Κεφάλαιο 11. Ισορροπία Hardy-Weinberg Θεωρητικό μέρος. Γ. Παπανικολάου και Λ. Δούκισσας Ο νόμος των Hardy-Weinberg

Transcript

1 Κεφάλαιο 11 Γ. Παπανικολάου και Λ. Δούκισσας Περίληψη Ο νόμος των Hardy-Weinberg μάς επιτρέπει να προβλέψουμε τις συχνότητες των γονότυπων στα άτομα της επόμενης γενιάς, όταν γνωρίζουμε τις συχνότητες των αλληλόμορφων σε έναν γενετικό τόπο. Eφόσον ισχύουν οι παραδοχές στις οποίες στηρίζεται το μαθηματικό μοντέλο του νόμου, τόσο οι συχνότητες των αλληλόμορφων όσο και οι συχνότητες των γονότυπων θα παραμένουν σταθερές στις επόμενες γενιές. Χρησιμοποιώντας τον έλεγχο καλής προσαρμογής, μπορούμε να εξετάσουμε την ισορροπία Hardy-Weinberg σε έναν πληθυσμό. Η απόκλιση από την ισορροπία είναι σπάνια στους ανθρώπινους πληθυσμούς και όταν δεν οφείλεται σε σφάλμα κατά τη γονοτύπηση, αποτελεί συνηθέστερη ένδειξη ότι παραβιάζεται η προϋπόθεση των τυχαίων διασταυρώσεων. Σε άλλη περίπτωση, η απόκλιση από την ισορροπία Hardy-Weinberg είναι ένδειξη μικροεξέλιξης που συμβαίνει στη διάρκεια μιας γενιάς. Όταν ένας πληθυσμός βρίσκεται σε ισορροπία Hardy-Weinberg, δεν συμπεραίνεται ότι οι προϋποθέσεις του νόμου ισχύουν, ούτε ότι ο πληθυσμός δεν εξελίσσεται, αλλά ότι η εξέλιξη δεν είναι δυνατόν να καταδειχθεί στη διάρκεια μιας γενιάς. Οι κύριοι εξελικτικοί παράγοντες που οδηγούν σε αλλαγή των συχνοτήτων των αλληλόμορφων είναι η μετάλλαξη, η επιλογή, η γενετική παρέκκλιση και η γονιδιακή ροή. Με τη βοήθεια προσομοιώσεων μπορούμε να εξετάσουμε με μεγαλύτερη ευκολία την ανεξάρτητη επίδραση του κάθε παράγοντα ξεχωριστά αλλά και περισσοτέρων παραγόντων σε συνδυασμό. Προαπαιτούμενη γνώση Κατανόηση της ισορροπίας Hardy-Weinberg, βασικών αρχών της θεωρίας των πιθανοτήτων και του ελέγχου υποθέσεων με τη δοκιμασία X 2. Προηγούμενη μελέτη του Κεφαλαίου 9 του συγγράμματος Thompson & Thompson, Ιατρική γενετική. 2η ελληνική έκδοση, Αθήνα: εκδ. Πασχαλίδης, 2011 και των Κεφαλαίων 4, 5 και 8 του συγγράμματος Β. Σταυρινός και Δ. Παναγιωτάκος, Βιοστατιστική, Αθήνα: Gutenberg, Θεωρητικό μέρος Ο νόμος των Hardy-Weinberg Εισαγωγή Μια σύντομη ιστορία Στο τέλος μιας διάλεξης του Reginald Punnet τον Φεβρoυάριο του 1908, ο στατιστικός Udny Yule ( ) έκανε μια ενδιαφέρουσα ερώτηση σχετικά με την κατανομή της βαραχυδακτυλίας, οι περισσότεροι τύποι της οποίας οφείλονται σε ένα επικρατές αλληλόμορφο. Ο Yule υπέθεσε ότι 209

2 ΕΡΓΑΣΤΗΡΙΑΚΕΣ ΑΣΚΗΣΕΙΣ ΓΕΝΕΤΙΚΗΣ ΤΟΥ ΑΝΘΡΩΠΟΥ δεδομένου ότι το αλληλόμορφο είναι επικρατές, θα έπρεπε σε κάθε άνθρωπο χωρίς βραχυδακτυλία να αντιστοιχούν τρεις περιπτώσεις με βραχυδακτυλία. Ωστόσο, κάτι τέτοιο δεν συνέβαινε στην πραγματικότητα. Γιατί; Μετά την ερώτηση του Yule, ο Punnet προσέτρεξε για βοήθεια στον συνάδελφό του, και συμπαίκτη του στο κρίκετ, μαθηματικό Godfrey Hardy ( ). Ο Punnet δεν μπορούσε να ερμηνεύσει γιατί ένα επικρατές χαρακτηριστικό δεν θα εξαπλωνόταν σταδιακά στον πληθυσμό και ένα υποτελές αλληλόμορφο δεν θα εξαφανιζόταν. Με άλλα λόγια, δεν μπορούσε να ερμηνεύσει γιατί ένα έθνος δεν θα γινόταν σιγά σιγά βραχυδακτυλικό [1]. Γνωρίζοντας ότι ο Hardy ενδιαφερόταν για τα καθαρά μαθηματικά, διατύπωσε το ερώτημα με μαθηματικούς όρους και ο Hardy το έλυσε πολύ γρήγορα, δημοσιεύοντας την εργασία του το 1908 [2], [3]. Ο Hardy δεν μπορούσε να φανταστεί τη θεμελιώδη επίδραση που θα είχε η συνεισφορά του στη γενετική. Ο Punnet, που αναγνώρισε τη σημασία της, αναφερόταν σε αυτή σαν τον «νόμο του Hardy». Αργότερα, διαπιστώθηκε ότι ο γερμανός γιατρός Wilhelm Weinberg ( ) είχε καταλήξει ανεξάρτητα στα ίδια συμπεράσματα, που παρουσίασε σε μια διάλεξη το Προκειμένου να αναγνωριστεί η συνεισφορά και των δύο επιστημόνων, ο γενετιστής Curt Stern πρότεινε η θεμελιώδης αυτή αρχή να ονομαστεί «νόμος των Hardy-Weinberg» [4]. Συχνότητες γονότυπων και αλληλόμορφων Προκειμένου να μετρήσουμε τη γενετική ποικιλότητα ενός πληθυσμού χρειάζεται να προσδιορίσουμε δύο διαφορετικά μεγέθη, τη συχνότητα των αλληλόμορφων και τη συχνότητα των γονότυπων. Ας υποθέτσυμε ότι έχουμε έναν πληθυσμό Ν ατόμων και δύο αλληλόμορφα, A και α σε έναν γενετικό τόπο. Ένα τέτοιο παράδειγμα θα μπορούσε να είναι ο πολυμορφισμός rs του γονιδίου TAS2R38 για τον οποίο γνωρίζουμε ότι υπάρχουν μόνο δύο εναλλακτικά αλληλόμορφα (το Τ και το C). Αν γονοτυπήσουμε το σύνολο των ατόμων του πληθυσμού για τον rs , μπορούμε να υπολογίσουμε τη συχνότητα των αλληλόμορφων και τη συχνότητα των γονότυπων όπως αναφέρουμε παρακάτω: Υπολογισμός της συχνότητας των γονότυπων: Τα δύο αλληλόμορφα A και α μπορούν να μας δώσουν τρεις πιθανούς γονότυπους. Τους AA, Aα και αα. Αν συμβολίσουμε τις συχνότητες των γονότυπων με f AA, f Aa και f aa αντίστοιχα, τότε η συχνότητα του κάθε γονότυπου θα είναι ίση με το πηλίκο του αριθμού των ατόμων με τον συγκεκριμένο γονότυπο διά του συνόλου των ατόμων. Για παράδειγμα, η συχνότητα του γονότυπου AA θα δίνεται από την εξίσωση: f AA = αριθμός των ατόμων με τον γονότυπο AA συνολικός αριθμός ατόμων που γονοτυπήθηκαν (11.1) ή αλλιώς: f AA = N AA (11.2) N Συχνά αναφερόμαστε σε αυτές τις συχνότητες σαν αναλογίες επί τοις εκατό, οπότε και το άθροισμά τους θα είναι 100%. Υπολογισμός της συχνότητας των αλληλόμορφων: Αν ονομάσουμε p και q τις συχνότητες στον πληθυσμό των αλληλόμορφων A και α αντίστοιχα, για τον υπολογισμό τους θα πρέπει να λάβουμε υπόψη ότι τα ομόζυγα άτομα έχουν δύο αντίγραφα του εκάστοτε αλληλόμορφου, ενώ τα ετερόζυγα ένα. Ο συνολικός αριθμός των αλληλόμορφων είναι 2N για ένα δείγμα από N διπλοειδή άτομα. Αν 210

3 συμβολίσουμε με N AA τον αριθμό των ομόζυγων ατόμων και με N Aα τον αριθμό των ετερόζυγων, η συχνότητα του αλληλόμορφου A θα δίνεται από την εξίσωση: p = 2 N AA + N Aα 2N (11.3) Η μέθοδος αυτή ονομάζεται μέθοδος καταμέτρησης των αλληλόμορφων. Ο υπολογισμός της συχνότητας του αλληλόμορφου A μπορεί εναλλακτικά να γίνει χρησιμοποιώντας τις συχνότητες των γονότυπων. Η συχνότητα θα είναι ίση με τη συχνότητα των ομόζυγων f AA, προσθέτοντας το ήμισυ της συχνότητας των ετερόζυγων f Aα : p = f AA + f Aa 2 (11.4) Με αντίστοιχο τρόπο μπορούμε να υπολογίσουμε τη συχνότητα q του αλληλόμορφου α, βασισμένοι στις συχνότητες των ομόζυγων αα και των ετερόζυγων Aα. Στην περίπτωση των δύο αλληλόμορφων με συχνότητες p και q ισχύει ότι: p + q = 1 (11.5) Μπορούμε λοιπόν να υπολογίσουμε τη συχνότητα του ενός αλληλόμορφου, εφόσον γνωρίζουμε τη συχνότητα του άλλου: p = 1 q και q = 1 p (11.6) Κατά τη μελέτη της ενδοοικογενειακής κληρονόμησης των αλληλόμορφων χρησιμοποιούμε συχνά το τετράγωνο του Punnet, προκειμένου να υπολογίσουμε την αναμενόμενη κατανομή των γονότυπων των παιδιών, όταν γνωρίζουμε τους γονότυπους των γονέων. Ο νόμος των Hardy-Weinberg επεκτείνει την ίδια ιδέα στο επίπεδο του πληθυσμού, προσφέροντας ένα μαθηματικό μοντέλο που επιτρέπει να προβλέψουμε τις συχνότητες των γονότυπων της επόμενης γενιάς, όταν γνωρίζουμε τις συχνότητες των αλληλόμορφων [4]. Όπως κάθε μαθηματικό μοντέλο, ο νόμος προϋποθέτει ορισμένες παραδοχές, οι οποίες περιγράφουν μια ιδεατή κατάσταση που σπάνια απαντάται στην πραγματική ζωή. Παρά τους περιορισμούς του, το μοντέλο μάς βοηθά να εξαγάγουμε χρήσιμα συμπεράσματα σε σχέση με το τι θα συνέβαινε σε διάφορα σενάρια και να κατανοήσουμε καλύτερα τον τρόπο που λειτουργεί η εξέλιξη. Ο νόμος των Hardy-Weinberg προβλέπει ότι σε έναν πληθυσμό του οποίου τα άτομα διασταυρώνονται τυχαία μπορούμε, συνδυάζοντας τυχαία τους γαμέτες, να υπολογίσουμε τις συχνότητες των γονότυπων στην επόμενη γενιά, βασισμένοι στις συχνότητες των αλληλόμορφων. Στον πίνακα 11.1 βλέπουμε, τις συχνότητες των γονότυπων στην επόμενη γενιά στην περίπτωση ενός γενετικού τόπου με δύο αλληλόμορφα A και α, με συχνότητες p και q αντίστοιχα. 211

4 ΕΡΓΑΣΤΗΡΙΑΚΕΣ ΑΣΚΗΣΕΙΣ ΓΕΝΕΤΙΚΗΣ ΤΟΥ ΑΝΘΡΩΠΟΥ Γυναίκες A (p) α (q) Άνδρες A (p) AA (p 2 ) Aα (pq) α (q) Aα (pq) αα (q 2 ) Πίνακας 11.1 Συχνότητες των γονότυπων στην επόμενη γενιά σε έναν γενετικό τόπο με δύο αλληλόμορφα όταν η διασταύρωση των γαμετών είναι τυχαία. Η αναμενόμενη συχνότητα των ομοζυγωτών AA θα είναι p 2. Η αναμενόμενη συχνότητα των ετεροζυγωτών Aα θα είναι 2pq. Η αναμενόμενη συχνότητα των ομοζυγωτών αα θα είναι q 2. Σημειώστε ότι κατά σύμβαση, χωρίς κάτι τέτοιο να είναι υποχρεωτικό, συνηθίζουμε να συμβολίζουμε με p τη συχνότητα του αλληλόμορφου που παρατηρείται συχνότερα στον πληθυσμό. Οι συχνότητες των τριών πιθανών γονότυπων θα έχουν άθροισμα 1. Έτσι η σχέση μπορεί να γραφεί με την παρακάτω μορφή: p 2 + q 2 + 2pq = 1 (11.7) Αντίστοιχα, για τρία αλληλόμορφα ισχύει: p 2 + q 2 + r 2 + 2pq + 2pr + 2qr = 1 Γνωρίζοντας τις αναλογίες των γονότυπων της επόμενης γενιάς, μπορούμε να υπολογίσουμε τις συχνότητες p και q των αλληλόμορφων A και α στον πληθυσμό της επόμενης γενιάς, χρησιμοποιώντας την εξίσωση 11.4: p = f AA + f Aa 2 = p2 + 2pq 2 = p2 + pq = p(p + q) = p Παρατηρούμε ότι στην επόμενη γενιά η συχνότητα του αλληλόμορφου A παρέμεινε αμετάβλητη (p = p). Αν ακολουθήσουμε τους ανάλογους υπολογισμούς, καταλήγουμε στο ίδιο συμπέρασμα και για τη συχνότητα του αλληλόμορφου α (q = q). Το συμπέρασμα του νόμου των Hardy-Weinberg είναι ότι, εφόσον συντρέχουν οι προϋποθέσεις του μαθηματικού μοντέλου, στην επόμενη γενιά δεν αναμένεται καμιά αλλαγή, ούτε στις συχνότητες των γονότυπων αλλά ούτε και στις συχνότητες των αλληλόμορφων. Αυτός είναι και ο λόγος που ο νόμος των Hardy-Weinberg αναφέρεται και ως «ισορροπία Hardy-Weinberg». Η διαπίστωση αυτή απαντά επίσης στο ερώτημα που έθεσε ο Yule, γιατί δηλαδή δεν μεταβάλλεται η συχνότητα των ατόμων με βραχυδακτυλία στον πληθυσμό. Ένα ακόμα συμπέρασμα από τους υπολογισμούς που προηγήθηκαν είναι ότι ένας πληθυσμός που δεν βρίσκεται αρχικά σε ισορροπία Hardy-Weinberg (H-W) μπορεί να επιστρέψει σε κατάσταση ισορροπίας μετά από έναν μόλις κύκλο τυχαίων διασταυρώσεων, δηλαδή στο διάστημα μιας γενιάς [5]. 212

5 σε Χ-φυλοσύνδετα αλληλόμορφα: Στην περίπτωση των αυτοσωματικών αλληλόμορφων υπάρχουν τρεις πιθανοί γονότυποι τόσο για τα άρρενα όσο και για τα θήλεα άτομα (AA, Aα και αα). Στην περίπτωση των φυλετικών χρωμοσωμάτων, με εξαίρεση την ψευδοαυτοσωματική περιοχή του χρωμοσώματος Υ, στο χρωμόσωμα Υ δεν απαντώνται ομόλογες περιοχές του χρωμοσώματος Χ. Για τα αλληλόμορφα αυτά υπάρχουν τρεις πιθανοί γονότυποι για τα θήλεα, αλλά μόνο δύο για τα άρρενα άτομα, οι A και α. Για τις γυναίκες, η αναμενόμενη συχνότητα των γονότυπων αναμένεται να ακολουθεί τον νόμο των Hardy-Weinberq όπως τον μελετήσαμε μέχρι τώρα: ο γονότυπος AA θα είναι f AA = p 2, ο γονότυπος αα f αα = q 2 και ο γονότυπος Aα f Aα = 2pq. Για τους άνδρες, η συχνότητα του γονότυπου θα είναι ίδια με τη συχνότητα του αλληλόμορφου, f A = p και f α = q. Προϋποθέσεις της ισορροπίας Hardy-Weinberg Οι βασικές πρoϋποθέσεις για να ισχύει η ισορροπία H-W είναι οι παρακάτω: 1. Ο οργανισμός είναι διπλοειδής και αναπαράγεται φυλετικά. 2. Οι συχνότητες των αλληλόμορφων είναι ίδιες ανάμεσα στα δύο φύλα. 3. Κάθε γενιά είναι διακριτή και δεν επικαλύπτεται με την άλλη. Τα άτομα μιας γενιάς δεν διασταυρώνονται με άτομα που ανήκουν σε άλλη γενιά. 4. Ο πληθυσμός είναι άπειρος (πολύ μεγάλος σε μέγεθος) 5. Οι διασταυρώσεις γίνονται τυχαία (ο πληθυσμός είναι παμμικτικός). Δεν υπάρχουν διασταυρώσεις ανάμεσα σε άτομα με στενές συγγενικές σχέσεις (ενδογαμία) ή προτίμηση στη διασταύρωση ανάλογα με τον γονότυπο ή τον φαινότυπο των ατόμων (εκλεκτική διασταύρωση). Δεν υπάρχει επίσης πληθυσμιακή διαστρωμάτωση, δηλαδή ο υπό μελέτη πληθυσμός δεν απαρτίζεται από υποομάδες που έχουν παραμείνει γενετικά διακριτές. Η παραβίαση αυτής της παραδοχής οδηγεί σε αυξημένη αναλογία εκπροσώπησης των ομοζυγωτών στις αναλογίες γονότυπων. 6. Δεν υπάρχει γενετική παρέκκλιση, δηλαδή δεν παρατηρούνται αποκλίσεις στις συχνότητες των αλληλόμορφων που οφείλονται στην τύχη. Η γενετική παρέκκλιση είναι επέκταση της θεωρίας των πιθανοτήτων, σύμφωνα με την οποία εξαιτίας δειγματοληπτικού σφάλματος μεταβάλλονται οι συχνότητες των αλληλόμορφων. Συνδέεται με την παραδοχή ότι ο υπό μελέτη πληθυσμός είναι άπειρος σε μέγεθος. 7. Δεν υπάρχει μετάλλαξη. Για παράδειγμα, το αλληλόμορφο Α θα κληρονομηθεί στην επόμενη γενιά χωρίς να μεταλλαχθεί σε α και το αντίστροφο. 8. Δεν υπάρχει φυσική επιλογή. Η πιθανότητα αναπαραγωγής και επιβίωσης δεν εξαρτάται από τον γονότυπο των ατόμων. Αν η πιθανότητα αναπαραγωγής και επιβίωσης μεταβάλλεται από έναν γονότυπο, τότε στην επόμενη γενιά ο γονότυπος αυτός θα υποεκπροσωπείται ή θα υπερεκπροσωπείται, μεταβάλλοντας τις συχνότητες των αλληλόμορφων. 9. Δεν υπάρχει μετανάστευση. Ο πληθυσμός είναι «κλειστός» και δεν υπάρχουν άτομα που μετανάστευσαν στον πληθυσμό, συνεισφέροντας τα δικά τους αλληλόμορφα στη γενετική σύνθεση της επόμενη γενιάς. Οι τελευταίες τέσσερις παραδοχές αποτελούν εξελικτικές δυνάμεις που έχουν τη δυνατότητα να μεταβάλουν τη συχνότητα των αλληλόμορφων. 213

6 ΕΡΓΑΣΤΗΡΙΑΚΕΣ ΑΣΚΗΣΕΙΣ ΓΕΝΕΤΙΚΗΣ ΤΟΥ ΑΝΘΡΩΠΟΥ Απόκλιση από την προϋπόθεση των τυχαίων διασταυρώσεων Η απόκλιση από τον κανόνα των τυχαίων διασταυρώσεων οδηγεί σε αύξηση της συχνότητας των ομόζυγων ατόμων στον πληθυσμό και αντίστοιχη ελάττωση των ετερόζυγων (έλλειμμα ετεροζυγωτών). Ωστόσο, δεν είναι δυνατό να προκαλέσει μεταβολές στη γονιδιακές συχνότητες, όταν δεν συνδυάζεται με άλλους εξελικτικούς παράγοντες [4]. Η ενδογαμία ή ομομιξία αναφέρεται στην επιλεκτική διασταύρωση μεταξύ ατόμων που συνδέονται μεταξύ τους με κάποιο κοινό πρόγονο. Σε σχετικά μικρούς πληθυσμούς η επιλογή συζύγων ανάμεσα στα μέλη του πληθυσμού οδηγεί συχνά στο ίδιο αποτέλεσμα, ακόμα και αν αυτό δεν είναι μια επιλογή που υποβάλλεται από τους πολιτιστικούς κανόνες. Οι γάμοι μεταξύ συγγενών (ή γενικά ατόμων που μοιράζονται έναν ή περισσότερους προγόνους από κοινού) οδηγούν σε αύξηση της αναλογίας των ομόζυγων στον πληθυσμό, γιατί αυξάνουν την πιθανότητα τα άτομα που διασταυρώνονται να είναι φορείς του ίδιου αλληλόμορφου, το οποίο κληρονόμησαν από έναν κοινό πρόγονο. Στην εκλεκτική διασταύρωση ο φαινότυπος και ο γονότυπος επηρεάζουν την επιλογή των ατόμων να διασταυρωθούν. Στους ανθρώπινους πληθυσμούς οι άνθρωποι συχνά επιλέγουν συντρόφους με παρόμοια φαινοτυπικά χαρακτηριστικά, όπως για παράδειγμα παρόμοιο ύψος. Το ακριβώς αντίθετο φαινόμενο, δηλαδή η διασταύρωση ατόμων με ανόμοια χαρακτηριστικά συχνότερα απ ό,τι θα συνέβαινε από την τύχη και μόνο, ονομάζεται ανομοιοφαινοτυπική διασταύρωση και το αποτέλεσμα της είναι η μείωση της ομοζυγωτίας [6]. Συντελεστής ενδογαμίας (F): Τα αποτελέσματα των μη τυχαίων διασταυρώσεων σε έναν πληθυσμό μπορούν να μετρηθούν συγκρίνοντας την αναμενόμενη από την ισορροπία H-W συχνότητα των ετεροζυγωτών (H e ) με την παρατηρούμενη (H o ). O συντελεστής ενδογαμίας (Inbreeding coefficient), που συμβολίζεται με F, εκφράζει την πιθανότητα ένα άτομο να φέρει δύο όμοια αλληλόμορφα εξαιτίας της καταγωγής τους από κάποιον κοινό πρόγονο. Ο υπολογισμός του γίνεται με την εξίσωση: F = H e H o H e όπου H e είναι η αναμενόμενη ετεροζυγωτία από την ισορροπία H-W, που υπολογίζεται με βάση τις συχνότητες των αλληλόμορφων στον πληθυσμό, ενώ H o είναι η παρατηρούμενη ετεροζυγωτία. Ο συντελεστής F κινείται θεωρητικά στο όριο μεταξύ -1 και +1, με τις αρνητικές τιμές να είναι ενδεικτικές περίσσειας ετεροζυγωτών και τις θετικές ελλείμματος ετεροζυγωτών, άρα αντίστοιχης περίσσειας ομοζυγωτών (αύξηση της ομοζυγωτίας). Στον πίνακα 11.2 δίνονται οι τιμές του συντελεστή F για διασταυρώσεις ανάμεσα σε άτομα με συγγενική σχέση [4]. 214

7 Διασταύρωση F Γονείς - τέκνα 1 4 = 0.25 Αδέλφια 1 4 = 0.25 Θείοι - ανίψια 1 8 = Πρώτα ξαδέλφια 1 16 = Δεύτερα ξαδέλφια 1 64 = Τρίτα ξαδέλφια = Πίνακας 11.2 Συντελεστής ενδογαμίας F για διάφορους τύπους διασταυρώσεων μεταξύ συγγενών. Γραφική παράσταση της ισορροπίας Hardy-Weinberg: Οι αναμενόμενες συχνότητες της ισορροπίας Hardy-Weinberg σε έναν γενετικό τόπο με δύο αλληλόμορφα μπορούν εύκολα να παρασταθούν σε ένα ορθοκανονικό σύστημα αξόνων. Στον άξονα των x x καταγράφουμε τη συχνότητα των αλληλόμορφων (p και q αντίστοιχα) και στον άξονα y y τις συχνότητες των γονότυπων AA, Aa και aa (εικόνα 11.1). Παρατηρούμε ότι καθώς το p αυξάνεται, η συχνότητα του ομόζυγου γονότυπου αυξάνεται εκθετικά, ενώ η συχνότητα του q μειώνεται. Όταν η συχνότητα του αλληλόμορφου A μηδενιστεί (p = 0), τότε η συχνότητα του γονότυπου aa παίρνει τη μέγιστη τιμή και ισούται με τη μονάδα. Αντίστοιχα, όταν η συχνότητα του α μηδενιστεί (q = 0), τότε η συχνότητα του γονότυπου AA παίρνει με τη σειρά της τη μέγιστη τιμή. Τέλος, οι ετεροζυγώτες (2pq) παριστάνονται με μια παραβολή, που το μέγιστο σημείο της (2pq) δίνεται όταν οι συχνότητες των αλληλόμορφων A και α παίρνουν την τιμή 0, 5 (p = q = 0, 5) (εικόνα 11.1). Εικόνα 11.1 Αναμενόμενες συχνότητες της ισορροπίας Hardy-Weinberg για έναν γενετικό τόπο με δύο αλληλόμορφα. («Hardy-Weinberg» από Johnuniq με άδεια CC BY-SA 3.0. Πηγή: commons.wikimedia.org/wiki/file:hardy-weinberg.svg#/media/file:hardy-weinberg.svg). 215

8 ΕΡΓΑΣΤΗΡΙΑΚΕΣ ΑΣΚΗΣΕΙΣ ΓΕΝΕΤΙΚΗΣ ΤΟΥ ΑΝΘΡΩΠΟΥ Εικόνα 11.2 Διάγραμμα De Finetti για έναν γενετικό τόπο με δύο αλληλόμορφα. Οι κατανομές συχνοτήτων των γονότυπων που ακολουθούν την ισορροπία H-W βρίσκονται πάνω στην παραβολή που συμπίπτει με τον αναμενόμενο αριθμό ετεροζυγωτών. Παρατηρούμε ότι οι παρατηρούμενες συχνότητες των γονότυπων στον γενετικό τόπο που ελέγξαμε βρίσκονται πολύ κοντά στην παραβολή, κατά συνέπεια ο πληθυσμός μας ακολουθεί την αναμενόμενη κατανομή της ισορροπίας. Μπορούμε να υπολογίσουμε γραφικά τις συχνότητες των αλληλόμορφων, χρησιμοποιώντας έναν χάρακα και φέροντας παράλληλες γραμμές με τις πλευρές του τριγώνου. Για παράδειγμα, για τον υπολογισμό της συχνότητας του αλληλόμορφου AA φέρουμε παράλληλη προς την πλευρά AaAA και εξετάζουμε το σημείο που τέμνει τις πλευρές Aααα ή AAαα (στην περίπτωσή μας 0, 25). Ακολουθώντας αντίστοιχα την ίδια διαδικασία, φέροντας παράλληλη ως προς την πλευρά Aaaa, βρίσκουμε τη συχνότητα του αλληλόμορφου aa (0, 26). Για την εύρεση της συχνότητας των ετεροζυγωτών φέρουμε την οριζόντια γραμμή μεταξύ του σημείου και της βάσης του τριγώνου και εξετάζουμε το σημείο στο οποίο τέμνει τον εξωτερικό άξονα (0, 48). Παράσταση της ισορροπίας σε διάγραμμα De Finetti. Ο Ιταλός στατιστικός Bruno De Finetti ( ) εισήγαγε ένα διάγραμμα τριών μεταβλητών, που χρησιμοποιείται συχνά στην πληθυσμιακή γενετική. Με το διάγραμμα αυτό, που συχνά ονομάζεται διάγραμμα De Finetti, παριστάνουμε την κατανομή των συχνοτήτων των γονότυπων και τη συχνότητα των αλληλόμορφων για έναν γενετικό τόπο με δύο αλληλόμορφα. Το διάγραμμα στηρίζεται σε ένα ισόπλευρο τρίγωνο, κάθε σημείο του οποίου, μέσα ή πάνω στις πλευρές του, αντιστοιχεί στον συνδυασμό των συχνοτήτων των τριών γονότυπων του πληθυσμού για τον συγκεκριμένο γενετικό τόπο. Σε κάθε σημείο στο εσωτερικό του τριγώνου αντιστοιχούν τρεις κάθετες ευθείες για κάθε πλευρά του τριγώνου (αποστάσεις του σημείου από τις πλευρές). Οι αποστάσεις του σημείου από τις πλευρές του τριγώνου είναι οι συχνότητες των γονότυπων. Το άθροισμα του μήκους των αποστάσεων είναι σταθερό, ανεξαρτήτως της θέσεως του σημείου μέσα στο τρίγωνο, και ισούται με τη μονάδα. Η βάση του τριγώνου είναι οι συχνότητες των αλληλόμορφων A και a, p και q = 1 p αντίστοιχα. Παρατηρήστε ότι η παραβολή που συμπίπτει με τον αναμενόμενο από την ισορροπία H-W αριθμό των ετεροζυγωτών είναι η ίδια με αυτή της εικόνας Κάθε σημείο που βρίσκεται εκτός της παραβολής αποκλίνει από την ισορροπία H-W, με τα σημεία που βρίσκονται πάνω από την παραβολή να έχουν περίσσεια ετεροζυγωτών, ενώ κάτω από την παραβολή έλλειμμα 216

9 ετεροζυγωτών σε σχέση με τον αναμενόμενο από την ισορροπία. Η απόκλιση της συχνότητας των ετεροζυγωτών από τη συνθήκη ισορροπίας είναι η απόσταση μεταξύ του σημείου και της παραβολής στην κάθετο ως προς τη βάση του τριγώνου. και εξέλιξη Η ισορροπία H-W αποτελεί τη βάση για να κατανοήσουμε τις εξελικτικές διαδικασίες. Το μαθηματικό μοντέλο των Hardy-Weinberg (H-W) προϋποθέτει την ισχύ ορισμένων παραδοχών και τυχόν παρατηρούμενες αποκλίσεις είτε στις συχνότητες των αλληλόμορφων είτε στις συχνότητες των γονότυπων υποδεικνύουν ότι μία ή περισσότερες από αυτές δεν πληρούνται. Παραβίαση της παραδοχής των τυχαίων διασταυρώσεων οδηγεί σε αλλαγές των γονοτυπικών συχνοτήτων, όχι όμως και των συχνοτήτων των αλληλόμορφων. Αντίθετα, στις περιπτώσεις μετάλλαξης, φυσικής επιλογής, γενετικής παρέκκλισης και γονιδιακής ροής (εισαγωγή νέων αλληλόμορφων σε ένα πληθυσμό, συνήθως ως αποτέλεσμα μετανάστευσης) προκαλείται μεταβολή της συχνότητας των αλληλόμορφων στις επόμενες γενιές, συνεπώς αλλαγή και εξέλιξη [4]. Μπορούμε να χρησιμοποιήσουμε την ισορροπία H-W προκειμένου να αποπειραθούμε να τεκμηριώσουμε τις υποθέσεις μας σχετικά με την ανθρώπινη εξέλιξη, ελέγχοντας αν η συχνότητες των γονότυπων που παρατηρούμε σε ένα δείγμα ανταποκρίνονται στις αναμενόμενες, με βάση τις συχνότητες των αλληλόμορφων που παρατηρούμε στο πληθυσμό. Ο τρόπος που γίνεται ο έλεγχος αναλύεται παρακάτω. Γενικά, οι αποκλίσεις από την ισορροπία H-W είναι σπάνιες στους ανθρώπους και ως αποτέλεσμα φυσικής επιλογής θα μπορούσαν να εμφανιστούν μόνο σε περίπτωση που παρατηρείται σημαντική διαφορά στη θνησιμότητα ενός γονότυπου μέσα σε μία γενιά [5]. Στις περισσότερες περιπτώσεις οι αποκλίσεις οφείλονται σε εργαστηριακό σφάλμα κατά τη γονοτύπηση των δειγμάτων ή σε παραβίαση της προϋπόθεσης των τυχαίων διασταυρώσεων, εξαιτίας της δομής του πληθυσμού από τον οποίο προέρχεται το δείγμα ή της μεθόδου δειγματοληψίας που ακολουθήθηκε. Για τον λόγο αυτό, αποκλίσεις από την ισορροπία H-W στη ρουτίνα των εργαστηρίων γενετικής επιδημιολογίας χρησιμοποιούνται για να καταδεικνύονται τεχνικά σφάλματα κατά τη γονοτύπηση και τη βελτίωση της ποιότητας των δεδομένων που θα υποβληθούν σε περαιτέρω στατιστική ανάλυση [5]. Τέλος, στην πραγματική ζωή, οι παράγοντες που επιδρούν στην κατεύθυνση μεταβολής της ισορροπίας H-W δεν δρουν απομονωμένα, ένας κάθε φορά, αλλά ταυτόχρονα, αλληλεπιδρώντας με πολύπλοκους τρόπους. Η ερμηνεία των αλλαγών παρουσιάζει μεγάλες δυσκολίες, πολύ περισσότερο όταν αναλύουμε ανθρώπινους πληθυσμούς Έλεγχος της ισορροπίας Hardy-Weinberg Ας εξετάσουμε το επόμενο παράδειγμα: Έστω ότι γονοτυπήσαμε τον πολυμορφισμό rs σε εθελοντές ελληνικής καταγωγής και πήραμε τα παρακάτω αποτελέσματα (πίνακας 11.3): Από τον πίνακα (11.3) μπορούμε να υπολογίσουμε τη συχνότητα ˆp του αλληλόμορφου T, σύμφωνα με την εξίσωση (11.3): ˆp = = 0, 495

10 ΕΡΓΑΣΤΗΡΙΑΚΕΣ ΑΣΚΗΣΕΙΣ ΓΕΝΕΤΙΚΗΣ ΤΟΥ ΑΝΘΡΩΠΟΥ T T T C CC Πίνακας 11.3 Αποτελέσματα γονοτύπησης του πολυμορφισμού rs σε εθελοντές ελληνικής καταγωγής. H συχνότητα ˆq του αλληλόμορφου C θα δίνεται από τον τύπο ˆq = 1 ˆp. Με τον τρόπο αυτό υπολογίζουμε ότι: ˆq = 1 0, 495 ˆq = 0, 505 Στηριζόμενοι στις συχνότητες των αλληλόμορφων p και q, μπορούμε να υπολογίσουμε τον αναμενόμενο (E) από την ισορροπία H-W αριθμό ατόμων για καθέναν από τους τρεις διαφορετικούς γονότυπους (T T, T C, CC) όπως φαίνεται παρακάτω: E T T = p 2 n = (0, 495) = 250, 67 E CC = q 2 n = (0, 505) = 260, 90 E T C = 2 p q n = 0, = 511, 45 Τα αποτελέσματα των υπολογισμών συνοψίζονται στον πίνακα Γονότυποι T T T C CC Παρατηρούμενος αριθμός ατόμων (O) Αναμενόμενος αριθμός ατόμων (E) 250,67 511,45 260,90 Πίνακας 11.4 Παρατηρούμενοι και αναμενόμενοι, με βάση την ισορροπία H-W, γονότυποι σε έναν πληθυσμό ατόμων. Παρατηρώντας τον πίνακα 11.4 διαπιστώνουμε ότι υπάρχει διαφορά ανάμεσα στην κατανομή των παρατηρούμενων και των αναμενόμενων από την ισορροπία H-W γονότυπων. Το ερώτημα που καλούμαστε να απαντήσουμε είναι αν η διαφορά αυτή είναι προϊόν τυχαίας διακυμάνσεως σε έναν πληθυσμό που βρίσκεται σε ισορροπία H-W ή είναι στατιστικά σημαντική και οφείλεται σε απόκλιση του πληθυσμού από το θεωρητικό μοντέλο της ισορροπίας H-W. Η απάντηση στο ερώτημα δίνεται με την εφαρμογή της κατάλληλης στατιστικής δοκιμασίας, που είναι ο έλεγχος καλής προσαρμογής. Έλεγχος καλής προσαρμογής Οι δοκιμασίες ελέγχου καλής προσαρμογής χρησιμοποιούνται όταν θέλουμε να ελέγξουμε αν η κατανομή που λαμβάνουμε είναι συμβατή με μια θεωρητική κατανομή που αναμένεται βάσει μιας ορισμένης θεωρίας ή υποθέσεως (στην προκειμένη περίπτωση το θεωρητικό μοντέλο της ισορροπίας H-W). Ένα στατιστικά σημαντικό αποτέλεσμα του ελέγχου υποδεικνύει ότι δεν υφίσταται καλή προσαρμογή. Οι στατιστικοί έλεγχοι που μπορούν να χρησιμοποιηθούν είναι οι ακόλουθοι: 1. Έλεγχος X 2 καλής προσαρμογής (με ή χωρίς την διόρθωση συνέχειας). 2. Έλεγχος του λόγου πιθανοφανειών. 218

11 3. Ακριβής έλεγχος του Fisher. 4. Ακριβής έλεγχος σε συνδυασμό με αλγόριθμους Monte Carlo. Στην συνέχεια θα αναλυθεί διεξοδικά ο έλεγχος καλής προσαρμογής X 2 του Pearson. Πριν προχωρήσουμε όμως στον στατιστικό έλεγχο, θα υπενθυμίσουμε συνοπτικά ορισμένα βασικά στοιχεία των ελέγχων υποθέσεων (για περισσότερες πληροφορίες δείτε τις βιβλιογραφικές αναφορές [7], [8]). Όταν διεξάγουμε έναν στατιστικό έλεγχο χρησιμοποιώντας ένα στατιστικό μέτρο, κάνουμε την υπόθεση ότι το μέτρο αυτό ακολουθεί μια γνωστή κατανομή πιθανότητας (για παράδειγμα την τυπική κανονική κατανομή, την κατανομή F, τη X 2 κ.λπ.). Στο στατιστικό μέτρο συμπυκνώνεται η σύγκριση των παρατηρούμενων και των αναμενόμενων τιμών. Ο έλεγχος υπόθεσης που θέλουμε να πραγματοποιήσουμε είναι αν ο πληθυσμός μας ακολουθεί ή όχι την ισορροπία Hardy-Weinberg. Για ευκολία, μπορεί να γραφεί ως εξής: H 0 : Ο πληθυσμός βρίσκεται σε ισορροπία Hardy-Weinberg. H 1 : Ο πληθυσμός δεν βρίσκεται σε ισορροπία Hardy-Weinberg. Το στατιστικό X 2 ισούται με: X 2 = n (O E) 2 H 0 X 2 E 1 β.ε. i=1 (11.8) όπου O είναι ο παρατηρούμενος αριθμός ατόμων και E ο αναμενόμενος για κάθε γονότυπο. Για τον υπολογισμό της κριτικής τιμής της κατανομής X 2 πρέπει να γνωρίζουμε την πληροφορία που απαιτήθηκε για να εκτιμήσουμε το στατιστικό X 2, δηλαδή τους βαθμούς ελευθερίας (β.ε.). Η τιμή X 2 ουσιαστικά μετρά την απόκλιση μεταξύ των πραγματικών συχνοτήτων και των αναμενόμενων. Για να αποφασίσουμε εάν η απόκλιση μεταξύ των παρατηρούμενων συχνοτήτων από τις αναμενόμενες με βάση την υπόθεση της ισορροπίας H-W είναι στατιστικά σημαντική, θα συγκρίνουμε το στατιστικό μέτρο του ελέγχου X 2 με την κριτική τιμή της κατανομής X 2 στο επίπεδο σημαντικότητας που θα διεξαχθεί ο έλεγχος. Το επίπεδο σημαντικότητας (ε.σ.) συμβολίζεται με το γράμμα a και αποτελεί τη μέγιστη αποδεκτή πιθανότητα να αποφασίσουμε ότι το αποτέλεσμα είναι στατιστικά σημαντικό και επομένως να απορρίψουμε λανθασμένα τη μηδενική υπόθεση, ενώ στην πραγματικότητα ισχύει. Με άλλα λόγια, δηλαδή, να αποφασίσουμε ότι η θεωρητική μας κατανομή δεν προσαρμόζεται ικανοποιητικά στα δεδομένα μας, όταν στην πραγματικότητα προσαρμόζεται. Οι πιο συνηθισμένες τιμές του a είναι οι 5%, 10%, και 1%. Οι βαθμοί ελευθερίας (β.ε.) στηρίζονται στον αριθμό των κατηγοριών των δεδομένων: β.ε. = (πλήθος κατηγοριών που συγκρίνονται) (πλήθος παραμέτρων που εκτιμώνται) 1 (11.9) Η αποδοχή ή η απόρριψη της μηδενικής υπόθεσής μας μπορεί να πραγματοποιηθεί με 3 τρόπους: 1. Συγκρίνοντας την υπολογισμένη τιμή X 2 με την κριτική τιμή της κατανομής X 2 1 σε κατάλληλο επίπεδο σημαντικότητας (α) που προκύπτει από πίνακες. 2. Χρησιμοποιώντας την τιμή p value του ελέγχου και συγκρίνοντάς τη με το επίπεδο σημαντικότητας α. Η τιμή p value ορίζεται ως η πιθανότητα να λάβουμε αποτέλεσμα ίσο ή πιο ακραίο από αυτό που παρατηρήσαμε, δοθέντος ότι ισχύει η μηδενική υπόθεση. Πιο απλά, το p value μάς λέει πόσα στοιχεία διαθέτουμε εναντίον της μηδενικής υπόθεσης. Όσο πιο μικρή είναι η τιμή του p value, τόσο περισσότερα στοιχεία διαθέτουμε για να απορρίψουμε τη μηδενική υπόθεση. 219

12 ΕΡΓΑΣΤΗΡΙΑΚΕΣ ΑΣΚΗΣΕΙΣ ΓΕΝΕΤΙΚΗΣ ΤΟΥ ΑΝΘΡΩΠΟΥ 3. Χρησιμοποιώντας διάστημα εμπιστοσύνης. Θα αναλύσουμε τους δύο πρώτους τρόπους, καθώς ο τρίτος ξεπερνάει τα όρια του παρόντος βιβλίου. Επιστρέφοντας λοιπόν στην περιπτώσεις 1 και 2, για να απορριφθεί η μηδενική υπόθεση (H 0 ) πρέπει: είτε η υπολογισμένη τιμή του στατιστικού X 2 να υπερβαίνει την κριτική τιμή του πίνακα για ένα δοσμένο ε.σ και έναν β.ε., δηλαδή X 2 > X 2 1,α (όπως γίνεται κατανοητό η θεωρητική μας κατανομή στην περίπτωση αυτή δεν αποτελεί καλή προσαρμογή για τα δεδομένα μας), είτε η τιμή p value του ελέγχου να είναι μικρότερη από το δοσμένο επίπεδο σημαντικότητας α, δηλαδή p value < α. Συνοπτικά, η σειρά που ακολουθούμε μπορεί να περιγραφεί ως εξής: 1. Πρώτα υπολογίζουμε το στατιστικό X 2 από τα δεδομένα μας. 2. Στη συνέχεια ορίζουμε το επίπεδο σημαντικότητας όπου θα πραγματοποιήσουμε τον έλεγχο. Συνήθως επιλέγουμε το a = 5%, δηλαδή να απορρίπτουμε τη μηδενική υπόθεση, εάν υπάρχει 5% ή λιγότερη πιθανότητα να κάνουμε λάθος. 3. Υπολογίζουμε τους βαθμούς ελευθερίας. 4. Βρίσκουμε από τον πίνακα της κατανομής X 2 τη ζητούμενη τιμή της κατανομής για το συγκεκριμένο επίπεδο σημαντικότητας στους αντίστοιχους βαθμούς ελευθερίας. 5. Συγκρίνουμε την τιμή X 2 του ελέγχου με την τιμή της κατανομής X 2 που βρήκαμε. Συνεχίζοντας το παράδειγμά μας χρησιμοποιώντας τα δεδομένα του πίνακα (11.4) μπορούμε να υπολογίσουμε το στατιστικό X 2 και να διεξαγάγουμε τον έλεγχο καλής προσαρμογής. Η σχέση (11.8) γίνεται: X 2 = n (O E) 2 = E i=1 ( , 67)2 250, 67 Κάνοντας τους υπολογισμούς βρίσκουμε ότι: + ( , 45)2 511, 45 + ( , 90)2 260, 90 X 2 = 1, 07 Ερμηνεία των αποτελεσμάτων του ελέγχου: Το επόμενο βήμα είναι να συγκρίνουμε την τιμή του X 2 που υπολογίσαμε με την τιμή της κατανομής X 2. Επιλέγουμε να διεξάγουμε τον έλεγχο σε β.ε,a επίπεδο σημαντικότητας a = 5%. Oι ζητούμενοι βαθμοί ελευθερίας για τον έλεγχο X 2 υπολογίζονται ως εξής: β.ε = Οι κατηγορίες που συγκρίνονται είναι οι 3 γονότυποι (AA, Aa, aa) και η εκτιμώμενη συχνότητα είναι 1 (η ˆp). Αξίζει να σημειωθεί ότι δεν χρειάζεται να προσμετρήσουμε τη συχνότητα του q ως παράμετρο που εκτιμάται, διότι υπολογίζεται έμμεσα από τη συχνότητα του p, λόγω της σχέσης p + q = 1. Από τον πίνακα της κατανομής X 2 με έναν βαθμό ελευθερίας, σε επίπεδο σημαντικότητας 5%, βρίσκουμε την τιμή (X 2 1,0.05 = 3, 84). Παρατηρούμε ότι δεν απορρίπτουμε τη μηδενική υπόθεση, διότι X 2 = 1, 07 < X 2 1,0.05 = 3, 84. Επομένως, ο πληθυσμός μας βρίσκεται σε ισορροπία H-W. Αξίζει να 220

13 τονιστεί ότι αρκετοί φοιτητές συγχέουν τον έλεγχο της μηδενικής και της εναλλακτικής υπόθεσης. Εάν δεν απορρίψουμε τη μηδενική υπόθεση, σημαίνει ότι ο πληθυσμός μας βρίσκεται σε ισορροπία Hardy-Weinberg! Πολύ συχνά το μέγεθος του δείγματος που διαθέτουμε είναι μικρό, με αποτέλεσμα οι αναμενόμενες συχνότητες των γονότυπων να είναι αρκετά χαμηλές. Στην περίπτωση αυτή ο έλεγχος καλής προσαρμογής του Pearson δεν είναι ο ενδεδειγμένος. Η συνηθισμένη σύσταση είναι να μη χρησιμοποιείαι όταν ο αριθμός των αναμενόμενων τιμών σε κάθε κελί είναι μικρότερος από 5 [7]. Όταν έχουμε μικρό δείγμα και αντιμετωπίζουμε το πρόβλημα αυτό, τότε καταφεύγουμε στους επόμενους δύο εναλλακτικούς στατιστικούς ελέγχους, δηλαδή στον ακριβή έλεγχο του Fisher ή στη διόρθωση συνέχειας του Yates [9]. Γραφική παράσταση του ελέγχου της ισορροπίας Hardy-Weinberg Όπως εξηγήσαμε στην παράγραφο «Παράσταση της ισορροπίας σε διάγραμμα De Finetti», οι παρατηρούμενες κατανομές συχνοτήτων των γονότυπων αποτυπώνονται ως σημεία εντός του ισόπλευρου τριγώνου του διαγράμματος De Finetti. Όταν οι παρατηρούμενες κατανομές ακολουθούν ή βρίσκονται πολύ κοντά στη θεωρητικά αναμενόμενη από την ισορροπία H-W, τότε βρίσκονται ακριβώς στην παραβολή της συχνότητας των ετεροζυγωτών ή πολύ κοντά πάνω ή κάτω από αυτή. Ωστόσο, ελέγχοντας οπτικά το γράφημα δεν είναι δυνατόν να αποφανθούμε πάντα αν ένα σημείο που βρίσκεται σε απόσταση από την παραβολή ακολουθεί την ισορροπία H-W. Για τον σκοπό αυτό θα πρέπει να ορίσουμε γραφικά και να προβάλουμε στο γράφημα την περιοχή αποδοχής της μηδενικής μας υπόθεσης (ότι ο πληθυσμός μας βρίσκεται σε ισορροπία H-W). Για να επιτευχθεί αυτό χρειάζεται να κατασκευάσουμε τις καμπύλες που οριοθετούν την περιοχή αποδοχής εκατέρωθεν της παραβολής της ισορροπίας για το επίπεδο στατιστικής σημαντικότητας στο οποίο διεξάγουμε τον έλεγχο. Η μέθοδος αυτή μπορεί να παρακάμψει τον υπολογισμό των p value από τον έλεγχο X 2 και να επιτρέψει τον οπτικό έλεγχο της ισορροπίας για έναν μεγάλο αριθμό διαλληλικών γενετικών τόπων ταυτόχρονα. Αν θεωρήσουμε ως μέτρο της απόκλισης από τη συνθήκη ισορροπίας για τους ετεροζυγώτες την ποσότητα D, όπου: D = 1 2 (nf AB e AB ) (11.10) n το μέγεθος του δείγματος, f AB ο παρατηρούμενος αριθμός των ετεροζυγωτών και e AB ο αναμενόμενος, τότε έχει αποδειχθεί [10] ότι μια ισοδύναμη έκφραση του στατιστικού μέτρου X 2 είναι η ακόλουθη: X 2 = D2 p 2 q 2 n (11.11) Το στατιστικό μέτρο της σχέσης ακολουθεί την κατανομή «χι-τετράγωνο» με έναν βαθμό ελευθερίας (όταν ισχύει η μηδενική υπόθεση της ισορροπίας H-W). Αντικαθιστώντας στην εξίσωση (11.11) την (11.10) και επιλύοντας ως προς τη συχνότητα των ετεροζυγωτών f AB συναρτήσει της συχνότητας p, λαμβάνουμε τις παραβολές που οριοθετούν την περιοχή αποδοχής: f AB = 2pq ± 2pq X 2 /n (11.12) Η εξίσωση μάς δείχνει ότι αποκλίσεις της συχνότητας των ετεροζυγωτών που διαφέρουν λιγότερο από την ποσότητα 2pq X 2 /n βρίσκονται εντός της περιοχής αποδοχής της ισορροπίας και περιγράφει τη θέση των παραβολών που την οριοθετούν πάνω και κάτω από την παραβολή των ετεροζυγωτών σε συνθήκες ισορροπίας Hardy-Weiberg (σχήμα 11.3). Με άλλα λόγια, μας προσφέρει το 221

14 ΕΡΓΑΣΤΗΡΙΑΚΕΣ ΑΣΚΗΣΕΙΣ ΓΕΝΕΤΙΚΗΣ ΤΟΥ ΑΝΘΡΩΠΟΥ μέτρο με το οποίο θα απορρίπτουμε την ισορροπία των Hardy-Weinberg, εάν η δειγματική συχνότητα των ετεροζυγωτών είναι πολύ μεγάλη ή πολύ μικρή: 1. Όταν υπάρχει πλήθος ετεροζυγωτών (D > 0), δηλαδή όταν ισχύει: f AB > 2pq + 2pq X1(α)/n 2 2. Όταν υπάρχει έλλειμμα ετεροζυγωτών (D < 0), δηλαδή όταν ισχύει: f AB < 2pq 2pq X1(α)/n 2 Κλείνοντας την ενότητα αυτή, αξίζει να σημειωθεί ότι ο γραφικός έλεγχος μπορεί να πραγματοποιηθεί με δύο επιπλέον τρόπους: 1. Με τον έλεγχο X 2 με διόρθωση συνέχειας. 2. Με τον ακριβή έλεγχο του Fisher. Εικόνα 11.3 Γράφημα De Finetti με οριοθετημένη την περιοχή αποδοχής της μηδενικής υπόθεσης. Τα σημεία που βρίσκονται εκτός της περιοχής αποδοχής δεν ακολουθούν την ισορροπία H-W. Πάνω από τα όρια της περιοχής αποδοχής σημειώνονται οι κατανομές συχνοτήτων που χαρακτηρίζονται από περίσσεια ετεροζυγωτών, ενώ κάτω αυτές με έλλειμμα ετεροζυγωτών. 222

15 Εξάγοντας βιολογικά συμπεράσματα από τον έλεγχο της ισορροπίας Hardy-Weinberg Για την αξιολόγηση της βιολογικής σημασίας των αποτελεσμάτων του ελέγχου της ισορροπίας H-W πρέπει να λαμβάνουμε υπόψη μας τα εξής: Αν ο πληθυσμός βρίσκεται σε ισορροπία H-W, δεν συμπεραίνεται ότι στον πληθυσμό ισχύουν οι παραδοχές του μαθηματικού μοντέλου. Οι παραδοχές μπορεί να παραβιάζονται και παρ όλα αυτά ο έλεγχός μας να μην καταδεικνύει απόκλιση από την ισορροπία. Έτσι, αν ο πληθυσμός βρεθεί σε ισορροπία H-W, δεν μπορεί να εξαχθεί το συμπέρασμα ότι δεν υπάρχει εξέλιξη. Η ορθότερη ερμηνεία είναι ότι οι αλλαγές που συμβαίνουν σε μια γενιά είναι απίθανο να καταδειχθούν στο δείγμα. Οι αποκλίσεις από την ισορροπία H-W είναι σπάνιες στους ανθρώπινους πληθυσμούς και, ως αποτέλεσμα φυσικής επιλογής, εμφανίζονται μόνο σε περίπτωση που παρατηρείται σημαντική διαφορά στη θνησιμότητα ενός γονότυπου μέσα σε μία γενιά. Όταν δεν επιδρά η φυσική επιλογή, αρκεί ένας μόνος κύκλος τυχαίων διασταυρώσεων σε μια γενιά ώστε να αποκατασταθούν οι γονοτυπικές συχνότητες στις προβλεπόμενες από την ισορροπία H-W. Έτσι, γεγονότα φυσικής επιλογής που συνέβησαν στο παρελθόν δεν μπορούν να καταδειχθούν. Ο έλεγχος είναι κατάλληλος στο να καταδείξει την πιθανή επιλογή μόνο στην τρέχουσα γενιά [5]. Όταν ο πληθυσμός βρίσκεται σε ισορροπία H-W, τα αποτελέσματα μπορούν να χρησιμοποιηθούν προκειμένου να εκτιμηθούν οι συχνότητες αλληλόμορφων και γονότυπων που θα ήταν αλλιώς δύσκολο να υπολογιστούν στον πληθυσμό. Αν ο πληθυσμός βρεθεί να αποκλίνει από την ισορροπία H-W, θα πρέπει πρώτα να εξεταστεί η πιθανότητα να έχει προκύψει κάποιο σφάλμα κατά τη γονοτύπηση του δείγματος. Αν η απόκλιση δεν οφείλεται σε εργαστηριακό σφάλμα, τότε κάποια από τις προϋποθέσεις του μαθηματικού μοντέλου παραβιάζεται. Η πιθανότερη εξήγηση είναι ότι παραβιάζεται η παραδοχή των τυχαίων διασταυρώσεων. Όταν το μέγεθος του πληθυσμού είναι μεγάλο, άρα η επίδραση της γενετικής παρέκκλισης είναι μικρή και η ομομιξία λιγότερο πιθανή, μεταξύ άλλων, θα πρέπει να εξετάζεται το ενδεχόμενο πληθυσμιακής διαστρωμάτωσης. Στις περιπτώσεις αυτές παρατηρείται αύξηση των ομοζυγωτών πέρα από τα επίπεδα των προβλεπομένων από την ισορροπία, με αντίστοιχη μείωση των ετεροζυγωτών (έλλειμμα ετεροζυγωτών). Δύο παραδείγματα που σχετίζονται με την ανθρώπινη διατροφή μάς δείχνουν στην πράξη τις δυνατότητες και τους περιορισμούς του ελέγχου της ισορροπίας H-W για την τεκμηρίωση της μικροεξέλιξης: Στην περίπτωση της νευροεκφυλιστικής εγκεφαλοπάθειας Kuru (OMIM#245300) που παρουσιαζόταν σε ορισμένες φυλές κατοίκων της Παπούας - Νέας Γουινέας, οι φέροντες τον ετερόζυγο γονότυπο του μονονουκλεοτιδικού πολυμορφισμού rs στο γονίδιο PRNP προστατεύονται από την εκδήλωση της νόσου. Η εξέταση του πληθυσμού των γυναικών Φόρε που γεννήθηκαν πριν το 1950 έδειξε δραματική αύξηση στη συχνότητα των ετεροζυγωτών, εξαιτίας της εκλεκτικής θνησιμότητας των PRNP ομόζυγων από τη νόσο Kuru [11]. Στην περίπτωση των Φόρε ο έλεγχος της ισορροπίας H-W έδειξε απόκλιση εξαιτίας της αρνητικής επιλογής των ομοζυγωτών στο διάστημα μιας γενιάς. Τι ακριβώς έτρωγαν οι κάτοικοι των ανατολικών υψιπέδων της Παπούας - Νέας Γουινέας και ποιος είναι ο ρόλος του γονιδίου PRNP (OMIM176640) θα χρειαστεί να το διερευνήσετε μόνοι σας, ανατρέχοντας στη σχετική βιβλιογραφία της ερώτησης 8 στο τέλος του κεφαλαίου. 223

16 ΕΡΓΑΣΤΗΡΙΑΚΕΣ ΑΣΚΗΣΕΙΣ ΓΕΝΕΤΙΚΗΣ ΤΟΥ ΑΝΘΡΩΠΟΥ Στην περίπτωση της δυσανεξίας στη λακτόζη, ή ορθότερα στην παρατεινόμενη έκφραση της λακτάσης (OMIM#223100), ο έλεγχος της ισορροπίας H-W δεν καταδεικνύει απόκλιση στους σύγχρονους πληθυσμούς. Οι μεταλλάξεις που οδήγησαν στην παρατεταμένη έκφραση του γονιδίου της λακτάσης (rs , rs182549) εμφανίζονται με υψηλές συχνότητες σε ορισμένους πληθυσμούς ως προϊόν της εξελικτικής διαδικασίας που συνέβη κατά το παρελθόν [12] [16]. Ο έλεγχος της ισορροπίας H-W δεν μπορεί να καταδείξει τη μικροεξέλιξη που συνέβη στο παρελθόν, γιατί αρκεί μονάχα ένας κύκλος τυχαίων διασταυρώσεων ώστε να επανέλθει ο πληθυσμός σε ισορροπία Εξελικτικοί παράγοντες Στις παραγράφους που ακολουθούν ανασκοπούνται αποσπασματικά οι τρόποι με τους οποίους οι παράγοντες της εξέλιξης επιδρούν στη μεταβολή των συχνοτήτων των αλληλόμορφων στους πληθυσμούς. Σκοπός της παράθεσης είναι να διευκολυνθεί η κατανόηση του πρακτικού μέρους της άσκησης. Η διεξοδική περιγραφή του τρόπου με τον οποίο επιδρούν ο καθένας ξεχωριστά και σε συνδυασμό ξεφεύγει από τους στόχους του βιβλίου. Για πληρέστερες αναφορές, οι φοιτητές ενθαρρύνονται να ανατρέξουν σε κλασικά συγγράμματα πληθυσμιακής γενετικής που αναφέρονται στη βιβλιογραφία [4], [5], [17] [20]. Μετάλλαξη Οι μεταλλάξεις είναι αλλαγές που συμβαίνουν στον γενετικό κώδικα και μπορούν να είναι διαφόρων ειδών. Για παράδειγμα, οι σημειακές μεταλλάξεις αφορούν τη μεταβολή ενός νουκλεοτιδίου σε ένα άλλο, ενώ οι ενθέσεις και απαλοιφές αφορούν αντίστοιχα την εισαγωγή ή την απαλοιφή ενός ή περισσοτέρων νουκλεοτιδίων από τη νουκλεοτιδική αλληλουχία. Οι μεταλλάξεις μπορούν να αφορούν και μεγάλες περιοχές ολόκληρων χρωμοσωμάτων, όπως για παράδειγμα οι αναστροφές, οι μεταθέσεις κ.ά. Οι μεταλλάξεις είναι σχετικά σπάνια γεγονότα όταν εξετάζονται ως πιθανότητα μετάλλαξης ενός γενετικού τόπου σε ένα άτομο ανά γενεά. Οι ρυθμοί της μεταλλαξιογέννεσης διαφέρουν για κάθε τύπο μετάλλαξης αλλά και για τις διάφορες περιοχές του γονιδιώματος. Για παράδειγμα, το μιτοχονδριακό γονιδίωμα εμφανίζει μεγαλύτερους ρυθμούς μετάλλαξης από το πυρηνικό. Στους ανθρώπους ο μέσος ρυθμός μετάλλαξης είναι περίπου 2, ανά βάση ανά γενιά. Ας θεωρήσουμε ένα απλουστευμένο μοντέλο μετάλλαξης, σαν αυτό που μας δίνεται η δυνατότητα να αξιοποιήσουμε από το πρόγραμμα προσομοίωσης που θα χρησιμοποιήσουμε. Έστω ότι το αλληλόμορφο Α με συχνότητα p στον γενετικό τόπο που μελετάμε μεταλλάσεται σε α με ρυθμό μετάλλαξης µ (ορθόδρομη μετάλλαξη), ενώ το αλληλόμορφο α με συχνότητα q μπορεί να μεταλλαχθεί σε A με ρυθμό μετάλλαξης ν (ανάδρομη μετάλλαξη): A µ α A ν α Ο αριθμός των αλληλόμορφων Α που μεταλάσσονται σε α εξαρτάται από τη συχνότητά του p και τον ρυθμό μετάλλαξης μ. Μια συνεχής μείωση του p (δοθέντος ότι µ > ν) θα οδηγήσει στην κατάσταση κατά την οποία οι ορθόδρομες μεταλλάξεις θα εξισωθούν με τις ανάδρομες, επειδή η συχνότητα q του αλληλόμορφου α θα έχει αυξηθεί με το πέρασμα των γενεών. Στο σημείο αυτό, της μεταλλακτικής ισορροπίας, οι συχνότητες των αλληλόμορφων θα σταματήσουν να μεταβάλλονται. Η 224

17 αλλαγή της συχνότητας του αλληλόμορφου α ανά γενιά είναι ίση με ( q): q = µp νq = µ(1 q) νq (11.13) Στο σημείο ισορροπίας η μεταβολή της συχνότητας θα είναι q = 0 και η συχνότητα ισορροπίας q θα δίνεται από την εξίσωση: q = µ µ + ν ενώ η αντίστοιχη συχνότητα του αλληλόμορφου Α από την εξίσωση: Ο δε λόγος των συχνοτήτων θα ισούται με: p = ν µ + ν q p = µ ν Οι μεταλλάξεις είναι η πηγή της γενετικής ποικιλότητας. Για να έχουν κάποια εξελικτική επίπτωση, θα πρέπει να συμβούν σε γαμετικά κύτταρα, ώστε να μπορούν να μεταβιβαστούν στις επόμενες γενιές. Οι ίδιες οι μεταλλάξεις μπορούν να οδηγήσουν σε μεταβολές των συχνοτήτων των αλληλόμορφων, ωστόσο οι μεταβολές αυτές, όταν δεν συνοδεύονται από την επίδραση άλλων εξελικτικών παραγόντων (όπως η επιλογή, η γενετική παρέκκλιση ή η γονιδιακή ροή) δεν μεταβάλλουν σημαντικά τις συχνότητες των αλληλόμορφων, ακόμα και σε μακρά εξελικτικά διαστήματα. Με άλλα λόγια, οι μεταλλάξεις εισάγουν νέα αλληλόμορφα στον πληθυσμό και έτσι αποτελούν τον απαραίτητο, αλλά όχι από μόνο του επαρκή, παράγοντα της εξέλιξης. Χρησιμοποιώντας το 2, ως μέσο ρυθμό μετάλλαξης ανά βάση ανά γενιά και υπολογίζοντας ότι το ανθρώπινο γονιδίωμα έχει 3, βάσεις και κάθε άτομο φέρει δύο αντίγραφα του γονιδιώματος, μπορούμε να υπολογίσουμε ότι σε κάθε άτομο σε κάθε γενιά αναμένεται να εμφανίζονται (2, ) (3, ) 2 = 147, 2 νέες μεταλλάξεις [4]. Σύμφωνα με πιο συντηρητικούς υπολογισμούς, καταλήγουμε στις 6, 4 μεταλλάξεις για κάθε άτομο. Πιθανότατα, λοιπόν, καθένας από εμάς είναι φορέας νέων μεταλλάξεων. Αν εξετάσουμε τους αριθμούς σε επίπεδο πληθυσμού, τότε σε πληθυσμό ατόμων θα δημιουργηθούν από έως νέες μεταλλάξεις ανά γενιά και αν αναγάγουμε τους αριθμούς αυτούς στο σύνολο του είδους, υπολογίζοντας τον σημερινό αριθμό ατόμων αναπαραγωγικής ηλικίας του πλανήτη, αντιλαμβανόμαστε το μέγεθος της γενετικής ποικιλότητας που προκύπτει για το ανθρώπινο είδος ( δισ. νέες μεταλλάξεις ανά γενιά) [4]. Το συμπέρασμα των υπολογισμών είναι ότι η πληθυσμιακή αύξηση συνδέεται με την αύξηση της γενετικής ποικιλότητας του είδους. Γενετική παρέκκλιση Υποθέστε ένα άτομο με γονότυπο Aα σε έναν γενετικό τόπο. Από τη θεωρία των πιθανοτήτων γνωρίζουμε ότι αν το άτομο που μελετάμε έκανε άπειρα παιδιά, τότε στην περίπτωση αυτή η πιθανότητα να μεταβιβάσει το αλληλόμορφο A στην επόμενη γενιά θα ήταν 0, 5, όπως ακριβώς και η πιθανότητα να πάρουμε «γράμματα» πετώντας ένα νόμισμα στο αέρα άπειρες φορές. Στην πραγματική ζωή ο αριθμός των παιδιών ενός ατόμου είναι πεπερασμένος και μικρός. Από σύμπτωση ένα άτομο με γονότυπο Aα και τρία παιδιά θα μπορούσε να μην έχει συνεισφέρει κανένα αλληλόμορφο A στην επόμενη γενιά ή θα μπορούσε να έχει συνεισφέρει 1, 2 ή 3. Όταν ο πληθυσμός είναι άπειρος 225

18 ΕΡΓΑΣΤΗΡΙΑΚΕΣ ΑΣΚΗΣΕΙΣ ΓΕΝΕΤΙΚΗΣ ΤΟΥ ΑΝΘΡΩΠΟΥ σε μέγεθος (μια από τις βασικές παραδοχές του νόμου των Hardy-Weinberg) η πιθανότητα να παρουσιαστούν αποκλίσεις στην εκπροσώπηση των αλληλόμορφων A και α στη δεξαμενή των γαμετών που θα διαμορφώσουν την επόμενη γενιά ατόμων εξαφανίζεται. Στην πραγματική ζωή, όμως, οι ανθρώπινοι πληθυσμοί είναι πεπερασμένοι σε μέγεθος και όσο πιο μικρό είναι το μέγεθός τους τόσο περισσότερο αυξάνει η πιθανότητα, εξαιτίας της τυχαιότητας και μόνο, να μεταβληθεί η συχνότητα των αλληλόμορφων στην επόμενη γενιά. Η περίπτωση αυτή αποτελεί το «δειγματοληπτικό σφάλμα» που αναφέρεται συχνά στην στατιστική. Οι αλλαγές των γονιδιακών συχνοτήτων που συμβαίνουν από τη μια γενιά στην άλλη και ακολουθούν τη θεωρία των πιθανοτήτων ονομάζονται τυχαίος περίπατος. Το αποτέλεσμα των διακυμάνσεων των συχνοτήτων των αλληλόμορφων στον πληθυσμό είναι ότι είτε κάποια στιγμή θα χαθούν (π.χ. p = 0) είτε ότι θα εγκαθιδρυθούν (p = 1), όπως φαίνεται στην εικόνα Εικόνα 11.4 Γενετική παρέκκλιση. Αποτέλεσμα προσομοίωσης 10 πληθυσμών των 30 ατόμων, χωρίς την επίδραση επιλογής, γονιδιακής ροής, ή μετάλλαξης στην συχνότητα του αλληλόμορφου Α. Παρατηρήστε ότι σε λιγότερες από 200 γενιές το αλληλόμορφο Α εγκαθιδρύθηκε σε 6 πληθυσμούς και χάθηκε σε 4. Από μαθηματική άποψη, κάθε πεπερασμένος πληθυσμός θα οδηγηθεί κάποια στιγμή είτε σε εγκαθίδρυση είτε σε εξάλειψη του αλληλόμορφου σε άλλο αριθμό γενιών. Για έναν σχετικά μεγάλο αριθμητικά πληθυσμό αυτό μπορεί να απαιτεί πολύ μεγάλο αριθμό γενιών. Παρότι δεν μπορούμε να προβλέψουμε σε κάποιο συγκεκριμένο πληθυσμό ποιο θα είναι το τελικό αποτέλεσμα της γενετικής παρέκκλισης στη συχνότητα ενός αλληλόμορφου (εγκαθίδρυση, εξαφάνιση ή διατήρηση μιας ενδιάμεσης συχνότητας μεταξύ 0 και 1) μετά από μερικές γενιές, χρησιμοποιώντας τη θεωρία των πιθανοτήτων μπορούμε να πούμε ποια έκβαση είναι η πιο πιθανή. Για παράδειγμα, αν η αρχική συχνότητα του αλληλόμορφου Α των προσομοιώσεων της εικόνας 11.4 ήταν 0, 1 αντί για 0, 5, τότε εύλογα υποθέτουμε ότι είναι περισσότερο πιθανό το αλληλόμορφο Α να οδηγηθεί σε εξάλειψη σε περισσότερους προσομοιούμενους πληθυσμούς από αυτούς στους οποίους θα οδηγηθεί σε εγκαθίδρυση. Η πιθανότητα εγκαθίδρυσης ή απώλειας ενός αλληλόμορφου είναι ίση με την αρχική του συχνότητα. Αυτό μπορεί να αποδειχθεί με τη θεωρία των πιθανοτήτων, αλλά η απόδειξη ξεφεύγει από το πλαίσιο του εγχειριδίου. Το μέγεθος του πληθυσμού και η έννοια του δραστικού μεγέθους του πληθυσμού (N e ): Για να κατανοήσουμε τη γενετική παρέκκλιση, είναι αναγκαίο να εμβαθύνουμε στην κατανόηση της έννοιας 226

19 του πληθυσμού. Στην προσπάθειά μας να εξηγήσουμε την τυχαία φύση της γενετικής παρέκκλισης αναφερθήκαμε στην έννοια του πληθυσμού με ορισμένες κρυφές παραδοχές: Ταυτίσαμε την έννοια του πληθυσμού με τα ενήλικα άτομα της αναπαραγωγικής ηλικίας (μόνο αυτά συμβάλλουν με γαμέτες στη διαμόρφωση των συχνοτήτων των αλληλόμορφων της επόμενης γενιάς). Υποθέσαμε ότι τα μεγέθη του πληθυσμού παρέμειναν σταθερά από γενιά σε γενιά (κάθε γενιά στην προσομοίωση που δείξαμε είχε 30 άτομα). Υποθέσαμε ότι οι αριθμοί των ανδρών και των γυναικών είναι ίσοι στον πληθυσμό (όταν κάναμε την προσομοίωση των 10 πληθυσμών με 30 άτομα, θεωρήσαμε στην πραγματικότητα ότι συμπεριλαμβάνουν 15 άνδρες και 15 γυναίκες). Υποθέσαμε ότι η διαφορά των απογόνων κάθε ζευγαριού είναι τυχαία (δεν υπάρχουν σημαντικές διαφορές στη γονιμότητα, στο μέγεθος της οικογένειας κ.λπ.). Από δημογραφική άποψη, η έννοια του πληθυσμού συμπεριλαμβάνει όλα τα ζώντα άτομα σε μια δεδομένη στιγμή. Αναφερθήκαμε προηγουμένως στον «ελληνικό πληθυσμό» και αν προσπαθήσουμε να εμβαθύνουμε σε αυτή την αφαίρεση θα έχουμε πολλά να συζητήσουμε. Από τη σκοπιά της γενετικής παρέκκλισης μας ενδιαφέρει ο αριθμός των ενήλικων ατόμων αναπαραγωγικής ηλικίας και όχι τα άτομα που βρίσκονται πριν ή μετά από αυτή. Δεν είναι εύκολο να υπολογίσουμε το μέγεθος αυτού του πληθυσμού στους πραγματικούς ανθρώπινους πληθυσμούς και συχνά χρησιμοποιείται ένας αδρός «κανόνας» που διαιρεί το μέγεθος του πληθυσμού με βάση τα απογραφικά στοιχεία στα τρία, υποθέτοντας ίση κατανομή ανάμεσα στα άτομα προ-αναπαραγωγικής, αναπαραγωγικής και μετα-αναπαραγωγικής ηλικίας [4]. Αν και χρησιμοποιείται συχνά ως αδρός τρόπος για τη σύγκριση πληθυσμών, γνωρίζουμε πολύ καλά ότι η ηλικιακή διάρθρωση των πληθυσμών διαφέρει σημαντικά. Ο αναπαραγωγικός πληθυσμός κυμαίνεται συνήθως μεταξύ 25% και 75% του συνολικού πληθυσμού και καθορίζεται από κοινωνικούς και πολιτιστικούς παράγοντες [5]. Τα στατιστικά στοιχεία είναι ενδεικτικά για τις διαφορές στον αναπαραγωγικό πληθυσμό των ευρωπαϊκών χωρών και το μέγεθος των οικογενειών. Για παράδειγμα, μέση ηλικία απόκτησης πρώτου τέκνου για τις σύγχρονες Ελληνίδες είναι τα 29,9 έτη ενώ για τις Ρουμάνες τα 25,8 έτη, με τον μέσο όρο για τις ευρωπαϊκές χώρες να είναι 28.7 έτη. Οι γεννήσεις τρίτου παιδιού αφορούν το 9,3% των γεννήσεων στην Ελλάδα, έναντι 17,6% στην Ιρλανδία και 19,6% στην Ισλανδία, με ευρωπαϊκό μέσο όρο 11,8% [21]. Η αναλογία των δύο φύλων μεταβάλλεται στους πραγματικούς πληθυσμούς από γενιά σε γενιά. Για παράδειγμα, το 1960 σε κάθε 100 άντρες στη Γερμανία αντιστοιχούσαν 115 γυναίκες και στην Ελλάδα 104, ενώ το 2015 σε κάθε 100 άντρες στη Γερμανία αντιστοιχούσαν 104 γυναίκες και 105,7 στην Ελλάδα (στοιχεία Eurostat). Το μέγεθος του πληθυσμού μπορεί επίσης να μεταβάλλεται σημαντικά, για παράδειγμα εξαιτίας φυσικών καταστροφών, πολέμων ή άλλων κοινωνικοοικονομικών παραγόντων. Ενδεικτικά, ο παγκόσμιος πληθυσμός ήταν μόλις 2 δισ. πριν από 100 χρόνια [22] και πιθανότατα 6 εκ. πριν από χρόνια [23]. Για να ξεπεραστούν τα προβλήματα που γεννιούνται από τις παραδοχές του μοντέλου μας, επινοήθηκε η έννοια του δραστικού μεγέθους πληθυσμού (Effective population size), που συμβολίζεται με N e. Το δραστικό μέγεθος πληθυσμού είναι μια προσαρμοσμένη τιμή του μεγέθους του πληθυσμού που λαμβάνει υπόψη τους παράγοντες που προαναφέρθηκαν. Όταν τα άρρενα και τα θήλεα άτομα δεν είναι ίσα αριθμητικά (συνεπώς δεν συμβάλλουν ατομικά με ισότιμο τρόπο στον αριθμό των αλληλόμορφων της επόμενης γενιάς), το δραστικό μέγεθος 227

20 ΕΡΓΑΣΤΗΡΙΑΚΕΣ ΑΣΚΗΣΕΙΣ ΓΕΝΕΤΙΚΗΣ ΤΟΥ ΑΝΘΡΩΠΟΥ πληθυσμού δίνεται από τον τύπο: N e = 4N fn m N f + N m (11.14) όπου N f ο αριθμός των θηλέων και N m ο αριθμός των αρρένων αναπαραγωγικής ηλικίας. Επειδή κάθε φύλο συνδράμει ισοδύναμα στα αλληλόμορφα της επόμενης γενιάς, σε έναν πληθυσμό που απαρτίζεται από 5 άνδρες και 50 γυναίκες η συνεισφορά του κάθε άνδρα θα είναι 1 1 = 1 των γονιδίων της επόμενης γενιάς, ενώ κάθε γυναίκας 1 1 = 1. Σύμφωνα με την εξίσωση 11.14, στην περίπτωση αυτή το δραστικό μέγεθος του πληθυσμού είναι N e = 18, 18 αναπαραγωγικά άτομα, έναντι των 55 πριν κάνουμε τη διόρθωση. Το πρόβλημα της μεταβολής του μεγέθους των πληθυσμών στις διαδοχικές γενιές μπορεί να αντιμετωπιστεί αν χρησιμοποιούμε μία και μοναδική τιμή του μεγέθους του πληθυσμού N e που λαμβάνει υπόψη της τις διακυμάνσεις. Αντί του αριθμητικού μέσου των πληθυσμών των διαδοχικών γενιών, έχει δειχθεί ότι σε αυτές τις περιπτώσεις είναι καλύτερο να χρησιμοποιούμε τον αρμονικό μέσο (harmonic mean). Ο αρμονικός μέσος υπολογίζεται με τον ακόλουθο τύπο: N e = t (1/N) (11.15) κατά τον οποίο προσθέτουμε τις τιμές 1/N των διαδοχικών γενιών ( ), ενώ με t συμβολίζουμε τον αριθμό των γενιών. Ο υπολογισμός αυτός αντιπροσωπεύει το μακροχρόνιο δραστικό μέγεθος του πληθυσμού (Long-term effective population size), που σε πολλές μελέτες αναφέρεται απλώς ως δραστικό μέγεθος του πληθυσμού. Στις περιπτώσεις αυτές δεν πρέπει να τον συγχέουμε με το τρέχον δραστικό μέγεθος του πληθυσμού. Οι μεταβολές του μεγέθους του πληθυσμού κάνουν αισθητή τη γενετική παρέκκλιση με δύο τρόπους, που περιγράφονται στα συγγράμματα της θεωρίας ως: το φαινόμενο της στενωπού, κατά το οποίο η γενετική παρέκκλιση συντελείται μετά από μια δραστική μείωση του μεγέθους του πληθυσμού και οδηγεί σε απώλεια ορισμένων αλληλόμορφων, με αποτέλεσμα ο πληθυσμός των επιζώντων να έχει διαφορετική γενετική σύσταση από τον αρχικό και η αρχή του ιδρυτή, κατά την οποία καινούριοι πληθυσμοί προκύπτουν από μικρό αριθμό ατόμων που προέρχονται από έναν αρχικό πληθυσμό. Τα ολιγάριθμα αυτά άτομα (ιδρυτές), που έχουν συνήθως σε κάποιο βαθμό επιλεγεί τυχαία, δημιουργούν νέους πληθυσμούς, των οποίων η γενετική σύσταση διαφέρει από τον αρχικό. Επιπτώσεις της γενετικής παρέκκλισης στη γενετική ποικιλότητα: Η γενετική ποικιλότητα ενός πληθυσμού δείχνει τη δυναμική της εξελικτικής αλλαγής και της δυνατότητας προσαρμογής του. Προσφέρει επίσης σημαντικά στοιχεία για την εξελικτική ιστορία του πληθυσμού, καθώς ορισμένοι εξελικτικοί παράγοντες οδηγούν στην αύξησή της ενώ άλλοι σε μείωση. Υπάρχουν διάφοροι τρόποι εκτίμησης της γενετικής ποικιλότητας. Δύο από τους απλούστερους δείκτες είναι το ποσοστό των πολυμορφικών γενετικών τόπων και η ετεροζυγωτία. Το ποσοστό των πολυμορφικών γενετικών τόπων (P ) υπολογίζεται αν διαιρέσουμε τον αριθμό των πολυμορφικών τόπων που βρήκαμε (x) με το σύνολο των γενετικών τόπων που εξετάσαμε (m): P = x m To ποσοστό των πολυμορφικών γενετικών τόπων μάς δίνει μια εικόνα της ποικιλότητας σε επίπεδο γενετικών τόπων ενός πληθυσμού, αλλά η ποικιλότητα εξαρτάται και από τη συχνότητα των 228

21 αλληλόμορφων στον πληθυσμό. Έτσι, ένα δεύτερο χρήσιμο μέτρο της γενετικής ποικιλότητας ενός πληθυσμού είναι η ετεροζυγωτία (H), που είναι απλούστατα η συχνότητα των ετεροζυγωτών στον πληθυσμό. Εξετάζοντας την ισορροπία H-W σε έναν γενετικό τόπο με δύο αλληλόμορφα, δείξαμε ότι ο αναμενόμενος αριθμός των ετεροζυγωτών ήταν ίσος με: H = 2pq και η μεγαλύτερη τιμή που μπορεί να πάρει η H στην περίπτωση δύο αλληλόμορφων είναι H = 0, 5 όταν p = q = 0, 5. Για γενετικούς τόπους με περισσότερα από ένα αλληλόμορφα, η ετεροζυγωτία μπορεί να υπολογιστεί αφαιρώντας τη συχνότητα του συνόλου των ομοζυγωτών από το 1: H = 1 p 2 i Η μέγιστη ετεροζυγωτία αυξάνεται καθώς αυξάνεται ο αριθμός των αλληλόμορφων, και προσεγγίζει τη μέγιστη τιμή H = 1 όταν ο αριθμός των αλληλόμορφων γίνεται άπειρος. Όπως εξηγήσαμε νωρίτερα, σε κάθε πεπερασμένο πληθυσμό η τυχαία διακύμανση των συχνοτήτων των αλληλόμορφων θα οδηγήσει τελικά είτε σε εγκαθίδρυση είτε σε απώλειά τους. Ο βασικός κανόνας είναι ότι όσο μικρότερος είναι ένας πληθυσμός τόσο μεγαλύτερη είναι η αναμενόμενη διακύμανση. Ο μέσος χρόνος εγκαθίδρυσης (average time to fixation) έχει υπολογιστεί σε: t = 4N e (11.16) όπου t είναι ο αριθμός των γενιών και N e το δραστικό μέγεθος του πληθυσμού. Η γενετική παρέκκλιση λειτουργεί προς την κατεύθυνση μείωσης της ποικιλότητας μέσω της εγκαθίδρυσης ή της απώλειας αλληλόμορφων. Και οι δύο εκβάσεις οδηγούν σε απώλεια της ετεροζυγωτίας στον πληθυσμό. Έχει υπολογιστεί ότι η αναμενόμενη μείωση της ετεροζυγωτίας σε έναν πληθυσμό μετά από t γενιές δίνεται από την εξίσωση: όπου H 0 είναι η αρχική ετεροζυγωτία στη γενιά t = 0. Η εξίσωση δείχνει ότι: H 1 = H 0 (1 1 2N )t (11.17) Η ετεροζυγωτία φθίνει όσο αυξάνουν οι γενιές (όσο αυξάνει η τιμή t). Όσο μικρότερο είναι το μέγεθος του πληθυσμού τόσο μεγαλύτερη είναι η μείωση της ετεροζυγωτίας από τη μια γενιά στην άλλη. Μετάλλαξη και γενετική παρέκκλιση: Οι μεταλλάξεις είναι σχετικά σπάνια γεγονότα όταν εξετάζονται από τη σκοπιά ενός ατόμου σε μια γενιά, αλλά στο επίπεδο του πληθυσμού η γενετική ποικιλότητα που εισάγουν εξαρτάται από το μέγεθός του. Αν θεωρήσουμε έναν πληθυσμό Ν ατόμων που φέρει μόνο ένα αλληλόμορφο Α στον γενετικό τόπο που εξετάζουμε, τότε η συχνότητα του αλληλόμορφου Α, η p A, θα είναι ίση με 1 (p A = 2N/2N = 1). Υποθέτουμε ότι συμβαίνει μια μετάλλαξη σε ένα αλληλόμορφο Α ενός ατόμου του πληθυσμού και δημιουργείται το νέο αλληλόμορφο α. Η συχνότητα του αλληλόμορφου α θα είναι q = 1/2N, δηλαδή πολύ μικρότερη από αυτή του Α. Το πιθανότερο είναι ότι το νέο αλληλόμορφο α θα χαθεί από τον πληθυσμό, αν η γενετική παρέκκλιση λειτουργεί μόνη χωρίς τη συνεπικουρία άλλων εξελικτικών δυνάμεων, όπως η επιλογή. Ωστόσο, σε κάποιους πληθυσμούς, από τύχη και μόνο, θα καταλήξει να εγκαθιδρυθεί. Αν ο πληθυσμός του παραδείγματος έχει 100 άτομα, τότε το αλληλόμορφο α Θα έχει συχνότητα q = 1/200 = 0, 005. Αναμένουμε λοιπόν να εξαφανιστεί στο 99,5 των περιπτώσεων, όμως στο 0,5 τελικά θα εγκαθιδρυθεί. 229

22 ΕΡΓΑΣΤΗΡΙΑΚΕΣ ΑΣΚΗΣΕΙΣ ΓΕΝΕΤΙΚΗΣ ΤΟΥ ΑΝΘΡΩΠΟΥ Η μετάλλαξη και η γενετική παρέκκλιση λειτουργούν σαν δύο αντιτιθέμενες δυνάμεις. Η μια προσθέτει νέα αλληλόμορφα στον πληθυσμό, αυξάνοντας τη γενετική ποικιλότητα, ενώ η άλλη τα αφαιρεί. Αφαιρετικά μπορούμε να θεωρήσουμε κάποιο σημείο ισορροπίας στο οποίο η επίδραση των δύο δυνάμεων εξισώνεται. Ένα τέτοιο απλό μοντέλο, που προϋποθέτει ότι κάθε καινούρια μετάλλαξη δημιουργεί με ρυθμό μ ένα νέο αλληλόμορφο που δεν υπάρχει ήδη στον πληθυσμό, είναι γνωστό με το όνομα μοντέλο των άπειρων αλληλόμορφων (Infinite alleles model). Σύμφωνα με αυτό, η μέγιστη ετεροζυγωτία είναι H = 1 και στην κατάσταση ισορροπίας μεταξύ μετάλλαξης και γενετικής παρέκκλισης η ετεροζυγωτία του γενετικού τόπου δίνεται από την εξίσωση: H = 4N eµ 4N e µ + 1 (11.18) Όταν το 4N e µ είναι κοντά στο 0, τότε η αναμενόμενη ετεροζυγωτία στο σημείο ισορροπίας θα είναι πολύ κοντά στο 0. Σε τιμές 4N e µ > 5 η ετεροζυγωτία είναι υψηλή και η επίδραση της γενετικής παρέκκλισης ασθενής. Σε τιμές 4N e µ κοντά ή ίσες με 1 δίνουν την αναμενόμενη ισορροπία μεταξύ γενετικής παρέκκλισης και μετάλλαξης. Το μοντέλο των άπειρων αλληλόμορφων και η ισορροπία ανάμεσα σε μετάλλαξη και γενετική παρέκκλιση είναι βασικές αρχές που χρησιμοποιούνται από την ουδέτερη θεωρία της εξέλιξης, που ερμηνεύει πολλές από τις αλλαγές στις γονιδιακές συχνότητες με τη γενετική παρέκκλιση που επιδρά σε ουδέτερες μεταλλάξεις (μεταλλάξεις που δεν υφίστανται επιλογή) [4]. Γονιδιακή ροή Οι ανθρώπινοι πληθυσμοί σε όλη τη διάρκεια της ιστορίας του είδους ερχόντουσαν σε επαφή μεταξύ τους και σε πολλές περιπτώσεις αναπτύσσονταν μεταναστευτικές ροές. Οι ροές αυτές, εκτός από πολιτικές, κοινωνικές, δημογραφικές και οικολογικές επιπτώσεις, έχουν και γενετικές, μέσω της μεταφοράς γενετικού υλικού από τη μια πληθυσμιακή ομάδα στην άλλη. Σε αντιδιαστολή με την επιλογή και τη γενετική παρέκκλιση, η γονιδιακή ροή, όπως ακριβώς και η μετάλλαξη, έχει τη δυνατότητα να εισαγάγει σε έναν πληθυσμό νέα αλληλόμορφα. Ένα άλλο αποτέλεσμα της γονιδιακής ροής είναι ότι τείνει να ελαττώνει τις γενετικές διαφορές ανάμεσα στους πληθυσμούς. Μπορούμε να εμβαθύνουμε στη σημασία της γονιδιακής ροής χρησιμοποιώντας ένα υπεραπλουστευμένο μοντέλο που πολλές φορές αναφέρεται ως μοντέλο της νήσου (Island model), σύμφωνα με το οποίο υποθέτουμε ότι υπάρχει μετανάστευση μόνο προς μία κατεύθυνση, για παράδειγμα από έναν ηπειρωτικό πληθυσμό προς ένα νησί του οποίου ο πληθυσμός είναι αρκετά μεγάλος, ώστε να θεωρήσουμε ότι δεν επηρεάζεται ιδιαίτερα από τη γενετική παρέκκλιση. Συμβολίζουμε με m τον μεταναστευτικό ρυθμό, που αποτελεί το ποσοστό των αλληλόμορφων του νησιωτικού πληθυσμού που προέρχεται από την ηπειρωτική χώρα σε κάθε γενιά (εικόνα 11.5), με p 0 την αρχική συχνότητα ενός αλληλόμορφου στη γενιά 0 στον νησιωτικό πληθυσμό και P τη συχνότητα του αλληλόμορφου στον ηπειρωτικό (εικόνα 11.5) [17]. Η συχνότητα του αλληλόμορφου στην επόμενη γενιά του νησιωτικού πληθυσμού θα δίνεται από την εξίσωση: p 1 = (1 m)p 0 + mp Aν υποθέσουμε ότι η ροή αυτή παραμένει σταθερή (m), και εφόσον η συχνότητα P παραμένει σταθερή στον ηπειρωτικό πληθυσμό, μπορούμε να υπολογίσουμε τη συχνότητα του αλληλόμορφου στις επόμενες γενιές χρησιμοποιώντας την εξίσωση: p t = (1 m) t (p o P ) + P 230

23 Εικόνα 11.5 Μεταναστευτική ροή προς μία κατεύθυνση με ρυθμό m (ποσοστό των αλληλόμορφων στον τελικό πληθυσμό που προέρχονται από τον αρχικό). Μετά τη μετανάστευση η νέα συχνότητα στον πληθυσμό υποδοχής θα είναι p 1 = (1 m)p 0 + mp. όπου p t η συχνότητα του αλληλόμορφου στη γενιά t. Η μεταβολή της συχνότητας του αλληλόμορφου p ισούται με τη διαφορά της νέας συχνότητας του αλληλόμορφου από την αρχική: p = p 1 p 0 = (1 m)p 0 + mp p 0 =... = m(p p 0 ) Συνεπώς, ο ρυθμός μεταβολής της συχνότητας λόγω γονιδιακής ροής εξαρτάται από δύο παράγοντες: το ποσοστό των μεταναστών στον τελικό πληθυσμό (την αναλογία των αλληλόμορφων m), τη διαφορά μεταξύ της συχνότητας του αλληλόμορφου στους μετανάστες (P ) και στον αρχικό πληθυσμό (p 0 ). Από την εξίσωση μπορούμε να διαπιστώσουμε ότι όσο συνεχίζεται η ροή και μειώνεται η διαφορά των συχνοτήτων ανάμεσα στους πληθυσμούς τόσο ο ρυθμός μεταβολής της συχνότητας φθίνει (εικόνα 11.5). Ένα δεύτερο απλό μοντέλο μελέτης της γονιδιακής ροής είναι να θεωρήσουμε δύο πληθυσμούς Α και B που ανταλλάσσουν μεταξύ τους αλληλόμορφα με τον ίδιο ρυθμό γονιδιακής ροής (m) (εικόνα 11.6) [17]. Στην περίπτωση αυτή η συχνότητα του αλληλόμορφου στην επόμενη γενιά (P At+1) για τον πληθυσμό θα δίνεται, όπως και στο προηγούμενο παράδειγμα, από την εξίσωση: και αντίστοιχα στον πληθυσμό B: P At+1 = (1 m)p At + mp Bt P Bt+1 = (1 m)p Bt + mp At Oι συχνότητες των αλληλόμορφων και στους δύο πληθυσμούς τείνουν να εξισωθούν με ταχύτητα που εξαρτάται από τον ρυθμό ροής m και τις διαφορές των συχνοτήτων μεταξύ τους. 231

24 ΕΡΓΑΣΤΗΡΙΑΚΕΣ ΑΣΚΗΣΕΙΣ ΓΕΝΕΤΙΚΗΣ ΤΟΥ ΑΝΘΡΩΠΟΥ Εικόνα 11.6 Μεταναστευτική ροή μεταξύ δύο πληθυσμών. Σύμφωνα με το μοντέλο της εικόνας, οι πληθυσμοί Α και Β ανταλλάσσουν μεταξύ τους μετανάστες με τον ίδιο ρυθμό. Εκτίμηση της γενετικής απόκλισης μεταξύ πληθυσμών Εξηγήσαμε την ετεροζυγωτία (H) ως δείκτη της γενετικής ποικιλότητας σε έναν πληθυσμό. Προκειμένου να εκτιμήσουμε την ποικιλότητα σε διαφορετικούς πληθυσμούς και να τους συγκρίνουμε μεταξύ τους ως προς τη γενετική τους διαφοροποίηση, χρησιμοποιούμε τον δείκτη εγκαθίδρυσης (Fixation index), F ST. Αν θεωρήσουμε έναν πληθυσμό ο οποίος αποτελείται από περισσότερους διακριτούς υποπληθυσμούς, όπως φαίνεται στην εικόνα 11.7 (ο πληθυσμός αυτός λέμε ότι εμφανίζει ιεραρχική δομή), τότε μπορούμε να εξετάσουμε τη γενετική ποικιλότητα σε τρία επίπεδα: Στον συνολικό πληθυσμό. Ένα τέτοιο μέτρο είναι να εξετάσουμε την ετεροζυγωτία στο πλαίσιο του συνολικού πληθυσμού (H T ) βασισμένοι στις συχνότητες των αλληλόμορφων που υπολογίζουμε στο σύνολο του πληθυσμού. Σε κάθε υποπληθυσμό ξεχωριστά. Στην περίπτωση αυτή εξετάζουμε την ετεροζυγωτία στο πλαίσιο του υποπληθυσμού (H S ) που εκφράζει και την ενδοπληθυσμιακή ποικιλότητα. Ανάμεσα στους υποπληθυσμούς. Μπορούμε να χρησιμοποιήσουμε ως μέτρο την μέση ετεροζυγωτία, αθροίζοντας τις ετεροζυγωτίες που παρατηρούνται στους υποπληθυσμούς που εξετάζουμε και διαιρώντας με τον αριθμό των πληθυσμών ( H S ). H συνολική ποικιλότητα οφείλεται στην ποικιλότητα που παρατηρείται εξαιτίας της γενετικής διαφοροποίησης των πληθυσμών (διαπληθυσμιακή ποικιλότητα, δηλαδή ανάμεσα στους υποπληθυσμούς) και της ποικιλότητας που οφείλεται στις διαφορές των ατόμων στο εσωτερικό των υποπληθυσμών (ενδοπληθυσμιακή ποικιλότητα). Προκειμένου να εκτιμήσουμε το ποσοστό της ποικιλότητας που οφείλεται στις διαφορές μεταξύ των πληθυσμών, χρησιμοποιούμε τον δείκτη εγκαθίδρυσης (F ST ), που είναι ο λόγος της ποικιλότητας ανάμεσα στους υποπληθυσμούς (διαπληθυσμιακή ποικιλότητα) προς τη συνολική ποικιλότητα: F ST = (διαπληθυσμιακή ποικιλότητα) (συνολική ποικιλότητα) (11.19) Χρησιμοποιώντας την ετεροζυγωτία ως μέτρο της ποικιλότητας, μπορούμε να εκφράσουμε τον λόγο (11.19) ως εξής: F ST = H T H S H T (11.20) 232

25 Εικόνα 11.7 Πληθυσμιακή διαστρωμάτωση. Ένας πληθυσμός (Τ) αποτελείται από γενετικά διακριτούς υποπληθυσμούς S1, S2 και S3. Για παράδειγμα, ο ευρωπαϊκός πληθυσμός αποτελείται από διάφορους υποπληθυσμούς (Έλληνες, Βρετανούς, Πολωνούς, Γερμανούς, Ιταλούς κ.λπ.) Αν κοιτάξουμε λίγο πιο προσεκτικά την εξίσωση (11.20), παρατηρούμε ότι όταν δεν υπάρχει καθόλου ποικιλότητα στους υποπληθυσμούς (όλα τα άτομα των υποπληθυσμών είναι ομόζυγα για τον γενετικό τόπο που εξετάζουμε, αλλά διαφορετικά αλληλόμορφα είναι εγκαθιδρυμένα στους πληθυσμούς), τότε το σύνολο της ποικιλότητας που διαπιστώνουμε οφείλεται στη γενετική διαφοροποίηση ανάμεσα στους υποπληθυσμούς (F ST = 1). Οι πληθυσμοί μπορούν τότε να θεωρηθούν γενετικά απομονωμένοι μεταξύ τους. Οι τιμές του F ST που έχουν υπολογιστεί για τους ανθρώπινους πληθυσμούς κυμαίνονται μεταξύ 0,05 και 0,1 (5-10%), γεγονός που υποδεικνύει ότι μόλις 5-10% της συνολικής γενετικής διαφοροποίησης οφείλεται στη γενετική διαφοροποίηση μεταξύ πληθυσμιακών ομάδων, ενώ το υπόλοιπο 90-95% αποδίδεται στην ποικιλότητα που παρατηρείται στο εσωτερικό τους [20]. Σύμφωνα με άλλους υπολογισμούς, η μέση τιμή του F ST για έναν μεγάλο αριθμό πολυμορφισμών είναι 0,139 [19]. Όταν F ST = 0 τότε ο πληθυσμός είναι παμμικτικός, υπάρχει δηλαδή τυχαία διασταύρωση ανάμεσα στα άτομα του συνολικού πληθυσμού T και δεν προκύπτει γενετική διαφοροποίηση ανάμεσα στους υποπληθυσμούς S 1, S 2 και S 3. Τιμές F ST μέχρι 0,05 δείχνουν αμελητέα γενετική διαφοροποίηση, ενώ τιμές F ST > 0, 25 πολύ μεγάλη γενετική διαφοροποίηση. Υπολογισμένες τιμές F ST δείχνουν μικρότερη διαφοροποίηση ανάμεσα στους πληθυσμούς που κατοικούν στην ίδια ήπειρο σε σχέση με πληθυσμούς που βρίσκονται σε διαφορετικές, εύρημα που συνάδει με τη σχετική απομόνωσή τους εξαιτίας της απόστασης. Ισορροπία μεταξύ γενετικής παρέκκλισης και γονιδιακής ροής: Εξετάζοντας τη σχέση μεταξύ γενετικής παρέκκλισης και μετάλλαξης, επισημάναμε ότι η μια προσθέτει νέα αλληλόμορφα στον πληθυσμό, αυξάνοντας τη γενετική ποικιλότητα, ενώ η άλλη τα αφαιρεί, μειώνοντας την ενδοπληθυσμιακή ποικιλότητα. Στην περίπτωση της γονιδιακής ροής μάς ενδιαφέρει να εξετάσουμε τη γενετική διαφοροποίηση ανάμεσα στους διαφορετικούς πληθυσμούς (και όχι ανάμεσα στα άτομα που ανήκουν στον ίδιο πληθυσμό), δηλαδή να συγκρίνουμε τη γενετική ποικιλότητα ανάμεσα σε πληθυσμούς. Αν δύο πληθυσμοί έχουν τις ίδιες συχνότητες αλληλόμορφων A και α σε έναν γενετικό τόπο (π.χ. p = 0, 8 και q = 0, 2), τότε δεν έχουν καμία διαφορά μεταξύ τους. Ωστόσο, τα άτομα που απαρτίζουν τον κάθε πληθυσμό έχουν διαφορές μεταξύ τους, φέροντας έναν από τους τρεις διαφορετικούς γονότυπους AA, Aα και αα. 233

26 ΕΡΓΑΣΤΗΡΙΑΚΕΣ ΑΣΚΗΣΕΙΣ ΓΕΝΕΤΙΚΗΣ ΤΟΥ ΑΝΘΡΩΠΟΥ Η γενετική παρέκκλιση αυξάνει τη γενετική διαφοροποίηση ανάμεσα στους πληθυσμούς, επειδή οδηγεί στη μείωση της ετεροζυγωτίας με την πάροδο των γενιών και την εγκαθίδρυση ή την απώλεια αλληλόμορφων. Αντίθετα, η γονιδιακή ροή έχει την τάση να μειώσει τη γενετική διαφοροποίηση δύο πληθυσμών, δρώντας προς την αντίθετη κατεύθυνση. Όπως και στην περίπτωση της σχέσης μεταξύ μετάλλαξης και γενετικής παρέκκλισης, έτσι και στη σχέση μεταξύ γονιδιακής ροής και γενετικής παρέκκλισης μπορούμε να θεωρήσουμε ένα σημείο ισορροπίας κατά το οποίο η διαφοροποίηση που δημιουργείται ανάμεσα στις πληθυσμιακές ομάδες από τη γενετική παρέκκλιση εξισορροπείται από τη γονιδιακή ροή. Υιοθετώντας ένα μοντέλο σύμφωνα με το οποίο η μετανάστευση είναι σχετικά σπάνια, και όλοι οι πληθυσμοί ενός είδους έχουν την ίδια πιθανότητα να ανταλλάξουν μεταξύ τους μετανάστες, ο Wright [24] έδειξε ότι η τιμή του F ST στο σημείο ισορροπίας δίνεται από την εξίσωση: F ST 1 4N e m + 1 (11.21) όπου N e είναι το δραστικό μέγεθος του πληθυσμού και m το ποσοστό των αλληλόμορφων των μεταναστών. Εξετάζοντας την εξίσωση, διαπιστώνουμε ότι ένα σχετικά μεγάλο μέγεθος πληθυσμού που εμποδίζει μεγάλες μεταβολές στη συχνότητα των αλληλόμορφων σε συνδυασμό με ένα μικρό ποσοστό μεταναστών ανά γενιά αρκεί για να διατηρήσει τους πληθυσμούς γενετικά παρόμοιους. Ένα άλλο σημαντικό σημείο της εξίσωσης είναι ότι το γινόμενο N e m (μέγεθος πληθυσμού ποσοστό αλληλόμορφων που προέρχονται από τους μετανάστες) είναι ο αριθμός των μεταναστών M. Δυστυχώς, η εξίσωση αυτή δεν είναι ιδιαίτερα χρήσιμη στην πράξη, όταν θελήσουμε να τη χρησιμοποιήσουμε για τον υπολογισμό της μεταναστευτικής ροής ανάμεσα σε πληθυσμούς, διότι στην πραγματική ζωή οι πληθυσμοί δεν ανταλλάσσουν μεταξύ τους μετανάστες με τον ίδιο ρυθμό. Φυσική επιλογή Η έννοια της φυσικής επιλογής είναι βαθύτατα κακοποιημένη από πλήθος δημοσιολόγων που δεν έχουν μελετήσει ποτέ τη θεωρία της εξέλιξης. Πολλοί την ταυτίζουν συνειρμικά με την επιβίωση και την ισχύ, δίνοντάς της φιλοσοφικές και ιδεολογικές προεκτάσεις με αντιεπιστημονικό περιεχόμενο. Στο πλαίσιο της εξέλιξης αυτό που έχει σημασία δεν είναι η επιβίωση ενός ατόμου, αλλά η επιβίωση των γονιδίων του στον πληθυσμό, δηλαδή, η ικανότητά του να επιβιώσει μέχρι την αναπαραγωγική ηλικία και να αναπαραχθεί ώστε να συμβάλει στη γενετική σύνθεση της επόμενης γενιάς. Σύμφωνα με έναν ορισμό, φυσική επιλογή είναι απλώς «η διαφορική μεταβολή στη σχετική συχνότητα γονότυπων, λόγω διαφορών στην ικανότητα των φαινότυπων να εκπροσωπηθούν στην επόμενη γενιά» [18]. Η φυσική επιλογή μπορεί απλούστερα να κατανοηθεί ως η διαφορική αναπαραγωγή γονότυπων. Σε αντιδιαστολή με τις άλλες εξελικτικές δυνάμεις που τροποποιούν τις συχνότητες των αλληλόμορφων, η φυσική επιλογή σχετίζεται με την προσαρμογή των ατόμων και των πληθυσμών στο περιβάλλον στο οποίο ζουν. Για τον λόγο αυτό είναι ο παράγοντας που κυρίως ευθύνεται για την πορεία της εξέλιξης. Για να μελετήσουμε τη διαφορική αναπαραγωγή των γονότυπων χρειάζεται να εισαγάγουμε την έννοια της αρμοστικότητας (Fitness), που αντιπροσωπεύει την πιθανότητα επιβίωσης και αναπαραγωγής. Αν χρησιμοποιήσουμε το παράδειγμα των δύο αλληλόμορφων A και α σε έναν γενετικό τόπο, θα έχουμε τρεις πιθανούς γονότυπους AA, Aα και αα. Ας υποθέσουμε ότι παρακολουθήσαμε έναν πληθυσμό ατόμων με κατανομή γονότυπων AA = 250 άτομα, Aα = 500 και αα = 250 άτομα. Στον πίνακα 11.2 σημειώνονται τα ευρήματά μας, εξετάζοντας τον πληθυσμό κατά την αναπαραγωγική του ηλικία, διαπιστώνοντας τον αριθμό των ατόμων ανά γονότυπο που επιβίωσαν και συμβάλλουν με τους γαμέτες τους στη γενετική σύνθεση της επόμενης γενιάς. Η απόλυτη αρμοστικότητα (Absolute fitness) (W ) υπολογίζεται στην τελευταία γραμμή του πίνακα 11.5 και μας δείχνει 234

27 την ποσοστιαία αλλαγή για τον κάθε ξεχωριστό γονότυπο. Με τον τρόπο αυτό μπορούμε εύκολα να διαπιστώσουμε ότι η επιβίωση των ατόμων διαφορετικών γονότυπων δεν είναι η ίδια και ότι περισσότερα άτομα που έφεραν τον γονότυπο αα πέθαναν πριν την αναπαραγωγική ηλικία (W αα = 0, 6), ενώ την καλύτερη αρμοστικότητα είχε ο γονότυπος W AA με W AA = 0, 9 > W Aα = 0, 8 > W αα = 0, 6. Παρατηρήστε ότι στο παράδειγμα, για λόγους απλούστευσης, δεν λάβαμε υπόψη τυχόν διαφορές στη γονιμότητα των γονότυπων, αλλά μόνο στη θνησιμότητα. AA Aα αα Κατά τη γέννηση Κατά την ενηλικίωση W W AA = = 0, 9 W Aα = = 0, 8 W αα = = 0, 6 Πίνακας 11.5 Αριθμός ατόμων κατά τη γέννηση και την ενηλικίωση και υπολογισμός της απόλυτης αρμοστικότητας (W ). Από μαθηματική άπόψη διευκολύνει η χρησιμοποίηση της σχετικής αρμοστικότητας (Relative fitness) (w), που εκφράζει την αρμοστικότητα σε σχέση με τον πιο προσαρμοσμένο γονότυπο. Στην περίπτωση του παραδείγματος του πίνακα 11.5 ο γονότυπος αυτός είναι ο AA με W AA = 0, 9 στον οποίο δίνουμε την τιμή σχετικής αρμοστικότητας w AA = 1. Οι τιμές σχετικής αρμοστικότητας υπολογίζονται διαιρώντας την τιμή της απόλυτης αρμοστικότητας κάθε γονότυπου με αυτή του περισσότερο προσαρμοσμένου, W AA = 0, 9, όπως φαίνεται στον πίνακα AA Aα αα w AA = 0,9 0,9 = 1 w Aα = 0,8 0,9 = 0, 88 w αα = 0,6 0,9 = 0, 66 Πίνακας 11.6 Yπολογισμός της σχετικής αρμοστικότητας (w). Ο συντελεστής επιλογής (Selection coefficient) (s) είναι το αντίθετο της αρμοστικότητας (w) και εκφράζει την πιθανότητα της μη επιβίωσης και αναπαραγωγής. Δίνεται από τη σχέση: w + s = 1 ή: s = 1 w (11.22) Μπορούμε να υπολογίσουμε τις επιπτώσεις της επιλογής στις συχνότητες των αλληλόμορφων ακολουθώντας τέσσερα βήματα, που συνοψίζονται στον πίνακα 11.7: 1. Προσδιορίζουμε τις αναμενόμενες από την ισορροπία H-W αρχικές συχνότητες των γονότυπων (συχνότητες πριν την επιλογή). 2. Υπολογίζουμε την αλλαγή στις συχνότητες των γονότυπων εξαιτίας της επιλογής. Ο υπολογισμός, εφόσον γνωρίζουμε την αρμοστικότητα, είναι απλώς το γινόμενο της συχνότητας με την αρμοστικότητα, (w) p 2 w AA ή αλλιώς p 2 (1 s). Το άθροισμα των νέων συχνοτήτων των γονότυπων που προκύπτουν αποτελεί τη μέση αρμοστικότητα (Mean fitness) ( w): w = p 2 w AA + q 2 w αα + 2pqw Aα 235

28 ΕΡΓΑΣΤΗΡΙΑΚΕΣ ΑΣΚΗΣΕΙΣ ΓΕΝΕΤΙΚΗΣ ΤΟΥ ΑΝΘΡΩΠΟΥ Η μέση αρμοστικότητα ΔΕΝ εκφράζει μέσο όρο των σχετικών αρμοστικοτήτων, αλλά το σταθμισμένο ως προς τη συχνότητα άθροισμα των τιμών της σχετικής αρμοστικότητας για κάθε γονότυπο. Η μέση αρμοστικότητα ποσοτικοποιεί την επιλογή που έχει συμβεί σε σχέση με την περίπτωση κατά την οποία δεν υπάρχει επιλογή (ισορροπία H-W), όπου η μέση αρμοστικότητα είναι w = 1. Αν η μέση αρμοστικότητα είναι w = 0, 9 αυτό σημαίνει ότι το 90% του πληθυσμού επιβιώνει και το 10% δεν επιβιώνει. 3. Υπολογίζουμε τις σχετικές συχνότητες των γονότυπων. Επειδή οι συχνότητες των γονότυπων μετά την επιλογή δεν έχουν άθροισμα 1, αλλά την τιμή της μέσης αρμοστικότητας w, πρέπει να κανονικοποιήσουμε τις συχνότητες διαιρώντας τη συχνότητα κάθε γονοτύπου με τη μέση αρμοστικότητα: p = p2 w AA w Μετά από αυτή τη διαδικασία οι σχετικές συχνότητες των γονότυπων θα έχουν και πάλι άθροισμα 1. AA Aα αα 1 Συχνότητες πριν την επιλογή p 2 2pq q 2 Αρμοστικότητα w AA w Aα w αα 2 Συχνότητες γονότυπων μετά την επιλογή p 2 w AA 2pqw Aα q 2 w αα p 2 w AA w 3 Σχετικές συχνότητες γονότυπων μετά την επιλογή 4 Συχνότητες αλληλόμορφων μετά την επιλογή p = p(pw AA+qw Aα ) 2pqw Aα w q 2 w αα w w 2p q q = q(pwαα+pw Aα) w Μεταβολή της συχνότητας λόγω επιλογής p = p p q = q q Πίνακας 11.7 Yπολογισμός της μεταβολής των συχνοτήτων των αλληλόμορφων μετά την επιλογή. 4. Υπολογίζουμε τις νέες συχνότητες των αλληλόμορφων. Χρησιμοποιώντας τις σχετικές συχνότητες των γονότυπων μετά την επιλογή υπολογίζουμε τις νέες συχνότητες των αλληλόμορφων χρησιμοποιώντας την εξίσωση: p = f AA + f Aa 2 αντικαθιστώντας τις συχνότητες με τους υπολογισμούς του πίνακα: p = p2 w AA w + 2pqw Aα 2 w = p2 w AA + pqw Aα w = p(pw AA + qw Aα ) w Η μεταβολή της συχνότητας ανά γενιά ( p) είναι: p = p p και αντικαθιστώντας τις αντίστοιχες συχνότητες: p = pq[p(w AA w Aα ) + q(w Aα + w αα )] w 236

29 Αν η συχνότητα του αλληλόμορφου αυξάνει, το πρόσημο της μεταβολής είναι θετικό, ενώ αν μειώνεται αρνητικό. Αν η συχνότητα του ενός αλληλόμορφου αυξάνει, υποχρεωτικά αντίστοιχη μείωση θα παρουσιάσει η συχνότητα του δεύτερου αλληλόμορφου. Με αντίστοιχο τρόπο μπορούμε να υπολογίσουμε και τη συχνότητα q του αλληλόμορφου α. Στην περίπτωση δύο αλληλόμορφων p + q = 1 άρα q = 1 p Τύποι επιλογής: Η επιλογή δρα πάντοτε στους φαινότυπους. Στον βαθμό που οι φαινότυποι εξαρτώνται από τη γενετική ποικιλομορφία, η επιλογή τελικά οδηγεί σε μεταβολές των συχνοτήτων των αλληλόμορφων που συνδέονται με αυτούς. Στο παράδειγμα των δύο αλληλόμορφων Α και α, οι τρεις εναλλακτικοί γονότυποι μπορούν να εμφανίσουν διαφορετικούς τρόπους αλληλεπίδρασης με το περιβάλλον, οδηγώντας στα παρακάτω μοντέλα επιλογής: 1. Επιλογή ενάντια σε ένα υποτελές αλληλόμορφο. Στην περίπτωση αυτή ισχύει w AA = w Aα = 1 και w αα < 1 (w αα = 1 s) δηλαδή οι ομόζυγοι για το αλληλόμορφο α έχουν μικρότερη αρμοστικότητα από τους άλλους γονότυπους. Στην περίπτωση αυτή η μέση αρμοστικότητα είναι: w = p 2 w AA + q 2 w αα + 2pqw Aα = p 2 (1) + q 2 (1 s) + 2pq(1) που απλοποιείται τελικά σε: w = 1 sq 2 Η νέα συχνότητα (q ) του αλληλόμορφου α μετά την επιλογή είναι: που απλοποιείται τελικά σε: q = q(pw Aα + qw αα ) w = q = q sq2 1 sq 2 q[p(1) + q(1 s)] w Η μεταβολή ( q) της συχνότητας του αλληλόμορφου α μετά την επιλογή δίνεται από την εξίσωση: q = spq2 1 sq 2 (11.23) Το αρνητικό πρόσημο της q υποδεικνύει ότι η συχνότητα του αλληλόμορφου α θα φθίνει εξαιτίας της επιλογής. Το σημείο ισορροπίας όπου q = 0 θα επιτευχθεί όταν η συχνότητα q μηδενιστεί. Καθώς η τιμή του q θα φθίνει, θα ελαττώνεται και ο ρυθμός μεταβολής και από μαθηματικής απόψεως το αλληλόμορφο δεν θα εξαλειφθεί ποτέ. Στην πραγματικότητα, ωστόσο, τελικά το αλληλόμορφο θα εξαλειφθεί. Όσο αυξάνει η τιμή του συντελεστή επιλογής (s) τόσο συντομότερα θα συμβεί αυτό. Ακόμα και αν όλοι οι ομοζυγώτες αα πέθαιναν πριν την αναπαραγωγική ηλικία, θα χρειαστεί κάποιος χρόνος για να εξαφανιστεί το αλληλόμορφο α από τον πληθυσμό εξαιτίας των ετεροζυγωτών φορέων. 2. Επιλογή ενάντια σε ένα επικρατές αλληλόμορφο. Στην περίπτωση αυτή ισχύει w AA = w Aα = 1 s (στο μοντέλο υποθέτουμε ότι ο ομόζυγος και ο ετερόζυγος γονότυπος επιλέγονται εξίσου, με τον ίδιο συντελεστή s για λόγους απλοποίησης) και w αα = 1, δηλαδή οι ομόζυγοι για το αλληλόμορφο α έχουν την υψηλότερη αρμοστικότητα. Ακολουθώντας τη μεθοδολογία του πίνακα 11.4 και της προηγούμενης παραγράφου μπορούμε να υπολογίσουμε με ανάλογο τρόπο ότι: w = 1 s + sq 2 237

30 ΕΡΓΑΣΤΗΡΙΑΚΕΣ ΑΣΚΗΣΕΙΣ ΓΕΝΕΤΙΚΗΣ ΤΟΥ ΑΝΘΡΩΠΟΥ και p = p = p(1 s) 1 s + sq 2 spq2 1 s + sq 2 (11.24) Από την εξίσωση παρατηρούμε ότι η συχνότητα του αλληλόμορφου α είναι πάντα φθίνουσα (αρνητικό πρόσημο), που είναι αναμενόμενο γιατί το αλληλόμορφο επιλέγεται αρνητικά, και ότι η εξάλειψη του αλληλόμορφου θα είναι απόλυτη (ακόμα και με τη μαθηματική έννοια). Ωστόσο, στην περίπτωση αυτή, είναι δυνατόν το αλληλόμορφο A να εξαλειφθεί σε μία μόνο γενιά, αν ο συντελεστής επιλογής λάβει την τιμή 1. Στην περίπτωση αυτή, όπου όλα τα ομόζυγα και ετερόζυγα για το αλληλόμορφο A άτομα πεθαίνουν πριν την αναπαραγωγή τους, στο διάστημα μιας γενιάς θα επιβιώσουν μόνο τα ομόζυγα αα άτομα και το αλληλόμορφο A θα εξαλειφθεί. 3. Επιλογή ενάντια σε ένα ισοεπικρατές αλληλόμορφο. Στην περίπτωση αυτή ισχύει w AA = 1 w Aα = 1 s και w 2 αα = 1 s. Στην περίπτωση αυτή ο ομόζυγος γονότυπος AA έχει τη μεγαλύτερη αρμοστικότητα, ο ομόζυγος γονότυπος αα τη μικρότερη και ο ετερόζυγος Aα ενδιάμεση (1 s ). Ακολουθώντας τη μεθοδολογία του πίνακα 11.4 οδηγούμαστε στους εξής 2 τελικούς υπολογισμούς: w = 1 sq και q = q sq(1 + q)/2 1 sq q = spq/2 1 sq (11.25) Από την εξίσωση παρατηρούμε ότι η συχνότητα του αλληλόμορφου α θα έχει φθίνουσα πορεία και από μαθηματική άποψη έχει όριο, όπως και την περίπτωση της επιλογής ενάντια σε ένα υποτελές αλληλόμορφο. Ωστόσο, για τις ίδιες τιμές του s η μεταβολή της συχνότητας θα είναι μεγαλύτερη στην περίπτωση της επιλογής ενάντια σε ένα ισοεπικρατές αλληλόμορφο και τούτο γιατί η αρμοστικότητα των ετεροζυγωτών είναι μικρότερη. Στην περίπτωση της επιλογής ενάντια σε ένα υποτελές αλληλόμορφο δεν υπάρχει επιλογή ενάντια στους ετεροζυγώτες. 4. Επιλογή ενάντια στον ετεροζυγώτη. Στην περίπτωση αυτή ισχύει w AA = 1, w αα = 1 και w Aα = 1 s. Ο ετεροζυγώτης έχει μικρότερη αρμοστικότητα σε σχέση με τους δύο ομοζυγώτες που έχουν την ίδια. Ακολουθώντας τη μεθοδολογία του πίνακα 11.4 οδηγούμαστε στους εξής τελικούς υπολογισμούς: w = 1 2spq q = q spq 1 2spq και spq(q p) q = (11.26) 1 2spq Παρατηρούμε ότι στην εξίσωση αυτή, σε αντίθεση με τις περιπτώσεις που μελετήσαμε μέχρι τώρα, το πρόσημο της μεταβολής δεν είναι ξεκάθαρο και εξαρτάται από τη διαφορά (q p). Αν q > p τότε η συχνότητα του αλληλόμορφου α θα αυξηθεί μέχρι το αλληλόμορφο να εγκαθιδρυθεί, ενώ στην αντίθετη περίπτωση θα ελαττωθεί μέχρι το αλληλόμορφο να εξαλειφθεί. Η έκβαση εξαρτάται από την αρχική τιμή της συχνότητας του αλληλόμορφου. Θεωρητικά, όταν 238

31 τα αλληλόμορφα έχουν την ίδια αρχική συχνότητα (q = p = 0, 5) δεν θα επέρχεται καμία μεταβολή ( q = 0) και οι συχνότητές τους θα βρίσκονται σε σημείο ισορροπίας. Στην πράξη, κάτι τέτοιο δεν θα μπορούσε να διαρκέσει για πολύ, καθώς οι μεταβολές που οφείλονται στη γενετική παρέκκλιση θα οδηγούσαν σύντομα τις αρχικές συχνότητες των αλληλόμορφων σε διαφοροποίηση. 5. Επιλογή προς όφελος του ετεροζυγώτη. Στην περίπτωση αυτή ισχύει w AA = 1 s, w αα = 1 t και w α = 1, δηλαδή ο ετεροζυγώτης εμφανίζει τη μεγαλύτερη αρμοστικότητα, ενώ οι ομοζυγώτες w AA και w αα επιλέγονται αρνητικά με συντελεστές επιλογής s και t αντίστοιχα. Ακολουθώντας την ίδια μεθοδολογία με τις προηγούμενες περιπτώσεις, βρίσκουμε ότι: w = 1 sp 2 tq 2 και q = q = q tq 2 1 sp 2 tq 2 pq[sp tq] (11.27) 1 sp 2 tq 2 Οι εξισώσεις στην περίπτωση της επιλογής προς όφελος του ετεροζυγώτη παρουσιάζουν αξιομνημόνευτες διαφορές σε σχέση με τις άλλες περιπτώσεις επιλογής που εξετάσαμε. Η πρώτη παρατήρηση είναι ότι η μέγιστη αρμοστικότητα δεν βρίσκεται στις ακραίες τιμές της q, q = 1 ή q = 0. Η δεύτερη παρατήρηση είναι ότι το πρόσημο της μεταβολής q μπορεί να είναι θετικό ή αρνητικό, με αποτέλεσμα σε κάποιες περιπτώσεις η συχνότητα του αλληλόμορφου να αυξάνεται και σε άλλες η συχνότητα του αλληλόμορφου να μειώνεται. Όταν sp > tq τότε το πρόσημο είναι θετικό και η συχνότητα αυξάνεται, ενώ στην αντίθετη περίπτωση μειώνεται. Κάτι ανάλογο είδαμε ότι συνέβαινε και στην επιλογή ενάντια στον ετεροζυγώτη. Στην κατάσταση ισορροπίας, όπου δεν υπάρχει μεταβολή της συχνότητας των αλληλόμορφων, ( q = 0), θα πρέπει sp = tq. Χρησιμοποιώντας αυτή τη σχέση μπορούμε να υπολογίσουμε ξανά τις συχνότητες των αλληλόμορφων στην κατάσταση ισορροπίας, αντικαθιστώντας στην εξίσωση τη συχνότητα q μετά την επιλογή s(1 q) = tq. Η επίλυση της εξίσωσης δίνει: q = s s + t (11.28) και επειδή p = 1 q, στην κατάσταση ισορροπίας η συχνότητα p του αλληλόμορφου A θα είναι: p = t (11.29) s + t Η τρίτη παρατήρηση είναι ότι σε όλες τις περιπτώσεις επιλογής που εξετάσαμε μέχρι τώρα η επιλογή οδηγούσε, στο σημείο ισορροπίας, τις τιμές των συχνοτήτων των αλληλόμορφων είτε στην εγκαθίδρυση (με συχνότητα 1) είτε στην απώλεια (με συχνότητα 0). Εξαίρεση αποτελούσε το μη ρεαλιστικό σενάριο της επιλογής ενάντια στον ετεροζυγώτη, όπου στο σημείο ισορροπίας p = q = 0, 5. Στην περίπτωση της επιλογής προς όφελος του ετεροζυγώτη, στο σημείο ισορροπίας οι τιμές των συχνοτήτων λαμβάνουν μια ενδιάμεση τιμή μεταξύ 1 και 0 και κανένα από τα δύο αλληλόμορφα δεν εξαλείφεται. Η κατάσταση αυτή ονομάζεται εξισορροπημένη επιλογή και οι πολυμορφισμοί εξισορροπημένοι πολυμορφισμοί. 239

32 ΕΡΓΑΣΤΗΡΙΑΚΕΣ ΑΣΚΗΣΕΙΣ ΓΕΝΕΤΙΚΗΣ ΤΟΥ ΑΝΘΡΩΠΟΥ Το πλεονέκτημα του ετεροζυγώτη είναι μια περίπτωση εξισορροπημένης επιλογής και ερμηνεύει εν μέρει γιατί υπολειπόμενα αλληλόμορφα που μπορεί να οδηγούν σε σοβαρές ασθένειες διατηρούνται στους πληθυσμούς. Γνωρίζουμε για παράδειγμα ότι οι φορείς της δρεπανοκυτταρικής αναιμίας έχουν πλεονεκτική αρμοστικότητα σε περιοχές όπου ενδημεί η ελονοσία και παρότι η δρεπανοκυτταρική αναιμία (ομοζυγωτία για την παθολογική αιμοσφαιρίνη HBs) είναι μια σοβαρή ασθένεια, το υπεύθυνο αλληλόμορφο δεν εξαλείφεται από τον πληθυσμό. Με απλά λόγια, στην περίπτωση υπεροχής του ετεροζυγώτη κανένα από τα δύο αλληλόμορφα δεν μπορεί να εξαλείψει το άλλο. Η επιλογή μπορεί να ελαττώνει τα αλληλόμορφα των ομοζυγωτών, αλλά αυτά διατηρούνται στον πληθυσμό εξαιτίας των ετεροζυγωτών που έχουν την υψηλότερη αρμοστικότητα Στη σχέση μεταξύ μετάλλαξης και επιλογής διακρί- Ισορροπία μεταξύ μετάλλαξης και επιλογής: νουμε δύο περιπτώσεις: Την περίπτωση που το νέο αλληλόμορφο είναι επιβλαβές και μειώνει την αρμοστικότητα. Αυθόρμητα θα υποθέταμε ότι η εισαγωγή ενός νέου επιβλαβούς αλληλόμορφου στον πληθυσμό θα οδηγούσε γρήγορα στην εξαφάνισή του εξαιτίας της επιλογής. Κάτι τέτοιο δεν συμβαίνει στην πραγματικότητα. Αν υποθέσουμε ότι το αλληλόμορφο α προέρχεται από μετάλλαξη του αλληλόμορφου A με ρυθμό µ (A µ α) και είναι υπολειπόμενο, τότε θα οδηγεί σε επιλογή έναντι των ομοζυγωτών αα. Στην αρχή η συχνότητά του θα είναι μικρή και έτσι θα υπάρχουν πολύ λίγα αα άτομα για να επιλεγούν. Ακόμα και με πλήρη επιλογή των ομοζυγωτών (s = 1, δηλαδή, η διαταραχή να είναι γενετικά θνησιγόνος) το αλληλόμορφο δεν θα εξαφανιζόταν, καθώς θα συνέχιζε να εμφανίζεται με ρυθμό µ και θα διατηρούνταν στους ετεροζυγώτες φορείς. Τελικά, η συχνότητα θα εξισορροπούνταν από την επιλογή των ομοζυγωτών. Στην κατάσταση ισορροπίας μεταξύ μετάλλαξης και επιλογής θα έχουμε: q s = q m όπου q s είναι η μεταβολή της συχνότητας εξαιτίας της επιλογής (selection) και q m εξαιτίας της μετάλλαξης (mutation). Αντικαθιστώντας με τις εξισώσεις και έχουμε: µp = spq2 1 sq 2 αν θεωρήσουμε ότι το q 2 είναι πάρα πολύ μικρό μέγεθος, η εξίσωση απλοποιείται σε: µp = spq 2 ή q = µ s (11.30) όπου q η συχνότητα του α στο σημείο ισορροπίας Παρότι λοιπόν η επιλογή μπορεί να διατηρεί τη συχνότητα χαμηλά, δεν μπορεί να την οδηγήσει ποτέ στην τιμή 0. Η ελάχιστη συχνότητα θα επιτευχθεί όταν s = 1 και είναι η q = µ. Με παρόμοιο τρόπο μπορούμε να υπολογίσουμε τη συχνότητα του αλληλόμορφου A για ένα επικρατές επιβλαβές αλληλόμορφο που προκύπτει με ρυθμό µ (α µ A). Στο σημείο ισορροπίας η συχνότητά δίνεται από τη σχέση: p µ (11.31) s 240

33 Ας θεωρήσουμε δύο γενετικά θνησιγόνους διαταραχές (s = 1) που προκύπτουν από αλληλόμορφα που εμφανίζουν τον ίδιο μεταλλακτικό ρυθμό (για παράδειγμα µ = 2, ) εκ των οποίων στην μεν πρώτη επιλέγεται αρνητικά ο ομόζυγος υπολειπόμενος γονότυπος, ενώ στη δεύτερη, που είναι επικρατής, επιλέγονται αρνητικά τόσο ο ομόζυγος γονότυπος όσο και ο ετερόζυγος. Στην πρώτη περίπτωση, στο σημείο ισορροπίας θα έχουμε συχνότητα q = µ = 2, = 0, Στη δεύτερη περίπτωση στο σημείο ισορροπίας η συχνότητα θα είναι p = µ = 2, δηλαδή πολύ μικρότερη από την υπολειπόμενη διαταραχή. Αυτό είναι αναμενόμενο, γιατί στη δεύτερη περίπτωση επιλέγονται αρνητικά όχι μόνο οι ομοζυγώτες, αλλά και οι ετεροζυγώτες για το επιβλαβές αλληλόμορφο. Την περίπτωση που το νέο αλληλόμορφο προσφέρει κάποιο πλεονέκτημα και αυξάνει την αρμοστικότητα. Σε περίπτωση που ένα νέο υπολειπόμενο αλληλόμορφο προσφέρει πλεονέκτημα στους ομοζυγώτες (w αα = 1) και ενδιάμεσο πλεονέκτημα στους ετεροζυγώτες (w AA < w Aα < 1), η συχνότητα παραμένει αρχικά χαμηλή στον πληθυσμό, καθώς ο αριθμός των ατόμων που επωφελούνται παραμένει μικρός. Καθώς τα άτομα με γονότυπο αα και Aα αυξάνονται στον πληθυσμό, η πιθανότητα επιλογής αυξάνεται, οδηγώντας σε εκθετική αύξηση της συχνότητας μετά από κάποιες γενιές. Ο ρυθμός αύξησης είναι μεγαλύτερος στην περίπτωση που το μεταλλαγμένο αλληλόμορφο είναι επικρατές. Επιλογή και γενετική παρέκκλιση: Η τύχη ενός αλληλόμορφου από τον συνδυασμό επίδρασης της επιλογής και της γενετικής παρέκκλισης θα εξαρτηθεί από τη σχετική τους δύναμη. Αν η επιλογή είναι ασθενής (οι διαφορές αρμοστικότητας είναι μικρές ανάμεσα στους γονότυπους) και το μέγεθος του πληθυσμού μικρό, η γενετική παρέκκλιση έχει μεγαλύτερη βαρύτητα στη διαμόρφωση της συχνότητας των αλληλόμορφων. Αντίθετα, αν ο πληθυσμός είναι μεγάλος, ακόμα και μια ασθενής επιλογή παίζει κυρίαρχο λόγο στη διαμόρφωση της συχνότητας των αλληλόμορφων. Επιλογή και ενδογαμία: Η ενδογαμία δεν μεταβάλλει απο μόνη της τις συχνότητες των αλληλόμορφων σε έναν πληθυσμό. Ωστόσο προκαλεί σημαντικές αλλαγές στις συχνότητες των γονότυπων, αυξάνοντας τον αριθμό των ομοζυγωτών και οδηγώντας ταυτόχρονα σε ισάριθμο έλλειμα ετεροζυγωτών στον πληθυσμό. Η αλλαγή στις συχνότητες των γονότυπων μπορεί να έχει μεγάλη επίδραση στον τρόπο που επιδρά η επιλογή, καθώς περισσότεροι ομοζυγώτες θα γίνοται αντικείμενο της επίδρασής της. Για παράδειγμα, στην περίπτωση ενός υπολειπόμενου αλληλόμορφου που επιλέγεται αρνητικά, όσο υψηλότερη είναι η ενδογαμία τόσο ταχύτερα θα ελαττωθεί η συχνότητά του στον πληθυσμό Εργαλεία λογισμικού Το πρόγραμμα De Finetti Generator Το πρόγραμμα De Finetti Generator κατασκευάζει διαγράμματα de Finetti που απεικονίζουν τις γονοτυπικές συχνότητες διαλληλικών γενετικών τόπων σε έναν πληθυσμό. Κάθε σημείο εντός ή στις πλευρές του τριγώνου αντιπροσωπεύει την αναλογία των συχνοτήτων των τριών γονότυπων (βλ. σχετικά την παράγραφο «Παράσταση της ισορροπίας σε διάγραμμα De Finetti»). Αναπτύχθηκε από τον Henning Henschke και είναι διαθέσιμο στην ηλεκτρονική διεύθυνση https: //Finetti.meb.uni-bonn.de/. Εκτός από την online έκδοση διαθέτει και εκτελέσιμο αρχείο το οποίο μπορούμε να εγκαταστήσουμε στον υπολογιστή μας. Για να χρησιμοποιηθεί είναι απαραίτητο ο περιηγητής ιστοσελίδων μας να διαθέτει υποστήριξη για αρχεία τύπου svg (scalable verctor graphics). 241

34 ΕΡΓΑΣΤΗΡΙΑΚΕΣ ΑΣΚΗΣΕΙΣ ΓΕΝΕΤΙΚΗΣ ΤΟΥ ΑΝΘΡΩΠΟΥ Το αρχείο εισόδου του προγράμματος είναι ένα απλό αρχείο κειμένου ASCII με τα παρακάτω χαρακτηριστικά: Γραμμές σχολίων που ξεκινούν με το σύμβολο *. Μία μοναδική γραμμή για τον τίτλο του διαγράμματος. Γραμμές με τα δεδομένα για κάθε δείγμα, που προαιρετικά μπορεί να έχουν ένα σύμβολο. Τρεις ακέραιους αριθμούς που αφορούν τις συχνότητες των γονότυπων με σειρά AA, Aα και αα διαχωρισμένες μεταξύ τους με κενούς χαρακτήρες. Ένα προαιρετικό σχόλιο για κάθε δείγμα - πληθυσμό. Ο μέγιστος αριθμός δεδομένων που μπορεί να επεξεργαστεί είναι για 98 δείγματα. Παράδειγμα ενός τέτοιου αρχείου δίνεται παρακάτω: * Finetti students exercise * CC TC TT *1000genomes rs rs selected 1000 Genomes 1: ALL_1000_GENOMES 2: CHB 3: JPT 4: TSI 5: CEU 6: GBR Το πρόγραμμα παράγει αρχεία εξόδου όταν σε περιβάλλον γραμμής εντολών bash εκτελέσουμε την εντολή: $. / F i n e t t i onoma_arhiou_ascii Τα αρχεία εξόδου βρίσκονται σε έναν κατάλογο που έχει το όνομα του αρχείου εισόδου μας. Μέσα στον κατάλογο βρίσκονται τα ακόλουθα: Όνομα_αρχείου_ascii.html: Πρόκειται για το βασικό αρχείο, που περιέχει το γράφημα και τα αποτελέσματα της στατιστικής ανάλυσης. Κατάλογος images: Περιέχει τις εικόνες svg που δημιουργήθηκαν. Κατάλογος css: Περιέχει αρχεία που μας επιτρέπουν να τροποποιήσουμε την εμφάνιση του διαγράμματος και της ιστοσελίδας που παρουσιάζει τα αποτελέσματα. Για να δούμε τα αποτελέσματα της ανάλυσης αρκεί να ανοίξουμε το αρχείο με κατάληξη.html στον περιηγητή ιστοσελίδων. 242

35 Το πακέτο HardyWeinberg της R Η R είναι ένα περιβάλλον ανοιχτού λογισμικού για την πραγματοποίηση στατιστικών υπολογισμών και την κατασκευή γραφημάτων. Δημιουργήθηκε από τον Ross Ihaka και τον Robert Gentleman στο Πανεπιστήμιο του Όκλαντ της Ν. Ζηλανδίας. Το όνομά της οφείλεται στα αρχικά γράμματα των μικρών ονομάτων των δύο δημιουργών της. Ένα από τα πλεονεκτήματα της R είναι και η επεκτασιμότητά της, με βιβλιοθήκες που ονομάζονται πακέτα (packages). Η R είναι διαθέσιμη ως ελεύθερο λογισμικό υπό τους όρους της GPL του Ιδρύματος Ελεύθερου Λογισμικού σε μορφή αρχείων εγκατάστασης αλλά και πηγαίου κώδικα. Το πακέτο που θα χρησιμοποιήσουμε στην R ονομάζεται «HardyWeinberg» και δημοσιεύτηκε για πρώτη φορά το 2015 [25]. Ο ακριβής τίτλος του είναι «Γραφικοί έλεγχοι για την ισορροπία Hardy- Weinberg» (Graphical Tests for Hardy-Weinberg Equilibrium) και δημιουργός του είναι ο Jan Graffelman, ο οποίος διδάσκει στο Τμήμα Στατιστικής της Πολυτεχνικής Σχολής της Βαρκελώνης στην Ισπανία. Στο πακέτο αυτό περιλαμβάνονται πολλοί χρήσιμοι έλεγχοι και συναρτήσεις. Μια κατηγορία αποτελούν ορισμένα εργαλεία που χρησιμοποιούνται για τον έλεγχο της ισορροπίας H-W για διαλληλικούς γενετικούς τόπους (έλεγχος X 2 καλής προσαρμογής, ακριβής έλεγχος του Fisher κ.ά). Τέλος, στο πακέτο HardyWeinberg βρίσκεται και η ρουτίνα H-WTernaryPlot, που σχηματίζει τη γραφική παράσταση των τριών γονότυπων (AA, aa, Aa) σε ένα διάγραμμα De Finetti, ορίζοντας γραφικά την περιοχή αποδοχής της υπόθεσης της ισορροπίας ανάμεσα σε δύο παραβολές. Επιτρέπει τον γραφικό έλεγχο πολλαπλών δεικτών ταυτόχρονα (όπως για παράδειγμα πολλών μονουκλεοτιδικών πολυμορφισμών, SNPs) σε ένα γράφημα. Μας δίνεται η δυνατότητα, με μια γρήγορη ματιά, να διαπιστώσουμε αν οι πολυμορφικοί δείκτες που μελετάμε βρίσκονται σε ισορροπία H-W. PoPG: Λογισμικό προσομοίωσης πληθυσμιακής γενετικής Το πρόγραμμα PopG είναι ένας προσομοιωτής πληθυσμιακής γενετικής ενός γενετικού τόπου με δύο αλληλόμορφα και δημιουργήθηκε προκειμένου να χρησιμοποιείται από φοιτητές. Επιτρέπει στους φοιτητές να μελετήσουν με απλό τρόπο τα αποτελέσματα της φυσικής επιλογής, της γενετικής παρέκκλισης, της μετάλλαξης και της μετανάστευσης στη συχνότητα των αλληλόμορφων και να κατανοήσουν καλύτερα τις εξελικτικές διαδικασίες. Αναπτύχθηκε από το τμήμα των γονιδιωματικών επιστημών του Πανεπιστημίου της Ουάσινγκτον, με τη συνεισφορά των Joe Felsenstein, Hisashi Horino, Sean Lamont, Bill Alford, Mark Wells, Mike Palczewski, Doug Buxton, Elizabeth Walkup, Ben Zawadzki και Jim McGill. Το PopG διατίθεται ελεύθερα για εκπαιδευτικούς σκοπούς στην ηλεκτρονική διεύθυνση Με την εκκίνηση του προγράμματος εμφανίζεται το γραφικό περιβάλλον που απεικονίζει τους άξονες x και y. Στον κάθετο άξονα (y) αναγράφεται η συχνότητα του αλληλόμορφου A, ενώ στον οριζόντιο (x) ο αριθμός των γενιών στις οποίες γίνεται η προσομοίωση (εικόνα 11.8). Το πρόγραμμα χρησιμοποιεί μια γεννήτρια τυχαίων αριθμών προκειμένου να παραγάγει τις συχνότητες των γονότυπων της επόμενης γενιάς. Κάθε γραμμή απεικονίζει την εξέλιξη των συχνοτήτων του αλληλόμορφου σε έναν πληθυσμό σε συνάρτηση με τις γενιές που βρίσκονται υπό την επίδραση της γενετικής παρέκκλισης (εικόνα 11.8). Η μπλε γραμμή του διαγράμματος δείχνει τις συχνότητες των αλληλόμορφων στην περίπτωση που ο πληθυσμός έχει άπειρα άτομα (δεν υπάρχει γενετική παρέκκλιση). Με την επιλογή New Run από το μενού Run εμφανίζεται το παράθυρο στο οποίο τοποθετούμε τις βασικές παραμέτρους τις οποίες θέλουμε να προσομοιώσουμε. Αυτές περιλαμβάνουν το μέγεθος του πληθυσμού, την αρμοστικότητα των γονότυπων (AA, Aα και αα) τον ρυθμό μεταλλαγής των δύο αλληλόμορφων από τον έναν στον άλλο, τη μεταναστευτική ροή, την αρχική συχνότητα του αλληλόμορφου A, των αριθμό των γενιών στον οποίο επιθυμούμε να γίνει η προσομοίωση και τον 243

36 ΕΡΓΑΣΤΗΡΙΑΚΕΣ ΑΣΚΗΣΕΙΣ ΓΕΝΕΤΙΚΗΣ ΤΟΥ ΑΝΘΡΩΠΟΥ αριθμό των πληθυσμών που θέλουμε να απεικονιστούν ταυτόχρονα (εικόνες 11.8, 11.9 ). Ο ρυθμός μετανάστευσης ανάμεσα στους πληθυσμούς που προσομοιώνονται είναι ο ίδιος. Εικόνα 11.8 Γραφικό περιβάλλον του προγράμματος PopG. Αποτελέσματα προσομοίωσης με βάση τις παραμέτρους που φαίνονται στην εικόνα Απεικονίζεται η εξέλιξη της συχνότητας του αλληλόμορφου σε 10 πληθυσμούς (γραμμές μαύρου χρώματος) σε 100 γενιές. Παρατηρήστε την απώλεια του αλληλόμορφου A σε έναν από τους 10 πληθυσμούς που προσομοιώνονται. Εικόνα 11.9 Παράθυρο ρυθμίσεων των παραμέτρων προσομοίωσης στο πρόγραμμα PopG. Με την επιλογή Save οι χρήστες μπορούν να σώσουν σε αρχείο εικόνας το γράφημα που παράχθηκε από την προσομοίωση. 244

37 11.2 Πρακτικό μέρος Έλεγχος ισορροπίας Hardy-Weinberg και κατασκευή γραφικών αναπαραστάσεων Υπολογισμός της συχνότητας των αλληλόμορφων Επισκεπτόμενοι την ιστοσελίδα του 1000 Genomes ( ανακτήσαμε τα δεδομένα του πίνακα 11.8 σχετικά με τη συχνότητα των γονότυπων του πολυμορφισμού rs σε επιλεγμένους πληθυσμούς. Παρατηρήστε ότι κάθε πληθυσμός στον πίνακα συμβολίζεται με τρία κεφαλαία γράμματα. Οι επεξηγήσεις μπορούν να βρεθούν αν ανατρέξουμε στην ιστοσελίδα Για παράδειγμα, με GBR συμβολίζονται οι Βρετανοί από τη Σκωτία και την Αγγλία, ενώ με TSI οι Ιταλοί από την περιοχή της Τοσκάνης. Πληθυσμός CC TC TT Συχνότητα Τ (ˆp) Συχνότητα C (ˆq) Αναμενόμενοι ετεροζυγώτες (E T C ) CHB JPT TSI CEU GBR ,58 0,42 45,42 Σύνολο Έλληνες Πίνακας 11.8 Συχνότητες γονότυπων του πολυμορφισμού rs από επιλεγμένους πληθυσμούς του 1000 Genomes. Στο τέλος παρατίθενται οι συχνότητες από δείγμα ελληνικού πληθυσμού. 1. Προκειμένου να υπολογίσουμε τη συχνότητα του αλληλόμορφου T στον κάθε πληθυσμό, χρησιμοποιούμε την εξίσωση Για παράδειγμα, στους Βρετανούς ο υπολογισμός μάς δίνει: (2 32) = 0, 58. Η συχνότητα του αλληλόμορφου C μπορεί να υπολογιστεί από την εξίσωση p+q = 1 (1 0, 58 = 0, 42), δεδομένου ότι ο γενετικός τόπος έχει δύο αλληλόμορφα (C και Τ). Υπολογίστε τις συχνότητες των αλληλόμορφων T και C συμπληρώνοντας τα κενά του πίνακα Συμπληρώστε τον πίνακα υπολογίζοντας την αναμενόμενη συχνότητα των ετεροζυγωτών (2pq) με βάση τις υπολογισμένες συχνότητες των αλληλόμορφων και τον αναμενόμενο (2pq) αριθμό τους E T C. 3. Τι παρατηρείτε στους πληθυσμούς; Υπάρχει έλλειμμα ή περίσσεια ετεροζυγωτών; Με ποιόν τρόπο μπορούμε να απαντήσουμε στο αν οι διαφορές αυτές οφείλονται στην τύχη και μόνο εξαιτίας δειγματοληπτικού σφάλματος ή αν υπάρχει απόκλιση από την ισορροπία H-W; 245

38 ΕΡΓΑΣΤΗΡΙΑΚΕΣ ΑΣΚΗΣΕΙΣ ΓΕΝΕΤΙΚΗΣ ΤΟΥ ΑΝΘΡΩΠΟΥ Έλεγχος καλής προσαρμογής και κατασκευή διαγράμματος De Finetti. Υπάρχουν πολλές εφαρμογές λογισμικού που αυτοματοποιούν τον έλεγχο της ισορροπίας H-W. Στα εργαστήρια στατιστικής γενετικής εκατομμύρια πολυμορφισμοί μπορούν να ελεγχθούν με τη βοήθεια λογισμικού σε λίγα λεπτά. Η εφαρμογή De Finetti Generator που θα χρησιμοποιήσουμε θα πραγματοποιήσει τον έλεγχο και θα κατασκευάσει ταυτόχρονα ένα διάγραμμα De Finetti όπου θα απεικονιστούν τα αλληλόμορφα. Η γραφική παράσταση μας επιτρέπει να βγάλουμε συμπεράσματα πολύ σύντομα, με μια γρήγορη ματιά στο διάγραμμα. Η εφαρμογή απαιτεί τη χρήση ενός αρχείου κειμένου με τη δομή που περιγράψαμε στην παράγραφο «Το πρόγραμμα De Finetti Generator». Στη συνέχεια θα κατασκευάσουμε ένα διάγραμμα De Finetti προκειμένου να αναπαραστήσουμε την ισορροπία γραφικά και να πραγματοποιήσουμε τον έλεγχο καλής προσαρμογής, χρησιμοποιώντας τα στοιχεία του πίνακα Προετοιμασία αρχείου εισόδου 1. Χρησιμοποιώντας τον επεξεργαστή κειμένου gedit δημιουργούμε ένα νέο αρχείου κειμένου. Στην πρώτη γραμμή τοποθετούμε το σύμβολο και εισάγουμε τα σχόλιά μας, που δεν θα χρησιμοποιηθούν από την εφαρμογή. Σε επόμενη γραμμή αναγράφουμε τον τίτλο που θέλουμε να εμφανιστεί στην αναφορά του προγράμματος, χωρίς να προηγείται κανένας ειδικός χαρακτήρας. 2. Σημειώνουμε τα στοιχεία των πληθυσμών που θα αναλύσουμε ακολουθώντας την εξής σειρά: Τοποθετούμε πρώτα ένα αριθμητικό χαρακτηριστικό του πληθυσμού και στη συνέχεια άνω και κάτω τελεία (π.χ. 1:). Αφήνουμε έναν κενό χαρακτήρα και στην συνέχεια τοποθετούμε κατά σειρά τον αριθμό των ομοζυγωτών για το αλληλόμορφο α1, τον αριθμό των ετεροζυγωτών α1α2 και τον αριθμό των ομοζυγωτών α2α2, διαχωρισμένους με έναν κενό χαρακτήρα. Δίνουμε ένα χαρακτηριστικό όνομα στον πληθυσμό (θα χρησιμοποιήσουμε τους συμβολισμούς του 1000 Genomes) Στο τέλος της διαδικασίας το αρχείο μας θα δείχνει κάπως έτσι: * Finetti students exercise * CC TC TT *1000genomes rs greeks rs selected 1000 Genomes and Greeks 1: ALL_1000_GENOMES 2: CHB 3: JPT 4: TSI 5: CEU 6: GBR 7: GR 246

39 3. Αποθηκεύουμε το αρχείο μας δίνοντας κάποιο όνομα και την κατάληξη.fti (στην περίπτωσή μας de_finetti_ex1.fti) στον ίδιο κατάλογο που είναι εγκατεστημένη η εφαρμογή De Finetti Generator. Τρέξιμο της εφαρμογής και ανάγνωση των αποτελεσμάτων 1. Ανοίγουμε την εφαρμογή Τερματικό και μεταβαίνουμε στον κατάλογο που βρίσκεται η εφαρμογή De Finetti. Στη γραμμή εντολών δίνουμε την εντολή: $. / F i n e t t i d e _ F i n e t t i _ e x 1. f t i 2. Το πρόγραμμα δημιουργεί έναν κατάλογο με το όνομα του αρχείου εισόδου χωρίς την κατάληξη.fti, στην περίπτωσή μας de_finetti_ex1. Μέσα στον κατάλογο βρίσκεται ένα αρχείο με κατάληξη.html και όνομα ίδιο με το αρχείο εισόδου. Το αρχείο περιέχει τα αποτελέσματα των στατιστικών αναλύσεων που έγιναν στους πληθυσμούς και την απεικόνιση του ελέγχου καλής προσαρμογής στο διάγραμμα De Finetti. 3. Με δεξί κλικ επιλέγουμε να ανοίξουμε το αρχείο.html με τον περιηγητή ιστοσελίδων. 4. Στην οθόνη μας εμφανίζονται τα αποτελέσματα της ανάλυσης, όπως φαίνεται στην εικόνα Εικόνα Αποτελέσματα ελέγχου της ισορροπίας Hardy-Weinberg και διάγραμμα De Finetti με τη χρήση της εφαρμογής De Finetti Generator όπως φαίνονται στον περιηγητή ιστοσελίδων. Σε επίπεδο σημαντικότητας a = 5% εξετάζουμε τα αποτελέσματά μας. Παρατηρούμε ότι όλοι οι πληθυσμοί βρίσκονται σε ισορροπία H-W (ισχύει p value = 0, 34 > 0, 05). Τα σημεία όπου τοποθετούνται οι πληθυσμοί είναι πλησίον της παραβολής της συνθήκης ισορροπίας. Ωστόσο, το μειονέκτημα της αναπαράστασης είναι ότι δεν μπορούμε να διαπιστώσουμε οπτικά αν κάποιος πληθυσμός δεν βρίσκεται σε ισορροπία H-W. 247