Употреба на антителата во научни и клиничкодијагностички

Transcript

1 Употреба на антителата во научни и клиничкодијагностички цели Одредување (во крв) на нивото на: Хормони Антитела Ензими Метаболити Антитела против непротеински антигени Специфични оштетувања на DNA Шеќери Липиди Витамини Јод 1

2 Дијагностика Детекција на пептиди и други молекули при разни заболувања Ендокрини: хиперинсулинемија, хиперпаратироидизам Туморски антигени: p53 тумор супресор, α- фетопротеин Антитела против вирусни протеини (HIV, хепатитис) Терапевтски цели Неутрализирачки антитела Анти-ErbB2 за канцер на дојка и овариуми Анти-CD20 за B-клеточна лимфома Антисеруми и антитела (за вируси и отрови) Терапевтски цели Антисеруми и противотрови (за убоди од змии и пајаци) Антитела поврзани со токсини, специфични за туморски антигени Антитела против автоимуни антитела Вакцини Анти-IgE и анти-igm за третман на алергии Биотероризам?... 2

3 Потреба од комплементарност и мало растојание Дефиниција за афинитет Моновалентно поврзување Висок vs низок афинитет Антигени-антитела Збир од нековалентни интеракции Зошто е важна позицијата на еквилибриумот? K a константа на афинитет Висок афинитет = М -1 3

4 Антигени-антитела K d =1/K a (висок афинитет = М) K d =10-9 nm поврзувачи, K d =10-6 μм поврзувачи (средно висок афинитет) Ензим-супстрат (K d =10-4 ) vs. високо спец. антитело (K d =10-12 ) k 1 [L/mol/s] и k -1 [1/s] 4

5 Ако половина од достапните антигени се поврзани со антитело [Ag]=[Ab-Ag complex] и K a =1/[Ab] или K d =[Ab] антителата се ефикасни во конц. близу нивната K d μм поврзувач ќе биде ефикасен кога е застапен во μm опсег на концентрации повеќе специфичности може да бидат покриени со nm поврзувачи Мултивалентно поврзување Експериментално одредување на К а Рамнотежна дијализа 5

6 [Ab t ] - познатa [Ab] = [Ab t ] [Ab-Ag complex] [Ab-Ag complex] = рад. (А) рад. (B) рад. (B) = [Ag] 6

7 7

8 Иста конц. на антитело, варирачки концентрации на лиганд 8

9 Авидитет - мерка за вкупната сила на мултивалентното поврзување (не е прост производ!) 9

10 За IgG (две поврзувачки места со идентичен афинитет) теоретски: Авидитет = K a x K a = (K a ) 2 = [Ag][Ab]/[Ag][Ab] Геометриски бариери Висок авидитет може да компензира низок афинитет (пр. IgG vs. IgM) Авидитет 10

11 Вкрстена реактивност Пр. ABO антигени; М антигени од S. pyogenes Површинска плазмонска резонанца (Surface Plasmon Resonance - SPR) Мерење на афинитет, стапка на реакција (во двете насоки) и одредување на концентрацијата на антитело Појава на електромагнетни бранови (површински плазмони) кои се пропагираат низ интерфејсот помеѓу метал и раствор Промена во интерфејсот (границата раствор-метал; пр. адсорпција на молекули) променети рефлектирачки карактеристики промена во природата на бранот 11

12 При одреден агол (резонантен) дел од инцидентната светлина се апсорбира од слојот злато и нејзината енергија се конвертира во плазмонски бранови пад во интензитетот на рефлектирана светлина Аголот зависи од: бојата на светлината, дебелината и кондуктивноста на металот, оптичките карактеристики на материјалот во близина на површината на металот Промената во резонантниот агол е пропорционална на бројот на поврзани антитела 12

13 13

14 Карактеризирање на епитопски својства со помош на SPR 14

15 Карактеризирање на епитопски својства со помош на SPR Сензитивност минимална конц. на антитела кои може да бидат детектирани со соодветната техника 15

16 Имунопреципитација Преципитини Kraus, 1897 Heidelberger, Kendall, 1929 Oudin, 1946; Mancini, 1960; Laurell 1966 Денес клиничка примена во квалитативно и квантитативно одредување на серумски имуноглобулини Имунопреципитација Соодветен квантитативен сооднос на антиген и антитело = преципитација (Oudin-ова реакција) Зона на еквивалентност Течна и гел средина Афинитет, авидитет, ph, температура, јонски сили, активитет... 16

17 Имунопреципитација Моновалентни антигени и моноклонски антитела = преципитација? 17

18 Имунопреципитација Преципитација во течна средина ( ring test ) Солубилни антигени и антитела Време = 5 мин. Имунопреципитација 18

19 Двојна имунодифузија на агар Бунарчиња со антигени и антитела Концентрациски градиент имунопреципитациска линија Идентификација на антиген и делумна квантификација Време = 48 часа 19

20 Една линија серумот содржи Ab специфични за Ag Повеќе линии хетерогеност на Ag и Ab Нема линија Нема Ab специфични за Ag Има Ab но не се способни да го преципитираат Ag Концентрациите не се соодветни за да се постигне еквивалентност Оддалеченоста на линијата зависи од концетрацијата на реагенсите и може да се калибрира со стандарди Дебелина на линијата (квантитативност?) Анализа на степен на идентичност на антигени 20

21 21

22 Радијална (единечна) имунодифузија на агар Гел со фиксна концентрација на антитела Дифузија на антигенот до постигнување на еквиваленција Дијаметар на прстен ~ концентрација на антиген. Зошто? Време = 48 часа 22

23 Радијална (единечна) имунодифузија на агар Комерцијални плочи и табели Одредување на IgG, IgA и IgM, поретко IgD и IgE За кој дел од молекулата на одредуваното антитело се специфични антителата во агарот? 23

24 Имуноелектрофореза Електрофореза на серум во агар (1%) или агароза Додавање антисерум имунопреципитациска линија/линии Ниска резолуција Време = 48 часа 24

25 Еднодимензионална единечна електроимунодифузија (Laurell-ова ракетна електрофореза) Агарозен гел со антитела Квантитативна висина на ракета ~ концентрација на Ag Gruber-Durham реакција, 1896 Аглутинација agglutinare - да се залепи за агрегација на кл. (RBCs, бактерии) со додавање на аглутинин (се врзува за повеќе од еден антиген истовремено) Landsteiner, 1900 ABO систем; Хемаглутинација Денес клиничка примена; техники со висока осетливост; квалитативни, семиквантитативни 25

26 Два ER, во изотоничен р-ор, не можат да се доближат на пократко растојание од Å Услови за одвивање на реакцијата на аглутинација (реверзибилен процес): Достапни антигени Квантитет на антитела (пр. IgM-25 vs. IgG-20000) Сооднос антиген/антитело Оптимални температурни граници ph Јонски сили Време на инкубација Промешување, центрифугирање 26

27 Аглутинациски техники Директни нерастворливи антигени (пр. мембрански); пр. RBCs од човек со крвна група А и серум од човек со крвна група B Индиректни (пасивни) растворливи антигени врзани за пасивни носачи Ниска цена; брзина; интерференција 27

28 Тест за директна аглутинација Директно аглутинирање на RBCs, бактерии, габи и сл. со серумски антитела Квантификација на концентрацијата на антитела Серија разредувања од серумот + фиксна количина од антигенот Максималното разредување кое дава аглутинација титар Резултат - реципрочна вредност од максималното разредување Prozone ефект висока конц. на антитело (мало разредување) = нег.; поголемо разредување = поз. (пациент 6); некомплетни антитела; моноклонски vs. поликлон.; ограничена подвиж.; расп. на епитопи 28

29 Индиректна аглутинација - аглутинациски тестови (латекс аглутинација, коагрегација) Обложени RBCs или честичка (од латекс, бактерија) обложена со антигени (или антитела) Примерок (серум, CSF) кој може да го содржи специфичното антитело (или антиген) Инхибиција на хемаглутинација Растворливи антигени способност да ја инхибираат аглутинацијата на RBCs (обложени со ист антиген) под дејство на антитела 1. Примерок со антиген (крв, урина...) + специфично антитело 2. Честици обложени со истиот антиген Отсуство на аглутинација = позитивен резултат Квантификација серија разредувања на примерокот и одредување титар 29

30 Инхибиција на хемаглутинација Инхибиција на хемаглутинација 30

31 Инхибиција на хемаглутинација Примена: Детекција на автоантитела (со DAT) при имуно-посредувана хемолитичка анемија, SLE... Детекција на анти-rh-антитела на површината на RBCs од новороденче со DAT IAT тестирање за компатибилност при трансфузија, детекција на Rh-антитела во серум кај бремени жени... 31

32 Ligand-binding assay, заситувачки методи, компетитивен тест... Yalow и Berson, 1960 radioimmunoassay (RIA) за определување на хуман инсулин во серум Еkins, 1960 метод за определување на тироксин во серум Engvall и Permann, ELISA Одредување на: хормони, лекови, туморски маркери, антитела... Радиоимунотест Radioimmunoassay (RIA) Подготовка на мешавина од радиоактивен антиген ( 125 I или 131 I во тирозинските резидуи на протеинот) и антитела ( first antibody ) специфични за тој антиген Серија на познати количини на необележан ( cold ) антиген (стандардни раст.) се додава на поединечни примероци од горенаведената мешавина Необележаниот антиген компетира со радиоактивниот антиген за врзување со антителата конц. на необележан антиген бр. на радиоактивни антигени истиснати од врзните места на антителата 32

33 Одвојување на комплексите антигенантитело од слободните антигени (во супернатант) Мерење радиоактивност на поединечните примероци (γ-бројач) Стандардна крива на поврзување Паралелно со стандардите, примероци со иста количина од смесата (радиоактивен антиген и антитело) + непозната количина на необележан антиген ( unknowns ) Мерење радиоактивност и отчитување од стандардна крива 33

34 Техники за одвојување на слободните од поврзаните антигени Додавање на второ ( second - 2) антитело специфично за првото ( first antibody -1) преципитација на комплексите антиген-антитело1-антитело2, а неврзаните антигени остануваат во супернатантот Сензитивност и до неколку pg (10-12 g) на антиген. Радијација! 34

35 Техники за одвојување на слободните од поврзаните антигени Aнтителата специфични за антигените може да бидат поврзани за ѕидовите на епруветата инкубација измивање на слободните антигени мерење радиоактивност на двете фракции Антителата специфични за антигените може да бидат врзани за инертни честички (пр. Sephadex) центрифуирање по инкубација слободните антигени во супернатантот, врзаните во талогот Ензимо-имуно тест - Enzyme-Linked Immuno Sorbent Assay (ELISA) (EIA) Детекција на антиген или антитело во примерок Примена: Детекција на: HIV, hepatitis B и C, сифилис, хламидија, алергени, реуматоидни фактори, кокаин, опијати (пр. Δ-9- tetrahydrocannabinol), Тoxoplasma gondii Mерење нивоа на: HCG, LH, TSH, T 3, T 4, стероидни хормони... 35

36 Системи за визуелизација HRP 36

37 ELISA standard curve Аb14004 used as primary antibody (0.1µg/ml), human C1q used as test antigen and a goat anti IgY-HRP as a secondary antibody. 37

38 38

39 Имунофлуоросценција хистохемиска и цитохемиска техника Coons и сор., Подготовка на препарат Фиксација на клетките Метанол цитоскелет Формалдехид мембрански асоцирани компоненти Параформалдехид/глутаралдехид мембрански и цитоскелетни антигени Боење Пермеабилизација Triton X-100 Инкубација со флуоросцентно антитело 39

40 Техники на боење Директна имунофлуоросценција антиген на препаратот антитело со ков. поврзана флуоресцентна молекула Индиректна имунофлуоросценција антиген на препаратот примарно антитело секундарно антитело со ковалентно поврзана флуоросцентна молекула Зошто индиректна имунофлуоресценција? Проблеми со специфичноста на примарното антитело Слабо експресирани антигени 40

41 Техники на боење Систем биотин-авидин антиген антитело поврзано со биотин додавање на авидин поврзан со флуоресцентна молекула = антиген антитело биотин авидин флуоросцентна молекула Антитела обележани со ензим или со колоидно злато Авторадиографија Флуоросцентен микроскоп 41

42 Делба на хумана канцер клетка Ендотелна клетка од пулмонарна артерија на говедо (јадрасино, микротубулизелено, актински филаментицрвено) 42

43 Јадро на хуман лимфоцит (хромозом 13- зелено, центриолицрвено) Детекција на хумани IgA околу капиларите на хистолошки препарат од кожа 43

44 Проточна цитометрија 44