7 ANALYTICKÉ METÓDY. 7 Analytické metódy 82

7 Analytické metódy 82 7 ANALYTICKÉ METÓDY Analytické metódy používané v klinickej chémii možno rozdeliť podľa rôznych kritérií tak ako je to obvyklé v analytickej chémii, napr. na makro- a mikrometódy, kvalitatívne (využitie diagnostických prúžkov typu áno/nie), semikvantitatívne (diagnostické prúžky na analýzu moču) a kvantitatívne metódy (napr. stanovenie albumínu v moči imunoturbidimetricky), podľa princípu na spektrálne (AES, AAS, spektrofotometria), elektrochemické (potenciometria, coulometria), separačné (elektroforéza, chromatografia), enzýmové a imunometódy. Analytické metódy možno rozdeliť aj podľa toho, či bola metóda odporúčaná medzinárodne, či je odporúčaná v rámci národného odporúčania, a preto používaná vo veľkom rozsahu, alebo, či sa určitá metóda používa len v jednom alebo menšej skupine laboratórií. Sú to metódy definičné, referenčné a odporúčané. Definičná (primárna) metóda je metóda s najvyššou úrovňou analytickej spoľahlivosti (najvyššou metrologickou kvalitou), pre ktorú možno vyjadriť úplný rozbor neistôt v SI jednotkách. Metóda má opodstatnený a dobre overený teoretický základ, je dôkladne experimentálne overená; výsledky merania majú zanedbateľnú systematickú chybu a vysoký stupeň presnosti. Primárne metódy tvoria základ správnosti v chemickej analýze. Využívajú sa hlavne na získanie hodnôt primárnych referenčných materiálov. Za primárne metódy sa v súčasnosti považujú gravimetria, coulometria, odmerná analýza a metóda izotopového zrieďovania v hmotnostnej spektrometrii (ID-MS). V klinickej chémii sa používa hlavne ID-MS a ID-GC. Pretože ID-MS a ID-GC sú zložité a časovo náročné metódy, nepoužívajú sa v bežnej dennej laboratórnej praxi, ale využívajú sa na atestáciu kalibrátorov a kontrolných prípravkov. Metódy boli zavedené hlavne preto, že odstraňujú alebo aspoň minimalizujú vplyv matrice vzorky jej zrieďovaním. Definičné metódy boli vypracované pre anorganický fosfor, Na, K, Ca, Mg, glukózu, cholesterol, kreatinín, kyselinu močovú, močovinu a triacylglyceroly. Referenčná metóda je dôsledne preskúmaná metóda, ktorá jasne a presne opisuje potrebné podmienky a postupy pre meranie jednej alebo viacerých hodnôt vlastnosti, o ktorých sa dokázalo, že ich presnosť vyhovuje zamýšľanému použitiu metódy. Preto sa referenčná metóda môže použiť na posúdenie správnosti iných metód pre rovnaké merania a na charakterizovanie sekundárneho referenčného materiálu. Správnosť metódy sa overuje priamym porovnaním s definičnou metódou a primárnym referenčným materiálom. Ďalším charakteristickým znakom referenčných metód je nízka náchylnosť na rušivé vplyvy (interferencie). V klinickej chémii sa využívajú predovšetkým na validáciu rutinných metód a charakterizáciu referenčných materiálov (napr. stanovenie celkového obsahu bielkovín v štandardoch metódou podľa Kjeldahla). Niektoré sa používajú aj rutinne. Odporúčaná metóda (podľa IFCC ) má mať opísanú logickú postupnosť činností, ktoré sú súčasťou postupu merania, tak ako boli definované a odporúčané príslušnou pracovnou skupinou

7 Analytické metódy 83 (napr. stanovenie enzýmov AST, ALT, ALP, LD podľa postupov spracovaných enzýmovým panelom expertov IFCC). Rutinné metódy sú obvykle porovnávacie metódy; metódy založené na porovnávaní hodnoty meranej veličiny so známou hodnotou tej istej veličiny. Namerané výsledky sa vyznačujú dobrou presnosťou, ale ich správnosť je nižšia. Pri posudzovaní zdravotného stavu a určovaní diagnózy obvykle vyšetrenie jedného parametra neposkytne dostatočné informácie. Jednotlivé analyty/metódy sa preto zoskupujú do rôznych súborov. Toto zoskupovanie je väčšinou funkčné a vychádza z klinických požiadaviek lekárov, alebo má dôvody organizačné, bezpečnostné alebo ekonomické a závisí od laboratória. Pretože klinická chémia a laboratórna medicína je odbor pracujúci pre lekára a pacienta, pri vytváraní súborov analytov sú rozhodujúce klinické požiadavky. Podľa zamerania a účelu rozoznávame akútne (statimové) vyšetrenie, základné biochemické a hematologické vyšetrenie, základné vyšetrenie moču a cielené orgánové vyšetrenia. Akútne (statimové) vyšetrenie je určené na rýchlu orientáciu lekára. Ide zväčša o stanovenie jedného alebo skupiny hlavných analytov (z klinického pohľadu), ktoré lekár potrebuje poznať čo najskôr a ktoré musí byť laboratórium schopné vykonávať non-stop. Základné (screeningové) biochemické vyšetrenie sa využíva na určenie predbežnej diagnózy v neakútnych prípadoch. Jeho úlohou je obsiahnuť čo možno najviac metabolických funkcií. Vyšetrenie sa vykonáva zo séra. Príkladom kombinácie pre základné vyšetrenie môže byť súbor obsahujúci základné analyty typické pre činnosť hlavných orgánov a funkcií napr. glukóza (diabetes), kreatinín alebo močovina (obličky), bilirubín, AST, ALT (pečeň), kreatínkináza a troponín (srdce), α-amyláza (slinivka), acidobázická rovnováha (ph krvi, po 2, pco2), chloridy, Na, K, celková bielkovina, albumín. Pri vybočujúcej hodnote určitého analytu pri screeningu sa dodatočne vyžiada stanovenie ďalších analytov typických pre daný prípad. Základné hematologické vyšetrenie sa tiež využíva na určenie predbežnej diagnózy. Pozostáva z vyšetrenia krvného obrazu (hemoglobín, hematokrit, erytrocyty, leuko-cyty, trombocyty, diferenciálny rozpočet leukocytov, morfologické zmeny leukocytov a erytro-cytov) a základného vyšetrenia hemostázy (rekalcifikačný čas plnej krvi a plazmy, protrombínový čas - Quick test a aktivovaný parciálny tromboplastinový test - APTT). Základné vyšetrenie moču. K základným vyšetreniam moču patrí semikvantitatívna analýza moču vykonávaná diagnostickými prúžkami (ph, dusitany, bielkovina, glukóza, bilirubín, urobilinogén, ketolátky, osmolalita, erytrocyty a hemoglobín, leukocyty) a tiež vyšetrenie močového sedimentu. Vyšetrenie močového sedimentu je založené na mikroskopickom hodnotení orgánových (erytrocyty, leukocyty, valce, epitelie) a kryštalických súčastí moču charakteristických pre funkciu obličiek a močového ústrojenstva. Oddelene sa analyzujú kryštalické súčasti (močové konkrementy) tvorené šťavelanom vápenatým, fosforečnanom vápenatým alebo horečnatým, kyselinou močovou a cystínom. Prítomnosť konkrementov sa zistí IČ spektrometriou, polarizačnou mikroskopiou alebo chemickou kvalitatívnou analýzou (dôkaz Ca 2+ 2+ 2-, Mg, C 2 O 4, PO4 3- a kyseliny močovej) a ak je to potrebné, nasleduje aj stanovenie týchto zložiek.

7 Analytické metódy 84 Cielené (orgánové) vyšetrenie je zamerané na zhodnotenie funkčného stavu určitého orgánu alebo systému. Napr. súbor na vyšetrenie pečene obsahuje stanovenie ALT, AST/ALT, AST, GGT/AST, GGT, ALP a bilirubínu v sére a urobilinogénu a bilirubínu v moči. Kardiologický súbor obsahuje stanovenie AST, CK, CK-MB, troponínu T, troponínu I, myoglobínu a LD. Zvláštnu skupinu tvoria akútne vyšetrenia a analýzy vykonávané v blízkosti chorého alebo v priamej línii kontaktu s pacientom, napr. pri lôžku pacienta, personálom zdravotníckeho zariadenia (klinická chémia akútnych stavov, bedside monitoring, Point-Of-Care, POCT). POCT je zameraná na sledovanie stability tzv. vnútorného prostredia pacienta (určenie ph krvi, po 2, pco2, Na, K, chloridy a hemoglobín). Na vyšetrovanie sa používajú buď špeciálne pre POCT upravené prístroje, alebo sú k dispozícii jednorazové sety väčšinou na semikvantitatívnu analýzu. Obidva spôsoby zohľadňujú predovšetkým nutnosť jednoduchej obsluhy, minimálnych nákladov na údržbu a rýchlosť získania výsledku. Okrem vyššie uvedených metodík, sú v súčasnosti dostupné POCT metodiky aj na stanovenie glukózy, laktátu, funkcie trombocytov, kreatinínu, močoviny, cholesterolu, triacylglycerolov, troponínu T, troponínu I, myoglobínu, CK-MB, drog, alkoholu, tumorových markerov a iných. Špeciálnu skupinu analýz, ktoré sa vykonávajú mimo zdravotníckych zariadení, tvoria analýzy súvisiace s domácou samokontrolou (selfmonitoring) pacientov. Tieto analýzy vykonáva pacient sám s cieľom skontrolovať svoj aktuálny zdravotný stav, upraviť dávkovanie liekov alebo získať podnet k návšteve lekára. Najčastejšie si pacienti stanovujú glukózu v plnej kapilárnej krvi a na základe výsledkov si upravia diétu a dávkovanie inzulínu. Ďalším príkladom samokontroly je určenie tehotenstva testom poskytujúcim odpoveď áno/nie. Monitorovanie koncentrácie liečiv v klinických vzorkách v priebehu terapie (terapeutické monitorovanie hladín liečiv, therapeutic drug monitoring, TDM) a odhaľovanie zneužívania liečiv alebo užívania drog (drug of abuse) predstavuje osobitnú časť činnosti laboratórií vybavených špeciálnymi analyzátormi. 7.1 Spektrálne metódy 7.1.1 Molekulová absorpčná spektrometria v UV/VIS oblasti Molekulová absorpčná spektrometria v UV/VIS oblasti je založená na meraní zoslabenia intenzity žiarenia vlnovej dĺžky 200 až 800 nm skúmanou vzorkou. Biologická vzorka (plazma, sérum, moč, mozgovomiechový mok a iné) predstavuje vzorku so značne zložitou matricou, ktorá obsahuje veľký počet zložiek. Tieto zložky poskytujú rôzne molekulové absorpčné spektrá, ale môžu vykazovať aj fluorescenciu alebo turbiditu. Kvantitatívna analýza je založená na využití Bouguerovho-Lambertovho-Beerovho zákona. Meria sa absorbancia A pri vlnovej dĺžke λ maxima absorpčného pásu. A λ = log (I 0,λ /I λ ) = ε λ b c, kde I 0,λ je intenzita žiarenia vstupujúceho do absorbujúcej vrstvy, I λ je intenzita žiarenia po prechode touto vrstvou, ε λ je molový absorpčný koeficient absorbujúcej látky, c je koncentrácia absorbujúcej látky a b je dráha, ktorú lúč prechádza v absorbujúcom prostredí. Uvedený zákon platí pre monochromatické žiarenie a opticky číre zriedené (c < 0,01 mol/l) roztoky, v ktorých absorbujúce častice nepodliehajú žiadnym interakciám.

7 Analytické metódy 85 Pri analýze klinických vzoriek sa uplatňujú rôzne faktory, ktoré spôsobujú rôzne odchýlky od linearity závislosti A λ = f(c). V biologických vzorkách sú často prítomné rôzne koloidné častice (zákal, lipemické sérum), preto sa niekedy okrem absorpcie žiarenia uplatňuje aj odraz a rozptyl žiarenia na týchto časticiach (obr. 7-1). Rozptýlené žiarenie sa šíri do priestoru všetkými smermi. Rozptylom žiarenia dochádza k jeho zoslabeniu v smere dopadajúceho žiarenia (turbidancia), čo vedie k zdanlivo vyššej absorpcii/absorbancii žiarenia. b Zdroj I 0 I Monochromátor Transparentná vzorka Detektor Rozptyl Detektor Obr. 7-1 Absorpcia a rozptyl žiarenia V UV/VIS oblasti sa pozorujú dva typy rozptylu. Rayleighov rozptyl sa pozoruje na časticiach malých rozmerov vzhľadom na vlnovú dĺžku žiarenia a zdanlivá absorpcia žiarenia v dôsledku tohto rozptylu A RR závisí od vlnovej dĺžky A RR ~ 1/λ 4. Tyndalov rozptyl sa pozoruje na časticiach veľkých rozmerov v porovnaní s vlnovou dĺžkou žiarenia a zdanlivá absorpcia žiarenia v dôsledku tohto rozptylu A TR závisí od vlnovej dĺžky A TR ~ 1/λ 2. Z uvedených vzťahov vyplýva, že chyby v dôsledku rozptylu žiarenia koloidnými časticami sa prejavujú predovšetkým v UV oblasti. Okrem rozptylu sa môže prejaviť aj fluorescencia zložiek prítomných vo vzorke. Fluorescenčné žiarenie sa podobne ako rozptýlené žiarenie šíri do priestoru všetkými smermi. V prípade, že niektorá zo zložiek vzorky vyžaruje fluorescenčné žiarenie, toto emitované žiarenie po dopade na detektor spôsobuje chybu v meraní hodnôt absorbancie. Veľkosť tejto chyby, ako aj vlnová dĺžka, pri ktorej sa chyba zaznamená, závisí od usporiadania optickej časti spektrofotometra. Pri klasickom usporiadaní (klasická optika, obr. 7-2) na vzorku postupne dopadá žiarenie rôznej vlnovej dĺžky. Keď sa skenuje interval excitačných vlnových dĺžok, dochádza k absorpcii žiarenia, a tým iniciácii fluorescencie. Výsledkom je emisia žiarenia pri vyšších vlnových dĺžkach. Pretože detektor nerozlišuje jednotlivé vlnové dĺžky, absorbancia nameraná pri excitačných vlnových dĺžkach je nižšia. Keď sa skenuje interval emisných vlnových dĺžok, neobjavuje sa žiadna fluorescencia a hodnota meranej absorbancie je nezmenená. Pri reverznom usporiadaní (obrátená optika, obr. 7-2) na vzorku dopadá žiarenie všetkých vlnových dĺžok simultánne, teda aj žiarenie zodpovedajúce excitačným vlnovým dĺžkam a vzorka preto emituje žiarenie. Rozdiel oproti predchádzajúcemu usporiadaniu je v tom, že pri reverznom usporiadaní sa vlnová dĺžka žiarenia selektuje štrbinou až po prechode žiarenia vzorkou. Detektor zaznamená emitované žiarenie pri správnej (emisnej) vlnovej dĺžke, preto je nameraná absorbancia pri emisnej vlnovej dĺžke nižšia, ale absorbancia nameraná pri excitačnej vlnovej dĺžke je nezmenená.

7 Analytické metódy 86 Štrbina Štrbina Monochromátor Fluorescencia Detektor Fluorescencia Monochromátor Detektor Klasická optika Obrátená optika A A λ EM λ EM λ EX λ EX Vlnová dĺžka Vlnová dĺžka Obr. 7-2 Vplyv fluorescencie na tvar absorpčného spektra (normálna a obrátená optika) Absorpčné spektrum neovplyvnené fluorescenciou ( ), vplyv fluorescencie (- - - -) Priame spektrofotometrické stanovenia (bez predchádzajúcej úpravy vzorky a špecifickej chemickej reakcie) sa v praxi v podstate nevykonávajú, pretože klinicky významné zložky neposkytujú dostatočne špecifické absorpčné spektrá a prejavuje sa veľký vplyv zložiek matrice vzorky. Napr. pri stanovení bilirubínu interferuje hemoglobín, pri stanovení bielkovín interferujú voľné aminokyseliny (tyrozín, tryptofán, fenylalanín). Aj napriek tomu sa spektrofotometria s úspechom využíva na stanovenie mnohých substrátov a katalytickej aktivity enzýmov. Tieto stanovenia sú založené na špecifickej chemickej reakcii medzi analytom a činidlom, ktorej výsledkom je spektrofotometricky stanoviteľný produkt. Množstvo produktu vznikajúceho chemickou reakciou možno sledovať meraním absorbancie (pri konštantnej vlnovej dĺžke) v závislosti od času (obr. 7-3).

7 Analytické metódy 87 A Kinetická metóda Meranie aktivity enzýmu alebo koncentrácie substrátu Rovnovážna metóda Na obr. 7-3 sú vymedzené tri oblasti (časové úseky). V prvej časti je absorbancia prakticky konštantná, prípadne nevýrazne narastá (koncentrácia produktu je blízka medzi stanovenia metódy). Potom nasleduje oblasť, kedy absorbancia (koncentrácia produktu) rastie lineárne s časom. Táto oblasť poskytuje tzv. kinetické informácie. Nakoniec nasleduje rovnovážna oblasť, kedy sa absorbancia s časom nemení (analyt zreagoval s činidlom, dosiahla sa rovnováha). Čas Obr. 7-3 Závislosť absorbancie produktu od času Z obr. 7-3 vyplývajú dva typy metód: rovnovážne metódy a kinetické metódy. Rovnovážne metódy sú metódy, pri ktorých sa meranie (stanovenie) realizuje za rovnovážnych podmienok (end-point, metóda konečného bodu, metóda konštantného času). Namerané hodnoty absorbancie pre roztoky štandardov rôznej koncentrácie sa vynesú do grafu ako funkcia času (obr. 7-4). End-point [št 5 ] Kalibrácia [št 5 ] A [št 4 ] [št 3 ] A [št 4 ] [št 3 ] [št 2 ] [št 2 ] Čas [št 1 ] [blank] [št 1 ] Koncentrácia Obr. 7-4 Závislosť absorbancie od času pre sadu štandardných roztokov a kalibračná čiara (závislosť absorbancie od koncentrácie štandardov po dosiahnutí rovnovážneho stavu) št 1 < št 2 < št 3 < št 4 < št 5, zvislá prerušovaná čiara označuje dosiahnutie rovnovážneho stavu, zvislá prerušovaná čiara označuje dosiahnutie rovnovážneho stavu. Z grafu sa vyhodnotí čas, kedy sa dosiahne rovnováha pre všetky štandardné roztoky. Hodnoty nameraných absorbancií všetkých štandardných roztokov sa potom vynesú do kalibračného grafu. Z analytickej kalibračnej krivky sa určí lineárna oblasť. Väčšina klinicky významných analytov/substrátov (albumín, celková bielkovina, bilirubín, glukóza, cholesterol, kreatinín, kyselina močová, močovina, fosfor) sa stanovuje rovnovážnymi

7 Analytické metódy 88 metódami. Na stanovenie sa využívajú chemické reakcie založené na vzniku rôznych typov farebných zlúčenín. Napr. stanovenie bilirubínu je založené na reakcii s diazotovanou kyselinou sulfanilovou, pričom vzniká červený azobilirubín. Azobilirubín je azofarbivo, ktoré má vlastnosti acidobázického indikátora: v slabo kyslom a neutrálnom roztoku je červený (430-460 nm), v silno alkalickom prostredí je modrý (580-620 nm). Bilirubín + kyselina sulfanilová + NaNO 2 + HCl akcelerátor (kofeín) červený azobilirubín. Veľmi rozšírené je využitie takých reakcií, v ktorých sa ako reagent (katalyzátor) uplatňuje špecifický enzým. Produkt (napr. H 2 O 2 ) reakcie katalyzovanej enzýmom sa stanoví farebnou indikačnou reakciou. Napr. princípom stanovenia glukózy je jej oxidácia katalyzovaná enzýmom glukózaoxidáza (GOD), pričom vzniká kyselina glukonová a peroxid vodíka. GOD β-d-glukóza + O 2 + H 2 O kyselina D-glukonová + H2O 2. Reakciou vzniknutý H 2 O 2 sa použije na oxidačnú kopuláciu (kondenzáciu) 4-aminoantipyrínu s fenolom (katalyzovaná peroxidázou, POD), pričom vzniká červeno sfarbené chinónimínové farbivo. Meria sa absorbancia vzniknutého chinónimínovéh o farbiva pri vlnovej dĺžke okolo 500 nm. R-NH 2 + C 6 H 5 -OH + 2 H 2 O 2 POD R-N=C 6 H 4 =O + 4 H 2 O. Kinetické metódy sú metódy, pri ktorých sa priebežne sleduje absorbancia v závislosti od času (rýchlosť reakcie). Kinetické metódy, najmä tie, ktoré využívajú enzýmy ako katalyzátory, sú vhodné na stanovenie stopových koncentrácií zložiek. Tieto enzýmové reakcie sa vyznačujú vysokou selektivitou, ktorá často umožňuje stanovenie zložky aj vo veľmi komplikovanej matrici. Využívajú sa predovšetkým na stanovenie katalytickej aktivity enzýmov (časť 7.5). UV/VIS detektory v separačných metódach UV detektory patria medzi najrozšírenejšie detektory v HPLC a kapilárnej elektroforéze (CE). UV detektor môže pracovať s jednou vlnovou dĺžkou (254 nm), viacerými vlnovými dĺžkami (254 a 280 nm), ale stále častejšie sa používajú detektory s diódovým poľom (diode-array detector, DAD). V klasickom spektrometri (obr. 7-5) polychromatické žiarenie zo zdroja prechádza vstupnou štrbinou monochromátora a po dopade na disperzný prvok (mriežka) vznikajú spojite premenné vlnové dĺžky. Výstupná štrbina monochromátora vymedzuje úzky interval vlnových dĺžok žiarenia, ktoré sa vzorkou absorbuje. Klasické usporiadanie je vhodné na meranie pri jednej vlnovej dĺžke. Na meranie pri viacerých vlnových dĺžkach, alebo na snímanie celých spektier, je menej vhodné, pretože v takomto prípade sa musí mriežka monochromátora mechanicky natáčať, čo vnáša chyby do meraní. Okrem toho nameranie veľkej série dát je časovo náročné.

7 Analytické metódy 89 Zdroj žiarenia Štrbina Mriežka Štrbina Vzorka Detektor Obr. 7-5 Schéma klasického UV/VIS spektrometra (klasická optika) V spektrometri s diódovým poľom, DAD, (obr. 7-6) polychromatické žiarenie zo zdroja prechádza cez vzorku (napr. zóny zložky na výstupe z chromatografickej kolóny). Žiarenie sa potom fokusuje na vstupnú štrbinu polychromátora. Polychromátor (mriežka) rozloží žiarenie na jednotlivé vlnové dĺžky, ktoré potom dopadajú na diódové pole. V diódovom poli každá dióda meria úzky pás spektra (úzky interval vlnových dĺžok). Interval vlnových dĺžok registrovaný jednou diódou závisí od veľkosti vstupnej štrbiny polychromátora a od veľkosti diódy. Každá dióda plní v podstate rovnakú funkciu ako výstupná štrbina monochromátora v klasickom spektrometri. DAD umožňuje rýchle snímanie celých spektier bez nutnosti meniť polohu optických prvkov. Šošovka Zdroj žiarenia Šošovka Vzorka Štrbina Diódové pole Mriežka Obr. 7-6 Schéma spektrometra s diódovým poľom (obrátená optika)

7 Analytické metódy 90 Výhodou použitia DAD v HPLC je, že detektor monitoruje napr. každý pík pri viac ako jednej vlnovej dĺžke, čo je užitočné vtedy, keď zložky vzorky absorbujú žiarenie pri rôznych vlnových dĺžkach. Pretože počas eluovania jedného píku možno zaregistrovať niekoľko spektier, umožňuje tiež kontrolovať čistotu píkov a stanoviť aj zložky, ktoré nie sú dostatočne rozdelené. DAD poskytuje pre každý pík nielen elučný čas, ale aj príslušné spektrá, čo umožňuje porovnaním s databankou elučných charakteristík a spektier tiež identifikáciu zložiek. V HPLC a CE sa používa predovšetkým na stanovenie exogénnych zložiek v biologických vzorkách (liečivá, toxické zložky). Absorpčná denzitometria Princíp absorpčnej denzitometrie je rovnaký ako pri absorpčnej fotometrii, riadi sa rovnakými zákonmi, ale odlišuje sa v inštrumentálnom usporiadaní. Denzitometria stanovuje absorpciu žiarenia prechádzajúceho pevnou opticky priepustnou vrstvou. Denzitometre sa obvykle využívajú na detekciu bielkovín alebo lipoproteínov rozdelených plošnou chromatografiou alebo elektroforézou. Bielkoviny a lipoproteíny sa pre lepšiu detekciu vyfarbujú (bielkoviny na modro, lipoproteíny na červeno). Využíva sa tiež pri vyhodnocovaní diagnostických prúžkov. Žiarenie zo zdroja (volfrámová alebo halogénová žiarovka, ortuťová lampa, laser) sa optickými prvkami (šošovka, štrbina, filter) usmerní na meraný elektroforeogram a meria sa absorpcia žiarenia buď posúvaním elektroforeogramu pomocou skenovacej dosky, alebo sa posúva optická časť zariadenia. Získa sa grafický záznam - krivka, kde jednotlivé zložky rozdelenej zmesi sú v ideálnom prípade zaznamenané ako súmerné pásy tvaru Gaussovej krivky (obr. 7-7). Albumín Záznam z denzitometra α 1 α 2 β γ Elektroforéza Obr. 7-7 Separácia bielkovín v sére plošnou elektroforézou a záznam z denzitometra Plocha pod jednotlivými krivkami je úmerná relatívnemu zastúpeniu jednotlivých zložiek v stanovovanej vzorke. Denzitometre poskytujú hodnovernú informáciu len vtedy, ak sú jednotlivé zložky dostatočne rozdelené a sfarbenie medzi zložkami sa blíži pozadiu. Metóda vyžaduje okrem intenzívneho zdroja žiarenia aj dokonale priepustnú podložku (plast, sklo) a vrstvu tuhej fázy. Zvyčajne sa však pozoruje obmedzená priepustnosť predovšetkým vrstvy tuhej fázy. Okrem toho, na rozhraní dvoch prostredí dochádza k rôznym odrazovým javom, ktoré

7 Analytické metódy 91 sa zložito korigujú. Preto je výhodnejšie pri vyhodnocovaní farebných reakcií na tuhej fáze využiť meranie odrazeného žiarenia, tzv. reflektometriu. 7.1.2 Luminiscenčné metódy Luminiscenciou sa označuje emisia žiarenia, ktorá sa objavuje pri prechode molekuly z excitovaného stavu do jej základného stavu. Podľa toho, aký zdroj energie sa použije na dosiahnutie excitovaného stavu molekúl, sú známe rôzne typy luminiscencie: energia dodaná elektromagnetickým žiarením (fotoluminiscencia fluorescencia a fosforescencia), teplom (pyroluminiscencia, termoluminiscencia), chemickou reakciou (chemiluminiscencia), elektrickým poľom (elektroluminiscencia, katódoluminiscencia), energia biologických pochodov (bioluminiscencia). V klinickej chémii má najväčší význam fotoluminiscencia, predovšetkým fluorescencia. Novým trendom je využitie chemiluminiscencie. Fluorescencia Značný počet endogénnych zložiek biologických vzoriek, ako aj mnoho liečiv poskytuje charakteristické, dostatočne špecifické fluorescenčné excitačné a emisné spektrá. Citlivosť fluorescenčnej spektrometrie je obvykle o niekoľko poriadkov vyššia než citlivosť spektrofotometrie, v mnohých prípadoch porovnateľná s citlivosťou rádiometrických metód. Veľmi dôležitým faktorom pre výber luminiscenčnej metódy je relatívne nízka cena potrebného prístrojového vybavenia v porovnaní s inými metódami s podobnou citlivosťou. Uvedené charakteristiky vysvetľujú významné rozšírenie fluorescenčnej spektrometrie v kvalitatívnej analýze niektorých zložiek v biologických vzorkách, ale aj v kvantitatívnej analýze predovšetkým pre zložky, ktoré sa vo vzorkách nachádzajú v pomerne nízkych koncentráciách. V kvalitatívnej analýze sa fluorescencia využíva na určenie porfyrínov (λ EXC = 366 nm) v moči. Súčasťou štruktúry bielkovín krvnej plazmy sú prirodzené fluorofory a to aromatické aminokyseliny fenylalanín (λ EXC = 260 nm), tyrozín (λ EXC = 275 nm) a tryptofán (λ EXC = 260-280 nm, λ EM = 340 nm). Pretože v plazmových bielkovinách je fluorescencia fenylalanínu a tyrozínu silne zhášaná, pozoruje sa len fluorescencia zodpovedajúca tryptofánu. Fluorescenciu tryptofánu možno využiť na jeho dôkaz v zmesi s prakticky všetkými známymi aminokyselinami. Kvantitatívna analýza je založená na využití prirodzenej fluorescencie stanovovaných zložiek (priama fluorimetria), alebo na reakcii stanovovanej zložky s vhodným fluorescenčným činidlom (nepriama fluorimetria). Ako fluorescenčné činidlá sa využívajú deriváty fluoresceínu a rodamínu, kumaríny (umbelliferon) a ďalšie. Fluorimetricky sa stanovujú aminokyseliny, katecholamíny, serotonín, histamín, porfyríny, bilirubín, nukleotidy (ATP, ADP, NADH, NADPH), enzýmy (LD, AST, ALT, CK), hormóny, steroidy, vitamíny a mnohé liečivá.

7 Analytické metódy 92 Významné je využitie fotoluminiscencie molekúl v imunoanalýze, tzv. fluorescenčná imunoanalýza (FIA), kde sa rôzne typy fluoroforov využívajú na označenie protilátok alebo antigénov (časť 7.6). Časovo rozložená fluorescencia V klasickej fluorescenčnej spektrometrii sa vzorka kontinuálne excituje vhodným žiarením a zaznamenáva sa priemerná intenzita fluorescencie. V biologických vzorkách je meranie fluorescencie často sprevádzané vysokým signálom pozadia, ktorý vzniká v dôsledku neselektívnej fotoexcitácie. V takýchto prípadoch možno merať časovo rozloženú fluorescenciu (obr. 7-8), kedy sa na excitáciu nepoužíva kontinuálne excitačné žiarenie, ale excitačný pulz. Po ožiarení vzorky excitačným pulzom trvá fluorescenčné žiarenia analytov podstatne dlhšie ako fluorescencia pozadia. Fluorescenciu analytov je teda možné merať až po vyhasnutí fluorescencie pozadia, čím sa zvýši citlivosť stanovenia. Časový profil intenzity fluorescencie I je na obr. 7-8. Ak sa použije rovnaké delenie časovej osi, každá fluoreskujúca molekula vykazuje rozdielne výsledky pre znázornené parametre I a I max, keďže doba zhášania a kvantový výťažok sú charakteristické pre daný fluorofor. Meranie vyžaduje špeciálny fluorimeter, kde excitačné pulzy a meranie intenzity fluorescenčného žiarenia nasledujú po sebe vo vhodných časových intervaloch. I Excitačný pulz Analyt Pozadie Meranie I I max 0 Čas, μs Nový cyklus Obr. 7-8 Zmena intenzity I fluorescenčného žiarenia s časom v časovo rozloženej fluorescencii Fluorescenčné detektory v separačných metódach Podobne ako UV/VIS detekcia, aj fluorescenčná detekcia sa využíva v HPLC a CE. Výhodou je vysoká selektivita a citlivosť detekcie. Častou nevýhodou býva nutnosť priebežne meniť vlnovú dĺžku excitačného žiarenia.

7 Analytické metódy 93 Chemiluminiscencia Chemiluminiscenciu možno najjednoduchšie opísať ako chemickú reakciu, ktorá emituje svetlo. Ak chemickou reakciou vzniká dostatočné množstvo energie (približne 300 kj/mol pre emisiu modrého svetla a 150 kj/mol pre emisiu červeného svetla), táto energia umožní prechod elektrónov z ich základného elektrónového stavu do excitovaného elektrónového stavu. Tento elektrónový prechod je často sprevádzaný zmenou vibračného a rotačného stavu molekúl. V organických zlúčeninách najčastejšie dochádza k prechodom π π* alebo n π*. Návrat elektrónov do základného stavu sprevádzaný emisiou žiarenia sa nazýva chemiluminiscencia. Excitovaná molekula môže strácať energiu aj chemickou reakciou, kolíziou, vnútornou konverziou alebo inak. Tieto neradiačné spôsoby sú z analytického hľadiska nežiaduce. V chemiluminiscencii chemická reakcia produkuje energiu, ktorá je potrebná na prechod molekúl zo základného do excitovaného stavu. Keďže na excitáciu molekúl nie je potrebný zdroj žiarenia, ktorý bol nevyhnutný vo fotoluminiscencii, problémy súvisiace s rozptylom žiarenia alebo nestabilitou zdroja žiarenia sa tu nevyskytujú. V chemiluminiscencii sa pozoruje nižší signál pozadia v porovnaní s fotoluminiscenciou, kde vysoké pozadie vzniká v dôsledku neselektívnej fotoexcitácie. Nie je preto potrebné používať časovo rozloženú fluorescenciu. Okrem toho luminometre využívajúce optické vlákna patria medzi najlacnejšie zariadenia. Chemiluminiscencia sa využíva v imunoanalýze na označenie antigénov alebo protilátok a ich následnú detekciu. V súčasnosti sú známe mnohé chemiluminiscenčné činidlá, najčastejšie sa používa luminol, izoluminol a ich deriváty, deriváty akridínu a deriváty peroxyšťavelanu. Luminol, izoluminol a ich deriváty Zjednodušená reakčná schéma luminolu je na obr. 7-9. V protogénnych rozpúšťadlách (voda, zmes vody a alkoholu) rôzne kyslíkaté zlúčeniny (molekulový kyslík, peroxidy) oxidujú deriváty luminolu v prítomnosti katalyzátora. Ako katalyzátory sa uplatňujú rôzne enzýmy (mikroperoxidáza, myeloperoxidáza, peroxidáza z chrenu, kataláza), metaloproteíny (hemoglobín) a minerálne katalyzátory (molekulový ozón a halogény, ióny Fe 3+, Co 2+ a Cu 2+ a ich komplexy). Do chemiluminiscenčnej reakcie môžu byť zahrnuté rôzne enzýmy a zmesi enzýmov produkujúce kyslíkaté deriváty (napr. ALP, β-d-galaktozidáza, β-glukozidáza, laktátoxidáza). O OH NH NH peroxidáza O + 2 H 2 O 2 + OH - + N 2 + 3 H 2 O + h ν (λ max = 430 nm) O NH 2 O NH 2 O luminol 3-aminoftalát Obr. 7-9 Reakčná schéma luminolu Deriváty luminolu sa využívajú predovšetkým v imunoanalýze na označenie reaktantov. Deriváty izoluminolu vykazujú zvýšenú účinnosť chemiluminiscencie po naviazaní napr. na substrát enzýmovej reakcie, a preto sa používajú na označenie substrátu. Naproti tomu luminol je omnoho účinnejší vo voľnom stave. Preto sa používa v imunoanalýze s enzýmovými značkami (stanovenie testosterónu, hcg, ALP, cholínesterázy a iných). Deriváty luminolu sa využívajú aj v neimunometódach, napr. na stanovenie tyrozínu, celkového cholesterolu, glukózy a antibiotík.

7 Analytické metódy 94 Deriváty akridínu Deriváty akridínu vykazujú chemiluminiscenciu v prítomnosti peroxidu vodíka a silných zásad (obr. 7-10). Na rozdiel od derivátov luminolu, v tomto prípade nie je potrebný katalyzátor reakcie. Výhodou derivátov akridínu je vysoký kvantový výťažok a malý signál pozadia (bez katalyzátora je pozadie nižšie), čo vedie k vysokej citlivosti stanovení. Ľahko sa viažu na proteíny, čo je výhodné pri značení reaktantov v imunoanalýze. Využívajú sa na imunostanovenie tumorových markerov (α-fetoproteín), imunoglobulínov, interleukínov, interferónov, proinzulínu, apolipoproteínu B, vitamínu B 12 a iných. CH CH N + 3 3 N + H 2 O CO 2 + 2 OH - + 2 + X - + hν O X derivát akridínu O Obr. 7-10 Reakčná schéma derivátov akridínu Deriváty peroxyšťavelanu Mnohé deriváty šťavelanu sa oxidujú peroxidom vodíka za vzniku vysokoenergetických medziproduktov. Tieto medziprodukty samotné žiarenie neemitujú. Emisia žiarenia nastáva až procesom prenosu energie na akceptor (fluorescer), ktorý takto prechádza do excitovaného stavu. Takýmto akceptorom môže byť napr. 9,10-difenylantracén, dipyridamol, perylén. Akceptor v excitovanom stave je potom zdrojom luminiscencie (obr. 7-11). V kombinácii s akceptorom sú deriváty šťavelanu najúčinnejšie nebiologické zdroje luminiscencie. Akceptor a šťavelan sa vyberajú pre určitú aplikáciu nezávisle, účinnosť a flexibilita sú teda hlavné výhody tohto systému. Deriváty šťavelanu sú nestále vo vode a vlhkých rozpúšťadlách, čo limituje ich využitie pre diagnostické účely. Chemiluminiscencia šťavelanov sa využíva na detekciu enzýmov, ktoré tvoria peroxid vodíka: cholínoxidáza, cholesteroloxidáza, xantínoxidáza, glukózaoxidáza. Využíva sa aj v kombinácii s extrakciou alebo HPLC na stanovenie liečiv, hormónov a oligonukleotidov. NO 2 O O NO 2 prenos energie O 2 N O C C O NO 2 H 2 O 2 donor dioxyetándion hν bis(2,4-dinitrofenyl)štavelan Obr. 7-11 Reakčná schéma šťavelanu akceptor perylén Optické senzory Optické senzory sú najpopulárnejšie senzory v analýze biologických vzoriek. Výhodou je nedeštruktívna analýza a rýchle generovanie a načítavanie signálu. Zavedenie optických vlákien

7 Analytické metódy 95 (optody) ako optických vodičov a zdokonalenie optoelektroniky rozšírilo možnosti aplikácie týchto zariadení v klinickej analýze. Optické senzory sú založené na meraní zmien v absorpcii, luminiscencii, rozptyle a odraze žiarenia. Na trhu sú dostupné analyzátory určené na vyšetrenie základných parametrov vnútorného prostredia (po 2, pco 2, ph, Na, K, Ca, Cl, celkový hemoglobín, saturácia hemoglobínu kyslíkom) na resuscitačných jednotkách, operačných sálach, jednotkách intenzívnej starostlivosti alebo v teréne. Analyzátory sú založené na fluorescenčnej detekcii všetkých meraných parametrov (okrem hemoglobínu a saturácie hemoglobínu kyslíkom) pomocou fluorescenčných optod. Emitované žiarenie je od excitačného žiarenia oddelené pomocou optických filtrov. Optoda na meranie parciálneho tlaku kyslíka po 2 je založená na meraní zhášania fluorescencie katiónového farbiva kyslíkom. Optoda na meranie ph využíva zmenu fluorescencie farbiva (acidobázického indikátora) imobilizovaného na povrchu optody v závislosti od zmeny ph. Na rozdiel od klasickej sklenej elektródy, táto optoda nepotrebuje referenčnú elektródu a je málo ovplyvňovaná nerovnakou iónovou silou roztoku. Optoda na meranie parciálneho tlaku oxidu uhličitého pco 2 využíva membránu nepriepustnú pre ióny a priepustnú pre CO 2, ktorá pokrýva optodu na meranie ph. ph optoda meria zmenu ph spôsobenú prenikajúcim CO 2 cez membránu. Optody na meranie Na, K, Ca a Cl využívajú rovnaké membrány ako iónovo-selektívne elektródy pre Na, K, Ca a Cl obsahujúce naviac vhodné fluorescenčné farbivo. S rastúcou koncentráciou iónu intenzita fluorescencie farbiva rastie alebo klesá, podľa typu iónu. Ani tieto optoelektródy nepotrebujú referenčnú elektródu. Meranie koncentrácie celkového hemoglobínu a saturácie hemoglobínu kyslíkom je založené na princípe reflektancie (odraz) červeného a IČ žiarenia. Červené svetlo sa používa na meranie saturácie kyslíkom, IČ žiarenie na meranie celkového hemoglobínu. Tieto zariadenia sú prenosné, môžu pracovať na NiCd akumulátor, potrebný objem krvi je 135 μl. Kalibrácia zariadenia sa vykonáva automaticky využitím kalibračných plynov, kalibračné parametre pre celkový hemoglobín a saturáciu hemoglobínu kyslíkom dodáva výrobca. 7.1.3 Plameňová atómová emisná spektrometria (FAES) FAES sa v klinickej chémii využíva na stanovenie sodíka, draslíka, vápnika a lítia v biologických tekutinách. Vzorky (sérum, moč, punktát, obsah cysty) sa obvykle riedia vodou v pomere 1:50 až 1:200. Niekedy riediaci roztok obsahuje aj povrchovo aktívnu látku (Brij 35) na zlepšenie atomizácie. V praxi sa na stanovenie sodíka a draslíka využíva predovšetkým FAES s vnútorným štandardom lítiom alebo céziom. Na stanovenie sodíka sa využíva jeho základná čiara 589 nm, na stanovenie draslíka jeho základná čiara 768 nm. Vzorka sa riedi s LiCl alebo CsCl, ktoré sa uplatňujú ako spektrálne pufre. Vo vzorkách, v ktorých je súčasne prítomný draslík aj sodík, sa pozoruje zvýšenie intenzity emitovaného žiarenia draslíkom. K tomuto nárastu dochádza v dôsledku prenosu energie z excitovaného sodíka na draslík v základnom stave. Ak sa ku vzorke pridá lítium, lítium zachytáva túto energiu a chráni draslík pred excitáciou. Lítium

7 Analytické metódy 96 súčasne plní aj funkciu vnútorného štandardu, voči ktorému sa určuje koncentrácia sodíka alebo draslíka. 7.1.4 Nefelometria a turbidimetria Nefelometria a turbidimetria sa využívajú predovšetkým na stanovenie bielkovín (antigénov alebo protilátok) imunoprecipitačnými reakciami. Imunoprecipitáty vznikajú v roztoku reakciou antigénov s protilátkami. Žiarenie prechádzajúce takýmto roztokom sa absorbuje, rozptyľuje, odráža a časť žiarenia prechádza nezmenená. Zvyšovanie koncentrácie imunoprecipitátu spôsobuje nárast rozptylu a odrazu, ale zníženie priepustnosti (transmitancie). Množstvo precipitátu možno stanoviť meraním žiarenia vzniknutého rozptylom (nefelometria) alebo meraním rozptylom zoslabeného žiarenia (turbidimetria) (obr. 7-12). Detektor Detektor Zdroj žiarenia Kyveta so vzorkou Zdroj žiarenia Kyveta so vzorkou Nefelometria Turbidimetria Obr. 7-12 Schéma nefelometrického a turbidimetrického merania Ak sú rozmery častice menšie alebo rovné vlnovej dĺžke dopadajúceho žiarenia a častice sa nachádzajú v prostredí s rozdielnym indexom lomu, dochádza k rozptylu žiarenia. Malé častice (< λ/10) spôsobujú tzv. Rayleighov rozptyl, rozptýlené žiarenie sa šíri do priestoru symetricky (obr. 7-13). Väčšie častice (rozmery v intervale λ/10 až 1,5λ) spôsobujú nesymetrický rozptyl žiarenia (obr. 7-13). Svetelný tok rozptýleného žiarenia závisí od uhla, ktorý zviera primárny lúč so smerom k detektoru rozptýleného žiarenia. hν hν Symetrický rozptyl žiarenia na častici < λ/10 Nesymetrický rozptyl žiarenia na častici λ/10 až 1,5 λ Obr. 7-13 Symetrický a nesymetrický rozptyl žiarenia

7 Analytické metódy 97 Nefelometria Väčšina rozpustných proteínov má rozmery v intervale 1-100 nm, a preto rozptyľujú dopadajúce UV/VIS takmer symetricky. Imunoprecipitáty majú veľkosť 250-1000 nm, zvyčajne sú teda väčšie ako vlnová dĺžka dopadajúceho žiarenia. Približne platí, že asi 90 % z dopadajúceho žiarenia sa na časticiach veľkosti 1 000 nm rozptyľuje pod uhlom menším ako 10 o. Väčšie častice (nad 10 000 nm) rozptyľujú žiarenie pod uhlom 1 o, čo výrazne znižuje uhol merania. Nefelometre sú konštruované tak, aby umožňovali meranie v obidvoch prípadoch, čo si ale vyžaduje zdroj poskytujúci žiarenie s vysokou intenzitou a zložitý systém zosilnenia rozptylom vzniknutého žiarenia pred dopadom na detektor. Okrem toho lúč žiarenia musí byť rovný, preto sú výhodné ako zdroje lasery s malou divergenciou lúča. Intenzita rozptýleného žiarenia závisí od počtu rozptyľujúcich častíc/objem, veľkosti a tvaru častíc a od uhla, pod ktorým sa rozptýlené žiarenie meria. Znižovanie vlnovej dĺžky zvyšuje rozptyl, ale súčasne rastie aj absorpcia žiarenia molekulami. Preto sa v nefelometrii používajú vyššie vlnové dĺžky. Turbidimetria V turbidimetrii sa meria intenzita prechádzajúceho žiarenia, čo je technicky menej náročné než meranie vzniknutého rozptýleného žiarenia. Za normálnych podmienok (zriedený roztok) predstavuje zoslabené žiarenie veľký podiel z dopadajúceho žiarenia, a preto na spoľahlivé meranie signálu postačuje jeho menšie zosilnenie. Turbidimetre pracujú s vlnovou dĺžkou 320-380 nm alebo 500-650 nm. Za týchto podmienok sa dosiahne maximálna turbidita bez vplyvu interferencie napr. z proteínov, ktoré absorbujú pri 400-425 nm. V turbidimetrii platí vzťah podobný Lambertovmu-Beerovmu zákonu, v nefelometrii sa zvyčajne využíva empirický vzťah medzi pomerom toku žiarenia rozptýleného k dopadajúcemu a medzi koncentráciou častíc vo vzorke. Všeobecne je turbidimetria výhodnejšia na meranie vyšších koncentrácií, nefelometria na nižšie koncentrácie. 7.1.5 Reflexná fotometria Reflexná fotometria sa využíva na kvantitatívne vyhodnotenie vyfarbených chromatogramov, elektroforeogramov, diagnostických prúžkov a iných reakcií v tuhej fáze. Reflexné fotometre merajú žiarenie odrazené od vyfarbenej časti pevnej podložky. Pri dopade monochromatického žiarenia na rozhranie dvoch prostredí charakterizovaných rôznymi indexami lomu dochádza k odrazu žiarenia (obr. 7-14). Pri dopade žiarenia na rovinné lesklé hladké, žiarenie neabsorbujúce povrchy, sa pozoruje zrkadlový odraz, ktorý sa riadi zákonom odrazu. Intenzita odrazeného žiarenia závisí od uhla dopadu žiarenia a indexu lomu materiálu. Najvyšší odraz sa pozoruje na kovových materiáloch. Na polomatných žiarenie absorbujúcich povrchoch s určitými nerovnosťami povrchu sa pozoruje difúzny rozptyl žiarenia. Žiarenie sa odráža nielen v smere zrkadlového odrazu, ale je difúzne odrážané vo všetkých ďalších smeroch.

7 Analytické metódy 98 Nekovové materiály majú nižšiu intenzitu odrazeného žiarenia, žiarenie čiastočne prechádza do štruktúry nekovového materiálu a odráža sa difúzne. Ak v opticky hustejšom prostredí dochádza aj k absorpcii žiarenia, odraz žiarenia nie je úplný. Táto skutočnosť je základom použiteľnosti odrazu pre analytické aplikácie. Nameraním závislosti reflektancie vzorky (t.j. pomeru medzi odrazeným a dopadajúcim žiarivým tokom) od vlnovej dĺžky žiarenia možno získať principiálne rovnaké informácie ako metódou absorpčnej spektrometrie. Podľa rozsahu použitých vlnových dĺžok sa na tvare reflexného spektra prostredníctvom absorpčného koeficientu uplatnia elektrónové a vibračné prechody, vibrácie kryštálových mriežok atď. Hladký a žiarenie neabsorbujúci povrch zrkadlový odraz Polomatný povrch zrkadlový a difúzny odraz Drsný a žiarenie absorbujúci povrch difúzny odraz Obr. 7-14 Odraz žiarenia na rôznych povrchoch Impregnované vlákna žiarenie odrážajú a kvapalná zložka, obsahujúca reakčné produkty, žiarenie absorbuje. Žiarenie sa po prechode týmto heterogénnym prostredím odrazí od plastovej podložky znovu do heterogénneho prostredia a prechádza ním smerom k detektoru. Vzhľadom na to, že svetelný výťažok odrazeného žiarenia je pomerne malý, komerčné reflexné fotometre na vyhodnotenie prúžkov z impregnovaných vlákien využívajú zariadenie navrhnuté Ulbrichtom. Je to biely guľovitý reflektor (Ulbrichtova guľa, obr. 7-15), ktorý fokusuje všetko odrazené žiarenie z reagenčného políčka na detektor fotodiódu. Clona zabraňuje priamemu odrazu dopadajúceho žiarenia na meraný povrch gule. Toto usporiadanie sa označuje 0 o /d geometria. Používa sa aj usporiadanie označované ako d/0 o geometria. V tomto prípade je žiarenie vychádzajúce zo zdroja odrážané všetkými smermi vnútorným povrchom gule tak, že dopadá na povrch reagenčného políčka rovnomerne zo všetkých smerov. Odrazené žiarenie sa meria v kolmom smere na reagenčné políčko. Ak sa na analýzu použije viacvrstvový film, ktorý na rozdiel od impregnovaných vlákien predstavuje homogénnu matricu, automatizovaná reflexná spektrometria často poskytuje výsledky porovnateľné s absorpčnou spektrometriou v roztokoch. Zdrojom žiarenia je halogénová lampa, žiarenie vydelené interferenčným filtrom dopadá na film, prechádza absorbujúcou vrstvou, odráža sa od reflexnej podložky, znovu prechádza absorpčnou vrstvou a dopadá na fotonásobič. Vyššia homogenita matrice filmu umožňuje získať presnejšie výsledky, a to takej kvality, že tieto analyzátory nahradzujú v klinicko-biochemických laboratóriách automatické analyzátory.

7 Analytické metódy 99 Detektor Detektor Clona Zdroj Vzorka Zdroj Clona Meraný povrch gule Meranie odrazeného žiarenia geometriou 0 o /d Vzorka Merania odrazeného žiarenia geometriou d/0 o Obr. 7-15 Schéma usporiadania reflexného fotometra s Ulbrichtovou guľou 7.1.6 Hmotnostná spektrometria Hmotnostná spektrometria sa často používa v spojení s niektorou zo separačných metód, pričom táto kombinácia spája výhody moderných separačných metód vysoká účinnosť separácie zložiek s výhodami hmotnostnej spektrometrie možnosť identifikácie zložiek. Kombinácia plynovej chromatografie s hmotnostnou spektrometriou je jedna z najvýznamnejších analytických metód na identifikáciu zložiek v zložitých biologických vzorkách. Využíva sa predovšetkým v toxikológii, farmakológii a dopingovej kontrole. 7.2 Elektrochemické metódy 7.2.1 Coulometrické titrácie Coulometrické titrácie (coulometria pri konštantnom prúde) sú založené na meraní elektrického náboja potrebného na kvantitatívnu chemickú premenu analytu. V coulometrických titráciách sa titračné činidlo vyrába (generuje) elektrolýzou priamo v roztoku na pracovnej elektróde prechodom konštantného jednosmerného prúdu. Takto vzniknuté titračné činidlo potom reaguje so stanovovanou látkou umiestnenou do priestoru pracovnej elektródy. Meria sa čas od začiatku elektrolýzy (od začiatku generovania titračného činidla) do dosiahnutia bodu ekvivalencie, ktorý sa určí napr. potenciometricky alebo amperometricky. Výhodou coulometrie oproti odmernej analýze je, že nie je potrebná príprava a štandardizácia odmerných roztokov, umožňuje analyzovať zafarbené a kalné roztoky a stanovenie možno automatizovať.

7 Analytické metódy 100 Chloridometre V klinickej biochémii sa coulometrické titrácie využívajú predovšetkým na stanovenie chloridov v biologických vzorkách (sérum, moč, likvor, pot) v špeciálnych titrátoroch (chloridometroch). Chloridometer (obr. 7-16) sa skladá z titračnej nádoby (obsahujúcej zmes polyvinylalkoholu, kyseliny dusičnej a kyseliny octovej a analyzovaný roztok objemu V), striebornej anódy a pomocnej striebornej katódy, miešadla a dvoch elektród na indikáciu bodu ekvivalencie. Meranie času Zdroj prúdu I = konšt Pracovná elektróda Ag Ag + + e Indikácia Pomocná elektróda Dvojica indikačných elektród Miešadlo Obr. 7-16 Schéma zapojenia chloridometra Princíp coulometrickej titrácie: Titračné činidlo (Ag + ) vzniká na Ag anóde prechodom konštantného prúdu I: Ag Ag + + e. Vzniknuté ióny Ag + reagujú s iónmi Cl - vo vzorke, pričom vzniká vo vode veľmi málo rozpustný AgCl: Ag + + Cl - AgCl. Bod ekvivalencie možno indikovať potenciometricky s použitím striebornej, argentochloridovej alebo iónovo-selektívnej elektródy (selektívna na Ag + alebo Cl - ) a vhodnej referenčnej elektródy. V bode ekvivalencie, keď sú všetky chloridy viazané do zrazeniny AgCl, nastane náhla zmena potenciálu. Zmeria sa čas t, počas ktorého prechádzal analyzovaným roztokom konštantný prúd I, potrebný na dosiahnutie bodu ekvivalencie. Koncentrácia chloridov sa vypočíta ako: c = I t z -1 F -1 V -1. Bod ekvivalencie možno indikovať aj amperometricky použitím dvoch indikačných Ag elektród, na ktoré sa vloží konštantné napätie. V tomto prípade sa v bode ekvivalencie pozoruje nárast prúdu v dôsledku redukcie nadbytočného Ag + na Ag, ktorá prebieha na Ag katóde indikačného systému elektród.

7 Analytické metódy 101 Chloridometre zvyčajne udávajú výsledok priamo ako hodnotu koncentrácie chloridov, čo značne urýchli analýzu (20 s na jedno stanovenie). Spotreba séra je 0,01 až 0,1 ml. 7.2.2 Amperometria Clarkova kyslíková elektróda Clarkova kyslíková elektróda (obr. 7-17) je článok pracujúci na princípe amperometrie. Skladá sa z polarizovanej Pt (alebo Au, Ag) elektródy (katóda, indikačná elektróda) a z chloridostriebornej referenčnej elektródy. Medzi elektródami je elektrolyt (KCl a tlmivý roztok). Obe elektródy sú od meraného roztoku oddelené tenkou hydrofóbnou membránou z teflonu, silikónu alebo polypropylénu, ktorá je priepustná pre kyslík. Galvanometer Zdroj (0,6-0,7V) Pt katóda O 2 + 2 H 2 O + 4e 4 OH - Ag/AgCl anóda Ag e Ag + Membrána priepustná pre O 2 O vo vzorke 2 KCl + tlmivý roztok Obr. 7-17 Schéma Clarkovej kyslíkovej elektródy Na elektródy sa vkladá konštantné jednosmerné napätie (0,6-0,7 V), pri ktorom sa kyslík na katóde redukuje. Galvanometrom sa meria pretekajúci prúd, ktorý je úmerný koncentrácii rozpusteného kyslíka v analyzovanom roztoku. V klinickej biochémii sa Clarkova kyslíková elektróda najčastejšie používa v analyzátoroch krvných plynov (stanovenie po 2 ), ale tiež v analyzátoroch s rôznymi biosenzormi využívajúcimi enzýmy.

7 Analytické metódy 102 7.2.3 Konduktometria V konduktometrii sa meria vedenie elektrického prúdu v roztoku elektrolytov, ktoré zahŕňa migráciu iónov k elektródam opačného náboja. Konduktometria je založená na vzťahu medzi elektrickou vodivosťou a koncentráciou elektrolytov. Na vedení elektrického prúdu sa podieľajú všetky ióny prítomné v roztoku, nielen ióny stanovovanej zložky. Táto neselektivita a malá citlivosť konduktometrie v podstate limituje jej využitie v klinickej analýze. Konduktometria je vhodná na stanovenie zložiek prítomných vo vzorke vo vyššej koncentrácii. Príkladom je stanovenie močoviny v automatických analyzátoroch. Neutrálna molekula močoviny sa v prítomnosti enzýmu ureáza štiepi na produkty CO 2 a NH 3, ktoré vo vode vytvárajú ióny NH 4 + a HCO 3 -, čo sa prejaví zvýšením vodivosti roztoku. V hematológii sa konduktometria používa na počítanie krviniek. Vodivosť krviniek je nižšia ako vodivosť solí, ktoré sa používajú ako suspenzné médium. Suspenzia krviniek prechádza tryskou vhodnej veľkosti. Počítajú sa vzniknuté impulzy, ktoré sa po zosilnení vyhodnotia. 7.2.4 Potenciometria Potenciometria je metóda využívajúca na získanie informácií o zložení vzorky hodnotu nameraného napätia vhodne zostaveného galvanického článku pri prakticky nulovom prúde. Na rýchle merania, zvyčajne v klinickej analýze nevyhnutné, sa používajú metódy priamej potenciometrie s využitím iónovo-selektívnych elektród (ISE) ako indikačných elektród. ISE je indikačná elektróda, ktorej potenciál selektívne závisí od aktivity príslušného iónu vo vzorke, avšak jej potenciál je ovplyvňovaný všetkými iónmi rovnakého náboja v miere vyjadrenej potenciometrickými koeficientmi selektivity. ISE vykazujú rýchlu odozvu v širokom intervale aktivít, možno ich použiť aj na meranie zakalených a farebných roztokov. Určitým problémom je, že ISE poskytujú informácie o aktivite analytu, nie o jeho koncentrácii. Priama potenciometria neriedených biologických vzoriek poskytuje vždy vyššie výsledky stanovenia (napr. pri stanovení Na a K v moči) v porovnaní s referenčnou metódou (FAES). Ďalším problémom je selektivita elektródy. Podľa materiálu, z ktorého je vyrobená membrána elektródy, možno ISE rozdeliť na elektródy s tuhou membránou a elektródy s kvapalnou membránou. V súčasnosti je komerčne dostupné množstvo ISE elektród pre rozličné analyty a rôzne typy vzoriek. V klinickej analýze sa využívajú len niektoré. Iónovo-selektívne elektródy (ISE) s tuhou membránou Sklená ph elektróda Na tenkej sklenej membráne oddeľujúcej dva roztoky s rôznou koncentráciou H + iónov vzniká potenciálový rozdiel, ktorého meranie je princípom použitia sklenej elektródy na meranie ph. Sklená ph elektróda je doteraz najpoužívanejšou ISE elektródou vďaka vysokej selektivite na H + ióny, širokému koncentračnému rozsahu a rýchlej odozve. Sklená membrána môže byť zložená

7 Analytické metódy 103 napr. z 72 % SiO 2, 22 % Na 2 O, 6 % CaO alebo pre oblasť ph > 10 sa používa membrána z 80 % SiO 2, 10 % Li 2 O, 10 % CaO. Sklená pna elektróda Zmenou zloženia sklenej membrány (71 % SiO2, 11 % Na2O, 18 % Al 2 O 3,) sa získa sklená elektróda so zvýšenou selektivitou na ióny Na +, tzv. pna elektróda. Sú známe aj sklené elektródy so zvýšenou selektivitou na ióny K + alebo NH + 4. pcl elektróda a iné ISE selektívne na chloridy (pcl elektródy) a ióny Ag (pag elektródy) využívajú membrány pripravené zo zmesi Ag2S a AgCl. Namiesto AgCl sa môže v zmesi s Ag2S použiť aj AgBr, AgI alebo AgSCN, potom sa získa ISE selektívna na príslušný anión (Br -, I - alebo SCN - ). + ISE s kvapalnými membránami Pri príprave ISE s kvapalnými membránami sa používajú pórovité hydrofóbne polyméry (PVC, silikónová guma, teflon) nasiaknuté membránovou kvapalinou buď ionexom alebo neutrálnym (nenabitým) nosičom v organickom rozpúšťadle, ktoré sa nemieša s vodou. pca elektróda Využíva ionex didecylfosforečnan vápenatý (alebo iný ionex typu C8-C16),rozpustený v di-n- alebo v 1-dekanole. Najvýznamnejšie interferujúce zložky sú železo a zinok. oktylfenylfosfonáte Elektródu možno použiť v intervale ph 5,5 až 11. V elektródach s neutrálnymi (nenabitými) nosičmi (neutral carrier electrodes) sa ako nosiče využívajú niektoré prírodné makrocyklické zlúčeniny alebo syntetické cyklické polyétery (crown étery), ktoré v štruktúre obsahujú dutinu rozmerov iónov (malých molekúl). Najčastejšie sa tieto nosiče používajú v ISE pre katióny alkalických kovov a kovov alkalických zemín (obr. 7-18). pk elektróda ISE selektívna na K + využíva valinomycín (cyklický dodekadepsipeptid obsahujúci 12 striedajúcich sa esterových a peptidových spojovacích článkov, obr. 7-18). O O O O O Si Na + O O O O O H N O O K + O H N O 3 O N Na + 4 O O Ca 2+ O O O N O O Mg 2+ Obr. 7 18 Nenabité nosiče používané v ISE na ióny Na +, K +, Ca 2+ a Mg 2+ Molekula valinomycínu má tvar prstenca s vysokou koncentráciou elektrónov v dutine prstenca (na karbonylových skupinách), do ktorej je selektívne vťahovaný K +. Selektivita je zrejme daná

7 Analytické metódy 104 vhodnou veľkosťou iónov K + (iónový polomer je 0,133 nm) vzhľadom na polomer dutiny. Veľkosť dutiny valinomycínu je 5 000-krát menej výhodná pre ióny Na + a až 18 000-krát menej výhodná pre ióny H +. Malý vplyv iónov H + na selektivitu umožňuje pracovať aj vo veľmi kyslom prostredí. Elektróda s valinomycínom v PVC membráne sa používa na stanovenie draslíka v plnej krvi, plazme, sére a zriedenom moči. V prípade analýzy neriedeného moču je výhodnejšie použiť elektródu s valinomycínom v silikónovej gume ako membráne, pretože u PVC sa pozoroval prienik niektorých aniónov z moču do materiálu PVC. Plynová Severinghausova elektróda, pco2 elektróda pco 2 elektródu pôvodne vyvinuli Severinghaus a Bradley (1957) na meranie parciálneho tlaku CO 2 v krvi. Používa sa na meranie CO 2 v rôznych automatizovaných systémoch doteraz. Je to sklená elektróda, ktorá je od meraného roztoku oddelená silikónovou (teflonovou) membránou prepúšťajúcou CO 2. Medzi membránou a sklenou elektródou je roztok obsahujúci Na2CO 3 a NaCl. Difundujúci CO 2 zo vzorky po prechode membránou znižuje ph v priestore medzi membránou a sklenou elektródou podľa reakcie: CO + + HCO - 2 + H O H 3. 2 Zmena ph v tomto priestore je priamo úmerná parciálnemu tlaku CO 2 v skúmanom roztoku a je meraná vlastnou sklenou elektródou. Na obr. 7-19 je schematicky znázornený potenciometrický pco 2 senzor v tvare katétra vhodný pre in vivo monitorovanie CO 2. Senzor sa skladá z polymérovej ph citlivej elektródy v tvare rúrky, ktorá je umiestnená vo vnútri rúrky zo silikónovej gumy. Silikónová guma prepúšťa CO 2. Výhodou tohto usporiadania je, že vonkajšia silikónová trubica chráni ph elektródu pred poškodením pri zavádzaní katétra do žily. Ag/AgCl elektróda Roztok Na 2 CO 3 + NaCl Ag/AgCl PVC membrána Referenčný roztok ph elektródy ph citlivá membrána Membrána priepustná pre CO 2 (rúrka zo silikónovej gumy) CO 2 vo vzorke 1,1 mm Obr. 7-19 Schéma elektródy vo forme katétra na in vivo monitorovanie pco 2

7 Analytické metódy 105 Viacvrstvové filmy na potenciometrické merania Viacvrstvovú filmovú technológiu vyvinuli vo firme Kodak pre potenciometrické systémy pre klinickú analýzu. Meranie prebieha na povrchu vhodnej iónovo-selektívnej vrstvovej elektródy, ktorá poskytuje odozvu napr. na K +, Na +, Cl - a CO 2. Vrstvy sa pripravujú nanášaním vhodných polymérových membrán nad vrstvu vnútornej referenčnej elektródy nanesenej na vhodnej vodivej podložke. Schematický obrázok cely použitej na meranie K + v sére je na obr. 7-20. Vzorka Štandard Elektróda pre vzorku Soľný mostík Film valinomycínu KCl film AgCl vrstva Ag vrstva Nosič Elektróda pre štandard Potenciometer Obr. 7-20 Schéma viacvrstvového filmu na potenciometrické stanovenie draslíka Dve identické elektródy vo forme tenkého filmu na báze valinomycínu sú spojené soľným mostíkom z papiera. Jedna kvapka (10 μl séra) sa kvapne k jednej elektróde a k druhej elektróde sa kvapne rovnaký objem roztoku štandardu draslíka. Tieto dve kvapaliny vytvoria spojenie kapilárnym tokom cez úzky pásik papiera, ktorý nahrádza tradičný soľný mostík. Papierový pásik je pokrytý polyetylénom, ktorý chráni vrstvu pred vyparovaním. Potenciometer zapojený k elektródam meria výsledný rozdiel potenciálu. Stabilný potenciál sa dosiahne asi za 3 min po nanesení vzorky. Účinnosť týchto suchých vrstiev je porovnateľná s konvenčnou iónovoselektívnou elektródou. Každá vzorka sa analyzuje na novej elektróde, čím sa odstránil problém zo znečisťovaním jej povrchu a zanášaním chýb pri opakovanom použití tej istej elektródy. Analyzátor na meranie ph a krvných plynov Je vybavený sklenou elektródou na meranie ph, Clarkovou kyslíkovou elektródou a Severinghausovou elektródou na meranie pco 2.

7 Analytické metódy 106 7.3 Chromatografické metódy Chromatografické metódy umožňujú separáciu zložiek zložitých zmesí a v spojení s vhodnou detekčnou technikou aj identifikáciu a stanovenie týchto zložiek. Využívajú sa v klinickej chémii (separácia aminokyselín, enzýmov, lipidov, sacharidov, hormónov, steroidov, liečiv, vitamínov), vo farmakológii (terapeutické monitorovanie liečiv) a v toxikológii (identifikácia a stanovenie toxických zložiek, dopingová kontrola). Pri separácii zložiek sa uplatňujú všetky známe separačné princípy (adsorpcia, Nernstov rozdeľovací zákon, výmena iónov, chemická reakcia a veľkosť molekúl). V klinickej biochémii je najpoužívanejšia tenkovrstvová chromatografia, v toxikológii a farmakológii sa využíva predovšetkým kolónová chromatografia. 7.3.1 Tenkovrstvová chromatografia (TLC) TLC je výhodná separačná metóda a to z viacerých dôvodov. Umožňuje paralelnú analýzu viacerých vzoriek, čím sa dosiahne vysoká priepustnosť separačného systému, umožňuje detekciu zložiek po ukončení separácie bez časových nárokov na rýchlosť odozvy detektora, detekcia zložiek v stacionárnej fáze často nezávisí od vlastností mobilnej fázy, stacionárna fáza sa použije len na jednu analýzu. Metóda je veľmi vhodná pre finančne nenáročné analýzy vyžadujúce minimálnu úpravu vzoriek, alebo v takých prípadoch, kde použitie TLC zjednoduší prípravu vzorky redukovaním počtu predseparačných krokov. Uprednostňuje sa tiež pri analýze zložiek, ktoré sa všeobecne zložito detegujú a vyžadujú preto pokolónovú derivatizáciu. Mnohé tieto výhody sa využívajú v rozsiahlych kontrolných programoch (identifikácia zneužívania liečiv alebo toxických zložiek v biologických vzorkách). TLC sa často používa ako screeningová metóda na vyhľadanie podozrivých vzoriek a identifikovanie zložiek, ktoré sa potom stanovujú inou analytickou metódou. V klinickej chémii sa TLC využíva na separáciu sérových lipidov, cholesterolu a jeho esterov, hormónov, vitamínov, katecholamínov, na dôkaz a stanovenie liečiv a ich metabolitov. Využíva sa tiež v imunochromatografii na separáciu viazaných a nenaviazaných značiek. Vo väčšine týchto systémov je protilátka imobilizovaná na vhodnom nosiči (papier, silikagél, polymér) vo forme prúžku. Vzorka (obsahuje antigén) zmiešaná s označeným antigénom preniká chromatografickým systémom a reaguje s protilátkou v prúžku. Neviazaný označený podiel antigénu sa potom môže stanoviť v zóne za týmto prúžkom alebo sa stanoví množstvo označeného antigénu naviazaného na protilátku v prúžku.

7 Analytické metódy 107 7.3.2 Kolónová chromatografia Kvapalinová chromatografia (LC) Adsorpčná LC Princíp separácie zmesi látok je založený na rozdielnej adsorpcii na povrchu adsorbentu. Používajú sa polárne (silikagél - oxid kremičitý, florisil - kremičitan horečnatý, alumina - oxid hlinitý) aj nepolárne (aktívne uhlie) adsorbenty. Adsorpčná LC sa využíva predovšetkým na delenie zmesí nepolárnych alebo stredne polárnych zložiek. Silne polárne a iónové zlúčeniny sa na polárnych adsorbentoch viažu veľmi pevne a nemožno ich vytesniť ani najpolárnejším rozpúšťadlom. V klinickej biochémii sa adsorpčná LC využíva na izoláciu a čistenie rôznych látok napr. bilirubín, cholesterol, delenie enzýmov, izoenzýmov, porfyrínov a liečiv. Rozdeľovacia LC Princípom separácie zmesi zložiek je ich rozdielna rozpustnosť v dvoch vzájomne obmedzene miešateľných kvapalinách, z ktorých jedna je zakotvená na nosiči v podobe tenkého filmu (stacionárna fáza) a druhá preteká kolónou (mobilná fáza). Využíva sa predovšetkým v TDM a toxikológii. Ionexová LC Princípom metódy je výmena iónov medzi stacionárnou fázou (ionex: katex, anex, amfotérny, chelátotvorný) a roztokom (mobilnou fázou). Ako mobilná fáza sa používa vodný alebo vodnoalkoholový roztok, pričom selektivitu separácie možno ovplyvniť výberom ph, typom tlmivého roztoku a iónovou silou. Zbrzďovanie prieniku slabých kyselín a zásad chromatografickou kolónou naplnenou ionexom závisí od ph mobilnej fázy, pretože ph ovplyvňuje ionizáciu slabých protolytov. Nedisociované molekuly nie sú na ionexoch zbrzďované. Zbrzďovanie prieniku aniónov slabých kyselín na anexoch vzrastá (kapacitný pomer sa zvyšuje) s rastúcim ph mobilnej fázy, zatiaľ čo zbrzďovanie prieniku katiónov slabých zásad klesá (kapacitný pomer klesá) s rastúcim ph. Závislosť kapacitných pomerov od ph mobilnej fázy pre niektoré purínové a pyrimidínové zásady separované na silne kyslom katexe je na obr. 7-21. Z obr. 7-21 je zrejmé, že s poklesom ph mobilnej fázy vzrastajú kapacitné pomery zložiek. Pri určitom ph sa však separované zásady úplne protonizujú a ich separácia je znovu nezávislá od ph. Uracil je v uvedenej oblasti ph neutrálny, preto má veľmi malý kapacitný pomer. Pri zbrzďovaní uracilu sa uplatňuje len difúzia do pórov ionexu.

7 Analytické metódy 108 kapacitný pomer 16 14 12 10 8 6 4 adenín cytozín gaunín 2 uracil 0 2 3 4 5 6 7 8 ph Obr. 7-21 Závislosť kapacitných pomerov od ph mobilnej fázy Separácia aminokyselín (bielkovín) Aminokyseliny a bielkoviny sú amfotérne zlúčeniny, ktorých výsledný náboj závisí od ph prostredia, v ktorom sa nachádzajú. Vplyv ph na protolytické rovnováhy týchto zložiek možno opísať rovnicami: bielkovina CH NH 3 + COOH ph<pi bielkovina CH NH 2 COOpH>pI bielkovina OH- OH- H + CH NH 3 + COO- H + ph=pi Pri ph izoelektrického bodu (pi) sú aminokyseliny (bielkoviny) elektroneutrálne, náboj v molekule je kompenzovaný vznikom zwitter iónu, preto sa ich pohyb na ionexe nezbrzďuje. Pri hodnotách ph nad ph izoelektrického bodu sa nachádzajú v roztoku vo forme aniónov a preto sa na ich separáciu môžu použiť anexy. Pri hodnotách ph nižších ako je izoelektrický bod sa v roztoku nachádzajú ako katióny a na ich separáciu možno použiť katexy. Aminokyseliny sa pri separácii viažu na ionex predovšetkým elektrostatickými silami, vzniknutá väzba je pre rôzne aminokyseliny rôzne pevná. Zachytené aminokyseliny sa z ionexu eluujú premývaním roztokom, ktorého zložky sa viažu na ionex silnejšie ako rozdelené aminokyseliny. Na separáciu aminokyselín sa používajú automatické analyzátory s kolónami naplnenými ionexami na delenie kyslých, neutrálnych a zásaditých aminokyselín. Rozdelené aminokyseliny sa automaticky eluujú tlmivými roztokmi (citrát sodný, citrát lítny). Rozdelenie zložiek sa dosiahne zmenou ph a iónovej sily elučného roztoku a teploty kolóny. Zložky sa automaticky vyfarbia ninhydrínom a meria sa absorbancia pri dvoch vlnových dĺžkach. Na stanovenie prolínu a hydroxyprolínu sa používa vlnová dĺžka 440 nm, ostatné aminokyseliny sa detegujú pri vlnovej dĺžke 570 nm. Ionexová chromatografia sa využíva na delenie bielkovín, peptidov, aminokyselín, DNA, enzýmov, vitamínov, liečiv a alkaloidov v biologických vzorkách.

7 Analytické metódy 109 Gélová LC V gélovej chromatografii sa zložky separujú na základe rozdielnej veľkosti a tvaru molekúl. Molekuly, ktorých rozmer je menší ako sú otvory gélu, budú v dutinách gélu zadržiavané, molekuly väčšie ako dutiny gélu na kolóne zadržiavané nebudú a vychádzajú z kolóny ako prvé. Pomocou gélov možno zahusťovať biologické tekutiny s nízkou koncentráciou bielkovín. Ak sa pridá napr. Sephadex v suchom stave k likvoru, gél začne napučiavať a zadrží malé častice. Po odstredení sa zahustený likvor môže použiť na elektroforézu bielkovín. V klinickej biochémii sa gélová chromatografia využíva na: o skupinovú separáciu zložiek s veľmi rozdielnymi hodnotami M r (odsoľovanie bielkovín, peptidov, polysacharidov, oddelenie koenzýmov alebo inhibítorov od enzýmov), o frakcionovanie a izoláciu jednotlivých zložiek zo zmesi, napr. bielkoviny, peptidy, sacharidy, polysacharidy, izoenzýmy, DNA, o sledovanie tvorby komplexov katiónov kovov s bielkovinami alebo polysacharidmi, o určenie molovej hmotnosti rozdelených bielkovín. Kolóna sa kalibruje pomocou bielkovín so známou M r a presne zmerané elučné časy sa potom porovnávajú s výsledkami analýzy delených bielkovín. Afinitná LC Afinitná chromatografia je založená na špecifickej reakcii medzi separovanou látkou S a vhodným ligandom L, ktorý je chemicky naviazaný na nosič, pričom vzniká komplex SL. Napríklad pri separácii antigénov (bielkovín) je ligandom špecifická protilátka, pri separácii enzýmov je ligandom špecifický substrát, inhibítor enzýmu alebo kofaktor enzýmu. V klasickej kolónovej LC sa ako nosič ligandu používa agaróza, dextrán a celulóza. V HPLC je nosičom silikagél alebo vhodný polymér. Príklad izolácie zložky S zo zmesi so zložkami A a B je na obr. 7-22. Vzorka A,B,S Vytláčadlo V L LS LS LV A,B S Obr. 7-22 Izolácia zložky S afinitnou chromatografiou. L je ligand pre zložku S Chromatografická kolóna sa naplní makromolekulovým nosičom, na ktorý je naviazaný ligand. Vzorka sa nadávkuje na kolónu za takých podmienok (ph, iónová sila), kedy sa separovaná zložka S silne viaže na ligand. Zo vzorky sa na kolóne zadrží len tá zložka (S), ktorá má v kolóne svoj špecifický ligand. Ostatné látky kolónou pretečú. Izolovaná zložka S sa z väzby na ligand

7 Analytické metódy 110 uvoľní premytím kolóny takým činidlom, ktoré má vyššiu afinitu k ligandu ako zložka S. Zvyčajne sa zmení ph alebo zloženie tlmivého roztoku mobilnej fázy (zníži sa sila interakcie S a L) alebo sa pridá komplexačné činidlo do mobilnej fázy (na vytlačenie S z väzby na L). Zložka S eluujúca z kolóny sa buď priamo stanoví použitím vhodného detektora alebo sa frakcie vytekajúce z kolóny automaticky zberajú zberačom frakcií a následne analyzujú. Využitie v klinickej chémii: o Izolácia enzýmov (napr. enzymoimunoanalýza), bielkovín (napr. výroba antisér), hormónov (napr. rádioimunoanalýza), nukleových kyselín, liečiv a drog. o o o o o Rozlíšenie izoenzýmov ALP produkovaných v pečeni a kostiach analýzou séra použitím afinitnej kolóny naplnenej lecitínom. Separácia a izolácia špecifických proteínov a peptidov. Stacionárnou fázou je ionex s imobilizovanými Cu 2+ (Zn 2+ 2+ 2+, Ni, Co ) iónmi. Ióny Cu 2+ vytvárajú komplexy s niektorými stavebnými zložkami proteínov aminokyselinami (napr. silné komplexy s histidínom, cysteínom, tryptofánom, slabšie s fenylalanínom, tyrozínom, lyzínom a arginínom). Po naviazaní proteínov na Cu 2+ v kolóne, sa tieto naviazané proteíny uvoľnia premytím vytláčadlom (napr. imidazol). Sila interakcie proteínu s Cu 2+ je rôzna pre rôzne proteíny a v mnohých prípadoch využiteľná na účinnú separáciu a izoláciu špecifických proteínov. Z rôznych afinitných reakcií sa najčastejšie uplatňuje interakcia antigén-protilátka, v takomto prípade sa technika označuje ako imunoafinitná chromatografia. Kolóny naplnené proteínom A alebo proteínom G (ligandy pre protilátky) sú vhodné na stanovenie imunoglobulínov pri neutrálnom ph. Pri nižšom ph komplex proteín imunoglobulín disociuje. Proteíny A a G reagujú s rôznymi typmi imunoglobulínov rôzne, sú vhodné predovšetkým na analýzu imunoglobulínov skupiny G. Na čistenie polyvalentných antisér. Na nosič sa naviaže príslušná bielkovina (antigén), proti ktorej chceme získať protilátku. Kolóna sa preleje antisérom, ktoré obsahuje protilátky proti viacerým bielkovinám. Na kolóne zostane naviazaná len tá protilátka, ktorá je špecifická pre bielkovinu naviazanú na nosič v kolóne. Po uvoľnení protilátky z väzby na bielkovinu sa takto získa monovalentné antisérum.

7 Analytické metódy 111 HPLC V klasickej kolónovej chromatografii sa používajú kolóny s priemerom 1-2 cm, ktoré sa plnia časticami veľkosti 100-200 μm. Takéto usporiadanie umožňuje pretekanie mobilnej fázy gravitačnou silou. Jednotlivé frakcie sa zachytávajú do zberača frakcií a analyzujú sa jednoduchými chemickými metódami. Metóda je zdĺhavá a neumožňuje delenie zložitých zmesí. V HPLC sa používajú náplne s rozmermi častíc menšími ako 30 μm, ktorými sú naplnené tenké kolóny. Prietok mobilnej fázy zabezpečuje vysokotlakové čerpadlo, eluát z kolóny kontinuálne prechádza detektorom. Okrem kontinuálneho monitorovania zložiek eluujúcich z kolóny, je výhodou HPLC aj lepšie rozlíšenie zložiek a vyššia účinnosť separácie v porovnaní s klasickou LC. V HPLC sa môžu zložky deliť na základe rovnakých princípov ako v klasickej LC. Metóda sa využíva v terapeutickom monitorovaní liečiv, pri identifikácii a stanovení liečiv a ich metabolitov v biologických materiáloch, delení lipidov, steroidov, aminokyselín a ich derivátov, peptidov, katecholamínov, na stanovenie aktivity enzýmov a pod. Pred HPLC analýzou je často nutné biologickú vzorku upraviť extrakciou alebo odstránením bielkovín. V klinickej analýze sa veľmi často využíva chromatografia na obrátených fázach (reversed-phase, RP) stacionárna fáza je nepolárna (napr. C 18 ) a mobilná fáza je polárna (vodný roztok). Pri analýze vodných roztokov vzoriek obsahujúcich bielkoviny (napr. sérum) dochádza na nepolárnej stacionárnej fáze k denaturácii bielkovín a postupne až k upchávaniu kolóny. Pretože odstraňovanie bielkovín je časovo pomerne náročné a vnáša aj chyby do celkového postupu, je výhodnejšie analyzovať biologické vzorky priamo bez predchádzajúcej úpravy. Takéto priame dávkovanie vzoriek obsahujúcich bielkoviny umožňujú špeciálne stacionárne fázy označované ako materiály s obmedzeným prístupom (Restricted Access Medium, RAM). Pri separácii na RAM sa súčasne uplatňujú dva separačné princípy: o princípom rozdeľovacej alebo ionexovej chromatografie sú zadržiavané nízkomolekulové zložky, o princípom size-exclusion (vylučovanie podľa veľkosti, podobne ako v gélovej chromatografii) sú vylučované makromolekulové látky. RAM sa pripravujú rôznym spôsobom, ako príklad možno uviesť materiály označované ako semipermeabilné povrchy (Semi-Permeable Surface, SPS) a materiály s hydrofóbnym vnútorným povrchom (Internal Surface Reversed Phase, ISRP). Materiály označované ako semipermeabilné povrchy (obr. 7-23) sú tvorené časticami silikagélu (veľkosť častíc 5 μm, veľkosť pórov 10 nm). Na povrchu častice silikagélu je kovalentne naviazaný reťazec polyoxyetylénu (hydrofilný, biokompatibilný nezráža proteíny). Vo vnútri (pod sieťou z polyoxyetylénu) je naviazaná hydrofóbna C 8 fáza, ktorá princípom RP zadržiava malé málo polárne analyty.

7 Analytické metódy 112 Analyt Proteíny Polyoxyetylén hydrofilný vonkajší povrch Silikagél C 8 hydrofóbny vnútorný povrch Obr. 7-23 Materiál so semipermeabilným povrchom Aj pri materiáloch s hydrofóbnym vnútorným povrchom (obr. 7-24) základ sorbentu tvorí silikagél (častice veľkosti 5 μm, veľkosť pórov 8 nm). Proteín Analyt Hydrofóbny vnútorný priestor, retencia malých molekúl Hydrofilný vonkajší povrch, glycín, biokompatibilný Obr. 7-24 Materiál s hydrofóbnym vnútorným povrchom Vo vnútri pórov je naviazaný glycyl-l-fenylalanyl-l-fenylalanín, ktorý v štruktúre obsahuje hydrofóbnu časť, a to fenyl. Táto hydrofóbna časť molekuly interaguje RP mechanizmom s málo polárnymi malými časticami. Na separáciu sa používa mobilná fáza s hodnotu ph v alkalickej oblasti, kde -COOH z aminokyseliny disociuje za vzniku COO -, ktorý plní funkciu katexu. Princíp separácie je teda kombinácia rozdeľovacej a ionexovej chromatografie. Na povrchu častíc je naviazaný glycín, ktorý je hydrofilný, a preto na povrchu nedochádza k denaturácii proteínov. Životnosť RAM vypočítaná na celkový objem nadávkovaného séra je 50 až 100 ml bez zmeny separačnej účinnosti systému. Na takýchto sorbentoch nedochádza k denaturácii proteínov, proteíny eluujú z kolóny v mŕtvom čase (alebo jemu blízkom). Plynová chromatografia (GC) Plynová chromatografia sa používa na separáciu a stanovenie alkoholu a prchavých látok (acetón) v krvi a moči, na separáciu lipidov, steroidov, hormónov, liečiv a ich metabolitov v krvi. GC-MS sa využíva predovšetkým v toxikológii. Výhodou je citlivosť, veľká rýchlosť odozvy a selektivita analýzy.

7 Analytické metódy 113 7.4 Elektroforetické metódy Elektroforetické metódy umožňujú separáciu nabitých častíc na základe rozdielnej pohyblivosti zložiek v jednosmernom elektrickom poli. Pohyblivosť nabitých častíc závisí od vlastností samotných častíc (celkový náboj, veľkosť a tvar molekúl), vlastností prostredia (typ elektrolytu, koncentrácia, iónová sila, ph), vlastností nosiča alebo kapiláry (gél, sorbent, povrch kapiláry) a vlastností elektrického poľa (intenzita, stabilita, homogenita). Na účinnosť elektroforetickej separácie v elektrolytoch má nepriaznivý vplyv pohyb zložiek konvekciou a tiež tepelný pohyb vznikajúci v dôsledku zahrievania elektrolytu prechodom elektrického prúdu. Preto sa elektroforetické separácie realizujú v tzv. antikonvektívnych prostrediach, ako je polyakrylamidový alebo agarózový gél vo forme tenkej vrstvy (plošná elektroforéza). Aj keď je to jedna z najrozšírenejších separačných techník, plošná elektroforéza má niektoré nevýhody ako dlhý čas separácie, malá účinnosť separácie, problémy s detekciou a automatizáciou. Uvedené nevýhody odstránilo zavedenie kapilár, ktoré sú samy osebe antikonvektívne. Na elektroforetickú separáciu v kapilárach možno použiť len čistý elektrolyt alebo gél. Výhodou kapilárnych techník je kratší čas analýzy, vyššia účinnosť, lepšie rozlíšenie a on-line detekcia rozdelených zložiek, napr. UV/VIS, vodivostným, fluorescenčným detektorom alebo MS. Podľa experimentálneho usporiadania možno elektroforetické techniky rozdeliť na: zónovú elektroforézu, izoelektrickú fokusáciu, izotachoforézu, gélovú elektroforézu a micelárnu elektrokinetickú chromatografiu. V kapilárach sa bežne realizujú všetky elektroforetické techniky, v plošnom usporiadaní sa vykonáva predovšetkým zónová a gélová elektroforéza a izoelektrická fokusácia. 7.4.1 Elektroforéza v plošnom usporiadaní V klinickej biochémii sa intenzívne využíva predovšetkým elektroforéza v plošnom usporiadaní na acetylcelulózových fóliách, na agarovom, agarózovom alebo polyakrylamidovom géli, ktoré sú nanesené na sklenej platničke. Využíva sa hlavne na analýzu bielkovín v sére a v moči. Pre niektoré klinické stavy sa získavajú charakteristické elektroforeogramy séra (znížená koncentrácia albumínu s polyklonálnym zmnožením imunoglobulínov pri cirhóze pečene, znížená frakcia albumínu so zvýšenou frakciou α 2 -globulínov u nefrotického syndrómu a iné). Na spresnenie diagnózy sa patologický nález z elektroforézy ďalej doplní imunochemickým stanovením. Elektroforéza v plošnom usporiadaní sa vykonáva v elektroforetických zariadeniach pozostávajúcich z držiaka na platničky pre vertikálne alebo horizontálne usporiadané gély, vyvíjacej komory, platničky s gélom (rozmerov cm cm mm) a zdroja s regulovaným výstupným napätím a prúdom (napr. 0-250 V, 0-100 ma). Vzorka sa nanáša do jamiek kapilárou alebo mikrostriekačkou. Na obr. 7-25 je znázornená platnička so šiestimi jamkami na nanesenie vzorky. Do jamiek pri okraji gélu sa naniesli roztoky štandardov (1. a 6. jamka), do ostatných jamiek vzorky (3,4,5). Z obrázka je zrejmé, že vzorka v 5. jamke mala rovnaké zloženie ako štandard v prvej jamke. Na vyhodnotenie vyfarbených elektroforeogramov sa používa denzitometria.

7 Analytické metódy 114 elektrolyt jamky pre vzorky katóda zdroj plastový držiak anóda gél elektrolyt Obr. 7-25 Elektroforéza s horizontálne uloženým gélom Elektroforéza na acetylcelulózových fóliách Ak sa ako nosič elektrolytu použije acetylcelulózová fólia, elektroforetická separácia je založená na rozdieloch vo veľkosti elektrického náboja. Sérové bielkoviny sa na acetylcelulóze rozdelia na 5-6 frakcií (obr. 7-26). Zvýšené α 2 -globulíny Albumín Elektroforeogram sérových bielkovín Štart α 1 α 2 β γ Normálne sérum α 1 α 2 β γ Záznam z denzitometra Albumín α 1 α 2 β γ Obr. 7-26 Separácia troch vzoriek sérových bielkovín plošnou elektroforézou a záznamy z denzitometra

7 Analytické metódy 115 Na separáciu sa používa potenciál 10-30 V/cm, intenzita prúdu 0,3 až 0,5 ma/cm a doba potrebná na dosiahnutie separácie je 15-30 min. Po ukončení elektroforézy sa bielkoviny fixujú napr. kyselinou trichlóroctovou, alebo octovou. Potom sa elektroforeogram vyfarbí. Farbiace činidlo sa volí podľa druhu analytov. Na vyfarbenie bielkovín sa používa Ponceu S (červené sfarbenie), amidočerň 10 B (modré) a Coomasie blue G 250 (modré), na vyfarbenie lipoproteínov Sudan čerň (modročervené) alebo Nigrosin (čierne). Pri stanovení bielkovín v likvore sa na vyfarbenie používa koloidné striebro alebo zlato, čím sa dosiahne veľmi citlivá detekcia. Na odfarbenie pozadia sa používa kyselina octová alebo zmes metanolu a kyseliny octovej. Doštička sa potom spriesvitní v zmesi metanol - ľadová kyselina octová a vysuší. Elektroforeogram sa vyhodnocuje denzitometricky. Elektroforéza na acetycelulózových fóliách sa využíva na separáciu bielkovín v sére, moči, mozgovomiechovom moku a extraktoch z tkanív, na delenie lipoproteínov, izoenzýmov a pod. Čas potrebný na analýzu sa všeobecne pohybuje od 15 min do 2 h. Elektroforéza na agarovom alebo agarózovom géli Agar je zmes dvoch polysacharidov (agarózy a agaropektínu) obsiahnutých v morských riasach. Je to porézny nosič, ktorý umožňuje elektroforetickú migráciu vysokomolekulových látok s M r okolo 6 000 000. Jeho nevýhodou je vplyv elektroosmózy, ktorá spôsobuje tok tlmivého roztoku smerom ku katóde. Tým je znížená rýchlosť migrácie častíc k anóde a v niektorých prípadoch (β2- a γ-globulínov) k ich spätnému pohybu. β2- a γ-globulíny sa potom pohybujú ku katóde na rozdiel od ostatných bielkovín, ktoré sa pri ph 8,6 pohybujú ku anóde. Agaróza je polysacharid pripravený z agaru po odstránení agaropektínu. Výhodou je, že u agarózy sa elektroosmóza uplatňuje len minimálne. Používa sa potenciál 10-20 V/cm, čas potrebný na separáciu je od 30 min do 2 h. Normálne ľudské sérové bielkoviny sa delia na agare na 5-6 frakcií a na agaróze až na 6-7 frakcií. Patologické stavy sa môžu prejaviť prítomnosťou ďalších frakcií. Využíva sa na separáciu bielkovín v sére a v moči predovšetkým v screeningových metódach. V takomto prípade sa na sklenú platničku s gélom nanesie pre kontrolu vzorka séra zdravých jedincov a tiež vzorky séra pacientov. Po skončení separácie sa získané elektroforeogramy vizuálne porovnajú a u zistených patologických vzoriek sa následne vykoná imunochemická analýza. Elektroforéza na polyakrylamidovom géli (PAGE) Ak sa použije ako nosič elektrolytu polyakrylamidový gél, separácia prebieha nielen podľa veľkosti elektrického náboja, ale aj podľa M r. Hustota použitého gélu rozhoduje o tom, ktorý separačný princíp bude prevažovať. Gély s malou hustotou majú veľké póry a zložky sa na nich separujú predovšetkým podľa veľkosti elektrického náboja. Naopak, u koncentrovaných gélov prevláda delenie podľa M r. Metóda sa používa na separáciu bielkovín krvného séra, ktoré sa takto rozdelia na 25 až 30 frakcií.

7 Analytické metódy 116 PAGE sa využíva nielen v jednorozmernom, ale tiež v dvojozmernom usporiadaní, kde sa obvykle na separáciu v prvom smere použije agaróza a až v druhom smere (kolmom na prvý smer) sa použije PAGE. Používa sa tiež v takom dvojrozmernom usporiadaní, kde sa v prvom smere použije IEF (obr. 7-27). agaróza (IEF) PAGE Obr. 7-27 Dvojrozmerná IEF-PAGE Elektroforéza na polyakrylamidovom géli v prostredí dodecylsulfátu sodného (SDS-PAGE) V tomto prípade sa elektroforéza vykonáva na platniach s vrstvou polyakrylamidového gélu v elektrolyte, ktorý obsahuje prídavok SDS. SDS-PAGE sa používa na separáciu zmesi bielkovín. V prostredí SDS majú všetky bielkoviny približne rovnaký elektrický náboj, a preto sa pri separácii na polyakrylamidovom géli delia na základe rozdielnej M r. Metódu je takto možné použiť aj na určenie M r porovnaním pohyblivosti analyzovaných zložiek s pohyblivosťou štandardov bielkovín so známou M r. Výhodou PAGE je vysoké rozlíšenie a ostrosť separovaných zón. Ak sa použije konštantná koncentrácia gélu, sérové bielkoviny sa delia na 25-30 frakcií, ale ak sa použije gradient koncentrácie gélu, možno rozdeliť až 60 frakcií. Výhodou je tiež možnosť separácie buď na základe elektrického náboja, alebo podľa veľkosti molekúl v géloch rôznej koncentrácie. PAGE sa v klinickej biochémii využíva na podrobnejšie delenie bielkovinových frakcií v biologických tekutinách s nízkym obsahom bielkovín (likvor, moč), na separáciu tkanivových bielkovín, apolipoproteínov, polysacharidov, izoenzýmov, nukleových kyselín a iných. Na rutinnú analýzu bielkovín nie je veľmi vhodná, pretože poskytuje priveľa informácií, čo komplikuje vyhodnotenie elektroforeogramov. Izoelektrická fokusácia (IEF) a IEF-SDS-PAGE V IEF sa ako nosič používa agarózový alebo polyakrylamidový gél, ktorý sa zmieša so špeciálnou zmesou amfolytov (obr. 7-28) s požadovaným intervalom gradientu ph. Stabilný gradient ph možno dosiahnuť použitím špeciálnych nízkomolekulových oligomérov (M r 300 až 600) obsahujúcich alifatické karboxylové skupiny a aminoskupiny, ktorých pi sa pohybuje vo vhodnom intervale, najčastejšie sa používa interval pi 3-10. CH 2 N (CH 2 )n N CH 2 (CH 2 )n NR 2 n = 2 alebo 3 R = H alebo (CH 2 )n-cooh Obr. 7-28 Všeobecný vzorec amfolytov používaných v IEF

7 Analytické metódy 117 Vplyvom elektrického poľa sa zmes týchto zložiek rozdelí podľa pi tak, že najkyslejšie sa nachádzajú pri anóde a smerom ku katóde sa rozmiestňujú postupne stále zásaditejšie molekuly amfolytov. Princípom metódy je delenie látok v jednosmernom elektrickom poli v gradiente ph na základe ich rozdielneho izoelektrického bodu. Na platničku sa okrem vzorky nanášajú aj štandardy so známym izoelektrickým bodom. IEF sa v klinickej biochémii využíva na podrobnejšiu analýzu bielkovín v tkanivách a biologických tekutinách, na separáciu izoenzýmov (AMS, ALP a CK), na stanovenie glykovaného hemoglobínu, na podrobné určenie frakcií imunoglobulínov, na určenie izoelektrického bodu separovaných látok, ale aj na preparatívne účely (bielkoviny). Výhodná je kombinácia IEF s SDS-PAGE. Látky sa IEF najskôr separujú na základe rozdielnych izoelektrických bodov. Po ukončení prvej separácie sa vykoná elektroforéza na polyakrylamidovom géli s rozpusteným SDS v smere kolmom na smer IEF. Zložky sa pri metóde SDS- PAGE separujú na základe veľkosti molekúl a M r. Táto kombinácia umožňuje rozdeliť bielkoviny odlišujúce sa v poradí len niekoľkých aminokyselín v reťazci. Poskytuje tiež informácie o zmenách v zložení bielkovín v jednotlivých bunkách. Afinitná elektroforéza Afinitná elektroforéza využíva rovnaký princíp ako afinitná chromatografia. Na nosič, ktorým je napr. polyakrylamidový gél sa naviaže vhodný ligand, ktorý špecificky reaguje s analytom (zvyčajne špecifická bielkovina). Vznikne komplex ligand-špecifická bielkovina, ktorého elektroforetický pohyb je zbrzďovaný. Ostatné bielkoviny sa pohybujú normálnou elektroforetickou rýchlosťou. Súčasne sa zrealizuje analýza vzorky na čistom polyakrylamidovom géli (kontrola). Porovnaním kontrolného elektroforeogramu a elektroforeogramu s ligandom sa zistí, ktorá bielkovina má afinitu k danému ligandu (obr. 7-29). Afinitná elektroforéza je špeciálna technika, ktorá sa využíva na rôzne kvalitatívne účely, napr. na kontrolu čistoty imunochemických materiálov (antiséra, antigény) a enzýmových prípravkov. štart B A Separácia na PAGE (kontrola) A B C D Separácia na PAGE s naviazaným ligandom proti zložke B C D Obr. 7-29 Separácia zložiek A,B,C a D metódou PAGE a afinitnou elektroforézou na PAGE naviazaným ligandom proti zložke B

7 Analytické metódy 118 7.4.2 Kapilárne elektroforetické metódy Všetky kapilárne elektroforetické metódy možno zrealizovať v zariadení uvedenom na obr. 7-30. Kapilárna zónová elektroforéza (CZE) Pod označením CZE sa uvádza metóda, v ktorej sa separačná kapilára, anódový aj katódový priestor naplnia jednoduchým tlmivým roztokom - elektrolytom. Kapilára Detektor Elektrolyt Zdroj napätia Vzorka Obr. 7-30 Schéma zariadenia na kapilárnu elektroforézu V CZE sa ióny separujú na základe rozdielnej rýchlosti migrácie spôsobenej rozdielmi v ich pomeroch hmotnosti a náboja v prostredí vhodného základného elektrolytu nachádzajúceho sa napr. v kremennej kapiláre. Za normálnych podmienok (t.j., povrch kapiláry je nabitý záporne) elektroosmotický tok smeruje ku katóde a súčasne rýchlosť elektroosmotického toku (v EOF) je podstatne vyššia ako elektroforetické rýchlosti iónov (katiónov aj aniónov). Výsledná rýchlosť pohybu je vektorovým súčtom rýchlosti elektroosmotickej a elektroforetickej. Z toho vyplýva, že výsledný pohyb katiónov, aniónov aj neutrálnych zložiek bude smerovať ku katóde. Tento proces je znázornený na obr. 7-31. Katióny sa pohybujú rýchlejšie, pretože ich vlastná elektroforetická rýchlosť aj rýchlosť elektroosmotického toku (v EOF) smerujú ku katóde, neutrálne zložky sa pohybujú smerom ku katóde rýchlosťou elektroosmotického toku, avšak nie sú rozdelené. Anióny sa pohybujú tiež ku katóde, ale pomalšie, pretože sú priťahované anódou (ich elektroforetická rýchlosť smeruje k anóde). Takto možno v jednom experimente rozdeliť súčasne katióny aj anióny, pričom neutrálne zložky zostanú nerozdelené.

7 Analytické metódy 119 Detektor + + + + + + + + + + + + + + + + ++ + v EOF + + + + + + + + + + + + + + + + + + ++ + Vzorka E Elektrolyt E t = 0 Elektrolyt (E) E E E t > 0 Obr. 7-31 Schéma separácie kapilárnou zónovou elektroforézou Kapilárna gélová elektroforéza (CGE) CGE sa využíva predovšetkým v biochémii na separáciu makromolekúl ako sú proteíny a nukleové kyseliny na základe ich rozdielnej veľkosti. Separácia na základe veľkosti iónov sa dosahuje elektroforézou vzorky vo vhodnom géli (polyakrylamid), ktorý pôsobí ako molekulové sito (obr. 7-32). Nabité častice migrujú cez polymérnu sieť, kde sú zbrzďované, pričom väčšie ióny sú zbrzďované viac ako menšie ióny. Vzorka Detektor Elektrolyt a gél E t = 0 Elektrolyt (E) E E t > 0 Obr. 7-32 Schéma separácie kapilárnou gélovou elektroforézou

7 Analytické metódy 120 Okrem funkcie molekulového sita sú gély významné aj tým, že minimalizujú konvekciu, elektroosmózu, difúziu a adsorpciu roztoku. CGE možno porovnať s gélovou elektroforézou na tenkých vrstvách, pretože mechanizmus separácie je rovnaký. Kapilárna technika má niektoré výhody: umožňuje použiť 10 až 100-krát vyššiu intenzitu elektrického poľa, on-line detekciu a automatizáciu. Použitie metódy je obmedzené len na separáciu iónov, pretože neutrálne molekuly nemigrujú cez gél, keďže v CGE nedochádza k elektroosmotickému toku. Kapilárna izoelektrická fokusácia (CIEF) CIEF (obr. 7-33) sa používa na separáciu amfotérnych látok (aminokyselín, proteínov) na základe rozdielnych pi hodnôt. Anódový priestor sa naplní (t = 0) kyslým roztokom, katódový priestor sa naplní alkalickým roztokom a vzorka sa nadávkuje do kapiláry spolu s elektrolytom (miesto dávkovania vzorky v podstate nie je dôležité). Ako elektrolyt sa používa zmes amfolytov (často ide o polyamino-polykarboxylové kyseliny, obr. 7-28), ktoré majú pi hodnoty v rozsahu intervalu ph potrebného na separáciu (napr. 4-10). Detektor H 3 PO 4 Amfolyt + vzorka (A, B, C) NaOH t = 0 H + A B C OH - t > 0 4 5 6 7 8 9 10 ph gradient tlak C A B Detekcia Obr. 7-33 Kapilárna izoelektrická fokusácia - schéma separácie troch zložiek A,B a C s izoelektrickými bodmi pi 6, 7 a 8 Po zapnutí elektrického poľa sa pozdĺž kapiláry sformuje gradient ph (t > 0), pričom najnižšie ph je pri anóde a najvyššie pri katóde. Každá zložka (nabitý amfolyt aj nabitý proteín) bude migrovať smerom k miestu, kde ph elektrolytu sa rovná jej pi hodnote. Napr. ak sa proteín nachádza na mieste, kde je ph elektrolytu vyššie ako jeho pi hodnota, proteín získa záporný náboj, pohybuje sa smerom k anóde, teda v smere klesajúceho ph až dosiahne také miesto, kde sa ph elektrolytu rovná jeho pi hodnote. V tomto mieste bude výsledný náboj proteínu rovný nule a teda aj jeho elektroforetická rýchlosť bude nulová. Tento proces sa nazýva fokusácia.

7 Analytické metódy 121 Zóny proteínov zostávajú úzke, pretože ak proteín vojde do susednej zóny, kde je už iné ph, získa tu náboj a vráti sa späť do svojej vlastnej zóny. Dosiahnutie ustáleného stavu sa prejaví navonok poklesom elektrického prúdu na nulu. Sfokusované zóny sa potom vhodným spôsobom posunú cez detektor (použitím tlaku alebo pridaním soli do jednej z elektródových nádobiek). CIEF možno použiť na separáciu proteínov, ktorých pi hodnoty sa odlišujú aspoň o 0,004 pi jednotky. Využitie CE v klinickej analýze Prvá oblasť využitia CE je v separácii a stanovení malých organických molekúl a anorganických iónov pre screeningové, súdne účely alebo v terapeutickom monitorovaní liečiv. V analýze zabavených drog sa využíva predovšetkým CZE ako alternatíva k tradične používanej metóde GC-MS. Spojenie CZE s MS detekciou je výhodné na analýzu predovšetkým takých zložiek, ktoré je problém analyzovať metódou GC-MS (ópiové alkaloidy, benzodiazepíny a LSD). CZE je vhodná na stanovenie liečiv a ich metabolitov, na stanovenie niektorých malých endogénnych molekúl a iónov v biologických vzorkách. Analýza vzoriek obsahujúcich proteíny vyžaduje úpravu vzorky (odstránenie proteínov denaturáciou alebo ultrafiltráciou, prekoncentrovanie extrakciou a iné). Druhá oblasť využitia je separácia biomolekúl (peptidov, proteínov a DNA fragmentov). V CE sa tieto zložky správajú rozdielne pokiaľ ide o separačnú účinnosť ako malé molekuly. Biomolekuly sa líšia elektrickým nábojom, veľkosťou (M r ), tvarom (konformácia), hydrofobicitou a špecifickou väzbovou kapacitou. S ohľadom na tieto vlastnosti možno biomolekuly separovať na základe rozdielov v: elektroforetickej pohyblivosti (CZE), veľkosti (CGE), náboji (CIEF) a špecifickej interakcii s inými biomolekulami (bioafinitná elektroforéza, napr. CZE s prídavkom komplexačného činidla). Na detekciu proteínov sa využíva meranie absorbancie pri 254 a 280 nm (aromatická časť biomolekuly) alebo v intervale 200-220 nm (peptidická časť). Podobne ako v kvapalinovej chromatografii, selektivita UV detekcie nie je dostatočná, preto sa často používa fluorescenčná detekcia po derivatizácii s fluorescenčným činidlom. Zatiaľ čo laserom-indukovaná fluorescencia (LIF) je najcitlivejšia metóda detekcie, MS poskytuje najviac informácií. V CIEF sa používa ako detekcia aj chemiluminiscencia, v CZE možno myoglobín detegovať amperometricky. Elektroforeogram normálneho séra získaný CE obsahuje šesť frakcií: albumín, α1-globulín, α2- globulín, β1-globulín, β2-globulín a γ-globulín (obr. 7-34). Z variability v pomere frakcií týchto proteínov možno usudzovať na zdravotný stav, najvýznamnejšie z diagnostického hľadiska sú však zmeny v oblasti β- a γ-globulínov. Účinnosť separácie proteínov v sére metódou CZE je lepšia v porovnaní s elektroforézou na acetylcelulóze alebo agaróze, aj rozlíšenie je lepšie. Na elektroforeogramoch z CZE možno v oblasti β- globulínov vidieť dva alebo viac píkov (hemopexin, transferín a komplement). Schopnosť CE a agarózovej plošnej elektroforézy diskriminovať medzi rôznymi chorobnými stavmi je podobná (96 % zhoda sa dosiahla v diskriminácii rôznych chorobných stavov ako hypogamaglobulinémia, akútny a chronický zápal, cyrhóza, poly- a monoklonálna gamapatia).

7 Analytické metódy 122 Normálne sérum Albumín α 1 α 2 β γ Prealbumím Albumín α 1 -kyslý glykoproteín α 1 -antitrypsín Haptoglobín α 2 -makroglobulín γ-globulíny Komplement Transferín-Hemopexín LDL (β-lipoproteín) Monoklonálna gammapatia zvýšný γ-globulín Reaktanty akútnej fázy zvýšený α 1 -, α 2 -, znížený albumín Albumín α 1 α 2 β γ Albumín α 1 α 2 β γ Obr. 7-34 Elektroforeogramy normálneho séra a séra pacientov získané CZE CE možno využiť aj na separáciu proteínov v moči (zvýšené vylučovanie proteínov močom, Bence-Jones proteínuria) a mozgovomiechovom moku (neurologické ochorenia), na analýzu variantov hemoglobínu, lipoproteínových frakcií. Tretia oblasť využitia je v separácii nukleových kyselín. Makromolekuly ako sú DNA nie možno separovať v jednoduchom elektrolyte bez prídavku gélu, pretože majú rovnaký pomer hmotnosti a náboja, ktorý sa nemení s veľkosťou makromolekuly. Napr. v DNA, každý ďalší nukleotid prinesie do DNA reťazca rovnakú časť hmotnosti a náboja a neovplyvní pohyblivosť makromolekuly (iónu) v elektrolyte. Na ich separáciu sa preto využíva CGE založená na separácii podľa veľkosti. Ako gély sa používajú polyakrylamid, dimetylakrylamid, kvapalné

7 Analytické metódy 123 kryštály a iné. Technika sa využíva v sekvenovaní DNA, vyhľadávaní mutácií DNA, detekcii vírusových ochorení (HIV, hepatitídy C). Aj keď CE poskytuje rôzne možnosti riešenia klinických problémov, v rutinnej praxi zatiaľ technika nemá väčšie uplatnenie s výnimkou molekulárnej diagnostiky. Jedným z dôvodov, okrem vysokej ceny zariadenia, môžu byť vyššie nároky na kvalifikáciu a skúsenosti personálu. 7.5 Základy enzýmovej analytiky Enzýmy sú makromolekulové bielkovinové katalyzátory biologického pôvodu (biokatalyzátory), ktoré umožňujú priebeh mnohých zložitých biochemických reakcií v živých organizmoch pri fyziologických podmienkach. V štruktúre enzýmu je časť molekuly aktívne centrum enzýmu nevyhnutná pre aktivitu enzýmu. Niektoré enzýmy majú aj nebielkovinovú súčasť koenzým, ktorý sa zvyčajne viaže v blízkosti aktívneho centra enzýmu a tiež sa zúčastňuje enzýmovej reakcie. Látka, ktorej premenu enzým katalyzuje sa nazýva substrát. Enzýmy sa podľa spôsobu ich účinku delia do šiestich tried na oxidoreduktázy (EC 1), transferázy (EC 2), hydrolázy (EC 3), lyázy (EC 4), isomerázy (EC 5) a ligázy (EC 6) (EC, Enzyme Comission of the International Union of Biochemistry). Tieto hlavné triedy sa delia na ďalšie podskupiny. Pri enzýmovej reakcii sa substrát S viaže na aktívne centrum enzýmu E, pričom vzniká komplex ES, vzniknutý produkt P sa uvoľní a na uvoľnené aktívne centrum enzýmu sa naviaže ďalšia molekula substrátu (obr. 7-35). E ES E S E + S ES E + P P Obr. 7-35 Schéma enzýmovej reakcie V bunkách zdravého jedinca je aktivita enzýmov udržiavaná na takmer konštantnej hodnote, pričom len malé množstvo enzýmu prechádza bunkovou membránou a možno ho stanoviť v krvnej plazme. Niektoré chorobné stavy sú sprevádzané zvýšeným transportom enzýmov cez bunkovú membránu, preto stanovenie aktivity enzýmov v plazme/sére umožňuje zistenie ochorenia, spresnenie diagnózy a navrhnutie vhodnej terapie. Pre interpretáciu výsledkov stanovenia enzýmov sa preto uprednostňuje určenie ich katalytickej aktivity pred stanovením koncentrácie. Podľa SI je jednotkou katalytickej aktivity enzýmu mol/s. Katalytickú aktivitu 1 mol/s má také množstvo enzýmu, ktoré rozloží 1 mol enzýmového substrátu za čas 1 s za definovaných reakčných podmienok (druh a koncentrácia substrátu, teplota, druh, koncentrácia a ph tlmivého roztoku, prípadne ďalšie látky prítomné v inkubačnej zmesi). Táto jednotka, mol/s, má aj zaužívaný názov katal (kat), teda mol/s = kat. Z praktických dôvodov sa aktivita

7 Analytické metódy 124 väčšinou vyjadruje v μkat = μmol/s alebo v nkat = nmol/s. Používa sa tiež jednotka U (International Enzyme Unit, IU). Katalytickú aktivitu 1 U má také množstvo enzýmu, ktoré rozloží za jednu minútu 1 μmol enzýmového substrátu za daných podmienok. Prepočet jednotiek je: 1U = 1μmol/min = 16,67 nmol/s = 16,67 nkat. Katalytická koncentrácia enzýmu sa vyjadruje -1-1 -1-1 -1-1 ako jeho katalytická aktivita vztiahnutá na objem/hmotnosť vzorky, kat l = mol l s, U/l (μkat l = μmol l s ). Výrobcovia enzýmov používajú pre enzýmy v tuhom stave jednotku kat/mg alebo U/mg. Okrem toho sa používajú aj iné jednotky zavedené pôvodnými autormi, takže niekedy je vzájomný prepočet údajov prakticky nerealizovateľný. V imunodiagnostike sa stanovuje hmotnosť enzýmov (mass concentration) a ich hmotnostná koncentrácia sa vyjadruje zvyčajne ako proteíny v g/l alebo v μg/ml. Dôležité je, že biokatalyzátory sú aktívne aj in vitro, čo umožňuje využiť enzýmy aj v analytickej chémii. Z analytického hľadiska je významná selektivita katalytického účinku enzýmov, ktorá sa prejavuje tým, že v prítomnosti enzýmu prebieha len jediná reakcia substrátu. Jej rýchlosť je v prítomnosti enzýmu tak zvýšená, že rušivé vplyvy vedľajších termodynamicky možných (pomalších) reakcií sa vôbec neprejavia. Reakciu katalyzovanú enzýmom možno využiť na stanovenie všetkých zložiek, ktoré sa tejto reakcie zúčastňujú. V klinickej analýze sa tieto reakcie využívajú jednak na stanovenie enzýmov ako analytov (stanovenie katalytickej aktivity enzýmov), ale tiež na stanovenie substrátov s enzýmami ako analytickými činidlami. Stanovenie enzýmovými metódami sa vykonáva sledovaním priebehu enzýmovej reakcie: o Rovnovážnymi metódami stanovenie úbytku substrátu alebo prírastku produktu po dosiahnutí rovnováhy enzýmovej reakcie. Rovnovážnymi metódami možno stanoviť len substráty. Katalytický účinok enzýmu neovplyvňuje rovnováhu reakcie, len jej rýchlosť. Celkové množstvo premeneného substrátu alebo vzniknutého produktu nezávisí od enzýmu (kofaktora, aktivátora, inhibítora). Ustálenie rovnováhy možno urýchliť použitím malého množstva substrátu a naopak veľkého množstva enzýmu. o Kinetickými metódami z rýchlosti enzýmovej reakcie, ktorá závisí od koncentrácie substrátu, enzýmu, kofaktora, aktivátora, inhibítora. Metódy založené na meraní reakčnej rýchlosti sa môžu použiť na stanovenie všetkých zložiek enzýmovej reakcie. Kinetické metódy sú rýchlejšie ako metódy rovnovážne, preto sa niekedy používajú aj na stanovenie substrátov. Na stanovenie aktivátorov, kofaktorov a aktivity enzýmov je kinetická metóda jediná použiteľná metóda. Rýchlosť katalytickej reakcie je zvyčajne úmerná koncentrácii katalyzátora, a to aj v prípadoch, keď nie je známy mechanizmus katalýzy, ani príslušné kinetické rovnice.

7 Analytické metódy 125 7.5.1 Stanovenie katalytickej aktivity enzýmov Stanovenie katalytickej aktivity enzýmu je založené na meraní rýchlosti, akou enzým katalyzuje premenu špecifického substrátu na produkt. Túto premenu možno sledovať buď meraním poklesu koncentrácie substrátu, alebo meraním prírastku koncentrácie produktu reakcie. Enzýmové stanovenia sú dostatočne špecifické za predpokladu, že na substrát pôsobí v danom prostredí len jeden enzým. Sú aj dostatočne citlivé a spoľahlivé, ak sa zvolí vysoká koncentrácia substrátu vzhľadom na koncentráciu enzýmu a tiež vhodná metóda stanovenia rýchlosti premeny substrátu na produkt. Pretože na katalytickú aktivitu enzýmov vplývajú rôzne faktory (druh a koncentrácia substrátu, teplota, druh, koncentrácia a ph tlmivého roztoku, prípadne ďalšie látky prítomné v inkubačnej zmesi), každé stanovenie je potrebné vykonať za presne definovaných podmienok. IUB (International Union of Biochemistry and Molecular Biology) požaduje, aby sa stanovenie vykonávalo za optimálnych podmienok, avšak úplnú špecifikáciu podmienok neuvádza, čo vedie k niektorým problémom. Teplota Teplotný pracovný rozsah enzýmov siaha od teplôt okolo 0 o C až do teplôt vyšších ako 100 o C u enzýmov izolovaných z termofilných baktérií. Oblasť optimálnej tepelnej stability väčšiny enzýmov leží medzi 20-50 o C. S rastúcou teplotou rastie riziko denaturácie enzýmov. Odolnosť proti denaturácii sa zvýši ukotvením enzýmov na nosič alebo biotechnologickými a genetickými zásahmi. Pri určovaní katalytickej koncentrácie enzýmov referenčnými metódami IFCC je potrebné udržiavať teplotu so zhodou lepšou než 0,1 o C. Pri rutinnej analýze by sa teplotné podmienky pri meraní mali týmto limitom približovať. Aj keď všeobecne vládne zhoda v tom, s akou odchýlkou má byť teplota pri práci s enzýmami udržiavaná, s teplotou samotnou je to o niečo zložitejšie. Obvykle nie možno pracovať pri teplote, pri ktorej je katalytická účinnosť najvyššia, pretože pri týchto teplotách sa už výrazne prejavuje denaturácia. Pokusy dohodnúť sa na normovanej teplote nepriniesli jednoznačný záver. Z tradičných dôvodov mnohé klinické laboratóriá uprednostňujú 37 o C. IFCC navrhuje teplotu 30 o C (pri použití bodu topenia čistého gália 29,77 o C ako referenčnej teploty). V súčasnej dobe sa v Európe uprednostňuje teplota 37 o C. V klinickej chémii je voľba teploty a jej dodržiavanie veľmi dôležité. Inak nie možno vzájomne porovnávať výsledky. Tlmivé roztoky Všetky enzýmy vykazujú optimálnu aktivitu pri určitom optimálnom ph. Toto maximum býva niekedy veľmi úzke a všeobecne okrem koncentrácie iónov H + závisí aj od typu použitého tlmivého roztoku, iónovej sily a koncentrácie substrátu. Optimálna hodnota ph často zodpovedá ph telesnej tekutiny, v ktorej sa enzým nachádza. Na aktivitu enzýmu má vplyv aj typ použitého tlmivého roztoku. Výborne sa osvedčili Goodove tlmivé roztoky. Ide o skupinu látok, z ktorých väčšina patrí medzi amfolyty. V tlmivých roztokoch tohto typu sa všeobecne pozoruje vyššia

7 Analytické metódy 126 aktivita enzýmov než v tlmivých roztokoch iného typu. Pokrývajú prakticky celý pracovný rozsah enzýmov. V najdôležitejšej oblasti ph 6-9 je ich k dispozícii väčší počet, takže možno vybrať taký, v ktorom má enzým optimálnu aktivitu. Typ a koncentrácia substrátu Na stanovenie katalytickej aktivity enzýmov sa používajú syntetické substráty, pretože zvyčajne poskytujú vyššiu rýchlosť enzýmovej reakcie (enzým β-galaktozidáza hydrolyzuje syntetický substrát 2-nitrofenyl-β-galaktozid asi 70-krát rýchlejšie ako svoj prirodzený substrát laktózu). Výber substrátov býva najčastejšie obmedzený ich rozpustnosťou, ktorá neumožňuje úplnú optimalizáciu enzýmového stanovenia. Okrem typu substrátu je dôležitá aj jeho koncentrácia. Rýchlosť väčšiny enzýmových reakcií (pri konštantnej teplote, ph a koncentrácii enzýmu) s rastúcou koncentráciou substrátu do určitého bodu narastá a ďalej sa už nemení (obr. 7-36). v v max v max /2 reakcia 1. poriadku reakcia 0. poriadku Obr. 7-36 Závislosť reakčnej rýchlosti v enzýmovo katalyzovanej reakcie od koncentrácie substrátu [S] Koncentrácia enzýmu je konštantná, v max je maximálna rýchlosť reakcie, K M je Michaelisa-Mentenovej konštanta (pre S), reakcia 0. poriadku [S] 100 K M, reakcia 1. poriadku [S] < 0,1 K M K M [S] Matematickým zápisom funkcie uvedenej na obr. 7-36 je rovnica Michaelisa-Mentenovej: v = v max [S ] / (K M + [S]), kde v max je maximálna rýchlosť reakcie a K M je Michaelisa-Mentenovej konštanta (udáva koncentráciu [S], pri ktorej je v = v max /2). Pre [S] >> K M platí, že v = v max (prakticky pre [S] 100 K M ). Pri enzýmovej reakcii sa substrát viaže na aktívne centrum enzýmu, pričom vzniká komplex. Enzým je aktívny len vtedy, ak takýto komplex so substrátom vytvorí. Vzniknutý produkt sa uvoľní a na uvoľnené aktívne centrum enzýmu sa naviaže ďalšia molekula substrátu. Ak je koncentrácia substrátu nízka (obr. 7-37), enzým je obklopený len malým počtom molekúl substrátu a pravdepodobnosť, že sa substrát naviaže na enzým je nižšia ako v prípade vyššej koncentrácie substrátu. S rastúcou koncentráciou substrátu sa časový interval potrebný na to, aby ďalšia molekula substrátu dosiahla na uvoľnené aktívne centrum, postupne skracuje. Toto prebieha až dovtedy, kým enzým nie je obklopený takým množstvom substrátu, že substrát sa viaže na aktívne centrum enzýmu okamžite po tom, ako sa z aktívneho centra uvoľní produkt. V tomto okamihu nastane saturácia enzýmu substrátom (obr. 7-37), rýchlosť reakcie je maximálna a je daná len časom potrebným na zreagovanie substrátu na aktívnom centre. ES S ES Obr. 7-37 Vznik komplexu enzým-substrát ES pri nízkej a vysokej koncentrácii substrátu S

7 Analytické metódy 127 Ak je koncentrácia enzýmu konštantná a koncentrácia substrátu je malá, prebieha enzýmová reakcia podľa kinetiky prvého poriadku, teda rýchlosť reakcie rastie lineárne s rastúcou koncentráciou substrátu. Ak je koncentrácia substrátu dostatočne vysoká, reakcia prebieha podľa kinetiky nultého poriadku, teda konštantnou rýchlosťou, ktorá nezávisí od koncentrácie substrátu. Stanovenie katalytickej koncentrácie enzýmov je založené na kinetike nultého poriadku. Závislosť rýchlosti reakcie od koncentrácie substrátu pri rôznych koncentráciách enzýmu je uvedená na obr. 7-38. Z obrázka je zrejmé, že pri určitej koncentrácii substrátu rýchlosť reakcie už nie je ovplyvňovaná zmenou koncentrácie substrátu (nultý poriadok, saturácia enzýmu substrátom) a závisí lineárne od koncentrácie enzýmu. Lineárna závislosť rýchlosti reakcie od koncentrácie enzýmu umožňuje stanovenie enzýmov kinetickými metódami. v [S] [E 4 ] [E 3 ] [E 2 ] [E 1 ] nultý poriadok Obr. 7-38 Závislosť rýchlosti enzýmovej reakcie v od koncentrácie substrátu [S] pri rôznej koncentrácii enzýmu [E 1 ] < [E 2 ] < [E 3 ] < [E 4 ] Z rovnice Michaelisa-Mentenovej vyplýva, že pre maximálnu reakčnú rýchlosť je teoreticky potrebná nekonečná koncentrácia substrátu; v praxi sa vyžaduje, aby koncentrácia substrátu [S] 100 K M. Ale aj táto požiadavka je často ťažko splniteľná, napr. z dôvodu malej rozpustnosti substrátu, alebo inhibície substrátom. Pri stanovení aktivity enzýmov reakcia zvyčajne neprebieha za podmienok maximálnej rýchlosti, čo znamená, že rýchlosť reakcie sa s časom mení. Kinetiku nultého poriadku možno aplikovať aj pre takýto prípad, ale len vtedy, ak je splnený predpoklad, že východisková koncentrácia substrátu sa v priebehu reakcie príliš nemení (úbytok substrátu nemá byť väčší ako 10 % z pôvodnej koncentrácie). Takáto situácia nastane len v prvých minútach analýzy. V tomto prípade sa predpokladá kinetika nultého poriadku pre tzv. počiatočnú rýchlosť v 0, kedy sa považuje koncentrácia komplexu enzým-substrát za stálu. (Pri väčšom úbytku substrátu koncentrácia komplexu ES klesá, kinetika nultého poriadku prechádza do kinetiky prvého poriadku alebo vyšších poriadkov. Výsledkom je, že rýchlosť premeny substrátu na produkt závisí od poklesu koncentrácie substrátu a reakcia sa spomaľuje). Rýchlosť enzýmovej reakcie sa stanovuje priebežným meraním reakčnej rýchlosti a to tak, že sa kontinuálne sleduje prírastok produktu alebo úbytok substrátu. Obvykle sa meria zmena fyzikálno-chemických parametrov ako absorbancia, fluorescencia, ph a iné, ktoré sa vynesú do grafu oproti času (obr. 7-39). Smernica lineárnej časti tohto grafu je priamo úmerná reakčnej rýchlosti. Reakčná rýchlosť vzorky sa zistí porovnaním so smernicou získanou pre štandard. Na krivke závislosti meraného parametra (napr. absorbancie) od času je tzv. lag-fáza (fáza oneskorenia), alebo počiatočná fáza reakcie, zodpovedajúca neustálenému, nerovnovážnemu stavu, ktorý vzniká po zmiešaní komponentov reakcie (tepelná a kinetická nestabilita). Meranie sa preto vykonáva vždy až po prebehnutí tejto lag-fázy, v lineárnej oblasti.

7 Analytické metódy 128 Fotometre pre kinetické merania sú vybavené programom na kontrolu linearity a signalizujú odchýlky od časovo konštantnej zmeny absorbancie v rámci naprogramovanej regresie. Na výpočet sa použijú tie hodnoty, ktoré podmienku linearity (teda reakcie nultého poriadku) spĺňajú. A Lag Lineárna Fáza fáza fáza vyčerpania A c b a v=a/t 1 2 t/min t/min Obr. 7-39 Krivky enzýmovej reakcie 1/ Typická krivka enzýmovej reakcie s počiatočnou lag-fázou, lineárnou oblasťou zmeny meraného parametra (absorbancie) v závislosti od času a s fázou, kedy dochádza k vyčerpaniu substrátu 2/ Krivky závislosti meraného parametra (absorbancie) od času pre tri rôzne koncentrácie (aktivity) enzýmu. a nízka, b stredná, c najvyššia aktivita. Ak vzrastá aktivita enzýmu, lag-fáza klesá, lineárna oblasť sa skracuje a k vyčerpaniu substrátu dochádza vo veľmi krátkom čase Ak substrát a produkt nemajú vhodné indikačné vlastnosti, je potrebné zaradiť následné (pomocné) indikačné reakcie. Pomocné reakcie sa používajú aj v prípade nevýhodnej rovnovážnej koncentrácie. V tomto prípade sa použije taká pomocná reakcia, ktorá posúva rovnováhu enzýmovej reakcie v smere tvorby produktu (reakcia odčerpáva produkt). Spektrofotometrické metódy Mnohé kinetické merania enzýmových reakcií sú založené na sledovaní redukcie koenzýmu NAD +, ktorá prebieha podľa reakcie: NAD + + 2 e + H + NADH. Redukovaná forma koenzýmu NADH absorbuje UV žiarenie pri vlnovej dĺžke 340 nm, NAD + v tejto oblasti neabsorbuje (obr. 7-40). Stanovenie je založené na meraní prírastku absorbancie A pri 340 nm. Oxidačno-redukčných reakcií katalyzovaných enzýmami s koenzýmom NAD + /NADH je veľmi veľa a využívajú sa na stanovenie enzýmov (napr. LD, glutamátdehydrogenáza, kreatínkináza, ALT, AST) aj substrátov (laktát, glukóza, etanol a iné).

7 Analytické metódy 129 Stanovenie aktivity laktátdehydrogenázy (LD) Stanovenie aktivity LD je založené na reakcii: Laktát + NAD + LD pyruvát + NADH + H +. Absorpčné spektrum pre všetky zložky reakcie je uvedené na obr. 7-40. Laktát a pyruvát v uvedenej oblasti žiarenie neabsorbujú, pri vlnovej dĺžke 340 nm absorbuje len NADH. Postup: Na stanovenie aktivity LD sa v temperovanej kyvete zmieša laktát s NAD + a tlmivým roztokom a pridá sa vzorka séra. Meria sa zmena A pri vlnovej dĺžke 340 nm v časovom intervale asi 100 s. Reakcia nekatalyzovaná LD je extrémne pomalá, preto je prídavok LD jediný dôvod, prečo rastie koncentrácia NADH, a teda aj A. Rýchlosť prírastku absorbancie ΔA/Δt je priamo úmerná reakčnej rýchlosti Δc/Δt. Z tohto pomeru, ak sa zohľadní hodnota ε, možno vypočítať aktivitu LD (obr. 7-40). A 1,5 NAD + Laktát, pyruvát, NAD + a NADH ΔA/ε=Δc ΔA/(Δt ε)=δc/δt=v 1,0 NADH A 340 nm pridanie LD (séra) 3 nkat 2 nkat 0,5 0,0 NAD + laktát, pyruvát 240 280 320 360 400 vlnová dĺžka/nm laktát NAD + 0 Δt ΔA t/min 1 nkat 0 nkat Obr. 7-40 Stanovenie katalytickej aktivity laktátdehydrogenázy Fluorescenčné metódy Fluorescenčné metódy sú založené na tvorbe fluoreskujúcej zlúčeniny v priebehu enzýmovej reakcie a všeobecne majú nižšiu medzu stanovenia (LOD 10-12 mol/l) ako spektrofotometrické metódy (LOD 10-6 mol/l). Fluorescenčné metódy možno použiť napr. na sledovanie reakcií, v ktorých vystupuje koenzým NAD + /NADH, keďže NADH vykazuje v alkalickej oblasti intenzívnu fluorescenciu. Na stanovenie vyššie uvedenej LD je teda možné použiť aj fluorescenčnú metódu. Problémom u fluorescenčných metód je zhášanie fluorescencie absorbujúcimi molekulami, ale tiež interferencie zložiek vykazujúcich fluorescenciu v meranej oblasti.

7 Analytické metódy 130 7.5.2 Stanovenie substrátov Výhodou enzýmových metód stanovenia substrátov je špecifickosť a citlivosť tohto typu stanovení. Na stanovenie analytov, ktoré sú substrátom enzýmových reakcií, možno použiť metódy rovnovážne aj metódy kinetické. Stanovenie substrátov kinetickými metódami vyžaduje úpravu reakčných podmienok tak, aby reakcia prebiehala podľa kinetiky prvého poriadku. Len v prípade použitia end-point metódy (prebehnutie reakcie do konca, do úplného zreagovania substrátu), nie je bezpodmienečne nutná reakcia prvého poriadku. Stanovenie kinetickými metódami je založené na platnosti rovnice: V = v max [S] / (K M + [S]). Graficky je závislosť rýchlosti reakcie od koncentrácie substrátu pri konštantnej koncentrácii enzýmu znázornená na obr. 7-36. Ak pre koncentráciu substrátu platí, že: potom: [S] < 0,1 K, M v = v max [S] / (K M ), teda rýchlosť v je pri konštantnej koncentrácii enzýmu priamo úmerná koncentrácii substrátu. Z toho vyplýva, že množstvo substrátu možno merať kinetickou metódou len pri jeho nízkej koncentrácii. Pri vyššej koncentrácii dochádza k saturácii enzýmu a rýchlosť reakcie sa so zmenou koncentrácie substrátu nemení. Stanovenie glukózy s enzýmami GOD, POD a oxidačnou kopuláciou Princípom metódy je oxidácia glukózy katalyzovaná GOD za vzniku peroxidu vodíka: β-d-glukóza + O 2 + H O GOD kyselina D-glukonová + H O. 2 2 2 Reakciou vzniknutý H O 2 2 sa použije na oxidačnú kopuláciu 4-aminoantipyrínu s fenolom alebo 3-metylfenolom (katalyzovaná POD), pričom vzniká chinónimínové farbivo, ktoré je červené: R-NH 2 + C 6 H 5 -OH + 2 H 2 O POD R-N=C H =O + 4 H O. 2 6 4 2 Meria sa absorbancia vzniknutého chinónimínového farbiva pri vlnovej dĺžke okolo 500 nm. Postup: Na stanovenie sa pripraví pracovný roztok obsahujúci všetky potrebné zložky (enzýmy GOD a POD, 4-aminoantipyrín, 3-metylfenol vo fosforečnanovom tlmivom roztoku ph 8). V kyvete sa k 1 ml pracovného roztoku vytemperovaného na teplotu 37 o C pridá 10 μl séra a meria sa zmena absorbancie v časovom intervale 30-90 s (kinetické meranie, obr. 7-41), alebo sa zmeria výsledné zafarbenie zmesi po 15 min (rovnovážne meranie, obr. 7-41) pri vlnovej dĺžke 500 nm. Ak sa zmeria výsledné zafarbenie v čase, kedy glukóza vo vzorke zreagovala kvantitatívne (po 15 min), výsledná koncentrácia chinónimínového farbiva [farbivo] je rovnaká, ako bola koncentrácia glukózy v pôvodnej vzorke [glukóza]. 0

7 Analytické metódy 131 pridanie substrátu (glukózy, séra) A (500 nm) Enzýmy, bezfarebný prekurzor ΔA Rovnovážna metóda [farbivo] = ΔA / ε [farbivo] = [glukóza] 0 Kinetická metóda ΔA / (Δt ε) = Δc / Δt = v 0 5 10 15 t/min Obr. 7-41 Stanovenie glukózy kinetickou a rovnovážnou metódou 7.6 Imunochemické metódy 7.6.1 Úvod do imunochémie Pojem imunochémia zaviedol švédsky chemik S. A. Arrhenius, ktorý v r. 1907 charakterizoval imunochémiu ako vedu o chemických reakciách látok vznikajúcich po injektovaní cudzích látok do krvi zvierat (tzn. po imunizácii zvierat). V súčasnosti sa imunochémia definuje ako veda skúmajúca chémiu antigénov a protilátok a mechanizmus ich interakcií spolu s ďalšími molekulami, ktoré sú súčasťou imunitných reakcií. Imunitný systém Základnou úlohou imunitného systému organizmu je zistiť poškodené alebo odcudzené vlastné bunky, označiť ich ako cudzie a zaistiť ich likvidáciu a tiež chrániť organizmus pred patogénnymi mikroorganizmami (baktérie, plesne, kvasinky a vírusy). Imunitný systém pozostáva z lymfocytov (druh leukocytov), z niektorých ďalších buniek (makrofágy), z protilátok (imunoglobulíny) a z látok ako sú imunohormóny, zložky komplementu a iné. Imunitný systém prostredníctvom svojich zložiek, lymfocytov a protilátok (antibody, Ab), deteguje odcudzené alebo cudzie bunky a molekuly, označí ich ako antigény (Ag) a nasleduje ich odstránenie. Protilátky a lymfocyty nerozpoznajú celé antigény, ale len určité miesta na ich povrchu, ktoré sa nazývajú determinantné skupiny determinanty (epitopy). Antigény sú teda

7 Analytické metódy 132 molekuly, ktoré obsahujú v svojej štruktúre determinanty. Protilátky sa nenaväzujú na determinanty celým svojim povrchom, ale len určitým väzbovým miestom. Protilátky Protilátky sú heterogénne glykoproteínové molekuly, ktoré svojou elektroforetickou pohyblivosťou patria medzi globulíny frakcie β 1 až γ. Preto sa protilátky nazývajú imunoglobulíny (Ig). V ľudskom organizme bolo zistených 5 tried imunoglobulínov, ktoré sa označujú IgG, IgA, IgM, IgD a IgE. Imunoglobulíny sú proteíny s charakteristickou štruktúrou a špecifickými väzbovými miestami pre antigén. Molekula imunoglobulínu obsahuje 2 páry polypeptidových reťazcov pospájaných vzájomne kovalentnými a inými typmi väzieb. Každý pár polypeptidových reťazcov je zložený z menšieho a väčšieho reťazca polypeptidov Väčšie reťazce, označujú sa ako ťažké (H reťazce), majú M r asi 50 000 70 000 a líšia sa podľa typu imunoglobulínu (reťazce γ, α, μ, δ a ε). Menšie reťazce sa označujú ako ľahké (L reťazce, κ reťazce a λ reťazce) majú M r asi 25 000 a sú rovnaké pre všetky imunoglobulíny. Ľahké aj ťažké reťazce sa skladajú z dvoch častí, z časti premennej (variabilnej, V), ktorá je štruktúrnym základom väzbových miest pre antigény a z časti konštantnej (C). Na obr. 7-42 je zjednodušená schéma štruktúry imunoglobulínu. Antigén L-reťazec H-reťazec Obr. 7-42 Schéma štruktúry imunoglobulínu V-časť C-časť Variabilná časť V obsahuje funkčné skupiny, ktoré môžu interagovať s antigénom; imunoglobulín má dve väzbové miesta pre antigén IgG má M r asi 143 000-149 000 a tvorí približne 75 % všetkých imunoglobulínov, má svoje podtriedy IgG 1, 2, 3 a 4, z nich každá má svoje špecifické funkcie a ich nedostatok sa väčšinou prejavuje pri respiračných chorobách. IgA tvorí asi 15-20 % a IgM asi 3-10 % všetkých imunoglobulínov. IgM je tvorený piatimi podjednotkami, a preto má desať väzbových miest pre antigény. IgM sa označuje aj ako makroglobulín, je omnoho väčší ako ostatné imunoglobulíny (M r okolo 900 000). IgD a IgE sa za normálnych okolností vyskytujú v organizme vo veľmi malej koncentrácii. Zvýšenie hladiny IgD bolo opísané pri niektorých druhoch chronických infekcií. Zvýšené hodnoty IgE sa vyskytujú pri niektorých druhoch alergií. Antigény Antigény sú makromolekulové látky (bielkoviny, polysacharidy, lipopolysacharidy, nukleoproteíny, glykoproteíny, steroidné hormóny a enzýmy) prirodzeného alebo syntetického pôvodu, ktoré imunitný systém rozpoznáva ako cudzie. Antigény po vniknutí do organizmu stimulujú tvorbu protilátok (navodia imunitnú odpoveď). Antigén môže byť kompletný (funkčný) alebo nekompletný (hapten). Kompletný antigén sa označuje ako imunogén. Pre imunogén je charakteristická schopnosť navodiť imunitnú odpoveď a schopnosť reagovať s lymfocytmi a protilátkami. Imunogén reaguje

7 Analytické metódy 133 len s tými lymfocytmi a protilátkami, ktorých tvorbu vyvolal (špecifickosť reakcie imunogén protilátka). Nekompletný antigén sa označuje ako hapten. Hapten je nízkomolekulová látka, ktorá sama nemôže vyvolať tvorbu protilátok, nenavodí imunitnú odpoveď (nie je imunogénna), ale môže špecificky reagovať s protilátkami. Takmer každá nízkomolekulová látka môže byť haptenom a po naviazaní na vhodný nosič (sérový albumín, globulíny, vaječný albumín, fibrinogén) sa môže stať imunogénom. Každý kompletný antigén (imunogén) sa skladá z makromolekulovej časti (tzv. nosiča) a nízkomolekulových determinantov. Determinanty sú buď prirodzenou súčasťou imunogénu alebo sa naň naviazali dodatočne ako hapteny. Antigény majú na povrchu molekuly rôzny počet determinantných skupín, avšak organizmus reaguje tvorbou protilátok len na tie determinantné skupiny, ktoré sú mu cudzie. Schéma kompletného antigénu (imunogénu) s naviazaným haptenom je na obr. 7-43. Hapten Determinant Nosič Obr. 7-43 Schéma imunogénu s naviazaným haptenom Príprava protilátok (antiséra) Tvorba protilátok je výsledkom prirodzeného procesu vývoja organizmu, alebo k nej dochádza po umelom podaní antigénu imunizáciou (očkovaním). Pri imunizácii zvierat sa väčšinou získajú protilátky ako imúnne sérum anti- sérum. Na tieto účely sa imunizujú rôzne zvieratá od myší, cez králikov, kozy a ovce k prasatám, podľa toho, aké a koľko antiséra je potrebné získať. Takto získané protilátky môžu byť monošpecifické (na imunizáciu sa použil jeden jednoduchý antigén tzv Q-antiséra), alebo polyšpecifické (na imunizáciu sa použila zmes antigénov alebo komplexný antigén). Komplexné antigény sú vírusy, baktérie, živočíšne bunky a pod. Z polyšpecifického antiséra sa môže získať monošpecifické antisérum vysycovaním antigénmi, ktoré spôsobia precipitáciu nežiaducich protilátok. Dnes sa väčšinou ako polyklonálne protilátky označujú protilátky pripravené imunizáciou zvierat. Pokiaľ má použitý antigén viac antigénnych determinantov, vzniknú v sére jednotlivé protilátky proti týmto determinantom. Monoklonálne protilátky sa produkujú umelou bunkovou kultúrou, ktorá sa získa imunizáciou (najčastejšie myší) príslušným antigénom. Pri produkcii in vitro sa získajú vyššie výťažky. Reakcia antigénu s protilátkou Ak je v reakčnej zmesi prítomný antigén (Ag) aj protilátka (Ab), vždy vznikne imunokomplex Ab-Ag. Reakciu vzniku imunokomplexu Ab + Ag Ab-Ag možno opísať rovnovážnou (asociačnou) konštantou K = [Ab-Ag] [Ab] -1 [Ag] -1. Typické hodnoty K sa pohybujú v intervale

7 Analytické metódy 134 10 6-10 12 l/mol, ale komplexy s hodnotou konštanty K < 10 8 l/mol sa v imunoanalýze obvykle nepoužívajú. Vznik imunokomplexu Ag-Ab je základom všetkých imunoanalytických metód. Podľa rozpustnosti vytvoreného imunokomplexu sa metódy delia na: o precipitačné, kde sa na detekciu alebo stanovenie využíva vznik imunokomplexu Ab-Ag vo forme precipitátu (zrazeniny). Ak k precipitácii dochádza v roztoku, metódy sa nazývajú serologické. Ak k precipitácii dochádza v prostredí gélu, metódy sa nazývajú imunodifúzne, o neprecipitačné, kde sa na detekciu alebo stanovenie využíva rozpustný imunokomplex Ab-Ag a jeden z reaktantov (Ag alebo Ab) sa obvykle vopred označí vhodnou značkou. Hlavným problémom analýzy biologických materiálov imunochemickými metódami je vplyv zložite j zmesi proteínov, sacharidov, lipidov, malých molekúl a solí vo vzorke. Monoklonálne protilátky majú omnoho nižšiu afinitu ako polyklonálne, dobre reagujú s antigénmi v tlmivých roztokoch, ale nie tak dobre v sére alebo plazme. Imunochemické metódy predstavujú polovicu všetkých laboratórnych výkonov uvádzaných v sadzobníku pre klinickú biochémiu a väčšinu diagnostických metód v laboratórnej časti nukleárnej medicíny, mikrobiológie, imunológie a alergológie. Výsledky imunochemických analýz majú nesporný význam pri sledovaní terapie a tiež v mnohých prípadoch aj v predklinickej diagnostike. 7.6.2 Precipitačné imunochemické metódy Ak je v reakčnej zmesi prítomný antigén aj protilátka, vždy dochádza k vzniku rozpustného imunokomplexu. Imunoprecipitát vzniká len v určitom intervale pomerov koncentrácií antigénu a protilátky. Interval optimálnych koncentrácií pre vznik imunoprecipitátu sa označuje ako zóna ekvivalencie (obr. 7-44). prebytok protilátky zóna ekvivalencie prebytok antigénu množstvo precipitátu rozsah merania množstvo antigénu Obr. 7-44 Precipitačná krivka

7 Analytické metódy 135 V zóne ekvivalencie sa pomer počtu molekúl antigénu a protilátky približuje hodnote 1:1. Výrazný nadbytok antigénu alebo protilátky zabraňuje vzniku precipitátu. Každý imunoglobulín má v molekule dve väzbové miesta, na ktoré sa môže naviazať molekula Ag. Najjednoduchší imunokomplex má teda zloženie Ag-Ab-Ag (obr. 7-45). M r takéhoto komplexu sa pohybuje v intervale 160 000-1 500 000, čo umožňuje komplexu zostať v roztoku rozpusteným. Ak je v molekule antigénu väčší počet determinantov, môže vznikať reťazcová až sieťová štruktúra omnoho väčších rozmerov, čo vedie k vzniku precipitátu (obr. 7-45). Antigén, ktorý má v štruktúre jedinečné (neopakujúce sa v štruktúre jednej molekuly) determinanty, vytvára precipitát len s polyklonálnou protilátkou. Monoklonálne protilátky môžu vytvárať precipitát len s takým antigénom, v molekule ktorého sa daný determinant opakuje viackrát (tento prípad znázorňuje obr. 7-45). Na nízkomolekulové hapteny (malé rozmery molekuly) sa dve veľké molekuly protilátky nemôžu naviazať a preto nevytvárajú imunoprecipitát. + + n Antigén obsahuje štyri rovnaké determinanty Dvojväzbová protilátka Rozpustný imunokomplex vzniká v nadbytku antigénu alebo protilátky Nerozpustný imunoprecipitát vzniká pri optimálnom pomere antigénu a protilátky Obr. 7-45 Schéma vzniku rozpustného imunokomplexu a štruktúra zosieťovaného imunokomplexu (precipitátu) Imunoprecipitácia je reakcia rozpusteného antigénu s rozpustenou protilátkou, pri ktorej vznikne precipitát. Ak reaguje rozpustená protilátka s korpuskulárnym (nerozpusteným) antigénom, výsledkom takejto reakcie je imunoaglutinácia (zhlukovanie častíc). Podstatou imunoaglutinácie je tiež spojenie antigénu obsahujúceho niekoľko determinantov na povrchu častice (napr. erytrocyty, baktérie, latexové častice) s molekulami dvojväzbových protilátok. Serologické metódy (precipitácia v roztoku) Serologické metódy sú založené na precipitácii vo voľnom roztoku. Umožňujú určiť (dokázať) protilátku alebo antigén, v niektorých prípadoch aj hapten, a stanoviť ich približnú koncentráciu. Medzi serologické metódy patria jednoduché precipitačné metódy, imunonefelometria, imunoturbidimetria a aglutinačné metódy.

7 Analytické metódy 136 Jednoduché precipitačné metódy Tieto metódy sa realizujú na podložnom sklíčku alebo v mikroskúmavke. Využívajú sa na kvalitatívnu analýzu, poskytujú binárnu odpoveď áno/nie, vznikol/nevznikol precipitát. Pri dôkaze na podložnom sklíčku sa ku kvapke vzorky séra pridá kvapka roztoku antigénu a ak vzorka séra obsahovala príslušnú protilátku, vizuálne možno pozorovať vznik precipitátu. V skúmavke sa pozoruje vznik precipitátu na rozhraní oboch reaktantov, a pretože precipitát má tvar prstenca, označuje sa ako prstencová precipitácia. Okrem jednoduchého dôkazu možno zmeraním výšky prstenca precipitátu určiť analyt aj semikvantitatívne. Imunonefelometria a imunoturbidimetria Od jednoduchej imunoprecipitácie sa odlišujú spôsobom detekcie precipitátu. Vznik precipitátu (zákal) sa meria turbidimetricky alebo nefelometricky. Metódy umožňujú kvantitatívnu analýzu, vyznačujú sa značnou citlivosťou (ng/ml), umožňujú vykonávať vyšší počet analýz, ktoré možno automatizovať. Analyzovaná vzorka (obsahuje antigén) aj monovalentné antisérum (monovalentná protilátka) sa zriedi fosforečnanovým tlmivým roztokom (ph 7,2-7,5) obsahujúcim PEG. Po zmiešaní oboch zložiek sa zmes inkubuje predpísaný čas pri predpísanej teplote. Prídavok PEG podporuje precipitáciu a vznik väčších častíc precipitátu a v určitom koncentračnom intervale zabraňuje rozpúšťaniu precipitátu prebytočným antigénom. Pri stanovení sa pracuje pri dvoch koncentráciách (dvoch riedeniach), pretože z jednej analýzy nie možno zistiť, ktorej z dvoch možných koncentrácií antigénu signál zodpovedá (či ide o vzostupnú alebo zostupnú časť precipitačnej krivky, obr. 7-44). Aglutinačné metódy Aglutinačné metódy sú obdobou precipitačných metód. Aglutinačné reakcie sú ale podstatne citlivejšie. Odlišujú sa charakterom antigénu, ktorý je korpuskulárny. V tomto prípade je antigén buď integrálnou súčasťou povrchu častice alebo antigén obalí častice (latex, erytrocyty, častice zlata a iné) pridané do reakcie. Po pridaní protilátky vzniká aglutinát. So známym antisérom sa takto identifikujú niektoré baktérie a rôzne typy erytrocytov. Aglutinačné metódy sa môžu použiť podobne ako precipitačné metódy na dôkaz na mikrotitračnej doštičke alebo na stanovenie tzv. latexovou turbidimetriou. V prípade latexovej turbidimetrie sa latexové guľovité mikročastice obalia vhodnou protilátkou, po zmiešaní latexového reagentu so vzorkou dochádza k väzbe medzi antigénom a protilátkou, čo sa prejaví ich zhlukovaním do väčších útvarov (aglutinačnou reakciou) a nárastom turbidity. Metóda sa využíva na stanovenie C-reaktívneho proteínu (častica má na povrchu protilátku proti ľudskému C-reaktívnemu proteínu), feritínu (častica má na povrchu protilátkou proti ľudskému feritínu).

7 Analytické metódy 137 Imunodifúzne metódy (precipitácia v prostredí gélu) Imunodifúzne metódy využívajú precipitáciu v prostredí gélu a umožňujú kvalitatívnu aj kvantitatívnu analýzu. Metódy sú založené na rozdielnej rýchlosti difúzie antigénov a protilátok v géli. Rýchlosť difúzie v géli závisí od difúznych charakteristík antigénov a protilátok (M r, koncentrácia), od štruktúry a vlastností gélu a od teploty. Rýchlosť difúzie sa zvyšuje s narastajúcou koncentráciou látky a znižuje sa s rastúcou molovou hmotnosťou látky. Ak do gélu difunduje len jedna látka (antigén alebo protilátka, častejšie je to antigén), technika sa označuje ako jednoduchá imunodifúzia a využíva sa v kvantitatívnej analýze. V kvalitatívnej analýze sa obvykle využíva dvojitá imunodifúzia, kde do gélu difundujú obidve látky, antigén aj protilátka. Ako gél sa používa agar alebo agaróza pripravené v tlmivom roztoku ph 8 až 9 (barbital-octan, boritan, TRIS-barbital a pod.) nanesený na vhodnej podložke alebo v skúmavke z plastu alebo skla. Aj keď postup analýzy závisí od zvolenej techniky, imunodifúzne metódy majú niekoľko spoločných krokov: precipitácia v géli, vymytie nezreagovaných zložiek a gélu napr. z platne, sušenie platne, vyfarbenie precipitátu (podobne ako pri elektroforéze bielkovín), odfarbenie pozadia, sušenie platne a vizuálne alebo denzitometrické vyhodnotenie. Imunodifúzne metódy sa môžu kombinovať s elektroforézou, čím vznikla rozsiahla skupina metód vhodných na kvalitatívnu aj kvantitatívnu analýzu. Kvalitatívne metódy sú: o Dvojitá radiálna imunodifúzia (Ouchterlony) o Imunoelektroforéza (Grabar a Williams) o Protismerná imunoelektroforéza o Imunoblotting o Imunofixácie Kvantitatívne metódy sú: o Jednoduchá lineárna imunodifúzia v skúmavke (Oudin), v kapiláre, v kapiláre v elektrickom poli (imunoelektromigrácia) o Jednoduchá radiálna imunodifúzia (Manciniová) o Elektroimunodifúzia (raketová imunoelektroforéza) (Laurell) o Dvojrozmerná imunoelektroforéza (Clarke a Freeman) Kvalitatívne metódy Používajú sa na dôkaz antigénov pomocou špecifických antisér (špecifických protilátok) alebo na dôkaz prítomnosti protilátok pomocou čistých antigénov. Dvojitá radiálna imunodifúzia (Ouchterlony) Metóda je vhodná na dôkaz Ag pomocou monovalentného antiséra obsahujúceho špecifickú Ab proti to muto Ag. Analýza sa vykonáva v agarovom (polyakrylamidovom) géli s vyhĺbenými jamkami (obr. 7-46).

7 Analytické metódy 138 Do jamky v strede sklíčka sa nanesie protilátka, do jamiek po obvode sa nanesú vzorky séra a či stý antigén (pozitívna kontrola, ktorá umožňuje kontrolu funkčnosti systému). Antigén aj protilát ka difundujú do gélu a ak spolu reagujú, v mieste dotyku tvoria precipitačnú líniu. Dobre viditeľný precipitát vznikne len pri optimálnom pomere množstiev antigénu a protilátky, preto je pri analýze potrebné použiť rôzne zriedenú vzorku. precipitát pozitívna kontrola čistý antigén protilátka proti agarový gél Nanesenie: protilátka, pozitívna kontrola, 5 vzoriek séra Vyhodnotenie: čistý antigén (pozitívna kontrola) vytvoril precipitát, 2 vzorky vytvorili precipitát - obsahujú určovaný antigén Obr. 7-46 Dvojitá radiálna imunodifúzia Metóda sa môže použiť aj na posúdenie identity odlišnosti antigénov. Ak sú antigény identické, protilátka reaguje s oboma antigénmi rovnako a obidve precipitačné línie potom splynú do oblúčika (obr. 7-47). Rovnaké determinanty v obidvoch antigénoch Čiastočne rozdielne determinanty Rozdielne determinanty Protilátka proti Protilátky proti obidvom antigénom Protilátky proti obidvom antigénom Obr. 7-47 Dvojitá radiálna imunodifúzia (rovnaké, čiastočne rozdielne a rozdielne antigény) Ak sú antigény len čiastočne identické (majú len jeden spoločný determinant), potom sa pozoruje vznik výbežku na oblúčikovej precipitačnej línii.

7 Analytické metódy 139 Ak sú antigény odlišné, každý reaguje so svojou špecifickou protilátkou, vytvorí vlastnú precipitačnú líniu a nastane prekríženie línií. Imunoelektroforéza (Grabar a Williams) V imunoelektroforéze sa analýza skladá z dvoch krokov (obr. 7-48). V prvom kroku sa antigény (napr. vo vzorke séra) rozdelia elektroforézou v agarovom géli na jednotlivé bielkovinové frakcie. Potom sa v agarovej vrstve vyhĺbi kanálik pozdĺž elektroforeogramu a do kanálika sa nanesú protilátky (antisérum proti rozdeleným bielkovinám). Rozdelené antigény a protilátky difundujú proti sebe a ak spolu reagujú, vytvoria precipitačnú líniu. Nevýhodou je zdĺhavá analýza (2-3 dni), výhodou je vysoké rozlíšenie zložiek - za vhodných podmienok možno identifikovať až 30 rôznych bielkovín. 1. krok 2. krok vzorka Ag 1,2,3,4 gél nanesenie Ab proti Ag 1,2,3,4 elektroforéza, rozdelenie antigénov difúzia Ag a Ab vznik precipitátu 1 2 3 4 Obr. 7-48 Imunoelektroforéza Protismerná imunoelektroforéza V tomto prípade sa analýza zrealizuje v jednom kroku (obr. 7-49). Antigén (vzorka) a protilátka sa umiestnia do jamiek v agarovom géli do radu proti sebe tak, že bližšie k anóde je protilátka. Pri elektroforéze v tlmivom roztoku ph 8 až 9 migruje antigén (anión) k anóde a protilátka (kladný náboj) smerom ku katóde. V slabo alkalickom prostredí sa väčšina bielkovinových antigénov nachádza v roztoku vo forme aniónu. V mieste, kde sa stretne antigén s protilátkou sa vytvorí precipitačná línia. Používa sa na detekciu antigénov s väčšou elektroforetickou pohyblivosťou ako je pohyblivosť protilátky, pretože precipitačná línia sa musí vytvoriť v priestore medzi jamkami, ktoré k sebe patria. Inak by sa precipitačné línie pre jednotlivé vzorky pomiešali. Na analýzu sa musí použiť kvalitné monovalentné antisérum. Možno analyzovať niekoľko vzoriek súčasne, celá analýze trvá od 30 do 120 min.

7 Analytické metódy 140 nanesenie vzorky (antigén) gél elektroforéza, pohyb antigénov pohyb protilátok vznik precipitátu nanesenie protilátky Obr. 7-49 Protismerná imunoelektroforéza Imunoblotting Imunoblotting je založený na prenose (blotting) molekúl (bielkoviny rozdelené elektroforézou na géli) z pohyblivej fázy ( gélu) do tuhej fázy (napr. na nitrocelulózovú membránu). Analýza sa realizuje v dvoch krokoch (obr. 7-50). V prvom kroku sa elektroforézou v agarovom (poly- géli rozdelí zmes antigénov (napr. vzorka séra). Druhým krokom je prenos akrylamidovom) rozdelených frakcií antigénov na vhodnú pevnú matricu (nitrocelulózová membrána) difúziou (málo účinná), tlakom (blotting, odtlačok, prenos) alebo aj elektroforeticky (elektroblotting, Western blotting). Elektroforetickým prenosom možno získať niekoľko kópií rozdelených frakcií antigénov. Jednotlivé kópie sa môžu vyhodnotiť rôznymi metódami (použiť vyfarbenie, využiť interakcie s rôznymi typmi protilátok), čím sa z jednej vzorky získa značné množstvo informácií. 1. krok elektroforéza, separácia antigénov 2. krok blotting 1 2 3 4 nitrocelulóza Obr. 7-50 Imunoblotting Imunofixácie Aj v tomto prípade sa analýza realizuje v dvoch krokoch (obr. 7-51). V prvom kroku sa elektroforézou (alebo izoelektrickou fokusáciou) v agarovom (polyakrylamidovom) géli antigény rozdelia na jednotlivé frakcie. V druhom kroku sa na povrch vlhkého gélu priloží pásik napr. acetylcelulózy s monošpecifickou protilátkou. Protilátka difunduje z pásika do gélu a reaguje s antigénom za vzniku precipitátu. Pásik s protilátkou sa prikladá len na tú časť gélu, kde sa predpokladá prítomnosť antigénu, čím sa šetria protilátky.

7 Analytické metódy 141 1. krok elektroforéza separácia antigénov 1,2,3,4 2. krok imunofixácia pásik so špecifickou protilátkou pre antigén 2 1 2 3 4 1 3 4 vymytie nezreagovaných zložiek, zostane precipitát z antigénu 2 Obr. 7-51 Imunofixácie Kvantitatívne metódy Rýchlosť difúzie v agarovom géli závisí od množstva aplikovaného antigénu alebo protilátky, difúznych charakteristík antigénu/protilátky a teploty. Rýchlosť difúzie látky v géli rastie s rastúcou koncentráciou látky a znižuje sa s rastúcou molovou hmotnosťou látky. S rastúcou teplotou sa rýchlosť difúzie zvyšuje. Jednoduchá lineárna imunodifúzia Stanovenie sa realizuje v skúmavke (obr. 7-52), ktorá obsahuje napr. 0,5 ml agarózového gélu s protilátkou proti stanovovanému antigénu. Na gél sa nanesie roztok antigénu (0,05 ml), a potom sa všetko prevrství parafínovým olejom, aby nedochádzalo k odparovaniu. Antigén difunduje gélom a vytvára precipitačný prstenec. Vzdialenosť (L) prstenca od miesta nanesenia antigénu je priamo úmerná koncentrácii antigénu. parafínový olej vzorka, antigén L L gél s protilátkou precipitačný prstenec c Obr. 7-52 Jednoduchá lineárna imunodifúzia Jednoduchá radiálna imunodifúzia (Manciniová) Je založená na kruhovej (radiálnej) difúzii roztoku antigénu z miesta nanesenia (malý kruhový štart) do vrstvy gélu obsahujúceho špecifickú protilátku (obr. 7-53).

7 Analytické metódy 142 Na štart sa nanesie napr. vzorka krvného séra. Bielkoviny krvného séra (medzi nimi aj antigén) difundujú radiálne do gélu. V géli vytvára antigén so svojou špecifickou protilátkou precipitačný prstenec. Čím väčšia je koncentrácia antigénu vo vzorke, tým vyššia je jeho difúzia do gélu a tým väčší precipitačný prstenec vznikne. Dosiahnutie rovnovážneho stavu (ukončenie imunodifúzie) vyžaduje asi 48 h. Na vyhodnotenie sa zmeria priemer (D) prstenca pomocou špeciálnej šablóny a zostrojí sa kalibračný graf závislosť hodnôt (D-α) od koncentrácie antigénu. Hodnota α je priemer kruhovej jamky. V prípade ukončenej imunodifúzie je táto závislosť lineárna. Pri rýchlejšej verzii sa zmeria priemer prstenca pred ukončením imunodifúzie (asi po 6 h). V tomto prípade je hodnota (D-α) priamo úmerná logaritmu koncentrácie antigénu. Metóda neukončenej imunodifúzie poskytne výsledok rýchlejšie, ale za cenu nižšej zhodnosti výsledkov. Metóda nevyžaduje drahú prístrojovú techniku, umožňuje stanoviť koncentráciu ľubovoľného antigénu ak je k dispozícii zodpovedajúce dostatočne čisté monovalentné antisérum, je pomerne lacná. Nevýhodou je časová náročnosť. štandardy antigénu na kalibráciu kruhová jamka (priemer α) nanesenie vzorky kruhový prstenec (priemer D) D-α c gél s protilátkou Obr. 7-53 Jednoduchá radiálna imunodifúzia Na platničku sa nanieslo 5 kalibračných štandardov a 20 vzoriek Elektroimunodifúzia (raketová imunoelektroforéza) Elektroimunodifúzia je kombinácia jednoduchej radiálnej imunodifúzie s elektroforézou (obr. 7-54). Vykonáva sa v gélovej vrstve pripravenej z agarózy v slabo alkalickom prostredí (barbital ako tlmivý roztok, ph 8,6) obsahujúcej rovnomerne rozptýlenú monošpecifickú protilátku. Väčšina bielkovinových antigénov sa za týchto podmienok pohybuje smerom k anóde. Pri migrácii gélom sa antigén stretáva s protilátkou, ale vznikajúci komplex antigén-protilátka sa v nadbytku protilátky plynulo rozpúšťa až do okamihu, keď je všetok antigén špecifickou protilátkou vyviazaný. Vzniknutý precipitát má tvar rakety. Vzdialenosť vrcholu rakety od štartu (L) je priamoúmerná koncentrácii antigénu. Analýza si vyžaduje čas 3-16 h.

7 Analytické metódy 143 Elektroimunodifúzia je v porovnaní s jednoduchou radiálnou imunodifúziou rýchlejšia a citlivejšia, umožňuje stanoviť 0,1 mg/l bielkovín. Nevýhodou je vyššia spotreba špecifických antisér. Môže sa použiť aj na stanovenie koncentrácie protilátok v sére. V tomto prípade obsahuje gél namiesto protilátky práve príslušný antigén. gél s protilátkou precipitát v tvare rakety L L nanesenie vzorky c kalibrácia Obr. 7-54 Elektroimunodifúzia (raketová imunoelektroforéza) Dvojrozmerná imunoelektroforéza Je to kombinácia elektroforézy a raketovej techniky. Realizuje sa v dvoch krokoch (obr. 7-55). V prvom kroku sa v čistom agarovom alebo polyakrylamidovom géli bez protilátok rozdelí zmes antigénov elektroforézou. V druhom kroku sa vyreže pásik gélu s rozdelenými frakciami v prvej elektroforéze. Tento pásik sa priloží k okraju čistej agarovej platne, na zvyšok tejto platne sa naleje gél obsahujúci antisérum (polyšpecifické protilátky proti hľadaným antigénom). Potom nasleduje druhá elektroforéza v kolmom smere na prvú elektroforézu, čím sa rozdelia antigény na antigény s aniónovou a antigény s katiónovou pohyblivosťou. Antigény migrujú do prostredia s protilátkami a vytvárajú precipitačné rakety. Plocha rakety je za určitých podmienok úmerná koncentrácii antigénu. Technika umožňuje rozlíšiť až 50 bielkovín v ľudskom sére, avšak stanoviť ich je zložité. 1. krok elektroforéza gél odrezať 2. krok elektroforéza v kolmom smere gél s protilátkami nanesenie vzorky Obr. 7-55 Dvojrozmerná imunoelektroforéza Výhodou tejto techniky je vysoké rozlíšenie a citlivosť. Nevýhodou je časová náročnosť, okrem toho dvojrozmerná imunoelektroforéza vyžaduje asi dvojnásobok antiséra v porovnaní s raketovou technikou.

7 Analytické metódy 144 Využitie precipitačných metód je spojené s určitými limitujúcimi faktormi. Ako už bolo uvedené, nie všetky protilátky vytvárajú s antigénom precipitát. U niektorých protilátok je to spôsobené ich malou afinitou k antigénom; na vznik rozpustného imunokomplexu je potrebný nadbytok antigénu, ale v nadbytku antigénu nevzniká precipitát (obr. 7-44). Aj napriek tomu, že monoklonálne protilátky majú vysokú afinitu k špecifickému determinantu v molekule antigénu, precipitát zvyčajne netvoria (precipitát vznikne len s antigénom, v ktorom sa determinant nachádza viackrát). Protilátky z triedy IgM vytvárajú precipitát len veľmi ťažko alebo vôbec nie. Nízkomolekulové hapteny tiež netvoria precipitáty. Ak zložky imunochemickej reakcie môžu vytvárať precipitát, limitujúcim faktorom je ich koncentrácia. Ak je koncentrácia nízka, precipitát buď nevznikne, alebo sa vytvorí malé množstvo precipitátu, ktoré nie možno detegovať obvykle používanými metódami (vizuálne, denzitometria, turbidimetria). Precipitačnými metódami možno stanoviť antigény alebo protilátky v biologickej vzorke (tab. 7-1) vtedy, ak je ich koncentrácia vyššia ako 10 mg/l. Tabuľka 7-1 Využitie precipitačných imunochemických metód v klinickej chémii Metóda Serologické metódy Jednoduchá precipitácia Imunonefelometria Aglutinácia Imunodifúzne metódy kvalitatívne Dvojitá radiálna imunodifúzia Imunoelektroforéza Protismerná imunoelektroforéza Imunoblotting Imunofixácie Imunodifúzne metódy kvantitatívne Jednoduchá radiálna imunodifúzia Elektroimunodifúzia Dvojrozmerná imunoelektroforéza dôkaz proteínov Využitie v klinickej chémii stanovenie bielkovín v biologických tekutinách tehotenský test hcg v moči dôkaz patologických bielkovín (α 1 -fenoproteín), kontrola čistoty antisér klasifikácia monoklonálnych imunoglobulínov dôkaz Bence-Jones proteínu, dôkaz plazmatických bielkovín v moči, mozgovomiechovom moku dôkaz α 1 -fenoproteínu, feritínu, antigénu hepatitídy B dôkaz Bence-Jones proteínu dôkaz monoklonálnych imunoglobulínov stanovenie IgA, IgM, α 1 -antitrypsínu, C-reaktívneho proteínu, α 1 -makroglobulínu, transferínu stanovenie bielkovín v plodovej vode, mozgovomiechovom moku, α 1 -antitrypsínu, transferínu, IgM, IgA umožňuje komplexné sledovanie zmesi antigénov a ich stanovenie

7 Analytické metódy 145 7.6.3 Neprecipitačné imunochemické metódy s označenými reaktantmi Nové možnosti prinieslo zavedenie neprecipitačných imunochemických metód, kde sa na detekciu alebo stanovenie využíva rozpustný imunokomplex a jeden z reaktantov (antigén alebo protilátka) sa vopred označí vhodnou značkou. Používajú sa také značky, ktoré poskytujú intenzívny merateľný signál, čím sa dosiahne vyššia citlivosť a medza stanovenia pod 10 mg/l. Tieto metódy umožňujú stanoviť aj nízkomolekulové zložky typu haptenov (teda monovalentné zložky, ktoré tvoria imunokomplex, ale nie precipitát, napr. liečivá a hormóny). Podľa typu značky a meracej techniky možno neprecipitačné metódy s označenými reaktantmi rozdeliť takto: Rádiometrické metódy o Rádioimunoanalýza (Radio Immuno Assay, RIA) o Imunorádiometrická analýza ( Immuno Radio Metric Assay, IRMA) Enzýmové metódy o Enzymoimunoanalýza ( Enzymo Immuno Assay, EIA) (komerčný názov EMIT) o Enzyme Linked Immunosorbent Assay (ELISA) o Imunoenzymometrická analýza (Immuno Enzymo Metric Assay, EIMA) Fluorescenčné metódy o Fluorescenčná imunoanalýza (Fluorescence Immuno Assay, FIA) o Fluorescenčná polarizačná imunoanalýza (Fluorescence Polarization Immuno Assay, FPIA) (komerčný názov TDx) o Časovo rozlíšená fluorescenčná imunoanalýza (Time Resolved Fluorescence Immuno Assay (TR-FIA) (komerčný názov DELFIA) Luminiscenčné metódy o Luminoimunoanalýza (Lumino Immuno Assay, LIA), o Imunoluminometrická analýza (Imuno Lumino Metric Assay, ILMA) Elektrochemiluminiscenčné metódy o Elektrochemiluminiscencia (ElectroChemiLuminescence, ECL) Metódy možno rozdeliť na kompetitívne (uplatňuje sa súťaž o väzbové miesta) a nekompetitívne (súťaž o väzbové miesta sa neuplatňuje). Ďalšie delenie je na metódy homogénne (nevyžadujú separáciu) a heterogénne (separácia je potrebná). Kompetitívne metódy Usporiadanie experimentu bude ďalej opísané pre stanovenie antigénu (Ag). K stanovovanému antigénu (ku vzorke) sa pridá presne známe množstvo rovnakého antigénu označeného vhodnou

7 Analytické metódy 146 10 Ab + 20 Ag* 10 Ab-Ag* + 10 Ag* 10 Ab + 20 Ag* + 5 Ag 8 Ab-Ag* + 2 Ab-Ag + 12 Ag* + 3 Ag 10 Ab + 20 Ag* + 20 Ag 5 Ab-Ag* + 5 Ab-Ag + 15 Ag* + 15 Ag 10 Ab + 20 Ag* + 30 Ag 4 Ab-Ag* + 6 Ab-Ag + 16 Ag* + 24 Ag signál Ab-Ag* 10 9 8 7 6 5 4 0 5 10 15 20 25 30 množstvo Ag signál Ag* 16 15 14 13 12 11 10 0 5 10 15 20 25 30 množstvo Ag signál Ab-Ag*/Ag* 1,0 0,8 0,6 0,4 0,2 0 5 10 15 20 25 30 množstvo Ag Obr. 7-56 Schéma kompetitívnej metódy na stanovenie Ag a zodpovedajúce kalibračné krivky zna čkou (Ag*). Do reakcie sa použije malé (limitované) množstvo protilátky Ab v porovnaní s množstvom označeného Ag*. V reakcii je teda omnoho viac molekúl Ag*, ako sa ich môže naviazať na väzbové miesta protilátky. V roztoku je okrem Ag* prítomný aj Ag zo vzorky, preto dochádza k súťaži označeného a neoznačeného antigénu o limitovaný počet väzbových miest protilátky. Ag a Ag* sa budú na tieto väzbové miesta viazať v rovnakom pomere, v akom boli zastúpené v zmesi na začiatku reakcie. Reakciou vzniknú imunokomplexy Ab-Ag a Ab-Ag* a v reak čnej zmesi zostane určité množstvo nenaviazaného Ag a Ag* (obr. 7-56). Na detekciu sa využi je meranie signálu značky v nenaviazanom antigéne Ag* alebo v imunokomplexe Ab-Ag*. Ak sa do reakcie použije konštantné množstvo Ab a Ag*, možno zostrojiť kalibračnú krivku ako závislosť signálu (množstva) označeného antigénu viazaného v Ab-Ag* od množstva antigénu Ag aleb o závislosť signálu označeného voľného antigénu Ag* od množstva antigénu Ag. Kalibra čná krivka sa môže zostrojiť aj ako závislosť pomeru signálov Ab-Ag*/Ag* od množstva Ag. Zjednodušene možno kompetitívnu metódu opísať schémou na obr. 7-56 vychádzajúcou z predpokladu, že protilátka je jednoväzbová a že do imunoreakcie vstupuje konštantné množstvo Ab a Ag*, mení sa len množstvo Ag (vzorka). Pomer počtu molekúl Ag*/Ag pred reakciou je rovnaký ako pomer počtu molekúl Ab-Ag*/Ab- Ag po prebehnutí imunoreakcie. Na obr. 7-56 sú uvedené aj zodpovedajúce kalibračné krivky. Kompetitívne metódy sa delia na homogénne a heterogénne metódy. Metódy homogénne sa používajú v takých prípadoch, keď je signál značky viazanej v Ag* iný ako jej signál v komplexe Ab-Ag*. Napríklad enzýmová značka naviazaná na Ag má enzýmovú aktivitu, ale po jej naviazaní do imunokomplexu aktivitu stratí. V homogénnych metódach reakcia prebieha v jednej skúmavke, nie je nutné separovať komplex Ab-Ag* od ostatných zložiek reakčnej zmesi. Výhodou je jednoduchý postup, krátky čas analýzy, jednoduchá

7 Analytické metódy 147 automatizácia. V porovnaní s heterogénnymi metódami sú menej citlivé a určité problémy prinášajú interferencie v podstate neznámych zložiek vo vzorke. Metódy heterogénne sa používajú vtedy, ak je nutné oddeliť vznikajúci komplex Ab-Ag* od Ag* (signál značky nezávisí od toho, kde je naviazaná a zostáva konštantný aj po imunoreakcii). Na separáciu Ag* a Ab-Ag* sa používa gélová chromatografia na mikrokolónke (Ag* a Ab-Ag* majú rozdielnu veľkosť). Iná možnosť je previesť voľnú alebo naviazanú frakciu značky do tuhej fázy. Voľná frakcia Ag* sa prevedie do tuhej fázy sorpciou na povrch vhodného sorbentu (aktívne uhlie, latexové častice, silikagél), pričom frakcia viazaná v komplexe Ab-Ag* zostane v roztoku a od seba sa oddelia odstredením. Viazaná frakcia Ab-Ag* sa do tuhej fázy prevedie nešpecifickou alebo špecifickou precipitáciou komplexu Ab-Ag*. Pri nešpecifickej precipitácii sa do tuhej fázy prevedú okrem komplexov Ab-Ag a Ab-Ag* aj ďalšie prítomné bielkoviny. Na nešpecifickú precipitáciu (zrážanie bielkovín) sa používajú soli (síran sodný), organické rozpúšťadlá (metanol, etanol, acetón). Najčastejšie sa používa zrážanie imunokomplexov polyetylénglykolom (PEG). Pri špecifickej precipitácii sa na zrážanie imunokomplexov využíva sekundárna protilátka (Ab 2 ), ktorá reaguje špecificky s prvou protilátkou Ab 1 v komplexe Ag-Ab1, pričom vznikajú komplexy Ag-Ab1-Ab2, ktoré vytvárajú veľké precipitačné agregáty. Metóda sekundárnej protilátky patrí medzi najrozšírenejšie techniky, pretože je univerzálna, vysoko špecifická a neporušuje rovnováhu základnej imunoreakcie. Tuhá fáza vzniknutá pri precipitácii sa oddeľuje odstredením. Ak je sekundárna protilátka naviazaná na tuhú fázu, napr. na steny skúmavky, odstreďovanie nie je potrebné. Veľmi výhodná je imobilizácia Ag alebo Ab na tuhej fáze (steny skúmavky, mikrotitračnej doštičky, povrch gulôčok). V heterogénnych metódach sa v mnohých prípadoch dosahuje vyššia citlivosť ako pri homogénnych metódach. Nutnosť separácie Ag* a Ab-Ag* komplikuje samotný analytický postup a spôsobuje problémy pri uplatňovaní automatizácie. Nekompetitívne metódy Usporiadanie experimentu bude ďalej opísané pre stanovenie antigénu (Ag) vo vzorke tzv. sendvičovou metódou (obr. 7-57). Táto metóda je použiteľná len pre také antigény, ktoré majú minimálne dve väzbové miesta, pretože sendvičová metóda pracuje s dvoma špecifickými protilátkami proti stanovovanému antigénu. Prvá špecifická protilátka Ab 1 (proti prvému väzbovému miestu antigénu) je neoznačená a je naviazaná v nadbytočnom množstve na vhodnom tuhom nosiči (steny skúmavky, doštičky). Stanovovaný antigén sa na prvú protilátku naviaže a zostane tak fixovaný na tuhom povrchu. Potom sa systém premyje a pridá sa druhá špecifická protilátka Ab 2 * (proti druhému väzbovému miestu antigénu), ktorá je taktiež v nadbytku a je označená značkou.

7 Analytické metódy 148 Druhá protilátka sa naviaže na druhé väzbové miesto antigénu a jej prebytok sa vymyje. Používajú sa monoklonálne protilátky v dostatočnom nadbytku v porovnaní s koncentráciou antigénu. Zmeria sa signál značky v imunokomplexe Ab1-Ag-Ab2* naviazanom na tuhej fáze. Tento signál je priamo úmerný množstvu Ag vo vzorke. Ab 1 Vzorka (Ag) Inkubácia Ab 1 -Ag na nosiči, zložky vzorky Ab 1 -Ag Nadbytok Ab 2 * Inkubácia Ab 1 -Ag-Ab 2 * na nosiči, voľná Ab 2 * Ab 1 -Ag-Ab 2 * na nosiči Vymytie Vymytie voľnej Ab * 2 30 Prvá protilátka Ab 1 je viazaná na nosiči v nadbytku vo vzorke sa stanovuje antigén Ag druhá protilátka Ab 2 je označená značkou pridáva sa v nadbytku -Ab 2 * signál Ab 1 -Ag 25 20 15 10 5 0 0 3 6 9 12 15 množstvo Ag Obr. 7-57 Schéma sendvičovej metódy Rádiometrické metódy Rádioimunoanalýza (RIA) RIA je kompetitívna heterogénna metóda. Na označenie sa používajú rádioizotopy 125 I, 14 C, 75 Se, 57 Co a 3 H. Doba použitia rádioizotopov je limitovaná, napr. polčas rozpadu 125 I je 60 dní. Analytické súpravy majú teda limitovanú použiteľnosť, a preto je vhodné analyzovať práve toľko vzoriek, aby sa spotrebovala jedna súprava (zhromažďovať vzorky, až kým sa naplní kapacita jednej súpravy alebo vykonať potrebný počet odberov vzoriek niekoľko dní po sebe). Výhodou RIA je vysoká špecifickosť a citlivosť a možnosť automatizácie. Umožňuje stanoviť každú zložku, pre ktorú je dostupná protilátka, pričom medza stanovenia sa pohybuje v intervale 10-9 -10-12 g/l. Metóda RIA umožňuje stanoviť aj hapteny, ktoré sa môžu naviazať na špecifické protilátky bez účasti nosiča. Nevýhodou je práca s rádioaktívnym materiálom a pomerne nákladné zariadenie.

7 Analytické metódy 149 Činidlá označené rádioizotopom sa využívajú aj v neimunochemických metódach. V neimunochemických metódach stanovovaný analyt nevytvára väzbu s protilátkou, ale s iným väzbovým reagentom. Väzbovým reagentom môžu byť transportné bielkoviny (metóda Competitive Protein Binding Assay), enzýmy (Rádioenzýmová analýza, REA) a receptory (Rádioreceptorová analýza, RRA). Enzýmové metódy Enzýmy ako značky kovalentne viazané na reaktant (antigén alebo protilátku) pri niektorých stanoveniach postupne nahradili používané rádionuklidy. Aby bolo možné využiť enzým ako značku, enzým musí mať určité vlastnosti: ľahko merateľná katalytická aktivita, aktivita zostane zachovaná aj po naviazaní do konjugátu s reaktantom, jeho substrát musí mať vysoký signál po koncovej reakcii, musí byť ľahko dostupný v požadovanej čistote, nesmie sa vyskytovať v meranej vzorke. Najčastejšie sa používajú enzýmy peroxidáza (POD) a alkalická fosfatáza (ALP). POD katalyzuje oxidáciu aromatických diamínov na farebné zlúčeniny a tiež oxidačnú kopuláciu fenolu a jeho derivátov so 4-aminoantipyrínom za vzniku chinónimínových farbív. ALP katalyzuje hydrolýzu mnohých monoesterov kyseliny fosforečnej, napr. hydrolýzou 4-nitrofenylfosfátu vzniká žlto sfarbený 4-nitrofenol, alebo z umbelliferylfosfátu vzniká umbelliferon, ktorý vykazuje fluorescenciu. Ďalším príkladom je enzým β-d-galaktozidáza a jej substrát 4-metylumbelliferyl-D-galaktozid. Enzýmovou reakciou vznikne 4-metylumbelliferon, ktorý vykazuje fluorescenciu. Okrem fotometrických a fluorescenčných metód sa na meranie signálu môžu použiť aj chemilumini- scenčné metódy. Kompetitívna enzymoimunoanalýza v heterogénnom prostredí (ELISA) ELISA sa používa na stanovenie antigénov s vyššou M r (nad 20 000) alebo na detekciu protilátok. V tejto metóde sa predpokladá, že enzým je aktívny nielen po naviazaní na antigén AgE, ale že si zachová aktivitu aj v imunokomplexe Ab-AgE. Meria sa enzýmová aktivita označeného komplexu Ab-AgE. Pred pridaním substrátu je potrebné odstrániť voľný označený AgE, ktorý by inak tiež reagoval so substrátom. Imunokomplexy možno vyzrážať napr. prídavkom PEG. Meria sa intenzita sfarbenia, ktoré poskytuje označený imunokomplex pri reakcii so svojim substrátom. Absorbancia je potom nepriamo úmerná koncentrácii stanovovaného Ag. Vzorka (napr. krvné sérum) obsahujúca antigén sa odpipetuje do jamky na doštičke (obr. 7-58). Steny jamky sú pokryté protilátkou, ktorá špecificky viaže antigén. Súčasne sa pridá malé množstvo čistého antigénu označeného enzýmom E (POD). Počet protilátok, na ktoré sa môže antigén zo vzorky a antigén so značkou E naviazať, je limitovaný. Tieto dve zložky teda súťažia o väzbové miesta protilátok. Nenaviazané molekuly sa vymyjú. Potom sa pridá roztok substrátu (H 2 O 2, fenol, 4-aminoantipyrín) pre enzým POD. Po pridaní substrátu prebehne enzýmová reakcia (indikačná reakcia) a vznikne farebný produkt, ktorého absorbancia A sa meria. Stanovenie sa vyhodnotí metódou kalibračnej krivky.

7 Analytické metódy 150 Antigén označný enzýmom POD Vzorka Inkubácia Mikrotitračná doštička Meranie absorbancie A Ag Vymyť H 2 O 2, fenol, R-NH 2 Inkubácia POD (E- ) R-NH 2 + C 6 H 5 -OH + 2 H 2 O 2 R-N=C 6 H 4 =O + 4 H 2 O Obr. 7-58 Kompetitívna enzymoimunoanalýza v heterogénnom prostredí Nekompetitívna enzymoimunoanalýza (sendvičová ELISA) Meria sa aktivita enzýmu v imunokomplexe Ab 1 -Ag-Ab 2 E naviazanom na tuhej fáze (po odstránení prebytočného Ab 2 E). Pridá sa substrát v tlmivom roztoku, alebo substrát spolu s ďalším chromogénnym systémom, ktorý umožňuje celé stanovenie vykonať až o niekoľko poriadkov citlivejšie. Nameraná absorbancia je priamo úmerná koncentrácii stanovovaného Ag. Kompetitívna enzymoimunoanalýza v homogénnom prostredí (EIA, EMIT) EIA sa využíva na stanovenie nízkomolekulových látok (liečivá, hormóny, antigény a hapteny). V EIA sa analyt (napr. antigén) označí vhodným enzýmom (AgE). Stanovenie predpokladá, že po naviazaní enzýmu na určitý antigén sa enzýmová aktivita nezmení, že sa nezmení ani sila interakcie antigénu s protilátkou a k strate enzýmovej aktivity dochádza až po naviazaní na príslušnú protilátku (vzniká Ab-AgE). Po prebehnutí kompetitívnej imunoreakcie zostane v roztoku časť AgE nenaviazaná, čo sa prejaví enzýmovou aktivitou, ktorá je úmerná množstvu analytu vo vzorke. Po pridaní substrátu sa meria intenzita sfarbenia produktu, ktorý vznikol katalytickým účinkom AgE. Intenzita sfarbenia je priamo úmerná koncentrácii Ag vo vzorke.

7 Analytické metódy 151 Fluorescenčné metódy Na označenie stanovovaného antigénu alebo protilátky sa používa vhodný fluorofor (fluoresceín, 7-hydroxykumarin, rodamín, cheláty Eu 3+ a iné). Fluorimetria má v porovnaní so spektrofotometriou nižšiu medzu stanovenia (0,2 μg/l). V prípade biologických vzoriek je fluorescencia silne ovplyvňovaná matricou vzorky (interferencie pozadia). V mnohých prípadoch je preto potrebné matricu pred vlastným meraním oddeliť. Zásadné zlepšenie FIA (potlačenie vplyvu matrice séra) sa dosiahlo zavedením merania technikou TR-FIA (časovo rozlíšenou FIA). V TR-FIA sa ako značky používajú cheláty Eu 3+, Tb 3+, Sm 3+, Tu 3+ a La 3+, ktoré majú fluorescenčný dosvit 10 až 1000 μs. Intenzita fluorescencie značiek sa meria s časovým oneskorením 400-800 μs, čím sa oddelí (časovo rozlíši) interferujúca fluorescencia séra, ktorá má dosvit 1-20 ns. Kompetitívna homogénna FIA (FPIA) Zavedenie fluorescenčnej polarizačnej imunoanalýzy (FPIA) umožnilo zrealizovať homogénnu kompetitívnu FIA (bez nutnosti separácie voľnej a viazanej formy fluoroforu). FPIA je založená na meraní intenzity modrého polarizovaného žiarenia. FPIA využíva rôznu rýchlosť rotácie malých a veľkých molekúl, ktorej výsledkom je zmena polarizácie žiarenia. Ako zdroj žiarenia sa používa volfrámová alebo halogénová lampa vysielajúca žiarenie rôznych vlnových dĺžok. Pred zdroj žiarenia sa vloží interferenčný filter, ktorý prepúšťa len modré svetlo (žiarenie s vlnovou dĺžkou 481 až 489 nm). Toto žiarenie ďalej prechádza tekutým polarizačným kryštálom, z ktorého vychádza polarizované modré svetlo, kmitajúce len v jednej rovine. Ak sa do polarizovaného svetla vloží fluorofor, fluorofor prechádza do excitovaného stavu a pri návrate do základného stavu emituje zelené svetlo (525-550 nm). Ak je fluorofor viazaný na veľkú molekulu (ako značka v komplexe Ab-Ag, obr. 7-59), nemôže voľne rotovať, emitované zelené svetlo bude kmitať v rovnakej rovine ako modré polarizované svetlo polarizácia bude zachovaná. To znamená, že fluorofor viazaný v komplexe Ab-Ag nevplýva na intenzitu modrého polarizovaného svetla. modré polarizované svetlo Označený antigén rýchla rotácia polarizácia sa zoslabí Označený imunokomplex pomalá rotácia polarizácia sa zachová Obr. 7-59 Princíp fluorescenčnej polarizačnej imunoanalýzy Naopak, fluorofor naviazaný ako značka na malú molekulu Ag môže voľne rotovať, emitované zelené svetlo bude kmitať v inej rovine než modré svetlo a polarizácia sa zoslabí alebo stratí.

7 Analytické metódy 152 Nameraná polarizácia teda závisí od koncentrácie voľného, fluoroforom označeného Ag. FPIA sa používa na stanovenie analytov s malou M r pod 2 000, napr. liečiv a hormónov. Kompetitívna heterogénna FIA Využíva separáciu voľnej a viazanej frakcie označených analytov do tuhej fázy (napr. polyakrylamidové gulôčky s kovalentne naviazanou špecifickou protilátkou). Výhodou je oddelenie séra od výsledného meraného roztoku a potlačenie signálu matrice séra. Aj v tomto prípade možno použiť princíp časovo rozlíšeného merania fluorescencie s chelátmi vzácnych zemín. Analýza sa môže vykonať aj na mikrodoštičkách s protilátkou naviazanou v jamkách. Nekompetitívna heterogénna FIA Do tejto skupiny patrí heterogénna DELFIA (Dissociation-Enhanced Lanthanide Fluoroimuoassay). Stanovovaný Ag reaguje so svoju špecifickou protilátkou naviazanou v nadbytočnom množstve na tuhej fáze. Vznikne imunokomplex Ag-Ab 1. Po inkubácii a premytí sa v nadbytku pridá druhá protilátka, ktorá je označená chelátom Eu (Ab 2 -Eu). Ión Eu 3+ v cheláte vykazuje len slabú fluorescenciu. Označená protilátka sa naviaže na druhú stranu Ag a vznikne komplex (Ab 1 -Ag-Ab 2 -Eu). Potom sa pridá zosilňovacie činidlo (enhanced solution). Po pridaní tohto činidla, Eu 3+ z označeného komplexu (Ab 1 -Ag-Ab 2 -Eu) disociuje do roztoku. V roztoku potom Eu 3+ vytvorí so zosilňovacím činidlom silne fluoreskujúci chelát uzavretý v micelách tvorených komponentmi zosilňovacieho roztoku. Po pridaní zosilňovacieho činidla sa zvýši fluorescencia chelátu Eu 3+ až miliónkrát. Meria sa intenzita fluorescencie, ktorá je priamo úmerná množstvu Ag vo vzorke. Metóda DELFIA je citlivá, presná, analyzujú sa neriedené roztoky vzoriek, je menej prácna ako RIA, doba analýzy je 1-5 h. Eu sa v biologickom materiáli nenachádza, čím sa eliminujú rušivé vplyvy matrice. Metóda vyžaduje kvalitný prístroj na meranie fluorescencie. Nevýhodou je vysoká cena súprav a závislosť od ich dovozu. Je vhodná na stanovenie hormónov, liečiv a bielkovín. Homogénna TR-FIA Princíp DELFIA bol zjednodušený aj do podoby homogénnej metódy TR-FIA založenej na zosilnení emisie chelátov lantanoidov v dôsledku neradiačného prenosu energie z týchto chelátov (donor) na vhodné organické farbivo (akceptor). Účinnú dvojicu donor-akceptor všeobecne vytvorí taký donor, ktorého emisné spektrum sa prekrýva s absorpčným spektrom akceptora. Schéma procesu prenosu energie z donora na akceptor je uvedená na obr. 7-60. Ak sa použije donor s dlhým dosvitom (dlhou dobou zhášania) a akceptor s krátkym dosvitom, doba zhášania emisie akceptora sa predĺži a emitované žiarenie možno merať v časovo rozloženom móde. Doba zhášania emisie akceptora závisí od doby zhášania donora a účinnosti prenosu energie.

7 Analytické metódy 153 Použitie donora s dlhou dobou dosvitu (mikrosekundy až milisekundy) umožňuje časovo rozlíšené meranie emisie, čo je efektívna metóda na zníženie signálu pozadia (autofluorescencia, rozptyl, emisia priamo excitovaného akceptora), ktorý má dosvit v rozsahu nanosekúnd. Prenos energie Excitácia Donor (dlhý dosvit) Akceptor (krátky dosvit) Emisia predĺžený dosvit akceptora vyššia citlivosť Obr. 7-60 Prenos energie Donor absorbuje žiarenie zo zdroja a prechádza do excitovaného stavu; energia sa prenesie na akceptor, čím sa akceptor dostane do excitovaného stavu; akceptor emituje žiarenie Obvykle používané komplexy lantanoidov sa skladajú z iónov Eu 3+, Tb 3+, Sm 3+ a La 3+ a rôznych derivátov β-diketónov a aromatických amínov ako ligandov. Všeobecným problémom je malá stabilita týchto komplexov. Vyššia fotostabilita a zosilnenie signálu sa dosiahne vtedy, ak sa ako donor použijú polystyrénové nanočastice obsahujúce chelát lantanoidu s dlhou dobou dosvitu. Komerčne sú dostupné nanočastice založené na polystyréne (veľkosť 100-800 nm) obsahujúce veľmi veľké množstvo komplexu Eu 3+ s β-diketónom (napr. 30 000 častíc komplexu Eu 3+ s 2-naftoyl-trifluoracetónom sa nachádza na jednej 107 nm polystyrénovej častici). Ak sa tieto častice použijú ako donor energie, energia sa neradiačne prenáša z veľkého počtu excitovaných Eu-chelátov na jedinú časticu akceptora. V porovnaní s klasickým prenosom energie z jediného donora na jeden akceptor sa pri použití nanočastíc zvýši prenos energie na jediný akceptor a tým aj meraný emisný signál. Tento princíp sa použil na stanovenie 17β-estradiolu (E2) kompetitívnou TR-FIA založenou na prenose energie z nanočastice obsahujúcej Eu 3+ -chelát s dlhým dosvitom na akceptor vykazujúci fluorescenciu s krátkym dosvitom (obr. 7-61). Častice veľkosti 92 nm obsahujúce Eu 3+ -chelát boli pokryté vrstvou protilátky proti 17β-estradiolu. Ako akceptor sa použilo organické farbivo (AlexaFluor680) konjugované s 17β-estradiolom. Po ukončení kompetitívnej reakcie sa merala intenzita fluorescencie pri vlnovej dĺžke 730 nm v časovom intervale, ktorý bolo potrebné optimalizovať. Medza detekcie bola 70 pmol/l. Nanočastice možno využiť aj v nekompetitívnej TR-FIA. Ako príklad je na obr. 7-62 uvedený prenos energie po ukončení imunoreakcie pri stanovení PSA (špecifický antigén prostaty, biomarker rakoviny). Polystyrénové donorové nanočastice (107 nm) obsahujúce Eu 3+ -chelát sú pokryté prvou protilátkou proti PSA. Polystyrénové častice (3 μm) obsahujúce farbivo (TransFluoSphere, TFS) pokryté vrstvou druhej protilátky proti PSA sa použili ako akceptor. Keď PSA vytvorí imunokomplex so svojimi protilátkami, Eu častice a TFS častice sa priblížia dostatočne na to, aby nastal prenos energie z Eu 3+ na TFS. Koncentráciu PSA možno stanoviť meraním zosilnenej emisie TFS častíc vo vhodnom časovom intervale (medza detekcie < 0,1 ng/ml).

7 Analytické metódy 154 Nanočastica Eu-chelát (donor) s protilátkou proti E2 Emisia 615 nm dlhý dosvit Excitácia 340 nm Konjugát AlexaFluor680 (akceptor) s E2 Emisia 730 nm krátky dosvit Prenos energie Produkt imunoreakcie Zosilnená emisia 730 nm predĺžený dosvit akceptora Emisia 615 nm dlhý dosvit Obr. 7-61 Stanovenie 17β-estradiolu (E2) kompetitívnou TR-FIA (predĺžený dosvit akceptora sa meria pri 730 nm) Excitácia 340 nm Nanočastica Eu-chelát (donor) s protilátkou Polystyrénová častica TFS (akceptor) s protilátkou Emisia 615 nm dlhý dosvit Emisia 760 nm krátky dosvit Prenos energie TFS Produkt imunoreakcie Zosilnená emisia 760 nm predĺžený dosvit akceptora Emisia 615 nm dlhý dosvit Obr. 7-62 Stanovenie PSA nekompetitívnou TR-FIA PSA, protilátky proti PSA FIA založená na luminiscencii komplexov lantanoidov je značne rozšírená metóda v klinickej diagnostike a bioanalytickej chémii. Vďaka unikátnym spektrálnym vlastnostiam (veľmi dlhý luminiscenčný dosvit, veľký Stokesov posun a úzky profil emisného pásu) sú tieto komplexy veľmi výhodné pre TR-FIA na účinné oddelenie signálu pozadia. Ak sa použije dvojica donor-akceptor založená na prekrývajúcom sa emisnom a absorpčnom spektre, zvyšková emisia donora v oblasti vlnových dĺžok emisie akceptora limituje citlivosť

7 Analytické metódy 155 stanovenia, citlivosť závisí aj od kvantového výťažku fluorescencie donora. Okrem toho, počet donorov a akceptorov, ktoré môžu vytvoriť efektívny pár donor-akceptor, je limitovaný. Novým trendom je použitie takých donorov a akceptorov, ktorých spektrá sa neprekrývajú. Ich výhodou je, že citlivosť stanovenia nezávisí od kvantového výťažku donora, neprejavuje sa zvyšková emisia donora a rozšírila sa paleta použiteľných donorov a akceptorov. Chemiluminiscenčné metódy Na označenie antigénov alebo protilátok a ich následnú detekciu sa využíva aj chemiluminiscencia, najčastejšie v kombinácii s enzýmovými reakciami. Výhody chemiluminiscencie v imunoanalýze sú: o široký lineárny rozsah až šesť poriadkov, o rýchla emisia žiarenia predovšetkým vtedy, keď je žiarenie generované vo forme jediného záblesku, o vysoká stabilita mnohých reagentov a väčšiny konjugátov (po naviazaní sa často pozoruje zvýšená stabilita), o malá spotreba cenovo náročných netoxických reagentov, o krátky inkubačný čas, keďže sa všeobecne dosahuje vysoká citlivosť, o kompatibilita s homogénnym, heterogénnym, kompetitívnym, nekompetitívnym, priamym aj nepriamym imunostanovením. Využitie komplexu avidín-biotín a streptavidín-biotín Avidín (bielkovina izolovaná z vaječného bielka) a biotín (vitamín H) vytvárajú stabilný prakticky ireverzibilný komplex (afinitná konštanta K = 10 15 ), pričom jedna molekula avidínu viaže štyri molekuly biotínu nekovalentnými väzbami. Z praktického hľadiska je významné, že avidín a jeho deriváty dokážu v zložitej zmesi rozpoznať nielen voľný biotín, ale aj biotín naviazaný na látky s malou aj s veľkou molekulou a vytvoriť komplex avidín-biotín. Podobne ako avidín sa využíva aj streptavidín (Streptomyces avidínii), ktorý reaguje s biotínom tiež v pomere 1:4. Vysoká afinita avidínu k biotínu sa využíva v imunoanalýze na zvýšenie citlivosti stanovení. Na karboxylovú skupinu bočného reťazca biotínu sa zvyčajne naviaže bielkovinová protilátka (alebo iná molekula). Cyklická časť molekuly biotínu musí zostať nezmenená, pretože je nevyhnutná pre rozpoznanie a vznik väzby avidín-biotín. Na avidín sa najčastejšie naviaže niektorá zo značiek, napr. enzým (ALP alebo POD), fluorofor. Systémy s avidínom a biotínom sa využívajú v postupoch ELISA, imunoblottingu a afinitnej chromatografii. Príklady využitia komplexu avidín-biotín v imunoanalýze sú uvedené v tab. 7-2.

7 Analytické metódy 156 Tabuľka 7-2 Príklady využitia komplexu avidín-biotín v imunoanalýze Analyt Spôsob väzby Vzorka Metóda Apolipoproteín B B-Ab A-POD ELISA Feritín B-Ab A-POD ELISA hcg B-Ab A-POD ELISA Interleukin 2 B-Ab A-ALP ELISA IgA B-Ab A-POD ELISA IgE, IgG A-Ab B-erytrocyty Aglutinácia Encefalitída Ab B-Ag A-POD ELISA Karcioembryonálne Ag B-Ab A-POD ELISA A- avidín, B-biotín Imunochromatografické určenie troponínu T s využitím komplexu streptavidín-biotín Používajú sa dve pohyblivé protilátky (obr. 7-63), jedna z protilátok je označená zlatom, na dru hej je naviazaný biotín. Antigén, v tomto prípade troponín T, vytvára s týmito protilátkami sendvič. Nanesenie Reakčná Kontrolná Odčítanie vzorky zóna zóna vzorky Dve protilátky, jedna značená zlatom na druhej naviazaný biotín Peptid Membrána Streptavidín Vzorka séra obsahuje antigén Obr. 7-63 Imunochromatografické určenie troponínu T

7 Analytické metódy 157 V kontrolnej zóne doštičky je syntetický peptid, ktorý viaže protilátku označenú zlatom. Vznik tohto komplexu sa prejaví vznikom červeného prúžku, ktorý sa pozoruje vizuálne. V odčítacej zóne vzorky je streptavidín, ktorý viaže druhú protilátku (protilátku s naviazaným biotínom). Po nanesení 0,15 ml nezrážavej krvi do okienka doštičky sa erytrocyty odfiltrujú jednou zložkou doštičky a plazma difunduje do reakčnej zóny. Pri normálnom obsahu troponínu T sa v indikačnom okienku objaví jeden červený prúžok v kontrolnej zóne (výsledok testu je negatívny), pri zvýšenom obsahu troponínu T sa vytvoria dva prúžky (jeden v kontrolnej zóne a druhý v odčítacej zóne vzorky). V imunoanalýze sa dnes využívajú všetky vyššie uvedené techniky. Výber techniky závisí od účelu a zamerania príslušného laboratória (paleta metód a analytov). Popri rádiometrických metódach sa v klinickej chémii (biochémii) používajú hlavne metódy s fotometrickou alebo turbidimetrickou detekciou, teda také, ktoré nevyžadujú zvláštne prístrojové vybavenie. Laboratóriá zamerané na imunoanalýzu sa ale bez nákladných a špeciálnych analyzátorov na LIA, poprípade ECL, nezaobídu. Detekčné limity sú u metód FIA, FPIA a EIA na úrovni ng, pre RIA a IRMA sú to pg, pre LIA, ILMA až fg. Od zavedenia RIA (1959), ako prvej imunochemickej metódy s označeným reaktantom, prešli imunometódy výrazným vývojom. V prvej etape sa rozvíjali predovšetkým klasické kompetitívne metódy s jednou senzorovou protilátkou. V druhej etape sa vyvíjali nekompetitívne metódy, ktorých princíp merania umožňoval dosiahnuť lepšiu citlivosť stanovenia v porovnaní s kompetitívnymi metódami. Významné zlepšenie prinieslo zavedenie neizotopových značiek, ktoré v niektorých prípadoch umožnili dosiahnuť lepšiu citlivosť a špecifickosť ako rádioaktívne značky. Postupne sa objavili rôzne špeciálne prístupy a modifikácie v experimentálnom usporiadaní imunoanalýz, čím vznikli metódy a postupy, ktoré len ťažko možno označiť za typicky kompetitívne alebo nekompetitívne. Z tohto dôvodu bol zavedený pojem obsadenosť (occupancy) senzorovej (vychytávacej) protilátky. Všetky imunometódy sú potom založené na meraní frakčnej obsadenosti rozpoznávacích miest senzorovej protilátky a delia sa podľa toho, ako sa táto obsadenosť meria (obr. 7-64). Kompetitívne metódy sú založené na meraní neobsadených väzbových miest senzorovej protilátky. Ak sa merajú obsadené väzbové miesta senzorovej protilátky, sú to nekompetitívne metódy. V súčasnosti prebieha vývoj ultracitlivých mikrospotových imunometód, ktoré umožňujú jednou analýzou stanoviť desiatky analytov v malom množstve vzorky. Pri mikrospotových imunoanalýzach sa používajú mikroplôšky s rozmermi 10 až 50 μm pokryté senzorovou protilátkou o koncentrácii 0,05/K (K je asociačná konštanta senzorovej protilátky). Využívajú sa protilátky s hodnotami K poriadkov 10 10-10 12 l/mol, takže koncentrácie senzorovej protilátky sú 10-12 -10-14 mol/l. Výhodou je, že pre veľmi nízke koncentrácie protilátky obsadenosť väzbových miest F od koncentrácie protilátky nezávisí, a závisí iba od koncentrácie analytu. U bežných imunometód je koncentrácia senzorovej protilátky 0,5/K alebo vyššia. Mikrospot so senzorovou protilátkou sa vystaví pôsobeniu analyzovanej vzorky, pričom sa analyt naviaže na senzorovú protilátku. Potom sa použije vysoká koncentrácia vyvíjacej

7 Analytické metódy 158 protilátky. Vyvíjacia protilátka sa viaže buď na druhé väzbové miesto analytu (ak je dostatočne veľké), alebo na neobsadené miesta senzorovej protilátky v prípade, ak je analyt malý nekompetitívny alebo kompetitívny princíp (obr. 7-64). Mikrospot 10 μm Senzorová protilátka c = 10-12 mol/l Vzorka, analyt Vyvíjacia protilátka Vyvíjacia protilátka Kompetitívna metóda Nekompetitívna metóda Obr. 7-64 Mikrospotová imunoanalýza Na mikrospot s naviazanou senzorovou protilátkou sa nanesie vzorka. Analyt sa naviaže na senzorovú protilátku. Vyvíjacia protilátka sa viaže na neobsadené väzbové miesta senzorovej protilátky (kompetitívna metóda). Alebo sa vyvíjacia protilátka viaže na druhé väzbové miesto analytu priame meranie obsadenosti (nekompetitívna metóda) Ak je senzorová a vyvíjacia protilátka označená rozdielnou značkou, napr. rádioaktívnou, enzýmovou, chemiluminiscenčnou (obr. 7-65), možno určiť podiel obsadenosti senzorovej protilátky. Pomer signálov oboch značiek určí podiel obsadenosti senzorovej protilátky. Výhodné sú predovšetkým fluorescenčné značky, keďže umožňujú optické skenovanie mikrospotov.

7 Analytické metódy 159 Laser excitácia λ 1 Detektor emisia λ 3 Označená senzorová protilátka Monochromátor emisia λ 2 Označená vyvýjacia protilátka Obr. 7-65 Mikrospotová (AAI) imunoanalýza s dvoma protilátkami označenými dvoma fluorescenčnými značkami Pomer fotónov s λ 2 a λ 3 určuje hodnotu obsadenosti senzorovej protilátky, ktorá závisí od koncentrácie analytu vo vzorke Špeciálne technológie (ink-jet spotting) umožňujú vytvoriť niekoľko mikrospotov na malých plochách (napr. 196 mikrospotov na ploche priemeru 3 mm), čím sa získa mikrospotová matica (obr. 7-66). Ak každý mikrospot obsahuje senzorovú protilátku pre iný analyt, možno vykonať stanovenie viacerých analytov v jednej vzorke. Detekcia signálu v určitom presne definovanom mieste (x,y alebo r súradnice mikrospotu) poskytuje kvalitatívnu informáciu, jeho intenzita kvantitatívnu informáciu. Mikrospotové analýzy sú rovnako citlivé alebo citlivejšie než konvenčné analýzy a vyžadujú porovnateľnú dobu inkubácie. Laser λ 1 λ 3 λ 2 Obr. 7-66 Mikrospotová matica (Microspot array) na stanovenie viacerých analytov imunoanalýzou Každý mikrospot obsahuje senzorovú protilátku pre určitý analyt. Obsadenosť senzorovej protilátky sa určí z pomeru signálu fotónov s λ 2 a λ 3. Detail jedného mikrospotu je na obr. 7-65

7 Analytické metódy 160 7.7 Biosenzory Biosenzor je špeciálny typ chemického senzora, ktorý sa skladá z biologického rozpoznávacieho prvku a fyzikálno-chemického prevodníka. Biologický prvok rozpoznáva prítomnosť, aktivitu alebo koncentráciu špecifického analytu v roztoku. Toto rozpoznanie môže nastať na základe vzniku väzby (afinitný ligandový biosenzor, imunosenzor, kde rozpoznávacím prvkom je protilátka, úsek DNA alebo receptor bunky) alebo biokatalytickou reakciou (enzýmové biosenzory). Interakciou rozpoznávacieho prvku s analytom sa zmení určitá vlastnosť roztoku vzorky. Prevodník premieňa túto zmenu na merateľný elektrický signál. Prevodníky môžu byť elektrochemické, optické, hmotnostné a tepelné. 7.7.1 Enzýmové biosenzory Enzýmové elektródy Enzýmové elektródy sa skladajú z elektródy, na ktorej je imobilizovaný enzým (obr. 7-67). V praxi sa najčastejšie používajú membránové elektródy so zabudovaným enzýmom do membrány z polyamidovej tkaniny alebo s enzýmom fixovaným v polyakrylamidovom géli na celulóze. Najstabilnejšie sú elektródy s enzýmom naviazaným na syntetickú membránu kovalentnou väzbou. Enzýmové elektródy umožňujú merať koncentráciu takých zložiek, ktoré sú substrátom, aktivátorom alebo inhibítorom imobilizovaného enzýmu. Analyt difunduje do enzýmovej vrstvy, kde prebehne enzýmová reakcia. Zmena v reakčnej zmesi (úbytok reaktantu, prírastok produktu) sa deteguje elektrochemicky amperometricky alebo potenciometricky. Dialyzačná membrána Telo elektródy E + S ES E + P Analyt S Membrána s enzýmom E Obr. 7-67 Schéma enzýmovej elektródy s enzýmom imobilizovaným v membráne na čele elektródy Amperometrické biosenzory Amperometrické senzory merajú zmenu elektrického prúdu medzi indikačnou a referenčnou elektródou pri elektrochemickej reakcii pri konštantnom potenciáli. Využívajú enzýmovo katalyzovanú reakciu, v ktorej prírastok produktu alebo úbytok reaktantu možno merať amperometricky. Vhodné enzýmy sú oxidázy a dehydrogenázy.

7 Analytické metódy 161 V reakcii katalyzovanej oxidázou možno merať úbytok O 2 (redukcia na katóde) alebo prírastok H O (oxidácia na anóde). 2 2 Substrát + O oxidáza 2 produkt + H2O 2. - O + 2 H O + 4 e 4 OH 2 2 H 2 O 2 H + + O + 2 e. 2 2 V reakcii katalyzovanej dehydrogenázou sa sleduje prírastok množstva NADH (oxidácia na anóde). Substrát + NAD + dehydrogenáza produkt + NADH + H+ NADH NAD + + H + + 2 e. Stanovenie glukózy v krvi Prvý amperometrický biosenzor opísali Clark a Lyons. Bol to biosenzor na stanovenie glukózy v krvi. Roztok enzýmu glukózaoxidáza (GOD) bol fyzikálne zachytený medzi membránu priepustnú pre kyslík v kyslíkovej elektróde a vonkajšiu dialyzačnú membránu (obr. 7-68). Dialyzačná membrána prepúšťa kyslík a glukózu, ale proteíny a makromolekuly nie (vylučovanie podľa veľkosti). Galvanometer Pt katóda O 2 + 2 H 2 O + 4 e 4 OH - Dialyzačná membrána Membrána priepustná pre O 2 Ag/AgCl anóda Ag e Ag + Rozpustený enzým GOD Glukóza + O 2 GOD kyselina glukonová + H 2 O 2 Glukóza a O 2 vo vzorke Obr. 7-68 Schéma elektródy na stanovenie glukózy s enzýmom glukózaoxidáza imobilizovaným na čele Clarkovej kyslíkovej elektródy Elektróda sa najskôr ponorí do tlmivého roztoku. Kyslík difunduje z roztoku cez selektívnu membránu k elektróde, kde sa pri napätí 0,6-0,7 V redukuje. Meria sa elektrický prúd, ktorého veľkosť je úmerná východiskovej koncentrácii kyslíka v meranom roztoku. Po ustálení konštantnej hodnoty prúdu sa do roztoku pridá známy objem vzorky obsahujúcej glukózu. Prebehne enzýmová reakcia oxidácie glukózy, pri ktorej sa spotrebúva kyslík. Úbytok kyslíka po pridaní glukózy sa prejaví poklesom prúdu Glukóza sa za katalytického účinku enzýmu GOD oxiduje kyslíkom podľa reakcie: Glukóza + O 2 GOD kyselina glukonová + H2O 2. Úbytok kyslíka je úmerný koncentrácii glukózy a meria sa kyslíkovou elektródou (časť 7.2).

7 Analytické metódy 162 Ak sa zmení polarita elektród v kyslíkovej elektróde, to znamená, že platinová elektróda bude anóda vzhľadom na Ag/AgCl referenčnú elektródu, na anóde sa bude oxidovať H 2 O 2 vznikajúci pri oxidácii glukózy: H 2 O 2 H + + O + 2 e. 2 2 Aj v tomto prípade je nameraný prúd úmerný koncentrácii glukózy. Komerčne dostupné biosenzory na stanovenie glukózy využívajú detekciu H 2 O 2. Problémom je, že enzýmová reakcia oxidácie glukózy si vyžaduje prítomnosť dostatočného množstva kyslíka vo vzorke aj v kalibračných štandardoch, aby bola závislosť meraného prúdu od koncentrácie glukózy lineárna. Okrem toho jediným dôvodom zmeny koncentrácie kyslíka má byť jeho reakcia s glukózou. Na oxidáciu H 2 O 2 na elektróde je potrebné použiť pomerne vysoký potenciál (0,7 V) oproti Ag/AgCl, čo je spojené s interferenciami napr. v dôsledku oxidácie kyseliny askorbovej alebo močoviny. Niektoré biosenzory sú vybavené rôznymi membránami, ktoré zamedzujú prístup interferujúcich zložiek k elektróde (membrána z acetylovanej celulózy vylučovanie interferujúcich zložiek podľa veľkosti, Nafion vylučovanie podľa náboja). Problémy súvisiace s vplyvom kyslíka sa najčastejšie riešia použitím iných mediátorov (iných akceptorov elektrónov namiesto kyslíka v reakcii oxidácie glukózy). Ak je mediátorom kyslík, reakciu katalyzovanú enzýmom oxidáza možno opísať rovnicami: S + E ox EoxS P + Ered O 2 + E red H 2 O 2 + E ox na elektróde H 2 O 2 2 H + + O 2 + 2 e. Ak je mediátorom Med, reakciu katalyzovanú enzýmom oxidáza možno opísať rovnicami: S + E ox E ox S P + E red Med ox + Ered Med red + E ox na elektróde Med red Med. ox Ak je mediátorom kyslík, reakciu oxidácie glukózy možno opísať rovnicami: Glukóza + GOD ox GOD ox Glukóza kyselina glukonová + GOD red O 2 + GOD red H 2 O 2 + GOD ox na elektróde H 2 O 2 2 H + + O 2 + 2 e. Ak je mediátorom Med, reakciu oxidácie glukózy možno opísať rovnicami: Glukóza + GOD ox GOD ox Glukóza kyselina glukonová + GOD red Med ox + GOD red Med red + GOD ox na elektróde Med red Med. ox Mediátory, zvyčajne imobilizované spolu s enzýmom, prenášajú elektróny k povrchu anódy a na povrchu sa oxidujú. Redukovaná GOD (GOD red ) z enzýmovej reakcie sa reoxiduje elektrochemicky generovanou oxidovanou formou mediátora Med a výsledkom je cyklický reakčný mechanizmus (obr. 7-69). ox

7 Analytické metódy 163 Ako mediátor sa používa dimetylferocén (Med red ) imobilizovaný spolu s GOD na grafitovej elektróde. Jeho oxidovaná forma Med ox je dimetylfericín a vzniká oxidáciou na elektróde. Prúd, ktorý vzniká v priebehu tohto cyklického mechanizmu, je úmerný koncentrácii glukózy vo vzorke. Mediátory umožňujú pracovať pri nižších potenciáloch (0,2 V), eliminujú závislosť meraného prúdu od koncentrácie kyslíka a tiež znižujú interferencie vznikajúce v dôsledku oxidácie iných zložiek vzorky. e Med red Med ox GOD red GOD ox Glukóza Kyselina glukonová Cyklické regenerovanie mediátora (Med) v biosenzore pre glukózu. ox - oxidovaná, red - redukovaná forma Elektróda Obr. 7-69 Schéma využitia redox mediátora Použitie inej oxidoreduktázy než GOD poskytuje teoretické možnosti na stanovenie iných klinicky zaujímavých zložiek (alkohol, cholesterol, kreatinín). Stanovenie laktátu v krvi Biosenzor na stanovenie laktátu obsahuje enzým laktátdehydrogenáza (LD), ktorý katalyzuje reakciu laktátu s kofaktorom NAD +. Reakciou vzniknutý NADH sa oxiduje na anóde. Veľkosť oxidačného prúdu je priamoúmerná koncentrácii laktátu. Oxidačnou reakciou sa regeneruje NAD +, ktorý sa využije na ďalšie stanovenie. Laktát + NAD + NADH NAD + + H + + 2 e. LD pyruvát + NADH + H + Na oxidáciu NADH je potrebný pomerne vysoký potenciál 0,8 V vs. Ag/AgCl. Ak je súčasťou 3- biosenzora aj mediátor Fe(CN) 6 a druhý enzým diaphoráza, potom postačuje potenciál 0,3 V vs. Ag/AgCl. NADH + 2 Fe(CN) 6 3- diaphoráza NAD + 4- + 2 Fe(CN) 6 + H +. Stanovenie etanolu V biosenzoroch na stanovenie etanolu je enzým alkoholdehydrogenáza (ADH) imobilizovaný na platinovej alebo uhlíkovej anóde. Enzým ADH katalyzuje reakciu etanolu s kofaktorom NAD +. Reakciou vzniknutý NADH sa oxiduje na anóde. Veľkosť oxidačného prúdu je priamo úmerná koncentrácii etanolu. Oxidačnou reakciou sa regeneruje NAD +, ktorý sa využije na ďalšie stanovenie (obr. 7-70). C 2 H 5 OH + NAD + NADH NAD + + H + + 2 e. ADH C2H 4 O + NADH + H +.

7 Analytické metódy 164 Elektróda e NADH NAD + ADH C 2 H 4 O C 2 H 5 OH Obr. 7-70 Cyklické regenerovanie NAD + v elektrochemickom biosenzore na stanovenie etanolu Potenciometrické biosenzory Stanovenie močoviny v sére Enzým ureáza katalyzuje hydrolýzu močoviny, pri ktorej vzniká NH 3. NH 3 vo vode hydrolyzuje. NH 2 -CO-NH 2 + H 2 O NH 3 + H 2 O NH 4 + + OH -. ureáza CO2 + 2 NH 3 Vlastné stanovenie je založené na meraní aktivity iónov NH 4 + použitím iónovo-selektívnej NH 4 + elektródy so zakotvenou ureázou. Elektróda je vhodná pre ph < 8. Problémom v praktickom využití potenciometrických biosenzorov v klinickej chémii je ich citlivosť, ktorá je nižšia ako u amperometrických senzorov a tiež vplyv ďalších zložiek roztoku na hodnotu meraného potenciálu. Lepšie výsledky sa dosahujú použitím FET (field-effect transistor), čo sú polovodičové senzory. FET sa používajú na monitorovanie náboja na povrchu elektródy, ktorý vznikol v medzere medzi tzv. source a drain elektródou. Povrchový potenciál sa mení s koncentráciou analytu. Bunkové elektródy Bunkové elektródy sa pripravujú podobným spôsobom ako enzýmové elektródy. Reakčnú vrstvu v tomto prípade netvoria enzýmy, ale mikrobiálne bunky vhodne zachytené na povrchu senzora. Stanovenie môže byť založené na využití enzýmov obsiahnutých v mikrobiálnych bunkách alebo na zložitejších procesoch (napr. bunkové dýchanie, ktoré možno sledovať Clarkovou kyslíkovou elektródou). Sledovanie bunkového dýchania sa využíva napr. pri stanovení antibiotík. Antibiotikum usmrtí mikroorganizmus obsiahnutý v bunkovej elektróde. Usmrtenie buniek sa prejaví stratou dýchania. Pomocou Clarkovej kyslíkovej elektródy sa meria pokles spotreby kyslíka, ktorý je úmerný koncentrácii antibiotika. Pri stanovení vitamínov obsahuje reakčná vrstva taký mikroorganizmus, ktorého rast závisí od koncentrácie stanovovaného vitamínu. Tkanivové elektródy Ako zdroj enzýmov sa môžu použiť aj tenké rezy živočíšneho alebo rastlinného tkaniva upevnené na elektródu. Kyslíková elektróda s upevneným rezom zo šupiek uhorky umožňuje

7 Analytické metódy 165 stanoviť vitamín C (askorbátoxidáza prítomná v uhorke katalyzuje oxidáciu kyseliny askorbovej na kyselinu dehydroaskorbovú). Výhody enzýmových elektród Enzýmové elektródy sa pomerne jednoducho konštruujú, pričom spotreba enzýmu na prípravu elektródy je veľmi malá a náklady na analýzu sú minimálne. Enzýmy sa pri reakcii nespotrebúvajú, elektródy preto možno používať aj niekoľko týždňov až mesiacov. Meranie je rýchle a jednoduché (až 60 analýz za 1 h), elektródy sú vhodné na kontinuálne automatizované monitorovanie aj zakalených a fluoreskujúcich roztokov. Ich nevýhodou je nedostupnosť v potrebnom sortimente. Komerčne sú dostupné len elektródy na stanovenie glukózy, laktátu, močoviny a kreatinínu, aj keď sú opísané postupy na stanovenie mnohých iných zložiek ako fenylalanín, tyrozín, močovina, kyselina močová, kyselina šťavelová, cholesterol, kreatín a vitamín C. Optické enzýmové biosenzory Optické biosenzory sú najpopulárnejšie senzory, pretože sú nedeštrukčné a umožňujú rýchle generovanie a načítavanie signálu. Zavedenie optických vlákien (optody) ako optických vodičov a zdokonalenie optoelektroniky zlepšilo univerzálnosť týchto zariadení pre rôzne klinické aplikácie. Optické senzory založené na meraní fluorescencie, luminiscencie a odraze žiarenia sa využívajú sa stanovenie substrátov rôznych reakcií katalyzovaných enzýmami. Testovací prúžok na určenie glukózy v moči bol pravdepodobne prvý optický biosenzor pre klinické aplikácie (rok 1957). Enzýmy GOD a POD boli spolu imobilizované na celuloidovom prúžku. Enzýmovou reakciou vznikajúci H 2 O reagoval s imobilizovaným o-tolidínom za vzniku farebného produktu. 2 Okrem zavádzania testovacích prúžkov pre ďalšie analyty sa rozvíjajú nové senzory založené na optických vláknach s imobilizovaným enzýmom a indikátorovým farbivom. Tieto senzory sú založené na optickej detekcii ph, NH 3, CO 2, O 2, H2O2 a NADH, teda zložiek súvisiacich s enzýmovými reakciami katalyzovanými oxidázou, deaminázou, dekarboxylázou, hydrolázou esterov a dehydrogenázou. Optody na meranie ph a po 2 sa využívajú nielen ako už uvedené senzory na meranie ph a po 2 v analyzátoroch krvi (časť 7.1), ale tvoria aj základ optických enzýmových biosenzorov. Napr. na optode na meranie po 2 je imobilizovaný enzým oxidáza spolu s fluorescenčným indikátorom. Optoda meria zhášanie fluorescencie indikátora prítomným kyslíkom. Výsledkom enzýmovej reakcie katalyzovanej oxidázou je pokles koncentrácie kyslíka, čo vedie k zníženiu zhášania fluorescencie indikátora. Meraná intenzita fluorescencie je úmerná koncentrácii substrátu enzýmovej reakcie. Stanovenie glukózy Na obr. 7-71 je optoda na stanovenie glukózy. Optoda obsahuje fluorescenčné farbivo Ru(1,10- fenantrolín) 3 2+ citlivé na kyslík imobilizované spolu s GOD na optickom vlákne. Kyslík spôsobuje zhášanie fluorescencie tohto farbiva. Úbytok kyslíka v dôsledku enzýmovej reakcie oxidácie glukózy sa teda prejaví nárastom intenzity fluorescencie farbiva (zníži sa zhášanie). Toto zvýšenie intenzity fluorescenecie je úmerné koncentrácii glukózy vo vzorke. Podobný princíp sa využíva aj v biosenzore na stanovenie cholesterolu a bilirubínu.

7 Analytické metódy 166 Okrem poklesu koncentrácie kyslíka je výsledkom enzýmovej oxidácie glukózy aj zmena ph. Zmenu ph možno merať optickým senzorom s fluoresceínom ako indikátorovým farbivom. Protonizovaná forma fluoresceínu nevykazuje fluorescenciu, avšak jeho konjugovaná zásada emituje fluorescenčné žiarenie pri vlnovej dĺžke 530 nm (excitácia pri 490 nm). Pracovný rozsah optody s fluoresceínom je v intervale ph 6,8-7,2. Nevýhodou je, že signál optody závisí od iónovej sily vzorky a prejavuje sa tiež vplyv ph vzorky. Optické vlákno Nosič z polyesteru Silikónová vrstva obsahujúca 2+ farbivo Ru(1,10-fenantrolín) 3 Optická izolácia z uhlíka Imobilizovaná GOD Obr. 7-71 Biosenzor na stanovenie glukózy založený na optode pre kyslík Stanovenie laktátu Optické senzory založené na dehydrogenázach majú výhodu v tom, že vznikajúci NADH možno detegovať priamo, bez použitia indikátorového farbiva. Napr. optoda na stanovenie laktátu s enzýmom LD založená na reakcii: Laktát + NAD + LD pyruvát + NADH + H + meria intenzitu fluorescencie pri vlnovej dĺžke 450 nm reakciou vznikajúceho NADH. Nevýhodou je, že do vzorky je nutné pridať NAD + (optoda nie je sebestačná). Využitie enzýmových biosenzorov v klinickej chémii Najrozšírenejšie je využitie enzýmových senzorov na stanovenie glukózy v plnej krvi, sére, plazme a moči. Využívajú sa optické alebo amperometrické senzory, buď ako jednoúčelové, ale tiež ako súčasť multifunkčných elektrochemických senzorov (obr. 7-72). Biosenzory umožňujú stanovenie glukózy nielen in vitro, ale aj in vivo. V súčasnosti sú komerčne dostupné biosenzory, ktoré sa implantujú pod kožu a umožňujú monitorovanie glukózy v priebehu 1-2 týždňov.

7 Analytické metódy 167 Odpad Prietoková cela Protielektróda Glukóza Laktát pco 2 ph K + Ca 2+ Na + Referenčná elektróda po 2 Vzorka Obr. 7-72 Multifunkčný elektrochemický biosenzor 7.7.2 Imunosenzory Biosenzory, ktoré monitorujú interakciu antigénu s protilátkou sa označujú ako imunosenzory. Na tuhom povrchu nosiča je imobilizovaný antigén alebo protilátka, ktorý špecificky interaguje s analytom. Zmeny, ku ktorým dochádza v dôsledku tejto interakcie sa merajú elektrochemickými, optickými, hmotnostnými alebo tepelnými senzormi. Elektrochemické imunosenzory Amperometrické imunosenzory Amperometrické imunosenzory sa delia na priame (homogénne) a nepriame (heterogénne). Priame imunosenzory poskytujú výsledok v reálnom čase, nevyžadujú separačný stupeň. Naopak, nepriame imunosenzory vyžadujú zaradenie separačného kroku a ďalšej reakcie, ktorou vzniká merateľný produkt. Väčšina imunoreaktantov (antigény, protilátky, hormóny) nie je schopná zúčastňovať sa oxidačnoredukčnej reakcie (základ amperometrie) priamo. Imunoreakcia sa v tomto prípade využíva ako základ selektívneho rozpoznávania analytu a jej spojenie s amperometrickou detekciou si vyžaduje označenie jedného z reaktantov. Ako značky sa používajú enzýmy, ktoré umožňujú vznik elektroaktívnych zložiek a tieto sa potom merajú. Stanovenie hcg Amperometrický imunosenzor na stanovenie ľudského choriového gonadotropínu (hcg) využíva kompetitívnu heterogénnu imunometódu ELISA (obr. 7-73).

7 Analytické metódy 168 Monoklonálna protilátka proti hcg je imobilizovaná (obr. 7-73) na kyslíkovej elektróde. hcg zo vzorky a hcg označený enzýmom katalázou súťažia o väzbové miesta protilátky na povrchu elektródy. Nešpecificky viazaný hcg sa vymyje a elektróda sa ponorí do roztoku obsahujúceho H2O 2. Pôsobením enzýmu kataláza vzniká z H2O 2 kyslík, ktorý sa meria kyslíkovou elektródou. Veľkosť katodického prúdu je nepriamo úmerná koncentrácii produkovaného kyslíka, a tým aj koncentrácii hcg v sére. Čím väčšia bude koncentrácia hcg vo vzorke, tým viac ho bude naviazaného v imunokomplexe so špecifickou protilátkou, a tým menej vznikne imunokomplexu s enzýmom označeným hcg (nameria sa nižší katodický prúd). Galvanometer Pt katóda O 2 + 2 H 2 O + 4 e 4 OH - Ag/AgCl anóda Ag e Ag + Polymérová membrána Membrána priepustná pre O 2 Protilátka proti hcg hcg Enzým kataláza H 2 O 2 O 2 Obr. 7-73 Amperometrický imunosenzor na nepriame stanovenie hcg Predchádzajúce amperometrické stanovenie vyžadovalo zaradenie separačného stupňa, (vymývanie nenaviazaného analytu označeného enzýmom), avšak amperometrický imunosenzor umožňuje aj priame stanovenie. Príklad priameho stanovenia hcg je na obr. 7-74. Prvá protilátka (vychytávacia) proti hcg je kovalentne naviazaná na mikroporéznej nylonovej membráne pokrytej zlatom. Membrána plní jednak funkciu tuhého nosiča pre sendvičovú imunoanalýzu, ale tiež pracovnej elektródy amperometrického senzora. Druhá protilátka proti hcg je označená enzýmom ALP a inkubuje sa so vzorkou a vychytávacou protilátkou imobilizovanou na elektróde. Označená protilátka viazaná do sendviča je priestorovo oddelená od nadbytku označenej protilátky. Substrát (p-aminofenylfosfát) sa privádza z druhej strany poréznej membrány. Substrát difunduje cez membránu a najskôr reaguje s enzýmom naviazaným do sendviča. p-aminofenylfosfát + H 2 O ALP p-aminofenol + H3PO 4. Elektroaktívny produkt tejto reakcie, p-aminofenol, sa oxiduje na zlatej elektróde pri potenciáli 1,9 V vs. Ag/AgCl. Veľkosť prúdu je priamoúmerná koncentrácii hcg vo vzorke.

7 Analytické metódy 169 Protilátka označená enzýmom ALP Vzorka Inkubácia Mikroporézna membrána so zlatom (elektróda) a vychytávacou protilátkou Pridať substrát p-aminofenylfosfát Inkubácia Ag/AgCl Pt Au Pripojiť elektródy p-aminofenol ο vzniká na povrchu elektródy Vložiť U=konšt p-aminofenylfosfát + H 2 O ALP p-aminofenol + H 3 PO 4 Potenciostat Ag/AgCl Pt Au Merať I I t/s c e p-aminofenol + 6 OH - - 6 e p-nitrofenol + 4 H 2 O Obr. 7-74 Amperometrický imunosenzor na priame stanovenie hcg Potenciometrické imunosenzory U potenciometrickým imunosenzorov sa vyskytujú podobné problémy ako u enzýmových biosenzorov nedostatočná citlivosť a selektivita. Vývoj tohto typu imunosenzorov sa v podstate zastavil, určitá nádej, pokiaľ ide o klinické aplikácie, sa vkladá do spojenia FET s iónovoselektívnymi elektródami (ISFET). V literatúre sa objavuje opis rôznych elektrochemických imunosenzorov už asi 25 rokov, ale zatiaľ tento typ biosenzorov nie je komerčne dostupný.

7 Analytické metódy 170 Elektrochemiluminiscencia Z komerčne dostupných imunosenzorov sa elektrochemickému najviac približuje imunosenzor, ktorý na monitorovanie imunochemickej reakcie využíva kombináciu elektrochemického a optického mechanizmu známeho pod názvom elektrochemiluminiscencia. Elektrochemiluminiscencia je proces, pri ktorom určitá zložka po elektrochemickej excitácii emituje luminiscenčné žiarenie. Značkou, ako je Ru(bpy) 3 2+ [ruténium tris(2,2 )-bipyridyl], sa označí protilátka. Tento komplex ruténia sa spolu s druhým reaktantom (tripropylamín, TPA) oxiduje na povrchu elektródy. Obidva reaktanty postupne prechádzajú sériou chemických reakcií, ktorých výsledkom je prechod ruténia do excitovaného stavu. Ruténium pri prechode z excitovaného do základného stavu emituje luminiscenčné žiarenie. Značka Ru(bpy) 3 2+ prechádza mnohými excitačno-emisnými cyklami, čím sa znásobuje intenzita emitovaného žiarenia, a preto sa dosiahne vysoká citlivosť stanovenia. V experimentálnom usporiadaní je vychytávacia protilátka pre analyt imobilizovaná na magnetickej gulôčke (obr. 7-75). TPA h ν 610 nm streptavidín biotín vychytávacia protilátka analyt druhá protilátka 2+ značka Ru(bpy) 3 Obr. 7-75 Elektrochemiluminiscenčný imunosenzor vychytávacia protilátka je na magnetickej gulôčke viazaná pomocou komplexu streptavidín-biotín, druhá protilátka je označená s Ru(bpy) 2+ 3, TPA je tripropylamín) Používa sa sendvičová metóda, pričom magnet drží gulôčku na povrchu elektródy. Takto sa vlastne separuje viazaná a neviazaná označená druhá protilátka. Preto sa len značky viazané na vychytávacích magnetických zrnkách excitujú potenciálom vkladaným na elektródu. Tento typ senzora sa vyrába aj v prevedení pre kompetitívnu imunoanalýzu. Optické imunosenzory Optické imunosenzory sú vhodné na monitorovanie imunoreakcií, na stanovenie klinicky zaujímavých antigénov, na štúdium kinetiky a afinitných interakcií antigénu s protilátkou. V analýze biomolekúl sú najrozšírenejšie a tvoria najrozsiahlejšiu skupinu biosenzorov. Môžu byť priame (nevyžadujú označenie reaktantu) a nepriame (so značkou fluorescencia, chemi- alebo bioluminiscencia).