PROTEINI. Doc. dr Snežana Marković

Transcript

1 PROTEINI Doc. dr Snežana Marković Institut za biologiju i ekologiju Prirodno-matematički fakultet Univerzitet u Kragujevcu

2 Proteos prvi, najvažniji. 20 proteinogenih L- aminokiselina (AK). AK na istom alfa atomu imaju vezanu karboksilnu i amino grupu. Karboksilna kiselina daje kiseo karakter, a amino grupa daje bazni karakter, tako da su to amfoterna jedinjenja. PROTEINI

3

4 Protein je polipeptidni niz aminokiselina koje su povezane peptidnim vezama. Peptidna veza se formira između karboksilne kiseline jedne AK i amino grupe druge kiseline. DNK nosi informaciju za sve proteine. Na riobozomima nastaje primarna struktura proteina. PRIMARNA STRUKTURA proteina predstavlja kovalentni skelet polipeptidnog lanca.

5 ODREĐIVANJE PRIMARNE STRUKTURE PROTEINA Seindžer, g., primarna struktura insulina 1. prečišćavanje pojedinačnih polipeptidnih lanaca (baze, kiseline) 2. Redukcija S-S veza (2-merkaptoetanol) 3. Jedan uzorak se hidrolizuje (jake baze, kiseline) i odredi aminokiselinski sastav (jonoizmenjivačka hromatografija; rastuće ph; ninhidrinski reagens) 4. Drugi uzorak - identifikacija AK na NH 2 i COOH kraju (Edmanova reakcija; karboksipeptidaze) 5. Polipeptid se seče na manje fragmente (ograničena enzimska ili hemijska hidroliza) 6. Određivanje aminokiselinskog sastava fragmenata i redosleda aminokiselina 7. Treći uzorak se parcijalno hidrolizuje drugim reagensom i analizira aminokiselinski sastav i redosled AK dve grupe fragmenata sa istim regionima 8. Upoređivanje dve grupe fragmenata kompletan redosled AK u uzorku 9. Određivanje položaja S-S veza (delimična hidroliza originalnog uzorka tripsinom, bez narušavanja S-S veza)

6 Konformacija proteina prostorno struktuiranje proteina (sekundarna, tercijerna i kavternerna struktura) Sekundarna struktura proteina Formiranje vodoničnih veza između peptidnih veza koje se uspostavljaju između svake četvrte aminokiseline unutar jednog polipetidnog lanca - alfa heliks.

7 Formiranjem vodoničnih veza između C=O i NH grupe susednih lanaca ili između različitih delova jednog polipeptidnog lanca - β nabrana ploča. (paralelna i antiparalelna) Disulfidne S-S veze

8 TERCIJERNA struktura nastaje spontanim uvijanjem polipeptida u kome učestvuju sve R grupe pojedinačnih aminokiselina. Prilikom savijanja globularnih proteina hidrofobne aminokiseline se potiskuju u unutrašnjost molekula, a polarne ostaju u kontaktu sa vodom.

9 Proteini koji imaju samo tercijernu strukturu su: - albumini, gamaglobulini, osein (kost), keratin, histoni - složeni proteini nastaju povezivanjem globula proteina sa mastima ili šećerima; - tubulin, glikoproteini, lipoproteini, fosfoproteini nukleoproteini (složeni proteini).

10 Kvaternarna struktura nastaje povezivanjem većeg broja polipeptidnih lanaca (protomere); homo- ili heterooligomeri; Deo oligomera koji je funkcionalno aktivan - subjedinica (od jednog ili više polipeptidnih lanaca). Povezivanjem subjedinica u kvaternernu strukturu nastaje spiralan (aktin ili α-keratin) ili globularan molekul (hemoglobin). Proteinski omotač virusa Formiranje funkcionalnih ribozoma Spontano aranžiranje (self assembling), ili potpomognuto faktorima aranžiranja (assembling factors), najčešće e enzimi.

11 PROTEINSKI DOMEN - substruktura nastala od bilo kog dela polipeptidnog lanca koji je nezavisno uključen u kompaktnu, stabilnu strukturu Proteinski moduli Ostale aminokiseline su odgovorne za struktuiranje proteina i zauzimanje pravilne konformacije Mesto vezivanja (binding site) - svaki region proteina koji interaguje sa drugim molekulima preko nekovalentnih veza. Mutacije u delu gena koji kodira funkcionalni domen proteina mogu biti fatalne potpuna nefunkcionalnost proteina, dok mutacije koje bi zahvatile delove DNK koji kodiraju ostatak proteina odgovoran za struktuiranje mogu biti i tihe, neeksprimirane

12 DENATURACIJA I RENATURACIJA PROTEINA Denaturacija narušavanje konformacije molekula proteina gubitak funkcije proteina Visoke T ili ekstremne ph Reverzibilan proces Spontana renaturacija u nativnu konfiguraciju proteina (niža slobodna energija) Primarna struktura polipeptidnog lanca određuje njegov prostorni oblik (konformaciju) Konformacija proteina određuje njegovu funkcionalnost Eksperimenti sa ribonukleazom (RNKazom)

13 PRATIOCI PROTEINA Obrada polipeptidnog lanca biološki aktivan oblik Nativna konformacija, kovalentne modifikacije, lokalizacija u ćeliji, udruživanje sa drugim polipeptidnim lancima Pratioci proteina, molekularni šaperoni - PROTEINI TOPLOTNOG STRESA (heat shock proteins - HSP) Sprečavaju agregaciju i pogrešno savijanje novosintetisanih proteina Omogućuju transport kroz biološke membrane Omogućuju udruživanje polipeptida u oligomere Omogućuju disagregaciju, odvijanje i ponovno savijanje u nativni oblik Protein u odvijenom (O), ispravno savijenom (S) i pogrešno savijenom obliku (A/D) HSP imaju ATPaznu i odvijajuću aktivnost i stimulišu prelaz polipeptidnih lanaca iz A/D u O i O u S oblik HSP70 (monomeri, vezuju se za proteine u toku sinteze) i HSP60 (oligomeri, vezuju se za nepravilno savijene ili dentaurisane proteine)

14 POSTRANSLACIONE MODIFIKACIJE PROTEINA Kovalentne modifikacije: Proteolitičko uklanjanje vodećeg metionina (formilmetionina) Ograničena proteoliza (preproteini proteini; tripsin, himotripsin) Odstranjivanje signalnih peptida na NH 2 kraju (transmembranski i sekretorni proteini) pomoću peptidaza Digestija poliproteina pomoću proteaza (hormoni) Modifikacije aminokiselinskih bočnih grupa (fosforilacije, acetilacije, glikozilacije, hidroksilacije, metilacije, ADPribozilacije, i sl.) regulatorni značaj Ne modifikuju se: Ala, Gly, Ile, Leu, Met, Val Vezivanje koenzima (biotin, piridoksal fosfat)

15 Endoplazmatski retikulum granulirani i negranulirani Goldžijev kompleks Proteini kao gradivni elementi ćelije, proteini enzimi, proteini organela, proteini za export Proteinsko pakovanje u ER (glikozilacija, stvaranje S-S mostova) Signalna sekvenca polipeptida sa amino kraja, hidrofobna Proteozomi ili lizozomi razgradnja nepravilno savijenih proteina (izloženi hidrofobni segmenti; ubikvitin)

16 Грешке у протеинској регулацији и/или некоректно функционисање протеозома доводe до болести као последице агрегације мутантних протеина. Болести нервног система, Хантинктонова и Алцхајмерова болест, у којима се делови резистентних протеинских агрегата формирају и таложе у мозгу - прионске болести. Последица су погрешно увијених прионских протеина (ПрП) који су локализовани на површини мембране неурона. Приони имају способност да катализују погрешно савијање коректно савијених протеина ПрП доприносећи бржем напретку ширења болести са ћелије до ћелије. Приони (протеинске инфективне честице, антишаперони ) се појављују у два облика при чему је дефектни протеински агенс (ПрП сц ) продукт мутације на гену (ПРНП ц ). НативниприонПрП ц сеналазинаповршининервнећелије.дефектниприон ПрП сц се акумулира у форми агрегата који доводе до Кројцфелд-Јакобове - (Creutzfeld-Jacob) болести (болест лудих крава), неуролошке болести која је последица погрешно савијених протеина ПРП ц. Oба прионска протеина имају идентичне аминокиселинске секвенце, али се различито савијају. Представљају конформере. Нормални ПрП ц протеин има претежно α хеликс савијање и растворан је. Абнормални ПрП сц протеин има у конформацији 45% β-плоче, несолубилан је и неосетљив на протеазе; доводи до агрегације.

17

18

19

20 PROTEOMIKA - proučavanje proteoma; proučavanje ukupnih proteina u ćeliji, uključujući njihovu prisutnost, distribuciju, postranslacione modifikacije, ulogu i interakcije koje ostvaruju sa ostalim makromolekulima u ćeliji ili organizmu u određenom momentu ili u specifičnom stanju ćelijskog ciklusa. Proteom - svi eksprimirani proteini jednog organizma. Jedan organizam ima različitu proteinsku ekspresiju u različitim tipovima ćelija, zavisno od uloge koju one obavljaju. Čovek ima oko gena ali se procenjuje da je broj očekivanih proteina između do

21 Enzimi su složeni proteini; polipeptidni lanci i kofaktori (mali organski molekuli ili joni metala - Fe, Mn, Mg, Zn). APOENZIM proteinski deo enzima KOENZIMI - organske molekule, najčešće vitamini: tiamin vit. B1 (tiamin pirofosfat), riboflavin vit. B2 (FADH), niacin (NADH, NADPH), pantotenska kiselina (koenzim A), piridoksin (piridoksal fosafat), biotin (biotin), lipoična kiselina (lipoamid), folna kiselina (tetrahidrofolat), vit. B12 (kobalamin koenzim). PROSTETIČNE GRUPE enzimski kofaktori vezani za enzim nekovalentnim ili kovalentnim vezama HOLOENZIM katalitički aktivan enzim sa vezanim koenzimom ili jonima metala

22 Konfiguracija enzima - određene grupe aminokiselina formiraju udubljenje (aktivno mesto) u koje ulazi supstrat (ligand) i gde se odvija reakcija. Aktivno mesto i supstrat su strogo specifični i ponašaju se kao ključ i brava. Aktivno mesto enzima se formira u tercijernoj strukturi enzima prostornim približavanjem AK koje u primarnoj strukturi mogu biti vrlo udaljene. Aktivno mesto ima dve uloge (1) vezivanje supstrata i (2) kataliza. Regulatorno mesto

23 Mehanizam pomoću koga enzim može biti povremeno aktivan ili inaktivan je poznat kao alosterička interakcija.

24 Inhibicija povratnom spregom biološka kontrola. Produkt u nekoj reakciji se ponaša kao efektor inhibirajući funkciju jednog od enzim. Kompetitivna inhibicija jedinjenje slično supstratu, zauzima aktivno mesto i inhibira delovanje enzima (delovanje lekova i bakterijskih enzima, sprečavanje neurotransmisije, acetil holin esteraza). Nekompetitivna inhibicija - supstance koje nisu slične substratu, vezuju se za enzim, izazivaju promenu u aktivnom mestu enzima i on ne prepoznaje supstrat (delovanje otrova, arsen, živa, cijanidi).

25 INTERAKCIJA PROTEINA I DNK Interakcije protein DNK pomoću slabih nekovalentnih veza PROTEINI KOJI PREPOZNAJU SEKUNDARNU STRUKTURU DNK 1. Proteini koji se vezuju za B zavojnicu Histoni DNK nukleozomi Hidrofobne interakcije i jonske veze Vezivanje za dvolančanu DNK, nespecifično za redosled nukleotida

26 2. Proteini koji prepoznaju jednolančanu DNK Razdvajanje lanaca DNK prilikom replikacije, transkripcije, rekombinacije SSB proteini, helikaze

27

28 A B Z 3. Proteini koji prepoznaju karakteristične konformacije DNK A, B ili C zavojnica Krstaste strukture Afinitet za vezivanje kružnih DNK molekula (bakterijski, mitohondrijski)

29 4. Proteini koji menjaju konformaciju DNK Topoizomeraza I Topoizomeraza II

30 PROTEINI KOJI PREPOZNAJU PRIMARNU STRUKTURU DNK Regulacija replikacije i transkripcije Palindromski nizovi ili invertovani ponovci u okviru DNK Prepoznavanje između bočnih lanaca aminokiselima u proteinima i specifičnih baznih parova u malom ili velikom žljebu DNK Regulatorni proteini domeni sa jakim afinitetom za specifične nizove nukleotida i domeni sa slabijim afinitetom za nespecifično vezivanje za bilo koji niz nukleotida

31