Pseudomonas: Μεραληζκνί Παζνγέλεηαο

Transcript

1 ΑΡΗΣΟΣΔΛΔΗΟ ΠΑΝΔΠΗΣΖΜΗΟ ΘΔΑΛΟΝΗΚΖ ΥΟΛΖ ΘΔΣΗΚΧΝ ΔΠΗΣΖΜΧΝ ΣΜΖΜΑ ΒΗΟΛΟΓΗΑ ΠΡΟΓΡΑΜΜΑ ΜΔΣΑΠΣΤΥΗΑΚΧΝ ΠΟΤΓΧΝ ΔΦΑΡΜΟΜΔΝΖ ΓΔΝΔΗΚΖ ΚΑΗ ΒΗΟΣΔΥΝΟΛΟΓΗΑ ΜΔΣΑΠΣΤΥΗΑΚΖ ΔΡΓΑΗΑ Pseudomonas: Μεραληζκνί Παζνγέλεηαο ΜΠΑΜΠΔΣΑ ΜΑΡΗΑ ΤΠΟΣΡΟΦΟ ΗΚΤ Δπηβιέπνπζα Καζεγήηξηα: ηβξνπνύινπ Αθξνδίηε (Ακαπθδνχηνζα ηαεδβήηνζα ηιήιαημξ Βζμθμβίαξ ΑΠΘ) Θεζζαινλίθε 2013

2 Δπηβιέπνπζα Καζεγήηξηα: ηβξνπνύινπ Αθξνδίηε (Ακαπθδνχηνζα ηαεδβήηνζα ηιήιαημξ Βζμθμβίαξ ΑΠΘ) Σξηκειήο εμεηαζηηθή επηηξνπή: ηβξνπνύινπ Αθξνδίηε (Ακαπθδνχηνζα ηαεδβήηνζα ηιήιαημξ Βζμθμβίαξ ΑΠΘ) Αξζελάθεο Μελάο (Καεδβδηήξ ηιήιαημξ Βζμθμβίαξ ΑΠΘ) Γηάγθνπ Μελάο (Καεδβδηήξ ηιήιαημξ Βζμθμβίαξ ΑΠΘ) 2

3 Δπραξηζηίεο Ζ πανμφζα ιεηαπηοπζαηή δζαηνζαή εηπμκήεδηε ζημ Δνβαζηήνζμ Γεκζηήξ Μζηνμαζμθμβίαξ ημο Σιήιαημξ Βζμθμβίαξ ημο Ανζζημηέθεζμο Πακεπζζηδιίμο Θεζζαθμκίηδξ ζηα πθαίζζα ημο ιεηαπηοπζαημφ πνμβνάιιαημξ ζπμοδχκ Δθανιμζιέκδ βεκεηζηή ηαζ αζμηεπκμθμβία. Ανπζηά εα ήεεθα κα εοπανζζηήζς ζδζαίηενα ηδκ ακαπθδνχηνζα ηαεδβήηνζα η. ζανμπμφθμο Αθνμδίηδ, αθεκυξ βζα ηδκ ειπζζημζφκδ πμο ιμο έδεζλε ηαζ ιμο ακέεεζε ηδ ζοβηεηνζιέκδ ενβαζία ηαζ αθεηένμο βζα ημ εκδζαθένμκ ηαζ ηδκ οπμιμκή πμο επέδεζλε ηαε υθδ ηδ δζάνηεζα ηδξ ζοκενβαζίαξ ιαξ, ηυζμ ζε ενβαζηδνζαηυ επίπεδυ ιε ηδκ πνμεοιία ηδξ κα ιμο ιάεεζ ηεπκζηέξ υζμ ηαζ ζε ζοββναθζηυ επίπεδμ ηδξ πανμφζαξ δζαηνζαήξ. Αηυια εα ήεεθα κα εοπανζζηήζς ημκ ηαεδβδηή η.ανζεκάηδ Μδκά βζα ηζξ εφζημπεξ παναηδνήζεζξ, ηζξ ζοιαμοθέξ ηαζ ηδκ ειπζζημζφκδ πμο ιμο έδεζλε, ηαε υθδ ηδ δζάνηεζα ηςκ πεζναιάηςκ, υπςξ επίζδξ ηαζ βζα ηδ ζοιιεημπή ημο ζηδκ ελεηαζηζηή επζηνμπή ηδξ πανμφζαξ ενβαζίαξ. Θα ήεεθα επίζδξ κα εοπανζζηήζς ημκ ηαεδβδηή η.γζάβημο Μδκά βζα ημ εκδζαθένμκ, ημ πνυκμ πμο ιμο αθζένςζε ηαζ βζα ηδκ οπμζηήνζλδ ημο, ηυζμ ζε επίπεδμ εηπαζδεοηζηυ υζμ ηαζ ζε οθζηυ, ηαεχξ ηαζ βζα ηδ ζοιιεημπή ημο ζηδκ ελεηαζηζηή επζηνμπή ηδξ πανμφζαξ ενβαζίαξ. Αηυια, εα ήεεθα κα εοπανζζηήζς ημκ επίημονμ ηαεδβδηή η.πακηενή Διιακμοήθ βζα ημκ πνυκμ, ηδ αμήεεζα ηαζ ηα οθζηά πμο ιμο πνμζέθενε βζα κα δζελαπεεί ιένμξ ηςκ πεζναιάηςκ ηδξ πανμφζαξ ιεηαπηοπζαηήξ ενβαζίαξ. Δπζπθέμκ, εα ήεεθα κα εοπανζζηήζς ημοξ οπμρήθζμοξ δζδάηημνεξ Σζζβανίδα Κχζηα ηαζ Κακαηά Δζνήκδ βζα ηδκ ηαεμδήβδζδ ημοξ ηαζ ηδ αμήεεζα ημοξ ζε ιένμξ ηςκ πεζναιάηςκ. Δπίζδξ, εοπανζζηχ ηα ιέθδ ημο ενβαζηδνίμο Γεκζηήξ Μζηνμαζμθμβίαξ βζα ηδκ άρμβδ ζοκενβαζία ιαξ. Αηυια εοπανζζηχ ημ Ίδνοια Κναηζηχκ Τπμηνμθζχκ δζυηζ, δ μθμηθήνςζδ ηδξ ενβαζίαξ αοηήξ έβζκε ζημ πθαίζζμ ηδξ οθμπμίδζδξ ημο ιεηαπηοπζαημφ πνμβνάιιαημξ ημ μπμίμ ζοβπνδιαημδμηήεδηε ιέζς ηδξ πνάλδξ «Πνυβναιια πμνήβδζδξ οπμηνμθζχκ ΗΚΤ ιε δζαδζηαζία ελαημιζηεοιέκδξ αλζμθυβδζδξ» αηαδ. έημοξ απυ πυνμοξ ημο Δ.Π. «Δηπαίδεοζδ ηαζ Γζα Βίμο Μάεδζδ» ημο Δονςπαίημο Κμζκςκζημφ Σαιείμο (ΔΚΣ) ηαζ ημο ΔΠΑ ( ). Σέθμξ εοπανζζηχ ηδκ ιδηένα ιμο βζα ηδκ οπμζηήνζλδ ηδξ ζε ηάεε ιμο επζθμβή ηαζ ηδκ οπμιμκή πμο έδεζλε υθμ αοηυ ημ δζάζηδια. 3

4 Βηβιηνγξαθία ΒΙΒΛΙΟΓΡΑΥΙΑ 4 ΠΕΡΙΛΗΨΗ 7 ABSTRACT 8 1. ΕΙΑΓΩΓΗ ΓΕΝΟ PSEUDOMONAS ΣΑΞΙΝΟΜΙΗ ΣΩΝ ΒΑΚΣΗΡΙΩΝ ΣΟΤ ΓΕΝΟΤ PSEUDOMONAS ΜΕ ΣΑ ΣΗ ΧΡΗΗ ΣΩΝ ΓΟΝΙΔΙΩΝ gyrb, ropb, ΚΑΙ ropd ΗΜΑΝΣΙΚΟΣΕΡΑ ΕΙΔΗ ΣΟΤ ΓΕΝΟΤ PSEUDOMONAS ΠΑΘΟΓΟΝΟ ΔΡΑΗ ΣΩΝ ΨΕΤΔΟΜΟΝΑΔΩΝ ΚΤΡΙΟΣΕΡΑ ΝΟΗΜΑΣΑ ΠΟΤ ΟΦΕΙΛΟΝΣΑΙ Ε ΒΑΚΣΗΡΙΑ ΣΟΤ ΓΕΝΟΤ PSEYDOMONAS ΕΚΚΡΙΗ ΠΡΩΣΕΪΝΩΝ ΣΑ ΑΡΝΗΣΙΚΑ ΚΑΣΑ GRAM ΒΑΚΣΗΡΙΑ ΠΕΡΙΓΡΑΦΗ ΣΟΤ ΕΚΚΡΙΣΙΚΟΤ ΤΣΗΜΑΣΟ ΙΙΙ ΜΗΧΑΝΙΜΟ ΜΕΣΑΦΟΡΑ ΣΟ ΚΤΣΣΑΡΟΠΛΑΜΑ ΣΟΤ ΞΕΝΙΣΗ ΜΟΛΤΜΑΣΙΚΟΙ ΠΑΡΑΓΟΝΣΕ ΚΑΙ ΠΑΘΟΓΕΝΕΙΑ ΣΟ ΤΣΗΜΑ ΕΚΚΡΙΗ ΣΤΠΟΤ VI ΕΚΚΡΙΣΙΚΟ ΤΣΗΜΑ ΣΤΠΟΤ VI ΚΑΙ ΠΑΘΟΓΕΝΕΙΑ ΚΟΠΟ ΕΡΓΑΙΑ 32 2.ΤΛΙΚΑ ΚΑΙ ΜΕΘΟΔΟΙ ΣΑΞΙΝΟΜΙΗ ΑΠΟΜΟΝΩΗ ΟΛΙΚΟΤ DNA ΣΟΤ ΒΑΚΣΗΡΙΟΤ ΑΛΤΙΔΩΣΗ ΑΝΣΙΔΡΑΗ ΠΟΛΤΜΕΡΑΗ ΚΑΘΑΡΙΜΟ ΕΛΕΓΧΟ ΣΕΛΙΚΟΤ ΠΡΟΪΟΝΣΟ ΧΡΗΗ ΕΡΓΑΛΕΙΩΝ ΒΙΟΠΛΗΡΟΦΟΡΙΚΗ ΓΙΑ ΣΗΝ ΣΑΤΣΟΠΟΙΗΗ ΣΟΤ ΒΑΚΣΗΡΙΑΚΟΤ ΣΕΛΕΧΟΤ P.A ΒΙΟΧΗΜΙΚΟΙ ΕΛΕΓΧΟΙ ΓΙΑ ΣΗΝ ΣΑΤΣΟΠΟΙΗΗ ΣΟΤ ΒΑΚΣΗΡΙΑΚΟΤ ΣΕΛΕΧΟΤ P.A ΤΣΗΜΑΣΑ ΣΑΤΣΟΠΟΙΗΗ - API 20NE ΑΝΘΕΚΣΙΚΟΣΗΣΑ ΣΟΤ ΒΑΚΣΗΡΙΑΚΟΤ ΣΕΛΕΧΟΤ P.A1 ΣΑ ΒΑΡΕΑ ΜΕΣΑΛΛΑ ΠΑΘΟΓΕΝΕΙΑ ΣΟΤ ΒΑΚΣΗΡΙΑΚΟΤ ΣΕΛΕΧΟΤ P.A1 42 4

5 ΕΛΕΓΧΟ ΓΙΑ ΣΗΝ ΤΠΑΡΞΗ ΚΑΨΟΤΛΑ ΣΟ ΒΑΚΣΗΡΑΚΟ ΣΕΛΕΧΟ P. A ΕΠΙΗΜΑΝΗ ΣΟΤ ΒΑΚΣΗΡΙΑΚΟΤ ΣΕΛΕΧΟΤ P.A ΕΛΕΓΧΟ ΓΙΑ ΣΗΝ ΤΠΑΡΞΗ ΣΩΝ ΓΟΝΙΔΙΩΝ ΣΟΤ ΕΚΚΡΙΣΙΚΟΤ ΤΣΗΜΑΣΟ ΣΤΠΟΤ VI ΣΟ ΒΑΚΣΗΡΙΑΚΟ ΣΕΛΕΧΟ P.A ΑΛΛΗΛΕΠΙΔΡΑΗ ΣΟΤ ΒΑΚΣΗΡΙΑΚΟΤ ΣΕΛΕΧΟΤ P.A1 ΜΕ GRAM ΘΕΣΙΚΑ ΒΑΚΣΗΡΙΑ ΜΟΛΤΝΗ ΕΤΚΑΡΤΩΣΙΚΩΝ ΚΤΣΣΑΡΩΝ ΜΕ ΣΟ ΒΑΚΣΗΡΙΑΚΟ ΣΕΛΕΧΟ P.A ΗΛΕΚΣΡΟΝΙΚΗ ΜΙΚΡΟΚΟΠΙΑ ΑΡΩΗ (SEM) ΜΙΚΡΟΚΟΠΙΟ ΤΝΕΣΙΑΚΗ ΑΡΩΗ ΜΕ ΛΕΙΖΕΡ (CONFOCAL) ΑΠΟΣΕΛΕΜΑΣΑ ΣΑΤΣΟΠΟΙΗΗ ΣΟΤ ΒΑΚΣΗΡΙΑΚΟΤ ΣΕΛΕΧΟΤ P.A ΦΤΛΟΓΕΝΕΣΙΚΗ ΚΑΣΑΣΑΞΗ ΣΟΤ ΒΑΚΣΗΡΙΑΚΟΤ ΣΕΛΕΧΟΤ P.A1 ΜΕ ΒΑΗ ΣΟ ΓΟΝΙΔΙΟ ΣΟΤ 16S rrna ΓΕΝΙΚΑ ΧΑΡΑΚΣΗΡΙΣΙΚΑ ΣΟΤ ΒΑΚΣΗΡΙΑΚΟΤ ΣΕΛΕΧΟΤ P.A ΦΤΛΛΟΓΕΝΕΣΙΚΗ ΚΑΣΑΣΑΞΗ ΣΟΤ ΒΑΚΣΗΡΙΑΚΟΤ ΣΕΛΕΧΟΤ P.A1 ΜΕ ΣΗ ΧΡΗΗ ΣΩΝ ΓΟΝΙΔΙΩΝ gyrb, ropb ΚΑΙ ropd ΑΝΘΕΚΣΗΚΟΣΗΣΑ ΣΟΤ ΒΑΚΣΗΡΙΑΚΟΤ ΣΕΛΕΧΟΤ P.A1 ΣΑ ΒΑΡΕΑ ΜΕΣΑΛΛΑ ΤΓΚΕΝΣΡΩΣΙΚΑ ΑΠΟΣΕΛΕΜΑΣΑ ΑΠΟ ΒΙΟΧΗΜΙΚΟΤ ΕΛΕΓΧΟΤ ΚΑΙ ΦΤΛΟΓΕΝΕΣΙΚΗ ΑΝΑΛΤΗ ΜΗΧΑΝΙΜΟΙ ΠΑΘΟΓΕΝΕΙΑ ΚΑΨΟΤΛΑ ΕΠΙΗΜΑΝΗ ΣΟΤ ΒΑΚΣΗΡΙΑΚΟΤ ΣΕΛΕΧΟΤ P.A ΕΚΚΡΙΣΙΚΟ ΜΗΧΑΝΙΜΟ VI ΕΠΙΔΡΑΗ ΣΟΤ ΒΑΚΣΗΡΙΑΚΟΤ ΣΕΛΕΧΟΤ P.A1 ΣΗΝ ΕΠΙΒΙΩΗ ΣΟΤ BACILLUS THURINGIENSIS ΕΠΙΔΡΑΗ ΣΟΤ ΒΑΚΣΗΡΙΑΚΟΤ ΣΕΛΕΧΟΤ P.A1 ΣΗ ΒΙΩΙΜΟΣΗΣΑ ΣΟΤ STAPHYLOCOCCUS AUREUS ΜΟΛΤΝΗ ΕΤΚΑΡΤΩΣΙΚΑΝ ΚΤΣΣΑΡΩΝ ΜΕ ΣΟ ΒΑΚΣΗΡΙΑΚΟ ΣΕΛΕΧΟ P.A1. 76 ΤΖΗΣΗΗ 81 ΤΜΠΕΡΑΜΑΣΑ 84 ΒΙΒΛΙΟΓΡΑΥΙΑ 85 ΕΛΛΗΝΙΚΗ ΒΙΒΛΙΟΓΡΑΥΙΑ 90 5

6 ΗΛΕΚΣΡΟΝΙΚΗ ΒΙΒΛΙΟΓΡΑΥΙΑ 90 6

7 Πεξίιεςε ημπυξ ηδξ πανμφζαξ ιεθέηδξ ήηακ δ ηαλζκυιδζδ ημο ααηηδνζαημφ ζηεθέπμοξ Pseudomonas A1 (Ρ.Α1) ζημ επίπεδμ ημο είδμοξ ηαζ δ δζενεφκδζδ ηδξ παεμβμκζηυηδηαξ ημο. Μεηά απυ θοθμβεκεηζηή ακάθοζδ πμο έβζκε ιε ηδκ πνήζδ ηςκ βμκζδίςκ 16S rrna, gyrb, ropb ηαζ ropd, αθθά ηαζ ιε αάζδ ηα αζμπδιζηά ηαζ θοζζμθμβζηά παναηηδνζζηζηά ημο, δζαπζζηχεδηε υηζ ημ ζηέθεπμξ P.A1 δεκ ακήηεζ ζε ηακέκα ηαοημπμζήιεκμ είδμξ ημο βέκμοξ Pseudomonas ηαζ επμιέκςξ είκαζ έκα κέμ είδμξ. Σα βμκίδζα vgrg ηαζ hcp ακζπκεφεδηακ ιε PCR ζημ ααηηδνζαηυ ζηέθεπμξ P.A1. Σα παναπάκς ζοκηδνδιέκα βμκίδζα ανίζημκηαζ ζε έκα μπενυκζμ, ημ μπμίμ ηςδζημπμζεί ημ εηηνζηζηυ ζφζηδια ηφπμο VI (T6SS) ηαζ επμιέκςξ ημ ζηέθεπμξ P.A1 δζαεέηεζ ημ T6SS, πμο είκαζ οπεφεοκμ βζα ηδ ιυθοκζδ εοηανοςηζηχκ ηαζ πνμηανοςηζηχκ ηοηηάνςκ. Σμ ζηέθεπμξ P.A1 πνμζημθθήεδηε ηαζ δζείζδοζε ζε ηνζξ εοηανοςηζηέξ ηοηηανζηέξ ζεζνέξ (μζηεμαθάζηεξ, HuH-7, NH3T3) πμο ελεηάζηδηακ. Σμ πμζμζηυ δζείζδοζδξ ημο ζηεθέπμοξ P.A1 ζε ηφηηανα μζηεμαθαζηχκ, NH3T3 ηαζ HuH-7 ηοιάκεδηε απυ 0,7% έςξ 7%, εκχ ημ ορδθυηενμ πμζμζηυ παναηδνήεδηε ζημοξ ηφηηανα HuH-7. Με δθεηηνμκζηυ ιζηνμζηυπζμ ζοκεζηζαηήξ ζάνςζδξ ιε θέζγεν δζαπζζηχεδηε υηζ ημ ιεβαθφηενμ πμζμζηυ ηςκ ηοηηάνςκ ημο ζηεθέπμοξ P.A1 εκημπίζηδηε εκδμηοηηανζηά ζημκ πονήκα ηςκ ηοηηάνςκ NH3T3, ηαζ ιπμνεί κα πνμηαθέζεζ ηνμπμπμζήζεζξ ζηδκ ιεηαβναθζηή ζοζηεοή ημο λεκζζηζημφ ηοηηάνμο. ηα πνχηα 10 θεπηά ηδξ ιυθοκζδξ παναηδνήεδηε ιε δθεηηνμκζηή ιζηνμζημπία ζάνςζδξ (SEM) υηζ δδιζμονβμφκηαζ μπέξ ζηδκ ηοηηανζηή ιειανάκδ ηςκ ηοηηάνςκ HuH- 7, μζ μπμίεξ πζεακυκ πνμηαθμφκηαζ ηαηά ηδ δζείζδοζδ ημο ααηηδνίμο ζηα ηφηηανα, δεδμιέκμο υηζ δ δζάιεηνμξ ηδξ μπήξ (1,20 ιm) είκαζ ιεβαθφηενδ απυ ηδκ δζάιεηνμ ημο ααηηδνίμο (0,846 ιm). Ωζηυζμ απαζηείηαζ πεναζηένς δζενεφκδζδ. Σμ ααηηδνζαηυ ζηέθεπμξ P.A1 πνμζημθθάηαζ ηαζ ζηδ ζοκέπεζα εακαηχκεζ Gram-εεηζηά ααηηδνία, ιε εενιμ-ελανηχιεκμ ηνυπμ. Σμ ζηέθεπμξ P.A1 πνμηάθεζε ιείςζδ ηδξ αζςζζιυηδηαξ ημο B.thuringiensis ηαηά 37%, 17% ηαζ 15% ζημοξ 37 o C, 30 o C ηαζ 25 o C ακηίζημζπα. Δπίζδξ, ιείςζε ηδκ αζςζζιυηδηα ημο S.aureus ηαηά 32%, 25% ηαζ 12% ζημοξ 37 o C, 30 o C ηαζ 25 o C. 7

8 Abstract The purpose of the present study was the identification of bacterial strain Pseudomonas A1 (Ρ.Α1) at the genus level and the investigation of its pathogenic properties. After phylogenetic analysis with the use of genes16s rrna, gyrb, ropb and ropd, as well as based on its biochemical and physiological properties, it was found that the strain P.A1 does not belong to any identified species of the genus Pseudomonas and therefore is a new species. The genes vgrg and hcp were detected by PCR in the bacterial strain P.A1. The above conserved genes were located in an operon, which encodes the secretion system VI (T6SS) and therefore the strain P.A1 contains the T6SS, which is responsible for infection of eukaryotic and prokaryotic cells. Strain P.A1 was attached to and penetrated three eukaryotic cell lines (osteoblast, HuH-7, NH3T3) which were examined. The penetration rate of the strain P.A1 ranged from 0.7% to 7%, for osteoblasts, NH3T3 and Huh-7 cells, while highest rate was observed in HuH-7. Confocal microscopy revealed that the higher percentage of P.A1 cells was located in the nucleus of infected cells, and may cause alterations to the host s transcriptome. During the first 10 min of infection it was observed by SEM the creation of holes in the cell membrane of HuH-7 cells, which probably were caused by the penetration of bacteria into the cells, since the diameter of hole (1.20 ιm) is greater than the diameter of the bacterium (0,846ιm). Ζowever, additional investigation is needed,. Σhe bacterial strain P.A1 attaches to and then kills Gram positive bacteria, with temperature-depended manner. The strain P.A1 caused reduction of B.thuringiensis viability by 38%, 17% and 15% at 37 o C, 30 o C and 25 o C respectively. In addition it caused reduction of S.aureus viability by 31%, 25% and 12% at 37 o C, 30 o C and 25 o C. 8

9 1. ΔΗΑΓΧΓΖ 1.1. ΓΔΝΟ PSEUDOMONAS Σμ υκμια Pseudomonas δυεδηε ζηα ααηηήνζα ημο βέκμοξ αοημφ, απυ ημκ ηαεδβδηή Migula ημο Karlsruhe Institute ηδξ Γενιακία ζημ ηέθμξ ημο δέηαημο εκάημο αζχκα (Migula 1894), μ μπμίμξ πενζέβναρε ηα ααηηήνζα αοηά ςξ «ηφηηανα ιε πμθζηά υνβακα ηίκδζδξ ζηα μπμία ζπάκζα παναηδνήεδηε ζπδιαηζζιυξ ζπμνίςκ, ιυκμ ζε μνζζιέκα είδδ (βζα πανάδεζβια: Pseudomonas violacea)». ήιενα, είκαζ βκςζηυ, υηζ ηα ααηηήνζα ημο βέκμοξ Pseudomonas δεκ ζπδιαηίγμοκ ζπυνζα. Ο ζπδιαηζζιυξ ζπμνίςκ πμο παναηδνήεδηε απυ ημκ Migula πζεακά μθείθεηαζ ζηδκ παναηήνδζδ δζαεθαζηζηχκ ηυηηςκ πμο πνμέηορακ απυ απμεειαηζηά οθζηά, ηα μπμία ζοπκά ιμζάγμοκ ιε ζπυνζα. Αλίγεζ κα ζδιεζςεεί υηζ ήηακ μ πνχημξ πμο πενζέβναρε ημ είδμξ Pseudomonas pyocyanea, ημ μπμίμ ανβυηενα ιεημκμιάζηδηε ζε Pseudomonas aeruginosa, έκα ααηηήνζμ ζδζαίηενα ιεθεηδιέκμ πμο θένεζ πμθθμφξ ηαζ πμθφπθμημοξ ιδπακζζιμφξ ιμθοζιαηζηυηδηαξ (Palleroni 2010). Σα ααηηήνζα ημο βέκμοξ Pseudomonas έπμοκ πενζβναθεί ςξ ηαηά Gram ανκδηζηά ααηηήνζα, ιδ ζπμνζμβυκα, ηα μπμία ηζκμφκηαζ µε έκα ή πενζζζυηενα ιαζηίβζα ηαζ ημ ζχια ημοξ είκαζ εοεφβναιιμ ή εθαθνά ηεηαιιέκμ. Σα ααηηήνζα αοηά απμιμκχκμκηαζ απυ έκα εονφ θάζια δζαθμνεηζηχκ μζημεέζεςκ ηαζ έπεζ απμδεζπεεί δ πμθθαπθή αθθδθεπίδναζή ημοξ ιε γςζημφξ, θοηζημφξ ηαζ πνμηανοςηζημφξ μνβακζζιμφξ. Ζ εονεία ελάπθςζδ ηςκ ααηηδνίςκ αοηχκ οπμδεζηκφεζ πνμζανιμζηζηυηδηα ςξ πνμξ ηδκ θοζζμθμβία ηαζ ηδ βεκεηζηή αοηχκ ηςκ ιζηνμμνβακζζιχκ ζε ανηεηά ιεβάθμ ααειυ (Palleroni 2010). Ζ πνμζανιμζηζηυηδηα ηςκ ααηηδνίςκ ημο βέκμοξ Pseudomonas μθείθεηαζ: ζηζξ πενζμνζζιέκεξ δζαηνμθζηέξ απαζηήζεζξ ημοξ, ημ ιεβάθμ ανζειυ μνβακζηχκ εκχζεςκ πμο ιπμνμφκ κα πνδζζιμπμζήζμοκ ςξ πδβή εκένβεζαξ ηαζ ηδκ πμζηζθυηδηα ζημ ιεηααμθζζιυ ημοξ πμο εηηείκεηαζ απυ αοημηνμθία έςξ θζεμηνμθία. Ωξ επαηυθμοεμ ηα ααηηήνζα ημο βέκμοξ Pseudomonas απακηχκηαζ ζημ έδαθμξ (Amy et al 1992; Haase et al 1995; Sørensen et al 1992), ζε οδάηζκα πενζαάθθμκηα (Morais et al 1997) ζε θοηά (Clerc et al 1998), θφµαηα (Sallal et al 1989) ηαζ ζημ ζχια δζαθυνςκ μνβακζζιχκ (Rhame and Perkash 1979). 9

10 Οζ ζοκεήηεξ ημο εδάθμοξ επζηνέπμοκ ηδκ ακάπηολδ ηςκ ααηηδνίςκ ημο βέκμοξ Pseudomonas ηαζ ηαοηυπνμκα εοκμμφκ ηδκ ακάπηολδ αηηζκμµοηήηςκ ημο βέκμοξ Streptomyces. Οζ ζηνεπημµφηδηεξ απμζημδμµμφκ ηα μνβακζηά ζφιπθμηα ηαζ πνμζθένμοκ ζηζξ ρεοδμµμκάδεξ ηα μνβακζηά ιμκμµενή πμο πνεζάγμκηαζ ςξ πδβή άκεναηα. Ζ ζοιαίςζδ αοηή ιπμνεί ίζςξ κα απμηεθέζεζ µζα πζεακή ελήβδζδ ηδξ ακεεηηζηυηδηαξ πμο πανμοζζάγμοκ μζ ρεοδμµμκάδεξ ζηα ακηζαζμηζηά πμο πανάβμκηαζ απυ ημοξ ζηνεπημµφηδηεξ (Amy et al 1992). Σα ααηηήνζα ημο βέκμοξ Pseudomonas είκαζ ηονίςξ αενυαζμζ ιζηνμμνβακζζιμί, πμο πνδζζιμπμζμφκ ηo μλοβυκμ ςξ ηεθζηυ δέηηδ δθεηηνμκίςκ, αθθά οπάνπμοκ ηαζ ακαενυαζα ζηεθέπδ πμο πνδζζιμπμζήζμοκ ηα κζηνζηά ζυκηα ςξ ηεθζηυ δέηηδ δθεηηνμκίςκ. Απμζημδμιμφκ ηα ζάηπανα µέζς ηδξ μδμφ Entner-Doudoroff, δζαζπμφκ μλεζδςηζηά ηδ βθοηυγδ ηαζ άθθα ζάηπανα εκχ δεκ ιπμνμφκ κα δζαζπάζμοκ ηδ θαηηυγδ. Δίκαζ εεηζηά ςξ πνμξ μλεζδάζδ ηαζ ηαηαθάζδ. Σα ααηηήνζα αοηά δεκ ειθακίγμκηαζ ζοπκά ζε εενιυθζθα ηαζ υλζκα πενζαάθθμκηα (Todar 2004). Μενζηά είδδ ρεοδμιμκάδςκ έπμοκ ηδκ ζηακυηδηα κα πνδζζιμπμζήζμοκ πενζζζυηενα απυ 150 δζαθμνεηζηά είδδ μνβακζηχκ εκχζεςκ ςξ ιμκαδζηή πδβή άκεναηα ηαζ εκένβεζαξ ηαζ είκαζ αλζμζδιείςηα βζα ημκ πθμφζζμ ηαηααμθζζιυ ημοξ. Σα ζαπνμθοηζηά είδδ ηςκ ρεοδμιμκάδςκ ιπμνμφκ κα απμιμκςεμφκ απεοεείαξ απυ ημ θοζζηυ ημοξ πενζαάθθμκ ζε ημζκά ενεπηζηά ιέζα (nutrient agar). οπκά βζα ηδκ απμιυκςζδ ηςκ δζαθυνςκ ρεοδμιμκάδςκ πνδζζιμπμζείηαζ δ ιέεμδμξ ειπθμοηζζιμφ, δ μπμία ααζίγεηαζ ζηδκ εκίζποζδ ημο ενεπηζημφ ιέζμο ιε ζοβηεηνζιέκεξ πδβέξ άκεναηα (κζημηίκδ, ημθμουθζμ, μηηάκζμ) μζ μπμίεξ επζθέβμκηαζ ακάθμβα ιε ημ είδμξ πμο πνυηεζηαζ κα απμιμκςεεί. Έηζζ, μζ απμκζηνμπμζδηζηέξ ρεοδμιμκάδεξ ιπμνμφκ κα απμιμκςεμφκ ζε ενεπηζηά ιέζα πμο πενζέπμοκ κζηνζηά ζυκηα. Με ακάθμβδ πνμζέββζζδ βίκεηαζ εθζηηή δ απμιυκςζδ ηςκ Pseudomonas aeruginosa, Pseudomonas stutzeri ηαζ Pseudomonas mendocina, ζε εενιμηναζία πμο ηοιαίκεηαζ απυ 37 ιέπνζ 40ºC, εκχ βζα Pseudomonas fluorescens απαζηείηαζ παιδθυηενδ (πενίπμο 30ºC) εενιμηναζία (Todar 2004). Έκα ααζζηυ παναηηδνζζηζηυ μνζζιέκςκ ααηηδνίςκ ημο βέκμοξ Pseudomonas είκαζ δ παναβςβή πνςζηζηχκ, μζ μπμίεξ θεμνίγμοκ υηακ εηηεεμφκ ζε οπενζχδδ αηηζκμαμθία παιδθμφ ιήημοξ ηφιαημξ (254nm), ζδζαίηενα υηακ ανίζημκηαζ ζε ζοκεήηεξ έθθεζρδξ ζζδήνμο. Μενζηέξ απυ αοηέξ ηζξ πνςζηζηέξ υπςξ δ πομηοακίκδ (pyocyanin) θεζημονβμφκ ςξ ζζδδνμθμνείξ βζα ηδκ πνυζθδρδ ζζδήνμο. ε ζοκεήηεξ ακεπάνηεζαξ ζζδήνμο δ παναβςβή ηςκ πνςζηζηχκ πνμάβεηαζ, ηαζ δζαπζζηχκεηαζ ιε ηδκ ακάπηολδ ηςκ ρεοδμιμκάδςκ ζε ενεπηζηυ ιέζμ King s B, ημ μπμίμ δεκ πενζέπεζ ηαευθμο ζίδδνμ. Σμ 10

11 βέκμξ Pseudomonas απμηεθείηαζ απυ θεμνίγμκηα ηαζ µδ-θεμνίγμκηα είδδ ιε παναηηδνζζηζημφξ ακηζπνμζχπμοξ ηα ααηηήνζα P.aeruginosa, P. fluorescens ηαζ P.stutzeri, P.mendocina, ακηίζημζπα. Σα πενζζζυηενα είκαζ ζαπνμθοηζηά (P. fluorescens) ή θοημπαεμβυκα (Kersters et al 1996). Σμ ααηηήνζμ P.aeruginosa είκαζ ηοπζηυ είδμξ ημο βέκμοξ, ημ βμκζδίςια ημο έπεζ πθέμκ πανημβναθδεεί (Stover et al 2000a) ηαζ έπεζ βίκεζ ακηζηείιεκμ πθδεχναξ ενεοκχκ. Σμ ααηηήνζμ P.fluorescens εεςνείηαζ εηενμβεκέξ είδμξ ημ μπμίμ ιπμνεί κα δζαζνεεεί πεναζηένς αάζεζ δζαθυνςκ ηαλζκμιζηχκ παναηηδνζζηζηχκ ζε οπμείδδ, βκςζηά ςξ αζυηοπμζ (biotypes ή biovars). Λεπημιενείξ θαζκμηοπζηέξ, πδµεζμηαλζκμµζηέξ ηαζ βμκμηοπζηέξ ένεοκεξ οπμδεζηκφμοκ υηζ ηα είδδ P. fluorescens, P. marginalis, P. putida, P. stanieri και P. stutzeri είκαζ ζδζαζηένςξ εηενμβεκή (Palleroni 2010). Έκα αηυια ζημζπείμ πμο παναηηδνίγεζ ηζξ πενζζζυηενεξ ρεοδμµμκάδεξ είκαζ δ ηίκδζδ ημοξ µέζς εκυξ ή πμθθχκ ιαζηζβίςκ. Σα ααηηήνζα αοηά ειθακίγμοκ ηαηηζζιυ (αενμηαηηζζµυ ηαζ πδιεζμηαηηζζµυ) πμο επδνεάγεηαζ απυ ηδ ζφζηαζδ ημο ενεπηζημφ οθζημφ ηαζ ηδ εενιμηναζία επχαζδξ (Todar 2004). Δπζπθέμκ, ηα ααηηήνζα αοηά έπμοκ ιεβάθμ ανζειυ πθαζιζδίςκ, ηα μπμία ζοπκά θένμοκ βμκίδζα ακεεηηζηυηδηαξ ζε ακηζααηηδνζδζαημφξ πανάβμκηεξ. ε ζφβηνζζδ υιςξ µε ηθζκζηά ζηεθέπδ άθθςκ εζδχκ, ημ ααηηήνζμ P.aeruginosa, πμο ακηζπνμζςπεφεζ ημ ηαθφηενα ιεθεηδιέκμ ααηηήνζμ ημο βέκμοξ, θένεζ ζπεηζηά θίβα πθαζιίδζα ακεεηηζηυηδηαξ ζε ακηζαζμηζηά, εκχ ειθακίγεζ εκδμβεκή ακεεηηζηυηδηα ζε άθθα ακηζαζμηζηά, υπςξ είκαζ μζ α-θαηηάιεξ. ηδκ πενίπηςζδ αοηή δ ακεεηηζηυηδηα μθείθεηαζ ζημ βμκίδζμ ampc, ημ μπμίμ ηςδζημπμζεί α-θαηηαιάζεξ πμο δζαζπμφκ ημκ α-θαηηαιζηυ δαηηφθζμ ηαζ ζοκεπχξ ηαεζζημφκ ημ ακηζαζμηζηυ ακεκενβυ (Shahid and Malik 2005). Υαναηηδνζζηζηυ πανάδεζβια ηζξ πμζηζθίαξ ηςκ πθαζιζδίςκ πμο ζοκακηχκηαζ ζηα ααηηήνζα ημο βέκμοξ Pseudomonas απμηεθεί ημ ααηηήνζμ P.aeruginosa ζημ μπμίμ έπμοκ ανεεεί ζοκμθζηά δεηαηνείξ μιάδεξ πθαζιζδίςκ, απυ ηζξ μπμίεξ δ μιάδα Ρ-2, πενζθαιαάκεζ πενζζζυηενα απυ ηα ιζζά ζογεοηηζηά πθαζιίδζα πμο έπεζ ημ είδμξ. Δηηυξ απυ πανάβμκηεξ πμο πνμζδίδμοκ ακεεηηζηυηδηα ζε ακηζαζμηζηά ηαζ πδιζηέξ εκχζεζξ (οδνάνβονμ, αμνζηυ η.ά.), υθα ηα πθαζιίδζα ηδξ μµάδαξ Ρ-2 ιεηαθένμοκ πανάβμκηεξ ακεεηηζηυηδηαξ ζημ ηεθθμονζχδεξ ηαζ ηεθθμονζηυ ζυκ. Σα πθαζιίδζα ηδξ μιάδαξ Ρ-9 είκαζ ηονίςξ πθαζιίδζα ηαηααμθζζιμφ ηαζ ζοκεζζθένμοκ ζηδ δζαηνμθζηή πμζηζθμιμνθία ηςκ ρεοδμιμκάδςκ. Γζα πανάδεζβια ηα πθαζιίδζα NAH, SAL ηαζ TOL, θένμοκ βμκίδζα πμο ειπθέημκηαζ ζημκ ηαηααμθζζιυ ημο καθεαθζκίμο, ημο ζαθζηοθζημφ μλέμξ ηαζ ημο ημθμομθίμο ακηίζημζπα (Lehrbach et al 1983). 11

12 ΣΑΞΗΝΟΜΖΖ ΣΧΝ ΒΑΚΣΖΡΗΧΝ ΣΟΤ ΓΔΝΟΤ PSEUDOMONAS Σα ααηηήνζα ημο βέκμοξ Pseudomonas ακήημοκ ζηδκ μζημβέκεζα Pseudomonadaceae. ηδκ ίδζα μζημβέκεζα ακήημοκ ηαζ ηα βέκδ Xanthomonas, Frateuria ηαζ Zoogloea. Σα ημζκά παναηηδνζζηζηά ηςκ βεκχκ αοηχκ είκαζ ηονίςξ μ αενυαζμξ ιεηααμθζζµυξ, δ έθθεζρδ ζηακυηδηαξ γφµςζδξ, δ απμοζία ζηακυηδηαξ θςημζφκεεζδξ ηαζ δ ζηακυηδηα ακάπηολδξ ζε δζάθμνα μνβακζηά οπμζηνχιαηα. Ο Palleroni (1973) ηαλζκυιδζε ημ βέκμξ ηςκ ρεοδμµμκάδςκ, µε αάζδ ηδκ μµμθμβία ημο νζαμζςµζημφ RNA ζε πέκηε μιάδεξ (RNA homology groups) (Palleroni et al 1973). Ζ θοθμβεκεηζηή απυζηαζδ ιεηαλφ ηςκ πέκηε μιάδςκ ηαεμνίζηδηε ζηδ ζοκέπεζα µε πενζζζυηενδ αηνίαεζα, µε ηδ πνήζδ πζμ ελεθζβιέκςκ ιεευδςκ, υπςξ μ οανζδζζµυξ rrna:dna ηαζ δ αθθδθμφπζζδ (sequencing) ηδξ αημθμοείαξ ημο 16S rrna ζε έκα πθήεμξ δζαθμνεηζηχκ ααηηδνίςκ. Σα εονήιαηα ηςκ ενεοκχκ αοηχκ μδήβδζακ ζηδκ ηαεζένςζδ ημο 16S rrna ςξ ενβαθείμο βζα ηδκ ηαοημπμίδζδ ηςκ πνμηανοςηζηχκ ηοηηάνςκ. ε μνζζιέκεξ πενζπηχζεζξ, υπςξ βζα πανάδεζβια ζηδκ μζημβέκεζα Pseudomonadaceae έβζκακ ζδιακηζηέξ ηαλζκμιζηέξ ακαηαηαηάλεζξ ζε επίπεδμ μζημβέκεζαξ ηαζ είδμοξ πμο ζοκμδεφηδηακ απυ ακάθμβεξ αθθαβέξ ζηδκ μκμιαημθμβία ηςκ ααηηδνίςκ. Με αάζδ ηδκ μµμθμβία ημο νζαμζςµζημφ RNA, μ Palleroni (1973) ηαλζκυιδζε ημ βέκμξ ηςκ ρεοδμµμκάδςκ ζε πέκηε δζαηνζηέξ μιάδεξ, πμο είκαζ μζ αηυθμοεεξ: Οιάδα rrna I : πενζθαιαάκεζ ημ βέκμξ Pseudomonas πμο ακήηεζ ζηδκ β-οπμηάλδ ηςκ Πνςηεμααηηδνίςκ ηαζ πενζθαιαάκεζ 30 είδδ ρεοδμιμκάδςκ πμο ειθακίγμοκ βμκμηοπζηέξ ηαζ θαζκμηοπζηέξ μιμζυηδηεξ µε ημ ηοπζηυ είδμξ P.aeruginosa (Moore et al 1996). Οιάδα rrna II: πενζθαιαάκεζ ηδ α-οπμηάλδ ηςκ Πνςηεμααηηδνίςκ. Σα ααηηήνζα αοηά ιεηαθένεδηακ ζε δφμ κέα βέκδ, πμο είκαζ: (α) Burkholderia, µε ηοπζηυ είδμξ ηδκ B.cepacia (Yabuuchi et al. 1992) ηαζ (α) Ralstonia, µε ηοπζηυ είδμξ ηδκ R.pickettii (Yabuuchi et al 1992). Οιάδα rrna III: πενζθαιαάκεζ ηδ α-οπμηάλδ ηςκ Πνςηεμααηηδνίςκ δ μπμία ιεημκμιάζηδηε ζε μζημβέκεζα Comamonadaceae ηαζ πενζθαιαάκεζ ηα βέκδ Acidovorax, Comamonas ηαζ Hydrogenophaga. Οιάδα rrna IV: πενζθαιαάκεζ ηα ααηηήνζα P.diminuta ηαζ P.vesicularis, ηα μπμία ακήημοκ ζηδκ α-οπμηάλδ ηςκ Πνςηεμααηηδνίςκ ηαζ ιεηαθένεδηακ ζημ κέμ βέκμξ Brevundimonas (Segers et al 1994), Οιάδα rrna V: πενζθαιαάκεζ ηζξ ρεοδμµμκάδεξ πμο ανπζηά ιεηαθένεδηακ ζημ βέκμξ Xanthomonas ηαζ ανβυηενα ζημ κέμ βέκμξ Stenotrophomonas (Yabuuchi et al 1992). 12

13 ΣΑΞΗΝΟΜΗΖ ΣΧΝ ΒΑΚΣΖΡΗΧΝ ΣΟΤ ΓΔΝΟΤ PSEUDOMONAS ΜΔ ΣΑ ΣΖ ΥΡΖΖ ΣΧΝ ΓΟΝΗΓΗΧΝ gyrb, ropb, ΚΑΗ ropd. Σμ βμκίδζμ ropb ηςδζημπμζεί βζα ηδ α οπμιμκάδα ηδξ RNA πμθοιενάζδξ ηαζ έπεζ πνδζζιμπμζδεεί ςξ ζδιείμ ακαθμνάξ βζα ηδκ ηαοημπμίδζδ ααηηδνίςκ ηαεχξ ηαζ βζα θοθμβεκεηζηέξ ακαθφζεζξ. Σμ βμκίδζμ ropb είκαζ έκα πμθφ ζδιακηζηυ βμκίδζμ (housekeeping), θυβς ημο νυθμο πμο επζηεθεί ζηδκ ηοηηανζηή νφειζζδ. Δπζπθέμκ είκαζ ζδζαίηενα ζοκηδνδιέκμ ηαζ οπάνπεζ ζε υθα ηα ααηηήνζα. Μεηά απυ ζφβηνζζδ ηςκ θοθμβεκεηζηχκ δέκδνςκ πμο πνμέηορακ ιε αάζδ ημ βμκίδζμ ropb, ηςκ ααηηδνίςκ ημο βέκμοξ Pseudomonas, ιε εηείκα πμο πνμέηορακ ιε αάζδ ημ 16S rrna, αθθά ηαζ ιε άθθεξ ιεευδμοξ ηαοημπμίδζδξ, δζαπζζηχεδηε υηζ ζημ θοθμβεκεηζηυ δέκηνμ πμο πνμέηορε ιε αάζδ ημ βμκίδζμ ropb, α) απεζημκίζηδηακ ηα είδδ πμο ακήημοκ ζηδκ ίδζα μιάδα ιε αάζδ ημκ νζαυηοπμ (ribotype), α) απεζημκίζηδηακ μζ ζπέζεζξ ηςκ δζαθμνεηζηχκ εζδχκ ιε οανζδζζιμφξ DNA-DNA ηαζ β) μζ ζπέζεζξ ιεηαλφ βκςζηχκ εζδχκ ιε αάζδ ηα παναηηδνζζηζηά ημοξ. Σα παναπάκς δεδμιέκα δείπκμοκ υηζ ημ βμκίδζμ ropb ιπμνεί κα πνδζζιμπμζδεεί βζα ηδκ ηαοημπμίδζδ ααηηδνίςκ ημο βέκμοξ Pseudomonas ζε επίπεδμ είδμοξ. Όζμκ αθμνά ηδ θοθμβεκεηζηή ηαηάηαλδ ηςκ ααηηδνίςκ ημο βέκμοξ Pseudomonas ημ βμκίδζμ ropb έπεζ πνδζζιμπμζδεεί εηηεηαιέκα βζα ηδκ ηαλζκυιδζδ ηαζ ηδ θοθμβεκεηζηή ηαηάηαλδ ηυζμ ηςκ ήδδ οπανπυκηςκ αθθά ηαζ κέςκ εζδχκ ημο βέκμοξ (Ait Tayeb et al 2005a). Σμ βμκίδζμ gyrb ηςδζημπμζεί ηδκ α οπμιμκάδα ηδξ DNA βονάζδξ ηαζ επίζδξ δζαεέηεζ ηάπμζα παναηηδνζζηζηά πμο ημ ηάκμοκ ηαηάθθδθμ βζα θοθμβεκεηζηέξ ακαθφζεζξ, πμο είκαζ ηα αηυθμοεα: (α) ημ βμκίδζμ αοηυ δεκ ιεηαθένεηαζ ιε μνζγυκηζα ιεηαθμνά ιεηαλφ ηςκ ααηηδνζαηχκ εζδχκ, (α) μ νοειυξ ιε ημκ μπμίμ ελεθίζζεηαζ είκαζ ορδθυηενυξ απυ εηείκμ ημο βμκίδζμο 16S rrna, (β) έπεζ ανεεεί ζηα πενζζζυηενα ααηηδνζαηά είδδ ηαζ (δ) δζαεέηεζ ηυζμ ζοκηδνδιέκεξ υζμ ηαζ ιεηααθδηέξ πενζμπέξ πμο ζοιαάθθμοκ ζηδκ απμιυκςζδ ημο βμκζδίμο ιε PCR (Fukushima et al 2002; Yamamoto and Harayama 1995a). Ζ αθθδθμοπία ημο βμκζδίμο gyrb έπεζ πνδζζιμπμζδεεί βζα ηδκ ηαοημπμίδζδ ααηηδνίςκ δζαθμνεηζηχκ βεκχκ, ζοιπενζθαιαακμιέκςκ ηςκ βεκχκ Vibrio ( (Kasai et al 1998; Venkateswaran et al 1998; Vuddhakul et al 2000), Bacillus, Pseudomonas (Yamamoto and Harayama 1995a), Leptospira (Slack et al 2006) ηαζ Aeromonas (Sen 2005). Όπςξ δζαπζζηχκεηαζ απυ ηζξ παναπάκς ιεθέηεξ ημ βμκίδζμ gyrb πνδζζιμπμζήεδηε εηηεηαιέκα βζα ηδκ ηαοημπμίδζδ ιζηνμμνβακζζιχκ. Ωζηυζμ, ημ ορδθυ πμζμζηυ ηδξ 13

14 ιμνζαηήξ ελέθζλδξ ημο βμκζδίμο αοημφ πνμηάθεζε επζθοθάλεζξ, υζμκ αθμνά ηδκ εηενμβέκεζα ημο βμκζδίμο ιεηαλφ ζηεθεπχκ πμο ακήημοκ ζε ημκηζκά είδδ. Οζ επζθοθάλεζξ αοηέξ άνεδηακ ιεηά απυ ιεθέηδ, πμο έδεζλε υηζ δ αθθδθμοπία ημο βμκζδίμο gyrb πανμοζζάγεζ δζαθμνέξ αηυια ηαζ ιεηαλφ ζηεθεπχκ ημο ίδζμο είδμοξ (Demarta et al 2004). Σμ βμκίδζμ ropd ηςδζημπμζεί ηδκ ζίβια οπμιμκάδα (ζ 70 ) ηδξ RNA πμθοιενάζδξ. Ζ ζίβια οπμιμκάδα ηδξ RNA πμθοιενάζδξ ακαβκςνίγεζ ημκ πνμαβςβέα ημο βμκζδίμο ηαζ ζοκδέεηαζ ιε αοηυκ, μδδβχκηαξ ζηδκ έκανλδ ηδξ ιεηαβναθήξ. Σα βμκίδζμ ropd υπςξ ηαζ ημ gyrb οπάνπεζ ζε υθα ζπεδυκ ηα ααηηήνζα ηαζ έπεζ δεζπηεί υηζ ελεθίζζεηαζ ιε βνδβμνυηενμ νοειυ απυ υηζ ημ βμκίδζμ ημο 16S RNA ηαζ βζα αοηυ ημ θυβμ μζ θοθμβεκεηζηέξ ακαθφζεζξ ιε ηδκ πνήζδ ηαζ αοημφ ημο βμκζδίμο έπμοκ ιεβαθφηενδ αηνίαεζα (Yamamoto and Harayama 1995a). Ζ πνήζδ ηςκ παναπάκς βμκζδίςκ δεκ ακηζηαεζζηά ηδ πνήζδ ημο βμκζδίμο 16S rrna υζμκ αθμνά ηζξ θοθμβεκεηζηέξ ακαθφζεζξ, ζοιαάθεζ υιςξ ζηδ δζαθεφηακζδ ηςκ δζαθμνχκ πμο πνμηφπημοκ ζηζξ θοθμβεκεηζηέξ ακαθφζεζξ πμο βίκμκηαζ ιε ηδκ πνήζδ ημο 16S rrna ηαζ ζε αοηέξ πμο βίκμκηαζ ιε ηδ πνήζδ DNA:DNA οανζδζζιμφ (Yamamoto and Harayama 1995a) ΖΜΑΝΣΗΚΟΣΔΡΑ ΔΗΓΖ ΣΟΤ ΓΔΝΟΤ PSEUDOMONAS Pseudomonas aeruginosa: Μεηαλφ υθςκ ηςκ ρεοδμµμκάδςκ, ημ ααηηήνζμ P.aeruginosa έπεζ πνμζεθηφζεζ ημ ιεβαθφηενμ εκδζαθένμκ ιζηνμαζμθυβςκ, βεκεηζζηχκ ηαζ αζμπδιζηχκ, ηονίςξ επεζδή δζαεέηεζ πμθθαπθμφξ ιδπακζζιμφξ παεμβμκζηυηδηαξ. Σα πενζζζυηενα ζηεθέπδ ιπμνμφκ κα ακαβκςνζζεμφκ εφημθα µέζς θαζκμηοπζηχκ παναηηδνζζηζηχκ πμο δεκ απακηχκηαζ ζε άθθα ααηηήνζα, εη ηςκ μπμίςκ ηα ηονζυηενα είκαζ δ παναβςβή πνςζηζηχκ, δ ζηακυηδηα απμκζηνμπμίδζδξ ηαζ δ ζηακυηδηα ακάπηολδξ ζημοξ 42 C. Οζ ζοκήεεζξ απμζηίεξ ηδξ P.aeruginosa είκαζ επίπεδεξ µε ακχιαθα άηνα ηαζ µε ηδκ πάνμδμ ημο πνυκμο έπμοκ ηδκ ηάζδ κα απθχκμκηαζ ζηδκ επζθάκεζα ημο ενεπηζημφ οθζημφ. Ζ ιμνθμθμβία ηςκ απμζηζχκ δεκ είκαζ πάκημηε δ ηοπζηή. Έπμοκ δζαπςνζζηεί 6 ιμνθυηοπμζ απμζηζχκ υπςξ μζ θείεξ (smooth), μζ λδνέξ (rough), μζ αθεκκχδεζξ (mucoid), μζ γεθαηζκχδεζξ, μζ ιζηνέξ, μζ έπμοζεξ ηδ ιμνθή ημο ημθμααηηδνζδίμο. Ζ P. aeruginosa πανάβεζ δζάθμνεξ πνςζηζηέξ µε ηονζυηενδ ηδκ πομηοακίκδ (pyocyanin), µζα πνάζζκδ πνςζηζηή παναηηδνζζηζηή αοημφ ημο είδμοξ, δεδμιέκμο υηζ δεκ έπεζ ανεεεί άθθμ είδμξ κα ηδκ πανάβεζ. (Todar 2004). 14

15 Υαναηηδνζζηζηέξ αζμπδιζηέξ ζδζυηδηεξ ηδξ P.aeruginosa είκαζ υηζ δζαζπά μλεζδςηζηά, δδθαδή αενυαζα, ηδ βθοηυγδ, ηδκ λοθυγδ, ηδ θνμοηηυγδ ηαζ άθθα ζάηπανα πςνίξ παναβςβή αενίμο, εκχ δεκ δζαζπά ακαενυαζα ηακέκα ζάηπανμ. εκ δζαζπά ηδ θαηηυγδ, ηδ ιαθηυγδ, ηδ ζμοηνυγδ, ηδ ζαθζηίκδ. Τδνμθφεζ ημ απμννοπακηζηυ Tween 80 ηαζ δεκ πνδζζιμπμζεί ημ πμθο-α-οδνμλοαμοηονζηυ ςξ απμεδηεοηζηυ οθζηυ (Murray et al 1999) Έκα αηυια απυ ηα παναηηδνζζηζηά ηδξ P.aeruginosa πμο αλίγεζ κα ζδιεζςεεί είκαζ μ ορδθυξ ααειυξ εββεκμφξ ακεεηηζηυηδηαξ ζε πθήεμξ δζαθμνεηζηχκ δμιζηά ακηζιζηνμαζαηχκ παναβυκηςκ, μπμία μθείθεηαζ ςξ έκα ααειυ ζε ζοζηήιαηα εηνμήξ ζηδ παιδθή δζαπεναηυηδηα ηδξ ελςηενζηήξ ιειανάκδξ. Δπζπθέμκ, δ P.aeruginosa θένεζ µία επαβχβζιδ πνςιμζςιζηά ηςδζημπμζμφιεκδ AmpC ηεθαθμζπμνζκάζδ δ μπμία, αηυιδ ηαζ ζε παιδθά επίπεδα, πανέπεζ ακεεηηζηυηδηα ζηζξ αιζκμπεκζηζθθίκεξ ηαζ ζηζξ ζηεκμφ ηαζ εονέςξ θάζιαημξ ηεθαθμζπμνίκεξ. Οζ µυκμζ ακηζιζηνμαζαημί πανάβμκηεξ πμο είκαζ δναζηζημί έκακηζ ηδξ P.aeruginosa είκαζ ηάπμζεξ α-θαηηάµεξ (ticarcillin, piperacillin, aztreonam, imipenem, cefsulodin, cefoperazone and ceftazidime), μζ πζμ πνυζθαηεξ αµζκμβθοημζίδεξ ηαζ θθμομνμηζκμθυκεξ, fosfomycin ηαζ colistin. Αηυιδ ηαζ μζ ηεθαθμζπμνίκεξ ηέηανηδξ βεκζάξ, cefpirome ηαζ cefepime, πμο έπμοκ απμηεθεζιαηζηυηενδ δνάζδ εκάκηζα ζηα ηαηά Gram ανκδηζηά ααηηήνζα είκαζ θζβυηενμ απμηεθεζιαηζηέξ απυ ηδκ ceftazidime υζμκ αθμνά ζηδκ P. aeruginosa in vitro (Shahid and Malik 2005) Pseudomonas stutzeri: H Pseudomonas stutzeri είκαζ έκα ιδ θεμνίγμκ ααηηήνζμ ιε ζζπονή απμκζηνμπμζδηδηή δνάζδ ηαζ εονεία ελάπθςζδ ζε έδαθμξ ηαζ κενυ. οκήεςξ ακαβκςνίγεηαζ απυ ηδ ιμνθή ηςκ απμζηζχκ πμο είκαζ αδνέξ, βεζηκζάγμοζεξ ηαζ έπμοκ ζημφνμ ηαζηακυ πνχια θυβς ηδξ ορδθήξ πενζεηηζηυηδηάξ ζε ηοηυπνςια C. H Pseudomonas stutzeri ζοκήεςξ απμζηίγεζ ζημ έδαθμξ ηαζ ζε οβνά πενζαάθθμκηα, υπςξ ζε ζηάζζια κενά, οβνά οπμκυιςκ, απζμκζζιέκμ κενυ, ζηα οβνά αζιμδζαθφζεςξ, ζηα οβνά ζαπμφκζα, ζηα ηαθθοκηζηά, ζηα οβνά θαηχκ επαθήξ. Σμ ιζηνυαζμ αοηυ ιπμνεί κα ακαπηοπεεί ζηδ εενιμηναζία ημο ζχιαημξ. Οζ παναηηδνζζηζηυηενεξ ζδζυηδηέξ ημο ααηηδνίμο αοημφ είκαζ υηζ έπεζ έκα πμθζηυ ιαζηίβζμ, οδνμθφεζ ημ άιοθμ, μλεζδχκεζ ηδ ιαθηυγδ εκχ δεκ μλεζδχκεζ ηδ θαηηυγδ (Palleroni et al 1970). Pseudomonas fluorescens: Δίκαζ ιζηνυαζμ πμο γεζ ζαπνμθοηζηά ζημ έδαθμξ, ζημ κενυ ηαζ ζηδκ επζθάκεζα ηςκ θοηχκ. Έπεζ απμιμκςεεί απυ ζαφνεξ, έκημια ηαζ εδθαζηζηά. Βνίζηεηαζ ζηα ηνυθζια υπςξ ημ βάθα, ημ ηνέαξ, ηα θαπακζηά. Δπίζδξ ιπμνεί κα απμιμκςεεί απυ ηαθθοκηζηά, θοζζμθμβζηά δζαθφιαηα πθςνζμφπμο καηνίμο, αναζά ακηζζδπηζηά ηαζ ηα οβνά δζαθφθαλδξ ηςκ θαηχκ επαθήξ, υπςξ επίζδξ απυ δείβιαηα 15

16 κμζμημιεζαημφ πενζαάθθμκημξ. Απμηεθεί µέθμξ ηδξ θοζζμθμβζηήξ πθςνίδαξ ηδξ ζημιαημθαννοββζηήξ ημζθυηδηαξ (Sørensen et al 1992). Σμ ααηηήνζμ αοηυ ζπάκζα είκαζ παεμβυκμ ζημοξ ακενχπμοξ ηονίςξ θυβμ ηδξ ακζηακυηδηαξ ηδξ κα ακαπηφζζεηαζ ζηδ εενιμηναζία ημο ζχιαημξ, ακ ηαζ έπεζ ζοζπεηζζεεί µε θθεβιμκέξ ημο μονμπμζδηζημφ ζοζηήιαημξ, ζδραζιία ηαζ άθθεξ παεμθμβζηέξ ηαηαζηάζεζξ. Ζ πζμ βκςζηή ζοζπέηζζδ αοημφ ημο ιζηνμαίμο µε ηθζκζηήξ ζδιαζίαξ επεζζυδζα είκαζ δ ιυθοκζδ αίιαημξ µε P. fluorescens ηαζ δ επαηυθμοεδ ιεηάδμζή ηδξ ζε αζεεκείξ πμο οπυηεζκηαζ ζε ιεηάββζζδ (Hsueh et al 1998). Απυ ηα παναπάκς πνμηφπηεζ υηζ ημ ααηηήνζμ αοηυ εα πνέπεζ κα εεςνείηαζ ηαζ κα ιεηαπεζνίγεηαζ ςξ εκ δοκάιεζ παεμβυκμ. Απυ αζμπδιζηήξ άπμρδξ, δεκ πανάβεζ πομηοακίκδ αθθά πομθεμνεζεΐκδ, µία πναζζκίγμοζα θεμνίγμοζα πνςζηζηή πμο πανάβμοκ ηαζ μνζζιέκα ζηεθέπδ ηδξ P.aeruginosa. Έπεζ ηδκ ζηακυηδηα παναβςβήξ θεηζεζκάζδξ, υιςξ δεκ έπεζ ηδκ ζηακυηδηα κα ακαπηφζζεηαζ ζημοξ 42 μ C υπςξ δ P.aeruginosa. οκήεςξ δζαεέηεζ πενζζζυηενεξ απυ έκα πμθζηά ιαζηίβζα ηαζ μνζζιέκα ζηεθέπδ έπμοκ ηδκ ζηακυηδηα κα μλεζδχκμοκ ηδ θαηηυγδ παναηηδνζζηζηυ πμο δεκ ζοκακηάηε ζοκήεςξ ζηα ααηηήνζα ημο βέκμοξ Pseudomonas. Διθακίγεζ ιεβάθδ πμζηζθμιμνθία ηαζ βζα αοηυ ημ θυβμ ηα ζηεθέπδ ημο είδμοξ αοημφ έπμοκ δζαπςνζζηεί ζε 7 αζυηοπμοξ ιε αάζδ ηζξ δζαθμνέξ πμο ειθακίγμοκ ζημοξ αζμπδιζημφξ παναηηήνεξ. Δίκαζ οπμπνεςηζηά αενυαζμξ µιζηνμμνβακζζιυξ, εηηυξ απυ ιενζηά ζηεθέπδ πμο ιπμνμφκ κα πνδζζιμπμζήζμοκ ηα κζηνζηά ζυκηα ςξ απμδέηηδ δθεηηνμκίςκ ακηί ημο µμνζαημφ μλοβυκμο (Palleroni 1984). Δπζπθέςκ έπεζ δεζπηεί υηζ μνζζιέκα ζηεθέπδ αοημφ ημο είδμοξ έπμοκ ηδκ ζηακυηδηα κα απμζημδμιμφκ, ιενζηχξ ή μθζηχξ, µία πθδεχνα μνβακζηχκ εκχζεςκ υπςξ ζηονυθζμ, ΣΝΣ ηαζ πμθοηοηθζημφξ ανςιαηζημφξ οδνμβμκάκεναηεξ (Caldini et al 1995) Κάπμζα ζηεθέπδ ηδξ P.fluorescens ηαηαζηέθθμοκ ηζξ αζεέκεζεξ ηςκ θοηχκ, πνμζηαηεφμκηαξ ημοξ ζπυνμοξ ηαζ ηζξ νίγεξ απυ επζιυθοκζδ µε ιφηδηεξ. Αοηυ ημ βεβμκυξ μθείθεηαζ ζηδκ παναβςβή δεοηενμβεκχκ ιεηααμθζηχκ υπςξ ακηζαζμηζηχκ, ζζδδνμθυνςκ ηαζ οδνμηοακίμο. Ο ακηαβςκζζηζηυξ απμηθεζζιυξ ηςκ παεμβυκςκ ζακ απμηέθεζια ηδξ ηαπείαξ απμίηζζδξ ηδξ νζγυζθαζναξ µε P. fluorescens ιπμνεί κα πνδζζιμπμζδεεί βζα ημκ έθεβπμ ηςκ αζεεκεζχκ ηςκ θοηχκ (O Sallivan 1992). Pseudomonas mendocina: Ζ P.mendocina ιμζάγεζ µε ηδκ P.stutzeri ζηζξ αζμπδιζηέξ ηαζ άθθεξ ζδζυηδηεξ. Οζ απμζηίεξ ηδξ είκαζ επίπεδεξ, θείεξ ηαζ έπμοκ ηαθέηζηνζκςπυ πνχια ελαζηίαξ ηδξ πανμοζίαξ ηανμηεκμεζδχκ πνςζηζηχκ. Ζ P.mendocina έπεζ απμιμκςεεί απυ κμζμημιεζαηυ πενζαάθθμκ, αθθά δεκ έπεζ εκμπμπμζδεεί ςξ αζηζμθμβζηυξ πανάβμκηαξ κυζμο ζημοξ ακενχπμοξ. Δίκαζ ηονίςξ ιζηνυαζμ ημο εδάθμοξ ηαζ ηςκ 16

17 αηάεανηςκ ηαζ ζηάζζιςκ οβνχκ. Σα ααζζηά παναηηδνζζηζηά βζα κα ηαοημπμζδεεί έκα ααηηήνζμ ςξ P.medocida είκαζ δ ειθάκζζδ πενζζζυηενςκ ηςκ ηνζχκ ιαζηζβίςκ ζε ηάεε πυθμ ημο ααηηδνίμο, δ ζηακυηδηα ημο κα ηζκείηαζ, δ πανάβςβδ μλέςξ ηαηά ηδ γφιςζδ βθοηυγδξ, δ ακζηακυηδηα γφιςζδξ θαηηυγδξ, δ εεηζηή ακηίδναζδ ςξ πνμξ μλεζδάζδ ηδξ ζκδμθαζκυθδξ, δ παναβςβή αενίμο απυ ηα κζηνζηά ηαζ δ πανμοζία ηδξ δζοδνμθάζδξ ηδξ L- ανβζκήκδξ. Δπζπθέμκ δεκ έπεζ ηδκ ζηακυηδηα κα ιεηααμθίγεζ ημ άιοθμ ηαζ ηδ ιαθηυγδ ηαζ ακαπηφζζεηαζ ζημοξ 42 o C. οκεπχξ είκαζ ζπεηζηά εφημθμξ μ δζαπςνζζιυξ ηδξ απυ ηα ζηεθέπδ ημο ααηηδνίμο P.fluorescens πμο θεμνίγμοκ ηαζ έπμοκ ηδκ ζηακυηδηα παναβςβήξ αενίμο απυ ηα κζηνζηά (Murray et al 1999). Pseudomonas alcaligenes θαη Pseudomonas pseudoalcaligenes: Δίκαζ δφμ είδδ πμο ιμζάγμοκ πμθφ. Σα εθάπζζηα παναηηδνζζηζηά πμο ιπμνμφκ κα πνδζζιμπμζδεμφκ βζα κα ηαοημπμζδεεί έκα ααηηήνζμ ςξ P.alcaligenes ή P.pseudoalcaligenes είκαζ υηζ ηαζ ηα δφμ είδδ δζαεέημοκ πενζζζυηενα απυ ηνία ιαζηίβζα ζε ηάεε πυθμ ημο ηοηηάνμο, δ ζηακυηδηα ημοξ κα ηζκμφκηαζ, δ εεηζηή ακηίδναζδ ςξ πνμξ μλεζδάζδ ηδξ ζκδμθαζκυθδξ ηαζ δ παναβςβή μλέςκ απυ ημκ ιεηααμθζζιυ ηδξ βθοηυγδξ δ μπμία ειθακίγεηαζ ιυκμ ζε μνζζιέκα ζηεθέπδ ηδξ P.pseudoalcaligenes. Καζ ηα δομ είδδ δεκ έπμοκ ηδκ ζηακυηδηα κα πανάβμοκ πνςζηζηέξ. Ζ ααζζηή δζαθμνά ημοξ είκαζ υηζ δ P.alcaligenes δεκ δζαζπά ηδ θνμοηηυγδ εκχ δ P.pseudoalcaligenes ηδ δζαζπά. ε υθεξ ζπεδυκ ηζξ άθθεξ αζμπδιζηέξ δμηζιαζίεξ μζ δζαθμνέξ ακάιεζα ζε αοηά ηα δφμ είδδ αθμνμφκ ημ εηαημζηζαίμ πμζμζηυ ηςκ ζηεθεπχκ πμο δίκμοκ εεηζηή δ ανκδηζηή ηδκ ηάεε αζμπδιζηή ακηίδναζδ. Καζ ηα δφμ είδδ είκαζ ιζηνυαζα ημο θοζζημφ πενζαάθθμκημξ ηαζ ζδζαίηενα ημο βθοημφ κενμφ. Σα ααηηήνζα αοηά ανίζημκηαζ ζημ κενυ ηςκ ημθοιαδηζηχκ δελαιεκχκ, ζημ κενυ εκοδνείςκ πμο γμοκ πεθχκεξ, ζε ζηάζζια κενά. Δπίζδξ έπμοκ ακζπκεοεεί ζε πμθθά ηνυθζια πμο ένπμκηαζ ζε επαθή µε ημ κενυ ( βάθα, ηαηεροβιέκμ ράνζ). Ζ P. alcaligenes ιπμνεί κα πνμηαθέζεζ θμζµχλεζξ ημο ακχηενμο ακαπκεοζηζημφ ζοζηήιαημξ ζημοξ ακμζμηαηεζηαθιέκμοξ αθθά μζ πενζπηχζεζξ πμο έπμοκ ακαθενεεί είκαζ ζπάκζεξ (Murray et al 1999). Pseudomonas putida: Δίκαζ ηαη ελμπήκ ιζηνυαζμ ημο εδάθμοξ ηαζ θζβυηενμ ημο κενμφ. Απακηάηαζ ζημ κμζμημιεζαηυ πενζαάθθμκ, ζε ακηζζδπηζηά ηαζ απμθοιακηζηά οβνά. Όθα ηα ζηεθέπδ ηδξ είκαζ ηζκδηά, μλεζδχκεζ ζπεηζηά θίβα ζάηπανα ηαζ δζαπςνίγεηαζ ζε δφμ αζυηοπμοξ. Σα ααζζηά ηνζηήνζα βζα κα παναηηδνζζηεί έκα ααηηήνζμ ςξ P.putida είκαζ δ πανμοζία ηδξ μλεζδάζδξ ηδξ ζκδμθαζκυθδξ, δ παναβςβή πομθεμνεζεΐκδξ αθθά υπζ πομηοακίκδξ, δ πανμοζία ηδξ δζοδνμθάζδξ ηδξ ανβζκίκδξ, δ ζηακυηδηα οδνυθοζδξ ηδξ γεθαηίκδξ ηαζ δ αδοκαιία ακάπηολδξ ζημοξ 42 μ C (Murray et al 1999). 17

18 Pseudomonas alcaliphila: Σμ ααηηήνζμ P.alcaliphila απμιμκχεδηε βζα πνχηδ θυνα ημ 2001 απυ δείβιαηα εαθαζζζκμφ κενμφ. Οζ απμζηίεξ ημο είκαζ ηοηθζηέξ ηαζ άπνςιεξ. Γζαεέηεζ έκα ιυκμ πμθζηυ ιαζηίβζμ ημ μπμίμ δζεοημθφκεζ ηδκ ηίκδζδ ημο. Σμ ααηηήνζμ P.alcaliphila είκαζ εεηζηυ βζα ηζξ δμηζιαζίεξ ηαηαθάζδξ ηαζ μλεζδάζδξ. Έπεζ ηδκ ζηακυηδηα κα πανάβεζ μλέα ηαηά ημκ ιεηααμθζζιυ ηδξ βθοηυγδξ ηάης απυ αενυαζεξ ζοκεήηεξ ηαζ ιεηαηνέπεζ κα κζηνζηά ζε κζηνχδδ. Δπίζδξ οδνμθφεζ ηδκ ηαγεΐκδ ηαζ ηδκ γεθαηίκδ αθθά υπζ ημ άιοθμ ηαζ ημ DNA. Σμ ααηηήνζμ αοηυ έπεζ ηδκ ζηακυηδηα κα ακαπηφζζεηαζ ζημοξ 4 μ C αθθά υπζ ζημοξ 40 μ C. Ακαπηφζζεηαζ ζε μοδέηενμ ηαζ αθηαθζηυ πενζαάθθμκ ιε ηζιέξ ph ιέπνζ 10, αθθά βζα κα ιπμνέζεζ κα ακαπηοπεεί ζε ηυζμ αθηαθζηυ ph απαζηεί ηδκ πανμοζία NaCl, ημ μπμίμ υιςξ δεκ είκαζ απαναίηδημ βζα ηδκ ακάπηολδ ημο ζε μοδέηενμ ph. (Yumoto et al 2001). Pseudomonas toyotomiensis: Σμ ααηηήνζμ P.toyotomiensis απμιμκχεδηε βζα πνχηδ θμνά ημ 2011 απυ δείβια πχιαημξ ηαζ ζφιθςκα ιε ηδκ ακάθοζδ ημο 16s RNA βμκζδίμο, ημ ααηηήνζμ αοηυ ακήηεζ ζημ pseudomonas oleovorans group. Έπεζ ηδκ ζηακυηδηα κα ακαπηφζζεηαζ ζε έκα ιεβάθμ εφνμξ ph (6-10) ηαζ εενιμηναζζχκ (4 o C-42 o C) ιε αέθηζζηδ εενιμηναζία ακάπηολδξ ημοξ 35 o C. Έπεζ ηδκ ζηακυηδηα κα οδνμθφεζ ηδκ α- εζημοθίκδ, Tween 20, 40, 60 ηαζ 80 αθθά δεκ ιπμνεί κα οδνμθφζεζ, ηαγεΐκδ, γεθαηίκδ ηαζ άιοθμ (Hirota et al 2011). 18

19 1.2. ΠΑΘΟΓΟΝΟ ΓΡΑΖ ΣΧΝ ΦΔΤΓΟΜΟΝΑΓΧΝ ΚΤΡΗΟΣΔΡΑ ΝΟΖΜΑΣΑ ΠΟΤ ΟΦΔΗΛΟΝΣΑΗ Δ ΒΑΚΣΖΡΗΑ ΣΟΤ ΓΔΝΟΤ PSEYDOMONAS Μενζηά είδδ ρεοδμµμκάδςκ είκαζ παεμβυκα ηαζ απμιμκχεδηακ απυ ηθζκζηά δείβιαηα, αθθά ηα πενζζζυηενα είδδ εεςνμφκηαζ δοκδηζηά παεμβυκα. Οζ παεμβυκεξ ρεοδμιμκάδεξ παναηηδνίγμκηαζ ςξ "παιδθήξ θμζιμβυκμο ζηακυηδηαξ (virulence)", δεδμιέκμο υηζ πνμηαθμφκ αζεέκεζεξ ηονίςξ ζε ακενχπμοξ µε ακεπανηέξ ακμζμπμζδηζηυ ζφζηδια. Θεςνμφκηαζ ιεηαδμηζηέξ αθθά υπζ δεοηενμβεκχξ ιεηαδζδυιεκεξ. Σμ ααηηήνζμ P. aeruginosa είκαζ µία απυ ηζξ ηνεζξ επζηναηέζηενεξ δοκδηζηέξ αζηίεξ πνυηθδζδξ ιμθοζιαηζηχκ αζεεκεζχκ ζε ακενχπμοξ (Stover et al. 2000) ηαζ πνμηαθεί αζεέκεζεξ ζε θοηά, βεβμκυξ πμο οπμδεζηκφεζ ηδ δοζημθία δζάηνζζδξ ιεηαλφ θοημπαεμβυκςκ ηαζ ηθζκζηχκ ρεοδμιμκάδςκ (Todar 2004). Οζ ζοκδεέζηενεξ αζεέκεζεξ πμο απμδίδμκηαζ ζηδκ P.aeruginosa είκαζ μζ αηυθμοεεξ: Λνηκώμεηο ηνπ αλαπλεπζηηθνύ: οιααίκμοκ ζπεδυκ απμηθεζζηζηά ζε ακενχπμοξ µε ηαηαζηαθιέκμ ακμζμπμζδηζηυ ζφζηδια, υπςξ ηανηζκμπαεείξ πμο οπυηεζκηαζ ζε πδιεζμεεναπεία. Ζ ιαηνυπνμκδ απμίηζζδ ημο ακαπκεοζηζημφ ζοζηήιαημξ απυ αθεκκχδδ ζηεθέπδ P.aeruginosa ζε αζεεκείξ µε ηοζηζηή ίκςζδ είκαζ ζοπκή ηαζ ανηεηέξ θμνέξ, ζε ζοκδοαζιυ µε ηδ θοζζηή ακεεηηζηυηδηα ημο ιζηνμαίμο ζηα ακηζαζμηζηά, δ ηεθζηή έηααζδ είκαζ ιμζναία (Stover et al 2000b). Βαθηεξηαηκία: Ζ P.aeruginosa πνμηαθεί ααηηδνζαζιία ηονίςξ ζε ακαζμηαηεζηαθιέκμοξ αζεεκείξ ηαζ ζε άημια πμο έπμοκ πνμδζάεεζδ ζε αζιαημθμβζηέξ ηαημήεεζεξ, αζεεκείξ µε ζφκδνμιμ επίηηδηδξ ακμζζαηήξ ακεπάνηεζαξ (AIDS), μοδεηενμπεκία, ζαηπανχδδ δζααήηδ ηαζ ζμαανά εβηαφιαηα. Σα πενζζζυηενα πενζζηαηζηά εηδδθχκμκηαζ ιέζα ζηα κμζμημιεία ηαζ ηζξ ηθζκζηέξ. Ζ ρεοδμιμκάδα απμηεθεί ημκ αζηζμθμβζηυ πανάβμκηα βζα ημ 25% ηςκ εκδμκμζμημιεζαηχκ ααηηδνζαζιζχκ (Todar 2004). Δλδνθαξδίηηδα: Ζ P.aeruginosa (πομηοακζηή ρεοδμιμκάδα) πνμζαάθθεζ ηζξ ηανδζαηέξ ααθαίδεξ ηςκ πνδζηχκ εκδμθθέαζςκ μοζζχκ ηαζ ηςκ ακενχπςκ µε ηεπκδηέξ ηανδζαηέξ ααθαίδεξ. Σμ ιζηνυαζμ εβηαείζηαηαζ ζημ εκδμηάνδζμ µε άιεζδ δζείζδοζδ απυ ημ αίια (Todar 2004). Λνηκώμεηο ηνπ Κεληξηθνύ Νεπξηθνύ πζηήκαηνο: Ζ πομηοακζηή ρεοδμιμκάδα πνμηαθεί ιδκζββίηζδεξ ηαζ εβηεθαθζηά απμζηήιαηα. Σμ ιζηνυαζμ εζζαάθθεζ ζημ ηεκηνζηυ κεονζηυ ζφζηδια, είηε απυ ηα παναηείιεκα υνβακα υπςξ ημ εζςηενζηυ αοηί ή μ 19

20 παναννζκζηυξ ηυθπμξ, είηε άιεζα µέζς ηνακζαηχκ ηναοιάηςκ, πεζνμονβζηχκ ηαζ δζαβκςζηζηχκ επεµαάζεςκ είηε απυ απμιαηνοζιέκα ιμθοζιέκα υνβακα υπςξ ημ μονμπμζδηζηυ ζφζηδια (Todar 2004). Ωηίηηδεο: Ζ P.aeruginosa είκαζ ημ επζηναηέζηενμ αίηζμ πνυηθδζδξ ελςηενζηήξ ςηίηζδαξ. Σμ ιζηνυαζμ ζοπκά απμζηίγεζ ημ ελςηενζηυ αημοζηζηυ πυνμ οπυ ζοκεήηεξ ηναοιαηζζιμφ, φβνακζδξ ηαζ θθεβιμκήξ (Todar 2004). Λνηκώμεηο νθζαικώλ: Μυθοκζδ ημο ακενχπζκμο ιαηζμφ µε P.aeruginosa μδδβεί ζε μλεία θθεβιμκή ηαζ έθημξ ηεναημεζδμφξ πμο ελεθίζζεηαζ ναβδαία ζε δζάηνδζδ ηαζ ιυκζµδ ιείςζδ ηδξ υναζδξ, ακ δεκ ακηζιεηςπζζηεί επζηοπχξ. Σέημζεξ θθεβιμκέξ είκαζ ζοπκέξ (επίπηςζδ πενίπμο 13%) ζημοξ ακενχπμοξ πμο πνδζζιμπμζμφκ θαημφξ επαθήξ είηε θυβς εθθζπμφξ ηαεανζζµμφ ηςκ θαηχκ είηε θυβς ηναοιαηζζιμφ ημο ιαηζμφ απυ ημοξ (Bukanov et al 1994). Λνηκώμεηο νζηώλ θαη ζπλδέζκσλ: Οζ θμζιχλεζξ ηςκ μζηχκ ηαζ ηςκ ζοκδέζιςκ ζοιααίκμοκ είηε µε άιεζμ απμζηζζιυ ημο ιζηνμαίμο είηε µε ιεηαθμνά ημο ιζηνμαίμο µέζς ημο αίιαημξ απυ άθθεξ επζιμθοζιέκεξ πδβέξ. Οζ ιμθφκζεζξ µέζς αίιαημξ είκαζ πενζζζυηενμ ζοπκέξ ζε πνήζηεξ εκδμθθέαζςκ μοζζχκ ηαζ ζε ζοκδοαζιυ µε θμζιχλεζξ ημο μονμπμζδηζημφ ή ηδξ ποέθμο. Ζ P.aeruginosa πνμηαθεί πνυκζα μζηεμιοεθίηζδα, πμο ζοκήεςξ μθείθεηαζ ζε άιεζμ απμζηζζιυ ημο ιζηνμαίμο ηαζ είκαζ ημ πζμ ζοπκυ παεμβυκμ πμο ειπθέηεηαζ ζε μζηεμπμκδνίηζδα φζηενα απυ ηναφιαηα πμο πνμήθεακ απυ παναηεκηήζεζξ (Todar 2004). Λνηκώμεηο ηνπ νπξνπνηεηηθνύ ζπζηήκαηνο: Οζ θμζιχλεζξ αοηέξ, ζοκήεςξ απμηηχκηαζ εκδμκμζμημιεζαηά ηαζ ζπεηίγμκηαζ µε ηαεεηδνζαζιμφξ ή πεζνμονβζηέξ επειαάζεζξ. Ζ πομηοακζηή ρεοδμιμκάδα είκαζ ημ ηνίημ επζηναηέζηενμ αίηζμ ηςκ εκδμκμζμημιεζαηχκ θμζιχλεςκ ημο μονμπμζδηζημφ ηαζ εοεφκεηαζ βζα ημ 12% πενίπμο υθςκ ηςκ θμζιχλεςκ αοημφ ημο ηφπμο. Δπζπθέμκ, δ πομηοακζηή ρεοδμιμκάδα ιπμνεί κα εζζέθεεζ ζημ ηοηθμθμνζηυ ζφζηδια µέζς ημο μονμπμζδηζημφ ηαζ απμηεθεί αζηζμθμβζηυ πανάβμκηα βζα ημ 40% πενίπμο υθςκ ηςκ ρεοδμιμκαδζηχκ ααηηδνζαζιζχκ (Todar 2004). Λνηκώμεηο ηνπ γαζηξεληεξηθνύ ζσιήλα: Ζ P.aeruginosa ιπμνεί κα πνμηαθέζεζ θμζιχλεζξ ζε μπμζμδήπμηε ζδιείμ ημο βαζηνεκηενζημφ ζςθήκα απυ ημ θάνοββα έςξ ημκ πνςηηυ. Οζ θμζιχλεζξ αοημφ ημο είδμοξ ζοκήεςξ πνμηαθμφκηαζ ζε ακαζμηαηεζηαθιέκμοξ. Σμ ιζηνυαζμ έπεζ εκμπμπμζδεεί βζα πενζπνςηηζηέξ θμζιχλεζξ, ηοπζηή βαζηνεκηενίηζδα ηαζ εκηενμημθίηζδα. Ο βαζηνεκηενζηυξ ζςθήκαξ απμηεθεί επίζδξ µία ζδιακηζηή πφθδ εζζυδμο βζα ηδκ εηδήθςζδ ρεοδμιμκαδζηήξ ζδραζιίαξ (Todar 2004). 20

21 Λνηκώμεηο ηνπ δέξκαηνο θαη ησλ καιαθώλ ηζηώλ: Ζ P.aeruginosa πνμηαθεί πθδεχνα θμζιχλεςκ ημο δένιαημξ είηε εκημπζζιέκεξ είηε δζάποηεξ. Πνμδζαεεηζημί πανάβμκηεξ είκαζ δ θφζδ ηδξ ζοκέπεζαξ ημο δένιαημξ είηε απυ ηναφιαηα είηε απυ εβηαφιαηα, μζ ζοκεήηεξ ορδθήξ οβναζίαξ υπςξ ζοιααίκεζ ζημ αοηί ηςκ ημθοιαδηχκ, ζηα πυδζα ηςκ αεθδηχκ ηαζ ζημοξ αζεεκείξ µε AIDS. Ζ ρεοδμιμκάδα έπεζ επίζδξ εκμπμπμζδεεί βζα ηδ εοθαηίηζδα υπςξ ηαζ βζα µδ- ακηζιεηςπίζζµεξ ιμνθέξ ημζκήξ αηιήξ (Todar 2004). φιθςκα µε ημ CDC (Centers for Disease Control and Prevention, USA), δ μθζηή επίπηςζδ ηςκ θθεβιμκχκ απυ P.aeruginosa ζε κμζμημιεία ηςκ Ζκςιέκςκ Πμθζηεζχκ ηδξ Αιενζηήξ είκαζ ηαηά µέζμ υνμ πενίπμο 0,4%, ηαζ ημ ααηηήνζμ αοηυ είκαζ ημ ηέηανημ πζμ ζοπκά εονζζηυµεκμ κμζμημιεζαηυ παεμβυκμ ηαζ οπεφεοκμ βζα ημ 14% ημο ζοκυθμο ηςκ εκδμκμζμημιεζαηχκ θμζιχλεςκ (CDC). Οζ ηονζυηενμζ θυβμζ πμο μζ ρεοδμιμκάδεξ άνπζζακ κα επζηναημφκ, απυ ημκ πεναζµέκμ αζχκα, ςξ µία απυ ηζξ ηονζυηενεξ δοκδηζηέξ αζηίεξ αζεεκεζχκ, είκαζ δ ακεεηηζηυηδηά ημοξ ζε ακηζαζμηζηά ηαζ απμθοιακηζηά ηαζ δ πνμζανιμζηζηυηδηά ημοξ ςξ πνμξ ηζξ δζαηνμθζηέξ ημοξ ζοκήεεζεξ (Stover et al 2000a). Οζ ρεοδμιμκάδεξ ιπμνμφκ κα επζαζχκμοκ επί ιαηνυκ ζε πμθφ δζαθμνεηζηά πενζαάθθμκηα θυβς ηςκ πμθθχκ εκγφιςκ πμο έπμοκ, ηα μπμία ημοξ επζηνέπεζ κα ζοκεέημοκ ηζξ απαναίηδηεξ εκχζεζξ βζα ηδ δζαηνμθή ημοξ απυ ηζξ απθμφζηενεξ εκχζεζξ πμο ανίζημοκ ζημ πενζαάθθμκ. Πμθθά οθζηά πμο πνδζζιμπμζμφκηαζ ζηα κμζμημιεία, ζοπκά ιμθφκμκηαζ µε ρεοδμιμκάδεξ υπςξ ακηζζδπηζηά οβνά (εκχζεζξ ηεηανημηαβμφξ αιιςκίμο, πθςνεδζλίκδ), απμθοιακηζηά, αθθά ηονίςξ κενυ, δζαθφιαηα ηαζ ζαηνζηά ενβαθεία (Todar 2004). ηα κμζμημιεία, μζ ρεοδμιμκάδεξ ιεηαθένμκηαζ µέζς ηςκ ημπνάκςκ ηαζ ηςκ ηνμθχκ. Δπζπθέμκ, μζ επζζηέπηεξ ηαζ ημ πνμζςπζηυ ιεηαθένμοκ ηα ααηηήνζα µέζς ηςκ ακηζηεζιέκςκ (ηνμθέξ, θοηά, θμοθμφδζα, δχνα). Σα θαπακζηά έπμοκ ακαθενεεί ςξ µία απυ ηζξ ηφνζεξ πδβέξ ιυθοκζδξ ηςκ κμζμημιεζαηχκ πχνςκ µε ηδκ P.aeruginosa (Correa et al 1991). Ζ πμζηζθυηδηα ηςκ πενζααθθυκηςκ πμο εοκμμφκ ηδκ εβηαηάζηαζδ ηαζ ακάπηολδ ηςκ ρεοδμιμκάδςκ δδιζμονβμφκ δοζημθίεξ ζημκ έθεβπμ ημο ιζηνμμνβακζζιμφ ζηα κμζμημιεία ιε απμηέθεζια δ πνυθδρδ ηδξ ιυθοκζδξ κα εεςνείηαζ ζπεδυκ αδφκαηδ. Ο ιεβαθφηενμξ ηίκδοκμξ εθθμπεφεζ βζα ημοξ ακμζμηαηεζηαθιέκμοξ, ηα κεμβκά, ημοξ ηανηζκμπαεείξ ηαζ ηζξ βοκαίηεξ πμο εβηοιμκμφκ ηαζ ημοξ ακενχπμοξ πμο έπμοκ οπμζηεί εβηαφιαηα. (Todar 2004). 21

22 ΔΚΚΡΗΖ ΠΡΧΣΔΨΝΧΝ ΣΑ ΑΡΝΖΣΗΚΑ ΚΑΣΑ GRAM ΒΑΚΣΖΡΗΑ Ζ έηηνζζδ πνςηεσκχκ έπεζ έκακ πνςηανπζηυ νυθμ ζηδ δζαιυνθςζδ ηςκ αθθδθεπζδνάζεςκ ηςκ ααηηδνίςκ ιε ημ αζμηζηυ ηαζ ααζμηζηυ πενζαάθθμκ ημοξ. Έκαξ ιεβάθμξ ανζειυξ πνςηεσκχκ, πμο εηηνίκμκηαζ απυ παεμβυκμοξ ηαζ άθθμοξ ζοιαζςηζημφξ ιζηνμμνβακζζιμφξ, πνμμνίγμκηαζ κα εζζαπεμφκ ζηα ηφηηανα ημο λεκζζηή ιε ζημπυ ηδκ ηνμπμπμίδζδ ηδξ θοζζμθμβίαξ ημο ηαζ ηδκ πνμχεδζδ ηδξ απμίηζζδξ (ημλίκεξ ηαζ πνςηεΐκεξ ηεθεζηέξ). Έηζζ, έπμοκ ακαπηοπεεί δζάθμνα ελεζδζηεοιέκα ζοζηήιαηα έηηνζζδξ πνςηεσκχκ βζα κα δζεοημθφκμοκ ηδ δζαδζηαζία αοηή. ηδκ πενίπηςζδ ηςκ ανκδηζηχκ ηαηά Gram ααηηδνίςκ, υπμο δ έηηνζζδ απαζηεί ηδ ιεηαθμνά ιαηνμιμνίςκ δζαιέζμο ηδξ εζςηενζηήξ ηαζ ελςηενζηήξ ιειανάκδξ ημο ααηηδνζαημφ ηοηηάνμο, έπμοκ πνμζδζμνζζηεί ιέπνζ ζήιενα έλζ βεκζηέξ ηαηδβμνίεξ ζοζηδιάηςκ έηηνζζδξ πνςηεσκχκ. Ονζζιέκεξ εηηνζκυιεκεξ πνςηεΐκεξ δζαζπίγμοκ ηδκ εζςηενζηή ηαζ ελςηενζηή ιειανάκδ ζε έκα εκζαίμ αήια ιέζς ηςκ ζοζηδιάηςκ έηηνζζδξ ηφπμο Η, ηφπμο ΗΗΗ, ηφπμο IV ή ηφπμο VI. Άθθεξ πνςηεΐκεξ εηηνίκμκηαζ ανπζηά ζημκ πενζπθαζιζηυ πχνμ ιέζς ημο βεκζημφ ιμκμπαηζμφ Sec ή ημο ιμκμπαηζμφ ηςκ δφμ ανβζκζκχκ (Two-arginine, Σat) ηαζ ζηδ ζοκέπεζα δζαζπίγμοκ ηδκ ελςηενζηή ιειανάκδ ιέζς ηςκ εηηνζηζηχκ ζοζηεοχκ ηφπμο ΗΗ, ηφπμο V ή θζβυηενμ ζοπκά, ηφπμο Η ή ηφπμο IV. Σα εηηνζηζηά ζοζηήιαηα ηφπμο II ηαζ V απαζημφκ βεκζηά ηδκ πανμοζία εκυξ αιζκμηεθζημφ πεπηζδίμο ζήιαημξ πνμηεζιέκμο κα πνδζζιμπμζήζμοκ ημ ιμκμπάηζ Sec βζα ηδκ έηηνζζδ απυ ημ ηοηηανυπθαζια ζημ πενίπθαζια. Ακηίεεηα, ηα εηηνζηζηά ζοζηήιαηα ηφπμο I, III ηαζ IV, ιπμνμφκ κα εηηνίκμοκ ιία πνςηεΐκδ ζηδκ απμοζία αιζκμηεθζημφ πεπηζδίμο ζήιαημξ. Δκχ ηα ζοζηήιαηα ηφπμο I ηαζ V είκαζ ζπεηζηά απθά, απμηεθμφιεκα απυ ιυκμ δφμ ή ηνεζξ πνςηεΐκεξ, ηα εηηνζηζηά ζοζηήιαηα ηφπμο II ηαζ IV απμηεθμφκηαζ απυ ζφκεεηα πμθοπνςηεσκζηά ζφιπθμηα, πμο δζαζπίγμοκ μθυηθδνμ ημ ηοηηανζηυ θάηεθμ. Σα εηηνζηζηά ζοζηήιαηα ηφπμο III, IV ηαζ VI ειπθέημκηαζ ζε αθθδθεπζδνάζεζξ ιεηαλφ ααηηδνζαηχκ ηαζ εοηανοςηζηχκ ηοηηάνςκ ηαζ ζηδ ιεηαθμνά ααηηδνζαηχκ πνςηεσκχκ-ηεθεζηχκ απεοεείαξ ζημ εοηανοςηζηυ ηοηηανυπθαζια. Σα ηνία αοηά εηηνζηζηά ζοζηήιαηα ζοπκά ηςδζημπμζμφκηαζ απυ ιεβάθα ζοιπθέβιαηα βεζημκζηχκ/μιαδμπμζδιέκςκ βμκζδίςκ ηα μπμία ανίζημκηαζ ζε παεμβυκα ηαζ μκμιάγμκηαζ κδζίδεξ παεμβέκεζαξ (Pathogenicity islands, PAIs) (Cornelis and Van Gijsegem 2000). 22

23 Δζηυκα 1: πδιαηζηή απεζηυκζζδ ηςκ 7 δζαθμνεηζηχκ εηηνζηζηχκ ζοζηδιάηςκ (Cornelis and Van Gijsegem 2000) Όθα ηα εηηνζηζηά ζοζηήιαηα έπμοκ ανεεεί ζε ααηηήνζα ημο βέκμοξ Pseudomonas. Με ελαίνεζδ ημ εηηνζηζηυ ζφζηδια ημο IV υθα ηα οπυθμζπα εηηνζηζηά ζοζηήιαηα έπμοκ ιεθεηδεεί ζηα ααηηήνζα ημο είδμοξ P.aeruginosa. Ζ P.aeruginosa απμηεθεί μνβακζζιυ ιμκηέθμ βζα ηδ ιεθέηδ ηδξ έηηνζζδξ πνςηεσκχκ. Σα πμθθά ηαζ δζαθμνεηζηά εηηνζηζηά ζοζηήιαηα πμο δζαεέηεζ δζεοημθφκμοκ ημ ααηηήνζμ κα πανάβεζ ηαζ κα εηηνίκεζ έκα ιεβάθμ ανζειυ ελςπνςηεσκχκ. Σα εηηνζηζηά ζοζηήιαηα ηφπμο ΗΗΗ ηαζ ηφπμο VI είκαζ αοηά πμο έπμοκ ιεθεηδεεί πενζζζυηενμ εηηεηαιέκα απυ υθα ηα οπυθμζπα εηηνζηζηά ζοζηήιαηα ηςκ ααηηδνίςκ ημο βέκμοξ Pseudomonas ηαζ ιάθζζηα ζε ιεβαθφηενμ ααειυ ζηα ααηηήνζα ημο είδμοξ P.aeruginosa. 23

24 ΠΔΡΗΓΡΑΦΖ ΣΟΤ ΔΚΚΡΗΣΗΚΟΤ ΤΣΖΜΑΣΟ ΗΗΗ Σμ εηηνζηζηυ ζφζηδια ΗΗΗ πενζθαιαάκεζ ιζα πθεζάδα πνςηεσκχκ πμο ιπμνμφκ κα δζαηνζεμφκ ζε δμιζηέξ, εηηνζκυιεκεξ ηαζ αμδεδηζηέξ. Οζ δμιζηέξ ζπδιαηίγμοκ: (i) ημ ααζζηυ ζχια ηδξ εηηνζηζηήξ ιδπακήξ, πμο είκαζ ιζα οπενιμνζαηή δμιή πμο δζαπενκά ηζξ δφμ ιειανάκεξ ηαζ ημ πενίπθαζια ημο ααηηδνίμο ηαζ ζοκδέεζ ημ ηοηηανυπθαζια ιε ημκ ελςηοηηάνζμ πχνμ. (ii) Μζα ελςηοηηάνζα πνμέηηαζδ ημο ααζζημφ ζχιαημξ, πμο είκαζ ιζα επζιήηδξ, ηοθζκδνζηή δμιή ηαζ θεζημονβεί πζεακυηαηα ςξ αβςβυξ, ιέζς ημο μπμίμο ιεηαθένμκηαζ μζ ιμθοζιαηζημί πανάβμκηεξ ζημ ηοηηανυπθαζια ημο λεκζζηή. Οζ εηηνζκυιεκεξ πνςηεΐκεξ δζαηνίκμκηαζ: (i) ζημοξ πανάβμκηεξ παεμβέκεζαξ (effectors), πμο δνμοκ ζημ εζςηενζηυ ημο λεκζζηή ηαζ (ii) ζηζξ πνςηεΐκεξ δζάκμζλδξ/ιεηαθμνάξ (translocators), πμο εεςνμφκηαζ οπεφεοκεξ βζα ηδ δζάκμζλδ πυνμο ζηδ ιειανάκδ ημο λεκζζηή. Σέθμξ, οπάνπεζ ιζα μιάδα αμδεδηζηχκ πνςηεσκχκ (chaperones, ζαπενυκεξ) πμο είκαζ απαναίηδηεξ βζα ηδκ έηηνζζδ μνζζιέκςκ παναβυκηςκ. Οζ πνςηεΐκεξ αοηέξ πζζηεφεηαζ υηζ ιεηαλφ άθθςκ ειπθέημκηαζ ζηδκ ζενανπζηή έηηνζζδ ηςκ οπμζηνςιάηςκ ημο εηηνζηζημφ ζοζηήιαημξ ηαζ πανάθθδθα δζαζθαθίγμοκ ηδκ αηεναζυηδηα ημοξ ζημ ηοηηανυπθαζια ημο παεμβυκμο (Cornelis and Van Gijsegem 2000). Δθθξηηηθή κεραλή. Ζ εηηνζηζηή ιδπακή απανηίγεηαζ απυ ημ ααζζηυ ζχια ηαζ έκα ηοθζκδνζηυ ζπδιαηζζιυ πμο εηηείκεηαζ πένα απυ ηδκ επζθάκεζα ημο ααηηδνίμο. Σμ ααζζηυ ζχια είκαζ έκα πμθφ-πνςηεσκζηυ ζφιπθμημ, πμο δμιείηαζ απυ πενίπμο πνςηεΐκεξ (Hueck 1998). Γζαπενκά ηζξ δφμ ααηηδνζαηέξ ιειανάκεξ, ημ πενίπθαζια ηαζ ζοκδέεζ ημ ηοηηανυπθαζια ιε ημκ ελςηοηηάνζμ πχνμ. Μέζς αοηήξ ηδξ δμιήξ μζ εηηνζκυιεκεξ πνςηεΐκεξ οπενπδδμφκ ηα ειπυδζα ηςκ θζπζδζηχκ δζπθμζημζαάδςκ ηαζ ηςκ πεπηζδμβθοηακχκ ζημ δνυιμ ημοξ πνμξ ηδκ έλμδμ (Kimbrough and Miller 2000). Πνυηεζηαζ βζα ιζα ηοθζκδνζηή δμιή, πμο πενζαάθθεηαζ απυ δφμ γεφβδ δαηηοθίςκ. Σμ έκα γεφβμξ εκημπίγεηαζ ζηδκ πενζμπή ηδξ ελςηενζηήξ ιειανάκδξ ηαζ ημ δεφηενμ ζηδκ πενζμπή ηδξ εζςηενζηήξ. ηδκ πενίπηςζδ ημο ιαζηζβίμο δ ζοζηεοή απμθήβεζ ζημ ηοηηανυπθαζια ημο ααηηδνίμο ζε έκα δαηηφθζμ πμο μκμιάγεηαζ ηοηηανμπθαζιαηζηυξ δαηηφθζμξ (Cytoplasmic ή C-ring, πενζζζυηενεξ θεπημιένεζεξ βζα ηδ δμιή αοηή ακαθένμκηαζ ζηδ ζοκέπεζα). Ακηίζημζπα πεζνάιαηα πμο απμηαθφπημοκ ηδ δμιή ημο ααζζημφ ζχιαημξ θοηζηχκ παεμβυκςκ δεκ έπμοκ ακαθενεεί. Απυ ηζξ πνςηεΐκεξ ημο ααζζημφ ζχιαημξ είκαζ βκςζηή ζε ορδθή δζαηνζηζηυηδηα ιυκμ δ δμιή ηδξ ηαναμλοηεθζηήξ οπμιμκάδαξ ηδξ πνςηεΐκδξ FliG ημο ιαζηζβίμο (Brown et al 2005). Ζ πνμέηηαζδ ημο ααζζημφ ζχιαημξ ηδξ εηηνζηζηήξ ζοζηεοήξ (Δζη.2) ζημκ ελςηοηηάνζμ πχνμ είκαζ ιζα επζιήηδξ, ηοθζκδνζηή δμιή πμο ακάθμβα ιε ημ παεμβυκμ ζημ 24

25 μπμίμ παναηδνείηαζ ακαθένεηαζ ςξ pilus (ζηα θοημπαεμβυκα) ή needle (ζηα γςμπαεμβυκα, (Kimbrough and Miller 2000). H δμιή αοηή εεςνείηαζ ακάθμβδ ημο ιαζηζβίμο ηαζ ζοκίζηαηαζ απυ ηδ ζοιιεηνζηή επακάθδρδ ιζαξ ή πενζζζυηενςκ ιζηνχκ, οδνυθζθςκ πνςηεσκχκ. Απυ δεδμιέκα δθεηηνμκζηήξ ιζηνμζημπίαξ βίκεηαζ θακενυ υηζ πανμοζζάγεζ ιεβάθεξ μιμζυηδηεξ ιεηαλφ γχμ- ηαζ θοημπαεμβυκςκ. Ζ ζδιακηζηυηενδ δζαθμνά πμο παναηδνήεδηε είκαζ ημ πμθφ ιεβαθφηενμ ιήημξ ημο pilus ζοβηνζηζηά ιε ημ needle πμο είκαζ πζεακυ κα μθείθεηαζ ζημ υηζ ημ pilus πνέπεζ κα δζαπενκά υθμ ημ πάπμξ ημο ηοηηανζημφ ημζπχιαημξ (>100 nm) ηςκ θοηζηχκ ηοηηάνςκ πνμηεζιέκμο κα πνμζεββίζεζ ημ ηοηηανυπθαζια ημοξ (Büttner and Bonas 2003). Δζηυκα 2: πδιαηζηή απεζηυκζζδ ηδξ εηηνζηζηήξ ζοζηεοήξ εηηνζηζημφ ζοζηήιαημξ ηφπμο ΗΗΗ. Ζ ελαηνίαςζδ ημο νυθμο ημο needle/pilus ςξ απθυ ενβαθείμ πνμζηυθθδζδξ απμηεθεί εδχ ηαζ πνυκζα ακηζηείιεκμ δζαιάπδξ ηαζ ένεοκαξ. Έπεζ δεζπηεί υηζ μζ δμιέξ αοηέξ είκαζ απαναίηδηεξ βζα ηδκ εηδήθςζδ παεμβέκεζαξ ηαζ υηζ δ ηφπμο ΗΗΗ-εθεβπυιεκδ έηηνζζδ βίκεηαζ ιυκμ απυ μνζζιέκα ζδιεία ημο ααηηδνίμο πμο ζοιπίπημοκ ιε ηδκ πανμοζία ημοξ ζηδκ επζθάκεζα ημο ααηηδνίμο (Büttner and Bonas 2003) ΜΖΥΑΝΗΜΟ ΜΔΣΑΦΟΡΑ ΣΟ ΚΤΣΣΑΡΟΠΛΑΜΑ ΣΟΤ ΞΔΝΗΣΖ Γζα κα εζζέθεμοκ ζημ ηοηηανυπθαζια ημο λεκζζηή μζ πανάβμκηεξ παεμβέκεζαξ απαζηείηαζ δ ηαηαζηνμθή ηδξ ιειανάκδξ ημο λεκζζηή ηαζ δ δδιζμονβία εκυξ πυνμο ιεηαθμνάξ (translocon). Ζ δζάκμζλδ ημο πυνμο απμδίδεηαζ ζηζξ θεβυιεκεξ πνςηεΐκεξ δζάκμζλδξ/ιεηαθμνάξ (translocators). Γφμ ημοθάπζζημκ απυ αοηέξ πζζηεφεηαζ υηζ ζοκαενμίγμκηαζ ςξ μθζβμιενή ηαζ ζπδιαηίγμοκ έκα ζφιπθμημ ζηακυ κα ηαηαζηνέρεζ ηδ 25

26 ιειανάκδ ημο λεκζζηή ηαζ κα δδιζμονβήζεζ ιζα πφθδ εζζυδμο βζα ημοξ ιμθοζιαηζημφξ πανάβμκηεξ. ηα θοημπαεμβυκα δ HrpF ηδξ Xanthomonas είκαζ δ ιυκδ οπμρήθζα πνςηεΐκδ-translocator (Büttner and Bonas 2003). Έηζζ, μ παναηηδνζζιυξ ημο ζοιπθυημο δζάκμζλδξ/ιεηαθμνάξ αθμνά πνμξ ημ πανυκ ηα παεμβυκα γςζηχκ ηοηηάνςκ ιε πζεακέξ οπμρήθζεξ πνςηεΐκεξ ηζξ YpoB/YopD (Yersinia), IpaB/IpaC (Shigella), EspB/EspD (Escherichia coli) ηαζ PopB/PopD (P. Aeruginosa). Έπεζ ανεεεί υηζ μζ πνςηεΐκεξ αοηέξ απμηεθμφκ οπμζηνχιαηα ημο εηηνζηζημφ ιδπακζζιμφ ΗΗΗ ηαζ έπμοκ πνμαθεπυιεκεξ δζαιειανακζηέξ πενζμπέξ. Οζ πνςηεΐκεξ αοηέξ έπμοκ ηδκ ζδζυηδηα κα μθζβμιενίγμκηαζ, κα ακαβκςνίγμοκ ιειανάκεξ ηαζ κα πνμζδέκμκηαζ ζε αοηέξ ηαζ ηεθζηά κα ηζξ ηαηαζηνέθμοκ δδιζμονβχκηαξ πυνμοξ (Büttner and Bonas 2003). απεξόλεο. Ζ απμηεθεζιαηζηή ηφπμο ΗΗΗ έηηνζζδ ελανηάηαζ απυ ηδκ πανμοζία ηαζ δνάζδ ιζαξ μιάδαξ ηοηηανμπθαζιαηζηχκ πνςηεσκχκ πμο μκμιάγμκηαζ αμδεδηζηέξ (chaperones) (Cornelis and Van Gijsegem 2000). Οζ πνςηεΐκεξ αοηέξ πμο έπμοκ ζπεηζηά ιζηνυ ιέβεεμξ ηαζ ιζηνή ηζιή ζζμδθεηηνζημφ ζδιείμο, ακαβκςνίγμοκ ιε ιεβάθδ εζδζηυηδηα ημ οπυζηνςια ημοξ πμο είκαζ μζ παεμβυκμζ πανάβμκηεξ ηαζ μζ πνςηεΐκεξ δζάκμζλδξ/ιεηαθμνάξ. οπκά ημ βμκίδζμ πμο ηζξ εηθνάγεζ ανίζηεηαζ δίπθα ζημ βμκίδζμ ημο οπμζηνχιαημξ ημοξ. Πνυζθαηα πνμηάεδηε μ δζαπςνζζιυξ ημοξ ζε δφμ ηφνζεξ μιάδεξ ακάθμβα ιε ημ ακ είκαζ ζαπενυκεξ παεμβυκςκ παναβυκηςκ ή πνςηεσκχκ δζάκμζλδξ/ιεηαθμνάξ (Pallen et al 2006). Ο δζαπςνζζιυξ αοηυξ ααζίζηδηε ζηδκ παναηήνδζδ υηζ δ πνχηδ ηαηδβμνία θαίκεηαζ κα ιμζνάγεηαζ ημζκά παναηηδνζζηζηά ιε εοηανοςηζηέξ ζαπενυκεξ εκχ δ δεφηενδ υπζ. Δπζπθέμκ μζ ζαπενυκεξ ιμθοζιαηζηχκ παναβυκηςκ πνμαθέπεηαζ κα έπμοκ ιζηηή δμιή άθθα-έθζηαξ-αήηα-πηοπήξ εκχ βζα ηζξ ζαπενυκεξ ηςκ πνςηεσκχκ δζάκμζλδξ/ιεηαθμνάξ πνμαθέπεηαζ ιζα πθήνςξ άθθα-δμιή. Μέπνζ ηχνα έπμοκ πνμζδζμνζζηεί δμιέξ ζαπενμκχκ ημο εηηνζηζημφ ιδπακζζιμφ ηφπμο ΗΗΗ απυ γςζηά παεμβυκα πμο ακήημοκ ζηδκ πνχηδ ηαηδβμνία π.π. CesT απυ ηδκ εκηενμαζιμνναβζηή (enterohemorrhagic) E. coli ηαζ SigE απυ ηδ S. enterica (Luo et al 2001) ηαζ SycE απυ ηδ Y. Pestis (Birtalan et al 2002a). Όθεξ αοηέξ μζ ζαπενυκεξ έπμοκ ιζηηή άθθα-αήηα δμιή εκχ είκαζ αλζμζδιείςηδ δ ηνζζδζάζηαηδ μιμζυηδηα ημοξ πμο βίκεηαζ πζμ εκδζαθένμοζα θυβς ηδξ απμοζίαξ μιμθμβζχκ ζε επίπεδμ αιζκμλζηήξ αθθδθμοπίαξ. Έπεζ επίζδξ πνμζδζμνζζηεί δ δμιή ηδξ FliS ημο ααηηδνζαημφ ιαζηζβίμο. H FliS είκαζ ζαπενυκδ ηδξ πνςηεΐκδξ πμο δμιεί ημ ιαζηίβζμ (flagellin) ηαζ έπεζ α-εθζημεζδή δζαιυνθςζδ. Ακ ηαζ δεκ ειπίπηεζ ζε ηαιζά απυ ηζξ ηαηδβμνίεξ πμο ακαθένμκηαζ παναπάκς δ δμιή ηδξ θαίκεηαζ κα ηδκ ηαηαηάζζεζ ζηδ δεφηενδ μιάδα (Birtalan et al 2002a). 26

27 Έκα εονφ θάζια θεζημονβζχκ απμδίδεηαζ ζηζξ ζαπενυκεξ: (i) Θεςνείηαζ υηζ ζηαεενμπμζμφκ ημ οπυζηνςια ημοξ ειπμδίγμκηαξ πνχζιεξ αθθδθεπζδνάζεζξ πμο εα μδδβμφζακ ζε ζοκαενμίζεζξ ηαζ ηαηαηνήικζζδ. Ο νυθμξ αοηυξ επζηοβπάκεηαζ ιε ημ κα ηαθφπημοκ πενζμπέξ ημο οπμζηνχιαημξ πμο ιπμνμφκ κα ζοιιεηέπμοκ ζε ηέημζεξ αθθδθεπζδνάζεζξ. Δπζπθέμκ πζζηεφεηαζ υηζ δνμοκ ζηδκ πνμ-εηηνζηζηή ζηαεενμπμίδζδ ηςκ οπμζηνςιάηςκ ημοξ ειπμδίγμκηαξ ηδκ πνςηευθοζδ ημοξ. (ii) Πζεακμθμβείηαζ υηζ ζηδ δμιή ζαπενυκδξ-οπμζηνχιαημξ εδνεφεζ έκα είδμξ ηνζζδζάζηαημο ζήιαημξ έηηνζζδξ πμο ακαβκςνίγεηαζ απυ ηδκ εηηνζηζηή ιδπακή. Ζ οπυεεζδ αοηή δζαηοπχεδηε ιεηά ηδκ επίθοζδ ηδξ ηνζζδζάζηαηδξ δμιήξ δφμ ζοιπθυηςκ ζαπενυκδξ-οπμζηνχιαημξ, ημο Sic-Spt απυ ηδ Salmonella (Stebbins and Galán 2001) ηαζ ημο SycE-YopE απυ ηδ Yersinia (Birtalan et al 2002b). Οζ δμιέξ αοηέξ έπμοκ ακαπάκηεπεξ μιμζυηδηεξ πμο δεκ πνμένπμκηαζ απυ μιμζυηδηεξ ζηδκ αιζκμλζηή αθθδθμοπία. Δπζπθέμκ ζηζξ δμιέξ αοηέξ ημ οπυζηνςια δζαηδνείηαζ ζε ιζα διζ-δζπθςιέκδ ηαηάζηαζδ πμο ιάθθμκ θαίκεηαζ απαναίηδηδ βζα ηδ δζέθεοζδ ημο ιέζα απυ ημ ιζηνήξ δζαιέηνμο ααζζηυ ζχια ηαζ ηδκ ελςηοηηανζηή, ηοθζκδνζηή πνμέηηαζδ. (iii) Τπάνπμοκ εκδείλεζξ υηζ μζ ζαπενυκεξ δίκμοκ έκα είδμξ πνμηεναζυηδηαξ ζηδκ έηηνζζδ ηςκ οπμζηνςιάηςκ ημοξ. (iv) Σέθμξ, έπεζ δεζπηεί υηζ πμθθέξ απυ ηζξ ζαπενυκεξ ειπθέημκηαζ ζηδ νφειζζδ ηδξ έηθναζδξ βμκζδίςκ ημο ζοζηήιαημξ ΜΟΛΤΜΑΣΗΚΟΗ ΠΑΡΑΓΟΝΣΔ ΚΑΗ ΠΑΘΟΓΔΝΔΗΑ Ζ μνβάκςζδ ημο πμθφπθμημο εηηνζηζημφ ιδπακζζιμφ ΗΗΗ έπεζ ηονίςξ έκα ζηυπμ, ηδ ιεηαθμνά ηαζ εκαπυεεζδ ημλζηχκ παναβυκηςκ (effectors) ζημ ηοηηανυπθαζια ημο λεκζζηή (Cornelis and Van Gijsegem 2000). Πνυηεζηαζ βζα πνςηεΐκεξ πμο δεκ πανμοζζάγμοκ αιζκμλζηή μιμθμβία ακάιεζα ζηα δζάθμνα εηηνζηζηά ζοζηήιαηα ηφπμο ΗΗΗ, αθθά ειθακίγμοκ ηοηηανμημλζηυηδηα ηαζ ζε πμθθέξ πενζπηχζεζξ ημοξ απμδίδεηαζ εκγοιζηή εκενβυηδηα θςζθαηάζδξ, ηζκάζδξ, ηνακζθενάζδξ, ηοηθάζδξ ή θζπάζδξ (Huek 1998, Sato et al. 2003). Οζ ηφνζμζ ζηυπμζ αοηχκ ηςκ παναβυκηςκ θαίκεηαζ κα είκαζ μ ηοηηανμζηεθεηυξ ημο λεκζζηή ηαζ ηα ηοηηανζηά ζήιαηα ιε ηεθζηυ απμηέθεζια ηδκ απεκενβμπμίδζδ ηδξ άιοκαξ ημο. Γζα μνζζιέκμοξ απυ αοημφξ έπεζ δεζπηεί υηζ θηάκμοκ ιέπνζ ημκ πονήκα ημο λεκζζηή υπμο πζεακυκ ειπθέημκηαζ ζηδ νφειζζδ ηδξ έηθναζδξ ηςκ βμκζδίςκ ημο (Büttner and Bonas 2003). ηα πθαίζζα ηδξ ένεοκαξ βζα ηδ δζεοηνίκζζδ ημο αηνζαμφξ νυθμο αοηχκ ηςκ παναβυκηςκ πνμζδζμνίζηδηακ μζ ηνζζδζάζηαηεξ δμιέξ πμθθχκ απυ αοημφξ (Tengel et al 2002). Ζ πθδνμθμνία πμο ακηθήεδηε υιςξ δεκ ήηακ ακάθμβδ ηςκ πνμζδμηζχκ ηαζ πμθθά απυ ηα ενςηήιαηα πμο αθμνμφκ ημ πχξ ακαβκςνίγμκηαζ απυ ηδκ εηηνζηζηή ιδπακή, ιε πμζά δζαιυνθςζδ ηαλζδεφμοκ πνμξ ημ ηφηηανμ-δέηηδ ηαζ πχξ ακαβκςνίγμοκ ηαζ 27

28 αθθδθεπζδνμφκ ιε ημοξ ζηυπμοξ ημοξ ζημ λεκζζηή παναιέκμοκ ακαπάκηδηα (Cornelis and Van Gijsegem 2000). ηδ ζοκέπεζα ακαθένμκηαζ ιενζηά απυ ηα βκςζηυηενα παεμβυκα πμο πνδζζιμπμζμφκ ημ εηηνζηζηυ ζφζηδια ΗΗΗ βζα ιυθοκζδ ηςκ λεκζζηχκ ημοξ, ζηζαβναθείηαζ μ ηνυπμξ δνάζδξ ηςκ ακηίζημζπςκ ιμθοζιαηζηχκ παναβυκηςκ ηαζ ηα ζοιπηχιαηα ηδξ ιυθοκζδξ. Μενζηά απυ ηα γςμ-παεμβυκα πμο πνδζζιμπμζμφκ ημ εηηνζηζηυ ζφζηδια ΗΗΗ βζα ιυθοκζδ ηςκ λεκζζηχκ ημοξ ακήημοκ ζηα βέκδ Yersinia, Shigella ηαζ Salmonella (Collazo and Galán 1997). Ζ Υ.pestis πνμηαθεί πακμφηθα (bubonic plague) ιε ζοιπηχιαηα ααηηδνζαζιία, κεηνςηζηέξ ηαζ αζιμνναβζηέξ αθάαεξ ζε πμθθά υνβακα πμο μδδβμφκ ζημ εάκαημ εκηυξ 2-3 διενχκ απυ ηδ ιυθοκζδ. Ακάθμβα ζοιπηχιαηα πνμηαθμφκ μζ Υ. enterocolitica ηαζ Y.pseudotuberculosis. Ζ παεμβέκεζα ηδξ Yersinia εκημπίγεηαζ ζηδκ ζηακυηδηα ηδξ κα ακηζζηέηεηαζ ζηδκ ακμζμάιοκα ημο λεκζζηή ηονίςξ ακαζηέθθμκηαξ ηδ θφζδ ηδξ απυ ηα θαβμηφηηανα ηαζ ζηδκ ημλζηυηδηα ηδξ βζα ηα επζεδθζαηά ηφηηανα. Καζ μζ δφμ αοηέξ δνάζεζξ μθείθμκηαζ ζε ιμθοζιαηζηέξ πνςηεΐκεξ πμο εβπφκμκηαζ ζημ ηοηηανυπθαζια ημο λεκζζηή ιέζς ημο εηηνζηζημφ ζοζηήιαημξ ΗΗΗ ηαζ είηε απμθςζθμνζθζχκμοκ θςζθμνζθζςιέκεξ ηονμζίκεξ πνςηεσκχκ ηςκ ιαηνμθάβςκ είηε ηαηαζηνέθμοκ ημκ ηοηηανμζηεθεηυ ηςκ επζεδθζαηχκ ηοηηάνςκ ηαηαηενιαηίγμκηαξ ηα ζκίδζα αηηίκδξ. Ζ S. flexneri είκαζ έκα εκηενμπαεμβυκμ πμο εζζένπεηαζ ζηα ηφηηανα ημο λεκζζηή. Πνμηαθεί δζάθμνεξ ιμνθέξ δζάννμζαξ ιε πζμ ζμαανή ηδκ αζιμνναβζηή δοζεκηενία (bacillary dysentery). Ζ S. flexneri πνμηαθεί ηδκ απυπηςζδ ηςκ ιαηνμθάβςκ ηαζ έηζζ απμθεφβεζ ηδ θφζδ ηδξ, εκχ δζεζζδφεζ ζε επζεδθζαηά ηφηηανα επάβμκηαξ ηδ δδιζμονβία ιειανακζηχκ πηοπχζεςκ πμο ηαηαθήβμοκ ζηδκ εβηυθπςζδ ηδξ. Ζ S.typhimurium εβηαείζηαηαζ εκδμηοηηάνζα ημο λεκζζηή ηαζ πνμηαθεί βαζηνεκηενίηζδεξ, ααηηδνζαζιία ηαζ εκηενζηυ πονεηυ, αζεέκεζεξ πμο λεηζκμφκ απυ εκηενζηή ιυθοκζδ. Δίκαζ ημ ιυκμ ααηηήνζμ ζημ μπμίμ έπμοκ ανεεεί δφμ ηφπμο ΗΗΗ ζοζηήιαηα πμο ηςδζημπμζμφκηαζ απυ δζαθμνεηζηέξ μιάδεξ βμκζδίςκ ηαζ ειπθέημκηαζ ζε δζαθμνεηζηά ζηάδζα ζηδκ πμνεία ηδξ ιυθοκζδξ. Φοημπαεμβυκα πμο πνδζζιμπμζμφκ ηφπμο ΗΗΗ εηηνζηζηά ζοζηήιαηα βζα πνμζαμθή ακήημοκ ζηα βέκδ Pseudomonas syringae, Ralstonia solanacearum, Xanthomonas ηαζ Erwinia. Δηηυξ απυ ηδκ εηδήθςζδ παεμβέκεζαξ, υπςξ ήδδ έπεζ ακαθενεεί, ημ ηφπμο ΗΗΗ εηηνζηζηυ ζφζηδια ειπθέηεηαζ ζηδκ εηδήθςζδ ιζαξ αιοκηζηήξ ακηίδναζδξ πμο μκμιάγεηαζ ακηίδναζδ οπενεοαζζεδζίαξ (Hypersensitive Response, HR) ηαζ παναηηδνίγεηαζ απυ ηδ κέηνςζδ ηςκ ηοηηάνςκ ημο λεκζζηή πμο ένπμκηαζ ζε άιεζδ θοζζηή επαθή ιε ημ παεμβυκμ (Hauck et al 2003). 28

29 ΣΟ ΤΣΖΜΑ ΔΚΚΡΗΖ ΣΤΠΟΤ VI Πμθφ πνυζθαηα παναηηδνίζηδηε δ εηηνζηζηή ζοζηεοή ηφπμο VI (T6SS) δ μπμία απμηεθείηαζ απυ ιζα ζονζββχδδ δμιή (εκουζςια, injectisome) πμο έπεζ ηδ δοκαηυηδηα κα ιεηαθένεζ πνςηεΐκεξ ηαηεοεείακ ζημ ηοηηανυπθαζια ηςκ ηοηηάνςκ-λεκζζηχκ, δ μπμία είκαζ ακάθμβδ ηςκ εηηνζηζηχκ ζοζηεοχκ ηφπμο ΗΗΗ ηαζ IV, εκχ δεκ έπμοκ ακαβκςνζζηεί αιζκμηεθζηά πεπηίδζα-μδδβμί ζηζξ εηηνζκυιεκεξ πνςηεΐκεξ. Ανπζηά, ηα βμκίδζα ημο T6SS παναηδνήεδηακ ςξ ιία ζοκηδνδιέκδ πενζμπή ζε κδζίδεξ παεμβέκεζαξ ηςκ ανκδηζηχκ ηαηά Gram ααηηδνίςκ, εκχ ανβυηενα (ημ 2006) δζαπζζηχεδηε υηζ ηςδζημπμζμφκ πνςηεΐκεξ πμο ζοκζζημφκ ημκ εηηνζηζηυ ιδπακζζιυ ηφπμο VI. Πενζζζυηενμ απυ ημ έκα ηέηανημ ηςκ ααηηδνζαηχκ βμκζδζςιάηςκ πμο έπμοκ αθθδθμοπδεεί ιέπνζ ζήιενα πενζέπμοκ βμκίδζα πμο ηςδζημπμζμφκ ζοζηαηζηά ημο T6SS, πενζθαιαάκμκηαξ ηονίςξ πνςηεμααηηήνζα, αθθά ηαζ πθακηημιφηδηεξ ηαζ μλευθζθα ααηηήνζα (Tseng et al 2009). Σμ T6SS θαίκεηαζ κα απαζηείηαζ βζα ηδκ απμηεθεζιαηζηή απμίηζζδ ηδξ νίγαξ απυ ηα ζοιαζςηζηά αγςημδεζιεοηζηά ααηηήνζα Mesorhizobium loti ηαζ Rhizobium leguminosarum. Δκδζαθένμκ πνμηαθεί ημ βεβμκυξ υηζ βμκίδζα, πμο ηςδζημπμζμφκ ζοζηαηζηά ημο T6SS εκημπίγμκηαζ ηαζ ζε ιενζημφξ ιδ ζοιαζςηζημφξ μνβακζζιμφξ, υπςξ Myxococcus xanthus, Dechloromonas aromatica ηαζ Rhodopirellula baltica, υπμο ιπμνεί κα ζοιαάθμοκ ζηδκ πενζααθθμκηζηή πνμζανιμβή ημοξ, υπςξ ημ ζπδιαηζζιυ αζμθζθι. Δζηυκα 3: πζιαηζηή απεζηυκζζδ ηδξ εηηνζηζηήξ ζοζηεοήξ ημο εηηνζηζημφ ζοζηήιαημξ ηφπμο VI Με αάζδ ηα δζαεέζζια πεζναιαηζηά δεδμιέκα, ηαζ ηζξ μιμζυηδηεξ ζε επίπεδμ αθθδθμοπίαξ ιε μνζζιέκα ζοζηαηζηά ημο T4SS ηαζ ημο αηναίμο ζοιπθυημο ηδξ μονάξ (tail spike) ημο T4 ααηηδνζμθάβμο, πνμηάεδηε έκα ιμκηέθμ ημο T6SS εκομζχιαημξ (Δζη.3), 29

30 πμο πενζθαιαάκεζ ιία ηοηηανμπθαζιαηζηή πνςηεΐκδ ζοκμδυ ιε εκενβυηδηα ATPάζδξ, έκα ηακάθζ πμο ζοκδέεζ ηδκ εζςηενζηή ηαζ ηδκ ελςηενζηή ιειανάκδ, ηαζ ιζα αεθμκμεζδή δμιή (needle) δ μπμία ηαθφπηεηαζ ζηδκ άηνδ ηδξ ιε ιζα πνςηεΐκδ ζπδιαηζζιμφ πυνμο (Shrivastava and Mande, 2008). Ονζζιέκα ζοζηαηζηά ηδξ ζοζηεοήξ ίζςξ θεζημονβμφκ ζακ πνςηεΐκεξ-ηεθεζηέξ, πμο ιεηαθένμκηαζ ζηα ηφηηανα ημο λεκζζηή. Παναδείβιαημξ πάνζκ δ πνςηεΐκδ vgrg-1, δ μπμία απμηεθεί ζοζηαηζηυ ημο T6SS ημο V. cholerae, πενζέπεζ ιία ηαναμλοηεθζηή πενζμπή πμο ιπμνεί κα εζζένπεηαζ ζηα ιαηνμθάβα ηαεχξ ζοκδέεηαζ ιε ηδκ αηηίκδ (Pukatzki et al 2007a). Δκημφημζξ, μζ ηαοηυηδηεξ ηαζ μζ θεζημονβίεξ ηςκ ηεθεζηχκ ηφπμο VI (T6SS effectors), ζοκμθζηά, παναιέκμοκ ακεπανηχξ ηαηακμδηέξ ΔΚΚΡΗΣΗΚΟ ΤΣΖΜΑ ΣΤΠΟΤ VI ΚΑΗ ΠΑΘΟΓΔΝΔΗΑ Σμ T6SS έπεζ δεζπηεί υηζ είκαζ απαναίηδημ βζα ηδκ παεμβέκεζα πμθθχκ ααηηδνίςκ. Σα ααηηήνζα πμο δζαεέημοκ αοηυκ ημκ ιδπακζζιυ ακήημοκ ζε πμθθά ηαζ δζαθμνεηζηά είδδ ηαζ ιπμνεί κα είκαζ θοημπαεμβυκα (π.π. Pectobacterium atrosepticum), παεμβυκα ααηηήνζα ηςκ γχςκ (π.π. Salmonella Gallinarum) ηαεχξ ηαζ παεμβυκα ημο ακενχπμο (π.π. V. cholerae, Burkholderia sp. ηαζ P. aeruginosa). ε μνζζιέκεξ πενζπηχζεζξ έπεζ δεζπηεί υηζ δ απμζζχπδζδ ηςκ βμκζδίςκ ημο T6SS έπεζ ζακ απμηέθεζια ηδκ απχθεζα ηδξ παεμβμκζηυηδηαξ ηυζμ ζε γςζηά ιμκηέθα παεμβμκζηυηδηαξ ηαεχξ ηαζ ζε ιεθέηεξ πμο έβζκακ ζε ηαθθζένβεζεξ εοηανοςηζηχκ ηοηηάνςκ πανυθα αοηά μ αηνζαήξ ιδπακζζιυξ ζημκ μπμίμ ααζίγεηαζ δ παεμβμκζηυηδηα ημο εηηνζηζημφ ζοζηήιαημξ ηφπμο VI δεκ είκαζ αηυια βκςζηυξ. Αηνζαήξ θεπημιένεζεξ βζα ημκ ηνυπμ δνάζδξ ημο T6SS ζηα εοηανοςηζηά ηφηηανα οπάνπμοκ ιυκμ βζα έκα πμθφ ιζηνυ ανζειυ πενζπηχζεςκ. Σμ ηαθφηενα παναηηδνζζιέκμ T6SS είκαζ αοηυ ημο ααηηδνίμο V.cholerae. Μζα απυ ηζξ ηνείξ μιυθμβεξ πνμξ ηδ VgrG πνςηεΐκεξ μζ μπμίεξ ζπεηίγμκηαζ ιε ηδκ T6SS-ελανηχιεκδ παεμβμκζηυηδηα ημο V.cholerae, δ VgrG-1, έπεζ ηδκ ίδζα δμιή ιε ηδκ VgrG ιυκμ πμο ζημ C-ηεθζηυ ηδξ άηνμ ειθακίγεζ ιζα πενζμπή ιέζς ηδξ μπμίαξ ζοκδέεηαζ ιε ηδκ αηηίκδ (actincross-linking domain,acd) αοηυ ημ ηιήια ηδξ πνςηεΐκδξ έπεζ ηδκ ζηακυηδηα κα πμθοιενίγεζ G-αηηίκδ in vitro (Pukatzki et al 2007a; Pukatzki et al 2009). Ζ T6SS-ελανηχιεκδ είζμδμξ ηδξ VgrG-1 ACD ζε ιαηνμθάβα εδθαζηζηχκ θάκδηε υηζ πνμηαθεί πμθοιενζζιυ ηδξ αηηίκδξ ημο ηοηηάνμο ηαζ ηαηά ζοκέπεζα ηοηηανμημλζηυηδηα. ε ιεθέηεξ πμο έβζκακ βζα ηδκ T6SS-ελανηχιεκδ αθθδθεπίδναζδ V. cholerae ιε ηφηηανα εδθαζηζηχκ δείπηδηε υηζ δ αθθδθεπίδναζδ ιεηαλφ ηδξ VgrG-1 πενζμπήξ ημο T6SS ιε ηδκ αηηίκδ ζοιααίκεζ ιυκμ ζηδκ πενίπηςζδ πμο έπεζ βίκεζ 30

31 θαβμηφηηςζδ ημο V. cholera απυ ημ ιαηνμθάβμ (Ma et al 2009). Αοηή δ παναηήνδζδ έπεζ μδδβήζεζ ζηδκ οπυεεζδ υηζ ιεηά απυ ηδ θαβμηφηςζδ μνζζιέκςκ ηφηηάνςκ V. cholera εκενβμπμζείηαζ ζε αοηά ημ T6SS ηαζ βίκεηαζ ιεηαηυπζζδ ηδξ VgrG-1 ACD ζε υθδ ηδκ ηεκμημπζηή ιειανάκδ ζημ ηοηυπθαζια ημο ιαηνμθάβμο. Ζ ACD πενζμπή αθθδθεπζδνά ιε ηδκ αηηίκδ ιέζα ζημ ηοηυπθαζια ειπμδίγεζ ηδκ πενεηαίνς θαβμηφηςζδ πνμζηαηεφμκηαξ ιε αοηυ ημκ ηνυπμ ημκ οπυθμζπμ πθδεοζιυ ημο V.Cholera πμο δεκ έπεζ αηυια θαβμηοηηανμεεί. Με πανυιμζμ ηνυπμ δ ACD πενζμπή είκαζ απαναίηδηδ βζα ηδκ T6SS-ελανηχιεκδ είζμδμ ημο D.discoideum ζηδ θαβμηοηηανζηή αιμζαάδα δ υπμζα ηαζ πάθζ βίκεηαζ θυβμ αθθδθεπίδναζδξ ιε ηδκ αηηίκδ (Ma et al 2009;Pukatzki et al 2007b). Καηά ζοκέπεζα δ ACD πενζμπή, ιπμνεί κα εεςνδεεί πνςηεΐκδ ηεθεζηήξ πανυθμ πμο δεκ είκαζ απαναίηδηδ βζα ηδκ έηηνζζδ απυ ημ T6SS αθθά βζα ηζξ ηοηηανμημλζηέξ επζδνάζεζξ ηδξ ζηδκ αηηίκδ (Ma et al 2009). ε in vivo πεζνάιαηα πμο έπμοκ βίκεζ ζε γςζηυ ιμκηέθμ πμκηζημφ έπεζ δεζπηεί υηζ δ ζφκδεζδ ηδξ VgrG-1 ACD ιε ηδκ αηηίκδ ηςκ ηοηηάνςκ ημο εκηένμο πνμηαθεί ιζα ζεζνά δζαννμσηχκ απμηνίζεςκ πμο πενζθαιαάκμοκ ζοζζχνεοζδ οβνμφ, δζήεδζδ ηςκ ηοηηάνςκ ημο ακμζμπμζδηζημφ ηαζ θθεβιμκχδδ ακηίδναζδ. Αοηή δ T6SS-ελανηχιεκδ θθεβιμκχδδξ ακηίδναζδ ιπμνεί κα πνμάβεζ ηδκ επζαίςζδ ή ακαπαναβςβή ημο V.cholerae ζημ έκηενμ (Ma and Mekalanos 2010). Άθθεξ πενζπηχζεζξ ζηζξ υπμζεξ έπεζ δεζπηεί δ παεμβμκζηυηδηα μνζζιέκςκ ααηηδνίςκ κα ελανηάηαζ απυ ημ T6SS είκαζ δ πενίπηςζδ ημο παεμβυκμο P.aeruginosa ημ μπμίμ θαίκεηαζ κα δζαεέηεζ ηνία T6SS ημ έκα (Ζ1) ελ αοηχκ θαίκεηαζ κα εοεφκεηαζ βζα ηδ ιμθοζιαηζηυηδηα ζε ιμκηέθμ ανμοναίμο πνυκζαξ ακαπκεοζηζηήξ θμίιςλδξ (Potvin et al 2003), ημ δεφηενμ (Ζ2) θαίκεηαζ κα εοεφκεηαζ βζα ηδκ παεμβμκζηυηδηα ζε ιδ θαβμηοηηανζηέξ ηοηηανζηέξ ηαθθζένβεζεξ ημο Caenorhabditis elegans ηαζ ηέθμξ ημ δεφηενμ (Ζ1) ζε ζοκδοαζιυ ιε ημ ηνίημ (Sana et al 2012) (Ζ3) T6SS θαίκεηαζ κα είκαζ απαναίηδηα βζα ηδκ πθήνδ ιμθοζιαηζηυηδηα ημο ααηηδνίμο ζε πεζναιαηζηυ ιμκηέθμ πκεοιμκίαξ πμκηζημφ, ζε ιμκηέθμ μλέςξ εβηαφιαημξ ηαεχξ ηαζ βζα ηδ ιυθοκζδ άβνζμο ηφπμο ημο Arabidopsis (Lesic et al 2009). 31

32 1.3. ΚΟΠΟ ΔΡΓΑΗΑ ημπυξ ηδξ πανμφζαξ ενβαζίαξ ήηακ : α) δ ηαλζκυιδζδ ημο ααηηδνζαημφ ζηεθέπμοξ P.A1 ζημ επίπεδμ ημο είδμοξ. α) δ δζενεφκδζδ ηδξ παεμβμκζηυηδηαξ ημο ααηηδνζαημφ ζηεθέπμοξ P.A1 32

33 2.ΤΛΗΚΑ ΚΑΗ ΜΔΘΟΓΟΗ 2.1. ΣΑΞΗΝΟΜΗΖ ΑΠΟΜΟΝΧΖ ΟΛΗΚΟΤ DNA ΣΟΤ ΒΑΚΣΖΡΗΟΤ Γζα κα ιπμνέζμοκ κα βίκμοκ μζ ιμνζαηέξ ακαθφζεζξ βζα ηδκ ηαλζκυιδζδ ααηηδνζαημφ ζηεθέπμοξ P.A1, ανπζηά έβζκε απμιυκςζδ ημο μθζημφ DNA απυ ημ ααηηήνζμ. Σα αήιαηα πμο αημθμοεήεδηακ βζα αοηυ ημ ζημπυ είκαζ ηα ελήξ: Φοβμηέκηνδζδ (3.500 rpm βζα 5 θεπηά) απυ 20 ml οβνήξ ηαθθζένβεζαξ ημο ααηηδνίμο πμο έπεζ ακαπηοπεεί ζε ηζκμφιεκμ επςαζηήνα ημοθάπζζημκ 18 χνεξ. Δπακεχνδζδ ζε 1 ml TE (10 mm Tris, 1 mm EDTA ph:8). Πνμζεήηδ 10 mg θοζμγφιδξ ηαζ απαθή ακαηίκδζδ. Δπχαζδ ζημοξ 37 o C βζα 5 θεπηά. Πνμζεήηδ 240 ιl 0,5 Μ EDTA (ph:8) ηαζ 26 ιl πνςηεσκάζδξ Κ (10 mg/ml ζε ddh 2 Ο (ακάδεοζδ). Δπχαζδ ζημοξ 37 o C βζα 5 θεπηά. Πνμζεήηδ 140 ιl 10% SDS ηαζ ακάδεοζδ. Δπχαζδ ζημοξ 37 o C βζα 2 χνεξ. Πνμζεήηδ 2,8 ml αζεακυθδξ. οθθμβή ημο DNA ιε ιζα θοβζζιέκδ πζπέηηα Pasteur. Δπακεχνδζδ ζε 500 ιl ΣΔ ηαζ επχαζδ ζημοξ 65 o C βζα 10 θεπηά. Πνμζεήηδ 500 ιl θαζκυθδ/πθςνμθυνιζμ (ζζμζηαειζζιέκμ ιε ΣΔ). Αθαίνεζδ 400 ιl απυ ηδκ οδαηζηή θάζδ ηαζ πνμζεήηδ 144 ιl 7,5 M Ammonium Acetate ηαζ 1 ml αζεακυθδξ. Ακάδεοζδ ηαζ επχαζδ ζε εενιμηναζία δςιαηίμο βζα 5 θεπηά. Φοβμηέκηνδζδ ζηα rpm βζα 5 θεπηά. Πθφζδ ημο ζγήιαημξ ιε 70% αζεακυθδ. Φοβμηέκηνδζδ ζηα rpm βζα 5 θεπηά ηαζ ζηέβκςια. Δπακεχνδζδ ζε 500 ιl ΣΔ πμο πενζέπεζ 100 ιg/ml RNAse A. Έθεβπμξ ημο ηεθζημφ πνμσυκημξ ιε δθεηηνμθυνδζδ ζε πδηηή αβανυγδξ. 33

34 ΑΛΤΗΓΧΣΖ ΑΝΣΗΓΡΑΖ ΠΟΛΤΜΔΡΑΖ Ζ εκίζποζδ ημο βμκζδίμο ημο 16S rrna, πμο ακηζζημζπεί ζημ έκα ηιήια ηδξ ιζηνήξ οπμιμκάδαξ ημο νζαμζχιαημξ ζηα πνςηανοςηζηά ηφηηανα, ημο βμκζδίμο πμο ηςδζημπμζεί βζα ηδ α-οπμιμκάδα ηδξ βονάζδξ (gyrb), ημο βμκζδίμο πμο ηςδζημπμζεί βζα ηδ α-οπμιμκάδα ηδξ RNA πμθοιενάζδξ (ropb) ηαζ ημο βμκζδίμο πμο ηςδζημπμζεί βζα ημκ πανάβμκηα ζίβια ηδξ RNA πμθοιενάζδξ (ropd). Γζα ηδκ εκίζποζδ ημο βμκζδίμο ημο 16S rrna πνδζζιμπμζήεδηακ μζ εηηζκδηέξ 8F ηαζ 1541R. Ζ επζθμβή ηςκ ζοβηεηνζιέκςκ εηηζκδηχκ έβζκε δζυηζ είκαζ παβηυζιζμζ (universal) εηηζκδηέξ βζα ημ βμκίδζμ αοηυ ηαζ θυβς ημο οανζδζζιμφ ημοξ ζηζξ εέζεζξ 8 ηαζ 1541 ημο βμκζδίμο, είκαζ ζηακμί κα ημ ηαθφρμοκ μθυηθδνμ. Γζα ηδκ εκίζποζδ ηςκ βμκζδίςκ gyrb, ropb ηαζ ropd μζ εηηζκδηέξ πμο πνδζζιμπμζήεδηακ θαίκμκηαζ ζημκ Πίκαηα 2. Πίκαηαξ 2: Οζ εηηζκδηέξ πμο πνδζζιμπμζήεδηακ βζα ηδκ εκίζποζδ ηςκ βμκζδίςκ gyrb, ropb ηαζ ropd Γνλίδην 16S rrna Όλνκα εθθηλεηή Αιιεινπρία εθθηλεηή Tm Βηβιηνγξαθία 8F 5 -AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3 60 O C (Böttger 1989) 1541R 5 -AAGGAGGTGATCCANCCRCA-3 60 O C gyrb UP-1E 5 - CAGGAAACAGCTATGACCAYGSNGGNGGNAARTTYRA O C (Yamamoto, Harayama 1995) AprU 5 -TGTAAAACGACGGCCAGTGCNGGRTCYTTYTCYTGRCA O C ropb LAPS 5 -TGGCCGAGAACCAGTTCCGCGT-3 64 O C (Ait Tayeb et al 2005b) LAPS27 5 -CGGCTTCGTCCAGCTTGTTCAG-3 65,8 O C ropd 70F 5 -ACGACTGACCCGGTACGCATGTAYATGMGNGARATGGGNACNGT-3 >75 O C (Yamamoto, Harayama 1995) 70R 5 -ATAGAAATAACCAGACGTAAGTTNGCYTCNACCATYTCYTTYTT O C ημοξ Πίκαηεξ 3,4 ηαζ 5 θαίκεηαζ ημ ιίβια ηδξ ακηίδναζδξ πμο πνδζζιμπμζήεδηε βζα ηάεε βμκίδζμ. Πίκαηαξ 3: Μίβια ηδξ ακηίδναζδξ PCR βζα ηδκ εκίζποζδ ημο βμκζδίμο ημο 16s rrna Μίγκα αληίδξαζεο γηα ην γνλίδην ηνπ 16S rrna Πνζόηεηεο (50κl ηειηθόο όγθνο) 5X νοειζζηζηυ δζάθοια (Kapa taq) 5 ιl Γζδεμλοκμοηθεμηίδζα dntp s (10 mm) 0,75 ιl Δηηζκδηήξ 8F(25 ιm) 0,4 ιl Δηηζκδηήξ 1541R(25 ιm) 0,4 ιl Πμθοιενάζδ 1 ιl DNA εηιαβείμ (1/9 αναίςζδ) 1 ιl Γζζαπεζηαβιέκμ H 2 O 16,45 ιl 34

35 Πίκαηαξ 4: Μίβια ηδξ ακηίδναζδξ PCR βζα ηδκ εκίζποζδ ηςκ βμκζδίςκ gyrb ηαζ ropd Μίγκα αληίδξαζεο γηα ηα γνλίδηα gyrb θαη ropd (50κl ηειηθόο όγθνο αληίδξαζεο) 5X νοειζζηζηυ δζάθοια (kapa taq) 10 ιl Γζδεμλοκμοηθεμηίδζα (2 mm) 7.5 ιl Ακμδζηυξ Δηηζκδηήξ (25pmol/ ιl) 2 ιl Καεμδζηυξ Δηηζκδηήξ(25pmol/ιl) 2 ιl Πμθοιενάζδ 0.6 ιl DNA εηιαβείμ (300ng/ ιl) 1 ιl Γζζαπεζηαβιέκμ H 2 O 26.9 ιl Πίκαηαξ 5: Μίβια ηδξ ακηίδναζδξ PCR βζα ηδκ εκίζποζδ ημο βμκζδίμο ημο ropb Μίγκα αληίδξαζεο γηα ηo γνλίδην ropb (50κl ηειηθόο όγθνο αληίδξαζεο ) 5X νοειζζηζηυ δζάθοια (Kapa Taq) 10 ιl Γοδεμλοκμοηθεμηίδζα (2 mm) 7.5 ιl Ακμδζηυξ Δηηζκδηήξ (25pmol/ ιl) 0,8 ιl Καεμδζηυξ Δηηζκδηήξ (25pmol/ιl) 0,8 ιl Πμθοιενάζδ 0.6 ιl DNA εηιαβείμ (300ng/ ιl) 1 ιl Γζζαπεζηαβιέκμ H 2 O 26.9 ιl Οζ ζοκεήηεξ ακηίδναζδξ ηδξ PCR πμο πνδζζιμπμζήεδηακ βζα ηδκ εκίζποζδ ηςκ βμκζδίςκ 16s rrna, gyrb, ropb ηαζ ropd θαίκμκηαζ ζημοξ παναηάης Πίκαηεξ 6, 7 ηαζ 8 ακηίζημζπα: Πίκαηαξ 6: οκεήηεξ ηδξ ακηίδναζδξ ηδξ PCR βζα ηδκ εκίζποζδ ημο βμκζδίμο 16S rrna πλζήθεο αληίδξαζεο γηα ην 16S rrna 36 ηφηθμζ 94 o C βζα 2 θεπηά 94 o C βζα 30 δεοηενυθεπηα 58 o C βζα 1 θεπηυ 79 o C βζα 50 δεοηενυθεπηα 79 o C βζα 7 θεπηά Πίκαηαξ 7: οκεήηεξ ηδξ ακηίδναζδξ ηδξ PCR βζα ηδκ εκίζποζδ ηςκ βμκζδίςκ gyrb ηαζ ropd πλζήθεο αληίδξαζεο γηα ηα γνλίδηα gyrb θαη ropd 94 μ C βζα 1 θεπηυ 30 ηφηθμζ 60 μ C βζα 1 θεπηυ 72 μ C βζα 1 θεπηυ 35

36 Πίκαηαξ 8: οκεήηεξ ηδξ ακηίδναζδξ ηδξ PCR βζα ηδκ εκίζποζδ ημο βμκζδίμο ropb πλζήθεο αληίδξαζεο γηα ην ropb 94 o C βζα 1:30 θεπηά 94 μ C βζα 30 δεοηενυθεπηα 40 ηφηθμζ 45 μ C βζα 1 θεπηυ 72 μ C βζα 50 δεοηενυθεπηα 72 μ C βζα 5 θεπηά ΚΑΘΑΡΗΜΟ ΔΛΔΓΥΟ ΣΔΛΗΚΟΤ ΠΡΟΨΟΝΣΟ Μεηά ηδκ εκίζποζδ ηςκ βμκζδίςκ 16S rrna, gyrb, ropb ηαζ ropd αημθμφεδζε ηαεανζζιυξ ηςκ πνμσυκηςκ ηδξ PCR ιε ημ ηζη NucleoSpin Extract II (Macherey - Nagel). Ζ δζαδζηαζία πμο αημθμοεήεδηε ήηακ ζφιθςκα ιε ηζξ μδδβίεξ ημο ηζη ηαζ ήηακ δ αηυθμοεδ: Ακάιζλδ εκυξ υβημο πνμσυκημξ PCR ιε δφμ υβημοξ NT buffer (binding buffer). Φυνηςια ημο δείβιαημξ ζηδ ζηήθδ ημο ηζη πμο ημπμεεηείηαζ επάκς ζε ζςθήκα. Φοβμηέκηνδζδ ζηα g βζα 1 θεπηυ. Απμιάηνοκζδ ημο οβνμφ πμο δζαπέναζε ηδ ιειανάκδ ηαζ ζοζζςνεφηδηε ζημ ζςθήκα. Πνμζεήηδ 700 ιl NT3 buffer (wash buffer) ζηδ ζηήθδ. Φοβμηέκηνδζδ ζηα g βζα 1 θεπηυ. Απμιάηνοκζδ ημο οβνμφ πμο δζαπέναζε ηδ ιειανάκδ ηαζ ζοζζςνεφηδηε ζημ ζςθήκα. Φοβμηέκηνδζδ ζηα g βζα 2 θεπηά. Πνμαζνεηζηή επχαζδ ηδξ ζηήθδξ βζα 2-5 θεπηά ζημοξ 70 o C (βζα ηδκ πθήνδ απμιάηνοκζδ ηδξ αζεακυθδξ πνζκ ηδκ έηθμοζδ). Πνμζεηηζηή αθαίνεζδ ηδξ ζηήθδξ απυ ημ ζςθήκα ηαζ ημπμεέηδζή ηδξ ζε ηαζκμφνζμ ζςθήκα ηφπμο eppendorf. Πνμζεήηδ 50 ιl NE buffer (elution buffer) ηαζ επχαζδ βζα 1 θεπηυ ζε εενιμηναζία δςιαηίμο. Φοβμηέκηνδζδ ζηα g βζα 1 θεπηυ. Γζα ημκ έθεβπμ ηδξ ζοβηέκηνςζδξ ηαζ ηδξ ηαεανυηδηαξ ημο ηεθζημφ πνμσυκημξ, έβζκε δθεηηνμθυνδζδ ζε 1% πδηηή αβανυγδξ ηαζ θςημιέηνδζδ ζηα 260 ηαζ 280 nm (Sambrook et al., 1989). Ζ ζοβηέκηνςζδ ηαζ δ ηαεανυηδηα ημο DNA οπμθμβίγεηαζ ιε ηδ αμήεεζα ηςκ ηφπςκ: οβηέκηνςζδ DNA = OD260 Υ 50 Υ ζοκηεθεζηήξ αναίςζδξ. Καεανυηδηα: OD260/ OD280. Ηδακζηέξ ηζιέξ ηαεανυηδηαξ είκαζ 1,

37 ΥΡΖΖ ΔΡΓΑΛΔΗΧΝ ΒΗΟΠΛΖΡΟΦΟΡΗΚΖ ΓΗΑ ΣΖΝ ΣΑΤΣΟΠΟΗΖΖ ΣΟΤ ΒΑΚΣΖΡΗΑΚΟΤ ΣΔΛΔΥΟΤ P.A1 Έπεζηα, αημθμφεδζε δ απμζημθή ημο DNA βζα αθθδθμφπζζδ ζηδκ εηαζνία Labsupplies. Ζ εηαζνία ιαξ επέζηνερε ζε ιμνθή πνςιαημβναθήιαημξ ηδκ αθθδθμοπία ηάεε βμκζδίμο δζαααζιέκδ ηαζ απυ ημκ ακμδζηυ ηαζ απυ ημκ ηαεμδζηυ εηηζκδηή έηζζ χζηε κα οπάνπεζ αθθδθμεπζηάθορδ ηδξ αθθδθμοπίαξ ζημ ιεβαθφηενμ ιένμξ ηδξ. Ζ πεναζηένς ακάθοζδ, χζηε κα ηαηαθήλμοιε ζηδκ ηεθζηή αημθμοεία, έβζκε ιε ημ πνυβναιια Bioedit. ηδ ζοκέπεζα, έβζκε δ ακαγήηδζδ ηδξ ηαοηυηδηαξ ηςκ οπυ ιεθέηδ αθθδθμοπζχκ, δ μπμία πναβιαημπμζήεδηε ιε ζφβηνζζδ αοηχκ, ιε ηζξ δζαεέζζιεξ αθθδθμοπίεξ ηδξ αάζδξ δεδμιέκςκ GenBank, πνδζζιμπμζχκηαξ ηδ ιδπακή ακαγήηδζδξ BLAST (Basic Local Alignment Search Tool) ημο NCBI (National Center for Biotechnology Information) ( Με ηδ πνήζδ ημο αθβμνίειμο Blast ανέεδηακ μζ 30 πζμ μιυθμβεξ αθθδθμοπίεξ βζα ηαεέκα απυ ηα βμκίδζα πμο ιεθεηήεδηακ ηαζ ηα απμηεθέζιαηα θαίκμκηαζ ζημ ηεθάθαζμ ηςκ απμηεθεζιάηςκ. Με ηδ πνήζδ ημο NCBI ζοθθέπεδηακ απυ ηδ αάζδ δεδμιέκςκ GenBank μζ απαναίηδηεξ αθθδθμοπίεξ (πενίπμο 26-28) έηζζ χζηε κα ηαηαζηεοαζημφκ ηα θοθμβεκεηζηά δέκηνα ιε αάζδ ηδκ αθθδθμοπία ηαεεκυξ απυ ηα βμκίδζα πμο αθθδθμοπήεδηακ. Ζ εοεοβνάιιζζδ ηςκ κμοηθεμηζδζηχκ αθθδθμοπζχκ, πναβιαημπμζήεδηε ιέζς ημο αθβυνζειμο πμθθαπθήξ εοεοβνάιιζζδξ Clustal W, ημο πνμβνάιιαημξ Lasergene 7.0 (Thompson et al 1994). Ζ εηηίιδζδ ηςκ ελεθζηηζηχκ απμζηάζεςκ ηςκ κμοηθεμηζδζηχκ ηαζ αιζκμλζηχκ αθθδθμοπζχκ, πναβιαημπμζήεδηε ιέζς ηδξ ιεευδμο Maximum Composite Likelihood (Tamura et al 2007). Σα θοθμβεκεηζηά δέκηνα ηαηαζηεοάζηδηακ ιε ηδ ιέεμδμ Neighbor-Joining (Saitou and Nei 1987), ιέζς ημο πνμβνάιιαημξ MEGA 5.0 (Molecular Evolutionary Genetics Analysis) (Tamura et al 2007). Ζ αλζμπζζηία ηαζ δ ζηαεενυηδηα ηςκ ζπέζεςκ ημο δεκδνμβνάιιαημξ εηηζιήεδηε ιέζς 1000 bootstrap δεζβιάηςκ. 37

38 ΒΗΟΥΖΜΗΚΟΗ ΔΛΔΓΥΟΗ ΓΗΑ ΣΖΝ ΣΑΤΣΟΠΟΗΖΖ ΣΟΤ ΒΑΚΣΖΡΗΑΚΟΤ ΣΔΛΔΥΟΤ P.A1 Πναβιαημπμζήεδηακ αζμπδιζημί έθεβπμζ βζα κα πνμζδζμνζζεμφκ ηα παναηηδνζζηζηά ημο ααηηδνζαημφ ζηεθέπμοξ P.A1. Γζα κα δζαπζζηςεεί εάκ ημ ααηηδνζαηυ ζηέθεπμξ P.A1 ακήηεζ ζηζξ θεμνίγμοζεξ ρεοδμιμκάδεξ ημ ααηηήνζμ αοηυ ηαθθζενβήεδηε ζε ενεπηζηυ ιέζμ Kings Medium B (Πίκ. 9), ημ μπμίμ δεκ πενζθαιαάκεζ ηαευθμο ζίδδνμ. Οζ ηαθθζένβεζεξ επςάζηδηακ βζα 24 h ηαζ εθέβπεδηε εάκ πανάβμοκ θεμνίγμοζεξ πνςζηζηέξ ζοβηνζηζηά ιε ημκ ιάνηονα πμο ήηακ ημ ααηηήνζμ P.aeruginosa. Πίκαηαξ 9: οζηαηζηά ημο ενεπηζημφ ιέζμο Kings Medium B πζηαηηθά ηνπ ζξεπηηθνύ κέζνπ Kings Medium B Πεπηυκδ 10g K 2 HPO 4 1.5g MgSO 4 7H 2 O 1.5g Γθοηενυθδ 10g Άβαν 15g Γζζαπεζηαβιέκμ H 2 O 1000ml Δπζπθέμκ, έβζκε ιζα ζεζνά αζμπδιζηχκ εθέβπςκ βζα κα δζαπζζηςεεί δ πμζηζθία ηςκ μνβακζηχκ εκχζεςκ, πμο ημ ααηηδνζαηυ ζηέθεπμξ P.A1 ιπμνεί κα πνδζζιμπμζήζεζ ςξ ιμκαδζηή πδβή άκεναηα. Γζα ημ ζημπυ αοηυ, πνδζζιμπμζήεδηε ημ ενεπηζηυ ιέζμ Μ9 ςξ αάζδ βζα ημοξ αζμπδιζημφξ εθέβπμοξ. Σα ζοζηαηζηά ημο ενεπηζημφ αοημφ θαίκμκηαζ ζημκ Πίκαηα 10. Πίκαηαξ 10: οζηαηζηά ημο δζαθφιαημξ Μ9 βζα 1 θίηνμ ημο δζαθφιαημξ Μ9 Γηάιπκα αιάησλ γηα όγθν δηαιύκαηνο 1ιίηξν Na 2 HPO 4 :7H 2 O 12.8g KH 2 PO 4 3g NaCl 0.5g NH 4 Cl 1g To ph ημο δζαθφιαημξ νοειίζηδηε ζημ 7,4 ηαζ αημθμφεδζε απμζηείνςζδ, ζηδ ζοκέπεζα δ εενιμηναζία ημο δζαθφιαημξ έπεζε ζημοξ 30 μ C ηαζ έβζκε πνμζεήηδ 1ml απυ ημ δζάθοια 1Μ MgSO 4, 1ml απυ ημ δζάθοια 0.1M CaCl 2. H πνμξ ελέηαζδ μοζία πνμζηέεδηε ζε πμζμζηυ 20% w/v. Οζ πδιζηέξ μοζίεξ πμο ελεηάζηδηακ ςξ ιμκαδζηέξ πήβεξ άκεναηα ζφιθςκα ιε ηδκ παναπάκς ιέεμδμ ήηακ: αδμκζηυθδ, L-αναιπζκυγδ, θνμοηηυγδ, ιακκζηυθδ, βθοηυγδ, ζμοηνυγδ, ζμναζηυθδ, λοθυγδ, θαηηυγδ, θαζκοθαθακίκδ, ηονμζίκδ, πνμθίκδ, ηζηνζηυ άθαξ, άιοθμ, εζημοθίκδ, ηαγεΐκδ, ιαθηυγδ, ζαθζηίκδ, PNGP, αζεαθμθαιίκδ, ζζηζδίκδ, αεκγυθζμ, θαζκυθδ, αμοηονζηυ μλφ, βθμοηαιζηυ μλφ, ημθμοέκζμ, 38

39 αζεακυθδ, βθοηίκδ, βθοηενυθδ, Tween 80, Tween 60, αζεοθεκμβθοηυθδ, μλαθζηυ μλφ, δθεηηνζηυ μλφ, ιδθζηυ μλφ, θεηζείκδ ΤΣΖΜΑΣΑ ΣΑΤΣΟΠΟΗΖΖ - API 20NE Σμ API20NE (biomérieux) απμηεθεί έκα ειπμνζηά δζαεέζζιμ ζφζηδια βνήβμνδξ ηαοημπμίδζδξ µδ-εκηενμααηηδνζαηχκ Gram ανκδηζηχκ ααηηδνίςκ. Σμ ζφζηδια αοηυ εθέβπεζ είημζζ αζμπδιζηέξ ζδζυηδηεξ ημο οπυ ελέηαζδ ααηηδνίμο. οβηεηνζιέκα ελεηάγεζ μηηχ αζμπδιζηέξ δζενβαζίεξ ηαζ ακάπηολδ πανμοζία 12 ζαηπάνςκ. Απμηεθείηαζ απυ είημζζ ιζηνμηορεθίδεξ πμο πενζέπμοκ αθοδαηςιέκα οπμζηνχιαηα. Δάκ ημ ααηηήνζμ πενζέπεζ ζε εκενβή ιμνθή ηα έκγοια πμο ηαηαθφμοκ ηζξ ακηίζημζπεξ αζμπδιζηέξ δζενβαζίεξ, ηυηε δ εεηζηή ακηίδναζδ ειθακίγεηαζ ςξ αθθαβή πνχιαημξ είηε άιεζα είηε ιεηά ηδκ πνμζεήηδ ακηζδναζηδνίςκ. Ζ αθμιμίςζδ ηςκ ζαηπάνςκ εθέβπεηαζ µε ηδκ ακάπηολδ ή υπζ ημο ααηηδνίμο ζηα ζοβηεηνζιέκα οπμζηνχιαηα. Ο ζοκδοαζιυξ ηςκ εεηζηχκ ηαζ ανκδηζηχκ ακηζδνάζεςκ πανάβεζ έκα κμφιενμ, ζφιθςκα µε ημ μπμίμ πναβιαημπμζείηαζ δ ηαοημπμίδζδ εθυζμκ ακηζζημζπεί ζε ζοβηεηνζιέκμ βέκμξ ή είδμξ ααηηδνίμο. Σα οπμζηνχιαηα ακηζδνάζεζξ-εκγοια ημο ηζη ήηακ: Νζηνζηυ ηάθζμ, ηνοπημθάκδ βζα ηδκ ακηίδναζδ ηδξ παναβςβήξ ζκδυθδξ, βθοηυγδ βζα κα εθεβπεεί ακ δζαεέηεζ ηδκ μλεζδάζδ ηδξ βθοηυγδξ, ανβζκίκδ βζα κα εθεβπεεί δ φπανλδ ηδξ δετδνμθάζδξ ηδξ ανβζκίκδξ, μονία βζα κα εθεβπεεί δ φπανλδ μονεάζδξ, εζημοθίκδ βζα κα δζαπζζηςεεί ακ βίκεηαζ οδνυθοζδ ιε ημ έκγοιμ α-βαθαηημζζδάζδ, γεθαηίκδ (µε india ink) βζα κα δζαπζζηςεεί δ φπανλδ γεθαηζκάζδξ, π-κζηνμθαζκοθ-α-d-βαθαηημπονακμγίηδξ α-βαθαηημζζδάζδ. Οζ μοζίεξ ζηζξ μπμίεξ εθέβπεδηε δ ζηακυηδηα ακάπηολδξ ημο ααηηδνίμο ήηακ: Γθοηυγδ, ανααζκυγδ, ιακκυγδ, ιακκζηυθδ, κ-αηεηοθ-βθοημγαµίκδ, ιαθηυγδ, βθοημκζηυ, ηαπνζηυ (n-δεηακμσηυ), αδζπζηυ, ιδθζηυ, ηζηνζηυ, θαζκοθμλζηυ, ηεηναµεεοθ-π-θαζκοθμδζαµίκδ ηοημπνςµζηή μλεζδάζδ. 39

40 2.1.7.ΑΝΘΔΚΣΗΚΟΣΖΣΑ ΣΟΤ ΒΑΚΣΖΡΗΑΚΟΤ ΣΔΛΔΥΟΤ P.A1 ΣΑ ΒΑΡΔΑ ΜΔΣΑΛΛΑ Γζα κα δζαπζζηςεεί ακ ημ ααηηδνζαηυ ζηέθεπμξ P.A1 έπεζ ηδκ ζηακυηδηα κα ακαπηφζζεηαζ πανμοζία αανέςκ ιεηάθθςκ, πναβιαημπμζήεδηε ηαθθζένβεζα ημο ααηηδνζαημφ ζηεθέπμοξ P.A1 ζε ενεπηζηυ ιέζμ Nutrient Agar πμο πενζείπε πμζυηδηα ημο ηάεε αανέςξ ιεηάθθμο ηδξ ηάλδξ ηςκ 300 ιg/ml. Σα αανέα ιέηαθθα βζα ηα μπμία πναβιαημπμζήεδηε έθεβπμξ ήηακ Cr (VI), Pb, Cu, Fe ηαζ Zn. Γζα ημκ πνμζδζμνζζιυ ηδξ ακαβςβήξ ημο Cr(VI) πνδζζιμπμζήεδηακ ηαθθζένβεζεξ ημο οπυ ιεθέηδ ααηηδνίμο ειπθμοηζζιέκεξ ιε ή πςνίξ Cr(VI) (ιάνηοναξ). Δπίζδξ, πνδζζιμπμζήεδηε ενεπηζηυ ιέζμ πςνίξ ααηηήνζα ειπθμοηζζιέκμ ιε Cr(VI) βζα ημκ πνμζδζμνζζιυ ηδξ θοζζηήξ ακαβςβήξ Cr(VI) ζηδ δζάνηεζα ηδξ ηαθθζένβεζαξ. Οζ ζοβηεκηνχζεζξ ημο Cr(VI) πμο επζθέπεδηακ ήηακ 0.2 ηαζ 0.3 mg/ml. Απυ ηάεε ηαθθζένβεζα ζοθθέπεδηακ 5 ml ηα μπμία θοβμηεκηνήεδηακ (9000 rpm βζα 5 min) ηαζ ζηδ ζοκέπεζα ηαηαρφπεδηακ ζημοξ -20 C, βζα κα ιείκμοκ ακαθθμίςηα ιέπνζ ημ ηέθμξ ημο πεζνάιαημξ. Ζ δεζβιαημθδρία ηςκ οπενηείιεκςκ δεζβιάηςκ, έβζκε ζε ηαεμνζζιέκα πνμκζηά δζαζηήιαηα (0 h, 24 h, 48 h, 72 h). Γζα ημκ οπμθμβζζιυ ηδξ πμζυηδηαξ ημο ελαζεεκμφξ πνςιίμο ζημ οπενηείιεκμ ηςκ ηαθθζενβεζχκ, έβζκε δ ααειμκυιδζδ ηδξ δζαδζηαζίαξ ιε ηδκ ηαηαζηεοή ηδξ πνυηοπδξ ηαιπφθδξ. Γζα ημκ οπμθμβζζιυ ηδξ ακαβςβήξ ή απμημλζημπμίδζδξ ημο ελαζεεκμφξ πνςιίμο πνδζζιμπμζήεδηε δ ιέεμδμξ 1,5-diphenyl carbazide (DPC) ή DPCZ reagent (Zakaria et al 2007). Ζ ιέεμδμξ έπεζ ηδκ ζηακυηδηα κα ιεηνά ιυκμ ημ ελαζεεκέξ ηαζ υπζ ημ μθζηυ πνχιζμ. Ωξ πδβή ελαζεεκμφξ πνςιίμο πνδζζιμπμζήεδηε ημ K 2Cr 2O 7 (δζπνςιζηυ ηάθζμ). Γζα ηδκ ηαηαζηεοή ηδξ πνυηοπδξ ηαιπφθδξ πνδζζιμπμζήεδηακ ηα αηυθμοεα: 1 ml απυ ηα πνυηοπα δζαθφιαηα βκςζηχκ ζοβηεκηνχζεςκ ( mg/ml) ζηα μπμία πνμζηέεδηακ 9 ml 0,2 M H 2SO 4 (1,112 ml H 2SO ,88 ml ddh 2O 4) ηαζ 0.2 ml DPCZ ζοβηέκηνςζδξ 0.25% w/v (0.025 g DPCZ reagent ζε 10 ml αηεηυκδ) θςημιεηνήεδηακ ζηα 540 nm ζε ζοζηεοή SHIMADZU UV-1201V. Λυβς ημο πενζμνζζιέκμο εφνμοξ οπμθμβζζιμφ ηδξ δζαδζηαζίαξ, ακαβηαία ηνίεδηε δ αναίςζδ ηςκ δεζβιάηςκ, χζηε δ ζοβηέκηνςζή ημοξ κα ηοιαίκεηαζ απυ 1-20 ιl/ml. Έηζζ, μζ αναζχζεζξ ηοιαίκμκηαζ απυ 1/10 βζα ηδ ζοβηέκηνςζδ 0.01 mg/ml ιέπνζ 1/30 βζα ηδ ζοβηέκηνςζδ 0.6mg/ml. οβηεηνζιέκα, βζα ηδκ πνυηοπδ ηαιπφθδ ηα δείβιαηα οπμθμβίζηδηακ ζφιθςκα ιε ηα παναηάης: Γζα ηεθζηή ζοβηέκηνςζδ 0,6 mg/ml Cr(VI) δ ζοκμθζηή αναίςζδ είκαζ 1/300 ηαζ πνμηφπηεζ απυ 1 ml αναζςιέκμο δείβιαημξ [33 ιl δείβιαημξ ιl ddh 2O (αναίςζδ 40

41 1/30)] + 9 ml 0,2M H 2SO 4 (αναίςζδ 1/10) ηαζ ηέθμξ πνμζηέεδηακ 0.2 ml 0,25 % w/v DPCZ. Γζα ηεθζηή ζοβηέκηνςζδ 0,5 mg/ml Cr(VI) δ ζοκμθζηή αναίςζδ είκαζ 1/400 ηαζ πνμηφπηεζ απυ 1 ml αναζςιέκμο δείβιαημξ [25 ιl δείβιαημξ ιl ddh 2O (αναίςζδ 1/40)] + 9 ml 0,2M H 2SO 4 (αναίςζδ 1/10) ηαζ ηέθμξ πνμζηέεδηακ 0.2 ml 0,25 % w/v DPCZ. Γζα ηεθζηή ζοβηέκηνςζδ 0,4 mg/ml Cr(VI) δ ζοκμθζηή αναίςζδ είκαζ 1/200ηαζ πνμηφπηεζ απυ 1 ml αναζςιέκμο δείβιαημξ [60 ιl δείβιαημξ ιl ddh 2O (αναίςζδ 1/20)] + 9 ml 0,2M H 2SO 4 (αναίςζδ 1/10) ηαζ ηέθμξ πνμζηέεδηακ 0.2 ml 0,25 % w/v DPCZ. Γζα ηεθζηή ζοβηέκηνςζδ 0,3 mg/ml Cr(VI) δ ζοκμθζηή αναίςζδ είκαζ 1/200 ηαζ πνμηφπηεζ απυ 1 ml αναζςιέκμο δείβιαημξ [50 ιl δείβιαημξ ιl ddh 2O (αναίςζδ 1/20)] + 9 ml 0,2M H 2SO 4 (αναίςζδ 1/10) ηαζ ηέθμξ πνμζηέεδηακ 0.2 ml 0,25 % w/v DPCZ. Γζα ηεθζηή ζοβηέκηνςζδ 0,2 mg/ml Cr(VI) δ ζοκμθζηή αναίςζδ είκαζ 1/50 ηαζ πνμηφπηεζ απυ 1 ml αναζςιέκμο δείβιαημξ [200 ιl δείβιαημξ ιl ddh 2O (αναίςζδ 1/5)] + 9 ml 0,2M H 2SO 4 (αναίςζδ 1/10) ηαζ ηέθμξ πνμζηέεδηακ 0.2 ml 0,25 % w/v DPCZ. Γζα ηεθζηή ζοβηέκηνςζδ 0,1 mg/ml Cr(VI) δ ζοκμθζηή αναίςζδ είκαζ 1/50 ηαζ πνμηφπηεζ απυ 1 ml αναζςιέκμο δείβιαημξ [200 ιl δείβιαημξ ιl ddh 2O (αναίςζδ 1/5)] + 9 ml 0,2M H 2SO 4 (αναίςζδ 1/10) ηαζ ηέθμξ πνμζηέεδηακ 0.2 ml 0,25 % w/v DPCZ. Γζα ηεθζηή ζοβηέκηνςζδ 0,05 mg/ml Cr(VI) δ ζοκμθζηή αναίςζδ είκαζ 1/40 ηαζ πνμηφπηεζ απυ 1 ml αναζςιέκμο δείβιαημξ [250 ιl δείβιαημξ ιl ddh 2O (αναίςζδ 1/4)] + 9 ml 0,2M H 2SO 4 (αναίςζδ 1/10) ηαζ ηέθμξ πνμζηέεδηακ 0.2 ml 0,25 % w/v DPCZ. Γζα ηεθζηή ζοβηέκηνςζδ 0,025 mg/ml Cr(VI) δ ζοκμθζηή αναίςζδ είκαζ 1/20 ηαζ πνμηφπηεζ απυ 1 ml αναζςιέκμο δείβιαημξ [500 ιl δείβιαημξ ιl ddh 2O (αναίςζδ 1/2)] + 9 ml 0,2M H 2SO 4 (αναίςζδ 1/10) ηαζ ηέθμξ πνμζηέεδηακ 0.2 ml 0,25 % w/v DPCZ. Γζα ηεθζηή ζοβηέκηνςζδ 0,01 mg/ml Cr(VI) δ ζοκμθζηήξ αναίςζδξ είκαζ 1/10 ηαζ πνμηφπηεζ απυ 1 ml δείβιαημξ + 9 ml 0,2M H 2SO 4 (αναίςζδ 1/10) ηαζ ηέθμξ πνμζηέεδηακ 0.2 ml 0,25 % w/v DPCZ. 41

42 2.2. ΠΑΘΟΓΔΝΔΗΑ ΣΟΤ ΒΑΚΣΖΡΗΑΚΟΤ ΣΔΛΔΥΟΤ P.A ΔΛΔΓΥΟ ΓΗΑ ΣΖΝ ΤΠΑΡΞΖ ΚΑΦΟΤΛΑ ΣΟ ΒΑΚΣΖΡΑΚΟ ΣΔΛΔΥΟ P. A1 Σμ πνςηυημθθμ πμο πνδζζιμπμζήεδηε βζα κα δζαπζζηςεεί ημ ααηηδνζαηυ ζηέθεπμξ P.A1 δζαεέηεζ δ υπζ ηάρμοθα ήηακ ημ αηυθμοεμ: Ακάιζλδ ιζαξ ζηαβυκαξ απυ οβνή ηαθθζένβεζαξ ημο ααηηδνζαημφ ζηεθέπμοξ P.Α1 ιε ιζα ζηαβυκα 5% Nigrosin. Σμ ιίβια απθχκεηε ζε ακηζηεζιεκμθυνμ ηαζ αθήκεηε κα ζηεβκχζεζ Ξέπθοια ιε αζεακυθδ Πνμζεήηδ 1% crystalviolet ηαζ επχαζδ βζα 2min Ξέπθοια ιε ddh 2 O Σμ δείβια αθήκεηε κα ζηεβκχζεζ Παναηήνδζδ ημο δείβιαημξ ζημ μπηζηυ ιζηνμζηυπζμ βζα ηδκ φπανλδ ηάρμοθαξ ΔΠΗΖΜΑΝΖ ΣΟΤ ΒΑΚΣΖΡΗΑΚΟΤ ΣΔΛΔΥΟΤ P.A1 Γζα κα ιπμνέζεζ κα δζενεοκδεεί δ παεμβμκζηυηδηα ημο ααηηδνζαημφ ζηεθέπμοξ P.A1 ηαζ πζμ ζοβηεηνζιέκα δ αθθδθεπίδναζδ ηδξ ιε άθθα ααηηήνζα, ηαεχξ ηαζ δ πζεακή ζηακυηδηα ημο κα ιμθφκεζ εοηανοςηζηά ηφηηανα, ηνίεδηε ζηυπζιμ ημ ααηηήνζμ αοηυ κα επζζδιακεεί ιε ηάπμζα θεμνίγμοζα πνςζηζηή. ε ιζα πνχηδ πνμζέββζζδ ημ ααηηδνζαηυ ζηέθεπμξ P.Α1 πέναζε απυ ιζα εζδζηή ηαηενβαζία, έηζζ χζηε ηα ηφηηανα ημο κα βίκμοκ ζηακά πνμξ ιεηαζπδιαηζζιυ (competent cells), βζα κα βίκεζ μ ιεηαζπδιαηζζιυξ ημοξ ιε ημ πθαζιίδζμ pgfp. Σμ πθαζιίδζμ αοηυ θένεζ δφμ βμκίδζα, ημ έκα πνμζδίδεζ ακεεηηζηυηδηα ζημ ακηζαζμηζηυ αιπζηζθίκδ ηαζ ημ άθθμ εηθνάγεζ ηδκ πνάζζκδ θεμνίγμοζα πνςηεΐκδ (GFP). Σμ ααηηδνζαηυ ζηέθεπμξ P.Α1 δεκ ιπυνεζε κα βίκεζ ζηακυ πνμξ ιεηαζπδιαηζζιυ (competent) ιε ημ ηθαζζηυ πνςηυημθθμ (Sambrook et al 2001) ηαεχξ ηαζ ιε δφμ αηυια πνςηυημθθα βζα ζηακά ηφηηανα πμο ήηακ ελεζδζηεοιέκα βζα ααηηήνζα ημο βέκμοξ Pseudomonas (Liu et al 1996) ηαζ βζα αοηυ ημ θυβμ έβζκακ ηνμπμπμζήζεζξ ημο ηθαζζημφ πνςημηυθθμο βζα κα αολδεμφκ μζ πζεακυηδηεξ ημ ααηηδνζαηυ ζηέθεπμξ P.A1 κα ιεηαζπδιαηζζηεί. Οζ ηνμπμπμζήζεζξ αοηέξ πενζεθάιαακακ πνήζδ ημο ακηζδναζηδνίμο DMSO ζε ζοβηέκηνςζδ 50ιl/mL ζημ ηεθεοηαίμ αήια πνζκ ηδκ ηαηάρολδ ηςκ ηοηηάνςκ, ή ηδκ εθανιμβή οπενήπςκ ζημ ίδζμ ζηάδζμ ή ηαζ ζοκδοαζιυ ηςκ δφμ επζδνάζεςκ. Δπζπθέμκ δ μπηζηή ποηκυηδηα ηςκ ηοηηάνςκ πνμζανιυζηδηε ζημ 0,8 μπηζηή ποηκυηδηα OD 600 ακηί 42

43 βζα 0,5 πμο πνδζζιμπμζείηαζ ζημ ηθαζζηυ πνςηυημθθμ. Σμ πνςηυημθθμ ιεηαζπδιαηζζιμφ ζημ μπμίμ εθανιυζηδηακ μζ ηνμπμπμζήζεζξ ήηακ ημ ηθαζζηυ (Sambrook et al 2001). ε ιζα επυιεκδ πνμζέββζζδ ημ ααηηδνζαηυ ζηέθεπμξ P.A1 επζζδιάκεδηε ιε θθμομνεζηεΐκδ (fluorescein), αοηή δ πνςζηζηή έπεζ ηδκ ζηακυηδηα κα αάθεζ ηα ααηηήνζα, πςνίξ κα επδνεάγεζ ηδ αζςζζιυηδηα ηαζ ηδκ ηζκδηζηυηδηα ημοξ ηαζ ημοξ πνμζδίδεζ πνάζζκμ θεμνζζιυ υηακ βίκεηαζ παναηήνδζδ ζημ ιζηνμζηυπζμ θεμνζζιμφ. Γζα κα ιπμνέζεζ κα βίκεζ δ επζζήιακζδ ιε θθμομνεζηεΐκδ αημθμοεήζαιε ημ παναηάης πνςηυημθθμ: Φοβμηέκηνδζδ ηαθθζένβεζαξ μπηζηήξ ποηκυηδηαξ OD 600 0,4 Δπακεχνδζδ ημο ζγήιαημξ ζε (0,2Μ) ακεναηζηυ κάηνζμ ph 9 Πνμζεήηδ 100ιg fluorescein βζα ηάεε έκα ml δζαθφιαημξ Δπχαζδ 1h ζημοξ 37 μ C (ηα πνχηα 10 θεπηά ιε ηίκδζδ) Φοβμηέκηδζδ ηαζ απμιάηνοκζδ ηδξ θθμομνεζηεΐκδξ Δπακεχνδζδ ημο ζγήιαημξ ζε PBS. Σμ παναπάκς πνςηυημθθμ είκαζ ααζζζιέκμ ζημ πνςηυημθθμ ηςκ kourelis et al 2010 ιε ιζηνέξ ηνμπμπμζήζεζξ (Kourelis et al 2010) ΔΛΔΓΥΟ ΓΗΑ ΣΖΝ ΤΠΑΡΞΖ ΣΧΝ ΓΟΝΗΓΗΧΝ ΣΟΤ ΔΚΚΡΗΣΗΚΟΤ ΤΣΖΜΑΣΟ ΣΤΠΟΤ VI ΣΟ ΒΑΚΣΖΡΗΑΚΟ ΣΔΛΔΥΟ P.A1. Γζα κα δζαπζζηςεεί εάκ ημ ααηηδνζαηυ ζηέθεπμξ P.A1 δζαεέηεζ ή υπζ ημ εηηνζηζηυ ζφζηδια ηφπμο VI (T6SS) ηνίεδηε ζηυπζιμ κα ζπεδζαζημφκ εηηζκδηέξ βζα ηδκ εκίζποζδ δομ βμκζδίςκ, vgrg (ημ βμκίδζμ αοηυ ηςδζημπμζεί βζα ηδκ πνςηεΐκδ ημο άηνμο ηδξ μονάξ ημο T6SS) ηαζ hcp (ημ βμκίδζμ πμο ηςδζημπμζεί βζα ηδκ πνςηεΐκδ πμο ζπδιαηίγεζ ημ ηονίςξ ζχια ηδξ εηηνζηζηήξ ζοζηεοήξ). Σα βμκίδζα αοηά έπεζ δεζπηεί υηζ είκαζ δμιζηά ηαζ θαίκεηαζ υηζ είκαζ ζοκηδνδιέκα ακάιεζα ζημοξ μνβακζζιμφξ. Ακάιεζα ζηα ζοββεκζηά είδδ ημο ααηηδνζαημφ ζηεθέπμοξ P.A1, ιυκμ ημ βμκζδίςια ηδξ Pseudomonas medocina είκαζ πθήνςξ αθθδθμοπδιέκμ, ζημ μπμίμ έπμοκ ανεεεί οπμεεηζηέξ αθθδθμοπίεξ ηςκ βμκζδίςκ ημο T6SS. Γζα αοηυ ημ θυβμ, δ αθθδθμοπίεξ πμο πνδζζιμπμζήεδηακ ςξ αθθδθμοπίεξ ακαθμνάξ βζα ημκ ζπεδζαζιυ ηςκ εηηζκδηχκ ακήημοκ ζηδκ P.mendocina NK-01. Γζα κα ηαεμνζζημφκ μζ εέζεζξ ιε ηδ ιεβαθφηενδ ζοκηήνδζδ ζηζξ μπμίεξ εα ζπεδζαζημφκ μζ εηηζκδηέξ βζα ηαεέκα απυ 2 πνμακαθενεέκηα, πνδζζιμπμζήεδηακ μζ αθθδθμοπίεξ ηεζζάνςκ αηυια ααηηδνίςκ ημο βέκμοξ Pseudomonas. Αοηά ήηακ P.aeruginosa LESB58, P.aeruginosa PA7, P.mendocina ymp ηαζ P.protegens Pf-5 βζα ημ 43

44 βμκίδζμ vgrg ηαζ μζ αθθδθμοπίεξ ηςκ μνβακζζιχκ P.poae, P.brassicacearum NFM421, P.protegens CHA0 ηαζ P.mendocina NK-01 βζα ημ βμκίδζμ hcp. Οζ αθθδθμοπίεξ ηςκ βμκζδίςκ vgrg ηαζ hcp ηςκ παναπάκς ααηηδνίςκ ακαηηήεδηακ ιε ηδ πνήζδ ημο NCBI απυ ηδ αάζδ δεδμιέκςκ Genbank ηαζ ζηδ ζοκέπεζα, έβζκε εοεοβνάιιζζδ ηςκ αθθδθμοπζχκ ημοξ ιε ηδ πνήζδ ημο πνμβνάιιαημξ Clustalw βζα κα ανεεμφκ μζ πζμ ζοκηδνδιέκεξ πενζμπέξ. Οζ εηηζκδηέξ ζπεδζάζηδηακ ιε ηδ πνήζδ ημο πνμβνάιιαημξ Oligo Explorer ηαζ θαίκμκηαζ ζημκ Πίκαηα 11. Πίκαηαξ 11: Δηηζκδηέξ βζα ηδκ εκίζποζδ ηςκ βμκζδίςκ vgrg ηαζ hcp Γνλίδην Δθθηλεηήο Tm Μήθνο Πξντόληνο vgrg 5 -ATCATCAAGCAGGTGTTCCG o C 1186bp 5 - TTTCATCCACCTCGACGACG o C hcp 5 - CCCAGGACAAGACCCACAAG o C 303bp 5 - CCCGAACCGCCAGTGCTCAG o C Ζ ζοκεήηεξ ηδξ ακηίδναζδξ PCR βζα ηα δομ βμκίδζα ήηακ ακηίζημζπεξ ιε εηείκεξ πμο πνδζζιμπμζήεδηακ βζα ηδκ εκίζποζδ ημο βμκζδίμο ημο 16S rrna (Πίκαηαξ 6) ιε πνμζανιμζιέκδ ηδ εενιμηναζία ζφκδεζδξ ηςκ εηηζκδηχκ ημοξ 53 o C βζα ημ βμκίδζμ vgrg ηαζ ζημοξ 57 o C βζα ημ βμκίδζμ hcp ΑΛΛΖΛΔΠΗΓΡΑΖ ΣΟΤ ΒΑΚΣΖΡΗΑΚΟΤ ΣΔΛΔΥΟΤ P.A1 ΜΔ GRAM ΘΔΣΗΚΑ ΒΑΚΣΖΡΗΑ Γζα κα δζαπζζηςεεί εάκ ημ ααηηδνζαηυ ζηέθεπμξ P.A1 έπεζ ηδ δοκαηυηδηα κα ιεζχκεζ ηδ αζςζζιυηδηα άθθςκ εεηζηχκ ηαηά Gram ααηηδνίςκ, δ πεζναιαηζηή δζαδζηαζία πμο ήηακ δ αηυθμοεδ: Έβζκακ δζαδμπζηέξ αναζχζεζξ απυ ηαθθζένβεζα ημο ααηηδνζαημφ ζηεθέπμοξ P.A1 μπηζηήξ ποηκυηδηαξ πενίπμο 0,8 (OD 600 ) ιέπνζ ηδκ αναίςζδ 10-2 (αοηή δ αναίςζδ ακηζζημζπεί πενίπμο ζε 10 6 ηφηηανα/ml) Έβζκακ δζαδμπζηέξ αναζχζεζξ απυ ηαθθζένβεζα Bacillus thuringiensis μπηζηήξ ποηκυηδηαξ 0,4 (OD 600 ) ιέπνζ ηδκ αναίςζδ 10-2 (αοηή δ αναίςζδ ακηζζημζπεί πενίπμο ζε 10 3 ηφηηανα/ml) Πνμζηέεδηακ 25ιl απυ ηάεε εκαζχνδια ζε ηαηάθθδθμ ζςθήκα (ζηδκ πενίπηςζδ ημο ιάνηονα έβζκε πνμζεήηδ ιυκμ δείβιαημξ απυ ημ εκαζχνδια ηςκ ηφηηανςκ ημο Bacillus thuringiensis ηαζ υπζ ημο ααηηδνζαημφ ζηεθέπμοξ P.A1) 44

45 Φοβμηέκηνδζδ ημο ιίβιαημξ ζηζξ 5000g βζα πέκηε θεπηά. Δπακεχνδζδ ημο ιίβιαημξ ζε 50 ιl νοειζζηζημφ δζαθφιαημξ PBS. Δπχαζδ ημο ιίβιαημξ βζα 3h ζηδκ ηαηάθθδθδ ηάεε θυνα εενιμηναζία. Ζ παναπάκς πεζναιαηζηή δζαδζηαζία αημθμοεήεδηε βζα κα πνμηφρμοκ ζοκμθζηά 9 λεπςνζζηέξ ιζηηέξ (B.thuringiensis-P.A1) ηαθθζένβεζεξ ηαζ 9 λεπςνζζηέξ ηαεανέξ ηαθθζένβεζεξ ημο B.thuringiensis, μζ μπμίεξ απμηεθμφζακ ημ ιάνηονα ημο πεζνάιαημξ. Ζ επχαζδ έβζκε βζα 3 χνεξ ημπμεεηχκηαξ απυ 3 δείβιαηα ιζηηήξ ηαθθζένβεζαξ ηαζ 3 δείβιαηα ιάνηονεξ ζημοξ 25 o C, 30 o C ηαζ ζημοξ 37 o C. Ζ ίδζα αηνζαχξ πεζναιαηζηή δζαδζηαζία αημθμοεήεδηε ηαζ ζηδκ πενίπηςζδ ηδξ αθθδθεπίδναζδξ ημο ααηηδνζαημφ ζηεθέπμοξ P.A1 ιε ημ ααηηήνζμ Staphylococcus aureus. Ζ ιυκδ δζαθμνά ήηακ υηζ δ ηαθθζένβεζα ημο Staphylococcus aureus είπε μπηζηή ποηκυηδηα 0,5. ημ ηέθμξ ηδξ επχαζδξ, ηα ααηηήνζα ιεηνήεδηακ ιε ηζηθμπμίδζδ, ηυζμ ζηζξ ιζηηέξ ηαθθζένβεζεξ υζμ ηαζ ζημκ ιάνηονα ΜΟΛΤΝΖ ΔΤΚΑΡΤΧΣΗΚΧΝ ΚΤΣΣΑΡΧΝ ΜΔ ΣΟ ΒΑΚΣΖΡΗΑΚΟ ΣΔΛΔΥΟ P.A1 Γζα κα δζαπζζηςεεί εάκ ημ ααηηδνζαηυ ζηέθεπμξ P.A1 έπεζ ηδκ ζηακυηδηα κα πνμζημθθάηαζ ζηα εοηανοςηζηά ηφηηανα ηαζ κα εζζένπεηαζ ζε αοηά, ιεηνήεδηακ ηα ααηηήνζα πμο πνμζημθθχκηαζ, ηαεχξ ηαζ ηα ααηηήνζα πμο δζεζζδφμοκ ζε εοηανοςηζηά ηφηηανα. Πζμ ζοβηεηνζιέκα πνδζζιμπμζήεδηακ ηα ηφηηανα HuH-7 (ηφηηανα δπαημηανηζκχιαημξ), NH3Σ3 (ζκμαθάζηεξ πμκηζημφ) ηαζ μζηεμαθάζηεξ πμκηζημφ. Ζ πεζναιαηζηή δζαδζηαζία ήηακ δ αηυθμοεδ: 1. Καθθζένβεζα εοηανοςηζηχκ ηφηηανχκ (10 6 ηφηηανα ακά ηνζαθίμ 5cm) ζε ενεπηζηυ ιέζμ DMEM (10% FBS) δζαηδνήεδηε ζηδκ απμοζία ακηζαζμηζηχκ βζα ημοθάπζζημκ 24 χνεξ. 2. Φοβμηέκηνδζδ ηαθθζένβεζαξ (5000g βζα 10 θεπηά) ημο ααηηδνζαημφ ζηεθέπμοξ P.A1 μπηζηήξ ποηκυηδηαξ 0,9 OD 600 (ακηζζημζπεί ζε ανζειυ ααηηδνίςκ ηδξ ηάλδξ ηςκ ηφηηανα/ml). 3. Δπακεχνδζδ ηδξ ηαθθζένβεζαξ ζε νοειζζηζηυ δζάθοια PBS ακάθμβδξ πμζυηδηαξ ιε ημκ ανπζηυ υβημ ηδξ ηαθθζένβεζαξ. 4. Δλζ ηνζαθία ιε εοηανοςηζηά ηφηηανα ιμθφκεδηακ ιε 1mL απυ ημ εκαζχνδια ηςκ ααηηδνίςκ ζημ ηαεέκα. 5. Δπχαζδ ηςκ 6 ηνζαθίςκ βζα 10 min ή 30min ζημοξ 37 o C. 6. Πθφζζιμ ηςκ ηοηηάνςκ, ημοθάπζζημκ 4 θμνέξ ιε νοειζζηζηυ δζάθοια PBS, βζα κα απμιαηνοκεμφκ ηα ιδ πνμζημθθδιέκα ααηηήνζα. 45

46 7. ηα 3 απυ ηα 6 ηνζαθία, πνμζηέεδηακ 2 ml παβςιέκμο δζξ απεζηαβιέκμο κενμφ ζε ηάεε έκα ηνζαθίμ. Μεηά απυ 5 min (βζα κα ζπάζμοκ ηα ηφηηανα) έβζκε ηζηθμπμίδζδ ημο εκαζςνήιαημξ ζε ηνζαθία ζε Nutrient Agar. 8. Πνμζεήηδ 1mL νοειζζηζημφ δζαθφιαημξ PBS ιε 20 ιg/ml ζζπνμθθμλαζίκδ ζηα οπυθμζπα 3 ηνίθζα ηαζ επχαζδ βζα 90 min ζημοξ 37 o C βζα κα πεεάκμοκ ηα ελςηοηηανζηά ααηηήνζα. Δπακάθδρδ ημο αήιαημξ 7 ηαζ βζα ηα οπυθμζπα 3 ηνζαθία. Μέηα απυ επχαζδ πενίπμο 24 ςνχκ ζημοξ 37 o C, έβζκε ηαηαιέηνδζδ ηςκ απμζηζχκ ηαζ οπμθμβίζηδηακ ηα πνμζημθθδιέκα ηαζ ηα εκδμηοηηανζηά ααηηήνζα βζα ηάεε ηοηηανζηή ζεζνά ΖΛΔΚΣΡΟΝΗΚΖ ΜΗΚΡΟΚΟΠΗΑ ΑΡΧΖ (SEM) Υνδζζιμπμζήεδηε δθεηηνμκζηή ιζηνμζημπία ζάνςζδξ (SEM) βζα κα βίκεζ παναηήνδζδ ηςκ πνχηςκ ζηαδίςκ ηδξ ιυθοκζδξ ηςκ εοηανοςηζηχκ ηοηηάνςκ ιε ημ ααηηδνζαηυ ζηέθεπμξ P.A1. Ανπζηά έβζκε ηαθθζένβεζα ηςκ ηοηηάνςκ HuH-7 ζε ενεπηζηυ ιέζμ DMEM ιε 10% FBS, ηαζ δ ηαθθζένβεζα δζαηδνήεδηε βζα ημοθάπζζημκ 24h πςνίξ ακηζαζμηζηά. Κφηηανα HuH-7 ιμθφκεδηακ ιε 1mL εκαζςνήιαημξ ζε PBS ημο ααηηδνζαημφ ζηεθέπμοξ P.A1 (μπηζηήξ ποηκυηδηαξ 0.8 OD 600 ) ηαζ επςάζηδηακ βζα 10 min ζημοξ 37 o C. Μεηά ημ πέναξ ηςκ 10 min ημ εκαζχνδια ηςκ ααηηδνίςκ απμιαηνφκεδηε ηαζ ηα ηφηηανα λεπθφεδηακ βζα 4 θμνέξ ιε PBS έηζζ χζηε κα απμιαηνοκεμφκ ηα ιδ πνμζημθθδιέκα ααηηήνζα. Σα ηφηηανα ιμκζιμπμζήεδηακ βζα 15 min ζε δζάθοια 4% παναθμνιαθδεΰδδξ ηαζ ζηδ ζοκέπεζα αημθμοεήεδηε δ δζαδζηαζία αθοδάηςζδξ ηςκ δεζβιάηςκ ιε δζαθμνεηζηέξ ζοβηεκηνχζεζξ αζεακυθδξ (ETOH). α) 30% ETOH ζε H2O βζα 10 min α) 50% ETOH ζε H2O βζα 10 min β) 70% ETOH ζε H2O βζα 10 min δ) 90% ETOH ζε H2O βζα 10 min ε) 100% ETOH βζα 10 min. ηδ ζοκέπεζα, ηα ιμκζιμπμζδιέκα δείβιαηα επακεναηχεδηακ βζα 24 χνεξ ζε ηεκυ ηαζ παναηδνήεδηακ. Σμ δθεηηνμκζηυ ιζηνμζηυπζμ ζάνςζδξ πμο πνδζζιμπμζήεδηε ήηακ 20k Volt JEOL JMS-840A εκζζποιέκμ ιε ζφζηδια ιζηνμακάθοζδξ δζάποζδξ εκένβεζαξ X-ray (EDS) Oxford ISIS 300 ηαζ ημ απαναίηδημ θμβζζιζηυ βζα ηδ ζδιεζαηή ιζηνμακάθοζδ, βναιιζηή ιζηνμακάθοζδ ηαζ πδιζηή πανημβνάθδζδ ηδξ οπυ ελέηαζδ επζθάκεζαξ. Οζ ζοκεήηεξ πμο 46

47 πνδζζιμπμζήεδηακ ήηακ: ηάζδ επζηάποκζδξ 20kV, ηάεεημ νεφια 45nA ηαζ πνυκμ ιέηνδζδξ 60 δεοηενυθεπηα, ιε δζυνεςζδ ZAF πμο πνμενπυηακ on-line. Σα δείβιαηα ηαθφθεδηακ ιε άκεναηα πνδζζιμπμζχκηαξ ιζα Jeol JEE-4x ακηθία ηεκμφ ΜΗΚΡΟΚΟΠΗΟ ΤΝΔΣΗΑΚΖ ΑΡΧΖ ΜΔ ΛΔΗΕΔΡ (CONFOCAL) Γζα κα πνμζδζμνζζεεί μ εκδμηοηηανζηυξ εκημπζζιυξ ημο ααηηδνζαημφ ζηεθέπμοξ P.A1, πνδζζιμπμζήεδηε ιζηνμζηυπζμ ζοκεζηζαηήξ ζάνςζδξ ιε θέζγεν. Σμ ααηηδνζαηυ ζηέθεπμξ P.A1 επζζδιάκεδηε ιε θθμομνεζηεΐκδ (fluorescein- πνάζζκμξ θεμνζζιυξ) ηαζ δ αηηίκδ ηςκ εοηανοςηζηχκ ηοηηάνςκ NH3T3 πμο πνδζζιμπμζήεδηακ επζζδιάκεδηε ιε θαθθμσδίκδ (phalloidin- ηυηηζκμξ θεμνζζιυξ) Ζ πεζναιαηζηή δζαδζηαζία πμο αημθμοεήεδηε είπε ςξ ελήξ: α) ηφηηανα NH3T3 ηαθθζενβήεδηακ ζε ενεπηζηυ ιέζμ DMEM ιε 10% FBS ζηδκ απμοζία ακηζαζμηζηχκ βζα ημοθάπζζημκ 24 χνεξ, α) ημ ααηηδνζαηυ ζηέθεπμξ P.A1 επζζδιάκεδηε ιε θθμομνεζηεΐκδ ηαζ δ μπηζηή ημο ποηκυηδηα πνμζανιυζηδηε ζημ 0.8 OD 600, β) έβζκε ιυθοκζδ ηςκ ηφηηανςκ NH3T3 ιε 1mL εκαζςνήιαημξ ημο επζζδιαζιέκμο ιε θθμομνεζηεΐκδ ααηηδνζαημφ ζηεθέπμοξ P.A1 ηαζ αημθμφεδζε επχαζδ ζημοξ 37 o C βζα 90 min, δ) αθαζνέεδηε ημ εκαζχνδια ηςκ ααηηδνίςκ ηαζ ηα εοηανοςηζηά ηφηηανα πθφεδηακ 4 θμνέξ ημοθάπζζημκ ιε PBS, ε) πνμζηέεδηε δζάθοια 4% παναθμνιαθδεΰδδξ βζα 15 min, γ) αθαζνέεδηε δ παναθμνιαθδεΰδδ ηαζ πνμζηέεδηε δζάθοια 0.2% TritonX ζε PBS, δ) αθμφ αθαζνέεδηε ημ TritonX, πνμζηέεδηε δζάθοια θαθθμσδίκδξ ζε PBS ζε ακαθμβία 1/10 ηαζ επςάζηδηε βζα 12 χνεξ ζε εενιμηναζία δςιαηίμο, ε) αθαζνέεδηε δ θαθθμσδίκδ ηαζ πνμζηέεδηε ιζηνή πμζυηδηα DAKO. Σα δείβιαηα παναηδνήεδηακ ζε ιζηνμζηυπζμ ζοκεζηζαηήξ ζάνςζδξ ιε θέζγεν. 47

48 3. ΑΠΟΣΔΛΔΜΑΣΑ 3.1. ΣΑΤΣΟΠΟΗΖΖ ΣΟΤ ΒΑΚΣΖΡΗΑΚΟΤ ΣΔΛΔΥΟΤ P.A1 Με αάζδ ηα ιμνθμθμβζηά, αζμπδιζηά ηαζ θοζζμθμβζηά παναηηδνζζηζηά ημο ααηηδνίμο ιεηά απυ ιζα ζεζνά εθέβπςκ, ανέεδηε υηζ ακήηεζ ζημ βέκμξ Pseudomonas ηαζ παναηηδνίζηδηε ιέπνζ ηδκ μνζζηζηή ημο ηαοημπμίδζδ ςξ Pseudomonas ζηέθεπμξ A1 (Παπαδμπμφθμο 2008). Γζα κα ιπμνέζμοκ κα επζαεααζςεμφκ ηα παναπάκς δεδμιέκα αθθά ηαζ βζα κα μθμηθδνςεεί δ ηαοημπμίδζδ ηαζ ζημ επίπεδμ ημο είδμοξ, πνδζζιμπμζήεδηε δ ιέεμδμξ ημο 16S rrna (Böttger 1989), δ μπμία πνδζζιμπμζείηαζ ηαηά ηυνμκ βζα ηδκ ηαοημπμίδζδ ηςκ ιζηνμμνβακζζιχκ ζημ επίπεδμ ημο βέκμοξ ηαζ πμθθέξ θμνέξ ηαζ ημο είδμοξ. Αηυια πναβιαημπμζήεδηε ιζα ζεζνά απυ αζμπδιζημφξ εθέβπμοξ ιε ζημπυ ηδ ζφβηνζζδ ημο ααηηδνζαημφ ζηεθέπμοξ P.A1 ιε ηα ζοββεκζηά ημο (ιε αάζδ ημ βμκίδζμ ημο 16S rrna), βζα κα δζαπζζηςεεί ακ ακήηεζ ή υπζ ζε ηάπμζμ ήδδ ηαοημπμζδιέκμ είδμξ. Δπζπθέμκ πνδζζιμπμζήεδηακ μζ αθθδθμοπίεξ ηςκ βμκζδίςκ gyrb (DNA βονάζδ), ropb ( α οπμιμκάδα ηδξ RNA πμθοιενάζδξ) ηαζ ropd (ζίβια οπμιμκάδα ηδξ RNA πμθοιενάζδξ), ηα μπμία έπμοκ πνδζζιμπμζδεεί ηα ηεθεοηαία πνυκζα βζα ηδκ ηαθφηενδ ηαλζκυιδζδ ηαζ θοθμβεκεηζηή ηαηάηαλδ ηςκ ιζηνμμνβακζζιχκ ΦΤΛΟΓΔΝΔΣΗΚΖ ΚΑΣΑΣΑΞΖ ΣΟΤ ΒΑΚΣΖΡΗΑΚΟΤ ΣΔΛΔΥΟΤ P.A1 ΜΔ ΒΑΖ ΣΟ ΓΟΝΗΓΗΟ ΣΟΤ 16S rrna Ζ πνχηδ πνμζέββζζδ βζα ηδκ ηαλζκυιδζδ ημο ααηηδνζαημφ ζηεθέπμοξ P.A1 ζε επίπεδμ είδμοξ ήηακ δ απμιυκςζδ ιε PCR ηαζ δ αθθδθμφπζζδ ημο βμκζδίμο ημο 16S rrna. Σμ βμκίδζμ αοηυ είκαζ ζδζαίηενα ζοκηδνδιέκμ ηαζ έπεζ πνδζζιμπμζδεεί εονφηαηα ηζξ ηεθεοηαίεξ δεηαεηίεξ βζα ηδκ ηαλζκυιδζδ ηςκ ιζηνμμνβακζζιχκ. Σμ ιέβεεμξ ηδξ αθθδθμοπίαξ πμο απμιμκχεδηε ήηακ 1372 bp ηαζ εηηίκεηαζ απυ ηδ εέζδ 36 ημο βμκζδίμο ιέπνζ ηδ εέζδ Ζ αθθδθμοπία ημο 16S rrna ημο ααηηδνζαημφ ζηεθέπμοξ P.A1 είκαζ: >P.A1 16S rrna TGATAGGAATTTGTTGCTGGATTTACCGCACCGACGGGTGAGTAATGCCTAGGAATCTGCCTGGTAGTGGGGGATAACGT TCCGAAAGGAACGCTAATACCGCATACGTCCTACGGGAGAAAGCAGGGGACCTTCGGGCCTTGCGCTATCAGATGAGCCT AGGTCGGATTAGCTAGTTGGTGAGGTAATGGCTCACCAAGGCGACGATCCGTAACTGGTCTGAGAGGATGATCAGTCACA CTGGAACTGAGACACGGTCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTGGGGAATATTGGACAATGGGCGAAAGCCTGATCCAG CCATGCCGCGTGTGTGAAGAAGGTCTTCGGATTGTAAAGCACTTTAAGTTGGGAGGAAGGGCATTAACCTAATACGTTAG TGTTTTGACGTTACCGACAGAATAAGCACCGGCTAACTTCGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGAAGGGTGCAAGCGTTAA TCGGAATTACTGGGCGTAAAGCGCGCGTAGGTGGTTTCGTTAAGTTGGATGTGAAAGCCCCGGGCTCAACCTGGGAACTG CATCCAAAACTGGCGAGCTAGAGTACGGTAGAGGGGTGGTGGAATTTCCTGTGTAGCGGTGAAATGCGTAGATATAGGAA GGAACACCAGTGGCGAAGGCGACCACCTGGACTGATACTGACACTGAGGTGCGAAAGCGTGGGGAGCAAACAGGATTAG 48

49 ATACCCTGGTAGTCCACGCCGTAAACGATGTCAACTAGCCGTTGGGTTCCTTGAGAACTTAGTGGCGCAGCTAACGCATTA AGTTGACCGCCTGGGGAGTACGGCCGCAAGGTTAAAACTCAAATGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCGGTGGAGCATG GTGGTTTAATTCGAAGCAACGCGAAGAACCTTACCTGGCCTTGACATGCTGAGAACTTTCCAGAGATGGATTGGTGCCTTC GGGAACTCAGACACAGGTGCTGCATGGCTGTCGTCAGCTCGTGTCGTGAGATGTTGGGTTAAGTCCCGTAACGAGCGCAA CCCTTGTCCTTAGTTACCAGCACGTAATGGTGGCACTCTAAGGAGACTGCCGGTGACAAACCGGAGGAAGGTGGGGATGA CGTCAAGTCATCATGGCCCTTACGGCCAGGGCTACACACGTGCACAATGGTCGGTACAAAGGGTTGCCAAGCCGCGAGGT GGAGCTAATCCCATAAAACCGATCGTAGTCCGGATCGCAGTCTGCAACTCGACTGCGTGAAGTCGGAATCGCTAGTAATC GTGAATCAGAATGTCACGGTGAATACGTTCCCGGGCCTTGTACACACCGCCCGTCACACCATGGGAGTGGGTTGCTCCAG AAGTAGCTAGTCT φιθςκα ιε ημκ αθβυνζειμ Blast n, μζ 30 αθθδθμοπίεξ ιε ηζξ μπμίεξ ειθακίγεζ ιεβαθφηενδ μιμθμβία ημ 16S rrna πμο απμιμκχεδηε απυ ημ ααηηδνζαηυ ζηέθεπμξ P.A1, θαίκμκηαζ ζημκ Πίκαηα 1. Παναηδνείηαζ υηζ ημ βμκίδζμ ημο 16S rrna ημο ααηηδνζαημφ ζηεθέπμοξ P.A1 ειθακίγεζ 99% μιμθμβία ηαζ 94% επζηάθορδ ηδξ αθθδθμοπίαξ ημο ιε ηνία δζαθμνεηζηά είδδ Pseudomonas ηα μπμία είκαζ: Pseudomonas alcaliphila, Pseudomonas toyotomiensis ηαζ Pseudomonas mendocina. Δπζπθέμκ, δζαπζζηχεδηε υηζ ειθακίγεζ ορδθή μιμθμβία ιε ηα είδδ Pseudomonas alcaligenes ηαζ Pseudomonas pseudoalcaligenes, ιε ηα μπμία πανμοζζάγεζ 99% μιμθμβία ηαζ 93% πμζμζηυ επζηάθορδξ. Πίκαηαξ 1: Οζ 30 αθθδθμοπίεξ πμο ειθάκζζακ ηδ ιεβαθφηενδ μιμθμβία ιε ηδκ αθθδθμοπία ημο βμκζδίμο ημο 16S rrna ημο ααηηδνζαημφ ζηεθέπμοξ P.A1 ζφιθςκα ιε ημκ αθβυνζειμ ημο Blast n. Οξγαληζκόο Max Total Query E Ident Accession score score cover value Pseudomonas alcaliphila L % % KF Pseudomonas toyotomiensis CSY-P % % KF Pseudomonas toyotomiensis GL % % KC Pseudomonas mendocina zyj % % EU Pseudomonas alcaligenes NCIMB % % JX Pseudomonas pseudoalcaligenes C70b % % JX Pseudomonas mendocina FB % % HQ Pseudomonas mendocina PC % % DQ Pseudomonas mendocina PC % % DQ Pseudomonas toyotomiensis W % % KC Pseudomonas pseudoalcaligenes ASU % % KC Pseudomonas pseudoalcaligenes ASU % % KC Pseudomonas alcaliphila D % % EU Pseudomonas cf. pseudoalcaligenes % % AF Pseudomonas pseudoalcaligenes KF % % AB Pseudonocardia kongjuensis OAct % % KC Pseudomonas alcaliphila NBRC % % AB Pseudomonas alcaliphila N % % JF Pseudomonas oleovorans subsp % % DQ lubricantis RS1 Pseudomonas mendocina PC % % DQ Pseudomonas alcaliphila AL % % NR Pseudomonas pseudoalcaligenes CLR % % KF Pseudomonas mendocina S178S % % JF

50 Pseudomonas mendocina % % EU Pseudomonas mendocina JY % % EU Pseudomonas nitroreducens % % AF Pseudomonas alcaligenes CLRI % % KF Pseudomonas alcaliphila CLSI % % KF Pseudomonas nitroreducens ES % % JF Pseudomonas alcaliphila PNS % % JF ηδ ζοκέπεζα, έβζκε θοθμβεκεηζηή ακάθοζδ ιε ηδ πνήζδ ηδξ αθθδθμοπίαξ πμο απμιμκχεδηε απυ ημ ααηηδνζαηυ ζηέθεπμξ P.A1 ηαζ άθθεξ 27 αθθδθμοπίεξ ημο 16S rrna πμο ακήημοκ ζε ρεοδμιμκάδεξ δζαθμνεηζηχκ εζδχκ, ιε ζημπυ κα δζαπζζηςεεί ιε πμζα είδδ Pseudomonas ειθακίγεζ ζοββέκεζα ημ ααηηδνζαηυ ζηέθεπμξ P.A1. Σμ θοθμβεκεηζηυ δέκηνμ πμο πνμέηορε ιε αοηυκ ημκ ηνυπμ πανμοζζάγεηαζ ζηδκ Δζηυκα 1. Ωξ μνβακζζιυξ ιάνηοναξ εηηυξ μιάδαξ (outgroup) πνδζζιμπμζήεδηε ημ Cellvibrio ostraviensis LMG

51 Pseudomonas alcaliphila L8 (KF ) 40 Pseudomonas mendocina zyj1-4 (EU ) 58 Pseudomonas toyotomiensis CSY--P3 (KF ) 96 Pseudomonas A1 64 Pseudomonas oleovorans subsp.lubricantis (DQ ) 71 Pseudomonas nitroreducens ES-9 (JF ) 40 Pseudomonas lindanilytica IPL-1 (DQ ) 37 Pseudomonas aeruginosa LMG 1242 (Z ) Pseudomonas borbori R (AM ) Pseudomonas argentinensis CH01(AY ) 99 Pseudomonas flavescens B62 (U ) Pseudomonas stutzeri ATCC17587 (U ) 83 Pseudomonas chloritidismutans AW-1(AY ) 94 Pseudomonas xanthomarina KMM1447(AB ) 45 Pseudomonas jessenii CIP (AF ) 24 Pseudomonas agarici LMG2112 (Z ) Pseudomonas asplenii ATCC (AB ) 100 Pseudomonas fuscovaginae ICMP 5940 (FJ ) 36 Pseudomonas putida IAM1236 (D ) Pseudomonas monteilii CIP10488 (AF ) Pseudomonas plecoglossicida FPC951 (AB ) Pseudomonas mosselii CIP (AF ) Pseudomonas cremoricoloranta IAM 1541 (AB ) Pseudomonas oryzihabitans IAM1568 (D84004) 24 Pseudomonas fulva NRIC0180T (AB ) 100 Pseudomonas parafulva AJ2129T (AB ) Cellvibrio ostraviensis LMG19434 (AJ ) Δζηυκα 1: Φοθμβεκεηζηή ηαηάηαλδ ημο ααηηδνζαημφ ζηεθέπμοξ P.A1 ιε αάζδ ηδκ αθθδθμοπία ημο βμκζδίμο ημο 16S rrna

52 Όπςξ θαίκεηαζ ζηδκ Δζηυκα 1, ημ ααηηδνζαηυ ζηέθεπμξ P.A1 ηαηαηάζζεηαζ θοθμβεκεηζηά ζημκ ίδζμ ηθάδμ ιε ηα ααηηήνζα P.alcaliphila, P.medocina ηαζ P.toyotomiensis. Αοηυ οπμδεζηκφεζ υηζ αηυια ηαζ ζε θοθμβεκεηζηυ επίπεδμ δεκ ζοββεκεφεζ ιε έκα, αθθά ιε ηνεζξ δζαθμνεηζημφξ ιζηνμμνβακζζιμφξ ζημκ ίδζμ ααειυ ηαζ ζοκεπχξ είκαζ αδφκαηδ δ ηαλζκυιδζδ ημο ααηηδνζαημφ ζηεθέπμοξ P.A1 ζε επίπεδμ είδμοξ, ιυκμ ιε ηδ πνήζδ ημο 16S rrna. Δπζπθέμκ, δζαπζζηχεδηε υηζ πανμοζζάγεζ ζοββέκεζα ιε ηα είδδ Pseudomonas oleovorans subsp. Lubricantis ηαζ P.toyotomiensis, ηα μπμία ακήημοκ ζημ Pseudomonas oleovorans group. Σα παναπάκς δεδμιέκα, μδήβδζακ ζηδκ πναβιαημπμίδζδ ιζαξ εηηεηαιέκδξ ζεζνάξ αζμπδιζηχκ εθέβπςκ, ιε ζηυπμ κα ζοβηνζεεί ημ ααηηδνζαηυ ζηέθεπμξ P.A1 ζε αζμπδιζηυ επίπεδμ ιε ηα ηνία ααηηήνζα ιε ηα μπμία ειθακίγεζ ηδ ιεβαθφηενδ μιμθμβία ζημ 16S rrna ΓΔΝΗΚΑ ΥΑΡΑΚΣΖΡΗΣΗΚΑ ΣΟΤ ΒΑΚΣΖΡΗΑΚΟΤ ΣΔΛΔΥΟΤ P.A1 Δπεζδή, δ ηαοημπμίδζδ ημο ααηηδνζαημφ ζηεθέπμοξ P.A1 δεκ επζηεφπεδηε, ειθακίγεζ υιςξ ζοββέκεζα ιε ηα ααηηήνζα P.alcaliphila, P.medocina ηαζ P.toyotomiensis, πμο ηαηαηάζζμκηαζ ζημκ ίδζμ ηθάδμ ιε αοηήκ, πναβιαημπμζήεδηε ιζα ζεζνά αζμπδιζηχκ ηαζ θοζζμθμβζηχκ εθέβπςκ βζα κα πνμζδζμνζζεμφκ ηα παναηηδνζζηζηά ηδξ ηαζ κα ζοβηνζεμφκ ιε ηα ζοββεκζηά πνμξ αοηήκ είδδ (P.alcaliphila, P.medocina ηαζ P.toyotomiensis). Α. Φπζηνινγηθά ραξαθηεξηζηηθά ηνπ βαθηεξηαθνύ ζηειέρνπο P.A1 1. Παξαγσγή θζνξηδόλησλ ρξσζηηθώλ Ανπζηά, εθέβπεδηε εάκ ημ ααηηδνζαηυ ζηέθεπμξ P.A1 πανάβεζ θεμνίγμοζεξ πνςζηζηέξ, ζε ενεπηζηυ ιέζμ Kings Medium B, ημ μπμίμ δεκ πενζέπεζ ηαευθμο ζυκηα ζζδήνμο ηαζ μδδβεί ζηδκ οπενέηθναζδ ηςκ θεμνζγυκηςκ πνςζηζηχκ ιε απμηέθεζια μ θεμνζζιυξ κα είκαζ έκημκμξ ηαζ δζαηνζηυξ. Γζαπζζηχεδηε υηζ ημ ααηηδνζαηυ ζηέθεπμξ P.A1 δεκ πανάβεζ θεμνίγμοζεξ πνςζηζηέξ, ζε ακηίεεζδ ιε ημκ εεηζηυ ιάνηονα, πμο ήηακ ηαοημπμζδιέκμ ζηέθεπμξ ηδξ Pseudomonas aeruginosa, ημ μπμίμ είπε έκημκμ πνάζζκμ θεμνζζιυ. Σμ ααηηδνζαηυ ζηέθεπμξ P.A1 υπςξ ηαζ ηα ααηηήνζα P.alcaliphila, P.medocina ηαζ P.toyotomiensis, ηα μπμία ακήημοκ θοθμβεκεηζηά ζημκ ίδζμ ηθάδμ δεκ πανάβμοκ θεμνίγμοζεξ πνςζηζηέξ. 52

53 2. Δύξνο ζεξκνθξαζίαο θαη ph αλάπηπμεο Έβζκε ηαιπφθδ ακάπηολδξ ημο ααηηδνζαημφ ζηεθέπμοξ P.A1 ζε 6 δζαθμνεηζηέξ εενιμηναζίεξ βζα πνμκζηυ δζάζηδια 24 ςνχκ βζα κα δζαπζζηςεεί ημ εφνμξ εενιμηναζζχκ ζημ μπμίμ ιπμνεί κα ακαπηοπεεί. Όπςξ θαίκεηαζ ζηδκ Δζηυκα 2 ημ ααηηδνζαηυ ζηέθεπμξ P.A1 έπεζ ηδκ ζηακυηδηα κα ακαπηφζζεηαζ ζε έκα ιεβάθμ εφνμξ εενιμηναζζχκ πμο ηοιαίκεηαζ απυ ημοξ 4 o C ιέπνζ 46 o C, ιε αέθηζζηδ εενιμηναζία ακάπηολδξ ημοξ 37 o C. εενιμηναζίεξ. Δζηυκα 2: Καιπφθδ ακάπηολδξ ημο ααηηδνζαημφ ζηεθέπμοξ P.A1 ζε 6 δζαθμνεηζηέξ Όζμκ αθμνά ημ έονμξ ηςκ εενιμηναζζχκ ζηζξ μπμίεξ ημ ααηηδνζαηυ ζηέθεπμξ P.A1 ακαπηφζζεηαζ, δζαθένεζ απυ ηα ηνία ααηηήνζα ιε ηα υπμζα ηαηαηάζζεηαζ θοθθμβεκεηζηά ζημκ ίδζμ ηθάδμ. Πζμ ζοβηεηνζιέκα, δ P.toyotomiensis έπεζ εφνμξ εενιμηναζζχκ ακάπηολδξ απυ ημοξ 4 o C έςξ ημοξ 42 o C (Hirota et al 2011), δ P.alcaliphila ακαπηφζζεηαζ ζημοξ 4 o C αθθά υπζ ζημοξ 40 o C (Yumoto et al 2001) ηαζ δ P.medocina έπεζ ηδκ ζηακυηδηα κα ακαπηφζζεηαζ ζημοξ 42 o C αθθά δεκ οπάνπμοκ δζαεέζζια αζαθζμβναθζηά δεδμιέκα ςξ πνμξ ηδκ ακάπηολδ ηδξ ζημοξ 4 o C ή ζημοξ 46 o C (Murray et al 1999). Με δεδμιέκμ υηζ ημ ααηηδνζαηυ ζηέθεπμξ P.A1 ηαηαηάζζεηαζ θοθμβεκεηζηά ζημκ ίδζμ ηθάδμ ιε ηα ααηηήνζα P.alcaliphila και P.toyotomiensis ηα μπμία ακαπηφζζμκηαζ ζε ζδζαίηενα αθηαθζηυ πενζαάθθμκ, ιε ηζιέξ ph πμο ηοιαίκμκηαζ απυ 7 έςξ 10 βζα ηδκ 53

54 P.alcaliphila (Yumoto et al 2001) ηαζ απυ 6 έςξ 10 βζα ηδκ P.toyotomiensis (Hirota et al 2011) ηνίεδηε ζηυπζιμ κα δζενεοκδεεί ημ εφνμξ ph ζημ μπμίμ ακαπηφζζεηαζ ημ ααηηδνζαηυ ζηέθεπμξ P.A1. Γζα ημ ζημπυ αοηυ, ημ ααηηδνζαηυ ζηέθεπμξ P.A1 ηαθθζενβήεδηε ζε οβνά ενεπηζηά ιέζα ιε ηζιέξ ph απυ 2 έςξ 12 ηαζ επςάζηδηε βζα 48 χνεξ ζημοξ 37 o C. Γζαπζζηχεδηε υηζ ημ ααηηδνζαηυ ζηέθεπμξ P.A1 ακαπηφπεδηε ζε ηζιέξ ph απυ 5 έςξ 12, ηαζ ζοκεπχξ είκαζ πενζζζυηενμ αθηαθευθζθδ απυ ηα ζοββεκζηά ηδξ είδδ. Β. Βηνρεκηθά ραξαθηεξηζηηθά ηνπ βαθηεξηαθνύ ζηειέρνπο P.A1 1. Μεηαηξνπή ησλ ληηξηθώλ ζε ληηξώδε Ζ ιεηαηνμπή ηςκ κζηνζηχκ ζε κζηνχδδ είκαζ ηφνζμ παναηηδνζζηζηυ ηαζ ηςκ ηνζχκ ααηηδνίςκ ιε ηα μπμία ημ ααηηδνζαηυ ζηέθεπμξ P.A1 ηαηαηάζζεηαζ θοθμβεκεηζηά ζημκ ίδζμ ηθάδμ. Γζα ημ θυβμ αοηυ ηνίεδηε ζηυπζιμ κα εθεβπεεί ακ ημ ααηηδνζαηυ ζηέθεπμξ P.A1 έπεζ ηδκ ζηακυηδηα κα ιεηαηνέπεζ ηα κζηνζηά ζε κζηνχδδ. Ζ ζηακυηδηα αοηή ιπμνεί κα παεεί πνμζςνζκά ζηδκ πενίπηςζδ πμο ημ ααηηήνζμ ακαηαθθζενβείηαζ βζα πμθφ ηαζνυ ζηδκ απμοζία κζηνζηχκ. Γζα κα ακαηηδεεί αοηή δ ζδζυηδηα, ημ οπυ ιεθέηδ ααηηήνζμ, εα πνέπεζ κα ακαηαθθζενβδεεί βζα ημοθάπζζημκ 30 δζαδμπζηέξ θμνέξ ζε ενεπηζηυ πμο κα πενζέπεζ κζηνζηά. Μεηά απυ 30 ημοθάπζζημκ δζαδμπζηέξ ακαηαθθζένβεζεξ ζε ενεπηζηυ πμο πενζείπε κζηνζηά, ημ ααηηδνζαηυ ζηέθεπμξ P.A1 έδςζε ανκδηζηή ακηίδναζδ υζμκ αθυνα ηδ ιεηαηνμπή ηςκ κζηνζηχκ ζε κζηνχδδ. Ωξ εεηζηυξ ιάνηοναξ πνδζζιμπμζήεδηε ημ ααηηήνζμ P.aeruginosa, πμο είκαζ βκςζηυ υηζ ιεηαηνέπεζ ηα κζηνζηά ζε κζηνχδδ ηαζ ιάθζζηα ιε απεθεοεένςζδ αενίμο. Σα δεδμιέκα αοηά δείπκμοκ υηζ ημ ααηηδνζαηυ ζηέθεπμξ P.A1 δεκ έπεζ ηδκ ζηακυηδηα ιεηαηνμπήξ ηςκ κζηνζηχκ ζε κζηνχδδ ζε ακηίεεζδ ιε ηα ζοββεκζηά πνμξ αοηήκ ααηηήνζα P.toyotomiensis, P.medocina ηαζ P.alcaliphila. 2. Μνλαδηθέο πεγέο άλζξαθα γηα ηελ αλάπηπμε ηνπ βαθηεξηαθνύ ζηειέρνπο P.A1 Έκα ζδιακηζηυ παναηηδνζζηζηυ ηςκ ααηηδνίςκ ημο βέκμοξ Pseudomonas, είκαζ δ ζηακυηδηα ημοξ κα πνδζζιμπμζμφκ πμθθέξ ηαζ δζαθμνεηζηέξ μνβακζηέξ εκχζεζξ ςξ πδβή άκεναηα. Γζα κα πνμζδζμνζζεεί ςξ έκα ααειυ ημ πνμθίθ ημο ααηηδνζαημφ ζηεθέπμοξ P.A1 υζμκ αθυνα ηζξ δζαθμνεηζηέξ πήβεξ άκεναηα πμο ιπμνεί κα πνδζζιμπμζήζεζ, δ πεζναιαηζηή πνμζέββζζδ πμο αημθμοεήεδηε πενζεθάιαακε ηαθθζένβεζα ημο ααηηδνζαημφ ζηεθέπμοξ P.A1 ζε δζάθοια αθάηςκ M9 ιε ηδκ πνμζεήηδ ηάεε θυνα ιίαξ εη ηςκ 40 δζαθμνεηζηχκ μοζζχκ πμο πνδζζιμπμζήεδηακ ςξ ιμκαδζηή πδβή άκεναηα. Σα απμηεθέζιαηα 54

55 πανμοζζάγμκηαζ ζημκ Πίκαηα 2 ηαζ δείπκμοκ υηζ ημ ααηηδνζαηυ ζηέθεπμξ P.A1 πνδζζιμπμζεί βζα ηδκ ακάπηολδ ηδξ, 16 απυ ηζξ 40 δζαθμνεηζηέξ πήβεξ άκεναηα πμο εθέβπεδηακ. Πίκαηαξ 2: Οζ δζαθμνεηζηέξ πήβεξ άκεναηα πμο ιπμνεί κα πνδζζιμπμζήζεζ ημ ααηηδνζαηυ ζηέθεπμξ P.A1. Πεγή Άλζξαθα Απνηέιεζκα Πεγή Άλζξαθα Απνηέιεζκα Αζεακυθδ + Ξοθυγδ - Αδμκζηυθδ - Μαθηυγδ - Αζεοθεκμβθοηυθδ - Ολαθζηυ - Άιοθμ - Πνμθίκδ + Αζεακμθαιίκδ - PNGP - Βεκγυθζμ - Succinate + Βμοηζνζηυ Ολφ - αθζηίκδ - Γθοηίκδ - μοηνυγδ - Γθοηενυθδ + μναζηυθδ - Γθοηυγδ + Succinate + Γθμοηαιζηυ Ολφ + αθζηίκδ - Δζημοθίκδ - μοηνυγδ - Εεθαηίκδ - Σονμζφκδ + Ηζηζδίκδ + Tween 80 + Κζηνζηυ Άθαξ + Tween 60 + Καγεΐκδ - Σμθμοέκζμ - Λαηηυγδ - H 2 s - L-Αναιπζκυγδ - Φαζκυθδ - Μδθζηυ Ολφ + Φαζκδθαθακίκδ + Μακκζηυθδ + Φνμοηηυγδ + Σα απμηεθέζιαηα (Πίκαηαξ 2) έδεζλακ υηζ ημ ααηηδνζαηυ ζηέθεπμξ P.A1 έπεζ ηδκ ζηακυηδηα κα πνδζζιμπμζεί 16 απυ ηζξ 40 δζαθμνεηζηέξ πήβεξ άκεναηα πμο εθέβπεδηακ. 3. Σαπηνπνίεζε ηνπ βαθηεξηαθνύ ζηειέρνπο P.A1 κε ηε ρξήζε ηνπ θηη API 20 NE Σμ API 20NE είκαζ έκα ειπμνζηυ ηζη ημ μπμίμ έπεζ επακεζθδιιέκα πνδζζιμπμζδεεί βζα ηδκ ηαοημπμίδζδ ααηηδνίςκ ημο βέκμοξ Pseudomonas πμο έπμοκ απμιμκςεεί απυ ηθζκζηά ή πενζααθθμκηζηά δείβιαηα. ημκ Πίκαηα 3 θαίκμκηαζ ηα απμηεθέζιαηα ημο API 20NE βζα ημ ααηηδνζαηυ ζηέθεπμξ P.A1, ηαεχξ επίζδξ ηαζ ηα αζμπδιζηά παναηηδνζζηζηά ηςκ ζοββεκζηχκ πνμξ αοηήκ ρεοδμιμκάδςκ (P.medocida, P.alcaligenes, P.alcaliphila ηαζ P.toyotomiensis) (Ugur et al 2012;Hirota et al 2011; Yumoto et al 2001). Γζαπζζηχκεηαζ υηζ ημ ααηηδνζαηυ ζηέθεπμξ P.A1 δζαθένεζ ςξ πνμξ ηα αζμπδιζηά ημο παναηηδνζζηζηά απυ ηα ηνία είδδ ιε ηα μπμία πανμοζζάγεζ μιμθμβία ζημ επίπεδμ ημο 16S RNA. Πζμ 55

56 ζοβηεηνζιέκα, πανμοζζάγεζ δζαθμνέξ ζε 6, 2 ηαζ 1 αζμπδιζημφξ εθέβπμοξ ιε P.toyotomiecis, P.alcaliphila ηαζ P.medocida ακηίζημζπα. Πίκαηαξ 3: φβηνζζδ ημο ααηηδνζαημφ ζηεθέπμοξ P.A1 ιε ηνία αηυια είδδ Pseudomonas ζε αζμπδιζηυ επίπεδμ ιε ημ ηζη API 20NE Αληηδξάζεηο Έλδπκα P.medocida P.alcaliphila P.toyotomiensis P.A1 Παναβςβή Ηκδυθδξ Εφιςζδ Γθοηυγδξ Γζοδνμθάζδ ηδξ Ανβζκίκδξ Οονεάζδ - - Τδνυθοζδ (α-βθοημζζδάζδ) Δζημοθίκδ Τδνυθοζδ (πνςηεάζδ) Εεθαηίκδ Β-βαθαηημγζδάζδ (Πανα-κζηνμθαζκοθα-D-Γαθαηημπονακμγζδαζδξ) Αθμιμίςζδ Γθοηυγδξ Αθμιμίςζδ Ανααζκυγδξ Αθμιμίςζδ Μακκυγδξ Αθμιμίςζδ Μακκζηυθθδξ Αθμιμίςζδ Ν-Αηεηοθμ- - - Γθοημγαιίκδξ Αθμιμίςζδ Μαθηυγδξ Αθμιμίςζδ Γθοημκζημφ Καθίμο + + Αθμιμίςζδ Καπνζημφ Ολέςξ + + Αθμιμίςζδ Αδζπζημφ Ολέςξ - - Αθμιμίςζδ Μδθζημφ + + Αθμιμίςζδ trisodium CITrate + + Αθμιμίςζδ Φαζκοθμμλζημφ μλέςξ - - Απυ ημκ παναπάκς Πίκαηα θαίκεηαζ υηζ ημ ααηηδνζαηυ ζηέθεπμξ P.A1 δζαθένεζ ςξ πνμξ ηα αζμπδιζηά παναηηδνζζηζηά ημο απυ ηα ηνία είδδ ιε ηα μπμία πανμοζζάγεζ μιμθμβία ζημ επίπεδμ ημο 16S rrna. Πζμ ζοβηεηνζιέκα ημ ααηηδνζαηυ ζηέθεπμξ P.A1 διαφέρει από την P.toyotomiesis ως προς 6 αζμπδιζημφξ εθέβπμοξ, ιε ηδκ P.alcaliphila ζε δφμ αζμπδιζημφξ εθέβπμοξ ηαζ ιε ηδκ P.medocida πανμοζζάγεζ δζαθμνά ζε έκα ιυκμ αζμπδιζηυ έθεβπμ. οκμθζηά, ηα παναπάκς δεδμιέκα δείπκμοκ υηζ ημ ααηηδνζαηυ ζηέθεπμξ P.A1 δζαθένεζ απυ ηα ζοββεκζηά πνμξ αοηυ είδδ ςξ πνμξ ηα αηυθμοεα: (α) εφνμξ εενιμηναζίαξ ακάπηολδξ, (α) ημ εφνμξ ph ζημ μπμίμ ακαπηφζζεηαζ ηαζ (β) ζε αζμπδιζηά παναηηδνζζηζηά 56

57 ΦΤΛΛΟΓΔΝΔΣΗΚΖ ΚΑΣΑΣΑΞΖ ΣΟΤ ΒΑΚΣΖΡΗΑΚΟΤ ΣΔΛΔΥΟΤ P.A1 ΜΔ ΣΖ ΥΡΖΖ ΣΧΝ ΓΟΝΗΓΗΧΝ gyrb, ropb ΚΑΗ ropd Σα βμκίδζα gyrb, ropb ηαζ ropd ημο ααηηδνζαημφ ζηεθέπμοξ P.A1 εκζζπφεδηακ ιε PCR ηαζ ζηδ ζοκέπεζα ηα πνμσυκηα ηδξ PCR αθθδθμοπήεδηακ ιε ηδ πνήζδ ημο ακμδζημφ υζμ ηαζ ημο ηαεμδζημφ εηηζκδηή. Σα απμηεθέζιαηα ηδξ αθθδθμφπζζδξ ηςκ βμκζδίςκ αοηχκ ήηακ ζε ιμνθή πνςιαημβναθδιάηςκ (Δζη.3), ηα μπμία ακαθφεδηακ ζηδ ζοκέπεζα ιε ημ πνυβναιια Bioedit. Δζηυκα 2: Ακάθοζδ πνςιαημβναθήιαημξ ιε ηδ πνήζδ ημο πνμβνάιιαημξ Bioedit. Γνλίδην gyrb: Ζ αθθδθμοπία ημο βμκζδίμο gyrb πμο απμιμκχεδηε απυ ημ ααηηδνζαηυ ζηέθεπμξ P.A1 ακηζζημζπεί ζηδ εέζδ 1 έςξ ηαζ ηδ εέζδ 900 ημο βμκζδίμο. οκμθζηά δ αθθδθμοπία πμο πνμέηορε ιεηά ηδκ ακάθοζδ ιε ημ πνυβναιια Bioedit ήηακ δ αηυθμοεδ: >P.A1 gyrb TGCCGGGCAGGCCGGCGATGTCCAGCGCACCTTTACGGCGAGTCATCTCACGCGCTTTACGGGCTGCTTCGCGGGCACGC GCGGCATCGATCATCTTGCCGACCACGGCTTTGGCTTCGTTGGGGTTTTCCAGCAGGAAGTCGGAGAAGTACTTGCCCATC TCCTGTTCGACCGCAGTTTTTACCTCGCTCGATACCAGTTTGTCCTTGGTCTGCGAGCTGAATTTCGGGTCCGGCACCTTGA CCGAGATGATAGCAGTCAGACCTTCGCGGGCATCGTCACCGGTGGTGGAAACCTTGAACTTCTTGGCCAGGCCTTCGGCCT CGATGTAGTTGTTCAGGTGGCGGGTGAGGGCGGAACGGAAACCGGCCAGGTGCGTGCCACCGTCACGCTGCGGAATGTTG TTGGTGAAGCAAAGCAGGTTCTCGTTGAAGCTGTCGTTCCACTGCAGGGCAACTTCGACACCAACGCCGTCTTCTTCGCGC TGAACGTTGAAGTGGAACACCTGGTTGACCACGGTTTTGTTGGTGTTCAGGTACTCGACGAAGGCCTTCAGACCACCTTCG TACTTGAACAACTCTTCCTTGCCGGTGCGCTCGTCGCGCAGCAGGATGCCCACGCCGGAGTTGAGGAAGGACAGTTCGCG CAGACGCTTGGCCAGGATGTCCCAGCTGAAATGGATGTTGGCGAAGGTCTCTTCGGACGGTTTGAAGTGGATCTGCGTAC CGGTACCGTCGGTGTCACCGACAGCGGCCAGAGGCGCTTGCGGTACACCATGCACGTAGGTCTGTTCCCAGATTTTGCCGC TACGGCGGATGGTCAGCACCAGCTCCTTGGAGAGGGCGTTCACCACCGAGACACCCACGCCATGCAGGCCGCCGGATACC TTGTAGCTGTTGT ηδ ζοκέπεζα δ αθθδθμοπία αοηή ζοβηνίεδηε ιε ηδ αμήεεζα ημο αθβμνίειμο Blast ιε υθεξ ηζξ ηαηαηεεεζιέκεξ αημθμοείεξ, βζα κα πνμζδζμνζζεεί ημ πμζμζηυ μιμθμβίαξ ημο βμκζδίμο gyrb πμο απμιμκχεδηε απυ ημ ααηηδνζαηυ ζηέθεπμξ P.A1 ιε ημ ακηίζημζπμ βμκίδζμ απυ υθεξ ηζξ ηαηαηεεεζιέκεξ αθθδθμοπίεξ. Οζ 30 αθθδθμοπίεξ πμο ειθακίγμοκ ηδ ιεβαθφηενδ μιμθμβία θαίκμκηαζ ζημκ Πίκαηα 4. 57

58 Πίκαηαξ 4: Σα απμηεθέζιαηα απυ ηδ ζφβηνζζδ ημο βμκζδίμο gyrb ημο ααηηδνζαημφ ζηέθεπμξ P.A1 ιε ηδ αμήεεζα ημο αθβμνίειμο Blast n. Οξγαληζκόο Max Total Query E- Ident Accession score score cover value Pseudomonas toyotomiensis gyrb % % AB Pseudomonas alcaliphila gyrbl cds % % AB Pseudomonas alcaliphila gyrb % % FN Pseudomonas indoloxydans gyrb % % AB Pseudomonas oleovorans. lubricantis % % EF Pseudomonas pseudoalcaligenes gyrb % % AB Pseudomonas mendocina NK-01, % % CP Pseudomonas pseudoalcaligenes gyrb % % AB Pseudomonas oleovorans gyrb % % AB Pseudomonas mendocina gyrb % % AJ Pseudomonas pseudoalcaligenes % % DQ Pseudomonas alcaligenes gyrb % % AB Pseudomonas mendocina ymp, % % CP Pseudomonas fulva 12-X, % % CP Pseudomonas pseudoalcaligenes % % DQ Pseudomonas guangdongensis SgZ % % JX Pseudomonas aeruginosa IFO % % AB Pseudomonas aeruginosa PA1R, % % CP Pseudomonas aeruginosa PA1, % % CP Pseudomonas aeruginosa PAO1-VE % % CP Pseudomonas aeruginosa PAO1-VE % % CP Pseudomonas aeruginosa PAO % % CP Pseudomonas aeruginosa c7447m % % CP Pseudomonas aeruginosa M18, % % CP Pseudomonas aeruginosa py11t % % GU Pseudomonas aeruginosa PAO1, % % AE Pseudomonas aeruginosa gyrb MT % % AB Pseudomonas aeruginosa IFO % % AB Pseudomonas aeruginosa RP73, % % CP Pseudomonas aeruginosa B136-33, % % CP Απυ παναπάκς θαίκεηαζ υηζ ημ βμκίδζμ gyrb ημο ααηηδνζαημφ ζηεθέπμοξ P.A1 ειθακίγεζ ημ ιεβαθφηενμ πμζμζηυ μιμθμβίαξ ιε ημοξ μνβακζζιμφξ P.toyotomiensis ηαζ P.alcaliphila ιε πμζμζηά μιμθμβίαξ 95% ηαζ 94% ακηίζημζπα. Σμ θοθμβεκεηζηυ δέκηνμ πμο πνμέηορε απυ ηδ ζφβηνζζδ ημο βμκζδίμο gyrb ιε 27 αηυια ααηηήνζα ημο βέκμοξ Pseudomonas πανμοζζάγμκηαζ ζηδκ Δζηυκα 3: 58

59 100 Pseudomonas linyingensis CGMCC (KF ) 99 Pseudomonas sagittaria CC-OPY-1 (JQ ) 81 Pseudomonas guangdongensis SgZ-6 (JX ) 29 Pseudomonas tuomuerensis JCM14085 (AB ) Pseudomonas alcaligenes IFO14159 (AB ) Pseudomonas aeruginosa IFO3080 (AB ) Pseudomonas stutzeri (FJ ) Pseudomonas nitroreducens IAM1439T (AB ) 97 Pseudomonas indica MTCC3713 (AB ) Pseudomonas mendocina ATCC25411 (AJ ) 46 Pseudomonas toyotomiensis (AB ) Pseudomonas A1 Pseudomonas alcaliphila (AB494446) 60 Pseudomonas oleovorans subsp.lubricantis RS1 (EF ) Pseudomonas indoloxydans (AB ) Pseudomonas pseudoalcaligenes IAM12410 (AB ) 100 Pseudomonas fulva IAM1587 (AB ) Pseudomonas straminea (AB ) 43 Pseudomonas anguilliseptica FPC48 (AB ) 70 Pseudomonas seleniipraecipitans LMG25475 (HE ) Pseudomonas cuatrocienegasensis LMG24676 (GU ) Pseudomonas putida (KC ) Pseudomonas monteilii (HE ) Pseudomonas chlororaphis BS1393 (FJ ) Pseudomonas marginalis (FJ ) Pseudomonas koreensis16610 (AM ) 54 Pseudomonas fluorescens LRB3W1 (AB ) 50 Pseudomonas corrugata 3056 (AB ) 0.02 Δζηυκα 3: Φοθμβεκεηζηή ηαηάηαλδ ημο ααηηδνζαημφ ζηεθέπμοξ P.A1 ιε αάζδ ηδκ αθθδθμοπία ημο βμκζδίμο gyrb. φιθςκα ιε ηδ θοθμβεκεηζηή ακάθοζδ πμο πναβιαημπμζήεδηε ιε ηδ αάζδ ηδκ αθθδθμοπία ημο βμκζδίμο gyrb ημ ααηηδνζαηυ ζηέθεπμξ P.A1 ηαηαηάζζεηαζ ζημκ ίδζμ ηθάδμ ιε ημ ααηηήνζμ P.toyotomiensis ηαζ ημ αιέζςξ πζμ ζοββεκζηυ ηδξ είδμξ είκαζ ημ ααηηήνζμ P.alcaliphila. 59

60 Γνλίδην ropb: Σμ βμκίδζμ ropb απμιμκχεδηε απυ ημ ααηηδνζαηυ ζηέθεπμξ P.A1 ιε PCR ηαζ έπεζηα έβζκε δ αθθδθμφπζζδ ημο. Σμ ηιήια ημο βμκζδίμο πμο πνυεηορε ιεηά ηδκ αθθδθμφπζζδ είπε ιέβεεμξ 1089 bp ηαζ ακηζζημζπμφζε ζηδκ πενζμπή ημο βμκζδίμο απυ ηδ εέζδ 23 ιέπνζ ηδ εέζδ Ζ αθθδθμοπία DNA πμο πνμέηορε ήηακ δ αηυθμοεδ: >P.A1 ropb GCGAAGGCCTGATGCCGCAAGACCTGATCAACGCCAAGCCGGTTGCGGCGGCGGTGAAGGAGTTCTTCGGTTCCAGCCAG CTCTCGCAGTTCATGGACCAGAACAACCCGCTGTCCGAGATCACCCACAAGCGCCGCGTTTCCGCACTCGGCCCAGGTGG TCTGACCCGTGAGCGTGCAGGCTTCGAAGTCCGCGACGTACACCCGACTCACTATGGTCGCGTGTGCCCGATCGAAACGC CGGAAGGTCCGAACATCGGTCTGATCAACTCGCTGGCGGCCTACGCCCGCACCAACCAGTACGGCTTCCTGGAAAGCCCG TACCGCGTGGTCAAGGAAGGCAAGGTCACCGACGAGATCGTGTTCCTGTCCGCCATCGAAGAGGCCGACCATGTTATCGC CCAGGCGTCTGCGACCCTGAACGACAAGGGTCAGCTGATCGACGAACTGGTAGCCGTACGTCACCTCAACGAATTCACCG TCAAGGCGCCGGAAGACGTGACCCTGATGGACGTGTCGCCGAAGCAGGTCGTTTCCGTCGCTGCCTCGCTGATTCCGTTCC TTGAGCACGACGACGCCAACCGCGCCCTCATGGGTTCGAACATGCAGCGTCAGGCTGTACCGACTGTGCGTGCCGACAAG CCGCTGGTAGGTACCGGTATGGAGCGCAACGTCGCCCGTGACTCCGGCGTCTGCGTCGTGGCCCGTCGTGGCGGGGTGAT CGACTCCGTCGACGCCAGCCGTATCGTGGTTCGTGTCAACGATGACGAAGTCGAAACTGGCGAAGCCGGTGTCGACATCT ACAACCTGACCAAATACACCCGCTCCAACCAGAACACCTGCATCAACCAGCGTCCGCTGGTGAGCAAAGGTGACAAGGTG GCGCGTAGCGACATCATGGCTGACGGCCCGTCCACCGATATGGGTGAACTGGCGCTGGGTCAGAACATGCGCGTGGCGTT CATGCCGTGGAACGGCTTCAACTTCGAAGACTCCATCTGCCTGTCCGAGCGCGTGGTTCAGGAAGACCGCTTCACCACGAT CCACATCCAGGAACTGACCTGCGTGGCGCGTGACACCAAGCTCGGCC ηδ ζοκέπεζα, δ αθθδθμοπία αοηή ζοβηνίεδηε ιε υθεξ ηζξ βκςζηέξ αθθδθμοπίεξ πμο είκαζ ηαηαηεεεζιέκεξ ζηδ αάζδ δεδμιέκςκ Genbank ιε ηδ αμήεεζα ημο αθβμνίειμο Blast n. Σα απμηεθέζιαηα ιε ηζξ 30 πζμ ημκηζκέξ αθθδθμοπίεξ ιε αάζδ ημ Blast n θαίκμκηαζ ζημκ Πίκαηα 4. Με αάζδ ηδκ αθθδθμοπία ημο βμκζδίμο ropb ημ ααηηδνζαηυ ζηέθεπμξ P.A1 πανμοζζάγεζ ημ ιεβαθφηενμ πμζμζηυ μιμθμβίαξ ιε ηδκ P.alcaliphila ηαζ μζ αιέζςξ πζμ ημκηζκέξ αθθδθμοπίεξ ακήημοκ ζημοξ μνβακζζιμφξ, P.toyotomiensis, P.pseudoalcaligenes ηαζ P.mendocina. 60

61 Πίκαηαξ 4: φβηνζζδ ημο βμκζδίμο ropb ημο ααηηδνζαημφ ζηεθέπμοξ P.A1 ιε υθα ηα ηαηαηεεεζιέκα βμκίδζα ιε ηδ αμήεεζα ημο αθβμνίειμο Blast n. Οργανισμός Max Total Query E Ident Accession score score cover value Pseudomonas alcaliphila CIP T % % AJ Pseudomonas toyotomiensis % % AB Pseudomonas pseudoalcaligenes LMG % % AJ Pseudomonas mendocina ymp % % CP Pseudomonas indoloxydans % % AB Pseudomonas pseudoalcaligenes LMG % % AJ Pseudomonas pseudoalcaligenes LMG 1225T % % AJ Pseudomonas mendocina strain ATCC % % KF Pseudomonas mendocina NK % % CP Pseudomonas pseudoalcaligenes LMG % % AJ Pseudomonas mendocina LMG 1223T % % AJ Pseudomonas mendocina LMG % % AJ Pseudomonas fulva 12-X % % CP Pseudomonas alcaligenes LMG % % AJ Pseudomonas alcaligenes DCB015 RNA % % FJ Pseudomonas sp. CC-G9A % % JQ Pseudomonas oleovorans LMG 2229T % % AJ Pseudomonas nitroreducens MHP % % FN Pseudomonas denitrificans ATCC 13867, % % CP Pseudomonas flavescens CIP T % % AJ Pseudomonas flavescens CIP % % AJ Pseudomonas nitroreducens CCUG 12538T % % FN Pseudomonas putida W % % CP Pseudomonas corrugata TEIC % % JX Pseudomonas resinovorans NBRC % % AP Pseudomonas corrugata strain TEIC % % JX Pseudomonas fuscovaginae strain ICMP % % FJ Pseudomonas corrugata partial LMG % % HE Pseudomonas citronellolis CCUG 17933T % % FN Pseudomonas corrugata LMG % % AJ ηδ ζοκέπεζα έβζκε θοθμβεκεηζηή ακάθοζδ ηδξ αθθδθμοπίαξ ημο βμκζδίμο ropb ζοβηνζηζηά ιε άθθεξ 26 αθθδθμοπίεξ ααηηδνίςκ ημο βέκμοξ Pseudomonas. Σμ θοθμβεκεηζηυ δέκηνμ πμο πνμέηορε θαίκεηαζ ζηδκ Δζηυκα 4. 61

62 Pseudomonas chlororaphis LMG1245 (AJ ) 94 Pseudomonas jessenii CIP (AJ ) Pseudomonas corrugata TEIC1148 (J X ) Pseudomonas agarici LMG2112 (AJ ) Pseudomonas uscovaginae ICMP11824 (FJ ) Pseudomonas mosselii ATCCBAA-99 (FN ) Pseudomonas parafulva CIP107617(AJ ) 99 Pseudomonas putida U (JN ) Pseudomonas plecoglossicida CIP (AJ717456) Pseudomonas borbori LMG23199 (FN ) Pseudomonas oryzihabitans CIP (AJ717470) Pseudomonas alcaligenes LMG6354 (AJ ) Pseudomonas flavescens CIP (AJ ) Pseudomonas indoloxydans (AB ) Pseudomonas mendocina ymp (CP ) 95 Pseudomonas pseudoalcaligenes LMG5517 (AJ ) Pseudomonas oleovorans LMG2229 (AJ ) Pseudomonas toyotomiensis (AB ) Pseudomonas alcaliphila CIP (AJ ) Pseudomonas A1 100 Pseudomonas nitroreducens MHP41 (FN ) Pseudomonas denitrificansatcc13867 (CP004143) Pseudomonas citronellolis CCUG17933 (FN56827) Pseudomonas aeruginosa LMG1242 (AJ ) PseudomonastuomuerensisJCM14085 (AB ) Pseudomonas stutzeri (AJ ) Pseudomonas xanthomarina CCUG46543 (FN554765) 0.01 Δζηυκα 4: Φοθμβεκεηζηυ δέκηνμ ιε αάζδ ημ βμκίδζμ ropb ημο ααηηδνζαημφ ζηεθέπμοξ P.A1. φιθςκα ιε ηδ θοθμβεκεηζηή ηαηάηαλδ πμο έβζκε ιε ηδ πνήζδ ημο βμκζδίμο ropb ημ ααηηδνζαηυ ζηέθεπμξ P.A1 ηαηαηάζζεηαζ ζημκ ίδζμ ηθάδμ ιε ημ ααηηήνζμ P. alcaliphila ηαζ ημ αιέζςξ πζμ ζοββεκζηυ ημοξ είδμξ είκαζ δ P.toyotomiensis ropd: Σμ βμκίδζμ ropd απμιμκχεδηε ιε PCR απυ ημ ααηηδνζαηυ ζηέθεπμξ P.A1 ηαζ ζηδ ζοκέπεζα αθθδθμοπήεδηε. Σμ ηιήια ημο βμκζδίμο πμο αθθδθμοπήεδηε είπε ιήημξ 62

63 806 bp ηαζ ακηζζημζπεί ζηδ εέζδ 22 ςξ ηδ εέζδ 827 ημο βμκζδίμο. Ζ αθθδθμοπία ημο ήηακ δ αηυθμοεδ: > P.A1 ropd GGAACTGCTGACCCGCGAAGGCGAGATCGAAATCGCCAAACGCATCGAGGAAGGCATCCGCGAAGTCATGAGCGCCATC GCTCACTTCCCCGGCACCGTCGACGGCATCCTCGCCGAGTACACCCGCGTCACCACCGAGGGCGGCCGCCTGGCCGAAGT CCTCAGTGGCTACATCGACCCGGATGACGGCAGCGTGCCTGACGAAGCCGCCGCCCCCGTTCCCGTCAAGGAAGGCGCCG CCGCTGAAGAAAGCGACGACGAAGAAGAAGACGAGAGCGGCGACGACGAGGAAGAAGAAGGCGATGGCGGCCCGGACC CGGAAGAAGCGGCTCGCCGTTTCACTGCCGTGGCCGAGCAGCAGGACAAAGTCCTCAAGGCGCTGAAGAAGCATGGTCG TGGCAGCAAGCAGGCCACCGAAGAGCTGGCCACCCTGGCCGAGCTGTTCATGCCGATCAAGCTGGTGCCCAAGCAGTACG ACGCCCTGGTTACCAAGGTGCGCGACGCCCTCGACCGTCTGCGTGCGCAAGAACGCGCCATCATGCAGCTGTGCGTACGT GATGCGCGCATGCCGCGTGCCGACTTCCTGCGCCTGTTCCCGGGCAACGAAATCGACATGGATTGGGCCGCCGACCTGGC CAAGGGCAAGGCCAAGTACGCCGAAGCCCTGGGCAACCTGCAGGCCGACATTCAGCGCTGCCAGCAGAAGCTGGCCGAT CTGGAAGCCGAGTGCAGCCTGACCCTGGCCGAGATCAAGGACATCAACCGTCGCATGTCCATCGGTGAAGCGAAAGCTCG CCGCGCCAAAA ηδ ζοκέπεζα, δ αθθδθμοπία αοηή ζοβηνίεδηε ιε υθεξ ηζξ βκςζηέξ αθθδθμοπίεξ πμο είκαζ ηαηαηεεεζιέκεξ ζηδ αάζδ δεδμιέκςκ Genbank ιε ηδ αμήεεζα ημο αθβμνίειμο Blast n. Σα απμηεθέζιαηα ιε ηζξ 30 πζμ ημκηζκέξ αθθδθμοπίεξ ιε αάζδ ημ Blast n θαίκμκηαζ ζημκ Πίκαηα 5. Παναηδνείηαζ υηζ ιε αάζδ ηδκ αθθδθμοπία ημο βμκζδίμο ropd ημ ααηηδνζαηυ ζηέθεπμξ P.A1 πανμοζζάγεζ ιεβαθφηενμ πμζμζηυ μιμθμβίαξ ιε ημ είδμξ P.pseudoalcaligenes πμο είκαζ ηδξ ηάλδξ ημο 98% ιε επζηάθορδ αθθδθμοπίαξ 99%, ηαζ ιε ηδκ P.toyotomiensis πμο ειθακίγεζ πμζμζηυ μιμθμβίαξ ηδξ ηάλδξ ημο 98% ηαζ επζηάθορδ αθθδθμοπίαξ 98%. 63

64 Πίκαηαξ 5: φβηνζζδ ημο βμκζδίμο ropd ημο ααηηδνζαημφ ζηέθεπμξ P.A1 ιε υθα ηα ηαηαηεεεζιέκα ζηδ αάζδ δεδμιέκςκ Genbank βμκίδζα ιε ηδ πνήζδ ημο αθβμνίειμο Blast n. Οξγαληζκός Max Total Query E- Iden Accession score score cover value t Pseudomonas pseudoalcaligenes FP1 (rpod) % % DQ Pseudomonas toyotomiensis % % AB Pseudomonas oleovorans subsp. Lubricantis RS % % EF Pseudomonas mendocina ymp, % % CP Pseudomonas mendocina NK-01, % % CP Pseudomonas composti CECT: % % FR Pseudomonas composti CECT: % % FR Pseudomonas mendocina MSSRFD398 RNA % % KF Pseudomonas alcaliphila ATCC BAA % % GQ Pseudomonas oleovorans rpod IFO % % AB Pseudomonas pseudoalcaligenes I AM % % AB Pseudomonas pseudoalcaligenes IFO % % AB Pseudomonas mendocina partial ATCC % % AJ Pseudomonas pseudoalcaligenes FP4 sigma % % DQ Pseudomonas indoloxydans % % AB Pseudomonas alcaliphila rpod LMG 23134T % % FN Pseudomonas indoloxydans JCM 14246T % % HE Pseudomonas mendocina A63/ % % HE Pseudomonas alcaliphila W1AT18 RNA % % JQ Pseudomonas oleovorans A577/ % % HE Pseudomonas alcaliphila T10AT % % JQ Pseudomonas straminea IAM % % AB Pseudomonas fulva IAM % % AB Pseudomonas fulva 12-X, % % CP Pseudomonas benzenivorans DSM 8628T % % HE Pseudomonas argentinensis LMG 22563T % % FN Pseudomonas alcaligenes rpod IFO % % AB Pseudomonas resinovorans NBRC % % AP Pseudomonas flavescens LMG 18387T % % FN Pseudomonas denitrificans ATCC % % CP ηδ ζοκέπεζα έβζκε θοθμβεκεηζηή ακάθοζδ ηδξ αθθδθμοπίαξ ημο βμκζδίμο ropd ζοβηνζηζηά ιε άθθεξ 26 αθθδθμοπίεξ ααηηδνίςκ ημο βέκμοξ Pseudomonas. Σμ θοθμβεκεηζηυ δέκηνμ πμο πνμέηορε θαίκεηαζ ζηδκ Δζηυκα 5. 64

65 41 Pseudomonas pseudoalcaligenes FP1 (DQ ) 64 Pseudomonas toyotomiensis (AB ) 62 Pseudomonas A1 Pseudomonas mendocina ymp (CP ) Pseudomonas alcaliphila ATCCBAA-571 (GQ920788) Pseudomonas oleovorans subsp. lubricantis RS1 (EF ) Pseudomonas indoloxydans (AB ) Pseudomonas borbori LMG23199 (FN ) Pseudomonas argentinensis LMG22563 (FN ) Pseudomonas flavescens LMG18387 (FN ) Pseudomonas alcaligenes IFO14159 (AB ) 75 Pseudomonas tuomuerensis JCM14085 (AB ) Pseudomonas oryzihabitanslmg7040 (FN ) Pseudomonas xanthomarina CCUG46543 (AM ) Pseudomonas chloritidismutans (AJ ) Pseudomonas stutzeri CCUG11256 (AJ ) 100 Pseudomonas asplenii NCPPB1947 (AB ) 100 Pseudomonas fuscovaginae LMG2158 (FN ) Pseudomonas jessenii CIP (FN ) 91 Pseudomonas agarici NCPPB2289 (AB ) 100 Pseudomonas cremoricolorata (FN ) Pseudomonas plecoglossicida CIP (FN554503) Pseudomonas mosselii ATCCBAA-99 (FN ) 94 Pseudomonas putida IFO14164 (D ) Pseudomonas fulva IAM1529 (AB ) Pseudomonas parafulva DSM (FN ) 0.02 Δζηυκα 5: Φοθμβεκεηζηή ηαηάηαλδ ημο ααηηδνζαημφ ζηεθέπμοξ P.A1 ιε αάζδ ηδκ αθθδθμοπία ημο βμκζδίμο ropd. Με αάζδ ημ βμκίδζμ ropd, δ θοθμβεκεηζηή ηαηάηαλδ, έδεζλε υηζ ημ ααηηδνζαηυ ζηέθεπμξ P.A1 ηαηαηάζζεηαζ ζημκ ίδζμ ηθάδμ ιε ηα ααηηήνζα P.toyotomiensis ηαζ 65

66 P.pseudoalcaligenes, εκχ ζημκ αιέζςξ πζμ ημκηζκυ ηθάδμ ανίζημκηαζ ηα ααηηήνζα P.medocina ηαζ P.alcaliphila ΑΝΘΔΚΣΖΚΟΣΖΣΑ ΣΟΤ ΒΑΚΣΖΡΗΑΚΟΤ ΣΔΛΔΥΟΤ P.A1 ΣΑ ΒΑΡΔΑ ΜΔΣΑΛΛΑ Δίκαζ ιέπνζ ζήιενα βκςζηά ανηεηά ααηηήνζα ημο βέκμοξ Pseudomonas ηα μπμία πανμοζζάγμοκ ακεεηηζηυηδηα ζε αανέα ιέηαθθα μνζζιέκα ελ αοηχκ είκαζ ηα είδδ Pseudomonas mendocina (Shukla et al 2007), Pseudomonas corrugata (Viti et al 2006) ηαζ Pseudomonas putida (Poornima et al 2010). Με δεδμιέκμ υηζ ακάιεζα ζε αοηά ηα είδδ είκαζ ηαζ ημ είδμξ Pseudomonas mendocina ημ μπμίμ είκαζ ζοββεκζηυ ημο ααηηδνζαημφ ζηεθέπμοξ P.A1 ηνίεδηε ζηυπζιμ κα δζενεοκδεεί ημ ηαηά πυζμκ έπεζ ηαζ ημ ααηηδνζαηυ ζηέθεπμξ P.A1 ηδκ ζηακυηδηα κα ακαπηφζζεηαζ ζηδκ πανμοζία αανέςκ ιεηάθθςκ. Γζα κα δζαπζζηςεεί εάκ ημ ααηηδνζαηυ ζηέθεπμξ P.A1 έπεζ ακεεηηζηυηδηα ζε αανέα ιέηαθθα (Cr (VI), Pb, Cu, Fe ηαζ Zn) ηαθθζενβήεδηε ζε Nutrient Agar πμο πενζείπε έκα απυ ηα παναπάκς αανέα ιέηαθθα ζε ζοβηέκηνςζδ 300 ιg/ml. Μέηα απυ 24 h επχαζδ δζαπζζηχεδηε υηζ ημ ααηηδνζαηυ ζηέθεπμξ P.A1 ακαπηφζζεηαζ ζηδ πανμοζία ηςκ Cr VI, Pb, Cu ηαζ Fe αθθά δεκ ακαπηφζζεηαζ ζηδ πανμοζία ημο Zn. Δπζπθέςκ είκαζ βκςζηυ πςξ ααηηήνζα ημο βέκμοξ Pseudomonas (π.π. Pseudomonas putida) έπμοκ ηδκ ζηακυηδηα κα ηάκμοκ ακαβςβή ημο Cr(VI) ηαζ κα ημ ιεηαηνέπμοκ ζε θζβυηενμ ημλζηέξ εκχζεζξ υπςξ ημ Cr(III) ηαζ βζα αοηυ ημ θυβμ ελεηάζηδηε δ πζεακή ακαβςβή ημο Cr(VI) απυ ημ ααηηδνζαηυ ζηέθεπμξ P.A1 ιε ηδ ιέεμδμ DPCZ (Zakaria et al 2007; Zakaria et al 2007; Zakaria et al 2007). Σα απμηεθέζιαηα έδεζλακ υηζ ημ ααηηδνζαηυ ζηέθεπμξ P.A1 ακάβεζ ημ Cr(VI) ζε πμζμζηυ 68% ζε ζπέζδ ιε ημ ιάνηονα ζε πνμκζηυ δζάζηδια 72 h. 66

67 ΤΓΚΔΝΣΡΧΣΗΚΑ ΑΠΟΣΔΛΔΜΑΣΑ ΑΠΟ ΒΗΟΥΖΜΗΚΟΤ ΔΛΔΓΥΟΤ ΚΑΗ ΦΤΛΟΓΔΝΔΣΗΚΖ ΑΝΑΛΤΖ Σα ζοβηεκηνςηζηά απμηεθέζιαηα απυ ηδ θοθμβεκεηζηή ακάθοζδ ηςκ αθθδθμοπζχκ ηςκ βμκζδίςκ 16S rrna, gyrb, ropb ηαζ ropd θαίκμκηαζ ζημκ Πίκαηα 6. Πίκαηαξ 6: Πμζμζηυ μιμθμβίαξ ηςκ βμκζδίςκ 16S rrna, gyrb, ropb ηαζ ropd ημο ααηδηνζαημφ ζηεθέπμοξ P.A1 ιε ηα πζμ ζοββεκζηά πνμξ αοηήκ είδδ Pseudomonas Γνθηκαζία P. alcaliphila P.toyotomiensis P.mendocina P.pseudoalcaligenes 16S rrna 99% 99% 99% 99% gyrb 94% 95% 94% 90% ropb 97% 97% 95% 95% ropd 97% 98% 97% 98% Με αάζδ ηδκ αθθδθμοπία ημο 16S rrna ημ ααηηδνζαηυ ζηέθεπμξ P.A1 ειθακίγεζ 99% μιμθμβία ιε ηέζζενα δζαθμνεηζηά ααηηήνζα ηα μπμία είκαζ: P.alcaliphila, P.toyotomiensis, P.mendocina ηαζ P.pseudoalcaligenes. Με αάζδ ηδκ αθθδθμοπία ημο βμκζδίμο gyrb ημ ααηηδνζαηυ ζηέθεπμξ P.A1 ειθακίγεζ ημ ιεβαθφηενμ πμζμζηυ μιμθμβίαξ (95%) ιε ημ ααηηήνζμ P.toyotomiensis. Με αάζδ ημ βμκίδζμ ropb ειθακίγεζ ημ ιεβαθφηενμ πμζμζηυ μιμθμβίαξ ηδξ ηάλδξ ημο 97% ιε δφμ δζαθμνεηζηά ααηηήνζα (P. alcaliphila ηαζ P.toyotomiensis). Καζ ηέθμξ ιε αάζδ ηδκ αθθδθμοπία ημο βμκζδίμο ropd ημ ααηηδνζαηυ ζηέθεπμξ P.A1 ειθακίγεζ ημ ιεβαθφηενμ πμζμζηυ μιμθμβίαξ ιε ημ ααηηήνζμ P.toyotomiensis ηαζ P.pseudoalcaligenes ηαζ είκαζ ηδξ ηάλδξ ημο 98%. Σα αζμπδιζηά παναηηδνζζηζηά ημο ηάεε ααηηδνίμο πμο θαίκμκηαζ ζημκ πίκαηα 7 έπμοκ ζοθθεπεεί, βζα ηδκ P.toyotomiensis απυ ηδ ενβαζία ηςκ Hirota et al, πμο ήηακ μζ πνχημζ πμο πενζέβναρακ ημ ζοβηεηνζιέκμ είδμξ, βζα την Pseudomonas alcaliphila απυ ηδκ ενβαζία ηςκ Yomoto et al, πμο είκαζ δ ενβαζία ζηδκ μπμία πενζβνάθεηαζ βζα πνχηδ θμνά ημ ζοβηεηνζιέκμ είδμξ ηαζ βζα ηα ααηηήνζα P.mendocina ηαζ P.pseudoalcaligenes απυ ημ αζαθίμ Manual of clinical microbiology ημ μπμίμ πενζέπεζ ηα αζμπδιζηά παναηηδνζζηζηά εκυξ ιεβάθμο ιένμοξ ηςκ ιζηνμμνβακζζιχκ ηαζ πνδζζιμπμζείηαζ βζα ηδκ ηαλζκυιδζδ ημοξ. 67

68 Πίκαηαξ 7: Γζαθμνέξ ζημοξ αζμπδιζημφξ εθέβπμοξ πμο πναβιαημπμζήεδηακ ακάιεζα ζημ ααηηδνζαηυ ζηέθεπμξ P. A1 ηαζ ηα ζοββεκζηά πνμξ εηείκμ είδδ Pseudomonas Γνθηκαζία P. alcaliphila 1 P.toyotomiensis 2 P.mendocina 3 P.pseudoalcaligenes 4 P. A1 Δφνμξ 4 o C-40 o C 4 o C-42 o C 42 o C (-) 4 o C-46 o C εενιμηναζζχκ Δφνμξ ph (-) (-) 5-12 Γζάζπαζδ Νζηνζηχκ Παναβςβή Ηκδυθδξ Τδνυθοζδ Δζημοθίκδξ Τδνυθοζδ Εεθαηίκδ Αθμιμίςζδ Γθοηυγδξ Αθμιμίςζδ Ανααζκυγδξ Αθμιμίςζδ Μακκυγδξ Αθμιμίςζδ Μακκζηυθθδξ : (Hirota et al 2011), 2: (Hirota et al 2011), 3,4: (Murray et al 1999) Απυ ηα παναπάκς δεδμιέκα δζαπζζηχκμκηαζ ηα αηυθμοεα: α) ημ ααηηδνζαηυ ζηέθεπμξ P.A1 πανμοζζάγεζ ηζξ πενζζζυηενεξ δζαθμνέξ ιε ηδκ P.toyotomiensis ζοβηνζηζηά ιε ηα ζοββεκζηά πνμξ αοηήκ είδδ Pseudomonas πμο ελεηάζηδηακ, α) ιε ηδκ P.alcaliphila πανμοζζάγεζ δζαθμνά ζε 3 δζαθμνεηζημφξ αζμπδιζημφξ εθέβπμοξ ηαεχξ ηαζ ζημ εφνμξ εενιμηναζζχκ ηαζ ph, ζηα μπμία ακαπηφζζεηαζ, β) ιε ηδκ P.pseudoalcaligenes πανμοζζάγεζ δζαθμνέξ ζε 2 δζαθμνεηζημφξ αζμπδιζημφξ εθέβπμοξ, ζημ εφνμξ εενιμηναζζχκ ηαζ ph ζηα μπμία ακαπηφζζεηαζ ηαζ ηέθμξ δ) ιε ηδκ P.medocina πανμοζζάγεζ δζαθμνά ζε 2 δζαθμνεηζημφξ αζμπδιζημφξ εθέβπμοξ. Σα δεδμιέκα αοηά μδδβμφκ ζημ ζοιπέναζια υηζ ημ ααηηδνζαηυ ζηέθεπμξ P.A1 ακήηεζ ζε έκα κέμ είδμξ ηαζ πνμηείκεηαζ ημ υκμια Pseudomonas hellenica. 68

69 3.2. ΜΖΥΑΝΗΜΟΗ ΠΑΘΟΓΔΝΔΗΑ ΚΑΦΟΤΛΑ Ζ ηάρμοθα είκαζ έκα πμθοζαηπανζηζηήξ θφζδξ πενίαθδια πμο δζαεέημοκ μνζζιέκα ιυκμ ααηηήνζα, ημ μπμίμ πνμζηαηεφεζ ηα ααηηήνζα απυ ηδ λδναζία, αθθά ηονίςξ απυ ηδ δνάζδ ηςκ ιαηνμθάβςκ, εκζζπφμκηαξ έηζζ ηδκ παεμβμκζηυηδηα ημοξ. Γζα κα ελεηαζηεί εάκ ημ ααηηδνζαηυ ζηέθεπμξ P.A1 δζαεέηεζ ηάρμοθα, έβζκε δ ηαηάθθδθδ πνχζδ ηαζ δζαπζζηχεδηε υηζ ημ ααηηδνζαηυ ζηέθεπμξ P.A1 δζαεέηεζ ηάρμοθα, υπςξ θαίκεηαζ ζηδκ Δζηυκα 6 ζε ακηίεεζδ ιε ημ ααηηήνζμ E.coli BL21 ημ μπμίμ πνδζζιμπμζήεδηε ςξ ανκδηζηυξ ιάνηοναξ. Δζηυκα 6: Υνχζδ βζα ηάρμοθα.ημο ααηηδνζαημφ ζηεθέπμοξ P.A1 Δπεζδή ημ ααηηδνζαηυ ζηέθεπμξ P.A1 πανάβεζ ηάρμοθα, δ μπμία πνμςεεί ηδ δζείζδοζδ ημο ααηηδνίμο ζημοξ ζζημφξ ηςκ εδθαζηζηχκ ηαζ ζε ζοκδοαζιυ ιε ηδκ ζηακυηδηα ηδξ κα ακαπηφζζεηαζ ζηδ εενιμηναζία ημο ζχιαημξ (37 μ C) δζενεοκήεδηε δ πζεακυηδηα κα πνμηαθεί ιμθφκζεζξ ζε ηφηηανα δζαθμνεηζηήξ πνμέθεοζδξ 69

70 ΔΠΗΖΜΑΝΖ ΣΟΤ ΒΑΚΣΖΡΗΑΚΟΤ ΣΔΛΔΥΟΤ P.A1 Γζα κα δζενεοκδεεί δ παεμβυκμξ δνάζδ ημο ααηηδνζαημφ ζηεθέπμοξ P.A1 ηυζμ εκάκηζα ζε άθθα ααηηήνζα υζμ ηαζ ζηα εοηανοςηζηά ηφηηανα, ηνίεδηε ζηυπζιδ δ επζζήιακζδ ημο ζοβηεηνζιέκμο ααηηδνίμο ιε ηάπμζα θεμνίγμοζα πνςζηζηή, έηζζ χζηε κα είκαζ δζαηνζηυξ μ εκημπζζιυξ ημο ααηηδνζαημφ ζηεθέπμοξ P.A1, ζηα οπυ ιεθέηδ δείβιαηα. ε ιζα πνχηδ πνμζέββζζδ ημ ααηηδνζαηυ ζηέθεπμξ P.A1 ιεηαζπδιαηίζηδηε ιε πθαζιίδζμ πμο εηθνάγεζ ηδκ πνάζζκδ θεμνίγμοζα πνςηεΐκδ (GFP). Ωζηυζμ, υπςξ παναηδνμφιε ζηδκ Δζηυκα 7, δ έκηαζδ ημο θεμνζζιμφ ήηακ ζε παιδθυ επίπεδμ ηαζ επζπθέμκ δεκ παναηδνήεδηε θεμνζζιυξ ζε ιειμκςιέκα ηφηηανα. Δζηυκα 7: Δζηυκα ιεηαζπδιαηζζιέκςκ ηοηηάνςκ ημο ααηηδνζαημφ ζηεθέπμοξ P.A1 ιε ημ πθαζιίδζμ pgfp. α) εζηυκα απυ μπηζηυ ιζηνμζηυπζμ, α) ημ ίδζμ πεδίμ ιε ηδκ εζηυκα απυ ιζηνμζηυπζμ θεμνζζιμφ. ηδ ζοκέπεζα ελεηάζηδηε εάκ είκαζ εθζηηή δ επζζήιακζδ ημο ααηηδνζαημφ ζηεθέπμοξ P.A1 ιε θθμομνεζηεΐκδ (fluorescein). Υνδζζιμπμζήεδηακ 5 δζαθμνεηζηέξ ζοβηεκηνχζεζξ θθμομνεζηεΐκδξ βζα κα πνμζδζμνζζεεί δ ζοβηέκηνςζδ ηδξ θθμομνεζηεΐκδξ πμο μδδβεί ζηδκ επζζήιακζδ ημο ιεβαθφηενμο δοκαημφ πμζμζημφ ηςκ ηοηηάνςκ ημο ααηηδνζαημφ ζηεθέπμοξ P.A1. Γζαπζζηχεδηε υηζ, επζζήιακζδ ημο ααηηδνζαημφ ζηεθέπμοξ P.A1 ιε 100 ιg/ml θθμομνεζηεΐκδξ μδήβδζε ημ 84% ηςκ ηοηηάνςκ κα ειθακίγμοκ έκημκμ θεμνζζιυ (Δζηυκα 8). 70

71 Δζηυκα 8: Δπζζδιαζιέκα ιε θθμομνεζηεΐκδ ηφηηανα ηδξ P.A1.(α) εζηυκα απυ μπηζηυ ιζηνμζηυπζμ, (α) ημ ίδζμ μπηζηυ πεδίμ ζε ιζηνμζηυπζμ θεμνζζιμφ, (β) ηαοηυπνμκδ απεζηυκζζδ (α) ηαζ (α) ΔΚΚΡΗΣΗΚΟ ΜΖΥΑΝΗΜΟ VI Γζα κα δζαπζζηςεεί εάκ ημ ααηηδνζαηυ ζηέθεπμξ P.A1 δζαεέηεζ ή υπζ ημ εηηνζηζηυ ζφζηδια ηφπμο VI (T6SS), ζπεδζάζηδηακ εηηζκδηέξ βζα ηδκ εκίζποζδ δομ ζοκηδνδιέκςκ βμκζδίςκ, vgrg ηαζ hcp, ημο T6SS. Σα ηιήιαηα ηςκ βμκζδίςκ πμο εκζζπφεδηακ είπακ ιέβεεμξ 1186 bp ηαζ 303 bp βζα ηα βμκίδζα vcrg ηαζ hcp ακηίζημζπα. Όπςξ θαίκεηαζ ζηδκ Δζηυκα 7, ηα δφμ βμκίδζα εκζζπφεδηακ ηαζ είπακ ημ ακαιεκυιεκμ ιέβεεμξ. Γεδμιέκμο υηζ ηα βμκίδζα ημο T6SS ανίζημκηαζ ζε έκα μπενυκζμ, ακίπκεοζδ ηςκ βμκζδίςκ vgrg ηαζ hcp ζημ ααηηδνζαηυ ζηέθεπμξ P.A1 δείπκεζ υηζ ημ ααηηήνζμ έπεζ ημ εηηνζηζηυ ζφζηδια ηφπμο VI. Δζηυκα 7: Ζθεηηνμθυνδζδ ζε πδηηή αβανυγδξ ηςκ πνμσυκηςκ PCR πμο πνμέηορακ απυ ηδκ εκίζποζδ ηςκ βμκζδίςκ vgrg (1) ηαζ hcp (2) ΔΠΗΓΡΑΖ ΣΟΤ ΒΑΚΣΖΡΗΑΚΟΤ ΣΔΛΔΥΟΤ P.A1 ΣΖΝ ΔΠΗΒΗΧΖ ΣΟΤ BACILLUS THURINGIENSIS ε πνυζθαηεξ ιεθέηεξ έπεζ δεζπηεί υηζ μνζζιέκα ηαηά Gram ανκδηζηά ααηηήνζα έπμοκ ηδκ ζηακυηδηα κα ιμθφκμοκ Gram εεηζηά ααηηήνζα ιε ηδ αμήεεζα εκυξ ιδπακζζιμφ πμο απμζαθδκίζηδηε ημ 2006 ηαζ μκμιάζηδηε εηηνζηζηυ ζφζηδια ηφπμο VI. Γζα κα δζαπζζηςεεί εάκ ημ ααηηδνζαηυ ζηέθεπμξ P.A1 έπεζ ή υπζ ηδκ ζηακυηδηα κα επδνεάγεζ ηδ αζςζζιυηδηα Gram εεηζηχκ ααηηδνίςκ, έβζκε επζζήιακζδ ημο ααηηδνζαημφ ζηεθέπμοξ P.A1 ιε θθμομνεζηεΐκδ ηαζ ζηδ ζοκέπεζα έβζκε ζοβηαθθζένβεζα ηςκ ααηηδνίςκ Bacillus thuringiensis ηαζ P.A1 ιε ακαθμβία ηοηηάνςκ 1 πνμξ 1000 ακηίζημζπα. Ζ ακαθμβία αοηή ααζίζηδηε ζηδ δζαθμνά ιεβέεμοξ ηςκ δφμ ηοηηάνςκ. Ζ ζοβηαθθζένβεζα επςάζηδηε βζα 3 71

72 % Πμζμζηυ Μείςζδξ Ανζειυξ ηοηηάνςκ B.thuringiensis (CfU/mL) χνεξ ζε νοειζζηζηυ δζάθοια PBS, ζε ηνεζξ δζαθμνεηζηέξ εενιμηναζίεξ. Καηά ηδ δζάνηεζα ηδξ επχαζδξ ζοθθέπεδηακ δείβιαηα βζα κα παναηδνδεμφκ ζημ ιζηνμζηυπζμ. Δπίδξαζε ηνπ βαθηεξηαθνύ ζηειέρνπο P.A1 ζηελ επηβίσζε ηνπ B.thuringiensis B.thuringiensis B.thuringiensis και P.A h 3h 3h 3h 25 o C 30 o C 37 o C Υνυκμξ Δζηυκα 8: Δπίδναζδ ημο ααηηδνζαημφ ζηεθέπμοξ P.A1 ζηδκ επζαίςζδ ηςκ ηοηηάνςκ ημο B. thuringiensis. Πνζνζηό κείσζεο ηνπ B.thuringiensis o C 30 o C 37 o C Θεξκνθξαζία Δζηυκα 9: Πμζμζηυ ιείςζδξ ημο B.thuringiensis ζηδκ πανμοζία ημο ααηηδνζαημφ ζηεθέπμοξ P.A1. Σα απμηεθέζιαηα πανμοζζάγμκηαζ ζηζξ Δζηυκεξ 8-9 ηαζ δείπκμοκ ηα αηυθμοεα: (α) δ επζαίςζδ ηςκ ηοηηάνςκ ημο B.thuringiensis ιεζχεδηε ζηδκ πανμοζία ημο ααηηδνζαημφ 72

73 ζηεθέπμοξ P.A1 ζηζξ ηνεζξ εενιμηναζίεξ πμο εθέβπεδηακ (Δζη. 8,9). ημοξ 25 μ C παναηδνήεδηε δ ιζηνυηενδ ιείςζδ πμο ήηακ ηδξ ηάλδξ ημο 15% ζε ζπέζδ ιε ημκ ιάνηονα, εκχ ζημοξ 37 μ C παναηδνήεδηε δ ιεβαθφηενδ ιείςζδ πμο ήηακ 38% ζε ζπέζδ ιε ημκ ιάνηονα. ε ακηίεεζδ ιε ημκ B.thuringiensis, μ πθδεοζιυξ ημο ααηηδνζαημφ ζηεθέπμοξ P.A1 δε ιεηααθήεδηε ηαηά ηδ δζάνηεζα ημο πεζνάιαημξ. (α) Καηά ηδκ έκανλδ ηδξ επχαζδξ ημ ααηηδνζαηυ ζηέθεπμξ P.A1 έδεζλε έκημκμ ηαηηζζιυ πνμξ ηα ηφηηανα ημο B.thuringiensis (Δζη.10), ζηδ ζοκέπεζα παναηδνήεδηε έκημκδ πνμζηυθθδζδ ημο ααηηδνζαημφ ζηεθέπμοξ P.A1 ζε ηφηηανα ημο B.thuringiensis (Δζη. 10), εκχ ζημ ηέθμξ ηδξ επχαζδξ παναηδνήεδηακ κεηνά ηφηηανα ημο B.thuringiensis ζηα μπμία είπε πνμζημθθδεεί ημ ααηηδνζαηυ ζηέθεπμξ P.A1 (Δζη. 11) Δζηυκα 10: οβηαθθζένβεζα ημο ααηηδνζαημφ ζηεθέπμοξ P.A1 και B.thuringiensis ιεηά απυ επχαζδ 30 min.. Δζηυκα 11: οβηαθθζένβεζα ημο ααηηδνζαημφ ζηεθέπμοξ P.A1 ηαζ B.thuringiensis ιεηά απυ επχαζδ 1h (α) εζηυκα απυ μπηζηυ ιζηνμζηυπζμ, (α) δ ίδζα εζηυκα απυ ιζηνμζηυπζμ θεμνζζιμφ (ιε πνάζζκμ πνχια αθέπμοιε ηα ηφηηανα ηδξ P.A1, (β) μζ εζηυκεξ α ηαζ α ιαγί (3) 73

74 Ανζειυξ ηφηηάνςκ S.aureus (CfU/mL) Δζηυκα 12: οβηαθθζένβεζα ημο ααηηδνζαημφ ζηεθέπμοξ P.A1 ηαζ B.thuringiensis ιεηά απυ επχαζδ 3 h (α) εζηυκα απυ μπηζηυ ιζηνμζηυπζμ, (α) δ ίδζα εζηυκα απυ ιζηνμζηυπζμ θεμνζζιμφ (ιε πνάζζκμ πνχια αθέπμοιε ηα ηφηηανα ηδξ P.A1, (β) ηαοηυπνμκδ απεζηυκζζδ (α) ηαζ (α) ιαγί ΔΠΗΓΡΑΖ ΣΟΤ ΒΑΚΣΖΡΗΑΚΟΤ ΣΔΛΔΥΟΤ P.A1 ΣΖ ΒΗΧΗΜΟΣΖΣΑ ΣΟΤ STAPHYLOCOCCUS AUREUS ηδ ζοκέπεζα ελεηάζηδηε δ ζηακυηδηα ηδξ P.A1 κα επδνεάγεζ ηδ αζςζζιυηδηα ημο Gram εεηζημφ ααηηδνίμο Staphylococcus aureus. Αημθμοεήεδηε δ ίδζα πεζναιαηζηή πνμζέββζζδ, ιε αοηήκ πμο ακαθένεδηε ζηδκ εκυηδηα ιε ηδ δζαθμνά υηζ δ ακαθμβία ηοηηάνςκ Staphylococcus aureus πνμξ P.A1 ήηακ 1 πνμξ 100 ακηίζημζπα ηαζ ααζίζηδηε ζηδ δζαθμνά ιεβέεμοξ ηςκ δφμ ηοηηάνςκ Δπίδξαζε ηνπ βαθηεξηαθνύ ζηειέρνπο P.A1 ζηελ επηβίσζε ηνπ S.aureus S.aureus S.aureus και P.A Δζηυκα 13: Δπίδναζδ ημο ααηηδνζαημφ ζηεθέπμοξ P.A1 ζηδκ επζαίςζδ ηςκ ηοηηάνςκ ημο S.aureus ζε ηνείξ δζαθμνεηζηέξ εενιμηναζίεξ 0h 3h 3h 3h 25 o C 30 o C 37 o C Υνυκμξ εενιμηναζία 74

75 Ποσοστό μείωσης % Σα απμηεθέζιαηα πανμοζζάγμκηαζ ζηζξ Δζηυκεξ ηαζ δείπκμοκ ηα αηυθμοεα: (α) δ επζαίςζδ ημο S.aureus ιεζχεδηε ζηδκ πανμοζία ημο ααηηδνζαημφ ζηεθέπμοξ P.A1 ζηζξ ηνεζξ εενιμηναζίεξ πμο εθέβπεδηακ (Δζη. 13 ηαζ 14). Ζ ιεβαθφηενδ ιείςζδ ηδξ αζςζζιυηδηαξ ηςκ ηοηηάνςκ ημο S.aureus πναβιαημπμζήεδηε ζημοξ 37 o C ηαζ ήηακ ηδξ ηάλδξ ημο 31%, εκχ ζηζξ παιδθυηενεξ εενιμηναζίεξ 30 o C ηαζ 25 o C δ ιείςζδ ηδξ αζμζζιυηδηαξ ημο S.aureus ήηακ 25% ηαζ 12,5% ακηίζημζπα. (α) Ζ ιζηνμζημπζηή παναηήνδζδ δείβιαημξ έδεζλε υηζ ημ ααηηδνζαηυ ζηέθεπμξ P.A1 πανμοζζάγεζ έκημκμ ηαηηζζιυ πνμξ ηα ηφηηανα ημο S.aureus (Δζηυκα 15). 35 Πνζνζηό κείσζεο ησλ θπηηάξσλ ηνπ S.aureus Θερμοκρασία ( o C) Δζηυκα 14: Πμζμζηυ ιείςζδξ ηδξ επζαίςζδξ ημο S.aureus ζηδκ πανμφζζα ημο ααηηδνζαημφ ζηεθέπμοξ P.A1 Δζηυκα 15: οβηαθθζένβεζα ημο ααηηδνζαημφ ζηεθέπμοξ P.A1 και S.aureus ιεηά απυ επχαζδ 1 h. (α) μπηζηυ ιζηνμζηυπζμ, (α) εζηυκα ημο ίδζμο μπηζημφ πεδίμο ζε ιζηνμζηυπζμ θεμνζζιμφ, (β) ηαοηυπνμκδ απεζηυκζζδ (α) ηαζ (α). 75

76 3.2.5 ΜΟΛΤΝΖ ΔΤΚΑΡΤΧΣΗΚΑΝ ΚΤΣΣΑΡΧΝ ΜΔ ΣΟ ΒΑΚΣΖΡΗΑΚΟ ΣΔΛΔΥΟ P.A1. Γζα κα δζενεοκδεεί εάκ ημ ααηηδνζαηυ ζηέθεπμξ P.A1 έπεζ ηδκ ζηακυηδηα κα πνμζημθθάηαζ ηαζ κα δζεζζδφεζ ζε εοηανοςηζηά ηφηηανα, έβζκε ιυθοκζδ ηοηηάνςκ HuH-7 (ηφηηανα δπαημηανηζκχιαημξ) ιε ημ ααηηδνζαηυ ζηέθεπμξ P.A1 βζα 10 ηαζ 30 min ηαζ ζηδ ζοκέπεζα ιεηνήεδηε μ ανζειυξ ηςκ ααηηδνίςκ πμο πνμζημθθήεδηακ υπςξ ηαζ αοηχκ πμο δζείζδοζακ ζηα ηφηηανα HuH-7. Σα απμηεθέζιαηα πανμοζζάγμκηαζ ζηζξ Δζηυκεξ 16 ηαζ 17, ηαζ δείπκμοκ υηζ ιεβάθμξ ανζειυξ ηοηηάνςκ ημο ααηηδνζαημφ ζηεθέπμοξ P.A1 πνμζημθθάηαζ ηαζ δζεζζδφεζ ζηα ηφηηανα HuH-7 ιε πνυκμ-ελανηχιεκμ ηνυπμ. Ο νοειυξ δζείζδοζδξ είκαζ πενίπμο δφμ ηάλεζξ ιεβέεμοξ ιζηνυηενμξ, ζοβηνζηζηά ιε ημκ νοειυ πνμζηυθθδζδξ. Δζηυκα 16: Κφηηανα HuH-7 ιμθφκεδηακ βζα 10 ηαζ 30 θεπηά ιε ημ ααηηδνζαηυ ζηέθεπμξ P.A1 ηαζ ζηδ ζοκέπεζα ιεηνήεδηακ ηα πνμζημθθδιέκα ηαζ εκδμηοηηανζηά ηφηηανα ημο ααηηδνζαημφ ζηεθέπμοξ P.A1. Δζηυκα 17: Μυθοκζδ ηφηηανςκ HuH-7 ιε επζζδιαζιέκμ ιε θθμομνεζηεΐκδ ημ ααηηδνζαηυ ζηέθεπμξ P.A1 (α) μπηζηυ ιζηνμζηυπζμ, (α) εζηυκα ημο ίδζμο πεδίμο ζε ιζηνμζηυπζμ θεμνζζιμφ ηαζ (β) ηαοηυπνμκδ απεζηυκζζδ ηςκ (α) ηαζ (α). 76

77 Κφηηανα HuH-7 πμο είπακ ιμθοκεεί βζα 10 min ιε ημ ααηηδνζαηυ ζηέθεπμξ P.A1 παναηδνήεδηακ ιε δθεηηνμκζηυ ιζηνμζηυπζμ ζάνςζδξ (SEM). Πένα απυ ημκ ελαζνεηζηά ιεβάθμ ανζειυ ααηηδνίςκ πμο είπακ πνμζημθθδεεί ζηα ηφηηανα HuH-7, ήηακ εκηοπςζζαηή δ ειθάκζζδ μπχκ ζηδκ ηοηηανζηή επζθάκεζα ηςκ ηοηηάνςκ HuH-7 (Δζη. 18). Οζ μπέξ αοηέξ είπακ δζάιεηνμ 1.29 ιm, ηαζ ημ πθάημξ ημο ααηηδνζαημφ ζηεθέπμοξ P.A1 ήηακ ιm βεβμκυξ πμο επζηνέπεζ ηδκ οπυεεζδ υηζ ημ ααηηήνζμ, δζαζπχκηαξ ηδ ιειανάκδ εζζένπεηαζ ζημ ηοηηανυπθαζια. Ζ οπυεεζδ αοηή είκαζ εκδζαθένμοζα, αθθά απαζηεί πεναζηένς δζενεφκδζδ. Δζηυκα 18: Κφηηανα HuH-7 ιμθφκεδηακ βζα 10 min ιε ημ ααηηδνζαηυ ζηέθεπμξ P.A1 ηαζ θςημβναθήεδηακ ιε δθεηηνμκζηυ ιζηνμζηυπζμ ζάνςζδξ (SEM). ηδ ζοκέπεζα, πνδζζιμπμζχκηαξ ηδκ ίδζα πεζναιαηζηή πνμζέββζζδ πμο ακαθένεδηε παναπάκς, εθέβπεδηε εάκ ημ ααηηδνζαηυ ζηέθεπμξ P.A1 έπεζ ηδκ ζηακυηαηα κα ιμθφκεζ ηφηηανα δζαθμνεηζηήξ πνμέθεοζδξ υπςξ μζηεμαθάζηεξ ηαζ NH3Σ3 (ζκμαθάζηεξ πμκηζημφ). Σα απμηεθέζιαηα πανμοζζάγμκηαζ ζηζξ Δζηυκεξ18-20 ηαζ δείπκμοκ υηζ ιεβάθμξ ανζειυξ ηοηηάνςκ ημο ααηηδνζαημφ ζηεθέπμοξ P.A1 πνμζημθθάηαζ ηαζ δζεζζδφεζ ζε ηφηηανα μζηεμαθαζηχκ ηαζ ζκμαθαζηχκ. Ο νοειυξ πνμζηυθθδζδξ ηαζ δζείζδοζδξ ημο ααηηδνζαημφ ζηεθέπμοξ P.A1 ζηα ηφηηανα ηςκ μζηεμαθαζηχκ είκαζ ιεβαθφηενμξ απυ υηζ ζηα ηφηηανα ΝΖ3Σ3. 77

78 Δζηυκα 19: Κφηηανα μζηεμαθαζηχκ ιμθφκεδηακ βζα 10 ηαζ 30 θεπηά ιε ημ ααηηδνζαηυ ζηέθεπμξ P.A1 ηαζ ζηδ ζοκέπεζα ιεηνήεδηακ ηα πνμζημθθδιέκα ηαζ εκδμηοηηανζηά ααηηήνζα. Δζηυκα 20: Κφηηανα 3Σ3 ιμθφκεδηακ βζα 10 ηαζ 30 θεπηά ιε ημ ααηηδνζαηυ ζηέθεπμξ P.A1 ηαζ ζηδ ζοκέπεζα ιεηνήεδηακ ηα πνμζημθθδιέκα ηαζ εκδμηοηηανζηά ηφηηανα ημο ααηηδνίμο. Δζηυκα 21: Κφηηανα NH3Σ3 ιμθφκεδηακ ιε ημ ααηηδνζαηυ ζηέθεπμξ P.A1: (α) εζηυκα ηοηηάνςκ NH3T3 απυ μπηζηυ ιζηνμζηυπζμ, α) ημ ίδζα πεδίμ ζε ιζηνμζηυπζμ θεμνζζιμφ, (β) ηαοηυπνμκδ απεζηυκδζδ (α) ηαζ (α) 78

79 Απυ ηα παναπάκς δεδμιέκα δζαπζζηχεδηε υηζ έκαξ ζδιακηζηά ιεβάθμξ πθδεοζιυξ ημο ζηεθέπμοξ P.A1 πμο ηοιαίκεηαζ απυ 10 3 έςξ 10 6 δζεζζδφεζ εκηυξ 10 min ζημ ηοηηανυπθαζια ηςκ ηοηηάνςκ πμο ελεηάζηδηακ. Δπεζδή δ δζείζδοζδ ηςκ εζζενπμιέκςκ ααηηδνίςκ είκαζ πμθφ ιεβάθδ, εθέβπεδηε μ ηοηηανζηυξ εκημπζζιυξ ημοξ ιε ιζηνμζηυπζμ ζοκεζηζαηήξ ζάνςζδξ ιε θέζγεν. Γζα αοηυκ ημκ θυβμ, έβζκε ιυθοκζδ ηοηηάνςκ NH3T3 ιε ημ ααηηδνζαηυ ζηέθεπμξ P.A1, πμο είπε επζζδιακεεί ιε θθμονεζηεΐκδ ηαζ ζηδ ζοκέπεζα έβζκε πνχζδ ηδξ αηηίκδξ ιε θαθμεζδίκδ. Όπςξ θαίκεηαζ ζηδκ Δζηυκα 22, ημ ααηηδνζαηυ ζηέθεπμξ P.A1 εκημπίγεηαζ ηονίςξ ζημκ πονήκα ηαζ επίζδξ παναηδνείηαζ αζοκέπεζα ηδξ ηοηηανζηήξ ιειανάκδξ. Δζηυκα 22: Ζθεηηνμκζηυ ιζηνμβνάθδια ζοκεζηζαηήξ ζάνςζδξ ιε θέζγεν, ηοηηάνςκ ΝΖ3Σ3 πμο έπμοκ ιμθοκεεί ιε ημ ααηηδνζαηυ ζηέθεπμξ P.A1 βζα 90 min, (α) έκα ηφηηανμ ζκμαθάζηδ ιμθοζιέκμ ιε ημ ααηηδνζαηυ ζηέθεπμξ P.A1, (α) ημ ίδζμ ηφηηανμ ζημ μπμίμ απεζημκίγεηαζ ιυκμκ δ αηηίκδ, (β) ημ ίδζμ ηφηηανμ ζημ μπμίμ απεζημκίγεηαζ ημ ζηέθεπμξ P.A1 ηαζ μ πονήκαξ ημο ηοηηάνμο, (δ) ηφηηανμ πμο δεκ έπεζ ιμθοκεεί ιε ημ ααηηδνζαηυ ζηέθεπμξ P.A1. Κυηηζκμ: ακηζπνμζςπεφεζ ηδκ αηηίκδ. Πνάζζκμ: ακηζπνμζςπεφεζ ημ ααηηδνζαηυ ζηέθεπμξ P.A1 ηαεχξ ηαζ ημκ αοημθεμνζζιυ ημο πονήκα. 79

80 Δζηυκα 23: Κφηηανα ΝΖ3Σ3 πμο ιμθφκεδηακ ιε ημ ααηηδνζαηυ ζηέθεπμξ P.A1, (α) ηφηηανα ΝΖ3Σ3 πμο ιμθφκεδηακ ιε ημ ααηηδνζαηυ ζηέθεπμξ P.A1 ηαζ (α) ηφηηανα NH3Σ3 πμο δεκ έπμοκ ιμθοκεεί (ιάνηοναξ). 80