Имунопреципитација и имуноелектрофореза

Transcript

1 Имунопреципитација и имуноелектрофореза

2 Имунопреципитација Kraus, 1897 Heidelberger, Kendall, 1929 Oudin, 1946; Mancini, 1960; Laurell 1966 Денес клиничка примена во квалитативно и квантитативно одредување на серумски имуноглобулини

3 Соодветен квантитативен сооднос на антиген и антитело = преципитација (Oudin-ова реакција) Еквиваленција Течна и гел средина ph, температура, јонски сили, активитет...

4 Моновалентни антигени и моноклонални антитела = преципитација?

5 Преципитација во течна средина ( ring test ) Солубилни антигени и антитела Време = 5 мин.

6 Двојна имунодифузија на агар Бунарчиња со антигени и антитела Концентрациски градиент имунопреципитациска линија Идентификација на антиген и делумна квантификација Време = 48 часа

7 Една линија серумот содржи Ab специфични за Ag Повеќе линии хетерогеност на Ag и Ab Нема линија нема Ab специфични за Ag има Ab но не се способни да го преципитираат Ag концентрациите не се соодветни за да се постигне еквивалентност

8 Оддалеченостаналинијатазависиод концетрацијата на реагенсите и може да се калибрира со стандарди Дебелина на линијата Анализа на степен на идентичност на антигени

9

10 Пациент 3, лево, позитивен за кокидомикоза Пациенти 2 и 3, десно, позитивни за хистоплазмоза. Двете линии се појавуваат кај хронични случаи

11 Можности за различни експериментални модификации

12 Радијална (единечна) имунодифузија на агар Гел со фиксна концентрација на антитела Дифузија на антигенот до постигнување на еквиваленција Дијаметарнапрстен ~ концентрација на антиген. Зошто? Време = 48 часа

13

14 Комерцијални плочи и табели Одредување на IgG, IgA и IgM. Поретко IgD и IgE За кој дел од молекулата на одредуваното антитело се специфични антителата во агарот? За Fc фрагментите на тешкиот синџир

15 Имуноелектрофореза Електрофореза на серум во агар (1%) или агароза Додавање антисерум имунопреципитациска линија/линии Ниска резолуција Време = 48 часа

16

17 Диск полиакриламидна гел електрофореза (DPGE) Електрофореза на серум Акриламид( ) + N,N -метилен бисакриламид( ) полиакриламид( ) Висока резолуција Антисерум; Дензитометрија Време 4 часа

18 Аплициран примерок Нормален серум Серум без IgG Изолиран IgG Очекуван резултат по електрофореза Сите фракции на протеини се присутни Помалку дискови во гамаглобулинскиот дел Една интензивна линија во делот на имуноглобулините

19 Имунофиксациска електрофореза Електрофоретско одвојување преципитација во in situ моноспецифични серуми испирање боење Мonoclonal free lambda light chains detected in the gamma region

20 Еднодимензионална двојна електроимунодифузија (електропеципитација) Спонтана дифузија vs. движење под дејство на електрично поле Семиквантитативна Време = 30 мин.

21 Еднодимензионална единечна електроимунодифузија (Laurell-ова ракетна електрофореза) Агарозен гел со антитела Разредувања од серум Квантитативна висина на ракета ~ концентрација на Ag

22 Прва димензија сепарација на протеините со електрофореза Втора димензија - електроимунопреципитација

23 ИМУНОХЕМИСКИ И ИМУНОФИЗИЧКО-ХЕМИСКИ МЕТОДИ

24 Испитувања на промени во серумските протеини Имунохемиски и имунофизичко-хемиски разлики меѓу поеднинечните компоненти Техники: Хроматографија на колона Афинитетна хроматографија Јоноизменувачка хроматографија Гел филтрација Вискозиметрија Детекција на: криоглобулини, пироглобулини, парапротеини, имунокомплекси

25 Хроматографија на колона изолирање на индивидуални компоненти (имуноглобулини) од смеси (серум) Стаклена цевка (d= mm.; h= cm.) Стационарна фаза (адсорбант) Материјал кој се испитува Мобилна фаза (елуент)

26 Аплициран серум Физичко-хемиските карактеристики на протеините одредуваат колку време ќе се задржуваат односно пропуштаат низ матриксот на смолата

27 Јоноизменувачка хроматографија Разлики во наелектризираноста на различните протеини Гел = наелектризирана група врзaна за носач (целулоза, декстран, акрилски кополимери...) Анјонска јоноизменувачка хроматографија Катјонска јоноизменувачка хроматографија

28 Промени во пуферот (елуентот) кој протекува низ колоната: моларитет број на јони од пуферот кои конкурираат со протеините за поврзување со гелот промена на ph промена во наелектризираноста на протеините во примерокот Анимација 1 Анимација 2

29 Моларност на NaCl Хроматографија на серум на DEAE-целулоза ph Елуиран протеин IgG Трансферин IgA, албумини, α-2 глобулини Албумини, α-2 глобулини, β липопротеини α-2 глобулини, β глобулини, хептаглобулини IgM, β липопротеини, β глобулин

30 Гел филтрација Раздвојување врз основа на молекулската маса Гел зрна декстран (различни типови различни димензии на порите) Елуација распоред според тоа како се намалува молекулската маса на протеините

31 Примена: Одвојување на IgM од другите Ig. Зошто? Одвојување на тешки од лесни синџири За приближно одредување на молекуската маса на непознати протеини. Како? Molecular weight vs. elution volume. Plot of molecular weight of proteins against their elution volume from a gel filtration column. Proteins are yeast alcohol dehydrogenase (150 kd), bovine serum albumin (66 kd), carbonic anhydrase (29 kd), and cytochrome c (12.4 kd). Анимација 1 Анимација 2

32 Афинитетна хроматографија Добивање гел = ковалентно поврзување на одговарачки врзувач со носач (смола од агароза, декстран...) Елуација со промена на експерименталните услови Пример: изолирање серумски антитела со смола за која е врзан антиген (протеин А од S. aureus IgG1, 2, 4)

33 Анимација

34 Парапротеин имуноглобулински продукт од моноклонски плазма клетки - при хронични инфламаторни процеси, мултипла миелома, лимфома... протеини во плазма вискозност на серум Освалдов вискозиметар

35 Постапка: Се работи во водена бања на 37 С Примерокот од серум се пушта да протече низ капиларната цевка на вискозиметарот. Притоа се мери времето за кое течноста патува од точката А до точката В Истото се повторува со дестилирана вода како примерок Се пресметува релативната вискозност на серумот која е сооднос од брзина на проток на серумот (s) / брзина на проток на водата (s) Нормални вредности:

36 Криоглобулини абнормални протеини (моноклонални имуноглобулини, имунокомплекси со IgM) асоцирани со: Мултипен миелом Автоимуни пореметувања Хронични инфекции Реуматоидни заболувања Реверзибилна преципитација на ладно симптоми

37 Cryoglobulinemia is caused by an abnormal protein that is occasionally found in the blood of people with multiple myeloma, leukemia, and certain forms of pneumonia. It causes blood to gel at low temperatures. In this picture, cryoglobulinemia has reduced blood flow in the fingers so much the fingers have turned dark; the black areas are gangrene resulting from lack of blood flow.

38 Постапка на детекција: Колектирање крв со загреан шприц и чување на 37 С докоагулација Издвојување серум Чување на серумот на 4 С, 78 часа до 7 дена појава на преципитат од криоглобулини Квантификација на криопреципитатот: Употреба на криокрит Одредување на конц. на протеини пред и по криопреципитација Растворање на преципитатот во кисел пуфер и мерење апсорпција на 280 nm

39 Пироглобулини атипични моноклонски имуноглобулини (обично IgM) кои иреверзибилно преципитираат на 56 С Асоцирани со мултипна миелома и макроглобулинемија Детекција загревање на примерок од серум

40 Имунокомплекси и нивна детекција Реуматоидни, хематолошки и болести на бубрезите (пр. гломерулонефритис) Имунохистолошки техники Методи за детекција: Физички ултрацентрифугирање, гел филтрација, таложење со полиетилен гликол, спектрофотометриски Интеракцијанаимунокомплексoт соc1q рецептор Интеракција на имунокомплексот со кл. рецептори (пр. Fc)

41 ВРЗУВАЧ-ЛИГАНД ТЕСТОВИ

42 Ligand-binding assay, заситувачки методи, компетитивен тест... Yalow и Berson, 1960 radioimmunoassay (RAI) за определување на хуман инсулин во серум Еkins, 1960 методзаопределувањена тироксин во серум Engvall и Permann, ELISA Одредување на: хормони, лекови, туморски маркери, антитела...

43 Радиоимунотест radioimmunoassay (RIA) Tехника (фаза на калибрација): Подготовка на мешавина од радиоактивен антиген ( 125 I или 131 I во тирозинските резидуи на протеинот) и антитела( first antibody ) специфични за тој антиген Серија на познати количини на необележан ( cold ) антиген се додава на поединечни примероци од горенаведената мешавина Необележаниот антиген компетира со радиоактивниот антиген за врзување со антителата конц. на необележан антиген бр. на радиоактивни антигени истиснати од врзните места на антителата

44 Tехника (фаза на калибрација): Одвојување на комплексите антигенантитело од слободните антигени (во супернатант) Мерење радиоактивност на поединечните примероци (γ-бројач) Стандардна крива на поврзување

45 Tехника: Паралелно со стандардите, примероци со иста количина од смесата (радиоактивен антиген и антитело) + непозната количина на необележан антиген ( unknowns ) Мерење радиоактивност и отчитување од стандардна крива

46 Техники за одвојување на слободен антиген: Aнтителата специфични за антигените може да бидат врзани за ѕидовите на епруветата инкубација измивање на слободните антигени мерење радиоактивност на двете фракции Антителата специфични за антигените може да бидат врзани за инертни честички (пр. Sephadex) центрифуирање по инкубација слободните антигени во супернатант, врзаните во талог

47 Техники за одвојување на слободен антиген: Додавање на второ ( second ) антитело специфичнозапрвото ( first antibody ) преципитација на комплексите антигенантитело-антитело, а неврзаните антигени остануваат во супернатант Сензитивност идо неколку pg (10-12 g) на антиген. Радијација!

48

49 Ензимо-имуно тест - Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay (ELISA) (EIA) Детекција на антиген или антитело во примерок Примена: Детекција на: HIV, hepatitis B, hepatitis C, сифилис, хламидија, алергени, реуматоидни фактори, кокаин, опијати (пр. Δ-9- tetrahydrocannabinol), Тoxoplasma gondii Mерење нивоа на: HCG, LH, TSH, T 3, T 4, стероидни хормони...

50 Техника ( sandwich ELISA): Специфични антитела за одредуваниот антиген се фиксираат за подлога (дно на пластично бунарче) Се подотвува и раствор од антитела специфични за антигенот* кои се конјугирани со ензим (пр. β-галактозидаза која конвертира необоен/нефлуоросцентен супстрат во обоен/флуоросцентен продукт)

51

52 Техника ( sandwich ELISA): Во бунарчињата се додава течноста (пр. урина, серум...) која ги содржи одредуваните антигени Врзување на антиген со антитело Се додаваат антителата конјугирани со ензим антитело-антиген-антитело сендвич Измивање и додавање супстрат Стопирање на р-ја конц. на антиген ~ апсорпција/флуорес.

53 Техника (мерење конц. на антитела со ELISA): Бунарчињата се обложени со соодветен антиген Се додава растворот (пр. серум) кој ги содржи антителата врзување антиген-антитело Се додава анти-имуноглобулин конјугиран со ензим измивање Се додава супстрат за ензимот Интензитет на обојување ~ конц. на антитело

54

55 Техника (индиректна ELISA): Се аплицираат познати количини од даден антиген на дното од пластични бунарчиња адсорпција на антигените Се аплицираат примероци од серум кои содржат непознати количини од дадениот антиген инкубација (неспецифична фиксација на антигенот за бунарчето) Измивање се додава конц. р-р одbsa во бунарчињата за да се спречи неспецифична адсорпција од страна на други протеини Се додаваат специфични антитела за антигенот антитела конјугирани со ензим измивање супстрат мерење Ензимот делува како појачувач (amplifier)

56

57 ELISA standard curve. Аb14004 used as primary antibody (0.1µg/ml), human C1q used as test antigen and a goat anti IgY-HRP as a secondary antibody.

58 Техника компетитивна ELISA Анимација

59 Директна ELISA? (едно антитело конјугирано со ензим vs. две антитела) Предности Мани

60

61 Пример детекција на HIV Анимација 1 Анимација 2 Анимација 3

62 ИМУНОФЛУОРЕСЦЕНЦИЈА И ПРОТОЧНА ЦИТОМЕТРИЈА

63 Имунофлуоросценција хистохемиска и цитохемиска техника Coons исор., 1942

64 Подготовка на препарат Фиксација на клетките: Метанол цитоскелет Формалдехид мембрански асоцирани компоненти Параформалдехид/глутаралдехид мембранскиицитоскелетниантигени Боење: Пермеабилизација Triton X-100 Инкубација со флуоросцентно антитело

65 Техники на боење Директна имунофлуоросценција антиген на препаратот антитело со врзана флуоресцентна молекула Индиректна имунофлуоросценција антиген на препаратот антитело антитело со врзана флуоросцентна молекула

66

67 Техники на боење Систем биотин-авидин антиген антитело врзано со биотин додавање на авидин врзан со флуоресцентна молекула = антиген антитело биотин авидин флуоросцентна молекула Антитела обележани со ензим Авторадиографија

68 Флуоросцентен микроскоп

69 Делба на хумана канцер клетка

70 Ендотелна клетка од пулмонарна артерија на говедо (јадра-сино, микротубулизелено, актински филаментицрвено)

71 Јадро на хуман лимфоцит (хромозом 13- зелено, центриолицрвено)

72 ЕР обележан со моноклонално антитело на кокошкина Ca-ATP-аза

73 Детекција на хумани IgA околу капиларите на хистолошки препарат од кожа

74 Tutorials Basics of fluorescence Interpretation of spectra Light filters and sources Microscope simulator

75 Проточна цитометрија Principles of flow cytometry Data analysis for flow cytometry

76 АГЛУТИНАЦИЈА. КОМПЛЕМЕНТ

77 Gruber-Durham реакција, 1896 Аглутинација agglutinare - да се залепи за агрегација на кл. (RBCs, бактерии) со додавање на аглутинин (се врзува за повеќе од еден антиген истовремено) Landsteiner, 1900 ABO систем; Хемаглутинација Денес клиничка примена; техники со висока осетливост; квалитативни, семиквантитативни

78 Аглутинациони тестови (латекс аглутинација, коагрегација): Нерастворливи антигени или честичка (од латекс, бактерија) поврзана со антиген (или антитело) Примерок (серум, CSF) којможедагосодржи специфичното антитело (или антиген)

79 Услови за одвивање на реакцијата на аглутинација (реверзибилен процес): Достапни антигени (пр. А vs. D-30000) Квантитет на антитела (пр. IgM-25 vs. IgG ) Сооднос антиген/антитело Оптимални температурни граници ph Јонски сили Време на инкубација Промешување, центрифугирање

80 Аглутинациски техники: Директни нерастворливи антигени; пр. RBCs од човек со крвна група А и серум од човек со крвна група B Индиректни (пасивни) растворливи антигени врзани за пасивни носачи Ниска цена; брзина; интерференција

81 Тест за директна аглутинација Директно аглутинирање на RBCs, бактерии, габи и сл. со серумски антитела Квантификација на концентрацијата на антитела Серија разредувања од серумот + фиксна количина од антигенот Максималното разредување кое дава аглутинација титар

82 Резултат - реципрочна вредност од максималното разредување Prozone ефект висока конц. на антитело (мало разредување) = нег.; поголемо разредување = поз. (пациент 6); конц. Ab + Ag = мали, незабележливи комплекси

83

84 Тест за пасивна аглутинација

85

86 Материи кои спонтано се адсорбираат на RBCs Антигени од E. Coli Липополисахариди од N. meningitidis Ендотоксин од Mycoplasma sp. Вируси Антибиотици DNA Материи со кои може да се обложат RBCs HCG Антиген Антигени од полен Серумски протеини, тиреоглобулин... Начин на врзување 1,3-дифлуоро-4,6-динитро бензен Бисдиазот бензидин Под дејство на танинска киселина

87 Инхибиција на хемаглутинација Растворливи антигени способност да ја инхибираат аглутинацијата на RBCs (обложени со ист антиген) со антитело Фиксна количина на RBCs обложени со антигенсепомешуваатсофикснаколичина антитела во сите проби Во сите се додава испитуван примерок со непозната количина на антиген компетиција Квантификација серија разредувања на примерокот и одредување титар

88

89

90 Кумбсов (Coomb s) тест (AGT); 1945 Кумбсов реагенс антихуман глобулин Антиген/антитело сооднос, електрични полнежи на RBCs нема вкрстување (аглутинација) на клетките со антителата (иако се врзани за антигените) Додавање антитело специфично за некомплетните антитела (најчесто IgG) = аглутинација

91 Директен Кумбсов тест (DAT) примерокот содржи RBCs обложени со неаглутинирачки антитела Индиректен Кумбсов тест (IAT) примерокот (серумот) содржи некомплетни антитела

92

93 Примена: Детекција на автоантитела (со DAT) при имуно-посредувана хемолитичка анемија, SLE... Детекција на анти-rh-антитела на површината на RBCs од новороденче со DAT IAT тестирање за компитабилност при трансфузија, детекција на Rh-антитела во серум кај бремени жени...

94 Повеќе информации: g/tmu2000/tmu htm

95 Систем на комплементот

96

97 Хемолитички тест ја мери активноста на комплементот (најчесто способноста да лизира 50% од обложени RBCs) Oвчи RBCs (Е), Ab специфични за нив (А), серум од заморче-извор на комплемент (К) Серија на стандарди разредувања од К и фиксни количини од Е и А Проби фиксни количини од Е и А и серум (синовијална течност...) од пациент како извор на комплемент во различни разредувања

98 Резултати од хемолитички тест апсорпција = хемолиза (бр. на лизирани Е) Стандардна (контролна) крива (сигмоидна) апсорпција vs. количина на К 100% лиза = max. апсорпција Резултат рец. вредност од разредувањето на серумот кое дава 50% (или 100%) хемолиза = СН50 (СН100)

99 Обложени RBCs; Отсутен извор на комплемент

100 Примена на тестот Следење на автоимуни заболувања (SLE активност) Реуматоиден артритис (серум - нормална; синовијална течност - намалена) Зголемена активност при: канцер, некои инфекции, улцеративен колитис... Намалена активност при: цироза, гломерулонефритис, хепатитис, отфрлање на трансплантиран бубрег...

101 Автоматизиран СН50 кит имунопосредувана лиза на липозоми Липозоми содржат G6PDH и се обложени со DNP Смеса: Липозоми Антитела (специфични за DNP) Примерок од пациент кој содржи комплемент Супстрат =NAD и G6P - (NAD NADH A 340 )

102 Фиксација на комплементот детекција на специфично антитело или антиген во серум; најмала хемолитичка доза Систем од: серум (со или без одредуваното антитело), антиген, овчи RBCs обложени со антитела, комплемент (опционално)

103

104 Complement Fixation Ag mixed with test serum to be assayed for Ab Standard amount of complement is added Erythrocytes coated with Abs is added Amount of erythrocyte lysis is determined Ag No Ag Ag Ag Patient s serum

105 ОДРЕДУВАЊЕ НА КОНЦЕНТРАЦИЈА НА ИМУНОГЛОБУЛИНИ Принцип: Цинкот од растворот на цинк сулфат (ZnSO 4 xh 2 0) се поврзува за Fc фрагментите на имуноглобулините од примерокот и предизвикува заматување. Колку е поголема концентрацијата на имуноглобулини, толку е поинтензивно заматувањето. Се квантифицира спектрофотометриски. Потребни материјали: Раствор на цинк сулфат (ZnSO 4 xh 2 0) со концентрација 208 mg/ml; Дејонизирана вода (превриена минути, за да се отстрани јаглерод диоксидот); Сталак со епрувети; Сталак со епендорфи (2 ml); Ножички; Конец; Греалка; Wistar стаорци; Памук; Пипета ( μl); Спектрофотометриски кивети (семимикро); Раствор на бариум хлорид (1.15 g на BaCl 2 2H 2 O во 100 ml дејонизирана вода); 2% раствор на H 2 SO 4 ; Пипети (10 ml); Mензура (100 ml). Постапка: Се земаат примероци крв (од опашна вена) со волумен од најмалку 500 μl од три животни. Крвта се остава на собна температура да коагулира за време од 30 минути. Се центрифугира 10 минути на 2000 rpm за да се издвои серум. Во случај да се добие хемолитичен серум, постапката мора да се повтори. За секој примерок се подготвуваат по три епрувети на следниот начин: Бр. на епрувета Дејонизирана вода Серум Раствор на ZnSO 4 1 (контрола) 6 ml / / 2 6 ml 100 μl / 3 / 100 μl 6 ml Се земаат 3 ml од растворот на BaCl 2 и се дополнува до 100 ml со 2% раствор на H 2 SO 4. Вака подготвената мешавина има заматување кое одговара на раствор на имуноглобулини со концентрација од 20 g/l. Од неа се префрлаат 3 ml во епрувета и истата се обележува како стандарден раствор. Сите епрувети добро се промешуваат и се оставаат да стојат на собна температура за време од 60 минути. Потоа, уште еднаш добро се промешуваат и од секоја епрувета се префрла по 1 ml од содржината во спектрофотометриска кивета и се мери апсорбанца на бранова должина од 498 nm. Пресметување: Концентрацијата на имуноглобулините се пресметува по формулата: 20 ( апсорбанца на епрувета 3 апсорбанца на епрувета 2) Иг ( g / l) = апсорбанца на стандард