, magnezijev karbonat Močno nevtralizirajo želodčno kislino, do ph 7 ali več in povzročajo sekundarno hipersekrecijo HCl. Magnezijev hidroksid deluje zelo hitro, magnezijev karbonat pa zaradi svoje kristalne strukture nekoliko počasneje. Magnezijev klorid, ki nastane pri nevtralizaciji deluje laksativno. magnezijev peroksid Pri reakciji s HCl nastane nascentni kisik. Magnezijev peroksid deluje antacidno, antiseptično in dezodorantno. kalcijev karbonat Kalcijev karbonat nevtralizira želodčno kislino hitro in učinkovito. Hitrost delovanja je odvisna od velikosti delcev in kristalne strukture CaCO 3. Po Tomiću nevtralizira samo višek HCl in ne povzroča hipersekrecije, po Varagiću pa lahko nevtralizira vso prisotno kislino v želodcu in povzroči sekundarno hipersekrecijo HCl. Višek CaCO 3 mehansko ščiti sluznico želodca, zato mora biti v obliki drobnih, kroglastih delcev (praecipitatum). Pri dolgotrajnem jemanju kalcijevega karbonata, posebno, če se hkrati pije večje količine mleka, pride do absorpcije večjih količin kalcija in do mlečno alkalnega sindroma. CaCO 3 deluje obstipantno. kalcijevi fosfati Silikati Silikati vežejo kislino z adsorpcijo. Uporabljajo se v obliki zemljoalkalijskih in aluminijevih soli. magnezijev trisilikat Deluje počasi in dolgotrajno. V želodcu nastane koloidna silicijeva kislina, ki počasi veže HCl z adsorpcijo. Presežek Mg trisilikata ne dvigne ph nad fiziološko mejo in ne povzroča sekundarne hipersekrecije HCl. magnezijev aluminijev silikat Mg Al silikat veže želodčno kislino z adsorpcijo. Učinek traja dolgo časa. 16

18 Aluminijev hidroksid in soli Tvorijo hidrofilne koloide, ki imajo pufrsko-antacidne in adsorptivne lastnosti. Ne povzročajo alkaloze. aluminijev hidroksid Nevtralizira in adsorbira presežek želodčne kisline ter deluje kot adstringens. V želodcu tvori gel, ki prekrije sluznico in adsorbira HCl, toksine in bakterije. ph želodca vzdržuje v fiziološkem področju pri vrednostih 4-5. Ne povzroča sekundarne hipersekrecije HCl. Aluminijev hidroksid nevtralizira kislino počasneje kot magnezijev hidroksid ali karbonat in kot kalcijev karbonat. Pri nevtralizaciji HCl z Al(OH) 3 nastane AlCl 3, ki se veže s fosfati v črevesju v netopen Al fosfat, le-ta pa se izloči z blatom. Zaradi opisanega procesa pride pri dolgotrajni uporabi velikih doz Al(OH) 3 do hipofosfatemije. aluminijev fosfat Dvigne ph v želodcu na 3, ne povzroči nefiziološke alkalizacije želodčnega soka in ne sekundarne hipersekrecije HCl. V primerjavi z aluminijevim hidroksidom aluminijev fosfat ne preprečuje absorpcije fosfatov iz prebavnega trakta. Bizmutove soli Adsorbirajo želodčno kislino in delujejo adstringentno. Velike doze bizmutovih soli so toksične. LITERATURA: 1. Tomić D., Farmakoterapija, Medicinska knjiga, Beograd, Zagreb, Varagić V.M. in Milošević M.P., Farmakologija, Medicinska knjiga, Beograd, Zagreb, Goodman and Gilman s, The pharmacological basis of therapeutics, Gilman AG Rall TW et all., Dallas, Texas,

19 NALOGE 1. Tabletam Acimola, Kompensana in Rupuruta določamo nevtralizacijsko kapaciteto po predpisu po USP XXIII. Volumni porabljene NaOH so naslednji: Acimol 25,7 ml, Kompensan 43,8 ml in Rupurut 29,8 ml. Nevtralizacijske kapacitete, ki smo jih določili, padajo po naslednjem vrstnem redu: a) Rupurut > Kompensan > Acimol b) Kompensan > Rupurut >Acimol c) Acimol > Rupurut > Kompensan d) Acimol > Kompensan > Rupurut e) Rupurut > Acimol > Kompensan f) Kompensan > Acimol > Rupurut (R: c) 2. Kakšen je mehanizem antacidnega delovanja alkalijskih soli in kakšni so možni stranski učinki? Navedi dva predstavnika! 3. Opiši antacidno delovanje derivatov aluminija! Kateri predstavniki se uporabljajo, navedi njihove prednosti in stranske učinke! 4. Kako bo pacient, ki ima težave zaradi povečanega izločanja želodčne kisline, občutil delovanje vsakega od spodaj navedenih antacidov nekaj minut po aplikaciji, ter 1 do 2 uri po aplikaciji: a) silikatov (apliciramo najmanjšo predpisano dozirano količino zdravila) b) NaHCO 3 (apliciramo najmanjšo enkratno dozo učinkovine) Silikati, po nekaj minutah: Silikati, po 1-2 urah: NaHCO 3, po nekaj minutah: NaHCO 3, po 1-2 urah: 5. Nevtralizacijsko kapaciteto smo določili dvema antacidoma, ki sta bila vgrajena v tableti. V tableti A je bilo 0,5g NaHCO 3, ki se je sproščal iz tablete s konstantno hitrostjo 2mmol/min, v tableti B pa 0,5g Mg(OH) 2, ki se je sproščal s konstantno hitrostjo 0,1mmol/min. Izračunaj nevtralizacijski kapaciteti tablet A in B, glede na, v navodilu predpisano minimalno dozirano količino zdravila (v obeh primerih je to ena tableta), ki smo ju določili po postopku po USP 23! (atomski masi: Na=23, Mg=24,3; čas stika antacida s HCl pred začetkom titracije je 15 minut) 18

20 NAVODILA ZA EKSPERIMENTALNO DELO 1. S preliminarnim testom za določanje nevtralizacijske kapacitete antacidov (USP XXIII, predpis <1001>) ugotovite, če je dobljeno zdravilo antacid in za zdravila, ki so antacidi določite njihovo nevtralizacijsko kapaciteto po istem predpisu. Testirana zdravila: Acimol, tablete Acimol, suspenzija Duobloc, žvečilne tablete Gelusil Lac, tablete Gelusil Lac, praški Gastal, tablete Gastal, suspenzija Kompensan, tablete Rupurut, suspenzija Rupurut, tablete Venter, tablete Venter, granule natrijev hidrogenkarbonat, prašek 2. Preučite dobljene rezultate za vsa zdravila glede na njihovo kemično sestavo, dozo in indikacijsko področje. 19

21 20

22 21

23 22

24 23

25 4. vaja: DIFUZIJA IZ POLTRDNIH DERMALNIH FARMACEVTSKIH OBLIK 1) Poltrdne dermalne farmacevtske oblike: Tvorijo jih enostavne ali sestavljene podlage, v katerih je raztopljena ali dispergirana ena ali več zdravilnih učinkovin. Razlikujemo več vrst poltrdnih dermalnih farmacevtskih oblik: - mazila - kreme - gele - paste Vse so namenjene nanašanju na kožo ali na določene površine sluznice in lahko delujejo lokalno ali sistemsko. Terapevtska učinkovitost poltrdnih dermalnih farmacevtskih oblik je lahko ob isti učinkovini, vgrajeni v različne podlage, različna. Izbira optimalne podlage je odvisna od fizikalno-kemičnih lastnosti učinkovine in vehikla kot tudi od stanja in vrste kože, na katero bomo dermalno zdravilo aplicirali. 2) Zgradba kože (lat. cutis, gr. derma) 3) Perkutana absorpcija: Definirana je kot penetracija učinkovine s površine kože v kožo ali skozi kožo v krvni obtok. Pomembni faktorji tega procesa so mehanizem in hitrost prodiranja učinkovine v kožo in porazdelitev učinkovine neposredno po perkutani absorpciji. Ločimo dva glavna načina prehoda učinkovin v kožo in skozi njo: - transepidermalni, ki poteka skozi celotno epidermo, - transfolikularni, ki poteka v glavnem skozi žleze lojnice. 24

26 a) Transepidermalna absorpcija: Površina epiderme je 10 do 100-krat večja od površine kožnih žlez. Na njeni površini nastaja tanek film, ki je sestavljen iz sebuma, znoja in odluščenih poroženelih celic. Ker je ta film po sestavi in debelini neenakomeren, največkrat ne predstavlja ovire prodirajoči učinkovini. Zaroženela plast je debela µm. Njena glavna sestavina je keratin, beljakovina s sulfhidrilnimi skupinami, ki adsorbira velike količine vode. V tej plasti so tudi površinski lipidi, ki so razporejeni v prostorih med celicami. Ta plast deluje kot rezervoar za učinkovino in vzdržuje njen maksimalni koncentracijski gradient tik nad kožno bariero in s tem zavira prehod oziroma absorpcijo. Območje kožne bariere se nahaja med zaroženelo in zrnato plastjo. To je elektronegativno nabita plast, ki odbija anione in privlači katione. Debela je 10 µm in ovira prehod molekul z molekulsko maso večjo od Najhitreje prehajajo učinkovine s porazdelitvenim koeficientom k o/v =1, kar pomeni, da ima bariera tako lipofilne kot hidrofilne lastnosti. Molekul, ki prehajajo bariero ni veliko. Na njihovi nadaljnji poti se vežejo na generativno plast epiderme ali pa jih tkivna tekočina odplavi v limfne in krvne žile. V splošnem velja, da hitrost penetracije učinkovin raste v naslednjem zaporedju: hidrofilne < lipofilne < amfifilne b) Transfolikularna absorpcija: Poteka skozi tako imenovane kožne adnekse, pretežno skozi žleze lojnice. Pri tem je odločilna topnost učinkovine v sebumu. Skozi sebum prodre učinkovina do lojne žleze, katere membrana je bolj prepustna od kožne bariere. 4) Faktorji, ki vplivajo na perkutano absorpcijo: - Stanje kože Zgoraj naštete ugotovitve veljajo za zdravo, nepoškodovano kožo. Prepustnost poškodovane kože (travme, mehurji, ekcemi) je v splošnem zvečana. Kožna bariera je lahko poškodovana ali uničena in substance prosto prehajajo v usnjico. Na drugi strani pa je perkutana absorpcija močno zmanjšana v starosti, predvsem zaradi atrofičnih sprememb kožnih adneksov. - Permeabilnostni koeficient učinkovine Permeabilnostni koeficient je lahko podan s spodnjo enačbo: P eff = D P x P... porazdelitveni koeficient učinkovine med kožno bariero in vehiklom D... povprečni difuzijski koeficient učinkovine v barieri x... difuzna razdalja (efektivna debelina kožne bariere) Difuzivnost substanc s podobno molekulsko maso in velikostjo se ne spreminja močno. Nasprotno pa je porazdelitveni koeficient občutljiva in kompleksna funkcija molekularne strukture in velikosti molekule. Učinkovina dobro prodira v kožo, če je porazdelitveni koeficient koža/vehikel velik. Na drugi strani pa učinkovina ne more zapustiti kože, če je porazdelitveni koeficient koža/receptorska tekočina velik. Zaradi tega so najbolj zaželene učinkovine s porazdelitvenim koeficientom 1. 25

27 - Vpliv vlage Voda je v veliki meri adsorbirana na kožne beljakovine in njihove razgradne produkte. Prisotnosti vlage vpliva na prepustnost posameznih plasti kože. Vpliv vlage je še posebno pomemben za učinkovine, ki so pretežno hidrofilne. Znano je, da nekateri živčni bojni strupi hitreje penetrirajo skozi vlažno kot skozi suho kožo. Posebno važna je hidratacija zaroženele plasti, pri čemer pride do razširitve por. Brezvodne maščobne podlage so najbolj okluzivne in inducirajo največjo hidratacijo kože zaradi akumulacije znoja na površini med kožo in dermalno obliko. V/O emulzije so manj okluzivne, O/V emulzije pa ponavadi invertirajo zaradi izhlapevanja vode, pri čemer se ustvari zvezni oljni film, ki vsebuje raztopljeno učinkovino. Pri vodotopnih vehiklih izhlapevanje vode iz podlage vpliva na hidratacijo zaroženele plasti le v manjši meri. Suspendirani delci v pudrih ali pastah zmanjšajo efekt oljnega filma in s tem okluzivnost vehikla. Nekatere poltrdne dermalne farmacevtske oblike pri aplikaciji prekrijemo s povoji, s tem zadržimo perspiracijo in povečamo hidratacijo. Do neke mere vpliva na hidratacijo kože tudi debelina nanešenega sloja pripravka. - Vpliv podlage Glavna naloga podlage je omogočiti čim boljši stik med učinkovino in kožo. Najbolje se absorbirajo učinkovine iz vehiklov, ki se dobro razmažejo in se mešajo s sebumom. Vehikel sam ni sposoben zagotoviti absorpcije učinkovin, ki se slabo absorbirajo, lahko pa na drugi strani vpliva na absorpcijo učinkovin, ki se dobro absorbirajo. Bistvene so permeabilnostne lastnosti učinkovine v vehiklu in kožni barieri ter hidratacija kože. Splošnih zakonitosti, ki bi veljale za razvrstitev posameznih podlag v korelaciji z absorpcijo učinkovin, je malo. Ugotovitve v literaturi so vezane na različne učinkovine in eksperimentalne metode, ki so bile uporabljene v posameznih primerih. - Vpliv površinsko aktivnih snovi Te snovi emulgirajo sebum in zvečajo perkutano absorpcijo. Holesterol, primešan podlagi, poveča absorpcijo, medtem ko apliciran na kožo pred aplikacijo pripravka zmanjša njeno prepustnost za učinkovino. Zelo pomembna je pravilna izbira površinsko aktivne snovi, saj lahko pride do inkompatibilnosti, npr. kompleksacije učinkovine. Izkazalo se je, da neionski emulgatorji najbolje pospešujejo perkutano absorpcijo. - Vpliv koncentracije učinkovine Za suspenzijske poltrdne dermalne oblike velja: dq/dt = (A D C s / 2t) 1/2 A... koncentracija učinkovine D... difuzijska konstanta učinkovine v zunanji fazi pripravka C s... topnost učinkovine v zunanji fazi pripravka t... pretečen čas - Vpliv ph Hitrost absorpcije učinkovin, ki so šibke kisline ali baze, je močno odvisna od ph vehikla. Aktivnostni koeficient molekularne oblike učinkovine je funkcija ph pri vrednostih ph>pka za kisline in pri vrednostih ph< pkw-pkb za baze. 26

28 - Ostali faktorji Med ostale faktorje štejemo način absorpcije, površino kože, na katero apliciramo poltrdno dermalno farmacevtsko obliko, čas kontakta med pripravkom in kožo, pogostnost aplikacije, temperaturo kože... 5) Metode določevanja perkutane absorpcije Te metode v splošnem delimo na 'in vitro' in 'in vivo' metode. 'In vitro' metode so primerne predvsem za določanje sproščanja učinkovine iz podlage, ne moremo pa iz njihovih rezultatov napovedati hitrosti in obsega perkutane absorpcije. - Penetracija v modele Ta pojem obsega različne 'in vitro' metode, ki jih uporabljamo v primerjalnih študijah sproščanja. Najpogostejši sistem je agarni gel, katerega zvezna faza je voda in predstavlja zato v primerjavi s kožo dokaj enostavno strukturo. Med sistemi najdemo še membrane iz celuloznega filtra in ovčjega mehurja in tudi te so le grob približek kompleksnemu in dinamičnemu sistemu - koži. - Histološke študije Pri teh perkutano absorpcijo vrednotimo z opazovanjem histoloških rezov kožnega tkiva. Opazuje se določen efekt, npr. keratoliza ali obarvanje tkiva. - Uporaba označevalcev V ta namen se uporabljajo različna barvila, fluorescentne snovi in izotopi. Pogoj za njihovo uporabo je, da prodirajo skupaj z učinkovino, ker sicer pride do napak. Pri uporabi radioaktivnih označevalcev je ta bojazen odveč, saj lahko vključimo radioaktivni atom (tricij ali radioaktivni jod) v molekulo učinkovine. Detekcija je možna na več načinov: direktno štetje na površini kože, avtoradiografija (histološki rezi osvetljujejo fotografski film) in meritev radioizotopa v tkivih in telesnih tekočinah. - Merjenje fizioloških učinkov Hitrost in obseg perkutane absorpcije vrednotimo s hitrostjo nastopa in intenzivnostjo farmakološkega učinka. Meri se npr. dvig krvnega pritiska, vazodilatacija, nastop anestezije, znižanje praga bolečine, smrt... - Analiza tkiv S primerno analitsko metodo določujemo koncentracijo oz. količino učinkovine v koži, krvi, urinu, posameznih organih. Poznati moramo farmakokinetične parametre učinkovine. - Izgubljanje učinkovine z mesta aplikacije Pri tem iščemo razliko med aplicirano dozo in trenutno količino učinkovine na mestu aplikacije. Pogosto je težko kvantitativno odstraniti učinkovino s površine kože. Med pretežno lipofilnimi spojinami je perkutana absorpcija dokazana za benzokain, sulfanilamid, salicilno kislino, morfin, pilokarpin, fenol, sarin, med pretežno hidrofilnimi pa za tiaminijev klorid, vitamin C, soli alkaloidov, penicilin G-kalijeva sol, natrijev salicilat itd. Posebno veliko študij perkutane absorpcije je opravljenih na področju vitaminov, kortikosteroidov in spolnih hormonov. 27

29 NAVODILA ZA EKSPERIMENTALNO DELO Naloga: Določi hitrost sproščanja borne kisline iz naslednjih podlag, pripravljenih po Ph.Jug.IV: 1. Excipiens ad unguenta 2. Excipiens ad unguenta antibiotica 3. Excipiens ad oculenta 4. Excipiens emulsificans 5. Excipiens emulsificans aquosum 6. Excipiens lanacoli 7. Excipiens lanacoli aquosum 8. Excipiens macrogoli 9. Glyceroli unguentum Izvedba: Pripravimo gel (I) in raztopino (II). I: Agar 10 g II: 0.1 M NaOH 30 ml Glicerol 10 g 2% fenolftalein 9 ml Aq. purif. 900 ml Aq. purif. ad 100 ml Ob segrevanju raztopimo agar v vodi in glicerolu ter dodamo raztopino II. Raztopljeno maso vlijemo v petrijevke v višini 5 mm in pustimo, da se ohladi. S plutovrtom premera 16 mm izvrtamo luknjo na sredini agarnega gela. Na dno luknje nakapamo 3 kaplje stopljenega agarja, da preprečimo prodiranje učinkovine izpod podlage. Tako pripravljeno petrijevko stehtamo. Nato 9 g podlage dodamo 1 g borne kisline in temeljito homogeniziramo. S to poltrdno dermalno obliko previdno napolnimo luknjo v agarni podlagi, tako da je nivo dermalne oblike enak nivoju agarja. Petrijevko ponovno stehtamo in tako določimo maso mazilne podlage, ki je v izvrtini. V času ene ure vsakih deset minut merimo premer nevtralizacijske cone. Premer izmerimo v treh pravokotnih smereh in širino nevtralizacijske cone izračunamo po formuli: D - n.d y = y... širina nevtralizacijske cone 2.n D.. zunanji premer cone vključno s premerom izvrtine D... vsota vseh meritev v času t d... premer izvrtine n... število meritev v času t Rezultate cele skupine zberemo in jih v dnevniku prikažemo tako tabelarično kot tudi grafično. Za svojo mazilno podlago izračunamo še mole borne kisline, ki so se sprostili v agarni gel v merjenih časih. Pri tem predpostavimo popolno nevtralizacijo borne kisline in NaOH. Rezultate predstavimo grafično. 28

30 S pomočjo spodnje enačbe izračunamo za svojo podlago vsaj tri permeabilnostne koeficiente in njihovo povprečno vrednost. P eff = dq dt 1 A c 0 P eff...permeabilnostni koeficient dq/dt...hitrost prehoda učinkovine v agarni gel A...površina agarja, ki je v stiku s poltrdno dermalno obliko c 0... začetna koncentracija učinkovine RAČUNSKA NALOGA Premer izvrtine v agarnem gelu, kamor nanesemo mazilo je 10 mm. Koncentracija NaOH v agarnem gelu je 0,5 mol/l. Debelina gela je 10 mm. Ko napolnimo mazilo v izvrtino, sta nivoja mazila in agarnega gela enaka. Z mazilom smo v izvrtino vnesli 7,85 mmol borne kisline. Kakšen % ZU se sprosti iz mazila v času neskončno? 29

31 5. vaja: VEZAVA NA ALBUMINE PLAZEMSKI PROTEINI ALBUMINI α 1 KISLI GLIKOPROTEIN LIPOPROTEINI ZMANJŠANJE KONC. Starost Opekline Ciroza jeter GI bolezni Nosečnost Operacije Renalne motnje Bakterijska pljučnica Nefrotski sindrom Oralni kontraceptivi Hipertiroidizem Poškodbe POVEČANJE KONC. Benigni tumorji Naporni treningi Hipotiroidizem Nevroze Psihoze Shizofrenija Staranje Poškodbe Miokardni infarkt Renalne motnje Revmatoidni artrits Stres Operacije Diabetes Hipotiroidizem Nefrotski sindrom RAVNOTEŽNA DIALIZA Ravnotežna dializa je poleg ultrafiltracije, ultracentrifugiranja in gelske filtracije primerna metoda ločevanja prostega in na makromolekule vezanega liganda. Pogosto se uporablja za določevanje stopnje vezave učinkovin na plazemske proteine. Dializa poteka v celici, ki jo na dva dela enakih volumnov razmejuje polprepustna membrana. V enem od prostorov se nahaja plazma z učinkovino, v drugem pa pufer. Separacija proste in vezane učinkovine temelji na difuziji proste učinkovine iz plazme preko polprepustne membrane v pufer. Prehod kompleksov plazemski proteinučinkovina je onemogočen zaradi velikosti membranskih por (cut-off membrane je manjši od molekulske mase plazemskih proteinov). Prosta učinkovina prehaja membrano do vzpostavitve ravnotežja, ko se koncentracija učinkovine v pufru izenači s koncentracijo proste učinkovine v plazmi. Z določitvijo pufrske in plazemske koncentracije učinkovine se lahko izračunajo parametri vezave učinkovine na plazemske proteine (asociacijska konstanta, odstotek vezane učinkovine, stopnja vezave, število vezavnih mest, število razredov vezave). Na hitrost vzpostavitve ravnotežja pri ravnotežni dializi vplivajo temperatura, vrsta membrane in mešanje. Dializa običajno poteka pri telesni temperaturi. Čas dialize je potrebno določiti eksperimentalno. 30

32 Določitev proste frakcije učinkovine je lahko netočna zaradi: - vpliva ph: ph se zviša zaradi izgube CO 2 iz plazme pred dializo ali med njo. Sprememba ph je pomembna pri učinkovinah, katerih vezava je odvisna od ph. - volumskega premika: volumski premik pomeni povečanje volumna plazme zaradi difuzije vode iz pufra v plazmo, ki je posledica večjega osmotskega tlaka plazme. Zmanjša se koncentracija plazemskih proteinov, zato se spremenita stopnja vezave in kapaciteta vezanja, medtem ko vpliva na asociacijsko konstanto ni. Osmotski gradient zmanjšamo z uporabo izotoničnih pufrskih raztopin in z vključevanjem polimerov v pufer (npr. dekstran). - Donnanovega efekta: naboj plazemskih proteinov in učinkovine lahko povzroči različno koncentracijo proste učinkovine na obeh straneh membrane. Razlika v naboju se lahko zmanjša z uporabo pufra z dovolj veliko kapaciteto ali z dodatkom nevtralnih soli ustrezne koncentracije. - nelinearne vezave učinkovine na plazemske proteine: v ravnotežju je plazemska koncentracija učinkovine nižja kot na začetku dialize (razlika je odvisna od odstotka vezave), zato velja dobljeni odstotek vezave za končno plazemsko koncentracijo. Pri učinkovinah, katerih vezava je v danem koncentracijskem območju odvisna od koncentracije učinkovine, je potrebnih več eksperimentov, da lahko določimo odstotek vezave pri začetni koncentraciji. Za večino učinkovin je v območju terapevtskih koncentracij vezava na plazemske proteine linearna (neodvisna od koncentracije). - vezave učinkovine na dializno celico in membrano - časa dialize: pri nestabilnih učinkovinah NAVODILA ZA EKSPERIMENTALNO DELO Izvedba: Membrano vstavimo med plošči dializne celice, ki ju privijemo skupaj (slika 1). Vdolbine na eni strani membrane napolnimo s pomočjo injekcijske brizge (po 1 ml) z izotoničnim fosfatnim pufrom (ph=7.4). Na drugi strani membrane napolnimo eno vdolbino z raztopino albuminov (slepi vzorec), ostale štiri vdolbine pa z raztopino piroksikama v raztopini albuminov. V vseh štirih vdolbinah celice morajo biti iste koncentracije učinkovine. Odprtine zamašimo z vijaki. Dializa poteka 4 ure pri 37 C ob občasnem mešanju. 31

33 Slika 1: Dializna celica Uporabili bomo štiri različne začetne koncentracije piroksikama v raztopini albuminov. Po končani dializi odvzamemo pufrske dializate učinkovine. Dializate iste koncentracije združimo v centrifugirki, prav tako slepe dializate. Vsebino premešamo na ekscentričnem stresalniku. Pufrskim raztopinam na UV-spektrofotometru izmerimo absorbanco glede na slepi dializat. Merimo pri valovni dolžini 354 nm. Izračuni: Meritve vseh skupin združimo in izračune podamo v tabeli: Ctot (mg/l) Ctot (mol/l) A Cf (mol/l) Cpl (mol/l) Cb (mol/l) % vezave ν ν /Cf A....absorbanca Ctot..totalna (začetna) konc. učinkovine v raztopini albuminov Cf....koncentracija nevezane učinkovine v pufru v stanju ravnotežja Cb....koncentracija vezane učinkovine v raztopini albuminov v stanju ravnotežja Cpl.. celokupna koncentracija učinkovine v raztopini albuminov v stanju ravnotežja (plazemska koncentracija učinkovine) Cpl = Ctot - Cf M piroksikama = Cb = Ctot - 2 Cf C albuminov = 40 g/l % vezave = Cb / Cpl 100 M albuminov = ν = Cb / Cproteinov 32

34 Naloga: 1. Izračunaj odstotek vezave piroksikama na albumine plazme pri različnih plazemskih koncentracijah učinkovine v raztopini albuminov in to odvisnost prikaži na grafu. 2. Iz Scatchardovega diagrama (ν/cf = n K a - K a ν) določi za interakcijo piroksikama s plazemskimi albumini asociacijsko konstanto (K a (L/mol)) in število vezavnih mest piroksikama na molekuli vezavnega proteina (n). Priloga: Umeritvena krivulja za pufrske raztopine piroksikama (absorbanca izmerjena pri valovni dolžini 354 nm). Dobite na vajah! RAČUNSKE NALOGE 1.) Pri metodi ravnotežne dialize uporabljamo sistem s koncentracijo albuminov 40g/L. V tem sistemu je v ravnotežju delež proste zdravilne učinkovine 0.08, koncentracija vezane zdravilne učinkovine pa je mol/l. Izračunaj ravnotežno koncentracijo proste zdravilne učinkovine in afinitetno konstanto vezanja učinkovine na eno vezavno mesto. MM albuminov = ) Delež na proteine vezane učinkovine določamo z metodo ravnotežne dialize. Uporabljamo sistem s koncentracijo proteinov 70 g/l. Izhodna raztopina pri dializi vsebuje 200 mg zdravilne učinkovine v litru plazme. Učinkovina se pri terapevtskih koncentracijah veže na plazemske proteine 96%. Izračunaj število vezavnih mest učinkovine na molekuli plazemskega proteina, če je asociacijska konstanta L/mol. MM plaz. proteinov = 80000g/mol MM učinkovine = 250 g/mol 33