BIONANOTEHNOLOGIJA Navodila za vaje Vera Župunski in Gregor Gunčar Maj 2013
UVOD Protitelesa so približni 150 kda veliki glikoproteini, ki so sestavljeni iz dveh težkih in dveh lahkih verig, povezanih z disulfidnimi vezmi (Slika 1). Lahka veriga (25 kda) ima na N-koncu variabilno domeno (VL) in konstantno domeno (CL) na C-koncu. Težka veriga (50 kda) pa ima na N-koncu variabilno domeno (VH) in nato tri ali štiri konstantne domen (CH). Imunoglobuline lahko strukturno razdelimo na Fab fragment, ki se veže na antigen (VL-CL in VH-CH1; 50 kda), in konstantno regijo Fc (CH2-CH3, 25 kda). Variabilni regiji težke in lahke verige imata značilno trodimenzionalno strukturo, imenovano imunoglobulinsko zvitje, ki predstavlja sendvič iz dveh antiparalelnih β struktur, povezanih z disulfidno vezjo. Vsaka variabilna domena ima tri CDS (complementarity determining sequnce), to so zanke, ki se vežejo na antigen. Zanke so zelo varabilne regije, ki se razlikujejo po dolžini in zaporedju aminokislin. Površina protitelesa, ki se nekovalentno veže na antigen (epitop), se imenuje paratop. Slika 1: Imunoglobulini (IgG) in nanotelesa (Nb). Prikazana je shema protiteles, ki so v serumu kamelid. IgG1 so klasična protitelesa z dvema lahkima in dvema težkima verigama. IgG2 in IgG3 pa so protitelesa s težko verigo (havy chain antibodies HCAbs), ki se razlikujejo v dolžini verige med VHH in CH2. Nanotelesa (Nb) so samostojne VHH verige, ki so topni proteini in prepoznajo antigen. VLvariabilna regija lahke verige, VH-variabilna regija težke verige, CH-konstantna regija težke verige, Fcfragment, ki kristalizira (crystallizable fragment), scfv-enojna veriga variabilnega fragmenta (single chain variable fragment), VHH-variabilna regija težke verige v imunoglobulinih s težko verigo, Nbnanotelo (nanobody).
Posebna protitelsa, ki imajo le težko verigo, so odkrili pri kamelidah (kamele, lame) in ribah hrustančnicah (morski pes). Iz seruma kamelid so izolirali tri vrste protiteles (Slika 1): IgG1, IgG2 in IgG3. IgG1 so klasična heterotetramerna protitelesa, IgG2 in IgG3 pa so homodimeri z dvema težkima verigama in jih imenujemo protitelesa s težko verigo (HCAb havy chain antibody). Težka veriga je manjša od klasične, ker nima CH1 regije. Antigen prepozna le ena domena (VHH) - variabilna regija težke verige. Delež protiteles s težko verigo je pri kamelidah starega sveta približno 50 %, pri kamlidah novega sveta pa približno 30 %. Nastala so iz klasičnih protiteles z adaptivnimi spremembami in prispevajo k imunskemu odgovoru lam in kamel. Nanotelesa so rekombinantne topne VHH domene, velika nekaj nanometrov z molekulsko maso približno 15 kda. So najmanjše molekule, ki prepoznajo antigen, in imajo v primerjavi z variabilno regijo težke verige zamenjanih 5 aminokislin. Spremembe nekaterih hidrofobnih aminokislin v hidrofilne omogoča nanotelesom, da so topni proteini. Enostavno jih pridobivamo v bakterijah v topni frakciji, v večjih količinah pa jih pripravljajo v kavsovkah ali listih tobaka. Nanotelesa imajo klasično imunoglobulinsko zvitje z nekaj razlikami, ki jim omogoča večjo variabilnost. Nanotelesa se ne vežejo le na epitope na površini antigenov, ampak prepoznajo tudi mesta, ki ponavadi niso antigenska kot so aktivna mesta encimov ali vrzeli v biomarkerjih virusnih in bakterijskih bolezni. Številne lastnosti dajo nanotelesom prednosti pri uporabi pred klasičnimi protitelesi. Nanotelesa so majhne enodomenske molekule, ki se hitro sintetizirajo in lažje prodrejo skozi tkiva. Njihovo rekombinantno izražanje je enostavno in tudi cenovno bolj ugodno. Molekule so zelo obstojne, tudi pri 4 C ali celo sobni temperaturi, in se lahko po denaturaciji ponovno zvijejo (refolding). Poleg tega so slabo imunogena. Uporabljajo se kot raziskovalno orodje za blokiranje interakcij med proteini, pomoč pri kristalizaciji, za lokalizacijo molekul v celici. Na nanotelo je pripet GFP zeleni fluorescenčni protein, s pomočjo katerega nanotelo označi iskani antigen v celici. V diagnostiki se nanotelesa uporabljajo kot biosenzorji, ker se na nasprotno stran od paratopa lahko veže senzorna molekula. Nanotelesa, povezana z magnetnimi nanodelci omogočajo večjo občutljivost pri določanju analita. Ker so majhni in imajo kratko življensko dobo v krvi, so zelo primerni za radioimunoterapijo in in vivo slikanje. Uporabljajo se kot protistrupi za živalske toksine. Številna nova zdravila na osnovi nanoteles, ki prepoznajo viruse, bakterije in molekule, ki povzročajo bolezni (IL6R, TNFα...), so v kliničnih študijah. NAVODILA ZA EKSPERIMENTALNO DELO Izražanje hipervariabilne vezavne domene za kofein I. Gojenje celic BL21 DE3 bakterije E. coli z vektorjem za zapis hipervariabilne vezavne domene za kofein (pripravi asistent) Vektor pe-sumo z zapisom za hipervariabilno vezavno domeno za kofein smo vnesli v ekspresijski sev BL21 DE3 bakterije E. coli. Za prekonočno kulturo smo iz trdega gojišča LBA prenesli eno kolonijo
bakterij v 30 ml medija MDB (25 mm Na 2 HPO 4, 25 mm KH 2 PO 4, 50 mm NH 4 Cl, 5 mm Na 2 SO 4, 2 mm MgSO 4, 0,5 % glukoza, 0,25 % aspartat) z ampicilinom in približno 18 h stresali pri 37 C. Prekonočno kulturo smo shranili pri 4 C, kjer je obstojna do 4 tedne. V veliko (2 L) stresalno erlenmajerico smo dali 400 ml avtoinducirajočega medija ZYM-5052 (1 % N-Zamin AS, 0,5 % kvasni ekstrakt, 25 mm Na 2 HPO 4, 25 mm KH 2 PO 4, 50 mm NH 4 Cl, 5 mm Na 2 SO 4, 2 mm MgSO 4, 0,5 % glicerol, 0,05 % glukoza, 0,2 % laktoza) z ampicilinom, v katerem smo 1000x redčili prekonočno kulturo. Bakterije smo stresali približno 24 h na 37 C pri 160 o/min, dokler je naraščala absorbanca pri valovni dolžini 595 nm (optična gostota - OD 595 ). Celice smo iz gojišča odcentrifugirali pri 8000 g 20 min pri 4 C in jih resuspendirali v 40 ml vezavnega pufra (50 mm Tris, 500 mm NaCl, 20 mm imidazol, ph 7,5) za Ni-kelatno kromatografijo. Shranili smo alikvot za analizo na NaDS PAG (1- lizat). Celice smo homogenizirali s homogenizatorjem ter resuspendirali s pipeto in jih shranili na - 80 C. Potek dela: II. Izolacija hipervariabilne vezavne domene za kofein iz celic 1. Celice BL21 DE3 bakterije E. coli, v katerih se je izražala hipervariabilna vezavna domena za kofein odmrznemo v hladni vodi. Vsebino vseh centrifugirk združimo v hladno čašo, ki mora biti ves čas na ledu. Celični lizat v čaši na ledu sonificiramo 4x po 5 min z vmesnim intervalom dveh minut (na ledu!). Medtem pripravite pufer S. 2. Ko lizat ni več viskozen (DNA, ki se sprosti iz celic, povzroči viskoznost), ga centrifugiramo v alikvotih po 20 ml 20 min pri 13.000g in 4 C. Shranimo alikvot usedline (2-netopno) in supernatanta (3-topno) za analizo na NaDS PAG. 3. Supernatante združimo in prefiltriramo s pomočjo črpalke najprej skozi filter s porami velikosti 0,45 m, nato še skozi filter s porami velikosti 0,2 m. 4. Če je kolona shranjena v 20 % etanolu, jo najprej 15 min spiramo z vodo, nato še 15 min z vezavnim pufrom (v katerem je pripravljan vzorec). Kolono spiramo z 10. do 15. volumni kolone (volumen kolone je 1 ml). 5. S črpalko (počasi) nanesemo vzorec na Ni kolono, kamor se veže hipervariabilna vezavna domena za kofein s histidini, ki so na N-terminalnem koncu. Pod kolono postavimo čašo, kamor lovimo nevezano frakcijo. Shranimo alikvot za analizo na NaDS PAG (4-nevezano) in celoten nevezan vzorec shranimo na ledu. 6. Kolono spremo s pufrom S (20 mm Tris ph 8,0 in 150 mm NaCl) (10 volumnov kolone), da odstranimo nevezane proteine (shranimo alikvot za analizo na NaDS PAG 5-sprano) in v koloni zamenjamo pufer, v katerem je encim SUMO-peptidaza najbolj aktiven (pufer S + 1 mm DTT). 7. Na kolono nanesemo 1 ml (kolikor je volumen kolone) raztopine SUMO-peptidaze (pufer S, 1 mm DTT, koncentracija SUMO-peptidaze je: ) in inkubiramo preko noči pri 4 C. 8. SUMO-peptidaza bo cepila fuzijski protein tako, da SUMO ostane vezan na koloni, hipervariabilno vezavno domeno(vhh) za kofein pa eluiramo s kolone z 2x po 1 ml pufra S. Shranimo alikvot za analizo na NaDS PAG (6-vezano-VHH). Izmerimo koncentracijo vzorcev z Nanodrop aparaturo. Iz 800 ml bakterijskih kultur smo izolirali mg nanoteles proti kofeinu.
9. Regeneracija Ni-kelatne kolone: na kolono z brizgalko počasi nanesemo 2x po 1 ml elucijskega pufra (50 mm Tris, 500 mm NaCl, 300 mm imidazol, ph 7,5), da eluiramo SUMO protein. Shranimo alikvot za NaDS PAG (7-SUMO). Kolono dobro speremo z več volumni kolone z vodo in shranimo v 20 % etanolu. III. Vezava hipervariabilne vezavne domene za kofein na nanocevke in detekcija kofeina s HPLC 10. Nanocevke (vrsta: ) v mikrocentrifugirki sonificiramo v 1 ml pufru S z 1 mm DTT 5 min (na ledu!) in dodamo raztopino VHH za kofein ter inkubiramo preko noči pri 4 C, stresamo. 11. 1 ml raztopine nanocevk prenesemo v mikrocentrifugirko in centrifugiramo 3 min na 3000 g. Shranimo alikvot za merjenje koncentracije nanoteles v supernatantu (to so nanotelesa, ki se niso vezala na nanocevke). 12. Nanocevke 3x speremo z 1 ml pufra S z DTT, resuspendiramo s pipeto in vsakič centrifugiramo 3 min na 3000 g. Supernatant zavržemo. 13. Pripravimo 1,5 ml 10x redčitve filtrirane kave. Redčimo s pufrom S z DTT. 1 ml nanesemo na nanocevke, jih resuspendiramo in 30 min vrtimo. 14. Ponovno centrifugiramo kot prej in supernatant prenesemo v novo mikrocentrifugirko. 15. Centrifugiramo 2 min pri 13000 g. Supernatant prenesemo v novo centrifugirko. 16. S HPLC metodo z reverzno fazo bomo določili količino kofeina v vzorcu, ki smo ga nanesli na nanocevke z nanotelesi. Vsi pufri in vzorci morajo biti filtrirani ali centrifugirani, da se kolona ne zamaši. Na C18 kolono najprej nanesemo standard: 100 L 5 mg/ml kofeina. 17. Nato nanesemo še 2 vzorca: 200 L 10x redčene kave in 200 L 'nevezane' kave (10x redčena kava, ki se ni vezala na nanocevke). Mobilna faza je 0,1 % trifluorocetna kislina, eluirano z gradinetno elucijo do 90 % acetonitrila. Primerjajte površino pod pikom za kofein obeh vzorcev. IV. Analiza vzorcev med izolacijo VHH za kofein z NaDS PAGE 18. Pripravite 12,5 % akrilamidni gel vsem sedmim vzorcem dodajte ustrezno količino NaDS nanašalnega pufra, vzorce inkubirajte pri 100 C 5 min, kratko centrifugirajte in nanesite na gel skupaj s standardom. 19. Elektroforeza naj teče pri 35 ma toliko časa, da gre barvilo iz gela. 20. Po navodilih pobarvajte gel in ga nato razbarvajte. Komentirajte rezultate! Vprašanja za razmislek: Koliko kofeina se je vezalo na nanocevke? Je metoda za detekcijo ali dekofeinizacijo pijač primerna? Ali se je VHH izražala v BL21 sevu? Ste dobili ustrezne, dovolj veliko količino VHH?