ΠΑΝΔΠΙΣΗΜΙΟ ΠΑΣΡΩΝ τοιή Δπηζηεκώλ Τγείας Σκήκα Φαρκαθεσηηθής Δργαστήριο Μοριακής Βιολογίας και Ανοσολογίας

Transcript

1 ΠΑΝΔΠΙΣΗΜΙΟ ΠΑΣΡΩΝ τοιή Δπηζηεκώλ Τγείας Σκήκα Φαρκαθεσηηθής Δργαστήριο Μοριακής Βιολογίας και Ανοσολογίας ΤΝΔΚΦΡΑΗ ΚΑΙ ΜΔΛΔΣΗ ΤΠΟΜΟΝΑΓΩΝ ΣΟΤ ΝΙΚΟΣΙΝΙΚΟΤ ΤΠΟΓΟΥΔΑ ΑΚΔΣΤΛΟΥΟΛΙΝΗ ΑΝΘΡΩΠΙΝΩΝ ΝΔΤΡΙΚΩΝ ΚΤΣΣΑΡΩΝ Γιδακτορική Γιατριβή ΑΘΑΝΑΙΟ ΝΙΑΡΥΟ Φαρκαθοποηός ΠΑΣΡΑ

2 ΣΡΙΜΔΛΗ ΤΜΒΟΤΛΔΤΣΙΚΗ ΔΠΙΣΡΟΠΗ Γεώργηος Παηρηλός Αλαπιερωηής Καζεγεηής (Δπηβιέπωλ Καζεγεηής) ωθράηες Σδάρηος Κωλζηαληίλος Ποσιάς Οκόηηκος Καζεγεηής Δπίθοσρος Καζεγεηής ΔΠΣΑΜΔΛΗ ΔΞΔΣΑΣΙΚΗ ΔΠΙΣΡΟΠΗ Γεώργηος Παηρηλός Αλαπιερωηής Καζεγεηής (Δπηβιέπωλ Καζεγεηής) ωθράηες Σδάρηος Κωλζηαληίλος Ποσιάς Οκόηηκος Καζεγεηής Δπίθοσρος Καζεγεηής Υρήζηος Κοληογηάλλες Καζεγεηής Γεώργηος πσρούιηας Δσαγγειία Παπαδεκεηρίοσ Κωλζηαληίλος Ασγοσζηάθες Αλαπιερωηής Καζεγεηής Αλαπιερώηρηα Καζεγήηρηα Αλαπιερωηής Καζεγεηής 2

3 Πίνακας περιεχομένων Ευχαριςτίεσ... 7 Α. ΕΙΑΓΩΓΗ... 8 Α.1. ΠΕΝΣΑΜΕΡΗ ΧΗΜΕΙΟΕΛΕΓΧΟΜΕΝΑ ΚΑΝΑΛΙΑ ΙΟΝΣΩΝ... 8 Α.2. ΝΙΚΟΣΙΝΙΚΟΙ ΤΠΟΔΟΧΕΙ ΑΚΕΣΤΛΟΧΟΛΙΝΗ Α.3 ΜΤΪΚΟΤ ΣΤΠΟΤ nachr Α.4. ΝΕΤΡΙΚΟΤ ΣΤΠΟΤ nachr Α.5 Η ΣΡΙΣΟΣΑΓΗ ΚΑΙ Η ΣΕΣΑΡΣΟΣΑΓΗ ΔΟΜΗ ΣΩΝ nachr Α.6. ΑΛΛΑΓΕ ΠΟΤ ΕΠΑΓΟΝΣΑΙ ΣΗ ΣΕΡΕΟΔΟΜΗ ΣΩΝ nachr ΑΠΟ ΣΗΝ ΠΡΟΔΕΗ ΑΓΩΝΙΣΩΝ Α.7. ΑΝΑΔΙΠΛΩΗ, ΤΓΡΟΣΗΗ ΚΑΙ ΕΝΔΟΚΤΣΣΑΡΙΚΗ ΜΕΣΑΦΟΡΑ ΣΩΝ nachr Α.8. ΠΡΟΔΕΣΕ ΝΕΤΡΙΚΟΤ ΣΤΠΟΤ nachr ΜΕ ΦΑΡΜΑΚΟΛΟΓΙΚΟ ΕΝΔΙΑΦΕΡΟΝ Α.8.1. Η ΝΙΚΟΣΙΝΗ ΚΑΙ ΑΝΑΛΟΓΑ ΣΗ Α.8.2. Η ΕΠΙΒΑΣΙΔΙΝΗ ΚΑΙ ΑΝΑΛΟΓΑ ΣΗ Α.8.3. Η ΚΤΣΙΙΝΗ ΚΑΙ ΑΝΑΛΟΓΑ ΣΗ Α.8.4. ΝΙΚΟΣΙΝΙΚΟΙ ΑΝΣΑΓΩΝΙΣΕ Α ΑΝΣΑΓΩΝΙΣΕ ΑΝΑΛΟΓΑ ΝΙΚΟΣΙΝΗ Α ΑΝΣΑΓΩΝΙΣΕ ΑΝΑΛΟΓΑ ΕΠΙΒΑΣΙΔΙΝΗ Α.9. ΗΜΑΣΟΔΟΣΗΗ ΜΕ ΙΟΝΣΑ Ca 2+ ΜΕΩ ΝΕΤΡΙΚΟΤ ΣΤΠΟΤ nachr Α.10. ΤΝΕΙΦΟΡΑ ΣΩΝ ΝΕΤΡΙΚΟΤ ΣΤΠΟΤ nachr ΣΗΝ ΝΕΤΡΩΝΙΚΗ ΠΛΑΣΙΚΟΣΗΣΑ ΚΑΙ ΣΗ ΜΝΗΜΗ Α.11. ΕΜΠΛΟΚΗ ΣΩΝ ΝΕΤΡΙΚΟΤ ΣΤΠΟΤ nachr ΣΟ ΤΝΔΡΟΜΟ ΤΠΕΡΚΙΝΗΣΙΚΟΣΗΣΑ ΚΑΙ ΔΙΑΠΑΗ ΣΗ ΠΡΟΟΧΗ (ADHD) Α.12. ΡΤΘΜΙΗ ΓΟΝΙΔΙΑΚΗ ΕΚΦΡΑΗ ΜΕΩ ΝΕΤΡΙΚΟΤ ΣΤΠΟΤ nachr Α.13. ΑΝΣΙΦΛΕΓΜΟΝΩΔΕΙ ΚΑΙ ΝΕΤΡΟΠΡΟΣΑΣΕΤΣΙΚΕ ΔΡΑΕΙ ΝΕΤΡΙΚΟΤ ΣΤΠΟΤ nachr Α.14. Ο ΡΟΛΟ ΣΩΝ ΝΕΤΡΙΚΟΤ ΣΤΠΟΤ nachr ΣΟΝ ΚΑΡΚΙΝΟ Α.14.1 ΒΙΟΧΗΜΙΚΑ ΜΟΝΟΠΑΣΙΑ ΠΟΤ ΕΜΠΛΕΚΟΝΣΑΙ ΣΗΝ ΑΝΣΟΧΗ ΣΗΝ ΑΠΟΠΣΩΗ ΑΠΟ ΣΗ ΝΙΚΟΣΙΝΗ Α.15. Ο ΡΟΛΟ ΣΩΝ ΝΕΤΡΙΚΟΤ ΣΤΠΟΤ nachr ΣΗΝ ΑΓΓΕΙΟΓΕΝΕΗ Α.16. Ο ΡΟΛΟ ΣΩΝ ΝΕΤΡΙΚΟΤ ΣΤΠΟΤ nachr ΣΗ ΝΟΟ ΣΟΤ ALZHEIMER Α.17. Ο ΡΟΛΟ ΣΩΝ ΝΕΤΡΙΚΟΤ ΣΤΠΟΤ nachr ΣΗ ΧΙΖΟΦΡΕΝΙΑ Α.18. Ο ΡΟΛΟ ΣΩΝ ΝΕΤΡΙΚΟΤ ΣΤΠΟΤ nachr ΣΗΝ ΕΞΑΡΣΗΗ ΑΠΟ ΣΗ ΝΙΚΟΣΙΝΗ Α ΕΠΙΔΡΑΗ ΚΑΘΕ ΕΙΔΟΤ ΝΕΤΡΙΚΟΤ ΣΤΠΟΤ nachr ΣΟΝ ΕΘΙΜΟ ΣΗ ΝΙΚΟΣΙΝΗ45 Α.19. Ο ΡΟΛΟ ΣΩΝ ΝΕΤΡΙΚΟΤ ΣΤΠΟΤ nachr ΣΗΝ ΚΑΣΑΘΛΙΨΗ

4 Α.20. Ο ΡΟΛΟ ΣΩΝ ΝΕΤΡΙΚΟΤ ΣΤΠΟΤ nachr ΣΗΝ ΕΠΙΛΗΨΙΑ Α.21. ΣΑ ΤΣΗΜΑΣΑ ΕΚΦΡΑΗ ΠΡΩΣΕΪΝΩΝ Pichia pastoris ΚΑΙ ΚΤΣΣΑΡΑ ΕΝΣΟΜΩΝ Sf Α ΣΟ ΕΣΕΡΟΛΟΓΟ ΤΣΗΜΑ ΕΚΦΡΑΗ: ΚΤΣΣΑΡΑ ΕΝΣΟΜΩΝ Α ΣΟ ΕΣΕΡΟΛΟΓΟ ΤΣΗΜΑ ΕΚΦΡΑΗ Pichia pastoris Α.22. ΚΟΠΟ ΣΗ ΕΡΓΑΙΑ Β. ΤΛΙΚΑ ΚΑΙ ΜΕΘΟΔΟΙ Β.1.1. ΕΞΟΠΛΙΜΟ Β.1.2. ΠΛΑΣΙΚΑ ΑΝΑΛΩΙΜΑ Β.1.3. ΑΝΣΙΔΡΑΣΗΡΙΑ Β.1.4. ΔΙΑΛΤΜΑΣΑ Β.1.5. ΑΝΣΙΩΜΑΣΑ Β.2. ΜΕΘΟΔΟΙ Β.2.1. ΑΝΣΙΔΡΑΕΙ ΣΡΟΠΟΠΟΙΗΗ ΣΟΤ DNA Β.2.2. ΚΑΘΑΡΙΜΟ DNA ΠΡΟΪΟΝΣΟ ΕΝΖΤΜΙΚΩΝ ΑΝΣΙΔΡΑΕΩΝ Β.2.3. ΕΞΑΓΩΓΗ DNA ΑΠΟ ΣΜΗΜΑΣΑ ΠΗΚΣΩΜΑΣΟ ΑΓΑΡΟΖΗ Β.2.4. ΠΑΡΑΚΕΤΗ ΕΠΙΔΕΚΣΙΚΩΝ ΒΑΚΣΗΡΙΩΝ E. coli Β.2.5. ΜΕΣΑΧΗΜΑΣΙΜΟ ΒΑΚΣΗΡΙΩΝ E. coli Β.2.6. ΑΠΟΜΟΝΩΗ ΠΛΑΜΙΔΙΑΚΟΤ DNA ΑΠΟ E.coli Β.2.7. ΑΛΤΙΔΩΣΗ ΑΝΣΙΔΡΑΗ ΠΟΛΤΜΕΡΑΗ Β.2.8. ΗΛΕΚΣΡΟΦΟΡΗΗ DNA Ε ΠΗΚΣΩΜΑ ΑΓΑΡΟΖΗ Β.2.9. ΕΣΕΡΟΛΟΓΗ ΕΚΦΡΑΗ ΣΩΝ ΑΝΑΤΝΔΤΑΜΕΝΩΝ ΤΠΟΔΟΧΕΩΝ α4β2 Ε ΚΤΣΣΑΡΑ ΕΝΣΟΜΩΝ Sf Β ΕΣΕΡΟΛΟΓΗ ΕΚΦΡΑΗ, ΣΩΝ ΑΝΑΤΝΔΤΑΜΕΝΩΝ ΤΠΟΜΟΝΑΔΩΝ ΣΟΤ α4β2 nachr ΣΟΝ ΖΤΜΟΜΤΚΗΣΑ P. pastoris Β ΠΕΙΡΑΜΑΣΑ ΠΡΟΔΕΗ ΑΓΩΝΙΣΩΝ ΑΝΣΑΓΩΝΙΣΩΝ ΣΟΤ ΑΝΑΤΝΔΤΑΜΕΝΟΤ α4β2 nachrs Β ΑΝΙΧΝΕΤΗ ΑΝΑΤΝΔΤΑΜΕΝΩΝ ΤΠΟΔΟΧΕΩΝ Β ΒΕΛΣΙΣΟΠΟΙΗΗ ΣΗ ΕΚΦΡΑΗ ΣΩΝ ΑΝΑΤΝΔΤΑΜΕΝΩΝ ΤΠΟΔΟΧΕΩΝ Β ΠΡΟΔΙΟΡΙΜΟ ΤΓΓΕΝΕΙΑ ΣΩΝ ΤΠΟΔΟΧΕΩΝ ΜΕ 3 Η-ΕΠΙΒΑΣΙΔΙΝΗ Β ΠΕΙΡΑΜΑΣΑ ΑΝΣΑΓΩΝΙΜΟΤ ΜΕ ΜΗ ΕΠΙΗΜΑΜΕΝΟΤ ΠΡΟΔΕΣΕ Β ΠΡΟΔΙΟΡΙΜΟ ΣΟΤ ΠΟΟΣΟΤ ΔΙΑΛΤΣΟΠΟΙΗΗ ΣΩΝ ΤΠΟΔΟΧΕΩΝ Β ΧΡΩΜΑΣΟΓΡΑΦΙΑ ΤΓΓΕΝΕΙΑ ΙΟΝΣΩΝ ΜΕΣΑΛΛΟΤ Β ΧΡΩΜΑΣΟΓΡΑΦΙΑ ΜΟΡΙΑΚΟΤ ΑΠΟΚΛΕΙΜΟΤ

5 Β ΗΛΕΚΣΡΟΦΟΡΗΗ ΠΡΩΣΕΪΝΩΝ Ε ΠΗΚΣΩΜΑ ΠΟΛΤΑΚΡΤΛΑΜΙΔΙΟΤ Ε ΑΠΟΔΙΑΣΑΚΣΙΚΕ ΤΝΘΗΚΕ (SDS PAGE) Β ΣΤΠΩΜΑ WESTERN Β ΠΕΙΡΑΜΑΣΑ ΚΤΚΛΙΚΟΤ ΔΙΧΡΩΪΜΟΤ Β ELISA Β RIA Γ. ΑΠΟΣΕΛΕΜΑΣΑ ΕΚΦΡΑΗ Ε ΚΤΣΣΑΡΑ ΕΝΣΟΜΩΝ Sf Γ.1. ΚΑΣΑΚΕΤΗ ΣΟΤ ΑΝΑΤΝΔΤΑΜΕΝΟΤ ΓΕΝΕΣΙΚΟΤ ΤΛΙΚΟΤ ΣΩΝ ΒΑΚΙΛΟΪΩΝ Γ.1.1. ΤΠΟΚΛΩΝΟΠΟΙΗΗ ΣΩΝ cdna ΣΩΝ ΤΠΟΜΟΝΑΔΩΝ ΑΠΟ ΣΟ ΠΛΑΜΙΔΙΟ ptriex-3 neo ΣΟ pfastbac Γ.1.2. ΕΛΕΓΧΟ ΓΙΑ ΑΠΟΙΚΙΕ ΜΕ ΕΠΙΣΤΧΗ ΤΠΟΚΛΩΝΟΠΟΙΗΗ Γ.1.3. ΕΛΕΓΧΟ ΣΩΝ ΑΝΑΤΝΔΤΑΜΕΝΩΝ ΙΪΚΩΝ ΓΕΝΕΣΙΚΩΝ ΤΛΙΚΩΝ Γ.2. ΑΝΙΧΝΕΤΗ ΣΗ ΕΚΦΡΑΗ ΣΩΝ ΑΣ ΚΑΙ Κ ΤΠΟΔΟΧΕΩΝ Γ.2.1. ΑΝΙΧΝΕΤΗ ΜΕ ΣΤΠΩΜΑ WESTERN Γ.2.2. ΑΝΙΧΝΕΤΗ ΕΚΦΡΑΗ-ΤΓΚΡΙΗ ΜΕ ΠΡΟΔΕΗ 125 Ι-επιβατιδίνθσ Γ.3. ΒΕΛΣΙΣΟΠΟΙΗΗ ΣΗ ΕΚΦΡΑΗ ΣΩΝ α4β2 ΤΠΟΔΟΧΕΩΝ Ε ΚΤΣΣΑΡΑ ΕΝΣΟΜΩΝ Γ.3.1. ΠΡΟΔΙΟΡΙΜΟ ΒΕΛΣΙΣΟΤ ΧΡΟΝΟΤ ΕΚΦΡΑΗ Γ.3.2. ΠΡΟΔΙΟΡΙΜΟ ΒΕΛΣΙΣΗ ΑΝΑΛΟΓΙΑ ΑΝΑΤΝΔΤΑΜΕΝΩΝ α4 ΚΑΙ β2 ΒΑΚΙΛΟΙΩΝ ΓΙΑ ΣΗΝ ΕΚΦΡΑΗ ΣΩΝ ΑΣ ΚΑΙ Κ ΤΠΟΔΟΧΕΩΝ Γ.4. ΜΕΛΕΣΕ ΠΡΟΔΕΗ 3 Η-ΕΠΙΒΑΣΙΔΙΝΗ ΚΑΙ ΑΛΛΩΝ, ΜΗ ΕΠΙΗΜΑΜΕΝΩΝ ΠΡΟΔΕΣΩΝ ΣΟΤ ΑΝΑΤΝΔΤΑΜΕΝΟΤ α4β2 ΤΠΟΔΟΧΕΙ Γ.4.1. ΜΕΛΕΣΗ ΠΡΟΔΕΗ 3 Η-ΕΠΙΒΑΣΙΔΙΝΗ Γ.4.2. ΜΕΛΕΣΗ ΠΡΟΔΕΗ ΜΗ ΡΑΔΙΕΝΕΡΓΩΝ ΠΡΟΔΕΣΩΝ ΣΟΤ ΑΝΑΤΝΔΤΑΜΕΝΟΤ α4β2 ΤΠΟΔΟΧΕΙ Γ.5. ΠΕΙΡΑΜΑΣΑ ΔΙΑΛΤΣΟΠΟΙΗΗ ΣΩΝ ΤΠΟΔΟΧΕΩΝ Γ.5.1. ΔΙΑΛΤΣΟΠΟΙΗΗ ΜΕ ΜΗ ΙΟΝΙΚΑ ΚΑΙ ΑΜΦΟΛΤΣΙΚΑ ΑΠΟΡΡΤΠΑΝΣΙΚΑ Γ.5.2. ΔΙΑΛΤΣΟΠΟΙΗΗ ΜΕ ΙΟΝΙΚΑ ΑΠΟΡΡΤΠΑΝΣΙΚΑ Γ.5.3. ΕΠΙΔΡΑΗ ΣΟΤ ΧΡΟΝΟΤ ΚΑΙ ΣΗ ΘΕΡΜΟΚΡΑΙΑ ΣΗ ΔΙΑΛΤΣΟΠΟΙΗΗ Γ.5.4. ΕΦΑΡΜΟΓΗ ΤΠΕΡΗΧΩΝ ΣΑΤΣΟΧΡΟΝΑ ΜΕ ΣΗ ΧΡΗΗ TRITON X Γ.5.5. ΔΙΑΛΤΣΟΠΟΙΗΗ ΜΕ TRITON Ε ΠΟΛΤ ΑΛΚΑΛΙΚΟ ph Γ.6. ΚΑΘΑΡΙΜΟ ΚΑΙ ΑΠΟΜΟΝΩΗ ΣΟΤ α4β2 ΤΠΟΔΟΧΕΑ Γ.6.1. ΚΑΘΑΡΙΜΟ ΣΟΤ Κ α4β2 ΤΠΟΔΟΧΕΑ ΜΕ ΧΡΩΜΑΣΟΓΡΑΦΙΑ ΤΓΓΕΝΕΙΑ ΙΟΝΣΩΝ ΝΙΚΕΛΙΟΤ Γ.6.2. ΑΡΝΗΣΙΚΟΙ ΜΑΡΣΤΡΕ (ΚΤΣΣΑΡΑ SF9)

6 Γ.6.3. ΑΝΑΛΤΗ ΚΑΙ ΚΑΘΑΡΙΜΟ ΣΟΤ Κ α4β2 ΤΠΟΔΟΧΕΑ ΜΕ ΧΡΩΜΑΣΟΓΡΑΦΙΑ ΜΟΡΙΑΚΟΤ ΑΠΟΚΛΕΙΜΟΤ Γ.7. ΕΚΦΡΑΗ ΣΟ ΖΤΜΟΜΤΚΗΣΑ Pichia pastoris Γ.7.1. ΤΠΟΚΛΩΝΟΠΟΙΗΗ ΣΩΝ cdna ΑΠΟ ΣΟ ΠΛΑΜΙΔΙΟ ptriex-3 Neo ΣΟ ppic Γ.7.2. ΕΛΕΓΧΟ ΜΕΣΑΧΗΜΑΣΙΜΕΝΩΝ ΑΠΟΙΚΙΩΝ P. pastoris ΓΙΑ ΕΚΦΡΑΗ α4β2 ΤΠΟΔΟΧΕΩΝ Γ.7.3. ΑΝΙΧΝΕΤΗ ΣΩΝ α4β2 ΤΠΟΔΟΧΕΩΝ ΕΚΦΡΑΜΕΝΩΝ Ε P. pastoris ΜΕ ΣΤΠΩΜΑ WESTERN Γ.7.4. ΤΓΚΡΙΗ ΕΚΦΡΑΗ α4β2 ΤΠΟΔΟΧΕΩΝ Ε P. pastoris ΚΑΙ ΚΤΣΣΑΡΑ Sf Γ.7.5. ΠΕΙΡΑΜΑΣΑ ΔΙΑΛΤΣΟΠΟΙΗΗ ΣΩΝ α4β2 P. pastoris ΤΠΟΔΟΧΕΩΝ Γ.8. ΕΚΦΡΑΗ Ε ΚΤΣΣΑΡΑ ΕΝΣΟΜΩΝ ΣΟΤ ΑΝΘΡΩΠΙΝΟΤ α1 ECD Δ. ΤΖΗΣΗΗ ΠΕΡΙΛΗΨΗ ABSTRACT ΠΙΝΑΚΑ ΤΝΣΜΗΕΩΝ ΒΙΒΛΙΟΓΡΑΦΙΑ ΧΕΣΙΚΗ ΕΠΙΣΗΜΟΝΙΚΗ ΔΗΜΟΙΕΤΗ

7 Δπραξηζηίεο Ζ πανμφζα ιεθέηδ πναβιαημπμζήεδηε ζημ Δνβαζηήνζμ Μμνζαηήξ Βζμθμβίαξ ηαζ Ακμζμθμβίαξ ημο Σιήιαημξ Φανιαηεοηζηήξ ημο Πακεπζζηδιίμο Παηνχκ. Πνχηα απ υθα εα ήεεθα κα εοπανζζηήζς ηα ιέθδ ηδξ Σνζιεθμφξ οιαμοθεοηζηήξ Δπζηνμπήξ. Σμκ επζαθέπμκηα ακαπθδνςηή ηαεδβδηή Γεχνβζμ Παηνζκυ βζα ηδκ επίαθερδ, ημκ μιυηζιμ ηαεδβδηή ςηνάηδ Σγάνημ βζα ηδκ ακάεεζδ, ηδκ επίαθερδ, ηδκ ηαεμδήβδζδ, ηαεχξ επίζδξ ημκ ελμπθζζιυ ηαζ ηδκ οπμζηήνζλδ πμο ιμο πανείπε ηαε υθδ ηδ δζάνηεζα ηδξ ιεθέηδξ ηαζ ημκ επίημονμ ηαεδβδηή Κςκζηακηίκμ Πμοθά βζα ηδκ επίαθερδ, ηδκ ηαεμδήβδζδ, ηαεχξ ηαζ ηδκ πμθφηζιδ οπμζηήνζλδ πμο ιμο πανείπε υθμ αοηυ ημ δζάζηδια. Θενιά επίζδξ εα ήεεθα κα εοπανζζηήζς ηαζ ηα οπυθμζπα ιέθδ ηδξ Δπηαιεθμφξ Δλεηαζηζηήξ Δπζηνμπήξ βζα ηα πμθφηζια ζπυθζα πμο έηακακ πάκς ζηδκ ιεθέηδ αοηή ηαζ ηα μπμία μδήβδζακ ζηδ αεθηίςζή ηδξ: ημκ ηαεδβδηή Υνήζημ Κμκημβζάκκδ, ημκ Ακαπθδνςηή Καεδβδηή Γεχνβζμ πονμφθζα, ηδκ Ακαπθδνχηνζα Καεδβήηνζα Δοαββεθία Παπαδδιδηνίμο ηαζ ημκ ακαπθδνςηή Καεδβδηή Κςκζηακηίκμ Αοβμοζηάηδ. Δπζπθέμκ λεπςνζζηά εα ήεεθα κα πς έκα ιεβάθμ εοπανζζηχ ζε υθμοξ αοημφξ πμο ηαε υθδ ηδ δζάνηεζα ηδξ ιεθέηδξ αοηήξ ιε ζηήνζλακ ηαζ ιε άθθμοξ ηνυπμοξ. Σα οπυθμζπα ιέθδ ημο ενβαζηδνίμο βζα ηδκ ανιμκζηή ζοκενβαζία πμο είπαιε υθμ αοηυ ημ δζάζηδια, ημοξ θίθμοξ ιμο, αθθά ζδζαίηενα ηδκ μζημβέκεζά ιμο, πςνίξ ηδκ οπμζηήνζλή ηδξ μπμίαξ δφζημθα δ ιεθέηδ αοηή εα ιπμνμφζε κα μθμηθδνςεεί. 7

8 Α. ΔΗΑΓΧΓΖ Α.1. ΠΔΝΣΑΜΔΡΖ ΥΖΜΔΗΟΔΛΔΓΥΟΜΔΝΑ ΚΑΝΑΛΗΑ ΗΟΝΣΧΝ Ζ νφειζζδ ηδξ εζζυδμο ζυκηςκ ζημ ηοηηανυπθαζια είκαζ ιζα γςηζηήξ ζδιαζίαξ δζενβαζία βζα ηα ηφηηανα ηαζ ημκ μνβακζζιυ ηαζ ζοπκά επζηεθείηαζ ιέζς ηακαθζχκ ηα μπμία επζηνέπμοκ ηδ δίμδμ ζυκηςκ υηακ πνμζδέκεηαζ ζε αοηά ηάπμζμξ ζοβηεηνζιέκμξ κεονμδζααζααζηήξ. Τπάνπμοκ ανηεηά είδδ πδιεζμεθεβπυιεκςκ ηακαθζχκ ζυκηςκ ηα μπμία ακήημοκ ζηδκ ίδζα οπενμζημβέκεζα ηαζ εεςνείηαζ υηζ έπμοκ πνμηφρεζ απυ ημ ίδζμ πνμβμκζηυ βμκίδζμ. Σα πεκηαιενή πδιεζμεθεβπυιεκα ηακάθζα ζυκηςκ (ΠΥΚΗ) είκαζ δζαιειανακζηέξ πνςηεΐκεξ, μζ μπμίεξ πενζθαιαάκμοκ ημοξ κζημηζκζημφξ οπμδμπείξ αηεηοθμπμθίκδξ (nachr), ημοξ οπμδμπείξ βθοηίκδξ, ημοξ οπμδμπείξ β- αιζκμαμοηονζημφ μλέμξ-α (GABA-A) ηαζ ημοξ 5ΖΣ3 οπμδμπείξ ζενμημκίκδξ. Απμηεθμφκηαζ απυ πέκηε υιμζεξ ή δζαθμνεηζηέξ οπμιμκάδεξ, μζ μπμίεξ ζοβηνμημφκηαζ βφνς απυ έκακ άλμκα ζπδιαηίγμκηαξ ηακάθζα, απυ ηα μπμία ιπμνμφκ κα πενάζμοκ ζυκηα δζαιέζμο ηδξ ιειανάκδξ. Σα ΠΥΚΗ έπμοκ ζπήια ηοθίκδνμο ιε ιήημξ πενίπμο 110 Å ηαζ ιέβζζηδ δζάιεηνμ 90 Å. Οζ πέκηε οπμιμκάδεξ ζοβηνμημφκ έκα ζοιιεηνζηυ ηακάθζ ημ μπμίμ ζημ ηέκηνμ ημο έπεζ έκακ πυνμ (Kalamida et al. 2007). Δηθόλα 1. Σππηθό πεληακεξέο ρεκεηνειεγρόκελν θαλάιη ηόλησλ. Γζαηνίκμκηαζ: (1) ημ ζδιείμ πνυζδεζδξ οπμηαηαζηαηχκ, (2) μ πυνμξ ημο δζαφθμο, (3) ημ ελςηοηηανζηυ ηιήια, (4) ημ δζαιειανακζηυ ηιήια, (5) ημ ηοηηανμπθαζιαηζηυ ηιήια ημο ηακαθζμφ. Οζ 5 οπμιμκάδεξ πμο απμηεθμφκ ηα ηακάθζα αοημφ ημο ηφπμο ζοιαμθίγμκηαζ ιε βνάιιαηα. 8

9 Ζ πνυζδεζδ αβςκζζηχκ ζηα πδιεζμεθεβπυιεκα ηακάθζα ζυκηςκ πνμηαθεί αθθμζηενζηέξ ηνμπμπμζήζεζξ μζ μπμίεξ μδδβμφκ ζημ άκμζβια ηςκ ηακαθζχκ. Σα ακμζηηά ηακάθζα επζηνέπμοκ ηδκ δζέθεοζδ ζυκηςκ ηα μπμία ιε ηδ ζεζνά ημοξ πνμηαθμφκ δθεηηνμθοζζμθμβζηέξ ιεηααμθέξ ζηα ηφηηανα υπμο εδνάγμκηαζ. Δηηυξ απυ ηδκ ακμζηηή ηαζ ηδκ ηθεζζηή ηαηάζηαζδ, ζηα ΠΥΚΗ παναηδνείηαζ ηαζ δ απεοαζζεδημπμζδιέκδ ηαηάζηαζδ, ζηδκ μπμία δεκ ακζπκεφεηαζ νμή ζυκηςκ αηυια ηαζ πανμοζία αβςκζζηή (Kalamida et al. 2007). Δηθόλα 2. Σππηθή δνκή δηακεκβξαληθνύ ηκήκαηνο πεληακεξνύο ρεκεηνειεγρόκελνπ θαλαιηνύ ηόλησλ (ΠΚΗΥ). Απμηεθείηαζ απυ ηα δζαιειανακζηά ηιήιαηα ηςκ οπμιμκάδςκ, πμο ζπδιαηίγμοκ έκα ηακάθζ δζαιέζμο ηδξ ιειανάκδξ, ηα ημζπχιαηα ημο μπμίμο απμηεθμφκηαζ απυ ηαηάθμζπα ηςκ εθίηςκ Μ2 ηςκ οπμιμκάδςκ. [Σνμπμπμζδιέκμ απυ (Changeux 1993)]. Κάεε οπμιμκάδα ηςκ ΠΥΚΗ απμηεθείηαζ απυ έκα ιεβάθμ ελςηοηηανζηυ ηιήια (ECD, Extracellular Domain) ζημ αιζκμηεθζηυ άηνμ, ιεβέεμοξ αιζκμλέςκ, 4 δζαιειανακζηέξ α-έθζηεξ (Μ1-Μ4) αιζκμλέςκ, ιζα εκδμηοηηανζηή εδθζά ιήημοξ αιζκμλέςκ ηαζ ηέθμξ ζημ ηαναμλοηεθζηυ άηνμ, έκα ιζηνυ ελςηοηηανζηυ ηιήια ιήημοξ 4-28 αιζκμλέςκ. Υαναηηδνζζηζηέξ δμιέξ ημο ECD είκαζ δ αιζκμηεθζηή α-έθζηα, μ εφθαηαξ πνυζδεζδξ ημο κεονμδζααζααζηή, ηαεχξ ηαζ δ ηοζηεσκζηή εδθζά (Cys-loop), δ μπμία απμηεθείηαζ απυ 13 πενίπμο ζοκηδνδιέκα αιζκμλέα ηα μπμία ανίζημκηαζ ακάιεζα ζε δομ ηοζηεΐκεξ πμο ζπδιαηίγμοκ δζζμοθθζδζηυ δεζιυ. Ζ δμιή ηοζηεσκζηήξ εδθζάξ είκαζ ημζκή ζε υθεξ ηζξ ηφπμο α οπμιμκάδεξ ηςκ ΠΥΚΗ ηα μπμία μκμιάγμκηαζ βζ αοηυ ημ θυβμ ηαζ οπμδμπείξ ηοζηεσκζηήξ εδθζάξ (Cys-loop receptors). Σα εζςηενζηά ημζπχιαηα ημο ηακαθζμφ ζπδιαηίγμκηαζ απυ ηαηάθμζπα ηςκ Μ2 α- 9

10 εθίηςκ ηαζ απυ ηζξ πέκηε οπμιμκάδεξ. Σα ηαηάθμζπα αοηά ηαεμνίγμοκ ηαζ ηδκ εηθεηηζηυηδηα ημο ηακαθζμφ απέκακηζ ζηα ζυκηα (Gotti & Clementi 2004; Kalamida et al. 2007; Tsetlin, Kuzmin & Kasheverov 2011). Σα ηεθεοηαία πνυκζα έπμοκ ακαηαθοθεεί ΠΥΚΗ ηαζ ζε πνμηανοςηζημφξ μνβακζζιμφξ υπςξ μζ Erwinia chrysanthemi ηαζ Gleobacter violaceus ηα μπμία μκμιάγμκηαζ ELIC ηαζ GLIC ακηζζημίπςξ (Corringer et al. 2010). Σα ηακάθζα αοηά ακ ηαζ δεκ ηδκ ηοηηανμπθαζιαηζηή εδθζά, ηδ δμιή Cys-loop ηαζ ηδκ αιζκμηεθζηή α-έθζηα ζημ ECD, ειθακίγμοκ ορδθυ ααειυ μιμθμβίαξ ιε ηα ακηίζημζπα εοηανοςηζηά ΠΥΚΗ. Ο θοζζμθμβζηυξ ημοξ νυθμξ δεκ είκαζ αηυιδ ελαηνζαςιέκμξ, αθθά μφηε ηαζ μζ οπμηαηαζηάηεξ ημοξ, ιε ελαίνεζδ ηδκ GLIC ζηδκ μπμία έπεζ ανεεεί υηζ πνμζδέκμκηαζ πνςηυκζα. Δπίζδξ ζημ ίδζμ ηακάθζ έπεζ ανεεεί υηζ πνμζδέκμκηαζ βεκζηά ακαζζεδηζηά, πνάβια ημ μπμίμ παναηηδνίγεζ ηα ΠXKI (Nury et al. 2011). 10

11 Α.2. ΝΗΚΟΣΗΝΗΚΟΗ ΤΠΟΓΟΥΔΗ ΑΚΔΣΤΛΟΥΟΛΗΝΖ Απυ υθα ηα είδδ ηςκ ΠΥΚΗ πμο οπάνπμοκ, ιεβάθμ εκδζαθένμκ πανμοζζάγμοκ μζ κζημηζκζημί οπμδμπείξ αηεηοθμπμθίκδξ (nachr, nicotinic ACetylholine Receptors), ζδζαίηενα μζ ακενχπζκμζ, θυβς ηδξ ηαίνζαξ εέζδξ πμο ηαηέπμοκ ζημκ μνβακζζιυ ηαζ ηδξ εκδεπυιεκδξ ζηυπεοζήξ ημοξ ζε εεναπεοηζηέξ εθανιμβέξ. Πμθθά ηοηθμθμνμφκηα θάνιαηα ηαζ πμθθά πενζζζυηενα οπμρήθζα ημοξ ζημπεφμοκ. Παναδείβιαηα ηέημζςκ θανιάηςκ είκαζ ηα θάνιαηα βζα ηδ δζαημπή ημο ηαπκίζιαημξ, βζα ηδ εεναπεία ημο βθαοηχιαημξ ηαζ ηα ιομπαθανςηζηά, εκχ μθμέκα ηαζ αολάκεηαζ ημ εκδζαθένμκ βζα δδιζμονβία θανιάηςκ βζα κυζμοξ υπςξ Parkinson, Alzheimer ηαζ ηαηάεθζρδ. Ζ βκχζδ ηδξ ζηενεμδζαιυνθςζδξ αοηχκ ηςκ οπμδμπέςκ ιε ηδκ ηαθφηενδ δοκαηή ακάθοζδ, είκαζ ημ ηθεζδί βζα ημ ζπεδζαζιυ αβςκζζηχκ ηαζ ακηαβςκζζηχκ ορδθήξ εηθεηηζηυηδηαξ-δναζηζηυηδηαξ (Changeux & Taly 2008). Πένα απυ ημ εκδζαθένμκ βζα ηζξ εεναπεοηζηέξ δοκαηυηδηεξ πμο οπάνπμοκ, μζ nachr, πανμοζζάγμοκ ιεβάθμ ηαεανά ενεοκδηζηυ εκδζαθένμκ, ηαεχξ απμηεθμφκ ηαζ πνυηοπα ΠΥΚΗ. Ζ ηαεζένςζή ημοξ ςξ πνυηοπα έβζκε βζαηί ήηακ απυ ηα πνχηα ΠΥΚΗ πμο ιεθεηήεδηακ απυ ημκ Sir Henry Hallett Dale ημ 1914 (Tansey 2006) ηαεχξ ηαζ ηα πνχηα ηςκ μπμίςκ ακαθφεδηε δ δμιή (Unwin 1993). Ζ ένεοκα πάκς ζημοξ nachr λεηίκδζε ζηζξ ανπέξ ημο 20 μφ αζχκα ιε ημκ Sir Henry Dale, μ μπμίμξ ιεθέηδζε ηδκ επίδναζδ ηςκ αθηαθμεζδχκ κζημηίκδ ηαζ ιμοζηανίκδ, πάκς ζε δζαθυνςκ εζδχκ παναζηεοάζιαηα πμο έθενακ οπμδμπείξ αηεηοθμπμθίκδξ, δζαηνίκμκηάξ ημοξ ζε κζημηζκζημφξ ηαζ ιμοζηανζκζημφξ (Dale, 1914). Ζ πνχηδ δδιμζίεοζδ ιζαξ ζπεηζηά θεπημιενμφξ ιεθέηδξ ηδξ δμιήξ ΠΥΚΗ έβζκε πάκς ζε nachr απυ δθεηηνζηά υνβακα πμκδνζπεφμξ Torpedo californica (Unwin 1993). Οζ nachr ιπμνμφκ κα δζαηνζεμφκ ακάθμβα ιε ηα ηφηηανα ζηα μπμία εδνάγμκηαζ ηαηά ηακυκα, ζε ιοσημφ ηαζ κεονζημφ ηφπμο. ημοξ ιοσημφ ηφπμο nachr, 2 υιμζεξ οπμιμκάδεξ ηφπμο α ζοβηνμημφκ ηακάθζ ιαγί ιε άθθεξ ηνεζξ δζαθμνεηζηέξ, ιε ζημζπεζμιεηνία (α1) 2 α1(β/ε)δ. ημκ ακενχπζκμ μνβακζζιυ μζ οπμδμπείξ αοημί απακηχκηαζ ζηζξ κεονμιοσηέξ ζοκάρεζξ. Οζ κεονζημφ ηφπμο nachr, είηε απμηεθμφκηαζ απυ 5 υιμζεξ οπμιμκάδεξ ηφπμο α ιε ζημζπεζμιεηνία (α7-10) 5, είηε 2 οπμιμκάδεξ ηφπμο α ζοβηνμημφκ ηακάθζ ιαγί ιε ηνεζξ άθθεξ οπμιμκάδεξ ηφπμο α, ιε ζημζπεζμιεηνία (α2-6) 2 (α2-4) 3. ημκ ακενχπζκμ μνβακζζιυ μζ κεονζημφ ηφπμο nachr απακηχκηαζ ηονίςξ ζημ κεονζηυ ζφζηδια, αθθά έπμοκ ακζπκεοηεί ηαζ ζε ιδ κεονζηά ηφηηανα (Gahring & Rogers 2005). 11

12 Α.3 ΜΤΨΚΟΤ ΣΤΠΟΤ nachr Οζ ιοσημφ ηφπμο nachr ζημκ ακενχπζκμ μνβακζζιυ εδνάγμκηαζ ζηζξ κεονμιοσηέξ ζοκάρεζξ ηαζ μ νυθμξ ημοξ είκαζ κα ιεηαηνέπμοκ ηζξ κεονζηέξ εηθφζεζξ αηεηοθμπμθίκδξ ζε νμή ζυκηςκ ηαζ εηπυθςζδ ζημοξ παναηείιεκμοξ ιφεξ. Οζ ιοσημφ ηφπμο nachr δεκ πανμοζζάγμοκ ηδκ πμζηζθυηδηα ηςκ κεονζημφ ηφπμο αθθά έπμοκ δομ ηφπμοξ. Ο έκαξ ηφπμξ απακηάηαζ ηαηά ηδκ ειανοσηή γςή ηαζ ζηδ ζοκέπεζα δίκεζ ηδ εέζδ ημο ζημκ εκήθζημ ηφπμ (Kalamida et al. 2007). ημοξ ειανοζημφ ηφπμο ιοσημφξ nachr δ ζημζπεζμιεηνία ηςκ οπμιμκάδςκ είκαζ (α1) 2 α1βδ (Conti-Tronconi & Raftery 1982; Raftery et al. 1980) εκχ ζημκ εκήθζημ ηφπμ είκαζ (α1) 2 α1εδ (Martinou & Merlie 1991; Mishina et al. 1986). Ζ εέζδ πνυζδεζδξ ηδξ αηεηοθμπμθίκδξ δδιζμονβείηαζ ηονίςξ απυ ημ ελςηοηηανζηυ ηιήια (ECD) ηδξ α1 οπμιμκάδαξ ηαζ ζοιπθδνςιαηζηά απυ ηδ δζπθακή ηδξ οπμιμκάδα (Corringer, Le Novère & Changeux 2000). Ζ βεζηκίαζδ ηςκ δομ α1 οπμιμκάδςκ ημο ιοσημφ οπμδμπέα ιε δζαθμνεηζημφ ηφπμο οπμιμκάδεξ δδιζμονβεί δομ εέζεζξ πνυζδεζδξ ηδξ αηεηοθμπμθίκδξ ιε δζαθμνεηζηή ζοββέκεζα (Miyazawa et al. 1999; Sine et al. 1995). Πένακ ηδξ α1 οπμιμκάδαξ, μζ οπυθμζπεξ οπμιμκάδεξ ημο ιοσημφ ηφπμο nachr ζοκεζζθένμοκ ηαζ αοηέξ ζηδ θεζημονβζηυηδηα ημο οπμδμπέα. Γζα πανάδεζβια δ α1 οπμιμκάδα έπεζ δεζπεεί υηζ ιεηαλφ άθθςκ ζοιιεηέπεζ ηαζ ζηδ ζοβηέκηνςζδ ηςκ οπμδμπέςκ ζηδ κεονμιοσηή ζφκαρδ (Wheeler et al. 1994), εκχ δ θςζθμνοθίςζδ ηςκ β οπμιμκάδςκ ηαζ δ βθοημγοθίςζδ ηςκ δ αολάκμοκ ηδκ απυδμζδ ηδξ ζοβηνυηδζδξ ηςκ οπμιμκάδςκ ζε οπμδμπέα (Green, Ross & Claudio 1991; Ramanathan & Hall 1999). Ζ ιεηάπηςζδ απυ ηδκ έηθναζδ ημο ειανοσημφ ηφπμο ιοσημφ οπμδμπέα ζηδκ έηθναζδ ημο εκήθζημο ηφπμο, δδθαδή απυ ηδκ β οπμιμκάδα ζηδκ ε, θαιαάκεζ πχνα ζε εθάπζζηεξ ιένεξ ζηζξ κεονμιοσηέξ ζοκάρεζξ ηςκ ηαπέςκ ιοσηχκ ζκχκ, οπμδεζηκφμκηαξ υηζ δ εκενβμπμίδζδ ημο βμκζδίμο ηδξ ε οπμιμκάδαξ, πζεακυηαηα απυ ηδκ έκανλδ ηδξ κεονζηήξ δναζηδνζυηδηαξ, πνμηαθεί απεκενβμπμίδζδ ημο βμκζδίμο ηδξ β. Ζ β οπμιμκάδα ζοκεπίγεζ κα εηθνάγεηαζ ζε πμθφ ιζηνυηενμ πμζμζηυ ηαζ ζηδκ εκήθζηδ γςή (Missias et al. 1996). Γζάθμνεξ ιεηαθθάλεζξ ζε βμκίδζα πμο ηςδζημπμζμφκ ιοσημφ ηφπμο nachr ιπμνεί κα πνμηαθέζμοκ αθάαεξ υπςξ πνυςνμ ηενιαηζζιυ ηδξ ιεηάθναζδξ ή κα ειπμδίζμοκ ηδ ζοβηνυηδζδ ημο οπμδμπέα. Σέημζεξ ιεηαθθάλεζξ πμο αθμνμφκ ηδκ ε οπμιμκάδα 12

13 ζοκήεςξ ακηζζηαειίγμκηαζ απυ αολδιέκδ έηθναζδ ηδξ ειανοσηήξ β οπμιμκάδαξ. Δπακειθάκζζδ ημο ειανοσημφ ηφπμο ιοσημφ οπμδμπέα παναηδνείηαζ ζοπκά ζε ηαηαζηάζεζξ πνυκζαξ κεονμβεκμφξ ή ιομβεκμφξ θθεβιμκήξ, αθθά ιυκμ ζε ιφεξ ηφπμο Η (slow switch ή red) (Gattenlöhner et al. 2002). οκμπηζηά μζ ιοσημί nachr είκαζ ειανοσημφ ή εκήθζημο ηφπμο, ακάθμβα ιε ηδ θάζδ ακάπηολδξ ημο μνβακζζιμφ, αθθά μ ειανοσηυξ ηφπμξ ιπμνεί κα λακαηάκεζ ηδκ ειθάκζζή ημο ζε παεμθμβζηέξ ηαηαζηάζεζξ υπςξ θθεβιμκή ή εθαηηςιαηζηή ε οπμιμκάδα. Δπίζδξ υπςξ ηαζ ζε υθμοξ ημοξ nachr, δ α οπμιμκάδα παίγεζ ημκ ζπμοδαζυηενμ νυθμ ζημκ οπμδμπέα, αθθά ηαζ μζ οπυθμζπεξ οπμιμκάδεξ ζοκεζζθένμοκ ηαζ αοηέξ ζηδ θεζημονβζηυηδηα ημο ηακαθζμφ. Α.4. ΝΔΤΡΗΚΟΤ ΣΤΠΟΤ nachr Οζ κεονζημφ ηφπμο nachr παίγμοκ ηονίανπμ νυθμ ζηδ ιεηαβςβή ζήιαημξ ζημ πενζθενζηυ κεονζηυ ζφζηδια (Ullian, McIntosh & Sargent 1997; Zhang, Coggan & Berg 1996), εκχ ζημ ηεκηνζηυ κεονζηυ ζφζηδια θαίκεηαζ κα δζαδναιαηίγμοκ έκα νυθμ πενζζζυηενμ νοειζζηζηυ-ηνμπμζδηζηυ (Changeux et al. 1998). Διπθέημκηαζ ζε πμθθέξ παεήζεζξ ημο ΚΝ, υπςξ δ κυζμξ ημο Alzheimer (Parri, Hernandez & Dineley 2011), δ ζπζγμθνέκζα (Kalamida et al. 2007), δ επζθδρία (Steinlein & Bertrand 2010) ηαζ δ ηαηάεθζρδ (Mineur & Picciotto 2010). Νεονζημφ ηφπμο nachr έπμοκ επίζδξ ακαηαθοθεεί ηαζ ζε ιδ κεονζηά ηφηηανα, ηα μπμία ειπθέημκηαζ ζε κυζμοξ υπςξ δ θθεβιμκή, δ αββεζμβέκεζδ (Arias et al. 2009) ηαζ μ ηανηίκμξ (Egleton, Brown & Dasgupta 2008). Οζ κεονζημφ ηφπμο nachr ανίζημκηαζ ζε υθμ ημ ΚΝ ηαζ ηα βάββθζα. Δηθνάγμκηαζ ηυζμ ζε κεονζηά-δζεβένζζια ηφηηανα υζμ ηαζ ζε ιδ δζεβένζζια, υπςξ είκαζ ηα επζεδθζαηά ηαεχξ ηαζ ζε ηφηηανα ημο ακμζμπμζδηζημφ. Μέπνζ ζηζβιήξ έπμοκ ηθςκμπμζδεεί εκκέα α (α2-α10) ηαζ ηνεζξ α (α2-α4) κεονζημφ ηφπμο οπμιμκάδεξ. Οζ α7-α10 κεονζηέξ οπμιμκάδεξ απακηχκηαζ ηονίςξ ζε μιμπεκηαιενή ιμνθή, αθθά ηαζ ζε εηενμπεκηαιενή (α7/α8 ηαζ α9/α10). Οζ α2-α6 ηαζ α2-α4 ζπδιαηίγμοκ εηενμπεκηαιενή ηακάθζα πμο απμηεθμφκηαζ απυ 2 α-οπμιμκάδεξ ηαζ 3 α. Οζ α5 ηαζ α3 οπμιμκάδεξ δεκ ιπμνμφκ κα ζπδιαηίζμοκ θεζημονβζηά ηακάθζα υηακ εηθνάγμκηαζ είηε λεπςνζζηά είηε ηαζ μζ δφμ ιαγί ηαζ βζα κα ζπδιαηίζμοκ θεζημονβζηά ηακάθζα απαζηείηαζ 13

14 κα εηθνάγμκηαζ ιαγί ιε άθθεξ θεζημονβζηέξ οπμιμκάδεξ. Γζα ημ θυβμ αοηυ θέβμκηαζ ηαζ μνθακέξ οπμιμκάδεξ (Gotti et al. 2007; Plazas et al. 2005). Κμζκυ παναηηδνζζηζηυ ηςκ μιμπεκηαιενχκ κεονζημφ ηφπμο οπμδμπέςκ είκαζ δ ορδθή ζοββέκεζά ημοξ ιε ηδκ α-ιπμοβηανμημλίκδ (α-bgtx). Ο ηονζυηενμξ ηφπμξ απυ ημοξ μιμπεκηαιενείξ οπμδμπείξ είκαζ μ (α7) 5. ημκ εβηέθαθμ απακηάηαζ ζδζαίηενα ζημ θθμζυ, ζημκ ζππυηαιπμ, ηαζ ηζξ οπμθθμζχδεζξ ιεηαζπιζαηέξ πενζμπέξ (Picciotto et al. 2001). Ο οπμδμπέαξ αοηυξ είκαζ πενζζζυηενμ άθεμκμξ ζημκ εβηέθαθμ ηςκ πνςηεουκηςκ εδθαζηζηχκ ζε ζπέζδ ιε ημκ εβηέθαθμ άθθςκ εζδχκ, πνάβια πμο ιπμνεί κα ζπεηίγεηαζ ηαζ ιε ηζξ ορδθυηενεξ κμδηζηέξ ζηακυηδηεξ ηςκ πνχηςκ (Han et al. 2000; Ishii, Wong & Sumikawa 2005). Όηακ μ (α7) 5 οπμδμπέαξ ανίζηεηαζ πνμζοκαπηζηά (Jones, I. W. & Wonnacott 2004) πονμδμηεί ηδκ απεθεοεένςζδ βθμοηαιζκζημφ. Όηακ πάθζ ανίζηεηαζ ιεηαζοκαπηζηά ή πάκς ζημ ζχια ημο κεονχκα ζοκήεςξ πνμηαθεί ιαηνμπνυκζεξ επζδνάζεζξ, υπςξ δ έηθναζδ βμκζδίςκ ή δ ηνμπμπμίδζδ ιεηααμθζηχκ ιμκμπαηζχκ, ιέζς ηδξ ζηακυηδηάξ ημο κα άβεζ Ca 2+ (Barik & Wonnacott 2006; Gotti, Zoli & Clementi 2006). Απυ ημοξ εηενμπεκηαιενείξ nachr μ ηονζυηενμξ οπμδμπέαξ είκαζ μ α4α2. Όπςξ ηαζ υθμζ μζ εηενμπεκηαιενείξ κεονζημφ ηφπμο nachr μ α4α2 οπμδμπέαξ έπεζ πμθφ ορδθή ζοββέκεζα ιε ημοξ ιζηνμφ ιμνζαημφ αάνμοξ (ΜΒ) κζημηζκζημφξ οπμηαηαζηάηεξ, αθθά δεκ πνμζδέκεζ α-bgtx (Picciotto et al. 2001). Ο α4α2 nachr απακηάηαζ ζε υθμ ημκ εβηέθαθμ αθθά ζε μνζζιέκεξ πενζμπέξ ημο εβηεθάθμο υπςξ ζημ νααδςηυ ζχια ηαζ ζημ θθμζυ, έκαξ οπμπθδεοζιυξ πενζέπεζ ηαζ ηδκ α5 οπμιμκάδα. ημ νααδςηυ ζχια μ α4α2 nachr εδνάγεηαζ ηυζμ ζε κημπαιζκενβζημφξ υζμ ηαζ ζε ιδ κημπαιζκενβζημφξ κεονχκεξ εκχ μ α4α5α2 οπυηοπμξ εηθνάγεηαζ εζδζηά ζε ηενιαηζημφξ κημπαιζκενβζημφξ (Zoli et al. 2002). Ο α4α2 nachr επδνεάγεζ ηαζ ηδκ έηθοζδ GABA απυ κεονχκεξ ημο εαθάιμο ηαζ επίζδξ εδνάγεηαζ ζε GABAενβζημφξ κεονχκεξ μζ μπμίμζ κεονχκμοκ κημπαιζκενβζημφξ ζηδκ ημζθζαηή πενζμπή ηδξ ηαθφπηναξ (VTA) (Sher et al. 2004). ημκ εβηεθαθζηυ θθμζυ απακηάηαζ επίζδξ ηαζ μ οπυηοπμξ α2α4α2 (Gotti et al. 2005). Ο οπυηοπμξ α3α2 ακζπκεφεηαζ ζημ μπηζηυ ιμκμπάηζ (Gotti et al. 2005), εκχ μ α3α4 ζηδκ επίθοζδ (Hernandez et al. 2004) αθθά ηαζ ζημκ οπμεάθαιμ υπμο ειπθέηεηαζ ζηδκ έηθοζδ κμναδνεκαθίκδξ (Luo et al. 1998). Σέθμξ μζ οπυηοπμζ α6α4α2α3 ηαζ α6α2α3 έπμοκ ακζπκεοεεί ζημ νααδςηυ ζχια (Champtiaux et al. 2003; Zoli et al. 2002) ηαζ ζημ κςηζαίμ ιοεθυ (Gotti et al. 2005). Όπςξ θάκδηε παναπάκς μζ κεονζημφ ηφπμο nachr πανμοζζάγμοκ πμθφ ιεβαθφηενδ πμζηζθία ζε ζπέζδ ιε ημοξ ιοσημφ ηφπμο οπμδμπείξ, παίγμοκ ζδιακηζημφξ 14

15 νυθμοξ ζημ ηεκηνζηυ ηαζ ζημ πενζθενζηυ κεονζηυ ζφζηδια ηαζ ειπθέημκηαζ ζε πμθθέξ παεήζεζξ κεονζημφ ζοζηήιαημξ. Οζ πανμφζα ιεθέηδ εα εζηζαζηεί ζημκ α4α2 κεονζημφ ηφπμο nachr. Δηθόλα 3. Ζ θαηαλνκή ησλ nachr ζηνλ εγθέθαιν ησλ ηξσθηηθώλ. Ζ ηαηακμιή ηςκ ηονζυηενςκ ηφπςκ nachr ζημκ εβηέθαθμ ηςκ ηνςηηζηχκ, υπςξ έπμοκ πανημβναθδεεί ιε ηεπκζηέξ πνυζδεζδξ ναδζμεπζζδιαζιέκςκ πνμζδεηχκ, ιμκμηθςκζηχκ ακηζζςιάηςκ, in situ οανζδμπμίδζδξ, ηαεχξ επίζδξ ηαζ PCR, ζε ζζημφξ ΚΝ ηυζμ άβνζμο ηφπμο, υζμ ηαζ knockout πμκηζηχκ [Σνμπμπμζδιέκμ απυ (Gotti, Zoli & Clementi 2006)]. Δηθόλα 4. Ζ θαηαλνκή ησλ nachr ζην νπηηθό κνλνπάηη ησλ ηξσθηηθώλ. Ζ ηαηακμιή ηςκ ηονζυηενςκ ηφπςκ nachr πμο απακηχκηαζ ζημ αιθζαθδζηνμεζδή ηαζ ηζξ πνμαμθέξ ημο ζημκ έλς βμκαηχδδ πονήκα ηαζ ζημ άκς δζδφιζμ ηςκ ηνςηηζηχκ [Σνμπμπμζδιέκμ απυ (Gotti et al. 2007)]. 15

16 Α.5 Ζ ΣΡΗΣΟΣΑΓΖ ΚΑΗ Ζ ΣΔΣΑΡΣΟΣΑΓΖ ΓΟΜΖ ΣΧΝ nachr Ζ ηνζημηαβήξ ηαζ δ ηεηανημηαβήξ δμιή ηςκ nachr πνμζδζμνίζηδηε ανπζηά ιε δθεηηνμκζηή ιζηνμζηυπδζδ nachr δθεηηνζηχκ μνβάκςκ πμκδνζπεφμξ Torpedo californica (Unwin 1993) ηαζ ανβυηενα απυ ημκ πνμζδζμνζζιυ ηςκ ηνοζηαθθζηχκ δμιχκ ηδξ πνςηεΐκδξ πμο πνμζδέκεζ αηεηοθμπμθίκδ (AChBP, Achetylcholine Binding Protein) ημο ζαθζβηανζμφ Limnaea stagnalis (Brejc et al. 2001) ηαεχξ ηαζ άθθςκ AChBPs, ηδξ α1 οπμιμκάδαξ ημο ιοσημφ οπμδμπέα πμκηζημφ (Dellisanti et al. 2007) ηαζ ηεθεοηαία ηδξ πζιαζνζηήξ ακενχπζκδξ α7 ECD- Limnaea stagnalis AChBP (Li et al. 2011). Ζ ηεθεοηαία ηνοζηαθθζηή δμιή είκαζ ηαζ δ πζμ εκδζαθένμοζα υζμκ αθμνά ημοξ κεονζημφ ηφπμο nachr, ηαεχξ αθεκυξ έπεζ 71% μιμζυηδηα ιε ημκ ακενχπζκμ α7 οπμδμπέα ηαζ αθεηένμο ζοβηνμηεί πεκηαιενέξ ηακάθζ. Σα απμηεθέζιαηα υθςκ ηςκ ακςηένς ιεθεηχκ δείπκμοκ υηζ μζ nachr είκαζ ζοιιεηνζηά πεκηαιενή ηακάθζα ιε ηζξ οπμιμκάδεξ ημοξ κα είκαζ δζαηεηαβιέκεξ βφνς απυ έκακ άλμκα ζοιιεηνίαξ, υπςξ ηα θηενά ημο ακειυιοθμο, επζηαθφπημκηαξ εκ ιένεζ δ ιζα ηδκ άθθδ. Κάεε οπμιμκάδα nachr έπεζ ιζα α-έθζηα ζημ αιζκμηεθζηυ ηδξ άηνμ ηαζ έκακ οδνυθμαμ πονήκα βφνς απυ ημκ μπμίμ ακαδζπθχκεηαζ. Ο οδνυθμαμξ πονήκαξ απμηεθείηαζ απυ 10 α-θφθθα (α 1 -α 10 ) ηα μπμία ζοβηνμημφκηαζ ζε δομ παηέηα πμο ζοκδέμκηαζ ιε έκακ δζζμοθθζδζηυ δεζιυ ζπδιαηίγμκηαξ ιζα ιεβαθφηενδ δμιή (αsandwich). ηδκ πενζμπή ημο α-sandwich ανίζημκηαζ ηαηάθμζπα ηα μπμία ζοιιεηέπμοκ ζηδ δδιζμονβία ημο εφθαηα δέζιεοζδξ αηεηοθμπμθίκδξ πενίπμο 40 Å πάκς απυ ηδκ επζθάκεζα ηδξ ιειανάκδξ ημο ηοηηάνμο. Λυβς ηδξ εέζδξ ημοξ, ηα ηαηάθμζπα αοηά είκαζ ζε εέζδ κα ηνμπμπμζμφκ δναζηζηά ηδ ζηενεμδμιή ηςκ ηακαθζχκ ιε ηδκ πνυζδεζδ οπμηαηαζηάηδ (Brejc et al. 2001). Ο εφθαηαξ πνυζδεζδξ αηεηοθμπμθίκδξ ζπδιαηίγεηαζ απυ δομ βεζημκζηέξ οπμιμκάδεξ εη ηςκ μπμίςκ δ ιζα είκαζ οπμπνεςηζηά ηφπμο α. Απμηεθείηαζ απυ ημ ηφνζμ ιένμξ, πμο είκαζ ηαζ ημ ιεβαθφηενμ ηαεχξ ηαζ απυ ημ ζοιπθδνςιαηζηυ ιένμξ. Ζ α οπμιμκάδα πενζέπεζ ημ ιεβαθφηενμ πμζμζηυ ηςκ αιζκμλέςκ ημο εφθαηα ηαζ βζ αοηυ μκμιάγεηαζ ιείγςκ οπμιμκάδα, εκχ δ βεζημκζηή ηδξ πενζέπεζ ηα οπυθμζπα αιζκμλέα πμο απανηίγμοκ ημκ εφθαηα ηαζ βζ αοηυ μκμιάγεηαζ ζοιπθδνςιαηζηή οπμιμκάδα. Οζ μιμπεκηαιενείξ nachr έπμοκ πέκηε ζζμδφκαιεξ εέζεζξ δέζιεοζδξ εκχ μζ εηενμπεκηαιενείξ δφμ (Arias 2000; Corringer, Le Novère & Changeux 2000). Ζ ιείγςκ οπμιμκάδα ζοκεζζθένεζ ιε ηαηάθμζπα απυ ηζξ εδθζέξ Α, Β ηαζ C εκχ δ ζοιπθδνςιαηζηή ιε ηαηάθμζπα απυ ηζξ εδθζέξ D, E ηαζ F (Sine 2002; Unwin et al. 16

17 2002). Οζ εδθζέξ A, B, C, ηαζ D θένμοκ έκακ ανζειυ ορδθά ζοκηδνδιέκςκ ανςιαηζηχκ ηαηαθμίπςκ απυ ηα μπμία ζδζαίηενμ νυθμ παίγμοκ ηα ηαηάθμζπα ηονμζίκδξ πμο ζοκδέμκηαζ εοεέςξ ιε ημ ιυνζμ ηδξ αηεηοθμπμθίκδξ (Breese et al. 1997; Fu & Sine 1994; Galzi et al. 1991; Galzi et al. 1990; Kao & Karlin 1986). Οζ πθμφζζεξ ζε δθεηηνυκζα πθεονζηέξ μιάδεξ ηςκ ηονμζζκχκ ηάκμοκ αθθδθεπζδνάζεζξ ηφπμο π- ηαηζυκημξ ιε ημ εεηζηά θμνηζζιέκμ ζυκ ημο ηεηανημηαβμφξ αιιςκίμο ηδξ αηεηοθμπμθίκδξ (Fu & Sine 1994), εκχ ηα ζοκηδνδιέκα ηαηάθμζπα αζπανηζημφ μλέμξ ζηζξ εδθζέξ B ηαζ C ηδξ ηφνζαξ οπμιμκάδαξ, ζηαεενμπμζμφκ αηυια πενζζζυηενμ ημ αιιςκζαηυ ζυκ ιέζς δθεηηνμζηαηζηχκ αθθδθεπζδνάζεςκ. Πάθζ ζημκ εφθαηα δέζιεοζδξ αηεηοθμπμθίκδξ, ηάπμζα ηαηάθμζπα ηδξ εδθζάξ C θαίκεηαζ κα ηδκ ζοβηναημφκ ιε ηδ εδθζά F ηδξ ίδζαξ οπμιμκάδαξ. Ζ ανβζκίκδ 179 έθηεηαζ δθεηηνμζηαηζηά απυ ηδκ Glu 181 ηαζ ηδκ Asp 153 ηδξ εδθζάξ F ηαζ επίζδξ ηάκεζ δεζιυ οδνμβυκμο ιε ηδκ Gln 155. Ζ Asp 153 αθθδθεπζδνά ιε δεζιυ οδνμβυκμο ιε ηδκ Thr 28 απυ ημ α 1 -θφθθμ, εκχ δ Gln 155 αθθδθεπζδνά ιε δεζιμφξ van der Waals ιε ηδκ ηονμζίκδ 30. Van der Waals δεζιμί ακαπηφζζμκηαζ επίζδξ ιεηαλφ ηδξ ιεεεζμκίκδξ 156 ζηδ εδθζά F ιε ηδ θοζίκδ 178 ηαζ ηδκ ανβζκίκδ 179 (Osaka, Sugiyama & Taylor 1998; Sugiyama, Boyd & Taylor 1996). Δηθόλα 5. Ζ ηξηηνηαγήο δνκή κηαο ηππηθήο ππνκνλάδαο nachr. Απμηεθείηαζ απυ ημ ελςηοηηανζηυ ηιήια (ECD), ημ δζαιειανακζηυ ηαζ ηδκ ηοηηανμπθαζιαηζηή εδθζά. ημ ECD δζαηνίκεηαζ δ α-έθζηα ζημ αιζκμηεθζηυ άηνμ (α1), ηα δέηα α- θφθθα (α1-α10), ηοζηεσκζηή εδθζά, ηαεχξ ηαζ μζ εδθζέξ (A-F) ηαζ α1-α1. Σμ δζαιειανακζηυ ηιήια απμηεθείηαζ απυ 4 οδνυθμαεξ α-έθζηεξ (Μ1-Μ4) εκχ δ ηοηηανμπθαζιαηζηή εδθζά δεκ οζμεεηεί ζοβηεηνζιέκδ δζαιυνθςζδ [Σνμπμπμζδιέκμ απυ (Unwin 2005)]. 17

18 Δηθόλα 6. Ζ θξπζηαιιηθή δνκή ηεο α7-achbp θαη ζύγθξηζή ηεο κε άιιεο αλάινγεο δνκέο. (α) Σμ μιμπεκηαιενέξ ηδξ α7-achbp (Οζ πέκηε οπμιμκάδεξ απεζημκίγμκηαζ ιε δζαθμνεηζηυ πνχια). (β) Τπένεεζδ δζιενμφξ ηδξ α7 AChBP (ιπθε) πάκς ζε δζιενέξ ηδξ AChBP (πμνημηαθί). (γ) Τπένεεζδ ηδξ οπμιμκάδαξ ηδξ α7 AChBP (ιπθε) πάκς ζε οπμιμκάδεξ ηδξ AChBP (πμνημηαθί) ηαζ ηδξ α1 πμκηζημφ (ιςα). (δ) Απεζηυκζζδ ηδξ επζθάκεζαξ δζιενμφξ ηδξ α7 AChBP. Σα ηαηάθμζπα ημο ακενχπζκμο α7 nachr απεζημκίγμκηαζ ιε ιπθε εκχ ηα ακηίζημζπα ηδξ AChBP ιε πνοζυ πνχια. (ε) Τπένεεζδ ηδξ δζαιυνθςζδξ ηδξ α7 AChBP πανμοζία (ιπθε) ηαζ απμοζία (πνοζυ) αβςκζζηή. Ζ εκημκυηενδ αθθαβή παναηδνείηαζ ζηδ εδθζά C, δ μπμία οζμεεηεί ηδκ ηθεζζηή ηαζ ηδκ ακμζηηή δζαιυνθςζδ ακηίζημζπα. [Σνμπμπμζδιέκμ απυ (Li et al. 2011)]. 18

19 Α.6. ΑΛΛΑΓΔ ΠΟΤ ΔΠΑΓΟΝΣΑΗ ΣΖ ΣΔΡΔΟΓΟΜΖ ΣΧΝ nachr ΑΠΟ ΣΖΝ ΠΡΟΓΔΖ ΑΓΧΝΗΣΧΝ Ζ πνυζδεζδ ηςκ αβςκζζηχκ βίκεηαζ ιέζς ηαηαθμίπςκ πμο ανίζημκηαζ ζηζξ εδθζέξ Α-C ζηδκ ιείγμκα οπμιμκάδα ηαζ D-F ζηδ ζοιπθδνςιαηζηή. Οζ πζμ ζδιακηζηέξ ιεηαημπίζεζξ πμο ζοιααίκμοκ ιε ηδκ πνυζδεζδ αβςκζζηή ζε έκακ nachr θαιαάκμοκ πχνα ζηδ εδθζά C. Μζηνυηενδξ έηηαζδξ αθθαβέξ ζοιααίκμοκ ζηζξ εδθζέξ α 1 -α 1, Α, Β, F ηαζ ζηα α-θφθθα 7, 9 ηαζ 10. Αοηέξ μζ ιεηαημπίζεζξ αενμζζηζηά μδδβμφκ ζε ιζα δελζυζηνμθδ πενζζηνμθή ημο ελςηενζημφ α-θφθθμο, εκχ μζ εδθζέξ α 1 -α 1, Α, Β ηαζ C πενζζηνέθμκηαζ ανζζηενυζηνμθα. Ζ ιεηαηυπζζδ ημο ελςηενζημφ α-θφθθμο ζοκμδεφεηαζ ιε ακαδζάηαλδ ημο πονήκα ηςκ α-θφθθςκ έηζζ χζηε δ θαζκοθαθακίκδ 196 κα ιεηαημπζζηεί ηαζ κα θάαεζ ηδ δζαηνζηή εέζδ πμο ηαηέπεζ πανμοζία αβςκζζηή. Καηάθμζπα θαζκοθαθακίκδξ ή ηονμζίκδξ απακηχκηαζ ζε υθεξ ηζξ α- οπμιμκάδεξ ηςκ nachr ζε εέζεζξ μιυθμβεξ ηδξ θαζκοθαθακίκδξ 196. ε ακηίεεζδ ιε ημ ελςηενζηυ, ημ εζςηενζηυ α-θφθθμ δεκ ιεηαημπίγεηαζ απυ ηδκ πνυζδεζδ αβςκζζηή (Li et al. 2011). Ζ ακαδζάηαλδ ηδξ δμιήξ ηςκ nachr ιεηά απυ πνυζδεζδ αβςκζζηή λεηζκά απυ ηδ ιεηαηυπζζδ ηςκ ηαηαθμίπςκ πμο ανίζημκηαζ ζημ εφθαηα πνυζδεζδξ αηεηοθμπμθίκδξ δ μπμία ζοκμδεφεηαζ απυ ηζξ ιεηαημπίζεζξ ηαηαθμίπςκ ζηζξ εδθζέξ A, B, C ηαζ F. Οζ πζμ έκημκεξ ιεηαημπίζεζξ πμο ζοιααίκμοκ ζημ εφθαηα πνυζδεζδξ αηεηοθμπμθίκδξ είκαζ ηδξ ηονμζίκδξ 184 ζηδ εδθζά C ηαζ ηδξ ηονμζίκδξ 91 ζηδ εδθζά Α, μζ μπμίεξ ζηαεενμπμζμφκ ημ ηεηανημηαβέξ άγςημ ημο αβςκζζηή ιαγί ιε ηδ ηνοπημθάκδ 145 απυ ηδ εδθζά Β, ηδκ ηονμζίκδ 191 απυ ηδ εδθζά C ηαζ ηδ ηνοπημθάκδ 53 απυ ηδ εδθζά D. Ζ ηνοπημθάκδ 53 απμηηά δζάθμνεξ δζαιμνθχζεζξ απμοζία αβςκζζηή, αθθά ιυκμ ιζα πανμοζία αβςκζζηή. Οιμίςξ δ θοζίκδ 141 απμοζία αβςκζζηή δεκ θαιαάκεζ ζοβηεηνζιέκδ εέζδ, εκχ πανμοζία ημο ζηαεενμπμζείηαζ. Δπίζδξ απμοζία αβςκζζηή δ ανβζκίκδ 182 θαίκεηαζ κα ιπμνεί κα απμηηήζεζ δομ ζζμδφκαιεξ δζαιμνθχζεζξ. ηδ ιζα αθθδθεπζδνά ιε ημκ ανςιαηζηυ δαηηφθζμ ηδξ ηονμζίκδξ 184 ηαζ ζηδκ άθθδ ιε ηδ θοζίκδ 141. Πανμοζία αβςκζζηή αθθδθεπζδνά απμηθεζζηζηά ιε ηδκ ηονμζίκδ 184 (Li et al. 2011). Καηάθμζπα πμο ζπεηίγμκηαζ ιε ηδ εδθζά C θαίκεηαζ κα είκαζ ζδιακηζηά βζα ηδ θεζημονβζηυηδηα ημο οπμδμπέα. Απμοζία αβςκζζηή ημ βθμοηαιζηυ μλφ 185 απυ ηδ εδθζά C ηδξ ιείγμκμξ οπμιμκάδαξ είκαζ ζηναιιέκμ πνμξ ημ βθμοηαιζηυ μλφ 158 ηαζ ημ αζπανηζηυ μλφ 160 ηδξ εδθζάξ F ηδξ ζοιπθδνςιαηζηήξ οπμιμκάδαξ, δδιζμονβχκηαξ έκακ εφθαηα ανκδηζηά θμνηζζιέκμ, εκχ δ βθοηάκδ πμο ανίζηεηαζ ζημ αζπανηζηυ μλφ 19

20 108 ηδξ ζοιπθδνςιαηζηήξ οπμιμκάδαξ δδιζμονβεί δεζιμφξ van der Walls ιε ημ δζζμοθθζδζηυ δεζιυ ιεηαλφ ηςκ ηοζηεσκχκ 186 ηαζ 187 ζηδ εδθζά C ηδξ ηφνζαξ οπμιμκάδαξ. Ο ζοκδοαζιυξ ημο ανκδηζηά θμνηζζιέκμο εφθαηα ηαζ ηδξ οδνυθζθδξ βθοηάκδξ ιπμνεί κα δδιζμονβήζεζ έκα ιζηνμπενζαάθθμκ πμο ζοκηεθεί ζηδ δέζιεοζδ ηδξ εεηζηά θμνηζζιέκδξ αηεηοθμπμθίκδξ (Li et al. 2011). Δηθόλα 7. Ο ζύιαθαο δέζκεπζεο αθεηπινρνιίλεο. (α) πδιαηζηή πανάζηαζδ ηςκ αιζκμλέςκ πμο έπμοκ ηαοημπμζδεεί υηζ ζοιιεηέπμοκ ζηδ δέζιεοζδ ηδξ αηεηοθμπμθίκδξ. (β) & (δ) Κνοζηαθθμβναθζηή δμιή ηδξ εέζδξ δέζιεοζδξ αηεηοθμπμθίκδξ πνμζδειέκδ ιε ημκ αβςκζζηή κζημηίκδ (γ) ιε ημκ ακηαβςκζζηή ιεεοθηαημκζηίκδ. Καζ ζηζξ δομ πενζπηχζεζξ μζ πνμζδέηεξ ηαθφπημκηαζ απυ ηζξ δομ οπμιμκάδεξ. Δπίζδξ δζαηνίκμκηαζ μζ δζαθμνεηζηέξ δζαιμνθχζεζξ πμο οζμεεηεί δ εδθζά C ζηδκ πενίπηςζδ πνυζδεζδξ αβςκζζηή Κθεζζηή (δ) ηαζ πνυζδεζδξ ακηαβςκζζηή Ακμζηηή (γ) [Σνμπμπμζδιέκμ απυ (Changeux & Taly 2008)]. 20

21 Δηθόλα 8. ύγθξηζε αλνηθηνύ θαη θιεηζηνύ nachr. Ζ πνυζδεζδ αβςκζζηή πνμηαθεί δζαιμνθςηζηέξ αθθαβέξ ζηδκ ηνζημηαβή ηαζ ηεηανημηαβή δμιή ηςκ nachr ιε απμηέθεζια ημ άκμζβια ημο ηακαθζμφ ζυκηςκ. (Α) Σεηανημηαβήξ δμιή ακμζηημφ ηαζ ηθεζζημφ οπμδμπέα (Β) Ακαπανάζηαζδ ηδξ ζηνμθήξ ηςκ οπμιμκάδςκ (πανζζηάκμκηαζ ιε ηοθίκδνμοξ) πμο θαιαάκεζ πχνα ιε ηδκ πνυζδεζδ αβςκζζηή (Γ) Σμ ηακάθζ πμο ζπδιαηίγμοκ ηα δζαιειανακζηά ηιήιαηα ηςκ οπμιμκάδςκ ακμζηηυ ηαζ ηθεζζηυ. Ο ηφηθμξ ζημ ηέκηνμ δείπκεζ ηδ δζαθμνά ζηδ δζάιεηνμ ημο ηακαθζμφ [Σνμπμπμζδιέκμ απυ (Changeux & Taly 2008)]. 21

22 Α.7. ΑΝΑΓΗΠΛΧΖ, ΤΓΡΟΣΖΖ ΚΑΗ ΔΝΓΟΚΤΣΣΑΡΗΚΖ ΜΔΣΑΦΟΡΑ ΣΧΝ nachr Ο ηφηθμξ γςήξ ηςκ nachr νοειίγεηαζ απυ πμθθμφξ πανάβμκηεξ, αθθά θαίκεηαζ πςξ ημ ημιαζηυ ζηάδζμ πμο ηαεμνίγεζ ημ ακ εα ιεηαθενεεί έκαξ ηαζκμφνβζμξ οπμδμπέαξ ζηδκ επζθάκεζα ημο ηοηηάνμο, είκαζ ημ ακ εα ζοβηνμηδεμφκ ζςζηά μζ οπμιμκάδεξ πμο ημκ απμηεθμφκ. Φοζζμθμβζηά ιυκμ μζ οπμιμκάδεξ πμο έπμοκ ζοβηνμηήζεζ ηέθεζα ηακάθζα ιεηαθένμκηαζ ζηδκ ηοηηανζηή επζθάκεζα, εκχ ζηδκ ακηίεεηδ πενίπηςζδ ηαηαηναημφκηαζ ζημ εκδμπθαζιαηζηυ δίηηομ (ER) ηαζ ζηδ ζοκέπεζα απμζημδμιμφκηαζ (St John 2009). Έκαξ ηνυπμξ ηαεμνζζιμφ βζα ημ ακ έκαξ nachr έπεζ ζοβηνμηδεεί ζςζηά ή υπζ, θαίκεηαζ κα πενζθαιαάκεζ έκα ιμηίαμ ζε ιζα ζοκηδνδιέκδ δζαιειανακζηή πενζμπή ηςκ nachr οπμιμκάδςκ (Wang, J. M. et al. 2002). Μεηάθθαλδ ημο ιμηίαμο αοημφ επέηνεπε ζε ιδ ζςζηά ζπδιαηζζιέκμοξ οπμδμπείξ κα θηάκμοκ ζηδ ηοηηανζηή επζθάκεζα, εκχ δ εζζαβςβή ημο ιμηίαμο αοημφ ζε ιδ μιυθμβεξ πνςηεΐκεξ πμο ηακμκζηά ηαηαθήβμοκ ζηδκ ηοηηανζηή επζθάκεζα, πνμηαθμφζε ηδκ ηαηαηνάηδζή ημοξ ζημ ER. Φαίκεηαζ θμζπυκ υηζ ημ ιμηίαμ αοηυ ηαηαηναηεί ηζξ οπμιμκάδεξ ηςκ nachr ζημ ER, έςξ υημο ζοβηνμηήζμοκ θεζημονβζηά ηακάθζα ηαζ ημ ιμηίαμ ηνοθηεί ιέζα ζηδ δμιή ημο οπμδμπέα, δζαθμνεηζηά απμζημδμιμφκηαζ. Δπζπθέμκ μζ Keller ηαζ ζοκενβάηεξ ημ 2001, ακαηάθορακ υηζ ιεηαθθάζζμκηαξ έκα γεφβμξ ααζζηχκ αιζκμλέςκ ζηδκ ηοηηανμπθαζιαηζηή εδθζά ηδξ α1 οπμιμκάδαξ ιεζχκεηαζ δ πνυζδεζδ ηδξ οπμιμκάδαξ ιε ημ πνςηεσκζηυ ζφιπθεβια COPI, ημ μπμίμ δζαηζκεί πνςηεΐκεξ απυ ημ ζφιπθεβια Golgi πίζς ζημ ER. Δπεζδή μζ ιεηαθθαβιέκεξ α1 οπμιμκάδεξ ζοβηεκηνχκμκηακ ζημ ζφιπθεβια Golgi, μζ ενεοκδηέξ πνυηεζκακ υηζ ημ ζοβηεηνζιέκμ γεφβμξ αιζκμλέςκ παίγεζ ημ νυθμ εκυξ δεοηένμο ζδιείμο εθέβπμο ηδξ δζαδζηαζίαξ ζοβηνυηδζδξ nachr, ημ μπμίμ υπςξ ηαζ ημ δζαιειανακζηυ ιμηίαμ πμο ακαθφεδηε παναπάκς, ηνφαεηαζ ζηενεμπδιζηά υηακ βίκεζ ζςζηή ακαδίπθςζδ ηαζ ζοκανιμθυβδζδ ηςκ οπμιμκάδςκ επζηνέπμκηαξ ζημοξ ηαζκμφνβζμοξ οπμδμπείξ κα ζοκεπίζμοκ ηδκ πμνεία ημοξ πνμξ ηδ ηοηηανζηή επζθάκεζα. ε ιζα ιεθέηδ ημο Ren ηαζ ηςκ ζοκενβαηχκ ημο, ημ 2005, ακαβκςνίζηδηακ ζοβηεηνζιέκα οδνυθμαα αιζκμλέα ζηδκ ηοηηανμπθαζιαηζηή εδθζά ηςκ α4 ηαζ α2 οπμιμκάδςκ ηα μπμία υηακ ιεηαθθάζζμκηακ δεκ επδνέαγακ ηδ ζοββέκεζα ημο οπμδμπέα ιε ηδκ επζααηζδίκδ, αθθά ειπυδζγακ ηδ ιεηαθμνά ημο οπμδμπέα ζηδκ ηοηηανζηή επζθάκεζα. Φαίκεηαζ θμζπυκ υηζ ημ ζοβηεηνζιέκμ ζδιείμ εθέβπμο θεζημονβεί 22

23 ιεηά ηδ ζςζηή ζοβηνυηδζδ ημο οπμδμπέα επζνεάγμκηαξ ημ νοειυ ακυδμο ημο οπμδμπέα ζηδκ ηοηηανζηή ιειανάκδ. Δηηυξ απυ ημοξ παναπάκς ιδπακζζιμφξ βζα ηδ ζςζηή ακαδίπθςζδ ηαζ ζοβηνυηδζδ ηςκ οπμδμπέςκ, πμο πδβάγμοκ απυ ηζξ ίδζεξ ηζξ οπμιμκάδεξ ηςκ nachr, ακαηαθφπημκηαζ ηαηά ηαζνμφξ ηαζ ιδπακζζιμί μζ μπμίμζ ζπεηίγμκηαζ ιε αθθδθεπίδναζδ ηςκ οπμιμκάδςκ ιε άθθεξ πνςηεΐκεξ. Γζα πανάδεζβια ζημ κδιαημζηχθδηα C. elegans, δ πνςηεΐκδ Unc-50 πμο ανίζηεηαζ ζημ ζφιπθεβια Golgi ανέεδηε κα είκαζ απαναίηδηδ βζα ηδ ιεηαθμνά ηςκ nachr ζηδκ επζθάκεζα ηςκ ηοηηάνςκ (Eimer et al. 2007). Δπζπθέμκ δ πνςηεΐκδ VILIP-1 πμο απακηάηαζ ζε κεονζηά ηφηηανα έπεζ ανεεεί κα ειπθέηεηαζ ζηδ ιεηαθμνά απυ ημ ζφιπθεβια Golgi ζηδκ ηοηηανζηή επζθάκεζα πμθθχκ εζδχκ δζαιειανακζηχκ οπμδμπέςκ κεονμδζααζααζηχκ (Coussen et al. 2005). οβηεηνζιέκα έπεζ ανεεεί κα αολάκεζ ηδ ζοβηέκηνςζδ ηςκ οπμδμπέςκ ζηδκ ηοηηανμπθαζιαηζηή ιειανάκδ αηυια ηαζ ζε ζοζηήιαηα έηθναζδξ ηα μπμία δεκ έπμοκ ηαιία ζπέζδ ιε κεονζηά ηφηηανα, υπςξ ςμηφηηανα Xenopus (Lin, L. et al. 2002). Δπίζδξ, μζ πνςηεΐκεξ θαίκεηαζ κα ζοιαάθθμοκ ζηδ ιεηαθμνά δζαιειανακζηχκ πνςηεσκχκ απυ ημ ER ζηδκ ηοηηανζηή ιειανάκδ, ηαθφπημκηαξ ηζξ αθθδθμοπίεξ ζηζξ μπμίεξ πνμζδέκεηαζ ημ ζφιπθεβια COPI πμο πνμηαθεί ηαηαηνάηδζδ ηςκ πνςηεσκχκ ζημ ER (Mrowiec & Schwappach 2006). Οζ Bermudez ηαζ Moroni ημ 2006 πνυηεζκακ υηζ δ θςζθμνοθίςζδ ηςκ α4 οπμιμκάδςκ ζε έκα ζοβηεηνζιέκμ επίημπμ (PKA) επάβεζ ηδκ πνυζδεζδ ηςκ πνςηεσκχκ ζε αοηέξ ζημ ER. Αοηυ θαίκεηαζ πςξ πνμάβεζ ηδ ζοβηνυηδζδ ηςκ α4α2 οπμδμπέςκ μζ μπμίμζ ζηδ ζοκέπεζα ιεηαθένμκηαζ ζηδκ πθαζιαηζηή ιειανάκδ. Ζ πνςηεσκζηή θςζθμνοθίςζδ θαίκεηαζ κα επδνεάγεζ βεκζηυηενα ημοξ nachr. Οζ Cho ηαζ ζοκενβάηεξ ημ 2005, ανήηακ υηζ δ ακαζημθή ηςκ ηονμζίκμ-ηζκαζχκ μδδβεί ζε αφλδζδ ηςκ α7 nachr, ηυζμ ζε ςμηφηηανα, υζμ ηαζ ζε κεονχκεξ, εκχ δ ακαζημθή ηςκ ηονμζίκμ-θςζθαηαζχκ μδδβεί ζε ιείςζδ ηςκ ίδζςκ ηακαθζχκ. Μειανακζηά θζπίδζα, υπςξ δ πμθδζηενυθδ ηαζ ηα ζθζββμθζπίδζα, έπμοκ ανεεεί κα παίγμοκ επίζδξ νυθμ ζηδ δζαηίκδζδ ηαζ ηδκ μιαδμπμίδζδ ηςκ nachr. ε CHO- K1/A5 ηφηηανα ηα μπμία εηθνάγμοκ ιοσημφ ηφπμο nachr, δ δζαημπή ηδξ ζφκεεζδξ ζθζββμθζπζδίςκ μδήβδζε ζηδ ιείςζδ ηςκ οπμδμπέςκ ζηδκ επζθάκεζα ηςκ ηοηηάνςκ (Baier & Barrantes 2007). Δπζπθέμκ υηακ ηα ζθζββμθζπίδζα ελακηθμφκηακ, μζ κεμζοκηζεέιεκμζ nachr δεκ ζοβηνμημφκηακ ζςζηά, αθθά ζοκςζηίγμκηακ ζημ ER πςνίξ κα ιπμνμφκ κα ιεηαθενεμφκ ζηδ ηοηηανμπθαζιαηζηή ιειανάκδ (Marchand et al. 2002). Σμ ηεθεοηαίμ θαζκυιεκμ ίζςξ κα μθείθεηαζ ζημ υηζ πςνίξ ζθζββμθζπίδζα μζ 23

24 οπμδμπείξ δεκ ιπμνμφκ κα δδιζμονβήζμοκ ζπεδίεξ θζπζδίςκ, μζ μπμίεξ είκαζ απαναίηδηεξ βζα ηδ ζςζηή θεζημονβία πμθθχκ ιειανακζηχκ πνςηεσκχκ. οκμρίγμκηαξ, μζ πανάβμκηεξ απυ ημοξ μπμίμοξ ελανηάηαζ δ ζςζηή ακαδίπθςζδ ηαζ δ ζοβηνυηδζδ ηςκ οπμιμκάδςκ ζε nachr ηαεχξ ηαζ δ ιεηαθμνά ημοξ ζηδκ ηοηηανζηή επζθάκεζα είκαζ ηυζμ εζςηενζημί (αθθδθμοπίεξ αιζκμλέςκ ζηδκ πνςημηαβή δμιή ηςκ οπμιμκάδςκ) υζμ ηαζ ελςηενζημί (πνςηεΐκεξ-ιεηαθμνείξ, ηζκάζεξ ηαζ θζπίδζα) ηαζ ελαζθαθίγμοκ ζςζηή ζοβηνυηδζδ, θεζημονβζηυηδηα ηαζ εθεβπυιεκδ ιεηαθμνά ηςκ ηακαθζχκ ζηδκ ηοηηανμπθαζιαηζηή ιειανάκδ. Δηθόλα 9. Παξάγνληεο νη νπνίνη πξνάγνπλ ηε κεηαθνξά nachr ζηελ θπηηαξηθή επηθάλεηα (πάλσ κέξνο ηνπ ζρήκαηνο) θαη άιινη νη νπνίνη πξνάγνπλ ηελ θαηαθξάηεζε θαη ηελ πξσηεόιπζή ηνπο ζε θπηηαξηθά δηακεξίζκαηα (θάησ κέξνο ηνπ ζρήκαηνο). ημοξ πανάβμκηεξ πμο πνμάβμοκ ηδκ ιεηαθμνά ηςκ nachr ζηδκ ηοηηανζηή ιειανάκδ, πενζθαιαάκμκηαζ ηα οδνυθμαα αιζκμλέα πμο εκημπίζηδηακ ζηδ ηοηηανμπθαζιαηζηή εδθζά ηςκ α4 ηαζ α2 οπμιμκάδςκ, μζ πνςηεΐκεξ Unc-50 ηαζ VILIP-1 μζ μπμίεξ ιεηαθένμοκ ημοξ nachr ζηδκ ιειανάκδ, ηαεχξ ηαζ πμθδζηενυθδ ηαζ ζθζββμθζπίδζα ηα μπμία θαίκεηαζ πςξ ζπδιαηίγμοκ ζπεδίεξ θζπζδίςκ, απαναίηδηεξ βζα ηδ ιεηαθμνά ηςκ nachr. Απυ ημοξ πανάβμκηεξ πμο πνμάβμοκ ηδκ ηαηαηνάηδζδ ηαζ ηδκ πνςηευθοζδ ηςκ nachr, ημ ζοκηδνδιέκμ ιμηίαμ ζηδ δζαιειανακζηή πενζμπή ηςκ οπμιμκάδςκ ηαηαηναηεί ηζξ οπμιμκάδεξ ζημ Δ.Γ. ιέπνζ κα ζοβηνμηήζμοκ θεζημονβζημφξ οπμδμπείξ. Σμ γεφβμξ ααζζηχκ αιζκμλέςκ ηδξ ηοηηανμπθαζιαηζηήξ εδθζάξ ηςκ α1 οπμιμκάδςκ πνμζδέκεηαζ ζημ ζφιπθεβια COPI πμο ιεηαθένεζ πνςηεΐκεξ απυ ημ ζφιπθεβια Golgi πίζς ζημ Δ.Γ., εκχ μζ ηονμζίκμ-ηζκάζεξ έπεζ δεζπεεί υηζ υηακ ακαζηέθθμκηαζ, αολάκμκηαζ μζ α7 nachr [Σνμπμπμζδιέκμ απυ (St John 2009)]. 24

25 Α.8. ΠΡΟΓΔΣΔ ΝΔΤΡΗΚΟΤ ΣΤΠΟΤ nachr ΜΔ ΦΑΡΜΑΚΟΛΟΓΗΚΟ ΔΝΓΗΑΦΔΡΟΝ Α.8.1. Ζ ΝΗΚΟΣΗΝΖ ΚΑΗ ΑΝΑΛΟΓΑ ΣΖ Σα πονζδφθ-αίεεν-ακάθμβα [2] ηδξ κζημηίκδξ [1] πανμοζζάγμοκ αεθηζςιέκδ εηθεηηζηυηδηα βζα ημοξ α4α2 nachr (Bunnelle, Dart & Schrimpf 2004; Jensen et al. 2005; Romanelli et al. 2007), εκχ κευηενα ακάθμβα θένμοκ ζηδ εέζδ 5 ηδξ πονζδίκδξ, αηυνεζηδ άθηοθ-αθοζίδα [3]. Σα πανάβςβα αοηά πανμοζζάγμοκ ζοββέκεζα επζπέδμο nm ιε nachr πμο θένμοκ ηδκ α2 οπμιμκάδα (Wei et al. 2005). Σμ [4b] (R=CH 3 ) ιέεοθ-πονζδίθ-μιμηνμπακ-ακάθμβμ ανέεδηε κα έπεζ 3 θμνέξ ιεβαθφηενδ ζοββέκεζα απυ ημκ πνμηάημπυ ημο [4a] (R=H) πςνίξ ιεεοθμιάδα εηημπίγμκηαξ ηδ κζημηίκδ ιε Ki = 0,39 nm (Kanne et al. 2005). Σμ ακάθμβμ κζημηίκδξ [5] έπεζ 500 θμνέξ ιζηνυηενδ ζοββέκεζα ιε ημοξ nachr ζε ζπέζδ ιε ηδ κζημηίκδ [1] (Carroll et al. 2006). Ζ έκςζδ [6a] (R=H, X=CH 2 CHSPh) έπεζ δνάζδ ιενζημφ αβςκζζηή βζα ημοξ α3α4 nachr, εκχ δ ζοββεκζηή ηδξ [6b] (R=COOCH 3, X=CH=CH) ζοιπενζθένεηαζ ςξ πθήνδξ αβςκζζηήξ βζα ημοξ ίδζμοξ οπμδμπείξ ιε ζοββέκεζα πανυιμζα ιε αοηή ηδξ κζημηίκδξ. οβηνζηζηά ηυζμ βζα ημοξ α4α2 υζμ ηαζ βζα ημοξ α3α4 nachr, δ [6a] έπεζ ανεεεί κα έπεζ ιεβαθφηενδ ζοββέκεζα ζε ζπέζδ ιε ηδκ [6b] (Moaddel & Wainer 2003; Sarkar et al. 2004). ηα κζημηζκζηά ακάθμβα [7] ηαζ [8] μ πονζδίθ-δαηηφθζμξ έπεζ ακηζηαηαζηαεεί απυ ιία ζιίκμ- ή απυ ιία μλοίιζκμ-μιάδα (Pallavicini et al. 2004). Οζ εκχζεζξ αοηέξ έδεζλακ ζοββέκεζα επζπέδμο ιμ ιε ημοξ nachr. Ζ ακηζηαηάζηαζδ ημο πονζδζκζημφ δαηηοθίμο ιε ιζα ηζκμθίκδ δίκεζ ημ ακάθμβμ [9a] (X=NH, NCH 3 ). Αοηυ ηαζ ημ ακηίζημζπμ πανάβςβμ ηεηανημηαβμφξ αιιςκίμο [9b] (X= + NMe 2 ) έπμοκ ζοββέκεζα ιε ημοξ nachr 17 ηαζ 5 θμνέξ ακηζζημίπςξ ιεβαθφηενεξ απυ αοηή ηδ κζημηίκδξ (Guandalini et al. 2005). Σα ακάθμβα [10a] (NMe 2 ) ηαζ [10b] (NMe 3 I) έπμοκ ζοββέκεζα ηδξ ηάλεςξ ιμ (Guandalini et al. 2005). Ζ επέηηαζδ ηδξ απυζηαζδξ ιεηαλφ ηδξ ηζκμθζκζηήξ μιάδαξ ηαζ ηδξ μιάδαξ ημο ηεηανημηαβμφξ αιιςκίμο ιε ηδ πνήζδ ιζαξ αμοηοκζθζηήξ μιάδαξ έδςζε ηα πανάβςβα ιε ημ βεκζηυ ηφπμ [11]. Ζ έκςζδ [11a] (NCH 3 ) ζοιπενζθένεδηε ζακ αβςκζζηήξ ιε ζοββέκεζα πανυιμζα ιε ηζξ [9a] ηαζ [9b] (Guandalini et al. 2007). Ζ ακαβςβή ημο ηνζπθμφ δεζιμφ ηςκ ακαθυβςκ [11] ζε δζπθυ έδςζε ηα ακάθμβα [12] απυ ηα μπμία ιυκμ ημ ηνακξ-ιεεζςδζηυ ήηακ δναζηζηυ (εηηυπζζε ηδκ ηοηζζίκδ ιε Ki = 1,35 25

26 ιm). Οζ αβςκζζηζηέξ ζδζυηδηεξ ηςκ ακαθυβςκ [13]-[17] δεκ έπμοκ πνμζδζμνζζηεί αηυια, υιςξ μζ εκχζεζξ [14]-[17] ανέεδηακ κα έπμοκ ακαθβδηζηέξ ζδζυηδηεξ. Δηθόλα 10. Ζ ληθνηίλε θαη αλάινγά ηεο. Σα ακάθμβα ηδξ κζημηίκδξ [2] ηαζ ηα κευηενα ακάθμβα [3] πανμοζζάγμοκ αεθηζςιέκδ εηθεηηζηυηδηα βζα ημοξ nachr πμο θένμοκ ηδκ α2 οπμιμκάδα. Σμ [4b] (R=CH 3 ) ακάθμβμ ανέεδηε κα έπεζ 3 θμνέξ ιεβαθφηενδ ζοββέκεζα απυ ημκ πνμηάημπυ ημο [4a] πςνίξ ιεεοθμιάδα. Σμ ακάθμβμ κζημηίκδξ [5] έπεζ 500 θμνέξ ιζηνυηενδ ζοββέκεζα ιε ημοξ nachr ζε ζπέζδ ιε ηδ κζημηίκδ. Ζ έκςζδ [6a] (R=H, X=CH 2 CHSPh) έπεζ δνάζδ ιενζημφ αβςκζζηή βζα ημοξ α3α4 nachr εκχ δ ζοββεκζηή ηδξ [6b] (R=COOCH 3, X=CH=CH) ζοιπενζθένεηαζ ςξ πθήνδξ αβςκζζηήξ βζα ημοξ ίδζμοξ οπμδμπείξ. Σα κζημηζκζηά ακάθμβα [7] ηαζ [8] έδεζλακ ζοββέκεζα επζπέδμο ιμ ιε nachr. Σμ ακάθμβμ [9a] (X=NH, NCH 3 ) ηαζ ημ ακηίζημζπμ πανάβςβμ ηεηανημηαβμφξ αιιςκίμο [9b] (X= + NMe 2 ) έπμοκ ζοββέκεζα ιε ημοξ nachr 17 ηαζ 5 θμνέξ ακηζζημίπςξ ιεβαθφηενεξ απυ αοηή ηδ κζημηίκδξ. Σα ακάθμβα [10a] (NMe 2 ) ηαζ [10b] (NMe 3 I) έπμοκ ζοββέκεζα ηδξ ηάλεςξ ιμ. Ζ έκςζδ [11a] (NCH 3 ) ζοιπενζθένεδηε ζακ αβςκζζηήξ ιε ζοββέκεζα πανυιμζα ιε ηζξ [9a] ηαζ [9b], εκχ απυ ηα ακάθμβα [12] ιυκμ ημ ηνακξ-ιεεζςδζηυ ήηακ δναζηζηυ. Οζ εκχζεζξ [14]-[17] ανέεδηακ κα έπμοκ ακαθβδηζηέξ ζδζυηδηεξ. [Σνμπμπμζδιέκμ απυ (Romanelli et al. 2007)]. 26

27 Α.8.2. Ζ ΔΠΗΒΑΣΗΓΗΝΖ ΚΑΗ ΑΝΑΛΟΓΑ ΣΖ Σμ εκδζαθένμκ βζα ηζξ ακαζζεδηζηέξ ζδζυηδηεξ ηςκ κζημηζκζηχκ αβςκζζηχκ λεηίκδζε υηακ ακαηαθφθεδηακ μζ ζζπονέξ ακαθβδηζηέξ δνάζεζξ ηδξ επζααηζδίκδξ [18] ηαζ δ πμθφ ιεβάθδ πδιζηή ζοββέκεζα πμο έπεζ ιε ημοξ nachr. Χζηυζμ δ πνήζδ ηδξ ζακ ακαζζεδηζηυ πενζμνίγεηαζ πμθφ απυ ηζξ ζμαανέξ ακεπζεφιδηεξ εκένβεζεξ πμο έπεζ, μζ μπμίεξ πδβάγμοκ απυ ηδ παιδθή ηδξ εηθεηηζηυηδηα ακάιεζα ζημοξ nachr (Decker, Rueter & Bitner 2004; Marubio et al. 1999). Γζα κα ανεεί ημ πνυαθδια ηδξ παιδθήξ εηθεηηζηυηδηαξ ηδξ επζααηζδίκδξ, ζπεδζάζηδηε ιζα ζεζνά ακαθυβςκ ηδξ. Σμ ακάθμβμ [19] βζα πανάδεζβια ανέεδηε κα έπεζ ηδ ιζζή ζοββέκεζα ηδξ επζααηζδίκδξ ιε ημκ α4α2 nachr, αθθά πμθφ ορδθυηενδ εηθεηηζηυηδηα βζα ημκ α3α4 nachr (Wei et al. 2005). Γεκζηά πνυζεεζδ ιζηνχκ μιάδςκ ζηδ εέζδ 2 ηδξ επζααηζδίκδξ είκαζ ηαθά ακεηηή (Carroll et al. 2001), εκχ οπμηαηάζηαζδ ζηδ εέζδ 3 [20] δίκεζ αζεεκείξ αβςκζζηέξ (Carroll et al. 2005). Σνμπμπμζήζεζξ ζημ άγςημ ημο ηνμπακίμο δεκ βίκμκηαζ ηαθά ακεηηέξ ηαζ μδδβμφκ ζε πμθφ αζεεκέζηενμοξ αβςκζζηέξ (Horti et al. 1998) υπςξ π.π. δ έκςζδ [21]. Ζ πανάθδρδ ημο αγχημο απυ ημ δαηηφθζμ ημο ηνμπακίμο έδςζε ηδκ έκςζδ [22] δ μπμία έδεζλε ζοββέκεζα ιε ημκ α4α2 nachr ηαζ ακαζζεδηζηή δνάζδ ζε επίπεδα πανυιμζα ιε ηδ κζημηίκδ. Ζ ζοββέκεζα ημο ακαθυβμο [23] βζα ημκ α4α2 nachr ανέεδηε κα είκαζ πανυιμζα ιε αοηή ηδξ επζααηζδίκδξ αθθά βζα ημοξ α3α4 ηαζ ημοξ α7 ήηακ ιζηνυηενδ (Deuther-Conrad et al. 2004). Σμ ακάθμβμ αοηυ θμζπυκ πανμοζζάγεζ αεθηζςιέκδ εηθεηηζηυηδηα ζε ζπέζδ ιε ηδκ ανπζηή έκςζδ (επζααηζδίκδ). Σα ακάθμβα [24] ηαζ [25] πνμέηορακ απυ ηδκ ακηζηαηάζηαζδ ημο πθςνμπονζδζκζημφ δαηηοθίμο ιε έκακ ιεεοθ-ζζμλαγμθζδζκζηυ δαηηφθζμ (Badio et al. 1997). Σμ ακάθμβμ [24a] (R=H) πανμοζίαζε ζοββέκεζα ιε nachr εβηεθαθζημφ μιμβεκμπμζήιαημξ ανμοναίμο ζε ζοβηεκηνχζεζξ ηδξ ηάλεςξ ηςκ nm. Σμ ακάθμβμ [26] πανμοζίαζε ιεζςιέκδ ζοββέκεζα βζα ημοξ α4α2 ηαζ α3α4 nachr (Karig et al. 2003). Σα ακάθμβα [27] ηαζ [28] ηαζ ημ απθμπμζδιέκμ ακάθμβμ [29] έδεζλακ ζοββέκεζα ιε ημοξ α4α2 ηαζ α7 nachr ζε ζοβηεκηνχζεζξ επζπέδμο ιμ (Dallanoce et al. 2006). Σα ακάθμβα επζααηζδίκδξ [30], ηα μπμία εκζςιαηχκμοκ αιζκμλέα ζηδ δμιή ημοξ, έδεζλακ ακαθβδηζηέξ ζδζυηδηεξ ζε πμκηίηζα (Dong et al. 2003). 27

28 Δηθόλα 11. Ζ επηβαηηδίλε θαη αλάινγά ηεο. Σμ ακάθμβμ ηδξ επζααηζδίκδξ [19] έπεζ ηδ ιζζή ζοββέκεζα ηδξ επζααηζδίκδξ ιε ημκ α4α2 nachr αθθά πμθφ ορδθυηενδ εηθεηηζηυηδηα βζα ημκ α3α4 nachr. Γεκζηά οπμηαηάζηαζδ ζηδ εέζδ 3 ηδξ επζααηζδίκδξ [20] δίκεζ αζεεκείξ αβςκζζηέξ εκχ ηνμπμπμζήζεζξ ζημ άγςημ ημο ηνμπακίμο μδδβμφκ ζε πμθφ αζεεκέζηενμοξ αβςκζζηέξ υπςξ δ έκςζδ [21]. Ζ πανάθδρδ ημο αγχημο απυ ημ δαηηφθζμ ημο ηνμπακίμο έδςζε ηδκ έκςζδ [22] δ μπμία έδεζλε ζοββέκεζα ιε ημκ α4α2 nachr ηαζ ακαζζεδηζηή δνάζδ ζε επίπεδα πανυιμζα ιε ηδ κζημηίκδ. Σμ ακάθμβμ [23] πανμοζίαζε εηθεηηζηυηδηα βζα ημκ α4α2 nachr. Σμ ακάθμβμ [24a] (R=H) πανμοζίαζε ζοββέκεζα ιε nachr ζε ζοβηεκηνχζεζξ ηδξ ηάλεςξ ηςκ nm, εκχ ημ ακάθμβμ [26] πανμοζίαζε ιεζςιέκδ ζοββέκεζα βζα ημοξ α4α2 ηαζ α3α4 nachr. Σα ακάθμβα [27] ηαζ [28] ηαζ ημ απθμπμζδιέκμ ακάθμβμ [29] έδεζλακ ζοββέκεζα ιε ημοξ α4α2 ηαζ α7 nachr ζε ζοβηεκηνχζεζξ επζπέδμο ιμ. Σα ακάθμβα επζααηζδίκδξ [30] έδεζλακ ακαθβδηζηέξ ζδζυηδηεξ ζε πμκηίηζα. [Σνμπμπμζδιέκμ απυ (Romanelli et al. 2007)]. 28

29 Α.8.3. Ζ ΚΤΣΗΗΝΖ ΚΑΗ ΑΝΑΛΟΓΑ ΣΖ Ζ ηοηζζίκδ είκαζ έκα αθηαθμεζδέξ, ημ μπμίμ απακηάηαζ ζε θοηά ηδξ μζημβέκεζαξ Fabaceae υπςξ Laburnum ηαζ Cytisus, ιε ιεβάθδ ζοββέκεζα βζα ημκ α4α2 nachr, αθθά ζοιπενζθένεηαζ ζακ ιενζηυξ αβςκζζηήξ. ημκ α7 nachr ζοιπενζθένεηαζ ζακ πθήνδξ αβςκζζηήξ ακ ηαζ έπεζ παιδθή ζοββέκεζα ιε αοηυκ. Ζ εζζαβςβή εκυξ αηυιμο αθμβυκμο ζηδ εέζδ 9 [32] αολάκεζ ηδκ ζζπφ ηαζ ηδ ζοββέκεζα ημο αβςκζζηή βζα ημοξ α4α2, α7 ηαζ α3α4, αθθά υπζ ηαζ βζα ημκ ιοσηυ οπμδμπέα (Fitch et al. 2005; Slater et al. 2003). Ζ εζζαβςβή ημο αθμβυκμο ζηδ εέζδ 11 έπεζ άθθεξ επζδνάζεζξ μζ μπμίεξ πμζηίθμοκ ακάθμβα ιε ημ αθμβυκμ ηαζ ημκ οπμδμπέα [33]. Απυ ηδκ άθθδ ηα πανάβςβα [34] ηαζ [35] πανμοζζάγμοκ 2 ιε 3 θμνέξ ιείςζδ ηδξ ζοββέκεζαξ ιε nachr πμο πενζέπμοκ α2, α3, α4, α2 ηαζ α4 οπμιμκάδεξ. Σμ ακάθμβμ [36] (R=CH 3 ) ιε ιζα ιεεοθμιάδα ζηδ εέζδ 10 έπεζ ζοββέκεζα ιε ημκ α4α2 nachr πανυιμζα ιε αοηή ηδξ ηοηζζίκδξ αθθά είκαζ πενζζζυηενμ εηθεηηζηυξ βζα ημκ α3α4 ζε ζπέζδ ιε ηδκ ηοηζζίκδ (Chellappan et al. 2006). Ζ εζζαβςβή ιζαξ αζκοθμιάδαξ ζηδ εέζδ 9 δίκεζ ημ ακάθμβμ [37], (Picciotto & Zoli 2002) ιε ζοιπενζθμνά πανυιμζα ιε αοηή ηδξ ηοηζζίκδξ. Ζ αανεκζηθίκδ είκαζ ιζα λεπςνζζηή πενίπηςζδ ακαθυβμο ηδξ ηοηζζίκδξ, ηαεχξ πέναζε ιε επζηοπία ηζξ ηθζκζηέξ δμηζιέξ ηαζ πνδζζιμπμζείηαζ πθέμκ ςξ θάνιαημ βζα ηδ δζαημπή ημο ηαπκίζιαημξ (D'Souza & Markou 2011). Ζ αανεκζηθίκδ είκαζ έκαξ ιενζηυξ αβςκζζηήξ ιε ορδθή εηθεηηζηυηδηα βζα ημκ α4α2 έκακηζ άθθςκ nachr. Ζ αβςκζζηζηή ζζπφξ ημο ακαθυβμο είκαζ πανυιμζα ιε αοηή ηδξ ηοηζζίκδξ εκχ δ ζοββέκεζα ηδξ ιε ημκ α4α2 nachr είκαζ 3 θμνέξ ορδθυηενδ. In vivo ιεθέηεξ ζε ανμοναίμοξ έδεζλακ υηζ πνμηαθεί ημ % ηδξ απεθεοεένςζδξ κημπαιίκδξ πμο πνμηαθεί δ κζημηίκδ. Ζ αανεκζηθίκδ δζαηδνεί ηζξ ζδζυηδηεξ ηδξ ηοηζζίκδξ κα δνα ςξ ιενζηυξ αβςκζζηήξ ζημοξ α4α2 οπμδμπείξ ηαζ ςξ πθήνδξ αβςκζζηήξ ζημοξ α7 (Mihalak, Carroll & Luetje 2006). Ζ έκςζδ πνμηνίεδηε ιεηαλφ δομ μιάδςκ ακαθυβςκ ιε βεκζημφξ ηφπμοξ [38] ηαζ [39] (Coe et al. 2005). 29

30 Δηθόλα 12. Ζ θπηηζίλε θαη αλάινγά ηεο. Ζ εζζαβςβή εκυξ αηυιμο αθμβυκμο ζηδ εέζδ 9 ηδξ ηοηζζίκδξ [32] αολάκεζ ηδκ ζζπφ ηαζ ηδ ζοββέκεζα ημο αβςκζζηή βζα ημοξ α4α2, α7 ηαζ α3α4. Ζ εζζαβςβή ημο αθμβυκμο ζηδ εέζδ 11 έπεζ άθθεξ επζδνάζεζξ μζ μπμίεξ πμζηίθμοκ ακάθμβα ιε ημ αθμβυκμ ηαζ ημκ οπμδμπέα [33]. Απυ ηδκ άθθδ ηα πανάβςβα [34] ηαζ [35] πανμοζζάγμοκ 2 ιε 3 θμνέξ ιείςζδ ηδξ ζοββέκεζαξ ιε nachr πμο πενζέπμοκ α2, α3, α4, α2 ηαζ α4 οπμιμκάδεξ. Σμ ακάθμβμ [36] (R=CH 3 ) πανμοζζάγεζ ιεβαθφηενδ εηθεηηζηυηδηα βζα ημκ α3α4, εκχ εζζαβςβή ιζαξ αζκοθμιάδαξ ζηδ εέζδ 9 δίκεζ ημ ακάθμβμ [37] ιε ζοιπενζθμνά πανυιμζα ιε αοηή ηδξ ηοηζζίκδξ. Ζ βαξεληθιίλε είκαζ έκαξ ιενζηυξ αβςκζζηήξ ιε ορδθή εηθεηηζηυηδηα βζα ημκ α4α2 nachr ηαζ πνδζζιμπμζείηαζ ςξ θάνιαημ βζα ηδ δζαημπή ημο ηαπκίζιαημξ. Ζ έκςζδ πνμηνίεδηε ιεηαλφ δομ μιάδςκ ακαθυβςκ ιε βεκζημφξ ηφπμοξ [38] ηαζ [39]. [Σνμπμπμζδιέκμ απυ (Romanelli et al. 2007)]. 30

31 Α.8.4. ΝΗΚΟΣΗΝΗΚΟΗ ΑΝΣΑΓΧΝΗΣΔ Ζ ακάπηολδ ακηαβςκζζηχκ nachr έπεζ πνμζεθηφζεζ πμθφ ιζηνυηενμ εκδζαθένμκ ζε ζπέζδ ιε ηδκ ακάπηολδ αβςκζζηχκ (Romanelli et al. 2007). Αθθαβέξ ζηδ δμιή κζημηζκζηχκ αβςκζζηχκ ζοκήεςξ μδδβμφκ ζε απχθεζα ηδξ ζοββέκεζαξ αθθά ιενζηέξ θμνέξ ιπμνεί κα μδδβήζμοκ ζηδ δδιζμονβία ζοκαβςκζζηζηχκ ακηαβςκζζηχκ. Α ΑΝΣΑΓΧΝΗΣΔ ΑΝΑΛΟΓΑ ΝΗΚΟΣΗΝΖ Ζ αθηοθίςζδ ημο αγχημο ηδξ πονζδίκδξ μδδβεί ζε πανάβςβα ιε βεκζηυ ηφπμ [54]. Οζ εκχζεζξ αοηέξ πνμζδέκμκηαζ ζε α4α2 nachr ζε ζοβηεκηνχζεζξ ηδξ ηάλεςξ ηςκ mm- nm δείπκμκηαξ ζε αοημφξ εηθεηηζηυηδηα έκακηζ ηςκ α7 nachr (Wilkins et al. 2003). ηα ακάθμβα ιε βεκζηυηενμοξ ηφπμοξ [55]-[57] ημ ιήημξ ηδξ αθοζίδαξ πμο δζαζοκδέεζ ημοξ ανςιαηζημφξ δαηηοθίμοξ επδνεάγεζ ηαζ ηζξ ζδζυηδηέξ ημοξ ζακ α4α2 εηθεηηζημφξ ακηαβςκζζηέξ. Μάθζζηα ημ πανάβςβμ [57] ανέεδηε κα ιεζχκεζ ηδκ αοηυπμνήβδζδ κζημηίκδξ ζε πεζναιαηυγςα ηαζ βζ αοηυ έπεζ πνμηαεεί ηαζ ςξ οπμρήθζμ θάνιαημ βζα ηδ δζαημπή ημο ηαπκίζιαημξ (Ayers et al. 2002; Neugebauer et al. 2006). Ζ εζζαβςβή ιζαξ ανςιαηζηήξ μιάδαξ ζηδ εέζδ 5 ημο πονζδζκζημφ δαηηοθίμο ημο κζημηζκζημφ ακαθυβμο [2a] (X=H, ρήκα 9) μδδβεί ζηδ δδιζμονβία ημο ακηαβςκζζηή [59] εηηυξ ηαζ ακ μ ανςιαηζηυξ δαηηφθζμξ είκαζ πονζιζδίκδ (Lin, N. H. et al. 2001). Δπίζδξ δ εζζαβςβή ιζαξ θαίκοθ-αίεοθ-μιάδαξ ζηδ εέζδ 2 ηδξ κζημηίκδξ δίκεζ ημκ ακηαβςκζζηή [60a] (X=CH 2 CH 2 ) ιε ζοββέκεζα ηδξ ηάλεςξ nm βζα ημοξ nachr εβηεθαθζημφ μιμβεκμπμζήιαημξ πμκηζημφ (Ramunno et al. 2005). Σα αθηαθμεζδή [61]- [63] απυ ηδ νίγα ημο ηαπκμφ είκαζ α4α2 εηθεηηζημί ακηαβςκζζηέξ ιε Ki = 1,18 ιμ ηαζ 15,8 ακηίζημζπα. 31

32 Α ΑΝΣΑΓΧΝΗΣΔ ΑΝΑΛΟΓΑ ΔΠΗΒΑΣΗΓΗΝΖ Ζ εζζαβςβή ιζαξ θαίκοθ-μιάδαξ ζηδ εέζδ 3 ημο αβςκζζηή 2-θευνμ-δεξπθςνμεπζααηζδίκδ δίκεζ ημκ ακηαβςκζζηή [58] (Carroll et al. 2001). Ο ακηαβςκζζηήξ αοηυξ έπεζ ορδθή ζοββέκεζα δ μπμία υιςξ ιπμνεί κα αεθηζςεεί πενεηαίνς ιε ανςιαηζηή οπμηαηάζηαζδ ζηδ εέζδ 4, ιε δθεηηνμκζυθζθμοξ οπμηαηαζηάηεξ πμο έθημοκ δθεηηνυκζα (Carroll et al. 2004). Γζα πανάδεζβια ημ ακάθμβμ [58a], (Τ=ΝΟ 2 ) ιπθμηάνεζ ηδ κζημηίκδ ηδ κζημηίκδ ζημοξ α4α2 nachr ιε IC 50 = 0,1ιΜ (Abdrakhmanova et al. 2006). Δηθόλα 13. Νηθνηηληθνί αληαγσληζηέο. Οζ ακηαβςκζζηέξ-πανάβςβα κζημηίκδξ ιε βεκζηυ ηφπμ [54] πνμζδέκμκηαζ ζε α4α2 nachr ζε ζοβηεκηνχζεζξ ηδξ ηάλεςξ ηςκ mm- nm δείπκμκηαξ ζε αοημφξ εηθεηηζηυηδηα έκακηζ ηςκ α7 nachr. Σμ πανάβςβμ [57] ανέεδηε κα ιεζχκεζ ηδκ αοημπμνήβδζδ κζημηίκδξ ζε πεζναιαηυγςα ηαζ έπεζ πνμηαεεί ςξ οπμρήθζμ θάνιαημ βζα ηδ δζαημπή ημο ηαπκίζιαημξ. Ζ εζζαβςβή ιζαξ ανςιαηζηήξ μιάδαξ ζηδ εέζδ 5 ημο πονζδζκζημφ δαηηοθίμο ημο κζημηζκζημφ ακαθυβμο [2a] (X=H, ρήκα 9) μδδβεί ζηδ δδιζμονβία ημο ακηαβςκζζηή [59] εηηυξ ηαζ ακ μ ανςιαηζηυξ δαηηφθζμξ είκαζ πονζιζδίκδ (Lin, N. H. et al. 2001). Δπίζδξ δ εζζαβςβή ιζαξ θαίκοθ-αίεοθ-μιάδαξ ζηδ εέζδ 2 ηδξ κζημηίκδξ δίκεζ ημκ ακηαβςκζζηή [60a] (X=CH 2 CH 2 ) ιε ζοββέκεζα ηδξ ηάλεςξ nm βζα ημοξ nachr εβηεθαθζημφ μιμβεκμπμζήιαημξ πμκηζημφ. Σα αθηαθμεζδή [61]-[63] είκαζ α4α2 εηθεηηζημί ακηαβςκζζηέξ ιε Ki = 1,18 ιμ ηαζ 15,8 ακηίζημζπα. Ο ακηαβςκζζηήξ-πανάβςβμ επζααηζδίκδξ [58] έπεζ ορδθή ζοββέκεζα πμο αεθηζχκεηαζ πενεηαίνς ιε οπμηαηάζηαζδ ζημ ακάθμβμ [58a], (Τ=ΝΟ 2 ) πμο ιπθμηάνεζ ηδ κζημηίκδ ζημοξ α4α2 nachr ιε IC 50 = 0,1ιΜ. [Σνμπμπμζδιέκμ απυ (Romanelli et al. 2007)]. 32

33 Α.9. ΖΜΑΣΟΓΟΣΖΖ ΜΔ ΗΟΝΣΑ Ca 2+ ΜΔΧ ΝΔΤΡΗΚΟΤ ΣΤΠΟΤ nachr Οζ κεονζημφ ηφπμο nachr ηαζ ζδζαίηενα μ α7 nachr, πένα απυ ηδκ δζαπεναηυηδηα πμο έπμοκ βζα ηα ηαηζυκηα Na +, πανμοζζάγμοκ αλζυθμβδ δζαπεναηυηδηα ηαζ ζε ζυκηα Ca 2+. Ζ δζαπεναηυηδηα ζε ζυκηα Ca 2+ έπεζ ιεβάθδ ζδιαζία βζα κεονζηά ηαζ ιδ ηφηηανα, αθθά ηαζ βζα ημκ μνβακζζιυ ζακ ζφκμθμ, ηαεχξ ηα επίπεδα ημο εκδμηοηηανζημφ Ca 2+ παίγμοκ ζπμοδαζυηαημ νυθμ ζηδ αζμπδιεία ημο ηοηηάνμο ζε δζαδζηαζίεξ υπςξ δ ιοσηή ζφζπαζδ, δ απυπηςζδ ηαζ δ ικήιδ-ιάεδζδ (Adams, D. J. & Nutter 1992; Castro & Albuquerque 1995). Πανμοζζάγεζ εκδζαθένμκ υηζ δζαθμνεηζημί nachr θαίκεηαζ κα δνμοκ ιέζς δζαθμνεηζηχκ ηοηηανζηχκ ιδπακζζιχκ μζ μπμίμζ ειπθέημοκ Ca 2+. Γζα πανάδεζβια μζ πζμ δζαπεναημί ζε Ca 2+ α7 οπμδμπείξ, ζοκήεςξ εκενβμπμζμφκ ημκ ελανηχιεκμ απυ ηδ νζακμδίκδ ιδπακζζιυ CICR (Calcium Induced Ca 2+ Release) μ μπμίμξ απεθεοεενχκεζ ημ εκδμηοηηανζηά απμεδηεοιέκμ Ca 2+ (Sharma & Vijayaraghavan 2001; Tsuneki et al. 2000) εκχ μζ α3α2 οπμδμπείξ εκενβμπμζμφκ ημκ ιδπακζζιυ VOCCS (Voltage-Operated Ca 2+ Channels), μ μπμίμξ πενζθαιαάκεζ ηαζεμεθεβπυιεκα ηακάθζα πμο εζζάβμοκ Ca 2+ απυ ημ ελςηενζηυ ημο ηοηηάνμο (Dajas-Bailador, Soliakov & Wonnacott 2002; Shoop et al. 2001; Tsuneki et al. 2000). Δκδζαθένμκ πανμοζζάγεζ επίζδξ ημ υηζ ηα επίπεδα εκδμηοηηανζημφ Ca 2+ επδνεάγμοκ ιε ηδ ζεζνά ημοξ ηδ θεζημονβία ηςκ nachr (Khiroug et al. 2003; Quick & Lester 2002). Α.10. ΤΝΔΗΦΟΡΑ ΣΧΝ ΝΔΤΡΗΚΟΤ ΣΤΠΟΤ nachr ΣΖΝ ΝΔΤΡΧΝΗΚΖ ΠΛΑΣΗΚΟΣΖΣΑ ΚΑΗ ΣΖ ΜΝΖΜΖ Οζ κεονζημφ ηφπμο nachr έπμοκ ζοζπεηζζηεί εεηζηά ιε ηδ δζαδζηαζία ικήιδξιάεδζδξ ηονίςξ θυβς πεζναιάηςκ πμο έδεζπκακ εεηζηή επίδναζδ αβςκζζηχκ ζηδ δζαδζηαζία. Ο ζππυηαιπμξ, ημ ηέκηνμ ηθεζδί ζηδ δζαδζηαζία ηδξ ικήιδξ-ιάεδζδξ, έπεζ πνμζεθηφζεζ ιεβάθμ ενεοκδηζηυ εκδζαθένμκ ηαζ έπμοκ ακζπκεοηεί ζε αοηυκ ηνεζξ ημοθάπζζημκ ηφπμζ nachr: α7, α4α2 ηαζ α3α2 (Alkondon & Albuquerque 2004). Ζ ζοκαπηζηή θεζημονβία ζημκ ζππυηαιπμ θαίκεηαζ κα είκαζ έκαξ ζοκδοαζιυξ ακαζηαθηζηχκ GABAενβζηχκ ηαζ εκενβμπμζδηζηχκ βθμοηαιζκενβζηχκ δνάζεςκ, μζ μπμίεξ ηνμπμπμζμφκηαζ απυ δζαθμνεηζημφξ nachr (Alkondon & Albuquerque 2001; Alkondon, Pereira & Albuquerque 2003; Ji, Lape & Dani 2001). Δπίζδξ μζ ηαηαννάηηεξ ιεηαβςβήξ ζήιαημξ ERK/MAPK (Extracellular signal-regulated 33

34 Kinases /Mitogen-Activated Protein Kinases) έπμοκ ζοζπεηζζηεί ιε βκςζηζηέξ δζενβαζίεξ (Sweatt 2004). Οζ κεονζημφ ηφπμο nachr έπεζ ανεεεί κα ιεζμθααμφκ ζηδκ εκενβμπμίδζδ ηςκ ERK/MAPK αθθά ηαζ ημο CREB (camp Response Element- Binding protein) ζε δζάθμνεξ ηοηηανζηέξ ζεζνέξ κεονζηήξ πνμέθεοζδξ (Chang & Berg 2001; Nakayama et al. 2001; Nakayama et al. 2006). ημκ ζππυηαιπμ δ εκενβμπμίδζδ απυ κζημηίκδ έπεζ δεζπεεί υηζ πνμηαθεί απεθεοεένςζδ ημο εκδμηοηηανζηά απμεδηεοιέκμο Ca 2+ εκενβμπμζχκηαξ πνςηεσκζηέξ ηζκάζεξ ηαζ ηα ζοζηήιαηα ιεηαβςβήξ ζήιαημξ ERK/MAPK ηαζ CREB (Dajas-Bailador, Mogg & Wonnacott 2002; Hu et al. 2002). Α.11. ΔΜΠΛΟΚΖ ΣΧΝ ΝΔΤΡΗΚΟΤ ΣΤΠΟΤ nachr ΣΟ ΤΝΓΡΟΜΟ ΤΠΔΡΚΗΝΖΣΗΚΟΣΖΣΑ ΚΑΗ ΓΗΑΠΑΖ ΣΖ ΠΡΟΟΥΖ (ADHD) Σμ ζφκδνμιμ ADHD παναηηδνίγεηαζ απυ πνυκζα δοζημθία ζοβηέκηνςζδξ ηαζ απυζπαζδ ηδξ πνμζμπήξ ηαεχξ επίζδξ ζοπκά ηαζ απυ οπενηζκδηζηυηδηα ζε ηέημζμ ααειυ πμο ημ άημιμ κα ηαείζηαηαζ ιδ θεζημονβζηυ. Σα πνχηα ζοιπηχιαηα ημο ζοκδνυιμο ειθακίγμκηαζ ζοκήεςξ απυ ηδκ παζδζηή δθζηία ηαζ ζημ 50% ηςκ πενζπηχζεςκ αοηά ζοκεπίγμκηαζ ηαζ ζηδκ εκήθζηδ γςή (Barkley et al. 2002). Σμ πμζμζηυ ηςκ ηαπκζζηχκ ζημοξ αζεεκείξ ιε ADHD είκαζ ιεβαθφηενμ (40%) ζε ζπέζδ ιε ημ ακηίζημζπμ πμζμζηυ ζημ βεκζηυ πθδεοζιυ (Pomerleau et al. 1995). Μεθέηεξ ζε πεζναιαηυγςα έπμοκ δείλεζ υηζ nachr ειπθέημκηαζ ζηδ βκςζηζηή θεζημονβία (Blondel, Sanger & Moser 2000) ηαζ πζμ ζοβηεηνζιέκα μζ οπμδμπείξ α7 ηαζ α4α2 έπεζ δεζπεεί υηζ παίγμοκ ζδιακηζηυ νυθμ ζηδ ζοβηέκηνςζδ ηαζ ζηδ θεζημονβία ηδξ ικήιδξ-ιάεδζδξ ζε ανμοναίμοξ (Grottick & Higgins 2000; Levin et al. 1999). Δπίζδξ έπεζ δεζπεεί υηζ ηζζνυηα κζημηίκδξ ηαεχξ ηαζ άθθμζ κζημηζκζημί αβςκζζηέξ αεθηζχκμοκ ηα ηθζκζηά ζοιπηχιαηα αζεεκχκ ιε ADHD, αθθά ηαζ ζε πεζναιαηυγςα (ανμοναίμοξ) ιε ADHD, δ κζημηίκδ έπεζ δεζπεεί υηζ αεθηζχκεζ ηδκ ζηακυηδηα πνμζμπήξ αθθά ηαζ ηδ ικήιδ ιέζς οπμδμπέςκ α4α2 αθθά υπζ ηαζ ιέζς α7 (Levin & Rezvani 2000). Όθα ηα παναπάκς δείπκμοκ υηζ ζημκ ημιέα ηδξ εεναπείαξ ηδξ ADHD, οπάνπεζ έδαθμξ βζα ηδκ πνμμπηζηή ζηυπεοζδξ ηςκ nachr ηαζ ζδζαίηενα ημο α4α2 nachr ιε κζημηζκζημφξ αβςκζζηέξ. 34

35 Α.12. ΡΤΘΜΗΖ ΓΟΝΗΓΗΑΚΖ ΔΚΦΡΑΖ ΜΔΧ ΝΔΤΡΗΚΟΤ ΣΤΠΟΤ nachr Ζ έηθναζδ δζαθυνςκ κεονζημφ ηφπμο nachr απυ ηα πνχηα ζηάδζα ηδξ ειανομβέκεζδξ ηαζ δ δοκαηυηδηα ηυζμ έηθοζδξ αηεηοθμπμθίκδξ υζμ ηαζ ακηαπυηνζζδξ ζε αοηή (Smith et al. 1979), οπμδδθχκεζ υηζ αηυια ηαζ ζε αοηά ηα πνχζια ζηάδζα θαιαάκεζ πχνα κεονμδζααίααζδ, δ μπμία πνμθακχξ παίγεζ ηάπμζμ νυθμ ζημκ ζπδιαηζζιυ ημο κεονζημφ ζοζηήιαημξ (Arenella, Oliva & Jacob 1993; Corriveau & Berg 1993; Devay, Qu & Role 1994; Howard, Gershon & Margiotta 1995). Ακ ηαζ δ ζδιαζία ηδξ έηθναζδξ nachr ζε αδζαθμνμπμίδηα ηφηηανα δεκ έπεζ απμδεζπεεί αηυια, εζηάγεηαζ υηζ μζ οπμδμπείξ αοημί ιπμνεί κα ειπθέημκηαζ ηαζ ζηδ νφειζζδ ηδξ έηθναζδξ βμκζδίςκ. Ζ ειπθμηή nachr ζηδκ έηθναζδ βμκζδίςκ έπεζ δεζπεεί ζηδκ πενίπηςζδ ημο βμκζδίμο C-fos ζηα ηφηηανα PC12 (Greenberg, Ziff & Greene 1986). Δπίζδξ δ αφλδζδ ηδξ έηθναζδξ ηςκ βμκζδίςκ C-fos ηαζ junb, έπεζ δεζπεεί ζε δζάθμνεξ πενζμπέξ ημο εβηεθάθμο (Harlan & Garcia 1998; Pich et al. 1997; Salminen et al. 1999). Σμ βεβμκυξ υηζ ηα βμκίδζα αοηά εηθνάγμοκ ιεηαβναθζημφξ πανάβμκηεξ οπμδδθχκεζ υηζ nachr ιπμνμφκ έιιεζα κα επδνεάγμοκ ηδκ έηθναζδ πμθθχκ άθθςκ βμκζδίςκ. Ζ νφειζζδ ηδξ βμκζδζαηήξ έηθναζδξ ιέζς nachr δίκεζ επίζδξ ηδκ εοηαζνία βζα αοημννφειζζδ ηδξ πμθζκενβζηήξ κεονμδζααίααζδξ. Γζα πανάδεζβια δ οδνμλοθάζδ ηδξ ηονμζίκδξ, ημ έκγοιμ πμο ηαηαθφεζ ημ ηνίζζιμ ζηάδζμ ηδξ ζφκεεζδξ ηςκ ηαηεπμθαιζκχκ, έπεζ δεζπεεί υηζ αολάκεηαζ φζηενα απυ ιαηνμπνυκζα έηεεζδ ζε κζημηίκδ, ηυζμ in vivo, υζμ ηαζ ζε ηοηηανμηαθθζένβεζεξ (Kumer & Vrana 1996). Ο οπμδμπέαξ α7 έπεζ δεζπεεί υηζ ειπθέηεηαζ ζηδκ αφλδζδ ηδξ έηθναζδξ ημο εκγφιμο αολάκμκηαξ ηα επίπεδα ημο mrna ημο εκγφιμο ιέζς ημο ιδπακζζιμφ CICR (Calcium-Induced Calcium Release) πμο πενζθαιαάκεζ απεθεοεένςζδ Ca 2+ απυ εκδμηοηηανζηέξ απμεήηεξ (Gueorguiev et al. 2000). οκμπηζηά, έπεζ δεζπεεί υηζ μζ nachr ιεηαλφ άθθςκ επδνεάγμοκ ηαζ ηδκ έηθναζδ βμκζδίςκ υπςξ ημ C-fos, ημ junb ηαεχξ επίζδξ ηαζ ηδκ έηθναζδ ημο εκγφιμο ηδξ οδνμλοθάζδ ηδξ ηονμζίκδξ. Ζ νυθμξ πμο ιπμνεί κα παίγεζ μ έθεβπμξ ηδξ βμκζδζαηήξ έηθναζδξ ηαζ απυ ημοξ nachr, ιπμνεί κα είκαζ πένα απυ ηδκ αοημννφειζζδ ηδξ θεζημονβίαξ ημοξ ηαζ κα ειπθέημκηαζ ηαζ ζε άθθεξ θεζημονβίεξ ηυζμ ηαηά ηδκ ακάπηολδ υζμ ηαζ ηαηά ηδκ εκήθζηδ γςή. 35

36 Α.13. ΑΝΣΗΦΛΔΓΜΟΝΧΓΔΗ ΚΑΗ ΝΔΤΡΟΠΡΟΣΑΣΔΤΣΗΚΔ ΓΡΑΔΗ ΝΔΤΡΗΚΟΤ ΣΤΠΟΤ nachr Ανηεηέξ ένεοκεξ έδεζλακ ανπζηά ηζξ κεονμπνμζηαηεοηζηέξ ηαζ ανβυηενα ηαζ ηζξ ακηζθθεβιμκχδεζξ δνάζεζξ nachr κεονζημφ ηφπμο μζ μπμίμζ ανίζημκηαζ ζε κεονζηά ηαζ ιδ ηφηηανα. Ζ κεονμπνμζηαηεοηζηή δνάζδ ηςκ κεονζημφ ηφπμο nachr έπεζ δεζπεεί ηυζμ in vitro ζε ηοηηανμηαθθζένβεζεξ υζμ ηαζ ζε πεζναιαηυγςα. Έπεζ ακαθενεεί πνμζηαζία απυ μλεζδςηζηυ stress (Egea et al. 2007), ζηένδζδ μλοβυκμοζζπαζιίαξ (Gatto et al. 2004; Rosa et al. 2006), ζηένδζδ βθοηυγδξ (Egea et al. 2007; Rosa et al. 2006), ζηένδζδ NGF (Nerve Growth Factor) (O'Neill et al. 2002; Takada et al. 2003), έηεεζδ ζε αζεακυθδ (Hellström-Lindahl et al. 2004), ζε α-αιοθμεζδέξ πεπηίδζμ (Dineley 2007; Nordberg et al. 2002) ηαζ ζε paraquat (Khwaja et al. 2007). Φαίκεηαζ υηζ μζ α4α2 ηαζ α7 nachr αζημφκ ηζξ κεονμπνμζηαηεοηζηέξ ημοξ δνάζεζξ ιέζς δζαθμνεηζηχκ ιδπακζζιχκ. Οζ α7 οπμδμπείξ θένμκηαζ κα πνμζηαηεφμοκ ηα ηφηηανα ιέζς δδιζμονβίαξ ζοιπθυημο ιε ηονμζίκμ-θςζθμνοθζςιέκδ JAK2 (JAnus Kinase 2), δ μπμία ζηδ ζοκέπεζα εκενβμπμζεί ηδκ PI3 (PhosphoInositide Kinase 3) ηζκάζδ (Shaw, Bencherif & Marrero 2002), πνάβια πμο μδδβεί ηεθζηά ζε PKB (Protein Kinase B) θςζθμνοθίςζδ. Οζ de Jonge ηαζ ζοκενβάηεξ ημ 2005 επζαεααίςζακ ηδκ φπανλδ ημο ιμκμπαηζμφ πμο λεηζκά ιε ηδ δδιζμονβία ημο ζοιπθυημο α7-jak2 ηαζ ζηδ ζοκέπεζα ζοκδέεηαζ ιε ημ ιμκμπάηζ STAT3 (Signal Transducer and Activator of Transcription 3) πμο ζπεηίγεηαζ ηαζ ιε δζαδζηαζίεξ ηαηαζημθήξ θθεβιμκήξ. Ζ δζπθή πνμζηαηεοηζηή δνάζδ ηςκ κεονζημφ ηφπμο nachr έπεζ ιεβάθδ ζδιαζία, ηυζμ βζαηί οπμδδθχκεζ ειπθμηή ηςκ οπμδμπέςκ αοηχκ ζε εειεθζχδδ αζμπδιζηά ιμκμπάηζα, υζμ ηαζ βζα ημ υηζ ακμίβεζ κέεξ εοηαζνίεξ βζα ηδ δδιζμονβία πνςημπμνζαηχκ εεναπεζχκ πμο εα ζημπεφμοκ ημοξ οπμδμπείξ αοημφξ (Bencherif 2009). οκμρίγμκηαξ, μζ κεονζημφ ηφπμο nachr ιεηαλφ άθθςκ, πανμοζζάγμοκ ακηζθθεβιμκχδεζξ ηαζ κεονμπνμζηαηεοηζηέξ δνάζεζξ ηαζ ιάθζζηα ιε ιδπακζζιμφξ δζαθμνεηζημφξ βζα ηάεε είδμξ οπμδμπέα. Έηζζ μζ κεονζημφ ηφπμο nachr οπμδεζηκφμκηαζ ςξ πζεακμί θανιαημθμβζημί ζηυπμζ βζα ηδ εεναπεία κεονμεηθοθζζηζηχκ κυζςκ ηαζ θθεβιμκςδχκ ηαηαζηάζεςκ πςνίξ ηζξ πανεκένβεζεξ ηςκ ζηενμεζδχκ ηαζ ιδ ζηενμεζδχκ ακηζθθεβιμκςδχκ θανιάηςκ. 36

37 Α.14. Ο ΡΟΛΟ ΣΧΝ ΝΔΤΡΗΚΟΤ ΣΤΠΟΤ nachr ΣΟΝ ΚΑΡΚΗΝΟ Ζ πνχηδ ιεθέηδ ζηδκ μπμία ενεοκήεδηε δ επίδναζδ κζημηζκζημφ αβςκζζηή (κζημηίκδ) ζε ηοηηανζηέξ ζεζνέξ πνμενπυιεκεξ απυ ηανηζκζηά ηφηηανα ήηακ ημο Schuller ημ 1989, ζηδκ μπμία δζαπζζηχεδηε υηζ δ κζημηίκδ εκίζποε ηδκ ελάπθςζή ημοξ. Ανβυηενα ανέεδηε υηζ δ κζημηίκδ έπεζ ακηζαπμπηςηζηή δνάζδ ζε ηφηηανα πνμενπυιεκα απυ ιζηνμηοηηανζηυ ηανηίκμ ημο πκεφιμκα (SCLC, Small Cell Lung Carcinoma) εκενβμπμζχκηαξ έκα ζενμημκζκενβζηυ ιμκμπάηζ (Cattaneo et al. 1993; Maneckjee & Minna 1994). Δπζπθέμκ ημ ηάπκζζια έπεζ δεζπεεί υηζ είκαζ μ ααζζηυηενμξ πανάβμκηαξ ηζκδφκμο ζε ηανηίκμοξ εηηυξ ηςκ πκεοιυκςκ ηαζ ημο εκηένμο, ημο ζημιάπμο ηαζ ηδξ ηφζηεςξ (Cooke & Bitterman 2004). Λαιαάκμκηαξ οπυρδ ηα παναπάκς, μ αολδιέκμξ ηίκδοκμξ ηανηζκμβέκεζδξ απυ ημ ηάπκζζια ιπμνεί κα μθείθεηαζ ηαζ ζηδ κζημηίκδ (Minna 2003). Αηυια πζμ πνυζθαηεξ ένεοκεξ, έπμοκ δείλεζ υηζ εκενβμπμίδζδ ηςκ nachr ιπμνεί εηηυξ απυ ακηίζηαζδ ζηδκ απυπηςζδ, κα εκζζπφζεζ ηαζ άθθεξ παναηηδνζζηζηέξ δνάζεζξ ημο ηανηίκμο υπςξ μ ακελέθεβηημξ πμθθαπθαζζαζιυξ, δ ιεηάζηαζδ ηαζ δ αββεζμβέκεζδ (DasguptaKinkade, et al. 2006; DasguptaRastogi, et al. 2006; Jin et al. 2004; Xu et al. 2007). Απυ ηα παναπάκς βίκεηαζ θακενυ υηζ δ ζηυπεοζδ ηςκ nachr ιπμνεί κα έπεζ μθέθδ ζε ηάπμζεξ ακηζηανηζκζηέξ εεναπείεξ (Trombino et al. 2004). Δπζπθέμκ, ιδ κεονζημφ ηφπμο nachr έπμοκ ακζπκεοηεί ζηδκ επζθάκεζα επζεδθζαηχκ ηαζ εκδμεδθζαηχκ ανμβπζηχκ ηοηηάνςκ ηα μπμία ιάθζζηα ζοκεέημοκ ηαζ ACh ηαζ επζπθέμκ έπμοκ ηαζ δνάζδ αηεηοθ-ηνακθενάζδξ ηδξ πμθίκδξ (Gotti & Clementi 2004). Ίζςξ ηα ηφηηανα αοηά κα πνδζζιμπμζμφκ ηδκ ACh ςξ μνιυκδ ιε αοημηνζκείξ ηαζ παναηνζκείξ δνάζεζξ. ε επίπεδμ οπμιμκάδςκ, θαίκεηαζ πςξ οπάνπμοκ δζαθμνέξ ζηδκ έηθναζδ ηςκ nachr ζηδκ επζθάκεζα ηςκ ηανηζκζηχκ ηοηηάνςκ NSCLC (Non Small Cell Lung Cancer) ζε ζπέζδ ιε ιδ ηανηζκζηά ηφηηανα (Lam et al. 2007). ηα ηανηζκζηά ηφηηανα μζ α2 οπμιμκάδεξ ακζπκεφμκηαζ αολδιέκεξ εκχ μζ α4 ιεζςιέκεξ ζε ζπέζδ ιε ιδ ηανηζκζηά ηφηηανα (Lam et al. 2007). Δπίζδξ ανηεηά ορδθά επίπεδα α7 nachr έπμοκ ακζπκεοηεί ζε ακενχπζκα ηανηζκζηά ηφηηανα πνμενπυιεκα απυ ιεζμεδθίςια ηαζ απυ ηανηίκμ ημο παπέςξ εκηένμο (Trombino et al. 2004; Wong et al. 2007). Δπζπθέμκ έπεζ δεζπεεί υηζ δ κζημηίκδ ιπμνεί κα πνμηαθέζεζ αββεζμβέκεζδ (Cooke & Bitterman 2004), δζαδζηαζία δ μπμία είκαζ ηθεζδί βζα ηδκ ελάπθςζδ ημο ηανηίκμο. Ζ κζημηίκδ, έκαξ ηθαζζζηυξ αβςκζζηήξ ηςκ nachr ηαζ ζοζηαηζηυ-ηθεζδί ζημκ ηαπκυ, ιπμνεί κα εκζζπφζεζ ηδκ ελάπθςζδ ηυζμ ηανηζκζηχκ υζμ ηαζ θοζζμθμβζηχκ 37

38 ηοηηάνςκ (Gotti & Clementi 2004; Schuller 2007). Δπζπθέμκ μ ζοκδοαζιυξ κζημηίκδξ ηαζ οπενμλοβυκςζδξ έπεζ δεζπεεί υηζ ιπμνεί κα πνμηαθέζεζ ηανηίκμ ημο πκεφιμκα ζε πεζναιαηυγςα (Schuller et al. 1995). Αοηυ δείπκεζ υηζ δ πνυκζα εκενβμπμίδζδ ηςκ nachr ζε ζοκδοαζιυ ιε ηδκ ημπζηά αολδιέκδ μλοβυκςζδ πμο παναηδνείηε ζοπκά ζε ηαπκζζηέξ ιπμνεί κα είκαζ ιζα ζμαανή αζηία πνυηθδζδξ ηανηίκμο ηςκ πκεοιυκςκ (Schuller et al. 1995). Ο nachr πμο θένεηαζ κα ειπθέηεηαζ πενζζζυηενμ ζηδ ζπέζδ κζημηίκδξηανηζκμβέκεζδξ είκαζ μ α7, ηαεχξ ζε ιεθέηεξ ζε ηοηηανμηαθθζένβεζεξ SCLC ηαζ NSCLC κζημηζκζημί ακηαβςκζζηέξ υπςξ δ α-bgtx ηαζ δ ιέεοθ-ηαημκζηίκδ ιπθυηανακ ηδ εεηζηή επίδναζδ πμο έπεζ δ κζημηίκδ ζημκ πμθθαπθαζζαζιυ ηςκ ζοβηεηνζιέκςκ ηοηηάνςκ (DasguptaRastogi, et al. 2006). Δπζπθέμκ δ κζημηίκδ έπεζ δεζπεεί υηζ πνμζηαηεφεζ ηα ηφηηανα απυ απυπηςζδ επαβυιεκδ απυ ακηζκεμπθαζιαηζηά θάνιαηα (DasguptaKinkade, et al. 2006). Ζ ακηίζηαζδ ζηα θάνιαηα αοηά είκαζ έκα ζμαανυ πνυαθδια ζηδ πδιεζμεεναπεία ημο ηανηίκμο ηαζ ημ εκδεπυιεκμ υθεθμξ απυ ηδ ζοβπμνήβδζδ ηαεζενςιέκςκ ηοηηανμημλζηχκ θανιάηςκ ιαγί ιε κζημηζκζημφξ ακηαβςκζζηέξ αλίγεζ κα δζενεοκδεεί (Egleton, Brown & Dasgupta 2008). Α.14.1 ΒΗΟΥΖΜΗΚΑ ΜΟΝΟΠΑΣΗΑ ΠΟΤ ΔΜΠΛΔΚΟΝΣΑΗ ΣΖΝ ΑΝΣΟΥΖ ΣΖΝ ΑΠΟΠΣΧΖ ΑΠΟ ΣΖ ΝΗΚΟΣΗΝΖ Έπεζ δεζπεεί υηζ δ επαβυιεκδ απυ ηδ κζημηίκδ ακημπή ζηδκ απυπηςζδ ηαζ δ ζοκεπαβυιεκδ επζηάποκζδ ηδξ ελάπθςζδξ ηςκ ηανηζκζηχκ ηοηηάνςκ μθείθμκηαζ ζηδκ αφλδζδ ηυζμ ηδξ παναβςβήξ αολδηζηχκ παναβυκηςκ υπςξ BDNF, VEGF, PDGF, HGF, TGF-α υζμ ηαζ ζηδκ αφλδζδ ηδξ έηθναζδξ ηςκ οπμδμπέςκ ημοξ ζηδκ επζθάκεζα ηςκ ηοηηάνςκ (Conti-Fine et al. 2000; Zeidler, Albermann & Lang 2007). Ζ κζημηίκδ έπεζ δεζπεεί υηζ επάβεζ ηδ δνάζδ ημο EGFR (Epidermal Growth Factor Receptor) ιέζς αφλδζδξ ημο Ca 2+, πνμενπυιεκμ ηυζμ απυ εκδμηοηηανζηά απμεέιαηα υζμ ηαζ απυ ηδκ εκενβμπμίδζδ ηςκ ηφπμο L-ηαζεμεθεβπυιεκςκ ηακαθζχκ Ca 2+. Δπίζδξ δ κζημηίκδ έπεζ ανεεεί υηζ αολάκεζ ηδκ έηθναζδ ημο VEGFR (Vascular Epidermal Growth Factor Receptor) ζε ηφηηανα ηανηίκμο ημο ζημιάπμο, ηαζ δζεβείνεζ ηδκ έηθναζδ ηδξ COX-2 (Κοηθμλοβεκάζδ-2) (Schuller 2007; Sher et al. 1998). Ζ εκενβμπμίδζδ ηδξ COX-2 πονμδμηεί ηδ δζείζδοζδ ηςκ ηανηζκζηχκ ηοηηάνςκ ζημοξ παναηείιεκμοξ ζζημφξ ιέζς ηδξ εκενβμπμίδζδξ ηςκ ιεηαθθμπνςηεσκαζχκ MMP2 ηαζ MMP9, εκχ ηαοηυπνμκα δ κζημηίκδ δζεβείνεζ ηαζ ηδκ αββεζμβέκεζδ (Shin et al. 2005). ηδ ιεθέηδ ηςκ Flores-Delgado ηαζ ζοκενβαηχκ ημ 2007 ανέεδηε υηζ δ 38

39 κζημηίκδ ιπμνεί κα δζεβείνεζ ηδ θςζθμνοθίςζδ ηδξ PP1 (Protein Phosphatase 1), πνάβια πμο μδδβεί ζηδκ απεκενβμπμίδζή ηδξ. Ζ απεκενβμπμίδζδ ηδξ PP1 ιεζχκεζ ηα επίπεδα ημο ελανηχιεκμο απυ ηζξ ηοηθίκεξ πανάβμκηα p27 kip1, πνάβια πμο μδδβεί ηεθζηά ζε αφλδζδ ημο ηοηηανζημφ πμθθαπθαζζαζιμφ (Flores-Delgado et al. 2007). Ζ κζημηίκδ έπεζ δεζπεεί υηζ επίζδξ δζεβείνεζ ηδκ ελάπθςζδ ηαζ NSCLC επάβμκηαξ ηδκ έηθναζδ αζιπνμκεηηίκδξ ηαζ α5α1 ζκηεβηνίκδξ ιέζς ημο α7 nachr. Ζ αφλδζδ αοηή επζηοβπάκεηαζ ιέζς εκενβμπμίδζδξ ηςκ ERK ηαζ ηςκ ιμκμπαηζχκ PI3K/mTOR (Zheng et al. 2007). Δίκαζ εκδζαθένμκ υηζ δ αφλδζδ ηδξ παναβςβήξ αζιπνμκεηηίκδξ είκαζ έκαξ ηαη ελμπήκ δείηηδξ ηδξ ιεηαζηνμθήξ ηςκ ηοηηάνςκ απυ θοζζμθμβζηά επζεδθζαηά ζε ιεζεβποιαηζηά, ιεηαζηνμθή δ μπμία είκαζ βκςζηή υηζ απμηεθεί ζδιείμ ηαιπήξ βζα ηδκ έκανλδ ηδξ ηανηζκζηήξ ιεηάζηαζδξ. Ίζςξ θμζπυκ δ κζημηίκδ, υπζ ιυκμ κα πονμδμηεί ηδ δδιζμονβία κεμπθαζιάηςκ, αθθά αηυια ηαζ κα ηα μδδβεί ζηδ ελάπθςζδ/ιεηάζηαζδ. Άθθα ιμκμπάηζα ιέζς ηςκ μπμίςκ δνμοκ μζ α7 nachr, επάβμκηαξ ηδκ ελάπθςζδ ηανηζκζηχκ ηοηηάνςκ, πενζθαιαάκμοκ εκενβμπμίδζδ ηςκ NF-kB ηαζ SrC, ηαεχξ ηαζ ημ ιμκμπάηζ ηςκ Akt, HIF-1a, 5-θζπμλοβεκάζδξ (Adams, L. et al. 1995) ηαζ COX-2 (Trombino et al. 2004). ε ηφηηανα ιεζμεδθζχιαημξ, δ πνυζδεζδ κζημηίκδξ ζημοξ α7 nachr πνμηαθεί εζζνμή Ca 2+ δ μπμία εκενβμπμζεί ηζξ ηζκάζεξ MEKK1 ηαζ ERK1/2. ηδ ζοκέπεζα δ ΜΔΚΚ1 εκενβμπμζεί ημκ ιεηαβναθζηυ πανάβμκηα NF-kB, μ μπμίμξ πνμηαθεί ηδκ είζμδμ ημο ηοηηανζημφ ηφηθμο ζηδ θάζδ S (Hughes, B. W., Kusner & Kaminski 2006; Trombino et al. 2004). Μαηνμπνυκζα έηεεζδ επζεδθζαηχκ ηοηηάνςκ πκεφιμκα πμκηζημφ ζε κζημηίκδ, έπεζ δεζπεεί υηζ αολάκεζ ηα επίπεδα ηδξ ηοηθίκδξ D1 ηαζ εζζάβεζ ηα ηφηηανα ζηδ θάζδ S ημο ηοηηανζημφ ηφηθμο (Egleton, Brown & Dasgupta 2008). Δπζπθέμκ ιεθέηεξ ζε Α549 NSCLC ηφηηανα, έδεζλακ υηζ δ κζημηίκδ ιπμνεί κα επζηαπφκεζ ημκ ηοηηανζηυ πμθθαπθαζζαζιυ ιέζς ημο α7 nachr ηαζ ιάθζζηα ιε ζοβηέκηνςζδ 1ιΜ, δ μπμία είκαζ ηαζ δ ιέζδ ζοβηέκηνςζδ ζημ πθάζια ηςκ ηαπκζζηχκ. Πνυζδεζδ κζημηίκδξ ζημκ α7 nachr ανέεδηε υηζ επάβεζ ηδκ πνυζδεζδ ηδξ ζδιαημδμηζηήξ ηζκάζδξ c-src ζημκ α7 nachr ιέζς ηδξ πνςηεΐκδξ α-αννεζηίκδξ. Ζ πνυζδεζδ αοηή επάβεζ ηδ ζφκδεζδ ηδξ ηζκάζδξ Raf-1 ιε ημ ζφιπθμημ ηςκ ιεηαβναθζηχκ παναβυκηςκ E2F ηαζ πνςηεΐκδξ ημο νεηζκμαθαζηχιαημξ (Rb). Αοηή δ ζφκδεζδ Rb-Δ2F-Raf-1 πνμηαθεί ηδκ απεθεοεένςζδ ιεηαβναθζηχκ παναβυκηςκ Δ2F, μζ μπμίμζ πανμοζία επζπθέμκ ιζημβυκςκ ενεεζζιάηςκ πνμζδέκμκηαζ ζε οπμηζκδηέξ πμο επάβμοκ ηδκ είζμδμ ζηδ 39

40 θάζδ S ημο ηοηηανζημφ ηφηθμο, εκενβμπμζχκηαξ ημκ ηοηηανζηυ πμθθαπθαζζαζιυ (DasguptaRastogi, et al. 2006). οκμρίγμκηαξ έπεζ απμδεζπεεί υηζ δ κζημηίκδ είκαζ μοζία-ηθεζδί βζα ηδκ ειθάκζζδ ημο ηανηίκμο ζε ηαπκζζηέξ. Αοηυ δείπκεζ αθεκυξ ημ πυζμ ιεβάθδ επίδναζδ έπεζ δ κζημηζκζηή ζδιαημδυηδζδ αηυια ηαζ βζα ιδ κεονζηά ηφηηανα ηαζ πυζμ ιεβάθεξ πνμμπηζηέξ έπεζ δ ζηυπεοζδ ηςκ nachr ζηδ εεναπεία ημο ηανηίκμο ηαζ αθεηένμο πυζμ ζμαανά πνέπεζ κα επακελεηαζηεί δ πνήζδ ηζζνυηςκ ηαζ ηζζπθχκ κζημηίκδξ ςξ οπμηαηάζηαημ ημο ηαπκίζιαημξ. Δηθόλα 14. Απινπνηεκέλε απεηθόληζε νξηζκέλσλ βηνρεκηθώλ κνλνπαηηώλ πνπ ζπλδένπλ ηνπο α7 nachr κε ηε δηέγεξζε ηνπ θπηηαξηθνύ πνιιαπιαζηαζκνύ. α) ηα ηφηηανα ζε θάζδ αδνάκεζαξ δ ζδιαημδμηζηή ηζκάζδ SrC, δ α-αννεζηίκδ ηαζ μ α7 nachr δεκ ζπεηίγμκηαζ ηαζ δ πνςηεΐκδ ημο νεηζκμαθαζηχιαημξ Rb είκαζ απθά ζοκδειέκδ ιε ημκ ιεηαβναθζηυ πανάβμκηα Δ2F. β) Ζ πνυζδεζδ ηδξ κζημηίκδξ ζημκ α7 nachr επάβεζ ηδ δδιζμονβία ζοιπθυημο πμο πενζθαιαάκεζ ημκ α7 nachr, ηδ α-αννεζηίκδ ηαζ ηδ ηζκάζδ SrC ημ μπμίμ εκενβμπμζεί ηδκ ηεθεοηαία. Ζ εκενβμπμίδζδ ηδξ SrC επάβεζ ηδκ ζφκδεζδ ιεηαλφ Rb, E2F ηαζ Raf-1. Πανμοζία επζπθέμκ ιζημβυκςκ ζδιάηςκ μδδβμφκ ζηδκ απεθεοεένςζδ Δ2F μ μπμίμξ είκαζ ιεηαβναθζηυξ πανάβμκηαξ πμο μδδβεί ημ ηφηηανμ ζηδ θάζδ S ημο ηοηηανζημφ ηφηθμο. Δκαθθαηηζηά μ α7 nachr ιπμνεί κα επάβεζ ημκ ηοηηανζηυ πμθθαπθαζζαζιυ ιέζς ηδξ εζζυδμο Ca 2+ δ μπμία εκενβμπμζεί ηζξ ηζκάζεξ MEKK1 ηαζ ERK. Ζ MEKK1 εκενβμπμζεί ηεθζηά ημκ NFηΒ εκχ δ ERK επάβεζ ηδκ απεθεοεένςζδ Δ2F. [Σνμπμπμζδιέκμ απυ (Egleton, Brown & Dasgupta 2008)]. 40

41 Α.15. Ο ΡΟΛΟ ΣΧΝ ΝΔΤΡΗΚΟΤ ΣΤΠΟΤ nachr ΣΖΝ ΑΓΓΔΗΟΓΔΝΔΖ Αββεζμβέκεζδ είκαζ δ δζαδζηαζία δδιζμονβίαξ κέςκ αββείςκ ζημκ μνβακζζιυ. ηδ δζαδζηαζία ηδξ αββεζμβέκεζδξ ζδιακηζηυ νυθμ παίγμοκ ηα αββεζαηά εκδμεδθζαηά ηφηηανα ηα μπμία αθμφ δζεβενεμφκ, απμζημδμιμφκ ηδ ααζζηή ιειανάκδ ιε ιεηαθθμπνςηεάζεξ ηαζ ζηδ ζοκέπεζα πνμςεμφκηαζ, εβηαείζηακηαζ ηαζ πμθθαπθαζζάγμκηαζ ζηδκ επζθάκεζα ηςκ ηεκχκ πμο δδιζμονβμφκηαζ (Coultas, Chawengsaksophak & Rossant 2005). Ζ αηεηοθμπμθίκδ εεςνείηαζ υηζ είκαζ αοημηνζκήξ ηαζ παναηνζκήξ μνιυκδ πμο δνα ζημοξ κζημηζκζημφξ οπμδμπείξ ηςκ αββεζαηχκ εκδμεδθζαηχκ ηοηηάνςκ. Σμ βεβμκυξ υηζ ηυζμ μ ακαζημθέαξ αηεηοθμπμθζκεζηενάζδξ κεμζηζβιίκδ υζμ ηαζ δ κζημηίκδ επζηαπφκμοκ ηαζ εκζζπφμοκ ηδ δζαδζηαζία ηδξ αββεζμβέκεζδξ επζαεααζχκμοκ ηδκ εεςνία αοηή (Cooke & Bitterman 2004; Villablanca 1998). Οζ nachr πμο εδνεφμοκ ζηα εκδμεδθζαηά αββεζαηά ηφηηανα είκαζ μζ α7 ηαζ μζ εηενμιενείξ πμο ζοβηνμημφκηαζ απυ ηζξ οπμιμκάδεξ α3, α5, α2 ηαζ α4 (Heeschen et al. 2002). Όιςξ μ α7 θαίκεηαζ κα είκαζ μ πζμ πμθοπθδεήξ ηαζ μ πζμ ζδιακηζηυξ (Maus et al. 1998). Ζ αββεζμβέκεζδ, εηηυξ απυ ιζα θοζζμθμβζηή δζενβαζία ζημκ μνβακζζιυ, είκαζ επίζδξ ηαζ έκα ζηάδζμ-ηθεζδί ζηδ δζαδζηαζία ηδξ ακάπηολδξ ηανηζκζηχκ υβηςκ. Έκαξ ηανηζκζηυξ υβημξ ιπμνεί κα πνμζθαιαάκεζ ενεπηζηά ζοζηαηζηά ιε απθή δζάποζδ υηακ δ δζάιεηνυξ ημο δεκ λεπενκά ηα 1-2 mm. Γζα κα ζοκεπίζεζ κα ακαπηφζζεηαζ υιςξ πνεζάγεηαζ αζιμθυνα αββεία, δ δδιζμονβία ηςκ μπμίςκ ηαεμνίγεηαζ απυ ιζα ζζμννμπία αββεζμβεκεηζηχκ-ακηζαββεζμβεκεηζηχκ παναβυκηςκ, ζημοξ μπμίμοξ ζοιπενζθαιαάκμκηαζ ηαζ δ οπμλία, ημ ιεζςιέκμ ph, δ παιδθή ζοβηέκηνςζδ βθοηυγδξ ή δ ηοπυκ φπανλδ θθεβιμκήξ (Pandya, Dhalla & Santani 2006). οπκά ηα ηανηζκζηά ηφηηανα πανάβμοκ ζζπονμφξ αββεζμβεκεηζημφξ πανάβμκηεξ υπςξ μ VEGF επάβμκηαξ ηδ δδιζμονβία κέςκ αββείςκ ηα μπμία δζένπμκηαζ ιέζα απυ ηδ ιάγα ηςκ υβηςκ. Όιςξ ηυζμ δ αββεζμβεκεηζηή δνάζδ ημο VEGF υζμ ηαζ ημο bfgf έπεζ δεζπεεί υηζ ιπθμηάνμκηαζ πανμοζία α-bgtx (Ng, Krilleke & Shima 2006). Έκαξ ηνυπμξ πμο δ κζημηίκδ επάβεζ ηδκ αββεζμβέκεζδ είκαζ αολάκμκηαξ ηα επίπεδα πμθθχκ αββεζμβεκεηζηχκ παναβυκηςκ υπςξ μ VEGF, o BDNF, EGF, HGF, PDFG (Conti-Fine et al. 2000). Ζ ακάπηολδ εηθεηηζηχκ κζημηζκζηχκ ακηαβςκζζηχκ ιπμνεί κα ακμίλεζ κέμοξ δνυιμοξ ζηδ εεναπεία ημο ηανηίκμο ζημ επίπεδμ ηδξ αββεζμβέκεζδξ (Arias et al. 2009). 41

42 Α.16. Ο ΡΟΛΟ ΣΧΝ ΝΔΤΡΗΚΟΤ ΣΤΠΟΤ nachr ΣΖ ΝΟΟ ΣΟΤ ALZHEIMER Ζ ζοβηέκηνςζδ ζοζζςιαηςιέκμο α-αιοθμεζδμφξ πεπηζδίμο ζε πενζμπέξ ημο εβηεθάθμο ήηακ βκςζηυ υηζ μδδβεί ζηδ κεονμεηθοθζζηζηή κυζμ ημο Alzheimer. Όιςξ ηα ηεθεοηαία πνυκζα έπεζ ανπίζεζ κα απμηαθφπηεηαζ ηαζ μ νυθμξ ημο α7 nachr ζηδκ παεμβέκεζα ηδξ κυζμο (Parri, Hernandez & Dineley 2011). οβηεηνζιέκα παναηδνείηαζ εηθεηηζηή εηθφθζζδ πμθζκενβζηχκ κεονχκςκ ζημκ εβηεθαθζηυ θθμζυ, ιε ημκ ζππυηαιπμ κα είκαζ ιζα ζδζαίηενα εοάθςηδ ζηδκ αζεέκεζα πενζμπή, δ μπμία είκαζ ηαζ απυ ηζξ πνχηεξ πμο πνμζαάθθμκηαζ ηαηά ηδκ ελέθζλδ ηδξ αζεέκεζαξ, ιε απμηέθεζια ηδ δναιαηζηή ιείςζδ ηδξ ζηακυηδηαξ βζα ικήιδ-ιάεδζδ (Chrobak et al. 1988; Hasselmo 1999). Ζ ηθζκζηή παναηήνδζδ ηδξ αεθηίςζδξ ηςκ ζοιπηςιάηςκ ηδξ κυζμο ιεηά απυ πμνήβδζδ πμθζκενβζηχκ αβςκζζηχκ, ηαεχξ επίζδξ ηαζ ηδξ ζοζπέηζζδξ ιεηαλφ ηδξ έκηαζδξ ηςκ ζοιπηςιάηςκ ηαζ ηδξ ιείςζδξ ηςκ πμθζκενβζηχκ οπμδμπέςκ, δείπκμοκ υηζ οπάνπεζ ειπθμηή ηςκ ηεθεοηαίςκ (Doody et al. 2001; Minger et al. 2000; Pappas et al. 2000). Ζ οπυεεζδ αοηή εκζζπφεηαζ επίζδξ ηαζ απυ ημ βεβμκυξ υηζ μζ πενζζζυηενμζ κεονχκεξ ημο ζππυηαιπμο είκαζ ζδζαίηενα πθμφζζμζ ζε α7 nachr (Ikonomovic et al. 2009; Wang, H. Y. et al. 2009). ηα πνχηα ζηάδζα ηδξ ελέθζλδξ ηδξ κυζμο παναηδνείηαζ ανπζηά ιζα αφλδζδ ηδξ έηθναζδξ ημο α7 οπμδμπέα, πζεακυκ ςξ πνμζπάεεζα ακηζζηάειζζδξ ηδξ αθάαδξ ηαζ ζηδ ζοκέπεζα ιεβάθμ ιένμξ ηδξ πμθζκενβζηήξ έηπηςζδξ πμο παναηδνείηαζ μθείθεηαζ ζε πηχζδ ηδξ έηθναζδξ ηαζ ηδξ θεζημονβίαξ ημο ίδζμο οπμδμπέα (Fabian-Fine et al. 2001; Keller, C. et al. 2011; Perry et al. 1987). Λαιαάκμκηαξ οπυρδ ηαζ ημ βεβμκυξ υηζ μ α7 οπμδμπέαξ νοειίγεζ ηδκ είζμδμ Ca 2+ ηαζ υηζ επδνεάγεζ υθεξ ηζξ θεζημονβίεξ ηςκ κεονχκςκ πμο ημκ εηθνάγμοκ, δεκ απμηεθεί έηπθδλδ ημ βεβμκυξ υηζ δ εκενβμπμίδζδ ημο οπμδμπέα ιε αβςκζζηέξ αεθηζχκεζ ηδκ ηθζκζηή εζηυκα ηςκ αζεεκχκ (Dani 2001; Gray et al. 1996; Rezvani, Bushnell & Levin 2002). Ζ ακαηάθορδ υηζ ημ α-αιοθμεζδέξ πνμζδέκεηαζ ζζπονά ζημκ α7 nachr έδςζε κέα χεδζδ ζηδκ ένεοκα βζα ηδ κυζμ ημο Alzheimer. Ζ επζηναημφζα εεςνεία πνμηείκεζ έκα θοζζμθμβζηυ νυθμ ζηδκ αθθδθεπίδναζδ αοηή, ηαεχξ ημ α-αιοθμεζδέξ πεπηίδζμ πανάβεηαζ ηαζ θοζζμθμβζηά ζηα ηφηηανα, ζε δζαθοηή υιςξ ιμνθή (Dineley 2007; Ikonomovic et al. 2009; Wang, H. Y. et al. 2009). ηδκ πενίπηςζδ ηδξ κυζμο, ημ ζοζζςιαηςιέκμ α-αιοθμεζδέξ θαίκεηαζ κα ιπθμηάνεζ ηζξ θοζζμθμβζηέξ θεζημονβίεξ 42

43 ημο οπμδμπέα, μζ μπμίεξ ζοιαάθθμοκ ηαζ ζηδκ πνμζηαζία ηαζ ζοκηήνδζδ ηςκ κεονχκςκ (Bencherif 2009). οιπεναζιαηζηά, δ έκημκδ πανμοζία nachr ζηα ηέκηνα ημο εβηεθάθμο ηα μπμία πθήηημκηαζ απυ ηδ κυζμ ημο Alzheimer, ημ βεβμκυξ υηζ δ κυζμξ ιεζχκεζ δναζηζηά ηδ ζοβηέκηνςζή ημοξ ηαζ υηζ δ εκενβμπμίδζή ημοξ απαθφκεζ πνμζςνζκά ηα ζοιπηχιαηα ηδξ κυζμο, υπςξ ηαζ δ ζζπονή ζοββέκεζα ημο α-αιοθμεζδμφξ ιε ημκ α7 nachr, θαιαάκμκηαξ οπυρδ ηαζ ημοξ ζπμοδαίμοξ νυθμοξ πμο μζ nachr επζηεθμφκ ζημοξ κεονχκεξ πμο εδνάγμκηαζ, οπμδεζηκφμοκ ηδκ ειπθμηή ηςκ nachr ζηδ παεμβέκεζα ηδξ κυζμο ημο Alzheimer, ηαεχξ ηαζ ηζξ πζεακέξ εθανιμβέξ ηδξ βκχζδξ αοηήξ ζηζξ ένεοκεξ πμο βίκμκηαζ βζα ηδκ εεναπεία ηδξ ζοβηεηνζιέκδξ κυζμο. Α.17. Ο ΡΟΛΟ ΣΧΝ ΝΔΤΡΗΚΟΤ ΣΤΠΟΤ nachr ΣΖ ΥΗΕΟΦΡΔΝΗΑ Ζ ζπζγμθνέκζα είκαζ ιζα πνυκζα ροπζηή δζαηαναπή ηαζ εεςνείηαζ υηζ έπεζ ηαζ έκα ζδιακηζηυ βεκεηζηυ οπυααενμ. Όιςξ μ αηνζαήξ ιδπακζζιυξ ειθάκζζδξ ηδξ ζπζγμθνέκζαξ δεκ είκαζ αηυιδ βκςζηυξ. Δίκαζ εκδζαθένμκ υηζ ιεηαλφ ηςκ αζεεκχκ ιε ζπζγμθνέκζα ημ πμζμζηυ ηςκ ηαπκζζηχκ είκαζ πμθφ ορδθυηενμ (80-90%) ζε ζπέζδ ιε ημ ακηίζημζπμ πμζμζηυ ζημ βεκζηυ πθδεοζιυ (25-30%) (de Leon & Diaz 2012). Έπεζ δεζπεεί υηζ δ πνήζδ ηαπκμφ αεθηζχκεζ πανμδζηά ηδκ ηθζκζηή εζηυκα ηςκ ζπζγμθνεκχκ αζεεκχκ (Adler et al. 1993). Οζ Leonard ηαζ ζοκενβάηεξ ημ 2002 παναηήνδζακ ιζα αολδιέκδ ζοπκυηδηα ζηζξ ιεηαθθάλεζξ ημο οπμηζκδηή ηςκ α7 οπμιμκάδςκ ζημοξ ζπζγμθνεκείξ αζεεκείξ ζε ζπέζδ ιε ημ πμζμζηυ ημο βεκζημφ πθδεοζιμφ. Δπζπθέμκ ιεθέηεξ ζε πηςιαηζημφξ εβηεθάθμοξ ζπζγμθνεκχκ αζεεκχκ απμηάθορακ δζαηαναπέξ ζηδκ έηθναζδ ηυζμ ηςκ α7 υζμ ηαζ ηςκ α4α2 nachr (Freedman et al. 1995). Σα παναπάκς οπμδδθχκμοκ υηζ μζ nachr παίγμοκ ηάπμζμ νυθμ ζηδκ παεμθοζζμθμβία ηδξ κυζμο, βεβμκυξ πμο δείπκεζ υηζ αλίγεζ κα δζενεοκδεμφκ πενεηαίνς βζα ηοπυκ ειπθμηή ημοξ ζηδ κυζμ ηαεχξ ηαζ πζεακή αλζμπμίδζή ημοξ ζε εεναπείεξ ηδξ ζπζγμθνέκζαξ. 43

44 Α.18. Ο ΡΟΛΟ ΣΧΝ ΝΔΤΡΗΚΟΤ ΣΤΠΟΤ nachr ΣΖΝ ΔΞΑΡΣΖΖ ΑΠΟ ΣΖ ΝΗΚΟΣΗΝΖ Χξ βκςζηυκ δ ελάνηδζδ ζηδκ πενίπηςζδ ημο ηαπκίζιαημξ ηαπκμφ, μθείθεηαζ ζηδ κζημηίκδ πμο αοηυξ πενζέπεζ. Καηά ηδ δζάνηεζα ημο ηαπκίζιαημξ, δ κζημηίκδ πμο έπεζ πενάζεζ ζηδκ αένζα θάζδ, απμννμθάηαζ ηαπφηαηα απυ ημοξ πκεφιμκεξ, δζαπενκά ημκ αζιαημεβηεθαθζηυ θναβιυ, εζζένπεηαζ ζημκ εβηέθαθμ ηαζ πνμζδέκεηαζ ζημοξ nachr ημο ΚΝ. Ο εεζζιυξ ζηδ κζημηίκδ δζαηνίκεηαζ ζε ηνία ζηάδζα. ημ πνχημ ζηάδζμ δ πνυζδεζδ ηδξ κζημηίκδξ ζημοξ nachr πνμηαθεί αζζεήιαηα εοθμνίαξ, εοπανίζηδζδξ, παθάνςζδξ, αζζζμδμλίαξ ηαζ αολδιέκδξ ζοβηέκηνςζδξ (Henningfield, Miyasato & Jasinski 1985). Σα παναπάκς αζζεήιαηα παίγμοκ ζδιακηζηυ νυθμ βζα ηδκ έκανλδ ηαζ ηδ ζοκέπζζδ ηδξ ζοκήεεζαξ ημο ηαπκίζιαημξ (Watkins, Koob & Markou 2000). ημ δεφηενμ ζηάδζμ πενζθαιαάκμκηαζ ηα ζοιπηχιαηα πμο κμζχεεζ μ ελανηδιέκμξ ηαπκζζηήξ ακ ζηαιαηήζεζ κα θαιαάκεζ κζημηίκδ. Σα ζοιπηχιαηα αοηά παναηδνμφκηαζ επεζδή δ πνυκζα πνυζθδρδ κζημηίκδξ έπεζ επζθένεζ ηνμπμπμζήζεζξ ζημοξ κεονμαζμπδιζημφξ ιδπακζζιμφξ θήρδξ ακηαιμζαήξ-εοπανίζηδζδξ ηαζ πενζθαιαάκμοκ πεζιέκδ ροπμθμβία, αίζεδια ιζγένζαξ, εοενεεζζηυηδηα, άβπμξ, δοζημθία ζοβηέκηνςζδξ, ατπκία, βαζηνεκηενζηέξ εκμπθήζεζξ, αηυια ηαζ αναδοηανδία (Hughes, J. R. et al. 1991). Σμ ηνίημ ζηάδζμ ακαθένεηαζ ζηδ ηάζδ πμο έπμοκ αοημί πμο δζέημρακ ημ ηάπκζζια κα επζζηνέρμοκ ζηδκ ελάνηδζή ημοξ αηυια ηαζ ιεηά απυ πνυκζα. Όπςξ ζοιααίκεζ ηαζ ιε άθθεξ ελανηήζεζξ, δ επακεηηίκδζδ ηδξ ζοκήεεζαξ ημο ηαπκίζιαημξ ζοπκά ζοιααίκεζ ιεηά ηδκ έηεεζδ ημο πνχδκ ηαπκζζηή ζε έκα πενζαάθθμκ πμο ζπεηίγεηαζ εεηζηά ιε αοηή ηδ ζοκήεεζα, υπςξ ζοβηεηνζιέκα άημια, πχνμζ ηηθ (Hughes, J. R., Keely & Naud 2004). Καηά ηδ δζάνηεζα ημο ηαπκίζιαημξ, δ κζημηίκδ πμο πνμζδέκεηαζ ζημοξ κζημηζκζημφξ οπμδμπείξ ημο ιεζμιεηαζπιζαημφ ζοζηήιαημξ ακηαιμζαήξ (ΜΑ) δδιζμονβεί ζοκαζζεήιαηα εοπανίζηδζδξ ηαζ ζηακμπμίδζδξ. Σμ ΜΑ πενζθαιαάκεζ κημπαιζκενβζημφξ κεονχκεξ μζ μπμίμζ λεηζκμφκ απυ ηδκ VTA ηαζ απεθεοεενχκμοκ κημπαιίκδ ζε πενζμπέξ πμο ζπεηίγμκηαζ ιε ηδ ικήιδ-ιάεδζδ αθθά ηαζ ιε ζοκαζζεήιαηα. Σέημζεξ πενζμπέξ είκαζ δ αιοβδαθή, μ ζππυηαιπμξ ηαζ μ πνμιεηςπζαίμξ θθμζυξ. Ζ κζημηίκδ πνμζδεκυιεκδ ζημοξ nachr ηςκ κημπαιζκενβζηχκ κεονχκςκ ημο ΜΑ πνμηαθεί απεθεοεένςζδ πενζζζυηενδξ κημπαιίκδξ, δ μπμία πνμηαθεί ηα ζοκαζζεήιαηα ζηακμπμίδζδξ-εοπανίζηδζδξ (Balfour 2009). 44

45 Ζ κζημηίκδ επζπθέμκ ιεηααάθθεζ ηαζ έιιεζα ηα επίπεδα απεθεοεένςζδξ κημπαιίκδξ πνμζδεκυιεκδ ζε nachr πμο ανίζημκηαζ ζε εκενβμπμζδηζημφξ βθμοηαιζκενβζημφξ ηαζ ηαηαζηαθηζημφξ GABAενβζημφξ κεονχκεξ, μζ μπμίμζ εδνάγμκηαζ ζε δζάθμνα ηέκηνα ημο εβηεθάθμο (π.π. αιοβδαθή, ζππυηαιπμξ) ηαζ επδνεάγμοκ ηδκ έηηνζζδ κημπαιίκδξ απυ ημοξ κημπαιζκενβζημφξ κεονχκεξ. Οζ βθμοηαιζκενβζημί κεονχκεξ αολάκμοκ ηδκ έηηνζζδ κημπαιίκδξ, εκχ ακηζεέηςξ μζ GABAενβζημί ηδκ ιεζχκμοκ. Πζζηεφεηαζ πςξ ηαζ μζ βθμοηαιζκενβζημί ηαζ μζ GABAενβζημί κεονχκεξ παίγμοκ νυθμ ζηδκ ελάνηδζδ απυ ηδ κζημηίκδ (Markou 2008). Οζ nachr ανίζημκηαζ αηυια ηαζ ζε κεονχκεξ πμο εηηνίκμοκ ηαζ άθθμοξ κεονμδζααζααζηέξ υπςξ ζενμημκίκδ, κμνεπζκεθνίκδ, μπζμεζδή ηαζ ηακκααζκμεζδή, αθθά μ νυθμξ ημοξ ζημκ εεζζιυ ζηδ κζημηίκδ δεκ έπεζ αηυια δζενεοκδεεί επανηχξ. Α ΔΠΗΓΡΑΖ ΚΑΘΔ ΔΗΓΟΤ ΝΔΤΡΗΚΟΤ ΣΤΠΟΤ nachr ΣΟΝ ΔΘΗΜΟ ΣΖ ΝΗΚΟΣΗΝΖ Πεζνάιαηα ζε γχα έπμοκ δείλεζ υηζ δζαθμνεηζημί ηφπμζ nachr παίγμοκ ιεβαθφηενμ ή ιζηνυηενμ νυθμ ζηδκ ελάνηδζδ απυ ηδ κζημηίκδ. Οζ nachr πμο θαίκεηαζ κα παίγμοκ ημκ πζμ ζπμοδαίμ νυθμ είκαζ μζ πενζέπμκηεξ ηδκ οπμιμκάδα α2. ηδκ ένεοκα ηςκ Picciotto ηαζ ζοκενβαηχκ ημ 1998, πμκηίηζα knockout ζηδκ α2 οπμιμκάδα δεκ πμνδβμφζακ ζημκ εαοηυ ημοξ κζημηίκδ, υηακ υιςξ δ α2 οπμιμκάδα εηθναγυηακ ζημκ εβηέθαθυ ημοξ ιέζς βεκεηζημφ πεζνζζιμφ, ηα πμκηίηζα λεηίκδζακ κα αοημπμνδβμφκ κζημηίκδ. Δπζπθέμκ υηακ ζηα πμκηίηζα επμνδβείημ κζημηζκζηυξ ακηαβςκζζηήξ, εζδζηυξ βζα ημκ α4α2 nachr, δ αοημπμνήβδζδ κζημηίκδξ ιεζςκυηακ. Οζ nachr πμο πενζέπμοκ α6 ηαζ α7 οπμιμκάδεξ θαίκεηαζ κα παίγμοκ επίζδξ νυθμ ζημκ εεζζιυ ζηδ κζημηίκδ, ηαεχξ ζε ένεοκεξ ηςκ Dwoskin ηαζ ζοκενβαηχκ ημ 2009 ηαζ ηςκ Markou & Paterson ημ 2001 ακηζζημίπςξ, ανέεδηε υηζ ανμοναίμζ ζημοξ μπμίμοξ πμνδβήεδηακ ακηαβςκζζηέξ εζδζημί βζα ημοξ ακηίζημζπμοξ οπμδμπείξ ιείςζακ ηδκ αοημπμνήβδζδ κζημηίκδξ. Ακηίεεηα, nachr μζ μπμίμζ πενζείπακ ηδκ α5 οπμιμκάδα θαίκεηαζ κα δνμοκ εκάκηζα ζημκ εεζζιυ ζηδ κζημηίκδ, ηαεχξ πμκηίηζα knockout βζα ηδκ α5 οπμιμκάδα αοημπμνήβδζακ πενζζζυηενδ κζημηίκδ ζε ζπέζδ ιε ηα θοζζμθμβζηά πμκηίηζα (Fowler et al. 2011). Με αάζδ ηα παναπάκς, επυιεκμ ήηακ κα είκαζ μζ nachr πνχημξ ζηυπμξ ζηδ θανιαηεοηζηή αβςβή βζα ηδ δζαημπή ημο ηαπκίζιαημξ. Γζα πανάδεζβια δ αανεκζηθίκδ είκαζ έκαξ ιενζηυξ αβςκζζηήξ ηςκ α4α2 nachr μ μπμίμξ ηαηαθαιαάκεζ ηζξ εέζεζξ υπμο δεζιεουηακ δ κζημηίκδ πνζκ ηδ δζαημπή ημο ηαπκίζιαημξ ηαζ εκενβμπμζεί 45

46 αζεεκχξ ημοξ οπμδμπείξ αοημφξ πνμηεζιέκμο κα ιεηνζαζημφκ ηα ζοιπηχιαηα ηδξ ζηένδζδξ. Δηηυξ απυ ηδ πνήζδ ιενζηχκ αβςκζζηχκ δζενεοκάηαζ ηαζ δ πνήζδ αθθμζηενζηχκ ηνμπμπμζδηχκ μζ μπμίμζ εα πνμζδέκμκηαζ ζε εέζεζξ ηςκ nachrs, δζαθμνεηζηέξ απυ αοηέξ πμο πνμζδέκεηαζ δ αηεηοθμπμθίκδ ηαζ εα ιπμνμφζακ κα αθθάλμοκ ημκ ηνυπμ ιε ημκ μπμίμ ακηζδνμφκ μζ οπμδμπείξ ζηδκ πνυζδεζδ κζημηίκδξ (Taly et al. 2009; Yoshimura et al. 2007). Γζα πανάδεζβια έκαξ αθθμζηενζηυξ ηνμπμπμζδηήξ εα ιπμνμφζε κα ιεζχκεζ ηα αζζεήιαηα ζηακμπμίδζδξ, εοπανίζηδζδξ ηαζ παθάνςζδξ πμο πνμηαθεί δ κζημηίκδ ηαηά ηδ δζάνηεζα ημο ηαπκίζιαημξ πςνίξ κα επδνεάγεζ ηζξ θοζζμθμβζηέξ θεζημονβίεξ πμο επζηεθεί δ πνυζδεζδ ηδξ Ach ζημοξ nachr (D'Souza & Markou 2011). Δηθόλα 15. Δλώζεηο πνπ ρξεζηκνπνηνύληαη ή δνθηκάδνληαη σο θάξκαθα γηα ηε δηαθνπή ηνπ θαπλίζκαηνο. [Σνμπμπμζδιέκμ απυ (Romanelli et al. 2007)]. 46

47 Α.19. Ο ΡΟΛΟ ΣΧΝ ΝΔΤΡΗΚΟΤ ΣΤΠΟΤ nachr ΣΖΝ ΚΑΣΑΘΛΗΦΖ Ζ ηαηάεθζρδ είκαζ ιζα δζαηαναπή δ μπμία πνμζαάθθεζ πενίπμο ημ 25% ημο βεκζημφ πθδεοζιμφ, ιε ζοιπηχιαηα ηδκ ακαίηζα έκημκδ εθίρδ, απεθπζζία, ακδδμκία (ακζηακυηδηα ημο αηυιμο κα κμζχζεζ εοπανίζηδζδ), δζαηαναπέξ ημο φπκμο ηαζ ηδξ υνελδξ, ηαεχξ ηαζ απχθεζα ηδξ εκενβδηζηυηδηαξ ημο αηυιμο (Mineur & Picciotto 2010). Έπεζ απμδεζπεεί υηζ οπάνπεζ λεηάεανδ ζπέζδ ιεηαλφ ημο ηαπκίζιαημξ ηαζ ηδξ ηαηάεθζρδξ. Σα πμζμζηά ηαηάεθζρδξ ζημοξ ηαπκζζηέξ ηοιαίκμκηαζ ιεηαλφ 50-60% ζε ακηίεεζδ ιε ηα ακηίζημζπα πμζμζηά ημο βεκζημφ πθδεοζιμφ (25%) (Glassman et al. 1990). Δπίζδξ, μζ ηαπκζζηέξ ιε ζζημνζηυ ηαηάεθζρδξ είκαζ 2 έςξ 3 θμνέξ πζεακυηενμ κα απμηφπμοκ κα δζαηυρμοκ ημ ηάπκζζια ζε ζπέζδ ιε ημοξ ιδ ηαηαεθζπηζημφξ (Covey, Glassman & Stetner 1998). Δπζπθέμκ δ δζαημπή ημο ηαπκίζιαημξ ιπμνεί κα μδδβήζεζ ηαηαεθζπηζημφξ ηαπκζζηέξ ζε ηαηαεθζπηζηά επεζζυδζα (Glassman et al. 1990). Σέθμξ έπεζ δεζπεεί υηζ ηζζνυηα κζημηίκδξ ιπμνμφκ κα ιεζχζμοκ ηα ζοιπηχιαηα ηδξ ηαηάεθζρδξ αηυια ηαζ ζε ιδ ηαπκζζηέξ ηαηαεθζπηζημφξ. (Salín-Pascual et al. 1995). Όθα ηα παναπάκς δείπκμοκ υηζ δ κζημηίκδ ιε ηάπμζμ ηνυπμ ιεζχκεζ ηα ζοιπηχιαηα ηδξ κυζμο. Ζ δνάζδ ηδξ κζημηίκδξ δζαηνίκεηαζ ζε δομ ζηάδζα. Ανπζηά εκενβμπμζεί ημοξ nachr ηάκμκηάξ ημοξ κα ακμίλμοκ, εκχ ζηδ ζοκέπεζα πνμηαθείηαζ απεοαζζεδημπμίδζδ. Ζ ακηζηαηαεθζπηζηή δνάζδ ηδξ κζημηίκδξ πμο παναηδνήεδηε ζηζξ παναπάκς ιεθέηεξ ιπμνεί κα μθείθεηαζ ηυζμ ζηδκ ανπζηή εκενβμπμίδζδ-άκμζβια ηςκ κεονζημφ ηφπμο nachr υζμ ηαζ ζηδκ απεοαζζεδημπμίδζή ημοξ πμο ζοιααίκεζ θυβς ηδξ πνυκζαξ πμνήβδζδξ (Picciotto et al. 2008; Pidoplichko et al. 1997). Πάκηςξ ζε ηάεε πενίπηςζδ θαίκεηαζ πςξ μζ nachr ειπθέημκηαζ ζηδκ ηαηάεθζρδ. Οζ πνχημζ πμο δζαηφπςζακ ηδ εεςνία υηζ δ οπεναμθζηή πμθζκενβζηή δναζηδνζυηδηα ζημκ εβηέθαθμ ιπμνεί κα πνμδζαεέηεζ ζζπονά βζα ηαηάεθζρδ ήηακ μζ (Janowsky et al. 1972) μζ μπμίμζ εκέπθελακ ηαζ ηδ ιεζςιέκδ κμναδνεκαθζκζηή δναζηδνζυηδηα. Οζ παναπάκς μδδβήεδηακ ζημ ζοιπέναζια αοηυ απυ παναηδνήζεζξ υηζ μιάδεξ ημο πθδεοζιμφ πμο εηηέεδηακ ζε ακαζημθείξ αηεηοθμπμθζκεζηενάζδξ (π.π. μνβακμθςζθμνζηά εκημιμηηυκα) πανμοζίαγακ αολδιέκα πμζμζηά ηαηάεθζρδξ. Με αάζδ ηζξ παναηδνήζεζξ αοηέξ πμνήβδζακ ημκ ακαζημθέα αηεηοθμπμθζκεζηενάζδξ θοζμζηζβιίκδ, μ μπμίμξ δζαπενκά ημκ αζιαημεβηεθαθζηυ θναβιυ, ζε αζεεκείξ ιε ιακζμηαηάεθζρδ ηαζ παναηήνδζακ ιείςζδ ηςκ ζοιπηςιάηςκ ηδξ ιακίαξ ηαζ έκηαζδ ηςκ ζοιπηςιάηςκ ηδξ ηαηάεθζρδξ (Janowsky, el-yousef & Davis 1974). Όηακ δ 47

48 θοζμζηζβιίκδ πμνδβήεδηε ζε άημια πςνίξ ροπζαηνζηυ ζζημνζηυ παναηδνήεδηακ ηάπμζα ζοιπηχιαηα ηαηάεθζρδξ αθθά δ έκηαζή ημοξ δζέθενε πμθφ απυ άημιμ ζε άημιμ (Risch, Kalin & Janowsky 1981). Ακηζηαηαεθζπηζηή δνάζδ έπεζ παναηδνδεεί ηαζ ζε άθθμοξ κζημηζκζημφξ αβςκζζηέξακηαβςκζζηέξ ζε πεζναιαηυγςα. Γζα πανάδεζβια δ ιεηαιοθαιίκδ, έκαξ ιδ εζδζηυξ ηαζ ιδ ζοκαβςκζζηζηυξ ακηαβςκζζηήξ ηαζ έπεζ δείλεζ ακηζηαηαεθζπηζηή δνάζδ ζε πμκηίηζα (Andreasen et al. 2009; Caldarone et al. 2004; Risch, Kalin & Janowsky 1981). Ακηζηαηαεθζπηζηή δνάζδ έπεζ παναηδνδεεί επίζδξ ηαζ ζημοξ ιενζημφξ αβςκζζηέξ ηοηζζίκδ ηαζ αανεκζηθίκδ (Mihalak, Carroll & Luetje 2006; Rollema et al. 2007). Απυ ηζξ παναπάκς εκχζεζξ, δ ιεηαιοθαιίκδ, πμο ανπζηά πμνδβείημ ςξ ακηζοπενηαζζηυ, ενεοκάηαζ βζα πνήζδ ηαζ ςξ ακηζηαηαεθζπηζηυ ηαζ ζδζαίηενα ζηδκ πενίπηςζδ ηδξ δζαηαναπήξ Tourette, ζηδκ μπμία έπεζ δείλεζ πμθφ ηαθά πμζμζηά επζηοπίαξ (Silver, Shytle & Sanberg 2000; Silver et al. 2001). Δπζπθέμκ έπεζ δεζπεεί υηζ δ ζοβπμνήβδζδ ιεηαιοθαιίκδξ ή αανεκζηθίκδξ ιε οπμεεναπεοηζηέξ δυζεζξ ηθαζζζηχκ ακηζηαηαεθζπηζηχκ υπςξ ηα SSRI (Selective Serotonine Reuptake Inhibitors) ιπμνεί κα επάβεζ ακηζηαηαεθζπηζηή δνάζδ ηυζμ ζε ηνςηηζηά (Caldarone et al. 2004; Rollema et al. 2009) υζμ ηαζ ζε ακενχπμοξ (George et al. 2008; Philip et al. 2009). Μεηά ηδκ ακάπηολδ ηςκ SSRI (Selective Serotonin Reuptake Inhibitors) δ εεςνεία υηζ δ ηαηάεθζρδ μθείθεηαζ ζε έθθεζρδ ιμκμαιζκχκ έβζκε ηονίανπδ, αθθά πανυηζ μζ SSRI είκαζ απμηεθεζιαηζηά ηαζ αζθαθή θάνιαηα, πενίπμο ημ 50% ηςκ αζεεκχκ δεκ ακηζδνά ζε ηαιία απυ ηζξ ηαεζενςιέκεξ αοηέξ εεναπείεξ (Ruhé et al. 2006). Δπζπθέμκ είκαζ ζδζαίηενα εκδζαθένμκ υηζ ηα πενζζζυηενα απυ ηα πνδζζιμπμζμφιεκα ακηζηαηαεθζπηζηά έπμοκ δεζπεεί υηζ δνμοκ ηαζ ζακ κζημηζκζημί ακηαβςκζζηέξ ζε ζοβηεκηνχζεζξ επζπέδμο nm (Shytle et al. 2002). Αοηυ ίζςξ ελδβεί ηαζ ημ βζαηί πμθθέξ ηαηδβμνίεξ ακηζηαηαεθζπηζηχκ ιπμνμφκ κα αμδεήζμοκ ζηδ δζαημπή ημο ηαπκίζιαημξ ή ηαζ κα εκζζπφζμοκ άθθεξ εεναπείεξ βζα ηδ δζαημπή ημο (Shytle et al. 2002). Με αάζδ ηα παναπάκς, θαίκεηαζ υηζ δ ηαηάεθζρδ μθείθεηαζ ηυζμ ζε αολδιέκδ ζοβηέκηνςζδ αηεηοθμπμθίκδξ υζμ ηαζ ζε ιεζςιέκδ ζοβηέκηνςζδ ιμκμαιζκενβζηχκ δζααζααζηχκ, ηάηζ πμο ακμίβεζ κέμοξ δνυιμοξ ζηδκ ακηζιεηχπζζή ηδξ, ζδζαίηενα ζηζξ πενζπηχζεζξ εηείκεξ ηςκ αζεεκχκ πμο δεκ ακηζδνμφκ ζηδκ ηθαζζηή εεναπεία πμο ζημπεφεζ ζηδκ αφλδζδ ηδξ ζοβηέκηνςζδξ ηςκ ιμκμαιζκχκ. 48

49 Α.20. Ο ΡΟΛΟ ΣΧΝ ΝΔΤΡΗΚΟΤ ΣΤΠΟΤ nachr ΣΖΝ ΔΠΗΛΖΦΗΑ Δπζθδρία είκαζ ιζα πάεδζδ ημο ΚΝ δ μπμία παναηηδνίγεηαζ απυ επεζζυδζα επζθδπηζηχκ ηνίζεςκ. Έκα επζθδπηζηυ επεζζυδζμ λεηζκά υηακ ιζα πενζμπή ημο εβηεθάθμο οπενδζεβείνεηαζ. Ζ οπενδζέβενζδ αοηή ιπμνεί κα παναιείκεζ ζηδκ πενζμπή αοηή ή κα ελαπθςεεί ζε υθμ ημκ εβηέθαθμ. Απυ ημ ζδιείμ ηαζ ηδκ έηηαζδ ηδξ δζαηαναπήξ ζημκ εβηέθαθμ ελανηχκηαζ ηαζ ηα ζοιπηχιαηα ηςκ επζθδπηζηχκ επεζζμδίςκ. Οζ επζθδπηζημί πανμλοζιμί ιπμνεί κα πενζθαιαάκμοκ ακελέθεβηηδ ηζκδηζηυηδηα ιζαξ πενζμνζζιέκδξ μιάδαξ ιοχκ πςνίξ κα πανμοζζάγεζ απχθεζα ζοκείδδζδξ, ή κα παναηδνείηαζ απχθεζα ζοκείδδζδξ ηαζ ρεοδαζζεήζεζξ, ή ιζα απθή ζφκημιδξ δζάνηεζαξ απχθεζα ηδξ ζοκείδδζδξ, ή ζοπκά αηυια ηαζ ζοκδοαζιυ απχθεζαξ ζοκείδδζδξ ηαζ βεκζηεοιέκςκ ζε υθμ ημ ζχια ζπαζιχκ. Ο επζπμθαζιυξ ηδξ κυζμο ηοιαίκεηαζ ιεηαλφ 1:100 ηαζ 1:200, εκχ ηα αίηζα ιπμνεί κα είκαζ ηυζμ ηθδνμκμιζηά υζμ ηαζ πενζααθθμκηζηά. ηδ πθεζμρδθία ηςκ πενζπηχζεςκ επζθδρίαξ είκαζ δφζημθμ κα εκημπζζηεί ιζα ζοβηεηνζιέκδ ιεηάθθαλδ πμο απυ ιυκδ ηδξ κα πνμηαθεί ηάπμζμ ζοβηεηνζιέκμ ηφπμ επζθδρίαξ. Πανυθα αοηά, ιέπνζ ζηζβιήξ έπεζ εκημπζζηεί ιζα ηέημζα ζπεηζηά ζπάκζα πενίπηςζδ, δ μπμία μκμιάγεηαζ ADNFLE (Autosomal Dominant Nocturnal Frond Lobe Epilepsy). ηδκ ADNFLE ηα επζθδπηζηά επεζζυδζα ειθακίγμκηαζ ηαηά ηδ δζάνηεζα ημο ααεέςξ φπκμο ηαζ βζ αοηυ ημ θυβμ ζοκήεςξ δε βίκμκηαζ ακηζθδπηά απυ ημοξ αζεεκείξ. Υαναηηδνίγμκηαζ απυ επακάθδρδ ηάπμζςκ ζοβηεηνζιέκςκ ηζκήζεςκ πμο ιπμνεί κα ζοκμδεφμκηαζ ηαζ απυ ρεοδαζζεήζεζξ. Μενζημί αζεεκείξ εηδδθχκμοκ οπκμααζία ηαηά ηδ δζάνηεζα ηδξ μπμίαξ ιπμνεί κα ιζθμφκ αηαηακυδηα. Δπεζδή ηα επεζζυδζα θαιαάκμοκ πχνα ηαηά ηδ δζάνηεζα ημο ααεέςξ φπκμο, ακάθμβα ιε ηδ ζοπκυηδηά ημοξ ιπμνεί κα μδδβήζμοκ ζε ηαηή πμζυηδηα φπκμο ηαζ αίζεδζδ ηυπςζδξ ηαηά ηδ δζάνηεζα ηδξ διέναξ. ε μνζζιέκεξ μζημβέκεζεξ ειθακίγμκηαζ ζοιπηχιαηα ηα μπμία εηηυξ ηςκ επζθδπηζηχκ επεζζμδίςκ πενζθαιαάκμοκ επζπθέμκ ροπζαηνζηέξ δζαηαναπέξ ή ηαζ δζαηαναπέξ ζηδκ ζηακυηδηα ακηίθδρδξ (Bertrand et al. 2005; Cho, Y. W. et al. 2003; Magnusson et al. 2003). Ζ έκανλδ ηδξ κυζμο ζοιααίκεζ ζοπκυηενα ηαηά ηδ δεφηενδ δεηαεηία ηδξ γςήξ ακ ηαζ ιπμνεί κα ηοιαίκεηαζ απυ ηδκ πνχηδ ιέπνζ ηαζ ηδκ έηηδ. Ζ ζοπκυηδηα ηςκ επεζζμδίςκ ηείκεζ κα ιεζχκεηαζ ηαηά ηδ ιέζδ δθζηία ηαζ έπμοκ ακαθενεεί πενζπηχζεζξ υπμο ηα επζθδπηζηά επεζζυδζα ιεζχεδηακ βζα πμθφ ηαζνυ ή αηυια ηαζ ζηαιάηδζακ μνζζηζηά (Steinlein & Bertrand 2010). 49

50 Ζ πνχηδ ζδιεζαηή ιεηάθθαλδ δ μπμία ανέεδηε κα ζπεηίγεηαζ ιε ADNFLE πνμηαθεί ηδκ ακηζηαηάζηαζδ ηδξ ζενίκδξ 248 ζε θαζκοθαθακίκδ ζηδ δεφηενδ δζαιειανακζηή πενζμπή (Μ2) ηδξ κεονζημφ ηφπμο α4 οπμιμκάδαξ (Leniger et al. 2003; Steinlein et al. 1995). Ζ ιεηάθθαλδ αοηή ανέεδηε κα πνμηαθεί αθθαβέξ ζηδ θεζημονβζηυηδηα ημο οπμδμπέα, υπςξ μ πνυκμξ απεοαζζεδημπμίδζδξ ηαζ δ δζαπεναηυηδηα ημο ηακαθζμφ ζε Ca 2+ (Figl et al. 1998). Ζ παναηήνδζδ υηζ δ ηθζκζηή εζηυκα ηςκ αζεεκχκ αεθηζςκυηακ ζδιακηζηά ιε ηδ πμνήβδζδ ηανααιαγεπίκδξ, μδήβδζε ζε ένεοκεξ πμο έδεζλακ υηζ δ ηανααιαγεπίκδ πνμζδέκεηαζ εηθεηηζηά ζημοξ οπμδμπείξ πμο πενζέπμοκ ηδκ ιεηαθθαβιέκδ α4 οπμιμκάδα ηαζ ημοξ ιπθμηάνεζ (Picard et al. 1999). Ανβυηενα ανέεδηακ ηαζ άθθεξ ιεηαθθάλεζξ ζηζξ δζαιειανακζηέξ πενζμπέξ ηυζμ ηδξ α4 υζμ ηαζ ηδξ α2 οπμιμκάδαξ, μζ μπμίεξ ζπεηίγμκηαζ ιε ηδκ ADNFLE. οβηεηνζιέκα έπμοκ ανεεεί ημοθάπζζημκ έλζ ιεηαθθάλεζξ ζημ βμκίδζμ ηδξ α4 ηαζ πέκηε ζημ βμκίδζμ ηδξ α2 οπμιμκάδαξ. ε υθεξ ηζξ πενζπηχζεζξ μζ ιεηαθθάλεζξ αοηέξ μδδβμφκ ζηδ κυζμ βζαηί αολάκμοκ ηδκ εοαζζεδζία ζηδκ αηεηοθμπμθίκδ (Bertrand et al. 2005; Hoda et al. 2008; Itier & Bertrand 2002). Αφλδζδ ηδξ εοαζζεδζίαξ ζηδκ αηεηοθμπμθίκδ ανέεδηε επίζδξ κα πνμηαθεί ηαζ δ ιεηάθθαλδ Η279Ν ζηδκ α2 οπμιμκάδα (Aridon et al. 2006). Ζ πενίπηςζδ θμζπυκ ηδξ ADNFLE είκαζ ιέπνζ ζηζβιήξ δ ιμκαδζηή ιμνθή επζθδρίαξ ηδξ μπμίαξ ημ βεκεηζηυ οπυααενμ είκαζ λεηαεανζζιέκμ, ιε βκςζηέξ ζδιεζαηέξ ιεηαθθάλεζξ κα πνμηαθμφκ ζοβηεηνζιέκα ηθζκζηά ζοιπηχιαηα. Ζ ιεθθμκηζηή ένεοκα ιπμνεί κα απμηαθφρεζ ηαζ άθθμοξ ζοβηεηνζιέκμοξ ιμνζαημφξ ιδπακζζιμφξ μζ μπμίμζ πνμηαθμφκ δζάθμνεξ ιμνθέξ επζθδρίαξ. 50

51 Α.21. ΣΑ ΤΣΖΜΑΣΑ ΔΚΦΡΑΖ ΠΡΧΣΔΨΝΧΝ Pichia pastoris ΚΑΗ ΚΤΣΣΑΡΑ ΔΝΣΟΜΧΝ Sf9 Α ΣΟ ΔΣΔΡΟΛΟΓΟ ΤΣΖΜΑ ΔΚΦΡΑΖ: ΚΤΣΣΑΡΑ ΔΝΣΟΜΧΝ ε ανηεηέξ πενζπηχζεζξ έηθναζδξ πνςηεσκχκ πμο πνμένπμκηαζ απυ ακχηενμοξ εοηανοςηζημφξ μνβακζζιμφξ, ααηηδνζαηά ζοζηήιαηα έηθναζδξ, ακ ηαζ ζπεηζηά απθά ζηδ πνήζδ ημοξ, ζοπκά απμδεζηκφμκηαζ ακεπανηή ζημ επίπεδμ ηςκ ιεηαιεηαθναζηζηχκ ηνμπμπμζήζεςκ. Γζα ημ θυβμ αοηυ έπμοκ ακαπηοπεεί ηαζ ζοζηήιαηα έηθναζδξ πνςηεσκχκ ζε ηφηηανα ακχηενςκ μνβακζζιχκ. Μζα ηαηδβμνία αοηχκ ηςκ ζοζηδιάηςκ έηθναζδξ είκαζ ηαζ ηα ηφηηανα εκηυιςκ. Σα ηφηηανα εκηυιςκ έπμοκ ημ πθεμκέηηδια υηζ είκαζ ηφηηανα ακχηενςκ εοηανοςηζηχκ μνβακζζιχκ ζε ακηίεεζδ ιε ηα ααηηδνίδζα, εκχ πανάθθδθα είκαζ ανηεηά πζμ εφπνδζηα, πζμ ζηαεενά ηαζ πζμ ακεεηηζηά απυ ηζξ ακηίζημζπεξ ηοηηανζηέξ ζεζνέξ εδθαζηζηχκ. Δπίζδξ μζ απμδυζεζξ ζε πμζυηδηεξ πνςηεσκχκ πμο επζηοβπάκμκηαζ ιε αοηυ ημ ζφζηδια είκαζ πμθφ ορδθυηενεξ ζε ζπέζδ ιε ηζξ ηοηηανζηέξ ζεζνέξ απυ εδθαζηζηά (Jarvis 1993). Απυ ηα πζμ δζαδεδμιέκα είδδ ηοηηάνςκ εκηυιςκ είκαζ ηαζ ηα Sf9, ηα μπμία πνμένπμκηαζ απυ ηζξ ςμεήηεξ ημο εκηυιμο Spodoptera frugiperda. Έπμοκ ακαπηοπεεί δζάθμνεξ ιέεμδμζ βζα ηδκ έηθναζδ πνςηεσκχκ ζε ηφηηανα εκηυιςκ πνδζζιμπμζχκηαξ ηα ηαηάθθδθα πθαζιίδζα. Σα πθαζιίδζα αοηά φζηενα απυ δζαιυθοκζδ, είηε εκζςιαηχκμκηαζ ζηα πνςιμζχιαηα ηςκ ηοηηάνςκ εκηυιςκ, είηε δδιζμονβμφκ ααηζθμσμφξ μζ μπμίμζ ιμθφκμκηαξ ηα ηφηηανα πανάβμοκ ηδκ επζεοιδηή πνςηεΐκδ. Σα ηφηηανα εκηυιςκ ηαθθζενβμφκηαζ είηε πνμζημθθδιέκα ζε επζθάκεζεξ, είηε ζε αζχνδζδ, ακάθμβα ιε ηδκ ηθίιαηα ηδξ ηαθθζένβεζαξ. Οζ ιζηνήξ ηθίιαηαξ ηαθθζένβεζεξ βίκμκηαζ ζε ιζηνυ υβημ ενεπηζημφ ιέζμο ιε ηα ηφηηανα πνμζημθθδιέκα ζε επζθάκεζεξ. Γζα ιεβάθδξ ηθίιαηαξ ηαθθζένβεζεξ πνμηζιάηαζ δ ιέεμδμξ ηδξ ηαθθζένβεζαξ ζε αζχνδζδ (Invitrogen, 2002b). ηδκ πανμφζα ιεθέηδ πνδζζιμπμζήεδηακ ηφηηανα εκηυιςκ Sf9, ηα μπμία ελέθναζακ ηζξ οπμιμκάδεξ ημο ακενςπίκμο α4α2 nachr ηαηυπζκ ιυθοκζδξ ιε ααηζθμσμφξ. Οζ ααηζθμσμί είκαζ ιζα μζημβέκεζα νααδυιμνθςκ ζχκ ιε βεκεηζηυ οθζηυ δίηθςκμ ηοηθζηυ DNA (140kb) μζ μπμίμζ ιμθφκμοκ ηφηηανα ανενμπυδςκ. Ζ ιυθοκζδ απυ ααηζθμσυ δζαηνίκεηαζ ζε ηνία ζηάδζα. ημ πνχημ ζηάδζμ (0-6 χνεξ) μ ζυξ εζζένπεηαζ ζημ ηφηηανμ ιε εκδμηφηηςζδ, ημ βεκεηζηυ οθζηυ απεθεοεενχκεηαζ ηαζ 51

52 λεηζκά δ έηθναζδ ηςκ πνχζιςκ ζζηχκ βμκζδίςκ. ημ δεφηενμ ζηάδζμ (6-24 χνεξ) λεηζκά δ ακηζβναθή ημο βεκεηζημφ οθζημφ ηαζ δ παναβςβή ηαζ απεθεοεένςζδ ιειμκςιέκςκ ζμζςιαηίςκ. ημ ηνίημ ηαζ ηεθεοηαίμ ζηάδζμ (ιεηά ηζξ 24 πνχηεξ χνεξ) λεηζκά δ οπμπχνδζδ ηδξ απεθεοεένςζδξ ιειμκςιέκςκ ζμζςιαηίςκ ηαζ ανπίγεζ δ παναβςβή ζμζςιαηίςκ εβηθεζζιέκςκ ζε έθοηνα πμο ζπδιαηίγμκηαζ απυ ηδκ πνςηεΐκδ πμθοεδνίκδ. Γζα ηδκ έηθναζδ πνςηεσκχκ πνδζζιμπμζμφκηαζ βεκεηζηά ηνμπμπμζδιέκα ζηεθέπδ ημο ζμφ Autographa californica, απυ ηα μπμία ζοκήεςξ έπεζ αθαζνεεεί ημ βμκίδζμ ηδξ πμθοεδνίκδξ ηαζ ζηδ εέζδ ημο ιπαίκμοκ ηα πνμξ έηθναζδ βμκίδζα. Ο εβηθεζζιυξ ηςκ ζμζςιαηίςκ ζε πμθοεδνίκδ δεκ είκαζ απαναίηδημξ βζα ηδκ ιυθοκζδ ηςκ ηοηηάνςκ, εκχ ηαοηυπνμκα βίκεηαζ εηιεηάθθεοζδ ημο ζζπονμφ ζζημφ οπμηζκδηή ηδξ πνςηεΐκδξ αοηήξ (Jones, I. & Morikawa 1996). ηδ πανμφζα ιεθέηδ, βζα ηδ δδιζμονβία ηςκ ακαζοκδοαζιέκςκ ααηζθμσχκ, πνδζζιμπμζήεδηε ημ ζφζηδια Bac to Bac ηδξ εηαζνίαξ Invitrogen. ημ ζφζηδια αοηυ, ημ cdna ηδξ πνςηεΐκδξ-ζηυπμο ανπζηά εκζςιαηχκεηαζ ζε έκα πθαζιίδζμ pfastbac ημ μπμίμ ζηδ ζοκέπεζα πνδζζιμπμζείηαζ βζα ημκ ιεηαζπδιαηζζιυ ημο ελεζδζηεοιέκμο ζηεθέπμοξ DH10Bac ημο ααηηδνίμο E. coli. Σμ ζηέθεπμξ αοηυ θένεζ έκα ακηίβναθμ ημο βμκζδζχιαημξ ημο ααηζθμσμφ (Bacmid), ζοκ έκα αμδεδηζηυ πθαζιίδζμ πμο εηθνάγεζ ημ έκγοιμ πμο ιεηαεέηεζ ιέζα ζηα ααηηδνίδζα, απυ ημ pfastbac ζημ Bacmid, ηδκ ηαζέηα ημο βμκζδίμο ιαγί ιε απαναίηδηα ηιήιαηα ημο pfastbac. Μεηά απυ απμιυκςζδ, ημ ακαζοκδοαζιέκμ Bacmid πνδζζιμπμζείηαζ βζα ηδ δζαιυθοκζδ ηοηηάνςκ εκηυιςκ Sf9 ηαζ ηδ δδιζμονβία ηδξ πνχηδξ βεκζάξ ηςκ ακαζοκδοαζιέκςκ ααηζθμσχκ. ηδ ζοκέπεζα αημθμοεεί δ δδιζμονβία ηδξ δεφηενδξ ηαζ ηδξ ηνίηδξ βεκζάξ ααηζθμσχκ, ζηζξ μπμίεξ μ ηίηθμξ ημο ααηζθμσμφ είκαζ ανηεηά ορδθυξ βζα κα πνδζζιμπμζδεμφκ βζα ηδκ παναβςβή ηδξ πνςηεΐκδξ-ζηυπμο (Invitrogen, 2009). Σα πθεμκεηηήιαηα πμο πνμζθένεζ δ έηθναζδ πνςηεσκχκ ζε ηφηηανα εκηυιςκ, ήηακ μ θυβμξ βζα ημκ μπμίμ ημ παναπάκς ζφζηδια επζθέπεδηε κα δμηζιαζηεί βζα ηδκ έηθναζδ ημο ακενχπζκμο α4α2 nachr, ηαεχξ ηαζ ημο ίδζμο οπμδμπέα πςνίξ ηοηηανμπθαζιαηζηή εδθζά. 52

53 Δηθόλα 16. Έθθξαζε πξσηετλώλ ζε θύηηαξα εληόκσλ Sf9 κε ηε βνήζεηα βαθηιντνύ. Σα ηφηηανα Sf9 (Α), πνμένπμκηαζ απυ επζεδθζαηά ηφηηανα ηςκ ςμεδηχκ ημο εκηυιμο Spodoptera frugiperda (Β), ηα μπμία ιμθφκμκηαζ ιε ηνμπμπμζδιέκα ζηεθέπδ ημο ααηζθμσμφ Autographa californica (Γ). Δηθόλα 17. Αλαπαξάζηαζε ηνπ κνξηαθνύ ζθέινπο ηνπ ζπζηήκαηνο δεκηνπξγίαο αλαζπλδπαζκέλσλ βαθηιντώλ Bac to Bac. Μεηά ηδ δδιζμονβία ακαζοκδοαζιέκμο πθαζιζδίμο pfastbac1 ιε ημ πνμξ έηθναζδ βμκίδζμ, αημθμοεεί ιεηαζπδιαηζζιυξ ημο ζηεθέπμοξ DH10Bac E.coli. Σμ ζηέθεπμξ αοηυ θένεζ έκα ακηίβναθμ ημο βμκζδζχιαημξ ημο ααηζθμσμφ (Bacmid), ζοκ έκα αμδεδηζηυ πθαζιίδζμ πμο εηθνάγεζ ημ έκγοιμ πμο ιεηαεέηεζ ημ βμκίδζμ ιαγί ιε ηζξ απαναίηδηεξ βζα ηδκ έηθναζδ πενζμπέξ, απυ ημ pfastbac1 ζημ Bacmid. Μεηά απυ απμιυκςζδ, ημ ακαζοκδοαζιέκμ Bacmid ιπμνεί κα πνδζζιμπμζδεεί βζα δζαιυθοκζδ ηοηηάνςκ Sf9 ιε ζημπυ ηδκ παναβςβή ααηζθμσχκ. [Σνμπμπμζδιέκμ απυ (Invitrogen, 2009)] 53

54 Α ΣΟ ΔΣΔΡΟΛΟΓΟ ΤΣΖΜΑ ΔΚΦΡΑΖ Pichia pastoris Ο γοιμιφηδηαξ Pichia pastoris (P. pastoris) είκαζ έκα δζαδεδμιέκμ ζφζηδια έηθναζδξ ακαζοκδοαζιέκςκ πνςηεσκχκ, θυβς ηδξ απθυηδηαξ ηαζ ημο παιδθμφ ηυζημοξ ημο ζε ζπέζδ ιε άθθα πζμ πμθφπθμηα ζοζηήιαηα έηθναζδξ, υπςξ μζ ηοηηανζηέξ ζεζνέξ εδθαζηζηχκ. Ζ πμζυηδηα ηςκ εηθναγυιεκςκ πνςηεσκχκ είκαζ ζοκήεςξ ηαθή, ηαεχξ μ P. pastoris είκαζ εοηανοςηζηυξ μνβακζζιυξ ηαζ ιπμνεί κα ηάκεζ πμθθέξ απυ ηζξ ιεηαιεηαθναζηζηέξ ηνμπμπμζήζεζξ ηςκ ακχηενςκ ζοζηδιάηςκ έηθναζδξ, υπςξ δ ακαδίπθςζδ ηαζ δ βθοημγοθίςζδ ηςκ εηθναγυιεκςκ πνςηεσκχκ (Mattanovich et al. 2012). Έπμοκ ακαπηοπεεί εζδζηά ζηεθέπδ ημο γοιμιφηδηα P. pastoris ηαζ εζδζηά πθαζιίδζα βζα έηθναζδ ακαζοκδοαζιέκςκ πνςηεσκχκ ιε αοηυ ημ ζφζηδια. Σα παναπάκς ελαζθαθίγμοκ: Σδ ιεβζζημπμίδζδ ηδξ παναβςβήξ ηδξ ακαζοκδοαζιέκδξ πνςηεΐκδξ. Σδκ εθαπζζημπμίδζδ ηδξ έηθναζδξ αοηυθμβςκ πνςηεσκχκ. Σμκ πμθθαπθαζζαζιυ ιυκμ ηςκ ιεηαζπδιαηζζιέκςκ ηοηηάνςκ. Σδκ ηαηεφεοκζδ ηδξ εηθναγυιεκδξ πνςηεΐκδξ ζημ επζεοιδηυ δζαιένζζια ημο ηοηηάνμο ή ζημκ ελςηοηηάνζμ πχνμ. Σδκ έηθναζδ ηδξ πνςηεΐκδξ έηζζ χζηε κα θένεζ ζημ έκα άηνμ ηδξ έκακ επίημπμ πμο αμδεά ζηδκ απμιυκςζδ ηαζ ημκ ηαεανζζιυ. Σα ζηεθέπδ ημο γοιμιφηδηα P. pastoris ιεηαζπδιαηίγμκηαζ ιυκζια, εκζςιαηχκμκηαξ ζημ βεκεηζηυ ημοξ οθζηυ ηα παναπάκς πθαζιίδζα, ιε ηδ δζαδζηαζία ημο μιυθμβμο ακαζοκδοαζιμφ, ηαηά ηδκ μπμία βίκεηαζ ακηαθθαβή ιεηαλφ δφμ ηιδιάηςκ DNA ηα μπμία θένμοκ μιυθμβα άηνα. Σα πθαζιίδζα πνχηα βίκμκηαζ βναιιζηά, ηαηυπζκ πέρδξ ιε πενζμνζζηζηυ έκγοιμ ηαζ ζηδ ζοκέπεζα πνδζζιμπμζμφκηαζ βζα ιεηαζπδιαηζζιυ (Invitrogen, 2002a). Ο γοιμιφηδηαξ P. pastoris είκαζ έκαξ ιεεοθμηνυθμξ μνβακζζιυξ, δδθαδή ιπμνεί κα πνδζζιμπμζεί ηδ ιεεακυθδ ςξ ιμκαδζηή πδβή άκεναηα, πάνδ ζημ έκγοιμ ηδξ αθημμθζηήξ μλεζδάζδξ. Σμ έκγοιμ αοηυ μλεζδχκεζ ηδ ιεεακυθδ (ηαζ άθθεξ αθημυθεξ) πνμξ ηδκ ακηίζημζπδ αθδεΰδδ, δ μπμία ζηδ ζοκέπεζα, ιεηαηνεπυιεκδ ζημ ακηίζημζπμ μλφ ηαηαθήβεζ ζημκ ηφηθμ ημο Krebs. Ζ υθδ δζαδζηαζία πναβιαημπμζείηαζ ζηα 54

55 οπενμλεζδζμζχιαηα βζα ηδκ πνμζηαζία ημο ηοηηάνμο απυ ημ επζηίκδοκμ οπενμλείδζμ ημο οδνμβυκμο πμο πανάβεηαζ ςξ παναπνμσυκ (Invitrogen, 2002a). Λυβς ηδξ παιδθήξ ζοββέκεζαξ ηδξ αθημμθζηήξ μλεζδάζδξ ιε ηδ ιεεακυθδ, μ γοιμιφηδηαξ εηθνάγεζ ιεβάθδ πμζυηδηα ημο εκγφιμο πνμηεζιέκμο κα ακηαπελέθεεζ ζηζξ ακάβηεξ ημο ιεηααμθζζιμφ ημο πανμοζία αθημυθδξ ηαζ απμοζία ζαηπάνςκ. Όηακ πάθζ οπάνπμοκ ανηεηά ζάηπανα ηαζ ηαευθμο αθημυθεξ δ έηθναζδ ημο εκγφιμο εθαπζζημπμζείηαζ. Ζ έηθναζδ ηδξ αθημμθζηήξ μλεζδάζδξ νοειίγεηαζ ηονίςξ απυ ημκ οπμηζκδηή ΑΟΧ1. Ζ ιεεακυθδ είκαζ έκαξ ζζπονυξ επαβςβέαξ ημο εκγφιμο εκχ ιυνζα υπςξ ζάηπανα ηαζ βθοηενυθδ ηαηαζηέθθμοκ ηδ ιεηαβναθή ημο. Λυβς ηδξ έκημκδξ ιεηαβναθήξ πμο επάβεζ, μ ΑΟΧ1 πνδζζιμπμζείηαζ ςξ οπμηζκδηήξ ηςκ πνμξ έηθναζδ βμκζδίςκ ζημ ζφζηδια ημο γοιμιφηδηα P. pastoris. οκήεςξ δ ηαθθζένβεζα βζα παναβςβή πνςηεΐκδξ πςνίγεηαζ ζε δομ θάζεζξ. ηδκ πνχηδ θάζδ μ γοιμιφηδηαξ ηαθθζενβείηαζ ζε ενεπηζηυ ιε 1% βθοηενυθδ, δ μπμία δεκ επζηνέπεζ ηδκ παναβςβή πνςηεΐκδξ, βζα κα πμθθαπθαζζαζηεί μ ιφηδηαξ ιε βνήβμνμοξ νοειμφξ, πςνίξ κα θένεζ ημ αάνμξ ηδξ έηθναζδξ ηδξ ακαζοκδοαζιέκδξ πνςηεΐκδξ. ηδ δεφηενδ θάζδ δ ηαθθζένβεζα βίκεηαζ ζε ενεπηζηυ ιε 0,5% ιεεακυθδ. Ο οπμηζκδηήξ ΑΟΧ1 εκενβμπμζείηαζ ηαζ δ ακαζοκδοαζιέκδ πνςηεΐκδ οπενεηθνάγεηαζ. Αημθμοεμφκ ηα ζηάδζα ηδξ απμιυκςζδξ ηαζ ημο ηαεανζζιμφ (Invitrogen, 2002a). Ζ απθυηδηα ηαζ μζ δοκαηυηδηεξ ημο ζοζηήιαημξ έηθναζδξ πνςηεσκχκ ημο γοιμιφηδηα P. pastoris μδήβδζε ζηδκ επζθμβή ημο βζα ηδκ έηθναζδ ημο θοζζημφ ακενςπίκμο α4α2 nachr ηαεχξ ηαζ ημο ίδζμο οπμδμπέα πςνίξ ηοηηανμπθαζιαηζηή εδθζά, ηαοηυπνμκα ιε ηα ηφηηανα εκηυιςκ. ηυπμξ ήηακ κα ανεεεί ημ ζφζηδια έηθναζδξ ηαζ δ ιμνθή ημο οπμδμπέα (μ θοζζηυξ οπμδμπέαξ ή πςνίξ ηοηηανμπθαζιαηζηή εδθζά) πμο δίκμοκ ηα ιεβαθφηενα επίπεδα έηθναζδξ ηαζ ηδκ αέθηζζηδ πμζυηδηα οπμδμπέα. 55

56 Α.22. ΚΟΠΟ ΣΖ ΔΡΓΑΗΑ Όπςξ ακαθένεδηε ζηζξ πνμδβμφιεκεξ παναβνάθμοξ, μζ nachr είκαζ ζδιακηζηά ηακάθζα βζαηί ειπθέημκηαζ ζε πμθθέξ θεζημονβίεξ γςηζηήξ ζδιαζίαξ. Γζα ημ θυβμ αοηυ δ ιεθέηδ ημοξ έπεζ πνμζεθηφζεζ ιεβάθμ ενεοκδηζηυ εκδζαθένμκ απυ ηζξ ανπέξ ημο 20 μο αζχκα ηυζμ βζα ηδκ ηαηακυδζδ ηδξ θεζημονβίαξ ημοξ υζμ ηαζ βζα ηδκ παναζηεοή κέςκ θανιάηςκ. Καζ βζα ηζξ δομ πενζπηχζεζξ ιεθέηδξ, ηα παναζηεοάζιαηα ζζηχκ πμο θένμοκ nachr δεκ ανημφκ, βζ αοηυ δ έηθναζδ ακαζοκδοαζιέκςκ θεζημονβζηχκ οπμδμπέςκ ηαθήξ πμζυηδηαξ, ζε ζηακμπμζδηζηέξ πμζυηδηεξ ηαζ δ απμιυκςζδ ημοξ είκαζ ημιαζηήξ ζδιαζίαξ. Γζα ηδκ έηθναζδ, ηδκ απμιυκςζδ ηαζ ηδ ιεθέηδ ημο α4α2 nachr ζοβηεηνζιέκα, έπμοκ βίκεζ ανηεηέξ ιεθέηεξ, απυ ηζξ μπμίεξ ακ ηαζ έπμοκ πνμηφρεζ εκδζαθένμκηα εονήιαηα, δεκ έπεζ επζηεοπεεί αηυια δ έηθναζδ οπμδμπέα ηφπμο α4α2 ζε πμζυηδηα, ηαεανυηδηα ηαζ πμζυηδηα επανηείξ βζα δμιζηέξ ιεθέηεξ ορδθήξ ακάθοζδξ, υπςξ δ ηνοζηαθθμβναθία αηηζκχκ-υ ή μ πονδκζηυξ ιαβκδηζηυξ ζοκημκζζιυξ. Οζ πζμ πνυζθαηεξ πνμζπάεεζεξ έηθναζδξ α4α2 nachr έβζκακ ζε ακχηενα εοηανοςηζηά ζοζηήιαηα, υπςξ ηα ηφηηανα εκηυιςκ ηαζ ηοηηανζηέξ ζεζνέξ εδθαζηζηχκ. οβηεηνζιέκα μζ Wang ηαζ Abood ημ 1996 δδιμζίεοζακ ηα απμηεθέζιαηα ηδξ ιεθέηδξ ημοξ, πμο πενζεθάιαακε ηδκ ζοκέηθναζδ ηςκ οπμιμκάδςκ ημο α4α2 οπμδμπέα ημο ανμοναίμο ζε ηφηηανα εκηυιςκ ιε ααηζθμσυ ηαζ ημκ πνμζδζμνζζιυ ηδξ ζοββεκείαξ ημο ιε ναδζμεπζζδιαζιέκδ ιεεοθηαημκζηίκδ. Σδκ ίδζα πνμκζά μζ Buisson ηαζ ζοκενβάηεξ ελέθναζακ ηαοηυπνμκα ηζξ οπμιμκάδεξ ημο ακενςπίκμο α4α2 nachr ζε ηφηηανα HEK 293 ηαζ ιεθέηδζακ ηζξ δθεηηνμθοζζμθμβζηέξ ζδζυηδηεξ ηςκ οπμδμπέςκ πμο πνμέηορακ. Σμ 1999 μζ Shafaee ηαζ ζοκενβάηεξ ζηδ ιεθέηδ ημοξ ζφβηνζκακ ηζξ θανιαημθμβζηέξ ζδζυηδηεξ ηςκ θοζζηχκ ηαζ ηςκ εηθναζιέκςκ ζε ηφηηανα CV-1 ηαζ ςμηφηηανα Xenopus, α4α2 ανμοναίμο. Δπίζδξ ζηδ ιεθέηδ ηςκ Eaton ηαζ ζοκενβαηχκ ημ 2003, παναζηεοάζηδηακ ζηαεενά ιεηαζπδιαηζζιέκα επζεδθζαηά ηφηηανα SH-EP1, ηα μπμία ελέθναγακ ημκ ακενχπζκμ α4α2 nachr ηαζ ζηδ ζοκέπεζα πνμζδζμνίζηδηε δ ζοββέκεζά ημο ιε δζάθμνμοξ κζημηζκζημφξ αβςκζζηέξ ηαζ ακηαβςκζζηέξ. Δηηυξ απυ ηζξ παναπάκς ιεθέηεξ, ζηζξ μπμίεξ εηθνάζηδηακ μζ θοζζηέξ οπμιμκάδεξ ημο α4α2 οπμδμπέα, έβζκακ ηαζ άθθεξ ζηζξ μπμίεξ εηθνάζηδηακ ηνμπμπμζδιέκεξ οπμιμκάδεξ. Σμ 2005 μζ Person ηαζ ζοκενβάηεξ δδιμζίεοζακ ηδ ιεθέηδ ημοξ ζηδκ μπμία ελέθναζακ ηαοηυπνμκα ζε ςμηφηηανα Xenopus, ιμνζαηέξ ηαηαζηεοέξ ημο 56

57 ελςηοηηανζημφ ηιήιαημξ ηςκ α4 ηαζ α2 οπμιμκάδςκ, ιε ηαζ πςνίξ ημ Μ1 δζαιειανακζηυ ηιήια ηαζ ζηδ ζοκέπεζα ιεθέηδζακ ηδκ πνυζδεζδ ζε αοηέξ κζημηζκζηχκ οπμηαηαζηαηχκ. Δπίζδξ μζ ηενβίμο ηαζ ζοκενβάηεξ ημ 2011 δδιμζίεοζακ ηδκ ιεθέηδ ημοξ ζηδκ μπμία ελέθναζακ, ζημκ γοιμιφηδηα P. pastoris, ηα ελςηοηηανζηά ηιήιαηα ηςκ οπμιμκάδςκ ιζαξ α4 ηαζ ιζαξ α2 οπμιμκάδαξ εκςιέκα ηαζ ζηδ ζοκέπεζα ηα απμιυκςζακ ηαζ ιεθέηδζακ ηδκ πνυζδεζδ κζημηζκζηχκ οπμηαηαζηαηχκ. Ο ηφνζμξ ζημπυξ ηδξ πανμφζδξ ιεθέηδξ ήηακ δ έηθναζδ, μ ηαεανζζιυξ ηαζ μ παναηηδνζζιυξ ημο ακενχπζκμο οπμδμπέα α4α2 ζε πμζυηδηα, ηαεανυηδηα ηαζ πμζυηδηα ζηακή βζα δμιζηέξ ιεθέηεξ ορδθήξ ακάθοζδξ. Γζα κα επζηεοπεεί αοηυ δμηζιάζηδηε δ έηθναζδ ζε ηφηηανα εκηυιςκ Sf9 ηαζ ζημκ γοιμιφηδηα P. pastoris, ηυζμ ημο θοζζημφ οπμδμπέα [Άβνζμο Σφπμο, (AT)], υζμ ηαζ οπμδμπέα πςνίξ ηδκ ηοηηανμπθαζιαηζηή εδθζά [Κμθμαυξ, (Κ)], ιε ηα δζαιειανακζηά ηιήιαηα Μ3 ηαζ Μ4 ηςκ οπμιμκάδςκ κα ζοκδέμκηαζ ιε ιζα πεπηζδζηή βέθονα 3 αιζκμλέςκ. Συζμ μζ ΑΣ, υζμ ηαζ μζ K οπμιμκάδεξ, έθενακ ζημ ηαναμλοηεθζηυ ημοξ άηνμ ιζα αθθδθμοπία 8 ζζηζδζκχκ, πμο εα πνδζίιεοε ζηδκ ακίπκεοζδ ηαζ ηδκ απμιυκςζή ημοξ. Σα ηφηηανα εκηυιςκ είπακ πενζζζυηενεξ πζεακυηδηεξ κα εηθνάζμοκ ημοξ δομ ηφπμοξ α4α2 οπμδμπέςκ ηαεχξ είκαζ ελεθζηηζηά ακχηενα απυ ημοξ γοιμιφηδηεξ ηαζ έπμοκ ιεβαθφηενεξ δοκαηυηδηεξ έηθναζδξ πνςηεσκχκ ακχηενςκ εοηανοςηζηχκ μνβακζζιχκ. Απυ ηδκ άθθδ μ γοιμιφηδηαξ P. pastoris είκαζ έκα απθμφζηενμ ηαζ θεδκυηενμ ζφζηδια έηθναζδξ πνςηεσκχκ ζε ζπέζδ ιε ηα ηφηηανα εκηυιςκ ηαζ ηαηά πενίπηςζδ ιπμνεί κα επζηφπεζ ηαζ ορδθυηενα επίπεδα έηθναζδξ πνςηεΐκδξ. Ζ απαθμζθή ημο ιεβαθοηένμο ηιήιαημξ ηδξ εκδμηοηηανζηήξ εδθζάξ είπε ζακ πνςηανπζηυ ζημπυ ηδ δζεοηυθοκζδ ηςκ δμιζηχκ ιεθεηχκ βζα ηδκ ακάθοζδ ηδξ ηνζημηαβμφξ ηαζ ηδξ ηεηανημηαβμφξ δμιήξ ημο οπμδμπέα. ε ιζα πνςηεΐκδ, εφηαιπηα ηιήιαηα υπςξ δ ηοηηανμπθαζιαηζηή εδθζά ηςκ nachr (Kukhtina et al. 2006), αθεκυξ δδιζμονβμφκ ειπυδζα ζηδκ εη θφζεςξ εοαίζεδηδ δζαδζηαζία ηδξ ηνοζηάθθςζδξ, ηαζ αθεηένμο δοζημθεφμοκ ηδ δζαδζηαζία ακάθοζδξ ηςκ δεδμιέκςκ ηυζμ ζηδκ ηνοζηαθθμβναθία αηηίκςκ-υ, υζμ ηαζ ζημκ πονδκζηυ ιαβκδηζηυ ζοκημκζζιυ, ηαεχξ αολάκμοκ ημκ ευνοαμ. Οζ ιμνζαηέξ ηαηαζηεοέξ ηςκ οπμιμκάδςκ ιε ηζξ ημθμαέξ ηοηηανμπθαζιαηζηέξ εδθζέξ, ήηακ μιυθμβεξ ιε ιμνζαηή ηαηαζηεοή ζηδκ μπμία είπακ απαθεζθεεί ηα αιζκμλέα ηαζ υπςξ δδιμζίεοζακ ζηδ ιεθέηδ ημοξ μζ Valor ηαζ ζοκενβάηεξ ημ 2002 βζα ημκ α7 nachr ημο ανμοναίμο. Έκα επζπθέμκ πμθφ ζδιακηζηυ πθεμκέηηδια πμο ακαιεκυηακ κα έπεζ μ Κ οπμδμπέαξ ήηακ ορδθυηενα 57

58 επίπεδα έηθναζδξ, ηάηζ ημ μπμίμ παναηδνήεδηε ζηδκ πνμακαθενεείζα ζπεηζηή ενβαζία (Valor et al., 2002). Δηθόλα 18. ύγθξηζε ησλ ππνκνλάδσλ ηνπ θπζηθνύ α4β2 nachr ζε ζρέζε κε ηνπο ηξνπνπνηεκέλνπο ηεο παξνύζαο κειέηεο. ηζξ οπμιμκάδεξ ηςκ ηνμπμπμζδιέκςκ οπμδμπέςκ ηδξ πανμφζαξ ιεθέηδξ, ημ ιεβαθφηενμ ιένμξ ηδξ ηοηηανμπθαζιαηζηήξ εδθζάξ έθεζπε, εκχ μζ δζαιειανακζηέξ πενζμπέξ Μ3 ηαζ Μ4 ζοκδέμκηακ ιεηαλφ ημοξ ιε ιζα πεπηζδζηή βέθονα [Σνμπμπμζδιέκμ απυ (Bocquet et al. 2007)] Δηθόλα 19. ύγθξηζε ηεο πξσηνηαγνύο δνκήο ησλ άγξηνπ ηύπνπ ππνκνλάδσλ (ΑΣ) κε ηηο θνινβέο (Κ) κνξηαθέο θαηαζθεπέο ηεο παξνύζαο κειέηεο. ηυπμξ ηδξ πανμφζαξ ιεθέηδξ ήηακ δ έηθνάζδ ηςκ οπμιμκάδςκ ημο ακενςπίκμο α4α2 nachr ηυζμ ΑΣ, υζμ ηαζ Κ, ζηζξ μπμίεξ ημ ιεβαθφηενμ ιένμξ ηδξ ηοηηανμπθαζιαηζηήξ εδθζάξ έθεζπε ηαζ μζ δζαιειανακζηέξ πενζμπέξ Μ3 ηαζ Μ4 ζοκδέμκηακ ιεηαλφ ημοξ ιέζς 3 αιζκμλέςκ. 58

59 Συζμ μζ ΑΣ οπμιμκάδεξ ημο α4α2 nachr υζμ ηαζ μζ Κ, έθενακ ηαζ ημ ζδιαημδμηζηυ ημοξ πεπηίδζμ ζημ αιζκμηεθζηυ άηνμ, ημ μπμίμ ηζξ ηαηεφεοκε κα εηθναζημφκ ζημ εκδμπθαζιαηζηυ δίηηομ ηαζ ιεηά κα ιεηαθενεμφκ ζηδκ ηοηηανζηή ιειανάκδ, αθμφ πνχηα πενάζμοκ απυ ημ ζφιπθεβια Golgi. ημ ηαναμλοηεθζηυ ημοξ άηνμ υθεξ μζ οπμιμκάδεξ πμο εηθνάζηδηακ έθενακ έκακ επίημπμ 8 ζοκεπυιεκςκ ζζηζδζκχκ βζα εοημθυηενδ ακίπκεοζδ ιε ιμκμηθςκζηυ ακηίζςια ηαζ απμιυκςζδ ιε πνςιαημβναθία ζοββέκεζαξ ζυκηςκ ιεηάθθμο. Ζ πνςημηαβήξ δμιή ηδξ ακαζοκδοαζιέκδξ ΑΣ α4 οπμιμκάδαξ ήηακ δ παναηάης (ηδκ Κ α4 οπμιμκάδα ηα αιζκμλέα ιε ηυηηζκμ πνχια ακηζηαηαζηάεδηακ ιε ηα mkr): 1 melggpgapr llpplllllg tgllrasshv etrahaeerl lkklfsgynk 51 wsrpvanisd vvlvrfglsi aqlidvdekn qmmttnvwvk qewhdyklrw 101 dpadyenvts iripseliwr pdivlynnad gdfavthltk ahlfhdgrvq 151 wtppaiykss csidvtffpf dqqnctmkfg swtydkakid lvnmhsrvdq 201 ldfwesgewv ivdavgtynt rkyeccaeiy pdityafvir rlplfytinl 251 iipclliscl tvlvfylpse cgekitlcis vllsltvfll liteiipsts 301 lvipligeyl lftmifvtls ivitvfvlnv hhrsprthtm ptwvrrvfld 351 ivprlllmkr psvvkdncrr liesmhkmas aprfwpepeg eppatsgtqs 401 lhppspsfcv pldvpaepgp sckspsdqlp pqqpleaeka sphpspgpcr 451 pphgtqapgl akarslsvqh msspgeaveg gvrcrsrsiq ycvprddaap 501 eadgqaagal asrnthsael pppdqpspck ctckkepssv spsatvktrs 551 tkappphlpl spaltraveg vqyiadhlka edtdfsvked wkyvamvidr 601 iflwmfiivc llgtvglflp pwlagmihhh hhhhh Ζ πνςημηαβήξ δμιή ηδξ ακαζοκδοαζιέκδξ ΑΣ α2 οπμιμκάδαξ ήηακ δ παναηάης (ηδκ Κ α2 οπμιμκάδα ηα αιζκμλέα ιε ηυηηζκμ πνχια ακηζηαηαζηάεδηακ ιε ηα mqq): 1 marrcgpval llgfgllrlc sgvwgtdtee rlvehlldps rynklirpat 51 ngselvtvql mvslaqlisv hereqimttn vwltqewedy rltwkpeefd 101 nmkkvrlpsk hiwlpdvvly nnadgmyevs fysnavvsyd gsifwlppai 151 yksackievk hfpfdqqnct mkfrswtydr teidlvlkse vaslddftps 201 gewdivalpg rrnenpddst yvditydfii rrkplfytin liipcvlits 251 lailvfylps dcgekmtlci svllaltvfl lliskivppt sldvplvgky 301 lmftmvlvtf sivtsvcvln vhhrspttht mapwvkvvfl eklpallfmq 351 qprhhcarqr lrlrrrqrer egagalffre apgadsctcf vnrasvqgla 401 gafgaepapv agpgrsgepc gcglreavdg vrfiadhmrs edddqsvsed 451 wkyvamvidr lflwifvfvc vfgtigmflq plfqnytttt flhsdhsaps 501 skhhhhhhhh Σέθμξ, εα εθεβπεεί ακ μζ ηοπυκ δζαθμνέξ ζηδκ έηθναζδ ΑΣ ηαζ Κ α4α2 nachr ιεηαλφ ηοηηάνςκ εκηυιςκ ηαζ γοιμιφηδηα P. pastoris, αθμνμφκ βεκζηχξ υθμοξ ημοξ nachr ή ιυκμ ημκ ζοβηεηνζιέκμ οπυηοπμ. οβηεηνζιέκα εα εθεβπεεί δ έηθναζδ ζηα ζοζηήιαηα αοηά ημο ECD ηδξ α1 οπμιμκάδαξ ημο ακενχπζκμο ιοσημφ ηφπμο nachr. ηδ ζοκέπεζα, ημ α1 ECD εηθναζιέκμ ζε ηφηηανα εκηυιςκ εα ζοβηνζεεί ιε ημ ακηίζημζπμ εηθναζιέκμ ζημ γοιμιφηδηα P. pastoris, ςξ πνμξ ηδκ ηαηαθθδθυηδηά ημο βζα πνήζδ ζε δμιζηέξ ιεθέηεξ ορδθήξ δζαηνζηζηήξ ζηακυηδηαξ, ηαεχξ επίζδξ ηαζ ςξ 59

60 πνμξ ηδκ ζηακυηδηά ημο κα πνμζδέκεζ ακηζζχιαηα έκακηζ ημο ακενχπζκμο ιοσημφ ηφπμο nachr, ζδζυηδηα πμθφ ζδιακηζηή βζα πνήζδ ζε αεθηζςιέκεξ εεναπείεξ ηδξ αανζάξ ιοαζεέκεζαξ, υπμο εα βίκεηαζ επζθεηηζηή απμιάηνοκζδ ηςκ παεμβυκςκ ακηζnachr αοημακηζζςιάηςκ απυ ημκ μνβακζζιυ ηςκ αζεεκχκ. Β. ΤΛΗΚΑ ΚΑΗ ΜΔΘΟΓΟΗ Γζα ηδκ εηηέθεζδ ηςκ πεζναιάηςκ πνδζζιμπμζήεδηακ ηα παναηάης υνβακα ηαζ ακαθχζζια: Β.1.1. ΔΞΟΠΛΗΜΟ 1) Πζπέηεξ Gilson βζα ηδκ ιεηάββζζδ οβνχκ απυ 1 ιl έςξ 1 ml ηαζ δθεηηνζηυξ ακαννμθδηήξ (PIPETING AID) ηδξ Gilson βζα ιεηάββζζδ οβνχκ απυ 5 έςξ 50 ml. 2) Οβημιεηνζημί ηφθζκδνμζ ηδξ Nalgene ηαζ πθαζηζηά δμπεία (beakers) απυ ηδ Nalgen. 3) Εοβυξ ηδξ KERN. 4) Φαζιαημθςηυιεηνμ 6305 UV/Visible ηδξ JENWAY. 5) Φοβυηεκηνμξ Kubota 7780 ιε ηεθαθέξ RA-159G, AG-6512C, AG-5006A. 6) Οζ οβνέξ απμζηεζνχζεζξ έβζκακ ιε αοηυηαοζημ ηδξ Raypa. 7) οζηεοή πμθθαπθήξ ακαννυθδζδξ βζα Filter Assay ηδξ Amersham Biosciences. 8) Θενιζηυξ ηοηθμπμζδηήξ (MJ mini), ζοζηεοή δθεηηνμδζάηνδζδξ (Gene Pulser II) ηαζ ζοζηεοέξ μνζγυκηζαξ (Mini-Sub) ηαζ ηάεεηδξ δθεηηνμθυνδζδξ ηαζ δθεηηνμιεηαθμνάξ (Mini Protean) ηδξ BIORAD. 9) UV transiluminator ηδξ εηαζνίαξ UVP. 10) Μεηνδηέξ α ηαζ β-αηηζκμαμθίαξ ηδξ Perkin Elmer Wallac (ιμκηέθα 1409 ηαζ 2470 wizard 2 ακηζζημίπςξ). 11) οζηεοή οβνήξ πνςιαημβναθίαξ ορδθήξ απυδμζδξ βζα ημκ ηαεανζζιυ πνςηεσκχκ (FPLC) ηφπμο AKTA purifier ηδξ General Electric. 12) ηήθδ ιμνζαημφ απμηθεζζιμφ Superose 6 απυ ηδκ Amersham Biosciences. 13) Δπςαζηήνεξ mrc ηαζ Thermo Forma. 14) Θάθαιμξ κδιαηζηήξ νμήξ ηδξ Labcaire. 15) Οιμβεκμπμζδηήξ οπενδπςκ LABSONIC P ηδξ εηαζνίαξ Sartorius. 60

61 Β.1.2. ΠΛΑΣΗΚΑ ΑΝΑΛΧΗΜΑ 1) Πθαζηζηά αηνμνφβπζα (tips) απυ Greiner bio-one. 2) Πθαζηζημί ζςθήκεξ πμθοπνμποθεκίμο ηςκ 15 ηαζ 50 ml απυ Falcon. 3) Πθαζηζηά ζςθδκάνζα (eppendorf) 1,5 ml απυ Greiner bio-one. 4) Φίθηνα ιε δζάιεηνμ πυνμο 0,2 ιm απυ Whatman. 5) φνζββεξ ιζαξ πνήζδξ απυ B.D. 6) Φίθηνα οαθμαάιααηα απυ ηδκ Whatman (πυνμξ 1 ιm 2,5 cm δζάιεηνμξ). 7) Πθαζηζηέξ ζηνααυθαζιεξ θθάζηεξ βζα ηαθθζένβεζεξ ηοηηάνςκ απυ Greiner. Όθα ηα οάθζκα ηαζ πθαζηζηά είδδ πμο πνδζζιμπμζήεδηακ ήηακ απμζηεζνςιέκα ή απμζηεζνχκμκηακ ιε οβνή απμζηείνςζδ ιε ημ πνςηυημθθμ: 20 θεπηά ζημοξ C. Β.1.3. ΑΝΣΗΓΡΑΣΖΡΗΑ Όθα ηα πδιζηά πμο πνδζζιμπμζήεδηακ βζα ηδκ παναζηεοή νοειζζηζηχκ δζαθοιάηςκ ήηακ ηαεανυηδηαξ ημοθάπζζημκ 99% απυ ηζξ εηαζνίεξ Sigma ηαζ Applichem. Απυ ηζξ ίδζεξ εηαζνίεξ ήηακ ηαζ μζ ζηυκεξ απυ ηζξ μπμίεξ παναζηεοάζηδηακ ηα ενεπηζηά βζα ηζξ ηαθθζένβεζεξ ημο ααηηδνίμο E. coli ηαζ ημο γοιμιφηδηα P. pastoris, εκχ ημ ενεπηζηυ πμο πνδζζιμπμζήεδηε βζα ηα ηφηηανα εκηυιςκ ήηακ ημ SF900II ηδξ Invitrogen. Ραδζμεπζζδιαζιέκα ιε 125 Η ηαζ 3 Ζ ιυνζα επζααηζδίκδξ απυ ηδκ Amersham International. Β.1.4. ΓΗΑΛΤΜΑΣΑ Σα νοειζζηζηά δζαθφιαηα (ΡΓ) πμο πνδζζιμπμζμφκηαζ ζηδκ πανμφζα ιεθέηδ ηςκ μπμίςκ δ παναζηεοή ή δ ζφζηαζδ δεκ ακαθένεηε ζηδκ εκυηδηα Β.2 (ΜΔΘΟΓΟΗ) πενζβνάθμκηαζ ζε αοηή ηδκ πανάβναθμ είκαζ οδαηζηά ηαζ παξαζθεπαζκέλα κε dd H 2 O εθηόο αλ αλαθέξεηαη θάπνηνο άιινο δηαιύηεο. Σα ΡΓ θςζθμνζηχκ (PB) δζαθυνςκ ηζιχκ ph ηαζ ζοβηεκηνχζεςκ, παναζηεοάγμκηαζ ςξ ελήξ: Παναζηεοάγμκηαζ ηα δζαθφιαηα KH 2 PO 4 1M ηαζ K 2 ΖPO 4 1M ηαζ ακαιεζβκφμκηαζ ιέπνζ ημ ph κα θηάζεζ ζηδκ επζεοιδηή ηζιή. ηδ ζοκέπεζα απυ ημ PB 1Μ, αναζχκμκηαξ ιε d.d.h 2 O πνμηφπημοκ μζ άθθεξ ζοβηεκηνχζεζξ ΡΓ ηφπμο PB ίδζμο ph. 61

62 PBS: 60mM PB ph 7,4, 137 mm NaCl, 2,7 mm KCl. Β.1.5. ΑΝΣΗΧΜΑΣΑ Μμκμηθςκζηυ ακηίζςια (mab) έκακηζ ημο επζηυπμο πέκηε δζαδμπζηχκ ζζηζδζκχκ, ζογεοβιέκμ ιε ημ έκγοιμ ηδξ οπενμλεζδάζδξ αβνζμναπακίδαξ (HRP, Horse Radish Peroxidase) απυ ηδ Sigma (ακηί-5his HRP). Β.2. ΜΔΘΟΓΟΗ Β.2.1. ΑΝΣΗΓΡΑΔΗ ΣΡΟΠΟΠΟΗΖΖ ΣΟΤ DNA Σα έκγοια ηαζ ηα νοειζζηζηά δζαθφιαηα πμο απαζημφκηακ βζα ηζξ ακηζδνάζεζξ ηνμπμπμίδζδξ ημο DNA ήηακ απυ ηδκ εηαζνία New England Biolabs ζφιθςκα ιε ηα ελήξ πνςηυημθθα: ΠΔΦΖ dd H 2 O βζα ζοκμθζηυ υβημ ακηίδναζδξ 50 ιl 5 ιl 10Υ νοειζζηζηυ δζάθοια 20 ιg DNA 20 ιμκάδεξ απυ ηάεε πενζμνζζηζηυ έκγοιμ επχαζδ ζημοξ 37 0 C βζα 2 χνεξ ΓΖΜΗΟΤΡΓΗΑ ΣΤΦΛΧΝ ΑΚΡΧΝ dd H 2 O βζα ζοκμθζηυ υβημ ακηίδναζδξ 50 ιl 5 ιl 10Υ νοειζζηζηυ δζάθοια 20 ιg DNA 1 ιl ιείβια ηςκ ηεζζάνςκ dntp (10 mm) 3 ιμκάδεξ πμθοιενάζδξ pfu επχαζδ ζημοξ 72 o C βζα 15 θεπηά επχαζδ ζε ΘΓ βζα 10 θεπηά βζα επακαδζάηαλδ ημο DNA ΑΠΟΦΧΦΟΡΤΛΗΧΖ dd H 2 O βζα ζοκμθζηυ υβημ ακηίδναζδξ 50 ιl 5 ιl 10Υ νοειζζηζηυ δζάθοια 20 ιg DNA 62

63 5 ιμκάδεξ αθηαθζηήξ θςζθαηάζδξ SAP επχαζδ ζημοξ 37 o C βζα 30 θεπηά επχαζδ ζημοξ 65 o C βζα 15 θεπηά επχαζδ ζε ΘΓ βζα 10 θεπηά βζα επακαδζάηαλδ ημο DNA ΈΝΘΔΖ dd H 2 O βζα ζοκμθζηυ υβημ ακηίδναζδξ 20 ιl 2 ιl 10Υ νοειζζηζηυ δζάθοια 200 ng πθαζιζδίμο-θμνέα 200 ng α4 ή α2 cdna 20 ng ιμκυηθςκμο ζοκδέηδ (βζα ηδκ οπμηθςκμπμίδζδ ζημ πθαζιίδζμ pfastbac1 ) 10 ιμκάδεξ Σ4 DNA θζβάζδξ επχαζδ ζημοξ 16 0 C βζα 16 χνεξ Β.2.2. ΚΑΘΑΡΗΜΟ DNA ΠΡΟΨΟΝΣΟ ΔΝΕΤΜΗΚΧΝ ΑΝΣΗΓΡΑΔΧΝ Ο ηαεανζζιυξ DNA πμο απμηεθεί πνμσυκ εκγοιζηχκ ακηζδνάζεςκ, βίκεηαζ ιε ζημπυ ηδκ απμιάηνοκζδ ηςκ εκγφιςκ ηαζ ηςκ νοειζζηζηχκ δζαθοιάηςκ, ηα μπμία ιπμνεί κα απμηεθμφκ ειπυδζμ βζα ηζξ ιεηέπεζηα πνήζεζξ ημο. ηα πθαίζζα ηδξ ιεθέηδξ αοηήξ, μ ηαεανζζιυξ DNA πνμενπυιεκμο απυ εκγοιζηέξ ακηζδνάζεζξ έβζκε ιε ημ HiSpeed PCR Purification Kit ηδξ Qiagen. Β.2.3. ΔΞΑΓΧΓΖ DNA ΑΠΟ ΣΜΖΜΑΣΑ ΠΖΚΣΧΜΑΣΟ ΑΓΑΡΟΕΖ Ζ ελαβςβή DNA απυ ηειάπζα πδηηχιαημξ αβανυγδξ έβζκε ιε ημ HiSpeed Gel Extraction Kit ηδξ Qiagen. Β.2.4. ΠΑΡΑΚΔΤΖ ΔΠΗΓΔΚΣΗΚΧΝ ΒΑΚΣΖΡΗΧΝ E. coli Διαμθζάζηδηακ 10 ml LB ιε απμζηία απυ ηνοαθίμ LB ηαζ ζηδ ζοκέπεζα επςάζηδηε βζα χνεξ ζημοξ 37 C 0, οπυ ακάδεοζδ 250 rpm. Σδκ άθθδ ιένα ιε 1 ml απυ ηδκ παναπάκς ηαθθζένβεζα ειαμθζάζηδηακ 250 ml LB ηαζ δ κέα ηαθθζένβεζα επςάζηδηε ζημοξ 37 C 0, οπυ ακάδεοζδ 250 rpm εςζυημο δ OD 600 έβζκε 0,5-0,9. Ζ ηαθθζένβεζα επςάζηδηε ζημκ πάβμ βζα 10 θεπηά. 63

64 Αημθμφεδζε θοβμηέκηνδζδ ηδξ ηαθθζένβεζαξ ζηα g βζα 10 θεπηά ζημοξ 4 C 0 ηαζ απυποζδ ημο οπενηεζιέκμο. Σμ ηοηηανζηυ ίγδια επακαζςνήεδηε ζε 20 ml παβςιέκμο CaCl 2 0,1 Μ. Αημθμφεδζε λακά θοβμηέκηνδζδ ηδξ ηαθθζένβεζαξ ζηα g βζα 10 θεπηά ζημοξ 4C 0 ηαζ απυποζδ ημο οπενηεζιέκμο. Σμ ηοηηανζηυ ίγδια επακαζςνήεδηε ζε 4 ml παβςιέκμο CaCl 2 0,1 Μ. Πνμζηέεδηε 1ml απμζηεζνςιέκδξ βθοηενυθδξ ηαζ ακαδεφηδηακ ηαθά. Σμ εκαζχνδια ιμζνάζηδηε ζε πνμροβιέκμοξ ζςθήκεξ 1,5 ml (απυ 100 ιl ζε έηαζημ) ηαζ απμεδηεφηδηακ ζημοξ -80 C 0. Υνδζζιμπμζήεδηακ εκηυξ ελαιήκμο. Β.2.5. ΜΔΣΑΥΖΜΑΣΗΜΟ ΒΑΚΣΖΡΗΧΝ E. coli Ββήηε απυ ημοξ -80 C 0 μ απαναίηδημξ ανζειυξ ζςθήκςκ ιε επζδεηηζηά E. coli ηαζ ημπμεεηήεδηακ ζημκ πάβμ βζα κα απμροπεμφκ ανβά. Μεηά ηδκ απυρολή πνμζηέεδηε ημ πθαζιίδζμ (1-10 ιl δζαθφιαημξ πθαζιζδίμο πμο πενζείπακ πενίπμο 1ιg πθαζιζδίμο ή 10 ιl πνμσυκημξ ακηίδναζδξ θζβάζδξ) ηαζ ακαδεφηδηακ εθαθνά. Μεηά απυ επχαζδ 30 θεπηχκ ζημκ πάβμ ιπήηακ ζε οδαηυθμοηνμ 42 C 0 βζα 90 δεοηενυθεπηα. Αημθμφεδζε επχαζδ ζημκ πάβμ βζα 4 θεπηά. Μεηά πνμζηέεδηε 1 ml ενεπηζημφ LB ζε ηάεε ζςθήκα ηαζ επςάζηδηακ οπυ ακάδεοζδ ζημοξ 37 C 0 βζα 40 θεπηά. ηδ ζοκέπεζα 80 ιl επζζηνχεδηακ ζε έκα ηνοαθίμ ιε ηα ηαηάθθδθα ακηζαζμηζηά ηαζ ημ οπυθμζπμ θοβμηεκηνήεδηε ζηα g βζα 5 θεπηά. Μεηά ηδ θοβμηέκηνδζδ ημ ααηηδνζαηυ ίγδια επακαζςνήεδηε ζε 150 ιl οπενηεζιέκμο ηαζ επζζηνχεδηε ζε άθθμ ηνοαθίμ. Μεηά απυ επχαζδ ςνχκ ηςκ ηνοαθίςκ ζημοξ 37 C 0 εθέβπεδηακ βζα ακάπηολδ απμζηζχκ. 64

65 Β.2.6. ΑΠΟΜΟΝΧΖ ΠΛΑΜΗΓΗΑΚΟΤ DNA ΑΠΟ E.coli Ζ απμιυκςζδ πθαζιζδζαημφ DNA απυ ηαθθζένβεζεξ ιεηαζπδιαηζζιέκςκ ααηηδνίςκ E. coli έβζκε ιε ημ PureLink HiPure Plasmid Miniprep Kit ηδξ Invitrogen. Β.2.7. ΑΛΤΗΓΧΣΖ ΑΝΣΗΓΡΑΖ ΠΟΛΤΜΔΡΑΖ Ζ αθοζζδςηή ακηίδναζδ πμθοιενάζδξ (PCR) ιε ηδκ μπμία επζαεααζχεδηε υηζ ηα ηαεανζζιέκα Bacmid ήηακ ακαζοκδοαζιέκα, έβζκε ιε DNA πμθοιενάζδ: Platinum Taq polymerase ηδξ εηαζνίαξ Invitrogen ιε ημ ελήξ ιείβια ακηίδναζδξ: Γηάιπκα Όγθνο (κl) Ακαζοκδοζιέκμ bacmid DNA (100 ng) 1 10X ΡΓ 5 Mείβια dntp (10 mm) 1 MgCl 2 (50 mm) 1,5 Δηηζκδηέξ (1.25 ιl έηαζημξ απυ δζάθοιαηα 10 ιm) 2,5 dd H 2 O 38,5 Πμθοιενάζδ (5 ιμκάδεξ εκγφιμο/ιl) 0,5 οκμθζηυξ υβημξ 50 Πίλαθαο 1. Σo ιείβια ιε ημ μπμίμ έβζκε δ PCR. Σα ζηάδζα, μζ εενιμηναζίεξ ηαζ μζ πνυκμζ ηδξ ακηίδναζδξ πενζβνάθμκηαζ ζημκ πίλαθα 2. 65

66 ηάδην Υξόλνο Θεξκνθξαζία o C Δπαλαιήςεηο Ανπζηή απμδζάηαλδ 3 θεπηά 93 1 Απμδζάηαλδ 45 δεοηενυθεπηα 94 Δπακαδζάηαλδ 45 δεοηενυθεπηα Δπζιήηοκζδ 5 θεπηά 72 Σεθζηή επζιήηοκζδ 7 θεπηά 72 1 Πίλαθαο 2. Σα ζηάδζα, μζ εενιμηναζίεξ ηαζ μζ πνυκμζ ηδξ PCR. Μεηά ημ ηέθμξ ηδξ ακηίδναζδξ 10 ιl απυ ηα πνμσυκηα ηδ ακηίδναζδξ ακαθφεδηακ ιε δθεηηνμθυνδζδ. Β.2.8. ΖΛΔΚΣΡΟΦΟΡΖΖ DNA Δ ΠΖΚΣΧΜΑ ΑΓΑΡΟΕΖ Ζ δθεηηνμθυνδζδ ζε πδηηχιαηα αβανυγδξ, απμηεθεί ηδκ ζοκδεέζηενδ ιέεμδμ πνμζδζμνζζιμφ ηςκ ΜΒ ιμνίςκ DNA ηαεχξ είκαζ απθή ηαζ αηνζαήξ. οβηεηνζιέκα ζημ πνςηυημθθμ πμο αημθμοεήεδηε ζηδκ πανμφζα ιεθέηδ, ζοκανιμθμβήεδηε ημ ηαθμφπζ ηδξ μνζγυκηζαξ δθεηηνμθυνδζδξ ηαζ ιεηά ηδκ πνμζεήηδ ημο δζαθφιαημξ ημο πδηηχιαημξ, ζημ μπμίμ δ αβανυγδ είπε δζαθοημπμζδεεί ιε εένιακζδ, ιπήηακ ηαζ ηα πηεκάηζα βζα ηδ δδιζμονβία ηςκ θνεαηίςκ θυνηςζδξ ηςκ δεζβιάηςκ. Μεηά ηδ ζηενεμπμίδζδ ημο πδηηχιαημξ, ημ πήηηςια ηδξ αβανυγδξ ηαθφθεδηε ιε δζάθοια δθεηηνμθυνδζδξ ηαζ ηα ηηεκάηζα ηνααήπηδηακ βζα ηδ δδιζμονβία ηςκ θνεαηίςκ. ηδ ζοκέπεζα ηα πνμξ δθεηηνμθυνδζδ δείβιαηα ακαιείπεδηακ ιε δζάθοια θυνηςζδξ ηαζ θμνηχεδηακ ζηα θνεάηζα. Σεθζηά εθανιυζηδηε δθεηηνζηυ πεδίμ 100 V ιέπνζ ημ ιέηςπμ ηδξ δθεηηνμθυνδζδξ κα θηάζεζ ζημ ζηδκ άηνδ ημο πδηηχιαημξ. Οζ γχκεξ ημο DNA ειθακίζηδηακ ιε ηδ αμήεεζα πδβήξ οπενζχδμοξ θςηυξ (210 nm). ΓΗΑΛΤΜΑΣΑ Γηάιπκα ειεθηξνθόξεζεο: 20 mm Tris/CH 3 COOH ph 8, 10 mm EDTA. Γηάιπκα πεθηώκαηνο: Γζάθοια δθεηηνμθυνδζδξ + 1% (w/v) αβανυγδ + 1/ δζάθοια ανςιζμφπμο αζεζδίμο (10 mg/ml). Γηάιπκα θόξησζεο δεηγκάησλ 3x: 60 mm Tris/CH 3 COOH ph 8, 30 mm EDTA, 0,1% (w/v) bromophenol blue. 66

67 Β.2.9. ΔΣΔΡΟΛΟΓΖ ΔΚΦΡΑΖ ΣΧΝ ΑΝΑΤΝΓΤΑΜΔΝΧΝ ΤΠΟΓΟΥΔΧΝ α4β2 Δ ΚΤΣΣΑΡΑ ΔΝΣΟΜΧΝ Sf9 ηδκ πανμφζα ιεθέηδ πνδζζιμπμζήεδηακ ηφηηανα εκηυιςκ Sf9, ηα μπμία ελέθναζακ ηαοηυπνμκα ηζξ οπμιμκάδεξ ημο ακενςπίκμο α4α2 κεονζημφ nachr ηαηυπζκ ηαοηυπνμκδξ ιυθοκζδξ ιε ακαζοκδοαζιέκμοξ ααηζθμσμφξ πμο έθενακ ηα cdna ηςκ οπμιμκάδςκ ζημ βεκεηζηυ ημοξ οθζηυ. Καηαζθεπή αλαζπλδπαζκέλσλ βαθηιντώλ Ζ ηαηαζηεοή ηςκ ακαζοκδοαζιέκςκ ααηζθμσχκ έβζκε ιε ημ ζφζηδια BAC-to- BAC ηδξ Invitrogen. Σα cdna ηςκ οπμιμκάδςκ ημο α4α2 nachr ιεηαθένεδηακ απυ ημ πθαζιίδζμ ptriex-3 Neo ζημ πθαζιίδζμ pfastbac1, ημ μπμίμ ζηδ ζοκέπεζα πνδζζιμπμζήεδηε βζα ημ ιεηαζπδιαηζζιυ ημο ελεζδζηεοιέκμο ζηεθέπμοξ DH10Bac ημο ααηηδνίμο E. coli. Σμ ζηέθεπμξ αοηυ θένεζ έκα ακηίβναθμ ημο βμκζδζχιαημξ ημο ααηζθμσμφ (Bacmid), ζοκ έκα αμδεδηζηυ πθαζιίδζμ πμο εηθνάγεζ ημ έκγοιμ πμο ιεηαεέηεζ ιέζα ζηα ααηηδνίδζα, απυ ημ pfastbac1 ζημ Bacmid, ηδκ ηαζέηα πμο μνίγεηαζ απυ ηζξ αθθδθμοπίεξ Tn7L ηαζ Tn7R. Ζ ηαζέηα αοηή πενζέπεζ ημ cdna ηδξ πνςηεΐκδξ, ακάιεζα ζημκ οπμηζκδηή ηδξ πμθοεδνίκδξ ημο ζμφ ηαζ ηδκ πμθφ-α μονά ημο ζμφ SV40, ζοκ βμκίδζμ ακεεηηζηυηδηαξ ζηδκ βεκηαιζηίκδ. Ζ ιεηάεεζδ αοηήξ ηδξ ηαζέηαξ δζαηυπηεζ ημ βμκίδζμ ηδξ α-βαθαηημζζδάζδξ πμο ανίζηεηαζ ζημ Bacmid ηαζ έηζζ δομ 24ςνα ιεηά ημ ιεηαζπδιαηζζιυ ηςκ ααηηδνίςκ DH10Bac, μζ απμζηίεξ ζηζξ μπμίεξ έπεζ βίκεζ πθήνδξ ιεηάεεζδ είκαζ θεοηέξ ζηδκ δμηζιαζία blue-white screening, εκχ μζ απμζηίεξ ζηζξ μπμίεξ δεκ έπεζ μθμηθδνςεεί δ ιεηάεεζδ ηδξ ηαζέηαξ έπμοκ ιπθε πνχια. Μεηά απυ επζθμβή θεοηχκ απμζηζχκ, αημθμφεδζακ ηαθθζένβεζεξ ηςκ 10 ml ζε LB πμο πενζείπε βεκηαιζηίκδ, ηακαιοηίκδ ηαζ ηεηναηοηθίκδ ζε ζοβηεκηνχζεζξ ίδζεξ ιε αοηέξ ημο ηνοαθίμο βζα blue-white screening ηαζ ιεηά απμιυκςζδ πθαζιζδζαημφ DNA. Σμ πθαζιζδζαηυ DNA πμο απμιμκχεδηε πενζείπε ηαζ ημ ακαζοκδοαζιέκμ Bacmid ηαζ πνδζζιμπμζήεδηε βζα ηδ δζαιυθοκζδ ηοηηάνςκ Sf9, ζφιθςκα ιε ημ ελήξ πνςηυημθθμ: 1. ηνχεδηακ 10 6 ηφηηανα Sf9 ζε ηάεε θνεάηζμ πθάηαξ 6 θνεαηίςκ. 2. Σμ παθζυ ενεπηζηυ ακαννμθήεδηε πνμζεηηζηά ηαζ ακηζηαηαζηάεδηε ιε 2 ml Sf 900II. 67

68 3. 2 ιg πθαζιζδζαημφ DNA ιε Bacmid πνμζηέεδηακ ζε 100 ιl Sf 900II 4. Μεηά απυ ακάδεοζδ ημο πενζέηηδ, 8 ιl Cellfectin πνμζηέεδηακ ζε άθθα 100 ιl Sf 900II ηαζ αημθμφεδζε ηαθή ακάδεοζδ ημο ιείβιαημξ. 5. Σα 100 ιl ημο Sf 900II ιε ημ Bacmid, εκχεδηακ ιε ηα 100 ιl Sf 900II ιε ημ Cellfectin ηαζ αημθμφεδζε ηαθή ακάδεοζδ ημο ιείβιαημξ ηαζ επχαζδ βζα 30 θεπηά ζε εενιμηναζία δςιαηίμο (Θ.Γ.). 6. ημ ιείβια πνμζηέεδηακ άθθα 0,8 ml Sf 900II ηαζ αημθμφεδζε ακάδεοζδ ημο ιείβιαημξ. 7. Σμ παναπάκς ιείβια πνμζηέεδηε ζε ηάεε θνεάηζμ ηδξ πθάηαξ ιε ηφηηανα, αθμφ πνχηα απμιαηνφκεδηε ημ πνμδβμφιεκμ ενεπηζηυ ηαζ αημθμφεδζε επχαζδ βζα 5 χνεξ ζημοξ 27 μ C. 8. ηδ ζοκέπεζα, ημ ιείβια απμιαηνφκεδηε ηαζ πνμζηέεδηακ 3 ml Sf 900II/ 5 % FBS ζε ηάεε θνεάηζμ ηδξ πθάηαξ. 9. Πέκηε 24ςνα ανβυηενα ζοθθέπεδηε ημ οπενηείιεκμ απυ ηάεε θνεάηζμ ηαζ ιεηά απυ θοβμηέκηνδζδ g βζα 5 θεπηά ζημοξ 22 μ C, ζοθθέπεδηε ημ οπενηείιεκμ ιε ηδκ πνχηδ βεκζά ηςκ ααηζθμσχκ. 10. Απυ ηα 3 ml οπενηεζιέκμο ιε ηδκ πνχηδ βεκζά ααηζθμσχκ, ηα 2 ml απμεδηεφεδηακ ζημοξ -80 μ C βζα ιεθθμκηζηή πνήζδ, εκχ ημ άθθμ 1 ml πνμζηέεδηε ζε θθάζηα Σ75 ιε 20 ml ενεπηζηυ Sf 900II/ 5 % FBS, ημνεζιέκδ ιε ηφηηανα ηαηά 80 % ηδξ επζθάκεζαξ ηαζ έβζκε επχαζδ βζα 4 διένεξ βζα ηδ δδιζμονβία ηδξ δεφηενδξ βεκζάξ ααηζθμσχκ. 11. Γζα ηδκ παναθααή ηδξ δεφηενδξ βεκζάξ ααηζθμσχκ ζοθθέπεδηε ημ οπενηείιεκμ ηδξ βθάζηαξ, έβζκε θοβμηέκηνδζδ g βζα 5 θεπηά ζημοξ 22 μ C ηαζ ζοθθέπεδηε ημ οπενηείιεκμ. ηδ ζοκέπεζα ηα 21 ml ηδξ δεφηενδξ βεκζάξ ααηζθμσχκ πνμζηέεδηακ ζε 0,5 L ηαθθζένβεζαξ ζε αζχνδζδ ιε ενεπηζηυ Sf 900II/ 5 % FBS, ποηκυηδηαξ 2,5x10 6 ηφηηανα/ ml ηαζ έβζκε επχαζδ βζα 4 διένεξ, βζα ηδ δδιζμονβία ηδξ ηνίηδξ βεκζάξ ααηζθμσχκ 12. Ζ ηαθθζένβεζα ζε αζχνδζδ θοβμηεκηνήεδηε ζηα g βζα 5 θεπηά ζημοξ 22 μ C ηαζ ημ οπενηείιεκμ ιε ημοξ ζμφξ ηδξ ηνίηδξ βεκζάξ απμεδηεφηδηε ζημοξ 4 μ C. Ζ ηνίηδ βεκζά ααηζθμσχκ ήηακ ανηεηά ιεβάθδξ πμζυηδηαξ ηαζ μ ηίηθμξ ηδξ ήηακ ανηεηά ορδθυξ βζα κα πνδζζιμπμζδεεί βζα ηδκ παναβςβή ηςκ ΑΣ ηαζ Κ οπμδμπέςκ. 68

69 Έθθξαζε ησλ αλαζπλδπαζκέλσλ ππνδνρέσλ Ζ ηαθθζένβεζα ηςκ ηοηηάνςκ Sf9 λεηίκδζε ιε ηδκ ηαπεία απυρολδ εκυξ ανζειμφ 10 7 ηοηηάνςκ ζε 1 ml ενεπηζημφ ηαηαρφλεςξ, απυ εενιμηναζία οβνμφ αγχημο ζημοξ 27 μ C. Αιέζςξ ιεηά ηδκ απυρολδ ημ 1 ml ειαμθζάζηδηε ζε 10 ml ενεπηζημφ Sf900 II ζε θθάζηα T25. Μεηά ημ πέναξ 45 θεπηχκ επχαζδξ ζημοξ 27 μ C, ημ οβνυ πενζεπυιεκμ ηδξ θθάζηαξ απμπφεδηε ιαγί ιε υζα ηφηηανα δεκ είπακ πνμζδεεεί ζημκ ποειέκα ηδξ θθάζηαξ ηαζ πνμζηέεδηακ άθθα 5 ml θνέζημο ενεπηζημφ SF900II. Σα ηφηηανα αθέεδηακ ιέπνζ κα ηαθφρμοκ ημ 100% ηδξ επζθάκεζαξ ηδξ θθάζηαξ, μπυηε ηαζ έβζκε ακαηαθθζένβεζα. Οζ ηαθθζένβεζεξ ιε πνμζημθθδιέκα ηφηηανα λεηζκμφζακ ιε ηάθορδ ημο 20% ηδξ επζθάκεζαξ ηδξ θθάζηαξ, εκχ μζ ηαθθζένβεζεξ ιε ηφηηανα ζε αζχνδζδ λεηζκμφζακ ιε ποηκυηδηα 1 x Ζ έηθναζδ ηςκ ακαζοκδοαζιέκςκ οπμδμπέςκ λεηζκμφζε υηακ μζ ηαθθζένβεζεξ έθηακακ ζε ποηκυηδηα ηα 2,5x10 6 ηφηηανα /ml, ιε ηδκ πνμζεήηδ 1,25 x 10 7 ακαζοκδοαζιέκςκ ιε ηδκ α4 οπμιμκάδα ααηζθμσχκ /ml ηαζ ίζμ ανζειυ ιε ηδκ α2 οπμιμκάδα. Σέζζενα 24ςνα ανβυηενα βζκυηακ θοβμηέκηνδζδ ζηα g βζα 5 θεπηά ηαζ ημ ίγδια ηςκ ηοηηάνςκ είηε πνδζζιμπμζμφηακ απεοεείαξ είηε απμεδηεουηακ ζημοξ -80 μ C βζα ιεθθμκηζηή πνήζδ. ΘΡΔΠΣΗΚΑ ΓΗΑ ΣΑ ΣΔΛΔΥΖ ΣΟΤ ΒΑΚΣΖΡΗΟΤ E. coli LB dd H 2 O 1 L Yeast Extract: 5 g Tryptone: 10 g NaCl: 10 g Τβνή απμζηείνςζδ 21 θεπηχκ ζημοξ C Γζα ηδκ ηαηαζηεοή ηνοαθίςκ πνμζηέεδηακ 15 g Bacto agar πνζκ ηδκ απμζηείνςζδ. Γζα ηνοαθία αιπζηζθθίκδξ, πνμζηέεδηε επζπθέμκ 1 ml απυ 100 mg/ml οδαηζημφ δζαθφιαημξ αιπζηζθθίκδξ πνζκ ηδκ έβποζδ ημο ενεπηζημφ ζηα ηνοαθία ηαζ αθμφ δ εενιμηναζία πέζεζ ηάης απυ ημοξ 50 0 C. Γζα ηνοαθία blue-white screening, πνμζηέεδηακ επζπθέμκ 0,5 ml απυ 100 mg/ml οδαηζημφ δζαθφιαημξ ηακαιοηίκδξ, 143 ιl απυ 50 mg/ml οδαηζημφ δζαθφιαημξ 69

70 βεκηαιζηίκδξ, 1ml απυ 10 mg/ml αζεακμθζημφ δζαθφιαημξ ηεηναηοηθίκδξ, 0,5 ml απυ 100 mg/ml οδαηζημφ δζαθφιαημξ IPTG ηαζ 1ml απυ 50 mg/ml δζαθφιαημξ x- gal ζε DMF, πνζκ ηδκ έβποζδ ημο ενεπηζημφ ζηα ηνοαθία ηαζ αθμφ δ εενιμηναζία έπεζε ηάης απυ ημοξ 50 0 C. ΘΡΔΠΣΗΚΟ ΚΑΣΑΦΤΞΔΧ Σμ ενεπηζηυ ηαηαρφλεςξ, ημ μπμίμ πνδζζιμπμζήεδηε βζα ηδκ απμεήηεοζδ γςκηακχκ ηοηηάνςκ ζε οβνυ άγςημ βζα ακαηαθθζένβεζεξ, ήηακ: 10% DMSO + 5% αυεζμξ ειανοσηυξ μνυξ (FBS) + 42,5% Sf 900 ΗΗ+ 42,5% ενεπηζηυ ακάπηολδξ απυ ηδκ ηαθθζένβεζα ηςκ ηοηηάνςκ πμο απμεδηεφμκηαζ. Β ΔΣΔΡΟΛΟΓΖ ΔΚΦΡΑΖ, ΣΧΝ ΑΝΑΤΝΓΤΑΜΔΝΧΝ ΤΠΟΜΟΝΑΓΧΝ ΣΟΤ α4β2 nachr ΣΟΝ ΕΤΜΟΜΤΚΖΣΑ P. pastoris. Ζ έηθναζδ ακαζοκδοαζιέκςκ πνςηεσκχκ ζημκ γοιμιφηδηα Pichia pastoris βίκεηαζ ιέζς εζδζηχκ βζα ημ ζφζηδια πθαζιζδίςκ, ζηα μπμία εκζςιαηχκμκηαζ ηα βμκίδζα ηςκ πνμξ έηθναζδ πνςηεσκχκ ηαηυπζκ ιεηαζπδιαηζζιμφ. ηδκ πανμφζα ιεθέηδ πνδζζιμπμζείηαζ ημ ζηέθεπμξ GS115 ημο γοιμιφηδηα Pichia pastoris ιυκζια ιεηαζπδιαηζζιέκμ ιε ακαζοκδοαζιέκα πθαζιίδζα ppic9 (εηθόλα 20) ηα μπμία θένμοκ ηα cdnas ηςκ οπμιμκάδςκ ημο α4α2 ακενχπζκμο κεονζημφ nachr. Συζμ ημ ζηέθεπμξ ημο γοιμιφηδηα, υζμ ηαζ ημ πθαζιίδζμ πμο πνδζζιμπμζήεδηε ήηακ ηδξ εηαζνίαξ Invitrogen. 70

71 Δηθόλα 20. Σν πιαζκίδην ppic9. Γζαηνίκεηαζ ημ ηιήια πμο ακαβκςνίγμοκ δζάθμνα πενζμνζζηζηά έκγοια βζα ηδκ εκζςιάηςζδ ημο cdna ηδξ πνμξ έηθναζδ πνςηεΐκδξ, ηα ηιήιαηα (5 ΑΟΥ1, 3 ΑΟΥ1) ζηα μπμία ζοιααίκεζ μιυθμβμξ ακαζοκδοαζιυξ ιε ημ βεκεηζηυ οθζηυ ημο γοιμιφηδηα, ηαεχξ ηαζ ημ βμκίδζμ ηδξ ζζηζδζκζηήξ δζτδνμβεκάζδξ (HIS4) πμο πνμζδίδεζ ηδκ ζηακυηδηα επζαίςζδξ ζε ενεπηζηυ πςνίξ ζζηζδίκδ (Δζηυκα απυ Invitrogen 2002a). Μεηαζρεκαηηζκόο ηνπ δπκνκύθεηα P. pastoris Ο ιεηαζπδιαηζζιυξ ημο ζηεθέπμοξ GS115 έβζκε ςξ ελήξ: 1. Δπζζηνχεδηε ηνοαθίμ YPD ηαζ επζθέπεδηε ιζα απμζηία δ μπμία ακαηαθθζενβήεδηε ζε 5 ml YPD βζα 16 χνεξ ζημοξ 30 μ C οπμ ακαηίκδζδ ζηζξ 225 rpm. 2. Απυ ηδκ πνμδβμφιεκδ ηαθθζένβεζα 200 ιl ειαμθζάζηδηακ ζε 0,5 L YPD βζα 16 χνεξ ζημοξ 30 μ C οπμ ακαηίκδζδ ζηζξ 225 rpm ιέπνζ δ ηζιή OD 600 κα θηάζεζ ζημ 1,3-1,6. 3. Αημθμφεδζε θοβμηέκηνδζδ ηδξ ηαθθζένβεζαξ ζηα g βζα 5 θεπηά ζημοξ 4 o C, απυποζδ ημο οπενηεζιέκμο ηαζ επακαζχνδζδ ημο ζγήιαημξ ζε 500 ml dd Ζ 2 Ο 4 o C. 4. Φοβμηέκηνδζδ ζηα g βζα 5 θεπηά ζημοξ 4 o C, απυποζδ ημο οπενηεζιέκμο ηαζ επακαζχνδζδ ημο ζγήιαημξ ζε 250 ml dd Ζ 2 Ο 4 o C. 5. Φοβμηέκηνδζδ ζηα g βζα 5 θεπηά ζημοξ 4 o C, απυποζδ ημο οπενηεζιέκμο ηαζ επακαζχνδζδ ημο ζγήιαημξ ζε 20 ml 1Μ ζμναζηυθδξ 4 o C. 71

72 6. Φοβμηέκηνδζδ ζηα g βζα 5 θεπηά ζημοξ 4 o C, απυποζδ ημο οπενηεζιέκμο ηαζ επακαζχνδζδ ημο ζγήιαημξ ζε 1,5 ml 1Μ ζμναζηυθδξ 4 o C ιl απυ ημ εκαζχνδια ηςκ ηοηηάνςκ επςάζηδηακ ιε 2,5ιg βναιιζημφ ppic9 ακαζοκδοαζιέκμο ιε ημ α4 cdna ηαζ 2,5ιg ακαζοκδοαζιέκμο ιε ημ α2 cdna ζε ηοαέηα δθεηηνμδζάηνδζδξ ζημοξ 4 o C βζα 4 θεπηά. 8. Ζθεηηνμδζάηνδζδ ιε νοειίζεζξ: 1,5 kv, 25 ιf ιε low range resistance 200 ηαζ high range, βζα 5ιsec. 9. Αιέζςξ ιεηά πνμζηέεδηε 1 ml 1M ζμναζηυθδξ 4 o C ηαζ επζζηνχεδηακ ζε δομ ηνοαθία RDB 80 ηαζ 160 ιl ακηζζημίπςξ. 10. Αημθμφεδζε επχαζδ βζα ηέζζενα 24ςνα ζημοξ 30 o C ιέπνζ κα ειθακζζημφκ απμζηίεξ. Έθθξαζε ησλ ππνδνρέσλ Ζ ηαθθζένβεζα βζα ηδκ παναβςβή ηδξ πνςηεΐκδξ έβζκε ζε ηνία ζηάδζα. ημ πνχημ ζηάδζμ, 10 ml ενεπηζημφ YPD ειαμθζάζηδηακ ιε ηαθθζένβεζα γοιμιφηδηα ζε YPD δ μπμία ήηακ απμεδηεοιέκδ ζημοξ -80 μ C ιε 30 % βθοηενυθδ. Αοηυ ημ ζηάδζμ ήηακ πνμπαναζηεοαζηζηυ βζα κα ακαηάιρεζ μ γοιμιφηδηαξ απυ ηδκ πμθφ παιδθή εενιμηναζία ηαζ κα θηάζεζ ζε θάζδ εηεεηζηήξ ακάπηολδξ. Μεηά απυ 24 χνεξ επχαζδξ ζημοξ 30 μ C οπυ ακάδεοζδ ζηζξ 225 ζηνμθέξ ημ θεπηυ (rpm), πμζυηδηα απυ ηδ πνχηδ ηαθθζένβεζα ακαηαθθζενβήεδηε ιε ακαθμβία υβηςκ 1/100 ζε ενεπηζηυ BMGY πμο πενζέπεζ 1% βθοηενυθδ. ηδ ζοκέπεζα δ ηαθθζένβεζα επςάζηδηε ζημοξ 30 μ C οπυ ακάδεοζδ ζηζξ 225 rpm έςξ υημο δ μπηζηή ποηκυηδηα έθηαζε ηδκ ηζιή 2 ζε ιήημξ ηφιαημξ 600 nm. ημ ζδιείμ αοηυ, δ ηαθθζένβεζα θοβμηεκηνήεδηε ζηα g βζα 5 θεπηά ζε ΘΓ, έβζκε απυποζδ ημο οπενηεζιέκμο ηαζ ζηδ ζοκέπεζα ημ ίγδια επακαζςνήεδηε ζε υβημ ενεπηζημφ BMMY ηυζμ, χζηε δ ηαθθζένβεζα κα λεηζκήζεζ απυ OD 600 = 1. Tμ ενεπηζηυ BMMY πενζέπεζ 0,5% ιεεακυθδ βζα ηδκ επαβςβή ηδξ οπενέηθναζδξ ηςκ πνςηεσκχκ. Ζ ηαθθζένβεζα αοηή επςάζηδηε βζα 3 ιένεξ ζημοξ 22 μ C οπυ ακάδεοζδ ζηζξ 225 rpm, ιε ηαεδιενζκή πνμζεήηδ ιεεακυθδξ βζα δζαηήνδζδ ηδξ ζοβηέκηνςζδξ ζημ 0,5 %. Με ηδκ μθμηθήνςζδ ηδξ ηαθθζένβεζαξ βζκυηακ θοβμηέκηνδζδ ζηα g βζα 5 θεπηά ηαζ ημ ίγδια ηςκ ηοηηάνςκ είηε πνδζζιμπμζμφηακ απεοεείαξ είηε απμεδηεουηακ ζημοξ -80 μ C βζα ιεθθμκηζηή πνήζδ. Οζ ηαθθζένβεζεξ ιζηνήξ ηθίιαηαξ πμο έβζκακ βζα ηδκ ζφβηνζζδ ηδξ έηθναζδξ οπμδμπέςκ ιεηαλφ ιεηαζπδιαηζζιέκςκ απμζηζχκ, έβζκακ ηάης απυ ηζξ ίδζεξ ζοκεήηεξ ιε ηζξ παναπάκς, ιε ηδ ιυκδ δζαθμνά υηζ έηαζηδ απμζηία ειαμθζάζηδηε απεοεείαξ ζε 72

73 10 ml ενεπηζηυ BMGY ηαζ υηακ έθηαζε ζε ηζιή μπηζηήξ ποηκυηδηαξ: 1 (ιεηά απυ χνεξ) θοβμηεκηνήεδηε υπςξ παναπάκς ηαζ αθμφ έβζκε απυποζδ ημο οπενηεζιέκμο, μζ γοιμιφηδηεξ επακεςνήεδηακ ζε 10 ml BMMY ηαζ ηαθθζενβήεδηακ βζα 3 ιένεξ ιε ηαεδιενζκή πνμζεήηδ ιεεακυθδξ 0,5%. ηδ ζοκέπεζα μζ γοιμιφηδηεξ θοβμηεκηνήηακ ηαζ απμεδηεφηδηακ υπςξ παναπάκς. ΘΡΔΠΣΗΚΑ ΣΟΤ ΕΤΜΟΜΤΚΖΣΑ P. pastoris YPD (0,5 L) dd H 2 O: 450 ml Yeast Extract: 5 g Peptone: 10 g Τβνή απμζηείνςζδ 21 θεπηχκ ζημοξ C Πνμζεήηδ 50 ml δζαθφιαημξ βθοηυγδξ 10Υ Γζα ηδκ ηαηαζηεοή ηνοαθίςκ πνμζηέεδηακ 15g Bacto agar πνζκ ηδκ απμζηείνςζδ. RDB ηξπβιία (1 L) dd H 2 O: 700 ml μναζηυθδ 186 g Bacto agar 20 g Τβνή απμζηείνςζδ 21 θεπηχκ ζημοξ C ηαζ ημπμεέηδζδ ζε οδαηυθμοηνμ 60 0 C. Πνμζεήηδ ηςκ παναηάης δζαθοιάηςκ ζε εενιμηναζία 45 0 C. 100 ml δζαθφιαημξ 10Υ βθοηυγδξ 100 ml δζαθφιαημξ 10Υ YNB 2 ml δζαθφιαημξ 500Υ αζμηίκδξ 10 ml δζαθφιαημξ 100Υ AA Ακάιεζλδ ηαζ έβποζδ ζε ηνοαθία. BMGY (1 L) dd H 2 O: 750 ml Yeast Extract: 10 g Peptone: 20 g 73

74 PB 1M ph 7:100 ml Τβνή απμζηείνςζδ 21 θεπηχκ ζημοξ C Πνμζεήηδ: 10Υ δζαθφιαημξ βθοηενυθδξ: 100 ml 10Υ δζαθφιαημξ YNB: 30 ml 500Υ δζαθφιαημξ αζμηίκδξ: 4 ml BMMY (1 L) dd H 2 O: 850 ml Yeast Extract: 10 g Peptone: 20 g PB 1M ph 7:100 ml Τβνή απμζηείνςζδ 21 θεπηχκ ζημοξ C Πνμζεήηδ: 100% ιεεακυθδ: 5 ml 10Υ δζαθφιαημξ YNB: 30 ml 500Υ δζαθφιαημξ αζμηίκδξ: 4 ml ΓΗΑΛΤΜΑΣΑ-ΤΜΠΛΖΡΧΜΑΣΑ ΣΧΝ ΘΡΔΠΣΗΚΧΝ ΣΟΤ P. pastoris 10X δηάιπκα YNB: 1,34% (w/v) yeast nitrogen base, ιε (ΝΖ 4 ) 2 SO 4, πςνίξ αιζκμλέα. 500X δηάιπκα βηνηίλεο: 0,02% (w/v) αζμηίκδξ. 10X δηάιπκα γιπθόδεο: 20% (w/v) βθοηυγδξ. 10X δηάιπκα γιπθεξόιεο: 10% (v/v) βθοηενυθδξ. 100X δηάιπκα ΑΑ: 0,5% (w/v) απυ ηα αιζκμλέα: L-ιεεεζμκίκδ, L-βθμοηαιζηυ, L- θοζίκδ, L-θεοηίκδ ηαζ L-ζζμθεοηίκδ. Σα παναπάκς δζαθφιαηα απμζηεζνχεδηακ ιεηά απυ ηδκ παναζηεοή ημοξ πενκχκηαξ απυ θίθηνμ ηςκ 0,2 ιm. 74

75 Β ΠΔΗΡΑΜΑΣΑ ΠΡΟΓΔΖ ΑΓΧΝΗΣΧΝ ΑΝΣΑΓΧΝΗΣΧΝ ΣΟΤ ΑΝΑΤΝΓΤΑΜΔΝΟΤ α4β2 nachrs Β ΑΝΗΥΝΔΤΖ ΑΝΑΤΝΓΤΑΜΔΝΧΝ ΤΠΟΓΟΥΔΧΝ Γζα κα δζαπζζηςεεί δ έηθναζδ ηςκ ακαζοκδοαζιέκςκ οπμδμπέςκ ζηδκ ιειανάκδ ηςκ ηοηηάνςκ Sf9 ή ζημοξ γοιμιφηδηεξ P. pastoris, δζάθμνεξ πμζυηδηεξ ηοηηάνςκ ή γφιμιοηήηςκ επςάζηδηακ ιε 125 Η-επζααηζδίκδ ή 3 Ζ-επζααηζδίκδ. Σμ πμζμζηυ πμο πνμζδέεδηε, πνμζδζμνίζηδηε ιεηνχκηαξ ναδζεκενβέξ ηνμφζεζξ, αθμφ πνχηα ηα ηφηηανα πέναζακ απυ θίθηνμ ηαζ πθφεδηακ ιε ΡΓ βζα ηδκ απμιάηνοκζδ ηδξ ιδ εζδζηά πνμζδειέκδξ ναδζεκένβεζαξ. οβηεηνζιέκα ημ πνςηυημθθμ πμο αημθμοεήεδηε ήηακ ημ ελήξ: Έςξ ηαζ ηφηηανα Sf9 ή ακάθμβδ πμζυηδηα γοιμιφηδηα ακαιείπεδηακ ιε Κ/Λ 125 Η-επζααηζδίκδξ ή ηνμφζεζξ/θεπηυ (Κ/Λ) 3 Ζ-επζααηζδίκδξ ζε ηεθζηυ υβημ 100 ιl ιε ΡΓ PBS ηαζ επςάζηδηακ βζα 2 χνεξ. ηδ ζοκέπεζα πνμζηέεδηε 1 ml PBS ηαζ ιεηά απυ επακαζχνδζδ ηςκ ηοηηάνςκ ηα μπμία είπακ οπμζηεί ζημ ιεηαλφ ηαείγδζδ, ημ ιείβια πέναζε απυ θίθηνα οαθμαάιααηα ηα μπμία ζοβηνάηδζακ ηα ηφηηανα. Αημθμφεδζακ 3 πθφζεζξ ιε 1 ml PBS έηαζηδ ηαζ ζηδ ζοκέπεζα ιεηνήεδηακ απεοεείαξ μζ ναδζεκενβέξ ηνμφζεζξ ηδξ 125 Η-επζααηζδίκδξ, εκχ βζα ηδ ιέηνδζδ ηςκ ηνμφζεςκ ηδξ 3 Ζ-επζααηζδίκδξ ηα θίθηνα ειπμηίζηδηακ ζε δμηζιαζηζηυ ζςθήκα ιε 5 ml οβνυ ζπζκεδνζζιμφ Quicksafe A (Εinsser Αnalytic) ηαζ ιεηνήεδηακ ιεηά απυ επχαζδ ζε εενιμηναζία δςιαηίμο βζα 16 χνεξ, ιεηνήεδηακ. Β ΒΔΛΣΗΣΟΠΟΗΖΖ ΣΖ ΔΚΦΡΑΖ ΣΧΝ ΑΝΑΤΝΓΤΑΜΔΝΧΝ ΤΠΟΓΟΥΔΧΝ ηα πεζνάιαηα βζα ημκ πνμζδζμνζζιυ ημο αέθηζζημο πνυκμο έηθναζδξ ηςκ οπμδμπέςκ ηαζ ηδξ αέθηζζηδξ ακαθμβίαξ α4/α2 ααηζθμσχκ, έβζκε επχαζδ ιε Κ/Λ 125 Η-επζααηζδίκδξ ζε ηφηηανα Sf9, υπςξ ηαζ ζηα πεζνάιαηα ηδξ πνμδβμφιεκδξ παναβνάθμο βζα ηδκ ακίπκεοζδ ηςκ ακαζοκδοαζιέκςκ οπμδμπέςκ. 75

76 Β ΠΡΟΓΗΟΡΗΜΟ ΤΓΓΔΝΔΗΑ ΣΧΝ ΤΠΟΓΟΥΔΧΝ ΜΔ 3 Ζ- ΔΠΗΒΑΣΗΓΗΝΖ Ο πνμζδζμνζζιυξ ηδξ ζοββέκεζαξ ηςκ ακαζοκδοαζιέκςκ οπμδμπέςκ πμο εηθνάζηδηακ ζηα ηφηηανα εκηυιςκ ιε ηδκ 3 Ζ-επζααηζδίκδ, έβζκε επςάγμκηαξ βζα 2 χνεξ ζημοξ 4 μ C 10 5 ηφηηανα εκηυιςκ πμο ελέθναγακ ημοξ ΑΣ ηαζ Κ οπμδμπείξ, ιε αολακυιεκεξ ζοβηεκηνχζεζξ 3 Ζ-επζααηζδίκδξ, ζε ηεθζηυ υβημ 100 ιl ζε PBS. ηδ ζοκέπεζα ημ θζθηνάνζζια, μζ πθφζεζξ ηαζ δ ιέηνδζδ ηςκ ναδζεκενβχκ ηνμφζεςκ έβζκε υπςξ αηνζαχξ ηαζ ζηδκ πνμδβμφιεκδ πανάβναθμ. Β ΠΔΗΡΑΜΑΣΑ ΑΝΣΑΓΧΝΗΜΟΤ ΜΔ ΜΖ ΔΠΗΖΜΑΜΔΝΟΤ ΠΡΟΓΔΣΔ Ζ ζοββέκεζα ιδ επζζδιαζιέκςκ πνμζδέηεξ ιε ημοξ ακαζοκδοαζιέκμοξ οπμδμπείξ πμο εηθνάζηδηακ, πνμζδζμνίζηδηε έιιεζα απυ ηδκ ζηακυηδηα ηςκ πνχηςκ κα εηημπίγμοκ ηδκ 3 Ζ-επζααηζδίκδ απυ ημοξ εηθναζιέκμοξ οπμδμπείξ. Αολακυιεκεξ ζοβηεκηνχζεζξ ηςκ ιδ επζζδιαζιέκςκ πνμζδεηχκ επςάζηδηακ ηαοηυπνμκα ιε Κ/Λ 3 Ζ-επζααηζδίκδξ, βζα 2 χνεξ ζημοξ 4 μ C ιε 10 5 ηφηηανα, ηα μπμία είπακ εηθνάζεζ ημοξ οπμδμπείξ ζηδκ επζθάκεζά ημοξ. Καηά ηα άθθα ημ πνςηυημθθμ πμο αημθμοεήεδηε ήηακ ίδζμ ιε αοηυ ηδξ πνμδβμφιεκδξ παναβνάθμο. Β ΠΡΟΓΗΟΡΗΜΟ ΣΟΤ ΠΟΟΣΟΤ ΓΗΑΛΤΣΟΠΟΗΖΖ ΣΧΝ ΤΠΟΓΟΥΔΧΝ Γζα ημκ πνμζδζμνζζιυ ημο πμζμζημφ δζαθοημπμίδζδξ ηςκ οπμδμπέςκ, 10 6 ηφηηανα εκηυιςκ πμο ελέθναγακ ημοξ ΑΣ ή Κ οπμδμπείξ, δζαθοημπμζήεδηακ ζε 100 ιl PBS ιε έηαζημ απυ ηα απμννοπακηζηά πμο πενζβνάθμκηαζ ζηδκ εκυηδηα Γ.1.5. Ζ δζαθοημπμίδζδ έβζκε οπυ ακάδεοζδ βζα 5 θεπηά, ζε ΘΓ, ηαζ ζηδ ζοκέπεζα πνμζηέεδηακ Κ/Λ 3 H-επζααηζδίκδξ. Μεηά απυ επχαζδ 1 χναξ ζε εενιμηναζία δςιαηίμο, αημθμφεδζε θοβμηέκηνδζδ ζηα g βζα 15 θεπηά ζημοξ 4 μ C. Μεηά ηδ ζοθθμβή ημο οπενηεζιέκμο ηαζ ηδκ πνμζεήηδ 1 ml: 20 mm Tris/HCl, ph 7,4/ 1% Triton, μζ ναδζεκενβέξ ηνμφζεζξ ηςκ δζαθοημπμζδιέκςκ οπμδμπέςκ ιεηνήεδηακ, πενκχκηαξ ημ οπενηεζιέκμο απυ θίθηνα οαθμαάιααηα ηα μπμία πνμδβμοιέκςξ είπακ ειπμηζζηεί βζα ημοθάπζζημκ 16 χνεξ ζε δζάθοια 3% πμθοαζεοθεκζιίκδξ (PEI) ph: 9 ηαζ ζηδ ζοκέπεζα είπακ λεπθοεεί ιε 5 ml PBS. Οζ πθφζεζξ ηαζ δ ιέηνδζδ ηςκ πνμζδειέκςκ ναδζεκενβχκ ηνμφζεςκ ηδξ 3 H-επζααηζδίκδξ έβζκακ υπςξ ηζξ πνμδβμφιεκεξ παναβνάθμοξ. Οζ ηνμφζεζξ ηδξ 3 H-επζααηζδίκδξ πμο πνμζδέεδηε ζημ ίγδια ιεηνήεδηακ ιεηά απυ 76

77 δζαθοημπμίδζδ ημο ζγήιαημξ ιε 250 ιl SDS 1% (ζε dd H 2 O) ηαζ ακάιζλδ ιε 5 ml δζαθφιαημξ ζπζκεδνζζιμφ. Σμ πμζμζηυ δζαθοημπμίδζδξ οπμθμβίζηδηε απυ ημ θυβμ ηςκ ναδζεκενβχκ ηνμφζεςκ πμο ανέεδηακ ζημ οπενηείιεκμ, πνμξ ημ ζφκμθμ ηςκ ηνμφζεςκ πμο ανέεδηακ ζημ ίγδια ηαζ ημ οπενηείιεκμ. ηα πεζνάιαηα δζαθοημπμίδζδξ υπμο ηαοηυπνμκα ιε ηδκ πνήζδ Triton X-100 εθανιυζηδηακ ηαζ οπένδπμζ ή πμθφ αθηαθζηυ ph (Γ1.5.4 ηαζ Γ1.5.5), μ ανζειυξ ηςκ ηοηηάνςκ ήηακ 10 θμνέξ ιεβαθφηενμξ (10 7 ) υπςξ επίζδξ ηαζ μ υβημξ ηςκ δζαθοιάηςκ PBS- 1% Triton X- 100 πμο πνδζζιμπμζήεδηακ. Δπίζδξ δ οπενήπδζδ έβζκε ιε εκηαζδ 8W βζα 0-8 θεπηά ζε ΘΓ εκχ δ νφειζζδ ημο ph έβζκε δζάθοια HCl 10 Ν. Γζα ηδ ιεθέηδ ηδξ δζαθοημπμίδζδξ ηςκ οπμδμπέςκ πμο εηθνάζηδηακ ζημκ γοιμιφηδηα P. pastoris πνμδβήεδηε ημ παναηάης πνςηυημθθμ εναφζδξ ημο ηοηηανζημφ ημζπχιαημξ ιε ζθαζνίδζα οάθμο: 1) Φοβμηέκηνδζδ ηαθθζένβεζαξ γοιμιοηήηςκ πμο ελέθναγακ ημοξ οπμδμπείξ ζηα g βζα 15 θεπηά ζημοξ 4 μ C. 2) Εφβζζδ 500 mg ζγήιαημξ, πνμζεήηδ ίζμο υβημο οάθζκςκ ζθαζνζδίςκ ιε ημ ίγδια ημο γοιμιφηδηα ηαζ 20 % ημο υβημο PBS. 3) Έκημκδ ακάδεοζδ βζα 10 sec, ηαζ επχαζδ βζα 30 sec ζε οδαηυθμοηνμ ζημοξ 4 μ C. Δπακάθδρδ ημο ηφηθμο βζα 12 θμνέξ. 4) 1,2 ιl απυ ημ εκαζχνδια ηςκ γοιμιοηήηςκ ιε ζπαζιέκμ ηοηηανζηυ ημίπςια ζοθθέπεδηακ ηαζ ζημ δείβια πνμζδζμνίζηδηε ημ πμζμζηυ δζαθοημπμίδζδξ. Β ΥΡΧΜΑΣΟΓΡΑΦΗΑ ΤΓΓΔΝΔΗΑ ΗΟΝΣΧΝ ΜΔΣΑΛΛΟΤ Ζ πνςιαημβναθία ζοββέκεζαξ αλζμπμζεί ηζξ ζδζυηδηεξ πμο ιπμνεί κα έπεζ ιζα πνςηεΐκδ, ακάθμβα ιε ηδ δμιή ηδξ, χζηε κα πνμζδεεεί εζδζηά ζε ηάπμζμ είδμξ ζθαζνζδίςκ βζα ημκ ηαεανζζιυ ηδξ απυ πνμζιείλεζξ. ηδκ πανμφζα ιεθέηδ μζ ακαζοκδοαζιέκμζ α4α2 nachr πμο εηθνάζηδηακ, έθενακ ζημ ηαναμλοηεθζηυ ημοξ άηνμ ιζα αθθδθμοπία 8 δζαδμπζηχκ ηαηαθμίπςκ ζζηζδζκχκ, δ μπμία πνμζδέκεηαζ ζζπονά (ζζπονυηενα απυ ημκ ιέζμ δεζιυ ακηζβυκμο-ακηζζχιαημξ) ζε ζυκηα κζηεθίμο, ηα μπμία ανίζημκηαζ ιε ηδ ιμνθή ζοιπθυημο ζηδκ επζθάκεζα ζθαζνζδίςκ ζεθανυγδξ (ζηήθδ ζυκηςκ κζηεθίμο). Ο ηαεανζζιυξ πνςηεσκχκ ιε πνςιαημβναθία ζυκηςκ κζηεθίμο ιπμνεί κα βίκεζ είηε ζε θοζζμθμβζηέξ είηε ζε απμδζαηαηηζηέξ ζοκεήηεξ. 77

78 ε θοζζμθμβζηέξ ζοκεήηεξ, βζα κα επζηεοπεεί μ ηαεανζζιυξ πνςηεσκχκ ιε ηδ ζηήθδ ζυκηςκ κζηεθίμο, ανπζηά ημ δζάθοια πμο πενζέπεζ ηζξ πνςηεΐκεξ επςάγεηαζ οπυ ακάδεοζδ ιε ηα ζθαζνίδζα ζε ΡΓ πμο πενζέπεζ παιδθή ζοβηέκηνςζδ ζιζδαγμθίμο βζα κα απμθεοπεεί δ πνυζδεζδ ακεπζεφιδηςκ πνςηεσκχκ πμο δζαεέημοκ ηοπαία, βεζημκζηά ζζηζδζκζηά ηαηάθμζπα. Σμ ζιζδαγυθζμ είκαζ δ παναηηδνζζηζηή μιάδα ηςκ ηαηαθμίπςκ ζζηζδίκδξ ηαζ έηζζ ακηαβςκίγεηαζ ηδκ πνυζδεζδ ηςκ ζζηζδζκχκ ζηα ζθαζνίδζα ακάθμβα ιε ηδ ζοβηέκηνςζή ημο. Μεηά ηδκ πνυζδεζή ημοξ ζηα ζθαζνίδζα, αημθμοεμφκ εηπθφζεζξ ιε αολακυιεκδ ζοβηέκηνςζδ ζιζδαγμθίμο βζα ηδκ απμιάηνοκζδ ηςκ ιδ εζδζηά πνμζδειέκςκ πνςηεσκχκ. ε ζοβηεκηνχζεζξ έςξ 50 mm ημ ζιζδαγυθζμ εηημπίγεζ υθεξ ηζξ πνςηεΐκεξ μζ μπμίεξ έπμοκ θζβυηενα απυ 6 ζοκεπυιεκα ηαηάθμζπα ζζηζδζκχκ, εκχ ζε ζοβηεκηνχζεζξ ιεβαθφηενεξ απυ 150 mm εηημπίγεζ αηυια ηαζ ηζξ πνςηεΐκεξ ιε 6 δζαδμπζηά ηαηάθμζπα ζζηζδζκχκ επζηνέπμκηαξ ηδκ έηθμοζή ημοξ ζε ηαεανή ιμνθή ηαζ ηδκ παναθααή ημοξ. ε υθα ηα ζηάδζα ημ ΡΓ πενζέπεζ NaCl ζε ζοβηεκηνχζεζξ 300 mm ή πενζζζυηενμ βζα κα ειπμδίγεηαζ δ ιδ εζδζηή πνυζδεζδ ηςκ πνςηεσκχκ ζηα ζθαζνίδζα ιέζς ζμκηζηχκ αθθδθεπζδνάζεςκ (Qiagen 2003). ηδκ πανμφζα ιεθέηδ μ ηαεανζζιυξ ηςκ ακαζοκδοαζιέκςκ α4α2 nachr πμο εηθνάζηδηακ έβζκε ζφιθςκα ιε ημ παναηάης πνςηυημθθμ: 1. 1 g ηοηηάνςκ εκηυιςκ ηα μπμία ελέθναγακ ημκ Κ οπμδμπέα δζαθοημπμζήεδηακ ιε 50 ml δζαθφιαημξ πνυζδεζδξ οπμ ακάδεοζδ ζε ΘΓ βζα 20 θεπηά. 2. Αημθμφεδζε θοβμηέκηνδζδ ζηα g βζα 15 θεπηά ζημοξ 4 μ C. Μεηά ηδ ζοθθμβή ημο οπενηεζιέκμο πνμζηέεδηακ 0,5 ml ζθαζνζδίςκ ζεθανυγδξ- Νζηεθίμο ηαζ έβζκε επχαζδ ζημοξ 4 o C οπυ ακάδεοζδ βζα 1 χνα. 3. Σα ζθαζνίδζα παηεηανίζηδηακ ζε ζηήθδ ηαζ αημθμφεδζακ πθφζεζξ ιε 2 υβημοξ ζηήθδξ απυ ηάεε δζάθοια πθφζδξ ιε 10, 50 ηαζ 100 mm ζιζδαγμθίμο. 4. Έβζκε έηθμοζδ ιε 2 υβημοξ ζηήθδξ δζαθφιαημξ ιε 400 mm ζιζδαγμθίμο ηαζ παναθααή ηδξ πνςηεΐκδξ. 78

79 Γηάιπκα πξόζδεζεο 50 mm PB ph 8, 300 mm NaCl, 10 mm ζιζδαγμθίμο, Triton 1%, ιίβια ακαζημθέςκ πνςηεσκαζχκ ηδξ ThermoSCIENTIFIC Γηαιύκαηα πιύζεο 50 mm PB ph 8, 300 mm NaCl, 10, 50 ηαζ 100 mm ζιζδαγμθίμο, Triton 1% Γηάιπκα έθινπζεο 50 mm PB ph 8, 300 mm NaCl, 400 mm ζιζδαγμθίμο, Triton 1% Β ΥΡΧΜΑΣΟΓΡΑΦΗΑ ΜΟΡΗΑΚΟΤ ΑΠΟΚΛΔΗΜΟΤ Ζ πνςιαημβναθία ιμνζαημφ απμηθεζζιμφ είκαζ ιζα ηεπκζηή δ μπμία ηάκεζ δοκαηυ ημ δζαπςνζζιυ ιμνίςκ ιε δζαθμνεηζηά ΜΒ πνδζζιμπμζχκηαξ ιζα ζηήθδ ιμνζαημφ απμηθεζζιμφ. Ζ ανπή θεζημονβίαξ ηδξ ζηήθδξ ανίζηεηαζ ζηδ ιζηνμζημπζηή δμιή ηδξ ζηήθδξ δ μπμία απμηεθείηαζ απυ πμνχδδ ζθαζνίδζα. Όζμ ιζηνυηενμ ημ ΜΒ ηςκ ιμνίςκ ηυζμ πενζζζυηενμ εζζπςνμφκ ζηα πμνχδδ ζθαζνίδζα ηαζ ηαεοζηενμφκ κα εηθμοζημφκ. ηδκ πανμφζα ιεθέηδ δ ηεπκζηή αοηή πνδζζιμπμζήεδηε βζα ημκ ηαεανζζιυ ηαζ ημκ πνμζδζμνζζιυ ηςκ ΜΒ ηςκ ακαζοκδοαζιέκςκ α4α2 nachr πμο εηθνάζηδηακ. Υνδζζιμπμζήεδηε ζοζηεοή οβνήξ πνςιαημβναθίαξ ορδθήξ απυδμζδξ βζα ημκ ηαεανζζιυ πνςηεσκχκ ηφπμο: AKTApurifier-10 ηδξ General Electric (FPLC) ιε ζηήθδ Superose 6, υβημο 24 ml. Γζα ηδκ έηθμοζδ ηςκ οπμδμπέςκ πνδζζιμπμζήεδηακ 3 υβημζ ζηήθδξ δζαθφιαημξ: PBS/Triton 1%, ιε νοειυ 0,5 ml/ θεπηυ. Ο πνμζδζμνζζιυξ ηςκ δζαθοημπμζδιέκςκ οπμδμπέςκ ζηα ηθάζιαηα απυ ηδκ έηθμοζδ ηδξ ζηήθδξ ιμνζαημφ απμηθεζζιμφ, έβζκε επςάγμκηαξ δείβιαηα 150 ιl ιε Κ/Λ 3 H-επζααηζδίκδξ βζα 2 χνεξ ζημοξ 4 μ C ηαζ μζ ναδζεκενβέξ ηνμφζεζξ ιεηνήεδηακ αηνζαχξ υπςξ ηαζ ζηα δζαθοηά ηθάζιαηα ηςκ οπμδμπέςκ ηδξ παναβνάθμο Β

80 Β ΖΛΔΚΣΡΟΦΟΡΖΖ ΠΡΧΣΔΨΝΧΝ Δ ΠΖΚΣΧΜΑ ΠΟΛΤΑΚΡΤΛΑΜΗΓΗΟΤ Δ ΑΠΟΓΗΑΣΑΚΣΗΚΔ ΤΝΘΖΚΔ (SDS PAGE) Ζ δθεηηνμθυνδζδ είκαζ ηεπκζηή πνχηδξ επζθμβήξ βζα ημκ πνμζδζμνζζιυ ηςκ ιμνζαηχκ αανχκ ηςκ πνςηεσκχκ πμο οπάνπμοκ ζε έκα δείβια ηαεχξ είκαζ απθή, μζημκμιζηή, εκχ ηαοηυπνμκα πνμζθένεζ ιζα ηαθή εζηυκα βζα ηα ΜΒ ηςκ πνςηεσκχκ ημο δείβιαημξ ηαζ δίκεζ ηδκ δοκαηυηδηα βζα εηηίιδζδ ηδξ ζοβηέκηνςζήξ ημοξ. Ζ ηεπκζηή αοηή ζηδνίγεηαζ ζημ βεβμκυξ υηζ υηακ έκα θμνηζζιέκμ ιυνζμ ανεεεί ιέζα ζε δθεηηνμζηαηζηυ πεδίμ, ηζκείηαζ πνμξ ημκ ακηίεεηα θμνηζζιέκμ πυθμ. Ακάθμβα ιε ημ επζεοιδηυ απμηέθεζια δ δθεηηνμθυνδζδ ιπμνεί κα βίκεζ είηε ζε θοζζμθμβζηέξ ζοκεήηεξ είηε ζε απμδζαηαηηζηέξ. ηδκ ηεθεοηαία πενίπηςζδ ζε υθα ηα ζηάδζα ηδξ δθεηηνμθυνδζδξ, μζ πνςηεΐκεξ ανίζημκηαζ ζε ΡΓ πμο πενζέπεζ δζκαηνζμφπμ εεσηυ δςδεηαηοθζηυ κάηνζμ (SDS). Σμ SDS δζαηδνεί ηζξ πνςηεΐκεξ απμδζαηαβιέκεξ εκχ ηαοηυπνμκα ημοξ πνμζδίδεζ ζζπονυ ανκδηζηυ θμνηίμ. Έηζζ δ ζοιπενζθμνά ημοξ ζηδκ δθεηηνμθυνδζδ ελανηάηαζ ιυκμ απυ ημ ιμνζαηυ ημοξ αάνμξ ηαζ υπζ απυ ημ θμνηίμ πμο θένμοκ θοζζμθμβζηά. Δπίζδξ ακ πνεζάγεηαζ, ημ δζάθοια θυνηςζδξ ιπμνεί κα πενζέπεζ ηαζ ιενηαπημαζεακυθδ, δ μπμία δζαζπά ημοξ δζζμοθθζδζημφξ δεζιμφξ πμο οπάνπμοκ ζηζξ πνςηεΐκεξ ηαζ ζοβηναημφκ εηηυξ απυ ηδκ ηνζημηαβή ημοξ δμιή, εκςιέκεξ δομ ή πενζζζυηενεξ πμθοπεπηζδζηέξ αθοζίδεξ. Σμ πήηηςια πμθοαηνοθαιζδίμο πςνίγεηαζ ζε δομ ιένδ. Σμ έκα ιένμξ πμο πενζέπεζ ηαζ ηα θνεάηζα ζηα μπμία θμνηχκεηαζ ημ δείβια, έπεζ ιζηνή ποηκυηδηα ηαζ πνδζζιεφεζ βζα ηδκ πνμεημζιαζία ηςκ πνςηεσκχκ, πνζκ ηνέλμοκ ζημ ηονίςξ ηιήια ημο πδηηχιαημξ, ημ μπμίμ έπεζ ορδθυηενδ ποηκυηδηα ηαζ πνμηαθεί ημκ δζαπςνζζιυ ηςκ πνςηεσκχκ ηαεχξ δθεηηνμθμνμφκηαζ. Ακάθμβα ιε ημ ιέβεεμξ ηςκ πνςηεσκχκ πμο ακαιέκεηαζ κα ανίζημκηαζ ζημ δείβια ηοιαίκεηαζ ηαζ δ ποηκυηδηα ημο ηιήιαημξ ημο πδηηχιαημξ πμο πνμηαθεί ημκ δζαπςνζζιυ ηςκ πνςηεσκχκ. Γζα ημκ δζαπςνζζιυ πνςηεσκχκ ιεβάθμο ιμνζαημφ αάνμοξ πνδζζιμπμζείηαζ ιζηνήξ ποηκυηδηαξ πήηηςια εκχ βζα ημκ δζαπςνζζιυ ιζηνμφ ιμνζαημφ αάνμοξ πνδζζιμπμζείηαζ ιεβάθδξ ποηκυηδηαξ πήηηςια. Δπζπθέμκ βζα δείβιαηα ηα μπμία πενζέπμοκ πνςηεΐκεξ πμο πανμοζζάγμοκ ιεβάθδ πμζηζθία ζηα ΜΒ ημοξ, είκαζ ηαθφηενα ηα πδηηχιαηα ααειζδςηήξ ποηκυηδηαξ πμθοαηνοθαιζδίμο, εκχ βζα δείβιαηα ηα μπμία πενζέπμοκ πνςηεΐκεξ πμο πανμοζζάγμοκ ιζηνή απυηθζζδ ζηα ΜΒ ημοξ, είκαζ ηαθφηενα ηα πδηηχιαηα ζηαεενήξ ποηκυηδηαξ πμθοαηνοθαιζδίμο. 80

81 ηδκ πανμφζα ιεθέηδ ημ αηνζαέξ πνςηυημθθμ πμο πνδζζιμπμζήεδηε ήηακ ημ παναηάης: 1. οκανιμθμβήεδηε δ ιήηνα ηδξ ηάεεηδξ δθεηηνμθυνδζδξ. 2. Παναζηεοάζηδηε ημ πήηηςια δζαπςνζζιμφ ποηκυηδηαξ 12% ηαζ πφεδηε ιέζα ζηδ ιήηνα. 3. Έβζκε πνμζεηηζηή έβποζδ dd H 2 O ζηδκ επζθάκεζα ημο πδηηχιαημξ ιε ζημπυ αοηή κα βίκεζ επίπεδδ. 4. Μεηά ημκ πμθοιενζζιυ ηαζ ηδκ πήλδ ημο πδηηχιαημξ δζαπςνζζιμφ ημ κενυ απμιαηνφκεδηε απυ ηδκ επζθάκεζα ηαζ ζηδ εέζδ ημο εβπφεδηε ημ πήηηςια θυνηςζδξ δεζβιάηςκ ποηκυηδηαξ 4%. ε αοηυ αοείζηδηε επζπθέμκ ηαζ ημ πηεκάηζ πμο δδιζμονβεί ηα πδβαδάηζα ζηα μπμία θμνηχκμκηαζ ηα δείβιαηα. 5. Σα δείβιαηα πνςηεσκχκ ακαιείπεδηακ ιε δζάθοια θυνηςζδξ ηαζ επςάζηδηακ βζα 5 θεπηά ζημοξ 95 0 C πνζκ θμνηςεμφκ. 6. Δθανιυζηδηε ζηαεενή ηάζδ 120 Volt, ιέπνζ ημ ιέηςπμ ηδξ δθεηηνμθυνδζδξ κα θηάζεζ ζηδκ άηνδ ημο πδηηχιαημξ. 7. Μεηά ημ πέναξ ηδξ δθεηηνμθυνδζδξ, ημ πήηηςια αβήηε απυ ηδ ιήηνα ηαζ επςάζηδηε ζε δζάθοια πνχζεςξ βζα 1 ημοθάπζζημκ χνα. 8. Μεηά ηδκ πνχζδ ημο πδηηχιαημξ αημθμφεδζε ημ ζηάδζμ ημο απμπνςιαηζζιμφ, ηαηά ημ μπμίμ ημ πήηηςια επςάζηδηε οπυ ακάδεοζδ ζε 50 ml δζαθφιαημξ απμπνςιαηζζιμφ βζα 1 χνα υζεξ θμνέξ απαζηήεδηε ηάεε θμνά, βζα κα απμιαηνοκεεί δ πνςζηζηή πμο είπε απθά εβηθςαζζηεί ιέζα ζημ πήηηςια ηαζ κα ιείκεζ ιυκμ δ πνςζηζηή πμο είπε πνμζδεεεί ζηζξ πνςηεσκζηέξ γχκεξ. 9. Σμ πήηηςια ιε ηζξ ααιιέκεξ πθέμκ πνςηεσκζηέξ γχκεξ θςημβναθήεδηε ηαζ δ εζηυκα απμεδηεφηδηε δθεηηνμκζηά. ΓΗΑΛΤΜΑΣΑ Πήθησκα δηαρσξηζκνύ 3,4ml dd H 2 O 2,5ml 1,5M Tris-HCl, ph 8,8 0,1ml 10% (w/v) SDS 3,3ml Acrylamide Bis-acrylmide (30%/0,8% w/v) 81

82 0,05 ml 10% (w/v) APS 5 ιl TEMED Πήθησκα θόξησζεο δεηγκάησλ 3,075ml dd H 2 O 1,25ml 0,5 M Tris-HCl, ph 6,8 0,1ml 10% (w/v) SDS 0,67ml Acrylamide/Bis-acrylamide (30% / 0,8%w/v) 25ιl 10 (w/v) APS 5 ιl TEMED Γηάιπκα θόξησζεο δεηγκάησλ 3x 2,4 ml 1M Tris-Cl ph 6,8 3 ml 20% SDS 3ml Glycerol 100% 1,6 ml B-mercaptoethanol 0,006 gr Bromophenol blue Γηάιπκα ειεθηξνθόξεζεο 3,03 g Tris base 14,4 g Glycine 1gr SDS dd H 2 O ιέπνζ ημ 1L Γηάιπκα ρξώζεσο 0,1g Coomassie Blue R ml ιεεακυθδ 10 ml αηεημλζηυ μλφ Dd H 2 O ιέπνζ ηα 100ml Γηάιπκα απνρξσκαηηζκνύ 40ml ιεεακυθδ 10ml μλζηυ μλφ dd H 2 O ιέπνζ ηα 100ml 82

83 Β ΣΤΠΧΜΑ WESTERN Σμ ζηφπςια western είκαζ ιζα ζπεηζηά απθή ηεπκζηή, δ μπμία ηάκεζ δοκαηή ηδκ ακίπκεοζδ ζοβηεηνζιέκςκ ακηζβμκζηχκ επζηυπςκ, ιε πνήζδ ακηζζςιάηςκ, ζε πνςηεσκζηέξ γχκεξ. Έηζζ, ιε ηδ ιέεμδμ αοηή ιπμνμφκ κα ηαοημπμζδεμφκ ζοβηεηνζιέκεξ πνςηεΐκεξ αηυια ηαζ ιέζα ζε έκα πενίπθμημ πνςηεσκζηυ δείβια. Ανπζηά ημ δείβια οθίζηαηαζ δθεηηνμθυνδζδ ηαζ αθμφ πνχηα μζ πνςηεΐκεξ λεπςνίζμοκ ζε γχκεξ ακάθμβα ιε ηα ΜΒ ημοξ, ζηδ ζοκέπεζα ιεηαθένμκηαζ ιε ηδ αμήεεζα δθεηηνζημφ πεδίμο ζε ιζα ιειανάκδ ιε ζζπονέξ πνμζνμθδηζηέξ ζδζυηδηεξ. Σέθμξ, ιεηά ημ ιπθμηάνζζια ηδξ εθεφεενδξ επζθάκεζαξ ηδξ ιειανάκδξ, βίκεηαζ επχαζδ ιε ακηζζχιαηα, ιε ηδ αμήεεζα ηςκ μπμίςκ ζηδ ζοκέπεζα βίκεηαζ δ ειθάκζζδ ηςκ πνςηεσκζηχκ γςκχκ. Σα ακηζζχιαηα είηε είκαζ εκγοιμζφκδεηα, είηε αθμφ πνμζδεεμφκ ζημοξ επζηυπμοξ ημοξ, επςάγμκηαζ ιε ηαηάθθδθα εκγοιμζφκδεηα ακηζ-ακηζζχιαηα ηα μπμία πνμζδέκμκηαζ πάκς ζηα πνχηα. Ακαθοηζηά ζηδ ζοβηεηνζιέκδ ιεθέηδ ημ πνςηυημθθμ πμο αημθμοεήεδηε ήηακ ημ ελήξ: 1. Ζθεηηνμθυνδζδ SDS PAGE υπςξ πενζβνάθδηε ζηδκ ζπεηζηή πανάβναθμ, αθθά ιεηά ηδκ μθμηθήνςζδ ηδξ δθεηηνμθυνδζδξ: 2. Γίκεηαζ επχαζδ ηδξ πδηηήξ πμθοαηνοθαιζδίμο ζε δζάθοια δθεηηνμιεηαθμνάξ βζα 1 θεπηυ. 3. Δθανιμβή ιειανάκδξ PVDF πάκς ζηδκ πδηηή ηαζ εβηθςαζζιυξ ημοξ ιέζα ζε θφθθα δζδεδηζημφ πανηζμφ Whatman ηαζ ηςκ εζδζηχκ ζθμοββανζχκ. 4. Δθανιμβή δθεηηνζημφ πεδίμο, έκηαζδξ 350 ma βζα 1 χνα, ηάεεηα ζημ επίπεδμ ηδξ επαθθδθίαξ: ζπυββμο/πάνημο/πδηηήξ/pvdf/πάνημο/ζπυββμο. 5. Άκμζβια ηςκ θφθθςκ ηδξ επαθθδθίαξ, ειαάπηζζδ ηδξ ιειανάκδξ ζε 50 ml δζαθφιαημξ ιπθμηανίζιαημξ [PBS / 2% BSA (w/v)] ηαζ επχαζδ βζα 4 χνεξ. 6. Διαάπηζζδ ηδξ ιειανάκδξ ζε 50 ml PBS / 2% BSA ιε αναίςζδ 1:1000 ημο ακηί-5his mab-hrp ηαζ επχαζδ βζα 4 χνεξ. 7. Σνεζξ πθφζεζξ ηζξ ιειανάκδξ ιε 150 ml PBS ηαζ άθθεξ ηνεζξ ιε 150 ml PBS/tween 0,5%. 8. Διαάπηζζδ ηδξ ιειανάκδξ ζε 50 ml δζαθφιαημξ ειθάκζζδξ (PBS, 0,5 mg / ml DAB, 0,02% Ζ 2 Ο 2, 2 mm NiCl 2 ) ηαζ επχαζδ ιέπνζ ειθάκζζδξ πνςηεσκζηχκ ιπακηχκ. 83

84 9. Έλζ πθφζεζξ ηδξ ιειανάκδξ ιε 150 ml απμζηαβιέκμο κενμφ. 10. ηέβκςια ηδξ ιειανάκδξ, θςημβνάθδζδ ηαζ επζηυθθδζδ ζημ αζαθίμ ενβαζηδνίμο. Γηάιπκα ειεθηξνκεηαθνξάο 3,03 g Tris 14,4 g βθοηίκδ 200 ml ιεεακυθδ dd H 2 O ιέπνζ ημ 1 L Β ΠΔΗΡΑΜΑΣΑ ΚΤΚΛΗΚΟΤ ΓΗΥΡΧΨΜΟΤ Σα πεζνάιαηα ηοηθζημφ δζπνςσζιμφ (CD) έβζκακ ζημοξ 20 C πνδζζιμπμζχκηαξ ημ θαζιαημπμθςζίιεηνμ Jasco J-715 (Japan Spectroscopic Co.). Ζ ηαπφηδηα ζάνςζδξ ημο θάζιαημξ νοειίζηδηε ζηα 50 nm/min ηαζ ημ εφνμξ ηδξ ιπάκηαξ ζημ 1 nm. Ζ ζάνςζδ έβζκε ζημ εφνμξ ηςκ nm ηαζ ζε ακάθοζδ 0,2 nm. Σμ ιήημξ ηδξ μπηζηήξ δζαδνμιήξ ήηακ 1 mm ηαζ ημ ηαεανζζιέκμ i-α1-ecd (0.3 mg/ml) ανζζηυηακ δζαθοιέκμ ζε 10 mm PB ph 7,5, 50 mm NaF. Σμ θάζια ηδξ εζηυκαξ 50 είκαζ μ ιέζμξ υνμξ απυ 10 ζανχζεζξ απυ ημκ μπμίμ αθαζνέεδηε μ ευνοαμξ οπμαάενμο. Ζ δεοηενμηαβήξ δμιή οπμθμβίζηδηε ιε ηα πνμβνάιιαηα CDSSTR, CONTINLL ηαζ SELCON3. Β ELISA Σα πεζνάιαηα πνυζδεζδξ ηςκ mab έβζκακ ιε ηδκ ηεπκζηή ηδξ εκγοιμζφκδεηδξ ακμζμπνμζνμθδηζηήξ ιεευδμο (ELISA). 40 ng ηάεε α1-ecd πνμζδέεδηακ ιεηά απυ επχαζδ 2 ςνχκ ζημοξ 25 C (MaxiSorp F96, Nunc). Μεηά απυ ιπθμηάνζζια ιε PBS 2% BSA ph 7,4 βζα 30 θεπηά, 100 ιl απυ ηάεε αναίςζδ ακηζζχιαημξ επςάζηδηε βζα 3 χνεξ. Μεηά απυ πθφζεζξ (3 x PBS-Tween 0,1% + 3 x PBS) αημθμφεδζε επχαζδ 2 ςνχκ ιε 100 ιl anti-rat IgG (Pierce, αναίςζδ 1:500 ζε PBS, ph 7,4, 0,2% BSA). Ζ ακίπκεοζδ ηδξ πνυζδεζδξ ακηζζςιάηςκ έβζκε ιε οπυζηνςια TMB (3,3, 5,5-84

85 tetramethylbenzidine) ηαζ ακάπηολδ πνχιαημξ ιεηά απυ πνμζεήηδ 1 M H 2 SO 4. Ζ μπηζηή ποηκυηδηα ιεηνήεδηε ζηα 450 nm. Β RIA Σα πεζνάιαηα πνυζδεζδξ αοηυ-ακηζζςιάηςκ απυ μνμφξ ιοαζεεκχκ έβζκακ ιε ηδκ ηεπκζηή ηδξ ναδζμακμζμηαηααφεζζδξ (RIA). 40 ng ηάεε α1-ecd ναδζμεπζζδιάκεδηακ ιε 125 I-α-BTX (50,000 cpm) ζε υβημ 45 ιl PBS, 0,2% BSA, ph 7,4 βζα 3 χνεξ ζημοξ 4 C. Μεηά ηδκ πνμζεήηδ 1-5 ιl μνμφ ιοαζεεκχκ ηαζ PBS, 0,2% BSA ιέπνζ ηα 50 ιl, επςάζηδηακ ζημοξ 4 C βζα χνεξ ηαζ δ ακμζμηαηααφεζζδ έβζκε ιε ηδκ πνμζεήηδ 25 ιl μνμφ ηαηζίηαξ έκακηζ ακενχπζκςκ ακμζμζθαζνζκχκ ηαζ επχαζδ βζα 1,5 χνα ζημοξ 4 C. Αημθμφεδζε πνμζεήηδ 1 ml PBS-Triton 0,5% ηαζ θοβμηέκηνδζδ g ζημοξ 4 C, βζα 10 θεπηά ηαζ ημ οπενηείιεκμ απμννμθήεδηε. Σμ ηεθεοηαίμ αήια επακαθήθεδηε βζα 2 θμνέξ ηαζ ζηδ ζοκέπεζα ιεηνήεδηακ μζ ναδζεκενβέξ ηνμφζεζξ. Μεηά ηδκ αθαίνεζδ ημο εμνφαμο οπμαάενμο, ηα ηαηααοεζζιέκα α1-ecd εηθνάζηδηακ ςξ % πμζμζηυ ηςκ ηνμφζεςκ (Γcpm) επί ημο ζοκυθμο ηςκ ηνμφζεςκ πμο ηαηαβνάθμκηακ ιε filter assay επςάγμκηαξ 40 ng ηάεε α1-ecd ιε 50,000 cpm 125 I-α-BTX. 85

86 Γ. ΑΠΟΣΔΛΔΜΑΣΑ ΔΚΦΡΑΖ Δ ΚΤΣΣΑΡΑ ΔΝΣΟΜΧΝ Sf9 Γ.1. ΚΑΣΑΚΔΤΖ ΣΟΤ ΑΝΑΤΝΓΤΑΜΔΝΟΤ ΓΔΝΔΣΗΚΟΤ ΤΛΗΚΟΤ ΣΧΝ ΒΑΚΗΛΟΨΧΝ Γ.1.1. ΤΠΟΚΛΧΝΟΠΟΗΖΖ ΣΧΝ cdna ΣΧΝ ΤΠΟΜΟΝΑΓΧΝ ΑΠΟ ΣΟ ΠΛΑΜΗΓΗΟ ptriex-3 neo ΣΟ pfastbac1 Σα cdna ηςκ οπμιμκάδςκ δεκ ιπμνμφζακ κα οπμηθςκμπμζδεμφκ απυ ημ πθαζιίδζμ ptriex3-neo, υπμο ήηακ ανπζηά, ζημ pfastbac1 ιε ηδ πνήζδ ηςκ ίδζςκ πενζμνζζηζηχκ εκγφιςκ. Γζ αοηυ πνδζζιμπμζήεδηακ ηα έκγοια EcoRV ηαζ StuI, ηα μπμία άθδζακ ηοθθά άηνα πμο εκχεδηακ ιεηαλφ ημοξ ηαζ ηα ιμκυηθςκα άηνα ηςκ Bsu36I ηαζ PstI εκχεδηακ ιε θςζθμνοθζςιέκμ ιμκυηθςκμ ζοκδέηδ υπςξ θαίκεηαζ ζηδκ (εηθόλα 21). Δηθόλα 21. ρεδηάγξακκα κε ηε δπζθνιία πνπ είρε ε δηαδηθαζία ππνθισλνπνίεζεο θαη ν ηξόπνο κε ηνλ νπνίν μεπεξάζηεθε ηειηθά. H οπμηθςκμπμίδζδ ηςκ cdna ηςκ ΑΣ ηαζ Κ, α4 ηαζ α2 οπμιμκάδςκ, απυ ημ πθαζιίδζμ ptriex3-neo ζημ pfastbac1 δεκ ήηακ δοκαηυ κα βίκεζ ιε ηδ πνήζδ ηςκ ίδζςκ πενζμνζζηζηχκ εκγφιςκ. Γζ αοηυ πνδζζιμπμζήεδηακ ηα έκγοια EcoRV ηαζ StuI, ηα μπμία άθδζακ ηοθθά άηνα πμο εκχεδηακ ιεηαλφ ημοξ ηαζ ηα ιμκυηθςκα άηνα ηςκ Bsu36I ηαζ PstI εκχεδηακ ιε θςζθμνοθζςιέκμ ιμκυηθςκμ ζοκδέηδ. Έηζζ ηα ακαζοκδοαζιέκα ιε ηα cdna ηςκ AT ηαζ Κ, α4 ηαζ α2 οπμιμκάδςκ πθαζιίδζα ptriex-3 neo, οπέζηδζακ δζπθή πέρδ ιε ηα πενζμνζζηζηά έκγοια EcoRV ηαζ Bsu36I, εκχ ημ πθαζιίδζμ pfastbac1 οπέζηδ δζπθή πέρδ ιε ηα πενζμνζζηζηά έκγοια StuI ηαζ PstI. Αημθμφεδζε δθεηηνμθυνδζδ ηςκ πνμσυκηςκ ηδξ πέρδξ ζε πήηηςια αβανυγδξ υπμο δζαπςνίζηδηακ μζ γχκεξ ηςκ α4 ηαζ α2 cdna απυ ημ πθαζιίδζμ 86

87 ptriex-3 neo ηαζ ημ πθαζιίδζμ pfastbac1 απυ ημ ημιιέκμ ηιήια ημο πενζμπήξ ακαβκχνζζδξ πμθθαπθχκ πενζμνζζηζηχκ εκγφιςκ (εηθόλα 22). Δηθόλα 22. Ζιεθηξνθόξεζε ησλ πξντόλησλ πέςεο ησλ πιαζκηδίσλ ptriex3-νeo θαη pfastbac1. Ζθεηηνμθυνδζδ ηςκ πνμσυκηςκ πέρδξ πμο πνμέηορακ ιεηά απυ επχαζδ ιε ηα πενζμνζζηζηά έκγοια EcoRV ηαζ Bsu36I ηςκ πθαζιζδίςκ ptriex3-νeo, ακαζοκδοαζιέκςκ ιε ηα cdnas ηςκ AT ηαζ Κ α4 ηαζ α2 οπμιμκάδςκ, ηαεχξ ηαζ ιδ ακαζοκδοαζιέκμο πθαζιζδίμο pfastbac1 ιε ηα πενζμνζζηζηά έκγοια StuI ηαζ PstI. 1) ΑΣ α4 ptriex3-νeo 2) ΑΣ α2 ptriex3- Νeo 3) ptriex3-νeo 4) Κ α4 ptriex3-νeo 5) Κ α2 ptriex3-νeo 6) pfastbac1. Οζ γχκεξ ιε ηα cdna ηςκ οπμιμκάδςκ ηαεχξ ηαζ ημο ημιιέκμο πθαζιζδίμο πνμμνζζιμφ pfastbac1, απμηυπδηακ απυ ηδ πδηηή αβανυγδξ ηαζ ηαεανίζηδηακ. Αημθμφεδζε ακηίδναζδ θζβάζδξ πανμοζία ημο θςζθμνοθζςιέκμο ιμκυηθςκμο ζοκδέηδ ηαζ ηα πνμσυκηα ηδξ ακηίδναζδξ πνδζζιμπμζήεδηακ βζα ημκ επαηυθμοεμ ιεηαζπδιαηζζιυ επζδεηηζηχκ ααηηδνίςκ Top10F. Μεηά ημ ιεηαζπδιαηζζιυ ακαπηφπεδηακ απμζηίεξ ααηηδνίςκ ηα μπμία έθενακ πθαζιίδζα pfastbac1 ακαζοκδοαζιέκα ιε ηα cdna ηςκ α4 ηαζ α2 οπμιμκάδςκ ημο οπμδμπέα. 87

88 Γ.1.2. ΔΛΔΓΥΟ ΓΗΑ ΑΠΟΗΚΗΔ ΜΔ ΔΠΗΣΤΥΖ ΤΠΟΚΛΧΝΟΠΟΗΖΖ Οζ ααηηδνζαηέξ απμζηίεξ Top10F πμο ακαπηφπεδηακ ιεηά ημ ιεηαζπδιαηζζιυ, οπμαθήεδηακ ζε έθεβπμ βζα κα ηαοημπμζδεμφκ αοηέξ πμο έθενακ ακαζοκδοαζιέκα πθαζιίδζα pfastbac1. Ο έθεβπμξ έβζκε απμιμκχκμκηαξ ανπζηά πθαζιζδζαηυ DNA απυ ηαθθζένβεζεξ ειαμθζαζιέκεξ ιε απμζηίεξ. ηδ ζοκέπεζα δείβιαηα πθαζιζδζαημφ DNA οπμαθήεδηακ ζε πέρδ ιε ηα πενζμνζζηζηά έκγοια EcoRI ηαζ XhoI ηαζ αημθμφεςξ ακαθφεδηακ ιε δθεηηνμθυνδζδ ζε πδηηή αβανυγδξ. Έηζζ εκημπίζηδηακ απμζηίεξ πμο έθενακ πθαζιίδζα pfastbac1 ακαζοκδοαζιέκα ιε ηα cdna ηςκ α4 ηαζ α2 οπμιμκάδςκ. Δηθόλα 23. Ζιεθηξνθόξεζε γηα αλεύξεζε αλαζπλδπαζκέλσλ πιαζκηδίσλ pfastbac1. Πθαζιίδζα pfastbac1 ηαεανζζιέκα απυ απμζηίεξ ιεηαζπδιαηζζιέκςκ Top10F E. coli οπέζηδζακ πέρδ ιε εκδμκμοηθεάζεξ πενζμνζζιμφ EcoRI ηαζ XhoI βζα κα δζαπζζηςεεί ακ ήηακ ακαζοκδοαζιέκα ή υπζ. 1, 4, 5) Μδ ακαζοκδοαζιέκα πθαζιίδζα, 2, 3) Ακαζοκδοαζιέκα ιε Κ α4 cdna, 6, 7, 8) Ακαζοκδοαζιέκα ιε Κ α2 cdna, 9) Ακαζοκδοαζιέκα ιε ΑΣ α4 cdna. Πθαζιίδζα pfastbac1 ακαζοκδοαζιέκα ιε ΑΣ α2 cdna δεκ πενζθαιαάκμκηακ ζε αοηυ ημ πήηηςια αβανυγδξ. Απυ ηζξ απμζηίεξ πμο ανέεδηακ ιεηαζπδιαηζζιέκεξ ιε ακαζοκδοαζιέκα πθαζιίδζα pfastbac1, επζθέπεδηε ιζα βζα ηάεε οπμιμκάδα ηαζ ζηδ ζοκέπεζα ηαεανζζιέκμ πθαζιζδζαηυ DNA βζα ηάεε οπμιμκάδα, πνδζζιμπμζήεδηε βζα ιεηαζπδιαηζζιυ επζδεηηζηχκ ααηηδνίςκ DH10Bac ιε ζημπυ ηδ δδιζμονβία ακαζοκδοαζιέκμο βεκεηζημφ οθζημφ ααηζθμσχκ. 88

89 Γ.1.3. ΔΛΔΓΥΟ ΣΧΝ ΑΝΑΤΝΓΤΑΜΔΝΧΝ ΗΨΚΧΝ ΓΔΝΔΣΗΚΧΝ ΤΛΗΚΧΝ Μεηά ημ ιεηαζπδιαηζζιυ επζδεηηζηχκ ααηηδνίςκ DH10Bac ακαπηφπεδηε ιείβια θεοηχκ ηαζ ιπθε απμζηζχκ ζε ηνοαθία blue/white screening. ηζξ θεοηέξ απμζηίεξ πμο επζθέπεδηακ, ημ βμκίδζμ lacz ζημ βεκεηζηυ οθζηυ ηςκ ααηζθμσχκ (Bacmid) ηακμκζηά έπνεπε κα ήηακ δζαηεημιιέκμ θυβς ηδξ πνμζεήηδξ ηιήιαημξ απυ ημ pfastbac1. Γζα επαθήεεοζδ υηζ μζ θεοηέξ απμζηίεξ πμο επζθέπεδηακ πενζείπακ ακαζοκδοαζιέκα Bacmids, πναβιαημπμζήεδηε αθοζζδςηή ακηίδναζδ πμθοιενάζδξ (PCR) ιε δείβιαηα ηαεανζζιέκςκ Bacmid απυ ηέζζενζξ θεοηέξ απμζηίεξ, ιζα βζα ηάεε cdna οπμιμκάδαξ. Έηζζ επαθδεεφηδηε υηζ ηα Bacmid πμο δδιζμονβήεδηακ βζα ηδκ έηθναζδ ηςκ α4 ηαζ α2 οπμιμκάδςκ ζε ηφηηανα εκηυιςκ ήηακ υκηςξ ακαζοκδοαζιέκα. Δηθόλα 24. ρεδηάγξακκα ηνπ ηκήκαηνο ηνπ πιαζκηδίνπ pfastbac1 ην νπνίν ελζσκαηώλεηαη ζην Bacmid, θαζώο θαη ηνπ ηκήκαηνο πνπ απνηειεί ζηόρν ηεο PCR πνπ γίλεηαη γηα ηελ επηβεβαίσζε επηηπρνύο αλαζπλδπαζκνύ. Μέζα ζηα DH10Bac E. coli ηα ηιήιαηα ημο πθαζιζδίμο pfastbac1 πμο μνζμεεημφκηαζ απυ ηζξ αθθδθμοπίεξ Tn7R ηαζ Tn7L εκζςιαηχκμκηαζ ζηδκ πενζμπή mini-atttn7 ημο Bacmid δζαηυπημκηαξ ηδ ζοκέπεζα ημο βμκζδίμο ηδξ βαθαηημζζδάζδξ (LacZ) ιε απμηέθεζια ηδκ ακάπηολδ θεοηχκ απμζηζχκ. Γζα ηδκ επζαεααίςζδ υηζ μζ επζθεβιέκεξ απμζηίεξ έθενακ ιυκμ ακαζοκδοαζιέκα Bacmid, έβζκε PCR ιε ημοξ εηηζκδηέξ κα οανζδμπμζμφκηαζ πνζκ ηαζ ιεηά ηδκ πενζμπή mini-atttn7 ημο Bacmid. Σμ πνμσυκ PCR ιε ιδ ακαζοκδοαζιέκα Bacmid είκαζ ηιήιαηα DNA πενίπμο 300 bps, εκχ Bacmid ακαζοκδοαζιέκα ιε πθαζιίδζα pfastbac1 δίκμοκ πνμσυκηα ιεβέεμοξ bps ζοκ ημ ιέβεεμξ ημο οπυ ιεθέηδ βμκζδίμο (Invitrogen, 2009). Σα πνμσυκηα ηδξ PCR δθεηηνμθμνήεδηακ ζε πδηηή αβανυγδξ ηαζ έδςζακ γχκεξ DNA ακαιεκυιεκςκ ιεβεεχκ βζα ηάεε οπμιμκάδα (εηθόλα 25). 89

90 Δηθόλα 25. Ζιεθξνθόξεζε ησλ πξντόλησλ ηεο PCR κε δείγκαηα Bacmid από ιεπθέο απνηθίεο. Ζ δθεηηνμθυνδζδ ηςκ πνμσυκηςκ ηδξ PCR ιε δείβιαηα Bacmid απυ θεοηέξ απμζηίεξ πμο ακηζζημζπμφκ ζηζξ ΑΣ ηαζ Κ, α4 ηαζ α2 οπμιμκάδεξ έδςζακ γχκεξ DNA ακαιεκυιεκςκ ιεβεεχκ. 1) Γείηηδξ ιμνζαηχκ ιεβεεχκ 2) Κ α4 3) Κ α2 4) ΑΣ α4 5) ΑΣ α2. Μεηά ηδκ επαθήεεοζδ υηζ ηα Bacmid πμο απμιμκχεδηακ απυ ηα ααηηήνζα DH10Bac ήηακ ακαζοκδοαζιέκα, πνδζζιμπμζήεδηακ βζα ηδκ δζαιυθοκζδ ηοηηάνςκ εκηυιςκ ηαζ ηδκ δδιζμονβία ηςκ ακαζοκδοαζιέκςκ ααηζθμσχκ, μζ μπμίμζ ζηδ ζοκέπεζα πνδζζιμπμζήεδηακ βζα ηδκ ιυθοκζδ ηοηηάνςκ ηαζ ηδκ έηθναζδ ηςκ οπμδμπέςκ. 90

91 Γ.2. ΑΝΗΥΝΔΤΖ ΣΖ ΔΚΦΡΑΖ ΣΧΝ ΑΣ ΚΑΗ Κ ΤΠΟΓΟΥΔΧΝ Γ.2.1. ΑΝΗΥΝΔΤΖ ΜΔ ΣΤΠΧΜΑ WESTERN Ζ έηθναζδ ηςκ ΑΣ ηαζ Κ α4α2 οπμδμπέςκ ζηα ηφηηανα εκηυιςκ ανπζηά ακζπκεφεδηε ιε ζηφπςια Western πνδζζιμπμζχκηαξ ακηζ-5his mab-hrp (εηθόλα 26). Δηθόλα 26. Αλίρλεπζε ηεο έθθξαζεο ησλ ππνκνλάδσλ ησλ ΑΣ θαη Κ α4β2 ππνδνρέσλ κε ζηύπσκα Western. Γζα ηδκ ακίπκεοζδ ηδξ έηθναζδξ ηςκ ακαζοκδοαζιέκςκ οπμδμπέςκ, ηφηηανα εκηυιςκ ιμθοζιέκα ιε ηζξ α4 ηαζ α2 οπμιμκάδεξ δζαθοημπμζήεδηακ ζε δζάθοια θυνηςζδξ SDS PAGE. Μεηά απυ δθεηηνμθυνδζδ ηαζ δθεηηνμιεηαθμνά ηςκ πνςηεσκχκ ζε ιειανάκδ, δ ακίπκεοζδ έβζκε ιε ακηζ-5his mab-hrp. 1) ΑΣ α4α2 nachr, 2) K α4α2 nachr. Ζ εηθόλα 26 έδεζλε υηζ μζ ΑΣ ηαζ Κ α4α2 οπμδμπείξ υκηςξ εηθνάζηδηακ ζε ηφηηανα εκηυιςκ ιε ηζξ οπμιμκάδεξ ημοξ κα είκαζ ζε ακαιεκυιεκα ιμνζαηά αάνδ. Δπίζδξ μζ γχκεξ ημο Κ οπμδμπέα θάκδηακ ανηεηά εκημκυηενεξ, πνάβια πμο απμηέθεζε έκδεζλδ υηζ μ Κ οπμδμπέαξ ιπμνεί κα έπεζ ορδθυηενα επίπεδα έηθναζδξ. 91

92 Γ.2.2. ΑΝΗΥΝΔΤΖ ΔΚΦΡΑΖ-ΤΓΚΡΗΖ ΜΔ ΠΡΟΓΔΖ 125 Η-επηβαηηδίλεο Ζ ακίπκεοζδ ηδξ έηθναζδξ ηςκ ΑΣ ηαζ Κ α4α2 οπμιμκάδςκ έβζκε ηαζ ιε πνυζδεζδ 125 Η-επζααηζδίκδξ. Γζα ηδκ ακίπκεοζδ ηςκ ΑΣ ηαζ Κ α4α2 οπμδμπέςκ, ηα ιμθοζιέκα ιε ημοξ ακαζοκδοαζιέκμοξ ααηζθμσμφξ Sf9 ηφηηανα επςάζηδηακ ιε 125 Η-επζααηζδίκδ ηαζ ιεηά απυ πθφζεζξ ιεηνήεδηε δ πνμζδειέκδ ναδζεκένβεζα. ακ ανκδηζημί ιάνηονεξ ζημ πείναια πνδζζιμπμζήεδηακ ηυζμ ιδ ιμθοζιέκα ιε ζμφξ ηφηηανα υζμ ηαζ ηφηηανα ιμθοζιέκα ιε ααηζθμσμφξ ακαζοκδοαζιέκμοξ ιυκμ ιε ηδκ ιία οπμιμκάδα. Δηθόλα 27. Γηάγξακκα αλίρλεπζεο ΑΣ θαη Κ α4β2 ππνδνρέσλ ζε θύηηαξα Sf9. Sf9 ηφηηανα εκηυιςκ ιμθοζιέκα ιε ακαζοκδοαζιέκμοξ α4 ηαζ α2 ααηζθμσμφξ, επςάζηδηακ ιε cpm επζααηζδίκδξ ηαζ ιεηά απυ πθφζεζξ ιεηνήεδηε δ πνμζδειέκδ ναδζεκένβεζα. ακ ανκδηζημί ιάνηονεξ πνδζζιμπμζήεδηακ ηυζμ ιδ ιμθοζιέκα ηφηηανα Sf9, υζμ ηαζ ηφηηανα ιμθοζιέκα ιε ααηζθμσμφξ ακαζοκδοαζιέκμοξ ιυκμ ιε ηδ ιζα οπμιμκάδα. ηδκ εηθόλα 27 θαίκεηαζ υηζ ιυκμ ηα ηφηηανα πμο ιμθφκεδηακ ηαζ ιε α4 ηαζ ιε α2 ααηζθμσμφξ πνμζδέκμοκ 125 Η-επζααηζδίκδ, εκχ ζηα ιδ ιμθοζιέκα ιε ακαζοκδοαζιέκμοξ ααηζθμσμφξ ηφηηανα, ηαεχξ ηαζ αοηά πμο ελέθναγακ ιυκμ ηδ ιζα οπμιμκάδα, δεκ πνμζδέεδηε ζπεδυκ ηαευθμο 125 Η-επζααηζδίκδ. Δπίζδξ ζημ δζάβναιια θαίκεηαζ υηζ ηα ιμθοζιέκα ιε Κ α4 ηαζ α2 ααηζθμσμφξ ηφηηανα πνμζδέκμοκ πενζζζυηενεξ ηνμφζεζξ 125 Η-επζααηζδίκδξ. 92

93 Γ.3. ΒΔΛΣΗΣΟΠΟΗΖΖ ΣΖ ΔΚΦΡΑΖ ΣΧΝ α4β2 ΤΠΟΓΟΥΔΧΝ Δ ΚΤΣΣΑΡΑ ΔΝΣΟΜΧΝ Γ.3.1. ΠΡΟΓΗΟΡΗΜΟ ΒΔΛΣΗΣΟΤ ΥΡΟΝΟΤ ΔΚΦΡΑΖ Μεηά ηδκ επζηοπή ακίπκεοζδ ηδξ έηθναζδξ ηςκ ΑΣ ηαζ Κ α4α2 οπμδμπέςκ ζηα ηφηηανα εκηυιςκ δζενεοκήεδηακ μζ ζοκεήηεξ βζα αέθηζζηδ έηθναζή ημοξ. Καη ανπήκ πνμζδζμνίζηδηακ μζ πνυκμζ πμο απαζημφκηακ βζα ηδκ αέθηζζηδ έηθναζδ ηςκ οπμδμπέςκ απυ ηα ηφηηανα ιεηά ηδ ιυθοκζή ημοξ ιε ημοξ ΑΣ ηαζ Κ α4 ηαζ α2 ακαζοκδοαζιέκμοξ ααηζθμσμφξ. Ο πνμζδζμνζζιυξ ηςκ πνυκςκ πμο απαζημφκηακ βζα ηδκ αέθηζζηδ έηθναζδ ηςκ οπμδμπέςκ, έβζκε παίνκμκηαξ δείβιαηα απυ ηαθθζένβεζεξ ιμθοζιέκςκ ιε ααηζθμσμφξ Sf9 ηοηηάνςκ ζε αζχνδζδ ηάεε 24ςνμ, βζα 5 ιένεξ ιεηά ηδ ιυθοκζδ. Μεηά απυ επχαζδ ιε 125 Η-επζααηζδίκδ ηαζ πθφζεζξ, ιεηνήεδηε δ πνμζδειέκδ ναδζεκένβεζα ζε ηάεε δείβια ηοηηάνςκ ηαζ ζοβηνίεδηακ μζ Κ/Λ πμο έδςζακ ηα δείβιαηα. Σα απμηεθέζιαηα πανζζηάκμκηαζ ζηδκ εηθόλα 28. Δηθόλα 28. Πξνζδηνξηζκόο ηνπ βέιηηζηνπ ρξόλνπ γηα ηελ έθθξαζε ησλ ΑΣ θαη Κ ππνδνρέσλ. Καθθζένβεζεξ ηοηηάνςκ Sf9 ζε αζχνδζδ ιμθφκεδηακ ιε ακαζοκδοαζιέκμοξ ΑΣ ή Κ, α4 ηαζ α2 ααηζθμσμφξ ηαζ αημθμφεδζε δεζβιαημθδρία ακά 24ςνμ βζα 6 24ςνα ιεηά ηδ ιυθοκζδ. Γείβιαηα ηοηηάνςκ επςάζηδηακ ιε 125 Η-επζααηζδίκδ ηαζ ιεηά απυ πθφζεζξ ιεηνήεδηε δ πνμζδειέκδ ναδζεκένβεζα (Γcpm). Όπςξ θαίκεηαζ ζηδκ εηθόλα 28, μ αέθηζζημξ πνυκμξ βζα ηδκ έηθναζδ ηςκ ΑΣ ηαζ Κ οπμδμπέςκ είκαζ ηα 3 εζημζζηεηνάςνα. Ζ έηθναζδ είκαζ ηαηά πμθφ ιζηνυηενδ ιέπνζ ημ δεφηενμ 24ςνμ, εκχ απυ ημ ηέηανημ 24ςνμ ηαζ ιεηά μ ανζειυξ ηςκ οπμδμπέςκ πμο πνμζδέκμοκ 125 Η-επζααηζδίκδ ανπίγεζ κα θείκεζ. 93

94 Γ.3.2. ΠΡΟΓΗΟΡΗΜΟ ΒΔΛΣΗΣΖ ΑΝΑΛΟΓΗΑ ΑΝΑΤΝΓΤΑΜΔΝΧΝ α4 ΚΑΗ β2 ΒΑΚΗΛΟΗΧΝ ΓΗΑ ΣΖΝ ΔΚΦΡΑΖ ΣΧΝ ΑΣ ΚΑΗ Κ ΤΠΟΓΟΥΔΧΝ Σα ηφηηανα ιμθφκεδηακ ιε δζάθμνεξ ακαθμβίεξ α4/α2 ακαζοκδοαζιέκςκ ααηζθμσχκ, ιε ζημπυ ημκ πνμζδζμνζζιυ ηδξ ακαθμβίαξ ιε ηδ ιέβζζηδ έηθναζδ ΑΣ ηαζ Κ α4α2 οπμδμπέςκ. Ζ ακαθμβία ζχκ/ηοηηάνςκ πανέιεζκε ζηαεενή 10:1 εκχ δ ακαθμβία α4/α2 ααηζθμσχκ ήηακ απυ1:10 έςξ 10:1. Σα απμηεθέζιαηα θαίκμκηαζ ζηδκ εηθόλα 29. Δηθόλα 29. Μόιπλζε ησλ θπηηάξσλ κε δηαθνξεηηθέο αλαινγίεο α4 θαη β2 βαθηιντώλ. Γζα ημκ πνμζδζμνζζιυ ηδξ ακαθμβίαξ ιε ηδ ιέβζζηδ έηθναζδ ΑΣ ηαζ Κ α4α2 οπμδμπέςκ, ηφηηανα Sf9 ιμθφκεδηακ ηαοηυπνμκα ιε δζαθμνεηζηέξ ακαθμβίεξ ακαζοκδοαζιέκςκ α4 ηαζ α2 ααηζθμσχκ. Ζ ακαθμβία ζχκ/ηοηηάνςκ πανέιεζκε ζηαεενή 10:1 εκχ δ ακαθμβία α4/α2 ααηζθμσχκ ήηακ απυ 1:10 έςξ 10:1. Ζ ακίπκεοζδ ημο οπμδμπέα έβζκε απεοεείαξ ζηα ηφηηανα ιε επχαζδ 125 Η-επζααηζδίκδξ, πθφζεζξ ηαζ ιέηνδζδ ηδξ πνμζδειέκδξ ναδζεκένβεζαξ (Κ/Λ). ηδκ εηθόλα 29 μζ ακαθμβίεξ 1:3 ηαζ 1:1 ειθακίγμκηαζ κα δίκμοκ εθαθνχξ αολδιέκμοξ οπμδμπείξ πμο πνμζδέκμοκ 125 Η-επζααηζδίκδ. Πάκηςξ βεκζηά μζ δζαθμνεηζηέξ ακαθμβίεξ α4 ηαζ α2 ααηζθμσχκ δεκ είπακ ςξ απμηέθεζια ιεβάθεξ δζαθμνέξ ζηδκ έηθναζδ ηςκ οπμδμπέςκ. 94

95 Γ.4. ΜΔΛΔΣΔ ΠΡΟΓΔΖ 3 Ζ-ΔΠΗΒΑΣΗΓΗΝΖ ΚΑΗ ΑΛΛΧΝ, ΜΖ ΔΠΗΖΜΑΜΔΝΧΝ ΠΡΟΓΔΣΧΝ ΣΟΤ ΑΝΑΤΝΓΤΑΜΔΝΟΤ α4β2 ΤΠΟΓΟΥΔΗ Ζ ιεθέηδ πνυζδεζδξ 3 Ζ-επζααηζδίκδξ υπςξ ηαζ άθθςκ, ιδ επζζδιαζιέκςκ πνμζδεηχκ ζημοξ ακαζοκδοαζιέκμοξ ΑΣ ηαζ Κ α4α2 οπμδμπείξ έβζκε βζα κα πνμζδζμνζζημφκ μζ ζοββέκεζεξ πνυζδεζδξ, μζ μπμίεξ απμηεθμφκ έκα ηνζηήνζμ ηδξ πμζυηδηαξ ηδξ ηνζημηαβμφξ ηαζ ηεηανημηαβμφξ δμιήξ ηςκ ακαζοκδοαζιέκςκ οπμδμπέςκ. Δπίζδξ απυ ημ ιέβζζημ ανζειυ ιμνίςκ 3 Ζ-επζααηζδίκδξ πμο πνμζδέκμκηαζ ακά ηφηηανμ πμο εηθνάγεζ ΑΣ ηαζ Κ α4α2 οπμδμπείξ ιπμνμφκ κα οπμθμβζζημφκ ηαζ ηα επίπεδα έηθναζδξ, δδθαδή μ ανζειυξ ηςκ οπμδμπέςκ πμο εηθνάγμκηαζ ακά ηφηηανμ. Γ.4.1. ΜΔΛΔΣΖ ΠΡΟΓΔΖ 3 Ζ-ΔΠΗΒΑΣΗΓΗΝΖ Γζα κα πνμζδζμνζζηεί δ ζοββέκεζα ηςκ ΑΣ ηαζ Κ α4α2 οπμδμπέςκ ιε ηδκ 3 Ζ- επζααηζδίκδ, Sf9 πμο ελέθναγακ ημοξ ΑΣ ηαζ Κ ακαζοκδοαζιέκμοξ οπμδμπείξ, επςάζηδηακ ιε αολακυιεκεξ ζοβηεκηνχζεζξ 3 Ζ-επζααηζδίκδξ ηαζ ιεηά απυ πθφζεζξ ιεηνήεδηε δ πνμζδειέκδ ναδζεκένβεζα. Σα απμηεθέζιαηα ημο πεζνάιαημξ πανζζηάκμκηαζ ζηδκ εηθόλα 30. Οζ ζηαεενέξ K d πνμζδζυνζζακ ηδ ζοββέκεζα ηςκ ΑΣ ηαζ Κ οπμδμπέςκ ιε ηδκ 3 Ζ-επζααηζδίκδ εκχ απυ ηδ B max οπμθμβίζηδηε δ πμζυηδηα ημο ηάεε είδμοξ οπμδμπέςκ πμο εηθνάγμκηακ ακά 10 6 ηφηηανα, ιε αάζδ ηδκ εζδζηή εκενβυηδηα ηδξ 3 Ζ-επζααηζδίκδξ ηαζ ημ δεδμιέκμ υηζ ηάεε α4α2 οπμδμπέαξ δζαεέηεζ δομ εέζεζξ δέζιεοζδξ βζα αβςκζζηέξ ηαζ ζοκαβςκζζηζημφξ ακηαβςκζζηέξ (Arias 2000; Corringer, Le Novère & Changeux 2000). 95

96 Δηθόλα 30. Κακπύιεο θνξεζκνύ πξόζδεζεο 3 Ζ-επηβαηηδίλεο ηφηηανα Sf9 ηα μπμία ελέθναγακ ΑΣ ή Κ ακαζοκδοαζιέκμοξ α4α2 οπμδμπείξ επςάζηδηακ ιε αολακυιεκεξ ζοβηεκηνχζεζξ 3 Ζ-επζααηζδίκδξ. Ύζηενα απυ πθφζεζξ, δ ναδζεκένβεζα ιεηνήεδηε ηαζ δ πνμζδειέκδ 3 Ζ-επζααηζδίκδ ακά 10 5 ηφηηανα οπμθμβίζηδηε ηαζ παναζηάεδηε βναθζηά ςξ πνμξ ηδκ ζοκμθζηή ζοβηέκηνςζδ 3 Ζ-επζααηζδίκδξ. Οζ ηαιπφθεξ πνμέηορακ απυ ιδ βναιιζηή πνμζανιμβή ηςκ δεδμιέκςκ ζηδκ ελίζςζδ Y=Β max* X/K d +X (υπμο Τ δ πνμζδειέκδ 3 Ζ- επζααηζδίκδ ακά 10 5 ηφηηανα, Υ δ μθζηή ζοβηέκηνςζδ 3 Ζ-επζααηζδίκδξ, B max δ ιέβζζηδ ηζιή πνμζδειέκδξ 3 Ζ-επζααηζδίκδξ ακά 10 5 ηφηηανα ηαζ K d δ ζηαεενά απμδέζιεοζδξ, δδθαδή δ ζοβηέκηνςζδ 3 Ζ-επζααηζδίκδξ ζηδκ μπμία επζηοβπάκεηαζ ημ 50% ηδξ B max ). Μέζς ηδξ ιδ βναιιζηήξ πνμζανιμβήξ πνμζδζμνίζηδηακ μζ ηζιέξ ηςκ B max ηαζ K d. Οζ ηζιέξ K d ηαζ Β max (ακά 10 6 ηφηηανα) πμο πνμέηορακ ζοκμρίζηδηακ ζημκ πίλαθα 3. Τπνδνρέαο K d (nm) B max (pmol/10 6 cells) ΑΣ α4β2 0,3 0,22 Κ α4β2 0,73 1,58 Πίλαθαο 3. K d θαη Β max ηηκέο ησλ ΑΣ θαη Κ εθθξαζκέλσλ ππνδνρέσλ. Απυ ηδ ιδ βναιιζηή πνμζανιμβή ηςκ δεδμιέκςκ ημο δζαβνάιιαημξ ηδξ εηθόλαο 32 ζηδκ ελίζςζδ Y=Β max* X/K d +X, οπμθμβίζηδηακ μζ ηζιέξ K d ηαζ Β max ηςκ ΑΣ ηαζ Κ εηθναζιέκςκ οπμδμπέςκ. Ζ ηζιή K d ημο ΑΣ οπμδμπέα πμο οπμθμβίζηδηε είκαζ δ ιζζή απυ ηδκ ακηίζημζπδ ηζιή ημο Κ, πνάβια πμο δείπκεζ ηαζ δζπθάζζα ζοββέκεζα ιε ηδκ 3 Ζ-επζααηζδίκδ. Απυ ηδκ άθθδ μζ ηζιή Β max ημο Κ οπμδμπέα είκαζ 7 θμνέξ ιεβαθφηενδ οπμδεζηκφμκηαξ 7 θμνέξ ορδθυηενα επίπεδα έηθναζδξ. Απυ ηζξ ηζιέξ ημο πίλαθα 3 θαίκεηαζ μ ΑΣ οπμδμπέαξ έπεζ δζπθάζζα ζοββέκεζα ιε ηδκ 3 Ζ-επζααηζδίκδ ζε ζπέζδ ιε ημκ Κ οπμδμπέα, ηαεχξ δ ζηαεενά K d έπεζ ηδ ιζζή ηζιή ζε ζπέζδ ιε ηδ ακηίζημζπδ ημο Κ οπμδμπέα. Απυ ηδκ άθθδ μ Κ οπμδμπέαξ θαίκεηαζ κα έπεζ 7πθάζζα Β max απυ ημκ ΑΣ ηάηζ πμο δείπκεζ 7 θμνέξ ορδθυηενα επίπεδα έηθναζδξ. Με αάζδ ηζξ ηζιέξ Β max απυ ημκ πίλαθα 3 ηαζ ηδκ παναδμπή υηζ 96

97 ηάεε οπμδμπέαξ θένεζ δομ εέζεζξ πνυζδεζδξ, ζε 1 L ηαθθζένβεζαξ ιε 5x10 6 ηφηηανα/ ml εηθνάγμκηαζ 0,55 nmol ή 0,17 mg ΑΣ οπμδμπέα ή 3,95 nmol ή 0,88 mg Κ οπμδμπέα. Γ.4.2. ΜΔΛΔΣΖ ΠΡΟΓΔΖ ΜΖ ΡΑΓΗΔΝΔΡΓΧΝ ΠΡΟΓΔΣΧΝ ΣΟΤ ΑΝΑΤΝΓΤΑΜΔΝΟΤ α4β2 ΤΠΟΓΟΥΔΗ Γζα κα πνμζδζμνζζηεί δ ζοββέκεζα ηςκ ΑΣ ηαζ Κ α4α2 οπμδμπέςκ ιε ιδ ναδζμεπζζδιαζιέκμοξ πνμζδέηεξ, έβζκακ ιεθέηεξ ακηαβςκζζιμφ ηςκ ηεθεοηαίςκ ιε ηδκ 3 Ζ-επζααηζδίκδ. Κφηηανα Sf9 πμο ελέθναγακ ΑΣ ηαζ Κ α4α2 οπμδμπείξ επςάζηδηακ ιε Κ/Λ 3 Ζ-επζααηζδίκδξ ηαζ ιε αολακυιεκεξ ζοβηεκηνχζεζξ απυ ηάεε ιδ ζδιαζιέκμ ακηαβςκζζηζηυ πνμζδέηδ. Μεηά απυ πθφζεζξ ιεηνήεδηε δ πνμζδειέκδ ναδζεκένβεζα. Σα απμηεθέζιαηα πανμοζζάγμκηαζ ζηδκ εηθόλα 31. Με αάζδ ηζξ ηζιέξ IC 50 βζα ηάεε είδμξ οπμδμπέα ηαζ ακηαβςκζζηζημφ πνμζδέηδ, οπμθμβίζηδηακ μζ ζηαεενέξ πανειπυδζζδξ (K i ) ηςκ ακηαβςκζζηζηχκ πνμζδεηχκ ιέζς ηδξ ελίζςζδξ Cheng-Prusoff: Ki =IC 50 /(1+[ 3 H-epibatidine]/Kd) (πίλαθαο 4). Nicotine (nm) Imidazole (mm) TC-2559 (nm) UB-165 (nm) ΑΣ α4β2 43,2 1,12 14,2 32,6 Κ α4β2 52,9 2,6 26,4 73,8 K i Πίλαθαο 4. Οζ K i ηζιέξ ηςκ ηεζζάνςκ ιδ ζδιαζιέκςκ ακηαβςκζζηζηχκ πνμζδεηχκ ιε ημοξ ΑΣ ηαζ Κ οπμδμπείξ, υπςξ αοηέξ οπμθμβίζηδηακ ιέζς ηδξ ελίζςζδξ Cheng-Prusoff απυ ηζξ ακηίζημζπεξ ηζιέξ IC 50 ηαζ K d ηςκ οπμδμπέςκ ιε ηδκ 3 Ζ-επζααηζδίκδ. Όπςξ θαίκεηαζ ζημκ πίλαθα 4, μζ ηζιέξ K i ηαζ βζα ημοξ ηέζζενζξ ιδ ζδιαζιέκμοξ ακηαβςκζζηζημφξ πνμζδέηεξ είκαζ πζμ παιδθέξ βζα ημκ ΑΣ οπμδμπέα, ηάηζ πμο δείπκεζ ιεζςιέκδ ζοββέκεζα βζα ημκ Κ οπμδμπέα. Μάθζζηα μζ ηζιέξ είκαζ βζα ημκ Κ οπμδμπέα πενίπμο δζπθάζζεξ ζε ζπέζδ ιε ημκ ΑΣ, ηάηζ πμο δείπκεζ υηζ δ ζοββέκεζα είκαζ ιεζςιέκδ ηαηά ημ ήιζζο υπςξ ζζπφεζ ηαζ βζα 3 Ζ-επζααηζδίκδ ιε ημοξ ακηίζημζπμοξ οπμδμπείξ. 97

98 Δηθόλα 31. Κακπύιεο αληαγσληζκνύ ηεο 3 Η-επηβαηηδίλεο κε κε ζεκαζκέλνπο πξνζδέηεο ηοηηάνςκ Sf9 ηα μπμία ελέθναγακ ΑΣ ή Κ ακαζοκδοαζιέκμοξ α4α2 οπμδμπείξ επςάζηδηακ ιε cpm 3 Ζ-επζααηζδίκδξ ηαζ έκακ άθθμ (απυ ηέζζενζξ) ιδ επζζδιαζιέκμ πνμζδέηδ. Ύζηενα απυ πθφζεζξ, δ ναδζεκένβεζα ιεηνήεδηε ηαζ δ επί ημζξ εηαηυ (πμζμζηυ επί ηςκ ναδζεκενβχκ ηνμφζεςκ πμο ηαηαβνάθμκηαζ ζε δείβιαηα πςνίξ ακηαβςκζζιυ) πνμζδειέκδ 3 Ζ-επζααηζδίκδ οπμθμβίζηδηε ηαζ παναζηάεδηε βναθζηά ςξ πνμξ ηδ ζοβηέκηνςζδ ηςκ ακηαβςκζζηζηχκ πνμζδεηχκ. Οζ ηαιπφθεξ πνμέηορακ απυ ιδ βναιιζηή πνμζανιμβή ηςκ δεδμιέκςκ ζηδκ ελίζςζδ: Y=Bottom+(Top-Bottom)/[1+10ˆ(X-LogIC 50 )]. Όπμο Τ δ % πνυζδεζδ 3 Ζ-επζααηζδίκδξ, Υ δ ζοβηέκηνςζδ ηςκ ιδ ζδιαζιέκςκ ακηαβςκζζηζηχκ πνμζδεηχκ, Top δ ιέβζζηδ δέζιεοζδ 3 Ζ-επζααηζδίκδξ απμοζία ακηαβςκζζηζημφ πνμζδέηδ ηαζ Bottom δ ιδ εζδζηή δέζιεοζδ 3 Ζ-επζααηζδίκδξ ζε ζοκεήηεξ ημνεζιμφ απυ ημκ ακηαβςκζζηζηυ πνμζδέηδ, IC 50 μζ ζοβηεκηνχζεζξ ηςκ ιδ ζδιαζιέκςκ ακηαβςκζζηζηχκ πνμζδεηχκ, πανμοζία ηςκ μπμίςκ πανειπμδίγεηαζ ηαηά 50% δ πνυζδεζδ 3 Ζ-επζααηζδίκδξ. 98

99 Γ.5. ΠΔΗΡΑΜΑΣΑ ΓΗΑΛΤΣΟΠΟΗΖΖ ΣΧΝ ΤΠΟΓΟΥΔΧΝ Σμ πνχημ αήια βζα ημκ ηαεανζζιυ ιζαξ δζαιειανακζηήξ πνςηεΐκδξ είκαζ δ δζαθοημπμίδζή ηδξ απυ ηδκ ηοηηανμπθαζιαηζηή ιειανάκδ ζε οδαηζηυ νοειζζηζηυ δζάθοια. Αοηυ επζηοβπάκεηαζ ιε ηδ πνήζδ απμννοπακηζηχκ ηα μπμία πενζηθείμοκ ηα οδνυθμαα ηιήιαηα ηςκ πνςηεσκχκ ηαεχξ ηαζ ηα ιειανακζηά θςζθμθζπίδζα ζηα ιζηηφθζά ημοξ. Έηζζ ηαηαζηνέθεηαζ δ δμιή ηδξ ιειανάκδξ ηαζ μζ δζαιειανακζηέξ πνςηεΐκεξ δζαθοημπμζμφκηαζ. Σα απμννοπακηζηά ηαηδβμνζμπμζμφκηαζ ηονίςξ ιε αάζδ ημ θμνηίμ πμο θένμοκ ζε κε ηνληθά (πςνίξ θμνηζζιέκεξ μιάδεξ), αληνληθά (ανκδηζηά θμνηζζιέκα), θαηηνληθά (εεηζηά θμνηζζιέκα), ηαεχξ ηαζ ακθνιπηηθά (θένμοκ ηαζ εεηζηά ηαζ ανκδηζηά θμνηζζιέκεξ μιάδεξ). Όζμ αολάκεηαζ δ ζζπφξ ηαζ δ ζοβηέκηνςζδ εκυξ απμννοπακηζημφ, ιπμνμφκ κα δζαθοημπμζδεμφκ πενζζζυηενα ηαζ πζμ οδνυθμαα ιυνζα, αθθά ηαοηυπνμκα αολάκεηαζ ηαζ μ ηίκδοκμξ ηδξ πνςηεσκζηήξ απμδζάηαλδξ (Lichtenberg, Ahyayauch & Goñi 2013). ηα πεζνάιαηα πμο πενζβνάθμκηαζ ζε αοηή ηδκ εκυηδηα πνμζδζμνίζηδηε ημ πμζμζηυ ηςκ θεζημονβζηχκ α4α2 οπμδμπέςκ πμο δζαθοημπμζμφκηαζ ηάης απυ δζάθμνεξ ζοκεήηεξ ηαζ εηθνάζηδηε ςξ πμζμζηυ ημο δζαθοημπμζδιέκςκ οπμδμπέςκ επί ημο ζοκυθμο ηςκ εηθναζιέκςκ οπμδμπέςκ. Συζμ μζ δζαθοημπμζδιέκμζ υζμ ηαζ μζ ζοκμθζημί οπμδμπείξ πνμζδζμνίζηδηακ ιέζς ηδξ 125 Η- επζααηζδίκδξ πμο πνυζδεκακ. 99

100 Γ.5.1. ΓΗΑΛΤΣΟΠΟΗΖΖ ΜΔ ΜΖ ΗΟΝΗΚΑ ΚΑΗ ΑΜΦΟΛΤΣΗΚΑ ΑΠΟΡΡΤΠΑΝΣΗΚΑ Σα ιδ ζμκζηά ηαζ αιθμθοηζηά απμννοπακηζηά ηαηά ηακυκα δζαθοημπμζμφκ πνςηεΐκεξ ιε δζαιειανακζηά ηιήιαηα πςνίξ κα ηζξ απμδζαηάζμοκ ηαζ βζ αοηυ ημ θυβμ ήηακ ηα πνχηα πμο επεθέβδζακ κα δμηζιαζημφκ βζα ηδ δζαθοημπμίδζδ ηςκ α4α2 οπμδμπέςκ εηθναζιέκςκ ζηδ ιειανάκδ ηοηηάνςκ εκηυιςκ. Δπίζδξ αοηέξ μζ ηαηδβμνίεξ απμννοπακηζηχκ είκαζ πθήνςξ ζοιααηέξ ιε εθανιμβέξ υπςξ δ πνςιαημβναθία ζοββέκεζαξ ζυκηςκ ιεηάθθμο βζα ιεηέπεζηα πνςηεσκζηυ ηαεανζζιυ. Έηζζ ζοβηνίεδηε δ δζαθοημπμίδζδ ζε ηφηηανα ηα μπμία ελέθναγακ είηε ημκ ΑΣ είηε ημκ Κ οπμδμπέα, απυ απμννοπακηζηά ζηδκ ηοπζηή ζοβηέκηνςζδ ημο 1% πμο ζοκήεςξ πνδζζιμπμζείηαζ. Γμηζιάζηδηακ ηα απμννοπακηζηά: Triton Υ-100, CHAPS (3-[(3- Cholamidopropyl) dimethylammonio]-1-propanesulfonate), DDM (n-dodecyl α-dmaltoside) ηαζ ODG (N-Octanoyl-α-D-glucosylamine). Σα απμηεθέζιαηα θαίκμκηαζ ζηδκ εηθόλαο 32. Δηθόλα 32. Γηάγξακκα δηαιπηνπνίεζεο ιεηηνπξγηθώλ ππνδνρέσλ κε κε ηνληθά θαη ακθνιπηηθά απνξξππαληηθά. Σνία ιδ ζμκζηά (Triton Υ-100, DDM ηαζ ODG) ηαζ έκα αιθμθοηζηυ (CHAPS) απμννοπακηζηυ ζοβηνίεδηακ ςξ πνμξ ηδκ ζηακυηδηά ημοξ κα δζαθοημπμζμφκ ΑΣ ηαζ Κ α4α2 οπμδμπείξ εηθναζιέκμοξ ζε ηφηηανα εκηυιςκ ηφηηανα εκηυιςκ ηα μπμία ελέθναγακ ΑΣ ή Κ α4α2 οπμδμπείξ δζαθοημπμζήεδηακ ιε δζάθοια 1% απυ ηάεε έκα απμννοπακηζηυ ζε PBS ηαζ επζζδιάκεδηακ ιε 3 Ζ-επζααηζδίκδ. Μεηά απυ θοβμηέκηνδζδ πνμζδζμνίζηδηακ ηα πμζμζηά δζαθοημπμίδζδξ ηςκ οπμδμπέςκ. Απυ ηα πμζμζηά ηςκ ηνμφζεςκ δ εηθόλα 32, ημ Triton Υ-100 θαίκεηαζ κα οπενηενεί έκακηζ ηςκ ηνζχκ άθθςκ ιδ ζμκηζηχκ ηαζ αιθμθοηζηχκ απμννοπακηζηχκ ζηδ δζαθοημπμίδζδ θεζημονβζηχκ ΑΣ ηαζ Κ α4α2 οπμδμπέςκ. Δπίζδξ μ Κ οπμδμπέαξ θαίκεηαζ κα δζαθοημπμζείηαζ 4 θμνέξ πενζζζυηενμ απυ ημκ ΑΣ οπμδμπέα, ημ ιεβαθφηενμ πμζμζηυ ημο μπμίμο θαίκεηαζ κα παναιέκεζ αδζάθοημ. 100

101 Γ.5.2. ΓΗΑΛΤΣΟΠΟΗΖΖ ΜΔ ΗΟΝΗΚΑ ΑΠΟΡΡΤΠΑΝΣΗΚΑ Πνμηεζιέκμο κα αεθηζςεμφκ πενεηαίνς ηα πμζμζηά δζαθοημπμίδζδξ θεζημονβζηχκ α4α2 οπμδμπέςκ δμηζιάζηδηε δζαθοημπμίδζδ ιε δζάθμνεξ ζοβηεκηνχζεζξ πμθζημφ καηνίμο ηαζ θαμονμεεζσημφ καηνίμο. Σα απμννοπακηζηά αοηά ακήημοκ ζηδκ ηαηδβμνία ηςκ ακζμκζηχκ απμννοπακηζηχκ ηαζ είκαζ ζζπονυηενα ηςκ ιδ ζμκζηχκ πμο δμηζιάζηδηακ ανπζηά. Έηζζ έπνεπε κα δμηζιαζημφκ ζε δζάθμνεξ ζοβηεκηνχζεζξ ζηζξ μπμίεξ κα είκαζ ηυζμ ζζπονά χζηε κα δζαθοημπμζμφκ πενζζζυηενμοξ οπμδμπείξ, πςνίξ υιςξ κα πνμηαθμφκ απμδζάηαλδ ηδξ δμιήξ ημοξ. Σμ ακζμκζηυ απμννοπακηζηυ πμθζηυ κάηνζμ δμηζιάζηδηε βζαηί ζοκδοάγεζ ζζπονή ζηακυηδηα δζαθοημπμίδζδξ ςξ ζμκζηυ, ηαζ ηδκ ειπεζνζηή δζαπίζηςζδ υηζ βεκζηά δεκ απμδζαηάζζεζ ηζξ πνςηεΐκεξ ημοθάπζζημκ υηακ πνδζζιμπμζείηαζ ζε ζπεηζηά παιδθέξ ζοβηεκηνχζεζξ ηδξ ηάλεςξ ημο 1%. Απυ ηδκ άθθδ, ημ ακζμκζηυ απμννοπακηζηυ θαμονμεεζσημφ κάηνζμ (SDS) έπεζ ιεβάθδ δοκαηυηδηα δζαθοημπμίδζδξ οδνυθμαςκ ιμνίςκ, ςζηυζμ είκαζ απμδζαηαηηζηυ βζα ηζξ πενζζζυηενεξ πνςηεΐκεξ ζηζξ ζοβηεκηνχζεζξ 0,1-1% πμο πνδζζιμπμζείηαζ ζοκήεςξ ηαζ βζ αοηυ πνδζζιμπμζήεδηε ζε πμθφ παιδθέξ ζοβηεκηνχζεζξ απυ 0,01 % έςξ 0,05 %. ηδ ζοκέπεζα ηα πμζμζηά δζαθοημπμίδζδξ ηαζ ηςκ δομ ακζμκζηχκ απμννοπακηζηχκ ζοβηνίεδηακ ιε ηα ακηίζημζπα πμζμζηά ημο Triton Υ

102 Δηθόλα 33. Γηαιπηνπνίεζε ιεηηνπξγηθώλ ππνδνρέσλ κε SDS θαη ρνιηθό λάηξην Πνμζδζμνίζηδηακ πμζμζηά δζαθοημπμίδζδξ θεζημονβζηχκ ΑΣ ηαζ Κ οπμδμπέςκ ιε SDS ηαζ πμθζηυ κάηνζμ ζε ζοβηεκηνχζεζξ ηφηηανα εκηυιςκ ηα μπμία ελέθναγακ ΑΣ ή Κ α4α2 οπμδμπείξ δζαθοημπμζήεδηακ ζε δζάθμνεξ ζοβηεκηνχζεζξ πμθζημφ καηνίμο ηαζ SDS ηαζ επζζδιάκεδηακ ιε 3 Ζ-επζααηζδίκδ. Μεηά απυ θοβμηέκηνδζδ πνμζδζμνίζηδηακ ηα πμζμζηά δζαθοημπμίδζδξ ηςκ οπμδμπέςκ. Ζ εηθόλα 33 δείπκεζ υηζ δ ζοβηέκηνςζδ ηαζ ηςκ δομ ζμκζηχκ απμννοπακηζηχκ υπςξ ακαιεκυηακ επδνεάγεζ ημ πμζμζηυ ηςκ θεζημονβζηχκ ΑΣ ηαζ Κ α4α2 οπμδμπέςκ πμο δζαθοημπμζμφκηαζ. Καζ ηα δομ απμννοπακηζηά έπμοκ ιζα αέθηζζηδ ζοβηέκηνςζδ ζηδκ μπμία ιεβζζημπμζείηαζ δ δζαθοημπμίδζδ, αθθά ηακέκα δεκ θηάκεζ ηα πμζμζηά δζαθοημπμίδζδξ πμο επζηοβπάκμκηαζ ιε ημ Triton Υ-100 (69% βζα ηςκ Κ οπμδμπέα ηαζ 16% βζα ημκ ΑΣ). 102

103 Γ.5.3. ΔΠΗΓΡΑΖ ΣΟΤ ΥΡΟΝΟΤ ΚΑΗ ΣΖ ΘΔΡΜΟΚΡΑΗΑ ΣΖ ΓΗΑΛΤΣΟΠΟΗΖΖ ηζξ πνμδβμφιεκεξ παναβνάθμοξ ημ Triton Υ-100 απμδείπεδηε υηζ πθεμκεηηεί ακάιεζα ζηα απμννοπακηζηά πμο δμηζιάζηδηακ βζα ηδ δζαθοημπμίδζδ θεζημονβζηχκ οπμδμπέςκ. ηδ ζοκέπεζα δζενεοκήεδηε μ εκδεπυιεκμξ νυθμξ ηδξ εενιμηναζίαξ ηαζ ημο πνυκμο ζηδ δζαθοημπμίδζδ. Έηζζ δμηζιάζηδηε δζαθοημπμίδζδ θεζημονβζηχκ οπμδμπέςκ απυ ηφηηανα, ζε PBS ιε 1% Triton Υ-100, ζε εενιμηναζία δςιαηίμο, ζημοξ 37 ηαζ ζημοξ 4 μ C ηαζ ιε πνυκμοξ επχαζδξ 20 θεπηά, 3 χνεξ ηαζ 16 χνεξ. Δηθόλα 34. Γηαιπηνπνίεζε ιεηηνπξγηθώλ ππνδνρέσλ κε Triton 1% γηα δηαθνξεηηθνύο ρξόλνπο θαη ζε δηαθνξεηηθέο ζεξκνθξαζίεο. οβηνίεδηε δ δζαθοημπμίδζδ ΑΣ ηαζ Κ οπμδμπέςκ ιε Triton Υ-100 ζε ηνείξ δζαθμνεηζημφξ πνυκμοξ ηαζ ζε ηνείξ δζαθμνεηζηέξ εενιμηναζίεξ ηφηηηανα εκηυιςκ ηα μπμία ελέθναγακ ΑΣ ή Κ α4α2 δζαθοημπμζήεδηακ ιε: PBS 1 % Triton βζα 20 θεπηά, 3 χνεξ ηαζ 16 χνεξ, ζε εενιμηναζία δςιαηίμο (25C), ζοκηήνδζδξ (4C) ηαζ 37 o C (37C) ηαζ αημθμφεςξ επζζδιάκεδηακ ιε 3 Ζ-επζααηζδίκδ. Μεηά απυ θοβμηέκηνδζδ πνμζδζμνίζηδηακ ηα πμζμζηά δζαθοημπμίδζδξ ηςκ οπμδμπέςκ. Ζ εηθόλα 34 δείπκεζ υηζ δ εενιμηναζία ζηδκ μπμία ζδιεζχεδηε ημ ιεβαθφηενμ πμζμζηυ δζαθοημπμίδζδξ θεζημονβζημφ οπμδμπέα ήηακ μζ 25 o C. Ζ δζαθοημπμίδζδ πναβιαημπμζείηαζ ζφκημια ηαζ δεκ πνμπςνά πένακ ηςκ 20 θεπηχκ. Δπίζδξ ζε υθμοξ ημοξ πνυκμοξ ηαζ ηζξ εενιμηναζίεξ μ Κ οπμδμπέαξ είπε ηαθφηενα πμζμζηά δζαθοημπμίδζδξ απυ ημκ ΑΣ οπμδμπέα. 103

104 Γ.5.4. ΔΦΑΡΜΟΓΖ ΤΠΔΡΖΥΧΝ ΣΑΤΣΟΥΡΟΝΑ ΜΔ ΣΖ ΥΡΖΖ TRITON X-100 Γμηζιάζηδηε δ επίδναζδ πμο εα ιπμνμφζε κα έπε ζηδ δζαθοημπμίδζδ θεζημονβζηχκ οπμδμπέςκ δ εθανιμβή οπενήπςκ πανάθθδθα ιε ηδ πνήζδ απμννοπακηζημφ. ηδ θμβζηή πίζς απυ αοηυ ανίζηεηαζ ημ εκδεπυιεκμ ηδξ πνμζηυθθδζδξ ηςκ οπμδμπέςκ ζημκ ηοηηανμζηεθεηυ. Ακ αοηυ ίζποε, ηυηε μζ οπένδπμζ εα ιπμνμφζακ κα δζαηυρμοκ αοηή ηδ δζαζφκδεζδ. Έηζζ ηφηηανα Sf9 ιε εηθναζιέκμοξ ΑΣ ηαζ Κ οπμδμπείξ αθμφ δζαθοημπμζήεδηακ ζε PBS 1% Triton, οπέζηδζακ οπενήπδζδ βζα δζάθμνα πνμκζηά δζαζηήιαηα ηαζ ζηδ ζοκέπεζα πνμζδζμνίζηδηε ημ πμζμζηυ δζαθοημπμίδζδξ. Σμ απμννοπακηζηυ πμο επζθέπεδηε ήηακ ημ Triton Υ-100, ηαεχξ ζηα πνμδβμφιεκα πεζνάιαηα απμδείπεδηε ςξ ημ πθέμκ ηαηάθθδθμ. Δηθόλα 35. Γηαιπηνπνίεζε ΑΣ θαη Κ α4β2 ππνδνρέα κε ππέξερνπο θαη Triton 1 %. Μεθεηήεδηε δ δζαθοημπμίδζδ ΑΣ ηαζ Κ οπμδμπέςκ ιε Triton 1%, οπυ ηδκ επίδναζδ οπενήπςκ βζα πνμκζηυ δζάζηδια έςξ ηαζ 8 θεπηά ηφηηανα εκηυιςκ ηα μπμία ελέθναγακ ΑΣ ή Κ α4α2 οπμδμπείξ δζαθοημπμζήεδηακ ζε Triton 1% ζε ΘΓ ηαζ επζπθέμκ οπέζηδζακ οπενήπδζδ βζα 0, 2, 4, 6 ηαζ 8 θεπηά. ηδ ζοκέπεζα επζζδιάκεδηακ ιε 3 Ζ-επζααηζδίκδ ηαζ αημθμφεδζε θοβμηέκηνδζδ. Μεηά απυ θοβμηέκηνδζδ πνμζδζμνίζηδηακ ηα πμζμζηά δζαθοημπμίδζδξ ηςκ οπμδμπέςκ. Σμ δζάβναιια ηδξ εηθόλαο 35 δείπκεζ υηζ δ εθανιμβή οπενήπςκ ηαηά ηδ δζαθοημπμίδζδ υπζ ιυκμ δεκ αεθηζχκεζ ηδκ απυδμζδ, αθθά πνμμδεοηζηά ιεζχκεζ ηαζ ημ πμζμζηυ ηςκ θεζημονβζηά δζαθοημπμζδιέκςκ οπμδμπέςκ. 104

105 Διαλυτοποιηςη % Γ.5.5. ΓΗΑΛΤΣΟΠΟΗΖΖ ΜΔ TRITON Δ ΠΟΛΤ ΑΛΚΑΛΗΚΟ ph ε ιζα ηεθεοηαία πνμζπάεεζα αεθηίςζδξ ηςκ πμζμζηχκ δζαθοημπμίδζδξ ηςκ εηθναζιέκςκ οπμδμπέςκ, δμηζιάζηδηε δ πνήζδ ph 11, πανμοζία Triton Υ-100 1%, βζα 30 θεπηά. ημ πνςηυημθθμ αοηυ, ημ αηναία ορδθυ ph εα ιπμνμφζε εεςνδηζηά κα πνμηαθέζεζ ηδκ απμηυθθδζδ ημο οπμδμπέα απυ ημκ ηοηηανμζηεθεηυ δζεοημθφκμκηαξ ηδ δζαθοημπμίδζδ. Βεααίςξ ζε ηυζμ αηναίμ ph δ απμδζάηαλδ δεκ εα ιπμνμφζε πανά κα είκαζ έκα πμθφ πζεακυ εκδεπυιεκμ. Έηζζ έβζκε έκα πνμηαηανηζηυ πείναια ιε ηζξ ζοκεήηεξ αοηέξ AT K Δηθόλα 36. Γηαιπηνπνίεζε ΑΣ θαη Κ α4β2 ππνδνρέσλ κε Triton 1% ζε πνιύ πςειό ph ηφηηανα εκηυιςκ ηα μπμία ελέθναγακ ΑΣ ηαζ Κ οπμδμπείξ, δζαθοημπμζήεδηακ ζε δζάθοια PBS/Triton Υ-100 1%, ph 11. ηδ ζοκέπεζα αθμφ ημ ph νοειίζηδηε ζηδκ ηζιή 7,4 επζζδιάκεδηακ ιε 3 Ζ-επζααηζδίκδ, αημθμφεδζε θοβμηέκηνδζδ ηαζ έβζκε filter assay ζημ οπενηείιεκμ. Μεηά απυ θοβμηέκηνδζδ πνμζδζμνίζηδηακ ηα πμζμζηά δζαθοημπμίδζδξ ηςκ οπμδμπέςκ. Ζ εηθόλα 36 δείπκεζ υηζ ηα πμζμζηά θεζημονβζηχκ δζαθοημπμζδιέκςκ οπμδμπέςκ ήηακ πμθφ ιζηνυηενα ζημ ph 11, μπυηε θαίκεηαζ υηζ μφηε μ ΑΣ μφηε μ Κ οπμδμπέαξ ακηέπμοκ ημ ph αοηυ ηαζ έηζζ ημ εκδεπυιεκμ πνήζδξ αηναίμο ph ιε ζημπυ ηδκ οπμαμήεδζδ ηδξ δζαθοημπμίδζδξ απμηθείζηδηε. 105

106 Γ.6. ΚΑΘΑΡΗΜΟ ΚΑΗ ΑΠΟΜΟΝΧΖ ΣΟΤ α4β2 ΤΠΟΓΟΥΔΑ ηζξ πνμδβμφιεκεξ εκυηδηεξ μ Κ α4α2 οπμδμπέαξ απμδείπεδηε υηζ έπεζ 7 θμνέξ ορδθυηενα επίπεδα έηθναζδξ ηαζ 4 θμνέξ ορδθυηενα επίπεδα δζαθοημπμίδζδξ ζε ζπέζδ ιε ημκ ΑΣ οπμδμπέα. Γζα ημ θυβμ αοηυ ηα πεζνάιαηα απμιυκςζδξ ηαζ ηαεανζζιμφ ζοκεπίζηδηακ ιυκμ ιε ημκ Κ α4α2 οπμδμπέα. Ζ απμιυκςζδ ηαζ μ ηαεανζζιυξ ημο Κ α4α2 οπμδμπέα έβζκακ ιε δζαδμπζηά ζηάδζα πνςιαημβναθίαξ ζοββέκεζαξ ζυκηςκ κζηεθίμο ηαζ πνςιαημβναθίαξ ιμνζαημφ απμηθεζζιμφ. Γ.6.1. ΚΑΘΑΡΗΜΟ ΣΟΤ Κ α4β2 ΤΠΟΓΟΥΔΑ ΜΔ ΥΡΧΜΑΣΟΓΡΑΦΗΑ ΤΓΓΔΝΔΗΑ ΗΟΝΣΧΝ ΝΗΚΔΛΗΟΤ Οζ οπμιμκάδεξ α4 ηαζ α2 ηςκ ΑΣ ηαζ Κ οπμδμπέςκ έθενακ ζημ ηαναμλοηεθζηυ ημοξ άηνμ έκακ επίημπμ 8 ζζηζδζκχκ, μ μπμίμξ ακαπηφζζεζ ιεβάθδ ζοββέκεζα ιε δζζεεκή ηαηζυκηα ιεηάθθςκ οπυ ηζξ ηαηάθθδθεξ ζοκεήηεξ ηαζ βζ αοηυ ιπμνεί κα πνδζζιμπμζδεεί βζα ηδκ απμιυκςζδ ηδξ πνςηεΐκδξ-θμνέα. Έηζζ δζαθοημπμζδιέκμζ Κ α4α2 οπμδμπείξ ζε εηποθίζιαηα ιε Triton 1%, εηθναζιέκμζ ζε ηφηηανα Sf9, απμιμκχεδηακ ιε ζθαζνίδζα ζυκηςκ κζηεθίμο (Ni-NTA). Δπεζδή ζηδ δζαδζηαζία πνδζζιμπμζήεδηακ δζαθφιαηα πμο πενζείπακ ζιζδαγυθζμ, ημ μπμίμ πανειπμδίγεζ ηδκ πνυζδεζδ επζααηζδίκδξ (πανάβναθμξ Γ.1.4.2), δ ακίπκεοζδ ηςκ α4α2 οπμδμπέςκ ζηα ηθάζιαηα ηζξ ζηήθδξ έβζκε ιυκμ ιε ζηφπςια western. 106

107 Δηθόλα 37. Αλάιπζε κε ζηύπσκα western (Α) θαη SDS PAGE (B) ησλ θιαζκάησλ ηεο ρξσκαηνγξαθίαο ζπγγέλεηαο ηόλησλ ληθειίνπ ηνπ Κ ππνδνρέα. 1) Κ α4α2 ηφηηανα Sf9, 2) Δηπφθζζια Κ α4α2 Sf9, 3) Μεηά ημ πέναζια απυ ηα ζθαζνίδζα Ni-NTA, 4), 5), 6), 7) Πθφζεζξ ιε 1 υβημ ζηήθδξ 10, 10, 50, 100 mm ζιζδαγμθίμο ακηζζημίπςξ, 8) έηθμοζδ ιε 2 υβημοξ ζηήθδξ 400 mμ ζιζδαγμθίμο, 9) πνςηεσκζηυξ δείηηδξ ιμνζαηχκ αανχκ. ηδκ εηθόλα 37 θαίκεηαζ μ Κ α4α2 οπμδμπέαξ ζοιποηκςιέκμξ ηαζ ηαεανζζιέκμξ ζε ιεβάθμ ααειυ ζημ ηθάζια έηθμοζδξ, ζηα 400 mm ζιζδαγμθίμο. Γ.6.2. ΑΡΝΖΣΗΚΟΗ ΜΑΡΣΤΡΔ (ΚΤΣΣΑΡΑ SF9) Σα ηφηηανα εκηυιςκ, υπςξ υθα ηα ακχηενα εοηανοςηζηά ηφηηανα, δζαεέημοκ πμθθέξ πνςηεΐκεξ πμο θένμοκ ζοκεπυιεκα ηαηάθμζπα ζζηζδίκδξ, μζ μπμίεξ ιπμνμφκ κα πνμζδεεμφκ ζηα ζθαζνίδζα κζηεθίμο ιε ημκ ίδζμ ηνυπμ πμο πνμζδέκμκηαζ ηαζ μζ ακαζοκδοαζιέκεξ πνςηεΐκεξ πμο θένμοκ πμθφ-ζζηζδζκζηέξ αθθδθμοπίεξ. Γζα κα δζαπζζηςεμφκ ηοπυκ πνςηεΐκεξ ηςκ ηοηηάνςκ Sf9 ή ημο ααηζθμσμφ πμο πνμζδέκμκηαζ ζηα ζθαζνίδζα Ni-NTA ηαζ ειθακίγμκηαζ ζηα ηθάζιαηα έηθμοζδξ, πνδζζιμπμζήεδηακ ςξ ανκδηζημί ιάνηονεξ ηδξ δζαδζηαζίαξ ηαεανζζιμφ εηποθίζιαηα ιε απμννοπακηζηυ (Η) απυ ηφηηανα εκηυιςκ Sf9 ιμθοζιέκα ιε ιδ ακαζοκδοαζιέκμοξ ααηζθμσμφξ, ηαεχξ επίζδξ ηαζ (ΗΗ) απυ ιδ ιμθοζιέκα ηφηηανα. Καζ μζ δομ ανκδηζημί ιάνηονεξ 107

108 ηαεανίζηδηακ ιε ζθαζνίδζα κζηεθίμο, υπςξ αηνζαχξ ηαζ ηα ηφηηανα πμο ελέθναγακ Κ οπμδμπείξ. ηδ ζοκέπεζα ηα ηθάζιαηα ηςκ ζηδθχκ κζηεθίμο ακαθφεδηακ ιε SDS PAGE ηαζ ζηφπςια western ηαζ ηα απμηεθέζιαηα θαίκμκηαζ ζηδκ εηθόλα 38. A B Γ Δ Δηθόλα 38. Αλάιπζε κε ζηύπσκα western (Α, Β) θαη SDS PAGE (Γ, Γ) ησλ θιαζκάησλ ηεο ρξσκαηνγξαθίαο ζπγγέλεηαο ηόλησλ ληθειίνπ κε ηα δηαιπηνπνηεκέλα θύηηαξα Sf9 (Β, Γ) ή ηα κνιπζκέλα ρσξίο αλαζπλδπαζκέλν βαθηιντό δηαιπηνπνηεκέλα θύηηαξα (Α, Γ). 1) Γείηηδξ ΜΒ, 2) ημ ζηφπςια western: P. pastoris α1-6his ECD. ημ SDS PAGE: BSA, 3) Δηποθίζιαηα ηοηηάνςκ, 4) Μεηά ημ πέναζια απυ ζθαζνίδζα Ni-NTA, 5) πθφζδ ιε 50 mm ζιζδαγμθίμο, 6) πθφζδ ιε 100 mm ζιζδαγμθίμο, 7) 1δ έηθμοζδ ιε 1Μ ζιζδαγμθίμο, 8) 2δ έηθμοζδ ιε 1Μ ζιζδαγμθίμο, 9) θαζνίδζα Ni-NTA ιεηά ηζξ εηθμφζεζξ. ηδκ εηθόλα 38 δεκ ακζπκεφμκηαζ γχκεξ ζημ ζηφπςια western, πνάβια ημ μπμίμ επζαεααζχκεζ υηζ μζ γχκεξ πμο πνμέηορακ απυ δείβιαηα ηαεανζζιέκςκ Κ οπμδμπέςκ ηδξ πνμδβμφιεκδξ παναβνάθμο (Γ.1.6.1) ακήηακ πνάβιαηζ ζημκ οπμδμπέα αοηυ. Απυ ηδκ άθθδ ημ SDS PAGE δείπκεζ υηζ ανηεηέξ πνςηεΐκεξ ηςκ ηοηηάνςκ ηαζ ημο ζμφ πνμζημθθήεδηακ ζηα ζθαζνίδζα ζυκηςκ κζηεθίμο ηαηά ημ ζηάδζμ ηδξ πνυζδεζδξ ηαζ εηθμφζηδηακ ζε παιδθέξ ζοβηεκηνχζεζξ ζιζδαγμθίμο ζηα ζηάδζα ηςκ πθφζεςκ ηςκ ζθαζνζδίςκ. 108

109 Γ.6.3. ΑΝΑΛΤΖ ΚΑΗ ΚΑΘΑΡΗΜΟ ΣΟΤ Κ α4β2 ΤΠΟΓΟΥΔΑ ΜΔ ΥΡΧΜΑΣΟΓΡΑΦΗΑ ΜΟΡΗΑΚΟΤ ΑΠΟΚΛΔΗΜΟΤ Σμ ηθάζια ημο Κ α4α2 οπμδμπέα πμο απμιμκχεδηε ιε πνςιαημβναθία ζοββέκεζαξ ζυκηςκ κζηεθίμο, ηαεανίζηδηε πενεηαίνς ηαζ ακαθφεδηε ιε πνςιαημβναθία ορδθήξ πίεζδξ ζε ζηήθδ ιμνζαημφ απμηθεζζιμφ. Δπεζδή ημ Triton πμο πνδζζιμπμζήεδηε ζακ απμννοπακηζηυ απμννμθά πμθφ ζζπονά ζηα 280 nm, δ ακίπκεοζδ ηςκ οπμδμπέςκ δεκ έβζκε ιε αάζδ ηδκ μπηζηή απμννυθδζδ, αθθά ηδκ εζδζηή πνυζδεζδ 3 Ζ-επζααηζδίκδξ ζηα ηθάζιαηα ηδξ ζηήθδξ. Γζα ηδκ εηηίιδζδ ημο ιμνζαημφ αάνμοξ ημο ηαεανζζιέκμο οπμδμπέα, έβζκε ζφβηνζζδ ημο υβημο έηθμοζδξ ημο οπμδμπέα ιε ημοξ ακηίζημζπμοξ υβημοξ έηθμοζδξ πνςηεσκχκ-πνμηφπςκ ιε βκςζηά ιμνζαηά αάνδ υπςξ ακαθένμκηαζ ζηζξ μδδβίεξ ηδξ ηαηαζηεοάζηνζαξ εηαζνίαξ. Δπζπθέμκ, βζα μνευηενδ εηηίιδζδ ημο ιμνζαημφ αάνμοξ ηςκ ημνοθχκ πμο εα πνμέηοπηακ, απυ ηδ ζηήθδ πμο πνδζζιμπμζήεδηε, πέναζε δείβια οπμδμπέα ιοσημφ ηφπμο οπμδμπέα, πανυιμζμο ιμνζαημφ αάνμοξ (290 ηda), ναδζμεπζζδιαζιέκμο ιε 125 Η. Οζ ιεηνήζεζξ πανζζηάκμκηαζ ζημ δζάβναιια ηδξ εηθόλαο 39. Δηθόλα 39. Υξσκαηνγξάθεκα Κ α4β2 ππνδνρέα εθινπζκέλνπ από ζθαηξίδηα ηόλησλ ληθειίνπ. Δηθμοζιέκμξ οπμδμπέαξ απυ ζθαζνίδζα ζυκηςκ κζηεθίμο ηαεανίζηδηε πενεηαίνς ηαζ ακαθφεδηε ιε πνςιαημβναθία ιμνζαημφ απμηθεζζιμφ, ιε ζηήθδ Superose 6. Γείβιαηα απυ ηα ηθάζιαηα ηδξ ζηήθδξ ακαθφεδηακ ιε πνυζδεζδ 3 Ζ-επζααηζδίκδξ. ημ δζάβναιια πανζζηάκμκηαζ μζ Κ/Λ ζημκ υβημ έηθμοζδξ, πμο ακηζζημζπμφκ ζε ηάεε ηθάζια ηδξ ζηήθδξ πμο ιεηνήεδηε. Σα αέθδ δείπκμοκ ημκ υβημ πμο εηθμφζηδηε μ 125 Η-ζδιαζιέκμξ ιοσηυξ οπμδμπέαξ (290 KDa) ηαεχξ επίζδξ ηαζ ημοξ πνυηοπμοξ υβημοξ έηθμοζδξ ηςκ πνςηεσκχκ εονεμζθαζνίκδ (669 kda) ηαζ αυεζμξ αθαμοιίκδ (67 kda) απυ GE Healthcare, Instructions AF. 109

110 Όπςξ θαίκεηαζ ζηδκ εηθόλα 39 μ Κ α4α2 οπμδμπέαξ εηθμφζηδηε ζε υβημ έηθμοζδξ 15 ml, ζοιααηυ ιε ημ οπμθμβζζιέκμ ΜΒ (210 kda), ιε αάζδ ηζξ αθθδθμοπίεξ ηςκ αιζκμλέςκ. Σμ βεβμκυξ αοηυ, ιαγί ιε ημ δεδμιέκμ ηδξ πνυζδεζδξ επζααηζδίκδξ ηαζ άθθςκ πνμζδεηχκ, απμηεθεί ζζπονή έκδεζλδ υηζ μζ ηαοηυπνμκα εηθναγυιεκεξ ζηα ηφηηανα α4 ηαζ α2 οπμιμκάδεξ ζοβηνυηδζακ θεζημονβζημφξ α4α2 οπμδμπείξ. ηδ ζοκέπεζα, δείβιαηα ημο ηθάζιαημξ # 15 ακαθφεδηακ ιε SDS PAGE ηαζ ζηφπςια western δίκμκηαξ ηδκ εηθόλα 40. Δηθόλα 40. Αλάιπζε απνκνλσκέλνπ θαη θαζαξηζκέλνπ K α4β2 ππνδνρέα κε SDS PAGE (A) θαη ζηύπσκα western (B). Απμιμκςιέκμξ ηαζ ηαεανζζιέκμξ K α4α2 οπμδμπέαξ απυ ημ ηθάζια #15 ηδξ ζηήθδξ ιμνζαημφ απμηθεζζιμφ, ακαθφεδηε ιε SDS PAGE (A) ηαζ ζηφπςια western (B). Ο οπμδμπέαξ πανμοζζάζηδηε πμθφ ηαεανυξ ιε ηζξ δομ δζαηνζηέξ πνςηεσκζηέξ γχκεξ μζ μπμίεξ ακηζζημζπμφζακ ζηζξ α4 ηαζ α2 οπμιμκάδεξ. ηδκ εηθόλα 40 μ α4α2 οπμδμπέαξ θαίκεηαζ απμιμκςιέκμξ ηαζ ηαεανζζιέκμξ ζε ιεβάθμ ααειυ, ειθακίγμκηαξ δομ δζαηνζηέξ πνςηεσκζηέξ γχκεξ, μζ μπμίεξ ακηζζημζπμφκ ζηζξ α4 ηαζ α2 οπμιμκάδεξ. Ζ ζοβηέκηνςζδ οπμδμπέα ζημ ηθάζια #15 πνμζδζμνίζηδηε ιε ηδ ιέεμδμ Bradford ηαζ δ ζοκμθζηή απυδμζδ οπμθμβίζηδηε ζηα 0,1 mg ηαεανζζιέκμο οπμδμπέα / L ηαθθζένβεζαξ. 110

111 Γ.7. ΔΚΦΡΑΖ ΣΟ ΕΤΜΟΜΤΚΖΣΑ Pichia pastoris Γ.7.1. ΤΠΟΚΛΧΝΟΠΟΗΖΖ ΣΧΝ cdna ΑΠΟ ΣΟ ΠΛΑΜΗΓΗΟ ptriex-3 Neo ΣΟ ppic9 Γζα κα βίκεζ οπμηθςκμπμίδζδ ηςκ cdna ηςκ α4 ηαζ α2, ΑΣ ηαζ K οπμιμκάδςκ ημο οπμδμπέα ζημ πθαζιίδζμ ppic9, ηα ακαζοκδοαζιέκα πθαζιίδζα ptriex-3 neo οπέζηδζακ ηαοηυπνμκδ πέρδ ιε ηα πενζμνζζηζηά έκγοια EcoRV ηαζ Bsu36I. Σμ πθαζιίδζμ πνμμνζζιμφ ppic9 οπέζηδ ηαοηυπνμκδ πέρδ ιε ηα πενζμνζζηζηά έκγοια BamHI ηαζ EcoRI. Αημθμφεδζε δθεηηνμθυνδζδ ηςκ πνμσυκηςκ πέρδξ ζε πήηηςια αβανυγδξ (εηθόλα 41) Δηθόλα 41. Ζθεηηνμθυνδζδ ηςκ πνμσυκηςκ ηδξ πέρδξ ηςκ ακαζοκδοαζιέκςκ ptriex-3 neo πθαζιζδίςκ. Σα πθαζιίδζα ptriex-3 neo ακαζοκδοαζιέκα ιε ηζξ οπμιμκάδεξ ημο οπμδμπέα οπέζηδζακ πέρδ ιε EcoRV ηαζ Bsu36I. Πθαζιίδζμ ppic9, οπέζηδ πέρδ ιε ηα πενζμνζζηζηά έκγοια BamHI ηαζ EcoRI. 1) Μάνηοναξ ΜΒ, 2) ΑΣ α4, 3) ΑΣ α2, 4) Κ α4, 5) Κ α2, 6) ppic9. ηδ ζοκέπεζα μζ γχκεξ ηςκ απμημιιέκςκ cdna ηςκ οπμιμκάδςκ ηαεχξ ηαζ ημο ημιιέκμο ppic9 αθαζνέεδηακ απυ ημ πήηηςια αβανυγδξ ηαζ ημ DNA πμο πενζείπακ απμιμκχεδηε. Αημθμφεδζε δ δδιζμονβία ηοθθχκ άηνςκ ζηα βναιιζηά πθέμκ cdna ηυζμ ηςκ οπμιμκάδςκ υζμ ηαζ ημο ημιιέκμο ppic9 ιε απχηενμ ζημπυ ηδκ έκςζή ημοξ ιε ακηίδναζδ θζβάζδξ. Γζα ηδκ ελαζθάθζζδ ηδξ επζηοπίαξ ηδξ ακηίδναζδξ ημ ημιιέκμ ppic9 ςξ θμνέαξ ηθςκμπμίδζδξ οπέζηδ απμθςζθμνοθίςζδ βζα ηδκ απμηνμπή ηοηθμπμίδζήξ ημο πςνίξ κα έπεζ πνμζθάαεζ DNA. Μεηά απυ ηαεανζζιυ 111

112 υθςκ ηςκ ηιδιάηςκ DNA αημθμφεδζε δ ζφκδεζδ ηςκ cdna ηςκ οπμιμκάδςκ ιε ηoκ ppic9 ιε ακηίδναζδ θζβάζδξ. Σμ ιείβια ηδξ ακηίδναζδξ πνδζζιμπμζήεδηε απεοεείαξ βζα ιεηαζπδιαηζζιυ επζδεηηζηχκ ααηηδνίςκ ηα μπμία δδιζμφνβδζακ απμζηίεξ. Γζα 24 απμζηίεξ απυ ηάεε ακηίδναζδ ακαζοκδοαζιμφ cdna- ppic9 έβζκακ ηαθθζένβεζεξ ηςκ 5 ml ενεπηζημφ, απυ ηζξ μπμίεξ ζηδ ζοκέπεζα έβζκε πθαζιζδζαηή απμιυκςζδ. Αημθμφεδζε έθεβπμξ βζα ααηηδνζαημφξ ηθχκμοξ ιε μνεά ακαζοκδοαζιέκα ppic9, δδθαδή αοηά ζηα μπμία ηα cdna είπακ εκζςιαηςεεί ιε ημ ζςζηυ πνμζακαημθζζιυ (εηθόλα 42). Ο έθεβπμξ έβζκε ιε πέρδ ηςκ απμιμκςιέκςκ πθαζιζδίςκ ιε BglII βζα ηα α4-ppic9 ηαζ HindIII βζα ηα α2-ppic9. Ζ δθεηηνμθυνδζδ ηςκ πνμσυκηςκ ηςκ ακηζδνάζεςκ πέρδξ πενζβνάθμκηαζ ζηζξ εηθόλεο 42 ηαζ 43. Δηθόλα 42. Γζάηνζζδ ηςκ μνεά απυ ηα ακάζηνμθα ακαζοκδοαζιέκα πθαζιίδζα ppic9. πεδζάβναιια ημο ηνυπμο ιε αάζδ ημκ μπμίμ έβζκε δ δζάηνζζδ ηςκ μνεά (Α) απυ ηα ακάζηνμθα (Β) ακαζοκδοαζιέκςκ πθαζιζδίςκ ppic9. Μζα εκδμκμοηθεάζδ πενζμνζζιμφ έημρε ηα ακαζοκδοαζιέκα πθαζιίδζα ζε ηνία ζδιεία, εη ηςκ μπμίςκ ημ έκα ιέζα ζηδκ πενζμπή ηςκ πνμξ έηθναζδ α4 ηαζ α2 cdna. Αημθμφεδζε δθεηηνμθυνδζδ ζηδκ μπμία ηα μνεά απυ ηα ακάζηνμθα ακαζοκδοαζιέκα πθαζιίδζα ppic9 λεπχνζζακ δίκμκηαξ δζαθμνεηζηά ιμηίαα ιπακηχκ. 112

113 Δηθόλα 43. Ζθεηηνμθυνδζδ ηςκ πνμσυκηςκ πέρδξ βζα ηδκ δζάηνζζδ ηςκ μνεχξ ακαζοκδοαζιέκςκ AT α4-ppic9 (ανζζηενά) ηαζ AT α2-ppic9 (δελζά). Σα μνεχξ ακαζοκδοαζιέκα πθαζιίδζα AT α4-ppic9 (δείβιαηα 2, 6, 10, 11, 12) έπνεπε κα δχζμοκ γχκεξ ηςκ 5,9 kbp, 3 kbp ηαζ 1,8 kbp εκχ ηα μνεχξ ακαζοκδοαζιέκα πθαζιίδζα AT α2-ppic9 (δείβιαηα 2, 4, 5, 8) έπνεπε κα δχζμοκ γχκεξ 7,1 kbp, 1,8 kbp ηαζ 0,2 kbp. Σα οπυθμζπα δείβιαηα ήηακ ακαζοκδοαζιέκα ιε ακηίεεημ πνμζακαημθζζιυ ή βεκζηυηενα ιε ηνυπμ εθαηηςιαηζηυ. Ζ δθεηηνμθυνδζδ ηςκ πνμσυκηςκ ηςκ ακηζδνάζεςκ πέρδξ ζηδκ εηθόλα 43 έδεζλε ηζξ απμζηίεξ πμο ήηακ ιεηαζπδιαηζζιέκεξ ιε μνεχξ ακαζοκδοαζιέκα πθαζιίδζα. Με αάζδ ηα απμηεθέζιαηα αοηά επζθέπεδηε έκαξ ααηηδνζαηυξ ηθχκμξ βζα ηάεε έκα μνεχξ ακαζοκδοαζιέκμ ppic9 ιε ηα cdnas ηςκ ΑΣ ηαζ Κ, α4 ηαζ α2 οπμιμκάδςκ ημο οπμδμπέα. Απυ ημοξ ααηηδνζαημφξ ηθχκμοξ παναζηεοάζηδηακ ηα ακηίζημζπα πθαζιίδζα ζε ηθίιαηα MaxiPrep. ηδ ζοκέπεζα, ηα ακαζοκδοαζιέκα πθαζιίδζα ppic9 οπέζηδζακ πέρδ ιε ημ πενζμνζζηζηυ έκγοιμ PmeI πνμηεζιέκμο κα βίκμοκ βναιιζηά, ηαηαθθδθυηενα βζα ημκ ιεηαζπδιαηζζιυ γοιμιοηήηςκ. Ο ιεηαζπδιαηζζιυξ έβζκε ζε επζδεηηζημφξ γοιμιφηδηεξ Pichia pastoris ημο ηθχκμο GS115 ιε ηδ ιέεμδμ ηδξ δθεηηνμδζάηνδζδξ ηαζ αημθμφεδζε επίζηνςζδ ζε ηνοαθία RDB βζα κα ακαπηοπεμφκ απμζηίεξ ιεηαζπδιαηζζιέκςκ γοιμιοηήηςκ. 113

114 Γ.7.2. ΔΛΔΓΥΟ ΜΔΣΑΥΖΜΑΣΗΜΔΝΧΝ ΑΠΟΗΚΗΧΝ P. pastoris ΓΗΑ ΔΚΦΡΑΖ α4β2 ΤΠΟΓΟΥΔΧΝ Γζα κα δζαπζζηςεεί πμζεξ ιεηαζπδιαηζζιέκεξ απμζηίεξ P. pastoris εηθνάγμοκ ηαζ ηζξ δομ οπμιμκάδεξ ηςκ οπμδμπέςκ, ηαεχξ επίζδξ ηαζ βζα κα επζθεβμφκ αοηέξ μζ απμζηίεξ πμο εηθνάγμοκ πενζζζυηενμ, πζμ θεζημονβζημφξ οπμδμπείξ, έβζκε έθεβπμξ ηςκ απμζηζχκ βζα πνυζδεζδ 3 Ζ-επζααηζδίκδξ ηαζ έηζζ επεθέβδζακ ηοπαία 20 απμζηίεξ βζα ηάεε ακαζοκδοαζιέκμ οπμδμπέα. Δηθόλα 44. Έιεγρνο κεηαζρεκαηηζκέλσλ απνηθηώλ P. pastoris γηα έθθξαζε α4β2 ππνδνρέα. 100 ιl ηαθθζένβεζαξ απυ ηάεε απμζηία θοβμηεκηνήεδηακ ηαζ ημ ίγδια επςάζηδηε ιε 3 Ζ-επζααηζδίκδ Κ/Λ. Μεηά απυ πθφζεζξ ιεηνήεδηε δ πνμζδειέκδ ναδζεκένβεζα. ημ δζάβναιια πανζζηάκμκηαζ μζ Κ/Λ πμο έδςζε ηάεε απμζηία έπμκηαξ αθαζνεεεί μζ ναδζεκενβέξ ηνμφζεζξ οπμαάενμο πμο δίκμοκ ίζεξ πμζυηδηεξ απυ ιδ ιεηαζπδιαηζζιέκα γοιμηφηηανα. 114

115 ηδκ εηθόλα 44 θαίκεηαζ υηζ υθεξ μζ απμζηίεξ πμο εθέβπεδηακ έδςζακ ζδιακηζηυ ανζειυ ναδζεκενβχκ ηνμφζεςκ πςνίξ κα παναηδνείηαζ ιεβάθδ απυηθζζδ ιεηαλφ ηςκ απμζηζχκ. Με αάζδ ημ δζάβναιια αοηυ επζθέπεδηακ μζ απμζηίεξ #2 βζα ημκ ΑΣ οπμδμπέα ηαζ δ #8 βζα ημκ Κ, μζ μπμίεξ έδςζακ ηζξ πενζζζυηενεξ ναδζεκενβέξ ηνμφζεζξ ηαζ ηα πεζνάιαηα ζοκεπίζηδηακ ιε αοηέξ. Γ.7.3. ΑΝΗΥΝΔΤΖ ΣΧΝ α4β2 ΤΠΟΓΟΥΔΧΝ ΔΚΦΡΑΜΔΝΧΝ Δ P. pastoris ΜΔ ΣΤΠΧΜΑ WESTERN Γζα ιζα εηηίιδζδ ηςκ επζπέδςκ έηθναζδξ ζημκ γοιμιφηδηα P. pastoris ηςκ ΑΣ ηαζ Κ εηθναγυιεκςκ οπμδμπέςκ, ηαεχξ ηαζ βζα ημκ πνμζδζμνζζιυ ηςκ ιμνζαηχκ αανχκ ηςκ οπμιμκάδςκ ημοξ, δείβιαηα απυ δζάθμνεξ απμζηίεξ ιεηαζπδιαηζζιέκςκ γοιμιοηήηςκ, μζ μπμίεξ ελέθναγακ α4α2 οπμδμπέα δζαθοημπμζήεδηακ ιε SDS PAGE δζάθοια θυνηςζδξ, αθμφ πνχηα έζπαζε ημ ηοηηανζηυ ημοξ ημίπςια ιε ζθαζνίδζα οάθμο. Αημθμφεδζε SDS PAGE, δθεηηνμιεηαθμνά ζε ιειανάκδ ηαζ επχαζδ ιε ακηζ- 5His mab. Σα απμηεθέζιαηα θαίκμκηαζ ζηδκ εηθόλα

116 Δηθόλα 45. Αλίρλεπζε α4β2 ππνδνρέα εθθξαζκέλν ζε Pichia pastoris κε ζηύπσκα western. Γείβιαηα 15 ιg απυ δζάθμνεξ απμζηίεξ ιεηαζπδιαηζζιέκςκ P. pastoris (ηα κμφιενα ηςκ μπμίςκ θαίκμκηαζ ζηδκ εζηυκα) ηαζ ιδ ιεηαζπδιαηζζιέκςκ γοιμιοηήηςκ (GS 115), πμο ελέθναγακ AT οπμδμπέα (πάκς) ή Κ οπμδμπέα (ηάης) δζαθοημπμζήεδηακ ιε δζάθοια θυνηςζδξ SDS PAGE, αθμφ πνχηα έζπαζε ημ ηοηηανζηυ ημοξ ημίπςια ιε ζθαζνίδζα οάθμο. Αημθμφεδζε SDS PAGE, δθεηηνμιεηαθμνά ζε ιειανάκδ PVDF ηαζ επχαζδ ιε ακηζ-5his mab. Χξ εεηζηυξ ιάνηοναξ πνδζζιμπμζήεδηε ίζδ πμζυηδηα δζαθοημπμζδιέκςκ ηοηηάνςκ Sf9 ιμθοζιέκα ιε Κ α2 ακαζοκδοαζιέκμοξ ααηζθμσμφξ (Κ α2 Sf9). ηδκ εηθόλα 45 δ ακίπκεοζδ ηςκ οπμιμκάδςκ ημο οπμδμπέα ιε ζηφπςια western δεκ έβζκε δοκαηή ζημ γοιμιφηδηα P. pastoris, πζεακυηαηα θυβς πμθφ ιζηνχκ επζπέδςκ έηθναζδξ. Σμ υηζ ελακηθήεδηακ υθα ηα δοκαηά πενζεχνζα πμζυηδηαξ δείβιαημξ, ζοβηέκηνςζδξ mab ηαζ πνυκμο επχαζδξ ιε ημ δζάθοια ειθάκζζδξ, βζα ηδκ ακίπκεοζδ ηςκ οπμιμκάδςκ ημο οπμδμπέα, θαίκεηαζ απυ ηζξ πμθφ έκημκεξ γχκεξ πμο δίκμοκ ηα δείβιαηα Κ α2 Sf9, ηα μπμία έηνελακ ςξ εεηζημί ιάνηονεξ. 116

117 Δcpm Γ.7.4. ΤΓΚΡΗΖ ΔΚΦΡΑΖ α4β2 ΤΠΟΓΟΥΔΧΝ Δ P. pastoris ΚΑΗ ΚΤΣΣΑΡΑ Sf9 Γζα κα ζοβηνζεεί μ γοιμιφηδηαξ P. pastoris ιε ημκ ααηζθμσυ ςξ πνμξ ηα επίπεδα έηθναζδξ ημο οπμδμπέα, επςάζηδηακ ίδζεξ ιάγεξ ηοηηάνςκ ηαζ απυ ηα δομ ζοζηήιαηα έηθναζδξ ιε 3 Ζ-επζααηζδίκδ. Μεηά απυ πθφζεζξ ιεηνήεδηακ μζ πνμζδειέκεξ ναδζεκενβέξ ηνμφζεζξ ηαζ ζοβηνίεδηακ ζημ δζάβναιια ηδξ εηθόλαο Sf9 ΑΣ Sf9 Κ P. pastoris AT P. pastoris Κ Μάζα κυττάρων (μg) Δηθόλα 46. ύγθξηζε κεηαζρεκαηηζκέλσλ απνηθηώλ P. pastoris κε θύηηαξα Sf9 σο πξνο ηελ έθθξαζε ΑΣ θαη Κ α4β2 ππνδνρέσλ. Ίζεξ ιάγεξ ηοηηάνςκ εκηυιςκ ηαζ γφιδξ επςάζηδηακ ιε 3 Ζ-επζααηζδίκδ ηνμφζεςκ/θεπηυ ηαζ ιεηά απυ πθφζεζξ ιεηνήεδηε δ πνμζδειέκδ ναδζεκένβεζα. ημ δζάβναιια πανζζηάκμκηαζ μζ Κ/Λ πμο έδςζε ηάεε πμζυηδηα, ηάεε ιμνζαηήξ ηαηαζηεοήξ, απυ ηάεε ζφζηδια έηθναζδξ. Απυ ημ δζάβναιια ηδξ εηθόλαο 46 πνμηφπηεζ υηζ δ πνυζδεζδ 3 Ζ-επζααηζδίκδξ ζε οπμδμπείξ εηθναζιέκμοξ ζημ γοιμιφηδηα είκαζ ζαθχξ ιζηνυηενδ ζε ζπέζδ ιε ημοξ ίδζμοξ οπμδμπείξ εηθναζιέκμοξ ζε ίδζα ιάγα απυ ηφηηανα εκηυιςκ. Σμ βεβμκυξ αοηυ οπμδεζηκφεζ είηε θζβυηενδ έηθναζδ οπμδμπέςκ είηε παιδθυηενδξ πμζυηδηαξ δμιή, είηε ηαζ ηα δομ. 117

118 Διαλυτοποίηςη % Γ.7.5. ΠΔΗΡΑΜΑΣΑ ΓΗΑΛΤΣΟΠΟΗΖΖ ΣΧΝ α4β2 P. pastoris ΤΠΟΓΟΥΔΧΝ Γζα ζφβηνζζδ ημο ααειμφ δζαθοημπμίδζδξ ηςκ ΑΣ ηαζ Κ α4α2 οπμδμπέςκ πμο εηθνάζηδηακ ζε P. pastoris, ιε ημκ ακηίζημζπμ ααειυ δζαθοημπμίδζδξ ηςκ ίδζςκ οπμδμπέςκ εηθναζιέκςκ ζε ηφηηανα εκηυιςκ, δζαθοημπμζήεδηακ ιε Triton 1% ιεηαζπδιαηζζιέκα γοιμηφηηανα, αθμφ πνχηα ημ ηοηηανζηυ ημοξ ημίπςια έζπαζε ιε ζθαζνίδζα οάθμο. Μεηά απυ θοβμηέκηνδζδ έβζκε filter assay ζημ οπενηείιεκμ ηαζ πνμζδζμνίζηδηε μ ααειυξ δζαθοημπμίδζδξ ηςκ οπμδμπέςκ (εηθόλα 47). P. pastoris Βακιλοϊόσ ΑΣ Κ Δηθόλα 47. ύγθξηζε δηαιπηνπνίεζεο ιεηηνπξγηθώλ ππνδνρέσλ κε Triton 1% εθθξαζκέλσλ ζε δπκνκύθεηα P. pastoris θαη θύηηαξα εληόκσλ. P. pastoris πμο ελέθναγακ ΑΣ ή Κ α4α2 οπμδμπείξ ζοβηνίεδηακ ςξ πνμξ ημ πμζμζηυ δζαθοημπμίδζδξ ιε ηφηηανα εκηυιςκ ηα μπμία ελέθναγακ ημοξ ίδζμοξ οπμδμπείξ. Ζ δζαθοημπμίδζδ έβζκε ιε δζάθοια PBS/ Triton 1%, αθμφ πνχηα ημ ηοηηανζηυ ημίπςια έζπαζε ιε ζθαζνίδζα οάθμο ηαζ αημθμφεδζε επζζήιακζδ ιε 3 Ζ-επζααηζδίκδ. Μεηά απυ θοβμηέκηνδζδ έβζκε filter assay ζημ οπενηείιεκμ ηαζ δ δζαθοημπμίδζδ πνμζδζμνίζηδηε % ιε αάζδ ημ πμζμζηυ ηςκ ηνμφζεςκ ημο δζαθοημπμζδιέκμο οπμδμπέα ζημ οπενηείιεκμ, επί ηςκ ζοκμθζηχκ ηνμφζεςκ ζε οπενηείιεκμ ηαζ ίγδια. Όπςξ θαίκεηαζ ζηδκ εηθόλα 47 μ ααειυξ δζαθοημπμίδζδξ ηςκ οπμδμπέςκ ζηδ γφιδ ήηακ πμθφ ιζηνυηενμξ ζε ζπέζδ ιε ημοξ ίδζμοξ οπμδμπείξ εηθναζιέκμοξ ζε ηφηηανα Sf9. Οπυηε ηαζ ιε αοηά ηα απμηεθέζιαηα δ πνήζδ ημο γοιμιφηδηα P. pastoris βζα ηδκ έηθναζδ ηςκ ΑΣ ηαζ Κ α4α2 οπμδμπέςκ εβηαηαθείθεδηε. 118

119 Γ.8. ΔΚΦΡΑΖ Δ ΚΤΣΣΑΡΑ ΔΝΣΟΜΧΝ ΣΟΤ ΑΝΘΡΧΠΗΝΟΤ α1 ECD α1 ECD εηθναζιέκμ ζε ιυκζια ιεηαζπδιαηζζιέκα ηφηηανα εκηυιςκ (i-α1-ecd) (ηαθθζένβεζα 1L) απμιμκχεδηε ηαζ ηαεανίζηδηε ιε πνςιαημβναθία ζοββέκεζαξ ζυκηςκ κζηεθίμο ηαζ ιμνζαημφ απμηθεζζιμφ. Σμ ηεθεοηαίμ πνςιαημβνάθδια ημο i-α1- ECD έδςζε ιζα ημνοθή ζζπονήξ έκηαζδξ ιε ιεβάθδ ζηακυηδηα πνυζδεζδξ 125 Η-α- Μπμοβηανμημλίκδξ ( 125 Η-α-ΒΣΥ), ζοιααηή ιε ημ ιμνζαηυ ημο αάνμξ, υπςξ αοηυ οπμθμβίγεηαζ ιε αάζδ ηδκ πνςημηαβή ημο δμιή (32 kda) (εηθόλα 48). Δηθόλα 48. Υξσκαηνγξαθία κνξηαθνύ απνθιεηζκνύ ηνπ i-α1-ecd. i-α1-ecd εηθναζιέκμ απυ ηαθθζένβεζα ηοηηάνςκ εκηυιςκ 1L απμιμκχεδηε ηαζ ηαεανίζηδηε ιε πνςιαημβναθία ζοββέκεζαξ ζυκηςκ κζηεθίμο ηαζ ζηδ ζοκέπεζα ηαεανίζηδηε-ακαθφεδηε πενεηαίνς ιε πνςιαημβναθία ιμνζαημφ απμηθεζζιμφ. ημ πνςιαημβνάθδια πανζζηάκμκηαζ μζ ηζιέξ μπηζηήξ απμννυθδζδξ (Α 280 ) ηαεχξ ηαζ μζ ηνμφζεζξ 125 Η-α-ΒΣΥ πμο πνμζδέεδηακ ζε 20 ιl δείβιαημξ απυ ηάεε ηθάζια 1 ml ηδξ ζηήθδξ. Δπίζδξ ιε αέθδ επζζδιαίκμκηαζ ηαζ μζ υβημζ υπμο εηθμφμκηαζ πνςηεΐκεξ βκςζηχκ ιμνζαηχκ αανχκ. ηδ ζοκέπεζα ημ i-α1-ecd ιαγί ιε α1 ECD εηθναζιέκμ ζε γοιμιφηδηα P. pastoris, (y-α1-ecd) απμιμκςιέκμ ηαζ ηαεανζζιέκμ ιε ημκ ίδζμ ηνυπμ, δθεηηνμθμνήεδηακ ηαζ ακαθφεδηακ ιε πνχζδ coomassie ηαζ ιε ζηφπςια western. Καζ ιε ηζξ δομ ηεπκζηέξ ημ i-α1-ecd έδςζε ηαθφηενδ εζηυκα ζε ζπέζδ ιε ημ y-α1-ecd, απυ ηδκ μπμία πνμέηορε απυθοηα μιμζμβεκέξ, ιε ιζα πμθοπεπηζδζηή αθοζίδα πςνίξ ζδιάδζα πνςηευθοζδξ (εηθόλα 49). 119

120 Δηθόλα 49. Αλάιπζε θαη ζύγθξηζε ησλ i-α1-ecd θαη y-α1-ecd κε SDS PAGE (Α) θαη ζηύπσκα western(β). ε (Α) ηαζ (Β): 1) Μάνηοναξ ΜΒ 2) y-α1-ecd 3) i-α1-ecd. Δπζπθέμκ ημ i-α1-ecd οπμαθήεδηε ζε ακάθοζδ ηοηθζημφ δζπνςσζιμφ (CD) βζα ημκ πνμζδζμνζζιυ ηδξ πμζυηδηαξ ηδξ δεοηενμηαβμφξ ημο δμιήξ. Ζ ακάθοζδ ημο θάζιαημξ έδεζλε υηζ δ δεοηενμηαβήξ ημο δμιή απμηεθείηε απυ 40% α-θφθθα, 8% α-έθζηα, 22% α- ζηνμθέξ ηαζ 30% ιδ μνβακςιέκμ πμζμζηυ. οβηνίκμκηαξ ηδ δεοηενμηαβή δμιή ημο i- α1-ecd ιε αοηή ημο y-α1-ecd (Zouridakis et al. 2007) ημ πνχημ ανέεδηε κα έπεζ δζπθάζζμ πμζμζηυ α-έθζηαξ ηαζ ακηίζημζπα ιζηνυηενμ ιδ μνβακςιέκμ πμζμζηυ (ηαηά 4%) (εηθόλα 50). Δηθόλα 50. Αλάιπζε θπθιηθνύ δηρξστζκνύ (CD) ηνπ i-α1-ecd. Σμ i-α1-ecd οπμαθήεδηε ζε CD βζα ημκ πνμζδζμνζζιυ ηδξ πμζυηδηαξ ηδξ δεοηενμηαβμφξ ημο δμιήξ. Γζα κα ζοβηνζεμφκ ιεηαλφ ημοξ ηα i-α1-ecd ηαζ y-α1-ecd ηυζμ ςξ πνμξ ηδκ ζηακυηδηά ημοξ κα δεζιεφμοκ ακηζ-nachr αοηυ-ακηζζχιαηα απυ ημκ μνυ ιοαζεεκχκ, 120