Biosintetski procesi na ER-u i GA-u i mehanizmi vezikularnog transporta

Transcript

1 Biosintetski procesi na ER-u i GA-u i mehanizmi vezikularnog transporta Intracelularne membrane 1

2 Endoplazmatični retikulum ER je mreža cevčica i cisterni okruženih membranom ER formira membrana koja od okolnog citozola odvaja unutrašnji prostor-cisternu Najveća organela eukariotske ćelije Hrapavi (granularni) ER- grer Glatki (agranularni) ER-glER 2

3 Funkcije grer Sineteza proteina npr. sekretornih i integralnih Transport proteina do GA- sekretorni proteini Glikolizacija Formiranje disulfidnih veza i rearanžiranje Funkcije gler Sinteza svih lipida Metabolizam ugljenih hidrata. Transformacija glikogena u glukozu. detoksikacija Akumulacija Ca +2 - sarkoplaznmatični retikulum 3

4 Sekretorni proteini se usmeravaju pomoću signalne sekvence na rastućem amino (N) kraju. Signalna sekvenaca se proteolitički uklanja po ulasku u mikrozom. Signalnu sekvencu čine obično kratki nizovi hidrofobnih a.k. Mesto delovanja signalne peptidaze Čestica za prepoznavanje signala (engl. signal recognition particle- SRP) Šest polipeptida SRP RNK- mala citoplazamatska RNK Vezuje se za ribozom i signalnu sekvencu SRP RNK se vezuje za rrnk u velikoj ribozomalnoj subjedinici SRP RNK SRP proteini 4

5 Kotranslacijski prenos sekretornih proteina u ER Postranslacioni prenos proteina 5

6 Ugrađivanje proteina u membranu ER-a Proteini plazmine membrane ili membrana odeljaka ER GA plazmina membrana ili endozom Uvek se transportuju kao deo membrane Integralni membranski proteini su u obliku α heliksa izgrađeni od hidrofobnih a.k. Neki proteini prolaz ekroz membranu samo jednom a neki više puta. Kod nekih proteina amino kraj je prema citozolu a kod drugih karboksilni kraj-orjentacija se uspostvlja tokom translokacije rastićeg p.p. lanca u ER. Direktno ugrađivanje transmembranskog proteina čiji C-terminus se nalazi u citozolu Privremena signalna sekvenca Jedna STOP a.k. sekvenca Ugrađivanje u membranu omogućava stop a.k. Sekvenca u obliku α heliksa koja podstiče konformacijsku promenu translokona što omogućava njen lateralni izlazak i ugrađivanje u membranu ER-a. 6

7 Ugrađivanje membranskog proteina sa unutrašnjom signalnom sekvencom koja se ne uklanja Signalna sekvenca koju signal peptidaza ne uklanja A) Signalna sekvenca usmerava ugradnju proteina tako da je amino kraj u citozolu B) Signalna sekvenca usmerava ugradnju proteina tako da je karboksilni kraj u citozolu Ugrađivanje proteina koji više puta prolaze kroz membranu Ugrađivanje naizmeničnim unutrašnjim signalnim i stop sekvencama Unutrašnja signalan sekvenca dovodi do ugrađivanja p.p. lanca čiji je N terminus ka citozolu. Zaustavni signal signalizira zatvaranje translokona zbog čega nastaje petlja u lumenu ER-a a translacija se nastavlja u citozolu. Druga signalna sekvenca otvara translokon što podstiče ponovo ugrađivanje u membranu ER-a 7

8 Sklapanje i dorada proteina u ER-u U ER-u: Dorada proteina (npr. uklanjanje signalne sekvence) Sklapanje proteina Udruživanje subjedinica Formiranje dislufidnih veza Početna glikolizacija Dodavanje glikolipidnih sidara itd. Molekulski šaperoni npr. Hsp70 (BiP)- olakšava ulazak p.p. lanca u cisternu ER-a a zatim pomaže sklapanje i udruživanje u konačni protein. Formiranje disulfidnih veza (S-S) između cisteinskih ostataka je karakteristično za lumen ER-a zbog svoje oksidativnog okruženja za razliku od citozola gde je sredina redukciona i cistein se nalazi u obliku (-SH) protein-disulfid-izomeraza. Glikozilacija se odvija na bočnim lancima asparagina (N-glikolizacija). Oligosaharad se sintetiše na lipidnom nosaču (dolikolu) u membrani. Zatim se ceo oligo saharid prenosi na asparaginske ostake (Asn-X- Ser/Thr) Dodavanje GPI sidra Glikozilfosfatidil-inozitolna (GPI) sidra sadrže dva lanca m.k., oligosaharidni deo sa inozitolom i dr. u.h. i etanolamin. Po završetku sinteze proteina on se pomoću C terminalnog hidrofobnog regiona drži za membranu. C terminalni deo proteina se odstrani i zameni sa GPI sidom pomoću koga se drži za membranu. 8

9 Sklapanje glikoproteina pomoću kalretikulina Kada glikoprotein uđe dva glukozna ostatka se uklanjaju što omogućuje vezivanje kalretikulina i početak sklapanja Ako je ostalo previše hidrofobnih regiona i glikoprotein se ne može pravilno sklopiti, manozni ostaci se odstranjuju a protein se usmerava ka citozolu na ubikvitaciju i degradaciju u proteazomima. Senzor sklapanja proverava kvalitet sklapanja proveravajući izloženost hidrofobnih regiona. Ako glikoprotein nije paravilno sklopljen senzor sklapanja (glukoziltransferaza) dodaje ponovo glukozu što omogućava ulazak ponovo u kalretikulin Ako je glikoprotein pravilno sklopljen prelazi dalje ka prelaznom ER-u putem prenosnih vezikula. Sinteza lipida u gler-u Preteče za sintezu fosfolipida nalaze se u citozolu. Dve masne kiseline veza za CoA prvo se vežu za glicerol-3-fosfat pa nastaje fosfatidna kiselina koja se odmah ugrađuje u membranu. Fosfataza potom pretvarafosfatidnu kiselinu u diacilglicerol. Vezivanjem različitih polarnih grupa na diacilglicerol nastaju fosfatidlholin, fosatidiletanolamin, fosfatidilserin i fosfatidilinozitol 9

10 Translokacija fosfolipida Fosfolipidi se sintetišu na citozolnoj strani membrane Er-a. Prebacivanje na drugu stranu membrane odvija se pomoću fosfolipidnih flipaza. Na taj način rastu oba fosfolipidna sloja membrane ravnomerno. Transport iz ER-a u GA Vezikule koje nastaju pupljenjem na ER-u prenose sintetisane proteine i lipide do ER-GA međuodeljka (ERGIC - engl. ER-Goldgi intermediate compartment) pa dalje u GA. Proteini iz lumena ER-a putuju vezikulama izlivaju se u lumen GA. Membranski proteini zadržavaju istu orjentaciju u GA kao i u ER-u. 10

11 Signali za izvoz proteina iz ER-a Transmembranski proteini su prepoznatljivi zbog dvostrukih kiselih (npr. Asp-Asp ili Glu-Glu) ili dvostrukih hidrofobnih (npr. Met-Met) signalnih sekvenci na citozolnim delovima. Neki od ovih transmembranskih proteina služe kao receptori za GPI usidrene proteine i za proteine cisterne ER-a. Proteini koji treba da ostanu u lumenu ER-a npr. BiP, signalan peptidaza, protein-disulfid-izomeraza) sadrže povratnu signalnu sekvencu na karboksilnom kraju (Lys-Asp-Glu-Leu tj. KDEL i kartke završne sekvence sa dva Lys tj. KKXX). Proteini koji sadrže KDEL ili KKXX izlaze ali u povratku prepoznaju specifične reciklažne sekvence na membrani ER-a 11

12 Funkcije GA 1) Sortiranje proteina i lipida dospelih sa ER; 2) Hemijska modifikacija proteina-glikoproteini; i 3) Sortiranje i pakovanje tih molekula u transportne vezikule 4) Modifikacija amino kiselina (npr.prolin -> hidroksiprolin) 5) Adicija masnih kiselina 12

13 STRUKTURA G A 1. cis-ga: mreža tubularnih membrana bliža ER a) funcija = sortiranje proteina i) vraćanje proteina na ER 2. Goldžijeve cisterne: pljosnate membranske tvorevine razlikuju se cis, medijalne, i trans-cisterne u medijalnim cisternama se odvijaju glavni metabolitička aktivnost u trans cisternama se obavlja razvrstavanje, pakovanje i usmeravanje prema edozomima, lizozomima, ćelijskoj membrani ili van ćelije Glikozilacija proteina u GA Uklanjaju se četiri manoze. Dodaje se N-acetilglukozoamin. Uklanjaju se dve dodatne manoze. Dodaju se fruktoza i dva N- acetilglukozoamin. Dalja obrada N-vezanih oligosaharida na glikoproteinima iz ER-a u GA Dodaju se tri sijalinske kiseline Dodaju se tri galaktoze. Enzimi: Glikozil-transferaza- dodaje u.h. ostatke Glikozidaza- odstranjuje u.h. ostake 13

14 Metabolizam lipida u GA Ceramid koji se sintetiše u ER-u u GA se pretvara u sfingomijelin ili u glikolipide. Prva reakcija: fosfoholinska grupa se prenosi sa fosfatidilholina na ceramid. Druga reakcija: dodavanje jednog ili više u.h.(npr.glukoza) Nastanak transportnih vezikula Dve familije proteina koje vezuju GTP: Porodica faktora ADP-ribozilacije (ARF1-3 i Sar1) Rab protein Proteini adapteri Oblažući proteini Klatrin- vezikule koje učestvuju u transportu u oba smera GA - plazminoj membrani COPI (engl. Coat protein) - vezikule koje učestvuju u intracelularnom transportu COPII- vezikule nastaju na prelaznom ER-u i učestvuju u sekrecijkom putu 14

15 ARF1 započinje formiranje klatrinom obložene vezikule na trans strani Goldžijeve memrane. Po dolasku do membrane ARF/GDP se aktivira u ARF/GTP posebnim ARF guaniskim nukleotidnim izmenjivačem (ARF-GEF). ARF/GTP regrutuje protein GGA adapter do membrane koji potom veže transmembranski receptor interakcijom sa njegovim citozolnim repom. GGA se spaja sa drugim adapterskim proteinom AP1 koji služi za vezivanje sa klatrinom Spajanje vezikula 1. Prepoznavanje transportne vezikule ciljne membrane 2. Samo spajanje transportne i ciljne membrane SNARE transmembranski proteini: vsnare na vezikuli tsnare na ciljnoj membrani Rab porodica GTP vezujućih proteina Korak u transport Egzocitoza Rab protein Od prelaznog ER-a do GA Od GA do ER-a U okvuru GA Od trans strane GA do plazmine membrane Endocitoza Od ćel.membrane do ranog endozoma Od ranog endozoma do ćel.membrane Od ranog endozoma do kasnog endozoma Druge uloge Egzocitoza sekreetornih zrnaca Od kasnog endozoma do trans strane GA Od trans strane GA do bazolateralne membrane Od trans strane GA do apikalne membrane Rab1,Rab1b, Rab2 Rab6, Rab6b Rab1,Rab6, Rab6b Rab11a, Rab11b Rab5a, Rab5b, Rab5c Rab4,Rab15,Rab18 Rab7 Rab8b Rab9, Rab11a, Rab11b Rab8a Rab21 15

16 Proteini koji su usmereni u lizozome obeleženi su sa manoza -6-fosfatima koji se vežu za manoza -6-fosfatnim receptorima na trans strani GA. Sa citozolne strane manoza-6-fosfatnih receptora preko adaptivnih proteina se vezuje klatrin. Spajanje vezikula započinje kompleksom Rab/GTP Specifični Rab proteini na vezikuli i ciljnoj membrani vežu efektorske proteine i stapaju vezikulu sa ciljnom membranom Povezivanje omogućava interakciju vsnare i tsnare Priljubljivanje lipidni dvosloj postaje nestabilan i spaja se sa ciljnom membranom 16