ΛΙΠΟΩΜΑΣΑ ΜΕ ΕΞEIΔΙΚΕΤΗ ΓΙΑ ΣΑ ΠΕΠΣΙΔΙΑ Αβ ΚΑΙ ΓΙΑ ΣΟΦΕΤΗ ΣΩΝ ΤΠΟΔΟΦΕΩΝ ΣΡΑΥΕΡΡΙΝΗ ΣΟΤ ΑΙΜΑΣΟΕΓΚΕΥΑΛΙΚΟΤ ΥΡΑΓΜΟΤ.

Transcript

1 ΛΙΠΟΩΜΑΣΑ ΜΕ ΕΞEIΔΙΚΕΤΗ ΓΙΑ ΣΑ ΠΕΠΣΙΔΙΑ Αβ ΚΑΙ ΓΙΑ ΣΟΦΕΤΗ ΣΩΝ ΤΠΟΔΟΦΕΩΝ ΣΡΑΥΕΡΡΙΝΗ ΣΟΤ ΑΙΜΑΣΟΕΓΚΕΥΑΛΙΚΟΤ ΥΡΑΓΜΟΤ. Για την απόκτηςη του Μεταπτυχιακού Διπλώματοσ Ειδίκευςησ ςτην κατεύθυνςη «Βιομηχανική Υαρμακευτική και Ανάλυςη Υαρμάκων» Μαρκουτςά Ελένη Βιολόγοσ Πάτρα 2011

2 ΠΑΝΕΠΙΣΗΜΙΟ ΠΑΣΡΩΝ ΦΟΛΗ ΕΠΙΣΗΜΩΝ ΤΓΕΙΑ ΣΜΗΜΑ ΥΑΡΜΑΚΕΤΣΙΚΗ ΕΡΓΑΣΗΡΙΟ ΥΑΡΜΑΚΕΤΣΙΚΗ ΣΕΦΝΟΛΟΓΙΑ ΛΙΠΟΩΜΑΣΑ ΜΕ ΕΞEIΔΙΚΕΤΗ ΓΙΑ ΣΑ ΠΕΠΣΙΔΙΑ Αβ ΚΑΙ ΓΙΑ ΣΟΦΕΤΗ ΣΩΝ ΤΠΟΔΟΦΕΩΝ ΣΡΑΥΕΡΡΙΝΗ ΣΟΤ ΑΙΜΑΣΟΕΓΚΕΥΑΛΙΚΟΤ ΥΡΑΓΜΟΤ. ΕΞΕΣΑΣΙΚΗ ΕΠΙΣΡΟΠΗ Αντιμηςιάρη οφία Καθηγήτρια Τμήματος Φαρμακευτικής Κλεπετςάνησ Παφλοσ Επίκουρος Καθηγητής Τμήματος Φαρμακευτικής ωτηροποφλου Γεωργία Αναπληρώτρια Καθηγήτρια Τμήματος Φαρμακευτικής ii

3 iii

4 ΤΝΣΟΜΟΓΡΑΥΙΕ o ΑΕΦ:Αηκαηνεγθεθαιηθόο Φξαγκόο o BCEC: Brain Capillary Endothelial Cells o BSA: Bovine serum albumin (αιβνπκίλε βόεηνπ νξνύ) o Chol: Cholesterol (Χνιεζηεξόιε) o DLS: Dynamic Laser Scattering (Μεζνδνο δπλακηθήο ζθέδαζεο θσηόο) o DOPE: dioleoylphosphatidylethanolamine (Γηνιεϋιθσζθαηηδπιαηζαλνιακίλε) o DPPG: dipalmitoylphosphatidylglycerol (Γηπαικηηνϋινθσζθαηηδπινγιπθεξόιε) o DRV: dried reconstituted vesicles (Σπκππθλσκέλα-αλαγελλεκέλα θπζηίδηα) o DSC Differential Scanning Calorimetry (Γηαθνξηθή Θεξκηδνκεηξία Σάξσζεο) o DSPC: distearoylphosphatidylcholine (Γηζηεαξνϋινθσζθαηηδπινρνιίλε) o DSPE-PEG-COOH: Distearoyl-N-(3- carboxypropionoylpoly(ethyleneglycol)succinyl) phosphatidylethanolamine; o DTT: dithiothreitol; o EDAC: 1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimide; o FBS: Fetal Bovine Serum (Βόεηνο νξόο) o FITC: fluorescein isothiocyanate (ζεηνθπαληθή θινπνξνζθεῒλε) o hcmec/d: human Celebrαl Microvascular Δndothelial Cell (αλζξώπηλα εγθεθαιηθα ελδνζειηαθά θύηηαξα) o HPTS: 8-Hydroxypyrene-1,3,6-trisulfonic acid o HZPEG- DSPE: Hydrazide-PEG-DSPE. o LUV: large unilamellar vesicles (Μεγάια κνλνζηνηβαδηαθά θπζηίδηα) o MCC-PEG-DSPE: Maleimidomethyl-cyclohereance carboxylateo MLV: multilamellar vesicles (Πνιπζηνηβαδηαθά θπζηίδηα) o MPB-PE: N-(4-(P-maleimidophenyl)butyrl)-phophatidylethanolamine; o MP-PEG-DSPE: Maleimido-phenyl propinate-polyethyleneglycoldistearoylphosphatidylethanolamine; o MTT: (3-(4, 5-dimethylthiazolyl-2)-2, 5-diphenyltetrazolium bromide 3- (4,5-δηκεζπινζεηαδνιπιν-2)-2,5-δηκεζπινηεηξαδνιην βξσκίδην) o NGPE: N-glutaryl-phosphatidylethanolamine; iv

5 o NHS: N-hydroxy succinimide; o PA: phosphatidic acid (Φσζθαηηδηθό νμύ) o PC: phosphatidylcholine(φσζθαηηδπινρνιίλε) o PDP: N-(3-(2-pyridyldithio)propionyl); o PDP-DOPE: N-(3-(2-pyridyldithio)propionyl)dioleoylphosphoethanolamine; o PDP-PE: N-(3-(2 pridyldithio)propinyl)phosphatidylethanolamine; o PEG: polyethylene glycol (Πνιπαηζπιελνγιπθόιε) o PEG-DSPE;MPB-DOPE: N-(4-(P-maleimidophenyl)butyryl)dioleoyl phosphoethanolamine; o RES: Reticuloendothelial system (Γηθηπνελδνζειηαθό ζύζηεκα) o Rhod-PE: 1,2-dioleoyl-SN-glycero-3-phosphoethanolamine-N-(lissamine rhodamine B sulfonyl) o SAT: succinimidyl-s-acetylthioacetate; o SMPB: succinimidyl-4-(p-maleimidophenyl)butyrate; SPDP, N- hydroxysuccinimidyl-3-(2-pyridyldithio) propionate. o SPDP: N-hydroxysuccinimidyl-3-(2-pyridyldithio)propionate. o SPR: Surface Plasmon Resonance o SUV: small unilamellar vesicles (Μηθξά κνλνζηνηβαδηαθά θπζηίδηα) o TBS: Tris buffer saline (ξπζκηζηηθό δηάιπκα Tris κε ξπζκηζκέλε ηνληθή ηζρύ) o TC: Τransition Τemperature (Θεξκνθξαζία κεηάπησζεο) o TEM: Transmission Electron Microscopy (Ηιεθηξνληθό κηθξνζθόπην δηέιεπζεο) o ThT: Thioflavin T (ζεηνθιαβίλε Τ) v

6 ΠΕΡΙΛΗΨΗ Η παξνύζα εξγαζία εζηηάδεη ζηελ παξαζθεπή θαη κειέηε αλνζνιηπνζσκάησλ είηε γηα ζηόρεπζε ησλ ππνδνρέσλ ηξαλζθεξξίλεο ηνπ ΑΔΦ είηε κε εμεηδίθεπζε γηα ηα Αβ πεπηίδηα. Γηα ηελ πξόζδεζε ησλ αληηζσκάησλ ζηελ επηθάλεηα ησλ ιηπνζσκάησλ εθαξκόζακε κηα ηερληθή βαζηζκέλε ζην ζύζηεκα πξόζδεζεο βηνηίλεο/ζηξεπηαβηδίλεο. Έρεη πξόζθαηα πξνηαζεί όηη λαλνζπζηήκαηα πνπ θέξνπλ πνιιόπο πξνζδέηεο ζηελ επηθάλεηα ίζσο είλαη πην θαηάιιεια γηα ζηόρεπζε αζζελεηώλ ή βηνινγηθώλ θξαγκώλ. Σε απηέο ηηο πεξηπηώζεηο πξέπεη λα δηαζθαιηζηεί όηη ε ηθαλόηεηα ζηόρεπζεο ελόο πξνζδέηε δελ ζα επεξεαζηεί από ηελ παξνπζία θαη δεπηεξνπ. Σθνπόο είλαη ε παξαζθεπή ΟΧ-26 (θαηά ηνπ ππνδνρέα ηξαλζθεξξίλεο κνλνθισληθό αληίζσκα) λαλνιηπνζσκάησλ, ε κειέηε δηαθόξσλ παξαγόλησλ θαηά ηελ παξαζθεπή ηνπο θαη νη κειέηεο πξόζιεςεο από κνληέιν ηνπ ΑΔΦ. Ο ζπγθεθξηκέλνο ηύπνο αλνζνιηπνζσκάησλ επηιέρζεθε γηαηί είλαη γλσζηό όηη ζηνρεύνπλ ζε θύηηαξα πνπ ππεξεθθξάδνπλ ηνλ ππνδνρέα ηεο ηξαλζθεξξίλεο (TfR). Πξώηνο ζηόρνο είλαη ε παξαζθεπή αλνζνιηπνζσκάησλ πνπ θέξνπλ πξνζδεδεκέλν ζηελ επηθάλεηα ην κνλνθισληθό αληίζσκα ΟΧ-26 πνπ ζηνρεύεη ζηνλ ππνδνρέα ηεο ηξαλζθεξξίλεο θαη έγηλαλ κειέηεο ηεο πξόζιεςεο ησλ ΟΧ-26 αλνζνιηπνζσκάησλ από ηελ αζαλαηνπνηεκέλε θπηηαξηθή ζεηξά hcmec/d3. Δθηόο από ηηο κειέηεο πξόζιεςεο έγηλαλ θαη κειέηεο θπηηαξηθνύ εληνπηζκνύ ηνπ πεξηερνκέλνπ ησλ ιηπνζσκάησλ κε ζθνπό λα δηαζαθελίζνπκε ην κεραληζκό πξόζιεςεο. Τα απνηειέζκαηα καο έδεημαλ όηη ε πξόζιεςε ησλ αλνζνιηπνζσκάησλ από ηα θύηηαξα hcmec/d3 είλαη αξθεηά πςειή ζε ζύγθξηζε κε ηελ πξόζιεςε αλνζνιηπνζσκάησλ πνπ θέξνπλ IgG αληίζσκα ζηελ επηθάλεηά ηνπο. Δπίζεο, ε δέζκεπζε είλαη δνζνεμαξηώκελε θαη εμαξηάηαη θαη από ηελ πνζόηεηα ηνπ αληηζώκαηνο ζηελ επηθάλεηα ησλ ιηπνζσκάησλ. Οζνλ αθνξά ζηνλ κεραληζκό πξόζιεςεο ηα απνηειέζκαηα δείρλνπλ όηη έρνπκε ιπζνζσκαηηθό εληνπηζκό ηνπ πεξηερνκέλνπ ησλ ιηπνζσκάησλ ζπλεπώο κπνξνύκε λα ηζρπξηζηνύκε όηη ε πξόζιεςε γίλεηαη κέζσ ππνδνρέα θαη αθνινπζεί κεηαθνξά ζηα ιπζνζώκαηα. Γεύηεξνο ζηόρνο είλαη ε παξαζθεπή ιηπνζσκάησλ κε εμεηδίθεπζε γηα ηα Αβ πεπηίδηα. Παξαζθεπάζηεθαλ ιηπνζώκαηα πνπ θέξνπλ θνπξθνπκίλε εγθισβηζκέλε ζηε ιηπηδηθή δηπινζηηβάδα θαη κειεηήζεθε ε ηθαλόηεηα ηνπο λα αλαζηέινπλ ηε ζπζζσκάησζε Αβ1-40 κνλνκεξώλ ή νιηγνκεξώλ ή θαη λα απνζζπζσκαηώλνπλ ηληδηθέο κνξθέο ηνπ Αβ1-42 πεπηηδίνπ. Γηα ηνλ ιόγν απηό εθαξκόζηεθε ην πξσηόθνιιν ζεηνθιαβίλεο Τ, κε ηε ρξήζε ηνπ νπνίνπ κπνξνύκε λα αληρλεύνπκε ηελ ύπαξμε β-δνκώλ. Τα απνηειέζκαηα έδεημαλ όηη ε ιηπνζσκηθή θνπξθνπκίλε έρεη κεγαιύηεξε ηθαλόηεηα αλαζηνιήο ηεο ζπζζσκάησζεο θαη απνζζπζσκάησζεο ησλ δνκώλ ησλ Αβ πεπηηδίσλ ζε ζύγθξηζε κε ηελ ίδηα πνζόηεηα ειεύζεξεο vi

7 θνπξθνπκίλεο. Παξαζθεπάζηεθαλ επίζεο θαη αnti-abeta αλνζνιηπνζώκαηα θαη έγηλαλ κειέηεο πξνζδηνξηζκνύ ηεο ζπγγέλεηαο πξόζδεζεο απηώλ ζε αθηλεηνπνηεκέλα κνλνκεξή Αβ πεπηίδηα θαζώο θαη ζε ηλίδηα κε ηελ ηερληθή SPR. Τα απνηειέζκαηα έδεημαλ όηη ε ζπγγέλεηα πξόζδεζεο ησλ αλνζνιηπνζσκάησλ ζηα Αβ πεπηίδηα θαη ηλίδηα είλαη πςειή θαζώο θαη όηη ε ζηαζεξά δέζκεπζεο ησλ αλνζνιηπνζσκάησλ ζηα Αβ πεπηίδηα εμαξηάηαη από ηελ πνζόηεηα ηνπ αληηζώκαηνο ζηε ιηπνζσκηθή επηθάλεηα. vii

8 ABSTRACT This work focuses on the manufacture and study of immunoliposomes either for targeting of transferrin receptors of blood Brain Barrier or with specialization for Aβ peptides. For the attachment of antibodies in the surface of liposomes applied a technique based on the biotin/streptavidin linkage. It has been recently proposed that perhaps multiligant-decorated nanosystems may be more efficient to target specific diseases or biological barriers.insuch cases,it is important to be sure that the targeting potential of one ligand will not be negatively affected by the presence of the second on the same nanosystem. OX-26 (antitransferrin momoclonal antibody) nanoliposomes werw prepared and after evaluation of several preparative aspects their brain targeting potential was studied on a cellular model of BBB. Manufactured pegylated immunoliposomes coated with the monoclonal antibody OX-26 aimed transferrin receptor and studies of uptake of OX-26 immunoliposomes from cell line hcmec/d 3 were done. Also studies of cell tracking content of immunoliposomes were done in order to clarify the mechanism of intake. Our results showed that the uptake of immunoliposomes from hcmec/d 3 cell line is quite high in comparison with the uptake of immunoliposomes coated with IgG antibody. Moreover the uptake of immunoliposomes is dosedependent and depends on the quantity of antibody in the liposomal surface. With regard to the mechanism of intake, results show that there is lysosomatic localization of the liposomal content so we can say that uptake is achievied through receptor and then followed shipment to lysosomes. In the second part, manufactured liposomes and immunoliposomes with specialization for Ab peptides. In the first case prepared liposomes with curcumin incorporated into the lipid bilayer and the ability to inhibit the linking of Aβ1-40 monomers or oligomers or even to disagreggate fibrillar forms of Aβ1-42 peptide was studied. For this purpose applied the thioflavin T protocol, using which we can prove the existence of β-structures. The results showed that liposomal curcumin is more capable to inhibit the agreggation or to disaggregate structures of Aβ peptides compared with the same amount of free curcumin. In the second case, prepared anti- Abeta immunoliposomes and studies for the determination of the affinity for immobilized Aβ peptides monomers and fibrils were done with the SPR technique. The results showed that the affinity of immunoliposomes for Aβ monomers and fibrils viii

9 is high and that the Ka of immunoliposomes in Aβ peptides depends on the amount of antibodies that is tethered on the liposomal surface. ix

10 Δηζαγσγή Δηζαγσγή ζηα ιηπνζώκαηα Γνκή ιηπνζσκάησλ Φσζθνιηπίδηα Γπλάκεηο ζρεκαηηζκνύ Θεξκνθξαζία κεηάπησζεο Κιίζε αιπζίδαο Γηαρσξηζκόο θάζεο Υνιεζηεξόιε Οπδέηεξα θσζθνιηπίδηα Αξλεηηθά θνξηηζκέλα θσζθνιηπίδηα Τύπνη ιηπνζσκάησλ Πνιπζηηβαδηαθά ιηπνζώκαηα (Multilamellar vesicles, MLV) Μεγάια κνλνζηηβαδηαθά ιηπνζώκαηα (large unilamellar vesicles, LUV) Μηθξά κνλνζηνηβαδηαθά ιηπνζώκαηα (small unilamellar vesicles, SUV) πκβαηηθά ιηπνζώκαηα (Conventional liposomes) Ληπνζώκαηα καθξάο θπθινθνξίαο (Long circulating liposomes, stealth, or sterically stabilized) Αλνζνιηπνζώκαηα (Immunoliposomes) Καηηνληθά ιηπνζώκαηα (Cationic liposomes) Ληπνζώκαηα πνπ επάγνπλ ηε ζύληεμε (Fusogenic liposomes): Ληπνζώκαηα επαίζζεηα ζε ph Μέζνδνη παξαζθεπήο ιηπνζσκάησλ Μεραληθή δηαζπνξά Αθίδα ππεξήρσλ (Probe Sonicator)... 19

11 1.3.3 Δμώζεζε κέζσ θίιηξσλ MLV θαη SUV ιηπνζσκάησλ Υξήζε Μηθξνγαιαθησκαηνπνηεηή Δμώζεζε ζε ζάιακν εθαξκνγήο κεγάιεο πίεζεο Δλεζε ιηπηδίσλ Γεκηνπξγία κηθηώλ κηθθπιίσλ κε απνξξππαληηθά Άιιεο εηδηθέο κέζνδνη παξαζθεπήο ιηπνζσκάησλ Μέζνδνη θαζαξηζκνύ Γηαπίδπζε (dialysis) Φπγνθέληξεζε (centrifugation) Υξσκαηνγξαθία πεθηεζ (gel chromatography) Δλδνθιέβηα ρνξήγεζε Φξήζε ιηπνζσκάησλ σο ζπζηήκαηα ζηόρεπζεο θαξκάθσλ ζε εηδηθνύο ηζηνύο/θύηηαξα Τξόπνη αιιήιεπίδξαζεηο ιηπνζσκάησλ κε θύηηαξα Δλδνκεκβξαληθή κεηαθνξά Απειεπζέξσζε κεζσ επαθήο Πξνζξόθεζε ύληεμε Φαγνθπηηάξσζε/ελδνθπηηάξσζε Τξόπνη πξόζδεζεο αληηζσκάησλ ή άιισλ κνξίσλ ζηελ επηθάλεηα ησλ ιηπνζσκάησλ πνπ πξνάγνπλ ηελ εηδηθή ζηόρεπζε-δθαξκνγέο Οκνηνπνιηθή δέζκεπζε ησλ πξνζδεηώλ ζηελ επηθάλεηα ησλ ιηπνζσκάησλ ύδεπμε ησλ πξνζδεηώλ ζηελ επηθάλεηα κε ρξήζε ζεηναηζεξηθνύ δεζκνύ Πξνζθόιιεζε ησλ πξνζδεησλ ζηα ιηπνζώκαηα κέζσ δηζνπιθηδηθνύ δεζκνύ ηαπξσηή δηαζύλδεζε κεηαμύ θαξβνμπινκάδσλ ζηελ επηθάλεηα ησλ ιηπνζσκάησλ θαη πξσηνηαγώλ ακηλνκάδσλ ησλ πξνζδεηώλ Πξνζθόιιεζε ησλ πξνζδεηώλ ζηα ιηπνζώκαηα κέζσ πδξαδηλνδεζκνύ... 41

12 Πξνζθόιιεζε πνιιαπιώλ βεκάησλ κε ρξήζε ηεο αιιειεπίδξαζεο αβηδίλεο/βηνηίλεο Με νκνηνπνιηθέο κέζνδνη γηα ηελ πξόζδεζε ησλ κνξίσλ/αληηζσκάησλ ζηελ επηθάλεηα ησλ ιηπνζσκάησλ Ακεζε ελζσκάησζε ησλ κνξίσλ-πξνζδεηώλ ζηε ιηπνζσκηθή δηπινζηηβάδα Δηζαγσγή ιηπνπξνζδεδεκέλσλ αληηζσκάησλ ζηε ιηπνζσκηθή κεκβξάλε Πξνζθόιιεζε ησλ ζεξκν-ζπζζσκαησκέλσλ αληηζσκάησλ ζηελ επηθάλεηα ησλ ιηπνζσκάησλ Γέζκεπζε ησλ αληηζσκάησλ κέζσ απηελίσλ Αλνζνιηπνζώκαηα θαη ελεξγή ζηόρεπζε Αληηθαξθηληθά ιηπνζώκαηα Αηκαηνεγθεθαιηθόο θξαγκόο Λεηηνπξγίεο ηνπ αηκαηνεγθεθαιηθνύ θξαγκνύ Αλαηνκία ησλ εγθεθαιηθώλ ηξηρνεηδώλ Σηελέο ζπλδέζεηο Μεηαθνξά νπζηώλ θαηά κεθνο ηνπ ΑΔΦ Παζεηηθή δηάρπζε Πξσηεΐλεο-κεηαθνξείο ηνπ ΑΔΦ Γηαιπηνί κεηαθνξείο Γηαπέξαζε κε δηακεζνιάβεζε ππνδνρέα Σηόρεπζε θαξκάθσλ ζηνλ εγθέθαιν Ληπνζώκαηα θαη ζηόρεπζε ζηνλ εγθέθαιν ΟΦ-26 σο κεηαθνξέαο θαξκαθσλ ζηνλ εγθέθαιν Η θπηηαξηθή ζεηξά hcmec/d Πεπηίδηα Αβ θαη ξνή ζηελ αζζέλεηα Alzheimer Τνμηθόηεηα πεπηηδίσλ Αβ Γνκηθά ραξαθηεξηζηηθά Αβ πεπηηδίσλ Μνλνκεξε Αβ πεπηίδηα... 75

13 4.2.2 Γηκεξή θαη νιηγνκεξε Αβ πεπηίδηα Δγθεθαιηθή απνκάθξπλζε ησλ πεπηηδίσλ Αβ θαηά κήθνο ηνπ αηκαηνεγθεθαιηθνύ θξαγκνύ Μεηαθνξά ησλ πεπηηδίσλ αβ θαηά δηα κεζνπ ηνπ αεθ κέζσ ππνδνρέα Σθνπόο Πεηξακαηηθό Μέξνο Όξγαλα θαη Υιηθά Όξγαλα Υιηθά Τιηθά γηα ηελ Παξαζθεπή ιηπνζσκάησλ θαη αλνζνιηπνζσκάησλ Ληπίδηα θαη θζνξίδνπζεο νπζίεο Αληηζώκαηα πξσηεΐλεο Γηα ηελ βηνηηλπιίσζε ηνπ αληηζώκαηνο Καζαξηζκόο ησλ ιηπνζσκάησλ Γηα ηελ ζπκπύθλσζε ησλ ιηπνζσκηθώλ δεηγκάησλ Απνζπζζσκάησζε Αβ πεπηίδίσλ θαη ΣhT έιεγρνο Ζιεθηξνληθή κηθξνζθνπία ΣΔΜ Elisa Γηα ηελ ιύζε ησλ ιηπνζσκάησλ Ρπζκηζηηθά δηαιύκαηα Αληηδξαζηήξηα Καιιηέξγεηα ηεο θπηηαξηθήο ζεηξάο hcmec/d Πιήξεο ζξεπηηθό κέζν Θξεπηηθό γηα απνζήθεπζε θπηηάξσλ Μέζνδνη Φξσκαηνκεηξηθέο κέζνδνη πξνζδηνξηζκνύ ιηπηδίνπ θαη πξσηεῒλεο Πξνζδηνξηζκόο ιηπηδίνπ-μέζνδνο Stewart... 88

14 2.1.2 Bradford Μεζνδνο πξνζδηνξηζκνύ πξσηετλώλ Παξαζθεπή ιηπνζσκάησλ Παξαζθεπή ζηεξενρεκηθά ζηαζεξνπνηεκέλσλ αλνζνιηπνζσκάησλ Πξνεηνηκαζία ησλ MLVs ιηπνζσκάησλ Σξνπνπνίζε ησλ MLVs ζε SUVs Καζαξηζκόο ηεο κε εγθισβηζκέλεο ρξσζηηθήο Πξνεηνηκαζία ηεο γέιεο Παθεηάξηζκα γέιεο Πξόζδεζε ζηξεπηαβηδίλεο Καζαξηζκόο ειεύζεξεο ζηξεπηαβηδίλεο Βηνηηλπιίσζε αληηζσκαηνο Πξόζδεζε αληηζώκαηνο Πξνζδηνξηζκόο ηνπ κε πξνζδεδεκέλνπ αληηζώκαηνο κε Elisa Παξαζθεπή ιηπνζσκάησλ κε εγθισβηζκέλε θνπξθνπκίλε Φπζηθνρεκηθόο ραξαθηεξηζκόο Μέηξεζε κεγέζνπο θαη Εεηα δπλακηθνύ Ζιεθηξνληθή κηθξνζθνπία δηάδνζεο (ΣΔΜ) Μειέηε ηεο in vitro ζηεζεξόηεηαο ιηνπνζσκάησλ Μειέηεο πξόζιεςεο ησλ ιηπνζσκάησλ από ηελ θπηηαξηθή ζεηξά hcmec/d Kαιιηέξγεηα θαη αλαθαιιηέξγεηα θπηηάξσλ hcmec/d Πξνεηνηκαζία θπηηάξσλ γηα επώαζε κε ιηπνζώκαηα Πεηξάκαηα πξόζιεςεο ιηπνζσκάησλ/αλνζνιηπνζσκάησλ από θύηηαξα Μέζνδνο θπηηαξηθνύ εληνπηζκνύ ηνπ HPTS κε ηε ρξήζε NH4Cl Μειέηε θπηηαξνηνμηθόηεηαο (ΜΣΣ) Απνζπζζσκάησζε ησλ Αβ ηληδίσλ (Age Reversal) Θεηνθιαβίλε-Τ έιεγρνο

15 3. Απνηειέζκαηα Παξαζθεπή, ραξαθηεξηζκόο θαη πξόζιεςε ησλ ΟΦ-26 αλνζνιηπνζσκάησλ από ηελ θπηηαξηθή ζεηξά hcmec/d Παξαζθεπή θαη ραξαθηεξηζκόο ησλ αλνζνιηπνζσκάησλ Δπίδξαζε ηεο πνζόηεηαο ζηξεπηαβηδίλεο πνπ επσάδεηαη κε βηνηηλπιησκέλα ιηπνζώκαηα ζηελ ζπζζσκάησζε ησλ ιηπνζσκηθώλ δεηγκάησλ Δπίδξαζε ηεο πνζόηεηαο πξόζδεζεο ζηξεπηαβηδίλεο/αληηζώκαηνο ζην κέγεζνο θαη ζην δπλακηθό ησλ ιηπνζσκάησλ Mέηξεζε πνζνζηνύ πξνζδεδεκέλνπ ζηα ιηπνζώκαηα αληηζώκαηνο κε Elisa Μέηξεζε κεγέζνπο θαη δ-δπλακηθνύ ησλ αλνζνιηπνζσκάησλ Μνξθνινγηθή εθηίκεζε ηεο πξόζδεζεο ηνπ ΟΥ-26 ζηελ επηθάλεηα ησλ ιηπνζσκάησλ θαη ραξαθηεξηζκόο κεγέζνπο κε ΣΔΜ Μειέηε ηεο πξόζιεςεο ησλ αλνζνιηπνζσκάησλ κε ΟΥ-26 από ηελ θπηηαξηθή ζεηξά hcmec/d Μειέηε επίδξαζεο ηεο θπηηαξηθήο πξόζιεςεο από ηελ ιηπνζσκηθή δόζε Μειέηε ηεο επίδξαζεο ηνπ ρξόλνπ επώαζεο ζηελ θπηηαξηθή πξόζιεςε ησλ αλνζνιηπνζσκάησλ Δπηδξαζε ηεο ππθλόηεηαο ηνπ αληηζώκαηνο ΟΥ-26 πνπ βξίζθεηαη ζπλδεδεκέλν ζηελ επηθάλεηα ζηελ πξόζιεςε ησλ αλνζνιηπνζσκάησλ από ηα θύηηαξα Δθηίκεζε εηδηθόηεηαο πξόζιεςεο ησλ αλνζνιηπνζσκάησλ κε ΟΥ-26 ζηελ θπηηαξηθή ζεηξά hcmec/d Δθηίκεζε ηεο παξνπζίαο θαη δεύηεξνπ αληηζώκαηνο ζηελ πξόζιεςε ησλ αλνζνιηπνζσκάησλ ΟΥ-26 από ηα θύηηαξα Mειέηεο ιπζνζσκηθνύ εληνπηζκνύ κε ηελ ρξήζε ηεο θζνξίδνπζαο νπζίαο HPTS Μειέηε θπηηαξνηνμηθόηεηαο ησλ αλνζνιηπνζσκάησλ Αλαζηνιή ηεο ζπζζσκάησζεο ησλ Αβ 1-40 θαη Αβ 1-42 πεπηηδίσλ παξνπζία ιηπνζσκάησλ κε θνπξθνπκίλε

16 3.2.1 Αλαζηνιή ηεο ζπζζσκάησζεο ησλ Αβ 1-40 πεπηηδίσλ παξνπζία ιηπνζσκάησλ κε θνπξθνπκίλε Μέζνδνο ζεηνθιαβίλεο Σ Μειέηε ηνπ κεγέζνπο ησλ δνκώλ ησλ πεπηηδίσλ Αβ 1-40 κε ηελ ηερληθή DLS Μειέηε απνζζπζσκάησζεο ησλ δνκώλ ησλ Αβ 1-42 πεπηηδίσλ παξνπζία ιηπνζσκάησλ πνπ θέξνπλ θνπξθνπκίλε Μέζνδν ζεηνθιαβίλεο Σ Μειέηε ηνπ κεγέζνπο ησλ δνκώλ ησλ πεπηηδίσλ Αβ 1-42 κε DLS Mειέηε ηεο ζπγγέλεηαο ησλ Anti-abeta αλνζνιηπνζσκάησλ γηα ηα κνλνκεξή θαη ηλίδηα αβ1-42, κε ηελ κέζνδν SPR Σπδήηεζε-Σπκπεξάζκαηα Σπκπεξάζκαηααπό ηα πεηξάκαηα παξαζθεπήο θαη ραξαθηεξηζκνύ ησλ αλνζνιηπνζσκάησλ Σπκπεξάζκαηα από ηηο κειέηεο πξόζιεςεο ησλ αλνζνιηπνζσκάησλ ΟΦ-26 από ηα θύηηαξα hcmec/d Σπκπεξάζκαηα από ηα πεηξάκαηα ζπζζσκάησζεο ησλ Αβ πεπηηδίσλ πξνο ζρεκαηηζκό ηληδίσλ παξνπζία ιηπνζσκάησλ κε θνπξθνπκίλε Σπκπεξάζκαηα από ηηο κειέηεο ζπγγέλεηαο πξόζδζεο ησλ αnti-abeta αλνζνιηπνζσκάησλ ζε Αβ κνλνκεξή θαη ηλίδηα Σπλνπηηθά ζπκπεξάζκαηα Βηβιηνγξαθία

17 ΕΙΣΑΓΩΓΗ 1. ΕΙΑΓΨΓΗ ΣΑ ΛΙΠΟΨΜΑΣΑ 1.1 ΔΟΜΗ ΛΙΠΟΨΜΑΣΨΝ Σα θζπμζχιαηα είκαζ ημθθμεζδή ζςιαηίδζα ζθαζνζημφ ζπήιαημξ ηα μπμία α- πμηεθμφκηαζ απυ ιία ή πενζζζυηενεξ δζπθμζημζαάδεξ θζπζδίςκ, πμο εκαθθάζζμκηαζ ιε οδαηζηά ηιήιαηα. Αοηά ζπδιαηίγμκηαζ αοευνιδηα, υηακ ηα θζπίδζα δζαζπείνμκηαζ ζε οδάηζκμ ιέζμ, δδιζμονβχκηαξ έκα πθδεοζιυ ηοζηζδίςκ ημ ιέβεεμξ ηςκ μπμίςκ ηοιαίκεηαζ απυ ηάλεζξ ηςκ δεηάδςκ κακμιέηνςκ έςξ δεηάδςκ ιζηνμιέηνςκ ζε δζάιεηνμ. Εικόνα 1. Δομι λιποςϊματοσ. Εγκλωβιςμόσ λιποδιαλυτϊν και υδατοδιαλυτϊν ουςιϊν. Σα θζπμζχιαηα ιπμνμφκ κα ηαηαζηεοαζημφκ έηζζ χζηε κα παβζδεφμοκ πμζυηδηεξ ζοζηαηζηχκ είηε ζηδκ οδαηζηή θάζδ είηε ζηδκ ιειανάκδ (εζηυκα 1). Ζ αλία ηςκ θζπμζςιάηςκ ςξ ιμκηέθα ιειανακζηχκ ζοζηδιάηςκ πνμένπεηαζ απυ ημ βεβμκυξ υηζ ηα θζπμζχιαηα ιπμνεί κα παναζηεοαζημφκ απυ ζοζηαηζηά θοζζηήξ πνμέθεοζδξ, έηζζ χζηε δ θζπμζςιζηή ιειανάκδ κα ζπδιαηίγεζ ιζα δμιή δζπθμζημζαάδαξ, δ μπμία ζε ααζζηέξ βναιιέξ είκαζ πακμιμζυηοπδ ιε ημ θζπζδζηυ ηιήια ηςκ θοζζηχκ ηοηηανζηχκ ιειανακχκ (ιμκηέθμ νεοζημφ ιςζασημφ ηαηά Singer ηαζ Nicholson). Ζ μιμζυηδηα ιεηαλφ ηςκ θζπμζςιάηςκ ηαζ ιειανακχκ θοζζηήξ πνμέθεοζδξ αολάκεηαζ ιέζς ηδξ δοκαηυηδηαξ πμο οπάνπεζ βζα εηηεκή πδιζηή ηνμπμπμίδζδ ηδξ θζπμζςιζηήξ ιειανάκδξ ηαζ ιπμνεί κα αλζμπμζδεεί ζε ημιείξ πμο αθμνμφκ ηδ ζηυπεοζδ αζμδναζηζηχκ ε- 1

18 κχζεςκ ή ηδκ ακμζμηνμπμπoίδζδ, in vivo ηαζ in vitro, υπμο δ ζηακυηδηα ηςκ θζπμζςιάηςκ κα ιζιμφκηαζ ηδ ζοιπενζθμνά ηςκ ιειανακχκ θοζζηήξ πνμέθεοζδξ ηαζ κα απμζημδμιμφκηαζ απυ ηζξ ίδζεξ μδμφξ, ηα ηαεζζημφκ έκα πμθφ αζθαθέξ ηαζ απμηεθεζιαηζηυ ζφζηδια βζα ζαηνζηέξ εθανιμβέξ. Δκαθθαηηζηά ηα θζπμζχιαηα ιπμνεί κα απανηίγμκηαζ ελ μθμηθήνμο απυ ζοκεεηζηά ζοζηαηζηά, πμο επζθέβμκηαζ επεζδή θένμοκ αεθηζςιέκεξ πδιζηέξ ζδζυηδηεξ. Δ- πμιέκςξ εηηυξ ηςκ θςζθμθζπζδίςκ, ζηαεενά μπήιαηα ιειανακζηήξ δζπθμζημζαάδαξ ιπμνμφκ κα ζπδιαηζζημφκ απυ έκα εονφ θάζια άθθςκ ηφπςκ θζπζδίςκ, υπςξ βζα πανάδεζβια θζπανά μλέα, δεοηενμηαβείξ αιίκεξ δζπθήξ αθοζίδαξ ή πανάβςβα πμθδζηενυθδξ Τ Ω Ρ Τ Ξ Κ Θ Ο Θ Δ Θ Α Σα ηφνζα δμιζηά ζημζπεία ηςκ αζμθμβζηχκ ιειανακχκ είκαζ ηα θςζθμθζπίδζα. Αοηά έπμοκ ιζα πμθζηή ηεθαθή ηαζ δφμ οδνμβμκακεναηζηέξ αθοζίδεξ. Εικόνα 2. Δομι φωςφολιπιδίου και χαρακτθριςτικζσ ομάδεσ Ζ δμιή ημο πζμ απθμφ θςζθμβθοηενζδίμο απμηεθείηαζ απυ έκα ιυνζμ βθοηενυθδξ ζημ μπμίμ θζπανά μλέα αθηοθζχκμκηαζ ζηζξ εέζεζξ C 1 ηαζ C 2, ηαζ απυ ιία θςζθμνζηή μιάδα εζηενμπμζδιέκδ ζηδ εέζδ C 3 (εζηυκα 2). Σμ ιυνζμ αοηυ ακαθένεηαζ ςξ θςζθαηζδζηυ μλφ (PA). 2

19 Εικόνα 3. Αναπαράςταςθ δομισ φωςφολιπιδίου (Wolfe S.L., Molecular and Cellular Biology, Wadsworth Publishing Company, 1993, p 155.) Τπάνπμοκ δφμ είδδ θςζθμθζπζδίςκ, ηα θςζθμβθοηενίδζα ηαζ ηα ζθζββμθζπίδζα ιε ηα ακηίζημζπα πνμσυκηα οδνυθοζήξ ημοξ. Σμ πζμ ημζκυ πνδζζιμπμζμφιεκμ θςζθμθζπίδζμ βζα ημκ ζπδιαηζζιυ θζπμζςιάηςκ είκαζ δ θςζθαηζδοθμπμθίκδ (θεηζείκδ, PC), δ μπμία δζαεέηεζ δφμ οδνυθμαεξ οδνμβμκακεναηζηέξ αθοζίδεξ εκςιέκεξ, ιέζς ιζαξ βέθοναξ βθοηενυθδξ, ιε ιία οδνυθζθδ μιάδα θςζθμπμθίκδξ πμο απμηεθεί ηαζ ηδκ πμθζηή ηεθαθή ημο θζπζδίμο (εζημκα 3). Σα ιυνζα ηδξ θςζθαηζδοθμπμθίκδξ είκαζ αδζάθοηα ζημ κενυ ηαζ υηακ ανεεμφκ ζε οδαηζηυ ιέζμ, δζαηάζζμκηαζ εοεφβναιια ζε δζπθμζημζαάδεξ ιε ιμνθή επίπεδςκ θφθθςκ χζηε κα ιεζςεμφκ μζ αθθδθεπζδνάζεζξ ιεηαλφ ηδξ θζπανήξ αθοζίδαξ ηςκ οδνμβμκακενάηςκ ηαζ ηδξ οδαηζηήξ θάζδξ. Αοηέξ μζ αθθδθεπζδνάζεζξ απμηθείμκηαζ μθμηθδνςηζηά υηακ μζ ιμκάδεξ ακαδζπθχκμκηαζ ιεηαλφ ημοξ πνμξ ημκ ζπδιαηζζιυ ηθεζζηχκ/ζθναβζζιέκςκ ζςιαηζδίςκ. Σα θςζθμθζπίδζα δζαθένμοκ ζδιακηζηά απυ ηα αθθά αιθίθζθα ιυνζα (απμννοπακηζηά, θοζμθεηζείκδ) ζημ υηζ δ εοκμμφιεκδ δμιή βζα ηα πενζζζυηενα απυ αοηά ζε οδαηζηυ πενζαάθθμκ είκαζ ημ δζιμνζαηυ θεπηυ θφθθμ, πανά ημ ιζηηφθζμ. Ο θυβμξ είκαζ υηζ μζ δομ αθοζίδεξ θζπανχκ μλέςκ δίκμοκ ζηα ιυνζα ηςκ θςζθμθζπζδίςκ έκα ζπήια ηοθζκδνζηυ ηαηαθαιαάκμκηαξ οπένιεηνα ιεβάθμ υβημ ηαζ επμιέκςξ δε πςνμφκ ζημ εζςηενζηυ ημο ιζηηοθίμο αθθά είκαζ ηαηάθθδθα κα ζοζζςιαηχκμκηαζ ζε θζπζδζηέξ δζπθμζημζαάδεξ. Οζ θςζθαηζδοθμπμθίκεξ, βκςζηέξ ηαζ ςξ θεηζείκεξ, είκαζ δοκαηυκ κα ελαπεμφκ απυ θοζζηέξ πδβέξ άθθα ηαζ κα ζοκηεεμφκ πδιζηά. Δλάβμκηαζ εφημθα απυ ηνυημ αοβμφ ηαζ απυ ζυβζα αθθά θζβυηενμ εφημθα απυ ηανδζά ηαζ κςηζαίμ ιοεθυ αμμεζδχκ. Απμηεθχκηαξ ημ ηφνζμ δμιζηυ ζοζηαηζηυ ηςκ ηοηηανζηχκ ιειανακχκ, ζοπκά πνδζζιμπμζμφκηαζ ηαζ ςξ ηα ηφνζα θζπίδζα ηςκ θζπμζςιάηςκ ζε έκα εονφ θάζια εθανιμβχκ ελαζηίαξ ημο παιδθμφ ηυζημοξ, ζοβηνζηζηά ιε άθθα θςζθμθζπίδζα, ημο εεηζημφ ημοξ θμνηίμο ηαζ ηδξ πδιζηήξ ημοξ αδνάκεζαξ. Ζ θςζθαηζδοθμπμθίκδ πμο πνμένπεηαζ 3

20 απυ θοζζηέξ πδβέξ είκαζ ζηδκ πναβιαηζηυηδηα έκα ιίβια ιε αθοζίδεξ δζαθμνεηζημφ ιήημοξ ηαζ δζαθμνεηζηυ ααειυ αημνεζηυηδηαξ. Οζ θοηζηέξ θεηζείκεξ έπμοκ ορδθυ πμζμζηυ αημνεζηυηδηαξ ηςκ αθοζίδςκ εκχ μζ θεηζείκεξ γςζηήξ πνμέθεοζδξ πενζέπμοκ ορδθυ πμζμζηυ πθήνςξ ημνεζιέκςκ αθοζίδςκ. Σα θζπανά μλέα απυ θοζζηέξ πδβέξ έπμοκ ζπεδυκ απμηθεζζηζηά γοβυ ανζειυ ακενάηςκ ζηδκ αθοζίδα ηαεχξ ηαηά ηδ αζμζφκεεζδ δ ζφκεεζδ ηςκ αθοζίδςκ βίκεηαζ ιε ααζζηή ιμκάδα ημοξ δφμ άκεναηεξ ιέζς ημο ιδθμκοθμcoa ηαζ ιε ανπζηυ ιυνζμ έκα αηέηοθμcoa. Αοηή δ δζαδζηαζία ζοκεπίγεηαζ αδζάημπα ιέπνζ ημ ζπδιαηζζιυ ημο (C16:0) παθιζηζημφ μλέμξ, ημ μπμίμ είκαζ ημ θζπανυ μλφ ιε ηδκ ιζηνυηενδ ζε ιήημξ αθοζίδα πμο ανίζηεηαζ ζε θςζθμθζπίδζα εδθαζηζηχκ. ε αοηυ ημ ζηάδζμ δ δζαδζηαζία ηδξ επζιήηοκζδξ ηαζ δδιζμονβίαξ αημνεζηυηδηαξ ιπμνμφκ κα ζοιααίκμοκ πανάθθδθα. Ο πνχημξ δζπθυξ δεζιυξ δδιζμονβείηαζ ζηδ εέζδ 9 δδιζμονβχκηαξ ιζα μζημβέκεζα ιμκμαηυνεζηςκ θζπανχκ μλέςκ, ιε έκα cis δζπθυ δεζιυ ζηζξ εέζεζξ 9,11,13,15. Οζ δζπθμί δεζιμί ηςκ πμθοαηυνεζηςκ θζπανχκ μλέςκ πςνίγμκηαζ απυ ιζα ημοθάπζζημκ ιεεοθεκζηή μιάδα. Ζ δζαιυνθςζδ ηαζ μ ανζειυξ αοηχκ ηςκ δζπθχκ δεζιχκ ηαεχξ ηαζ ημ ιήημξ ηδξ αθοζίδαξ επζδνά ζημ ζδιείμ ηήλδξ ηαζ ζηα παναηηδνζζηζηά νεοζηυηδηαξ ηδξ ιειανάκδξ. Σα πενζζζυηενα θςζθμθζπίδζα θοζζηήξ πνμέθεοζδξ είιαζ «ιίβιαηα» επεζδή ηα θζπανά μλέα πμο ζοκάπημκηαζ ζηζξ εέζεζξ 1 ηαζ 2 ημο ίδζμο ιμνίμο ζοκήεςξ είκαζ δζαθμνεηζηά ιεηαλφ ημοξ. Ζ αθοζίδα ημο θζπανμφ μλέςξ ζηδκ εζςηενζηή εέζδ είκαζ αηυνεζηδ εκχ ηδξ ελςηενζηήξ εέζδξ είκαζ ηεημνεζιέκδ ηαζ ιεβαθφηενμο ιήημοξ υζμ αθμνά ημκ ανζειυ ηςκ αηυιςκ άκεναηα. Γζαθμνεηζηέξ ηθάζεζξ θςζθμθζπζδίςκ παναηηδνίγμκηαζ απυ ημοξ εζηενμπμζδιέκμοξ ζηδ θςζθμνζηή μιάδα ημο θςζθαηζδζημφ μλέμξ οπμηαηαζηάηεξ. Ακηζπνμζςπεοηζηέξ δμιέξ αοηχκ παναηίεεκηαζ ζηδκ εζηυκα 4. Εικόνα 4. Κατθγορίεσ φωςφολιπιδίων. Η δομι τθσ πολικισ κεφαλισ για κάκε φωςφολιπίδιο (χολίνθ, αικανολαμίνθ, ςερίνθ, γλυκερόλθ, ινοςιτόλθ). 4

21 Δ Σ Μ Α Λ Δ Θ Ρ Ρ Υ Ζ Λ Α Θ Ρ Λ Ξ Σ Σα θζπμζχιαηα παναηηδνίγμκηαζ ςξ ζοκενβεζαηέξ δμιέξ πμο ζπδιαηίγμκηαζ ηαζ δζαηδνμφκηαζ θυβς αθθδθμ εκζζπουιεκςκ, ιδ μιμζμπμθζηχκ αθθδθεπζδνάζεςκ. Σα θςζθμθζπίδζα ηαζ ηα βθοημθζπίδζα ςξ αιθίθζθα ιυνζα ζε οδαηζηυ πενζαάθθμκ ζοκαενμίγμκηαζ ημ έκα δίπθα ζημ άθθμ βζα κα εθαπζζημπμζήζμοκ ημκ ανζειυ ηςκ εηηεεεζιέκςκ οδνμβμκακεναηζηχκ αθοζίδςκ. Οζ οδνυθμαεξ αθθδθεπζδνάζεζξ είκαζ δ ηζκδηήνζςξ δφκαιδ ζημκ ζπδιαηζζιυ θζπζδζηχκ ζηζαάδςκ. Αοηή δ ζοκάενμζζδ οδνμβμκακεναηζηχκ αθοζίδςκ εοκμείηαζ επίζδξ ηαζ απυ ηζξ ιεηαλφ ημοξ εθηηζηέξ δοκάιεζξ ηφπμο Van der Waals, ηαεχξ επίζδξ ηαζ απυ ηζξ δθεηηνμζηαηζηέξ δοκάιεζξ ηαζ ημοξ δεζιμφξ οδνμβυκμο ιεηαλφ ηςκ πμθζηχκ ηεθαθχκ ηαζ ηςκ ιμνίςκ κενμφ απυ ημ πενζαάθθμκ. Ζ ζοιπενζθμνά ηςκ θζπζδίςκ ζε οδαηζηυ πενζαάθθμκ οπαβμνεφεηαζ απυ εββεκείξ πανάβμκηεξ υπςξ πμθζηυηδηα θζπζδίμο, ημ ιήημξ ηδξ αθεζθαηζηήξ αθοζίδαξ θζπανμφ μλέμξ, απυ ηδ εέζδ ηαζ ημ ααειυ αημνεζηυηδηαξ ηδξ αθεζθαηζηήξ αθοζίδαξ, απυ ηδ δζαηθάδςζδ αθεζθαηζημφ μλέμξ, απυ ημ ιέβεεμξ ηδ πμθζηυηδηα ηαζ ημ θμνηίμ ηδξ πενζμπήξ ηδξ ηεθαθήξ ηαεχξ επίζδξ ηαζ απυ ελςβεκείξ πανάβμκηεξ υπςξ δ ζοβηέκηνςζδ (lyotropism) ηαζ δ εενιμηναζία (thermotropism). Σα θςζθμθζπίδζα δζαθένμοκ ζδιακηζηά απυ ηα αθθά αιθζπαεή ιυνζα (απμννοπακηζηά, θοζμθεηζείκδ) ζημ υηζ δ εοκμμφιεκδ δμιή βζα ηα πενζζζυηενα απυ αοηά ζε οδαηζηυ πενζαάθθμκ είκαζ ημ δζιμνζαηυ θεπηυ θφθθμ, πανά ημ ιζηηφθζμ. Ο θυβμξ είκαζ υηζ μζ δομ αθοζίδεξ θζπανχκ μλέςκ δίκμοκ ζηα ιυνζα ηςκ θςζθμθζπζδίςκ έκα ζπήια ηοθζκδνζηυ ηαηαθαιαάκμκηαξ οπένιεηνα ιεβάθμ υβημ ηαζ επμιέκςξ δε πςνμφκ ζημ εζςηενζηυ ημο ιζηηοθίμο αθθά είκαζ ηαηάθθδθα κα ζοζζςιαηχκμκηαζ ζε θζπζδζηέξ δζπθμζημζαάδεξ. Οζ οδνυθμαεξ μονέξ έθημκηαζ ιεηαλφ ημοξ, εκχ μζ οδνυθζθεξ ηεθαθέξ ζοκδέμκηαζ ιε ημ οδαηζηυ ιέζμ (οδνυθζθεξ αθθδθεπζδνάζεζξ, οδνυθμαδ επίδναζδ) ελςηενζηά ηαζ εζςηενζηά ηδξ θζπμζςιζηήξ επζθάκεζαξ. Με ημκ ηνυπμ αοηυ ζπδιαηίγμκηαζ δζπθέξ θζπζδζηέξ ζηζαάδεξ μζ μπμίεξ ζθναβίγμοκ ηαζ δδιζμονβμφκ ιζηνά ζςιαηίδζα πανυιμζα ιε ηα ζςιαηζηά ηφηηανα ηαζ ηα μνβακίδζά ημοξ. Οζ δοκάιεζξ πμο ακαπηφζζμκηαζ ζηαεενμπμζχκηαξ ηα θζπμζχιαηα πςνίγμκηαζ ζε αθθδθεπζδνάζεζξ ιεηαλφ ηςκ θζπζδίςκ, υπςξ οδνυθζθεξ αθθδθεπζδνάζεζξ ακάιεζα ζηζξ πμθζηέξ μιάδεξ ηαζ αθθδθεπζδνάζεζξ Van der Waals ακάιεζα ζηζξ οδνμβμκακεναηζηέξ αθοζίδεξ ηαζ ηζξ αθθδθεπζδνάζεζξ ιεηαλφ θζπζδίςκ ηαζ κενμφ (οδνυθζθεξ αθθδθεπζδνάζεζξ, οδνυθμαδ επίδναζδ). Σμ αηναίμ ηιήια ηςκ θζπζδίςκ πμο λεηζκά ιε -NH 3 + είκαζ δ πμθζηή μιάδα (ή πμθζηή ηεθαθή). οκδέεηαζ ιέζς ηδξ βθοηενυθδξ ιε δφμ θζπανέξ αθοζίδεξ. Μζα απυ ηζξ αθοζίδεξ είκαζ εοεεία θζπανή αθοζίδα (ημνεζιέκδ), εκχ δ άθθδ πανμοζζάγεζ ηονηυηδηα θυβς cis δζπθμφ δεζιμφ (ιδ ημνεζιέκδ). Αοηυ επδνεάγεζ ημ παηεηάνζζια ηαζ ηδκ ηίκδζδ ζημ πθεονζηυ επίπεδμ ηδξ ιειανάκδξ Θ Ε Ρ Μ Ο Κ Ρ Α Θ Α Μ Ε Σ Α Π Σ Ω Η ε δζαθμνεηζηέξ εενιμηναζίεξ μζ θζπζδζηέξ ιειανάκεξ πενκμφκ δε δζαθμνεηζηέξ θάζεζξ ηαζ δ ιεηάπηςζδ απυ ηδ ιζα θάζδ ζηδκ άθθδ ιπμνμφκ κα ακζπκεοημφκ ιε 5

22 θοζζηέξ ηεπκζηέξ ηαεχξ δ εενιμηναζία αολάκεηαζ. Ζ πζμ ζηαεενή θάζδ είκαζ αοηή πμο απακηάηαζ ζηδκ ορδθυηενδ εενιμηναζία ηαηά ηδκ μπμία δ ιειανάκδ πενκά απυ ιία ζθζπηά δμιδιέκδ ζηενεή θάζδ ζε ιζα οβνή-ηνοζηαθθζηή θάζδ υπμο δ εθεοεενία ηίκδζδξ ηάεε ιμκάδαξ ημο θζπμζχιαημξ είκαζ ορδθυηενδ (εζηυκα 5) Στερει φάςθ Υγρι- κρυςταλλικι φάςθ Εικόνα 5. φιχτά δομθμζνθ φάςθ και υγρι φάςθ λιπιδικισ μεμβράνθσ. Ζ πζμ βκςζηή ιέεμδμξ πμο πνδζζιμπμζείηαζ βζα ημκ πνμζδζμνζζιυ ηδξ εενιμηναζίαξ ιεηάπηςζδξ (Tc) είκαζ δ δζαθμνζηή εενιζδμιεηνία ζάνςζδξ (DSC) (Huang C. et al., 1999) (εζηυκα 6). Ζ επίδναζδ ημο ιήημοξ ηςκ οδνμβμκακεναηζηχκ αθοζίδςκ ηαζ μ ααειυξ αημνεζηυηδηαξ ηαεχξ ηαζ δ οδνυθζθδ ηεθαθή παίγμοκ ημκ ζδιακηζηυηενμ νυθμ ζηδκ δζαιυνθςζδ ηδξ Tc. Γεκζηά ζζπφεζ υηζ αολάκμκηαξ ημ ιήημξ ηδξ αθοζίδαξ, ή αολάκμκηαξ ημκ ημνεζιυ ηςκ αθοζίδςκ αολάκεηαζ ηαζ δ εενιμηναζία ιεηάπηςζδξ. Μειανάκεξ πμο δμιμφκηαζ απυ θεηζείκδ αοβμφ έπμοκ εενιμηναζία ιεηάπηςζδξ απυ -15⁰C έςξ -7⁰C, ζε ζφβηνζζδ ιε ιειανάκεξ απυ γςζηέξ πδβέξ πμο δ εενιμηναζία ιεηάπηςζδξ ηοιαίκεηαζ απυ 0 έςξ 40⁰C. Εικόνα 6. Θερμιδογράφθμα (DSC) Θερμοκραςία ( o C) 6

23 Eνζργεια Θερμοχω ρθτικότθτα Cp Γζλη Aποςτακεροποιθμζνθ Γζλθ Εact Tm Υγρή Κρυςταλλική Στακεροποιθμζνθ Γζλθ Εact Tm Θερμοκραςία T Εικόνα 7. Θερμοκραςία μετάπτωςθ για PA και PE. Λζπμζχιαηα πμο δμιμφκηαζ απυ θςζθμθζπίδζα ιε ιεβαθφηενεξ ηεθαθέξ έπμοκ παιδθυηενδ εενιμηναζία ιεηάπηςζδξ ηαεχξ είκαζ θζβυηενμ ζηαεενέξ. Γζα πανάδεζβια δ εενιμηναζία ιεηάπηςζδξ βζα ηα PA ηαζ PC έπμοκ εενιμηναζίεξ ιεηάπηςζδξ 67 ηαζ 41 o C ακηίζημζπα (εζηυκα 7). Ζ ενιδκεία ηδξ επίδναζδξ ηδξ εενιμηναζίαξ ιεηάπηςζδξ ζε ζπέζδ ιε ηδκ νεοζηυηδηα ηδξ ιειανάκδξ είκαζ πνήζζιδ βζα ηδκ ηαηαζηεοή ηαζ ηδκ αζμιδπακζηή εηιεηάθθεοζδ ηςκ θζπμζςιάηςκ ηαεχξ δ θάζδ πμο ανίζηεηαζ δ θζπμζςιζηή ιειανάκδ ηαεμνίγεζ παναηηδνζζηζηά υπςξ δ δζαπεναηυηδηα, δ ζηακυηδηα ζφκηδλδξ, ζοζζςιάηςζδξ ηαζ ηδκ δέζιεοζδ πνςηεσκχκ πμο ζοκμθζηά ιπμνμφκ κα επδνεάζμοκ ζδιακηζηά ηδκ ζηαεενυηδηα ηςκ θζπμζςιάηςκ ηαζ ηδκ ζοιπενζθμνά ημοξ ζηα αζμθμβζηά ζοζηήιαηα Ι Κ Θ Ρ Ζ Α Κ Σ Ρ Θ Δ Α Ρ ε δζπθμζημζααδζηέξ ιειανάκεξ ηα ιυνζα ειθακίγμκηαζ εοεοβναιιζζιέκα ιε ηδκ βθοηενυθδ πενίπμο ηάεεηα ζημ επίπεδμ ηδξ ιειανάκδξ ηαζ δ ηεθαθή ημο θζπίδζμο πανάθθδθα ιε ηδκ επζθάκεζα ηδξ ιειανάκδξ (εζηυκα 8). Αοηή δ δζαιυνθςζδ εα έπνεπε κα ιεζχκεζ ηδκ απυζηαζδ ιεηαλφ ηςκ εεηζηχκ ηαζ ανκδηζηχκ θμνηίςκ ζημ θςζθμθζπίδζμ. ηδ θςζθαηζδοθμπμθίκδ ελαζηίαξ ηςκ ηνζχκ ιεεοθμιάδςκ πμο είκαζ δεζιεοιέκεξ ζημ άγςημ, δ ηεθαθή ημο ιμνίμο ζε αοηή ηδ δζαιυνθςζδ είκαζ ανηεηά μβηχδδξ ηαζ ηαηαθαιαάκεζ ιζα πενζμπή ζηδκ ιειανάκδ ηςκ 32 Å 2,δδθαδή ιεβαθφηενδ 7

24 απυ αοηή πμο ηαηαθαιαάκεηαζ απυ 2 ιυνζα ζε εοεφβναιιδ δζάηαλδ αθοζίδαξ (39 Å). Γζα κα λεπεναζηεί αοηυ, μζ οδνμβμκακεναηζηέξ αθοζίδεξ ζηνέθμκηαζ ηαηά ιζα βςκία 58⁰ ζε ζπέζδ ιε ημ επίπεδμ ηδξ ιειανάκδξ, ιε ηέημζμ ηνυπμ έηζζ χζηε κα ηαθφρμοκ ημκ ηεκυ πχνμ πμο δδιζμονβείηαζ απυ ηδκ ηεθαθή ημο ιμνίμο, ηαζ θένκμκηαξ ηζξ α- θοζίδεξ ηςκ βεζημκζηχκ ιμνίςκ ζε πμθφ ημκηζκή απυζηαζδ έηζζ χζηε κα ιεβζζημπμζδεμφκ μζ δοκάιεζξ Van der Waals ηαζ μζ άθθεξ ιδ μιμζμπμθζηέξ αθθδθεπζδνάζεζξ. Υδατικι Φάςθ Επίπεδο τθσ μεμβράνθσ Εςωτερικό λιπιδικισ διπλοςτοιβάδασ Εικόνα 8. Κλίςθ του υδρόφοβου τμιματοσ τθσ φωςφατιδυλοχολίνθσ. Ζ ηθίζδ ηδξ αθοζίδαξ ζε ζοκδοαζιυ ιε ημ βεβμκυξ υηζ μζ δφμ πνχημζ άκεναηεξ ηδξ αθοζίδαξ 2 είκαζ πανάθθδθμζ ζηδκ επζθάκεζα ηδξ ιειανάκδξ ζοκεπάβεηαζ υηζ θεηζείκεξ ιε ίζεξ ηαζ ηζξ δφμ αθοζίδεξ εα ζπδιαηίγμοκ ηεκά ζημ εζςηενζηυ ηδξ δζπθμζηζαάδαξ. ηδκ θφζδ αοηυ ημ πνυαθδια έπεζ θοεεί ιε ημ βεβμκυξ υηζ δ αθοζίδα 2 είκαζ ζοκήεςξ ιαηνφηενδ απυ ηδκ αθοζίδα 1(εζηυκα 9). Διαμόρφωςθ trans Διαμόρφωςθ gauche Εικόνα 9. Μετατόπιςθ τθσ υδρογονανκρακικισ αλυςίδασ του φωςφολιπιδίου. 8

25 Δ Θ Α Υ Ω Π Θ Ρ Λ Ξ Ρ Τ Α ΡΖΡ Καηά ηδκ αφλδζδ ηδξ εενιμηναζίαξ, μζ θζπανέξ αθοζίδεξ ηςκ ημνεζιέκςκ μλέςκ ηείκμοκ κα ημπμεεηδεμφκ ιε δζαθμνεηζηή απυ ηδκ all - trans εοεφβναιιδ δζεοεέηδζδ, π.π. ηδ δζεοεέηδζδ gauche. Αοηυ έπεζ ςξ απμηέθεζια κα επεηηείκεηαζ δ πενζμπή πμο ηαηαθαιαάκμοκ μζ οδνμβμκακεναηζηέξ αθοζίδεξ εκχ ζοβπνυκςξ ιεζχκεηαζ ημ ζοκμθζηυ ιήημξ αοηχκ, μπυηε ιεζχκεηαζ ηαζ ημ πάπμξ ηδξ δζπθμζημζαάδαξ ηαζ εοκμείηαζ δ ιεηάααζδ απυ ηδ ζηενεή ζηδκ οβνή ηνοζηαθθζηή θάζδ. Ζ ιεηάααζδ αοηή βζα ηδ θςζθαηζδοθμπμθίκδ δεκ μθμηθδνχκεηαζ ζε έκα ζηάδζμ, αθθά πενζθαιαάκεζ δφμ ιεηαπηχζεζξ: ηδκ ηφνζα ιεηάπηςζδ πμο πενζβνάθδηε παναπάκς ηαζ ηδκ πνμ - ιεηάπηςζδ, πενίπμο πέκηε ααειμφξ ηάης απυ ηδ εενιμηναζία ηδξ ηφνζαξ ιεηάπηςζδξ, ηαηά ηδκ μπμία ζοιααίκεζ ηαζ αθθαβή ζημκ πνμζακαημθζζιυ ηδξ πμθζηήξ ηεθαθήξ ημο θζπζδίμο. ε εενιμηναζίεξ ιεηαλφ ηςκ δφμ αοηχκ ιεηαπηχζεςκ, δ ιειανάκδ οζμεεηεί ιία πηοπςηή ειθάκζζδ υπμο ιεηαζπδιαηίγεηαζ απυ εοεφβναιιδ ζε ηοιαηζζηή επζθάκεζα ιε μνζζιέκδ πενζμδζηυηδηα (Kohlwein S.D. et al., 1992). Στερει φάςθ Υγρι κρυςταλλικι φάςθ Εικόνα 9. Μετάβαςθ τθσ μεμβράνθσ από τθν ςτερει ςτθν κρυςταλλικι φάςθ Υ Ξ Κ Ζ Ρ Δ Π Ξ Κ Ζ Οζ ζηενυθεξ είκαζ ζδιακηζηά ιυνζα ηςκ πενζζζυηενςκ θοζζηχκ ιειανακχκ, ηαζ δ εκζςιάηςζδ ζηενμθχκ ιέζα ζηζξ δζπθμζηζαάδεξ ηςκ θζπμζςιάηςκ ιπμνμφκ κα επζθένμοκ ζδιακηζηέξ αθθαβέξ ζηζξ ζδζυηδηεξ ηςκ ιειανακχκ. ηα εδθαζηζηά δ ηο- 9

26 νίανπδ ζηενυθδ είκαζ δ πμθδζηενυθδ ιε ιζα ζδιακηζηή πμζυηδηα ηδξ 7-δεοδνμβμκμπμθδζηενυθδξ κα ανίζηεηαζ ζηζξ οπμηοηηανζηέξ ιειανάκεξ. Κάπμζεξ απυ ηζξ ζηενυθεξ ηςκ θοηχκ είκαζ δ ζηζβιαζηενυθδ ηαζ δ ζζημζηενυθδ εκχ δ ενβμζηενυθδ είκαζ εκδμβεκήξ ζηενυθδ ηδξ ιαβζάξ, ηςκ ιοηήηςκ ηαζ ηάπμζςκ πνςηυγςςκ. Κμζκά παναηηδνζζηζηά υθςκ αοηχκ ηςκ ζηενμθχκ είκαζ δ 3α-οδνμλοθζηή μιάδα, έκαξ επίπεδμξ πονήκαξ ζηενεμεζδμφξ ηαζ ιζα αθεζθαηζηή πθεονζηή αθοζίδα (εζηυκα 10). Χοληςτερόλη Πολική Κεφαλή Δομή ςτεροειδοφσ Μη πολική υδρογονανθρακική α- λυςίδα Εικόνα 10. Βαςικι δομι χολθςτερόλθσ Ζ πμθδζηενυθδ δεκ δδιζμονβεί απυ ιυκδ ηδξ δζπθμζηζααδζαηέξ δμιέξ αθθά ιπμνεί κα εκζςιαηςεεί ζε θςζθμθζπζδζηέξ ιειανάκεξ ζε πμθφ ορδθέξ ζοβηεκηνχζεζξ πάκς απυ 1:1 ιμνζαηή ακαθμβία ή αηυια ηαζ 2:1 ιμνζαηή ακαθμβία ιε ημ θςζθμθζπίδζμ. ηζξ θοζζμθμβζηέξ ιειανάκεξ, δ ιμνζαηή ακαθμβία πμζηίθεζ απυ 0,1-1 ακάθμβα ιε ηδκ ακαημιζηή ηαζ ηοηηανζηή ημπμεεζία. Ώκηαξ αιθίθζθμ ιυνζμ, δ πμθδζηενυθδ εζζένπεηαζ ζηζξ ιειανάκεξ ιε ημ οδνμλφθζμ κα πνμζακαημθίγεηαζ πνμξ ηδκ οδαηζηή θάζδ, ηαζ δ αθεζθαηζηή αθοζίδα εοεοβναιιίγεηαζ πανάθθδθα ιε ηζξ αθοζίδεξ ημο θζπζδίμο ζημ ηέκηνμ ηδξ δζπθμζηζαάδαξ (εζηυκα 11). 10

27 Πολικι κεφαλι φωςφολιπιδίου Πολικι υδροξυλομάδα Χολθςτερόλθ Αλυςίδα λιπαροφ οξζοσ Εικόνα 11. Θζςθ χολθςτερόλθσ ςτθ λιπιδικι διπλοςτιβάδα.cooper JM.,The cell A molecular approachasm Press,1997. Ζ 3α-οδνμλοθμιάδα είκαζ ημπμεεηδιέκδ ιε ηα ηαναμλοθζηά ηαηάθμζπα ηςκ δεζιχκ εζηένα ηςκ θςζθμθζπζδίςκ, ιε πμθφ ιζηνή ηάεεηδ εθεοεενία ηζκήζεςκ. Ζ πανμοζία ημο άηαιπημο πονήκα ζηενεμεζδμφξ ηαηά ιήημξ ηςκ πνχηςκ 10 πενίπμο ακενάηςκ ηςκ θςζθμθζπζδίςκ έπεζ ςξ απμηέθεζια ηδκ ιείςζδ ηδξ εθεοεενίαξ ηζκήζεςκ αοηχκ ηςκ ακενάηςκ, εκχ πανάθθδθα δδιζμονβείηαζ πχνμξ βζα πμζηίθεξ ηζκήζεζξ ηςκ οπυθμζπςκ ακενάηςκ ζημ άηνμ ηςκ αθοζίδςκ. οκεπχξ μζ ιειανάκεξ ιε ορδθυ πμζμζηυ πμθδζηενυθδξ δεκ πανμοζζάγμοκ ηδκ ηθίζδ ηςκ αθοζίδςκ πμο παναηδνείηαζ ζηδκ ζηενεή θάζδ ηςκ θζπμζςιάηςκ πμο ζοκηίεεκηαζ ιυκμ απυ θςζθμθζπίδζα. Ζ πνμζεήηδ πμθδζηενυθδξ ζε ιειανάκεξ έπεζ επίζδξ ζδιακηζηή επίδναζδ ζηδκ εενιμηναζία ιεηάπηςζδξ. Γζα DPPC ιειανάκεξ δ εενιμηναζία ιεηάπηςζδξ αθθάγεζ απυ 41 ζημοξ 44 ιε 33% mol πμθδζηενυθδ. Καεχξ υιςξ δ ζοβηέκηνςζδ ηδξ πμθδζηενυθδξ ηείκεζ ζε πμζμζηά ζζμιμνζαηά ιε ημ θςζθμθζπίδζμ, δ εθεοεενία ηίκδζδξ πάκς απυ ηδ εενιμηναζία ιεηάπηςζδξ ιεζχκεηαζ εκχ ηάης απυ ηδ εενιμηναζία ιεηάπηςζδξ δ ηζκδηζηυηδηα αολάκεηαζ. Ωξ ζοκέπεζα ηαζ δ ιείςζδ ηδξ νεοζηυηδηαξ πάκς απυ ηδκ εενιμηναζία ιεηάπηςζδξ ηαεχξ ηαζ ηδξ δζαπεναηυηδηαξ Ξ Σ Δ Δ Δ Π Α Τ Ω Ρ Τ Ξ Κ Θ Ο Θ Δ Θ Α Δηηυξ απυ θςζθαηζδοθμπμθίκδ, μοδέηενεξ θζπζδζηέξ δζπθμζηζαάδεξ ιπμνεί κα ζοκηίεεκηαζ απυ ζθζββμιοεθίκδ, ή ακάθμβα θεηζείκδξ. Ζ ακηζηαηάζηαζδ ημο εζηένα απυ ζφκδεζδ αζεένα αολάκεζ ηδκ ακημπή ζηδκ οδνυθοζδ εκχ δεκ επδνεάγεζ ζδζαίηενα ηζξ ζδζυηδηεξ ηδξ ιειανάκδξ. Ζ πανμοζία ηδξ ζφκδεζδξ αιζδίμο ζηδκ ζθζββμιοεθίκδ ηαζ οδνμλοθμιάδςκ ζηδ εέζδ ηδξ βθοηενυθδξ ηδξ θεηζείκδ, αολάκεζ ηζξ αθθδθεπζδνάζεζξ δεζιμφ οδνμβυκμο ημ μπμίμ ελδβεί ηδκ ορδθυηενδ ηάλδ ηδξ ηνοζηαθθζηήξ 11

28 θάζδξ ζε ζφβηνζζδ ιε ηδ θςζθαηζδοθμπμθίκδ. πςξ ηαζ ιε ηζξ θεηζείκεξ, δ εενιμηναζία ιεηάπηςζδξ αολάκεηαζ ιε αφλδζδ ημο πμζμζημφ ηςκ ημνεζιέκςκ θζπανχκ μ- λέςκ. Γεκζηά μζ ιειανάκεξ απυ ζθζββμιοεθίκδ εεςνμφκηαζ πζμ ζηαεενέξ ηαζ ζθζπηά δμιδιέκεξ απυ ηζξ ιειανάκεξ θεηζείκδξ, ιε ιζηνυηενδ δζαπεναηυηδηα ζε δζαθφηεξ, αολδιέκδ ακημπή ζηδ θφζδ, ηαζ ιζηνυηενδ νεοζηυηδηα ιειανάκδξ. Άθθμ εεηζηά θμνηζζιέκμ θςζθμθζπίδζμ πμο ανίζηεηαζ ζοκήεςξ ζε θοζζηέξ ιειανάκεξ είκαζ ημ θςζθαηζδοθμαζεακμθαιίκδ (PE). Καηέπμκηαξ ιζα μιάδα αιιςκίμο δ μπμία είκαζ πνςημκζςιέκδ ζε εεηζηυ ph αοηυ ημ θζπίδζμ δζαθένεζ απυ ηδκ θεηζείκδ ζε δφμ πνάβιαηα. Σμ πνχημ είκαζ υηζ δ ηεθαθή ημο θζπζδίμο είκαζ θζβυηενμ μβηχδδξ απυ ηδκ θεηζείκδ ηαζ δεφηενμ υηζ ιπμνεί κα πάνεζ ιένμξ ζε αθθδθεπζδνάζεζξ δεζιμφ οδνμβυκμο ιε ηα βεζημκζηά ημο ιυνζα. Εικόνα 12. Φωςφολιπίδια: Φωςφατιδυλοχολίνθ. φιγγομυελίνθ και φωςφατιδυλοαικανολαμίνθ Α Π Μ Ζ Θ Ι Α Τ Ξ Π Θ Ρ Λ Δ Μ Α Τ Ω Ρ Τ Ξ Κ Θ Ο Θ Δ Θ Α ε ανκδηζηά θμνηζζιέκα θςζθμθζπίδζα έπμοιε πενζζζυηενεξ αθθδθεπζδνάζεζξ ιεηαλφ ηςκ ηεθαθχκ ηςκ θζπζδίςκ. Γζ αοηυ ζημ DPPG δ μβηχδδξ ηεθαθή βθοηενυθδξ ζε ζοκδοαζιυ ιε ηδκ δθεηηνμζηαηζηή απχεδζδ ημο ιδ πνςημκζςιέκμο θςζθυνμο ζε ph=7 πνμζδίδεζ ιζα ιείςζδ ζηδ εενιμηναζία ιεηάπηςζδξ ηαηά 10 ºC παιδθυηενα απυ ημ DSPC. Μειανάκεξ πμο δμιμφκηαζ απυ ανκδηζηά θμνηζζιέκα θζπίδζα ιπμνμφκ κα δεζιεφζμοκ ζζπονά ηα ηαηζυκηα ηαζ ζδζαίηενα ηα δζζεεκή ηαηζυκηα υπςξ 12

29 αζαέζηζμ ηαζ ιαβκήζζμ. H πνμζεήηδ ζυκηςκ ιπμνεί κα επζθένεζ αθθαβή ζηδ θάζδ ηδξ ιειανάκδξ απυ οβνή / ηνοζηαθθζηή ζε ζηενεή θάζδ. Λζπίδζα υπςξ ημ PS (θςζθαηζδοθμζενίκδ) δείπκμοκ αλζμζδιείςηδ επζθεηηζηυηδηα βζα ζυκηα αζαεζηίμο. Εικόνα 13. DPPG και PS 1.2 ΣΤΠΟΙ ΛΙΠΟΨΜΑΣΨΝ Σα θζπμζχιαηα δζαηνίκμκηαζ ζε δζάθμνεξ ηαηδβμνίεξ ακάθμβα ιε ημ ιέβεεμξ ηαζ ηςκ ανζειυ ηςκ ιειανακχκ υπςξ SUV, MLV ηαζ LUV. Γζαηνίκμκηαζ υιςξ ηαζ αάζδ ηςκ ζδζμηήηςκ ημοξ υζμκ αθμνά ζημκ ηνυπμ δνάζδξ ημοξ Ο Ξ Κ Σ Ρ Θ Β Α Δ Θ Α Ι Α Κ Θ Ο Ξ Ρ Ω Λ Α Α ( M U L T I L A M E L L A R V E S I C L E S, M L V ) Απμηεθμφκηαζ απυ πέκηε έςξ δεηάδεξ μιυηεκηνεξ πμθθαπθέξ δζπθμζηζαάδεξ, ιε ιέβεεμξ ιεβαθφηενμ απυ 500 nm (εζηυκα 14). Ζ απυζηαζδ ιεηαλφ ηςκ δζαδμπζηχκ δζπθμζηζαάδςκ ηαεμνίγεηαζ απυ ηδκ ζζμννμπία ηςκ εθηηζηχκ δοκάιεςκ van der Waals, δθεηηνμζηαηζηχκ ηαζ άθθςκ δοκάιεςκ άπςζδξ. Ζ ηονζυηενδ ιέεμδμξ παναζηεοήξ MLV θζπμζςιάηςκ είκαζ δ ιέεμδμξ ημο Bangham (ιέεμδμξ ελάηιζζδξ ημο δζαθφηδ ή αθθζχξ ιέεμδμξ εκοδάηςζδξ θεπημφ οιεκίμο) (Bangham A.D. et al., 1965). Δηηυξ απυ ηα πμθοζηζααδζαηά οπάνπμοκ ηαζ ηα μθζβμζηζααδζαηά (oligolamellar vesicles, OLV) ιε ιέβεεμξ πμο ηοιαίκεηαζ απυ 0,1 έςξ 1 ιm 13

30 Λ Δ Γ Α Κ Α Λ Ξ Μ Ξ Ρ Θ Β Α Δ Θ Α Ι Α Κ Θ Ο Ξ Ρ Ω Λ Α Α ( L A R G E U N I L A M E L L A R V E S I C L E S, L U V ) Σα θζπμζχιαηα αοηά έπμοκ δζάιεηνμ ηδξ ηάλδξ ηςκ 1000 nm ηαζ είκαζ ιμκμζηζααδζαηά (εζηυκα 14). Ακάθμβα ιε ημ επζεοιδηυ ιέβεεμξ, ηα LUV ιπμνμφκ κα παναζηεοαζεμφκ ιε δζαθμνεηζηέξ ιεευδμοξ υπςξ δ απμιάηνοκζδ απμννοπακηζημφ, δ έβποζδ αζεακμθζημφ ή αζεενζημφ δζαθφιαημξ θςζθμθζπζδίςκ ηαζ δ ελάηιζζδ δζαθφηδ Λ Θ Ι Π Α Λ Ξ Μ Ξ Ρ Ξ Θ Β Α Δ Θ Α Ι Α Κ Θ Ο Ξ Ρ Ω Λ Α Α ( S M A L L U N I L A M E L L A R V E S I C L E S, S U V ) Γζαεέημοκ ημ ιζηνυηενμ δοκαηυ ιέβεεμξ ζημ μπμίμ έκα θςζθμθζπίδζμ ιπμνεί κα ζπδιαηίζεζ θζπμζςιζηή ιμνθή. Ζ δοκαηυηδηα αοηή ελανηάηαζ απυ ηδκ ζμκζηή ζζπφ ημο δζαθφιαημξ θςζθμθζπζδίμο ηαζ απυ ηδ θζπζδζηή ζφζηαζδ ηςκ ιειανακχκ. Οζ ιέεμδμζ παναζηεοήξ SUV θζπμζςιάηςκ είκαζ (i) δ ηαηενβαζία ιε οπένδπμοξ ηαζ (ii) δ ιέεμδμξ δζαδμπζηχκ ηφηθςκ ρφλδξ - εένιακζδξ (freeze - thaw). Σα ιμκμζηζααδζαηά θζπμζχιαηα ιπμνεί κα είκαζ ηαζ ιεζαίμο ιεβέεμοξ (IUV Intermediate unilamellar vesicles ακηίζημζπα) Δηηυξ απυ αοηέξ ηζξ παναπάκς ηαηδβμνίεξ πμο είκαζ ηαζ μζ πζμ βκςζηέξ οπάνπμοκ ηαζ άθθεξ υπςξ ηα μθζβμζηζααδζαηά (oligovesicular vesicles OVV) πμο είκαζ ιζηνά θζπμζχιαηα πμο εκζςιαηχκμκηαζ ζε ηα βζβακηζαία θζπμζχιαηα (giant unilamellar vesicles GUV) πμο είκαζ ιεβαθφηενα απυ 1ιm ιεβαθφηενα. Eικόνα 14. Σα λιποςϊματα ταξινομοφνται με βάςθ το μζγεκόσ τουσ, το ςχιμα τουσ και τον αρικμό των ςτιβάδων τουσ ςε SUV = small unilamellar vesicle, LUV = large unilamellar vesicle, MLV = multilamellar vesicle, GUV = giant unilamellar vesicle, OVV = oligovesicular vesicle.η μπάρα αντιπροςωπεφει 5μm 2005, (από American Chemical Society). L I P O S O M E S ) Ρ Σ Λ Β Α Θ Ι Α Κ Θ Ο Ξ Ρ Ω- Λ Α Α ( C O N V E N T I O N A L 14

31 Δίκαζ θζπμζχιαηα πμο απμηεθμφκηαζ ιυκμ απυ θςζθμθζπίδζα (μοδέηενα ή/ηαζ ανκδηζηά θμνηζζιέκα) ή/ηαζ πμθδζηενυθδ. Δίκαζ ηα πζμ ημζκά πνδζζιμπμζμφιεκα θζπμζχιαηα ζηδ ιεηαθμνά αζμδναζηζηχκ εκχζεςκ (εζηυκα 15). Γζαθένμοκ ςξ πνμξ ηζξ θοζζημπδιζηέξ ημοξ ζδζυηδηεξ, υπςξ ημ ιέβεεμξ, ηδ θζπζδζηή ζφζηαζδ, ημ επζθακεζαηυ θμνηίμ ηαζ ημκ ανζειυ ηαζ νεοζηυηδηα ηςκ θζπζδζηχκ δζπθμζηoζαάδςκ. Σμ ααζζηυ παναηηδνζζηζηυ ημοξ είκαζ υηζ έπμοκ ιζηνυ πνυκμ ηοηθμθμνίαξ ζημ αίια. Ηn vivo (ζοπκά εκδμθθέαζα) έπμοκ ηδκ ηάζδ κα ζοζζςιαηχκμκηαζ ηαζ κα είκαζ μναηά ζηα θαβμηφηηανα ημο ιμκμπονδκζημφ ζοζηήιαημξ θαβμηοηηάνςκ, βκςζηυ επίζδξ ηαζ ςξ δζηηομεκδμεδθζαηυ ζφζηδια (RES). Tα ηφνζα υνβακα ζοζζχνεοζδξ είκαζ ημ ήπαν ηαζ δ ζπθήκα. Δηιεηαθθεουιεκμζ αοηυ ημ βεβμκυξ ιπμνεί κα βίκεζ ζηυπεοζδ θζπμζςιζηχκ αζμδναζηζηχκ εκχζεςκ ζε θαβμηφηηανα πμο είκαζ ιμθοζιέκα. Δπζπθέμκ, ηα ζοιααηζηά θζπμζχιαηα έπμοκ πνδζζιμπμζδεεί βζα ιεηαθμνά ακηζβυκςκ. Λζπμζςιζηά ειαυθζα έπμοκ απμδεζπεεί απμηεθεζιαηζηά ηαηά ζζηχκ, ααηηδνζαηχκ ηαζ παναζζηζηχκ ιμθφκζεςκ ηαεχξ επίζδξ ηαζ εκακηίμκ υβηςκ. 15

32 Κ Θ Ο Ξ Ρ Ω Λ Α Α Λ Α Ι Π Α Ρ Ι Σ Ι Κ Ξ Τ Ξ Π Θ Α Ρ ( L O N G C I R C U L A T I N G L I P O S O M E S, S T E A L T H, O R S T E R I C A L L Y S T A B I L I Z E D ) Αοηά ηα θζπμζχιαηα θέβμκηαζ επίζδξ stealth ή ζηενζηχξ ζηαεενμπμζδιέκα. Ο πνχημξ υνμξ ακαθένεηαζ ζηδκ ζηακυηδηά ημοξ κα δζαθεφβμοκ ηςκ ιαηνμθάβςκ ηαζ μ δεφηενμξ ζημ ιδπακζζιυ ζηενζηήξ ζηαεενμπμίδζήξ ημοξ, πμο είκαζ οπεφεοκμξ βζα ηδκ αφλδζδ ημο πνυκμο ηοηθμθμνίαξ. Σμ ηεθεοηαίμ μθείθεηαζ ζημ ημίπςια πμο ζπδιαηίγεηαζ πενζιεηνζηά ηςκ θζπμζςιάηςκ ηαζ απμηνέπεζ ηζξ αθθδθεπζδνάζεζξ ιε ιυνζα ηαζ ηοηηανζηά ζοζηαηζηά ημο αζμθμβζημφ πενζαάθθμκημξ, ηονίςξ πνςηεΐκεξ (εζηυκα 15). Σμ πζμ εκδζαθένμκ παναηηδνζζηζηυ ηςκ θζπμζςιάηςκ ιαηνάξ ηοηθμθμνίαξ είκαζ υηζ έπμοκ ηδκ ζηακυηδηα κα αβαίκμοκ εηηυξ ηοηθμθμνίαξ ζε πενζμπέξ υπμο δ δζαπεναηυηδηα ημο αββεζαημφ ημζπχιαημξ είκαζ αολδιέκδ. Αοηυ ζοιπίπηεζ ιε ημ βεβμκυξ υηζ μζ πενζμπέξ αολδιέκδξ ηνζπμεζδζηήξ δζαπεναηυηδηαξ πενζθαιαάκμοκ παεμθμβζηέξ πενζμπέξ, υπςξ ζηενεμφξ υβημοξ ηαζ πενζμπέξ ιμθφκζεςξ ηαζ θθεβιμκήξ. Πνμξ ημ πανυκ, μ πζμ δδιμθζθήξ ηνυπμξ παναβςβήξ ηέημζςκ θζπμζςιάηςκ είκαζ δ μιμζμπμθζηή ζφκδεζδ ημο πμθοιενμφξ πμθοαζεοθεκμβθοηυθδ (PEG) ζηδκ ελςηενζηή επζθάκεζα Α Μ Ξ Ρ Ξ Κ Θ Ο Ξ Ρ Ω Λ Α Α ( I M M U N O L I P O S O M E S ) Γζαεέημοκ εζδζηά ακηζζχιαηα ή ηιήιαηα ακηζζςιάηςκ (Fab ή ακηζζχιαηα ιμκήξ αθοζίδαξ) ζηδκ επζθάκεζά ημοξ ιε ζημπυ ηδκ ζημπεοιέκδ δνάζδ ημοξ (εζηυκα 15). Μέπνζ ηχνα έπμοκ δμηζιαζηεί ηονίςξ ζηδ ιεηαθμνά ακηζηανηζκζηχκ παναβυκηςκ. πςξ ηαζ άθθα ζςιαηίδζα ζηδκ ηοηθμθμνία ημο αίιαημξ, είκαζ δφζημθμ ζηα α- κμζμθζπμζχιαηα κα εβηαηαθείρμοκ ηδκ ηοηθμθμνία ζε άθθα δζαιενίζιαηα πθδκ ημο ήπαημξ ηαζ ημο ζπθήκα. Βέααζα stelth ακμζμθζπζμζχιαηα ελαζθαθίγμοκ ηαζ ηδκ ιαηνά ηοηθμθμνία εηηυξ απυ ηδκ ζηυπεοζδ. Σμπζηή πμνήβδζδ ελαζθαθίγεζ ιεβαθφηενδ εββφηδηα ζημοξ οπμδμπείξ. ε αοηή ηδκ ηαηδβμνία θζπμζςιάηςκ εα βίκεζ εηηεκέζηενδ ακαθμνά παναηάης. 16

33 Ι Α Θ Ξ Μ Θ Ι Α Κ Θ Ο Ξ Ρ Ω Λ Α Α ( C A T I O N I C L I P O S O M E S ) Αοηά εηπνμζςπμφκ ζπεηζηά κέα ιέθδ ηδξ μζημβέκεζαξ ηςκ θζπμζςιάηςκ. Βνίζημκηαζ ζηδκ πνχηδ βναιιή ςξ ζοζηήιαηα ιεηαθμνάξ βεκεηζημφ οθζημφ. Σα ηαηζμκζηά θζπζδζηά ζοζηαηζηά ημοξ αθθδθεπζδνμφκ ιε ηαζ ελμοδεηενχκμοκ- ημ ανκδηζηά θμνηζζιέκμ DNA, ζοιποηκχκμκηαξ έηζζ ημ DNA ζε ιζα πζμ ζοιπαβή δμιή. Σα ζφιπθμηα θζπζδίμο-dna πανέπμοκ πνμζηαζία ηαζ επάβμοκ ηδκ ηοηηανζηή εζςηενίηεοζδ ηαζ έηθναζδ ημο ζοιποηκςιέκμο πθαζιζδίμο Εηθόλα 15. Σρεκαηηθή απεηθόληζε ελόο ζηεξενρεκηθά ζηαζεξνπνηεκέλνπ ιηπνζώκαηνο. Τα stealth ιηπνζώκαηα εγθισβίδνπλ ηε βηνδξαζηηθή νπζία (1) ζε κηα θσζθνιηπηδηθή δηπινζηνηβάδα (2).Η PEG επηθάιπςε (3) επηηξέπεη ζηα ιηπνζώκαηα λα απνθεύγνπλ ην αλνζνπνηεηηθό ζύζηεκα απμάλνληαο ην ρξόλν εκηδσήο ηνπ θαξκάθνπ ζην ζώκα Κ Θ Ο Ξ Ρ Ω Λ Α Α Ο Ξ Σ Δ Ο Α Γ Ξ Σ Μ Ζ Ρ Σ Μ Ζ Ν Ζ ( F U S O G E N I C L I P O S O M E S ) : Σα θζπμζχιαηα αοηά ιπμνμφκ κα δζεοημθφκμοκ ηδκ εκδμηοηηανζηή ιεηαθμνά εβηθςαζζιέκςκ αζμδναζηζηχκ εκχζεςκ ιέζς ζφκηδλδξ ιε ηδ ιειανάκδ ηςκ ηοηηάνςκ/ζηυπςκ. Τπάνπμοκ δζάθμνμζ ηνυπμζ παναζηεοήξ ημοξ ιεηαλφ ηςκ μπμίςκ είκαζ δ πνήζδ θζπζδίςκ (υπςξ ημ DOPE) πμο είκαζ ζηακά κα απμζηαεενμπμζμφκ ηδκ δζπθμζημζαάδα ηαζ πνμηαθμφκ θαζκυιεκα ζφκηδλδξ. Δπίζδξ οπάνπμοκ πνςηεΐκεξ πμο επάβμοκ ηδ ζφκηδλδ ιε δοκαηυηδηα εκζςιάηςζδξ ζε θζπμζχιαηα. Γζάθμνεξ ιεθέηεξ έπμοκ 17

34 δείλεζ υηζ δ εκίζποζδ ηδξ ζηακυηδηαξ ζφκηδλδξ ηςκ θζπμζςιάηςκ ιπμνεί κα εθανιμζηεί πνμηεζιέκμο κα εκζζποεεί δ απμηεθεζιαηζηυηδηα ηςκ θζπμζςιζηχκ ζοζηδιάηςκ ιεηαθμνάξ βεκεηζημφ οθζημφ Κ Θ Ο Ξ Ρ Ω Λ Α Α Δ Σ Α Θ Ρ Η Ζ Α Ρ Δ p H Απμηεθμφκηαζ απυ θςζθμθζπίδζα υπςξ θςζθαηζδοθαζεακμθαιίκδ (PE), δζεθατθμθςζθαηζδοθμαζεακμθαιίκδ (DOPE). ε παιδθυ ph εκχκμκηαζ ιε ηδ ηοηηανζηή ιειανάκδ ημο εκδμζχιαημξ ηαζ απεθεοεενχκμοκ ημ πενζεπυιεκυ ημοξ ζημ ηοηηανυπθαζια. Δίκαζ ηαηάθθδθα βζα εκδμηοηηανζηή ιεηαθμνά αζεεκχκ αάζεςκ ηαζ ιαηνμιμνίςκ. Ζ αζμηαηακμιή ηαζ δ θανιαημηζκδηζηή ημοξ είκαζ ακάθμβδ ιε αοηή ηςκ ζοιααηζηχκ θζπμζςιάηςκ. 1.3 ΜΕΘΟΔΟΙ ΠΑΡΑΚΕΤΗ ΛΙΠΟΨΜΑΣΨΝ Τπάνπμοκ δζάθμνεξ ηεπκζηέξ παναζηεοήξ θζπμζςιάηςκ πμο επζθέβμκηαζ ακάθμβα ιε ηδκ πνμξ εβηθςαζζιυ αζμδναζηζηή έκςζδ, ημ πμζμζηυ εβηθςαζζιμφ πμο επζεοιμφιαζ ηαζ ηδκ ηεθζηή ιμνθή ηςκ θζπμζςιάηςκ πμο εέθμοιε κα παναζηεοάζμοιε Λ Ζ Υ Α Μ Θ Ι Ζ Δ Θ Α Ρ Ο Ξ Π Α ε αοηή ηδκ ηεπκζηή, πμο είκαζ ηαζ δ πζμ απθή (εζηυκα 16), ζπδιαηίγεηαζ θεπηυ οιέκζμ (film) ηαηά ηδκ ελάηιζζδ μνβακζημφ ή μνβακζηχκ δζαθοηχκ, ζημοξ μπμίμοξ έπεζ πνμδβμοιέκςξ δζαθοεεί ημ θζπίδζμ. Οζ εενιμηναζία ηαηά ηδκ ελάηιζζδ ημο δζαθφηδ πνέπεζ κα παναιέκεζ πάκς απυ ηδκ Tc. αθμφ ζπδιαηζζηεί ημ θεπηυ οιέκζμ βζα ηδκ πζζημπμίδζδ ηδξ απμιάηνοκζδξ υθμο ημο υβημο ημο δζαθφηδ ηαζ βζα κα απμθεοπεεί δ πδιζηή απμζημδυιδζδ ημο θζπζδίμο π.π. μλείδςζδ, ημ εζςηενζηυ ηδξ ζθαζνζηήξ θζάθδξ ζημ μπμίμ ζπδιαηίγεηαζ ημ θεπηυ οιέκζμ, εθανιυγεηαζ νεφια αγχημο βζα πέκηε θεπηά. 18

35 Λιπίδια και λιποδιαλυτά φάρμακα Εξάτμιςθ διαλφτθ Υδατικό διάλυμα και υδατοδιαλυτά φάρμακα Οργανικόσ διαλφτθσ Λιπιδικό φίλμ Ενυδάτωςθ και Ανάδευςθ Υπζρθχθςθ Εξώκθςθ από φίλτρο Ομογενοποίθςθ Εικόνα 16. Μζκοδοσ λεπτοφ υμενίου. Μεγάλα πολυςτιβαδιακά λιποςώματα Μικρά μονοςτιβαδιακά λιποςώματα Ζ εκοδάηςζδ (hydration) ημο οιεκίμο πμο αημθμοεεί πναβιαημπμζείηαζ ιε κενυ ή ιε νοειζζηζηυ δζάθοια ή ιε δζάθοια ηδξ πνμξ εβηθςαζζιυ αζμδναζηζηήξ μοζίαξ. Καζ ζε αοηυ ημ ζηάδζμ, υπςξ ηαζ ημ ζηάδζμ ηδξ ελάηιζζδξ ηςκ δζαθοηχκ, δ εενιμηναζία πνέπεζ κα παναιέκεζ πάκς απυ ηδκ Tc. Γζα αοηυ ημκ θυβμ ημ δζάθοια πμο πνμμνίγεηαζ βζα ηδκ εκοδάηςζδ έπεζ πνμεενιακεεί ζε αοηή ηδ εενιμηναζία ηαζ δ πνμζεήηδ αοημφ ζηδ ζθαζνζηή θζάθδ βίκεηαζ εκηυξ οδαηυθμοηνμο. Με ιδπακζηή ακάδεοζδ ηδξ θζάθδξ (vortex) ημ οιέκζμ απμημθθάηαζ απυ ηα ημζπχιαηά ηδξ, μπυηε θαιαάκεηαζ ιία εμθή δζαζπμνά ιε πμθοζημζααδζαηά θζπμζχιαηα ιεβάθμο ιεβέεμοξ MLV. Ζ ιείςζδ ημο ιεβέεμοξ ηςκ MLV θζπμζςιάηςκ ηαζ δ δδιζμονβία μιμβεκμφξ ζε ακαθμνά ιε ημ ιέβεεμξ πθδεοζιμφ, οθμπμζείηαζ ιε ηδ πνήζδ ηονίςξ θμοηνμφ οπενήπςκ (bath sonicator), αθθά ηαζ δζαθυνςκ άθθςκ ηεπκζηχκ, υπςξ ελχεδζδ ιέζς θίθηνςκ ή ιειανακχκ (extrusion), ιζηνoβαθαηηςιαημπμίδζδ (microemulcification). ημ ηεθεοηαίμ ζηάδζμ πναβιαημπμζείηαζ δ δζαδζηαζία ηδξ μιαθμπμίδζδξ (annealing), ηαηά ηδκ μπμία ηα θζπμζχιαηα ημπμεεημφκηαζ ζε οδαηυθμοηνμ ηαζ πάκηα ζε εενιμηναζία ορδθυηενδ αοηήξ ηδξ ιεηάπηςζδξ ημο θζπζδίμο, υπμο παναιέκμοκ βζα ιία πενίπμο χνα χζηε κα μθμηθδνςεεί ηαζ κα μιαθμπμζδεεί δ ιμνθμπμίδζδ ηδξ δμιήξ ημοξ. Ζ δζάιεηνμξ ηςκ θζπμζςιάηςκ πμο θαιαάκμκηαζ ιε ηδ ιέεμδμ αοηή ηοιαίκεηαζ απυ 5 έςξ 6 ιm Α Ι Θ Δ Α Σ Ο Δ Π Ζ Υ Ω Μ ( P R O B E S O N I C A T O R ) Σα θζπμζχιαηα πμο θαιαάκμκηαζ ιεηά ηδκ εκοδάηςζδ ημο θζθι είκαζ MLV βζα ηδκ ιεηαηνμπή ημοξ ζε SUV βίκεηαζ πνήζδ αηίδαξ οπενήπςκ. Γεδμιέκμο υηζ αοηά 19

36 ηα ζςιαηίδζα εα ζπάζμοκ μθμηθδνςηζηά ζηδκ πμνεία, δεκ είκαζ απαναίηδημ κα θδθεεί πνμζμπή ζπεηζηά ιε ημ ανπζηυ ιέβεεμξ ηςκ MLV θζπμζςιάηςκ, ημ πμζμζηυ εβηθςαζζιμφ ηαζ ημ πάπμξ ημο θζπζδζημφ οιεκίμο. Ζ αηίδα οπενήπςκ πνμηζιάηαζ βζα δζαζπμνέξ πμο απαζημφκ ορδθή εκένβεζα ζε ιζηνυ υβημ (π.π. ορδθέξ ζοβηεκηνχζεζξ θζπζδίμο, ή παπφννεοζηδ οδαηζηή θάζδ), εκχ ημ θμοηνυ οπενήπςκ είκαζ πενζζζυηενμ ηαηάθθδθμ βζα ιεβάθμοξ υβημοξ δζαθοιέκμο θζπζδίμο ηαζ βζα πενζπηχζεζξ πμο δεκ είκαζ απαναίηδηδ δ απυδμζδ μνζαημφ ιεβέεμοξ ζςιαηζδίςκ. Μεηά ηδκ εθανιμβή probe sonication αημθμοεεί θοβμηέκηνδζδ ζηα rpm βζα πέκηε θεπηά πνμηεζιέκμο κα απμιαηνοκεμφκ ηα νζκίζιαηα ηζηακίμο πμο απμημθθήεδηακ απυ ηδκ αηίδα ο- πενήπςκ θυβς ηνζαήξ ηδξ ζηδκ δζαζπμνά ηαζ ίζςξ ηαζ αδζάζπανημ θζπίδζμ ηαζ MLV Δ Ν Ω Η Ζ Ρ Ζ Λ Δ Ρ Ω Τ Θ Κ Π Ω Μ M L V Ι Α Θ S U V Κ Θ Ο Ξ Ρ Ω Λ Α Ω Μ Ζ ιείςζδ ημο ιεβέεμοξ ζημ επζεοιδηυ ιέβεεμξ επζηοβπάκεηαζ ιε ηδ πνήζδ θίθηνςκ ηςκ μπμίςκ μζ πυνμζ έπμοκ ζοβηεηνζιέκδ δζάιεηνμ. Ακάθμβα ιε ημ επζεοιδηυ ηεθζηυ ιέβεεμξ επζθέβεηαζ ηαζ ημ θίθηνμ ιε ημ ακάθμβμ ιέβεεμξ πυνςκ. Ζ ιέεμδμξ πανμοζζάγεζ ημ πθεμκέηηδια υηζ πανέπεζ επακαθήρζια απμηεθέζιαηα, εκχ ημ θζπίδζμ δεκ οθίζηαηαζ ηάπμζα ζδιακηζηή ιεηααμθή. Δπζπθέμκ ιπμνεί κα δζπθαζζαζηεί ημ πμζμζηυ εβηθςαζζιμφ δζαθυνςκ μοζζχκ. Ζ ελχεδζδ ιέζς θίθηνςκ δζαιέηνμο 0,2 ιm μδδβεί ζε ελαζνεηζηά μιμζμβεκείξ πθδεοζιμφξ θζπμζςιάηςκ δζαιέηνμο 270 nm (Olson F.et al., 1979) Υ Π Ζ Ρ Ζ Λ Θ Ι Π Ξ Γ Α Κ Α Ι Ω Λ Α Ξ Ο Ξ Θ Ζ Ζ Γζα ηδκ παναζηεοή θζπμζςιάηςκ ιπμνμφκ επίζδξ κα πνδζζιμπμζδεμφκ βαθαηηςιαημπμζδηέξ (Mayhew E. et al., 1984). Οζ ιζηνμβαθαηηςιαημπμζδηέξ είκαζ ζοζηεοέξ πμο ακηθμφκ ημ νεοζηυ, ζηδκ πνμηεζιέκδ πενίπηςζδ ηα θζπμζχιαηα, ιε πμθφ ορδθέξ πζέζεζξ ιέπνζ ηαζ (10000 p.s.i., bar) ιέζα απυ θίθηνα δζαιέηνμο 5ιm. ηδ ζοκέπεζα δζαπενκμφκ ημ ιίβια πςνζζιέκμ ζε δφμ ηιήιαηα ιε πμθφ ιεβάθδ ηαπφηδηα, απυ ιζηνά ηακάθζα πμο ακαιζβκφμοκ ηα δφμ νεφιαηα οπυ μνεή βςκία πανέπμκηαξ ιε ημκ ηνυπμ αοηυ πμθφ ιεβάθδ εκένβεζα. Σα θζπίδζα εζζάβμκηαζ ζημ ιζηνμβαθαηηςιαημπμζδηή ιε ηδ ιμνθή εκαζςνήιαημξ ιεβάθςκ θζπμζςιάηςκ MLV ή ιε ηδ ιμνθή ιδ εκοδαηςιέκμο θζπζδίμο εκηυξ οδαηζημφ ιέζμο. Με ηδκ ηεπκζηή αοηή παναζηεοάγμκηαζ ιζηνά MLV θζπμζχιαηα ιε ηαθή ηαηακμιή ιεβέεμοξ nm (micro emulsification liposomes, MEL). Οζ βαθαηηςιαημπμζδηέξ ιπμνμφκ κα πνδζζιμπμζδεμφκ ηαζ ζηδ αζμιδπακζηή παναβςβή βζα ηδκ παναζηεοή ιεβάθςκ πμζμηήηςκ θζπμζςιάηςκ (Vemuri S. et al., 1989). 20

37 Δ Ν Ω Η Ζ Ρ Ζ Ρ Δ Η Α Κ Α Λ Ξ Δ Τ Α Π Λ Ξ Γ Ζ Ρ Λ Δ Γ Α Κ Ζ Ρ Ο Θ Δ Ρ Ζ Ρ Ζ ηεπκζηή πενζθαιαάκεζ ηδκ εζζαβςβή πνμζπδιαηζζιέκςκ ιεβάθςκ θζπμζςιάηςκ ζε εάθαιμ (French Press) οπυ ιεβάθδ πίεζδ ( p.s.i.), ηαζ απμδίδεζ μιμβεκείξ ιμκμ- ή μθζβμ- ζηζααδζαηέξ θζπμζςιζηέξ δζαζπμνέξ εκδζάιεζςκ ιεβεεχκ (30 80 nm ζε δζάιεηνμ ακάθμβα ιε ηδκ εθανιμγυιεκδ πίεζδ) (Barenholtz Y. et al., 1979). Σα θζπμζχιαηα πμο θαιαάκμκηαζ ιε ηδ ιέεμδμ αοηή πνδζζιμπμζμφκηαζ βζα ηδ ιεηαθμνά εοαίζεδηςκ ιαηνμιμνίςκ ηαζ είκαζ πζμ ζηαεενά απυ ηα ηαηενβαζιέκα ιε οπένδπμοξ θζπμζχιαηα Δ Μ Δ Ρ Ζ Κ Θ Ο Θ Δ Θ Ω Μ Πενζθαιαάκεζ ιεευδμοξ ηαηάθθδθεξ βζα ηδκ παναζηεοή SUV ηαζ LUV θζπμζςιάηςκ. Γζάθοια θζπζδίμο ζε μνβακζηυ δζαθφηδ εκίεηαζ ηαπέςξ ζε πενίζζεζα οδαηζημφ ιέζμο πμο πενζέπεζ ηδκ μοζία πμο πνυηεζηαζ κα εβηθςαζζηεί ζηα θζπμζχιαηα. ηδ δζεπζθάκεζα ιεηαλφ κενμφ ηαζ μνβακζημφ δζαθφηδ, ηα θςζθμθζπίδζα αοημδζαηάζζμκηαζ ζε θζπμζχιαηα ιζηνήξ δζαιέηνμο. Σα ιεβάθα ζοβηνζηζηά πθεμκεηηήιαηα ηςκ ιεευδςκ είκαζ δ εφημθδ εθανιμβή ηδξ ηαζ μ πενζμνζζιέκμξ ηίκδοκμξ απμζημδυιδζδξ ηςκ θζπζδίςκ. Μεζμκέηηδια ηςκ ιεευδςκ είκαζ ημ παιδθυ πμζμζηυ εβηθςαζζιμφ βζα οδαημδζαθοηέξ μοζίεξ. Οζ πζμ ζοπκά εθανιμγυιεκεξ ιεεμδμθμβίεξ παναζηεοήξ ηέημζςκ θζπμζςιζηχκ δζαζπμνχκ πενζβνάθμκηαζ παναηάης ηαζ αθμνμφκ ζε πενζπηχζεζξ ηαηά ηζξ μπμίεξ: μ μνβακζηυξ δζαθφηδξ είκαζ ακαιίλζιμξ ιε ηδκ οδαηζηή θάζδ, μ μνβακζηυξ δζαθφηδξ είκαζ ιδ ακαιίλζιμξ ιε ηδκ οδαηζηή θάζδ, μ μνβακζηυξ δζαθφηδξ είκαζ ζε πενίζζεζα ηαζ ιδ ακαιίλζιμξ ιε ηδκ οδαηζηή θάζδ. 21

38 Δ Ζ Λ Θ Ξ Σ Π Γ Θ Α Λ Θ Ι Ω Μ Λ Θ Ι Ι Σ Κ Θ Ω Μ Λ Δ Α Ο Ξ Π Π Σ Ο Α Μ Θ Ι Α Καηά ηδκ ακάιζλδ θζπζδίςκ ιε απμννοπακηζηά ζμκζηά αιθμηενζηά ή ιδ ζμκζηά ζε νοειζζηζηυ δζάθοια, ζπδιαηίγμκηαζ αοευνιδηα ιεζηηά ιζηηφθζα (micelles). Σμ είδμξ ηαζ δ ηαηακμιή ηςκ πμθζηχκ ηαζ θζπυθζθςκ μιάδςκ ημο απμννοπακηζημφ ιέζα ζημ ιζηηφθζμ ηαεμνίγμοκ ημ ιέβεεμξ ηαζ ημ ζπήια ημο. Ζ ζοβηέκηνςζδ απμννοπακηζημφ ζημ κενυ ηαηά ηδκ μπμία ανπίγμοκ κα ζπδιαηίγμκηαζ ιζηηφθζα είκαζ βκςζηή ςξ ηνίζζιδ ζοβηέκηνςζδ ιζηηοθίςκ (critial micelle concentration, CMC). ε ζοβηεκηνχζεζξ ιζηνυηενεξ ηδξ ηνίζζιδξ ηα ιυνζα ημο απμννοπακηζημφ απακημφκ εθεφεενα ζημ δζάθοια ςξ ιμκμιενή, εκχ ζε ιεβαθφηενεξ ζπδιαηίγμοκ μθμέκα ιεβαθφηενεξ πμζυηδηεξ ιζηηοθίςκ. Σα απμννοπακηζηά δζαηνίκμκηαζ ζφιθςκα ιε ηδκ ηαηακμιή ηδξ πμθζηήξ ηαζ οδνυθμαδξ πενζμπήξ πμο δζαεέημοκ ζε πεπθαηοζιέκα (αθηοθμβθοημζίδζα πμο δίκμοκ ζθαζνζηά ιζηηφθζα) ηαζ επζιήηδ (πμθζηά άθαηα πμο ζπδιαηίγμοκ δζζημεζδή ιζηηφθζα). Ζ απμιάηνοκζδ ημο απμννοπακηζημφ απυ ηα ιζηηφθζα βίκεηαζ ιε δζαπίδοζδ ή πνςιαημβναθία ζηήθδξ ηαζ έηζζ ζπδιαηίγμκηαζ θζπμζχιαηα πμο εβηθςαίγμοκ υηζ οπάνπεζ ζηδκ οδαηζηή θάζδ. ημ ζηάδζμ αοηυ είκαζ εφημθμ κα απμιαηνοκεμφκ ηαζ ιζηνά ιυνζα, βζ` αοηυ ηα πμζμζηά εβηθςαζζιμφ ιε αοηή ηδκ ηεπκζηή δεκ είκαζ αλζυθμβα. Δίκαζ υιςξ απμηεθεζιαηζηή ιέεμδμξ βζα ημ ζπδιαηζζιυ θζπμζςιάηςκ πμο θένμοκ θζπυθζθα ιυνζα, αθμφ αοηά ιπμνμφκ κα εζζαπεμφκ ζηα ιζηηφθζα πανμοζία ήπζςκ απμννοπακηζηχκ ιε πμζμζηυ εβηθςαζζιμφ αηυιδ ηαζ 100% Ά Κ Κ Δ Ρ Δ Θ Δ Θ Ι Δ Ρ Λ Δ Η Ξ Δ Ξ Θ Ο Α Π Α Ρ Ι Δ Σ Ζ Ρ Κ Θ Ο Ξ Ρ Ω Λ Α Ω Μ Αφυδατωμζνα-Αναγεννημζνα Σφαιρίδια (DRV) Ζ ιέεμδμξ αοηή έπεζ ακαπηοπεεί απυ ημοξ C. Kirby and G.Gregoriadis, Καηά ηδκ ηεπκζηή αοηή, πναβιαημπμζείηαζ θομθζθμπμίδζδ (freeze - drying) δζαζπμνάξ άδεζςκ SUV θζπμζςιάηςκ πανμοζία δζαθφιαημξ ηδξ πνμξ εβηθςαζζιυ μοζίαξ. Δδχ, ζε ακηίεεζδ ιε ηδκ ηθαζζζηή παναζηεοή ιέζς ελάηιζζδξ ημο δζαθφηδ υπμο ηα ιυνζα ημο θζπζδίμο είκαζ ζε ηοπαία ηαηακμιή, ημ θζπίδζμ ημ μπμίμ ανίζηεηαζ ζηα ηεκά SUV είκαζ πμθφ ηαθά μνβακςιέκμ ζηδ δμιή ηδξ ιειανάκδξ. Έηζζ, ηαηά ηδκ πνμζεήηδ ημο οδαηζημφ ιέζμο ζπδιαηίγμκηαζ θζπμζχιαηα ιε ορδθή ζηακυηδηα εβηθςαζζιμφ ηαζ δζάιεηνμ απυ 400 nm ιέπνζ ιενζηά ιm. 22

39 Ψφξη Απόψυξη Υπερήχηςη (Freeze thaw sonication method, FTS) Ζ πνμδβμφιεκδ DRV ιέεμδμξ είκαζ παναθθαβή ιίαξ άθθδξ πανυιμζαξ πμο ακαπηφπεδηε κςνίηενα απυ ημοξ Pick, Kasahara and Hinckle, 1981, ηαηά ηδκ μπμία ημ πνμξ εβηθςαζζιυ οθζηυ εζζάβεηαζ ζηα θζπμζχιαηα επίζδξ ιεηά ημ ζπδιαηζζιυ ημοξ. ε αοηή ηδκ πενίπηςζδ αημθμοεείηαζ ιία πμνεία επακαθαιαακυιεκδξ ρφλδξ απυρολδξ βζα ηδ δζάννδλδ ηςκ SUV θζπμζςιάηςκ, ηαηά ηδ δζάνηεζα ηδξ μπμίαξ δ δζαθοιέκδ μοζία ελζζμννμπείηαζ ιεηαλφ εζςηενζημφ ηαζ εζςηενζημφ, εκχ ηα θζπμζχιαηα ζοκηήημκηαζ ηαζ αολάκμοκ αλζμζδιείςηα ζε ιέβεεμξ. Έηζζ επζηοβπάκμκηαζ πμζμζηά εβηθςαζζιμφ ιέπνζ ηαζ 30%. Σα θζπμζχιαηα πμο πανάβμκηαζ ιε ηδ ιέεμδμ αοηή πανμοζζάγμοκ ζδιακηζηά ιεζμκεηηήιαηα ζε ζφβηνζζδ ιε ηα DRV θζπμζχιαηα. Σμ ηονζυηενμ δεκ ιπμνμφκ κα πνδζζιμπμζδεμφκ μοδέηενα θζπίδζα ηαζ εζδζηά ημ PC, βζαηί πζεακχξ δ πανμοζία θμνηίμο απαζηείηαζ βζα ημ ζπδιαηζζιυ ηςκ ηνοζηάθθςκ ηαηά ηδ δζαδζηαζία ηδξ ρφλδξ, πμο αμδεμφκ ζηδ ζοκέπεζα ηδκ πμνεία εναφζδ / ζφκηδλδ. Γζα πανυιμζμοξ θυβμοξ δ ζμοηνυγδ, δζζεεκή ιεηαθθζηά ζυκηα (πμο ιπμνμφκ κα ελμοδεηενχκμοκ ημ επζθακεζαηυ θμνηίμ) ηαζ ορδθήξ ζμκζηήξ ζζπφμξ δζαθφιαηα αθάηςκ δεκ ιπμνμφκ κα εβηθςαζζημφκ απμηεθεζιαηζηά. Ωζηυζμ δ ιέεμδμξ είκαζ πμθφ απθή, ηαπεία, ήπζα ηαζ ηαηαθήβεζ ζε ιεβάθα ιμκμζημζααδζαηά ζςιαηίδζα, πνήζζια βζα ηδ ιεθέηδ θαζκυιεκςκ ιεηαθμνάξ ιέζς ιειανακχκ. Τεχνική ενόσ βήματοσ (one step method) Καηά ηδκ ηεπκζηή αοηή ημ θζπίδζμ ή ιίβια θζπζδίςκ ημπμεεημφκηαζ ζε θζαθίδζμ ιε πχια. Πνμζηίεεηαζ δ ηαηάθθδθδ πμζυηδηα κενμφ ή νοειζζηζημφ δζαθφιαημξ, ημ μπμίμ έπεζ πνμεενιακεεί ζε εενιμηναζία ορδθυηενδ απυ ηδ εενιμηναζία ιεηάπηςζδξ ημο θζπζδίμο. Αημθμοεεί εένιακζδ οπυ ακάδεοζδ ζε εενιμηναζία επίζδξ ιεβαθφηενδ ηδξ εενιμηναζίαξ ιεηάπηςζδξ βζα 4 έςξ 7 χνεξ (Shmeider et al., 1995). Ο ιδπακζζιυξ ζπδιαηζζιμφ θζπμζςιάηςκ απμοζία μνβακζηχκ δζαθοηχκ ηαζ επζθακεζμδναζηζηχκ μοζζχκ, δεκ είκαζ πθήνςξ βκςζηυξ. Κάης απυ ήπζεξ ζοκεήηεξ, δ εκοδάηςζδ ηςκ θζπζδίςκ είκαζ ιία ανβή δζαδζηαζία (Lasic D.P. et al., 1988). Ζ φπανλδ θμνηζζιέκςκ θζπζδίςκ, δ πανμοζία ηαζ δ ζοβηέκηνςζδ ηδξ πμθδζηενυθδξ ηαζ δ ζμκζηή ζζπφξ ημο οδαηζημφ ιέζμο, επδνεάγμοκ ημ ζπδιαηζζιυ θζπμζςιάηςκ. Μία εκαθθαηηζηή πενίπηςζδ είκαζ δ ιέεμδμξ βκςζηή ςξ ιέεμδμξ θοζαθίδαξ ("bubble method") πμο πνδζζιμπμζεί άγςημ ζηδ δζεπζθάκεζα κενμφ θζπζδίμο, βζα ηδ ιείςζδ ημο ιεβέεμοξ ηςκ παναζηεοαζεέκηςκ θζπμζςιάηςκ (Talsma H. et al., 1994). ηδκ πνάλδ, μζ πενζζζυηενεξ ιέεμδμζ παναζηεοήξ θζπμζςιάηςκ μδδβμφκ ζε ανηεηά εηενμβεκείξ πθδεοζιμφξ ζςιαηζδίςκ ιε εονεία ηαηακμιή ιεβέεμοξ. Γεδμιέκμο υηζ μ δζαεέζζιμξ πνμξ εβηθςαζζιυ, υβημξ θζπμζςιάηςκ πμζηίθθεζ ιε ηδκ ηαηακμιή ιεβέεμοξ, είκαζ πμθφ ζδιακηζηυ μζ θζπμζςιζηέξ παναζηεοέξ κα παναηηδνίγμκηαζ ζπεηζηά ιε ημ ιέβεεμξ, χζηε κα ενιδκεφμκηαζ ζςζηά μζ ζδζυηδηέξ ημοξ in vivo ηαζ in vitro. Αηυιδ ηαζ θζπμ- 23

40 ζχιαηα ιε ημ ίδζμ ιέβεεμξ ηαζ ημκ ίδζμ ανζειυ ζημζαάδςκ είκαζ δοκαηυ κα δζαθένμοκ ζηδκ εζςηενζηή ηαηακμιή ηδξ οδαηζηήξ θάζδξ ηαζ ζηδκ πμζυηδηα θζπζδίμο πμο ζοιιεηέπεζ ζηδ δμιή ηςκ ζςιαηζδίςκ. Ζ επζθμβή ημο ηφπμο θζπμζςιάηςκ πμο εα πνδζζιμπμζδεεί βζα ζοβηεηνζιέκδ ελανηάηαζ εκ ιένεζ απυ ημ είδμξ ηδξ μοζίαξ πμο πνυηεζηαζ κα εβηθςαζζηεί αθθά ηαζ απυ ηδκ επζεοιδηή ζοιπενζθμνά ημο θζπμζχιαημξ ιεηά ηδκ παναζηεοή ημο. 1.4 ΜΕΘΟΔΟΙ ΚΑΘΑΡΙΜΟΤ Ζ απμιάηνοκζδ ηςκ αζμδναζηζηχκ εκχζεςκ πμο ανίζημκηαζ ζημ πενζαάθθμκ ηςκ θζπμζςιάηςκ ζοκήεςξ ηνίκεηαζ απαναίηδηδ βζα αοηυ ημκ θυβμ έπμοκ ακαπηοπεεί ηεπκζηέξ δζαπςνζζιμφ ηςκ θζπμζςιάηςκ απυ μοζίεξ πμο ανίζημκηαζ ζημ οδαηζηυ ιέζμ ηςκ θζπμζςιάηςκ. Οζ ηεπκζηέξ δζαπςνζζιμφ ακαθένμκηαζ παναηάης Δ Θ Α Ο Θ Δ Σ Ρ Ζ ( D I A L Y S I S ) Καηά ηδ δζαδζηαζία ηδξ δζαπίδοζδξ δ θζπμζςιζηή δζαζπμνά ημπμεεηείηαζ ζε έκα δμπείμ, μ ποειέκαξ δ ηα ημζπχιαηα ημο δμπείμο απμηεθμφκηαζ απυ ιειανάκεξ δζαπίδοζδξ. Σμ δμπείμ ημπμεεηείηαζ ιε ηδ ζεζνά ημο ζε έκα ιεβαθφηενμ δμπείμ πμο πενζέπεζ ηαεανυ δζαθφηδ. Καηά ηδ δζαπίδοζδ, ηα ζυκηα ημο δθεηηνμθφηδ ηαζ άθθεξ δζαθοηέξ μοζίεξ ιζηνμφ ιμνζαημφ αάνμοξ ελένπμκηαζ απυ ημοξ πυνμοξ ηδξ ιειανάκδξ, εκχ ηα θζπμζχιαηα θυβς ιεβέεμοξ, δεκ ιπμνμφκ κα ελέθεμοκ Τ Σ Γ Ξ Ι Δ Μ Π Ζ Ρ Ζ ( C E N T R I F U G A T I O N ) Ζ ποηκυηδηα ηςκ δζπθμζηζαάδςκ απυ θςζθαηζδοθμπμθίκδ έπεζ ακαθενεεί υηζ είκαζ ίζδ ιε 1,0135 g ml -1 (Johnson et al., 1973). Ζ ηζιή αοηή αολάκεζ εθαθνά (1,0142 g ml -1 ) ιε ηδκ πνμζεήηδ πμθδζηενυθδξ ζε πμζμζηυ 50% ηαζ ακαιέκεηαζ ιεβαθφηενδ βζα ημνεζιέκα θζπίδζα, ηονίςξ ηάης απυ ηδ εενιμηναζία ιεηάπηςζδξ. Δπίζδξ δ πανμοζία πνςηεσκχκ ζηζξ ιειανάκεξ μδδβεί ζε αζζεδηή αφλδζδ ηδξ ποηκυηδηαξ. Έηζζ θζπμζςιζηέξ ιειανάκεξ δζεζπανιέκεξ ζε κενυ ή νοειζζηζηυ δζάθοια ηαεζγάκμοκ οπυ ηδκ επίδναζδ ηδξ αανφηδηαξ. Έπεζ οπμθμβζζηεί υηζ ιζηνά ιμκμζηζααδζαηά θζπμζχιαηα (SUV) απυ θςζθαηζδοθμπμθίκδ (PC) έπμοκ ζοκηεθεζηή ηαηααφεζζδξ S (sedimentation coefficient ιμκάδεξ Svedberg) 2,6 S ζημ κενυ, εκχ ημ ιέβεεμξ αοηυ αολάκεζ ζε 5,2 S ιε ηδκ πνμζεήηδ ιεβάθςκ πμζχκ πμθδζηενυθδξ (Newman et al., 1975). Έηζζ ακάθμβα ιε ηδ ζφζηαζδ ηδξ δζπθμζημζαάδαξ, ιζηνά ιμκμζηζααδζαηά θζ- 24

41 πμζχιαηα ιπμνμφκ ακ ηαηααοεζζημφκ ζηα g ιεηά απυ χνεξ ζε ιζα ο- πενθοβυηεκηνμ. Σα πμθοζημζααδζαηά θζπμζχιαηα ηαηααοείγμκηαζ εοημθυηενα (ζηα g ή θζβυηενμ ακάθμβα ιε ημ ιέβεεμξ, βζα 1 χνα πενίπμο). ηδκ πενίπηςζδ πμο εβηθςαίγεηαζ ιέζα ζηα θζπμζχιαηα αζμδναζηζηή έκςζδ ιε ορδθή ζοβηέκηνςζδ ή ιε ορδθυ ιμνζαηυ αάνμξ ζε ζοβηέκηνςζδ ζζμημκζηή ιε νοειζζηζηυ δζάθοια, δ ποηκυηδηα ημο ιέζμο πθδζζάγεζ ή οπενααίκεζ αοηή ηςκ θζπζδίςκ, ιε απμηέθεζια δ ηαηααφεζζδ κα είκαζ αδφκαηδ. Σμ πνυαθδια αοηυ ιπμνεί κα λεπεναζηεί ιε αναίςζδ ηςκ θζπμζςιάηςκ ζε έκα ιέζμ ιε παιδθυηενδ ποηκυηδηα έηζζ χζηε ηα θζπμζχιαηα κα είκαζ αανφηενα απυ αοηυ Υ Π Ω Λ Α Ξ Γ Π Α Τ Θ Α Ο Ζ Ι Ζ Ρ ( G E L C H R O M A T O G R A P H Y ) ηδκ οβνή πνςιαημβναθία ιμνζαημφ απμηθεζζιμφ ηα ιυνζα ηςκ ζοζηαηζηχκ εκυξ ιίβιαημξ, ιεηαηζκμφκηαζ ιε ηδ αμήεεζα ιζαξ οβνήξ ηζκδηήξ θάζδξ ιέζα ζημ πμνχδεξ δίηηομ ζηαηζηήξ θάζδξ ηαζ δζαπςνίγμκηαζ ιε αάζδ ημ ιέβεεμξ ημοξ. Σμ δζηηοςηυ πθέβια ηδξ ζηαηζηήξ θάζδξ θεζημονβεί ζα ιμνζαηυ ηυζηζκμ, επζηνέπμκηαξ ηδκ είζμδμ ζημ εζςηενζηυ ημο ιυκμ ζε ιυνζα ηαζ ζυκηα πμο είκαζ ιζηνυηενα απυ ημ ιέβεεμξ ηςκ πυνςκ ημο. Οοζίεξ ιεβαθφηενμο ιεβέεμοξ απμηθείμκηαζ απυ ημ κα εζζέθεμοκ ζημ δίηηομ ηαζ εηθμφμκηαζ πνχηεξ παναζονυιεκεξ απυ ηδκ ηζκδηή θάζδ. Οζ οπυθμζπεξ μοζίεξ, ακάθμβα ιε ημ ιέβεεμξ ημοξ ηαηακέιμκηαζ θζβυηενμ ή πενζζζυηενμ ζηδ ζηαηζηή θάζδ ηαζ εηθμφμκηαζ ηαηά ζεζνά ιεβέεμοξ. Ωξ ζηαηζηέξ θάζεζξ πνδζζιμπμζμφκηαζ ηονίςξ οδνυθζθεξ πδηηέξ απυ δζαηθαδζζιέκα πμθοιενή δεληνάκδξ (Sephadex G), αβανυγδξ (Sepharose B) ή πμθοαηνοθαιζδίμο (Bio-Gel-P). Δζδζηά πμθοιενή δεληνάκδξ ζπδιαηίγμοκ ιεηά απυ αθηοθίςζδ ηςκ οδνμλοθμιάδςκ ημοξ οδνυθμαεξ βέθεξ ιε μνβακζημφξ δζαθφηεξ (Sephadex LH). ζμκ αθμνά ζηα θζπμζχιαηα, μζ πθέμκ δζαδεδμιέκεξ βέθεξ βζα ημ δζαπςνζζιυ ηδξ εθεφεενδξ απυ ηδκ εβηθςαζζιέκδ μοζία είκαζ μζ Sephadex G (ηονίςξ G-50 ηαζ G-25) ΕΝΔΟΥΛΕΒΙΑ ΦΟΡΗΓΗΗ Μεηά απυ εκδμθθέαζα πμνήβδζδ ηα θζπμζχιαηα πνμζημθθχκηαζ ζηζξ ορδθήξ ποηκυηδηαξ θζπμπνςηεΐκεξ ημο πθάζιαημξ (HDL), μζ μπμίεξ ακηαθθάζζμκηαζ ιε ηα θςζθμθζπίδζα ηςκ θζπμζςιζηχκ ιειανακχκ, απμζηαεενμπμζχκηαξ έηζζ ηδκ ιειανάκδ ιε απμηέθεζια ηδκ απεθεοεένςζδ ηδξ εβηθςαζζιέκδξ μοζίαξ (Lasic D.D. et al., 1991). Δκχ πανάθθδθα μζ μρςκίκεξ πνμζημθθχκηαζ ζηδκ επζθάκεζα ηςκ θζπμζςιάηςκ ηαζ θεζημονβμφκ ςξ ζήιαηα βζα ηδκ εκενβμπμίδζδ ημο δζηηομεκδμεδθζαημφ ζοζηήιαημξ (RES), ημο ζπθήκα, ημο ήπαημξ ηαζ ηςκ θειθαδέκςκ. Σα ιαηνμθάβα ηφηηανα έπμοκ θαβμηοηηανζηέξ ζδζυηδηεξ, μπυηε εβημθπχκμοκ ηα θζπμζχιαηα ιέζς εκδμηφηηςζδξ ηαζ ηα πενζηθείμοκ ζε έκα πεπηζηυ ηεκμηυπζμ (εκδυζςια). Σμ πεπηζηυ ηεκμηυπζμ εκ ζοκεπεία ζοκηήηεηαζ ιε έκα ή πενζζζυηενα θοζμζχιαηα πμο πενζέπμοκ 25

42 οδνμθοηζηά έκγοια. Αημθμοεεί ηαηαζηνμθή ηδξ θζπμζςιζηήξ ιειανάκδξ ηαζ μζ αζμδναζηζηέξ μοζίεξ πμο απεθεοεενχκμκηαζ είηε ακηζδνμφκ ιέζα ζημ θοζυζςια, είηε ιεηακαζηεφμοκ ζ άθθεξ ηοηηανζηέξ πενζμπέξ (π.π. ζημκ πονήκα ηαηά ηδ δζάνηεζα πδιεζμεεναπείαξ ηανηίκμο) δζαπευιεκα ιέζς ηδξ θοζμζςιζηήξ ιειανάκδξ. (Gregoriadis G. 1976). Τπάνπμοκ υιςξ πθέμκ ηνυπμζ κα λεπεναζηεί αοηυ ημ ιεζμκέηηδια. Έπμοκ ζπεδζαζηεί θζπμζχιαηα πμο απμθεφβμοκ ηδκ εκηυπζζδ απυ ηα θοζμζχιαηα ηαζ ηδκ αδνακμπμίδζδ ημο πενζεπμιέκμο ημοξ. Γζα πανάδεζβια, υηακ εοαίζεδηα ζημ ph θζπμζχιαηα ανεεμφκ ζημ υλζκμ πενζαάθθμκ ηςκ εκδμζςιάηςκ, πζζηεφεηαζ υηζ ζοκηήημκηαζ ιε ηδ ιειανάκδ ηςκ ηεκμημπίςκ ηαζ απεθεοεενχκμοκ ημ πενζεπυιεκυ ημοξ ζημ ηοηηανυπθαζια (Connor J. et al., 1985). Ωζηυζμ ηα απμηεθέζιαηα πμο έπμοκ παναηδνδεεί in vitro είκαζ οπυ δζενεφκδζδ ζε in vivo ιεθέηεξ, υπμο μζ πνςηεΐκεξ ημο πθάζιαημξ πμο πνμζνμθχκηαζ ζηδκ θζπμζςιζηή επζθάκεζα ίζςξ πανειααίκμοκ ζηζξ ζοκηδημβυκεξ ζδζυηδηέξ ημοξ. Ζ πνυζθδρδ ηςκ θζπμζςιάηςκ απυ ηα ηφηηανα ημο RES ιπμνεί κα πανειπμδζζηεί ζηενεμπδιζηά, ηνμπμπμζχκηαξ ηδκ επζθάκεζά ημοξ ιε ηδκ πνμζεήηδ πμθοαζεοθεκμβθοηυθδξ (PEG). Με ηδκ ηεπκζηή αοηή παναζηεοάγμκηαζ "αυναηα" θζπμζχιαηα (stealth liposomes) ιαηνάξ ηοηθμθμνίαξ (Borison O. et al., 1996). Σα πνμδβμφιεκα πνυκζα ηα θζπμζχιαηα πμο πνδζζιμπμζμφκηακ ζηζξ in vivo ιεθέηεξ ήηακ θζπμζχιαηα ζοκηζεέιεκα απυ μοδέηενα θζπίδζα υπςξ ζθζββμιοεθίκδ ή θςζθαηζδοθμπμθίκδ ιε ηδκ πανμοζία πμθδζηενυθδξ ή αηυιδ ηαζ ηδ πνήζδ ηάπμζςκ θμνηζζιέκςκ θζπζδίςκ (Gregoriadis G.,1988). Ζ πανμοζία ηδξ πμθδζηενυθδξ ελαζθάθζγε ηδ ζηαεενυηδηα ηςκ θζπμζςιάηςκ απέκακηζ ζηζξ πνςηεΐκεξ ημο πθάζιαημξ (Mayhew E. et al., 1979, Szoka F. Καζ Papahadjopoulos D., 1981), εκχ δ πανμοζία θμνηζζιέκςκ θζπζδίςκ ελαζθαθίγεζ ηδκ απμθοβή ζοζζςιάηςζδξ ηαζ ηδκ αφλδζδ ηδξ ζηακυηδηαξ εβηθςαζζιμφ. 26

43 2. ΦΡΗΗ ΛΙΠΟΨΜΑΣΨΝ Ψ ΤΣΗΜΑΣΑ ΣΟΦΕΤΗ ΥΑΡΜΑΚΨΝ Ε ΕΙΔΙΚΟ- Τ ΙΣΟΤΚΤΣΣΑΡΑ 2.1 ΣΡΟΠΟΙ ΑΛΛΗΛΕΠΙΔΡΑΗ ΛΙΠΟΨΜΑΣΨΝ ΜΕ ΚΤΣΣΑΡΑ. Σα θζπμζχιαηα ιπμνμφκ κα αθθδθεπζδνάζμοκ ιε ηφηηανα ιε πμθθμφξ ηνυπμοξ ηαζ ηεθζηυ απμηέθεζια είκαζ ηα θζπμζςιζηά ζοζηαηζηά κα πενάζμοκ ζηα ηφηηανα Δ Μ Δ Ξ Λ Δ Λ Β Π Α Μ Θ Ι Ζ Λ Δ Α Τ Ξ Π Α Δκδμιειανακζηή ιεηαθμνά ηςκ θζπζδζηχκ ζοζηαηζηχκ ηςκ θζπμζςιάηςκ ιπμνεί κα επζηεοπεεί ιε πμθφ ζηεκή πνμζέββζζδ ηςκ δφμ θζπζδζηχκ δζπθμζηζαάδςκ πςνίξ κα είκαζ απαναίηδηδ δ δζάννδλδ ηςκ θζπμζςιάηςκ ή νφειζζδ ηδξ ζηαεενυηδηαξ αοηχκ (εζηυκα 16). ηδκ πναβιαηζηυηδηα αοηή δ ιεηαθμνά (ζοκήεςξ ηαζ πνμξ ηζξ δφμ ηαηεοεφκζεζξ) ιπμνεί κα επζηεοπεεί ιε απυθοηδ δζαηήνδζδ ημο πενζεπμιέκμο, ζημ οδαηζηυ ηιήια, ηςκ θζπμζςιάηςκ. Εικόνα 16. Ενδομεμβρανικι μεταφορά λιποςωμικϊν ςυςτατικϊν ςτα κφτταρα. Ζ ακηαθθαβή ηςκ θςζθμθζπζδίςκ ιεηαλφ θζπμζςιάηςκ ηαζ ηοηηάνςκ πζζηεφεηαζ υηζ είκαζ πζεακυκ κα ζοιααίκεζ ιέζς πνςηεσκχκ ακηαθθαβήξ ηδξ ηοηηανζηήξ επζθάκεζαξ ηαζ αοηυ βζαηί ιυκμ ιενζηά θςζθμθζπίδζα έπμοκ ηδκ ζηακυηδηα ακηαθθαβήξ (PC ηαζ PE) ηαζ δ ιεηαθμνά ιεζχκεηαζ ιεηά απυ πνήζδ ηνορίκδξ (Sendra, A. et al 1979 ). Φεμνίγμκηα πανάβςβα ημο PE ζοκδεδειέκα ιέζς ηδξ αιζκμιάδαξ δεκ ιεηαθένμκηαζ εκχ αοηά πμο θένμοκ ηδ θεμνίγμοζα εκζςιαηςιέκδ ζηδκ αθοζίδα ακηαθθάζμκηαζ ιε εοημθία. 27

44 Πανυιμζεξ αθθδθεπζδνάζεζξ ζοιααίκμοκ ιεηαλφ θζπμζςιάηςκ ηαζ θζπμπνςηεσκχκ (ζδζαίηενα ιε ορδθήξ ποηκυηδηαξ θζπμπνςηεσκχκ) ηαζ ζε ιενζηέξ πενζπηχζεζξ μδδβμφκ ζηδκ μθζηή ηαηαζηνμθή ηςκ θζπμζςιάηςκ. Ο ααειυξ ζημκ μπμίμ ζοιααίκεζ δ δζάνδλδ ηςκ θζπμζςιάηςκ ελανηάηαζ απυ ηδκ ακαθμβία ηςκ θζπμπνςηεσκχκ ζηα θζπμζχιαηα. Καζ ημ ζφζηδια εεςνείηαζ ημνεζιέκμ ζε ορδθέξ ζοβηεκηνχζεζξ θζπμζςιάηςκ. ε παιδθέξ θζπζδζηέξ ζοβηεκηνχζεζξ, SUV θζπμζχιαηα απμηεθμφιεκα ιυκμ απυ θεηζείκδ αοβμφ (πςνίξ πμθδζηενυθδ), απμζοκηίεεκηαζ βνήβμνα ζημ πθάζια, in vivo ηαζ in vitro ηαζ ηα θζπζδζηά ζοζηαηζηά ακαηαηακέιμκηαζ ιεηαλφ ηςκ θζπμπνςηεσκχκ (Scherphof,G et al 1978). Ζ εκζςιάηςζδ πμθδζηενυθδξ ζηδκ θζπμζςιζηή ιειανάκδ πμο απμηεθείηαζ απμηθεζζηζηά απυ PC έπεζ ςξ απμηέθεζια ηδκ ιείςζδ ημο ααειμφ απμζφκεεζδξ ηςκ θζπμζςιάηςκ ηαζ SUV θζπμζχιαηα ζθζββμιοεθίκδξ πμο απμηεθμφκηαζ ηαζ απυ 30% mol πμθδζηενυθδ ή πενζζζυηενμ παναιέκμοκ ακέπαθα ιε απυθοηδ δζαηήνδζδ ημο οδαηζημφ πενζεπμιέκμο ημοξ. Απυ ηδκ άθθδ υιςξ πθεονά, βζα ιεβάθα θζπμζχιαηα, πμθοζηζααδζαηά ηαζ ιμκμζηζααδζαηά, δ ιεηαθμνά θςζθμθζπζδίςκ ζε θζπμπνςηεσκεξ είκαζ παιδθή, ακελάνηδηα απυ ημ πμζμζηυ ηδξ πμθδζηενυθδξ πμο πενζέπμοκ. Ζ πμθδζηενυθδ έπεζ ηδκ ζηακυηδηα κα ιεηαθένεηαζ πμθφ βνήβμνα ιεηαλφ ηςκ ιειανακχκ ιε ηέημζμ ηνυπμ έηζζ χζηε δ ιμνζαηή ηδξ ζοβηέκηνςζδ κα ελζζμννμπείηαζ ιεηαλφ ηςκ ιειανακχκ Α Ο Δ Κ Δ Σ Η Δ Π Ω Ρ Ζ Λ Δ Ρ Ω Δ Ο Α Τ Ζ Ρ. Ζ απεθεοεένςζδ ημο οδαηζημφ πενζεπμιέκμο ηςκ θζπμζςιάηςκ ζοιααίκεζ ιε έκα ιενζηχξ βκςζηυ ιδπακζζιυ ηαηά ημκ μπμίμ δ επαθή ιε ηα ηφηηανα πνμηαθεί αφλδζδ ηδξ δζαπεναηυηδηαξ ηδξ θζπμζςιζηήξ ιειανάκδξ. Αοηυ μδδβεί ζηδκ απεθεοεένςζδ ηςκ οδαημδζαθοηχκ ζοζηαηζηχκ ζε ορδθέξ ζοβηεκηνχζεζξ ημκηά ζηδκ ηοηηανζηή ιειανάκδ, ιέζς ηδξ μπμίαξ ηάης απυ μνζζιέκεξ ζοκεήηεξ ιπμνμφκ κα πενάζμοκ ζημ εζςηενζηυ (εζηυκα 17). Ζ απεθεοεένςζδ ηςκ δζαθοιέκςκ μοζζχκ απυ ηα θζπμζχιαηα πμο πνμάβεηαζ απυ ηδκ επαθή ημοξ ιε ηα ηφηηανα έπεζ δεζπεεί υηζ αολάκεηαζ ιε ηδκ εκζςιάηςζδ πμθδζηενυθδξ ζηδ θζπζδζηή ζηζαάδα ηςκ θζπμζςιάηςκ (Van Reswoude,A 1981). Εικόνα 17. Απελευκζρωςθ μζςω επαφισ 28

45 Οζ παναπάκς δφμ ηνυπμζ πνμάβμοκ ηδ ιεηαθμνά ζοζηαηζηχκ ζε ζοβηεηνζιέκα ηφηηανα πςνίξ ηδκ δοκαηυηδηα εζζαβςβήξ μθυηθδνμο ημο θζπμζχιαημξ ηαζ είκαζ πνήζζιμζ βζα ιεηαθμνά δζαθοιέκςκ μοζζχκ ζε ηφηηανα ιε έθθεζρδ θαβμηηοηανζηήξ ζηακυηδηαξ Π Ρ Ο Ρ Ο Υ Η Η Ζ πνμζνυθδζδ ηςκ θζπμζςιάηςκ ζηδκ ηοηηανζηή επζθάκεζα ιπμνεί κα ζοιαεί ιε ιζηνή ή ακφπανηηδ εζςηενίηεοζδ ηςκ οδαηζηχκ ή ηαζ ηςκ θζπζδζηχκ ζοζηαηζηχκ (εζηυκα 19). Μπμνεί κα ζοιαεί είηε ςξ απμηέθεζια θοζζηχκ δοκάιεςκ έθλδξ ή ζακ απμηέθεζια πνυζδεζδξ ιέζς ελεζδζηεοιέκςκ οπμδμπέςκ ζε πνμζδέηεξ ηδξ θζπμζςιζηήξ ζηζαάδα. Πζζηεφεηαζ υηζ δ θοζζηή πνμζνυθδζδ ηςκ θζπμζςιάηςκ ίζςξ κα ζοιααίκεζ ιέζς δέζιεοζδξ ζε ζοβηεηνζιέκεξ ιειανακζηέξ πνςηεΐκεξ ηςκ ηοηηάνςκ (Pagano, R.E 1977). H πνυζθδρδ θζπμζςιάηςκ είκαζ ορδθυηενδ ζηδκ εενιμηναζία ιεηάπηςζδξ ή ηαζ ηάης απυ ηδ εενιμηναζία ιεηάπηςζδξ ηδξ θζπμζςιζηήξ ιειανάκδξ πζεακυκ επεζδή μζ εέζεζξ πνυζδεζδξ είκαζ ζδιεία ηδξ ιειανάκδξ πμο είκαζ πζμ ζηαεενά ζε παιδθέξ εενιμηναζίεξ. Εικόνα 19. α. προςρόφθςθ των λιποςωμάτων. β. ςφντθξθ των λιποςωμάτων με τθν κυτταρικι μεμβράνθ Ζ πνμζνυθδζδ είκαζ πνμαπαζημφιεκμ βζα ηδκ απμννυθδζδ ηςκ θζπμζςιάηςκ απυ ηα ηφηηανα άθθα ημ πμζμζ πανάβμκηεξ ηαεμνίγμοκ ημ ακ εα αημθμοεήζεζ πζκμηοηηάνςζδ ή θαβμηοηηάνςζδ δεκ είκαζ αηυια βκςζημί. ε ιεθέηεξ ημο Leserman et al (Νature 1981) έπεζ δεζπεεί υηζ πνμζηυθθδζδ ηςκ θζπμζςιάηςκ ζηδκ ηοηηανζηή ιειανάκδ ιπμνεί κα ζοιαεί ιέζς ζοβηεηνζιέκςκ πνςηεσκχκ ηδξ ηοηηανζηή επζθάκεζαξ. 29

46 Τ Ν Σ Η Ξ Η Κμκηζκή πνμζέββζζδ ηςκ θζπμζςιάηςκ ηαζ ηδξ ηοηηανζηήξ ιειανάκδξ ιπμνεί κα μδδβήζεζ ζε ζφκηδλδ ηςκ δφμ, μδδβχκηαξ ζε μθζηή ακαηαηακμιή ηςκ θζπμζςιζηχκ ιε ηα ιειανακζηά θζπίδζα ημο ηοηηάνμο ηαζ ηδκ απεθεοεένςζδ ημο θζπμζςιζημφ πενζεπμιέκμο ζημ ηοηηανυπθαζια (εζηυκα 19 α). ε in vitro πεζνάιαηα δ ζφκηδλδ ιπμνεί κα ζοιαεί ηαπφηαηα ιε εκζςιάηςζδ παναβυκηςκ ζφκηδλδξ υπςξ θοζμθεηζείκδ, PS ηαζ απμννοπακηζηά. ηδκ ιειανάκδ, υιςξ οπάνπεζ ημ εκδεπυιεκμ ηα ζοζηαηζηά αοηά κα είκαζ ημλζηά βζα ηα ηφηηανα. Μέπνζ ζήιενα δ πζμ απμηεθεζιαηζηή ιέεμδμξ βζα in vitro ιεηαθμνά θζπμζςιζηχκ ζοζηαηζηχκ ζε ηφηηανα ιε ζφκηδλδ είκαζ δ πνήζδ πνςηεσκχκ ζφκηδλδξ ημο ζμφ Sendai ιε ηδκ μπμία υπζ ιυκμ οδαημδζαθοηά ζοζηαηζηά ιπμνμφκ κα πενάζμοκ ζημ ηοηηανυπθαζια αθθά ηαζ θεζημονβζηέξ ιειανακζηέξ πνςηεΐκεξ ιπμνμφκ κα εζζαπεμφκ ζηδκ πθαζιαηζηή ιειανάκδ ηςκ ηοηηάνςκ. Άθθεξ ιέεμδμζ πμο ζηδνίγμκηαζ ζηδκ ζφκηδλδ πενζθαιαάκμοκ ηδκ εκζςιάηςζδ PE ή εθασημφ μλέμξ ή εεηζηά θμνηζζιέκςκ θζπζδίςκ (Felgner,P.L., et.al., 1987). In vivo υιςξ, δ δζαδζηαζία ηδξ ζφκηδλδξ ςξ ιέζμ βζα ηοηηανζηή πνυζθδρδ θζπμζςιάηςκ ένπεηαζ δεφηενδ, ιεηά ηδκ θαβμηοηηάνςζδ. ηζξ πενζζζυηενεξ πενζπηχζεζξ ηα θζπμζχιαηα α- πμιαηνφκμκηαζ απυ ημ αίια απυ θαβμηφηηανα ιε απμηέθεζια δ ζφκηδλδ κα ζοιααίκεζ ζε ιζηνυηενμ πμζμζηυ. Πμζμ εοκμσηέξ πενζμπέξ βζα ζφκηδλδ είκαζ πενζμπέξ υπμο δ δνάζδ ημο RES είκαζ ιεζςιέκδ υπςξ ζηα ιάηζα ζημ εβηεθαθμκςηζαίμ οβνυ ή ζε παεδηζηή πνμζνυθδζδ ζηα ημζπχιαηα ηςκ ηνζπμεζδχκ Τ Α Γ Ξ Ι Σ Α Π Ω Ρ Ζ / Δ Μ Δ Ξ Ι Σ Α Π Ω Ρ Ζ Σα ηφηηανα ιε θαβμηοηηανζηή δναζηδνζυηδηα πνμζθαιαάκμοκ ηα ηφηηανα ζηα εκδμζχιαηα, οπμηοηηανζηά ηοζηίδζα πμο ζπδιαηίγμκηαζ ιε ακαδίπθςζδ ηδξ πθαζιαηζηήξ ιειανάκδξ, ιε ph Tα εκδμζχιαηα ζηδ ζοκέπεζα ζοκηήημκηαζ ιε ηα θοζμζχιαηα πνμξ ηδκ δδιζμονβία δεοηενεουκηςκ θοζμζςιάηςκ υπμο δ ηοηηανζηή πέρδ θαιαάκεζ πχνα ζε έκα πενζαάθθμκ ιε ph πενίπμο 4.5. (εζηυκα 20) Σα θοζμζςιζηά έκγοια δζαννοβκφμοκ ηα θοζμζχιαηα, ηα θςζθμθζπίδζα οδνμθφμκηαζ ζε θζπανά μλέα, ηα μπμία ιπμνμφκ κα ακαηοηθςεμφκ ηαζ κα επακαεκζςιαηςεμφκ ζηα ηφηηανα. Ζ ιμίνα ηςκ θζπμζςιζηχκ θζπανχκ μλέςκ ιπμνεί κα ζπκδεεηδεεί ιε ηδ πνήζδ ζδιαζιέκμο DMPC, θυβς ημο υηζ δ ιζηνή αθοζίδα ημο ιονζζηζημφ μλέμξ ιπμνεί εφημθα κα δζαηνζεεί απυ ηζξ ιαηνφηενεξ αθοζίδεξ θζπανχκ μλέςκ ημο λεκζζηή. Ζ πμθδζηενυθδ ιεηααμθίγεηαζ ζε πμθζηά άθαηα. Μενζηά ακζμκζηά θζπίδζα ηαζ αζμδναζηζηέξ μοζίεξ ιπμνμφκ κα ακαζηείθμοκ ηδκ θοζμζςιαηζηή πέρδ ηαζ πνμηαθυοκ ιζα δζαηαναπή ρεοδμαπμεήηεοζδξ ζηα θοζμζχιαηα. 30

47 Εικόνα 20. Πρόςλθψθ των λιποςωμάτων με φαγοκυττάρωςθ. Καηά ηδ δζάνηεζα ηδξ δζάζπαζδξ ηςκ θζπμζςιάηςκ ζηα θοζμζχιαηα ημ πενζεπυιεκμ ημο οδαηζημφ ηιήιαημξ ηςκ θζπμζςιάηςκ απεθεοεενχκεηαζ ηαζ ιεηά απυ αοηυ ιπμνεί είηε κα παναιέκμοκ ζηα θοζμζχιαηα ιέπνζ ηδκ ελςηοηηάνςζδ, ζδζαίηενα ακ είκαζ ανηεηά θμνηζζιέκα ζε παιδθυ ph, είηε κα πενάζμοκ ανβά έλς απυ ηα θοζμζχιαηα ζημ οπυθμζπμ ηφηηανμ. Δπζπνυζεεηα ηδξ θαβμηοηηάνςζδξ ηα θζπμζχιαηα ιπμνμφκ κα πνμζθδθεμφκ ιε εκδμηοηηάνςζδ ιέζς οπμδμπέα. Δάκ ηα θζπμζχιαηα είκαζ ηαθοιιέκα ιε παιδθήξ ποηκυηδηαξ θζπμπνςηεΐκεξ (LDL) ή ηνακζθεννίκδ, εα πνμζδεεμφκ ζηα ηφηηανα ιέζς οπμδμπέςκ επζθάκεζαξ βζα ημοξ ζοβηεηνζιέκμοξ πνμζδέηεξ ηαζ ζηδκ ζοκέπεζα εα εζςηενζηεοεμφκ ιέζς ηαθοιιέκςκ ηοζηζδίςκ ιε αηυθμοεδ απμζημδυιδζδ ημο πνμζδέηδ ή ακαηφηθςζή ημο. Σα θζπμζχιαηα εα μδδβδεμφκ ζηα θοζμζχιαηα ηαζ ίζςξ ηαζ ζε άθθα μνβακίδζα (Golgi). 2.2 ΣΡΟΠΟΙ ΠΡΟΔΕΗ ΑΝΣΙΨΜΑΣΨΝ Η ΑΛΛΨΝ ΜΟΡΙΨΝ, ΣΗΝ ΕΠΙΥΑΝΕΙΑ ΣΨΝ ΛΙΠΟΨΜΑΣΨΝ, ΠΟΤ ΠΡΟΑΓΟΤΝ ΣΗΝ ΕΙΔΙΚΗ ΣΟΦΕΤΗ- ΕΥΑΡΜΟΓΕ Γζα εκενβή ζηυπεοζδ έπμοκ δδιζμονβδεεί θζπμζχιαηα πμο θένμοκ πνμζδεδειέκα ακηζζχιαηα, οδνμβμκάκεναηεξ ή άθθμοξ πνμζδέηεξ. Γφμ ιέεμδμζ οπάνπμοκ βζα πνυζδεζδ ιμνίςκ ζηδκ επζθάκεζα ηςκ θζπμζςιάηςκ, μιμζμπμθζηή ηαζ ιδ μιμζμπμθζηή. Ζ μιμζμπμθζηή πνυζδεζδ ιπμνεί κα επζηεοπεεί ιε δζάθμνεξ πδιζηέξ ακηζδνάζεζξ μδδβχκηαξ ζε πζμ ζηαεενυ δεζιυ ιεηαλφ ημο ιμνίμο ηαζ ημο θζπμζχιαημξ. ηδκ πενίπηςζδ ηδξ ιδ μιμζμπμθζηήξ ζφκδεζδξ, μ πνμζδέηδξ δεζιεφεηαζ ζημ θζπυζςια ιέζς δθεηηνμζηαηζηχκ ή οδνυθμαςκ αθθδθεπζδνάζεςκ, υπμο ηαζ ζε αοηή ηδκ ηαηδβμνία ανηεηέξ δζαθμνεηζηέξ πνμζεββίζεζξ έπμοκ ακαπηοπεεί. 31

48 Ξ Λ Ξ Θ Ξ Ο Ξ Κ Θ Ι Ζ Δ Δ Ρ Λ Δ Σ Ρ Ζ Ω Μ Ο Π Ξ Ρ Δ Δ Ω Μ Ρ Ζ Μ Δ Ο Θ Τ Α- Μ Δ Θ Α Ω Μ Κ Θ Ο Ξ Ρ Ω Λ Α Ω Μ Γεκζηά, μζ πνμζδέηεξ δεζιεφμκηαζ ζηδκ επζθάκεζα ηςκ θζπμζςιάηςκ ιέζς οδνυθμαςκ αβηονχκ πμο θένμοκ θεζημονβζηέξ μιάδεξ. Μία απυ ηζξ πνχηεξ πνμζπάεεζεξ επζηεφπεδηε πνδζζιμπμζχκηαξ ιζα ιαηνζά αθοζίδα θζπανμφ μλέμξ, υπςξ ημο παθιζηζημφ μλέμξ, ημ μπμίμ ήηακ μιμζμπμθζηά πνμζδεδειέκμ ζε έκα ακηίζςια. Ανηεημί ηφπμζ ακηζζςιάηςκ έπμοκ ζογεοπεεί ζε θζπυζςια πνδζζιμπμζχκηαξ παθιζηζηυ μλφ, αθθά δ ηεπκζηή ηδξ αφλδζδξ ηδξ οδνμθμαζηυηδηαξ ηεπκδηά είκαζ δ ίδζα. Γεκζηά, μ πνμζδέηδξ δεζιεφεηαζ ζημ παθιζηζηυ μλφ πνδζζιμπμζχκηαξ έκακ εκενβμπμζδιέκμ εζηένα, ημκ δθεηηνζιζδεζηένα ημο θζπανμφ μλέμξ ημ μπμίμ αθθδθεπζδνά ιε πνςηανπζηέξ αιίκεξ ημο πνμζδέηδ πνμξ ζπδιαηζζιυ ζηαεενμφ αιζδζημφ δεζιμφ ( Hughes BJ, et al.,1989, Huang A. et al.,1980, Harsch M. et al.,1981, Shen DF,et al.,1982, Carpenter- Green S. et al.,1983 ). Ζ ακηίδναζδ δέζιεοζδξ ιπμνεί κα εθεβπεεί χζηε κα επζηεοπεεί μ επζεοιδηυξ ααειυξ οδνμθμαζηυηδηαξ. Ο ηνμπμζπμζδιέκμξ πνμζδέηδξ είκαζ είηε εκζςιαηςιέκμξ ζηδκ θζπμζςιζηή ιειανάκδ ηαηά ημκ ζπδιαηζζιυ ηςκ θζπμζςιάηςκ ή πνμζεέηεηαζ ιεηά άιεζα ζηα πνμζπδιαηζζιέκα θζπμζχιαηα (Harsch M,et al.,1981, Torchilin VP et al.,1980). Αοηή δ πνμζέββζζδ έπεζ πνδζζιμπμζδεεί επζηοπχξ ιε ακηζζχιαηα ςξ πνμζδέηεξ (Hughes BJ, et al.,1989, Huang A et al.,1980, Harsch M,et al.,1981, Shen DF, et al.,1982,). Σα απμηεθέζιαηα έπμοκ απμδείλεζ υηζ ηαηά 50% έςξ ηαζ 100% ημο ζογεοβιέκμο ακηζζχιαημξ εηηίεεηαζ ζηδκ ελςηενζηή ιειανάκδ ημο θζπμζχιαημξ (Harsch M, et al.,1981, Shen DF, et al.,1982). In vitro ιεθέηεξ έπμοκ δείλεζ υηζ ημ εκζςιαηςιέκμ ακηίζςια δζαηδνεί ηζξ ζηακυηδηεξ πνυζδεζδξ ζε ηφηηανα ζηυπμοξ ηαζ υηζ δ πνυζδεζδ ημο ακηζζχιαημξ ζηα θζπμζχιαηα δεκ επδνεάγεζ ηδκ θεζημονβζηυηδηά ημο. Δπζπθέμκ in vitro ηαζ in vivo ζοβηνίζεζξ ιε απθά θζπμζχιαηα ή εθεφεενμ ακηίζςια έδεζλακ ηδκ οπενμπή ηδξ δναζηζηυηδηαξ ηαζ ζηυπεοζδξ ηςκ θζπμζςιάηςκ πμο θένμοκ ακηίζςια ζοκδεδειέκμ (Hughes BJ,et al.,1989, Huang A. et al.,1980, Harsch M, et al.,1981,). Αοηή δ ιέεμδμξ επεηηάεδηε ηαζ ζηζξ θεηηίκεξ ηαζ πζμ εζδζηά ζηδκ wheat germagglutinin (WGA) (Carpenter-Green S., et al.,1983 ). Ζ WGA πνμζδέεδηε ζημ παθιζηζηυ μλφ δίκμκηαξ παθιζηζηυ μλφ-wga ημ μπμίμ εκζςιαηχεδηε ζε θζπμζχιαηα ηαηά ηδκ παναζηεοή ημοξ. Ζ δναζηζηυηδηα ηδξ θεηηίκδξ πμο πνμζδέεδηε ζημ θζπυζςια δζαηδνήεδηε ηαζ ηα απμηεθέζιαηα έδεζπκακ υηζ μζ θεηηίκεξ ιπμνμφκ κα πνδζζιμπμζδεμφκ βζα ιεηαθμνά θανιάηςκ ζε ζημπεοιέκα ηφηηανα. Φςζθμθζπίδζα υπςξ δ θςζθαηζδοθμαζεακμθαιίκδ (PE) ηαζ ημ θςζθαηζδοθμσκμζζηυθδ (PI) έπμοκ επίζδξ πνδζζιμπμζδεεί ςξ άβηονεξ βζα ηδκ πνυζδεζδ άθθςκ ιμνίςκ/πνμζδεηχκ (Weissig V, et al.,1986, Torchilin VP, et al.,1982). Δδχ λακά, οπάνπμοκ δφμ πνμζεββίζεζξ βζα ηδκ εκζςιάηςζδ ημο πνμζδέηδ ζηδκ θζπμζςιζηή ιειανάκδ. Ζ πνχηδ ζοιπενζθαιαάκεζ ηδκ πνυζδεζδ ημο πνμζδέηδ ζημ ιυνζμ/άβηονα ηαζ ζηδκ ζοκέπεζα ακάιζλδ ιε ηα οπυθμζπα ζοζηαηζηά ημο θζπμζχιαημξ. ηδκ δεφηενδ πενίπηςζδ, ημ ιυνζμ/άβηονα ανίζηεηαζ ήδδ εκζςιαηςιέκμ ζηδκ θζπζδζηή δζπθμζηζαάδα ηαζ δ ακηίδναζδ πνυζδεζδξ ζοιααίκεζ ζηδκ ιειανάκδ ηςκ πνμζπδιαηζζιέκςκ θζπμζςιάηςκ. Κάης απυ αοηέξ ηζξ ζοκεήηεξ, είκαζ απαναίηδημ ηα ακηζδνχκηα πμο επζθέβμκηαζ κα ιδκ είκαζ αθααενά έηζζ χζηε κα απμθεοπεμφκ ιδ ακαζηνέρζιεξ αθθα- 32

49 βέξ ζηδκ δμιή ηςκ θζπμζςιάηςκ ή ηαηαζηνμθή ζημ δναζηζηυ ιυνζμ πμο ιεηαθένεηαζ ιε ηα θζπμζχιαηα. Μεηαλφ ηςκ οδνυθμαςκ ιμνίςκ πμο θεζημονβμφκ ςξ άβηονεξ ημ PE πνδζζιμπμζείηαζ ανηεηά ζοπκά ηαεχξ ιπμνεί εφημθα κα ηνμπμπμζδεεί πνμζθένμκηαξ θεζημονβζηέξ μιάδεξ. Κάεε μιμζμπμθζηή ακηίδναζδ πμο ιπμνεί κα πνδζζιμπμζδεεί βζα ηδκ δέζιεοζδ ηςκ πνμζδεηχκ ζε θςζθμθζπζδζηέξ άβηονεξ εα πενζβναθεί ακαθοηζηά παναηάης. Οζ πνμζδέηεξ πνέπεζ επίζδξ κα θένμοκ θεζημονβζηέξ μιάδεξ ζηακέξ κα ακηζδνμφκ ιε ηα ιυνζα/άβηονεξ. Μενζημί πνμζδέηεξ πενζέπμοκ έκα ή δφμ δζαθμνεηζηέξ θεζημονβζηέξ μιάδεξ (πνςημηαβείξ αιίκεξ ηαζ εεζμθμιάδεξ ηαζ ζοκεπχξ δεκ απαζηείηαζ πνμζεήηδ ηέημζςκ μιάδςκ. Μενζημί υιςξ πνμζδέηεξ δεκ δζαεέημοκ επζεοιδηέξ εζδζηέξ θεζημονβζηέξ μιάδεξ, υπςξ εεζυθεξ, ηαζ βζα ηα μπμία έπμοκ ακαπηοπεεί ανηεηέξ ιέεμδμζ πμο επζηνέπμοκ ηδκ παναβςβή ηέημζςκ μιάδςκ. Οζ πζμ βκςζηέξ μιμζμπμθζηέξ ακηζδνάζεζξ πμο πνδζζιμπμζμφκηαζ βζα ηδκ πνυζδεζδ ζηδκ επζθάκεζα ηςκ θζπμζςιάηςκ ιε ηα πθεμκεηηήιαηα ηαζ ηα ιεζμκεηηήιαηα πανμοζζάγμκηαζ παναηάης (εζηυκα 21) Τ Ζ Ε Τ Ξ Η Σ Ω Ν Π Ρ Ο Δ Ε Σ Ω Ν Σ Η Ν Ε Π Ι Φ Α Ν Ε Ι Α Μ Ε Χ Ρ Η Η Θ Ε Ι Ο Α Ι Θ Ε Ρ Ι Κ Ο Τ Δ Ε Μ Ο Τ. Ζ ακηίδναζδ ιεηαλφ ηδξ εεζυθδξ ηαζ ημο ιδθεσιζδίμο είκαζ ιζα απμδμηζηή ακηίδναζδ πμο δίκεζ ζηαεενυ δεζιυ εεζμαζεένα (εζηυκα 21). Θεζμθμιάδεξ ανίζημκηαζ εββεκχξ ζε ιενζηέξ πνςηεΐκεξ, αθθά ζε ιενζηέξ πενζπηχζεζξ, απμοζζάγμοκ ή ανίζημκηαζ ζε ακεπανηείξ πμζυηδηεξ. Γζα αοηυ ημ θυβμ πνέπεζ είηε κα πνμζηεεμφκ ιέζς πμζηίθςκ εηενμδζδναζηζηχκ παναβυκηςκ ζηαονςηήξ δζαζφκδεζδξ ή δδιζμονβμφκηαζ ιεζχκμκηαξ ημοξ ήδδ οπάνπμκηεξ δζζμοθθζδζημφξ δεζιμφξ (Crosasso P, et al.,1997, Derksen JT, et al.,1985). Γζζμοθθζδζημί δεζιμί οπάνπμοκ ζημ ηθάζια F(ab ) 2 ηςκ ακηζζςιάηςκ. Ακέπαθα IgG δεκ πενζέπμοκ εθεφεενδ εεζμθμιάδα ηαζ βζ αοηυ θεζημονβζημί πανάβμκηεξ ζηαονςηήξ δζαζφκδεζδξ πνέπεζ κα πνμζηεεμφκ. Ζ ακηίδναζδ πνυζδεζδξ ιπμνεί κα πανμοζζάγεζ ιζα πζεακυηδηα ηαηαζηνμθήξ ζηδκ εέζδ πνυζδεζδξ ηαεχξ μ ααειυξ ηδξ ακηίδναζδξ ηαζ δ εέζδ οπμηαηάζηαζδξ δεκ εθέβπμκηαζ εφημθα. Σα ηθάζιαηα Fab ιπμνμφκ κα πνδζζιμπμζδεμφκ άιεζα ηαεχξ ηάεε ηθάζια έπεζ ιζα εεζμθμιάδα δζαεέζζιδ. Σμ N-hydroxysuccinimidyl-3-(2-pyridyldithio) propionate (SPDP) ηαζ ημ N-succinimidyl-S-acetylthioacetate (SATA) πνδζζιμπμζμφκηαζ ςξ πανάβμκηεξ ζηαονςηήξ δζαζφκδεζδξ (Crosasso P, et al.,1997, Derksen JT, et al.,1985 ). Καζ ηα δφμ πανέπμοκ έκα δναζηζηυ ηαηάθμζπμ αιίκδξ βζα ηδκ ζφγεολδ ιε ημκ πνμζδέηδ. Καζ ζηζξ δφμ πενζπηχζεζξ, μζ εεζμθμιάδεξ δεκ είκαζ άιεζα δζαεέζζιεξ ηαζ ιζα ηνμπμπμίδζδ αοηχκ ηςκ ιμκάδςκ είκαζ απαναίηδηδ πνζκ ηδκ ακηίδναζδ ιε ηζξ μιάδεξ ιδθεσιζδίμο πμο εκζςιαηχκμκηαζ ιέζς θζπζδίςκ ζηα θζπμζχιαηα. ηδκ πενίπηςζδ (Derksen JT, et al.,1988) ημο SPDP, ημ dithiothreitol (DTT) ή έκαξ εκαθθαη- 33

50 ηζηυξ πανάβμκηαξ πνδζζιμπμζείηαζ βζα ηδκ ιείςζδ ηςκ δζζμοθθζδζηχκ δεζιχκ ζε εεζμθμιάδεξ (Πίκαηαξ 1). Πανυθα ηαφηα ημ DTT πανμοζζάγεζ ιζα ζδιακηζηή αζοιααηυηδηα ηαεχξ ιπμνεί επίζδξ κα δνάζεζ ιε ιδθεσιζδμιάδεξ ηαζ έηζζ ακηαβςκίγεηαζ ημκ δεζιυ ιε εεζυθδ. Γζ αοηυ ημ DTT πνέπεζ κα αθαζνεεεί μθμηθδνςηζηά πνζκ ηδκ ακηίδναζδ πνυζδεζδξ ηδξ εεζυθδξ ημο πνμζδέηδ ζηδκ επζθάκεζα ηςκ θζπμζςιάηςκ πμο θένμοκ ιδθεζιζδμιάδα. Αοηυ ημ πνυαθδια ιπμνεί κα επζθοεεί ιε ηδ πνήζδ ημο SATA, ημ μπμίμ πανέπεζ ιζα πνμζηαηεοιέκδ εεζμθμιάδα πμο βίκεηαζ δζαεέζζιδ ιε απμαηεηοθίςζδ ιε οδνμλοθαιίκδ. Ζ ηνμπμπμίδζδ βίκεηαζ ηάης απυ ζπεηζηά δπζυηενεξ ζοκεήηεξ ηαζ πςνίξ πεναζηένς αθθδθεπζδνάζεζξ ηαεχξ δ οδνμλοθαιίκδ δεκ αθθδθεπζδνά ιε μιάδεξ ιδθεσιζδίμο. Πίνακασ 1. Γνωςτοί παράγοντεσ ςταυρωτισ διαςφνδεςθσ. Πίνακασ 2. Ομοιοπολικoί τρόποι δζςμευςθσ αντιςωμάτων ςε λιποςϊματα 34

51 Πζμ ζοπκά ημ N-(4- (p-maleimidophenyl) butyryl) phophatidylethanolamine (MPB-PE) πνδζζιμπμζείηαζ ςξ άβηονα, ημ μπμίμ ακαιζβκφεηαζ ιε ηα οπυθμζπα ζοζηαηζηά ηςκ θζπμζςιάηςκ (Crosasso P, et al.,1997, Derksen JT, et al.,1985, Nassander UK, et al.,1995, Martin FJ, et al., 1982, Derksen JT, et al., 1988, Vingerhoeds MH, et al., 1996). Σμ ηιήια ιεηαλφ ηδξ ηεθαθήξ ημο θζπζδίμο ηαζ ημο ιαθεζιζδίμο αολάκεζ ηδκ έηεεζδ ημο δεφηενμο ζηζξ εεζμθμιάδεξ. Απυ ηδ ζηζβιή πμο μζ μιάδεξ ιαθεσιζδίμο έπμοκ πνμζηεεεί ζηδκ επζθάκεζα, μ πνμζδέηδξ πμο θένεζ εεζυθεξ ιπμνεί εφημθα κα πνμζδεεεί ζηα θζπμζχιαηα ιε απθή πνμζεήηδ ημο (Derksen JT, et al.,1985, Martin FJ,et al.,1982, Park JW, et al.,1995 ). Ο Nassander et al. (Nassander UK, et al., 1995) πνδζζιμπμίδζε Fab ηθάζιαηα ημο OV-TL3 (monoclonal antiovarian carcinoma IgG) πμο θένεζ εθεφεενεξ εεζμθμιάδεξ βζα ηδ δέζιεοζδ ζε ιδθεζιζδζμ-pe. Tα ακμζμθζπμζχιαηα πμο πνμέηορακ έδεζλακ ζηακυηδηα εζδζηήξ δέζιεοζδξ ζηα OVCAR-4 ηφηηανα ζηυπμοξ in vitro ηαζ in vivo, αθθά δεκ παναηδνήεδηε εζςηενίηεοζδ ηςκ ακμζμθζπμζςιάηςκ απυ ηα ηανηζκζηά ηφηηανα ζηυπμοξ. Ζ απμοζία εζςηενίηεοζδξ μθεζθυηακ πζεακυκ ζηδκ επζθμβή ημο ζοβηεηνζιέκμο πνμζδέηδ πμο πνμθακχξ δεκ πνμάβεζ ηδκ εζςηενίηεοζδ. Πανυθμ ημ ανκδηζηυ απμηέθεζια, απμδείπεδηε ζηδκ ίδζα ιεθέηδ υηζ δ ηάθορδ ηςκ θζπμζςιάηςκ ιε Fab ηθάζιαηα πνδζζιμπμζχκηαξ ιαθεζιίδζμηνμπμπμζδιέκμ PE είκαζ εθζηηή ηαζ υηζ ηα ακηζζχιαηα δζαηδνμφκ ηδκ ζηακυηδηα εζδζηήξ δέζιεοζδξ βζα ηα ακηζβυκα. Ο Park ηαζ ζοκενβάηεξ ημο (Park JW, et al.,1995 ) απέδεζλε υηζ δ εζςηενίηεοζδ ακμζμθζπμζςιάηςκ πμο θένμοκ έκα άθθμ ακηίζςια, anti-p185her2, είκαζ πζεακή ηαζ υηζ δ εζςηενίηεοζδ μθείθεηαζ ζηδκ εζδζηυηδηα ημο ακηζζχιαημξ πμο θένεζ ημ θζπυζςια, ηαεχξ control θζπμζχιαηα πμο δεκ θένμοκ ημ Fab ηθάζια δε έδεζλακ εζςηενίηεοζδ απυ ηα ηφηηανα SK-BR-3 cells. 35

52 Εικόνα 21. Διαφορετικζσ μζκοδοι δζςμευςθσ. Αντίδραςθ μεταξφ maleimide και κειολομάδων (Α), ςχθματιςμόσ διςουλφιδικοφ δεςμοφ (Β), αντίδραςθ μεταξφ καρβοξυλικοφ οξζοσ και πρωταρχικισ αμινομάδασ (C), αντίδραςθ μεταξφ υδραηιδίου και αλδεϋδομάδασ (D), ςταυρωτι ςφνδεςθ μεταξφ πρωταρχικισ αμίνθσ (Ε). Δπζπθέμκ, ηα ακμζμθζπμζχιαηα θαίκεηαζ κα ειθακίγμοκ ιεβάθδ ζηακυηδηα ακαζημθήξ ημο πμθθαπθαζζαζιμφ, πμθφ ιεβαθφηενδ απυ αοηή πμο επζδεζηκφμοκ ηα εθεφεενα ιμκμηθςκζηά ακηζζχιαηα, απμδεζηκφμκηαξ υηζ αοημφ ημο είδμοξ ηα θζπμζχιαηα είκαζ ηαηάθθδθα ςξ θμνείξ εεναπεοηζηχκ παναβυκηςκ βζα ηδ εεναπεία ακενχπζκςκ ηανηίκςκ πμο ααζίγμκηαζ ζηδκ οπενέηθναζδ ημο p185her2. Μζα άθθδ εκδζαθένμοζα ιεθέηδ επζαεααίςζε ηδκ ζηακυηδηα πνυζδεζδξ in vitro ηαζ in vivo ζε ακηζζχιαηα ιε θζπμζχιαηα ιέζς εεζμαζεενζημφ δεζιμφ (Crosasso P, et al.,1997). ε αοηή ηδκ πενίπηςζδ, επζθέπεδηακ AR-3 ιμκμηθςκζηά ακηζζχιαηα πμο ακαβκςνίγμοκ ημ ακηζβυκμ ημο ακενχπζκμο ηανηζκχιαημξ ημο εκηένμο. ε ζφβηνζζδ πάκηα ιε ηδκ εθεφεενδ αζμδναζηζηή μοζία, ηα θζπμζχιαηα πμο έθενακ ακηίζςια έδεζλακ κα θεζημονβμφκ ζδζαίηενα απμηεθεζιαηζηά ςξ ακηζηανηζκζημί πανάβμκηεξ ηαζ κα επζδεζηκφμοκ ιζηνυηενδ ζοζηδιζηή ημλζηυηδηα. 36

53 Εικόνα 22. Αντίδραςθ μεταξφ πρωταταγοφσ αμίνθσ και succimidyl εςτζρα του SPDP(Α), διάςπαςθ του διςουλφιδικοφ δεςμοφ από το DTT προσ ςχθματιςμό ελεφκερων κειολομάδων (Β), και αντίδραςθ με κειολομάδεσ (C). Ζ ηεπκμθμβία ηςκ ακμζμθζπμζςιάηςκ ιπμνεί κα ζοκδοαζηεί ιε ηδκ ηεπκμθμβία ζηενζηά ζηαεενμπμζδιέκςκ θζπμζςιάηςκ έηζζ χζηε κα επζηεοπεεί δ παναβςβή θζπμζςιάηςκ ζηακχκ κα παναιέκμοκ επί ιαηνυκ ζηδκ ηοηθμθμνία ηαζ ζηακχκ κα ζημπεφμοκ εζδζηά ζε ζοβηεηνζιέκμοξ ζζημφξ/ηφηηανα. Τπάνπμοκ δφμ ηνυπμζ κα παναζηεοαζημφκ αοημφ ημο είδμοξ ηα θζπμζχιαηα (Η) ιε δέζιεοζδ ηςκ ακηζζςιάηςκ πανάθθδθα ιε δέζιεοζδ ημο PEG ή (ii) ιε δέζιεοζδ ηςκ ακηζζςιάηςκ ζημ άηνμ ηδξ PEG αθοζίδαξ (Park JW, et al.,1995, Park JW. et al.,1997, Mercadal M, et al.,1999, ). Καζ βζα ηζξ δφμ πνμζεββίζεζξ ημ PEG εκζςιαηχκεηαζ ζηδκ δζπθμζηζαάδα ιέζς ιζαξ άβηοναξ υπςξ ημ distearoyl phosphatidylethanolamine (DSPE) ηαηά ηδκ παναζηεοή ηςκ θζπμζςιάηςκ (Koning GA,et al.,1999, Park JW.et al.,1997,). Γφμ δζαθμνεηζηά ιδθεζιζδμ-ηεθζηά PEG-PE έπμοκ ενεοκδεεί, ημ maleimidomethyl cyclohexanecarboxylate-peg-dspe (MCC-PEG-DSPE) ηαζ ημ maleimidophenylpropionate-peg-dspe (MP-PEG-DSPE) (Park JW.et al.,1997,). Οζ εεζμθμιάδεξ ημο Fab ηθάζιαημξ ή ημο εκενβμπμζδιέκμο ιμκμηθςκζημφ ακηζζχιαημξ (μθυηθδνμ ημ IgG) πνμζημθθχκηαζ ζηδκ ζοκέπεζα ζημ άηνμ ηδξ PEG αθοζίδαξ ιέζς ηδξ μιάδαξ ιαθεζιζδίμο ( Park JW.et al.,1997, Park JW,et al.,2002). Έκα ζπμοδαίμ πθεμκέηηδια ηδξ πνήζδξ ηςκ Fab0 ηθαζιάηςκ είκαζ υηζ δ επζηυθθδζή ημοξ ζηα θζπμζχιαηα μδδβεί ζε έκακ ζδακζηυ πνμζακαημθζζιυ ημο Fab ηθάζιαημξ ( Martin FJ, et al.,1981). Καζ ηα δφμ MP ηαζ MCC ηεθζηά άηνα απμδείπεδηακ κα είκαζ ημ ίδζμ απμηε- 37

54 θεζιαηζηά βζα ηδκ παναζηεοή ηςκ ακμζμθζπμζςιάηςκ (Kirpotin D. et al., 1997). - ηακ ηα ακηζζχιαηα δεζιεφμκηαζ άιεζα ζηδκ θζπμζςιζηή επζθάκεζα, δ ζοββέκεζα δέζιεοζδξ βζα ηα ηφηηανα ιεζχεδηε ελαζηίαξ ηδξ ζηενεμπδιζηήξ πανειπυδζζδξ πμο πνμηαθείηαζ απυ ηδκ ηάθορδ απυ ηζξ ορδθήξ ποηκυηδηαξ PEG αθοζίδεξ πμο ιεζχκμοκ δναιαηζηά ηδκ δζαεεζζιυηδηα ηςκ ακηζζςιάηςκ βζα ημ ακηζβυκμ ζηυπμ( Park JW,et al.,2002, Kirpotin D,et al., 1997 ). Αοηυ ημ πνυαθδια ηαηαζηναηδβείηαζ ιε ηδκ πνυζδεζδ ηςκ ακηζζςιάηςκ ζημ άηνμ ημο PEG ( Park JW,et al.,2002, Kirpotin D,et al., 1997 ). Δζηυκα 3 Ζ πνυζδεζδ ηςκ ακηζζςιάηςκ ιε εεζυθδ ζε ιαθεζιζδμ- άβηονεξ δεκ είκαζ ημ ιμκαδζηυ πνςηυημθθμ δέζιεοζδξ ιέζς δεζιμφ εεζμαζεένα. ηδκ πενίπηςζδ ηςκ θζπμζςιάηςκ ιαηνάξ ηοηθμθμνίαξ, ηα ακηζζχιαηα είκαζ δοκαηυκ κα πνμζδεεμφκ ζημκ θμνέα είηε απεοεείαξ ζηδκ επζθάκεζα ιέζς N-(3-(2- pyridyldithio)propionyl)dioleoylphosphoethanolamine (PDPDOPE) είηε ζημ PEG ηεθζηυ άηνμ ιέζς PDP-PEG-DSPE or PDP-PEG-PE (Mercadal M, et al.,1999,hansen CB,et al.,1995). πςξ ακαθένεδηε ηαζ παναπάκς, μζ εεζμθμιάδεξ δεκ είκαζ άιεζα δζαεέζζιεξ υηακ ημ SPDP πνδζζιμπμζείηαζ ςξ πανάβμκηαξ ζηαονςηήξ δζαζφκδεζδξ ηαζ ιία επζπθέμκ ακηίδναζδ απαζηείηαζ βζα κα ιεζχζεζ ημοξ δζζμοθθζδζημφξ δεζιμφξ ζηζξ εεζμθμιάδεξ. Σα ιαθεζιζδζμ- ακηζζχιαηα δδιζμονβμφκηαζ ιε ηδ πνήζδ εκυξ εηενμδζδναζηζημφ πανάβμκηα ζηαονςηήξ δζαζφκδεζδξ ημο succinimidyl 4-(pmaleimidophenyl)butyrate (SMPB),ημ μπμίμ δνα ιε ηζξ αιζκμιάδεξ ηςκ ακηζζςιάηςκ. Ο Hansen et al. (Hansen CB. et al.,1995) ζφβηνζκε πμζηίθεξ ιεευδμοξ δέζιεοζδξ ηαζ ηα απμηεθέζιαηα έδεζλακ υηζ δ ακηίδναζδ πμο πενζθαιαάκεζ ημκ ζπδιαηζζιυ δεζιμφ εεζμαζεένα ζημ άηνμ ηδξ PEG αθοζίδαξ έπεζ απυδμζδ πενίπμο 60% ιε 70% (Mercadal M. et al.,1999, Hansen CB. et al.,1995, Allen TM. et al., 1995). ε ακηίεεζδ, υηακ ηα ακηζζχιαηα δεζιεφμκηαζ άιεζα ζηδκ επζθάκεζα ηςκ θζπμζςιάηςκ ιέζς N-maleimidophenylbutyrate dioleoylphosphatidylethanolamine (MPB-DOPE) πανμοζία PEG-DSPE, δ ζηακυηδηα δέζιεοζδξ ήηακ ιυκμ 10%. Ο Mercadal (Mercadal M. et al., 1999) παναηήνδζε ζηακυηδηα πνυζδεζδξ 100% ιε πνμζηυθθδζδ ηςκ ακηζζςιάηςκ ζημ άηνμ ημο PEG, ημ μπμίμ επζαεααζχκεζ υηζ αοηή δ πνμζέββζζδ ιπμνεί κα αολήζεζ ζδιακηζηά ηδκ πνυζααζδ ηςκ θεζημονβζηχκ μιάδςκ, ζοκεπχξ κα αεθηζχζεζ ηδκ πμζυηδηα ημο πνμζδέηδ πμο δεζιεφεηαζ ζηα θζπμζχιαηα. Σμ PEG ιπμνεί επίζδξ κα δεζιεοηεί άιεζα ζηδκ πμθδζηενυθδ (Chol) ακηί βζα PE ή DSPE (Carrion C. et al., 2001). Ζ PEG πμθδζηενυθδ (Pegylated Chol PEG-Chol) πανάβεηαζ πζμ εφημθα ηαζ ιε ιζηνυηενμ ηυζημξ. Πανά ηα πθεμκεηηήιαηα, δ πμζυηδηα ηςκ ακηζζςιάηςκ πμο πνμζδέκεηαζ ζηα θζπμζχιαηα είκαζ παιδθυηενδ απυ αοηή ηςκ PEG-PE θμνέςκ (Carrion C. et al., 2001). Σμ πζμ πζεακυ είκαζ αοηυ κα μθείθεηαζ ζημ βεβμκυξ υηζ μζ θεζημονβζηέξ μιάδεξ είκαζ θζβυηενμ πνμζαάζζιεξ ελαζηίαξ ηδξ ιεζςιέκδξ ηζκδηζηυηδηαξ ημο PEG-Chol, ημ μπμίμ είκαζ ημπμεεηδιέκμ ααεφηενα ζηδκ θζπμζςιζηή ιειανάκδ. 38

55 Εικόνα 23 χθματιςμόσ των κειολομάδων με τθ χριςθ του SATΑ. Αντίδραςθ μεταξφ του succinimidyl εςτζρα του SATA και τθσ πρωταρχικισ αμίνθσ του προςδζτθ ι του μορίου/ άγκυρασ (Α) και αποικοδόμθςθ του διςουλφιδικοφ δεςμοφ με υδροξυλαμίνθ (Β) ΠΡΟΚΟΛΛΗΗ ΣΩΝ ΠΡΟΔΕΣΩΝ ΣΑ ΛΙΠΟΩΜΑΣΑ ΜΕΩ ΔΙΟΤΛΦΙΔΙΚΟΤ ΔΕΜΟΤ Μία απυ ηζξ πζμ βνήβμνεξ ηαζ εφημθεξ ακηζδνάζεζξ πενζθαιαάκεζ ηδκ ζφκδεζδ δφμ εεζμθμιάδςκ πνμξ ζπδιαηζζιυ δζζμοθθζδζημφ δεζιμφ. Πανυθα αοηά πνέπεζ κα ζδιεζςεεί υηζ μ δζζμοθθζδζημφξ δεζιυξ είκαζ ζπεηζηά αζηαεήξ ηάης απυ ηζξ ακαβςβζηέξ ζοκεήηεξ ημο μνμφ (Martin FJ,et al.,1981 ). Γζ αοηυ ημκ θυβμ μ δζζμοθθζδζηυξ δεζιυξ έπεζ ζηαδζαηά ακηζηαηαζηαεεί απυ άθθμοξ πζμ ζηαεενμφξ δεζιμφξ. Πνμζδέηεξ ιε εεζυθεξ ιπμνμφκ κα πνμηφρμοκ είηε ιε απμδυιδζδ δζζμοθθζδζηχκ δεζιχκ, εάκ οπάνπμοκ, είηε ιε ηδ πνήζδ ηςκ εηενμδζδναζηζηχκ παναβυκηςκ ζηαονςηήξ δζαζφκδεζδξ υπςξ ημο SATA ή SPDP ηα μπμία ακηζδνμφκ ιε ιυνζα πμο πενζθαιαάκμοκ πνςηανπζηέξ αιίκεξ πνμξ ζπδιαηζζιυ αιζδζημφ δεζιμφ (Hansen CB. et al., 1995, Martin FJ,et al.,1981 Ivanov VO. et al., 1985, Leserman LD. Et al., 1980). Σμ ζφιπθμημ πνςηεΐκδξ-δζεεζμπονζδίκδξ πνμζηαηεφεζ ηδ εεζμθμιάδα ζε δζζμοθθζδζηυ δεζιυ πμο ιπμνεί εφημθα κα ηνμπμπμζδεεί απυ ημ DTT αηνζαχξ πνζκ ηδκ ακηίδναζδ πνυζδεζδξ ζηα θζπμζχιαηα. Κάης απυ αοηέξ ηζξ ζοκεήηεξ δ εκδμιμνζαηή ζηαονςηή δέζιεοζδ ιεηαλφ ηςκ εεζμθμιάδςκ ιεζχκεηαζ ζημ εθάπζζημ. Οζ πνμζδέηεξ πμο θένμοκ εεζυθδ ιπμνμφκ ζηδκ ζοκέπεζα κα ακηζδνάζμοκ ιε ηδκ μιάδα ιαθεσιζδίμο ή ιε ημ πονζδοθδζεεζμ ηιήια πνμξ ζπδιαηζζιυ δζζμοθθζδζημφ δεζιμφ. Καζ πάθζ εδχ ημ πζμ ημζκά πνδζζιμπμζμφιεκμ ιυνζμ- άβηονα είκαζ ημ PE άθθα ζογεοβιέκμ ηχνα ζημ SPDP βζα ημ ζπδιαηζζιυ ζηαεενμφ παναβχβμο PDP-PE ημ μπμίμ ιπμνεί εφημθα κα εκζςιαηςεεί ζηδκ θζπμζςιζηή ιειανάκδ ηαηά ημκ ζπδιαηζζιυ ηδξ ( Martin FJ,et al.,1981 Leserman LD,et al., 1980). Ζ ιέεμδμξ πνυζδεζδξ ζοκηεθεί ζε ζηακμπμζδηζηή δέζιεοζδ ηςκ ακηζζςιάηςκ ζηα θζπμζχιαηα πςνίξ ηνμπμπμζήζεζξ ημο πνμζδέηδ. Δ- πζπθέμκ, in vitro ιεθέηεξ απέδεζλακ υηζ θζπμζχιαηα πμο θένμοκ Fab ηθάζιαηα ιέζς 39

56 δζζμοθθζδζηχκ δεζιχκ ακαβκςνίγμοκ ηαζ δεζιεφμκηαζ εζδζηά ζε ηφηηανα ζηυπμοξ ( Martin FJ. et al., 1981, Ivanov VO. et al., 1985, Leserman LD. et al., 1980) ΣΑΤΡΩΣΗ ΔΙΑΤΝΔΕΗ ΜΕΣΑΞΤ ΚΑΡΒΟΞΤΛΟΜΑΔΩΝ ΣΗΝ ΕΠΙΦΑΝΕΙΑ ΣΩΝ ΛΙΠΟΩΜΑΣΩΝ ΚΑΙ ΠΡΩΣΟΣΑΓΩΝ ΑΜΙΝΟΜΑΔΩΝ ΣΩΝ ΠΡΟΔΕΣΩΝ. Οζ πνμζδέηεξ ιπμνμφκ κα δεζιεοημφκ ζηδκ επζθάκεζα ηςκ θζπμζςιάηςκ ιε αιζδζηυ δεζιυ πνδζζιμπμζχκηαξ ιυνζμ-άβηονα ηνμπμπμζδιέκμ χζηε κα θένεζ ηεθζηυ άηνμ ηαναμλοθζηυ μλφ. Γζα αοηυ ημ ζημπυ, πνδζζιμπμζείηαζ ζοκήεςξ ημ distearoyl- N-(3carboxypropionoylpoly(ethyleneglycol)succinylphosphatidylethanolamine(DSPE -PEG-COOH), ημ μπμίμ πανέπεζ ηαναμλοθζηυ μλφ ζημ άηνμ ηδξ PEG αθοζίδαξ (Ishida O. et al., 2001, Maruyama K. et al., 1995). Ζ ακηίδναζδ πνυζδεζδξ δζελάβεηαζ πανμοζία ημο 1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimide (EDAC) (πανάβμκηαξ ζηαονςηήξ δζαζφκδεζδξ) βζα ημ ζπδιαηζζιυ εκυξ αηοθμαιζκμεζηένα μ μπμίμξ ζηδκ ζοκέπεζα ακηζδνά ιε πνςημηαβή αιίκδ ημο πνμζδέηδ, απμδίδμκηαξ έκα ζηαεενυ αιζδζηυ δεζιυ ( Ishida O. et al., 2001, Maruyama K. et al., 1995, Maruyama K. et al., 1990). Ζ πανμοζία ημο N-οδνμδθεηηνζιίδζμ (NHS) ηαηά ηδ δζάνηεζα ηδξ ακηίδναζδξ είκαζ ζδιακηζηή βζα ηδ ζηαεενμπμίδζδ ημο αηοθ αιζκμ εζηένα Σμ ηφνζμ πθεμκέηηδια αοηήξ ηδξ ιεευδμο είκαζ υηζ δεκ απαζηείηαζ πνμηνμπμπμίδζδ ηαζ έηζζ ιεζχκεηαζ ημ νίζημ ιεημοζίςζδξ ηαζ απχθεζα ηδξ ελεζδίηεοζδξ. μ Maruyama (Maruyama K. et al., 1995) πνδζζιμπμίδζε αοηυ ημ πνςηυημθθμ δέζιεοζδξ βζα ηδκ πνυζδεζδ ημο ιμκμηθςκζημφ ακηζζχιαημξ A (34A), εζδζηυ βζα πκεοιμκζηά εκδμεδθζαηά ηφηηανα ημο πμκηζημφ, ζε πςνζηά ζηαεενμπμζδιέκα θζπμζχιαηα. In vivo απμηεθέζιαηα απμδεζηκφμοκ υηζ ηα ακμζμθζπμζχιαηα δεζιεφμκηαζ εζδζηά ζηα ηφηηανα ζηυπμοξ. Καζ πάθζ ιζα ζφβηνζζδ ιεηαλφ ακμζμθζπμζςιάηςκ πμο θένμοκ ακηζζχιαηα ζημ άηνμ ημο PEG ηαζ ακμζμθζπμζςιάηςκ πμο θένμοκ ημ ακηίζςια άιεζα ζοκδεδειέκμ ζηδκ δζπθμζηζαάδα απέδεζλε υηζ ηα δεφηενα είκαζ θζβυηενμ ηαηάθθδθα ελαζηίαξ ηδξ ζηενεμπδιζηήξ πανειπυδζζδξ απυ ηδκ PEG αθοζίδα. Σα ακηζζχιαηα ήηακ ζοκεπχξ θζβυηενμ πνμζαάζζια βζα ακαβκχνζζδ ηαζ δέζιεοζδ ζηα ηφηηανα ζηυπμοξ. Ζ Ishida (Ishida O,et al.,2001,) έπεζ ενεοκήζεζ ηδκ πζεακυηδηα ηδξ πνήζδξ ηνακζθεννίκδξ (TF) ςξ πνμζδέηδ βζα ηδκ εκενβδηζηή πνυζδεζδ ζε ηανηζκζηά ηφηηανα. Ζ ηνακζθεννίκδ είκαζ ιία βθοημπνςηεΐκδ δ μπμία ιεηαθένεζ ζυκηα ζζδήνμο ζημ ζχια. Έπεζ πενζβναθεί υηζ δ ζοβηέκηνςζδ ηςκ οπμδμπέςκ ηδξ ηνακζθεννίκδξ TfR είκαζ ορδθυηενδ ζηα ηανηζκζηά ηφηηανα απ υηζ ζηα θοζζμθμβζηά. In Vitro ιεθέηεξ ζε ηανηζκζηά ηφηηανα παπέμξ εκηένμο απυ πμκηίηζα (colon 26) απμδεζηκφμοκ υηζ ηα Tf θζπμζχιαηα δεζιεφμκηαζ ζε αοηά ηα ηφηηανα, ηαζ ήηακ ζηακά εζςηενζηεοιέκα ιε εκδμηοηηάνςζδ ιέζς οπμδμπέα. In vivo ένεοκα ζημ colon 26 tumor bearing mice επζαεααίςζε αοηά ηα απμηεθέζιαηα ηαζ έδεζλακ υηζ ηα θζπμζχιαηα ιπμνμφκ κα αβμοκ εηηυξ βεκζηήξ ηοηθμθμνίαξ ηαηεοεοκυιεκα ιέζα ζημοξ υβημοξ. To πθεμκέηηδια ηδξ πνήζδξ TF ςξ αοημηαηεοεοκυιεκμ ιυνζμ ακηί βζα ακηζζχιαηα μθείθεηαζ ζημ βεβμκυξ υηζ δ ηνακζθεννίκδ οπάνπεζ ζημκ μνβακζζιυ ζε ορδθέξ ζοβηεκηνχζεζξ ηαζ βζα αοηυ ημ νίζημ ηδξ ακμζμθμβζηήξ 40

57 απυηνζζδξ είκαζ ζαθχξ παιδθυηενμ. Δκχ δ αθεμκία ηςκ TfR ζημοξ ακενχπζκμοξ υβημοξ ανηεί βζα κα πνμςεήζεζ επανηή ηαζ εζδζηή εεναπεία. Σμ PE ιπμνεί επίζδξ κα ηνμπμπμζδεεί δίκμκηαξ N-glutarylphosphatidylethanolamine (NGPE) ( Weissig V. et al., 1986, Torchilin VP. et al., 1992 Torchilin VP. et al., 1996, Holmberg E. et al., 1989 Khaw BA. et al., 2001 Torchilin VP. et al., 2001). Δδχ ηαζ πάθζ μ πανάβμκηαξ δζαζφκδεζδξ πμο πνδζζιμπμζείηαζ είκαζ ημ EDAC ηαζ μ πνμζδέηδξ ιπμνεί κα δεζιεοηεί ζημοξ θμνείξ ιέζς α- ιζδζημφ δεζιμφ είηε ηαηά ημ ζπδιαηζζιυ ηςκ θζπμζςιάηςκ ή ζε πνμζπδιαηζζιέκα θζπμζχιαηα (Torchilin VP,et al.,1992, Torchilin VP,et al.,2001, Blume G,et al.,1993). Πμζηίθεξ ιεθέηεξ απέδεζλακ υηζ ακμζμθζπμζχιαηα, πμο παναζηεοάζηδηακ ιε αοηυ ημκ ηνυπμ, ζοζζςνεφμκηαζ επανηχξ ζηα υνβακα ζηυπμοξ εκχ θζπμζχιαηα πςνίξ ακηίζςια δεκ δείπκμοκ ηδκ ίδζα ζοιπενζθμνά. Δζδζηυηενα μ Torchilin et al. (1996) πνυζδεζακ antimyosin ακηίζςια (AM) ζε οδνυθμαδ άβηονα (NGPE) ηαζ ημ ηνμπμπμζδιέκμ ακηίζςια εκζςιαηχεδηε ζηδκ θζπμζςιζηή ιειανάκδ ηαηά ημ ζπδιαηζζιυ ηςκ θζπμζςιάηςκ. Ζ ζηακυηδηα ηδξ ιεευδμο απμδείπεδηε υηζ ήηακ 65% ιε 75%. Ανηεηέξ εηαημκηάδεξ ηθάζιαηα Fab0 ζοκδέεδηακ ακά θζπυζςια. Ζ ακμζμδναζηζηυηδηα ηςκ ηνμπμπμζδιέκςκ Fab0 πμο ζοκδέεδηακ ζηα θζπμζχιαηα ιεηνήεδηε ηαζ ηα απμηεθέζιαηα απέδεζλακ υηζ δοζηοπχξ δ ακμζμδναζηζηυηδηα ημο ακηζζχιαημξ ιεζχεδηε απυ 15 έςξ 20 θμνέξ ζε ζφβηνζζδ ιε ημ εθεφεενμ ακηίζςια. Αοηή δ ιεζςιέκδ ακμζμδναζηζηυηδηα ηςκ Fab0 ηθαζιάηςκ ήηακ ιενζηχξ ελζζμννμπδιέκδ απυ ηδκ πανμοζία ορδθμφ ανζειμφ ακηζζςιάηςκ ακά θζπυζςια. Ζ ζηακυηδηα ηδξ εκενβδηζηήξ πνυζδεζδ θζπμζςιάηςκ δείπεδηε in vivo, ηαεχξ θζπμζχιαηα πμο έθενακ AM ζοζζςνεφηδηακ επζθεηηζηά ζημ κεηνςηζηυ ιομηάνδζμ, ζε ζφβηνζζδ ιε control θζπμζχιαηα πμο δεκ έθενακ AM πμο ήηακ ζδιακηζηά πανυκηα ζημ ιδ κεηνςηζηυ ιομηάνδζμ. Ο Blume et al. ( Blume G,et al.,1993) πνδζζιμπμίδζε αοηή ηδ ιέεμδμ δέζιεοζδξ βζα ηδκ πνυζδεζδ είηε άιεζα ζηδκ επζθάκεζα ηςκ θζπμζςιάαηςκ είηε ζημ άηνμ ημο PEG. Σα απμηεθέζιαηα έδεζλακ υηζ ζηδκ πνχηδ πενίπηςζδ, ηα θζπμζχιαηα είπακ ιαηνά ηοηθμθμνία ζημ αίια, αθθά έπαζακ ηδκ εζδζηυηδηα ηαζ ηδκ ζηακυηδηα δέζιεοζδξ ζηζξ πενζμπέξ ζηυπμοξ. ηδκ δεφηενδ πενίπηςζδ, ηα θζπμζχιαηα υπζ ιυκμ είπακ ιαηνά ηοηθμθμνία ζημ αίια αθθά ηαζ ζηακυηδηα δέζιεοζδξ ζηζξ πενζμπέξ ζηυπμοξ ΠΡΟΚΟΛΛΗΗ ΣΩΝ ΠΡΟΔΕΣΩΝ ΣΑ ΛΙΠΟΩΜΑΣΑ ΜΕΩ ΤΔΡΑΖΙΝΟΔΕ- ΜΟΤ Μζα άθθδ εκδζαθένμοζα ηεπκζηή βζα ηδκ δέζιεοζδ ακηζζςιάηςκ ζηδκ ελςηενζηυ ζηνχια ηςκ θζπμζςιζηχκ ιειανακχκ είκαζ ιέζς μιμζμπμθζηά δεζιεοιέκςκ ακηζζςιάηςκ, ιέζς ηςκ οδαηακενάηςκ ζε οδναγμκμιάδεξ πμο ανίζημκηαζ ζηδκ θζπμζςιζηή επζθάκεζα. Μζα ήπζα μλείδςζδ ημο οδνμβμκακεναηζημφ ηιήιαημξ ηδξ ζηαεενήξ πενζμπήξ ηδξ αανζάξ αθοζίδαξ ηδξ ακμζμζθαζνίκδξ απαζηείηαζ βζα ηδκ παναβςβή ηδξ αθδετδμιάδαξ. Ζ αθδετδμιάδα ακηζδνά ιε ημ οδναγίδζμ ημο ιμνίμο άβηονα (Koning GA. et al., 1999 Chua MM. et al., 1984, Harding JA. et al., 1997). Ζ μλείδςζδ ημο οδνμβμκακεναηζημφ ηιήιαημξ δζελάβεηαζ απυ ηδκ μλεζδάζδ ηδξ βαθαηηυγδξ 41

58 είηε απυ ημ οπενζςδζημφ καηνίμο (Hansen CB. et al., 1995, Chua MM. et al., 1984, Harding JA. et al., 1997, Goren D. et al., 1996, Lopes de Menezes DE. et al., 1998). Δίκαζ θακενυ υηζ δ ακηίδναζδ μλείδςζδξ πνέπεζ κα δζελαπεεί ηάης απυ ήπζεξ ζοκεήηεξ βζα ηδκ απμθοβή ηδξ απχθεζαξ ηδξ δναζηζηυηδηαξ ημο ακηζζχιαημξ. Απυ ηδ ζηζβιή πμο ηα μλεζδςιέκα ακηζζχιαηα ζπδιαηίγμκηαζ, ιπμνεί είηε κα δεζιεοηεί απεοεείαξ ζηδκ θζπζδζηή δζπθμζηζαάδα πμο πενζέπεζ οδναγίδζμ οδνυθμαδ άβηονα υπςξ ημ lauric acid hydrazide, ή πνμζημθθδιέκμ ζημ άηνμ ηδξ PEG αθοζίδαξ ηςκ ζηενζηά ζηαεενμπμζδιέκςκ θζπμζςιάηςκ (Koning GA. et al., 1999, Hansen CB. et al., 1995, Chua MM. et al., 1984, Harding JA. et al., 1997, Goren D. et al., 1996). ηδκ δεφηενδ πενίπηςζδ έκα ηνμπμπμζδιέκμ PEG-θζπίδζμ, hydrazide-peg-dspe (Hz-PEG-DSPE) πνδζζιμπμζείηαζ (Zalipsky S., 1993). Ζ ακηίδναζδ είκαζ απθή ηαζ έκαξ ζηαεενυξ δεζιυξ οδναγυκδξ ζπδιαηίγεηαζ. Αοηή δ ακηίδναζδ ζφγεολδξ εεςνδηζηά πνμζθένεζ ημ πθεμκέηηδια υηζ ηα ακηζζχιαηα είκαζ ζςζηά πνμζακαημθζζιέκα απυ ηδ ζηζβιή πμο πνμζημθθχκηαζ ζηδκ επζθάκεζα ηςκ θζπμζςιάηςκ ηαεχξ ιυκμ ημ Fc ηιήια ζοιιεηέπεζ ζηδκ ακηίδναζδ ζφγεολδξ, αθήκμκηαξ ηδκ εέζδ δέζιεοζδξ ημο ακηζβυκμο ακέπαθδ. Πανυθ αοηά, ιζα ζοβηνζηζηή ιεθέηδ ιεηαλφ δζαθμνεηζηχκ ιεευδςκ πνυζδεζδξ, απμηάθορε υηζ αοηή δ ηεπκζηή δεκ είκαζ ανηεηά ζηακή, ιυκμ έκα ιζηνυ πμζμζηυ ημο ακηζζχιαημξ πνμζδέκεηαζ (17%) (Hansen CB, et al.,1995,). ε ακηίεεζδ, μ δεζιυξ εεζμαζεένα θαίκεηαζ πμθθά οπμζπυιεκμξ επζηοβπάκμκηαξ πενίπμο 61% ζηακυηδηα πνυζδεζδξ. Αοηά ζηδνίγμκηαζ ηαζ απυ in vitro ένεοκα δ μπμία έδεζλε υηζ αοηή δ πνμζέββζζδ επζηνέπεζ ζε έκα ιζηνυ πμζμζηυ ηςκ θζπμζςιάηςκ κα πνμζδεεμφκ ζηα ηφηηανα ελαζηίαξ ηδξ ιζηνήξ ποηκυηδηαξ ακηζζχιαημξ ζε ζφβηνζζδ ιε άθθεξ ηεπκζηέξ δέζιεοζδξ (Hansen CB. et al., 1995,). Πανυθ αοηά εεηζηά απμηεθέζιαηα έπμοκ παναηδνδεεί in vitro ιε αοηή ηδ ιέεμδμ πνυζδεζδξ απυ ιζα άθθδ ενεοκδηζηή μιάδα. Ο Koning et al. (1999) έπεζ επζηοπχξ πνδζζιμπμζήζεζ οδναγμκμδεζιυ βζα ηδ ιεηαθμνά ημο ακηζηανηζκζημφ πνμθανιάημο, FUdR-dP, πμο εβηθςαίγεηαζ ζηδ δζπθμζηζαάδα θζπμζςιάηςκ πμο θένμοκ ιμκμηθςκζηυ ακηίζςια έκακηζ ημο ηανηίκμο ημο εκηένμο πμκηζηζμφ CC531. Παναηδνήεδηε ζε αοηή ηδκ ιεθέηδ υηζ ημ θάνιαημ ιεηαθένεδηε επζθεηηζηά ζηδκ επζθάκεζα ηςκ ηανηζκζηχκ ηοηηάνςκ ηαζ ζηδκ ζοκέπεζα εζςηενζηέοηδηε ζημ εζςηενζηυ ηςκ θοζμζςιάηςκ υπμο δ αζμδναζηζηή μοζία οδνμθφεδηε πνμξ ζπδιαηζζιυ εκενβήξ ιμνθήξ ηδξ. 42

59 ΣΑΤΡΩΣΗ ΔΙΑΤΝΔΕΗ ΜΕΣΑΞΤ ΣΩΝ ΠΡΩΣΑΡΧΙΚΩΝ ΑΜΙΝΩΝ ΣΗΝ ΕΠΙΦΑΝΕΙΑ ΣΩΝ ΛΙΠΟΩΜΑΣΩΝ ΚΑΙ ΣΩΝ ΠΡΩΣΑΡΧΙΚΩΝ ΑΜΙ- ΝΩΝ ΣΩΝ ΠΡΟΔΕΣΩΝ. Μεηαλφ ηςκ μιμζμπμθζηχκ ιεευδςκ δέζιεοζδξ, δ δέζιεοζδ άιεζα αιίιδξ-αιίκδξ έπεζ επίζδξ δζενεοκδεεί βζα ηδκ πνμζεήηδ ιμνίςκ ηδκ επζθάκεζα ηςκ θζπμζςιάηςκ (εζηυκα 21) ηονίςξ, δφμ μιμζμδζδναζηζηχκ ζοκδεηχκ, βθμοηαναθδετδδξ ηαζ suberimidate ( Torchilin VP,1979and 1978). Σμ πθεμκέηηδια αοηήξ ηδξ πνμζέββζζδξ ζφγεολδξ είκαζ υηζ δεκ απαζηείηαζ ηνμπμπμίδζδ βζα ηδκ πνμζεήηδ θεζημονβζηχκ μιάδςκ ζημκ πνμζδέηδ. ε αοηή ηδ ιέεμδμ πνυζδεζδξ δ πνςημηαβήξ αιίκδ ημο PE ζηδκ επζθάκεζα ηςκ θζπμζςιάηςκ ιέζς πανάβμκηα δζαζφκδεζδξ πνχηα εκενβμπμζείηαζ ηαζ αημθμφεςξ δεζιεφεηαζ μ πνμζδέηδξ υηακ πνδζζιμπμζείηαζ ημ suberimidate, μζ πνςηανπζηέξ αιίκεξ ακηζδνμφκ ιέζς ημο imidoester βζα ημ ζπδιαηζζιυ ημο αιζδζημφ δεζιμφ. Ζ ακηίδναζδ ιε ηδκ βθμοηαναθδεΰδδ πνμάβεηαζ ιέζς ημο ζπδιαηζζιμφ ηδξ Schiff s αάζδ ιε ακαδζεοεέηδζδ πνμξ ζηαεενυ πνμσχκ. Σα απμηεθέζιαηα έπμοκ απμδείλεζ υηζ ζπεδυκ ημ 60% ημο ακηζζχιαημξ δεζιεφηδηε ζηα θζπμζχιαηα ηαζ υηζ δζαηήνδζακ ηδκ ζηακυηδηα δέζιεοζδξ βζα ηα ακηζβυκα (Torchilin VP., 1978). Εικόνα 24. Προςκόλλθςθ των αντιςωμάτων ςτουσ φορείσ με τθ χριςθ αλλιλεπίδραςθσ αβιδίνθσ- βιοτίνθσ. Σρεισ διαφορετικζσ προςεγγίςεισ περιγράφονται. τθν άμεςθ (Α), βιοτινυλιωμζνα αντιςϊματα προςκολλϊνται ςτα ςωματίδια με αλλθλεπίδραςθ αβιδίνθσ- βιοτίνθσ και τα ςωματίδια χορθγοφνται άμεςα. τθν προςζγγιςθ δφο βθμάτων (Β), πρϊτα χορθγοφνται τα βιοτινυλιωμζνα αντιςϊματα ζτςι ϊςτε να επιτευχκεί θ ςυςςϊρευςθ και θ δζςμευςθ ςτα κφτταρα ςτόχουσ και ςτθν ςυνζχεια χορθγοφνται9 τα ςωματίδια ςυηευγμζνα με αβιδίνθ. τθν ςτόχευςθ τριϊν βθμάτων (c), χορθγοφνται πρϊτα τα βιοτινυλιωμζνα αντιςϊματα εν ςυνεχεία θ ελεφκερθ αβιδίνθ και ςτο τζλοσ τα βιοτινυλιωμζνα νανοςωματίδια. Πανά ημ βεβμκυξ υηζ δ ακηίδναζδ πνυζδεζδξ είκαζ ζηακή, δ πνήζδ μιμδζδναζηζηχκ ζοκδεηχκ ζπάκζα έπεζ εθανιμζηεί βζα ηδκ παναζηεοή ηςκ θζπμζςιάηςκ 43

60 βζα εκενβή ζηυπεοζδ ημο ακελέθεβηημο μιμπμθοιενζζιμφ ημο πνμζδέηδ ή ηςκ θζπμζςιάηςκ ηαηά ηδ δζάνηεζα ηδξ ακηίδναζδξ ζηαονςηήξ δζαζφκδεζδξ ΠΡΟΚΟΛΛΗΗ ΠΟΛΛΑΠΛΩΝ ΒΗΜΑΣΩΝ ΜΕ ΧΡΗΗ ΣΗ ΑΒΙΔΙΝΗ-ΒΙΟΣΙΝΗ ΑΛΛΗΛΕΠΙΔΡΑΗ Μία απυ ηζξ πζμ εκδζαθένμοζεξ πνμζεββίζεζξ πνυζδεζδξ πμο πνυζθαηα έπεζ δζενεοκδεεί είκαζ ημ ζφζηδια ααζδίκδξ-αζμηίκδξ, είκαζ απυ ηζξ πζμ δοκαηέξ βκςζηέξ ιδ μιμζμπμθζηέξ αζμθμβζηέξ ακηζδνάζεζξ (ζηαεενά ζπδιαηζζιμφ M _1 ). Αοηή δ ζηαεενή ζφκδεζδ, ζε ζφβηνζζδ ιε ηζξ βκςζηέξ μιμζμπμθζηέξ ακηζδνάζεζξ, επζηνέπεζ πμζηίθεξ εθανιμβέξ ζηδκ ακμζμθμβία, ζηδκ πνςιαημβναθία ζοββέκεζαξ, ζηδκ ζζημπδιεία ηαζ ζε άθθα πεδία. ήιενα δ ζηναηδβζηή ηδξ avidin biotin έπεζ βίκεζ έκα πνήζζιμ ενβαθείμ βζα ηδκ εκενβδηζηή ζηυπεοζδ, ζδζαίηενα ελαζηίαξ ηδξ δοκαηυηδηαξ εθανιμβήξ ζηναηδβζηήξ πμθθαπθχκ αδιάηςκ. Πμθθά οπμζπυιεκα απμηεθέζιαηα έπμοκ επζηεοπεεί ζηα μπμία πνμζεββίζεζξ ηςκ δφμ ή ηνζχκ αδιάηςκ ελεηάζηδηακ (Casalini P. et al., 1997, Magnani P., 1996 Moro M., 1997). οκήεςξ δ ιέεμδμξ δφμ αδιάηςκ ζοκίζηαηαζ ζηδκ πμνήβδζδ ημο αζμηζκοθζμιέκμο ακηζζχιαημξ πμο αημθμοεείηαζ απυ ηδκ έβποζδ ημο δναζηζημφ ιμνίμο πμο θένεζ ααζδίκδ. Ζ ααζδίκδ πμο είκαζ πνμζδεδειέκδ ζημ ακηίζςια ιπμνεί κα πνδζζιμπμζδεεί ζημ πνχημ αήια πμο αημθμοεείηαζ απυ ημ αζμηοκζθζςιέκμ ιυνζμ. Ζ πνμζέββζζδ ηνζχκ αδιάηςκ ααζίγεηαζ ζηδκ πμνήβδζδ ημο αζμηοκζθζςιέκμο ακηζζχιαημξ πμο αημθμοεείηαζ απυ πνμζεήηδ πενίζζεζαξ ζηέηδξ ααζδίκδξ ηαζ ζημ ηνίημ αήια πμνδβείηαζ δ αζμηίκδ πμο είκαζ πνμζδεδειέκδ ζε έκα δναζηζηυ ζοζηαηζηυ. Σμ ηφνζμ πθεμκέηηδια ηςκ πνμζεββίζεςκ πνμζηυπεοζδξ είκαζ υηζ επζηνέπμοκ ζηα ακηζζχιαηα κα ζοζζςνεφμκηαζ ζημοξ ζζημφξ ζηυπμοξ ηαζ υηζ εθαπζζημπμζμφκ ηδκ πμζυηδηα ηςκ ακηζζςιάηςκ ιε ιδ ζημπεοιέκδ δνάζδ. Ζ ηεπκμθμβία ααζδίκδξ-αζμηίκδξ έπεζ εθανιμζηεί ηαζ ζημ πεδίμ ηςκ θζπμζςιάηςκ ζε ιζα εκαθθαηηζηή ιέεμδμξ ηςκ ιεευδςκ μιμζμπμθζηήξ πνυζδεζδξ ηαεχξ ηα ζφιπθμηα πμο δδιζμονβμφκηαζ είκαζ πμθφ ζηαεενά. οκήεςξ, δ αζμηίκδ πνμζδέκεηαζ μιμζμπμθζηά ζηδκ επζθάκεζα ηςκ θζπμζςιάηςκ ιέζς ιμνίμο-άβηοναξ, υπςξ ημ DOPE, ηαζ ηα αζμηζκζθομιέκα ακηζζχιαηα πανάβμκηαζ ιε μιμζμπμθζηέξ ακηζδνάζεζξ (Mao S-Y.1994 Portnoy J,1998 Pieri I,1991). Καζ πάθζ εδχ δζαθμνεηζηέξ ακηζδνάζεζξ ιπμνμφκ κα επζθεπεμφκ. οπκά πνδζζιμπμζμφκηαζ αιζκμιάδεξ πμο ακηζδνμφκ ιε ημκ NHS ester ηδξ αζμηίκδξ (Hansen CB., 1995 ). Γζα ηδκ απμθοβή ηδξ πζεακυηδηαξ αδνακμπμίδζδξ ηςκ ακηζζςιάηςκ, δ πνήζδ παναβχβςκ αζμηίκδξ πμο αθθδθεπζδνμφκ ιε εεζμθμιάδεξ εθέβπεηαζ. Ο Hansen (Hansen CB., 1995) ζφβηνζκε ηδκ πνμζέββζζδ ζηυπεοζδξ ηςκ ηνζχκ αδιάηςκ ιε μιμζμπμθζηέξ ιεευδμοξ ζηυπεοζδξ. ε αοηή ηδκ ιεθέηδ ηα θζπμζχιαηα πμο πενζείπακ ημ biotin DOPE επςάζηδηακ πνχηα ιε ααζδίκδ ηαζ ζε έκα δεφηενμ αήια ακαιίπεδηακ ιε ημ αζμηζκζθζςιέκμ ακηίζςια. Σα απμηεθέζιαηα έδεζλακ παιδθή ζηακυηδηα δέζιεοζδξ ηςκ ακηζζςιάηςκ ζηα θζπμζχιαηα (9 ±3%) εκχ ζε ζφβηνζζδ ιε άθθεξ ιεευδμοξ πνυζδεζδξ (63 ±10% εεζμαζεενζηυ δεζιυ). Ζ ιζηνή πμζυηδηα δέζιεοζδξ ηςκ ακ- 44

61 ηζζςιάηςκ μθείθεηαζ πζεακυκ ζηδκ πςνμηαλζηή πανειπυδζζδ πμο πνμηαθείηαζ απυ ηδκ πανμοζία δφμ ιεβάθςκ πνςηεσκχκ (avidin and immunoglobulin). Φοζζηά δ πνήζδ ιαηνχκ ζοκδεηχκ εα ιπμνμφζε κα ιείςζδ ηδκ πςνμηαλζηή πανειπυδζζδ ηαζ κα αφλδζδ ηδκ ζηακυηδηα πνυζδεζδξ. Πανυηζ δ πνμδβμφιεκδ ιεθέηδ δεκ ήηακ πμθφ εκεαννοκηζηή, άθθεξ ιεθέηεξ έδεζλακ εκδζαθένμκ ζηδκ δζενεφκδζδ αοηήξ ηδξ πνμζέββζζδξ. Xiao et al. (Xiao Z,2002) απέδεζλακ ηδκ in vitro ζηακυηδηα ηδξ πνμζέββζζδξ ηνζχκ αδιάηςκ εζηυκα 4 βζα ζηυπεοζδ ηςκ θζπμζςιάηςκ ζε ηανηζκζηά ηφηηανα ςμεήηδξ ακενχπμο (OVCAR-3). Σα αζμηζκοθζςιέκα ακηζζχιαηα επςάζηδηακ ανπζηά ιε ηα ηφηηανα ηαζ ζηδκ ζοκέπεζα πνμζηέεδηε δ ζηνεπηααζδίκδ αημθμοεμφιεκδ απυ ηα αζμηζκοθζςιέκα θζπμζχιαηα. Ζ ααζδίκδ ιπμνεί κα ακηζηαηαζηαεεί απυ ηδ ζηνεπηααζδίκδ βζα ηδκ απμθοβή ηδξ ιδ εζδζηήξ δέζιεοζδξ πνςηεσκχκ ηδξ εββεκμφξ ααζδίκδξ (Loughrey H., 1987). Σα απμηεθέζιαηα έδεζλακ υηζ ηα θζπμζχιαηα δεζιεφμκηαζ εζδζηά ζηδκ ηοηηανζηή επζθάκεζα ηςκ OVCAR-3 ηοηηάνςκ αθθά υπζ ζηα ηφηηανα πμο δεκ εηθνάγμοκ ημ ζοβηεηνζιέκμ ακηζβυκμ. ε ιζα άθθδ ιεθέηδ ιζα in vitro ιεθέηδ επζαεααίςζε υηζ ηα θζπμζχιαηα πμο θένμκ ακηζζχιαηα πνμζημθθχκηαζ ζζπονά ζε ηανηζκζηά ηφηηανα ιε ηδ πνήζδ ζηναηδβζηήξ δφμ ή ηνζχκ αδιάηςκ (Loughrey H,1987). Γεκζηά δ ιεβαθφηενδ αηαηαθθδθυηδηα ζηδ πνήζδ ηδξ ηεπκμθμβίαξ ααζδίκδξαζμηίκδξ είκαζ δ πανμοζία ιζαξ πνυζεεηδξ ιεβάθδξ πνςηεΐκδξ (avidin) δ μπμία ιπμνεί κα αολήζεζ πμθφ ημ ιέβεεμξ ηςκ θζπμζςιάηςκ Μ Η Ο Μ Ο Ι Ο Π Ο Λ Ι Κ Ε Μ Ε Θ Ο Δ Ο Ι Γ Ι Α Σ Η Ν Π Ρ Ο Δ Ε Η Σ Ω Ν Μ Ο Ρ Ι- Ω Ν / Α Ν Σ Ι Ω Μ Α Σ Ω Ν Σ Η Ν Ε Π Ι Φ Α Ν Ε Ι Α Σ Ω Ν Λ Ι Π Ο Ω Μ Α Σ Ω Ν. πςξ ήδδ έπεζ ακαθενεεί, έκαξ εκαθθαηηζηυξ ηνυπμξ πνυζδεζδξ ιμνίςκ ζηδκ επζθάκεζα ηςκ θζπμζςιάηςκ είκαζ δ πνήζδ ιδ μιμζμπμθζηχκ ιεευδςκ. Αοηέξ έπμοκ ημ ιεβάθμ πθεμκέηηδια υηζ είκαζ εφημθμ ημ κα δζελαπεμφκ πςνίξ ηδ πνήζδ αθαπηζηχκ ακηζδναζηδνίςκ ΑΜΕΗ ΕΝΩΜΑΣΩΗ ΣΩΝ ΜΟΡΙΩΝ-ΠΡΟΔΕΣΩΝ ΣΗΝ ΛΙΠΟΩΜΙΚΗ ΔΙΠ- ΛΟΣΙΒΑΔΑ Μζα απθή ιέεμδμξ πμο δεκ απαζηεί πδιζηέξ ακηζδνάζεζξ είκαζ δ πνμζεήηδ ημο πνμζδέηδ ζημ ιίβια ηςκ θςζθμθζπζδίςκ ηαηά ηδ δζάνηεζα ηδκ παναζηεοήξ ημο θμνέα. Σμ IgG πνδζζιμπμζήεδηε ςξ ιμκηέθμ ηαζ ηα απμηεθέζιαηα έδεζλακ υηζ ημ ακηίζςια δεζιεφεηαζ ζηαεενά ηαζ δζαηδνεί ηδκ ζηακυηδηα πνυζδεζδξ ζημ ακηζβυκμ (Huang L.,1979). Πανυθ αοηά ημ επί ημζξ εηαηυ πμζμζηυ πνυζδεζδξ είκαζ ζπεηζηά παιδθυ (4 40%) ηαζ επζπνυζεεηα παναηδνείηαζ ζοζζςιάηςζδ ηςκ θζπμζςιάηςκ. Δπζπθέμκ δ ηεθζηή πμζυηδηα ημο πνμζδέηδ πμο ζοκδέεηαζ ζημ θζπυζςια δεκ εθέβπε- 45

62 ηαζ εφημθα ηαζ μ ζςζηυξ πνμζακαημθζζιυξ ηςκ ακηζζςιάηςκ δεκ είκαζ ελαζθαθζζιέκμξ αοηυξ είκαζ ίζςξ ηαζ μ θυβμξ πμο αοηή δ ιέεμδμξ δεκ έπεζ εονεία πνήζδ ΕΙΑΓΩΓΗ ΛΙΠΟΠΡΟΔΕΔΕΜΕΝΩΝ ΑΝΣΙΩΜΑΣΩΝ ΣΗΝ ΛΙΠΟΩΜΙΚΗ ΜΕΜΒΡΑΝΗ Ωξ εκαθθαηηζηή ιέεμδμξ ηδξ πδιζηήξ ζφκδεζδξ, δ πνήζδ θζπμπνμζδεδειέκςκ ακηζζςιάηςκ πμο πνμηφπημοκ απυ ηδ βεκεηζηή ιδπακζηή είκαζ ιζα εκδζαθένμοζα πνμζέββζζδξ (Laukkanen ML.,1993). Ζ ηεπκζηή πενζθαιαάκεζ ηδ αζμζφκεεζδ ηςκ θζπμπνςηεσκζηχκ ιμκήξ αθοζίδαξ ακηζζςιάηςκ πνδζζιμπμζχκηαξ ηδκ βεκεηζηή ιδπακζηή ηαζ ζηδκ ζοκέπεζα βίκεηαζ εκζςιάηςζδ αοηχκ ζηδκ θζπμζςιζηή ιειανάκδ ή ιε πνμζνυθδζδ ζε ήδδ ζπδιαηζζιέκδ θζπμζςιζηή ιειανάκδ (Laukkanen ML., 1995). Λζπμπνςηεσκζηά ιμκήξ αθοζίδαξ ακηζζχιαηα εηθνάγμκηαζ ζηδκ Escherichia coli. Σα θζπμζχιαηα πμο θένμοκ lipid-tagged antibody δζαεέημοκ ηδκ ζηακυηδηα εζδζηήξ δέζιεοζδξ απηεκίςκ αθθά αοηυ δεκ έπεζ δζενεοκδεεί ανηεηά ςξ ηχνα (Laukkanen ML., 1993, Laukkanen ML., 1974). Γζα αοηυ ημκ θυβμ δ πναηηζηή πνδζζιυηδηα ημοξ ιέκεζ κα απμδεζπεεί. Πνέπεζ κα ζδιεζςεεί υηζ αοηή δ πνμζέββζζδ απμθεφβεζ ηδκ εθανιμβή πδιζηχκ ακηζδνάζεςκ πμο ιπμνεί κα επζθένμοκ αθθαβέξ ζηδκ δναζηζηυηδηα ηςκ ακηζζςιάηςκ. Σμ ενχηδια είκαζ εάκ ημ ακηίζςια ιζαξ αθοζίδαξ πμο δεζιεφεηαζ άιεζα ζηδκ επζθάκεζα ηςκ θζπμζςιάηςκ εα είκαζ θεζημονβζηυ ζε αυναηα θζπμζχιαηα ΠΡΟΚΟΛΛΗΗ ΣΩΝ ΘΕΡΜΟ-ΤΩΜΑΣΩΜΕΝΩΝ ΑΝΣΙΩΜΑΣΩΝ ΣΗΝ ΕΠΙΦΑΝΕΙΑ ΣΩΝ ΛΙΠΟΩΜΑΣΩΝ Ζ πνχηδ πνμζπάεεζα παναζηεοήξ θζπμζςιάηςκ βζα ηδκ ζηυπεοζδ εκενβχκ αζμδναζηζηχκ εκχζεςκ ζε ζοβηεηνζιέκμοξ ζζημφξ πενζθαιαάκεζ ηδκ ιδ εζδζηή πνμζνυθδζδ ηςκ heat-aggregated antibodies ζηδκ επζθάκεζα ηςκ θζπμζςιάηςκ. Ο ζφκδεζιμξ ιεηαλφ ηςκ ζοζζςιαηςιέκςκ ακμζμζθαζνζκχκ ηαζ ηςκ θζπμζςιάηςκ δδιζμονβείηαζ ιέζς δθεηηνμζηαηζηχκ ηαζ οδνυθμαςκ αθθδθεπζδνάζεςκ. Έκα πανάδεζβια αοηήξ ηδξ ηεπκζηήξ δίκεηαζ απυ ημκ Weissmann et al. (1974) πμο παναζηεφαζε εενιμζοζζςιαηςιέκδ ακμζμζθαζνίκδ απθά εενιαίκμκηαξ ηδκ ανπζηή δζαθοιέκδ πνςηεΐκδ ζημοξ ζε οδαηυθμοηνμ βζα 10 minutes. Αοηυ ημ πνςηυημθθμ πνμηαθεί ιζα ακαδζάηαλδ ηςκ Fc πενζμπχκ ηδξ ακμζμζθαζνίκδξ πμο ηδξ επζηνέπεζ κα αθθδθεπζδνάζεζ ιε θζπμζχιαηα, πζεακυκ αεθηζχκμκηαξ ηζξ οδνμθμαζηέξ ζοκδέζεζξ ιε ηδκ θζπμζςιζηή ιειανάκδ. ε ιζα άθθδ ιεθέηδ, ηα θζπμζχιαηα επζηαθφθεδηακ ιε heat-aggregated IgM ηαζ ημ έκγοιμ οπενμλεζδάζδ (horseradish peroxidase) εκζςιαηχεδηε ζημ εζςηενζηυ ηςκ θζπμζςιάηςκ (Leserman LD., 1979). Σα απμηεθέζιαηα έδεζλακ υηζ δ πνυζθδρδ ημο εκγφιμο απυ ηα θοζμζχιαηα θαβμηοηηάνςκ ιε έθθεζρδ ηδξ οπενμλεζ- 46

63 δάζδξ αολάκεηαζ ζδιακηζηά υηακ ηα θζπμζχιαηα θένμοκ aggregated IgM ζε ζφβηνζζδ ιε απθά θζπμζχιαηα δ θζπμζχιαηα πμο θένμοκ ημ ανπζηυ IgM. Πανυηζ αοηυ ημ πνςηυημθθμ έπεζ δχζεζ εκδζαθένμκηα απμηεθέζιαηα, δ αθθδθεπίδναζδ ιεηαλφ ημο ακηζζχιαημξ ηαζ ηςκ θζπμζςιάηςκ δεκ είκαζ πμθφ ζζπονή ζε ζφβηνζζδ ιε ηζξ μιμζμπμθζηέξ ακηζδνάζεζξ πνυζδεζδξ. Δπζπθέμκ δ πμζυηδηα ημο ακηζζχιαημξ πμο πνμζδέκεηαζ ζηδκ επζθάκεζα ηςκ θζπμζςιάηςκ δεκ ιπμνεί κα εθεβπεεί ΔΕΜΕΤΗ ΣΩΝ ΑΝΣΙΩΜΑΣΩΝ ΜΕΩ ΑΠΣΕΝΙΩΝ. Έκα άθθμ πνςηυημθθμ ιδ μιμζμπμθζηήξ πνυζδεζδξ ζηδκ επζθάκεζα ηςκ θζπμζςιαηςκ ζοιπενζθαιαάκεζ ηδ πνήζδ απηεκίςκ πμο δνμοκ ςξ ζδιεία πνυζδεζδξ βζα ηζξ εέζεζξ πνυζδεζδξ ημο ακηζβυκμο ηςκ ακηζζςιάηςκ. Μενζηέξ εκδζαθένμοζεξ ιεθέηεξ έπμοκ δζελαπεεί ιε ηδ πνήζδ αοημφ ημο πνςημηυθθμο, ημ μπμίμ θένεζ ημ πθεμκέηηδια έκακηζ ηςκ άθθςκ ιδ μιμζμπμθζηχκ δεζιχκ, υηζ δ πμζυηδηα ημο ακηζζχιαημξ ζηδκ επζθάκεζα ηςκ θζπμζςιάηςκ είκαζ πζμ εφημθμ κα εθεβπεεί. Leserman et al. (Leserman LD,) παναζηεφαζε θμνείξ πμο έθενακ ζηδκ επζθάκεζα ημ 2,4 dinitrophenyl-hapten (DNP-hapten). In vitro δμηζιέξ ζε ηφηηανα ιοεθχιαημξ πμκηζημφ, MOPC 315, πμο εηθνάγμοκ ακμζμζθαζνίκδ, ιε ζοββέκεζα βζα ημ κζηνμθαζκοθαπηέκζμ, απέδεζλακ εζδζηή δέζιεοζδ ηςκ θζπμζςιάηςκ ζε αοηά ηα ηφηηανα. Με πεναζηένς ιεθέηεξ δ ίδζα ενεοκδηζηή μιάδα απέδεζλε ηδκ εζδζηή δέζιεοζδ ηςκ θζπμζςιάηςκ ζε ιζα άθθδ ηανηζκζηή ζεζνά ηδκ P388D1 (Leserman LD., 1980). Καζ πάθζ εδχ, ημ απηέκζμ ζοκδευηακ ιε PE έηζζ χζηε κα είκαζ εθζηηή δ εκζςιάηςζδ ημο ζηδ θζπζδζηή δζπθμζηζαάδα (Weinstein JN., 1978). 2.3 ΑΝΟΟΛΙΠΟΨΜΑΣΑ ΚΑΙ ΕΝΕΡΓΗ ΣΟΦΕΤΗ πςξ είδαιε ηαζ πνζκ, μ πζμ ζοκδεζζιέκμξ πνμζδέηδξ ζηδκ επζθάκεζα ηςκ θζπμζςιάηςκ είκαζ ηα ακηζζχιαηα. Σα ακμζμθζπμζχιαηα απμηεθμφκ ιζα δοκαιζηή ζηναηδβζηή ζηδκ εκενβδηζηή ζηυπεοζδ. Σα ηεθεοηαία πνυκζα ηα ακμζμθζπμζχιαηα έπμοκ ηενδίζεζ ηδκ ακαβκχνζζδ ςξ πζεακμί θμνείξ αζμδναζηζηχκ εκχζεςκ βζα ηανηζκζηή ζηυπεοζδ. In vitro ιεθέηεξ επζαεααζχκμοκ ηδ ζηακυηδηα ηςκ ακμζμθζπμζςιάηςκ κα ακαβκςνίγμοκ ηαζ κα πνμζδέκμκηαζ εζδζηά ζε ακηζβυκα. Δπζπθέμκ in vivo ένεοκεξ έπμοκ απμδείλεζ ηδ πνδζζιυηδηα ηςκ θζπμζςιάηςκ ζε ζοκδοαζιυ ιε ακηζηανηζκζηά ιυνζα εκζςιαηςιέκα ζε αοηά. Ζ ημλζηυηδηα ιεζχκεηαζ δναιαηζηά υπζ ιυκμ θυβς ημο εβηθεζζιμφ ηςκ θανιάηςκ ζε ζςιαηίδζα αθθά ηαζ ηδκ δοκαιζηή ηςκ αζμδναζηζηχκ εκχζεςκ δ μπμία παναιέκεζ ίδζα ή είκαζ ηαζ ορδθυηενδ απυ ηδξ εθεφεενδξ αζμδναζηζηήξ έκςζδξ ( Park JW,1997). Δπζπθέμκ ζηαεενέξ θζπμζςιζηέξ θανιαημιμνθέξ (liposomal doxorubicin, Doxil, ηαζ liposomal daunorubicin, Daunosome) έπμοκ ήδδ 47

64 βίκεζ απμδεηηέξ ςξ θανιαηεοηζηέξ ιμνθέξ ζηδκ μβημθμβία. Δίκαζ θακενυ υηζ εηηυξ απυ ηδκ ηεπκζηή πμο πνδζζιμπμζείηαζ βζα ηδκ πνυζδεζδ ηςκ ακηζζςιάηςκ ζηα θζπμζχιαηα ηαζ άθθεξ δζαθμνεηζηέξ πανάιεηνμζ είκαζ ηνίζζιμζ, ζοιπενζθαιαακμιέκςκ ηδκ επζθμβή ημο ακηζζχιαημξ, ηδκ ποηκυηδηα ηςκ ακηζζςιάηςκ ζηδκ θζπμζςιζηή επζθάκεζα ηαζ ηδκ πνήζδ άεζηηςκ θζπμζςιάηςκ ή ηθαζιάηςκ. Δάκ επζεοιείηαζ δ ε- ζςηενίηεοζδ ημο θμνέα είκαζ ζδιακηζηυ κα επζθεβεί έκα ακηίζςια πμο πνμάβεζ ηδκ εζςηενίηεοζδ. Σμ πθεμκέηηδια ηδξ πνήζδξ ακηζζςιάηςκ πμο εζςηενζηεφμκηαζ ηαζ ιεζμθααμφκ βζα ηδκ εζςηενίηεοζδ ημο θμνέα, είκαζ υηζ ημ εβηθςαζζιέκμ θάνιαημ μδδβείηαζ ηαηεοεείακ εκδμηοηηανζηά, αεθηζχκμκηαξ έηζζ ημ εεναπεοηζηυ απμηέθεζια ηαζ ιεζχκεζ ηδκ δνάζεζ ημο ζημοξ άθθμοξ ζζημφξ. Πνέπεζ κα ημκζζηεί υηζ δ εζςηενίηεοζδ ίζςξ ελανηάηαζ ηαζ απυ ημ ιμκηέθμ (ηοηηανζηή ζεζνά) πμο επζθέβεηαζ βζα ηζξ in vitro ιεθέηεξ. Γζα πανάδεζβια, ακμζμθζπμζχιαηα πμο ζημπεφμοκ ζημ HER- 2 ακηζβυκμ ακαθένεδηε υηζ εζςηενζηέομκηακ επζηοπχξ απυ ηδκ ηοηηανζηή ζεζνά ακενχπζκςκ ιαζηζηχκ ηανηζκζηχκ ηοηηάνςκ θζβυηενμ απυ ηδκ ηοηηανζηή ζεζνά MKN-7 ακενχπζκςκ ζημιαπζηχκ ηοηηάνςκ ή ηςκ SKOV-3 ηανηζκζηχκ ηοηηάνςκ ηδξ ςμεήηδξ, ηαζ ηαευθμο απυ ηα N-87 ακενχπζκα βαζηνζηά ηανηζκζηά ηφηηανα. Ζ επζθμβή ημο ακηζζχιαημξ ελανηάηαζ επίζδξ απυ ημ ηαηά πυζμ ακαιέκεηαζ κα έπμοκ εεναπεοηζηέξ ζδζυηδηεξ. Έκα ηαθυ πανάδεζβια δίκεηαζ απυ ηα anti-her2 ιμκμηθςκζηά ακηζζχιαηα πμο έπμοκ δνάζδ ηαηαζημθήξ ημο πμθθαπθαζζαζιμφ πμο ιπμνεί κα αεθηζχζεζ ηδκ εεναπεοηζηή ζηακυηδηα ημο εβηθςαζζιέκμο θανιάημο. Απυ ηδ ζηζβιή πμο ημ ακηίζςια έπεζ επζθεπεεί, είκαζ απαναίηδημ κα ηαεμνζζηεί δ πμζυηδηα ημο ακηζζχιαημξ πμο εα πνμζδεεεί ζηδκ επζθάκεζα ακά θζπυζςια ηαζ εα ελαζθαθίζεζ ηδκ δέζιεοζδ ηαζ ηδ ηοηηανζηή απυηνζζδ. Γεκ οπάνπεζ έκαξ ιυκμ ιαβζηυξ ανζειυξ ηαεχξ ιπμνεί κα πμζηίθεζ απυ 10 έςξ 40 πάκς απυ 240 ή ηαζ αηυια ορδθυηενα (Nassander UK., 1995, Mercadal M., 1999, Kirpotin D., 1997, Harding JA., 1997). Ο ανζειυξ πζεακυκ κα ελανηάηαζ άιεζα απυ ημ ζφζηδια ακηζζχιαημξ-ακηζβυκμο πμο έπεζ επζθεπεεί, ηδκ ακηίδναζδ πνμζηυθθδζδξ πμο έπεζ επζθεπεεί ηαζ απυ ηζξ δζαεέζζιεξ θεζημονβζηέξ μ- ιάδεξ ηςκ θζπμζςιάηςκ. Έκα άθθμ ηνίζζιμ ζδιείμ πμο απαζηεί ζηέρδ είκαζ εάκ πνέπεζ κα πνδζζιμπμζδεεί ακέπαθμ ακηίζςια ή ηθάζια [Fab ή (Fab)2], δ ηδξ βεκεηζηήξ ιδπακζηήξ Fv. Σα ηθάζιαηα είκαζ πνμηζιυηενα θυβς ηδξ απμοζίαξ ημο Fc ηιήιαημξ δ μπμία επζηνέπεζ ζηα θζπμζχιαηα κα ηοηθμθμνμφκ βζα πενζζζυηενμ πνυκμ ηαεχξ πνμζθαιαάκμκηαζ θζβυηενμ απυ ημ RES. F(ab )2 ηθάζιαηα επίζδξ δζαεέημοκ δζαεέζζιεξ εεζμθμιάδεξ βζα ζφγεολδ ζηα θζπμζχιαηα. Οζ εεζμθμιάδεξ ηδξ hinge πενζμπήξ απμηεθμφκ ζδακζηή εέζδ βζα πνυζδεζδ ηαεχξ υκηαξ ιαηνζά απυ ηδ εέζδ πνυζδεζδξ ημο ακηζβυκμο, ελαζθαθίγμοκ ζςζηυ πνμζακαημθζζιυ βζα ημ πνμζδεδειέκμ Fab ηθάζια ηαζ ηδκ ακμζμδναζηζηυηδηά ημο. Σέθμξ ηα, Fab ή Fv ηθάζιαηα είκαζ ζπεηζηά ιζηνά (50 or 25 kda, ακηίζημζπα) ζε ζφβηνζζδ ιε ημ μθυηθδνμ ακηίζςια IgG (150 kda) ή ημ F(ab )2 ηθάζια (100 kda) ηαζ αοηυ απμηεθεί πθεμκέηηδια υηακ ιεζμθααεί ιδπακζζιυξ ζφκηδλδξ ιεηαλφ ημο ηοηηάνμο ηαζ ηδξ θζζμζςιζηήξ ιειανάκδξ. 2.4 ΑΝΣΙΚΑΡΚΙΝΙΚΑ ΛΙΠΟΨΜΑΣΑ 48

65 Μζα εκδζαθένμοζα ζδζυηδηα ηςκ θζπμζςιάηςκ είκαζ δ θοζζηή ζηακυηδηά ημοξ κα ζημπεφμοκ ζε ηανηζκζημφξ ζζημφξ. Σμ εκδμεδθζαηυ ημίπςια ηςκ οβζή ακενχπζκςκ αζιαηζηχκ αββείςκ είκαζ εκημζπζζιέκα ιε εκδμεδθζαηά ηφηηανα ηα μπμία εκχκμκηαζ ζθζπηά ιεηαλφ ημοξ ιε ζηεκέξ ζοκδέζεζξ. Αοημί μζ ζηεκμζφκδεζιμζ ειπμδίγμοκ ηάεε ιεβάθμ ζςιαηίδζμ ημο αίιαημξ κα πενάζεζ έλς απυ ημ αββείμ. ιςξ ηα αββεία ζε ηανηζκζημφξ ζζημφξ δεκ δζαεέημοκ ηδκ ίδζα ζηακυηδηα ζοβηνάηδζδξ ζςιαηζδίςκ ζημ εζςηενζηυ ημοξ θυβς ηδξ ιεβαθφηενδξ δζαιέηνμο ηςκ πυνςκ. Λζπμζχιαηα ζοβηεηνζιέκμο ιεβέεμοξ, ζοκήεςξ ιέπνζ 400nm ιπμνμφκ βνήβμνα κα πενάζμοκ απυ ημ αίια ζηζξ ηανηζκζηέξ πενζμπέξ αθθά δεκ ζοιααίκεζ ημ ίδζμ ζε οβζείξ ζζημφξ ημο ζχιαημξ υπμο ημ εκδμεήθζμ ηςκ αββείςκ είκαζ ζθζπηά δμιδιέκμ. Ακηζηανηζκζηά θάνιαηα υ- πςξ ηα Doxorubicin (Doxil), Camptothecin ηαζ Daunorubicin (Daunoxome) έπμοκ ηοηθμθμνήζεζ ζηδκ αβμνά ζε θζπμζςιζηά ζοζηήιαηα ιεηαθμνάξ. Ανηεηέξ δζαθμνεηζηέξ ηεπκζηέξ έπμοκ εθανιμζηεί βζα κα ακηζιεηςπζζηεί δ α- κάπηολδ κεμπθαζηζηχκ ζζηχκ πνδζζιμπμζχκηαξ θζπμζςιζημφξ πανάβμκηεξ ιεηαθμνάξ. Κονίςξ ιπμνμφιε κα ηζξ δζαπςνίζμοιε ζε ηνεζξ ηαηδβμνίεξ. Σδ δζακμιή ακηζηανηζκζηχκ αζμδναζηζηχκ εκχζεςκ, ηδκ αεθηίςζδ ημο ίδζμο ημο αιοκηζημφ ζοζηήιαημξ ιε εκενβμπμίδζδ ηςκ ιαηνμθάβςκ (ακμζμεεναπεία), ηαεχξ ηαζ ηδ ιεηαθμνά ιμνίςκ ιε βεκεηζηέξ ηαζ ακμζμθμβζηέξ πθδνμθμνίεξ. ηδκ πενίπηςζδ πδιεζμεεναπείαξ βίκεηαζ ιεηαθμνά, ιέζς θζπμζςιάηςκ, θανιαημιμνίςκ ιζηνμφ ιμνζαημφ αάνμοξ, πμθοπεπηζδίςκ ηαζ πνςηεσκχκ. ηδκ πενίπηςζδ πδιεζμεεναπείαξ ιε θανιαημιυνζα ιζηνμφ ιμνζαημφ αάνμοξ ανηεηέξ πνμζεββίζεζξ έθηαζακ ζε επζηοπδιέκεξ εθανιμβέξ ιε απμηέθεζια ειπμνζηά δζαεέζζια θζπμζςιζηέξ αζμδναζηζηέξ μοζίεξ. Ζ ιέβζζηδ πνμζμπή δίκεηαζ ηχνα ζηδκ ηαθφηενδ ζηυπεοζδ ηςκ θζπμζςιάηςκ πμο θένμοκ ηα θανιαημιυνζα ηαζ ζηδκ βμκζδζαηή εεναπεία ημο ηανηίκμο. Βέααζα δ εζδζηή ζηυπεοζδ πνμτπμεέηεζ ηδκ εηιεηάθθεοζδ λεπςνζζηχκ, ιμκαδζηχκ ζδζμηήηςκ ηαζ ιμνζαηέξ ζηναηδβζηέξ πμο ζοιπενζθαιαάκμοκ πνυζδεζδ ιμκμηθςκζηχκ ακηζζςιάηςκ ζε θζπμζχιαηα (ακμζμθζπμζχιαηα). Παναδείβιαηα ηέημζςκ εθανιμβχκ έπμοκ ήδδ ακαθενεεί παναπάκς (οπμηεθάθαζμ 2.2). Με αοηυ ημκ ηνυπμ βίκεηαζ δοκαηή δ ζηυπεοζδ ζε ηανηζκζηά ηφηηανα ιε ακηζβμκμηαοημπμίδζδ ηαζ δ ιεηαθμνά ημο θανιάημο ιε εζςηενίηεοζδ ηςκ θζπμζςιάηςκ ζηα ηανηζκζηά ηφηηανα (Mastrobattista E., 1999). Πμθθά οπμζπυιεκα παναδείβιαηα είκαζ δ εκζζποιέκδ ακηζηανηζκζηή δναζηδνζυηδηα ηςκ anti- HER2 ακμζμθζπμζςιάηςκ πμο πενζέπμοκ doxorubicin (Park JW., 2002) ηαζ δ πνήζδ ηςκ anti EGFR (epidermal growth factor receptor) ακμζμθζπμζςιάηςκ ηα μπμία πανμοζζάγμοκ αολδιέκδ ηοηηανμημλζηή ζηακυηδηα in vitro εκάκηζ ηανηζκζηχκ ηοηηάνςκ πμο οπενεηθνάγμοκ ημκ EGFR ηαζ αολδιέκδ ζηακυηδηα in vivo ζε xenograft ιμκηέθα (Mamot C 2003). 49

66 3 ΑΙΜΑΣΟΕΓΚΕΥΑΛΙΚΟ ΥΡΑΓΜΟ Ζ δζαπέναζδ ημο αζιαημεβηεθαθζημφ θναβιμφ απμηεθεί ζδιακηζηυ αήια βζα ηδκ δζαπέναζδ εεναπεοηζηχκ παναβυκηςκ βζα ηδκ εεναπεία παεήζεςκ ημο εβηεθάθμο. Καηέπεζ κεονμπνμζηαηεοηζηυ νυθμ, ειπμδίγμκηαξ ηδκ ιεηαθμνά ζδιακηζηχκ δζαβκςζηζηχκ ηα εεναπεοηζηχκ παναβυκηςκ. Θεναπεοηζηά ιυνζα ηαζ βμκίδζα πμο εα ιπμνμφζακ κα ήηακ απμηεθεζιαηζηά βζα ηδκ δζάβκςζδ ηαζ ηδκ εεναπεία δεκ ιπμνμφκ κα δζαζπίζμοκ ημκ αζιαημεβηεθαθζηυ θναβιυ ζε ζηακμπμζδηζηέξ πμζυηδηεξ. Ο ιδπακζζιυξ βζα ηδκ ζηυπεοζδ ηςκ θανιάηςκ ζημκ ΑΔΦ πενζθαιαάκεζ δζαπέναζδ είηε ιέζς είηε πίζς απυ ημκ ΑΔΦ. Μέεμδμζ βζα ηδκ πμνήβδζδ αζμδναζηζηχκ εκχζεςκ δζαιέζμο ημο ΑΔΦ πενζθαιαάκμοκ δζάνδλδ ημο αζιαημεβηεθαθζημφ θναβιμφ ιε μζιςηζηά ιέζα, αζμπδιζηά ιε ηδ πνήζδ επεκενβχκ ζε αζιμθυνα αββεία μοζζχκ υπςξ αναδζηζκίκδ ή αηυια ηαζ ιε ημπζηή έηεεζδ ζε ζε ορδθήξ έκηαζδξ οπένδπμοξ. Άθθεξ ιέεμδμζ πμο πνδζζιμπμζμφκηαζ βζα ηδκ δζαπέναζδ ημο ΑΔΦ ειπενζέπμοκ ηδκ εηιεηάθθεοζδ ηςκ εκδμβεκχκ ζοζηδιάηςκ ιεηαθμνάξ, ζοιπενζθαιαακμιέκςκ ηςκ ιεηαθμνέςκ βθοηυγδξ ηαζ αιζκμλέςκ, ημοξ οπμδμπείξ ζκζμοθίκδξ ηαζ ηνακζθεννίκδξ ηαζ ημ ιπθμηάνζζια ηςκ ιεηαθμνεχκ εηνμήξ υπςξ ηδκ p-βθοημπνςηείκδ Κ Δ Θ Ξ Σ Π Γ Θ Δ Ρ Ξ Σ Α Θ Λ Α Ξ Δ Γ Ι Δ Τ Α Κ Θ Ι Ξ Σ Τ Π Α Γ Λ Ξ Σ Ζ ηφνζα θεζημονβία ημο αζιαημεβηεθαθζημφ θναβιμφ είκαζ δ πνμζηαζία ημο εβηεθάθμο απυ ηζξ ιεηααμθέξ ηςκ επζπέδςκ ηςκ ζυκηςκ, ηςκ αιζκμλέςκ, ηςκ πεπηζδίςκ ηαζ άθθςκ μοζζχκ ζημ αίια. Ο θναβιυξ εκημπίγεηαζ ζηα εβηεθαθζηά ηνζπμεζδή αββεία, ηα μπμία πανμοζζάγμοκ δφμ ζδζαζηενυηδηεξ. Σα ηφηηανα πμο ζπδιαηίγμοκ ηδκ εζςηενζηή επζθάκεζα αοηχκ ηςκ αββείςκ (εκδμεδθζαηά ηφηηανα) εκχκμκηαζ πμθφ ζηεκά ιεηαλφ ημοξ ιέζς εζδζηχκ ζοκδέζεςκ. Οζ ζοκδέζεζξ αοηέξ δεκ επζηνέπμοκ ζηζξ οδαημδζαθοηέξ μοζίεξ κα πενάζμοκ εθεφεενα απυ ημ αίια ηαζ κα εζζέθεμοκ ηεθζηά ζημ άιεζμ πενζαάθθμκ ηςκ εβηεθαθζηχκ ηοηηάνςκ. Δπίζδξ, ηα ηνζπμεζδή αββεία ημο εβηεθάθμο πενζαάθθμκηαζ απυ εζδζηέξ μιάδεξ ηοηηάνςκ πμο μκμιάγμκηαζ αζηνμηφηηανα ηαζ απμηεθμφκ έκακ επζπθέμκ θναβιυ ζηδ δίμδμ ηςκ μοζζχκ. οκεπχξ, δ ιυκδ μδυξ βζα κα δζέθεμοκ απυ ημκ αζιαημεβηεθαθζηυ θναβιυ μζ οδαημδζαθοηέξ μοζίεξ είκαζ δζαιέζμο ηςκ ίδζςκ ηςκ εκδμεδθζαηχκ ηοηηάνςκ. 50

67 Δπίζδξ ιεηαθμνζηέξ πνςηεΐκεξ πμο πνμθαιαάκμοκ ηδκ δζαπέναζδ ζοζηαηζηχκ πμο θεζημονβμφκ ςξ οπμζηνχιαηα βζα αοηά. ε αοηέξ ηζξ μοζίεξ πενζθαιαάκμκηαζ ηαζ ηάπμζεξ ηθζκζηά δμηζιαζιέκεξ αζμδναζηζηέξ εκχζεζξ (θζπυθζθα θάνιαηα ηαζ λεκμαζμηζηά). ε αοηή ηδκ ηαηδβμνία οπμδμπέςκ ακήημοκ μζ P-glycoproteins (P-gp), μζ πνςηείκεα ακηίζηαζδξ (breast cancer resistance proteins BCRP) ηαζ δ μζημβέκεζα ηςκ (πμθοακεεηηζηχκ πνςηεσκχκ ακηίζηαζδξ (multidrug resistance proteins MRP). ιςξ, ηαζ δ ιειανάκδ αοηχκ ηςκ ηοηηάνςκ απμηεθείηαζ απυ ιζα δζπθμζηζαάδα πνςηεσκχκ/θζπζδίςκ θεζημονβχκηαξ ςξ ημ ηφνζμ ηιήια ημο αζιαημεβηεθαθζημφ θναβιμφ. Ακηίεεηα, μζ θζπμδζαθοηέξ μοζίεξ (ζοιπενζθαιαακμιέκςκ ημο μλοβυκμο, ημο δζμλεζδίμο ημο άκεναηα, ηςκ ακαζζεδηζηχκ ηαζ ημο αθημυθ) ιπμνμφκ κα εζζέθεμοκ απυ ημ αίια ζηζξ δζάθμνεξ πενζμπέξ ημο εβηεθάθμο. Οζ παναπάκς δμιζηέξ ζδζυηδηεξ ημο αζιαημεβηεθαθζημφ θναβιμφ ζοκδοάγμκηαζ ιε ηδκ πανμοζία εζδζηχκ εκγφιςκ ζηα εβηεθαθζηά ηνζπμεζδή πμο ηαηαζηνέθμοκ ιδ επζεοιδηά πεπηίδζα ηαζ άθθα ιζηνά ιυνζα πμο θένμκηαζ ιε ημ αίια ζημκ εβηέθαθμ. Έηηυξ απυ ημκ πνμζηαηεοηζηυ ημο νυθμ μ αζιαημεββεθαθζηυξ θναβιυξ εθμδζάγεζ ημκ εβηέθαθμ ιε απαναίηδηα ενεπηζηά ζοζηαηζηά υπςξ βθοηυγδ, αιζκμλέα ιε δζαδζηαζίεξ εκενβδηζηήξ ιεηαθμνάξ. Δπζπθέμκ μ αζιαημεβηεθαθζηυξ θναβιυξ νοειίγεζ ηδκ ςζιςηζηή πίεζδ ημο ηεκηνζημφ κεονζημφ ζοζηήιαημξ βζα κα ελαζθαθίζεζ ηδκ ζςζηή ημο θεζημονβία. Ζ ηίκδζδ μπμζμοδήπμηε ζοζηαηζημφ απυ ημκ αζιαημεβηεθαθζηυ θναβιυ ζημκ εβηέθαθμ πενζθαιαάκεζ υπζ ιυκμ ηδ δζαπέναζδ ηαηά ιήημξ ημο αζιαημεβηεθαθζημφ θναβιμφ άθθα ηαζ ηδκ ηαηακμιή ημο ζηα ηνζπμεζδή ιέζς ημο αίιαημξ. ηδ νμή ημο αίιαημξ ιέζα ζηα ηνζπμεζδή, ηα ζοζηαηζηά ιπμνμφκ κα ιεηαθενεμφκ ιέζς ημο πθάζιαημξ, ηςκ πνςηεσκχκ ηαζ ηςκ ηοηηάνςκ ημο αίιαημξ. Ζ ηαηακμιή ηςκ ζοζηαηζηχκ ζηα εκδμαββεζαηά ηιήιαηα, δ δοκαιζηή ηδξ ακηαθθαβήξ ιεηαλφ ημοξ ηαζ δ ζπεηζηή νμή ημο ηαεεκυξ ιέζα ζημ αββεζαηυ ζφζηδια επδνεάγμοκ ηδκ πνυζθδρδ. Ζ εζζνμή ηαηά ιήημξ ημο αζιαημεβηεθαθζημφ θναβιμφ ελανηάηαζ απυ ηδκ επζθάκεζα s ηαζ ημκ ζοκηεθεζηή δζαπεναηυηδηα p. Καζ μζ δφμ αοημί πανάβμκηεξ πμζηίθμοκ ζδιακηζηά ζηα δζάθμνα ζδιεία ημο εβηεθάθμο. Αοημί δ απυ ημζκμφ ελάνηδζδ δείπκεηε λεηάεανα ιε ηδκ έηθναζδ ηδξ αββεζαηήξ δζαπεναηυηδηαξ (PS). Ο πανάβμκηαξ p δζαθένεζ ιεηαλφ δζαθμνεηζηχκ ζοζηαηζηχκ ηαζ ελανηάηαζ απυ πανάβμκηεξ υπςξ δ θζπμδζαθοηυηδηα ηςκ ζοζηαηζηχκ, ημ ιμνζαηυ ιέβεεμξ, ημκ ζοκηεθεζηή δζάποζδξ, ηδκ έηηαζδ ημο ιεηααμθζζιμφ ιέζα ζηα εκδμεδθζαηά ηφηηανα ηαζ δ αθθδθεπίδναζδ ιε ιεηαθμνείξ πμο δζεοημθφκμοκ ηδκ νμή πνμξ ηδκ ιία ή ηδκ άθθδ ηαηεφεοκζδ δ ηαζ πνμξ ηζξ δφμ ηαηεοεφκζεζξ ηαηά ιήημξ ημο αζιαημεβηεθαθζημφ θναβιμφ. 3.2 Α Μ Α Ξ Λ Θ Α Ω Μ Δ Γ Ι Δ Τ Α Κ Θ Ι Ω Μ Π Θ Υ Ξ Δ Θ Δ Ω Μ 51

68 Tα εβηεθαθζηά ηνζπμεζδή είκαζ ηα ιζηνυηενα αββεία ημο ακενχπζκμο ηοηθμθμνζημφ ζοζηήιαημξ (3-7 ιm δζάιεηνμξ) ιε μθζηυ ιήημξ km ηαζ επζθάκεζα 20 m 2 (Pardridge 2003). Γζαθμνεηζημί ηφπμζ ηοηηάνςκ υπςξ εκδμεδθζαηά ηφηηανα, αζηνμηφηηανα, πενζηφηηανα ηαζ κεονχκεξ δμιμφκ αοηά ηα ηνζπμεζδή. Σμ ηοηηανζηυ ζφιπθεβια μκμιάγεηαζ κεονμαββεζαηή ιμκάδα ηαζ νοειίγεζ ηδκ εβηεθαθζηή νμή ημο αίιαημξ αθθδθεπζδνχκηαξ ιε θεία ιοσηά ηφηηανα (Abbott et al., 2006).. Βαςικι μεμβράνθ Νευρώνασ περικφτταρο Ενδοκθλιακό κφτταρο των τριχοειδών Στενοςφνδεςμοσ Αςτροκφτταρο Μικρογλοία Εικόνα 25. Κυτταρικά ςυςτατικά του αιματοεγκεφαλικοφ φραγμοφ. Ο φραγμόσ ςυνίςταται από ενδοκθλιακά κφτταρα των τριχοειδϊν αγγείων, περιβάλλεται από βαςικι μεμβράνθ και πόδια αςτροκυττάρων, περικφτταρα και μικρογλοία (Abbott et al. 2006)). ε ακηίεεζδ ιε ηα πενζθενζηά εκδμεδθζαηά ηφηηανα ηα εκδμεδθζαηά ηφηηανα ημο εβηεθάθμο παναηηδνίγμκηαζ απυ ορδθυ ιζημπμκδνζαηυ πενζεπυιεκμ (Oldendorf et al. 1977), ηδκ έθθεζρδ ιζηνχκ πυνςκ (Fenstermacher et al. 1988) ηαζ απυ ιζηνή πζκμηοηηανζηή δναζηδνζυηδηα (Sedlakova et al. 1999). Δπζπθέμκ ηα εκδμεδθζαηά ηφηηανα ημο αζιαημεβηεθαθζημφ θναβιμφ ζπδιαηίγμοκ ζηεκμζοκδέζεζξ πμο αζθαθίγμοκ ηδκ παναηοηηανζηή δζαπέναζδ ηςκ οδνυθζθςκ ζοζηαηζηχκ. Σα εκδμεδθζαηά ηφηηανα ακαπηφζζμκηαζ πάκς ζηδ ααζζηή ιειανάκδ, ιία ιειανάκδ ιε ζφκεεηδ δμιή ημθθαβυκμο ηαζ πνςηεσκχκ υπςξ θαιζκίκδ, θζιπνμκεηηίκδ ηαζ άθθεξ πνςηεΐκεξ ηδξ ελςηοηηάνζαξ φθδξ (Goldsteinand Betz 1983). Σα εκδμεδθζαηά ηφηηανα ιμζνάγμκηαζ ηδκ ααζζηή ιειανάκδ ιε πενζαάθθμκηα πενζηφηηανα, κεονχκεξ ηαζ πνμελέπμκηα πυδζα ηςκ αζηνμηοηηάνςκ. Απυ ημ βεβμκυξ υηζ ηα πενζηφηηανα ηαζ ηα αζηνμηφηηηανα είκαζ ζε ζηεκή επαθή ιε ηα εκδμεδθζαηά είπε βίκεζ δ οπυεεζδ υηζ αοηά ηα ηφηηανα ιπμνεί κα πνμάβμοκ ζοβηεηνζιέκα παναηηδνζζηζηά ηςκ αζιαημεβηεθαθζηχκ εκδμεδθζαηχκ ηοηηάνςκ. ε in vitro ιμκηέθα έπεζ απμδεζπεεί υηζ ηα αζηνμηφηηανα αεθηζχκμοκ ηδ θεζημονβία ημο θναβιμφ ηαζ αθθάγμοκ ηδκ έηθναζδ οπμδμπέςκ αζμδναζηζηχκ εκχζεςκ υπςξ ηδξ P- glycoprotein (P-gp) ή ημο ιεηαθμνέα ηδξ βθοηυγδξ (GLUT-1) απεθεοεενχκμκηαξ δζαθοημφξ πανάβμκηεξ, μζ μπμίμζ αθθδθεπζδνμφκ ιε ηα εκδμεδθζαηά ηφηηανα (Schinkel 1999; McAllister et al. 2001). Οζ πανάβμκηεξ TGF (transforming growth factor) GDNF (glial-derived neurotrophic factor) ηαζ bfgf (basic fibroblast growth factor) ζοκηεθμφκ ζηδκ ηαθφηενδ δυιδζδ ηςκ ζδζμηήηςκ ημο αζιαημεβηεθαθζημφ θναβιμφ. Δπίζδξ βζα ηα αζηνμηφηηανα ηαζ ηα πενζηφηηανα πμο πενζαάθθμοκ ηα εκδμεδθζαηά ηφηηανα έπεζ πνυζθαηα απμδεζπεεί υηζ εοεφκμκηαζ βζα ηδκ ςνίιακζδ εκυξ ακέπαθμο 52

69 θναβιμφ (Abbott et al. 2006). Δίπε πνμηαεεί υηζ ηα πενζηφηηανα ζηαεενμπμζμφκ αοηή ηδ δμιή ηςκ εκδμεδθζαηχκ εβηεθαθζηχκ ηνζπμεζδχκ ειπμδίγμκηαξ ηδκ απυπηςζδ ημο εκδμεδθίμο (Ramsauer et al. 2002). Σμ αίια ιεηαθένεζ ζοζηαηζηά ζημκ αζιαημεβηεθαθζηυ θναβιυ ιέζς πμθφπθμηςκ, δζαηθαδζζιέκςκ δζηηφςκ ηςκ αββείςκ. Αοηά ηα δίηηοα πνμιδεεφμκηαζ απυ ιζηνέξ ανηδνίεξ, ηα μπμία πενζαάθθμκηαζ ηιδιαηζηά ή ελ μθμηθήνμο απυ πενζαββεζαηυ πχνμ. Αοηυξ είκαζ ζε άιεζδ επαθή ιε ημ οπμαναπκμζδζηυ εβηεθαθμκςηζαίμ οβνυ (sabarachnoidal cerebrospinal fluid CSF) ηαζ ζοπκά πενζθαιαάκεζ ιζηνμβθμία ηαζ θαβμηφηηανα ημο εβηεθάθμο. Σα ηνζπμεζδή δζμπεηεφμοκ ημ πενζεπυιεκυ ημοξ ζε έκα ιζηνυ ανζειυ ζοθθεηηζηχκ αβςβχκ. Αοηά ηα αββεία είκαζ θεπηυημζπα, απμηεθμφκηαζ ηονίςξ απυ εκδμεήθζμ ηαζ θεζημονβμφκ ςξ αββεία ακηαθθαβήξ. Πμθθέξ ιεθέηεξ δδθχκμοκ υηζ αοηά ηα αββεία είκαζ πζμ επζννεπή ζε νήλδ πμο ζοκεπάβεηαζ ηδκ ηαηάννεοζδ ημο αζιαημεβηεθαθζημφ θναβιμφ. Δίκαζ βκςζηυ υηζ οπάνπμοκ 4-5 θμνέξ πενζζζυηενα ηέημζα ζοθθεηηζηά αββεία απυ υηζ ιζηνέξ ηεθζηέξ ανηδνίεξ. Βέααζα ηα ηνζπμεζδή δεκ επεηηείκμκηαζ απυ ηδκ ανηδνία ζηα ζοθθεηηζηά ζςθδκάνζα πςνίξ κα δζαηθαδίγμκηαζ ζε παναηάλεζξ ηιδιάηςκ. Αοηά ηα ηιήιαηα ηςκ ηνζπμεζδχκ είκαζ μζ ααζζηέξ ιμκάδεξ ημο ηνζπμεζδμφξ ζοζηήιαημξ ηαζ πμζηίθμοκ ζδιακηζηά ζε ιέβεεμξ, πθάημξ ζοκεηηζηυηδηα ηαζ ζπήια. Σνζζδζάζηαηεξ δμιέξ δείπκμοκ υηζ ηα δζάθμνα ηιήιαηα ηοιαίκμκηαζ ζε ιήημξ απυ ιm ηαζ ιέζδ δζάιεηνμ απυ 3-10 ιm. Σα ηιήιαηα ηςκ ηνζπμεζδχκ ημο εβηεθάθμο δζαηθαδίγμκηαζ ηαζ εκχκμκηαζ ζοκεπχξ, ζοκηεθυκηαξ ζηδκ έκςζδ πμθθχκ ακ υπζ υθςκ ηςκ ημιιαηζχκ ιζαξ πενζμπήξ. Άθθα εηηυξ απυ ηδ ζφκδεζδ ιεηαλφ ημοξ ηα δζάθμνα ηιήιαηα δζαθένμοκ πμθφ ζε ιέβεεμξ ηαζ ζπήια. Ίζςξ ηα πενζαάθθμκηα εβηεθαθζηά ηφηηανα επζαάθθμοκ αοηέξ ηζξ δζαθμνέξ ζηα ηιήιαηα ηςκ ηνζπμεζδχκ έηζζ χζηε κα ακηαπμηνίκμκηαζ ηαθφηενα ζηζξ ακάβηεξ ηδξ πενζμπήξ πμο ηαθφπημοκ. Ο αζιαημεβηεθαθζηυξ θναβιυξ απμηεθείηαζ απυ ζηεκέξ ζοκδέζεζξ ηςκ εκδμεδθζαηχκ ηοηηάνςκ. Αοηέξ μζ ζοκδέζεζξ ηοηθχκμοκ ηάεε εκδμεδθζαηυ ζακ γχκδ ηαζ εκχκμοκ ηαζ βεζημκζηά ηφηηανα αθθά ηαζ ημκηζκά υνζα ημο ίδζμο ηοηηάνμο. Φοζζμθμβζηά μζ δζαθοιέκεξ μοζίεξ αδοκαημφκ κα δζαπενάζμοκ αοηέξ ηζξ ζηεκέξ ζοκδέζεζξ, ζοκεπχξ βζα κα πενάζμοκ πνέπεζ κα ηζκδεμφκ δζαιέζμο ηδξ ιειανάκδξ ηαζ ίζςξ ηαζ ημκ εκδμηοηηανζηχκ ηιδιάηςκ ηςκ εκδμεδθζαηχκ ηοηηάνςκ. Αοηή δ ζεζνζαηή δζάηαλδ ηςκ θναβιχκ ηαζ ηςκ δζαθυνςκ ηιδιάηςκ ακαιθίαμθα ζοκεζζθένμοκ ζδιακηζηά ζηδκ ακηίζηαζδ (resistance) ημο αζιαημεβηεθαθζημφ θναβιμφ. Σα εκδμεδθζαηά ηφηηανα ηςκ αζιμθυνςκ αββείςκ θοζζμθμβζηά έπμοκ πμθθμί θίβμοξ ιζηνμπυνμοξ ημ μπμίμ επζαεααζχκεζ υηζ είκαζ πμθφ ιζηνή δ δζαπέναζδ δζαιέζμο ηςκ ηοηηάνςκ ζε έκακ ακέπαθμ αζιαημεβηεθαθζηυ θναβιυ. Αοηά ηα ηφηηανα ζηενμφκηαζ ιζηνμακμζβιάηςκ, ηα μπμία ζπδιαηίγμκηαζ ζε άθθμοξ ζζημφξ απυ ηδκ ηθεζζηή απυεεζδ ηδξ ελςηενζηήξ ηαζ εζςηενζηήξ ιειανάκδξ ηαζ είκαζ ημζκά ζε ηνζπμεζδή αββεία πμο ζπδιαηίγμοκ αζμθμβζηά οβνά υπςξ αοηά ηςκ κεθνχκ. Αοηή δ έθθεζρδ είκαζ έκαξ πανάβμκηαξ πμο ζοκηεθεί ζηδκ βκςζηή ορδθή δθεηηνζηή ακηίζηαζδ ημο αζιαημεβηεθαθζημφ θναβιμφ. Σα ηφηηανα ημο αζιαημεβηεθαθζημφ θναβιμφ πενζέπμοκ πμθθά ιζημπυκδνζα βεβμκυξ πμο οπμδδθχκεζ ηδκ ορδθή ιεηααμθζηή δναζηδνζυηδηα. Σμ ημίπςια ηςκ ηνζπμεζδχκ ημο 53

70 εβηεθάθμο απμηεθείηαζ απυ ποηκή παπζά εζςηενζηή ιειανάκδ. Καηά ηυπμοξ δ εζςηενζηή ιειανάκδ δζαπςνίγεηαζ ηαζ εζςηθείεζ ιζηνά ζημονυπνςια πενζηφηηανα. Αοηά ηα ηφηηανα έπμοκ πμθθέξ ηαηεοεφκζεζξ ηαζ επεηηείκμκηαζ ζημ εκδμεήθζμ, υπμο ζπεδυκ ημ αημοιπμφκ ιέζς ηδξ ααζζηήξ ιειανάκδξ ημο ηνζπμεζδμφξ. Θεςνείηαζ υηζ ηα πενζηφηηανα έπμοκ ζοζηαθηζηή, ακμζμθμβζηή ηαζ θαβμηοηηανζηή θεζημονβία Ρ Δ Γ Α Μ Ξ Θ Ρ Σ Μ Δ Δ Ρ Λ Ξ Θ Σμ ηθεζδί ζηδ δμιή ημο ΑΔΦ είκαζ μζ ζηεκμζοκδέζεζξ. πςξ θαίκεηαζ ζε εζηυκεξ ηνοεηημιήξ μζ ζηεκμζοκδέζεζξ ζοκανιμθμβμφκηαζ απυ έκα ζφιπθεβια εκδμιειανακζηχκ ζκζδίςκ, ηα μπμία ζοζθίββμοκ ηα ηεκά ιεηαλφ ηςκ ηοηηάνςκ (Nagy et al. 1984). Οζ ζηεκμζοκδέζεζξ απμηεθμφκηαζ απυ ηνεζξ ακαπυζπαζηεξ ιειανακζηέξ πνςηεΐκεξ (occludin, claudin ηαζ junctional adhesion molecules (JAM)), μζ μπμίεξ είκαζ ζοκδεδειέκεξ ζε δζαθμνεηζηέξ ηοηηανμπθαζιαηζηέξ πνςηεΐκεξ, ζοιπενζθαιαακμιέκςκ ηςκ zonula occludζns (ZO) πνςηεΐκεξ ZO-1, ZO-2, ZO-3 ηαζ ηδκ cingulin. πςξ ήδδ ακαθένεδηε μζ ζηεκμζοκδέζεζξ είκαζ βκςζηυ υηζ πνμθαιαάκμοκ ηδκ παναηοηηανζηή δζαπέναζδ ιζηνχκ ιμνίςκ αηυια ηαζ ζυκηςκ υπςξ ηςκ Na+ ηαζ Cl-. Αοηή δ ζδζυηδηα μδδβεί ζε ορδθή δζαεκδμεδθζαηή δθεηηνζηή ακηίζηαζδ (transendothelial electrical resistances TEER) ηςκ 1,500-2,000 Ω/ cm 2 in vivo (Butt et al.,1990). Ζ πνχηδ ακαπυζπαζηδ ιειανακζηή πνςηεΐκδ πμο ακαηαθφθεδηε ήηακ δ 65 kda occludin (Furuse et al. 1993). Ζ δμιή ηδξ μηθμοδίκδξ ζοκίζηαηαζ απυ ηέζζενζξ δζαιειανακζηέξ πενζμπέξ, ιία ιαηνζά ηοημπθαζιαηζηή ηαναμλοηεθζηή ηαζ ιία ημκηή ηοημπθαζιαηζηή αιζκμηεθζηή. Ζ μηθμοδίκδ είκαζ άιεζα ζοκδεδειέκδ ιε ηζξ ZO πνςηεΐκεξ ιέζς ηςκ ηοημπθαζιαηζηχκ πενζμπχκ (Hirase et al. 1997). Ένεοκεξ οπμδδθχκμοκ υηζ δεκ ζοκεζζθένεζ άιεζα ζηδκ παναηοηηανζηή ακηίζηαζδ αθθά νοειίγεζ ηδκ δζαπεναηυηδηα ηςκ ζηεκμζοκδέζεςκ πμο ελανηάηαζ απυ ηδκ ηαηάζηαζδ θςζθμνοθίςζδξ ηδξ (reviewed in (Wolburg and Lippoldt 2002)). Μέπνζ ηχνα είκαζ βκςζηά 24 ιέθδ απυ ηδκ μζημβέκεζα ηςκ ηθαμοδζκχκ (Ballabh et al. 2004). Αοηέξ μζ θςζθμπνςηεΐκεξ ηςκ 22 kda δζαεέημοκ ηέζζενζξ δζαιειανακζηέξ πενζμπέξ ηαζ πνμζδέκμκηαζ ιε ηα ηαναμλοηεθζηά άηνα ημοξ ζηζξ ηοηηανμπθαζιαηζηέξ πνςηεΐκεξ υπςξ ZO-1, ZO-2 ηαζ ZO-3 (Furuse et al. 1998). Πνμζδεδειέκεξ μιμζμηοπζηά δ ιία ζηδκ άθθδ μζ μηθμοδίκεξ εεςνείηαζ υηζ αζθαθίγμοκ ηζξ ζηεκμζοκδέζεζξ (Furuse et al. 1999). ημκ αζιαεβηεθαθζηυ θναβιυ μζ claudin-3 (formerly classified as claudin-1) ηαζ claudin-5 ειθακίγμκηαζ κα είκαζ οπεφεοκεξ βζα ηδκ παιδθή παναηοηηανζηή δζαπεναηυηδηα (Morita et al., 1999; Liebner et al., 2000, Liebner et al., 2000, Lippoldt et al., 2000). 54

71 Εικόνα 26. Μοριακι οργάνωςθ των ςτεγανανϊν ςυνδζςμων (από Neuwelt et al. 2008)) Οζ JAM είκαζ 40 kda πνςηεΐκεξ πμο έπμοκ ιία δζαιειανακζηή πενζμπή ηαζ ιζα ελςηοηηανζηή πενζμπή ιε δφμ εδθζέξ πμο ζπδιαηίγμκηαζ απυ δζζμοθθζδζημφξ δεζιμφξ (Martin-Padura et al. 1998). ηα εβηεθαθζηά εκδμεδθζαηά ηφηηανα μζ JAM-1, JAM-2 ηαζ JAM-3 ζοκεζζθένμοκ ζηδκ δζαηήνδζδ ηςκ ζηεκμζοκδέζιςκ (Palmeri et al. 2000; Aurrand-Lionset al. 2001). Οζ ακαπυζπαζηεξ ιειανακζηέξ πνςηεΐκεξ είκαζ αβηονμαμθδιέκεξ ζε ηοηηανμπθαζιαηζηέξ πνςηεΐκεξ ηονίςξ ZO-1, ZO-2 ηαζ ZO-3. Σα ZO ιυνζα ηαζ ηα cingulin είκαζ membrane-associated guanylate kinase-like protein (MA- GUKs). Αοηέξ ιμζνάγμκηαζ μνζζιέκεξ πενζμπέξ (SH3, βμοακζθζηή ηοηθάζδ ηαζ ηδκ PDZ πενζμπή), μζ μπμίεξ ημοξ επζηνέπμοκ κα ιεηέπμοκ ζηδκ ιεηάδμζδ ζήιαημξ ηαζ κα αβηονμαμθμφκ ηζξ πνςηεΐκεξ πμο εοεφκμκηαζ βζα ηζξ ζηεκμζοκδέζεζξ ζημκ ηοηηανμζηεθεηυ (Furuse et al., 1994, Itoh et al., 1999, Ebnet et al., 2000) Λ Δ Α Τ Ξ Π Α Ξ Σ Ρ Θ Ω Μ Ι Α Α Λ Ζ Ι Ξ Ρ Ξ Σ Α Δ Τ Όπωσ ιδθ αναφζρκθκε θ μεταφορά βιοδραςτικών ενώςεων κατά μικοσ του ΑΕΦ μπορεί να γίνει με διάφορουσ τρόπουσ ΠΑΘΗΣΙΚΗ ΔΙΑΧΤΗ 55

72 οζηαηζηά πμο εεςνείηαζ υηζ δεκ δζαπενκμφκ ηα εβηεθαθζηά ηνζπμεζδή ζηδκ πναβιαηζηυηδηα πενκμφκ αθθά ιε πμθφ παιδθμφξ νοειμφξ. πςξ ζοκμπηζηά ακαθένεδηε παναπάκς, μζ ζηεκέξ ζοκδέζεζξ ηςκ εβηεθαθζηχκ εκδμεδθζαηχκ ηοηηάνςκ ιπθμηάνμοκ ηδκ δζαπέναζδ υθςκ ηςκ μοζζχκ ηαζ πζεακυηαηα αηυια ηαζ ημο κενμφ, δζαιέζμο ημο ημζπχιαημξ ηςκ ηνζπμεζδχκ. Ζ ιεηαθμνά απυ ημ αίια ζημκ εβηέθαθμ απμηεθεί ιεηαθμνά δζαιέζμο ηδξ ηοηηανζηήξ ιειανάκδξ ηαζ πενζθαιαάκεζ δζάθοζδ ζηδκ ηοηηανζηή ιειανάκδ ημο εκδμεδθζαημφ ηοηηάνμο ηαζ δζάποζδ ζημ ηοηυπθαζια. Πνζκ απυ έκα αζχκα μ Overton απέδεζλε υηζ δ δζαπεναηυηδηα ηςκ ιειανακχκ ηςκ ηοηηάνςκ ελανηάηαζ απυ ηδκ θζπμθζθζηυηδηα ηαζ ηδκ ζηακυηδηα δζάποζδξ ιζαξ μοζίαξ. Γεδμιέκμο ηδξ ηοηηανζηήξ θφζδξ, δ δζαπέναζδ ηαηά ιήημξ ημο αζιαημεβηεθαθζημφ θναβιμφ επίζδξ αημθμοεεί ημκ ηακυκα ημο Οverton, ιζα οπυεεζδ πμο έπεζ εθεβπεεί (Fenstermacher, 1989 ηαζ 1992). Γζα αοηυ ημκ θυβμ, πνμζδζμνίζηδηακ ζηαεενέξ ιεηαθμνάξ απυ ημ αίια ζημκ εβηέθαθμ βζα πενζζζυηενεξ απυ είημζζ μοζίεξ ηαζ εηηζιήεδηακ ζηαεενέξ υπςξ ημ FVe ηαζ δζαβνάιιαηα ημο logps έκακηζ ημο log μηηακυθδ/κενμφ ζοκηεθεζηή ηαηακμιήξ ηαζ μ ζοκηεθεζηήξ δζάποζδξ (PcDC). Οζ πζμ αηναζέξ ηζιέξ ημο βζκμιέκμο PS ήηακ πενίπμο 4x10-5 ηαζ 4x10-4 ml/g min βζα ηζξ δφμ θζβυηενμ δζαπεναηέξ μοζίεξ, ζκμοθίκδ ηαζ ζμοηνυγδ, ακηίζημζπα ηαζ 2,0 ηαζ 3.0 ml/ g min βζα ηζξ δφμ πζμ δζαπεναηέξ μοζίεξ, αζεακυθδ ηαζ ζζμπνμπακυθδ, ακηίζημζπα. Σμ βζκυιεκμ PcDc ήηακ 7,5 x10-11 ηαζ 14x10-10 cm 2 /sec βζα ηδκ ζκμοθίκδ ηαζ ηδ ζμοηνυγδ, ακηίζημζπα, ηαζ 10x10-6 ηαζ 22x10-6 cm2/sec βζα ηδκ αζεακυθδ ηαζ ηδκ ζζμπνμπακυθδ ακηίζημζπα. ε ζοιθςκία ιε ημκ ηακυκα ημο Overton αοηέξ μζ βναθζηέξ δείπκμοκ ιζα βναιιζηή ζπέζδ ιεηαλφ ημο βζκμιέκμο PS ηαζ PcDC ηαζ δ ηθίζδ είκαζ ίζδ ιε έκα ζε log-log ηθίιαηα. Πανειπζπηυκηςξ μ θυβμξ ηςκ δζαθμνχκ ζημ βζκυιεκμ PcDc είκαζ μ ζοκηεθεζηήξ ηαηακμιήξ πμο πμζηίθεζ απυ 3*10-5 βζα ηδκ ζκμοθίκδ ζε 1,3 βζα ηδκ ζζμπνμπακυθδ. πςξ εα ήηακ ακαιεκυιεκμ έκα βνάθδια ημο log PS έκαηζ ημο log Pc είκαζ επίζδξ βναιιζηυ ηαζ έπεζ ηθίζδ ίζδ ιε ηδκ ιμκάδα. Ζ ζοιθςκία ιεηαλφ ηδξ δζαπεναηυηδηαξ ημο αζιαημεβηεθαθζημφ θναβιμφ ηαζ ημο ηακυκα ημο Overton οπμδδθχκεζ ηδκ θεζημονβία ηςκ ηνζπμεζδχκ ημο εβηεθάθμο ςξ ιειανάκεξ πςνίξ πυνμοξ. Γζ αοηυ είκαζ ζδιακηζηυ μζ ιεζμηοηηάνζμζ πχνμζ κα παναιέκμοκ ηθεζζηεί ηαζ κα απμηεθμφκ ειπυδζμ ζηδ δίμδμ ηςκ αζμδναζηζηχκ εκχζεςκ. Aοηυ ηάκεζ ημκ αζιαημεβηεθαθζηυ θναβιυ ηυζμ ζθζπηά δμιδιέκμ υπμο αηυια ηαζ έκα ιζηνυ άκμζβια ζηδ δμιή ημο αολάκεζ ζδιακηζηά ηδκ δζαννμή μοζζχκ ιε παιδθή θζπμδζαθοηυηδηα. Γζα πανάδεζβια δ εζζνμή ηδξ ζμοηνυγδξ ιπμνεί κα αολδεεί 2 θμνέξ εάκ πυνμζ αηηίκαξ 8nm ζε πμζμζηυ 0,0001% ηδξ επζθάκεζαξ ημο ημζπχιαημξ ημο ηνζπμεζδμφξ ηαζ 20 θμνέξ εάκ ημ πμζμζηυ βίκεζ 0,001% ηδξ επζθάκεζαξ (S). Ακαθφζεζξ ηδξ ηζκδηζηήξ ηδξ νμήξ ηαηά ιήημξ ημο ΑΔΦ απμηάθορακ ιζα δζπθήξ ηαηεφεοκζδξ, ελανηχιεκδ απυ ηδκ ζοβηέκηνςζδ, ιεηαθμνά δζαθοιέκςκ μοζζχκ πμο μνίγμκηαζ ςξ εζζνμή ηαζ εηνμή. Ζ ηαεανή νμή είκαζ δ δζαθμνά ιεηαλφ ηςκ δφμ πμζμζηχκ ηαζ επδνεάγεηαζ ζδιακηζηά απυ ηδ θφζδ ημο ΑΔΦ. Ζ νμή ηαηά ιήημξ ημο 56

73 ΑΔΦ είκαζ ηαεμνζζηζηήξ ζδιαζίαξ βζα ηδκ επίηεολδ εεναπεοηζηχκ ζοβηεκηνχζεςκ θανιάηςκ ζημ ηεκηνζηυ κεονζηυ ζφζηδια. Ανηεημί ιδπακζζιμί ιεηαθμνάξ μνζμεεημφκ ημκ ΑΔΦ. πςξ ήδδ ακαθένεδηε ηα ιζηνά θζπυθζθα ιυνζα ιπμνμφκ εφημθα κα δζαπενάζμοκ ηα ηνζπμεζδή. Σα ιυνζα υιςξ πμο είκαζ θμνηζζιέκα, ιεβάθμο ιμνζαημφ αάνμοξ ηαζ/ή οδνυθζθα απαζημφκ ηακάθζα/δζαφθμοξ, ΑΣΡ, ηαζ/ή οπμδμπείξ βζα κα ελαζθαθίζμοκ ηδκ δζαπέναζή ημοξ ηαηά ιήημξ ημο ΑΔΦ. ιςξ μ αζιαημεβηεθαθζηυξ θναβιυξ δεκ ανίζηεηαζ ζε υθμ ημ πθάημξ ημο εβηεθάθμο. Σα πενζημζθζαηά υνβακα ηα μπμία μνζμεεημφκ ηζξ ημζθίεξ ημο εβηεθάθμο δεκ ηαηέπμοκ ηιήια ημο ΑΔΦ. Αοηά ηα υνβακα ειπθέημκηαζ ιε ηδκ αίζεδζδ ηαζ ηδκ μνιμκζηή νφειζζδ (απυ ημ αοηυκμιμ κεονζηυ ζφζηδια). Ζ απμοζία ημο ΑΔΦ ζε αοηά ηα ζδιεία εθέβπμο ζοιαάθθεζ ζηδ δζαηήνδζδ εκυξ ζηαεενμφ εβηεθαθζημφ πενζαάθθμκημξ παναημθμοεχκηαξ ηδκ ακηζζηάειζζδ ηςκ ζοζηαηζηχκ απυ ημ αίια ηαζ εκενβμπμζχκηαξ ακαδναζηζημφξ ιδπακζζιμφξ υηακ ηνίκεηαζ απαναίηδημ ΠΡΩΣΕΪΝΕ-ΜΕΣΑΦΟΡΕΙ ΣΟΤ ΑΕΦ. οζηήιαηα ιεηαθμνάξ ή ιεηαθμνείξ δζεοημθφκμοκ ηδκ ηίκδζδ ηάπμζςκ ζοζηαηζηχκ ηαηά ιήημξ ημο αζιαημεβηεθαθζημφ θναβιμφ. Ζ έηθναζδ πνςηεσκχκ ιεηαθμνέςκ είκαζ έκα ζδιακηζηυ παναηηδνζζηζηυ ηςκ αζιαημεβηεθαθζηχκ εκδμεδθζαηχκ ηοηηάνςκ πμο ζπδιαηίγμοκ ημκ ΑΔΦ. Λυβς ημο υηζ μ θναβιυξ είκαζ διζπεναηυξ βζα ηα ζοζηαηζηά, ηα μπμία είκαζ απαναίηδηα βζα ηδκ ζςζηή θεζημονβία ημο εβηεθάθμο, πμθθά ζοζηήιαηα ιεηαθμνάξ είκαζ πανυκηα ζηα ηφηηανα αοηά ζοιπενζθαιαακμιέκςκ ηςκ GLUT1, ανηεηχκ ιεηαθμνέςκ αιζκμλέςκ, κμοηθεμζζδίςκ ηαζ ιμκμηααναμλοθζηχκ μλέςκ (Drewes, 2001). Γζα πανάδεζβια, δ δζεκδμεδθζαηή νμή ηδξ D-βθοηυγδξ ηαζ ηδξ L-θαζκοθαθακίκδξ οπμαμδεάηε απυ ημκ ιεηαθμνέα ηδξ βθοηυγδξ, 55 kd GLUT-1, ηαζ ημκ ιεηαθμνέα ιεβάθςκ μοδέηενςκ αιζκμλέςκ, ζφζηδια L, ακηίζημζπα. Οζ ηζιέξ ηέημζςκ ζοζηαηζηχκ ημο βζκμιέκμο PS εα είκαζ αλζμζδιείςηα ορδθυηενεξ απυ αοηέξ πμο πνμαθέπμκηαζ ιε αάζδ ημ βζκυιεκμ PcDc. Γζα πανάδεζβια, υηακ μζ ζοβηεκηνχζεζξ ημο πθάζιαημξ είκαζ ζε θοζζμθμβζηά επίπεδα, ημ βζκυιεκμ PS ημο D-βθοηυγδ είκαζ 50 ιε 100 θμνέξ απυ αοηήκ πμο πνμαθέπεηαζ απυ log PcDc δζάβναιια ηαζ ημ PS βζκυιεκμ βζα ημ L- θαζκοθαθακίκδ 10 θμνέξ ορδθυηενμ απυ αοηυ ηδξ πνυαθερδξ. Αοημί μζ οπμδμπείξ είκαζ πνςηεΐκεξ ειπεδςιέκεξ ζηδκ ιειανάκδ πμο πανμοζζάγμκηαζ είηε ζηδκ ελςηενζηή είηε ζηδκ εζςηενζηή ιειανάκδ ηδξ δζπθμζηζαάδαξ είηε ηαζ ζηζξ δφμ πθεονέξ. Γμιζηά πανυιμζα ζοζηαηζηά ακηαβςκίγμκηαζ βζα ηδκ εέζδ πνυζδεζδξ ζημκ οπμδμπέα ηαζ έπμοκ δζαθμνεηζηή ζοββέκεζα βζα ηδκ πνςηεΐκδ. πςξ ηαζ ιε ηα έκγοια, αοημί μζ οπμδμπείξ επζδεζηκφμοκ ελάνηδζδ απυ ηδκ ζοβηέκηνςζδ 57

74 ημο πνμζδέηδ (ημνεζιυξ) ηαζ ζηενεμεζδζηυηδηα (ππ. ιεηαθένμοκ D- αθθά υπζ L- βθοηυγδ). Έπμοκ έκα ιέβζζημ πμζμζηυ ιεηαθμνάξ ημο πνμζδέηδ ημ μπμίμ ιπμνεί κα ηνμπμπμζδεεί απυ ηζκμφιεκμοξ οπμδμπείξ ιέζα ηαζ έλς απυ ηδ ιειανάκδ ηαζ αθθάγμκηαξ ηδκ ηαπφηδηα ημο πνμζδέηδ πμο ιεηαθένεηαζ δζαιέζμο ηδξ ιειανάκδξ. Μενζηά απυ αοηά ηα ζοζηήιαηα ιεηαθμνάξ ίζςξ ζοκδέμκηαζ ιε ηθίζδ ζυκηςκ ηαζ άιεζα ή έιιεζα ελανηχκηαζ απυ ημ ATP. Άθθα ζοζηήιαηα δζεοημθφκμοκ ηδ νμή ημο οπμζηνχιαημξ έκακηζ ηδξ ηθζζδξ ηδξ ζοβηέκηνςζδξ ηαζ απαζημφκ είηε εκένβεζα είηε ζφκδεζδ ιε ηάπμζα ηθίζδ ζυκηςκ. πςξ ακαθένεηαζ παναπάκς, δ D-βθοηυγδ ηαζ άθθεξ D-ελυγεξ ιεηαθένμκηαζ ηαηά ιήημξ ημο αζιαημεβηεθαθζημφ θναβιμφ απυ ηδκ 55 kd GLUT-1 πνςηεΐκδ. Αοηή δ πνςηεΐκδ ανίζηεηαζ ηαζ ζηζξ δφμ ιειανάκεξ ηςκ εκδμεδθζαηχκ ηοηηάνςκ, πζεακυηαηα ιε πανυιμζεξ ποηκυηδηεξ θεζημονβζηχκ ιεηαθμνέςκ ζε ηάεε επζθάκεζα. Σέημζα ζοζηήιαηα είκαζ ακελάνηδηα απυ ηθίζεζξ ζυκηςκ. Σμοθάπζζημκ έκα ζφζηδια ιεηαθμνάξ ιμκμηαναμλοθηχκ μλέςκ θαίκεηαζ κα θεζημονβεί ζημκ αζιαημεβηεβαθζηυ θναβιυ, ηονίςξ ιεηαθένμκηαξ βαθαηηζηυ ηαζ πονμζηαθοθζηυ απυ ημκ εβηέθαθμ ζημ αίια. Αοηή δ πνςηεΐκδ ακαθένεηαζ ςξ MCT1. Τπάνπεζ έκαξ ανζειυξ ιεηαθμνέςκ βζα ηα αιζκμλέα πμο ανίζημκηαζ ζημκ αζιαημεβηεθαθζηυ θναβιυ. Μεηαλφ αοηχκ είκαζ 1) ημ ζφζηδια L- ημ μπμίμ ιεηαθένεζ ιεβάθα μοδέηενα αιζκμλέα υπχξ L- θαζκοθαθακίκδ ηαζ L-ηονμζίκδ. 2) ημ ζφζηδια y+ ημ μπμίμ ιεηαθένεζ αιζκμλέα ιε ηαηζμκζηέξ πθεονζηέξ αθοζίδεξ (Lανβζκίκδ) ηαζ 3) ημ ζφζηδια Α ημ μπμίμ ιεηαθένεζ μοδέηενα αιζκμλέα υπςξ βθοηίκδ ηαζ αθακίκδ. Σμ ηεθεοηαίμ ζφζηδια είκαζ κάηνζμ ελανηχιεκμ ηαζ θαίκεηαζ πςξ θεζημονβεί ηονίςξ βζα κα ηαεανίγεζ αοηά ηα οπμζηνχιαηα απυ ημκ εβηέθαθμ. Ο ζδιακηζηυηενμξ ιεηαθμνέαξ βζα ηα ηαηζμκζηά αιζκμλέα είκαζ ημ CAT1. Δηηυξ απυ ημοξ οπμδμπείξ θήρδξ ηαζ δζάθμνεξ μζημβέκεζεξ πνςηεσκχκ ιεηαθμνέςκ εηνμήξ θανιάηςκ εηθνάγμκηαζ ζηα εκδμεδθζαηά ηφηηανα ημο εβηεθάθμο. αοημί μζ ιεηαθμνείξ πενζμνίγμοκκ ηδκ δζαπέναζδ δζαιέζμο ημο ΑΔΦ ηςκ οπμζηνςιάηςκ ημοξ ζοιπενζθαιαακμιέκςκ αζμδναζηζηχκ εκχζεςκ, ημλζηχκ ιεηααμθζηχκ ή ημλζκχκ ιέζς ιζαξ δζαδζηαζίαξ εκενβμφ ιεηαθμνάξ-εηνμήξ (de Boeret al., 2003). 58

75 Εικόνα 27 χθματικι απεικόνιςθ τθσ ζκφραςθσ των μεταφορζων φαρμάκων ςτα ανκρϊπινα αιματοεγκεφαλικά ενδοκθλιακά κφτταρα. ABC-transporter Οζ ABC-ιεηαθμνείξ είκαζ ιζα απυ ηζξ ιεβαθφηενεξ μζημβέκεζεξ πνςηεσκχκ πμο απμηεθείηαζ απυ 48 βμκίδζα ηα μπμία είκαζ ηαλζκμιδιέκα ζε επηά οπμμζημβέκεζεξ ζφιθςκα ιε ηδκ δμιή ημο βμκζδίμο ηαζ ηδκ αθθδθμοπία ηςκ αιζκμλέςκ (Dean et al. 2001). Αοηέξ είκαζ μθυηθδνεξ ιειανακζηέξ πνςηεΐκεξ πμο πνδζζιμπμζμφκ ηδκ εκένβεζα ηδξ οδνυθοζδξ ημο ATP βζα ηδκ ιεηαθμνά ηςκ οπμζηνςιάηςκ ημοξ ηαηά ιήημξ ηδξ ιειανάκδξ εκάκηζα ζε ορδθήξ ζοβηέκηνςζδξ ηθίζεζξ. Ζ ηφνζα θεζημονβία ηςκ ABC-ιεηαθμνέςκ είκαζ δ πνμζηαζία ημο ζχιαημξ απυ θοζζηέξ ημλίκεξ ηαζ λεκμαζμηζηά. Γζ αοηυ ημ θυβμ εηηνίκμκηαζ ζε πενζμπέξ ιε έκημκδ εηηνζηζηή δναζηδνζυηδηα (ήπαν ηαζ κεθνυξ) ηαζ ζε θναβιμφξ πμο πενζμνίγμοκ ηδκ είζμδμ ημλζκχκ (BBB, bloodtestisbarrier, gastro-intestinal tract) (Schinkel and Jonker 2003; Loscher and Potschka, 2005). 59

76 P-glycoprotein Ζ P-βθοημπνςηείκδ ABCB1, P-gp) είκαζ 170 kda θςζθμνοθζςιέκδ βθοημπνςηεΐκδ ιε δφμ μιυθμβα ιζζά πμο πενζθαιαάκμοκ 12 δζαιειανακζηέξ πενζμπέξ ηαζ δφμ πενζμπέξ δέζιεοζδξ ημο ATP ζοκμθζηά (Jones and George 2000). Τπάνπμοκ 2 ηφπμζ P-gp, πμο ηςδζημπμζμφκηαζ απυ ημ MDR1 ηαζ MDR2 βμκίδζα. ημκ ακενχπζκμ αζιαημεβηεθαθζηυ θναβιυ οπάνπεζ ιυκμ δ Ρ-gp πμο ηςδζημπμζείηαζ απυ ημ MDR1 (Demeule et al.2002). Ζ P-glycoprotein ανπζηά πενζβνάθδηε ζημ πεδίμ ημο ηανηζκμ δζαιεζμθααμφιεκδ πμθοθανιαηεοηζηή ακεεηηζηυηδηα (cancer mediating multidrug resistance (MDR)) απυ ATP-μδδβμφιεκδ εηνμή ηςκ πδιεζμεεναπεοηζηχκ (Biedler and Riehm 1970). Ζ P-gp έπεζ ιζα εονεία ζηακυηδηα πνυζδεζδξ οπμζηνςιάηςκ πμο πενζθαιαάκεζ ακηζηανηζκζηά θάνιαηα, ακμζμηαηαζηαθηζημφξ πανάβμκηεξ, ημνηζημεζδή μπζμεζδή, ακαζημθείξ ηςκ πνςηεαζχκ, ακηζροπςηζηά θάνιαηα ακηζεπζθδπηζηά θάνιαηα η.α. (Loscher and Potschka 2005). Ήηακ επίζδξ μ πνχημξ ιεηαθμνέαξ πμο ακαηαθφθεδηε ζημκ ακενχπζκμ ΑΔΦ (Cordon-Cardo et al. 1989; Thiebaut et al. 1989). Με ζοκεζηζαηή ηαζ δθεηηνμκζηή ιζηνμζημπία ανηεηέξ ιεθέηεξ δείπκμοκ ηδκ έηθναζδ ηδξ P-gp ζηδκ εζςηενζηή ιειανάκδ ημο ΑΔΦ πμθθχκ εζδχκ (Jette et al. 1993; Demeule et al. 2002). ε mdr1(-/-) knock-out πμκηίηζ 10- έςξ 100-θμνέξ αολδιέκα επίπεδα οπμζηνςιάηςκ ηδξ P-gp ανίζημκηαζ ζημκ εβηέθαθμ, οπμζηνχιαηα υπςξ ivermectin ή vinblastine απμδεζηκφμκηαξ ηδκ ζδιακηζηυηδηα ηδξ P-gp in vivo (Schinkel and Jonker 2003). Κθζκζηέξ drug-to-drug αθθδθεπζδνάζεζξ ιέζς ημο P-gp ζημκ ΑΔΦ ζε ακενχπμοξ βζα ηα οπμζηνχιαηα cyclosporine A ηαζ verapamil έδεζλακ υηζ ηα επίπεδα ημο Verapamil ζημκ εβηέθαθμ ήηακ ζδιακηζηά ιεβαθφηενα πανμοζία ηδξ ηοηθμζπμνίκδξ Α (Sasongko et al. 2005). BCRP Ζ πνςηεΐκδ ακηίζηαζδξ ηανηίκμο ημο ιαζημφ (breast cancer resistance protein) (ABCG2, BCRP) είκαζ 72 kda ιε 6 δζαιειανακζηά ηιήιαηα πμο ζπδιαηίγμοκ θεζημονβζηά μιμδζιενή. Ζ BCRP ακαηαθφθεδηε ζε ιζα ακεεηηζηή ζε εεναπεία ιαζηζηή ηανηζκζηή ηοηηανζηή ζεζνά (Doyle et al. 1998). πεηζηά πνυζθαηα ακαηαθφθεδηε υηζ εηθνάγεηαζ ζηδκ ακχηενδ ιειανάκδ ηςκ εκδμεδθζαηχκ ηοηηάνςκ ημο ΑΔΦ ηςκ βμονμοκζχκ ηαζ ημο ακενχπμο (Cooray et al. 2002; Eisenblatter and Galla 2002, Lee et al., 2005). Δπζπθέμκ δ BCRP εηθνάγεηαζ ηαζ ζημκ πθαημφκηα ζημ ηυθμκ ηαζ ζημ έκηενμ (Loscher ηαζ Potschka, 2005). ηα οπμζηνχιαηα ημο BCRP πενζθαιαάκμκηαζ ακηζηανηζκζηά θάνιαηα υπςξ ημ mitoxantrone, daunorubicin, doxorubicin, topotecan ηαζ epirubicin, ηανηζκμβυκα ηαζ ημλίκεξ (van Herwaarden et al. 2003; Han ηαζ Zhang 2004). Ο νυθμξ ηδξ BCRP in vivo είλαη ακθηζβεηήζηκνο. ε mdr Νμη άμοη πμκηίηζα δ πνυζθδρδ ημο mitoxantrone απυ ημκ εβηέθαθμ αολακυηακ πανμοζία ημο P-gp ηαζ BCRΡ ακαζημθέςκ δίκμκηαξ έηζζ ημ πνχημ απμδεζηηζηυ ζημζπείμ ηδξ BCRP δζαιεζμθααμφιεκδξ ιεηαθμνάξ ζημκ ΑΔΦ (Cisternino et al., 2004). Πανυθα αοηά ιζα 60

77 δζαθμνεηζηή ιεθέηδ ακαθένεζ υηζ δεκ οπάνπμοκ αθθαβέξ ζηα επίπεδα ημο mitoxantrone ζημκ εβηέθαθμ ζε Bcrp knock-out πμκηίηζα (Lee et al. 2005). MRPs Οζ πνςηεΐκεξ ηδξ μζημβέκεζαξ multidrug resistance protein (MRP, ABCC) ακήημοκ επίζδξ ζηδκ οπενμζημβέκεζα ηςκ ABC-ιεηαθμνέςκ 12 MRPs είκαζ βκςζηυ υηζ ακήημοκ ζηδκ μζημβέκεζα ABCC. οιιεηέπμοκ ζηδκ ιεηαθμνά ακζμκζηχκ ηαζ μοδέηενςκ θανιάηςκ υπςξ ακηζηανηζκζηά θάνιαηα ακηί-hiv θάνιαηα ηαζ βθμοηαεεζυκδ, βθμοημονμκίδζα ηαζ εεζζημφξ πνμζδέηεξ. Πανυηζ ηα οπμζηνχιαηα ημο P10 gp είκαζ βεκζηά ηαηζμκζηά ιυνζα, οπάνπεζ ιζα ζδιακηζηή επζηάθορδ ηδξ ελεζδίηεοζδξ βζα πνυζδεζδ οπμζηνςιάηςκ ιε ηζξ MRPs (Borst et al.,2000; Loscher and Potschka.,2005). ε αζιαημεβηεθαθζηά εκδμεδθζαηά ηφηηανα αμδζμφ ειθακίγεηαζ ημ mrna ηςκ MRP1, MRP4, MRP5 ηαζ MRP6 ηαεχξ ηαζ παιδθά πμζμζηά ημο MRP2 (Zhang et al., 2000, Berezowski et al., 2004). ε ιζα άθθδ ιεθέηδ απμδείπεδηε δ έηθναζδ ημο MRP2 ζηδκ εζςηενζηή ιειανάκδ ζηα εββεθαθζηά ηνζπμεζδή πμο πνμένπμκηακ απυ ανμοναίμ ηαεχξ ηαζ απυ πμίνμ (Miller et al., 2000). Πανυθα αοηά ιυκμ πενζμνζζιέκα δεδμιέκα είκαζ δζαεέζζια βζα ηδκ έηθναζδ ηςκ MRPs ζημκ ακενχπζκμ ΑΔΦ. Τρδθά πμζμζηά ημο mrna ημο MRP1 ζε ζφβηνζζδ ιε ηςκmrp2, MRP3 ηαζ MRP5 έπμοκ ακαθενεεί (Dombrowski et al., 2001). ε άθθδ ιεθέηδ απμδείπεδηε δ έηθναζδ ηςκ MRP1, MRP4 ηαζ MRP5 ζε πνςηεσκζηυ επίπεδμ εκχ μζ MRP2,MRP3 ηαζ MRP6 δεκ ακζπκεφηδηακ (Nies et al. 2004). ε αζιαημεβηεθαθζηά εκδμεδθζαηά ηφηηανα αμδζκά ηαζ ακενχπζκα μζ MRP1 ηαζ MRP5 εηθνάγμκηαζ ζηδκ ελςηενζηή ιειανάκδ εκχ δ MRP4 εηθνάγεηαζ ζζυπμζα ηαζ ζηζξ δφμ ιειανάκεξ (Zhang et al. 2000; Nies et al. 2004). Μέπνζ ηχνα θίβα είκαζ βκςζηά βζα ημκ ακηίηηοπμ ηςκ MRPs in vivo. ε MRP1 knock-out πμκηίηζα δεκ οπήνπε δζαθμνά ζηδκ δζαπέναζδ etoposide ζημκ εβηέθαθμ (Cisternino et al., 2003). Πανυθα αοηά ηα πμζμζηά ηδξ εηνμήξ εκυξ εκδμβεκμφξ estradiol-glucuronide ιεζςκυηακ ιεηά απυ εκδμεβηεθαθζηή έκεζδ απμδεζηκφμκηαξ υηζ ημ MRP1 ζοιιεηέπεζ ζηδκ έηηνζζδ ηςκ ιεηααμθζηχκ απυ ημκ εβηέθαθμ πανά ζηδκ εηνμή ηςκ αζμδναζηζηχκ εκχζεςκ απυ πανάβςβα ημο αίιαημξ ζοζηαηζηά (Cisternino et al., 2003, Sugiyama et al.,2003). ε ανμοναίμοξ ζε έθθεζρδ ημο mrp2 ηα επίπεδα ημο phenytoin ζημκ εβηέθαθμ ήηακ αολδιέκα απμδεζηκφμκηαξ υηζ μ mrp2 πνμθαιαάκεζ ηδκ δζαπέναζδ ημο phenytoin ζημκ εβηέθαθμ (Potschka et al., 2003) ΔΙΑΛΤΣΟΙ ΜΕΣΑΦΟΡΕΙ Ζ οπενμζημβέκεζα ηςκ δζαθοηχκ ιεηαθμνέςκ (SLC) πενζθαιαάκεζ ιζα πθδεχνα βμκζδίςκ ηα μπμία πςνίγμκηαζ ζε 43 μζημβέκεζεξ πμο ηςδζημπμζμφκ ιεηαθμνζηέξ πνςηεΐκεξ (Hediger et al. 2004). Αοηέξ μζ πνςηεΐκεξ δνμοκ παεδηζηά ςξ ιεηαθμνείξ δζπθμφ ζυκημξ, δζεοημθοκυιεκδξ ιεηαθμνείξ ή ακηαθθάηηεξ. ημκ ΑΔΦ μζ ιεηαθμνείξ SLCO/SLC21A ηαζ SLC22 ζοιιεηέπμοκ ζε δζαδζηαζίεξ εηνμήξ. ηα εβηεθαθζηά ηνζ- 61

78 πμεζδή ηςκ ανμοναίςκ εηθνάγμκηαζ ηα μνβακζηά ακζμκζηά ιεηαθμνζηά πμθοπεπηίδζα (organic anion transporting polypeptides Oatp) Oatp1a4 (Slco1a4), Oatp1a5 (Slco1a5) ηαζ Oatp1c1 (Slc1c1), ζηδκ εζςηενζηή ηαζ ζηδκ ελςηενζηή ιειανάκδ, υπμο ζοιιεηέπμοκ ζηδκ ιεηαθμνά αιθζπαεχκ μνβακζηχκ ακζυκηςκ υπςξ πμθζηά άθαηα ηαζ πνμζδέηεξ ζηενεμεζδχκ (Kusuhara and Sugiyama, 2005). Μυκμ ιζα ακενχπζκδ ζζμιμνθή OATP1A2 (SLCO1A2), ιε ορδθή μιμθμβία βζα ηδκ rat ζζμιμνθή είκαζ βκςζηή ηαζ εηθνάγεηαζ ζημκ ακενχπζκμ ΑΔΦ. Πανυθα αοηά δ ιειανακζηή ημπμεέηδζδ ηαεχξ ηαζ μ ακηίηηοπμξ in vivo παναιέκεζ αδζεοηνίκζζημξ (Gao et al.,2000). Σα ιέθδ ηδξ μζημβέκεζαξ SLC22 πμο είκαζ βκςζηυ υηζ εηθνάγμκηαζ ζημκ ακενχπζκμ ΑΔΦ είκαζ μζ μνβακζημί ακζμκζημί ιεηαθμνείξ (OAT3, SLC22A8) ηαζ μ μνβακζηυξ cation/carnitine ιεηαθμνέαξ (OCTN2, SLC22A3). Ο OAT3 εηθνάγεηαζ ζηδκ ααζμπθεονζηή ιειανάκδ ζημκ rat ΑΔΦ εκχ δ ιειανακζηή ημπμεέηδζή ηδξ ζημκ ακενχπζκμ ΑΔΦ παναιέκεζ αδζεοηνίκζζηδ (Mori et al. 2004). Σα οπμζηνχιαηα ημο OAT3 πενζθαιαάκμοκ paraaminohippuric acid, benzylpenicillin ηαζ homovanillic acid (Kusuhara and Sugiyama 2005). Ο OCTN2 είκαζ έκαξ αγςημελανηχιεκμξ ιεηαθμνέαξ ηανκζηίκδξ, μ μπμίμξ εηθνάγεηαζ ιεηαλφ άθθςκ ηαζ ζημκαδφ δζαθμνεηζηχκ εζδχκ (Miecz et al.,2008). Λυβς ημο υηζ δεκ οπάνπεζ ζε πμκηίηζα αοηυξ μ οπμδμπέαξ είκαζ ιζηνυηενδ δ ζοβηέκηνςζδ ηδξ αηεηοθμ ηανκζηίκδξ (Kusuhara and Sugiyama,2005) ΔΙΑΠΕΡΑΗ ΜΕ ΔΙΑΜΕΟΛΑΒΗΗ ΤΠΟΔΟΧΕΑ. οζηαηζηά ορδθμφ ιμνζαημφ αάνμοξ, υπςξ πεπηίδζα ιεβάθμο ιμνζαημφ αάνμοξ είκαζ αδφκαημκ κα ιεηαθενεμφκ ιέζς πνςηεσκχκ ιεηαθμνέςκ. Σέημζα ιυνζα ιεηαθένμκηαζ ηαηά ιήημξ ημο ΑΔΦ δζαιεζμθααμφιεκδξ οπμδμπέα ιεηαθμνάξ. Γζ αοηυ ηα αζιαημεβηεθαθζηά εκδμεδθζαηά ηφηηανα εηθνάγμοκ οπμδμπείξ βζα πνμζδέηεξ υ- πςξ δ ηνακζθεννίκδ ή δ ζκζμοθίκδ. Οζ οπμδμπείξ εζςηενζηεφμκηαζ ιέζς ηαθοιιέκςκ ηοζηζδίςκ ηθαενίκδξ ζπδιαηίγμκηαξ ανπζηά εκδμζχιαηα ηα μπμία ιεηαθένμκηαζ ζηα θοζμζχιαηα, υπμο ημ πενζεπυιεκμ ιπμνεί κα απεθεοεενςεεί. Οζ οπμδμπείξ ιεηαθένμκηαζ πίζς ζηδκ πθαζιαηζηή ιειανάκδ ιέζς ιειανακζηχκ ηοζηζδίςκ (de Boer et al. 2003). Έκαξ ζδιακηζηυξ οπμδμπέαξ ζημκ ΑΔΦ είκαζ μ οπμδμπέαξ ηδξ ηνακζθεννίκδξ (Jefferies et al. 1984). οιιεηέπεζ ζηδκ εκδμηοηηάνςζδ ηαζ ελςηοηηάνςζδ ηνακθεννίκδξ πμο ιεηαθένεζ ζίδδνμ. Μεηά ηδκ δέζιεοζδ ημο ζζδήνμο (Fe2+)-transferrin ζημκ TfR, δ εκδμηοηηάνςζδ ιέζς ηοζηζδίςκ ηθαενίκδξ θαιαάκεζ πχνα (Li and Qian, 2002). Γζα κα πνμζθδθεμφκ θάνιαηα ζημκ εβηέθαθμ ηα μπμία δε ιπμνμφκ κα δζαζπίζμοκ ημκ ΑΔΦ ημ ζφζηδια ιέζς ηνακζθεννίκδξ πνδζζιμπμζείηαζ ζε πεζνάιαηα ζηυπεοζδξ. Λζπμζχιαηα θμνηςιέκα ιε daunomycin ζογεοβκφμκηαζ ιε ακηζζχιαηα άιεζα έκακηζ ημο οπμδμπέα TfR (Huwyler et al. 1996). Μεηά απυ έκεζδ αοηχκ ηςκ ακμζμθζπμζςιάηςκ ζε ανμοναίμοξ ζδιακηζηά αολδιέκα επίπεδα ημο daunomycin ιεηνήεδηακ ζε ζφβηνζζδ ιε ηδκ εθεφεενδ αζμδναζηζηή έκςζδ (Schnyder et al.,2005). Ο οπμδμπέαξ ηδξ ηνακζθεννίκδξ (TfR) είκαζ έκα δζαιειανακζηυ μιμδζιενέξ ημ μπμίμ απμηεθείηαζ απυ δφμ ηαοηυζδια ιμκμιενή ιε ιμνζαηυ αάνμξ πενίπμο 90 62

79 kda Κάεε ιμκμιενέξ εκχκεηαζ ιε δφμ δζζμοθθζδζημφξ δεζιμφξ ζηζξ ηοζηεΐκεξ 89 ηαζ 98. Έπεζ έκα ιζηνυ αιζκμηεθζηυ άηνμ ηοηηανμπθαζιαηζηά (ηαηάθμζπα 1-67), ιζα ιζηνή δζαιειανακζηή πενζμπή (68-88) ηαζ έκα ιεβάθμ ελςηοηηανζηυ ηιήια (89-760), ημ μπμίμ είκαζ δζαθοηυ ηαζ θένεζ ιζα εοαίζεδηδ ζηδκ ηνορίκδ πενζμπή ηαζ πενζθαιαάκεζ ιία εέζδ δέζιεοζδξ βζα ηδκ ηνακζθεννίκδ Ρ Ξ Υ Δ Σ Ρ Ζ Τ Α Π Λ Α Ι Ω Μ Ρ Ξ Μ Δ Γ Ι Δ Τ Α Κ Ξ Οζ ιδπακζζιμί ιεηαθμνάξ δζαιέζμο ημο ΑΔΦ ιπμνμφκ κα πνδζζιμπμζδεμφκ βζα ζηυπεοζδ αζμδναζηζηχκ εκχζεςκ ζημκ εβηέθαθμ. Φοζζμθμβζηά μζ ζδακζηέξ οπμρήθζεξ αζμδναζηζηέξ εκχζεζξ βζα ζηυπεοζδ ζημκ εβηέθαθμ πνέπεζ κα είκαζ ιζηνά θζπυθζθα (ζφιθςκα ιε ημ ζοκηεθεζηή ιενζζιμφ μηηακυθδξ/κενμφ) οδνυθμαα ηαζ ζοιπαβή (έκαξ πανάβμκηαξ πμο οπμθμβίγεηαζ απυ ηδκ πμθζηυηδηα ηδξ επζθάκεζα). Οζ θοζζημπδιζηέξ πανάιεηνμζ ηαζ δ θφζδ ηδξ οπμρήθζαξ αζμδναζηζηήξ έκςζδξ ζημ αζμθμβζηυ ζφζηδια είκαζ μζ ηονίανπμζ πανάβμκηεξ ζημκ ζπεδζαζιυ ηδξ. ηδκ πενζθενεζαηή ηοηθμθμνία, ζοζηδιζηή πνςηευθοζδ ηαζ μρςκμπμίδζδ απυ ηζξ πνςηεΐκεξ ημο πθάζιαημξ ιπμνεί κα μδδβήζμοκ ζημκ ιεηααμθζζιυ ηδξ αζμδναζηζηήξ έκςζδξ πνίκ θηάζεζ ζημκ εβηέθαθμ. Ζ πζεακυηδηα ηοηηανζηήξ ηαηάζπεζδξ ηαζ ημ πμζμζηυ εηηαεάνζζδξ (clearance rate) ηδξ αζμδναζηζηήξ έκςζδξ ζημ αίια είκαζ επζπθέμκ εέιαηα πμο πνέπεζ κα εθεβπεμφκ ζηδκ ζηυπεοζδ. Σέθμξ, δ ηαηακυδζδ ημο πμζμζημφ εηηαεάνζζδξ ηδξ οπμρήθζαξ αζμδναζηζηήξ έκςζδξ ζημκ εβηέθαθμ είκαζ ακαβηαία ηαζ έιθαζδ πνέπεζ κα δμεεί ζηδ ζοβηέκηνςζδ ηδξ αζμδναζηζηήξ ζημκ εβηέθαθμ ζε ζπέζδ ιε ηδ ζοβηέκηνςζδ ηδξ έκςζδξ ζημ αίια πμο ηαθείηαζ logββ. ηδκ εκδμεδθζαηή ηοηηανζηή ιειανάκδ έκα θάνιαημ ιπμνεί κα πνμαπεεί ιέζς ιζαξ πθδεχναξ δζαδνμιχκ. ε ιζα οπμεεηζηή ηαηάζηαζδ εεςνμφιε υηζ υθα ηα θανιαημιυνζα είκαζ ίδζα (ηα μνίγμοιε βζα πανάδεζβια θάνιαημ Α, Β ηαζ C (Δζηυκα 28). Σμ θάνιαημ Α πνμζημθθάηαζ ζηδκ ααζζηή εκδμεδθζαηή ηοηηανζηή ιειανάκδ. Δάκ ημ θάνιαημ Α έπεζ ζοββέκεζα βζα ημοξ οπμδμπείξ εηνμήξ ημο ΑΔΦ ηυηε απμζηέθθεηαζ πίζς ζηδκ ηοηθμθμνία ημο αίιαημξ πςνίξ κα θηάζεζ ημκ ζηυπμ ημο. Δάκ υιςξ δεκ οπάνπεζ ζοββέκεζα βζα ημοξ οπμδμπείξ εηνμήξ ηυηε ημ θάνιαημ Α πενκά ζημ εζςηενζηυ ημο εκδμεδθζαημφ εβηεθαθζημφ ηοηηάνμο υπμο ένπεηαζ ακηζιέηςπμ ιε ηα ιεηααμθζηά ηοηηανζηά έκγοια ιεζχκμκηαξ ηδκ πζεακυηδηα κα θηάζεζ ημκ ζηυπμ ημο. Ακ εεςνήζμοιε υηζ ημ θάνιαημ Α λεπενκά ημ ειπυδζμ ηςκ οπμδμπέςκ εηνμήξ ηαζ ηδξ εκγοιζηήξ δζάζπαζδξ ηυηε πνμάβεηαζ δζαιέζμο ημο ηοηηάνμο ζηδκ ελςηενζηή εκδμεδθζαηή ιειανάκδ, ιέζα ζημκ εβηέθαθμ ημκηά ζημκ ζηυπμ ημο. Σμ θάνιαημ Α ζημκ ελςηοηηάνζμ πχνμ ημο εβηεθάθμο ιπμνεί κα απμιαηνοκεεί πςνίξ κα ανεζ ημκ ζηυπμ ημο ή κα πνμαπεεί άιεζα ζημκ ζηυπμ ημο ή ιπμνεί κα δνάζεζ ζακ ημ θάνιαημ Β ηοηθμθμνχκηαξ ζημ εβηεθαθμκςηζαίμ οβνυ ιέπνζ κα ανεζ ημκ ζηυπμ ημο. Δπζπθέμκ ηα θάνιαηα Α ηαζ Β ιπμνεί κα ανίζημκηαζ ζε ζζμννμπία ιεηαλφ εβηεθαθμκςηζαίμο οβνμφ-εβηεθαθζηχκ ηοηηάνςκ, εβηεθαθμκςηζαίμο οβνμφ-ηφηηανςκ ζηυπςκ ή ηαζ εβ- 63

80 ηεθαθζηχκ ηοηηάνςκ/ζηυπςκ. ηδκ πενζθενζηή ηοηθμθμνία ημ θάνιαημ C ανίζηεηαζ ζε ζζμννμπία ζηα ενοενμηφηηανα ηα ηζξ πνςηεΐκεξ ημο πθάζιαημξ. Οζ πνςηεΐκεξ ημο πθάζιαημξ ιπμνμφκ κα πνμζδεεμφκ ζημ θάνιαημ ηάκμκηαξ ημ αηυια πζμ εηηεεεζιέκμ ζηα ιαηνμθάβα ημο ζοηςηζμφ ηαζ ημο ζπθήκα ηαζ ζοκεπχξ ιεζχκμοκ ηδκ πζεακυηδηα ημ θάνιαημ κα θηάζεζ ζημκ εβηέθαθμ. Κφτταρο ςτόχοσ Περιφερικι κυκλοφορία Ενδοκθλιακι κυτταρικι μεμβράνθ Πρωτεΐνθ πλάςματοσ Μθχανιςμόσ εκροισ Κυτταρικόσ εντοπιςμόσ Κυτταρικά ζνηυμα Ζνηυμα οροφ Μεταβολίτεσ Κφτταρα αίματοσ Άλλα ςθμεία μεταβολιςμοφ Εικόνα 28. Μθχανιςμόσ ενδοκυτταρικισ μεταφοράσ ςτον εγκζφαλο βιοδραςτικισ ζνωςθσ και κατανομισ του. Σα Α, Β και C αποτελοφν τρεισ υποκετικζσ βιοδραςτικζσ ενϊςεισ. Παρακυτταρικό υδατικό μονοπάτι Υδατοδιαλυτοί παράγοντεσ Διακυτταρικό λιπόφιλο μονοπάτι Λιποδιαλυτοί παράγοντεσ Μεταφορικζσ πρωτείνεσ Γλυκόηθ Αμινοξζα Μεταφορικζσ πρωτείνεσ Ενδοκυττάρωςθ μζςω υποδοχζα Ινςουλίνθ τρανςφερρίνθ Ενδοκυττάρωςθ μζςω προςρόφθςθσ Αλβουμίνθ πρωτεΐνεσ του πλάςματοσ Pgp, MRP OAT Αντλίεσ εκροισ Φάρμακα ξενοβιοτικά Εικόνα 29. Μθχανιςμοί διαπζραςθσ του αιματοεγκεφαλικο φραγμοφ. 64

81 3.6 Κ Θ Ο Ξ Ρ Ω Λ Α Α Ι Α Θ Ρ Ξ Υ Δ Σ Ρ Ζ Ρ Ξ Μ Δ Γ Ι Δ Τ Α Κ Ξ Σα θζπμζχιαηα επζπνυζεεηα ηςκ μθζβμκμοηθεμηζδίςκ πνδζζιμπμζμφκηαζ ζοπκά ςξ ιεηαθμνείξ βζα αζμδναζηζηέξ εκχζεζξ ιζηνμφ ιμνζαημφ αάνμοξ ηαζ πεπηίδζα. Έπεζ ήδδ δδιμζζεοηεί υηζ μ εβηθςαζζιυξ ιέζα ζε θζπμζχιαηα ιπμνεί κα αθθάλεζ δναιαηζηά ηδ ιμίνα ηδξ εβηθςαζζιέκδξ αζμδναζηζηήξ έκςζδξ in vivo. Σα θζπμζχιαηα πνμθαιαάκμοκ ηδ δνάζδ ηςκ εκγφιςκ ζηδ δναζηζηή μοζία, ιπμνμφκ κα επδνεάζμοκ ηδκ εηηαεάνζζδ ζημ πθάζια ηαζ ηδκ ηαηακμιή ζημοξ ζζημφξ ιζαξ πθδεχναξ αζμδναζηζηχκ εκχζεςκ. Ζ ζηακυηδηα θυνηςζδξ ηδξ αζμδναζηζηήξ έκςζδξ, δ δζαηήνδζδ ημο πενζεπμιέκμο ημοξ, δ ζηαεενυηδηα ζημ πθάζια ηαζ μζ θανιαημηζκδηζηέξ ζδζυηδηεξ ιπμνμφκ κα νοειζζημφκ ιε ηαηάθθδθεξ ηνμπμπμζήζεζξ ηδξ δμιήξ ηςκ ημζκχκ θζπμζςιζηχκ θμνέςκ θανιάηςκ. Πανυθα αοηά ηα ημζκά θζπμζχιαηα δεκ ιπμνμφκ κα δζαπενάζμοκ ζδιακηζηά ημκ ΑΔΦ. Αοηυ ζζπφεζ ηαζ βζα ιζηνυηενα ιμκμζηζααδζαηά θζπμζχιαηα ηςκ 60 nm ναδζμζδιαζιέκα ιε ίκδζμ βζα ηα μπμία έπεζ απμδεζπεεί υηζ δεκ δζαπενκμφκ ημκ ΑΔΦ εκυξ οβζμφξ εβηεθάθμο. Γζαπέναζδ θζπμζςιάηςκ ιπμνεί κα παναηδνδεεί ιυκμ ιε ιδ εζδζηή θανιαημθμβζηή δζάνδλδ ημο ΑΔΦ ηαζ έβποζδ ορδθχκ δυζεςκ 25mg/kg ημο etoposide ή ζε πενζμπέξ ηανηζκζηχκ υβηςκ ημο εβηεθάθμο υπμο δ ανπζηεηημκζηή ηςκ αββείςκ δεκ είκαζ αηέναζα. Έκα ακηίζςια πμο πνδζζιμπμζείηαζ ζε ακμζμθζπμζχιαηα βζα ζηυπεοζδ ζημκ εβηέθαθμ πνέπεζ κα πθδνεί ηάπμζεξ πνμτπμεέζεζξ. Πνχηα απυ υθα ημ ακηίζςια πνέπεζ κα ακαβκςνίγεζ ηάπμζα δμιή πμο εηθνάγεηαζ απμηθεζζηζηά ζημκ ΑΔΦ. Γεφηενμ ημ ακηίζςια πνέπεζ κα είκαζ ζηακυ κα δζαζπίζεζ ημκ ΑΔΦ ιε έκα ιδπακζζιυ εκενβδηζηήξ ιεηαθμνάξ υπςξ ιεηαθμνάξ δζαιεζμθααμφιεκδξ απυ οπμδμπέα. Σνίημ, μ επίημπμξ ζημκ μπμίμ ζημπεφεζ ημ ακηίζςια πνμηζιάηαζ κα ιδκ είκαζ εζδμεζδζηυξ. Σέηανημκ, πνέπεζ κα είκαζ δζαεέζζιέξ ορδθέξ πμζυηδηεξ ημο ακηζζχιαημξ. Σμ ΟΥ-26 mab πθδνμί ανηεηέξ αθθά υπζ υθεξ ηζξ πνμτπμεέζεζξ. ε πεζνάιαηα in vitro δείπεδηε υηζ ηα ΟΥ-26 ακμζμθζπμζχιαηα ιπμνμφκ κα πνμζθδθεμφκ εζδζηά απυ γςκηακά RG2 ηφηηανα ηδξ βθμίαξ ανμοναίμο πμο οπενεηθνάγμοκ ημκ οπμδμπέα ηδξ ηνακζθεννίκδξ πάνα ημ ιεβάθμ ιέβεευξ ημοξ (90nm). Σα θένμκηα θεμνίγμκ θμνηίμ ακμζμθζπμζχιαηα ζοζζςνεφμκηαζ ιέζα ζε εκδμηοηηανζηυ (εκδμζςιζηυ) ηιήια. Πανυιμζα απμηεθέζιαηα παναηδνμφκηαζ ιε επχαζδ ακμζμθζπμζςιάηςκ πμο θένμοκ θεμνίγμοζεξ ιε πνυζθαηα απμιμκςιέκα εβηεθαθζηά ηνζπμεζδή ανμοναίμο ηα μπμία έδεζλακ πνυζδεζδ ζηδκ εζςηενζηή ηαζ ααζμπθεονζηή ιειανάκδ ημο εκδμεδθίμο ημο εβηεθάθμο. Ζ εβηεθαθζηή ηαηακμιή ημο ακηζηανηζκζημφ θανιάημο daunomycin πανέπεζ έκα πανάδεζβια βζα ηδκ in vivo εθανιμβή ηςκ OX-26 ακμζμθζπμζςιάηςκ. Γζάθμνεξ θανιαημιμνθέξ ημο Ζ3- daunomycin πμνδβήεδηακ ζε ανμοναίμοξ είηε ςξ εθεφεενμ θάνιαημ είηε εβηθςαζζιέκμ ζε απθά θζπμζχιαηα, είηε ζε πςνμηαλζηά ζηαεενμπμζδιέκα θζπμζχιαηα είηε ζε ακμζμθζπμζχιαηα ιε πμθοεεοθεκμβθοηυθδ ζηδκ επζθάκεζα (Πίκαηαξ). Έβζκακ θήρεζξ πθάζιαημξ ηαζ ιεηνήζεζξ ηδξ ζοβηεκηνχζδξ ζε δζάθμνα 65

82 πνμκζηά δζαζηήιαηα ηαζ ιεηά απυ ιία χνα ιέηνδζδ ηδξ ζοβηέκηνςζδξ ημο θανιάημο ζημκ εβηέθαθμ. Σμ εθεφεενμ daunomycin ηαζ ημ daunomycin ηςκ θζπμζςιάηςκ πςνίξ PEG ελαθακίζηδηε βνήβμνα απυ ηδκ ηοηθμθμνία δ εηηαεάνζζδ απυ ημ πθάζια ημο εβηθςαζζιέκμο θανιάημο ζε θζπμζχιαηα ιε PEG ιεζχεδηε ηαηά 66 θμνέξ. Με ζφγεολδ 29 ιμνίςκ ΟΥ-26 ακηζζςιάηςκ ακά θζπυζςια ιε PEG ιυκμ, ιενζηχξ ακαζηνέθεηαζ δ επίδναζή ημο ζηδκ εηηαεάνζζδ απυ ημ πθάζια. Ακάθοζδ ημο βζκμιέκμο δζαπεναηυηδηα επί ηδκ επζθάκεζα (PS) απμδεζηκφεζ υηζ ημ daunomycin ηαζ ζε ιζηνυηενμ ααειυ ηα απθά θζπμζχιαηα ιε εβηθςαζζιέκμ daunomycin δζαπενκμφκ ημκ Α- ΔΦ. Πανυθ αοηά δ ζοζζχνεοζδ ζημκ εβηεθαθζηυ ζζηυ ημο εθεφεενμο θανιάημο ηαζ ηςκ ημζκχκ θζπμζςιάηςκ ιε εβηθςαζζιέκμ θάνιαημ ήηακ ιζηνή, ςξ απμηέθεζια ηδξ ορδθήξ ζοζηδιζηήξ εηηαεάνζζδξ απυ ημ πθάζια. Ζ πνήζδ ηςκ θζπμζςιάηςκ ιε PEG ηαζ εβηθςαζζιέκμ θάνιαημ ιεζχκεζ ημ βζκυιεκμ PS ζημ ιδδέκ. Γεκ παναηδνείηαζ ηαιία θήρδ αοηχκ απυ ημκ εβηέθαθμ πανυηζ είκαζ αολδιέκμξ μ πνυκμξ ηοηθμθμνίαξ ημοξ ζημ αίια. Ακηίεεηα δ πνήζδ ή εθανιμβή πεβηοθζςιέκςκ ΟΥ-26 ακμζμθζπμζςιάηςκ αολάκεζ ημ βζκυιεκμ PS ζημκ ΑΔΦ ζε ζφβηνζζδ ιε ηα πεβηοθζςιέκα πςνίξ ακηίζςια θζπμζχιαηα ζοκηεθχκηαξ ζε αφλδζδ ηδξ πνυζθδρδξ απυ ημκ εβηέθαθμ. Ζ εοκμσηυηενδ ζοκεπχξ δζακμιή επζηεφπεδηε ιε πνήζδ πεβηοθζςιέκςκ ΟΥ-26 ακμζμθζπμζςιάηςκ. ημζπεζμιεηνζηή ακάθοζδ ηδξ πμζυηδηαξ ημο ακηζζχιαημξ ΟΥ-26 πμο πνμζδέεδηε ακά θζπυζςια απέδεζλε αφλδζδ ηδξ εηηαεάνζζδξ απυ ημ πθάζια ηαζ ιείςζδ ηδξ ζοζηδιζηήξ έκηαζδξ ηαηακμιήξ ηςκ ακμζμθζπμξςιάηςκ ιε ορδθυηενεξ ζοβηεκηνχζεζξ ακηζζχιαημξ. Τρδθυηενμ βζκυιεκμ PS ηαζ ηαθφηενδ ζοζζχνεοζδ ζημκ εβηεθαθζηυ ζζηυ παναηδνείηαζ ιε 29 ακηζζχιαηα ακά θζπυζςια. Πνυζθαηα ηα ΟΥ-26 ακμζμθζπμζχιαηα πνδζζιμπμζήεδηακ ζε πνμζεββίζεζξ ηαηακμιήξ βμκζδίςκ βζα κα ιεηαθένμοκ πθαζιίδζα βζα ηδκ θμοζζθενάζδ ηαζ ηδκ α- βαθαηημζζδάζδ ηαηά ιήημξ ημο ΑΔΦ. Πίνακα 3. Cl (Plasma Clearance), PS το γινόμενο διαπερατότθτασ επιφάνειασ και ςυςςϊρευςθ % τθσ δόςθσ που ανιχνεφεται ςτον εγκεφαλικό ιςτό (%ID g-1 ςτον ιςτό) 1 ϊρα μετά τθ χοριγθςθ. Χορθγικθκαν ελεφκερθ Daunomycin, εγκλωβιςμζνθ ςε κοινά λιποςϊματα, ςε ςτακεροποιθμζνα PEG-λιποςϊματα,ςε ανοςολιποςϊματα και ςε ανοςολιποςϊματα με IgG2a αναφοράσ (μθ ειδικό ιςότυπο). 66

83 Σα πθαζιίδζα εζςηθείμκηαζ ζε μοδέηενα θζπμζχιαηα. Ζ έηθναζδ ημο βμκζδίμο επεζ δεζπεεί υηζ ζοιααίκεζ ζηα εβηεθαθζηά ηφηηανα ιέζα απυ ημκ ΑΔΦ, απμδεζηκφμκηαξ ηδκ δζαπέναζδ ηςκ θζπυζςια ηςκ απυ ημκ ΑΔΦ in vivo. 3.7 ΞΥ- 2 6 Ω Ρ Λ Δ Α Τ Ξ Π Δ Α Ρ Τ Α Π Λ Α Ι Ω Μ Ρ Ξ Μ Δ Γ Ι Δ Τ Α Κ Ξ. Ζ ηνακζθεννίκδ απυ ιυκδ ηδξ είκαζ αηαηάθθδθμ ιυνζμ βζα ηδκ επζηοπή δζαπέναζδ ημο ΑΔΦ ηαζ ηδκ ιεηαθμνά θανιάηςκ ζημκ εβηέθαθμ ηαεχξ μζ οπμδμπείξ ηδξ ηνακζθεννίκδξ είκαζ ημνεζιέκμζ ηάης απυ θοζζμθμβζηέξ ζοκεήηεξ θυβς ηδξ ορδθήξ ζοβηέκηνςζδξ ηδξ ηνακζθεννίκδξ ζημ πθάζια (Seligman, 1983). Πανυθα ηαφηα ηα ακηζζχιαηα πμο δεζιεφμκηαζ ζημκ οπμδμπέα ηδξ ηνακζθεννίκδξ TfR έπεζ δεζπεεί υηζ ζημπεφμοκ εζδζηά ζημ εκδμεήθζμ ημο αζιαημεβηεθαθζημφ θναβιμφ ελαζηίαξ ηςκ ορδθχκ πμζμζηχκ ημο TfR πμο εηθνάγμκηαζ ζε αοηά ηα ηφηηανα (Friden, 1994; Bickel et al 2001, Μoos and Morgan 2001). Γζ αοηυ ημ θυβμ ημ ζοβηεηνζιέκμ ακηίζςια απμηεθεί δοκδηζηυ εκδοκάιεζ ιεηαθμνέα βζα ηδκ ιεηαθμνά εεναπεοηζηχκ μοζζχκ ζημ ηεκηνζηυ κεονζηυ ζφζηδια. Υνδζζιμπμζχκηαξ έκα ιμκμηθςκζηυ ακηίζςια πμκηζημφ ε- κάκηζα ζε οπμδμπέα TfR ανμοναίμο, ημ ΟΥ-26, απμδείπεδηε υηζ οπάνπεζ ιεβάθμξ ανζειυξ οπμδμπέςκ ζημ εκδμεήθζμ ημο ΑΔΦ (Jefferies et al., 1984). Σμ ΟΥ-26 δεζιεφεηαζ ζε ελςηοηηανζηή πενζμπή ημο TfR, δζαθμνεηζηή απυ ηδ εέζδ δέζιεοζδξ ηδξ ηνακζθεννίκδξ, ηαζ δεκ πανειααίκεζ ζηδ πνυζδεζδ ηδξ ηνακζθεννίκδξ (Jefferies et al., 1984). ε ιζα ιεθέηδ πάκς ζηδ δέζιεοζδ ηαζ ηδκ εκδμηοηηανζηή ιεηαθμνά ημο Ζ 3 ΟΥ26 ιε ηδ πνήζδ απμιμκςιέκςκ εβηεθαθζηχκ ηνζπμεζδχκ αμδζμφ απμδείπεδηε υηζ, υπςξ ηαζ δ ηνακζθεννίκδ, ημ ΟΥ26 πνμζδέκεηαζ ηαζ εζζένπεηαζ ζηα ηνζπμεζδή ζημοξ 37 ºC ή ζημοξ 4 ºC (Pardridge et al., 1991). Πενίπμο ημ 50% ημο πνμζδεδειέκμο ακηζζχιαημξ εζζένπεηαζ ζημ ηοηυπθαζια ιέζς εκδμηοηηάνςζδξ ιέζα ζε πνμκζηυ δζάζηδια 1-2 ςνχκ. Σμ ΟΥ26 θαιαάκεηαζ ζημκ εβηέθαθμ in vivo υπςξ απμδείπεδηε απυ πείναια πνδζζιμπμζχκηαξ ιζα ηεπκζηή εκδμηανςηζδζηήξ έβποζδξ/ηέκςζδξ (Triguero. et al.,1990) ζηα ηνζπμεζδή ζε πμκηίηζα. Με ακάθοζδ ημο ιεηαββεζαημφ πενζεπμιέκμο, δείπεδηε υηζ πενζζζυηενμ απυ ημ 65% ημο ΟΥ26 είπε πενάζεζ ιέζς ημο ΑΔΦ ζημ εβηεθαθζηυ ελςηοηηανζηυ ηιήια ηαζ ημ πμζμζηυ αοηυ είκαζ ζδιακηζηά ορδθυηενμ απυ ηδκ ηαηζμκζηή αθαμοιίκδ μνμφ ιυζπμο ή ημ ακηίζςια IgG απμδεζηκφμκηαξ υηζ δ δζαπέναζδ ιε δζαιεζμθάαδζδ οπμδμπέα ειθακίγεηαζ ςξ πζμ ηαηάθθδθδ ζε ζφβηνζζδ ιε δζαπέναζδ ιέζς πνμζνυθδζδξ. Σα πεζνάιαηα βζα ημκ πνμζδζμνζζιυ ηδξ πνυζθδρδξ ημο Ζ 3 - ΟΥ26 απυ ηα υνβακα έδεζλακ υηζ ημ ΟΥ26 ζοζζςνεφεηαζ ζηαεενά ζημκ εβηέθαθμ ζε ζφβηνζζδ ιε ημ ιμκμηθςκζηυ ακηίζςια IgG2a (Pardridge et al., 1991). Δπζπθέμκ, ιε ναδζμζδιαζιέκμ ΟΥ26 δείπεδηε υηζ δ εηηαεάνζζδ απυ ημκ μνυ ζοιααίκεζ πμθφ βνήβμνα (Pardridge et al., 1991). Γζα 67

84 αοηυ ημ θυβμ, ημ ΟΥ26 θαίκεηαζ κα είκαζ έκαξ ζηακυηαημξ οπμρήθζμξ ιεηαθμνέαξ αζμδναζηζηχκ εκχζεςκ ζημκ εβηέθαθμ (Wu et al., 2002). 68

85 3. 8 Ζ Ι Σ Α Π Θ Ι Ζ Ρ Δ Θ Π Α h C M E C / D 3 Ζ ηοηηανζηή ζεζνά hcmec/d3 ακαπηφπεδηε πνυζθαηα ιε ηδκ αεακαημπμίδζδ ηςκ πνςημβεκχκ ηοηηάνςκ BCEC ιέζς έηθναζδξ ηςκ htert ηαζ ημο SV40 ιεβάθμο Σ ακηζβυκμο ιεηά απυ βεκεηζηή ιεηαθμνά ιέζς ζζημφ θμνέα. Ζ ηοηηανζηή ζεζνά hcmec/d3 εηθνάγεζ ημοξ ηοπζημφξ δείηηεξ υπςξ ημοξ CD31, VE-cadherin, ηαζ ημκ πανάβμκηα von Willebrand. Σα ηφηηανα ειθακίγμοκ θοζζμθμβζηυ ηανουηοπμ, δδιζμονβμφκ ζε επζθάκεζα απυ πθαζηζηυ πνμζημθθδιέκα ιμκμζηίααδα ηοηηάνςκ ζε ηαθθζένβεζα ηαζ δδιζμονβμφκ ηνζπμεζδείξ ζςθήκεξ ζε ηαθμφπζ. Δπζπθέμκ, αοηή δ ηοηηανζηή ζεζνά εηθνάγεζ οπμδμπείξ πδιμηζκχκ ηαζ οπενεηθνάγεζ ιυνζα ζοκάθεζαξ βζα ηδκ πνμζηυθθδζδ ζε απυηνζζδ ζηζξ θθεβιμκχδεζξ ηοημηίκεξ. Σέθμξ ηα ηφηηανα επζδεζηκφμοκ ηα παναηηδνζζηζηά ηςκ ηοηηάνςκ ημο αζιαημεβηεθαθζημφ θναβιμφ υπςξ ημκ ζπδιαηζζιυ ηςκ ζηεκμζοκδέζιςκ ηαζ ηδκ ζηακυηδηα κα ειπμδίγμοκ ηδκ είζμδμ θανιάηςκ. ε ηαθθζένβεζα, αοηά ηα ηφηηανα εηθνάγμοκ ζδιακηζηέξ πνςηεΐκεξ ιεηαθμνείξ υπςξ ηζξ ABCB1, ABCC1 ηαζ ABCG2 (Weksler et al. 2005). ε ζφβηνζζδ ιε ηα πνςημβεκή ακενχπζκα εβηεθαθζηά ιζηνμαββεζαηά εκδμεδθζαηά ηφηηανα ζε coculture ιε ακενχπζκα αζηνμηφηηανα, ηα hcmec/d3 ηφηηανα απμδίδμοκ ηδκ ίδζα ορδθή δζαεκδμεδθζαηή δθεηηνζηή ακηίζηαζδ (TEER) αηυια ηαζ απμοζία αζηνμηοηηάνςκ (Cucullo et al. 2008). Σα παναηηδνζζηζηά ηα μπμία είκαζ ζδιακηζηά βζα ηδκ πνυαθερδ ηδξ δζαπέναζδξ ηςκ ιμνίςκ δζαιέζμο ημο αζιαημεβηεθαθζημφ θναβιμφ είκαζ δ ακηίζηαζδ ζηδκ δζαπέναζδ ιζηνμφ ιμνζαημφ αάνμοξ οδνυθζθςκ ιμνίςκ, ηαθή δζαπεναηυηδηα βζα οδνυθμαα ζοζηαηζηά ιζηνμφ ιμνζαημφ αάνμοξ ηαζ δ έηθναζδ ηαζ θεζημονβία ηςκ πνςηεσκχκ ιεηαθμνέςκ. Έπεζ ιεθεηδεεί δ παναηοηηανζηή ηαζ δ δζαηοηηανζηή δζαπέναζδ ιζάξ ζεζνάξ ζοζηαηζηχκ δζαθμνεηζηχκ θοζζημπδιζηχκ ζδζμηήηςκ ηαζ ιμνζαηχκ αανχκ βζα ηδκ απμηίιδζδ ηςκ ζηεκμζοκδέζιςκ. Έπεζ επίζδξ, δζενεοκδεεί δ επίδναζδ ακενχπζκμο μνμφ ζηδ δζαπεναηυηδηα ηδξ ζμοηνυγδξ. Ζ ζηακυηδηα εκυξ θανιάημο κα πενκά ζημκ εβηέθαθμ είκαζ ζδζαίηενα ζδιακηζηή βζα ημ ζπεδζαζιυ εκυξ θανιάημο. Σα θάνιαηα βζα ηδκ εεναπέζα δζαηαναπχκ ημο ηεκηνζημφ κεονζημφ ζοζηήιαημξ πνέπεζ κα έπμοκ ηδκ δοκαηυηδηα κα δζαπενκμφκ ημκ αζιαημεβηεθαθζηυ θναβιυ. Παναηάης εα ακαθενεμφκ ηάπμζα παναηηδνζζηζηά ηδξ ηοηηανζηήξ ζεζνάξ hcmec/d3 πμο αθμνμφκ ζηδκ δζαπέναζδ ηαζ ηδκ έηθναζδ ιεηαθμνέςκ απυ αοηά, πμο έβζκακ βκςζηά ιεηά απυ πνμζθαηεξ ιεθέηεξ. Καεχξ μζ ζηεκέξ ζοκδέζεζξ ειπμδίγμοκ ηδ δζαπέναζδ οδνυθζθςκ μοζζχκ απμηεθεί ζδιακηζηυ παναηηδνζζηζηυ εκυξ ηαθμφ αζιαημεβηεθαθζημφ θναβιμο. Έπεζ ιεθεηδεεί δ παεδηζηή παναηοηηανζηή δζαπεναηυηδηα ηδξ ζμοηνυγδξ, ημο lucifer yellow ηαζ ηδξ ζκμοθίκδξ ςξ παναηοηηανζημί ιάνηονεξ ηαζ ανέεδηακ υηζ είκαζ (1.60*10-3 cm/min)ηαζ (0.74*10-3) βζα ηδκ ζμοηνυγδ ηαζ ηδκ ζκμοθίκδ ακηίζημζπα (Weksler et al. 2005). ε ζφβηνζζδ ιε ηζξ ηοηηανζηέξ ζεζνέξ ανμοναίμο, υπςξ ιε ηδκ RBE4 (4.8*10-3 cm/min) (Rist et al. 1997), ηδκ GPNT (7.4*10-3 cm/min) (Regina et al. 1999) δ ηοηηανζηή ζεζνά hcmec/d3 ειθακίγεζ ορδθυηενδ παναηοηηανζηή ακηίζηαζδ. Δκχ βζα ηδκ ηοηηανζηή ζεζνά αμυξ ιε ηδ πνήζδ BCEC πνςημβεκχκ ηοηηάνςκ ζε ζφζηδια 69

86 ιε αζηνμηφηηαναμζ ιζηνυηενεξ ηζιέξ πμο έπμοκ ανεεεί είκαζ έςξ Pe (0.75*10-3 cm/min) (Cecchelli et al. 1999). Ζ ηζιή Ρe βζα ηδκ ζκμοθίκδ ζε hcmec/d3 ηφηηανα είκαζ πενίπμο (0.37*10-3 cm/min) (Cecchelli et al. 1999). Ζ δζαηοηηανζηή δζαπέναζδ ελεηάζηδηε ιε ηδ πνήζδ ηςκ θζπυθζθςκ ζοζηαηζηχκ ιζηνμφ ιμνζαημφ αάνμοξ πνμπακμθυθδ, ιμνθίκδ ηαζ ιζδαθμγάιδξ. Αοηά ηα ιυνζα δζαπενκμφκ ημκ αζιαημεβηεθαθζηυ θναβιυ ζε πμθφ ιεβαθφηενδ έηηαζδ απυ ηα οδνυθζθα ιυνζα. Ο θυβμξ ηςκ δζαπεναημηήηςκ ηδξ πνμπακμθυθδξ ηαζ ζκμοθίκδξ ήηακ 6,1, εκχ βζα ηα πνμπακμθυθδ ηαζ ζμοηνυγδ 2,8. Αοηυξ μ θυβμξ επζηνέπεζ ηδκ δζάηνζζδ ιεηαλφ ιμνίςκ ιε ορδθυ δ παιδθυ νοειυ δζαπέναζδξ. ε ζφβηνζζδ ιε ημ ιμκηέθμ BCEC, υπμο μ θυβμξ ιεηαλφ πνμπακμθυθδξ ηαζ ζμοηνυγδξ ήηακ 5,7 ζηδκ hcmec/d3 ηοηηανζηή ζεζνά ήηακ παιδθυηενμξ. Πανυθα αοηά ζηδκ ηοηηανζηή ζεζνά ανμοναίμο b.end3, δεκ ήηακ δοκαηή δ δζάηνζζδ ιεηαλφ ζοζηαηζηχκ-ιανηφνςκ δζαπεναηυηδηαξ (Omidi et al. 2003). Ζ δζαπεναηυηδηα ηδξ ζμοηνυγδξ ζηδκ ηοηηανζηή ζεζνά hcmec/d3 ήηακ ορδθυηενδ απυ αοηήκ ζε co-culture ζοζηδια ιε πνςηανπζηχκ ηοηηάνς ιε αζηνμηφηηανα (Cecchelli et al.1999). Δίκαζ βκςζηυ υηζ δ ςνίιακζδ ηαζ μζ ζηεκδ ζφκδεζδ ηςκ ηοηηάνςκ ιπμνεί κα επδνεαζηεί απυ ηα αζηνμηφηηαν ή απυ πανάβμκηεξ εονζζηυιεκμοξ ζημ αίια. Έπεζ ιεθεηδεεί δ επίδναζδ ημο ακενχπζκμο μνμφ ζηα ιμκμζηίααδα ηςκ ηοηηάνςκ hcmec/d3. Δπςάζεζξ ηςκ ηοηηάνςκ ιε δζαθμνεηζηέξ ζοβηεκηχζεζξ ακενχπζκμο μνμφ HS (2.5, 5, 10%),ακηζηαεζζηχκηαξ ημκ FCS, ζοκηεθεί ζε ιείςζδ ηδξ δζαπεναηυηδηαξ ηδξ ζμοηνυγδξ δ μπμία ηοιαίκεηαζ απυ 32% εςξ 39%. Ήδδ απυ ηδκ ζοβηέκηνςζδ 2.5% δ δζαπεναηυηδηα ηδξ ζμοηνυγδξ ήηακ ιζηνυηενδ ζε ζφβηνζζδ ιε ηςκ ηοηηάνςκ πμο ακαπηφπεδηακ ζε 2.5% FCS. ηδκ ο- ρδθυηενδ ζοβηέκηνςζδ ημο 10% HS δ Pe ήηακ 0.97*10-3 cm/min. μ ιδπακζζιυξ ιε ημκ μπμίμ μ ακενχπζκμξ μνυξ αολάκεζ ηηδκ ακηίζηαζδ ζηδκ δζαπεναηυηδηα ημο θναβιμφ παναιέκεζ αδζεοηνίκζζημξ. 70

87 4.ΠΕΠΣΙΔΙΑ Αβ ΚΑΙ ΡΟΗ ΣΗΝ ΑΘΕΝΕΙΑ ALZHEIMER. ε ιζηνμζημπζηυ επίπεδμ, μζ παναηηδνζζηζηέξ αθθμζχζεζξ ηδξ αζεέκεζαξ Alzheimer απμηεθμφκ μζ πθάηεξ πμο ζπδιαηίγμκηαζ απυ απμεέζεζξ ημο α-αιοθμεζδμφξ πεπηζδίμο(αα), ηαζ μζ εκδμκεονςκζηέξ ζκζδζηέξ δμιέξ ζημκ ιέζμ ηνμηαθζηυ θμαυ ηαζ ζημκ θθμζυ ημο εβηεθάθμο, πμο ζπδιαηίγμκηαζ απυ ηδ ιδ θοζζμθμβζηά οπενθςζθςνοθζςιέκδ πνςηεΐκδ tau, ηαοηυπνμκα ιε ημκ εηθοθζζιυ ηςκ κεονχκςκ ηαζ ηςκ ζοκάρεςκ. O οπμηείιεκμξ ιδπακζζιυξ ηδξ αζεέκεζαξ δεκ έπεζ δζαθεοηακεεί πθήνςξ υ- ιςξ βεκεηζηά, παεμθμβζηά ηαζ αζμπδιζηά ζημζπεία οπμδδθχκμοκ υηζ δ ζηαδζαηή παναβςβή ηαζ δ αηυθμοεδ ζοζζχνεοζδ ημο α-αιοθμεζδμφξ, εκυξ πνςηεμθοηζημφ ηιήιαημξ ηδξ πνυδνμιδξ πνςηεΐκδξ (Αmyloid Precursor Protein APP), ηαηέπεζ έκακ ηεκηνζηυ νυθμ. Σμ Αα πεπηίδζμ, ημ ηονίανπμ ζοζηαηζηχκ ηςκ κεονςηζηχκ πθαηχκ, ζπδιαηίγεηαζ ζε ιδ θοζζμθμβζηέξ πμζυηδηεξ ιε ιζα αζοκήεζζηδ πέρδ ημο ΑΡΡ, ιζαξ δζαιειανακζηήξ πνςηεΐκδξ ( ηda) πμο δ πνςηανπζηή ημο θεζημονβία δεκ είκαζ βκςζηή πανυηζ ειπθέηεηαζ ζηδκ κεονςκζηή πθαζηζηυηδηα ηαζ ζημκ ζπδιαηζζιυ ηςκ ζοκάρεςκ ηςκ κεονχκςκ. Ζ ηονίανπδ θοζζμθμβζηή νμή ηδξ ΑΡΡ είκαζ ζημοξ κεονχκεξ ηαζ εηηεθείηαζ απυ ηζξ α-secretase ηαζ β- secretase πνμξ ηδκ παναβςβή ηδξ Ρ3 πνςηεΐκδξ. Ακηίεεηα ζηδκ αζεέκεζα Alzheimer έκα αιοθμσδμβεκεηζηυ ιμκμπάηζ ςεεί ηδκ πέρδ ηδξ ΑΡΡ απυ ηδκ α-secretase αημθμοεμφιεκδ απυ ηδκ πέρδ ιε β-secretase πνμξ ηδκ παναβςβή Αα πεπηζδίςκ ιε ημκ ανζειυ αιζκμλζηχκ ηαηάθμζπςκ κα πμζηίθεζ απυ 39 έςξ 42. Εικόνα 30. Δράςθ ενηφμων ςτθν ΑPP. 71

88 Σα δφμ επζηναηέζηενα είκαζ ηα Αα 1-40 (90%) ηαζ Αα 1-42 (10%) υπςξ απμδείπεδηε ζε αζμπδιζηέξ ιεθέηεξ ζε θοιέκα ηφηηανα ηαζ ζε εβηεθάθμοξ. ημκ εβηέθαθμ, ηα ηφηηανα απεθεοεενχκμοκ αοηυ ημ πεπηίδζμ ζε δζαθοηή ιμνθή υπμο ηάης απυ θοζζμθμβζηέξ ζοκεήηεξ απμαάθθεηαζ. Πανυθ αοηά ζε ιδ θοζζμθμβζηέξ ζοκεήηεξ δ ΑΡΡ παναηηδνίγεηαζ απυ ηδκ ηάζδ βζα πέρδ απυ ηδκ α- secretase, οπενθμνηχκμκηαξ ημ ιδπακζζιυ απμαμθήξ ηδξ ιε απμηέθεζια κα ιδκ απμιαηνφκεηαζ. Αοηυ ηεθζηά μδδβεί ζε ζοζζχνεοζδ ηδξ Αα υπμο ζηαδζαηά ζπδιαηίγεζ μθζβμιενή, πμθοιενή ηαζ ζκζδζηά ζοζζςιαηχιαηα πνμηαθχκηαξ κεονμεηθοθζζιυ. Εικόνα 31. Δθμιουργία πλακϊν Αβ αμυλοειδϊν. 4.1ΣΟΞΙΚΟΣΗΣΑ ΠΕΠΣΙΔΙΨΝ Αβ Ζ κεονςκζηή απχθεζα ζηδκ αζεέκεζα Alzheimer μθείθεηαζ ζηζξ κεονμημλζηέξ ζδζυηδηεξ ηςκ Αα ζπδιαηζζιχκ. Πανυηζ ηα Αα ιπμνμφκ κα ζημηχζμοκ ημοξ κεονχκεξ, ιπμνμφκ επίζδξ κα δνάζμοκ πνμηαθχκηαξ ημλζηυηδηα ζηζξ ζοκάρεζξ, ιζα δνάζδ πμο θαίκεηαζ πζμ ζπεηζηή ιε ημκ νυθμ ηςκ Αα πεπηζδίςκ ζηδκ αζεέκεζα. Σα πνχηα ζηάδζα ηδξ αζεέκεζαξ παναηηδνίγμκηαζ ηονίςξ απυ ηδκ απχθεζα ηςκ ζοκάρεςκ πανά απυ ημκ κεονςκζηυ εάκαημ. Σα Αα ιπμνεί κα πνμηαθέζμοκ δεκδνζηζηή ή αλμκζηή α- καζημθή δ μπμία ζηαδζαηά μδδβεί ζε κεονςκζηυ εάκαημ. Ο ιδπακζζιυξ ηδξ κεονμημ- 72

89 λζηυηδηαξ ιέζς ηςκ Αα δεκ είκαζ απυθοηα βκςζηυξ. Ο κεονμεηθοθζζιυξ ιέζς ηςκ Αα πεπηζδίςκ ιπμνεί κα πνμηθδεεί απυ ηδκ δζάνδλδ ηςκ ιειανακχκ, ηδκ ακαζημθή ηδξ δναζηδνζυηδηαξ ηςκ ιζημπμκδνίςκ, ηδκ πνυηθδζδ μλεζδςηζημφ ζηνεξ, δζάνδλδ ηςκ ζοκάρεςκ ιεηάδμζδξ ηςκ ζδιάηςκ ηαζ ηδξ αλμκζηήξ ιεηαθμνάξ. ηδκ πναβιαηζηυηδηα μζ αθθαβιέκεξ αζμθμβζηέξ θεζημονβίεξ πμο μθείθμκηαζ ζηδκ πανμοζία ηςκ πεπηζδίςκ ζοιπενζθαιαάκμοκ ημκ ζπδιαηζζιυ ζμκηζηχκ ηακαθζχκ πμο ηνμπμπμζμφκ ηδκ μιμζυζηαζδ ηςκ ζυκηςκ αζαεζηίμο ηαζ πανάβμοκ δναζηζηέξ ιμνθέξ μλοβυκμο ηαζ μλεζδςηζηυ ζηνεξ, ζηναημθυβδζδ ηοηηανζηχκ παναβυκηςκ ή εκενβμπμίδζδ ηοηηανζηχκ δζαδζηαζζχκ υπςξ απυπηςζδ ηαζ θθεβιμκή, πνμηαθχκηαξ ιζα επαηυθμοεδ ζζηζηή αθάαδ ημο εβηεθάθμο ηαζ κεονςκζηυ εάκαημ. Σα Αα πεπηίδζα δεζιεφμκηαζ ζηδκ ηοηηανζηή ιειανάκδ ηαζ δδιζμονβεί ηακάθζα ή πυνμοξ πμο δζαννδβκφμοκ ηδκ ζμκηζηή μιμζυζηαζδ μδδβχκηαξ ζε κεονςκζηή δοζθεζημονβία ή εάκαημ ηαηαζηνέθμκηαξ ημ δοκαιζηυ ηδξ ιειανάκδξ ηαζ επζηνέπμκηαξ ηδκ αφλδζδ ηδξ νμήξ ημο αζαεζηίμο ιέζς ημκ ηακαθζχκ πμο ζπδιαηίγμκηαζ απυ ηα πεπηίδζα ή έιιεζα πνμηαθχκηαξ αολδιέκδ νμή αζαεζηίμο δθεηηνμεοαίζεδηςκ ηακαθζχκ αζαεζηίμο. Ζ ιεβάθδ μιμζυηδηα ηςκ πεπηζδίςκ Αα 1-40 ζε ιδ πμθζηυ πενζαάθθμκ ηαζ ηςκ ζζηχκ πεπηζδίςκ ζφκηδλδξ δδθχκεζ υηζ μ ζπδιαηζζιυξ πυνςκ ζηδκ ιειανάκδ ιπμνεί κα είκαζ έκαξ πανάβμκηαξ ηθεζδί βζα ηδκ κεονμημλζηυηδηα. Σα πεπηίδζα Αα ιπμνεί κα δζαηυρμοκ ηδκ δναζηδνζυηδηα ηδξ ιζημπμκδνζαηήξ μλεζδάζδξ ημο ηοημπνχιαημξ (cytochrome-c-oxidase COX) ηαζ δεζιεφεηαζ ζηδκ αθημμθζηή δζοδνμβμκάζδ πνμηαθχκηαξ ακαζημθή ηδξ ιζημπμκδνζαηήξ ακαπκεοζηζηήξ αθοζίδαξ, πμο μδδβεί ζε αφλδζδ ημο μλεζδςηζημφ ζηνεξ. Ζ ημλζηυηδηα ημο Αα πμο ζοκδέεηαζ ιε ημ μλεζδςηζηυ ζηνεξ ζοιπενζθαιαάκεζ ηζξ αθθδθεπζδνάζεζξ ιε ιεηαθθζηά ζυκηα παθημφ(cu 2+ ). Tα ζφιπθμηα Ab:Cu δδιζμονβμφκ δναζηζηέξ ιμνθέξ μλοβυκμο (reactive oxygen species ROS) υπςξ οπενμλείδζμ ημο οδνμβυκμο, ηαηαζηνέθμοκ ηδκ ακηζμλεζδςηζηή άιοκα ηαζ ιέζς ηςκ ROS πνμηαθμφκ ηαηαζηνμθή ηοηηανζηχκ δμιχκ. Ζ απχθεζα ηδξ βθμοηαεεζυκδξ (GSH) θαίκεηαζ κα είκαζ αζαεζημελανηχιεκδ οπμδδθχκμκηαξ υηζ μζ αθθαβέξ ζηδκ μιμζυζηαζδ ημο αζαεζηίμο είκαζ εκάκηζα ζημ ιμκμπάηζ ηςκ αθααχκ πμο πνμηαθμφκηαζ απυ ηα Αα πεπηίδζα ηαζ υηζ μζ μλεζδςηζηέξ αθάαεξ είκαζ απυ ιυκεξ ημοξ αζαεζημελανηχιεκεξ. Σα Αα ιπμνεί κα είκαζ μλεζδςηζηά ηνμπμπμζδιέκα ιε πνμζεήηδ άθθςκ ζοζηαηζηχκ (αθδεΰδεξ, κηυπα, κημπαιίκδ, δζοδνμλοζκδυθδ) ζηα ηαηάθμζπα ηονμζίκδξ ηαζ θοζίκδξ. Έκαξ εκαθθαηηζηυξ ιδπακζζιυξ βζα ηδκ ακαζημθή ηδξ ζοκαπηζηήξ ιεηάδμζδξ ιέζς ηςκ Αα ααζίγεηαζ ζηδκ ζηακυηδηα ηςκ Αα κα δεζιεφμοκ ζυκηα ρεοδανβφνμο. Ανηεηέξ ιεθέηεξ ζε πμκηίηζα έδεζλακ υηζ δ αθθδθεπίδναζδ ιεηαλφ Αα ηαζ ιεηαθθζηχκ ζυκηςκ ιέζα ζηδκ ζοκαπηζηή ζπζζιή ζοκεζζθένεζ ζε εθαηηςιαηζηή ιεηάδμζδ κεονζημφ ζήιαημξ ηαζ ζηδκ απχθεζα θεζημονβζηχκ ζοκάρεςκ (Snyder E.M. et al.,2005). 4.2 ΔΟΜΙΚΑ ΦΑΡΑΚΣΗΡΙΣΙΚΑ Αβ ΠΕΠΣΙΔΙΨΝ 73

90 Σα ημλζηά παναηηδνζζηζηά πμο εηδδθχκμκηαζ ζηδκ αζεέκεζα Alzheimer πζζηεφεηαζ υηζ ειθακίγμκηαζ ςξ απμηέθεζια αθθαβχκ ζηδκ δζαιυνθςζδ ηςκ Αα ιμκμιενχκ απυ ηδκ επζηναημφζα α έθζηα ζε ιίβια ακαδζπθςιέκςκ δζάιεζςκ πθμφζζςκ ζε α δμιέξ πμο μδδβμφκ ζε ζοζζςιάηςζδ ηςκ ιμκμιενχκ ηαζ ζε αηυθμοεμ ζπδιαηζζιυ ζκζδίςκ. Σα ηεθεοηαία πνυκζα έπεζ δεζπεεί υηζ ηα δζαθοιέκα μθζβμιενή ιπμνεί κα είκαζ πζμ ζδιακηζηά παεμθμβζηά απυ ηζξ αιοθμεζδείξ ζκχδεζξ απμεέζεζξ (Kayed,R.et al.,2003). Αοηή δ ηάζδ ηςκ αιοθμεζδχκ βζα ζπδιαηζζιυ δμιχκ ελανηάηαζ απυ ηδκ αιζκμλζηή αθθδθμοπία ηαζ ζφκεεζδ Λ Ξ Μ Ξ Λ Δ Π Ζ Α Β Ο Δ Ο Θ Δ Θ Α Ζ αθθδθμοπία ηςκ Αα1-42 είκαζ δ αηυθμοεδ NH2 DEAFRHDSGYFVHHQKLVFFAEDVGSNKGAIIGLMVGGVVIA-COOH Ζ αθθδθμοπία ημο Αα1-42 πςνίγεηαζ ζε δφμ πενζμπέξ. Σα ηαηάθμζπα 1-28 ζπδιαηίγμοκ ιζα ζπεηζηά οδνυθζθδ πενζμπή πμο ζηδκ ΑΡΡ είκαζ ημ ελςηοηηανζηυ ηιήια. Σα ηαηάθμζπα ακηζπνμζςπεφμοκ ηδκ οδνυθμαδ πενζμπή πμο ζπεηίγεηαζ ιε ημ εκδμιειανακζηυ ηιήια ηδξ ΑΡΡ. Σα Αα1-40 ηαζ Αα 1-42 πεπηίδζα ανίζημκηαζ ζε ηοπαίμ ημοαάνζ ζε οδαηζηυ δζάθοια, άθθα πενζέπμοκ ηάπμζα ζημζπεία δεοηενμηαβμφξ δζαιυνθςζδξ: ιζα έθζηα πνμθίκδξ 2 (ΡΗΗ) ζημ αιζκμηεθζηυ άηνμ, ηαζ δφμ α- ζηνμθέξ ζημ ηέκηνμ ηαζ ζημ ηαναμλοηεθζηυ άηνμ (Danielson, J. et al.,2006). Ζ δοκαιζηή ηςκ ιμκμιενχκ Αα1-40 ζε οδαηζηυ δζάθοια ιεθεηήεδηε απυ ημκ Danielson et al ιε NMR. Tμ ιήημξ ημο ιμκμιενμφξ Αα1-40 ανέεδηε υηζ ιεζχκεηαζ απυ μηηχ ζε ηνία ηαηάθμζπα αολάκμκηαξ ηδκ εενιμηναζία απυ 3 ζε 18 ºC. ημοξ 3 ηα πεπηίδζα πανμοζίαζακ δμιζηή ηθίζδ πμο ζπεηίγεηαζ ιε ηζξ πενζμπέξ δεοηενμηαβμφξ δμιήξ πμο πανμοζζάγεηαζ ζηα ζκίδζα ηαζ ιε ηδκ α έθζηα ζε ζοζηήιαηα ιειανακχκ. Πνμηάεδηε έκα δμιζηυ ιμκηέθμ βζα ημ ιμκμιενέξ δζαθοηυ α-πεπηίδζμ ιε έλζ πενζμπέξ δεοηενμηαβμφξ δζαιυνθςζδξ. Σα πεπηίδζα θένμοκ 2 πενζμπέξ ιε ηάζδ δζαιυνθςζδξ α δμιήξ (ηαηάθμζπα ηαζ 31-40), δφμ πενζμπέξ ιε ηθίζδ βζα δζαιυνθςζδ Ρζζ έθζηαξ (ηαηάθμζπα 1-4 ηαζ 11-15) ηαζ δφμ ιδ δμιδιέκεξ πενζμπέξ ιε ορδθή ηζκδηζηυηδηα (ηαηάθμζπα 5-10 ηαζ 25-30) πμο ζοκδέμοκ ηα δμιδιέκα ζημζπεία. Ακαθοηζηυηενα ημ ηαναμλοηεθζηυ άηνμ ζπδιαηίγεζ ιζα ακηζπανάθθδθδ α-δμιή ιε ηδκ ηεκηνζηή πενζμπή. Ζ ηεκηνζηή πενζμπή, ηονίςξ ζε παιδθέξ εενιμηναζίεξ, θένεζ έκα ιεβάθμ ηιήια ΡΗΗ έθζηαξ, ημ μπμίμ ιε αφλδζδ ηδξ εενιμηναζίαξ έπεζ ηάζδ πνμξ ζπδιαηζζιυ α-ζηνμθήξ. Ο πονήκαξ ηδξ ηεκηνζηήξ πενζμπήξ (ηαηάθμζπα 18-20) ζε παιδθέξ εενιμηναζίαξ έπεζ ηάζδ πνμξ ζπδιαηζζιυ α-ζηνμθήξ. Σμ ηζκδηυ ηιήια (15-30) επζηνέπεζ ζημ ηαναμλοηεθζηυ άηνμ κα πνμζεββίζεζ ζηδ α-ζηνμθή, υπμο μζ πθεονζηέξ αθοζίδεξ ιπμνμφκ κα ειπθαημφκ ζε 74

91 οδνυθμαεξ αθθδθεπζδνάζεζξ. Πμθθά πεζναιαηζηά δεδμιέκα έπμοκ δείλεζ υηζ ημ οδνυθμαμ ηιήια ζημ ηαναμλοηεθζηυ ηιήια ημο πεπηζδίμο Αα είκαζ οπεφεοκδ βζα ηδκ ηάζδ πνμξ ζπδιαηζζιυ α-δμιχκ, εκχ δ δζαιυνθςζδ ημο Αα ελανηάηαζ ηονίςξ απυ ηδ δεοηενμηαβή δμιή πμο οζμεεηείηαζ απυ ηδκ αιζκμηεθζηή πενζμπή. Αοηυ ζηδνίγεηαζ απυ ημ βεβμκυξ υηζ δ ιεηάθθαλδ ζημ V18, εκυξ αιζκμλέμξ ιε ηδκ ηάζδ βζα ζπδιαηζζιυ α- δμιχκ, ζε αθακίκδ (εκυξ αιζκμλέμξ πμο ζπδιαηίγεζ α-έθζηεξ) πνμάβεζ αφλδζδ ηςκ α- εθίηςκ ζημ Αα1-40 ηαζ δναιαηζηή ιείςζδ ζημκ ζπδιαηζζιυ ζκζδίςκ. Δπζπθέμκ δ ακηζηαηάζηαζδ ηδξ βθμοηαιίκδξ απυ βθμοηαιζκζηυ μλφ ζηδκ εέζδ 22 ιεζχκεζ ηδκ ηάζδ ηδξ Αα αιζκμηεθζηήξ πενζμπήξ κα οζμεεηήζεζ δμιή α-έθζηαξ ιε απμηέθεζια ηδκ αφλδζδ ζημοξ αιοθμεζδείξ ζπδιαηζζιμφξ( Soto,C.,et al., 1995) Δ Θ Λ Δ Π Ζ Ι Α Θ Ξ Κ Θ Γ Ξ Λ Δ Π Ζ Α β Ο Δ Ο Θ Δ Θ Α Σμ δζαθοηυ ιμκμιενέξ πεπηίδζμ έπεζ ορδθή ηάζδ πνμξ ημκ ζπδιαηζζιυ μθζβμιενχκ ηα μπμία ηεθζηά δδιζμονβμφκ ζκίδζα Αα (Walsh.D,M.et al.,2002) ζε ηζιέξ ph ιεηαλφ 4 ηαζ 7, ηαηαηνδικίγεηαζ βνήβμνα αολάκμκηαξ ηδκ δδιζμονβία α-δμιχκ. Πανυηζ ηα Αα 1-40 ηαζ 1-42 έπμοκ ηαοηυζδιδ αιζκμλζηή αθθδθμοπία, ανηεηέξ in vivo ηαζ in vitro ιεθέηεξ έπμοκ δείλεζ υηζ ηα δφμ πεπηίδζα έπμοκ δζαθμνεηζηέξ ζδζυηδηεξ ζοζζςιάηςζδξ ηαζ απυεεζδξ. Λεπημιενέζηενα ηα Αα 1-42 ζοζζςιαηχκμκηαζ πμθφ πζμ βνήβμνα απυ ηα 1-40 in vitro ηαζ είκαζ πζμ ημλζηά. Σμ 2008, μ Shen δζελήβαβε πεζνάιαηα πνμζμιμίςζδξ ιμνζαηή δοκαιζηήξ (MD) ζε Aα 1-40 ηαζ 1-42 ιε ζημπυ κα δζενεοκήζεζ ηδ θοζζηή αάζδ πίζς απυ ηζξ δζαθμνεηζηέξ ζδζυηδηεξ ηςκ δφμ πεπηζδίςκ. ηα πεπηίδζα Αα 1-40 θυβς ηδξ δζαιυνθςζδξ ζε R- έθζηα ιεηαλφ ηςκ ηαηαθμίπςκ (VV) ηαζ LMV, αοηά ηα ηαηάθμζπα ζπδιαηίγμοκ έκα οδνυθμαμ πονήκα ζημ ηαναμλοηεθζηυ άηνμ πμο ζηαεενμπμζεί ημ πεπηίδζμ. Απυ ηδκ άθθδ υιςξ πθεονά αοηυξ μ πονήκαξ ηαηαζηνέθεηαζ ζημ Αα πεπηίδζμ 1-42 ελαζηίαξ ηδξ πνμζεήηδξ ηςκ ηαηαθμίπςκ ΗΑ πμο ζπδιαηίγμοκ οδνυθμαεξ αθθδθεπζδνάζεζξ ιε ηα ηαηάθμζπα VV. Αοηυ πνμηαθεί ηδκ δζάνδλδ ηςκ οδνυθμαςκ αθθδθεπζδνάζεςκ ιεηαλφ ηςκ ηαζ LMV. οκεπχξ ηα ηαηάθμζπα VV ηείκμοκ κα πθδζζάζμοκ ιε ηα ΗΗ πνμξ ημκ ζπδιαηζζιυ εκυξ κέμο οδνυθμαμο πονήκα. πςξ ακαθένεδηε ηαζ πνζκ ιεθέηεξ NMR ζε ιζηνά Αα ηιήιαηα οπμδδθχκμοκ υηζ ζε οδαηζηά δζαθφιαηα ηα Αα πεπηίδζα ιπμνμφκ κα πενζβναθμφκ ζακ ηοπαίμ ζπείναια ιε ιυκμ ιενζηέξ ημπζηέξ ιδ ηοπαίεξ δμιέξ. Λεπημιενείξ υιςξ ιεθέηεξ δζελάβςκηαζ ζε ιίβιαηα οδαηζηχκ ηαζ μνβακζηχκ θεμνζμιέκςκ δζαθοηχκ υπςξ TFE ηαζ HFIP ηαζ ζε ημθμεζδή δζαθφιαηα θυβς ημο μηζ ηα Αα πεπηίδζα έπμοκ ιζηνή ηάζδ δζάθοζδξ ζε κενυ (Barrow. C.J. et al., 1991) ζε αοηά ηα ιέζα ηα πεπηίδζα δεκ ζοζζςιαηχκμκηαζ ηαζ έπμοκ ηονίςξ δζαιμνθχζεζξ α-έθζηαξ. Μίβιαηα κενμφ ηαζ TFE ιπμνεί επίζδξ κα πνμάβμοκ ηζξ α δμιέξ. Αοηή δ ζδζυηδηα πενζβνάθδηε απυ ημκ Tommaselli 75

92 (2006) ιε ζημπυ κα παναηηδνίζμοκ ηζξ ιεηαπηχζεζξ ζηδ δζαιυνθςζδ ηςκ Αα πεπηζδίςκ απυ έθζηεξ ζε α δμιέξ. Με ηζξ ηεπκζηέξ NMR ηαζ CD ηαεχξ ηαζ ιε πνμζμιεζχζεζξ MD έδεζλακ υηζ δ πονδκζηή αθθδθμοπία ηαηέπεζ ηεκηνζηυ νυθμ ζηζξ α-α ιεηαπηχζεζξ δζαιυνθςζδξ. Ζ α δζαιυνθςζδ είκαζ ζηαεενή ζε δζαθφιαηα πμο πενζέπμοκ % κενυ, ηαζ πνμζεήηδ ηαηάθθδθδξ πμζυηδηαξ HFIP ηνμπμπμζεί ηδκ δζαιυνθςζδ απυ α ζε α. δ ιμνθή ηςκ μθζβμιενχκ δεκ είκαζ αηυια βκςζηή ιε θεπημιένεζεξ. Πνυζθαηα πενζβνάθδηε ςξ έκα δςδεηαιενέξ ζηακυ κα δεζιεφεηαζ ζε δεκδνζηζηέξ δζαδζηαζίεξ ηςκ κεονχκςκ ηαζ κα ιπθμηάνεζ ηδ θοζζμθμβζηή θεζημονβία ηςκ ιειανακχκ (Barghorn,S.,et al.,2005and Lesne,S.et al.,2006). Απυ δμιζηή ζημπζά ειθακίγμκηαζ ςξ ιζηηφθζα Αα πεπηζδίςκ ιε ημ οδνυθμαμ ηαναμλοηεθζηυ άηνμ ηνοιιέκμ ζημ ηέκηνμ ημο ιζηηοθίμο ηαζ ηνίζζιδ ζοβηέκηνςζδ ιζηηοθζμπμίδζδξ ζζδ ιε 17,6mM (Kayed, R. et al.,2005) ηα πεπηίδζα ζηα μθζβμιενή είκαζ ηονίςξ πςνίξ δμιέξ (Chiti, F.,et al.,2006). Tμ 2005 μ Laurents et al. πνυηεζκε έκα δζαθμνεηζηυ είδμξ Αα ζοζζςιαηςιάηςκ, ηα επμκμιαγυιεκα α-ιπάθεξ, πμο ακζπκεφμκηαζ ζε ph παιδθυηενμ ημο 4 (Laurents, D.V.et al.,2005). Πνςημσκίδζα ηαζ ζκίδζα πνμσυκηα ηδξ ζοζζςιάηςζδξ ηςκ Αα μθζβμιενχκ είκαζ ηα Αα πνςημσκίδζα. Έπμοκ ιζα νααδμεζδή δμιή ιε ιήημξ nm, πμο παναηηδνίγεηε απυ έκακ πονήκα ιε πμθθέξ α-δμιέξ υπςξ οπμδδθχκεηαζ απυ ηδκ ακηίζηαζδ ζηδκ οδνμβυκμ-ακηαθθαβή ηαζ ηδκ ζηακυηδηα κα δεζιεφεηαζ ζε ενοενυ ημο Congo ηαζ εεμθθααίκδ-σ. Tα πνςημσκίδζα ιπμνμφκ κα επζιδηοκεμφκ ιε ζφκδεζδ ιζηνυηενςκ πνςημσκζδίςκ ιε ηαπφηδηα πμο ελανηάηαζ απυ ηδκ ζοβηέκηνςζδ ηςκ Αα, ημ ph, ηδκ ζμκζηή δφκαιδ ηαζ ηδκ εενιμηναζία. ιπμνμφκ βνήβμνα κα ιεηαηναπμφκ ζε δμιέξ πνςημζκζδίςκ Αα, υηακ οπάνπμοκ ήδδ ζπδιαηζζιέκα ζκίδζα, αηυια ηαζ ακ οπάνπεζ ηονίανπδ δοκαιζηή ζζζμνμπία ηςκ μθζβμιενχκ (Blakley,H.K. et al., 2000). Σμ ηεθζηυ ζηάδζμ ζημ ιμκμπάηζ ζοζζςιάηςζδξ ηςκ Αα είκαζ δ ςνίιακζδ ηςκ πνςημζκζδίςκ ζε ζκίδζα. Αοηή δ δζαδζηαζία ίζςξ δζελάβεηαζ απυ οδνυθμαδ επαθή 3 ηαζ 6 πνςημζκζδίςκ πμο οπμηίεεηαζ υηζ ζπδιαηίγμοκ έκα ζκίδζμ. Σα Αα ζκίδζα ζοκηίεεκηαζ απυ πμθθαπθά πνςημσκίδζα ζηνμαζθζζιέκα ημ ηαεέκα βφνς απυ άθθμ δδιζμονβχκηαξ κδιαημεζδείξ ζπδιαηζζιμφξ δζαιέηνμο 6 ιε 10 nm. Σα Αα1-40 ζκίδζα απμηεθμφκηαζ απυ 2 ή 3 πνςημσκίδζα δζεοεεηδιέκα ζε ανζζηενυζηνμθδ οπενέθζηα ζπδιαηίγμκηαξ ιζα ζπήιαημξ s ζκζδζαηή εβηάνζζα ημιή. Σα ζκίδζα αιοθμεζδμφξ έπμοκ παναηηδνζζηεί χξ εενιμδοκαιζηά ζηαεενά, μνβακςιέκα δμιζηά ζδιακηζηά αδζάθοηα, κδιαημεζδή πνςηεσκζηά ζοζζςιαηχιαηα πμο απμηεθμφκηαζ απυ επακαθαιαακυιεκεξ μιάδεξ α-δμιχκ εοεοβναιιζζιέκςκ ηάεεηα ζημκ άλμκα ημο ζκζδίμο ιε πζεακή πανάθθδθδ ή ακηζπανάθθδθδ μνβάκςζδ. ηα ζκίδζα αιοθμεζδμφξ, αοηέξ μζ α-δμιέξ είκαζ μνβακςιέκεξ ζε ιζα δζεοεέηδζδ υπμο μζ α δμιέξ ανίζημκηαζ ηάεεηα ζημκ ηφνζμ άλμκα ημο ζκζδίμο. Ο πνμζδζμνζζιυξ ηδξ μθζηήξ ιμνζαηήξ δμιήξ ηςκ ζκζδίςκ απαζηεί εζδζηέξ πεζναιαηζηέξ πνμζεββίζεζξ ελαζηίαξ ηδξ ιδ ηνοζηαθθζηήξ, αδζάθοηδξ θφζδξ. Δκχ ηα ιμκμιενή πεπηίδζα ανίζημκηαζ ηονίςξ ζε ηοπαία δζαιυνθςζδ, βζα ηα ζκζδζηά αιοθμεζδή, ηα ηονίανπα δεοηενμβεκή δμιζηά ζημζπεία είκαζ μζ α ζηνμθέξ. Ζ ιεθέηδ ηδξ δεοηενμηαβμφξ δμιήξ ηςκ ζκζδίςκ αιοθμεζδμφξ ζηδνίγεηαζ ζηδκ ηαοημπμίδζδ ηςκ ηιδιάηςκ ιε α-δμιέξ ηαζ πςνίξ α- δμιέξ (ζηνμθέξ εδθζέξ ή ηθίζεζξ). Σα ηεθεοηαία πνυηοπα βζα ηδκ δμιή ηςκ ζκζδίςκ οπμζηδνίγμοκ υηζ ζημκ πονήκα πενζέπμκηα δφμ ή πενζζζυηενα επίπεδα α-δμιχκ. Ζ 76

93 ηεηανημηαβήξ δμιή δδιζμονβείηαζ απυ επαθή ιεηαλφ ηςκ πθεονζηχκ αθοζίδςκ ζε ζκίδζα πμο ζπδιαηίγμκηαζ απυ ζπεηζηά ιαηνζά πεπηίδζα, μζ βεζημκζηέξ α-δμιέξ ιπμνεί κα ζπδιαηίγμκηαζ απυ α-ζηνμθέξ είηε απυ ημ ίδζμ είηε απυ βεζημκζηυ ιυνζμ απμδεζηκφμκηαξ υηζ μζ επαθέξ ηςκ πθεονζηχκ αθοζίδςκ απυ ηζξ μπμίεξ ελανηάηαζ δ ηεηανημηαβή δμιή, ιπμνεί κα είκαζ εκδμιμνζαηή ή δζαιμνζαηή. φιθςκα ιε δεδμιέκα απυ solid state NMR, ακηαθθαβήξ οδνμβυκςκ ηαζ EPR, ζε ζκίδζα πμο ζπδιαηίγμκηαζ απυ Αα 1-40 πεπηίδζα. Σα ηαηάθμζπα 1-9 είκαζ δμιζηά αηακυκζζηα, ηα ηαζ ζπδιαηίγμοκ α-ζηνμθέξ, ηαζ ηα ζπδιαηίγμοκ ιζα εδθζά ή ιζα ηάιρδ (Νicotra). 4.3 ΕΓΚΕΥΑΛΙΚΗ ΑΠΟΜΑΚΡΤΝΗ ΣΨΝ ΠΕΠΣΙΔΙΨΝ Αβ ΚΑΣΑ ΜΗΚΟ ΣΟΤ ΑΙ- ΜΑΣΟΕΓΚΕΥΑΛΙΚΟΤ ΥΡΑΓΜΟΤ. Κεκηνζηυ νυθμ, ζημ λεηίκδια ηαζ ηδκ πνυμδμ ηδξ αζεέκεζαξ, ηαηέπεζ δ ηαηάθθδθδ ζζμννμπία ιεηαλφ ηδξ παναβςβήξ ηςκ Αα ηαζ ημο ηαηααμθζζιμφ ημοξ. Ο Ito et al δδιμζίεοζε υηζ ημ clearance εηνμήξ ημο ναδζμζδιαζιέκμο 125Η Αα ζε πμκηίηζα είκαζ 11.0 ιl/min g brain (Ito,S., eta al.,2006) πεζναιαηζηά ζημζπεία οπμδδθχκμοκ υηζ ηα Αα ημο εβηεθάθμο ηαζ ημο αίιαημξ είκαζ ζε ζζμννμπία, ιέζς ημο ΑΔΦ, ηαζ δ απμιάηνοκζδ ηςκ Αα απυ ηδκ ηοηθμθμνία ημο αίιαημξ εα επζθένεζ αθθαβή ηδξ ζζμννμπίαξ πνμξ ημ αίια ιε απμηέθεζια κα απμιαηνφκεηαζ δ πενίζζεζα απυ ημκ εβηέθαθμ (sink effect)(matsuoka, Y., et al.,2003). Ζ απμιάηνοκζδ θαίκεηαζ υηζ δζελάβεηαζ ιε 2 ιμκμπάηζα. Με πνςηεμθοηζηή απμζημδυιδζδ ηαζ ιε ιεηαθμνάξ ιέζς οπμδμπέςκ απυ ημκ εβηέθαθμ. Πνςηεμθοηζηή απμζημδυιδζδ. Έκαξ ανζειυξ πνςηεαζχκ ειπθέηεηαζ ζηδκ πνςηεμθοηζηή εηηαεάνζζδ ηςκ Αα απυ ηεκηνζηυ κεονζηυ ζφζηδια. Οζ δφμ πζμ ζδιακηζηέξ εκδμπεπηζδάζεξ πμο ζοιιεηέπμοκ ζηδκ απμζημδυιδζδ ηςκ Αα πεπηζδίςκ είκαζ μζ ιεηαθθμεκδμπεπηζδάζεξ ρεοδανβφνμο, πμο ακαθένμκηαζ ηαζ ςξ έκγοια απμζημδυιδζδξ ηδξ ζκζμοθίκδξ IDE ή insulysin, neprilysin(nep), endothelin ηαζ δ πθαζιίκδ (Selkoe. D.J., et al., 2001) 77

94 Λ Δ Α Τ Ξ Π Α Ω Μ Ο Δ Ο Θ Δ Θ Ω Μ Α β Δ Θ Α Λ Δ Ρ Ξ Σ Ξ Σ Α Δ Τ Λ Δ Ρ Ω Σ Ο Ξ Δ Ξ Υ Δ Α Ζ εηηαεάνζζδ απυ ημκ εβηέθαθμ πνμξ ημ αίια ηςκ Αα επζηοβπάκεηαζ ιε ζοζηήιαηα εηνμήξ ιέζς ημο ΑΔΦ. Τπάνπμοκ ζημζπεία πμο οπμδδθχκμοκ υηζ μ οπμδμπέαξ ηςκ θζπμπνςηεσκχκ παιδθήξ ποηκυηδηαξ (lipoprotein receptor related protein LRP) ηαζ μ οπμδμπέαξ πνμσυκηςκ ηεθζηήξ βηοημγοθίςζδξ RAGE ζοιιεηέπμοκ ζηδκ εηνμή ηςκ Αα πεπηζδίςκ ηαηά ιήημξ ημο ΑΔΦ ιε ιεηαθμνά ιέζς οπμδμπέα (Zlokovik, B.V.,2004). Δκχ μζ LRP θαίκεηαζ κα ιεζμθααμφκ ζηδκ εηνμή ηςκ Αα απυ ημκ εβηέθαθμ πνμξ ηδκ ηοηθμθμνία ημο αίιαημξ μζ RAGE έπμοκ ειπθαηεί ζηδκ εζζνμή ηςκ Αα πεπηζδίςκ ζημκ εβηέθαθμ. Θεναπεοηζηέξ ζηναηδβζηέξ ιπμνμφκ κα ααζζζημφκ ζε εκενβμπμίδζδ ηςκ LRP-1 ή ζε απμνφειζζδ ηςκ RAGE. H ApoE δνχκηαξ πάκς ζε θζπίδζα ζε υθμ ημκ εβηέθαθμ παίγεζ ηεκηνζηυ νυθμ ζηδκ νφειζζδ ηςκ επζπέδςκ ηςκ Αα πεπηζδίςκ, ηαεχξ ηαζ ζηδκ απυεεζή ημοξ ηαζ ηδκ απμιάηνοκζή ημοξ (Holtzman, D.M., et al., 2001). Πνυζθαηα δδιμζζεφηδηε απυ ημκ Jiang Q et al υηζ ιμνθέξ ηδξ ApoE ιε θζπίδζα δνμοκ αεθηζχκμκηαξ ημ clearance ηςκ Αα πεπηζδίςκ απυ ημκ εβηέθαθμ ηαζ δζεοημθφκμκηαξ ηδκ πνςηεμθοηζηή απμζημδυιδζδ ηςκ Αα. Γδιμζίεοζακ υηζ δ πνμαβςβή ηςκ θζπζδζηχκ ιμνθχκ ApoE έπεζ ςξ απμηέθεζια ηδκ ιείςζδ ηςκ επζπέδςκ ηςκ Αα πεπηζδίςκ ηαζ ηςκ πθαηχκ (Jiang, Q., et al.,2008). Σα ιμνζαηά ιμκμπάηζα πμο είκαζ οπεφεοκα βζα ηδκ εζζνμή ηαζ ηδκ εηνμή ηςκ Αα πεπηζδίςκ απυ ημκ εβηέθαθμ δζαιέζμο ημο ΑΔΦ οπμδδθχκμοκ ιζα ηαηεοεοκηήνζα βναιιή βζα εεναπεοηζηέξ ζηναηδβζηέξ πμο ιπμνμφκ κα ζημπεφζμοκ ζηδκ ιείςζδ ηδξ ζοζζχνεοζδξ ηςκ εβηεθαθζηχκ Αα πεπηζδίςκ. Σμ clearance ηςκ Αα είκαζ πνμηζιυηενμ κα επζηεοπεεί πνζκ ηδκ ζοζζςιάηςζδ ηςκ Αα ζε ημλζηά μθζβμιενή ηαζ ζκίδζα ηαζ ιπμνεί κα επζηεοπεεί ιε πμθθμφξ ηνυπμοξ. Ακμζμεεναπεία Δκγοιζηή απμζημδυιδζδ απυ ιεηαθθμπνςηεάζεξ Αφλδζδ ημο clearance αολάκμκηαξ ηδ ιεηαθμνά ιέζς ημο ΑΔΦ, δζεβείνμκηαξ ημοξ LRP οπμδμπείξ ή ακαζηέθθμκηαξ ημοξ RAGE (ή P-gp) Πνυζθαηα, ακμζμθμβζηέξ πνμζεββίζεζξ έπμοκ οθμπμζδεεί βζα κα ιεζχζμοκ ηδκ νμή ηςκ Αα πνμξ ημ ηεκηνζηυ κεονζηυ ζφζηδια. Γφμ ααζζημί ιδπακζζιμί έπμοκ πνμηαεεί υηζ ζπεηίγμκηαζ βζα ηδκ ιείςζδ ηςκ αιοθμεζδχκ ζε transgenic πμκηίηζα ιε ορδθά επίπεδα anti-aα. Πνχηα ηα anti-aα ακηζζχιαηα ίζςξ δζαζπίζμοκ ημκ ΑΔΦ ηαζ κα δεζιεφμκηαζ ζε Αα πεπηίδζα ζημκ εβηέθαθμ, οπμηζκχκηαξ ηδκ πέρδ απυ ηδκ εκενβμπμζδιέκδ ιζηνμβθμία. Δκαθθαηηζηά, ακηζζχιαηα ή πανάβμκηεξ ηα μπμία έπμοκ ο- 78

95 ρδθή ζοββέκεζα βζα ηα Αα πεπηίδζα (βαββθζμζίδζα ή gelsolin) ίζςξ δεζιεφμκηαζ ζηα Αα ηαζ απμιμκχκμοκ ηα Αα απυ ηδκ πενζθένεζα πνμηαθχκηαξ έηζζ εηνμή αοηχκ απυ ημκ εβηέθαθμ ή ακαζηέθθμοκ ηδκ εζζνμή ηςκ Αα ζημκ εβηέθαθμ (Matsuoka, Y., et al., 2003 ηαζ Solomon, B., 2007) Έκαξ άθθμξ ηνυπμξ βζα ηδκ αεθηίςζδ ηδξ εηηαεάνζζδξ ηςκ Αα απυ ημκ εβηέθαθμ είκαζ δ οπεννφειζζδ ηςκ εκγφιςκ απμζημδυιδζδξ ηςκ Αα πεπηζδίςκ, βζα πανάδεζβια δ δναζηδνζυηδηα ημο NEP ιπμνεί κα οπεννοειζζηεί ιε πμνήβδζδ ζςιαημζηαηίκδξ (Saito, Σ., et. αl., 2005). 79

96 ΚΟΠΟ ημπυξ ηδξ πανμφζαξ ενβαζίαξ είκαζ: Α) Ζ παναζηεοή, μ παναηηδνζζιυξ ηαζ δ ιεθέηδ πνυζθδρδξ ακμζμθζπμζςιάηςκ πμο θένμοκ πνμζδεδειέκμ ιδ μιμζμπμθζηά, ζηδκ επζθάκεζα ημοξ ημ ακηίζςια ΟΥ-26, απυ ηδκ ηοηηανζηή ζεζνά hcmec/d3. Β) Ζ παναζηεοή θζπμζςιάηςκ ιε εβηθςαζζιέκδ ημονημοιίκδ ηαζ δ ιεθέηδ ηδξ επίδναζήξ ημοξ ζηδκ πμνεία ζπδιαηζζιμφ μθζβμιενχκ ηαζ ζκζδίςκ απυ ηα πεπηίδζα Αbeta ηαεχξ ηαζ δ παναζηεοή anti-abeta ακμζμθζπμζςιάηςκ ηαζ δ ιεθέηδ ηδξ ζοββέκεζα πνυζδεζδξ αοηχκ ζε Αα ζκζδζηέξ ιμνθέξ αθθά ηαζ ζε ιμκμιενή. Δίκαζ βκςζηυ υηζ ημ ιμκμηθςκζηυ ακηίζςια ΟΥ-26, έπεζ ηδκ ζηακυηδηα κα δεζιεφεηαζ ζημκ οπμδμπέα ηδξ ηνακζθεννίκδξ βζα αοηυ ημκ θυβμ επζθέπεδηε αοηυ ημ ακηίζςια βζα ζηυπεοζδ ζηα ακενχπζκα εκδμεδθζαηά αζιαημεβηεθαθζηά ηφηηανα. Σα ηφηηανα ημο αζιαημεβηεθαθζημφ θναβιμφ οπενεηθνάγμοκ ημκ οπμδμπέα ηδξ ηνακζθεννίκδξ ηαζ αοηυ ζοιααίκεζ θυβς ηδξ αολδιέκδξ ακάβηδξ ημο εβηεθάθμο βζα ζίδδνμ. Οζ εέζεζξ υιςξ πνυζδεζδξ ηδξ ηνακζθεννίκδξ ζημκ οπμδμπέα είκαζ δζαθμνεηζηέξ απυ ηζξ εέζεζξ πνυζδεζδξ ημο ακηζζχιαημξ ΟΥ-26 ζοκεπχξ δεκ επδνεάγεηαζ απυ ηδκ πανμοζία ηδξ. ημπυξ ήηακ κα ιεθεηήζμοιε ηδκ πνυζθδρδ ηςκ θζπμζςιάηςκ απυ ηα ηφηηανα, ζημπεφμκηαξ ζημοξ οπμδμπείξ ηνακζθεννίκδξ ιε θζπμζχιαηα πμο θένμοκ πνμζδεδειέκμ ημ ΟΥ-26. Δηηυξ απυ ηα πμζμζηά πνυζθδρδξ εεθήζαιε κα ιεθεηήζμοιε ηαζ ημκ ιδπακζζιυ πνυζθδρδξ, ηαζ ημκ οπμηοηηανζηυ εκημπζζιυ ηςκ θζπμζςιάηςκ ιεηά ηδκ επχαζδ ιε ηα θζπμζχιαηα. Ανπζηυξ ζηυπμξ ήηακ δ παναζηεοή ηαζ μ παναηηδνζζιυξ ηςκ ακμζμθζπμζςιάηςκ ιε ηδκ ιέεμδμ ζηνεπηααζδίκδξ/αζμηίκδξ. Οζ ζοκεήηεξ παναζηεοήξ ημοξ, ηαεχξ ηαζ μ ηαεανζζιυξ ημοξ ήηακ ζδιεία πμο έπνζγακ πνμζμπήξ ηαεχξ έπνεπε κα απμθεοπεεί δ πζεακυηδηα ζοζζςιάηςζδξ ημοξ πανμοζία ζηνεπηααζδίκδξ. Ο παναηηδνζζιυξ ημοξ υζμκ αθμνά ζημ πμζμζηυ δέζιεοζδξ ημο ακηζζχιαημξ ηαεχξ ηαζ ημ ηεθζηυ ημοξ ιέβεεμξ ήηακ ημ επυιεκμ αήια. ημ δεφηενμ ιένμξ ηδξ ενβαζίαξ ζημπυξ είκαζ δ ιεθέηδ ηδξ πμνείαξ ζοζζςιάηςζδξ ηςκ πεπηζδίςκ Αα 1-40 ηαζ 1-42 πανμοζία θζπμζςιάηςκ ιε ημονημοιίκδ. Δίκαζ βκςζηυ υηζ δ ημονημοιίκδ έπεζ ηδκ ζηακυηδηα κα ακαζηέθθεζ ηδκ ζοζζςιάηςζδ ηςκ πεπηζδίςκ Αbeta ηαεχξ ηαζ κα απμζζοζςιαηχκεζ ιεβαθφηενεξ δμιέξ ηςκ πεπηζδίςκ. Θεθήζαιε κα ιεθεηήζμοιε ακ δ ημονημοιίκδ εβηθςαζζιέκδ ζε θζπμζχιαηα δζαηδνεί αοηή ηδκ ζηακυηδηά ηδξ ή ακ ηδκ αεθηζχκεζ έκακηζ ηςκ ζκζδίςκ ηςκ αιοθμεζδχκ. 80

97 ΠΕΙΡΑΜΑΣΙΚΟ ΜΕΡΟ 1.ΟΡΓΑΝΑ ΚΑΙ ΤΛΙΚΑ 1.1 ΟΡΓΑΝΑ ph-ιεηνμ (WTW, ph 522) Yδαηυθμοηνμ νοειζγυιεκδξ εενιμηναζίαξ (JULABO, FS 18) Δπςαζηζηυξ εάθαιμξ (Thermo Forma,Series II,Water Jacketed, CO2 Incubator, Hepa Filter, model 3121 Laminar flow hood (Astec Microflow,BIOQUELL Medical Limited Lynx Crescent) Αηίδα Τπενήπςκ (Probe Sonicator Sonics Vibra Cell) Οπηζηυ ιζηνμζηυπζμ (ZEIS Axiovert 40 CFL) Ζθεηηνμκζηυ ιζηνμζηυπζμ δζενπυιεκδξ δέζιδξ TEM (JEM-2100) Ζθεηηνμκζηυξ γοβυξ αηνζαείαξ (Mettler AE 166, Deltarange) Θενιαζκυιεκδ πθάηα (Labinco L32) Λμοηνυ Τπενήπςκ (Branson, Bransonic ultrasonic 2510), Μαβκδηζηυξ ακαδεοηήναξ (IKAMAG RH JANKE &KUNKEL) Μδπακζηυξ ακαδεοηήναξ vortex (A-100 Micrel) Πενζζηνεθυιεκμξ Eλαηιζζηήναξ Rotary Evaporator (BÜCHI RE 111) 81

98 Zeta-sizer δοκαιζηυξ ζηεδαζιυξ θςηυξ (Malvern Nano-Zs, Malvern Instrument, UK) Φανιαηεοηζηυξ γοβυξ (Hellamco Mettler Toledo) Φαζιαημθςηυιεηνμ, Spectrophotometer UV-VIS (Shimadzu UV mini 1240) Φεμνζζιυιεηνμ (Shimadzu, RF-5301 PC) Φοβυηεκηνμξ (Biofuge 28 RS,HERAEUS SEPATECH) Ωζιυιεηνμ (Roembling auto cal type 13 DR automatic) 1.2 ΤΛΙΚΑ Σ Κ Θ Ι Α Γ Θ Α Ζ Μ Ο Α Π Α Ρ Ι Δ Σ Ζ Κ Θ Ο Ξ Ρ Ω Λ Α Ω Μ Ι Α Θ Α Μ Ξ Ρ Ξ Κ Θ- Ο Ξ Ρ Ω Λ Α Ω Μ ΛΙΠΙΔΙΑ ΚΑΙ ΦΘΟΡΙΖΟΤΕ ΟΤΙΕ Φςζθαηζδοθμπμθίκδ (PC) Avanti Polar Lipids, 1,2-distearoyl-sn-glycerol-3-phosphatidylcholine (DSPC) Avanti Polar Lipids, 1,2-distearoyl-sn-glycerol-3-phosphoethanolamine-N- [methoxy(polyethyleneglycol)-2000] (DSPE -PEG 2000 Avanti Polar Lipids), 1,2- distearoyl-sn-glycerol-3-phosphoethanolamine-n-[biotinyl (polyethyleneglycol) ] (DSPE-PEG Biotin) Avanti Polar Lipids, Υμθδζηενυθδ Sigma Fluorescein-isothiocyanate-dextran-4000 (FITC-dextran), HPTS (Sigma) Κμονημοιίκδ απυ Curcuma longa (Turmeric) Sigma Σα θζπίδζα ηαζ δ πμθδζηενυθδ δζαθφμκηαζ ζε πθςνμθυνιζμ:ιεεακυθδ 2/1ηαη υβημ. Οζ θεμνίγμοζεξ πνςζηζηέξ FITC-Dextran ηαζ HPTS δζαθφμκηαζ ζε PBS πςνίξ πθςνζμφπμ κάηνζμ ζε ζοβηεκηνχζεζξ 45 ηαζ 70 mm, ακηίζημζπα, ηαζ ζηδκζοκέπεζα νοειίγεηαζ δ ςζιςηζηυηδηα ζηα 300 mosm ιε ηδκ πνμζεήηδ ηδξ απαζημφιεκδξ πμζυηδηαξ πθςνζμφπμο καηνίμο. 82

99 ΑΝΣΙΩΜΑΣΑ ΠΡΩΣΕΪΝΕ OX-26 ακηίζςια mouse anti-rat IgG2a CD71:Biotin (Serotec) Ακηίζςια rabbit anti-mouse ζογεοβιέκμ ιε κακμζςιαηίδζα πνοζμφ 10 nm Sigma Βζμηζκοθζςιέκμ ακηίζςια mouse IgG2a ανκδηζηυ control Serotec. ηνεπηααζδίκδ απυ Streptomyces avidinii, ακαζοκδοαζιέκδ, εηθναζιέκδ ζε Δ.coli θομθζθμπμζδιέκδ Sigma IgG απυ μνυ πμκηζημφ, θομθζθμπμζδιέκμ (Sigma) Ζ ζηνεπηααζδίκδ δζαθφεηαζ ζε Milli-Q κενυ ζε ζοβηέκηνςζδ 2mg/ml. Σμ θομθζθμπμζδιέκμ IgG δζαθφεηαζ ζε Milli-Q κενυ ηαζ ζηδ ζοκέπεζα αζμηοκζθζχκεηαζ ζφιθςκα ιε ημ πνςηυημθθμ αζμηζκοθίςζδξ ηδξ Pierce Γ Θ Α Ζ Μ Β Θ Ξ Θ Μ Σ Κ Θ Ω Ρ Ζ Ξ Σ Α Μ Θ Ρ Ω Λ Α Ξ Ρ EZ-link παηέημ αζμηζκοθίςζδξ (Pierce). Zeba ζηήθεξ αθαθάηςζδξ θοβμηέκηνδζδξ (Pierce) 2ml. Bradford microassay (Biorad) Ι Α Η Α Π Θ Ρ Λ Ξ Ρ Ω Μ Κ Θ Ο Ξ Ρ Ω Λ Α Ω Μ Sephadex G-50 Sepharose CL-4B (Sigma-Aldrich) Γ Θ Α Ζ Μ Ρ Σ Λ Ο Σ Ι Μ Ω Ρ Ζ Ω Μ Κ Θ Ο Ξ Ρ Ω Λ Θ Ι Ω Μ Δ Δ Θ Γ Λ Α Ω Μ ςθήκεξ ζοιπφηκςζδξ Amicon Ultra 15 (Millipore) 83

100 Α Ο Ξ Ρ Σ Ρ Ρ Ω Λ Α Ω Ρ Ζ Α Β Ο Δ Ο Θ Δ Θ Ω Μ Ι Α Θ H T Δ Κ Δ Γ Υ Ξ Ρ Abeta πεπηίδζα (Salmona M, Mario Negri Milan) Καεανυ ηνζθεμνμαηεηζηυ μλφ, TFA Γζαζεοθαζεέναξ Θεζμακζζυθδ (Sigma) Θεζμθθααίκδ T δζαθοιέκδ (Sigma) Ζ Κ Δ Ι Π Ξ Μ Θ Ι Ζ Λ Θ Ι Π Ξ Ρ Ι Ξ Ο Θ Α Δ Λ Formvar-coated carbon 300 mesh copper grids (Agar Scientific, Ltd) Μμθοαδεκζηυ αιιχκζμ (Sigma) E L I S A OPD o-phenylenediamine dihydrochloride (Sigma) Rabbit anti-mouse IgG ζδιαζιέκμ ιε peroxidase (Sigma) Θεζζηυ μλφ (Sigma) BSA (Bovine serum albumin) (Sigma) ηνεπηααζδίκδ (απυ S. avidinii STREP )(Sigma). Γζάθοια 1mg/ml ζε Milli-Q κενυ Γ Θ Α Ζ Μ Κ Σ Ρ Ζ Ω Μ Κ Θ Ο Ξ Ρ Ω Λ Α Ω Μ Σriton-X 100 (Sigma) ζε δζάθοια 10% ηαζ 20% w/v Π Σ Η Λ Θ Ρ Θ Ι Α Δ Θ Α Κ Σ Λ Α Α Tris-HCl: (50mΜ νοειζζηζηυ Tris HCl, ph 7.0 ηαζ 100mM νοειζζηζηυ Tris HCl, ph 7.0) 84

101 ε ηεθζηυ υβημ 100 ml απεζηαβιέκμ κενυ. 0,758 gr ή 1,516 gr ακηίζημζπα Tris (Tris [hydroxymethyl] aminomethane) 0,02gr NaN3 (Sodium Azide) 99% (SIGMA) Ρφειζζδ ημο ph ζημ 7 ιε οδνμπθςνζηυ μλφ. PBS. (Ηζυημκμ νοειζζηζηυ δζάθοια θςζθμνζηχκ) ε ηεθζηυ υβημ 2L απεζηαβιέκμ κενυ, δζεθφεδζακ ΝαΖ 2 PO4 (δζζυλζκμ θςζθμνζηυ κάηνζμ) 2,88 gr KH 2 PO4 (δζζυλζκμ θςζθμνζηυ ηάθζ) o,48 gr NαCl (πθςνζμφπμ κάηνζμ) (Merck) 16 gr KCl (πθςνζμφπμ ηάθζ) 0,4gr NaN 3 (καηναγίδζμ) 0,4 gr Ρφειζζδ ph ζημ 7.4 Σμ PBS βζα ηδκ παναζηεοή ηαζ ημκ ηαεανζζιυ ηςκ θζπμζςιάηςκ πμο επςάζηδηακ ιε ηφηηανα ηαεχξ ηαζ βζα ημ λέπθοια ηςκ ηοηηάνςκ δεκ πενζείπε καηναγίδζμ. Δ- πζπθέμκ ημ PBS βζα ηα ηφηηανα ήηακ απμζηεζνςιέκμ Α Μ Θ Δ Π Α Ρ Ζ Π Θ Α Μέηρεζε ιηπηδίοσ -Αληηδραζηήρηο Stewart ε ηεθζηυ υβημ 1L απεζηαβιέκμ κενυ g FeCl 3 6 H 2 O (Iron (III) chloride hexahydrate) Merck 30.4 g NH 4 SCN (Ammonium thiocyanate) (Merck) Σμ δζάθοια είκαζ ζηαεενυ ζε εενιμηναζία δςιαηίμο βζα ανηεημφξ ιήκεξ. Πνέπεζ κα θοθάζζεηαζ ζε ζηζενυ ιένμξ. 85

102 1.3 ΓΙΑ ΣΗΝ ΚΑΛΛΙΕΡΓΕΙΑ ΣΗ hcmec/d3 ΚΤΣΣΑΡΙΚΗ ΕΙΡΑ Κμθθαβυκμ ηφπμο-η 100ιg/ml βζα ηδκ πνμζηυθθδζδ ζηζξ θθάζηεξ πνζκ ηδκ πνμζεήηδ ηοηηάνςκ. Σνορίκδ/EDTA (Gibco) ΜΣΣ( 3-(4,5-Dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide) Sigma Ο Κ Ζ Π Δ Ρ Η Π Δ Ο Θ Ι Ξ Λ Δ Ρ Ξ EBM-2 ενεπηζηυ (Lonza) 500ml FBS (Fetal Bovine Serum) 5% 25ml Πεκζηζθθίκδ-ηνεπημιοηίκδ 1% 5ml Τδνμημνηζγυκδ (Sigma) 1,4 ιμ 250ιl Αζημναζηυ μλφ 5 ιg/ml 2,5 ml Chemically defined lipid concentration 1/100 5ml Hepes 10mM 5ml bfgf 1ng/ml 2,5ml Η Π Δ Ο Θ Ι Ξ Γ Θ Α Α Ο Ξ Η Ζ Ι Δ Σ Ρ Ζ Ι Σ Α Π Ω Μ. 95% FBS 5% DMSO 86

103 2 ΜΕΘΟΔΟΙ 2.1 ΦΡΨΜΑΣΟΜΕΣΡΙΚΕ ΜΕΘΟΔΟΙ ΠΡΟΔΙΟΡΙΜΟΤ ΛΙΠΙΔΙΟΤ ΚΑΙ ΠΡΨΣΕЇΝΗ Ο Π Ξ Ρ Δ Θ Ξ Π Θ Ρ Λ Ξ Ρ Κ Θ Ο Θ Δ Θ Ξ Σ - Λ Δ Η Ξ Δ Ξ Ρ S T E W A R T H ιέεμδμs Stewart (Anal.Biochem, 1980) πνδζζιμπμζείηαζ πνμηεζιέκμο κα πνμζδζμνζζηεί δ αηνζαήξ ζοβηέκηνςζδ ημο θζπζδίμο ζηα θζπμζςιζηά δείβιαηα. Ζ ιέεμδμξ αοηή ααζίγεηαζ ζηδκ ζηακυηδηα ηςκ θςζθμθζπζδίςκ κα ζπδιαηίγμοκ ζφιπθμημ ιε ημ ζζδδνμεεζμηοακζμφπμ αιιχκζμ ζε μνβακζηυ δζάθοια. Σμ πθεμκέηηδια αοηήξ ηδξ ιεευδμο είκαζ υηζ δ πανμοζία ακυνβακμο θςζθυνμο δεκ πανειπμδίγεζ ηδκ ακάθοζδ. Ζ ζοζπέηζζδ ηςκ ηζιχκ απμννυθδζδξ ιε ηα ιg ημο θςζθμθζπζδίμο πναβιαημπμζείηαζ ιε εφημθμ ηνυπμ. Πνμεημζιαζία ηςκ πνυηοπςκ δζαθοιάηςκ ηαζ ηςκ δεζβιάηςκ: Παναζηεοάγμοιε 10 ml δζαθφιαημξ θςζθμθζπζδίμο PC (απυ δ/ια ανπζηήξ ζοβηέκηνςζδξ 20mg/mL) ζε πθςνμθυνιζμ ζε ζοβηέκηνςζδ 0.1 mg/ml. Δημζιάγμοιε ηα πνυηοπα δζαθφιαηα ζε δμηζιαζηζημφξ ζςθήκεξ ηςκ 10mL υπςξ θαίκεηαζ ζημκ πίκαηα 4. Πίλαθαο 4. Πξόηππα δηαιύκαηα γηα παξαζθεπή πξόηππεο θακπύιεο γηα πξνδηνξηζκό ιηπηδίνπ κε ηε κέζνδν Stewart. Δείγκα Ποζόηεηα ιηπηδίοσ (κg) Πρόησπο δηάισκα ιηπηδίοσ (ml) Χιωροθόρκηο (ml) ηδεροζεηοθσαληούτο 0.1 Μ (ml) ,3 17 2, ,8 1,2 2,

104 Ακαηζκμφιε ζζπονά ηα δείβιαηα ιε vortex επί 1min ηαζ ηα αθήκμοιε επχαζδ βζα 10 θεπηά Αθαζνμφιε πνμζεηηζηά ηδκ οπενηείιεκδ οδαηζηή θάζδ ιε ηδ αμήεεζα ακηθίαξ ηεκμφ ηαζ ιεηνάιε μπηζηή απμννυθδζδ ημο θζπζδίμο ζηα 485nm. Δηάγξακκα 1. Πξόηππε θακπύιε Stewart. Γζα ηδκ ιέηνδζδ ηδξ μπηζηήξ απμννυθδζδξ i. Ροειίγμοιε ημ ιήημξ ηφιαημξ ημο UV/Vis θςημιέηνμο ζηα 485 nm ii. Μδδεκίγμοιε ιε πθςνμθυνιζμ (ηοθθυ) iζζ. Μεηνάιε ηα δείβιαηα λεηζκχκηαξ απυ ημ αναζυηενμ ζημ ποηκυηενμ v. Βάζεζ ηδξ ηαιπφθδξ ακαθμνάξ πμο πνμηφπηεζ, οπμθμβίγεηαζ δ πμζυηδηα (ιg) ηαζ ηεθζηχξ δ ζοβηέκηνςζδ ημο θζπζδίμο (mg/ml) ζημ δείβια ενβαζίαξ. Γζα ηδκ ιέηνδζδ ηδξ θζπζδζηήξ ζοβηέκηνςζδξ ηςκ δεζβιάηςκ ζε 2mL CHCl πνμζηίεεκηαζ 20 ιl εκαζςνήιαημξ θζπμζςιάηςκ ηαζ 2 ml ακηζδναζηδνίμο Stewart. 3 ηακ ημ δείβια είκαζ ποηκυ (πάκς απυ 2mg/ml) ηυηε βίκεηαζμ πνχηα αναίςζδ ημο δείβιαημξ. Με ημκ ίδζμ ηνυπμ υπςξ παναπάκς ιεηνάιε ηδκ μπηζηή ποηκυηδηα. 88

105 B R A D F O R D Λ Δ Η Ξ Δ Ξ Ρ Ο Π Ξ Ρ Δ Θ Ξ Π Θ Ρ Λ Ξ Σ Ο Π Ω Δ Χ Μ Ω Μ. Ζ ανπή ηδξ ιεευδμο ζηδνίγεηαζ ζηδκ ζδζυηδηα ηδξ πνςζηζηήξ Coomassie Brilliant Blue (CBB) G-250 κα δεζιεφεηαζ ζηα ιυνζα ηςκ πνςηεσκχκ. Ζ πνςζηζηή αοηή, υηακ ανίζηεηαζ ζε εθεφεενδ ηαηάζηαζδ ηαζ ζε υλζκμ πενζαάθθμκ, απμννμθά ζηα 465nm ηαζ ημ πνχια ηδξ είκαζ ηαζηακυ. Ζ δδιζμονβία ημο ζοιπθυημο πνςηεΐκδξ-πνςζηζηήξ, έπεζ ςξ απμηέθεζια ηδκ ειθάκζζδ ηοακμφ πνχιαημξ ηαζ ηδ ιεηααμθή ημο ιέβζζημο απμννυθδζδξ ζηα 595nm, υπμο ηαζ ιεηνάηαζ θςημιεηνζηά. Καηά ημ ζπδιαηζζιυ ημο ζοιπθυημο δφμ ηφπμζ αθθδθεπζδνάζεςκ θαιαάκμοκ πχνα: δ ηυηηζκδ ιμνθή ηδξ πνςζηζηήξ δςνίγεζ ημ εθεφεενμ δθεηηνυκζμ ζηζξ ζμκζζιέκεξ μιάδεξ ηςκ πνςηεσκχκ ιε απμηέθεζια ηδκ δζαηάναλδ ηδξ ανπζηήξ ηαηάζηαζδξ ηδξ πνςηείκδξ ηαζ ηδκ έηεεζδ ηςκ οδνυθμαςκ πενζμπχκ. Αοηέξ μζ πενζμπέξ ζηδκ ηεηανημηαβή δμιή ηδξ πνςηείκδξ δεζιεφμκηαζ ιδ μιμζμπμθζηά ζηζξ ιδ πμθζηέξ πενζμπέξ ηδξ πνςζηζηήξ ιέζς van der Waals δοκάιεςκ, εέημκηαξ ηζξ εεηζηέξ αιζκμιάδεξ ζε εββφηδηα ιε ημ ανκδηζηυ θμνηίμ ηδξ πνςζηζηήξ. Αοηυξ μ δεζιυξ ζζπονμπμζείηαζ πεναζηένς ιε ζμκζηέξ αθθδθεπζδνάζεζξ ιεηαλφ ημοξ Πρόησπε αιβοσκίλες (BSA) Απυ ανπζηυ δζάθοια BSA 1mg/ml παναζηεοάγμοιε ιε αναίςζδ δζάθοια 0,1 mg/ml. Παναζηεοάγμοιε ηα οπυθμζπα δζαθφιαηα υπςξ θαίκμκηαζ ζημκ πίκαηα 5. Πίνακασ 5. Πρότυπα διαλφματα για παραςκευι πρότυπθσ καμπφλθσ για τον προςδιοριςμό ςυγκζντρωςθσ πρωτείνθσ Γείβια Πμζυηδηα (ιg) Πνυηοπμ δζάθοια BSA PBS (ml) Bradford (ml) (ml) 1 1 0,01 0,790 0, ,02 0,780 0, ,05 0,750 0, ,1 0,700 0, ,2 0,600 0,2 Με ιέηνδζδ ηδξ μπηζηήξ απμννυθδζδξ ηαηαζηεοάζηδηε δ πνυηοπδ. Ωξ ηοθθυ πνδζζιμπμζήεδηε δζάθοια πμο πενζείπε 0,8ml PBS ηαζ 0,2 ml Bradford. 89

106 Διάγραμμα 2. Πρότυπθ καμπφλθ για τον προςδιοριςμό τθσ ςυγκζντρωςθσ πρωτείνθσ με τθ μζκοδο Stewart. 2.2 ΠΑΡΑΚΕΤΗ ΛΙΠΟΨΜΑΣΨΝ Ο Α Π Α Ρ Ι Δ Σ Ζ Ρ Δ Π Δ Ξ Υ Ζ Λ Θ Ι Α Ρ Α Η Δ Π Ξ Ο Ξ Θ Ζ Λ Δ Μ Ω Μ Α Μ Ξ Ρ Ξ- Κ Θ Ο Ξ Ρ Ω Λ Α Ω Μ Εικόνα 32.χθματικι αναπαράςταςθ ανοςολιποςωμάτων. 90

107 Γζα ηδκ παναζηεοή ηςκ ακμζμθζπμζςιάηςκ (εζηυκα 32) επζθέπεδηε ιζα ιέεμδμξ ηνζχκ αδιάηςκ. ε πνχημ ζηάδζμ παναζηεοάγμκηαζ SUV θζπμζχιαηα υπμο ζηδκ θζπμζςιζηή ιειανάκδ εκζςιαηχκεηαζ θζπίδζμ ιε PEG πμο θένεζ ζημ άηνμ ηδξ αζμηίκδ DSPE-PEG2000Biotin. ηδκ ζοκέπεζα βίκεηαζ επχαζδ ζε πενίζζεζα ζηνεπηααζδίκδξ ηαζ ζηδκ ζοκέπεζα αθαζνείηαζ δ εθεφεενδ ζηνεπηααζδίκδ. ημ ηεθεοηαίμ αήια βίκεηαζ δ επχαζδ ιε ημ ακηίζςια πμο είκαζ αζμηζκοθζςιέκμ ΠΡΟΕΣΟΙΜΑΙΑ ΣΩΝ MLVS ΛΙΠΟΩΜΑΣΩΝ. Ανπζηά παναζηεοάγμκηαζ πμθοζημζααδζαηά θζπμζχιαηα (MLV) ιε ηδ ιέεμδμ ημο θεπημφ οιεκίμο (thin film method). ε ζθαζνζηή θζάθδ ηςκ 50 ml ή ηςκ 100 ml ιεηαθένμκηαζ μζ υβημζ ηςκ θζπζδίςκ ηαζ ηδξ πμθδζηενυθδξ. Οζ μνβακζημί δζαθφηεξ απμιαηνφκμκηαζ ιε ηδ πνήζδ πενζζηνεθυιεκμο ελαηιζζηήνα (rotary evaporator) εκχ δ εενιμηναζία ζημ οδαηυθμοηνμ νοειίγεηαζ ακάθμβα ιε ηδ εενιμηναζία ιεηάπηςζδξ ηςκ θζπζδίςκ. Μεηά ημ ζπδιαηζζιυ εκυξ θεπημφ οιεκίμο ζηα ημζπχιαηα ηδξ ζθαζνζηήξ θζάθδξ, δ πενίζζεζα μνβακζημφ δζαθφηδ απμιαηνφκεηαζ ιε ηδκ εθανιμβή νεφιαημξ αγχημο. Αημθμοεεί εκοδάηςζδ ημο οιεκίμο ιε δζάθοια PBS ή ιε ηδ θεμνίγμοζα μοζία FITC-Dextran ακάθμβα ιε ηδκ εθανιμβή ηςκ θζπμζςιάηςκ. Πνμηεζιέκμο κα α- πμημθθδεεί ημ οιέκζμ απυ ηα ημζπχιαηα ηδξ ζθαζνζηήξ θζάθδξ εθανιυγεηαζ ιδπακζηή ακάδεοζδ (vortex), θμοηνυ οπενήπςκ ηαεχξ ηαζ εένιακζδ πάκς απυ ηδ εενιμηναζία ιεηάπηςζδξ έηζζ χζηε κα θδθεεί ιζα εμθενή δζαζπμνά, ζηδκ μπμία οπάνπμοκ πμθοζημζααδζαηά θζπμζχιαηα ιεβάθμο ιεβέεμοξ. Ζ θζπζδζηή ζφζηαζδ ηςκ θζπμζςιάηςκ είπε ηζξ ελήξ ιμνζαηέξ ακαθμβίεξ (πίκαηαξ 6). Πίνακασ 6. Μοριακι αναλογία λιπιδικισ ςφςταςθσ DSPC/PC Chol DSPE- PEG2000Methoxy DSPE- PEG2000Biotin 2 1 0,08/0, /0,004/0,01/0,02 91

108 ΣΡΟΠΟΠΟΙΗ ΣΩΝ MLVS Ε SUVS Ζ ιείςζδ ημο ιεβέεμοξ ηδξ θζπμζςιζηήξ δζαζπμνάξ επζηοβπάκεηαζ ιε ηδ πνήζδ οπενήπςκ (probe sonicator) βζα 20 θεπηά. Μεηά αημθμοεεί θοβμηέκηνδζδ βζα 10 θεπηά ζηα rpm βζα ηδκ απμιάηνοκζδ ημο ηζηακίμο πμο απμημθθήεδηε θυβς ηνζαήξ απυ ηδκ αηίδα οπενήπςκ.σέθμξ ηα θζπμζχιαηα αθήκμκηαζ βζα annealing, βζα ιζα πενίπμο χνα ζε εενιμηναζία πάκς απυ ηδ εενιμηναζία ιεηάπηςζδξ ηςκ θζπζδίςκ, ιζα δζαδζηαζία ηαηά ηδκ μπμία ηαηημπμζμφκ αηέθεζεξ ηδξ ιειανάκδξ ημοξ. H απεθεοεένςζδ ημο πενζεπμιέκμο ημοξ ή δ ζφκηδλδ ηςκ θζπμζςιάηςκ ιπμνεί κα ζοιαεί ςξ απμηέθεζια εθαηηςιάηςκ ζηδκ δμιή ηδξ ιειανάκδξ πμο δδιζμονβμφκηαζ ηαηά ηδκ παναζηεοή ημοξ. Πανυηζ είκαζ ζφκδεεξ αοηά ηα εθαηηχιαηα ζηδκ ιειανάκδ κα οππανπμοκ ζε SUV θζπμζχιαηα υηακ παναζηεοάγμκηαζ ζε ζοκεήηεξ εενιμηναζίαξ ηάης απυ ηδ εενιμηναζία ιεηάπηςζδξ οπάνπμοκ εκδείλεζξ πμο επζαεααζχκμοκ ηδκ φπανλδ ηςκ αηεθεζχκ ζηδκ δμιή ηαζ ζε άθθμοξ ηφπμοξ θζπμζςιάηςκ αηυια ηαζ ζε ζοκεήηεξ πάκς απυ ηδκ εενιμηναζία ιεηάπηςζδξ. Σμ annealing ζοιαάθθεζ ζηδκ ε- λζζμννυπδζδ ηςκ δζαθμνχκ ζηδκ ποηκυηδηα ιεηαλφ ηςκ ακηίεεηςκ πθεονχκ ηδξ δζπθμζημζαάδαξ (εζςηενζηήξ ηαζ ελςηενζηήξ ζημζαάδαξ) ιέζς δζαιειανακζημφ flip-flop ΚΑΘΑΡΙΜΟ ΣΗ ΜΗ ΕΓΚΛΩΒΙΜΕΝΗ ΧΡΩΣΙΚΗ ηδκ πενίπηςζδ πμο δ εκοδάηςζδ ημο θεπημφ οιεκίμο έβζκε ιε δζάθοια θεμνίγμοζαξ μοζίαξ ηνίκεηαζ απαναίηδηδ δ απμιάηνοκζδ ηδξ ιδ εβηθςαζζιέκδξ ζηα θζπμζχιαηα πνςζηζηήξ. ε αοηή ηδκ πενίπηςζδ δ πνςζηζηή πμο πνδζζιμπμζήζαιε ή- ηακ ημ Fluorescein-isothiocyanate-dextran-4000 πμο έπεζ ζπεηζηά ιεβάθμ ιμνζαηυ αάνμξ βζα αοηυ ημκ θυβμ επζθέπεδηε ζηήθδ αβανυγδξ CL-4B βζα ημ δζαπςνζζιυ ηδξ εθεφεενδξ πνςζηζηήξ απυ ημ θζπμζςιζηυ ηθάζια. Ζ αβανυγδ είκαζ ιζα βέθδ ιε ζθαζνζηή δμιή αβανυγδξ πμο πνδζζιμπμζείηαζ ςξ οθζηυ θζθηνανίζιαημξ. Καζ είκαζ δζαεέζζιδ ειπμνζηά ζε 3 δζαθμνεηζηέξ ζοζηάζεζξ 2%, 4% ηαζ 6% πενζεπμιέκμο αβανυγδξ δδθαδή 2Β, 4Β ηαζ 6Β ακηίζημζπα. Οζ βέθεξ ζεθανυγδξ CL είκαζ cross-linked πανάβςβα ηδξ ζεθανυγδξ. Οζ CL ιμνθέξ ηζξ ζεθανυγδξ είκαζ πδιζηά ηαζ θοζζηά πζμ ζηαεενέξ ηαζ ακεεηηζηέξ απ υηζ δ ζεθανυγδ, πανέπμκηαξ ηδκ ίδζα πμζυηδηα επζθεηηζηυηδηαξ αθθά ιε ηαθφηενεξ ζδζυηδηαξ νμήξ. Ζ βέθδ αοηή ζπδιαηίγεζ έκα πμνχδεξ δίηηομ, ημ μπμίμ θεζημονβεί ςξ ιμνζαηυ ηυζηζκμ, επζηνέπμκηαξ ηδκ είζμδμ ζημ εζςηενζηυ ημο ιυκμ ηςκ ζυκηςκ ηαζ ιμνίςκ πμο έπμοκ ιέβεεμξ ιζηνυηενμ απυ ημ ιέβεεμξ ηςκ πυνςκ ημο. Οοζίεξ ιεβαθφηενμο ιεβέεμοξ, υπςξ ηα θζπμζχιαηα, απμηθείμκηαζ ηαζ εηθμφμκηαζ πνχηεξ ΠΡΟΕΣΟΙΜΑΙΑ ΣΗ ΓΕΛΗ 92

109 Ζ αβανυγδ πανέπεηαζ ήδδ δζμβηςιέκδ ζε δζάθοια πμο πενζέπεζ 20% αζεακυθδ. Γζ αοηυ ημκ θυβμ πνέπεζ πνζκ ημ παηεηάνζζια κα πνμδβδεμφκ δζαδμπζηέξ πθφζεζξ ηαζ απαενχζεζξ ηδξ ζεθανυγδξ ιε νοειζζηζηυ δζάθοια ΠΑΚΕΣΑΡΙΜΑ ΓΕΛΗ ηδκ ζοκέπεζα δ βέθδ εηπφκεηαζ ζε ζηήθδ ηαζ αθήκεηαζ κα παηεηανζζηεί ιε ζοκεπή πανμπή νοειζζηζημφ. Πνμζμπή ζδζαίηενδ πνέπεζ κα δςεεί ζημκ ηνυπμ πθήνςζδξ εηζζ χζηε κα απμθεοπεεί δ εζζαβςβή θοζαθίδςκ αένα. Ζ ζηακυηδηα δζαπςνζζιμφ ελανηάηαζ ηαζ απυ ηζξ δζαζηάζεζξ ηδξ ζηήθδξ ηαζ βζ αοηυ ημ θυβμ επζθέβμκηαζ ζηήθεξ ιε δζαιεηνμ 1 cm ηαζ ορμξ 40cm. Αθμφ παηεηανζζηεί δ ζηήθδ πνέπεζ κα αημθμοεήζεζ ημνεζιυξ ιε θζπμζςιζηυ δείβια έηζζ χζηε κα ηαθοθεμφκ ηοπυκ ιζηνά ηεκά πμο οπάνπμοκ ΠΡΟΔΕΗ ΣΡΕΠΣΑΒΙΔΙΝΗ. Γζα ηδκ πνυζδεζδ ηδξ ζηνεπηααζδίκδξ βίκεηαζ επχαζδ ηςκ θζπμζςιάηςκ πμο θένμοκ θζπίδζμ, ιε αζμηίκδ ζοκδεδειέκδ ζημ άηνμ ηδξ PEG αθοζίδαξ. πανμοζία πενίζζεζαξ ζηνεπηααζδίκδξ. Δίκαζ απαναίηδημ δ ζηνεπηααζδίκδ κα οπάνπεζ ζε πενίζζεζα εηζζ χζηε κα απμθεφβεηαζ δ ζοζζςιάηςζδ ηςκ θζπμζςιάηςκ. Ζ ζηνεπηααζδίκδ θένεζ ηέζζενζξ εέζεζξ πνυζδεζδξ βζα ηδκ αζμηίκδ. Ακ έκα ιυνζμ ζηνεπηααζδίκδξ δεζιεοηεί ζε αζμηίκεξ δζαθμνεηζηχκ θζπμζςιάηςκ εα έπεζ ςξ απμηέθεζια ηδκ ζοζζςιάηςζδ ηςκ θζπμζςιάηςκ. Πανμοζία πενίζζεζαξ ζηνεπηααζδίκδξ εθαπζζημπμζείηαζ ημ πμζμζηυ ζοζζςιάηςζδξ. Θα ακαθενεμφιε ακαθοηζηυηενα ζηα απμηεθέζιαηα. Ζ επχαζδ βίκεηαζ βζα ιία ςνα ζημοξ 37 ºC οπυ ακάδεοζδ ηαζ ζηδκ ζοκέπεζα overnight ζημοξ 4 ºC ηαζ ζημ ph ηςκ δεζβιάηςκ (7,4) ΚΑΘΑΡΙΜΟ ΕΛΕΤΘΕΡΗ ΣΡΕΠΣΑΒΙΔΙΝΗ. Ζ εθέοεενδ ζηνεπηααζδίκδ απμιαηνφκεηαζ απυ ημ θζπμζςιζηυ δείβια ιε ηδ πνήζδ ζηήθδξ αβανυγδξ. Ο δζαπςνζζιυξ ηδξ απυ ηα θζπμζςιζηά ηθάζιαηα πζζημπμζήεδηε ιε ηδ πνήζδ ακηζδναζηδνίμο Stewart ιε ημ μπυζμ ιεηνάιε θζπζδζηή ζοβηέκηνςζδ ηαζ ημο Bradford ιε ημ μπμίμ ιεηνάιαζ πνςηεσκζηή ζοβηέκηνςζδ. ημ δζάβναιια παναηάης θαίκεηαζ ηαεανά μ δζαπςνζζιυξ ημοξ ζε δζαθμνεηζηά ηθάζιαηα. 93

110 Διάγραμμα 3. Διαχωριςμόσ λιποςωμάτων από ελεφκερθ ςτρεπταβίνθ με χρωματογραφία μοριακοφ αποκλειςμοφ ςε ςτιλθ ςεφαρόηθσ 4Β-CL ΒΙΟΣΙΝΤΛΙΩΗ ΑΝΣΙΩΜΑΣΟ Σμ N-Hydroxysuccinimide (NHS) εζηέναξ ηδ αζμηίκδξ είκαζ ημ πζμ βκςζηυ ακηζδναζηήνζμ αζμηζκοθίςζδξ (εζηυκα 33). Ακηζδνά ιε πνςημηαβείξ αιίκμιάδεξ ζε ph ιεηαλφ 7 ηαζ 9 πνμξ ζπδιαηζζιυ αιζδζηχκ δεζιχκ. Οζ πνςηεΐκεξ ζοιπενζθαιαακμιέκςκ ηαζ ηςκ ακηζζςιάηςκ έπμοκ ανηεηέξ αιζκμιάδεξ ζηζξ πθεονζηέξ μιάδεξ ηδξ θοζίκδξ ηαζ ζημ Ν ηεθζηυ άηνμ ηάεε πμθοπεπηζδίμο πμο είκαζ δζαεέζζια ςξ ζηυπμζ βζα πνυζδεζδ ημο εκενβμπμζδιέκμο ΝΖS-αζμηίκδ ακηζδναζηδνίμο (εζηυκα 34). Εικόνα 33. Δομι του αντιδραςτθρίου Sulfo-NHS-LC-Biotin. 94

111 Εικόνα 34. Αντίδραςθ βιοτινυλίωςθσ πρωτεϊνϊν. Σμ Sulfo-NHS-LC-Biotin είκαζ οδαημδζαθοηυ ηαζ δζεοημθφκεζ ηδκ δζελαβςβή ηδξ ακηίδναζδξ ζε ιδ μνβακζημφξ δζαθφηεξ 1. Γζάθοζδ ημο Sulfo-NHS-LC-Biotin (1 mg ακά θοαθίδζμ) ζε 180 ιl απεζηαβιέκμο κενμφ (ηεθζηή ζοβηέκηνςζδ 10 mm), 2. Τπμθμβζζιυξ ηςκ mmoles ημο ακηζδναζηδνίμο αζμηζκοθίςζδξ πμο πνεζάγεηαζ βζα ηδκ ακηίδναζδ. Ο ηφπμξ βζα ημκ οπμθμβζζιυ δίκεηαζ παναηάης, Γζα πανάδεζβια βζα 2 ml ακηζζχιαημξ ζοβηέκηνςζδξ mg/ml 1 mmol IgG 2 ml IgG x mg/ ml x 160,000 mg IgG x 20 mmol Biot 1 mmol IgG = mmol Biotin With 10 mm concentration the volume of Biotin reagent is 8.7 μl 3. Πνμζεήηδ ημο οπμθμβζζιέκμο υβημο ακηζδναζηδνίμο ζημ ακηίζςια, 4. Δπχαζδ ηδξ ακηίδναζδξ βζα 2 χνεξ ζημκ πάβμ, 5. Απμιάηνοκζδ ηδξ πενίζζεζαξ ημο ακηζδναζηδνίμο αζμηζκοθίςζδξ.- Καεανζζιυξ ημο πνμζυκημξ ιε Zeta desalt ζηήθεξ θοβμηέκηνδζδξ. Οζ ζηήθεξ 95

112 πνμεημζιάγμκηαζ ιε ιζα ανπζηή θοβμηέκηνδζδ βζα απμιάηνοκζδ ημο νοειζζηζημφ πμο έπμοκ ηαζ ζηδκ ζοκέπεζα θμνηχκεηαζ ημ δείβια βζα ημ ηαεανζζιυ ηδξ ιδ πνμζδεδειέκδξ ζημ ακηίζςια αζμηίκδξ. Ζ θοβμηέκηνδζδ βίκεηαζ βζα 2 min ζηζξ 4000 rpm ΠΡΟΔΕΗ ΑΝΣΙΩΜΑΣΟ Γζα ηδκ πνυζδεζδ ημο ακηζζχιαημξ αημθμοεεί επχαζδ ηςκ δεζβιάηςκ ιε ηδκ ηαηάθθδθδ πμζυηδηα ακηζζχιαημξ. ημοξ οπμθμβζζιμφξ θαιαάκεηαζ οπυρδκ, βζα θυβμοξ ηονίςξ μζημκμιζημφξ, υηζ δ ιζζή πυζυηδηα πενίπμο ημο θζπζδίμο πμο θένεζ πνμζδεδειέκδ ηδ αζμηίκδ ανίζηεηαζ ζηδκ ελςηενζηή ζηζαάδα ηςκ θζπμζςιάηςκ. Ζ επχαζδ βίκεηαζ ηαζ πάθζ βζα ιία χνα ζημοξ 37 ºC ηαζ overnight ζημοξ 4 ºC. Αημθμοεεί ηαεανζζιυξ ημο ιδ πνμζδεδειέκμο ακηζζχιαημξ ζε ζηήθδ ζεθανυγδξ CL-4B ηαζ πζζημπμίδζδ ημο δζαπςνζζιμφ υπςξ ηαζ ιε ηδκ ζηνεπηααζδίκδ. 1` Διάγραμμα 4. Κακαριςμόσ των λιποςωμάτων από το ελεφκερο βιοτινυλιωμζνο αντίςωμα ΠΡΟΔΙΟΡΙΜΟ ΣΟΤ ΜΗ ΠΡΟΔΕΔΕΜΕΝΟΤ ΑΝΣΙΩΜΑΣΟ ΜΕ ELISA Μεηά ημκ ηαεανζζιυ ημο θζπμζςιζημφ ηθάζιαημξ απυ ημ ακηίζςια πμο πζεακυκ κα ιδκ έπεζ πνμζδεεεί ιπμνεί κα βίκεζ πμζμηζηυξ πνμζδζμνζζιυξ ημο ιδ πνμζδεδειέκμο ακηζζχιαημξ ιε Elisa. Σα ηθάζιαηα υπμο ακαιέκεηαζ κα εηθμφεηαζ ημ ακηίζςια ζοθθέβμκηαζ ηαζ ζοιποηκχκμκηαζ ζε ηεθζηυ υβημ 1 ml. 96

113 Εικόνα 35. Απεικόνιςθ τθσ Σεχνικισ Elisa. ε πθάηα ηςκ 96 πδβαδζχκ βίκεηαζ επχαζδ ανπζηά ιε 0,1ml ζηνεπηααζδίκδξ ζοβηέκηνςζδξ 20β/ml (2β/πδβάδζ). Γίκεηαζ επχαζδ βζα 1 χνα ζημοξ 37 ºC ηαζ ζηδκ ζοκέπεζα αθήκεηαζ overnight ζημοξ 4 ºC. Αημθμοεμφκ 3 πθφζεζξ ιε PBS ηδκ ζοκέπεζα βίκεηαζ επχαζδ ιε BSA 2% βζα ηδκ ηάθορδ ηςκ ιδ εζδζηχκ εέζεςκ δέζιεοζδξ, βζα 1 χνα, ζημοξ 37 ºC. Αημθμοεμφκ 3 πθφζεζξ ιε PBS. Πνμζηίεεκηαζ δζάθμνμζ υβημζ ημο δείβιαημξ ζηα πδβάδζα ηαεχξ ηαζ ιζα ζεζνά δεζβιάηςκ πνμηφπςκ απυ 100 pg/πδβάδζ έςξ 1ιg/πδβάδζ. Γίκεηαζ επχαζδ βζα 1 έςξ 2 χνεξ. Αημθμοεμφκ 3 πθφζεζξ ιε PBS. Πνμζηίεεκηαζ 100 ιl ημο 2 μο ακηζζχιαημξ πμο θένεζ πνμζδεδειέκμ HRP (1:2000 ζε 1% BSA). Αημθμοεεί επχαζδ βζα 1 χνα ζημοξ 37 ºC ηαζ 2 πθφζεζξ ιε PBS ηαεςξ ηαζ ιζα ηεθζηή ιε δζάθοια ηζηνζηχκ. Πνμζηίεεκηαζ 100ιl δζαθφιαημξ OPD (10mg OPD, 5 ιl οπενμλείδζμ 30% ζε 5ml δζαθφιαημξ ηζηνζημφ μλέμξ) ηαζ επςάγεηαζ ζε ζημηεζκυ δςιάηζμ βζα 30 θεπηά. Γζα ημκ ηενιαηζζιυ ηδξ ακηίδναζδξ πνμζηζεεκηαζ 100ιl εεζζημφ μλέμξ 2Μ. ηδκ ζοκέπεζα ιεηνάιε ηδκ απμννυθδζδ ζηα 492nm. Γζα ημκ οπμθμβζζιυ ηδξ ζοβηέκηνςζδξ άβκςζηςκ δεζβιάηςκ έπεζ ηαηαζηεοαζηεί ιζα πνυηοπδ ηαιπφθδ θμβανζειζηή. 97

114 Διαγραμμα 5. Πρότυπθ για το βιοτυνιλιωμζνο αντίςωμα ΟΧ Ο Α Π Α Ρ Ι Δ Σ Ζ Κ Θ Ο Ξ Ρ Ω Λ Α Ω Μ Λ Δ Δ Γ Ι Κ Ω Β Θ Ρ Λ Δ Μ Ζ Ι Ξ Σ Π Ι Ξ Σ- Λ Θ Μ Ζ Ζ παναζηεοή ηςκ θζπμζςιάηςκ ιε εβηθςαζζιέκδ ημονημοιίκδ ζηδκ θζπζδζηή δζπθμζηζαάδα έβζκε ζφιθςκα ιε ηδ ιέεμδμ θεπημφ οιεκίμο πμο πενζβνάραιε παναπάκς. Ζ ζφζηαζδ είκαζ δ αηυθμοεδ (πίκαηαξ 7): DPPC Cholesterol Curcumin 98

115 Εικόνα 36. χθματικι αναπαράςταςθ του λιπιδίου DPPC τθσ χολθςτερόλθσ και τθσ κουρκουμίνθσ Πίνακασ 7. Μοριακι αναλογία λιποςωμικισ ςφςταςθσ φζηαζδ DPPC Cholesterol Curcumin Μμνζαηή Ακαθμβία 2 1 0,185 Μεηά ηδκ παναζηεοή ηςκ θζπμζςιάηςκ ιε ηδ ιέεμδμ ημο θεπημφ οιεκίμο ηαζ ηδκ εκοδάηςζδ ημο οιεκίμο ιε PBS (υπςξ πενζβνάθδηε παναπάκς), αημθμοεεί extrusion ηςκ δεζβιάηςκ ανπζηά ιε ιειανάκεξ ιεβέεμοξ 400 nm ηαζ ζηδκ ζοκέπεζα απυ ιειανάκδ 100nm. Αημθμοεεί θοβμηέκηνδζδ ηςκ δεζβιάηςκ βζα απμιάηνοκζδ ηδξ ιδ εβηθςαζζιέκδξ ζηδκ θζπζδζηή ζηζαάδα ημονημοιίκδξ. Γζα ημκ πνμζδζμνζζιυ ηδξ πμζυηδηαξ ηδξ εβηθςαζζιέκδξ ημονημοιίκδξ ηαηαζηεοάζηδηε πνυηοπδ ηαιπφθδ. Ανπζηά παναζηεοάζηδηε δζάθοια ημονημοιίκδξ ζε ιεεακυθδ 10 ιg/ml ηαζ ζηδκ ζοκέπεζα παναζηεοάζηδηακ ιε αναζχζεζξ δζαθφιαηα απυ 0,1ιg/ml έςξ 5ιg/ml. Μεηνήεδηε δ απμννυθδζδ ηςκ δεζβιάηςκ ζηα 420nm ηαζ ηαηαζηεοάζηδηε δ παναηάης πνυηοπδ ηαιπφθδ. Διάγραμμα 6. Πρότυπθ καμπφλθ κουρκουμίνθσ ςε μεκανόλθ 2.3. ΥΤΙΚΟΦΗΜΙΚΟ ΦΑΡΑΚΣΗΡΙΜΟ ΣΨΝ ΛΙΠΟΨΜΑΣΨΝ Λ Δ Π Ζ Ρ Ζ Λ Δ Γ Δ Η Ξ Σ Ρ Ι Α Θ Ε Δ Α Δ Σ Μ Α Λ Θ Ι Ξ Σ Γζα ημκ οπμθμβζζιυ ηδξ ηαηακμιήξ ημο ιεβέεμοξ ηα εκαζςνήιαηα ηςκ θζπμζςιάηςκ ζε PBS αναζχκμκηαζ ζε ζοβηέκηνςζδ θζπζδίμο 0,4 mg/ml ηαζ ιεηνμφκηαζ 99

116 ιε DLS (Malvern Nano-Zs, Malvern Instrument, UK) ζημοξ 25 0 C ζε βςκία 173 o. Σμ zetasizer πνμζδζμνίγεζ ημ ιέβεεμξ ιεηνχκηαξ ηδκ ηίκδζδ brown ηςκ ζςιαηζδίςκ ζημ δείβια. Ωξ ηίκδζδ brown μνίγεηαζ δ ηοπαία ηίκδζδ ηςκ ζςιαηζδίςκ ζε έκα οβνυ ελαζηίαξ ηςκ ζοβηνμφζεςκ ιε ηα ιυνζα πμο ηα πενζααάθμοκ. Ζ ηεπκζηή ιέηνδζδξ ζημ Nano-Sizer είκαζ δ NIBS (Non-Invasive Backscatter) δ μπμία επεηηείκεζ ημ εφνμξ ηςκ ιεβεεχκ ηαζ ηςκ ζοβηεκηνχζεςκ πμο ιπμνμφκ κα ιεηνδεμφκ.ζ δοκαηυηδηα ημο Zetasizer Nano S ηαζ ημο Nano ZS instruments κα δζαηνζκμοκ ηζξ πθδνμθμνίεξ ζηάδαζδξ ζε βςκία 173 μκμιάγεηαζ backscatter ακίπκεοζδ. Δπζπθέμκ ημ μπηζηυ ζφζηδια δεκ είκαζ ζε επαθή ιε ημ δείβια βζ αοηυ ηαζ παναηηδνίγεηαζ ςξ non-invasive. Τπάνπμοκ πμθθά πθεμκεηηήιαηα ηδξ πνήζδξ ηδξ ηεπκζηήξ NIBS.Ζ εοαζζεδζία ηδξ ιεευδμο είκαζ αεθηζςιέκδ. Ο υβημξ ημο δείβιαημξ πμο επελενβάγεηαζ απυ ημ ζφζηδια είκαζ πενίπμο δέηα θμνέξ ιεβαθφηενμξ απυ ηςκ ημζκχκ 90 ιμζνχκ. ε ζοκδοαζιυ ιε ηδκ ζηακυηδηα ζοθθμβήξ δεδμιέκςκ απυ ημ NIBS μπηζηυ ζφζηδια, δ εοαζζεδζία αολάκεηαζ ηαηά δφμ ηάλεζξ ιεβέεμοξ επζηνέπμκηαξ ηδκ ιέηνδζδ ημο ιεβέεμοξ αναζςιέκςκ δζαθοιάηςκ ηαζ δζαζπμνχκ ζςιαηζδίςκ ιε ιεβεεμξ ιζηνυηενμ ηαζ απυ κακυιεηνμ. Έκα εονφ θάζια ζοβηεκηνχζεςκ δεζβιάηςκ ιπμνεί κα ιεηνδεεί. Ζ αηηίκα laser δεκ πνεζάγεηαζ κα πενάζεζ ιέζα απυ υθμ ημ δείβια. Μεηνχκηαξ ηα ζςιαηίδζα πμο ανίζημκηαζ ημκηά ζημ ημίπςια ηδ ζηορεθίδαξ, ημ θςξ πενκά ιε ιζηνυηενμ ιδημξ ζημ δείβια, ιεζχκμκηαξ ή ελαθείθμκηαξ ημ θαζκυιεκμ ηδξ πμθθαπθήξ ζηεδαζδξ υπμο δ αηηζκα ημο θςηυξ απυ έκα ζςιαηίδζμ ζηεδάγεηαζ ηαζ απυ άθθα ζςιαηίδζα. Αοηυ ηάκεζ δοκαηή ηδκ ιέηνδζδ ηαζ πζμ ποηκχκ δεζβιάηςκ. Ζ πνμεημζιαζία ηςκ δεζβιάηςκ είκαζ απθμφζηενδ.ζ επίδναζδ ηδξ ζηυκδξ είκαζ αζζεδηά ιεζςιέκδ ηαεχξ δ ζηυκδ ζηεδάγεζ πενζζζυηενμ θςξ ζηδκ ακηίεεηδ ηαηεφεοκζδ Ζ εέζδ ιέηνδζδξ ιέζα ζηδκ ηορεθίδα ημο Nano ZS νοειίγεηαζ αοηυιαηα χζηε κα δζεοεεημφκηαζ μζ απαζηήζεζξ βζα ορδθή εοαζζεδζία ή βζα ορδθή ζοβηέκηνςζδ. Αοηή δ εέζδ αθθάγεζ ιε ηδκ ιεηαηίκδζδ ηςκ θαηχκ εζηίαζδξ. Εικόνα 37. κζδαςθ για μικρά a και μεγάλα b ςωματίδια. 100

117 Γζα ιζηνά ζςιαηίδζα ή βζα δείβιαηα παιδθήξ ζοβηέκηνςζδξ, είκαζ πνμηζιυηενμ κα ιεβζζημπμζείηαζ δ ζηέδαζδ απυ ημ δείβια. Καεχξ δ δέζιδ laser πενκά ιέζς ημο ημζπχιαημξ ηδξ ηορεθίδαξ, δ δζαθμνά ζημκ δείηηδ δζάεθαζδξ ιεηαλφ ημο αένα ηαζ ημο οθζημφ ηδξ ηορεθίδαξ πνμηαθεί θάιρδ. Αοηή δ θάιρδ ίζςξ αθθδθεπζδνά ιε ημ ζήια ζηέδαζδξ. Μεηαηζκυκηαξ ηδκ εέζδ ιέηνδζδξ ιαηνζά απυ ημ ημίπςια ηδξ ηορεθίδαξ πνμξ ημ ηέκηνμ ελαθέζθεηαζ αοηυ ημ θαζκυιεκμ (εζηυκα 36 α). Μεβάθα ζςιαηίδζα ή δείβιαηα ιε ορδθή ζοβηέκηνςζδ ζηεδάγμοκκ πενζζζυηενμ θςξ. Μεηνχκηαξ ημκηά ζημ ημίπςια ηδξ ηορεθίδαξ ιεζχκεζ ηδκ επίδναζδ ηδξ πμθθαπθήξ ζηέδαζδξ ιεζχκμκηαξ ημ ιήημξ ημ μπμίμ πνέπεζ κα δζακφζεζ ημ ζηεδαζιέκμ θςξ (εζηυκα 36 α). ηα ίδζα δείβιαηα ιεηνήεδηε ηαζ ημ γήηα δοκαιζηυ ιε ηδ πνήζδ εκυξ ζοκδοαζιμφ ηεπκζηχκ Δlectrophoresis ηαζ Laser Doppler Velocimetry. Αοηή δ ιέεμδμs ιεηνάεζ πυζμ βνήβμνα ηζκείηαζ έκα ζςιαηίδζμ ζε έκα οβνυ υηακ εθανιυγεηαζ δθεηηνζηυ πεδίμ.ηα πενζζζυηενα οβνά πενζέπμοκ ζυκηα ηα μπμία ιπμνεί κα είκαζ εεηζηά ή ανκδηζηά θμνηζζιέκα ηαζ ηαθθμφκηαζ ηαηζυκηα ή ακζυκηα ακηίζημζπα. ηακ έκα θμνηζζιέκμ ζςιαηίδζμ αζςνείηαζ ζε έκα ιέζμ, ζυκηα ημο ακηίεεημο θμνηίμο έθημκηαζ πνμξ ηδκ επζθάκεζα ημο ζςιαηζδίμο. Σα ζυκηα πμο είκαζ ημκηά ζηδκ επζθάκεζα ηςκ ζςιαηζδίςκ, εα πνμζδεεμφκ ζζπονά, εκχ ηα ζυκηα πμο ανίζημκηαζ πζμ ιαηνζά εα πνμζεθηοεμφκ αζεεκχξ ζπδιαηίγμκηαξ αοηυ πμο μκμιάγεηαζ ζηζαάδα δζάποζδξ. Μέζα ζηδκ ζηζαάδα δζάποζδξ οπάνπεζ έκα εεςνδηζηυ υνζμ ηαζ ηάεε ζυκ ιέζα ζε αοηυ ημ υνζμ εα ηζκδεεί ιαγί ιε ημ ζςιαηίδζμ, υηακ αοηυ ηζκείηζα ιέζα ζημ οβνυ, αθθά ηάεε άθμμ ζυκ έλς απυ ημ υνζμ εα ιείκεζ εηεί πμο ήηακ. Αοηυ μκμιάγεηαζ επίπεδμ μθίζεδζδξ. Έκα δοκαιζηυ οπάνπεζ ιεηαλφ ηδξ επζθάκεζαξ ημο ζςιαηζδίμο ηαζ ημο οβνμφ ημ μπμίμ πμζηίθεζ ακάθμβα ιε απυζηαζδ απυ ηδκ επζθάκεζα ημο ζςιαηζδίμο, αοηυ ημ δοκαιζηυ αηδκ ζηζαάδα μθίζεδζδξ μκμιάγεηαζ Ε-δοκαιζηυ Ζ Κ Δ Ι Π Ξ Μ Θ Ι Ζ Λ Θ Ι Π Ξ Ρ Ι Ξ Ο Θ Α Δ Θ Α Δ Ξ Ρ Ζ Ρ ( Δ Λ ) Ζ δθεηηνμκζηή ιζηνμζημπία δζάδμζδξ είκαζ ιζα ιζηνμζημπζηή ηεπκζηή υπμο ιζα αηηίκα δθεηηνμκίςκ δζαδίδεηαζ ιέζς εκυξ πμθφ θεπημφ δείβιαημξ, αθθδθεπζδνχκηαξ ιε αοηυ. Ζ εζηυκα ζπδιαηίγεηαζ απυ ηδκ αθθδθεπίδναζδ ηςκ δθεηηνμκίςκ πμο πενκμφκ ιέζα απυ ημ δείβια. ε ιζηνυηενεξ ιεβεεφκζεζξ δ ακηίεεζδ ζηζξ εζηυκεξ απυ ΣΔΜ μθείθεηαζ ζηδκ απμννυθδζδ ηςκ δθεηηνμκίςκ ζημ οθζηυ ελαζηίαξ ηδξ θεπηυηδηαξ ηαζ ηδξ ζφκεεζδξ ημο οθζημφ. ε ιεβαθφηενεξ ιεβεεφκζεζξ πμθφπθμηεξ αθθδθεπζδνάζεζξ ηοιάηςκ δζαιμνθχκμοκ ηδκ έκηαζδ ηδξ εζηυκαξ. Δκαθθαηηζημί ηνυπμζ πνήζδξ επζηνέπμοκ ηδκ παναηδνδζδ δζαιμνθχζεςκ ζηδκ πδιζηή ηαοηυηδηα, ζημκ ηνοζηαθθζηυ πνμζακαημθζζιυηαζ ζηδκ δθεηημκζαηή δμιή. 101

118 Σα θζπμζχιαηα ζοβηέκηνςζδξ 1-2mg/ml επςάγμκηαζ βζα 2 θεπηά ζε πθέβιαηα παθημφ επζηαθθοιέκα ιε άκεναηα (300 mesh). Mζα ιζηνή ζηαβυκα δείβιαημξ α- θήκεηαζ βζα επχαζδ ζε εενιμηναζία δςιαηίμο. ηδκ ζοκέπεζα αθαζνείηαζ δ ζηαβυκα ιε δζδεδηζηυ πανηί. Γίκεηαζ ανκδηζηή πνχζδ ηςκ θζπμζςιάηςκ ιε 5% ιμθοαδεκζηυ αιιχκζμ δζαθοιέκμ ζε κενυ βζα 2 θεπηά. ηδκ ζοκέπεζα αθαζνείηαζ ημ ιμθοαδεκζηυ αιιχκζμ ηαζ ημ πθέβια λεπθέκεηαζ 2 θμνέξ ιε PBS ηαζ ιζα θμνά ιε απεζηαβιέκμ κενυ εηζζ χζηε κα ιδκ ιείκμοκ άθαηα ζημ πθέβια πμο εα δδιζμονβήζμοκ ευνοαμ ζημ δείβια. Σα δείβιαηα αθήκμκηαζ κα ζηεβκχζμοκ βζα 5 θεπηά ηαζ παναηδνμφκαηζ ζηα 100 KeV ζε δθεηηνμκζηυ ιζηνμζηυπζμ δζάδμζδξ ε ιεθέηεξ πζζημπμίδζδξ ηδξ πνυζδεζδξ ακηζζςιάηςκ ζηδκ επζθάκεζα ηςκ ακμζμθζπμζςιάηςκ, ζημ πθέβια πμο έπμοκ πνμζημθθδεεί ήδδ ηα ακμζμθζπμζχιαηα, βίκεηαζ επχαζδ ιε δεφηενμ ακηίζςια anti-mouse πμο θένεζ κακμζςιαηίδζα πνοζμφ 10nm, βζα 30 θεπηά. To ιδ πνμζδεδειέκμ ακηίζςια απμιαηνφκεηαζ ιε δζαδμπζηέξ πθφζεζξ ιε PBS ηαζ ζηδκ ζοκέπεζα αημθμοεμφκ ηα ζηάδζα ανκδηζηήξ πνχζδξ υπςξ πενζβνάθδηακ παναπάκς Λ Δ Κ Δ Ζ Ζ Ρ I N V I T R O Ρ Α Η Δ Π Ξ Ζ Α Ρ Κ Θ Ο Ξ Ρ Ω Λ Α Ω Μ Καζαρηζκός ιηποζωκάηωλ από ηε κε εγθιωβηζκέλε τρωζηηθή HPTS Μεηά ηδκ παναζηεοή ηςκ δεζβιάηςκ (SUV) αημθμοεεί απμιάηνοκζδ ηδξ ιδ εβηθςαζζιέκδξ μοζίαξ ιε ηδ αμήεεζα πνςιαημβναθίαξ ιμνζαημφ απμηθεζζιμφ (1x35cm), δ μπμία πενζέπεζ βέθδ Sepharose 4B-CL. Ωξ εηθμφηδξ πνδζζιμπμζείηαζ ζ- ζυημκμ νοειζζηζηυ δζάθοια PBS, έηζζ χζηε ηα θζπμζχιαηα κα παναιέκμοκ ζηαεενά απυ μζιςηζηή άπμρδ. Ζ βέθδ αοηή ζπδιαηίγεζ έκα πμνχδεξ δίηηομ, ημ μπμίμ θεζημονβεί ςξ ιμνζαηυ ηυζηζκμ, επζηνέπμκηαξ ηδκ είζμδμ ζημ εζςηενζηυ ημο ιυκμ ηςκ ζυκηςκ ηαζ ιμνίςκ πμο έπμοκ ιέβεεμξ ιζηνυηενμ απυ ημ ιέβεεμξ ηςκ πυνςκ ημο. Οοζίεξ ιεβαθφηενμο ιεβέεμοξ, υπςξ ηα θζπμζχιαηα, απμηθείμκηαζ ηαζ εηθμφμκηαζ πνχηεξ. 102

119 Επώαζε ιηποζωκάηωλ Μεηά ηδ ζοθθμβή ηςκ θζπμζςιζηχκ ηθαζιάηςκ αημθμοεεί επχαζδ αοηχκ ζημ οδαηυθμοηνμ, ζημοξ 37 0 C οπυ ήπζα ακαηίκδζδ (40 rpm). Πζμ ζοβηεηνζιέκα 100ιl δείβιαημξ ιεηαθένμκηαζ ζε δμηζιαζηζηυ ζςθήκα ηαζ ακαιζβκφμκηαζ ιε 500ιl νοειζζηζημφ δζαθφιαημξ PBS ή δζαθφιαημξ FBS. Οζ δμηζιαζηζημί ζςθήκεξ ημπμεεημφκηαζ ζημ οδαηυθμοηνμ. Μέηρεζε ζσγθράηεζες HPTS Απυ 0 έςξ 24 χνεξ ηαζ ακά ηαηηά πνμκζηά δζαζηήιαηα (0, 2,4,6,8 ηαζ 24 χ- νεξ) θαιαάκμκηαζ δείβιαηα βζα ιέηνδζδ ηδξ έκηαζδξ θεμνζζιμφ. Πνχηα υιςξ απμιαηνφκεηαζ δ ιδ εβηθςαζζιέκδ ζηα θζπμζχιαηα θεμνίγμοζα μοζία ιε πνςιαημβναθία ζηήθδξ. ηδκ ζοκέπεζα οπμθμβίγεηαζ μ εβηθςαζζιυξ ςξ πμζθίημ ηςκ mol θζπζδίμο ςξ πνμξ ηα mol ηδξ θεμνίγμοζαξ. Eπεζδή ημ HPTS έπεζ ηδκ ζηακυηδηα κα θεμνίγεζ αηυια ηαζ ιέζα ζηα θζπμζχιαηα δεκ είκαζ απαναίηδηδ δ θφζδ ηςκ θζπμζςιάηςκ. Οζ ιεηνήζεζξ ηδξ έκηαζδξ θεμνζζιμφ (Fluorescence Intensity, FI) πναβιαημπμζμφκηαζ ζε θex=413nm ηαζ θem=512nm. 103

120 2.4. MΕΛΕΣΕ ΠΡΟΛΗΧΗ ΣΨΝ ΛΙΠΟΨΜΑΣΨΝ ΑΠΟ ΣΗΝ ΚΤΣΣΑΡΙΚΗ ΕΙΡΑ HCMEC/D K Α Κ Κ Θ Δ Π Γ Δ Θ Α Ι Α Θ Α Μ Α Ι Α Κ Κ Θ Δ Π Γ Δ Θ Α Ι Σ Α Π Ω Μ H C M E C / D 3 Σα ηφηηανα ηαθθζενβμφκηαζ ζε θθάζηεξ ηςκ 75 cm ιε πθήνεξ ενεπηζηυ ιέζμ EBM-2 ζημοξ 37 C, ζε αηιυζθαζνα 5% CO2 ηαζ 100% οβναζία. ηακ ηα ηφηηανα ηαηαθάαμοκ ημ 100% ηδξ επζθάκεζαξ πνμζηυθθδζδξ (confluency), ηυηε απμημθθχκηαζ εκγοιζηά απυ ηδ θθάζηα, αναζχκμκηαζ ιε οβνυ ενεπηζηυ ιέζμ ηαζ ακαηαθθζενβμφκηαζ ζε 3 ηαζκμφνζεξ θθάζηαξ. Ανπζηά βίκεηαζ παναηήνδζδ ηδξ θθάζηαξ ζημ ιζηνμζηυπζμ. Ζ εζηυκα ηςκ ηοηηάνςκ είκαζ εκδεζηηζηή ηδξ ηαηάζηαζήξ ημοξ. Σα ηφηηανα πμο είκαζ πνμζημθθδιέκα ζημκ ποειέκα ηδξ θθάζηαξ εεςνμφκηαζ οβζή. Αοηά ηα μπμία έπμοκ πζμ ζθαζνζηή ιμνθή ηαζ επζπθέμοκ ζημκ οβνυ ενεπηζηυ ιέζμ εεςνμφκηαζ κεηνά. Δηηυξ απυ ηδ εέζδ ηαζ ηδ ιμνθμθμβία ηςκ ηοηηάνςκ παναηδνείηαζ ηαζ δ ζοβηέκηνςζδ ημοξ απυ ηδκ μπμία ελανηάηαζ ημ ακ εα πναβιαημπμζδεεί δ ακαηαθθζένβεζα. Δθυζμκ ηδνμφκηαζ μζ πνμτπμεέζεζξ βζα ηαθθζένβεζα, δ θθάζηα ιεηαθένεηαζ ζε εάθαιμ κδιαηζηήξ νμήξ βζα κα επζηεοπεμφκ μζ ζηείνεξ ζοκεήηεξ βζα ηδκ πναβιαημπμίδζδ ηδξ δζαδζηαζίαξ. Αημθμοεεί ήπζμ λέπθοια ημο ποειέκα ηδξ θθάζηαξ δομ θμνέξ ιε PBS. Με ηδ δζαδζηαζία αοηή απμιαηνφκμκηαζ ηοπυκ εκαπμιέκμκηα ίπκδ μ- νμφ, ηα μπμία πενζέπμοκ ακαζημθείξ ηδξ ηνορίκδξ. Γζα ηδκ απμηυθθδζδ ηςκ ηοηηάνςκ πνμζηίεεηαζ δζάθοια ηνορίκδξ, ημ μπμίμ δζαζπά ημοξ δεζιμφξ ιεηαλφ ηςκ ηοηηάνςκ ηαζ ηδξ οπεφεοκδξ βζα ηδκ πνμζηυθθδζδ επζθάκεζαξ. Ζ παναιμκή ηςκ ηοηηάνςκ ζηδκ ηνορίκδ δεκ πνέπεζ κα βίκεηαζ βζα ιεβάθα πνμκζηά δζαζηήιαηα, έηζζ χζηε κα ιδ ιεζχκεηαζ δ αζςζζιυηδηα ηςκ ηοηηάνςκ. Ζ απμηυθθδζδ ηςκ ηοηηάνςκ παναηδνείηαζ ζημ ιζηνμζηυπζμ. Αιέζςξ ιυθζξ αοηή μθμηθδνςεεί, απμιαηνφκεηαζ δ ηνορίκδ ιε ηεκμ, ιε πνμζμπή βζα κα ιδκ πνμζνμθδεμφκ ηαζ ηφηηανα. Σα ίπκδ ηδξ ηνορίκδξ πμο παναιέκμοκ απεκενβμπμζμφκηαζ ιε ηδκ πνμζεήηδ ημο ενεπηζημφ ιέζμο. Σα ηφηηανα επακαζςνμφκηαζ ζε ηαζκμφνζμ ενεπηζηυ ιέζμ ιε ακαννμθήζεζξ ιε ζζθχκζ. Γζα ηδκ επακαηαθθζένβεζα μζ θθάζηεξ ζηζξ μπμίεξ ιεηαθένμκηαζ ηα ηφηηανα πνέπεζ κα έπμοκ πνμεπςαζηεί βζα ιία χνα ιε ημθθαβυκμ ηαζ ζηδκ ζοκέπεζα αθμφ α- πμιαηνοκεεί δ πενίζζεζα ημο ημθθαβυκμο, ιε λέπθοια ιε PBS, εζζάβεηαζ ηαζκμφνβζμ ενεπηζηυ ηαζ ημ εκαζχνδια ηςκ ηοηηάνςκ ιέπνζ ηεθζηυ υβημ 10ml. Ζ ποηκυηδηα ημο εκαζςνήιαημξ αηδκ θθαζηα ανπζηά είκαζ ηφηηανα/cm Ο Π Ξ Δ Ξ Θ Λ Α Ρ Θ Α Ι Σ Α Π Ω Μ Γ Θ Α Δ Ο Ω Α Ρ Ζ Λ Δ Κ Θ Ο Ξ Ρ Ω Λ Α Α. 104

121 ηα πεζνάιαηα ιεθέηδξ ηδξ πνυζθδρδξ ηςκ θζπμζςιάηςκ ηαζ ακμζμθζπμζςιάηςκ απυ ηα ηφηηανα, δ επχαζδ ηςκ ηοηηάνςκ βίκεηαζ ζε πθάηα ιε 6 πδβάδζα. Α- θμφ πνμεπςαζημοκ ιε ημθθαβυκμ ζημοξ 37 C, ζε αηιυζθαζνα 5% CO2 ηαζ 100% οβναζία βζα ιία χνα, ημ ιδ πνμζημθθδιέκμ ημθθαβυκμ λεπθέκεηαζ ιε PBS. ηδκ ζοκέπεζα επςάγμκηαζ ηα ηφηηανα, υπςξ παναπάκς, ιε ηδκ ίδζα ανπζηή ποηκυηδηα ηοηηάνςκ ακά ηεηναβςκζηυ εηαημζηυ, άθθα ζε ηεθζηυ υβημ ηνζχκ ml ενεπηζημφ. Σμ ενεπηζηυ ιέζμ ακηζηαείζηαηαζ κα 2 διένεξ ηαζ υηακ ηα ηφηηανα ηαθφρμοκ υθδ ηδκ επζθάκεζα ημο πδβαδζμφ είκαζ έημζια βζα εθανιμβή ηςκ θζπμζςιάηςκ Ο Δ Θ Π Α Λ Α Α Ο Π Ξ Ρ Κ Ζ Φ Ζ Ρ Κ Θ Ο Ξ Ρ Ω Λ Α- Ω Μ / Α Μ Ξ Ρ Ξ Κ Θ Ο Ξ Ρ Ω Λ Α Ω Μ Α Ο Ξ Ι Σ Α Π Α. Πνζκ ηδκ επχαζδ ιε ηα θζπμζχιαηα ημ ενεπηζηυ ηςκ ηοηηάνςκ ακηζηαείζηαηαζ ιε θνέζημ. Γίκεηαζ πνμζεήηδ ηςκ θζπμζςιάηςκ nmoles θζπμζςιζημφ θζπζδίμο/10 6 ηφηηανα) ηαζ επχαζδ βζα θεπηά. Μεηά ημ πέναξ ημο πνυκμο επχαζδξ ημ ενεπηζηυ απμιαηνφκεηαζ ιε ακηθία ηεκμφ ηαζ αθμφ ηα ηφηηανα λεπθοεμφκ 3 θμνέξ ιε PBS βίκεηαζ δ πνμζεήηδ 0.3ml ηνορίκδξ. ηακ ηα ηφηηανα βίκμοκ ζθαζνζηά ηαζ πνζκ λεημθθήζμοκ εκηεθχξ αθαζνείηαζ πνμζεηηζηά δ ηνορίκδ ηαζ επακαζςνμφκηαζ ζε 1ml PBS. Ακ δ ηνορίκδ επδνεάγεζ ηδξ ιεηνήζεζξ ηυηε δ απμηηυθδζδ ηςκ ηοηηάνςκ απυ ημ πδβάδζ βίκεηαζ ιε απυλεζζδ ιε scrapers. ηδκ ζοκέπεζα ιεηνείηαζ μ θεμνζζιυξ ηςκ δεζβιάηςκ ζημ θεμνζζιυιεηνμ. Γζα ηζξ θεμνίγμοζεξ πμο μ θεμνζζιυξ ημοξ απμζαέκεηαζ θμβς ηδξ ζηζααδαξ ηςκ θζπζδίςκ πνέπεζ κα πνμζηεεεί ζηδκ δζαδζηαζία έκα αήια επχαζδξ ηςκ δεζβιάηςκ ιε triton-x 100 (0,1%), ακάδεοζδ ιε vortex, ήπζαξ εένιακζδξ ηαζ πνήζδ αηίδαξ οπεννήπςκ βζα ιενζηά δεοηενυθεπηα, πνζκ ηδκ ιέηνδζδ ηςκ δεζβιάηςκ. Καηά ηδκ δζελαβςβή ηςκ πεζναιάηςκ πάκηα αθήκμκηαζ ηάπμζα πδβάδζα ιε ηφηηανα ηεκά (πςνίξ θζπμζχιαηα) εηζζ χζηε κα οπμθμβίγεηαζ μ αοημθεμνζζιυξ ηαζ κα αθαζνείηαζ απυ ηζξ ηζιέξ ηςκ δεζβιάηςκ Λ Δ Η Ξ Δ Ξ Ρ Ι Σ Α Π Θ Ι Ξ Σ Δ Μ Ξ Ο Θ Ρ Λ Ξ Σ Ξ Σ H P T S Λ Δ Ζ Υ Π Ζ Ρ Ζ N H 4 C L. Σμ HPTS έπεζ δομ ζδιεία δζέβενζδξ. Έκα ακελάνηδημ ημο ph ζηα 413 nm ηαζ έκα ελανηχιεκμ ημο ph ζηα 454 nm. O θεμνζζιυξ ημο HPTS ιε δζέβενζδ ζηα 413 nm ηαζ απμννυθδζδ ζηα 512 nm ακηζπνμζςπεφεζ ημκ μθζηυ θεμνζζιυ πμο έπεζ πνμζθδθεεί απυ ηα ηφηηανα εκχ μ θυβμξ ηςκ θεμνζζιχκ ζε δζέβενζδ ζηα 454nm πνμξ ημκ θεμνζζιυ ζηα 413 nm είκαζ δείηηδξ ημο εκημπζζιμφ ηδξ πνςζηζηήξ ζηα θοζμζζχιαηα. 105

122 Εικόνα 38. Δομι HPTS και ςθμεία διζγερςθσ (ανεξάρτθτο και εξαρτϊμενο ph) Ακ δ πνςζηζηή ιεηά ηδκ επχαζδ ηςκ ηοηηάνςκ hcmec/d3 ιε ηα θζπμζχιαηα ανίζηεηαζ ζηα εκδμζχιαηα ηςκ ηοηηάνςκ ηυηε ιεηά ηδκ επχαζδ ιε 5mM NH 4 Cl (Kiprotin et al 1997) παναηδνείηαζ ιζα αφλδζδ ζημ ph αοημφ ημο ηοηηανζημφ ηιήιαημξ Ζ αφλδζδ ημο ph ζοκηεθεί ζηδκ αφλδζδ ημο θεμνζζιμφ ημο HPTS υηακ δ δζέβενζδ βίκεηαζ ζε ιήημξ ηφιαημξ 454nm (εοαίζεδημ ζημ ph). Αοηή δ επίδναζδ ιπμνεί κα ακαζηναθεί ιε ηδκ αθαίνεζδ ημο πθςνζμφπμο αιιςκίμο ηαζ πεναζηένς επχαζδ ιε ενεπηζηυ ιέζμ. H ιέεμδμξ πνδζζιμπμζείηαζ ιε ζημπυ κα ιεθεηδεεί εάκ ηα ακμζμθζπμζχιαηα πνμζθαιαάκμκηαζ απυ ηα ηφηηανα ιε ηδ δζαιεζμθάαδζδ οπμδμπέα to HPTS. ηα θζπμζχιαηα πμο πνδζζιμπμζμφκηαζ βζ αοηυ ημ ζημπυ εβηθςαίγεηαζ HPTS 35 mm Σα θζπμζχιαηα επςάγμκηαζ βζα δζάθμνα πνμκζηά δζαζηήιαηα ιε ηα hcmec/d3 ηφηηανα. Μεηά ηδκ επχαζδ ηα θζπμζςιζηά δείβιαηα αθαζνμφκηαζ ηαζ ηα ηφηηανα λεπθέκμκηαζ ιε PBS. ηδκ ζοκέπεζα ηα ηφηηανα απμημθθχκηαζ ιε scrapers ηαζ μ θεμνζζιυξ ιεηνάηαζ ηαζ ζηα δφμ ιήηδ δίέβενζδξ. ηδκ ζοκέπεζα ηα ηφηηανα επςάγμκηαζ ιε 5 mm NH 4 Cl ζε PBS βζα 10 θεπηά. Καζ μ θεμνζζιυξ ηςκ δεζβιάηςκ ιεηνάηαζ ηαζ πάθζ ηαζ ζηα δφμ ιήηδ δζέβενζδξ. ηδκ ζοκέπεζα ηα ηφηηανα θοβμηεκηνμφκηαζ ζηα 4000 rpm βζα 5 θεπηά ηαζ ημ ο- πενηείιεκμ απμιαηνφκεηαζ. Σα ηφηηανα επακαζςνμφκηαζ ζε ενεπηζηυ ιέζμ βζα 10 θεπηά ηαζ μ θεμνζζιυξ ηςκ δεζβιάηςκ ιεηνάηαζ λακά ηαζ ζη δφμ ιήηδ δζέβενζδξ. 106

123 Λ Δ Κ Δ Ζ Ι Σ Α Π Ξ Ξ Ν Θ Ι Ξ Ζ Α Ρ ( Λ ) Ο MTT έθεβπμξ είκαζ ιία πνςιαημιεηνζηή ιέεμδμξ βζα ηδκ ιέηνδζδ ηδξ δναζηζηυηδηαξ εκγφιςκ πμο ηνμπμπμζμφκ ημ MTT ζε θμνιαγάκδ δίκμκηαξ ζχδεξ πνχια. Μεηά ηδκ επχαζδ ηςκ ηοηηάνςκ ιε ηα θζπμζχιαηα αημθμοεεί οπμθμβζζιυξ ηδξ αζςζζιυηδηάξ ημοξ. Έηζζ ζε ηάεε ηορεθίδα ημπμεεημφκηαζ 50 ιl δζαθφιαημξ MTT (5mg/ml) ημ μπμίμ ιεηαηνέπεηαζ ζε ηνοζηάθθμοξ θμνιαγάκδξ απυ ιζημπμκδνζαηά έκγοια ιυκμ υηακ ημ ηφηηανμ ανίζηεηαζ ζε θοζζμθμβζηή ηαηάζηαζδ ηαζ αημθμοεεί επχαζδ βζα 2 χνεξ (βζα ημ ζπδιαηζζιυ ηςκ ηνοζηάθθςκ). ηδ ζοκέπεζα ημ ενεπηζηυ ιέζμ ακαννμθάηαζ ηαζ ζε ηάεε ηορεθίδα πνμζηίεεκηαζ 500ιl DMSO βζα ηδ δζάθοζδ ηςκ ηνοζηάθθςκ θμνιαγάκδξ. Ζ ιεηαηνμπή ημο MTT ζε ηνοζηάθθμοξ θμνιαγάκδξ είκαζ έκδεζλδ ηδξ θοζζμθμβζηήξ ηαηάζηαζδξ ηςκ ηοηηάνςκ. Γζα ηδ δζάθοζδ ηςκ ηνοζηάθθςκ ιεηά ηδκ πνμζεήηδ DMSO πναβιαημπμζείηαζ επχαζδ ζημοξ 37 C ηαζ ακάδεοζδ. Αημθμοεεί θςημιέηνδζδ ζηα 590 nm, πνδζζιμπμζχκηαξ θςηυιεηνμ ELISA. ε έκα πδβάδζ ημπμεεημφκηαζ 200ιl DMSO ηαζ δ απμννυθδζδ ημο πνδζζιμπμζείηαζ ςξ ιάνηοναξ. Απυ ηζξ μπηζηέξ απμννμθήζεζξ οπμθμβίγεηαζ ημ επζ ημζξ εηαηυ πμζμζηυ αζςζζιυηδηαξ. 2.5 ΑΠΟΤΨΜΑΣΨΗ ΣΨΝ Αβ ΙΝΙΔΙΨΝ (AGE REVERSAL, CLAUDIA MANZONI ET AL, 2009). Αοηυ ημ πνςηυημθθμ εθανιυγεηαζ πνμηεζιέκμο κα απμζοζζςιαηςεμφκ ηα ζκίδζα πμο έπμοκ δδιζμονβδεεί απυ ηα Αα πεπηίδζα. Πανέπμκηαζ δείβιαηα πεπηζδίςκ πμο πενζέπμοκ ηεθζηά ιμκμιενή ή ιζηνμφ ιμνζαημφ αάνμοξ μθζβμιενή. 1. Σα Aα 1-40 ηαζ 1-42 (2mg) δζαθφεδηακ ζε 0,5 ml ηαεανμφ ηνζθεμνμαηεηζημφ μλέμξ (TFA) πμο πενζείπε 4,5% εεζμακζγυθδ, ηαζ αθέεδηε ζε πάβμ βζα 30 έςξ 60 θεπηά εθανιυγμκηαξ ζζπονή ακάδεοζδ ιε vortex ηάεε 10 θεπηά. 2. ημ ιίβια πνμζηίεεκηαζ 167 ιl ηαεανμφ παβςιέκμο θμνιζημφ μλέμξ ηαζ ζηάβδδκ παβςιέκμξ δζαζεοθαζεέναξ (1ml). Δθανιυγεηαζ ακάδεοζδ ιε vortex ηαζ αθήκεηαζ βζα 20 θεπηά ζε παβυθμοηνμ ιέπνζ ηα πεπηίδζα κα ηαηαηνδικζζημφκ. Γζα κα απμθεοπεεί δ θμνιοθίςζδ, ηα πεπηίδζα πνέπεζ κα ηαηαηνδικζζημφκ απεοεείαξ ζε δζεεοθαζεένα ιεηά ηδκ πνμζεήηδ ημο θμνιζημφ μλέμξ. 3. Μεηά απυ 15 θεπηά βίκεηαζ θοβμηέκηνδζδ ζηα rpm ηαζ ηα πεπηίδζα πμο ζοθθέβμκηαζ απυ ημκ ποειέκα ημο ζςθήκα. 107

124 4. Αημθμοεεί ακαδζάθοζδ ζημ ηαηάθθδθμ Tris νοειζζηζηυ ηαζ θζθηνάνζζια απυ 0,22 ιm θίθηνμ έηζζ χζηε κα απμιαηνοκεμφκ ηοπυκ ζκίδζα πμο έπμοκ παναιείκεζ. 2.6 ΘΕΙΟΥΛΑΒΙΝΗ-Σ ΕΛΕΓΦΟ H T εεζμθθααίκδ είκαζ ιία ηαηζμκζηή πνςζηζηή αεκγμεεζαγυθδξ δ μπμία παναηηδνίγεηαζ απυ ηδκ αφλδζδ ημο θεμνζζιμφ ηδξ υηακ δεζιεφεηαζ ζε ζκίδζα αιοθμεζδχκ. Υνδζζιμπμζείηαζ βζα ηδκ ακίπκεοζδ α δμιχκ ηςκ ζκζδίςκ. Εικόνα 39. Δομι κειοφλαβίνθσ Σ Σα πεπηίδζα Αα 1-40 ηαζ 1-42 ιεηά ημ πνςηυημθθμ απμζοζζςιάηςζδξ δζαθφεδηακ ζε 50 mm Tris HCl νοειζζηζηυ ph 7 ή ζε 100 mm Tris HCl, ph 7,4 ακηίζημζπα, ζε ηεθζηή ζοβηέκηνςζδ 15 ιμ πεπηζδίςκ ηαζ 200 ιμ ΣhT. Αημθμφεδζε επχαζδ ζημοξ 37ºC οπμ ακάδεοζδ. Γζα πνμκζηυ δζάζηδια 90 ςνχκ, ακά ηαηηά πνμκζηά δζαζηήιαηα δζελάβμκηακ ιεηνήζεζξ θεμνζζιμφ ηςκ δεζβιάηςκ ζηα 450/482 nm. Γζα ημκ έθεβπμ ακαζημθήξ ηδξ ζοζζςιάηςζδξ πανμοζία θζπμζςιάηςκ, ηα θζπμζχιαηα επςάγμκηαζ απυ ηδκ ανπή ιε ηα πεπηίδζα. 108

125 3 ΑΠΟΣΕΛΕΜΑΣΑ 3.1 ΠΑΡΑΚΕΤΗ, ΦΑΡΑΚΣΗΡΙΜΟ ΚΑΙ ΠΡΟΛΗΧΗ ΣΨΝ OX-26 ΑΝΟΟΛΙΠΟ- ΨΜΑΣΨΝ ΑΠΟ ΣΗΝ ΚΤΣΣΑΡΙΚΗ ΕΙΡΑ hcmec/d3. Ανπζηά ιεηνήεδηακ μζ επζδνάζεζξ δζαθυνςκ παναβυκηςκ ζηα θοζζημπδιζηά παναηηδνζζηζηά ηςκ θζπμζςιάηςκ ηονίςξ ιεθεηήεδηε δ επίδναζδ ηδξ ζοβηέκηνςζδξ ζηνεπηααζδίκδξ (πενίζζεζα), ζημ ιέβεεμξ ηαζ ζηδκ ηαηακμιή ιεβέεμοξ ηςκ θζπμζςιάηςκ χζηε κα απμθεοπεεί πζεακή ζοζζςιάηςζή ημοξ ιέζς δεζιμφ αζμηίκδξ ζηνεπηααζδίκδξ. ηδκ ζοκέπεζα ηα θζπμζχιαηα παναζηεοάζηδηακ χζηε κα εκζςιαηχκμοκ εζδζηά ιυνζα δείηηεξ βζα κα ιπμνεί κα πμζμηζημπμζδεεί δ πνυζθδρή ημοξ απυ ηα ηφηηανα πμο οπενεηθνάγμοκ ημκ οπμδμπέα ηνακζθενίκδξ. Λεπημιενήξ ακάθοζδ ηςκ απμηεθεζιάηςκ αοηχκ ηςκ πεζναιάηςκ πανμοζζάγεηαζ ζηζξ επυιεκεξ παναβνάθμοξ Ο Α Π Α Ρ Ι Δ Σ Ζ Ι Α Θ Υ Α Π Α Ι Ζ Π Θ Ρ Λ Ξ Ρ Ω Μ Α Μ Ξ Ρ Ξ Κ Θ Ο Ξ- Ρ Ω Λ Α Ω Μ ε αοηή ηδκ πανάβναθμ εα πανμοζζαζημφκ μνζζιέκα απμηεθέζιαηα πμο αθμνμφκ ζηα θοζζημπδιζηά παναηηδνζζηζηά ηςκ θζπμζςιάηςκ υπςξ ημ ιέβεεμξ ηαζ ημ δοκαιζηυ ηςκ θζπμζςιάηςκ. Ανπζηά πανμοζζάγεηαζ δ ιεθέηδ βζα ημκ πνμζδζμνζζιυ ηδξ πμζυηδηαξ ζηνεπηααζδίκδξ πμο πνέπεζ κα πνδζζιμπμζδεεί ηαηά ηδκ επχαζδ εηζζ χζηε κα απμθεοπεεί δ ζοζζςιάηςζδ, ηςκ θζπμζςιάηςκ ηαηά ηδ δζαδζηαζία παναζηεοήξ ημοξ ηαεχξ ηαζ ιεθέηεξ βζα ημκ πνμζδζμνζζιυ ημο πμζμζημφ πνυζδεζδξ ημο ακηζζχιαημξ ζηα επζηαθοιιέκα ιε ζηνεπηααζδίκδ θζπμζχιαηα ΕΠΙΔΡΑΗ ΣΗ ΠΟΟΣΗΣΑ ΣΡΕΠΣΑΒΙΔΙΝΗ ΠΟΤ ΕΠΩΑΖΕΣΑΙ ΜΕ ΒΙΟΣΙ- ΝΤΛΙΩΜΕΝΑ ΛΙΠΟΩΜΑΣΑ ΣΗΝ ΤΩΜΑΣΩΗ ΣΩΝ ΛΙΠΟΩΜΙΚΩΝ ΔΕΙΓΜΑ- ΣΩΝ. Ζ ζηνεπηααζδίκδ δζαεέηεζ 4 πενζμπέξ δέζιεοζδξ βζα ηδκ αζμηίκδ. Δάκ δ ζηνεπηααζδίκδ επςαζηεί ζε ζοκεήηεξ 1:1 mol:mol ηαζ παιδθυηενα ακαθμνζηά ιε ηδκ εκζςιαηςιέκδ ζηα θζπμζχιαηα αζμηίκδ ηυηε οπάνπεζ δ πζεακυηδηα ημ ίδζμ ιυνζμ ζηνεπηααζδίκδξ κα αθθδθεπζδνά ιε ιυνζα αζμηίκδξ εκζςιαηςιέκα ζε δζαθμνεηζηά 109

126 θζπμζχιαηα ιε απμηέθεζια ηδκ ζοζζςιάηςζδ ηςκ θζπμζςιάηςκ. Γζα κα αεααζςεμφιε υηζ δ ζοβηέκηνςζδ ηδξ ζηνεπηααζδίκδξ δεκ εα επάβεζ ηδ ζοζζςιάηςζδ ηςκ θζπμζςιάηςκ πμο θένμοκ αζμηίκδ έβζκε ανπζηά έκαξ έθεβπμξ βζα κα ανεεεί ζε πμζά ζοβηέκηνςζδ, ακαθμνζηά ιε ηδ αζμηίκδ, δ ζηνεπηααζδίκδ δεκ επάβεζ ηδκ ζοζζςιάηςζδ ηςκ θζπμζςιάηςκ. Πίνακασ 8. Η ςτρεπταβιδίνθ επωάςτθκε ςε 2, 5, 10 και 20 φορζσ περίςςεια αναφορικά με τθν βιοτίνθ ( 0,025% αναφορικά με το λιπίδιο) ςτθν εξωτερικι πλευρά των λιποςωμάτων. STREP σγθέληρωζε Μέζε ηηκή δηακέηροσ (nm) Ποισδηαζπορά Ζήηα Δσλακηθό (mv) ±0.30 Control ±0.20 x20 STREP ± ±0.20 x10 STREP ± ±0.65 x5 STREP* ± ±1.1 x2 STREP* 128.4± ±0.96 Έβζκε έθεβπμξ ζε ζοκεήηεξ πενίζζεζαξ (x2, x5, x10, x20) ηδξ ζηνεπηααζδίκδξ ςξ πνμξ ηδκ αζμηίκδ (πίκαηαξ 8). Σμ ιέβεεμξ ηαζ ημ γ-δοκαιζηυ ιεηνήεδηακ ζε ZetaSizer. πςξ θαίκεηαζ απυ ηα απμηεθέζιαηα ημ ιέβεεμξ ηαζ ημ δοκαιζηυ ηςκ δεζβιάηςκ δεκ δζαθένμοκ ζδιακηζηά. Αλζμζδιείςημ είκαζ υιςξ υηζ ζηα δείβιαηα πμο δ επχαζδ έβζκε ζε πενίζζεζα x2 ηαζ x5 ειθακίζηδηε ηαζ ιζα δεφηενδ ημνοθή ζημ δείβια, δελζά ηδξ ηφνζαξ ημνοθήξ, πμο ακηζπνμζχπεοε ημ 2,5% ηαζ ημ 1% ηςκ δεζβιάηςκ ακηίζημζπα. Κνίκμοιε υηζ 1% ζοζζςιάηςζδ δεκ εα επζθένεζ αθθμίςζδ ηςκ δεζβιάηςκ ηαζ επζθέβμοιε αοηή ηδ ζοβηέκηνςζδ ηαηάθθδθδ βζα ηδκ δζελαβςβή ηςκ οπμθμζπςκ πεζναιάηςκ ηαεχξ θάααιε οπυρδκ ηαζ ημ ορδθυ ηυζημξ ηδξ ζηνεπηααζδίκδξ ΕΠΙΔΡΑΗ ΣΗ ΠΟΟΣΗΣΑ ΠΡΟΔΕΗ ΣΡΕΠΣΑΒΙΔΙΝΗ/ΑΝΣΙΩΜΑΣΟ ΣΟ ΜΕΓΕΘΟ ΚΑΙ ΣΟ ΔΤΝΑΜΙΚΟ ΣΩΝ ΛΙΠΟΩΜΑΣΩΝ. Μεηνήεδηακ δ ιέζδ δζάιεηνμξ, μ δείηηδξ πμθοδζαζπμνάξ (PDI) ηαζ ημ γ- δοκαιζηυ ηςκ θζπμζςιάηςκ ιε αζμηίκδ ζηδκ επζθάκεζα πνζκ (Biotin) ηαζ ιεηά (+STREP) ηδκ αθθδθεπζδναζδ ιε ζηνεπηααζδίκδ, ηαζ ιεηά ηδκ πνμζηυθθδζδ ημο ακ- 110

127 ηζζχιαημξ (OX-26). Ζ ηαηακμιή ημο ιεβέεμοξ ηςκ κακμζςιαηζδίςκ ηαζ ημ θμνηίμ ηδξ επζθάκεζαξ ιεηνήεδηακ ιεηά ηδκ απμιάηνοκζδ ηδξ πενίζζεζαξ ηδξ ζηνεπηααζδίκδξ, πμο δεκ είπε αθθδθεπζδνάζεζ ιε ηδ αζμηίκδ, ηαζ ηδκ απμιάηνοκζδ ημο ιδ πνμζδεδειέκμο ακηζζχιαημξ ιε πνςιαημβναθία βέθδξ απμηθεζζιμφ αάζεζ ιεβέεμοξ. Πίνακασ 9. Δφο διαφορετικζσ ςυςτάςεισ λιποςωμάτων αναφορικά με τθν βιοτίνθ (0,1% και 0,01%) ςτα διάφορα ςτάδια πρόςδεςθσ ςτρεπταβιδίνθσ (+STREP) και αντιςϊματοσ (+ΟΧ-26) κακϊσ και πριν τθν πρόςδεςθ ςτρεπταβιδίνθσ (+Biotin). ηάδηο παραζθεσής δείγκαηαηος mole % ιηπηδίοσ βηοηίλες Μέζε ηηκή δηακέηροσ (nm) Ποισδηαζπορά δ-δσλακηθό (mv) 1 (BIOTIN)* ± ±1.8 2 (+STREP) ± ±1.5 3 (+OX-26) ± ± (BIOTIN) ± ±0,19 2 (+STREP) ± ± (+OX-26) ± ±0.28 Μεθεηήεδηακ θζπμζχιαηα ιε δζαθμνεηζηή πμζυηδηα (mol%) θζπζδίμοαζμηίκδξ ακαθμνζηά ιε ημ ζοκμθζηυ θζπίδζμ (πίκαηαξ 9). πςξ θαίκεηαζ απυ ηα απμηεθέζιαηα, ηα θζπμζχιαηα ιε 0,1% mol αζμηίκδξ είκαζ ιεβαθφηενα. ζε ιέβεεμξ ζε ζφβηνζζδ ιε ηα θζπμζχιαηα ιε 0,01%mol αζμηίκδξ. Καζ αοηή δ δζαθμνά παναιέκεζ ηαζ ιεβαθχκεζ ζηα επυιεκα ζηάδζα. Με ηδκ πνυζδεζδ ηδξ ζηνεπηααζδίκδξ, δ δζαθμνά ιεηαλφ ηςκ δεζβιάηςκ ιε δζαθμνεηζηυ πμζμζηυ αζμηίκδξ, βίκεηαζ αηυια ιεβαθφηενδ. Καζ ζηα ηεθζηά δείβιαηα ηςκ ακμζμθζπμζςιάηςκ δ δζαθμνά ιεηαλφ ηςκ δεζβιάηςκ ιε δζαθμνεηζηυ πμζμζηυ αζμηίκδξ είκαζ πενζπμο 40 nm. Αοηή δ δζαθμνά δζηαζμθμβείηαζ απυ ημ βεβμκυξ υηζ ζηα θζπμζχιαηα ιε πενζζζυηενδ αζμηίκδ ζηδκ επζθάκεζα, πνμζημθθχκηαζ πενζζζυηενα ιυνζα ζηνεπηααζδίκδξ, ηαθφπημκηαξ ηδκ επζθάκεζα ηαζ αολάκμκηαξ έηζζ ημκ υβημ ηςκ κακμζςιαηζδίςκ. Αθθά ηαζ ζημ επυιεκμ ζηάδζμ, πνυζδεζδξ ημο ακηζζχιαημξ, ημ ιέβεεμξ ηςκ θζπμζςιάηςκ αολάκεζ πεναζηένς. 111

128 MΕΣΡΗΗ ΠΟΟΣΟΤ ΠΡΟΔΕΔΕΜΕΝΟΤ ΣΑ ΛΙΠΟΩΜΑΣΑ ΑΝΣΙΩΜΑΣΟ ΜΕ ELISA Γζα κα αεααζςεμφιε υηζ έπμοιε ζηακμπμζδηζηυ πμζμζηυ πνυζδεζδξ ημο ακηζζχιαημξ ζηδκ επζθάκεζα άθθα ηαζ βζα κα δμφιε ακ ημ πμζμζηυ ημο PEG ζηδκ επζθάκεζα παίγεζ ηάπμζμ νυθμ ζηδκ ζηακυηδηα πνυζδεζδ ημο ακηζζχιαημξ ιεηνήζαιε ηδκ πενίζζεζα ημο ακηζζχιαημξ ιεηά απυ ημκ δζαπςνζζιυ ηδξ ιε πνςιαημβναθία ιμνζαημφ απμηθεζζιμφ, βζα δφμ δζαθμνεηζηέξ ζοζηάζεζξ θζπμζςιάηςκ ακαθμνζηά ιε ημ πμζμζηυ ημο PEG (4% ηαζ 6% ημο ζοκμθζημφ θζπζδίμο). Δίκαζ βκςζηυ υηζ ζε πμζμζηυ 4% μζ αθοζίδεξ PEG είκαζ ζπεδυκ εοεοβναιιζζιέκεξ ζηδκ επζθάκεζα ηςκ θζπμζςιάηςκ. Θεθήζαιε κα δμφιε ακ ιε ιεβαθφηενμ πμζμζηυ PEG (6%) επζηοβπάκεηαζ ορδθυηενμ πμζμζηυ δέζιεοζδξ ημο ακηζζχιαημξ πζεακυκ θυβς ημο υηζ μζ αθοζίδεξ εα είκαζ πενζζζυηενμ εοεοβναιιζζιέκεξ ηαζ δεκ εα ηαθφπημοκ ηζξ PEG αθοζίδεξ πμο θένμοκ ζηδκ άηνδ πνμζδεδειέκδ αζμηίκδ. Πίνακασ 10. Ποςοςτό μθ προςδεδεμζνου αντιςϊματοσ επί τοισ εκατό για δφο διαφορετικζσ ςυςτάςεισ οςον αφορά ςτο PEG που υπάρχει ςτθν επιφάνεια, θ βιοτίνθ είναι και ςτισ δφο ςυςτάςεισ 0,05%. Δείγκα 6% PEG 4% PEG Περίζζεηα 7% 6% πςξ θαίκεηαζ απυ ηα απμηεθέζιαηα (πίκαηαξ 10) δεκ οπάνπεζ ζδιακηζηή δζαθμνά ιεηαλφ ηςκ δφμ ζοζηάζεςκ υζμκ αθμνά ζηδκ πνυζδεζδ ημο ακηζζχιαημξ. Δ- πίζδξ επζαεααζχκεηαζ υηζ ημ πμζμζηυ πνυζδεζδξ ημο ακηζζχιαημξ είκαζ ανηεηά ορδθυ ηαεχξ πάκεηαζ θζβυηενμ απυ ημ 10% ημο ακηζζχιαημξ πνμξ πνυζδεζδ ΜΕΣΡΗΗ ΜΕΓΕΘΟΤ ΚΑΙ ζ-δτναμικοτ ΣΩΝ ΑΝΟΟΛΙΠΟΩΜΑΣΩΝ. Μεηνήζαιε ημ ηεθζηυ ιέβεεμξ ακμζμθζπμζςιάηςκ ηαζ ηςκ ακηίζημζπςκ απθχκ θζπμζςιάηςκ πμο απμηεθμφκηαζ απυ θζπίδζμ PC ή DSPC ηαζ πμθδζηενυθδ ζε ιμνζαηή ακαθμβία 2:1. Σμ πμζμζηυ ημο ακηζζχιαημξ είκαζ 0,025% ακαθμνζηά ιε ημ θζπίδζμ ηαζ 0,05% βζα ημ δζπθυ ακηίζςια. 112

129 Πίνακασ 11. Μζγεκοσ και η-δυναμικό απλϊν λιποςωμάτων και ανοςολιποςωμάτων με ΟΧ-26 που ζχουν προςδεκεί ςτθν επιφάνεια λιποςωμάτων PC ι DSPC κακϊσ και με 2 διαφορετικζσ ποςότθτεσ αντιςϊματοσ (ΟΧ-26 και διπλό ΟΧ-26). Μέγεζος (nm) Ζήηα Δσλακηθό/mV Control PC 117,4 ±2,54-6,16 ±0,091 PC (+OX-26) 128,0 ±2,82-4,51 ±0,93 PC (+ δζπθυ ox26) 142,3 ±1,76-6,51 ±0,38 Control DSPC (-OX- 26) 117,3 ±2,19-1,35 ±0,495 DSPC (+OX-26) 171,5 ±0,424-1,20 ±0,035 πςξ θαίκεηαζ ζημκ πίκαηα 11 ηα απθά θζπμζχιαηα είκαζ ιζηνυηενα ζε ιέβεεμξ απυ ηα ακηίζημζπα ακμζμθζπμζχιαηα. Σα απθά PC θζπμζχιαηα είκαζ ηαηά 10 πενίπμο nm ιζηνυηενα απυ ακηίζημζπα PC-ακμζμθζπμζχιαηα εκχ ιε ηδκ πνυζδεζδ δζπθάζζαξ πμζυηδηαξ ακηζζχιαημξ ζηδκ επζθάκεζα ηςκ PC θζπμζςιάηςκ παναηδνμοιε υηζ ημ οδνμδοκαιζηυ ιέβεεμξ αολάκεηαζ ηαηά 25 nm ζε ζφβηνζζδ ιε ηα απθά θζπμζχιαηα. οκεπχξ δ πμζυηδηα ημο ακηζζχιαημξ πμο πνμζδέκεηαζ ζημ θζπυζςια έπεζ ζδιακηζηυ νυθμ ζημ ηεθζηυ ιέβεεμξ ηςκ ακμζμθζπμζςιάηςκ. οβηνίκμκηαξ ηα απθά θζπμζχιαηα PC ιε ηα απθά θζπμζχιαηα DSPC παναηδνμφιε υηζ ημ ανπζηυ ημοξ ιέβεεμξ είκαζ αηνζαχξ ημ ίδζμ. Καζ πάθζ ηα ακμζμθζπμζχιαηα DSPC είκαζ ιεβαθφηενα απυ ηα απθά θζπμζχιαηα DSPC ηαζ εδχ δ δζαθμνά ζημ ιέβεεμξ είκαζ θίβμ ιεβαθφηενδ ζε ζφβηνζζδ ιε ηα PC-θζπμζχιαηα. 113

130 ΜΕΛΕΣΗ ΣΑΘΕΡΟΣΗΣΑ ΛΙΠΟΩΜΑΣΩΝ ΠΟΤ ΦΕΡΟΤΝ ΕΓΚΛΩΒΙΜΕΝΗ ΣΗ ΧΡΩΣΙΚΗ HPTS. Γζα ηδκ ιεθέηδ ηδξ ζηαεενυηδηαξ ηςκ θζπμζςιάηςκ πμο θένμοκ εβηθςαζζιέκμ HPTS, ηα θζπμζχιαηα επςάζηδηακ ζε ζοβηέκηνςζδ 1mg/ml θζπζδίμο ηαζ πανμοζία 5% μνμφ FBS Πίνακασ 12. τακερότθτα των λιποςωμάτων που φζρουν εγκλωβιςμζνθ τθ χρωςτικι HPTS (35mM και 70mM). σγθράηεζε ηοσ HPTS (HPTS/ιηπίδηο) Ληποζώκαηα Χρόλος (h) Ληποζώκαηα ± ± ± 0,007 (35 mm HPTS) Ληποζώκαηα ± ± ± (70 mm HPTS) πςξ θαίκεηαζ ζημκ Πίκαηα 12 ηα θζπμζχιαηα ζοβηναημφκ ηδ πνςζηζηή ιεηά ηδκ επχαζδ ιέπνζ ηαζ 24 χνεξ πανμοζία μνμφ. Ο θυβμξ ηςκ mol θζπζδίμο πνμξ ηα mol πνςζηζηήξ παναιέκεζ ζηαεενυξ ζηζξ 24 χνεξ επχαζδξ ΜΟΡΦΟΛΟΓΙΚΗ ΕΚΣΙΜΗΗ ΣΗ ΠΡΟΔΕΗ ΣΟΤ ΟΧ-26 ΣΗΝ ΕΠΙΦΑΝΕΙΑ ΣΩΝ ΛΙΠΟΩΜΑΣΩΝ ΚΑΙ ΧΑΡΑΚΣΗΡΙΜΟ ΜΕΓΕΘΟΤ ΜΕ ΣΕΜ Γζα κα πζζημπμζήζμοιε πμζμηζηά ηδκ πνυζδεζδ ηςκ ακηζζςιάηςκ ζηδκ επζθάκεζα ηςκ ακμζμθζπμζςιάηςκ επςάζαιε ηα δείβιαηα ιε έκα δεφηενμ Anti Mouse IgG πμο πνμζδέκεηαζ ζημ πνχημ ακηίζςια ΟΥ-26 Mouse Anti Rat, ημ μπμίμ θένεζ πνμζδεδειέκα κακμζςιαηίδζα πνοζμφ. Μεηά ηδκ πνμεημζιαζία ηςκ δεζβιάηςκ ιεθεηήεδηακ ιε δθεηηνμκζηή ιζηνμζημπία δζέθεοζδξ. 114

131 Α. Β Γ. Εικόνα 40. Δομι λιποςωμάτων A. Εικόνα από TEM απλϊν λιποςωμάτων Β και Γ. εικόνα TEM ανοςολιποςωμάτων μετά από αλλθλεπίδραςθ με αντιςϊμα ςυνδεδεμζνο με νανοςωματίδια χρυςοφ. πςξ θαίκεηαζ ζηδκ εζηυκα 40, ημ δεφηενμ ακηίζςια δεζιεφεηαζ ιυκμ ζηα ακμζμθζπμζχιαηα εκχ δεκ δεζιεφεηαζ ηαευθμο ζηα δείβιαηα θζπμζςιάηςκ πμο δεκ θένμοκ ακηίζςια. Με αοηυ ημκ ηνυπμ πζζημπμζείηαζ πμζηζηά δ πνυζδεζδ ημο ακηζζχιαημξ ζηδκ επζθάκεζα ηςκ θζπμζςιάηςκ Λ Δ Κ Δ Ζ Ζ Ρ Ο Π Ξ Ρ Κ Ζ Φ Ζ Ρ Ω Μ Α Μ Ξ Ρ Ξ Κ Θ Ο Ξ Ρ Ω Λ Α Ω Μ Λ Δ ΞΥ- 2 6 Α Ο Ξ Ζ Μ Ι Σ Α Π Θ Ι Ζ Ρ Δ Θ Π Α H C M E C / D 3 ηζξ παναηάης παναβνάθμοξ πανμοζζάγμκηαζ απμηεθέζιαηα πμο αθμνμφκ ζημ πμζμζηυ πνυζθδρδξ ηςκ ακμζμθζπμζςιάηςκ απυ ηδ ηοηηανζηή ζεζνά ζε δζάθμνεξ ζοκεήηεξ υπςξ δζαθμνεηζηή θζπμζςιζηή δυζδ (πμζυηδηα θζπζδίμο), δζαθμνεηζηυξ πνυκμξ επχαζδξ ηαζ δζθμνεηζηή ποηκυηδηα ακηζζχιαημξ ζηδκ θζπμζςιζηή επζθάκεζα 115

132 ηαεχξ ηαζ ιεθέηεξ ημο πμζμζημφ πνυζθδρδξ ηςκ ακμζμθζμζςιάηςκ πανμοζία ηαζ δεφηενμο ιδ εζδζημφ ακηζζχιαημξ ΜΕΛΕΣΗ ΕΠΙΔΡΑΗ ΣΗ ΚΤΣΣΑΡΙΚΗ ΠΡΟΛΗΨΗ ΑΠΟ ΣΗΝ ΛΙΠΟΩΜΙΚΗ ΔΟΗ. Γζα κα δζενεοκήζμοιε ακ δ πνυζθδρδ ηςκ ακμζμθζπμζςιάηςκ απυ ηα ηφηηανα είκαζ δμζμελανηχιεκδ ηαζ ακ ζε ηάπμζμ ζδιείμ επζηοβπάκεηαζ ημνεζιυξ ηςκ οπμδμπέςκ ηςκ ηοηηάνςκ ηάκαιε πεζνάιαηα πνυζθδρδξ θζπμζςιάηςκ πνδζζιμπμζχκηαξ δζαθμνεηζηέξ δυζεζξ. Σα απμηεθέζιαηα πανμοζζάγμκηαζ ςξ πμζυηδηα θζπζδίμο πμο πνμζθήθεδηε απυ ηα ηφηηανα ζηζξ δζάθμνεξ δυζεζξ ηαζ ςξ επί ημζξ εηαηυ πμζμζηυ πνυζθδρδξ ηδξ πνςζηζηήξ. Διάγραμμα 7. Δοςοεξαρτϊμενθ πρόςλθψθ των OX-26 ανοςολιποςωμάτων και των Control λιποςωμάτων από τθν κυτταρικι ςειρά hcmec/d3, μετά από επϊαςθ των λιποςωμάτων με τισ ςυγκεκριμζνεσ δόςεισ λιπιδίου, για 60 λεπτά, ςτουσ 37:C. Σα ανοςολιποςϊματα ζχουν ενςωματωμζνθ βιοτίνθ (Biotin-DSPE-PEG) 0.02 mol% του ολικοφ λιπιδίου το uptake είναι εκφραςμζνο ςε nmol λιπιδίου ςτα κφτταρα βαςιηόμενοι ςτον φκοριςμό τoυ FITC που ζχει περάςει ςτα κφτταρα (λυμζνα κφτταρα με Triton) ςε ςφγκριςθ με το FITC που βρίςκεται εγκλωβιςμζνο ςτα λιποςϊματα. 116

133 Διάγραμμα 8. Εκατοςτιαία πρόςλθψθ των OX-26 ανοςολιποςωμάτων και των Control λιποςωμάτων από τθν κυτταρικι ςειρά hcmec/d3, μετά από επϊαςθ των λιποςωμάτων με τισ ςυγκεκριμζνεσ δόςεισ λιπιδίου, για 60 λεπτά, ςτουσ 370C. Σα ανοςολιποςϊματα ζχουν ενςωματωμζνθ βιοτίνθ (Biotin-DSPE-PEG) 0.02 mol% του ολικοφ λιπιδίου το uptake είναι εκφραςμζνο ςε nmol λιπιδίου ςτα κφτταρα βαςιηόμενοι ςτον φκοριςμό τoυ FITC που ζχει περάςει ςτα κφτταρα (λυμζνα κφτταρα με Triton) ςε ςφγκριςθ με το FITC που βρίςκεται εγκλωβιςμζνο ςτα λιποςϊματα. πςξ θαίκεηαζ ζημ δζάβναιια 7 υζμ αολάκεηαζ δ πμζυηδηα ημο θζπζδίμο πμο επςάγεηαζ ιε ηα ηφηηανα (10 6 ) αολάκεηαζ ηαζ δ πμζυηδηα ημο θζπζδίμο πμο πνμζθαιαάκεηαζ απυ αοηά. Αοηυ απμδεζηκφεζ ηδκ δμζμελανηχιεκδ πνυζθδρδ ηςκ θζπμζςιάηςκ απυ ηα ηφηηανα. Ακ υιςξ αοηά ηα δεδμιέκα εηθναζημφκ ζε επζ ημζξ εηαηυ πνυζθδρδ ημο FITC απυ ηα ηφηηανα (δζάβναιια 8) παναηδνμφιε υηζ ημ πμζμζηυ είκαζ ορδθυηενμ βζα ηδκ ιζηνυηενδ πμζυηδηα θζπζδίμο. Αοηυ είκαζ θμβζηυ ηαεχξ πνμθακχξ μθείθεηαζ ζημ υηζ μζ οπμδμπείξ ηνακζθενίκδξ ηςκ ηοηηάνςκ ζε ηάπμζμ ζδιείμ ηαηαθαιαάκμκηαζ απυ ηα θζπμζχιαηα ηαζ δ πεναζηένς αφλδζδ ηδξ πμζυηδηαξ δεκ επζθένεζ ακάθμβα αφλδζδ ημο επζ ημζξ εηαηυ πμζμζημφ πνυζθδρδξ ΜΕΛΕΣΗ ΣΗ ΕΠΙΔΡΑΗ ΣΟΤ ΧΡΟΝΟΤ ΕΠΩΑΗ ΣΗΝ ΚΤΣΣΑΡΙΚΗ ΠΡΟ- ΛΗΨΗ ΣΩΝ ΑΝΟΟΛΙΠΟΩΜΑΣΩΝ. Μεθεηήεδηε ημ πμζμζηυ πνυζθδρδξ ζοβηεηνζιέκδξ δυζδξ ακμζμθζπμζςιάηςκ απυ ηα ηφηηανα ζε δζάθμνεηζηά πνμκζηά δζαζηήιαηα επχαζδξ πνμηεζιέκμο κα ελεηάζμοιε ηδκ ηαπφηδηα ηδξ δζαδζηαζίαξ ηδξ πνυζθδρδξ ηςκ ακμζμθζπμζςιάηςκ απυ ηα ηφηηανα. 117

134 Διάγραμμα 9. Χρονοεξαρτϊμενθ πρόςλθψθ των OX-26 ανοςολιποςωμάτων από τθν κυτταρικι ςειρά hcmec/d3, μετά από επϊαςθ 100nmol λιποςωμάτων/ 106 κφτταρα για ςυγκεκριμζνα χρονικά διαςτιματα, ςτουσ 370C. τα ανοςολιποςϊματα είναι ενςωματωμζνθ βιοτίνθ (Biotin-DSPE-PEG) 0.05 mol% του ολικοφ λιπιδίου. Η πρόςλθψθ είναι εκφραςμζνθ ςε επι τοισ εκατό του εγκλωβιςμζνου ςτα λιποςϊματα FITC που ζχει προςλθφκεί από τα κφταρα. Παναηδνμφιε απυ ημ δζάβναιια 9, ιεηά απυ επχαζδ ηςκ ηοηηάνςκ ιε ηα θζπμζχιαηα βζα δζάθμνα πνμκζηά δζαζηήιαηα δεκ παναηδνμφκηαζ ζδιακηζηέξ δζαθμνέξ ζημ επζ ημζξ εηαηυ πμζμζηυ πνυζθδρδξ ηδξ εβηθςαζζιέκδξ ζηα θζπμζχιαηα πνςζηζηήξ. Αοηυ ζδιαίκεζ υηζ δ δζαδζηαζία ηδξ πνυζθδρδξ ιέζς ημο οπμδμπέα θαιαάκεζ πχνα πμθφ βνήβμνα. Δπίζδξ απυ ημ δζάβναιια θαίκεηαζ υηζ ημ πμζμζηυ πνυζθδρδξ παναιέκεζ ζηαεενυ. Γδθαδή ηα ηφηηανα θένμοκ ηεθζηά ημ ίδζμ πμζμζηυ ηδξ θεμνίγμοζαξ. Αοηυ αέααζα ιπμνεί κα ζδιαίκεζ είηε υηζ ηα ηφηηανα ζοβηναημφκ ηδ θεμνίγμοζα βζα ιεβάθμ πνμκζηυ δζάζηδια είηε υηζ ηδκ απμαάθθμοκ ζημ πενζαάθθμκ ηαζ ιε ζηαεενυ νοειυ πνμζθαιαάκμοκ κέα θζπμζχιαηα ΕΠΙΔΡΑΗ ΣΗ ΠΤΚΝΟΣΗΣΑ ΣΟΤ ΑΝΣΙΩΜΑΣΟ ΟΧ-26 ΠΟΤ ΒΡΙΚΕΣΑΙ ΤΝΔΕΔΕΜΕΝΟ ΣΗΝ ΕΠΙΦΑΝΕΙΑ ΣΗΝ ΠΡΟΛΗΨΗ ΣΩΝ ΑΝΟΟΛΙΠΟΩΜΑΣΩΝ ΑΠΟ ΣΑ ΚΤΣΣΑΡΑ. Γζα κα ιεθεηήζμοιε ηδκ επίδναζδ ημο πμζμζημφ ημο ακηζζχιαημξ, πμο ανίζηεηαζ πνμζδεδειέκμ ζηδκ επζθάκεζα ηςκ θζπμζςιάηςκ, ζημ επί ημζξ εηαηυ πμζμζηυ πνυζθδρδξ ηςκ θζπμζςιάηςκ απυ ηα ηφηηανα πνμεημζιάζαιε δείβιαηα ιε δζαθμνεηζηυ πμζμζηυ εκζςιαηςιέκδξ αζμηίκδξ ζηδκ δζπθμζηζαάδα (0.1%-0,01%) ηαζ ζοκεπχξ ιε δζαθμνεηζηυ ηεθζηά ακηίζςια πνμζδεδειέκμ ζηδκ επζθάκεζα. 118

135 Διάγραμμα 10. Επι τοισ εκατό πρόςλθψθ των ανοςολιποςωμάτων με διαφορετικό % ποςοςτο ενςωματωμζνθσ βιοτίνθσ ςτθν λιπιδικι διπλοςτιβάδα και λιποςωμάτων Control. Σο Uptake είναι το % ποςοςτό του FITC των λιποςωμάτων (200nmol λιπιδίου) που βρίςκεται ςε 106 κφτταρα βιοτίνθσ. Απυ ηα απμηεθέζιαηα (δζάβναιια 10) θαίκεηαζ υηζ υζμ αολάκεηαζ μ ανζειυξ ακηζζςιάηςκ ακά θζπυζςια ηυζμ αολάκεηαζ ηαζ ημ πμζμζηυ πνυζθδρδξ αοηχκ απυ ηα ηφηηανα. Αοηυ ιάθθμκ μθείθεηαζ ζηδκ αφλδζδ ηδξ πζεακυηδηαξ πμο έπεζ ηάεε θζπυζςια κα πνμζδεεεί ζημκ οπμδμπέα ηδξ ηνακζθενίκδξ. Δίκαζ πνμθακέξ υηζ υζμ ιεβαθφηενδ είκαζ δ ζοβηέκηνςζδ ημο ακηζζχιαημξ ηυζμ αολάκεηαζ ηαζ δ πζεακυηδηα πνυδεζδξ ζημκ οπμδμπέα ΕΚΣΙΜΗΗ ΕΙΔΙΚΟΣΗΣΑ ΠΡΟΛΗΨΗ ΣΩΝ ΑΝΟΟΛΙΠΟΩΜΑΣΩΝ ΜΕ ΟΧ- 26 ΣΗΝ ΚΤΣΣΑΡΙΚΗ ΕΙΡΑ HCMEC/D3. Γζα κα επζαεααζχζμοιε υηζ ημ ακηίζςια δεζιεφεηαζ εζδζηά ζημκ οπμδμπέα εεθήζαιε κα πνδζζιμπμζήζμοιε ςξ ανκδηζηυ control, εηηυξ απυ ηα απθά (πςνζξ ακηίζςια) θζπμζχιαηα, ηαζ θζπμζχιαηα πμο θένμοκ πνμζδεδειέκμ ακηίζςια IgG2a(negative control) ηαζ ακηίζςια IgG απυ μνυ πμκηζημφ. 119

136 Διάγραμμα 11. Επι τοισ εκατό πρόςλθψθ των ανοςολιποςωμάτων ΟΧ-26, IgG 2a (negative control) και IgG από ορό. Σο ποςοςτο ενςωματωμζνθσ βιοτίνθσ ςτθν λιπιδικι διπλοςτιβάδα είναι 0,05%. Σο Uptake είναι το % ποςοςτό του FITC των λιποςωμάτων (200nmol λιπιδίου) που βρίςκεται ςε 10 6 κφτταρα. πςξ θαίκεηαζ ζημ δζάβναιια 11 ηα δείβιαηα ιε ηα ιδ εζδζηά βζα ημκ οπμδμπέα ηδξ ηνακζθενίκδξ ακηζζχιαηα πνμζθαιαάκμκηαζ ζε πμθφ ιζηνυ πμζμζηυ απυ ηα ηφηηανα ηαζ ζε πμθφ ιζηνυηενμ πμζμζηυ αηυια ηαζ απυ ηα control ιε ηα απθά θζπμζχιαηα. Αοηυ απμδεζηκφεζ υηζ είκαζ δ εζδζηή δέζιεοζδ ημο ΟΥ-26 ηςκ θζπμζςιάηςκ πμο εοεφκεηαζ βζα ημ ορδθυηενμ πμζμζηυ πνυζθδρδξ αοηχκ απυ ηα ηφηηανα ΕΚΣΙΜΗΗ ΣΗ ΠΑΡΟΤΙΑ ΚΑΙ ΔΕΤΣΕΡΟΤ ΑΝΣΙΩΜΑΣΟ ΣΗΝ ΠΡΟΛΗΨΗ ΣΩΝ ΑΝΟΟΛΙΠΟΩΜΑΣΩΝ ΟΧ-26 ΑΠΟ ΣΑ ΚΤΣΣΑΡΑ. Γζα κα ιεθεηήζμοιε ακ δ πνυζδεζδ εκυξ δεφηενμο ιδ εζδζημφ ακηζζχιαημξ ζηδκ επζθάκεζα ηςκ ακμζμθζπμζςιάηςκ επζθένεζ αθθαβέξ ζηδκ ζηακυηδηα πνυζδεζδξ ηςκ ακμζμθζπμζςιάηςκ ιε ΟΥ-26 ζημοξ οπμδμπείξ ηνακζθενίκδξ ηςκ hcmec/d3 ηοηηάνςκ πνμζδέζαιε ζηδκ επζθάκεζα ηαζ έκα δεφηενμ ακηίζςια IgG ζηδκ ίδζα πμζυηδηα ιε ημ ΟΥ

137 Διάγραμμα 12. Επι τοισ εκατό πρόςλθψθ των ανοςολιποςωμάτων ΟΧ-26+IgG1:1 και OX-26. Σα ανοςολιποςϊματα ΟΧ-26+IgG 1:1 φζρουν προςδεδεμζνα ίςεσ ποςότθτεσ αντιςϊματων IgG και ΟΧ-26. Σο ποςοςτό ενςωματωμζνθσ βιοτίνθσ ςτθν λιπιδικι διπλοςτιβάδα των ΟΧ- 26+IgG1:1 και OX-26 είναι 0,1% και 0,05% αντίςτοιχα. Σο Uptake εκφράηεται με το επι τοισ εκατό ποςοςτό του FITC των λιποςωμάτων (200nmol λιπιδίου) που βρίςκεται ςε 106 κφτταρα βιοτίνθσ. πςξ αθέπμοιε ζημ δζάβναιια 12, παναηδνείηαζ ιζα ιζηνή ιείςζδ ζημ επζ ημζξ εηαηυ πμζμζηυ ηςκ θζπμζςιάηςκ πμο πνμζθαιαάκμκηαζ απυ ηα ηφηηανα ιεηά ηδκ πνυζδεζδ ηαζ ημο δεφηενμο, ιδ εζδζημφ, ακηζζχιαημξ ζηδκ επζθάκεζα ηςκ ακμζμθζπμζςιάηςκ. Ζ ιείςζδ δεκ είκαζ ορδθή άθθα απυ ηα απμηεθέζιαηα αθέπμοιε υηζ οπάνπεζ ιζα ιζηνή επίδναζδ. Κάπμζα θζπμζχιαηα εα πνμζακαημθίγμκηαζ πνμξ ηδκ επζθάκεζα ηςκ ηοηηάνςκ ιε εηηεεεζιέκμ πνμξ αοηή ηδκ επζθάκεζα ημ ιδ εζδζηυ ακηίζςια. Αοηυξ ζζςξ είκαζ έκαξ θυβμξ ηδξ ιζηνήξ ιείςζδξ ηδξ πνυζθδρδξ ηςκ ακμζμθζπμζςιάηςκ απυ ηα ηφηηανα MΕΛΕΣΕ ΛΤΟΩΜΙΚΟΤ ΕΝΣΟΠΙΜΟΤ ΜΕ ΣΗΝ ΧΡΗΗ ΣΗ ΦΘΟΡΙΖΟΤΑ ΟΤΙΑ HPTS Με ζηυπμ κα ιεθεηήζμοιε ηδκ πμνεία ηςκ θζπμζςιάηςκ ιεηά ηδκ πνυζθδρή ημοξ απυ ημοξ οπμδμπείξ πνδζζιμπμζήζαιε ηδκ θεμνίγμοζα μοζία HPTS (Kiprotin et al.,1997) ηδκ μπμία εβηθςαίζαιε ζημ εζςηενζηυ, οδαηζηυ, ηιήια ηςκ ακμζμθζπμζςιάηςκ. 121

138 Πίνακασ 13 Λόγοσ τθσ ζνταςθσ φκοριςμοφ FI-454 / FI-413 μετά από επϊαςθ 200 nmol ανοςολιποςωμάτων με OX-26 ι Control λιποςωμάτων με 106 κφτταρα για διαφορα χρονικά διαςτιματα ςτουσ 37 C. (+) NH 4 Cl (-) NH 4 Cl Υνυκμξ επχαζδξ (min) Control (Πεβηοθζςιέκα θζπμζχιαηα) OX-26 ακμζμθζπμζχιαηα ± ± ± ± ± ± & ± & ± ± ± πςξ θαίκεηαζ απυ ημκ πίκαηα 13 μ θυβμξ ηςκ θεμνζζιχκ 454/413 ηςκ ηοηηάνςκ πμο έπμοκ επςαζηεί ιε ηα θζπμζχιαηα ιεζχκεηαζ ζηαδζαηά ιε ημκ πνυκμ ηαζ αοηυ είκαζ έκδεζλδ ηδξ εζςηενίηεοζδξ ηδξ πνςζηζηήξ ζηα ηφηηανα. Καεχξ δ πνςζηζηή πενκά ζε πενζαάθθμκ ιε ιζηνυηενμ ph μ θεμνζζιυξ ζημ ph ελανηχιεκμ ζδιείμ (454) ιεζχκεηαζ εκχ μ θεμνζζιυξ ζημ ph ακελάνηδημ ζδιείμ παναιέκεζ ζηαεενυξ. οκεπχξ μ θυβμξ ηςκ θεμνζζιχκ ζηα δφμ ιήηδ ιεζχκεηαζ ηαζ απμδεζηκφεζ ημκ εκημπζζιυ ηδξ πνςζηζηήξ ζηα θοζμζχιαηα υπμο ημ ph είκαζ ιζηνυηενμ. Δπζπθέμκ ιεηά απυ επχαζδ ιε πθςνζμφπμ αιιχκζμ παναηδνείηαζ αφλδζδ ημο θυβμο ηςκ θεμνζζιχκ ακαθοηζηυηενα μ θεμνζζιυξ ζημ ph ελανηχιεκμ ζδιείμ (454nm) αολάκεηαζ εκχ ζηα 413 nm παναιέκεζ ζηαεενυξ. Καεχξ ημ πθςνζμφπμ αιιχκζμ αολάκεζ ημ ph ζηα εκδμηοηηανζηά ηιδιαηα, δ πνςζηζηή πμο είκαζ εβηθςαζζιέκδ ζηα θοζμζχιαηα εα δίκεζ ιεβαθφηενεξ ηζιέξ θεμνζζιμφ ζηα 454 nm θυβς ηδξ αφλδζδξ ημο ph. Ζ αφλδζδ ημο θυβμο ηςκ θεμνζζιχκ ιεηά ηδκ επχαζδ ιε ημ πθςνζμφπμ αιιχκζμ απμδεζηκφεζ ημκ θοζμζςιαηζηυ εκημπζζιυ ηδξ πνςζηζηήξ. Σμ θαζκυιεκμ αοηυ ακηζζηνέθεηαζ ιεηά απυ αθαίνεζδ ημο πθςνζμφπμο αιιςκίμο ηαζ επχαζδ ηςκ ηοηηάνςκ ιε ενεπηζηυ ιέζμ. Με αοηυκ ημκ ηνυπμ επακένπεηαζ ημ ph ηςκ εκδμηοηηανζηχκ ηιδιάηςκ ζηα θοζζμθμβζηά ημοξ επίπεδα, δδθαδή ιεζχκεηαζ ζοκεπχξ ηαζ δ ηζιή θεμνζζιμφ ζηα 454 επακένπεηαζ ζηα ανπζηά επίπεδα. 122

139 ΜΕΛΕΣΗ ΚΤΣΣΑΡΟΣΟΞΙΚΟΣΗΣΑ ΣΩΝ ΑΝΟΟΛΙΠΟΩΜΑΣΩΝ Γζα κα αεααζςεμφιε υηζ ηα θζπμζχιαηα δεκ είκαζ ημλζηά βζα ηα ηφηηανα, ηάκαιε έκα έθεβπμ ηοηηανμημλζηυηδηαξ ιε ηδκ εθανιμβή ηδξ ιεευδμο MTT Διάγραμμα 13. ΜΣΣ ζλεγχοσ. hcmec/d3 κφτταρα επωάςτθκαν ςε 24-well plates με λιποςωμικά δείγματα και διάλυμα MTT. Σα δείγματα είναι λιποςϊματα χωρίσ αντίςωμα, λιποςϊματα με ςτρεπταβιδίνθ, λιποςϊματα με ΟΧ-26 και με IgG. πςξ θαίκεηαζ απυ ηα απμηεθέζιαηα ζημ δζάβναιια 13 ηακέκα απυ ηα θζπμζςιζηά δείβιαηα δεκ είκαζ ηοηηανμημλζηυ. Σα control θζπμζχιαηα πμο είκαζ απθά θζπμζχιαηα πςνζξ ακηίζςια δείπκμοκ 100% αζςζζιυηδηα εκχ ηα θζπμζχιαηα ιε ηα ακηζζχιαηα IgG ηαζ ΟΥ-26 δείπκμοκ ιζα αιεθδηέα επίδναζδ ζηδκ αζςζζιυηδηα ηςκ ηοηηάνςκ. 3.2 ΑΝΑΣΟΛΗ ΣΗ ΤΨΜΑΣΨΗ ΣΨΝ ΑΒ 1-40 ΚΑΙ ΑΒ 1-42 ΠΕΠΣΙΔΙΨΝ ΠΑΡΟΤΙΑ ΛΙΠΟΨΜΑΣΨΝ ΜΕ ΚΟΤΡΚΟΤΜΙΝΗ. Μετά τθν αποςςυςωμάτωςθ των πεπτιδίων Αβ, εφαρμόηοντασ τθ μζκοδο age reversal, μετρικθκε το μεγεκοσ τουσ και ςτθν ςυνζχεια μελετικθκε θ πορεία ςυςςωμάτω- 123

140 ςισ τουσ παρουςία ι απουςία λιποςωμάτων. Τα αποτελζςματα παρουςιάηονται αναλυτικά ςτiσ επόμενεσ παραγράφουσ Α Μ Α Ρ Ξ Κ Ζ Ζ Ρ Ρ Σ Ρ Ρ Ω Λ Α Ω Ρ Ζ Ρ Ω Μ Α β Ο Δ Ο Θ Δ Θ Ω Μ Ο Α Π Ξ Σ Ρ Θ Α Κ Θ Ο Ξ Ρ Ω Λ Α Ω Μ Λ Δ Ι Ξ Σ Π Ι Ξ Σ Λ Θ Μ Ζ. Για τθν εκτίμθςθ τθσ ςυςςωμάτωςθσ εφαρμόςτθκαν δφο μζκοδοι. Η πρώτθ μζκοδοσ περιλαμβάνει τθν μζτρθςθ του φκοριςμοφ τθσ κειοφλαβίνθσ Τ και θ δεφτερθ τθν μζτρθςθ του τελικοφ μεγζκουσ των δομών των πεπτιδίων με DLS (NIBS) ΜΕΘΟΔΟ ΘΕΙΟΦΛΑΒΙΝΗ Σ. Γζα κα ιεθεηήζμοιε ηδκ ζηακυηδηα ηςκ θζπμζςιάηςκ ιε ημονημοιίκδ κα α- καζηείθμοκ ηδκ ζοζζςιάηςζδ ηςκ Αα 1-40 πεπηζδίςκ εθανιυζαιε ηδκ ιέεμδμ ηδξ εεζμθθααίκδξ Σ πνμηεζιέκμο κα ιεθεηήζμοιε ηδκ πμνεία ζοζζςιάηςζδξ ηςκ πεπηζδίςκ. Διάγραμμα 14. Λιποςϊματα με κουρκουμίνθ 1μΜ και ελεφκερθ κουρκουμίνθ επωάςτθκαν με 15μM Αβ 1-40 πεπτιδίου ςε Σris ρυκμιςτικό 50mM ph 7.0, παρουςία 200μΜ ΣhT, ςτουσ 370C για 90 ϊρεσ. Εκτόσ από τα δείγματα με λιποςϊματα και κουρκουμίνθ ζγινε επϊαςθ και πεπτιδίων παρουςία μόνο κειοφλαβίνθσ και μελετθκθκε θ πορεία ςχθματιςμοφ β δομϊν. 124