Sistemi za kontrolu kvaliteta proteina molekularni šaperoni i proteazom

Transcript

1 Sistemi za kontrolu kvaliteta proteina molekularni šaperoni i proteazom

2 Kako protein nakon sinteze postaje funkcionalan? Proces ekspresije gena nije završen prevođenjem informacije sadržane u irnk u redosled ak polipeptidnog lanca. Nekovalntne interakcije i kovalentne modifikacije su odgovorne za sazrevanje funkcionalnog proteina.

3 Kako protein nakon sinteze postaje funkcionalan? Većina promena koje mora da pretrpi novosintetisani polipeptid je uslovljena nekovalentnim interakcijama: uvijanje u jedinstvenu trodimenzionalnu konformaciju. vezivanje kofaktora neophodnih za aktivnost. neretko, protein-protein interakcija kojom ostvaruje svoju funkciju.

4 Kako protein nakon sinteze postaje funkcionalan? Mnogi proteini moraju da pretrpe i post-translacione kovalentne modifikacije na tačno određenim ak. Najčešće kovalentne modifikacije su glikozilacija i fosforilacija, mada je poznato preko 100 različitih tipova kovalentnih modifikacija. Informacija neophodna za sve nabrojane korake maturacije funkcionalnog proteina sadržana je u redosladu ak polipeptidnog lanca koji se sintetiše na ribozomima.

5 Prostorno uvijanje proteina je jedno od nerešenih pitanja nauke

6 Ko-translaciono prostorno uvijanje polipeptida Proces prostornog uvijanja rastućeg polipeptida odvija se uporedo sa njegovom sintezom. U trenutku kada se novosintetisani polipeptid oslobađa od ribozoma on stiče najveći deo svoje konformacije, ali ona nije finalna.

7 Ko-translaciono prostorno uvijanje polipeptida Tokom evolucije, sekvenca proteina nije bila selektovana samo za konformaciju koju može da stekne već i za sposobnost brzog prostornog uvijanja u trenutku dok rastući polipeptid izlazi iz ribozoma. Levinathal paradox

8 Formiranje trodimenzionalne strukture odvija se kroz dve faze

9 Formiranje trodimenzionalne strukture odvija se kroz dve faze Brza faza - Polipeptid stiče grubu tercijalnu strukturu još tokom izlaska iz ribozoma. Za sintezu polipeptida prosečne veličine potrebno je nekoliko minuta, a u roku od nekoliko sekundi stiče kompaktnu strukturu koja sadrži većinu finalne sekundarne strukture ( helikse i ploče) uređene na način koji je grubo sličan finalnoj tercijalnoj konformaciji.

10 Izlivena globula Nastala otvorena i fleksibilna struktura polipeptida naziva se izlivena (eng. molten) globula. U odnosu na finalnu trodimenzionalnu strukturu izlivena globula je otvorena i manje uređena.

11 Formiranje trodimenzionalne strukture odvija se kroz dve faze Izlivena globula je početna tačka za relativno spor proces prostornog podešavanja što za rezultat ima sticanje finalne trodimenzionalne konformacije proteina. Fino podešavanje bočnih ostataka ak čime protein stiče finalnu prostornu konformaciju predstavlja sporu fazu formiranja trodimentionalne strukture proteina.

12 Kontrola kvaliteta proteina Protein koji ima izložen hidrofobni region znatne veličine na svojoj površini je obično abnormalan. Hidrofobni regioni formiraju intermedijere - proteinske agregate štetne za ćeliju.

13 Kontrola kvaliteta proteina Ćelija je razvila mehanizme za kontrolu kvalitata proteina koji prepoznaju i otklanjaju proteine sa izloženim hidrofobnim regionima. Više od 30% novosintetisanih polipeptidnih lanaca biva selektovano za brzu razgradnju kao rezultat delovanja sistema za kontrolu kvaliteta proteina.

14 Ćelijski mehanizmi za kontrolu kvaliteta proteina Neki proteini spontano stiču pravilnu trodimenzionalnu konformaciju. Prostorno uvijanje mnogih proteina je efikasnije uz pomoć specijalne klase proteina nazvanih molekularni šaperoni. Kada pokušaji ponovnog uvijanja proteina ne uspeju nepravilno uvijeni proteini se potpuno razgrađuju u proteazomu.

15 Uloga molekularnih šaperona a. Pomažu proteinima da se prostorno uviju. b. Tokom procesa prostornog uvijanja štite proteine od protein protein interakcije sa drugim proteinima. c. Odmotavaju proteinske agregate d. Odmotavaju proteine koji su nepavilno uvijeni pre procesa njihove degradacije. e. Transport proteina f. Druge uloge

16 Molekularni šaperoni Proteini toplotnog šoka (hsp) čiji se nivo sinteze drastično povećava nakon kratkog izlaganja ćelije povišenim temperaturama (42 C). Eukariotske ćelije poseduju dve glavne familije molekularnih šaperona koje pomažu proteinima da se prostorno uviju Hsp60 i hsp70 Razlikuju se po mehanizmu delovanja i vremenskom periodu (u životu proteina) kada deluju.

17 Proteini hsp60 i hsp70 Zajedničke osobine: Pokazuju afinitet za izložene hidrofobne nizove pogrešno uvijenih proteina. Hidrolizuju ATP. Funkciju pomaganja proteinskog foldinga ostvaruju sa malim setom asociranih proteina (partner proteini).

18 Proteini hsp70 Deluju rano u životu proteina i prepoznaju niz od približno 7 hidrofobnih ak na površini proteina. Za ciljni protein se prvo vezuje pomoćni protein Hsp40, a zatim monomer Hsp70 u kompleksu sa ATP-om (Hsp70- ATP).

19 Protein Hsp70 ima ATP-aznu aktivnost i vrši hidrolizu ATP-a u ADP, podležući konformacionoj promeni koja mu omogućava da se čvršće veže za ciljni protein. Faktor za razmenu nukleotida, protein GrpE, uklanja nastali ADP, što uzrokuje da protein Hsp40 prvo napusti formirani kompleks, a zatim disocira i Hsp70. Ponovljeni ciklusi vezivanja i oslobađanja proteina Hsp40 i kompleksa Hsp70-ATP pružaju šansu ciljnom polipeptidu da ponovo proba da zauzme ispravnu konformaciju.

20 Proteini hsp60 Proteini hsp60 formiraju velike oligomerne strukture u čiju izolovanu unutrašnjost ulazi ciljni protein. Poznati su i kao šaperonini, a njihovi pomoćni proteini kao košaperonini.

21 Proteini hsp60 Deluju kasnije u životu proteina i takođe prepoznaje hidrofobne regione ak na površini proteina. Proteini ove familije formiraju oligomernu strukturu u obliku bureta, koja u trenutku kada obavlja svoju funkciju stupa u interakciju sa pomoćnim proteinom, čija je struktura u obliku kape.

22 Struktura bureta je izgrađena od 14 monomernih jedinica proteina GroEL. Centralna šupljina bureta je na sredini, preko C-krajeva monomernih jedinica GroEL, podeljena na dve simetrične šupljine. Strukturu kape formira sedam monomernih jedinica pomoćnog proteina GroES (Hsp10).

23 Proteini hsp60 U svakom ciklusu samo jedna polovina simetričnog bureta, odnosno jedan prsten, stupa u interakciju sa ciljnim proteinom. Prsten koji je aktivan i asociran sa kapom označava se kao proksimalni, dok se onaj koji je u tom trenutku neaktivan označava kao distalni.

24 Razgradnja proteina Kada je protein određen za degradaciju, nema povratka što obezbedjuje da nema ni parcijalno degradovanih proteina koji bi mogli interferirati sa biološkim procesima. U ćeliji postoje dva glavna puta destrukcije proteina: a) Razgradnja proteazama u lizozomima. b) Proteoliza ubikvitin-proteaznim putem.

25 Proteazom mašinerija za degradaciju proteina Krajnja mašinerija za razgradnju proteina u eukariotskim ćelijama je proteazom. Proteazomi su ATP zavisni proteinski kompleks lokalizovani i u citoplazmi i u jedru. Proteazom se sastoji iz 20S centralnog šupljeg cilindra (jezgra proteazoma) čija su oba kraja asocirana sa 19S kapama.

26 Proteazom mašinerija za degradaciju proteina Struktura 20S centralnog šupljeg cilindra je visoko konzervirana od kvasca do čoveka i sastoji se od 4 međusobno naslojena prstena. Svaki prsten je sačinjen od 7 subjedinica koje se dele u dve grupe: α subjedinice koje čine spoljašnja dva prstena i β subjedinice unutrašnja dva prstena.

27 Proteazom mašinerija za degradaciju proteina Neke od subjedinica proteozoma su proteaze čija se aktivna mesta nalaze na površini unutrašnje šupljine 20S cilindra, tako da je funkcija 20S cilindra razgradnja polipeptida. Za razliku od tipičnih proteaza, proteazom omogućava da gotovo svaka peptidna veza bude raskinuta, posedujući multiple proteolitičke aktivnosti u jednoj proteolitičkoj odaji.

28 Proteazom mašinerija za razgradnju proteina 19S kape selektivno vezuje proteine markirane za razgradnju i funkcionišu kao regulatorne kapije na ulazu u unutrašnjost cilindra. ATP-azne subjedinice kape odmotavaju proteine koji treba da se razgrade i ubacuju ih u jezgro proteazoma.

29 Proteini se obeležavaju za razgradnju Sa nekoliko izuzetaka, proteazom deluje na proteine koji su obeleženi za razgradnju preko kovalentno vezanog većeg broja kopija malog proteina (76 ak) koji se naziva ubikvitin. Da bi se konjugovao sa ciljnim proteinom, ubikvitin prvo mora biti aktiviran.

30 Proteini se obeležavaju za razgradnju Ubikvitin se aktivira za konjugaciju sa ciljnim proteinima preko vezivanja za ATP-zavisni proteina E1, koji se naziva ubikvitin aktivirajući enzim.

31 Proteini se obeležavaju za razgradnju Aktivirani ubikvitin se zatim prebacuje sa (cisteinskog ostatka) proteina E1 na (cisteinski ostatak) proteina E2, koji se naziva ubikvitin-konjugujući enzim.

32 Proteini se obeležavaju za razgradnju Protein E2 nalazi se u kompleksu sa jednim od članova familije proteina E3. Funkcionalni kompleks E2-E3 naziva se ubikvitin ligaza. Ubikvitin ligaza odgovorna je za prepoznavanje i obeležavanje ciljnog proteina poliubikvitinskim lancem.

33 Proteini se obeležavaju za razgradnju Jednom kada je proteinski substrat mono-ubikvitiran, poliubikvitinski lanac se formira kroz iste ubikvitin konjugacione kaskade, pri čemu je karboksilna grupa ubikvitina kovalentno vezana za Lys reziduu ubikvitina koji je već konjugovan za proteinski substrat. Multiubikvitinski lanac na ciljnom proteinu je ono što prepoznaju kape proteazoma.

34 Ubikvitin aktivirajući enzim E1 ili UBA Jedan enzim E1 je odgovoran za aktivaciju ubikvitina. Kod kvasaca je samo jedan funkcionalni enzim UBA, UBA1. Delecija gena UBA1 kod kvasca je letalna.

35 Ubikvitin konjugujući enzim E2 ili UBC Svi enzimi E2 (a njih je na desetine, najmanje 13 E2 kod kvasca, a oko 30 kod sisara) sadrže konzervirano oko 130 ak dugačko katalitičko jezgro, domen UBC.

36 Ubikvitin ligaze E3 E3 ligaze odnosno kompleksi ligaza prepoznaju specifične motive substrata i katalizuju transfer ubikvitina na proteinski substrat. U ćelijama sisara postoji nekoliko stotina različitih proteina E3, koji formiraju komplekse sa specifičnim proteinima E2.

37 Ubikvitin-proteazomski sistem Ubikvitin-proteozomski sistem sastoji se od mnogo različitih proteolitičkih puteva, koji imaju protein E1 na početku i proteazom na kraju puta, a razlikuju se u E2- E3 ubikvitin ligazama i pomoćnim faktorima. Različite ubikvitin-ligaze prepoznaju različite signale za razgradnju i time deluju na različite proteine.

38 Uloge ubikvitin-proteozomski sistem Prepoznaju i eliminišu proteine koji imaju pogrešnu trodimenzionalnu strukturu ili druge abnormalnosti. Postoje i proteini koji se sve vreme brzo degradaju. To su kratkoživeći proteini čija se kontrola funkcije ostvaruje preko regulacije njihove razgradnje. Uslovno kratkoživeći proteini su proteini koji su metabolički stabilni pod određenim uslovima, dok su pod drugim uslovima nestabilni.

39 Kontrola regulisane razgradnje proteina U ćeliji postoji čitav niz mehanizama kojima se kontroliše regulisana razgradanja proteina, Dva opšta puta indukovane degradacije proteina: Aktivacija kompleksa ubikvitin ligaze (E2-E3). Aktivacija signala za razgradnju.

40 Regulisana razgradnja proteina preko aktivacije ubikvitin ligaze Aktivacija E2-E3 kompleksa ostvaruje se: Fosforilacijom specifičnog ak ostatka. Alosteričkom aktivacijom vezivanjem nekog malog molekula (liganda) ili dodavanjem proteinske subjedinice.

41 Regulisana razgradnja proteina preko aktivacije signala za razgradnju Načini aktivacije signala za degradaciju su različiti: Fosforilacijom se otkriva sakriven signal za degradaciju. Regulisanom disocijacijom proteinske subjedinice. Kidanjem određene peptidne veze, čime se formira novi N-kraj kojeg specifičan protein E3 prepoznaje kao destabilišući N-kraj (signal za razgradnju).

42 Kontrola proteina preko regulacije njihove razgradnje Proteazom, procesivna mašinerija za degradaciju proteina je odgovoran za različite unutarćelijske aktivnosti: Uklanjanja pogrešno savijenih proteina; Regulacije ćelijskog ciklusa razgradnjom ciklina; U stečenom imunskom odgovoru obradom peptida antigena, itd.