ZVIJANJE PROTEINOV, RAZGRADNJA IN USMERJANJE

ZVIJANJE PROTEINOV, RAZGRADNJA IN USMERJANJE ZVIJANJE PROTEINOV Spontano Stanje odtajane kroglice Molekularni šaperoni POST-TRANSLACIJSKE MODIFIKACIJE PROTEINOV RAZGRADNJA Ubikvitin Proteasom USMERJANJE PROTEINOV Signali za usmerjanje proteinov Signalni peptid RENATURACIJA IN DENATURACIJA RIBONUKLEAZE A Christian Anfinsen, 1957

ZVIJANJE PROTEINOV Zvitje v nativno obliko brez intermediatov, dvostopenjski mehanizem, citokrom c U N Zvitje preko dobro določenih intermediatov, goveji pankreasni tripsinski inhibitor U I 1 I 2 I 3 N ZVIJANJE PROTEINOV burst phase - hitra faza (milisekunde) v kateri se tvori večina elementov sekunadrne strukture hidrofobni kolaps- hidrofobni deli se združijo, odstrani se voda. To stanje se imenuje STANJE ODTAJANE KROGLICE ( molten globule )- sekundarna struktura je tvorjena, 3D pa še ne. pojav strukure podobne nativni. Elementi sekundarne strukture so stabilizirani, ampak ne še pravilno vsidrani en v drugega. Stranske skupine še fleksibilne. Dobson CM Phil.Trans. R. Soc. Lond. B (2001) 356, 133-145 končni dogodki, ki privedejo do pakiranja v rigidno hidrofobno sredico (sekunde) Nekateri proteini se zvijejo spontano, KOTRANSLACIJSKO ZVIJANJE drugi potrebujejo pomoč PROTEINI, KI SODELUJEJO PRI ZVITJU PROTEINOV V CELICI Protein disulfid izomeraza (PDI) Peptidil prolil cis-trans izomeraza Molekularni šaperoni - Heat shock proteini 70 (Hsp60, Hsp70). Pri vseh organizmih v citosolu, ER, mitohondrijih, kloroplastih. DnaK -Šaperonini- ogromni kompleksi -Hsp90- zvitje proteinov, ki sodelujejo pri signalni transdukciji -Nukleoplazmini- za pravilno sestavo nukleosomov

PROTEIN DISULFID IZOMERAZA V reducirani obliki katalizira izmenjavo disulfidov, dokler ne dosežejo nativne stabilne konformacije. Zvitje Ribonukleaze A v prisotnosti 2-merkaptoetanola v 10h V prisotnosti PDI samo 2 min! PEPTIDIL PROLIL CIS-TRANS IZOMERAZA Xaa-Pro peptidne vezi lahko v 10% v cis konformaciji Peptidil prolil cis-trans izomeraza katalizira spremembo cis v trans konformacijo, ki je drugače počasen proces. TRANS CIS Vloga Hsp 70 Hsp = heat shock protein Hsp70 prepoznava nezvite regije novih proteinskih verig - posebno hidrofobne regije Veže se na regije in jih zaščiti pred nepravilnimi asociacijami, modifikacijami

GroEL GroES MOLEKULARNI ŠAPERONI GroEL/GroES sistem 14 identičnih 60 kda podenot; tvorijo dva obroča 7 podenot heptamer 10 kda proteinov Vezava in hidroliza ATP Desno GroEL Levo GroEL-GroES-(ADP) 7 1. Vezava 7 ATP in nepravilno zvitega proteina (cis) 5. Vezava novega substrata omogoči sprostitev pravilno zvitega proteina in ADP 2. Vezava GroES, ki spremeni konformacijo obroča in poveča votlino v katero se namesti protein 3. Hidroliza ATP (cca.13s). Pride do zvitja proteina. 4. Hidroliza ATP omogoči konformacijsko spremembo, ki olajša vezavo naslednjega substrata in 7 ATP (trans)

7 ATP na cikel Če protein še ni pravilno zvit lahko vstopi v nov cikel Zakaj se sploh zvije? 1. Anfinsenova kletka- GroEL/GroES skrije protein v mikrookolju pred ostalimi komponentami v citoplazmi s katerimi bi lahko nespecifično agregiral 2. Iterativno izboljševanje zvitja- z ATPjem omogočeno razvitje proteina, ki je nepravilno zvit in ujet v nepravilni konformaciji. Protein se veže na hidrofobne dele GroEL. Po hidrolizi ATP so hidrofobni deli bolj narazenpride do razvitja, sedaj se protein lahko ponovno zvije do najbolj stabilne oblike. In vivo GroEL/GroES kompleks reagira s 300 proteini E.coli (od 2500 citoplazemskih): skoraj vsi identificirani so encimi, ki sodelujejo pri metabolnih procesih in transkripciji ali translaciji. M 20-60 kda, večinoma proste β trakove. Takšni proteini se zvijajo počasneje, ker potrebujejo za tvorbo β ravnine več oddaljenih interakcij v pravilni orientaciji. Primer: Rodanaza zahteva hidrolizo 130 ATP za popolno zvitje POST-TRANSLACIJSKE MODIFIKACIJE PROTEINOV Zvijanje proteinov Biokemijske modifikacije proteolitska cepitev odcepitev Met1 (~50% proteinov v E.coli) odcepitev signalnega peptida potrebna za aktivnost določenih encimov (cimogen encim) modifikacije aminokislin pri 50% evkariontskih proteinih je N-terminalni konec acetiliran fosforilacija (Ser, Thr, Tyr), hidroksilacija (Pro, Lys) glikozilacija na hidroksilnih skupinah Ser, Thr ali amidni skupini Asn. Do 15 sladkornih ostankov- pomembno za funkcijo proteina dodatek prostetičnih skupin hem, biotin, pantotenska kislina RAZGRADNJA PROTEINOV sinteza/razgradnja okvarjeni, napačno zviti proteini, regulacijski, ki niso več potrebni razpolovna doba različna: RNA polimeraza 1.3 min citokrom c 150 min hemoglobin >100 dni Razgradnja: lizosomalna razgradnja proteasomi- razgradnja intracelularnih proteinov ubikvitin- 76 aminokislin velik peptid, ki se poveže s C-terminalnim koncem z ε-amino skupino lizina. Ob tem se porabi ATP. 26S proteasom razgradi z ubikvitinom označene proteine Proteasom prepozna z ubikvitinom označen protein, ga veže, delno razvije in v notranjosti razgradi na manjše peptide (3-23 aminokislin)

UBIKVITIN Trije encimi sodelujejo pri vezavi na protein Oligomerni ubikvitin signal za razgradnjo Signal za vezavo N-terminalna aminokislina PEST zaporedja 26S proteasom Drosophila melanogaster (450 190 Å) vezava in razvitje poli ubikvitiniranega proteina, da lahko vstopi v 20S proteasom razgradnja T. acidophilum 20S proteasom Kvasni 20S proteasom 28 podenot v štirih obročih, vsak iz 7 podenot cca. 700 kda

USMERJANJE PROTEINOV SEKRETORNA POT ORGANEL POLOŽAJ SIGNALA CEPITEV SESTAVA Endoplazemski N-terminalni konec + jedro 6-12 hidrofobnih retikulum- aminokislin, na začetku sekretorna pot lahko 1-2 bazične Mitohondrij N-terminalni konec + 3-5 zaporednih K ali R, pogosto S ali T, brez D in E Kloroplasti N-terminalni konec + ni ohranjenega dela. Pogosta S ali T in majhne hidrofobne aminokisline, brez D in E Peroksisom C-terminalni konec - SKL Jedro znotraj zaporedja - ena gruča 5 bazičnih aminokislin ali dve manjši gruči ločeni z 10 aminokislinami Endoplazemski C-terminalni konec - KDEL retikulum (zadrževanje) SIGNALNI PEPTID- tisti, ki se izločajo iz celice, v ostalih veziklih (lizosomi), membranski proteini 14-26 aminokislin na N-terminalnem delu pri evkariontih so ribosomi vezani na ER (granuliran ER) s signalnim peptidom gredo preko membrane in v ER. Potujejo preko GA v zunanjost. Navadno kemijske modifikacije (glikozilacija). regulirana sekrecija konstitutivna sekrecija sortiranje v lizosome

mesto cepitve 14-26 aminokislin signalni peptid "signal sequence" goveji rastni hormon MMAAGPRTSLLLAFALLCLPWTQVVGAFP goveji proalbumin MKWTFISLLLLFSSAYSRGV človeški proinzulin MALWMRLLPLLALLALWGPDPAAAFVN človeški interferon gamma MKYTSYILAFQLCIYLGSLGCYC človeški alfa-fibrinogen MFSMRIVCLVLSVVGTAWTADS človeška IgG MEFGLSWLFLVAILKGVQCEVQ podganja amilaza MKFVLLLSLIGFCWAQYD mišji alfa-fetoprotein MKWITPASLILLLLHFAASKALH kurji lizocim MRSLLILVLCFLPLAALGKVF koruzni rein protein MATKILALLALLALLVSATNAFII bazična regija 3-8 ostankov hidrofobna regija 7-14 ostankov nehelikalna regija 4-5 ostankov Sec61 α,β,γ podenote SRP prepozna signalni peptid in se veže nanj, skupaj z ribosomom se veže na SRP receptor SRP- signal recognition particle RNA (300 nukleotidov) 6 proteinov signalna peptidaza Sec61 Clemons WM et al. Curr. Opin. Struct. Biol. (2004) 14, 390-396 White SH and von Heijne G Curr. Opin. Struct. Biol. (2005) 15, 378-386

SINTEZA MEMBRANSKIH PROTEINOV White SH and von Heijne G Curr. Opin. Struct. Biol. (2004) 14, 397-404 SINTEZA IN USMERJANJE PROTEINOV PRI BAKTERIJAH Šaperoni Membranski proteini Periplazemski proteini in proteini zunanje membrane Citosolni proteini Maier T et al. Curr. Opin. Struct. Biol. (2005) 15, 204-212