Univerza v Mariboru Fakulea za kemijo in kemijsko ehnologijo Maja Habulin, Maeja Primožič Biokemijska ehnika Navodila za laboraorijske vaje (zbrano gradivo) Recenzen: izr. prof. dr. Mojca Škerge Maribor, 2008
Navodila za delo v mikrobiološkem laboraoriju 1. V laboraorij vsopamo v zaščinih haljah. Pri delu uporabljamo zaščine rokavice. 2. V laboraoriju ne jemo in ne pijemo!!! Ker se lahko inficiramo skozi usa, nos, oči in kožo, pri delu ne dajemo ničesar v usa (svinčnik, peresa, seklovina id.). 3. Z živimi mikrobi delamo previdno in asepično ob plamenu plinskega gorilnika. 4. Pri delu z gorilnikom pazimo, da nam plamen ne ožge kože, las ali halje. 5. Med delom z mikrobi in kužnino so vraa in okna zapra, da zračni ok ne nosi mikrobov po laboraoriju. 6. Pri delu pazimo, da mikrobnih kulur ne polivamo po mizi, po leh in obleki. Z rokami se ne doikamo kolonij in suspenzij živih mikrobov. Če pride kužnina v sik s kožo ali delavno površino, obvesimo asisena ali ehničnega sodelavca. Konaminirano delovno površino pokrijemo s saničevino in jo prelijemo z razkužilom. Razkužilo pusimo delovai najmanj 20 minu. Konaminirano meso na elesu ali obleki razkužimo in nao speremo z vodo. 7. Konaminiran maerial odlagamo v odlagalnike ali na označeno meso in ga nao avoklaviramo. 8. Kovinske predmee, ki pridejo v sik s kužnino (pincee, bakeriološke zanke id.) sproi ožigamo v plamenu. Ožigamo udi vraove epruve, erlenmajeric in seklenic z mikrobi, preden jih odpremo in po uporabi. 9. Po opravljenem delu pospravimo za seboj in razkužimo delovne površine. Prepričamo se, da so dovodi plina do gorilnikov zapri. 10. Pred in po začeku izvajanja vaj si skrbno umijemo roke z milom. Če je porebno roke udi razkužimo. 1
Asepično delo in osnove mikrobiološke ehnike Asepično delo Delo v mikrobiološkem laboraoriju zaheva asepično ehniko. Vse mikrobiološke preiskave, od odvzema vzorca in do končne idenifikacije mikrobov, morajo bii opravljene asepično. To pomeni, da s kužnino ali kulurami mikroorganizmov delamo ako, da; 1. onemogočimo dosop nezaželenim mikroorganizmom, ki bi konaminirali naše kulure in zaradi kaerih bi bili rezulai poskusov napačni; 2. pazimo, da mikroorganizmov ne razširjamo, kaji uegnili bi inficirai sebe ali druge. Za asepično delo je nujno, da so seklovina, predmei in pripomočki za delo er gojišča za gojenje mikroorganizmov serilni. Le pri asepični ehniki bodo rezulai preiskav pravilni, zao je pomembno, da delamo ob plamenu plinskega gorilnika, cepilno zanko in seklovino med delom ožigamo in da delovno površino redno čisimo z razkužili. Tudi ob skrbnem upoševanju pravil asepičnega dela je možno, da pride do konaminacije okolice ali kulure s kaero delamo. Osnove mikrobiološke ehnike Mikrobiologijo delimo na različna področja (npr. klinična mikrobiologija z odkrivanjem in idenifikacijo povzročieljev bolezni, saniarna mikrobiologija z nadzorom vode in živil id.). Glede na področja, s kaerimi se ukvarjajo, v različnih mikrobioloških laboraorijih uporabljajo različne ehnike. Nekaere ehnike so osnovne in jih mora obvladai vsak laboraorij. Med osnovne mikrobiološke ehnike priševamo: - gojenje bakerij Bakerije najlažje proučujemo, če jih znamo gojii v laboraorijskih razmerah. Običajno rasejo na rdnih ali v ekočih gojiščih. Na sveža gojišča kulure precepljamo s cepilno zanko, lahko pa udi z vaenko ali s pipeo. Za dobro ras moramo mikroorganizmom zagoovii primerna hranila za ras in primerne razmere (usrezen ph okolja, usrezna emperaura za ras, pravilna aeracija id.). 2
- mikroskopijo Morfološke značilnosi mikroorganizmov lahko opazujemo le z različnimi mikroskopskimi ehnikami. Mikroskop uporabljamo udi za kvanifikacijo populacij ali za preverjanje možnih konaminacij. - idenifikacijo Uvrščanje seva v vrso, rod ali v širšo skupino je pomembno, saj na a način lahko predvidimo nekaere njegove lasnosi. - serilizacijo Serilizacija je posopek, s kaerim uničimo ali odsranimo vse žive mikroorganizme. Meode in sredsva za serilizacijo in dezinfekcijo: 1. Fizikalne meode a) serilizacija s oploo - s suho oploo (Seriliziramo laboraorijsko seklovino v serilizaorjih. Posopek raja dalj časa, poeka pri višji emperauri in je manj učinkovi od serilizacije z vlažno oploo). - z vlažno oploo (Uporabimo avoklav, kjer z vodno paro pod lakom pri 121 C (15 minu) uničimo vse žive celice in spore.) - indalizacija (To meodo (30 minu od 80 100 C, 3 dni zapored) uporabljamo za serilizacijo snovi, ki bi jih višja emperaura uničila ali inakivirala.) b) serilizacija z obsevanjem - z ulravijoličnimi žarki (To sevanje se uporablja za serilizacijo prosorov in laminarjev). - z ionizirajočimi žarki (Serilizacija z gama žarki se uporablja v komercialne namene npr. za serilizacijo oplono občuljivih predmeov, večjih količin plasičnih izdelkov ali hrane.) 3
c) serilizacija s filracijo S filracijo seriliziramo pline ali emperaurno občuljive ekočine ako, da mikroorganizme odsranimo. Snov prehaja skozi filer, ki zadrži delce določene velikosi. č) serilizacija s plini Pline uporabljamo za serilizacijo prosorov in maeriala, ki ga ne moremo serilizirai na drugačen način. Najpogoseje se uporabljaa eilen oksid in pare formaldehida (žal sa zdravju škodljiva). Vse pogoseje se uporablja vodikov peroksid, ki je manj oksičen. 2. Kemična sredsva Pri uporabi kemijskih bakeriocidnih sredsev moramo vedei, da univerzalnega bakeriocidnega sredsva ne poznamo, zao moramo vedno izbrai najprimernejšega. Če želimo, da bo razkuževaje uspešno, moramo upoševai animikrobni speker, opimalno koncenracijo, emperauro in čas delovanja dezinficiensa (po navodilih proizvajalca) er okolje, v kaerem se mikrobi nahajajo. Za razkuževanje površin in prosorov uporabljamo dezinfekcijska sredsva, za razkuževanje kiv pa anisepike. Kemična sredsva lahko delujejo na mikroorganizme bakeriocidno (ubijajo), bakeriosaično (inhibirajo ras) ali bakerioliično (ubijajo celice z lizo). Kemična sredsva delujejo na vegeaivne celice, le redka udi na spore. 4
VAJA 1: Dokaz serilnega dela in izolacija bakerij z različnih površin Dokaz serilnega dela Maerial: - ri serilne epruvee - epruvea s hranilno juho - infuzijska seklenička z vodo - plošča hranilnega agarja - pipee (1 ml in 0,1 ml) Poek vaje: V ri epruvee odpipeiraje 0,9 ml hranilne juhe. Serilno vodo redčie v pripravljeni hranilni juhi ako, da v prvo epruveo odpipeiraje 0,1 ml vode, nao z novo pipeo prenesie 0,1 ml iz prve epruvee v drugo er ponovno z novo pipeo 0,1 ml iz druge epruvee v rejo. Z novo pipeo mešanico vedno najprej pomešae ako, da ekočino najprej poegnee v pipeo in jo nao izpusie iz nje. To ponovie rikra. Iz zadnje epruvee cepie s cepilno zanko na ploščo hranilnega agarja. Vse ri epruvee in ploščo inkubiraje na 37 C dva dni. Opomba: Plošče hranilega agarja so vedno, razen pri pregledovanju, obrnjene z gojiščem navzgor. Rezulai in diskusija: Opišie namen vaje, shemasko prikažie način priprave razredčin er cepljenja vzorca na ploščo hranilnega agarja. Opišie bakerijsko ras v posamezni epruvei in na plošči. Kaj pomeni ras bakerij v posamezni epruvei oz. na plošči? 5
Izolacija bakerij z različnih površin Maerial: - serilne vaenke - majhna epruvea s fiziološko razopino - plošča hranilnega agarja Poek vaje: Vaenko namočie v fiziološko razopino. S ako pripravljeno vaenko naredie bris izbrane površine (la, grlo, nos, delovna površina id.). Kužnino razmažie po delu plošče hranilnega agarja. S cepilno zanko naredie nao nekaj pravokonih poez čez prvi premaz, nao nadaljuje v isi smeri cepljenja, ne da bi se doikali prvega premaza (Slika 1.). Ploščo označie in inkubiraje do dva dni na 37 C. Slika 1: Razmaz brisa na plošči hranilnega agarja. Rezulai in diskusija: Opišie namen vaje, zapišie meso odvzema vzorca in shemasko ponazorie ipe kolonij, ki so se razmnožili na pripadajoči plošči hranilnega agarja. Ali se bakerije iz različnih vzorcev med seboj razlikujejo? Diskusija. 6
Izolacija čise kulure Vzorci običajno vsebujejo veliko različnih vrs mikroorganizmov in vsak od njih ima določene fiziološke in morfološke lasnosi. Le z osamivijo vsake bakerijske vrse posebej v čisi kuluri je mogoče posamezne vrse preučevai in jih okarakerizirai. Tudi za spoznavo že znanih vrs je praviloma porebna čisa kulura. Bakerijsko vrso, ki jo proučujemo, vselej najprej gojimo v čisi kuluri. V čisi kuluri je samo ena vrsa bakerije in zao so lasnosi kulure lasnosi e bakerijske vrse. Govorimo o izolaciji ali osamivi bakerije. V mešani kuluri je več ko ena vrsa bakerij. V akšnih kulurah določeno lasnos ni mogoče pripisai samo eni od vrs bakerij v kuluri. Iz mešane kulure izoliramo bakerije po več meodah. Tako dobimo posamezne bakerijske kolonije ise vrse v čisi kuluri, saj je le na a način mogoče preučevai vsako vrso bakerijeske kulure posebej. Čisos kulure in izolacija čise kulure Vsaki kuluri je porebno preverii njeno čisos. Čisos ekoče kulure je mogoče preverii pod mikroskopom. Običajno prepara čise kulure vsebuje le celice ise oblike, izjemoma pa so lahko bakerijske kulure pleomorfne (vsebujejo celice različnih oblik). Problem lahko predsavljajo udi različne bakerije, ki imajo podobno obliko in jih je zao pod mikroskopom ežko med seboj ločii. V akem primeru je porebno ekočo kuluro cepii na ploščo hranilnega agarja. Na akšnem gojišču se bo vsaka bakerijska celica namnožila in nasala bo kolonija, ki jo lahko v večini primerov dobro razločimo udi s prosim očesom. V kolikor se na ploščah pojavi le ena vrsa kolonij, lahko sklepamo, da je kulura čisa. Kolonije različnih vrs mikroorganizmov se med seboj ločijo po izgledu (Slika 2.). Ločijo se glede na: - barvo (prozorne, bele, v rumenih do rdečih onih, vijoličase, fluoroscenčne...); - površino (gladka, mokra, suha, nagubana, razbrazdana...); - velikos (premer manjši od 1 mm, 1 mm... ); - prečni prerez (ploska, dvignjena, konveksna, umbicilarna...); - obliko (okrogle, nepravilne, filamenozne, rizoidne...); - rob (gladek, valovi, korenas, s poglobivami, nažagan, žarkas (nias)...); 7
- usroj (krhke, rde, mazave, sluzne...). Čisos kulure lahko preverimo le, če je plošča»dobro cepljena«(kolone morajo bii dovolj narazen, da lahko zrasejo do za vrso značilne velikosi in razvijejo druge značilnosi). Tak način cepljenja imenujemo cepljenje do posameznih kolonij. Slika 2: Oblike in profili mikrobioloških kulur. Zaželeno vrso mikororganizmov lahko iz izhodnega maeriala izoliramo na več načinov: - z direkno meodo (Maerial suspendiramo in primerno rečimo er nao pod mikroskopom prenesemo eno samo celico v sveže gojišče (Primerna meoda za delo s kvasovkami.)). - z inidrekno meodo (Mašano kuluro najprej cepimo na gojišče do posameznih kolonij (Slika 3.). Na plošči z mešano kuluro izberemo kolonijo bakerije, ki jo želimo izolirai v čisi kuluri, er jo s cepilno zanko precepimo na svežo ploščo. Pri izolaciji čise kulure je ponavadi porebnih več zaporednih precepljanj). Bakerijske kulure lahko shranjujemo na več načinov: - s precepljanjem na ploščah ali poševnih gojiščih, 8
- z zamrzovanjem ( 20 C, 70 C, v ekočem dušiku pri 196 C z dodajanjem zaščinih sredsev, ki preprečujejo nasanek krisalov v celici), - s sušenjem (na serilnem filer papirju, v želaini, na granulah silikagela), - z liofilizacijo (suspenzijo mikroorganizmov hiro zamrznemo pri emperauri 54 C do 72 C in v vakuumu odsranimo vodo). Slika 3: Izolacija čise kulure s cepilno zanko. 9
VAJA 2: Izolacija čise kulure Maerial: - plošča z mešano kuluro - sveža plošča hranilnega agarja Poek vaje: Iz rdega gojišča z mešano kuluro izberie eno izmed kolonij in jo izoliraje v čisi kuluri z redkim cepljenjem na svežo ploščo do posameznih kolonij. Rezulai in diskusija: Opišie namen vaje er narišie poraslo kuluro na svoji plošči. Koliko ipov kolonij opazie? Ali je kulura čisa? Kaj je porebno sorii v primeru, da kulura še zmeraj ni čisa? Diskusija. 10
Gojenje bakerij in ugoavjanje velikosi mikrobnih populacij Gojenje bakerij Ras bakerij pomeni ras in povečevanje ševila celic. Za gojiev bakerij porebujemo: - primerna gojišča (porebno je zagoovii hranila in vir energije), - usrezen ph okolja, - inkubacijo pri usrezni emperauri in - pravilno aeracijo. Hranila Količina in kvaliea hranilnih snovi imaa ključen pomen za hiros celične rasi in s em za ras mikroorganizmov. S hranljivimi snovmi bogao in po sesavi pesro okolje omogoča učinkoviejšo energesko presnovo in biosinezo celičnih sesavin orej učinkovio celično in populacijsko ras. Ključne molekule rasnih poreb (.i. hranila) so: C, N, O, P, S. Te celica akumulira v elemenarni obliki ali v molekularnih agregaih. Izvor C: Pri avorofih je o CO 2, pri heerorofih pa organske molekule, pri čemer so ševilne bakerije usposobljene izdelovai svoje organske molekule iz zelo ševilnih in različnih virov ogljika. Npr. sevi vrse Pseudomonas, ki so značilni alni organizmi lahko rasejo na ogljikovodikih, ševilnih sladkorjih, maščobah, polisaharidih in dr. Izvor N: Značilna bakerijska celica je sesavljena v 15 % iz dušika (v beljakovinah, nukleinskih kislinah, celični seni). Večina bakerij sprejema ali amino skupine ali amoniak ali nira. Nekaere bakerije pa lahko celo fiksirajo amosferski dušik in vorijo amoniak. Izvor P: V glavnem je na voljo ko fosfani ion ali pa ko organsko vezan fosfor (npr. v nukleinskih kislinah). Kadar ga primanjkuje je fosfor omejevalec rasi (zao ga celice pogoso skladiščijo). Izvor S: Žveplo je porebno za sesavljanje aminokislin in za nekaere viamine. Je na voljo ko sulfa (SO -- 4 ) ali sulfid (S -- ). 11
Mikronurieni: K, Mg, Ca, Fe so porebni v majhnih a pomembnih količinah in so udeleženi ko kofakorji v ševilnih encimih in celičnih srukurah. Prvine v sledovih: Co, Zn, Mo, Cu, Mn, Ni, W, Se so porebne za manjše ševilo encimov. Vir energije Bakerijske vrse se razlikujejo glede na izrabo virov energije. Organorofi pridobivajo energijo iz organske snovi, liorofi uspejo za energeske porebe izkoriščai neorganske molekule, obojim pa pravimo, da so kemorofni mikroorganizmi. Le-i se bisveno razlikujejo od mikroorganizmov, ki so sposobni za svoje energeske porebe porabljai svelobo in jim pravimo foorofni mikroorganizmi. Pogoji za ras mikroorganizmov Mikroorganizmi porebujejo za ras, enako ko vsi organizmi, določene pogoje. Te pogoje lahko delimo v dve skupini: 1. fizikalni pogoji - emperaura (Bakerije gojimo pri emperauri, pri kaeri je njihova ras opimalna. Glede na višino opimalne emperaure delimo mikroorganizme v ri skupine: psihrofilni mikroorganizmi, ki rasejo pri nizkih emperaurah od 15 C do + 20 C; mezofilni mikroorganizmi imajo opimalno emperauro rasi med + 25 C in + 40 C in ermofilni mikroorganizmi pa imajo opimalno emperauro med + 50 C in + 60 C.) - kislos okolja (Večina bakerij živi v območju ph, ki je blizu nevralnemu med ph 6,5 in ph 7,5. Druge so prilagojene na bolj eksremne vrednosi: acidofili rasejo pri ph 4 pa vse do ph 1, alkalofili pa pri vrednosi ph 9 do 10.) - osmoski priisk 2. kemijski pogoji - vodna akivnos (Voda je nujno porebna za ras mikroorganizmov. Razen ega, da deluje ko opilo, služi ko vir kisika in vodika er ko zaščia pred emperaurnimi spremembami. Količino vode, ki jo bakerije lahko izrabljajo, izražamo ko vodno akivnos (a w ). Opimalna vrednos vodne akivnosi za večino vrs bakerij je nad 0,99. 12
Nekaere halofilne bakerije rasejo le pri višji koncenracijah NaCl, ki znižajo vodno akivnos na 0,88. - hranila (Ključna hranila za ras mikroorganizmov so: C, N, O, P, S er mikronurieni.) - kisik in drugi plini (Amosfera, v kaeri gojimo bakerije, je vir končnih akceporjev elekronov (O 2 ), vir subsraov za oksidacijo (H 2, CH 4, CO) in vir dušika er CO 2. Nekaere bakerije rasejo le v amosferi z več CO 2 (kapnofilne bakerije). Organizme, ki uporabljajo molekularni kisik, imenujemo aerobni organizmi. Obligano aerobni so isi, ki zaživljenje nujno porebujejo kisik. Organizme, ki sicer porebujejo kisik, vendar lahko rasejo udi, če kisik ni prisoen imenujemo fakulaivno aerobni organizmi. Obligano anaerobni so isi mikroorganizmi, ki niso sposobni uporabii molekularnega kisika za reakcijo pridobivanja energije. Ti mikroorganizmi prevarjajo kisik v H 2 O 2, ki lahko poškoduje celice). - rasni fakorji (Organski rasni fakorji (aminokisline, purini, pirimidini, viamini id.) so esencialne organske snovi, ki jih organizem sam ne more sineizirai. Dobii jih mora iz okolja). Hranilne podlage ali gojišča Hranilne podlage so hranilne snovi, pripravljene za gojenje mikroorganizmov v laboraorijskih razmerah. Ko gojišča bi lahko označili vse snovi, na ali v kaerih lahko rasejo mikroorganizmi. Gojišča, ki se uporabljajo v mikrobiologiji, so ševilna in raznolika, saj so prilagojena porebam mikroorganizmov in načinu uporabe (izolacija, vzdrževanje, namnoževanje in karakerizacija kulure). Gojišča so vodne razopine snovi, ki jih določena bakerija porebuje za ras. Glede na sesavo jih delimo na kompleksna (ne poznamo njihove naančne kemijske sesave) in definirana (vsebujejo očno določene koncenracije čisih kemikalij in se uporabljao pri šudiju mikrobnega meabolizma npr. Chujevo gojišče). 13
Ugoavljanje velikosi mikrobnih populacij Poznamo več načinov za določanje ševila mikrobnih celic. Pri nekaerih meodah merimo ševilo živih celic, pri drugih pa ežo celone populacije, ki je neposrdno sorazmerna s ševilom celic. Ševilo celic običajno izražamo ko ševilo celic v 1 ml ekočega vzorca ali v 1 g živila. Večina meod šeja emelji na neposrednem ali posrednem šeju majhnih vzorcev. Velikos celone bakerijske populacije se nao izračuna. 1. Indirekne ali gojivene meode a) Šeje na rdnih gojiščih je najpogoseje uporabljena meoda šeja celic. Ta meoda se uporablja predvsem za ugoavljanje ševila mikroorganizmov v ekočinah (voda, mleko, id.) in v maerialih, ki jih je mogoče suspendirai v ekočini. Pri ej meodi šejemo žive celice. V preiskovanem maerialu je navadno preveč bakerij, da bi jih lahko šeli in je zao reba maerial ali kuluro najprej redčii er primerne razredčine cepii na plošče hranilnega agarja. Gojiveni pogoji (emperaura, čas inkubacije er uporabljena gojišča) so odvisni od bakerij, na kaere se maerial preiskuje. Po 24 48-urni inkubaciji pri določeni emperauri (najpogoseje pri 30 C ali 37 C) kolonije prešejemo. Običajno šejemo na ploščah, ki imajo od 25 do 300 kolonij. Ševilo kolonij, ki zrasejo na plošči hranilnega agarja ni zmeraj enako ševilu bakerij v kuluri. Zao pravimo, da na plošči prešejemo enoe, ki vorijo kolonije (colony forming unis, CFU). Primer ugoavljanja ševila bakerij s šejem na ploščah: Iz vsake od reh epruve z razredčinami 10 7,10 8 in 10 9 smo cepili po 1 ml na vsako od reh plošč. Po inkubaciji smo prešeli naslednje ševilo kolonij: končna redčenja na ploščah ševilo kolonij 10 7 201, 187, 223 10 8 17, 25, 19 10 9 3, 2, 1 = 678 14
Izračun povprečnega ševila kolonij: 1. način: Porebno je izračunai povprečje za vsako razredčino posebej in nao še povprečje vseh razredčin. Za razredčino 10 7 : kolonij 620 = = 206,66 10 7 paralelk 3 ml Za razredčino 10 8 : kolonij 61 8 = = 20,33 10 = 203,33 10 7 paralelk 3 ml Za razredčino 10 9 : kolonij 6 9 = = 2 10 = 200 10 7 paralelk 3 ml 7 7 7 vseh pop. posamezne razred. 206,66 10 + 203,33 10 + 200 10 7 = = 203,32 10 š. razred. 3 ml 2. način: Če predposavimo, da so vsa redčenja enakovredna, lahko dodamo ševilu prešeih kolonij drugega redčenja eno ničlo, ševilu kolonij rejega pa dve ničli. Dobljeno vsoo vseh kolonij delimo s ševilom meriev in dobimo povprečno ševilo kolonij. Za razredčino 10 7 : 201, 187, 223 Za razredčino 10 8 : 170, 250, 190 Za razredčino 10 9 : 300, 200, 100 vseh kolonij = vseh paralelk 7 7 ( 201+ 187 + 223) 10 + ( 170 + 250 + 190) 10 + ( 300 + 200 + 100) 9 10 7 = vseh kolonij 7 = 192,33 10 vseh paralelk ml 3. način: Če predposavimo, da vsa redčenja niso enakovredna, saj se napaka z vsakim višjim redčenjem veča, pa lahko ševilo CFU ugoavljamo udi ako, da najbolj razredčenemu vzorcu pripišemo največjo ežo. Sešei je porebno vse kolonije, ki smo jih prešeli na ploščah agarja in vsoo delii s ševilom, ki je odvisno od ševila razredčiev in ševila paralelk npr. ri 15
različne razredčine s po dvema paralelkama; N=222 oz. za naš primer; ri redčenja, vsako s remi paralelkami N=333. vseh kolonij 678 9 = 10 = 203,6 10 7 N 333 ml b) Meoda najverjenejšega ševila (»Mos probable number«(mpn)) Ta meoda emelji na opazovanju rasi mikroorganizmov (ko monosi) in opazovanju meabolne dejavnosi mikroorganizmov (preko indikaorjev v ekočih gojiščih). To je meoda, pri kaeri kuluro ali preiskovani vzorec cepimo v serijo ekočih gojišč in glede na ševilo gojišč, v kaerih ugoovimo bakerijsko ras z verjenosnim računom, ugoavljamo približek za ševilo bakerij v vzorcu. Ta meoda se ruinsko uporablja pri ugoavljanju ševila koliformnih bakerij v vodi. 2. Direkne ali ševne meode Pri eh meodah šejemo bakerijske celice v vzorcu, kar lahko delamo na mikroskopskih preparaih ali s posebnimi napravami (npr. Coulerjev ševec delcev). Za akšno šeje uporabljamo objekne ploščice s ševnimi komorami. Na označen kvadra razmažemo vzorec in ga pokrijemo s krovnim sekelcem. S pomočjo mikroskopa prešejemo ševilo bakerij v kvadraih in izračunamo poprečno ševilo mikroorganizmov v vzorcu. 3. Fizikalne in kemijske meode - Turbidimerija merjenje monosi suspenzije opična gosoa (opical densiy, OD) s spekrofoomerom. Določena opična gosoa usreza določeni gosoi celic in zao se lahko opična gosoa odčia z umerivene krivulje ko ševilo bakerij na ml. - Ugoavljanje suhe ali mokre eže bakerij. - Ugoavljanje skupnega dušika. - Membranska filracija se uporablja za šeje bakerij v bisrih ekočih vzorcih (vodovodna voda, bisri sokovi, vino id.) er za šeje koliformnih bakerij, ki so kazalci fekalnih okužb živil in vode. 16
Ohranjanje mikroorganizemskih kulur Ločimo dva načina gojenja mikroorganizmov: - površinski način, kjer se mikroorganizmi razvijejo na površini hranilnih podlag, - submerzijski način, kjer se mikroorganizmi razvijejo poopljni v ekočih hranilnih podlagah. Tako gojenje je lahko koninuirano (v podlago neprekinjeno doekajo sveže hranilne snovi in se odsranjujejo meabolni produki). Kulure, ki so se razvile na hranilnih podlagah, hranimo v emnih in hladnih prosorih (v hladilniku). Pri diskoninuiranem gojenje mikroorganizmov oz. gojenju mikroorganozmov na podlagi, mikroorganizmom med njihovo rasjo ne dodajamo hranilne snovi in ne odsranjujemo meabolnih produkov mikroorganizmov. V akih razmerah so zao mikroorganizmi odvisni samo od določene količine hranilne snovi. Da bi preprečili izrodiev ali celo izumiranje kulure, je le o porebno precepii na sveže podlage. Pogosos precepljanja je odvisna od občuljivosi kulure (enkra na eden, enkra na mesec...). Čise kuure lahko ohranjamo udi v obliki rajnih kulur, ki se lahko ohranijo pri življenju udi po več le. Trajne kulure lahko pripravimo na več načinov: - z zmrzovanjem (čise kulure hiro zmrznemo pri emperauri od 50 C do 95 C v usrezni razopini sladkorjev ali krioproekorjev, - z liofilizacijo (suspenzijo mikroorganizmov hiro zmrznemo pri emperauri od 50 C do 72 C in z vakuumom odsranimo vodo, - z dehidracijo, - kuluro lahko hranimo udi na serilnem pesku ali glini. 17
VAJA 3: Priprava hranilnih medijev za gojenje bakerij in gliv Trdi medij za gojenje bakerij (mesni medij) - 5 g mesnega pepona - 3 g mesnega eksraka - 0,5 g NaCl - 5 g D-(+)-glukoze - 18 g agarja - 1 l navadne vode Vse sesavine zaehamo v 1000 ml bučko in dolijemo 1 l navadne vode. Bučko z razopino poopimo v vrelo vodno kopel er jo ob inenzivnem mešanju segrevamo dokler v razopini ni več opazii delcev. Tekoči medij za gojenje bakerij (mesni medij) - 5 g mesnega pepona - 3 g mesnega eksraka - 0,5 g NaCl - 5 g D-(+)-glukoze - 1 l navadne vode Vse sesavine zaehamo v 1000 ml bučko in dolijemo 1 l navadne vode. Bučko z razopino poopimo v vrelo vodno kopel er jo ob inenzivnem mešanju segrevamo dokler razopina ne posane popolnoma bisra. 18
Krompirjev agar za glive - 39 g krompirjevega deksroznega agarja (PDA) Agar zaehamo v 1000 ml bučko in dolijemo 1 l navadne vode. Bučko z razopino poopimo v vrelo vodno kopel er jo ob inenzivnem mešanju segrevamo dokler v razopini ni več opazii delcev. 19
VAJA 4: Ugoavljanje ševila bakerij s šejem na ploščah Maerial: - bakerijska kulura na poševnem gojišču - serilne perijevke - serilna razopina hranilnega agarja - epruvee s serilno fiziološko razopino (0,9 % NaCl) Poek vaje: V 1. epruveo dodaje 1 ml fiziološke razopine NaCl v kaero smo predhodno inokulirali bakerijsko kuluro. Z novo pipeo suspenzijo premešaje in prenesie v naslednjo epruveo 1 ml. Posopek ponovie še 6-kra in vsakič zamenjaje pipeo. 1 ml iz vsake redčene kulure iz zadnjih reh epruve odpipeiraje v serilno perijevko er prelije s hranilnim agarjem, kaerega emperaura ne sme presegai 60 C. Perijevko pazljivo preresie, da se razredčina kulure enakomerno porazdeli po perijevki. Na plošči označie končno redčenje! Inkubiraje pri določeni emperauri dva dni. Rezulai in diskusija: Opišie namen vaje, prešeje kolonije v posameznih razredčinah er izračunaje velikos bakerijske populacije. Diskusija. 20
VAJA 5: Ohraniev mikroorganizemskih kulur Maerial: - bakerijska kulura na poševnem gojišču - serilno poševno gojišče za bakerije Poek vaje: V desno roko primemo epruveo z bakerijsko kuluro zraslo na poševnem gojišču in epruveo s serilnim poševnim gojiščem za bakerije. Obema epruveama smo predhodno prežareli vraove na plinskem gorilniku, da preprečimo možnos konaminacije. Z desno roko odsranimo pokrove epruve in s prežarjeno ezo, ki smo jo ohladili na zraku, poegnemo narahlo po gojišču z zraslo kuluro. Ezo s kuluro prenesemo v sveže poševno gojišče in jo cepimo na površino svežega gojišča. Po končanem precepljanju epruvei z gojišči zapremo s pokrovi in jima ponovno prežarimo vraove. Prav ako prežarimo še ezo. Gojišče s sveže precepljeno kuluro inkubiramo pri emperauri 28 C 2-3 dni. Kuluro po končani inkubaciji shranimo v hladilnik. Rezulai in diskusija: Opišie namen vaje er opažanja. 21
Ocena učinkoviosi anisepikov in razkužil Proimikrobna sredsva lahko v grobem delimo na fizikalna (emperaura, sevanja) in kemijska (razkužila, anisepiki, anibioiki). Ko anisepike in razkužila uporabljamo različne snovi, ki bakerije uničujejo delujejo nanje bakericidno ali pa zavirajo bakerijsko ras delujejo bakerisaično. V mikrobiološkem laboraoriju uporabljamo razkužila (dezinficiense) za ubijanje mikrobov na površinah, opremi, priboru in seklovini er anisepike za razkuževaje rok. Nekaera pogoseje uporabljena razkužila so: - klorovi preparai na mikrobe delujejo bakericidno, ker so močni oksidani. Primerni so za laboraorijske površine, manj pa za kožo, ker jo močno izsušijo. - fenol je organski dezinficiens in se uporablja za sandard, s kaerim se primerja moč razkužil (fenolovo ševilo pove, za kolikokra je razkužilo učinkoviejše od 1-odsone razopine fenola). Moč dezinficiensov je mogoče ugoavljai udi z drugimi meodami. - formaldehid v plinskem sanju se uporablja za dezinfekcijo prosorov, ko formalin (5 % vodna razopina formaldehida) pa ko ekoč dezinficiens. Pogoso ga dodajajo v kombinirane dezinficiense. - kisline zaradi disociacije kisline znižajo ph in razkrajajo beljakovine. Za dezinfekcijo se uporabljajo peroksiocena kislina, ki deluje oksidaivno, redkeje pa udi solna in žveplena kislina. - lugi hidrolizirajo beljakovine in ogljikove hidrae. Od močnejših lugov se uporablja predvsem NaOH pri izbruhih posebno nevarnih infekcij. - alkoholi za razkuževanje rok se uporablja eanol (70 %) in propanol (60 70 %). V kozarec z eanolom odlagamo udi pincee in škarje, kadar pripravljamo razmaze ali cepimo kužnino na gojišča. - kalijev permangana uporabljamo ko dezinficiens predvsem pri prvi pomoči za razkuževanje kože in ran. Deluje ko oksidan. - vodikov peroksid se uporablja za razkuževanje kože in ran. Deluje ko oksidan. - jodovi preparai najpogoseje se uporablja jodova inkura za razkuževanje kože, operacijskih površin in ran. 22
- deergeni kaionske deergene, predvsem kvarerne amonijeve baze uporabljamo za razkuževanje rok v laboraoriju. Sicer pa deergene uporabljamo bolj za čiščenje ko za dezinfekcijo. - drugi dezinficiensi sem priševamo soli ežkih kovin (npr. živega srebra), ki prav ako delujejo dezinfekcijsko. Pri izbiri proimikrobnega sredsva moramo upoševai različne dejavnike, ko so ph, opnos, oksičnos, učinkovios (uničevaje vegeaivnih celic, uničevanje spor), vpliv na organske maeriale, korozivnos, id. Kadar uporabljamo določeno proimikrobno sredsvo, je porebno uporabii najvišjo koncenracijo, ki še ni škodljiva in le ega pri dolgorajni uporabi po določenem času uporabe zamenjai z drugim sredsvom. Učinkovios proimikrobnih sredsev lahko ugoavljamo na različne načine. Difuzijska meoda je podobna anibiogramu. Razkužila nanesemo na serilne diske ali v posebne kovinske nasavke in jih nao položimo na ploščo s kuluro. Po končani inkubaciji merimo cone inhibicije. Tes z nosilcem se uporablja za določanje učinkoviosi razkužil za razkuževanje predmeov. Konaminirani predme izposavimo razkužilu različnih koncenracij za daljši časovni inerval (od 2 do 20 minu). Za ugoavljanje učinkoviosi kemikalij na osnovi fenola se uporablja fenolni koeficien, kjer se primerja delovanje fenola in esirane kemikalije na določeni esni organizem. 23
VAJA 6: Inhibicija rasi mikroorganizmov Maerial: - glivična kulura - epruvee s serilno fiziološko razopino NaCl (1 x 9 ml in 2 x 10 ml) - inhibior rasi - 9 perijevke - serilni agar za gojenje gliv Poek vaje: V serilne perijevke prelijemo po 19 ml serilnega agarja za gojenje gliv, ki smo ga predhodno segreli uekočinili er ga enakomerno porazdelimo. Perijevke z agarjem posavimo v hladilnik za 30 minu, da se agar ponovno srdi. V epruveo z 10 ml serilne fiziološke razopine NaCl inokuliramo glivično kuluro. V drugo epruveo z 9 ml serilne fiziološke razopine prav ako cepimo glivično kuluro. Po inokulaciji dodamo v epruveo še 1 ml razopine inhibiorja rasi. V srjen agar naredimo luknjo premera 10 mm, v kaero nao odpipeiramo po 100 µl predhodno pripravljenih razopin: - v prve ri perijevke razopino glivične kulure, - v druge ri perijevke razopino glivične kulure z dodanim inhibiorjem in - v reje ri perijevke serilno fiziološko razopino. Gojišča inkubiraje pri 28 C. Po dveh dneh inkubiranja preverie ras mikroorganizma v posameznih perijevkah. Perijevke z gojišči pusie inkubira še nadaljnih 6 dni. Rezulai in diskusija: Opišie namen vaje er abelarično podaje rezulae meriev rasnega premera gliv. Kaj vam povejo rezulai dobljeni za vzorec fiziološke razopine? Diskusija. 24
VAJA 7: Primerjava učinkoviosi različnih razkužil Maerial: - različne bakerijske kulure - komercialna razkužila - 0,5 % vodna razopina fenola - 70 % alkohol - jodova inkura - prazni epruvei - dese epruvee s hranilno juho - pipee Poek vaje: 5 ml fenola in 5 ml izbranega razkužila je porebno odpipeirai v dve prazni serilni epruvei. Komercialno razkužilo je porebno predhodno redčii. Za vsako od obeh razkužil pripravie pe epruve s hranilno juho. Nanje je porebno napisai ime razkužila in čas 0, 2, 5, 10 in 20 minu. Odpipeiraje 0,5 ml bakerijske kulure v epruveo z razkužilom. Mešanico rahlo premešaje in akoj prenesie eno zanko kulure, inkubirane v razkužilu, v epruveo z gojiščem (čas 0). Po 2, 5, 10 in 20 minuah prenesie polno zanko kulure, inkubirane v razkužilu, v usrezne epruvee z gojiščem. Tesne epruvee je porebno inkubirai na emperauri 37 C 48 ur. Rezulai in diskusija: Opišie namen vaje er abelarično podaje rezulae rasi bakerij po 48 urni inkubaciji. Tabelarični prikaz naj zajema udi rezulae preosalih skupin. Z znakoma + (ras) in (ni rasi) označie ali je v določeni epruvei kulura začela rasi ali ne. Čemu je porebna konrola pri času 0? Kaera izmed esiranih kemikalij je najbolj učinkovia? Kaera izmed bakerijskih vrs je najbolj odporna proi delovanju uporabljenih razkužil? Diskusija. 25
ENCIMSKO KATALIZIRANE REAKCIJE Velik del kemijskih reakcij ne poeka dovolj hiro. Porebno akivacijsko energijo za kemijske reakcije najpogoseje dovajamo s segrevanjem, kar vodi do povišanja emperaure reakcijske zmesi. Možna po pa so udi kaalizaorji. Ti namreč znižujejo porebno količino akivacijske energije er ako omogočajo poek reakcij, ki ob isih energeskih pogojih ne bi bile možne. Kaalizaorji pospešujejo kemijske procese in se pri em ne porabljajo. To pomeni, da kaalizaorji vsopijo v sam proces, in ko je a končan, izsopijo iz njega nespremenjeni. Encimi so zelo akivni kaalizaorji, ki pospešijo reakcijo udi do 10 29 kra in zaradi ega v reakcijskem mediju delujejo uspešno v malih količinah. Reakcijo vodijo po drugi (ponavadi večsopenjski) poi, ki erja nižjo akivacijsko energijo, orej energijo, porebno, da pri rkih med delci pride do reakcije. Reakcije v živih organizmih se morajo odvijai po principu znižanja akivacijske energije, kar se dogaja s pomočjo biokemijskih kaalizaorjev, encimov. Slika 4 prikazuje zniževanje akivacijske energije s kaalizaorji. Energija reakanov 2 1 3 neencimska reakcija encimska reakcija Energija 4 Energija produkov Reakani produki 1 akivacijska energija neencimske reakcije 2 akivacijska energija za vorbo kompleksa encim subsra 3 akivacijska energija za encimsko reakcijo 4 sprememba noranje energije ( G) Slika 4: Znižanje akivacijske energije s kaalizaorji. 26
Poek encimske kaalize lahko razdelimo v ri faze: 1. v prvi fazi se svori kompleks encim subsra, ki ima nižjo akivacijsko energijo ko sam subsra. Nasajanje kompleksa mora bii hiro in reverzibilno; 2. v drugi fazi nasane produk, ki je vezan na akivno meso encima nasane orej kompleks encim produk; 3. v reji fazi nasopi osvobajanje produka. Kompleks encim produk razpade v encim + produk. Tako se encim regenerira in lahko ponovno vsopi v reakcijo s subsraom. Specifičnos encimske kaalize Za razliko od anorganskih kaalizaorjev, ko so kisline, baze, kovine in kovinski oksidi, encimi kažejo lasnosi specifičnosi. Nekaeri encimi so srogo specifični in delujejo samo na en določen subsra, drugi so manj specifični in kaalizirajo več različnih reakcij, nekaeri pa so specifični samo za neko skupino subsraov. Specifičnos encimov je pogojena z dvema dejavnikoma: 1. geomerijsko ujemanje encima in subsraa: molekula subsraa se mora naančno prilegai v kalup encima; 2. ujemanje v naboju in možnos približanja nabiih delov: naboja encima in subsraa z naspronim predznakom se moraa čim bolj približai. Fakorji, ki vplivajo na encimsko kaalizirane reakcije Encimsko kaalizirane reakcije so odvisne od vrse fakorjev, ki vplivajo na samo delovanje encimov. Ker so encimi proeini, so zelo občuljivi na visoko emperauro in delujejo samo v določenem emperaurnem inervalu. Pri nižjih emperaurah so bisveno manj akivni, pri višjih pa se lahko denaurirajo. Naboj encimov je odvisen od ph, zao delujejo samo v določenem območju ph. Na encimsko kaalizirane reakcije poleg emperaure in ph vplivaa udi koncenracija encima in subsraa. 27
Vpliv emperaure na hiros encimsko kaalizirane reakcije Pri povišani emperauri encimsko kaalizirane reakcije so dogajaa dve svari: 1. Poveča se hiros reakcije, ako ko pri večini kemijskih reakcij. 2. Sabilnos proeina se zmanjša zaradi ermične deakivacije. Fizikalni mehanizem za a fenomen je naslednji: z zviševanjem emperaure imajo aomi v molekulah encima višjo energijo in s em večjo endenco h gibanju. Torej pridobijo dovolj energije, da le-a preseže energijo šibkih inerakcij, zaradi kaerih se obdrži globularna srukura proeina. Temu sledi deakivacija, ki je lahko reverzibilna, ireverzibilna ali kombinirana. Za odvisnos začene hirosi reakcije od emperaure dobimo krivuljo zvonase oblike, kaere maksimum je časovno odvisen (Slika 5.). Zao je pojem emperaurni maksimum očno določen s emperaurnimi parameri. začena hiros reakcije emperaura Slika 5: Vpliv emperaure na hiros rekacije. Iz Arrheniusovega grafa lahko razberemo do kaere emperaure se akivnos encima povečuje in pri kaeri emperauri nasopi deakivacija encima. 28
Arrheniusova enačba (1) opisuje emperaurno odvisnos akivnosi encima: -Ea R T k = A e (1) kjer je : A Arrheniusova konsana, k - konsana reakcijske hirosi, E a akivacijska energija, R plinska konsana, T absoluna emperaura. Eserifikacija ocene kisline z izoamil alkoholom Esri so eni izmed najpomembnejših razredov organskih komponen in jih je mogoče sineizirai na različne načine: - z reakcijo med alkoholi in karboksilnimi kislinami (eserifikacija) z odsranivijo vode, - z menjavo acilnih skupin med esri in kislinami (acidoliza), - z menjavo acilnih skupin med esri in alkoholi (alkoholiza) ali glicerolom (gliceroliza), - z menjavo acilnih skupin med esri (ranseserifikacija). Produki eserifikacije kislin z daljšo verigo (12 20 ogljikovih aomov) in višjih alkoholov (z daljšo verigo) se uporabljajo ko maziva za sroje in ko mehčalci za zelo naančne sroje. Esri, dobljeni z reakcijo med kislinami z daljšo verigo (12 20 ogljikovih aomov) in nižjimi alkoholi (3 8 ogljikovimi aomi), se uporabljajo ko dodaki v prehrambeni, kozmeični, farmacevski indusriji in indusriji deergenov. Produki med kislinami s krako verigo (2 8 ogljikovih aomov) in alkoholi so pomembne arome in komponene dišav v prehrambeni, kozmeični, farmacevski indusriji in indusriji pijač. 29
Eil-, izopropil-, buil-, izobuil- in amil aceai se uporabljajo pri proizvodnji lakov zaradi dobre hlapljivosi. Eil-, izobuil-, amil- in izoamil aceai se pogoso uporabljajo udi ko komponene za dišave in arome, izopropil-, benzil-, okil- er meilni esri pa ko dodaki k parfumom. Izoamilni esri (posebej izoamil acea) so aroma esri in so pomembni udi s komercialnega vidika v prehrambeni indusriji (74 000 kg/leo) zaradi močne arome banane. Večina enosavnih esrov na ržišču je sineičnega izvora. Esri so v velikih količinah prisoni udi v naravi (v maščobah, oljih in voskih). Ponavadi se pridobivajo s kemijskimi reakcijami med alkoholom in organsko kislino v prisonosi kislinskega kaalizaorja ali pri eksrakciji iz naravnih maerialov. Naravni produki, dobljeni z drugo meodo, so zelo dragi in ne zadovoljujejo količinskim porebam ržišča. Bioehnološka proizvodnja aroma esrov z encimsko kaaliziranimi reakcijami (Slika 6.) je pridobila močno na pomenu v primerjavi s klasičinimi kislinskimi kaalizaorji, predvsem na področju proizvodnje naravnih arom in dišav. Vzrok za o je v regio- in sereospecifičnosi večine encimov, milih reakcijskih pogojih in sprejemljivosi ako sineiziranih produkov udi v prehrambeni indusriji. H 3 C O C OH + HOCH 2 CH 2 CH(CH 3 ) 2 encim O C H 3 C OCH 2 CH 2 CH(CH 3 ) 2 Slika 6: Encimsko kaalizirana eserifikacija med oceno kislino in izoamil alkoholom. Pri sinezi aroma esrov se ko kaalizaorji uporabljajo encimi lipaze (EC 3.1.1.3), ki spadajo v razred hidrolaz. Le-i so lahko prosi (naivni) ali imobilizirani na različne nosilce (smole id.). Prednos imobiliziranih encimov pred neimobiliziranimi je predvsem v možnosi večkrane uporabe, enosavni ločivi od reakcijske zmesi in največkra udi v boljši ermični obsojnosi. Čeprav 30
znižajo obraovalne sroške (možnos večkrane uporabe), pa je njihova nabavna vrednos dokaj visoka. Lipaze, kakor udi druge encime, lahko pridobivamo iz različnih virov. Tako npr. so lipaze lahko živalskega izvora (rebušna slinavka) ali mikrobnega izvora npr. iz gljiv (vrsa: Rhizopus) ali iz kvasovk (npr. rod: Candida) id. 31
VAJA 8: Proučevanje vpliva emperaure na poek sineze izoamil aceaa in na akivnos encima Maerial: - ocena kislina (3,6 M) - izoamil alkohol - NaOH (0,1 M) - 0,1 % razopina fenolfaleina v eanolu - naivni ali imobilizirani encim - pipee - vodna kopel - bučka s povranim hladilnikom Poek vaje: Reakcijska zmes vsebuje izoamil alkohol in oceno kislino v množinskem razmerju 2 proi 1. Reakcijsko zmes inkubiraje v reakcijski bučki s povranim hladilnikom v vodni kopeli pri dani emperauri. Iz inkubirane razopine odvzamie pri času 0 0,5 ml vzorca (slepi vzorec) in ga analiziraje po spodaj opisanem posopku. Nao dodaje 5 % (g/g subsraa) imobiliziranega ali prosega encima lipaze (Novozym 435 - NOVO Nordisk, Danska). V renuku, ko dodae encim v reakcijsko zmes, začnie merii čas reakcije. Nao jemljie po 0,5 ml vzorca iz reakcijske zmesi v sledečem časovnem zaporedju: 2 min, 5 min, 10 min, 15 min, 20 min, 30 min, 1 h, 1,5 h, 2 h, 2,5 h, 3 h, 3,5 h in 4 h. Vzorčie s pipeo v cenrifugirke. Vsak vzorec sproi analiziraje po spodaj opisani meodi. 32
Analizna meoda Določanje prosih kislin s iracijsko meodo Vsebnos prosih kislin v reakcijski zmesi se lahko določi s irimerično meodo. 0,1 g vzorca je porebno zaehai v erlenmajerico in razredčii z 20 ml razopine 0,1 % fenolfaleina v eanolu er irirai z 0,1 M NaOH. Vsebnos prosih kislin lahko izračunamo iz enačbe 2: V N M K % (PK) = (2) 10 m kjer je: M K molska masa kisline (M=60,031 g/mol), V volumen porabljenega NaOH (γ=0,1 mol/l), PK uežni % kisline, m masa zaehanega vzorca (g), N normaliea NaOH ( 0,1 N). Izračun koncenracije nasalega esra V določenih časovnih inervalih je porebno merii vsebnos prosih kislin v vzorcih, kaere je porebno predhodno sehai. S pomočjo spodaj navedenih enačb lahko izračunamo koncenracijo nasalega esra. a) V primeru uporabe naivnega encima Pred pričekom reakcije v času = 0 je bilo prisonih: a mol alkohola = n a M A = A g k mol ocene kisline = n k M K = K g skupno = G 0 g 33
Prisoen encim se v reakcijski zmesi razaplja in ako osaja razmerje encim/subsra po vzorčenjih enako. Koncenracija encima in osalih komponen ako s časom variira. Z vsakim molom ocene kisline reagira 1 mol izoamil alkohola in nasane 1 mol esra in 1 mol vode. Množino kisline (n k ) in množino nasalega esra (n e ) pri določenem času ( = n ) izračunamo po sledečih enačbah: % PK( = ) G 0 n k ( = n ) = n [mol] (3) M 100 K % PK( = n ) G 0 n e ( = n ) = nk ( = 0) [mol] (4) M 100 K Koncenracija posameznih komponen (c k - množinska koncenracija kisline; c e množinska koncenracija esra) v času = n : % PK( = n ) c k ( = n ) = [mol/g] (5) M 100 K nk ( = 0) % PK( = n ) c e ( = n ) = [mol/g] (6) G M 100 0 K 34
35 b) V primeru uporabe imobiliziranega encima V primeru uporabe imobiliziranega encima se koncenracija encima s časom ne spreminja. Koncenracija osalih komponen s časom variira. Pri izračunu je porebno upoševai da, razmerje subsra/encim ni konsanno ves čas reakcije. Pri času = 1 se je masa reakcijske zmesi zmanjšala za maso odvzeega vzorca ( g 1 ). 1 0 1 0 ) 0 ( ) ( g G G = = = [g] (7).. za = n n 1 0 n 0 ) ( ) ( g G G n = = = Množini posameznih komponen po odvzemu vzorca sa ) ( ) ( ) ( n k n n k n k c g n n = = = = [mol] (8) ) ( ) ( ) ( n e n n e n e c g n n = = = = [mol] (9) Za izračun množin n k ( = n ) in n e ( = n ) uporabimo enačbi 3 in 4. Koncenraciji obeh komponen pri času = n določimo po naslednjih enačbah: ) ( ) ( ) ( 1 n 0 n k n k = = = = G n c [mol/g] (10) ) ( ) ( ) ( 1 n 0 n e n e = = = = G n c [mol/g] (11)
Porebno je upoševai še maso encima v reakcijski zmesi, ki je ves čas reakcije konsanna. Tako se koncenracija produka v primeru uporabe imobiliziranega encima izraža ko koncenracija na gram encima: c ( e n e ( = n ) G ( = ) 0 n 1 = n ) = [mol/g/g encima ] (12) mencima Rezulai in diskusija: Na diagramu prikažie odvisnos konceracije nasalega produka od časa poeka reakcije pri različnih emperaurah. Določie začeno hiros posamezne reakcije, narišae diagram odvisnosi začene hirosi od emperaure in abelarično podaje vse merive, ko prikazuje abela 1 er navedie svoja opažanja in ugoovive. Tabela 1: Tabelarični prikaz rezulaov. /h m odvzeega vzorca /g m zaehe za analizo /g V NaOH /ml PK /% 0... 0,083............... 4...... Prosi encim: /h PK /% n k /mmol n e /mmol c k /(mmol/g) c e /(mmol/g) 0... 0,083............... 4...... 36
Imobilizirani encim: /h PK /% n k /mmol n k /mmol n e /mmol n e /mmol c k /(mmol/g) c e /(mmol/g) c e /(mmol/g/g encima ) 0........................... 4...... 37
Vpliv koncenracije subsraa na hiros encimsko kaalizirane reakcije V primeru encimske reakcije, ko je koncenracija encima nespremenjena, ima vsako povečanje konceracije subsraa za posledico povečanje začene hirosi vse do njene maksimalne vrednosi. Z nadaljnim povečevanjem koncenracije subsraa se hiros reakcije ne spreminja več. Pojavi se lahko inhibicija s subsraom. Slika 7 prikazuje vpliv koncenracije subsraa na hiros kemijske reakcije. V renuku, ko dosežemo maksimalno hiros reakcije, se ves encim porabi za vorbo kompleksa encim-subsra (ES). Slika 7: Vpliv koncenracije subsraa na hiros kemijske reakcije. Hiros reakcije ko funkcijo koncenracije subsraa lahko opišemo z Michaelis-Menenino enačbo 13: vmax [ S] [ S] + K M hiros = v = (13) v max je maksimalna hiros reakcije dosežena pri visokih koncenracijah subsraa. v max in v sa izraženi v enoah nasalega produka na enoo časa. K M je Michaelis-Menenina konsana, ki predsavlja koncenracijo subsraa, pri kaeri je hiros reakcije enaka polovici maksimalne hirosi. Simbol S predsavlja koncenracijo subsraa. 38
Hidroliza karboksimeil celuloze Celuloza je najbolj razširjen polimer v naravi. V raslinah predsavlja skeleno subsanco, ki je sesavljena iz monosaharida β-d-glukoze (Slika 8.), v kaerega udi razpade s hidrolizo. β-dglukopiranozidne enoe, povezane z 1 4 vezjo, vorijo linearno molekulo celuloze. Ševilo monomernih eno v molekuli je odvisno od izvora celuloze in načina izolacije. Tako naj bi bila večina celuloz v naravi sesavljenih iz povprečno okoli 14 000 β-d-glukopiranozidnih eno, a jo posopek predelave navadno zniža na okoli 2 500. Molska masa celuloze znaša nad 200 000 g/mol do več milijonov molskih eno. O CH 2 OCH 2 COONa O H OH H H O CH 2 OCH 2 COONa O H OH H H O CH 2 OCH 2 COONa O H OH H H O CH 2 OCH 2 COONa O H OH H H O H OH H OH H OH H OH Slika 8: Srukurna veriga karboksimeil celuloze. Karboksimeil celuloza (CMC) je zelo pomemben deriva celuloze. Z učinkovanjem monoklorocene kisline ali njene narijeve soli, narijevega monokloraceaa na alkali celulozo dobimo CMC. Z razliko od čise celuloze se dobro razaplja v vodi. CMC je vsesransko uporabna v ehniki, ker ima odlične emulgaorske in dispergaorske lasnosi. Uporablja se pri izdelavi klasičnih mil, ko sredsvo za izboljšanje kakovosi papirja, v kozmeični in prehrambeni indusriji (ko gosilo ali želirno sredsvo), v farmacevski indusriji, v indusriji nafe in udi ko lepilo. Celuloza je sladkor (polisaharid), ki daje pri hidrolizi (Slika 9.) celobiozo (disaharid) oz. glukozo (grozdni sladkor). Celuloza se lahko hidrolizira pri visokih emperaurah ob prisonosi razredčenih kislin ali pa ob prisonosi biokaalizaorjev (encimov). 39
celuloza celobioza glukoza Slika 9: Razpad celuloze na glukozo. S pomočjo encimov poekajo reakcije v mnogo milejših pogojih, pri bisveno nižjih emperaurah in koncenracijah. Encimi povečajo reakcijsko hiros ako, da znižajo energijo akiviranja reakcije. Celulaze (EC 3.2.1.4), ki spadajo v skupino hidrolaz (glikozidaz) so encimi, ki razgrajujejo (cepijo) β-1,4 vezi med glukoznimi enoami. Celulaze imajo širok speker uporabe (eksilna indusrija za beljenje kanin, prehrambena indusrija pri proizvodnji sokov, ko dodaek živilski hrani za izboljšanje kakovosi in prebavljivosi). Hidroliza celuloze poeče po sledeči enačbi: (C 6H10O5 )n + n H 2O n C6H12O6 Glavni fakorji, ki vplivajo na začeno hiros reakcije so: koncenracija encima, konceracija subsraa, reakcijska emperaura in ph okolja. Določiev začene reakcijske hirosi Med reakcijo, kaalizirano z encimom, opazimo višanje koncenracije produkov in upadanje koncenracije subsraov, dokler ni doseženo ravnoežje reakcije. 40
koncenracija c = d 0 2 + d 1 + d 2 čas Slika 10: Sprememba koncenracije produka v odvisnosi od časa za encimsko kaalizirano reakcijo. Hiros reakcije dobimo s pomočjo naklona angene na krivuljo. Reakcijsko hiros dobimo v vsakem renuku reakcije z naklonom angene na krivuljo koncenracije produka v odvisnosi od časa (Slika 10.). V.i. začeni fazi, preden se nakopiči produk, oz. preden drugi fakorji upočasnijo reakcijo, je vorba produka linearna s časom. Iz naklona angene v začeni fazi orej dobimo začeno hiros reakcije. Koncenracijo produka podamo v odvisnosi od časa. Za določiev začene reakcijske hirosi v i (g/(l h)) = (d c /d ) uporabimo funkcijo c = d 0 + d 1 + d 2 2. Vrednos začene reakcijske hirosi je enaka vrednosi d 1. 41
VAJA 9: Proučevanje vpliva koncenracije subsraa na poek encimsko kaalizirane hidrolize karboksimeil celuloze Maerial: - karboksimeil celuloza (CMC) - fosfa-cirani pufer - encim - celulaza Celluzyme 0,7T - razopina glukoze - razopina dinirosalicinske kisline (DNS) - pipee - vodna kopel - bučka s povranim hladilnikom Poek vaje: Pripravii je porebno razopino CMC določene koncenracije v 25 ml fosfa-ciranega pufra. V kolikor se CMC popolnoma ne razopi, je razopino priporočljivo rahlo segrevai (emperaura ne sme prekoračii 60 C). Tako pripravljeno razopino CMC inkubiraje v reakcijski bučki s povranim hladilnikom v vodni kopeli pri 30 C. Iz inkubirane razopine odvzamie pri času 0 1 ml vzorca (slepi vzorec) in ga analiziraje po spodaj opisanem posopku. Nao dodaje encim celulazo (Celluzyme 0,7T - NOVO Nordisk, Danska) koncenracije 44 g/l reakcijske zmesi. V renuku, ko dodae encim v reakcijsko zmes, začnie merii čas reakcije. Nao jemljie po 1 ml vzorca iz reakcijske zmesi v sledečem časovnem zaporedju: 2 min, 5 min, 10 min, 15 min, 20 min, 30 min, 1 h, 1,5 h, 2 h, 2,5 h, 3 h, 3,5 h in 4 h. Vsak vzorec sproi pripravie za analizo. Vzorčie s pipeo v cenrifugirke. 42
Analizna meoda Določevanje glukoze z dinirosalicinsko kolorimerično meodo Ta meoda emelji na zaznavanju prosih karbonilnih skupin (C=O), ako imenovanih reduciranih sladkorjev. Pri sami reakciji pride do oksidacije aldehidnih funkcionalnih skupin v glukozi. 3,5 dinirosalicinska kislina (DNS) se pri em reducira v 3, amino, 5-nirosalicinsko kislino. Tako en mol sladkorja reagira z enim molom 3,5-dinirosalicinske kisline. Priprava za analizo in merjenje absorbance 1 ml vzorca, vzeega po določenem času reakcije, dodamo 3 ml DNS. Cenrifugirko nao poopimo za 5 minu v vrelo vodno kopel in nao še za 5 minu v mrzlo vodno kopel. Vse cenrifugirke je porebno ermosairai na sobno emperauro, vzorec cenrifugirai in izmerii absorbanco na UV spekrofoomeru pri valovni dolžini 540 nm. Ko referenčno razopino uporabimo razopino 1 ml vode in 3 ml DNS. Prav ako je porebno izmerii absorbanco razopini glukoze (1 ml pripravljene razopine glukoze dodamo 3 ml DNS). Izračun koncenracije glukoze Po končanih merivah absorbanc je porebno še izračunai uežno koncenracijo nasale glukoze pri encimsko kaalizirani hidrolizi CMC. Uežna koncenracija glukoze je definirana z enačbo 14: ( A A ) vzorec slepi vzorec 0,5 γ glukoze = [g/l] (14) A sandard glukoze kjer je: A vzorec - absorbanca hidrolizaov po določenem času poeka reakcije, A slepi vzorec - absorbanca hidrolizaov v času 0, A sandard glukoze - absorbanca hidrolizaov v razopini glukoze. 43