1/3 / 2 1 7 Σ ε λ ί δ α 1 of 8 ΕΡΓΑΣΤΗΡΙΑΚΗ ΑΝΑΦΟΡΑ ΘΕΜΑ: Ποσοτικός Προσδιορισμός ολευρωπεΐνης σε δείγματα φύλλων ελιάς. ΗΜ/ΝΙΑ: 1/3/217 OLL-2 Ημ/νία παραλαβής: 25/11/214 Αποξηραμένα φύλλα αγριελιάς (ΑΡΧΑΙΑ ΙΘΩΜΗ, ΜΕΣΣΗΝΙΑ) OLL-3 Αποξηραμένα φύλλα αγριελιάς (ΦΟΙΝΙΚΙ ΜΕΣΣΗΝΙΑΣ) Ημ/νία παραλαβής: 25/11/214 OLL-4 Αποξηραμένα φύλλα αγριελιάς (ΚΡΙΣΚΟ) ΜΑΡΙΝΗΣ Ημ/νία παραλαβής: 25/11/214 PharmaGnose, Papathanasiou 24, 341, Chalkida, Euboea, Greece.
1/3 / 2 1 7 Σ ε λ ί δ α 2 of 8 OLL-5 Αποξηραμένα φύλλα αγριελιάς (ΓΑΡΓΑΛΙΑΝΟΙ ΜΕΣΣΗΝΙΑΣ) Ημ/νία παραλαβής: 25/11/214 OLL-6 Αποξηραμένα φύλλα αγριελιάς (ΜΥΣΤΡΑΣ) Κλαδιά από τρία διαφορετικά δέντρα Ημ/νία παραλαβής: 25/11/214 OLL-7 Αποξηραμένα φύλλα αγριελιάς (ΜΥΣΤΡΑΣ) Κλαδιά από τρία διαφορετικά δέντρα Ημ/νία παραλαβής: 25/11/214 OLL-8 Αποξηραμένα φύλλα αγριελιάς (ΜΥΣΤΡΑΣ) Κλαδιά από τρία διαφορετικά δέντρα Ημ/νία παραλαβής: 25/11/214 Validated report by: Analytical Department PharmaGnose, Papathanasiou 24, 341, Chalkida, Euboea, Greece.
1/3 / 2 1 7 Σ ε λ ί δ α 3 of 8 A. ΕΚΧΥΛΙΣΗ / ΠΡΟΕΤΟΙΜΑΣΙΑ ΔΕΙΓΜΑΤΟΣ Με σκοπό τον ποσοτικό προσδιορισμό της ολευρωπεΐνης από τα φύλλα ελιάς (κωδικοί δείγματος OLL-2, ΟLL-3, OLL-4, OLL-5, OLL-6, OLL-7, OLL-8), εφαρμόστηκε η μέθοδος εκχύλισης που περιγράφεται στη μονογραφία των φύλλων ελιάς (Oleae folium 1/29:1878) της Ευρωπαϊκής Φαρμακοποιίας (8 th Edition). Συγκεκριμένα, τα αποξηραμένα και κονιοποιημένα φύλλα ελιάς εκχυλίστηκαν με μεθανόλη για 3 λεπτά υπό ανάδευση και θέρμανση. Μετά από διήθηση, τα μεθανολικά εκχυλίσματα που προκύπτουν από εδώ και στο εξής TPF-OLL-2, TPF- OLL-3, TPF-OLL-4, TPF-OLL-5, TPF-OLL-6, TPF-OLL-7 και TPF-OLL-8 αραιώνονται με νερό και οδηγούνται προς ανάλυση. Η διαδικασία της εκχύλισης επαναλαμβάνεται συνολικά τρεις φορές. B. ΑΝΑΛΥΣΗ HPLC-DAD Χρησιμοποιώντας την τεχνική της υγρής χρωματογραφίας υψηλής απόδοσης με ανιχνευτή συστοιχίας φωτοδιόδων (HPLC-DAD) πραγματοποιήθηκε ο ποσοτικός προσδιορισμός του σεκοϊριδοειδούς στα δείγματα TPF-OLL-2, TPF- OLL-3, TPF-OLL-4, TPF-OLL-5, TPF-OLL-6, TPF-OLL-7 και TPF-OLL-8. Πειραματικές συνθήκες Συσκευή: THERMO HPLC SYSTEM Κωδικοί Δείγματος: TPF-OLL-2, TPF-OLL-3, TPF-OLL-4, TPF-OLL-5, TPF-OLL-6, TPF-OLL-7 και TPF-OLL-8. Διαλύτης Δείγματος: Μεθανόλη/Νερό Ημ/νία Ανάλυσης: 1/2/217 Στήλη: Discovery, HS C18 Μέγεθος στήλης: 15 cm x 4.6 mm Μέγεθος σωματιδίων πληρωτικού υλικού: 5μm Θερμοκρασία στήλης ( ο C): 4 Πίεση (psi): 25-3 Ρυθμός ροής (ml/min): 1 Ενέσιμος όγκος δείγματος (μl): 2 Θερμοκρασία δείγματος: RT Ανίχνευση: Υπεριώδες Ανιχνευτής Συστοιχίας Φωτοδιόδων (PDA) Κινητή φάση: Βαθμωτό σύστημα Χρόνος Ροή %A %B %C %D B = Ακετονιτρίλιο έκλουσης: 1.1 1.. 2.. 98. D = Νερό,.2% Οξικό οξύ 2 4. 1.. 3.. 7. 3 45. 1.. 3.. 7. 4 5. 1.. 2.. 98. PharmaGnose, Papathanasiou 24, 341, Chalkida, Euboea, Greece.
1/3 / 2 1 7 Σ ε λ ί δ α 4 of 8 Αποτελέσματα TPF-OLL-2 Εικόνα 1: Χρωματογράφημα RP-HPLC-DAD (28 nm) του αναλυόμενου δείγματος TPF-OLL- 2, όπου επισημαίνεται η κορυφή που αντιστοιχεί στην. 12 1 Detector 1-28nm TPF-OLL-3 12 1 8 8 6 6 4 4 2 2. 2.5 5. 7.5 1. 12.5 15. 17.5 2. 22.5 25. 27.5 3. 32.5 35. 37.5 4. 42.5 45. 47.5 5. Εικόνα 2: Χρωματογράφημα RP-HPLC-DAD (28 nm) του αναλυόμενου δείγματος TPF-OLL- 3, όπου επισημαίνεται η κορυφή που αντιστοιχεί στην. PharmaGnose, Papathanasiou 24, 341, Chalkida, Euboea, Greece.
1/3 / 2 1 7 Σ ε λ ί δ α 5 of 8 25 225 Detector 1-28nm OLL117 TPF-OLL-4 25 225 2 2 175 175 15 15 125 125 1 1 75 75 5 5 25 25-25 -25. 2.5 5. 7.5 1. 12.5 15. 17.5 2. 22.5 25. 27.5 3. 32.5 35. 37.5 4. 42.5 45. 47.5 5. Εικόνα 3: Χρωματογράφημα RP-HPLC-DAD (28 nm) του αναλυόμενου δείγματος TPF-OLL- 4, όπου επισημαίνεται η κορυφή που αντιστοιχεί στην. Detector 1-28nm 6 TPF-OLL-5 6 5 5 4 4 3 3 2 2 1 1. 2.5 5. 7.5 1. 12.5 15. 17.5 2. 22.5 25. 27.5 3. 32.5 35. 37.5 4. 42.5 45. 47.5 5. Εικόνα 4: Χρωματογράφημα RP-HPLC-DAD (28 nm) του αναλυόμενου δείγματος TPF-OLL- 5, όπου επισημαίνεται η κορυφή που αντιστοιχεί στην. PharmaGnose, Papathanasiou 24, 341, Chalkida, Euboea, Greece.
1/3 / 2 1 7 Σ ε λ ί δ α 6 of 8 6 Detector 1-28nm TPF-OLL-6 6 5 5 4 4 3 3 2 2 1 1. 2.5 5. 7.5 1. 12.5 15. 17.5 2. 22.5 25. 27.5 3. 32.5 35. 37.5 4. 42.5 45. 47.5 5. Εικόνα 5: Χρωματογράφημα RP-HPLC-DAD (28 nm) του αναλυόμενου δείγματος TPF-OLL- 6, όπου επισημαίνεται η κορυφή που αντιστοιχεί στην. 4 Detector 1-28nm TPF-OLL-7 4 35 35 3 3 25 25 2 2 15 15 1 1 5 5. 2.5 5. 7.5 1. 12.5 15. 17.5 2. 22.5 25. 27.5 3. 32.5 35. 37.5 4. 42.5 45. 47.5 5. Εικόνα 6: Χρωματογράφημα RP-HPLC-DAD (28 nm) του αναλυόμενου δείγματος TPF-OLL- 7, όπου επισημαίνεται η κορυφή που αντιστοιχεί στην. PharmaGnose, Papathanasiou 24, 341, Chalkida, Euboea, Greece.
1/3 / 2 1 7 Σ ε λ ί δ α 7 of 8 TPF-OLL-8 Εικόνα 7: Χρωματογράφημα RP-HPLC-DAD (28 nm) του αναλυόμενου δείγματος TPF-OLL- 8, όπου επισημαίνεται η κορυφή που αντιστοιχεί στην. Ποσοτικός προσδιορισμός ς Στο μεθανολικό εκχύλισμα των δειγμάτων φύλλων ελιάς, πραγματοποιήθηκε ποσοτικός προσδιορισμός της ς με χρήση της τεχνικής HPLC-DAD. Για το σκοπό αυτό, κατασκευάσθηκε καμπύλη βαθμονόμησης (Εικόνα 8) και η ανάλυση πραγματοποιήθηκε στα 28 nm. 8 6 y = 2227x + 27981 R² =,9999 4 2 5 1 15 2 25 3 35 Εικόνα 8: Καμπύλη βαθμονόμησης ς (1-3 μg/ml). PharmaGnose, Papathanasiou 24, 341, Chalkida, Euboea, Greece.
1/3 / 2 1 7 Σ ε λ ί δ α 8 of 8 Πίνακας 2: Ποσοτική ανάλυση των υπό μελέτη δειγμάτων. Κωδικός δείγματος (%) TPF-OLL-2 4.48 TPF-OLL-3 7.9 TPF-OLL-4 1.6 TPF-OLL-5 3.1 TPF-OLL-6 3.5 TPF-OLL-7 1.4 TPF-OLL-8 1.98 ΣΧΟΛΙΑ - ΠΑΡΑΤΗΡΗΣΕΙΣ Από τα χρωματογραφήματα των Εικόνων 1-7 διαπιστώνεται ότι τα υπό μελέτη εκχυλίσματα φύλλων ελιάς είναι πλούσια σε δευτερογενείς μεταβολίτες, με κύριο συστατικό το γλυκοζυλιωμένο σεκοϊριδοειδές. Από τον ποσοτική ανάλυση που πραγματοποιήθηκε στα επτά δείγματα φύλλων ελιάς, βρέθηκε ότι το δείγμα με κωδικό TPF-OLL-3 είναι το πιο πλούσιο σε Ολευρωπεϊνη συγκριτικά με τα υπόλοιπα καθότι περιέχει 7.9%, ποσοστό αρκετά υψηλό συγκρινόμενο με βιβλιογραφικά δεδομένα και με αντίστοιχες αναλύσεις που έχουν πραγματοποιηθεί στο Εργαστήριό μας. PharmaGnose, Papathanasiou 24, 341, Chalkida, Euboea, Greece.