Μελέηες επί ηες δομής και λειηοσργίας πρωηεϊνικών σπομονάδων ηοσ ριβονοσκλεοπρωηεϊνικού ζσμπλόκοσ ηες ριβονοσκλεάζες Ρ από ηο Dictyostelium discoideum

Transcript

1 ΠΑΝΔΠΙΣΗΜΙΟ ΠΑΣΡΩΝ ΥΟΛΗ ΔΠΙΣΗΜΩΝ ΤΓΔΙΑ ΣΜΗΜΑ ΙΑΣΡΙΚΗ ΠΡΟΓΡΑΜΜΑ ΜΔΣΑΠΣΤΥΙΑΚΩΝ ΠΟΤΓΩΝ ΣΙ ΒΑΙΚΔ ΙΑΣΡΙΚΔ ΔΠΙΣΗΜΔ ΣΟΜΕΑ ΒΑΙΚΩΝ ΙΑΣΡΙΚΩΝ ΕΠΙΣΗΜΩΝ Ι ΕΡΓΑΣΗΡΙΟ ΒΙΟΛΟΓΙΚΗ ΧΗΜΕΙΑ Μελέηες επί ηες δομής και λειηοσργίας πρωηεϊνικών σπομονάδων ηοσ ριβονοσκλεοπρωηεϊνικού ζσμπλόκοσ ηες ριβονοσκλεάζες Ρ από ηο Dictyostelium discoideum ΓΙΓΑΚΣΟΡΙΚΗ ΓΙΑΣΡΙΒΗ ΒΑΙΛΙΚΗ ΣΑΜΑΣΟΠΟΤΛΟΤ ΒΙΟΧΗΜΙΚΟ & ΒΙΟΣΕΧΝΟΛΟΓΟ ΠΑΣΡΑ 2010

2

3

4

5

6 ΠΡΟΛΟΓΟ Δ εηπυκδζδ ιζαξ δζδαηημνζηήξ δζαηνζαήξ απμηεθεί ιία απυ ηζξ πζμ ζπμοδαίεξ πενζυδμοξ ζηδ γςή εκυξ ενεοκδηή, ηαηά ηδκ μπμία δέπεηαζ ηυζμ επζζηδιμκζηή, υζμ ηαζ πκεοιαηζηή ηαζ δεζηή εηπαίδεοζδ. ηα πθαίζζα, θμζπυκ, ηδξ δζαιυνθςζδξ ημο επζζηδιμκζημφ ιμο ήεμοξ ήηακ πμθφ ζδιακηζηή δ ζοιαμθή ηαζ δ πανμοζία μνζζιέκςκ ακενχπςκ, ημοξ μπμίμοξ εα ήεεθα, ζηζξ θίβεξ αοηέξ παναβνάθμοξ, κα εοπανζζηήζς. Πνχηα απυ υθμοξ, εα ήεεθα κα εοπανζζηήζς ημκ Καεδβδηή ιμο, Αζμκφζζμ ΑναΎκα, βζα ηδκ άνηζα επζζηδιμκζηή ηαεμδήβδζή ημο. Θα ημο είιαζ πάκηα εοβκχιςκ βζα ηδκ απυθοηδ ειπζζημζφκδ πμο ιμο έδεζλε, ηυζμ ςξ άκενςπμ, υζμ ηαζ ςξ ζοκενβάηζδα ηαζ ενεοκήηνζα. Αε εα πνέπεζ κα παναθείρς κα ακαθένς ηδκ εζθζηνζκή ακηζιεηχπζζδ ηαζ ηδκ δεζηή οπμζηήνζλδ, πμο βεκκαζυδςνα ιμο επέδεζλε ηα έλζ πνυκζα ηδξ ζοκενβαζίαξ ιαξ. Θα έπς ζοκεπχξ ζημ κμφ ιμο ηζξ πμθφηζιεξ ζοιαμοθέξ ημο. Βοπανζζηχ ημκ Καεδβδηή Αδιήηνζμ Καθπαλή βζα ηδκ πνμεοιία ημο κα ιε ζοιαμοθεφζεζ, ηάεε θμνά πμο πνεζαγυιμοκ ηδκ επζζηδιμκζηά πθήνςξ ηαηανηζζιέκδ άπμρή ημο ηαζ θοζζηά βζα ηδ θζθζηή ηαζ άρμβδ ζοκενβαζία ιαγί ημο. Εδζαίηενα εα ήεεθα κα εοπανζζηήζς ημκ Ώκαπθδνςηή Καεδβδηή Κςκζηακηίκμ ηαευπμοθμ, μ μπμίμξ είκαζ μ άκενςπμξ πμο ιε ιφδζε ζηδκ ένεοκα ηαζ ιε δίδαλε ημκ επζζηδιμκζηυ ηνυπμ ζηέρδξ. Δ μθμηθδνςιέκδ επζζηδιμκζηή ημο οπυζηαζδ, ηαηά ηδ δζάνηεζα ηςκ θμζηδηζηχκ ιμο πνυκςκ, οπήνλε ζδιακηζηή βζα ηδκ αβάπδ πμο απέηηδζα βζα ηδκ αζμπδιεία ηαζ ηδκ ένεοκα βεκζηυηενα. Βπίζδξ, εοπανζζηχ ημκ Καεδβδηή Αζμκφζζμ οκεηυ, ιέθμξ ηδξ επηαιεθμφξ ελεηαζηζηήξ επζηνμπήξ, βζα ηδκ πάκηα εοβεκζηή ηαζ λεπςνζζηή πανμοζία ημο, δ μπμία ήηακ απαναίηδηδ βζα ημ θζθζηυ πενζαάθθμκ πμο ακαπηφπεδηε ζημκ ενβαζζαηυ πχνμ ηαζ ηαη επέηηαζδ ζηδκ εοπάνζζηδ πναβιαημπμίδζδ ηςκ πεζναιάηςκ. Βλ ανπήξ, δ ζοκενβαζία ιε ημκ Ώκαπθδνςηή Καεδβδηή Κονζάημ Κοπναίμ ήηακ ελαζνεηζηή ηαζ εέθς κα ημκ εοπανζζηήζς πμο δέπηδηε κα ζοιιεηάζπεζ ζηδκ επηαιεθή ελεηαζηζηή επζηνμπή. Σαοηυπνμκα, εοπανζζηχ ημκ Ώκαπθδνςηή Καεδβδηή Κςκζηακηίκμ Φθοηγάκδ, ιέθμξ ηδξ επηαιεθμφξ ελεηαζηζηήξ επζηνμπήξ, βζα ημ πνυκμ πμο αθζένςζε δζμνεχκμκηαξ ηδ δζδαηημνζηή δζαηνζαή ιμο. Πμθφηζιδ ηαζ απυθοηα θζθζηή απμδείπεδηε δ ζοκενβαζία ιε ημκ Λέηημνα Ώκδνέα Σγάημ, ημο μπμίμο δ αμήεεζα ήηακ ηαεμνζζηζηή βζα ηδκ αεθηίςζδ ηδξ πανμφζαξ δζαηνζαήξ. Σμο εφπμιαζ, επίζδξ, ηαθή ζοκέπεζα ζημ κέμ ενεοκδηζηυ ημο ένβμ. 5

7 Πεξηερόκελα Αεκ εα ήεεθα κα παναθείρς κα εοπανζζηήζς υθα ηα οπυθμζπα ιέθδ ΑΒΠ, πμο πθαζζζχκμοκ ημκ ημιέα ηδξ ΐζμθμβζηήξ Υδιείαξ, ημο ηιήιαημξ ηδξ Εαηνζηήξ, ηδκ ηα. μθία Ραοημπμφθμο, ημκ η. Γεχνβζμ Νηίκμ, ηδκ ηα. Μανία Μζπεθζκάηδ, ηδκ ηα. Μανβανίηα Εςάκκμο ηαζ ημκ η. Πέηνμ Μάιμ, μζ μπμίμζ απυ ηδκ ανπή ιε ακηζιεηχπζζακ ζακ ζζυηζιμ ιέθμξ ημο ενβαζηδνίμο ηαζ πάκηα είπα, υηακ πνεζαγυιμοκ ηδκ αιένζζηδ αμήεεζά ημοξ. Αε εα ιπμνμφζα κα ιδκ αθζενχζς ιζα λεπςνζζηή πανάβναθμ βζα ηδκ ελαζνεηζηή ζοκενβάηζδα, ημθθδηή ιμο θίθδ ηαζ οπμρήθζα δζδάηημνα, Υνοζαοβή Σμοιπέηδ. Ώπυ ηδκ ανπή ηδξ επαθήξ ιαξ ακαπηφλαιε έκακ ιμκαδζηυ ηνυπμ επζημζκςκίαξ, πμο αμήεδζε πμθφ ζηδκ ακηζιεηχπζζδ, ηυζμ ηςκ ενεοκδηζηχκ, υζμ ηαζ ηςκ πνμζςπζηχκ ακδζοπζχκ ιαξ. Δ πάκηα παιμβεθαζηή θζβμφνα ηδξ απμηεθεί πθέμκ ακαπυζπαζημ ημιιάηζ ηδξ ηαεδιενζκυηδηάξ ιμο, πμο δφζημθα εα απμπςνζζηχ. ηδ Υνοζαοβή, έκα πνάβια εέθς κα ηδξ εοπδεχ: κα ηάκεζ πάκηα ζςζηέξ επζθμβέξ ζηδ γςή ηδξ. Ώκ ηαζ δεκ απμηεθμφκ πθέμκ ιέθδ ημο ενβαζηδνίμο, εα ήεεθα κα εοπανζζηήζς ημοξ δζδάηημνεξ Αήιδηνα Καθαανζγζχηδ ηαζ Ώκαζηάζζμ ΐμονεηά, πάνδ ζημοξ μπμίμοξ ηαηάθενα κα πνμζανιμζηχ βνήβμνα ζημ κέμ ενβαζζαηυ πενζαάθθμκ, ηαεχξ επίζδξ ηαζ ημκ Μίθημ Γενυθοιμ. Εδζαίηενα εέθς κα εοπανζζηήζς ημκ η. ΐμονεηά, αθμφ ελαζηίαξ ηδξ αμήεεζάξ ημο επζηαπφκεδηε δ επζηοπήξ δζεηπεναίςζδ πμθθχκ πεζναιάηςκ ιμο. ηδ δζάνηεζα ηςκ έλζ αοηχκ πνυκςκ, πένα απυ ηδκ ενεοκδηζηή ειπεζνία ηαζ βκχζδ, απέηηδζα ηαζ πμθφηζιμοξ θίθμοξ. Πναβιαηζηυξ ζηαειυξ ηαζ ηδκ εοπανζζηχ βζ αοηυ, απμηέθεζε δ βκςνζιία ιμο ιε ηδκ δζδάηημνα Βθεοεενία ΐνογάηδ, δ μπμία ιαγί ιε ημκ ζφγοβυ ηδξ Άββεθμ Οζημκυιμο, ηαηέπμοκ λεπςνζζηή πζα εέζδ ζηδ γςή ιμο. Μμκαδζηή βζα ιέκα είκαζ ηαζ δ θζθία ιμο ιε ηδκ ιεηαπηοπζαηή θμζηήηνζα Μανία Μπίημο, ηδξ μπμίαξ εφπμιαζ ηαθή ζοκέπεζα ζηδκ επαββεθιαηζηή ηδξ ζηαδζμδνμιία ηαζ ηδξ οπυζπμιαζ ηδκ ζοκεπή ηαζ αιένζζηδ αμήεεζά ιμο, βζα υηζ ιε πνεζαζηεί. Θα ήεεθα κα ηδκ εοπανζζηήζς, ιαγί ιε ημκ οπμρήθζμ δζδάηημνα Μάνζμ Κνμηίδδ ηαζ ηζξ ιεηαπηοπζαηέξ θμζηήηνζεξ Υνφζα Κμκημπμφθμο ηαζ Μανία Ώπμζημθίδδ βζα ηδκ πναβιαηζηά άρμβδ ζοκενβαζία ηαζ βζα ηδκ ηαηακυδζδ πμο επέδεζλακ ηαηά ηδ ζοββναθή ηδξ δζαηνζαήξ ιμο. Βοπανζζηχ ηδκ ηαθή ιμο θίθδ Καηενίκα Γναθακάηδ, πμο απυ ηδκ ανπή ηδξ βκςνζιίαξ ιαξ ιε ζοιαμφθεοε ηαζ ιε ζηήνζγε, ηαεχξ επίζδξ, ηδκ αβαπδιέκδ ιμο Ώκεμφθα Ώθελμπμφθμο, πμο ακέηαεεκ ιαξ θνυκηζγε. Βοπανζζηχ ηζξ θίθεξ ιμο, Μανία, Ρέκα ηαζ Μανία, πμο ακ ηαζ δεκ ανίζημκηαζ ζημ ίδζμ ενβαζζαηυ πενζαάθθμκ, ήηακ πάκηα ημκηά ιμο. Βοπανζζηχ, επίζδξ, πμθφ ημκ Πακαβζχηδ βζα ηδκ πναβιαηζηά ακελάκηθδηδ οπμιμκή ηαζ ηαηακυδζή ημο. Βοπανζζηχ ηδκ αλζμθάηνεοηδ βζαβζά ιμο, ηδξ μπμίαξ δ ζοιαμθή ζηδκ ακαηνμθή ιμο 6

8 οπήνλε ζπμοδαία ηαζ δ απμοζία ηδξ εα είκαζ πάκημηε ακακηζηαηάζηαηδ. Σέθμξ, κμιίγς πςξ δεκ οπάνπμοκ θυβζα, ζηακά κα ιπμνέζμοκ κα εηθνάζμοκ ηδκ εοβκςιμζφκδ πμο έπς βζα ημοξ βμκείξ ιμο, Ώεακαζία ηαζ Γενάζζιμ. Οφηςξ ή άθθςξ ημοξ μθείθς αοηυ πμο είιαζ ηαζ μηζδήπμηε έπς επζηφπεζ ιέπνζ ζήιενα. Ώπθά εέθς κα ημοξ εοπανζζηήζς, αοημφξ ηαζ ημκ αδενθυ ιμο, Νίημ, βζαηί είκαζ ιμκαδζημί ζηδ γςή ηαζ ζηδ ηανδζά ιμο, βζαηί πζζηεφμοκ ζε ειέκα, βζαηί είκαζ μζ άκενςπμζ πμο ιε αβαπμφκ ηαζ ιε ακέπμκηαζ υπςξ είιαζ, βζαηί είκαζ αοημί πμο πάκημηε ανίζημκηαζ βφνς ιμο βζα κα ιε πνμζηαηεφμοκ ηαζ κα ιε ζηδνίγμοκ. Βίκαζ δεδμιέκμ πςξ πάκηα εα δδιζμονβχ ιε ιμκαδζηυ βκχιμκα κα ημοξ ηάκς πενήθακμοξ. 7

9

10 Δ πανμφζα δζδαηημνζηή δζαηνζαή εηπμκήεδηε ζηα πθαίζζα ημο Πνμβνάιιαημξ Μεηαπηοπζαηχκ πμοδχκ Εαηνζηέξ Βπζζηήιεξ ημο Σιήιαημξ Εαηνζηήξ, ημο Πακεπζζηδιίμο Παηνχκ ΣΡΙΜΔΛΗ ΤΜΒΟΤΛΔΤΣΙΚΗ ΔΠΙΣΡΟΠΗ 1. Καεδβδηήξ Αζμκφζζμξ ΑναΎκαξ (Βπζαθέπςκ Σιήια Εαηνζηήξ, Πακεπζζηήιζμ Παηνχκ) 2. Καεδβδηήξ Αδιήηνζμξ Καθπαλήξ (Σιήια Εαηνζηήξ, Πακεπζζηήιζμ Παηνχκ) 3. Ώκαπθδνςηήξ Καεδβδηήξ Κςκζηακηίκμξ ηαευπμοθμξ (Σιήια Εαηνζηήξ, Πακεπζζηήιζμ Παηνχκ) ΔΠΣΑΜΔΛΗ ΔΞΔΣΑΣΙΚΗ ΔΠΙΣΡΟΠΗ 1. Καεδβδηήξ Αζμκφζζμξ ΑναΎκαξ (Βπζαθέπςκ Σιήια Εαηνζηήξ, Πακεπζζηήιζμ Παηνχκ) 2. Καεδβδηήξ Αδιήηνζμξ Καθπαλήξ (Μέθμξ Σνζιεθμφξ οιαμοθεοηζηήξ Βπζηνμπήξ Σιήια Εαηνζηήξ, Πακεπζζηήιζμ Παηνχκ) 3. Ώκαπθδνςηήξ Καεδβδηήξ Κςκζηακηίκμξ ηαευπμοθμξ (Μέθμξ Σνζιεθμφξ οιαμοθεοηζηήξ Βπζηνμπήξ Σιήια Εαηνζηήξ, Πακεπζζηήιζμ Παηνχκ) 4. Καεδβδηήξ Αζμκφζζμξ οκεηυξ (Σιήια Εαηνζηήξ, Πακεπζζηήιζμ Παηνχκ) 5. Ώκαπθδνςηήξ Καεδβδηήξ Κςκζηακηίκμξ Φθοηγάκδξ (Σιήια ΐζμθμβίαξ, Πακεπζζηήιζμ Παηνχκ) 6. Ώκαπθδνςηήξ Καεδβδηήξ Κονζάημξ Κοπναίμξ (Σιήια Εαηνζηήξ, Πακεπζζηήιζμ Παηνχκ) 7. Λέηημναξ Ώκδνέαξ Σγάημξ (Σιήια Εαηνζηήξ, Πακεπζζηήιζμ Εςακκίκςκ) Δ πανμοζίαζδ ηδξ δζδαηημνζηήξ δζαηνζαήξ πναβιαημπμζήεδηε ζηζξ 28 επηειανίμο 2010 εκχπζμκ ηδξ Βπηαιεθμφξ Βλεηαζηζηήξ Βπζηνμπήξ. Δ έβηνζζδ ηδξ δζδαηημνζηήξ δζαηνζαήξ απυ ημ Σιήια Εαηνζηήξ δεκ οπμδδθχκεζ απμδμπή ηςκ απυρεςκ ημο ζοββναθέα (Νυιμξ 5343/32, άνενμ 202 2). 9

11

12

13

14 Πεξηερόκελα Πεξίιεςε-Abstract 19 Δηζαγσγή Αλαθάιπςε ησλ ξηβνελδύκσλ Ο θόζκνο ηνπ RNA Δμειηθηηθά θαηάινηπα ηνπ RNA θόζκνπ ζηνπο ζύγρξνλνπο νξγαληζκνύο ύγρξνλνο θόζκνο ηνπ RNA Σα ηξία βαζηθά κόξηα RNA Με θσδηθνπνηόλ RNA (non coding RNA) Καηαιπηηθό RNA Μηθξά ξηβνέλδπκα θπξνθέθαιν ξηβνέλδπκν (hammerhead ribozyme) Ρηβνέλδπκν θνπξθέηα (hairpin ribozyme) Μεγάια ξηβνέλδπκα Ηληξόληα ηεο νκάδαο Η θαη ΗΗ Ρηβόζσκα Ρηβνλνπθιεάζε Ρ (RNase P) Σα ππνζηξώκαηα ηεο RNase P RNase P: ηδηόηεηεο ηνπ ξηβνλνπθιενπξσηετληθνύ ζπκπιόθνπ Η RNA ππνκνλάδα ηεο RNase P Γεπηεξνηαγήο δνκή ηνπ RNA - Ο ζπληεξεκέλνο θνηλόο δνκηθόο ππξήλαο ηνπ RNA RNA ππνκνλάδα ηεο βαθηεξηαθήο RNase P RNA ππνκνλάδα ηεο RNase P από αξραία RNA ππνκνλάδα ηεο επθαξπσηηθήο RNase P Tξηηνηαγήο δνκή ηνπ RNA Σα Ρ RNA ησλ ηύπσλ Α θαη Β πηνζεηνύλ θνηλέο δηακνξθώζεηο γηα ηελ πεξηνρή εμεηδίθεπζεο θαη θαηάιπζεο Ο κεραληζκόο ηεο αληίδξαζεο Αλαγλώξηζε ππνζηξώµαηνο από ην νινέλδπµν Βαθηεξηαθή έλαληη επθαξπσηηθήο/αξραίαο RNase P Οη πξσηετληθέο ππνκνλάδεο ηεο RNase P Βαθηεξηαθή πξσηετληθή ππνκνλάδα Πξσηετληθέο ππνκνλάδεο από ηα αξραία Σξηηνηαγήο δνκή ηεο Ph Σξηηνηαγήο δνκή ηεο Ph Σξηηνηαγήο δνκή ηεο Ph Σξηηνηαγήο δνκή ηεο Ph1481 θαη Pf Λεηηνπξγηθέο κειέηεο Αιιειεπηδξάζεηο πξσηετλώλ-πξσηεΐλώλ θαη RNA-πξσηετλώλ Δπθαξπσηηθέο πξσηετληθέο ππνκνλάδεο ησλ ππξεληθώλ RNase P ελδύκσλ Αιιειεπηδξάζεηο πξσηετλώλ-πξσηετλώλ θαη RNA-πξσηετλώλ Διάρηζηνο θαηαιπηηθόο ππξήλαο Λεηηνπξγηθέο ηδηόηεηεο ησλ πξσηετληθώλ ππνκνλάδσλ Δπθαξπσηηθέο πξσηετληθέο ππνκνλάδεο ηεο RNase P ησλ νξγαληδίσλ Θεξαπεπηηθέο εθαξκνγέο ηεο RNase P 84 13

15 Πεξηερόκελα 5. Ο θπηηαξνκπμνκύθεηαο D. discoideum πζηεκαηηθή θαηάηαμε Βηνινγηθόο θύθινο ηνπ D. discoideum Ο θπηηαξνκπμνκύθεηαο D. discoideum σο εξεπλεηηθό εξγαιείν Υαξαθηεξηζηηθά ηεο RNase P από ην D. discoideum θνπόο ηεο εξγαζίαο 96 Τιηθά θαη Μέζνδνη 97 A. Τιηθά 99 Έκγοια: Ώκηζζχιαηα: ΐαηηδνζαηά ζηεθέπδ: Πθαζιίδζα: Κζη: Β. Μέζνδνη Καιιηέξγεηα D. discoideum Μεξηθόο θαζαξηζκόο RNase P από D. discoideum Οκνγελνπνίεζε θαη παξαιαβή θπηηαξηθνύ εθρπιίζκαηνο (S-100) Υξσκαηνγξαθία αληνληναληαιιαγήο Πξνεηνηκαζία Υξσκαηνγξαθία θαη ζπιινγή θιαζκάησλ Υξσκαηνγξαθία θαηηνληναληαιιαγήο Πξνεηνηκαζία Υξσκαηνγξαθία θαη ζπιινγή θιαζκάησλ Αλίρλεπζε δξαζηηθόηεηαο RNase P Mεηαγξαθή in vitro ηνπ γνληδίνπ ηνπ πξνδξόκνπ trna SupS Γνθηκή γηα ηελ αλίρλεπζε ελδπκηθήο δξαζηηθόηεηαο RNase P Κισλνπνίεζε ησλ γνληδίσλ drpp29 θαη drpp ρεδηαζκόο εθθηλεηώλ γηα ηα γνλίδηα drpp29 θαη drpp Αλαδήηεζε ζε ςεθηαθέο ηξάπεδεο δεδνκέλσλ ρεδηαζκόο εθθηλεηώλ γηα ηε θισλνπνίεζε ησλ ηκεκάησλ ηνπ γνληδίνπ drpp29, δ75, δ155 θαη ntr Απνκόλσζε γνληδησκαηηθνύ DNA από ην D. discoideum Πνζνηηθόο πξνζδηνξηζκόο λνπθιετθώλ νμέσλ κε θσηνκέηξεζε Αιπζηδσηή αληίδξαζε πνιπκεξάζεο (Polymerase Chain Reaction, PCR) Αληίζηξνθε κεηαγξαθή αιπζηδσηή αληίδξαζε πνιπκεξάζεο (reverse transcription PCR) Απνκόλσζε νιηθνύ RNA RT-PCR Ηιεθηξνθνξεηηθόο δηαρσξηζκόο θαη αλάθηεζε κνξίσλ DNA από πήθησκα αγαξόδεο

16 Πεξηερόκελα Κισλνπνίεζε ησλ πξντόλησλ ηεο PCR ζε πιαζκηδηαθό θνξέα pcr II TOPO Παξαζθεπή δεθηηθώλ θπηηάξσλ θαη κεηαζρεκαηηζκόο κε αλαζπλδπαζκέλν πιαζκίδην Απνκόλσζε πιαζκηδίνπ από βαθηεξηαθή θαιιηέξγεηα Απνκόλσζε πιαζκηδίνπ ζε κηθξή θιίκαθα (mini prep) Απνκόλσζε πιαζκηδίνπ ζε κεγάιε θιίκαθα (maxi prep) Τπεξέθθξαζε ηνπ γνληδίνπ drpp29, δ404 θαη ησλ ηκεκάησλ δ75, δ155 θαη ntr Τπνθισλνπνίεζε ζε θνξέα έθθξαζεο θαη κεηαζρεκαηηζκόο δεθηηθώλ BL21(DE3)Codon plus, BL21(DE3) θαη BL21(DE3)Rosetta DRpp29 θαη Γ Γ75, Γ155 θαη NTR Δπαγσγή ηεο έθθξαζεο ησλ αλαζπλδπαζκέλσλ γνληδίσλ Αλίρλεπζε ησλ αλαζπλδπαζκέλσλ πνιππεπηηδίσλ κε ειεθηξνθόξεζε ζε απνδηαηαθηηθό πήθησκα SDS/πνιπαθξπιακηδίνπ θαη αλάιπζε θαηά western Ζιεθηξνθόξεζε ζε πήθησκα SDS/πνιπαθξπιακηδίνπ Υξώζε κε Coomassie Brilliant Blue Υξώζε κε άξγπξν Αλάιπζε θαηά western Καζαξηζκόο αλαζπλδπαζκέλσλ πνιππεπηηδίσλ κε ρξσκαηνγξαθία ζπγγελείαο αθηλεηνπνηεκέλνπ ληθειίνπ Οκνγελνπνίεζε θπηηάξσλ Παξαιαβή θιαζκάησλ δηαιπηώλ θαη αδηάιπησλ πξσηετλώλ Καζαξηζκόο εθρπιίζκαηνο δηαιπηώλ πξσηετλώλ Καζαξηζκόο εθρπιίζκαηνο αδηάιπησλ πξσηετλώλ Παξαζθεπή πνιπθισληθώλ αληηζσκάησλ-πεηξάκαηα αλνζνρεκείαο Αλνζνπνίεζε θνπλειηώλ θαη παξαιαβή νξξνύ Γνθηκαζία dot blot Έκκεζε ELISA (enzyme-linked immunosorbent assay) γηα ηηηινδόηεζε ησλ αληηνξξώλ Καζαξηζκόο αληηζσκάησλ κε ζηήιε ζπγγελείαο Protein A-Sepharose Αλνζνθαηαθξήκληζε δξαζηηθόηεηαο RNase P κε πνιπθισληθά αληηζώκαηα Μεηαγξαθή in vitro ηνπ RNA ηεο RNase P Γνθηκή αιιαγήο ειεθηξνθνξεηηθήο θηλεηηθόηεηαο (Electrophoretic Mobility Shift Assay, EMSA) Αλαιύζεηο απνηππώκαηνο Αλάιπζε απνηππώκαηνο ηεο RNA ππνκνλάδαο ηεο RNase P ηνπ D. discoideum Αλάιπζε απνηππώκαηνο ηεο RNA ππνκνλάδαο ηεο RNase P ηνπ D. discoideum παξνπζία ηεο DRpp Αλαζύζηαζε ελδπκηθήο δξαζηηθόηεηαο RNase P in vitro Δηεξόινγε αλαζύζηαζε δξαζηηθόηεηαο RNase P (DRpp29-M1 RNA)

17 Πεξηερόκελα Δηεξόινγε αλαζύζηαζε δξαζηηθόηεηαο RNase P (Γ75-M1 RNA) Κηλεηηθή αλάιπζε ηνπ αλαζπζηακέλνπ ζπκπιόθνπ Γ75-M1 RNA Οκόινγε αλαζύζηαζε δξαζηηθόηεηαο RNase P Μνληέιν δνκήο ηεο DRpp Μνληεινπνίεζε ηεο DRpp29 βάζεη νκνινγίαο Πξόβιεςε ησλ πηζαλώλ θαηαινίπσλ ηεο DRpp29 πνπ αιιειεπηδξνύλ κε RNA Απνηειέζκαηα Κισλνπνίεζε ηνπ γνληδίνπ drpp Πξνζδηνξηζκόο πξσηνηαγνύο αιιεινπρίαο θαη θισλνπνίεζε ηνπ γνληδίνπ drpp Οκνπαξάζεζε ηεο DRpp29 κε νξζόινγεο πξσηεΐλεο από άιινπο νξγαληζκνύο Τπνθισλνπνίεζε ηνπ drpp29 ζε πιαζκηδηαθό θνξέα έθξθαζεο Παξαιαβή drpp29 θαη θνξέα έθθξαζεο κε ζπλεθηηθά άθξα Μεηαζρεκαηηζκόο δεθηηθώλ BL21(DE3)codon plus Παξαιαβή θαζαξήο αλαζπλδπαζκέλεο πξσηεΐλεο DRpp Δπαγσγή ηεο έθθξαζεο ηνπ drpp Απνκόλσζε ηεο DRpp29 κε ρξσκαηνγξαθία ζπγγελείαο αθηλεηνπνηεκέλνπ ληθειίνπ Παξαζθεπή πνιπθισληθώλ αληηζσκάησλ Αλνζνπνίεζε θνπλειηώλ Αλνζναπνηύπσζε θειίδαο (dot blot) Έκκεζε ELISA γηα ηηηινδόηεζε αληηνξξώλ Η DRpp29 ζπκκεηέρεη ζην καθξνκνξηαθό ζύκπινθν RNase P Αλάιπζε θαηά western Αλνζνθαηαθξήκληζε δξαζηηθόηεηαο RNase P από αληίζσκα έλαληη ηεο DRpp Λεηηνπξγηθή κειέηε ηεο αλαζπλδπαζκέλεο πξσηεΐλεο DRpp Ιδηόηεηεο πξόζδεζεο ηεο DRpp29 κε RNA κόξηα Ζ DRpp29 δεζκεύεη εηδηθά ηελ RNA ππνκνλάδα ηεο RNase P ηνπ D. discoideum - Αιιαγή ηεο ειεθηξνθνξεηηθήο θηλεηηθόηεηαο (EMSA) Ζ DRpp29 δελ αιιειεπηδξά εηδηθά κε ην ππόζηξσκα SupS1 - Αιιαγή ηεο ειεθηξνθνξεηηθήο θηλεηηθόηεηαο (EMSA) Καηαζθεύε θαη κειέηε ησλ δηαθξηηώλ πεξηνρώλ ηεο DRpp Κισλνπνίεζε ησλ ηκεκάησλ δ75, δ155 θαη ntr Δπαγσγή ηεο έθθξαζεο ησλ πνιππεπηηδίσλ Γ75, Γ155 θαη NTR Καζαξηζκόο ησλ πνιππεπηηδίσλ Γ75, Γ155 θαη NTR Μειέηε ηεο αιιειεπίδξαζεο ησλ πνιππεπηηδίσλ Γ75, Γ155 θαη NTR κε ηελ RNA ππνκνλάδα ηεο RNase P ηνπ D. discoideum Πξόβιεςε ησλ πηζαλώλ θαηαινίπσλ ηεο DRpp29 πνπ αιιειεπηδξνύλ κε ηελ RNA ππνκνλάδα ηεο RNase P

18 Πεξηερόκελα 6. Μειέηε ηεο δνκήο ηεο RNA ππνκνλάδαο θαη ηεο DRpp Πξνζδηνξηζκόο ηεο δεπηεξνηαγνύο δνκήο ηεο RNA ππνκνλάδαο Λεηηνπξγηθή κειέηε ηεο RNA ππνκνλάδαο ηνπ D. discoideum Αλάιπζε Απνηππώκαηνο ηεο RNA ππνκνλάδαο παξνπζία ηεο DRpp Aλαζύζηαζε δξαζηηθόηεηαο RNase P in vitro Γνθηκέο εηεξόινγεο αλαζύζηαζεο δξαζηηθόηεηαο RNase P ρεκαηηζκόο ελεξγνύ ζπκπιόθνπ από ηελ DRpp29 θαη ην M1 RNA ρεκαηηζκόο ελεξγνύ ζπκπιόθνπ από ην πνιππεπηίδην Γ75 θαη ην M1 RNA Κηλεηηθή αλάιπζε ησλ αλαζπζηακέλσλ ζπκπιόθσλ DRpp29-M1 RNA, C5-M1 RNA, Γ75-Μ1 RNA, θαζώο θαη ηνπ Μ1 ξηβνελδύκνπ Γνθηκέο νκόινγεο αλαζύζηαζεο δξαζηηθόηεηαο RNase P Πξνζδηνξηζκόο ηεο πξσηνηαγνύο αιιεινπρίαο θαη νκνπαξάζεζε ηεο DRpp21 κε νξζόινγεο πξσηεΐλεο από άιινπο νξγαληζκνύο Κισλνπνίεζε θαη ππνθισλνπνίεζε ηνπ ηκήκαηνο ηεο DRpp21, δ Παξαιαβή θαζαξνύ αλαζπλδπαζκέλνπ πνιππεπηηδίνπ Γ Αλαζύζηαζε δξαζηηθόηεηαο RNase P από ηε DRpp29, Γ404 θαη ηελ RNA ππνκνλάδα Μνληέιν δνκήο ηεο DRpp Η DRpp29 αλαδηπιώλεηαη ζύκθσλα κε ην ραξαθηεξηζηηθό κνηίβν ησλ Sm πξσηετλώλ πδήηεζε Η RNase P ηνπ D. discoideum Υαξαθηεξηζηηθά ηεο DRpp Η DRpp29 ζπκκεηέρεη ζην ξηβνλνπθιενπξσηετληθό ζύκπινθν ηεο RNase P Η DRpp29 πξνζδέλεηαη ζε κόξηα RNA Μνληεινπνίεζε-ε DRpp29 αλαδηπιώλεηαη όπσο νη Sm πξσηεΐλεο Σν πνιππεπηίδην Γ75 επζύλεηαη γηα ηελ πξόζδεζε ηεο DRpp29 ζην Ρ RNA ηνπ D. discoideum Πξνζδηνξηζκόο ηεο δεπηεξνηαγνύο δνκήο ηνπ P RNA ηεο RNase P από ην D. discoideum Η DRpp29 πξνζδέλεηαη ζηελ πεξηνρή εμεηδίθεπζεο S ηεο RNA ππνκνλάδαο Η DRpp29 θαη ην M1 RNA ζρεκαηίδνπλ ελεξγό ζύκπινθν κε δξαζηηθόηεηα RNase P Κισλνπνίεζε ηνπ γνληδίνπ drpp21 θαη ραξαθηεξηζκόο ηνπ πξντόληνο πνπ θσδηθνπνηεί Η DRpp29 καδί κε ηo Γ404 θαη ηελ RNA ππνκνλάδα ζρεκαηίδνπλ ελεξγό ζύκπινθν κε δξαζηηθόηεηα RNase P Βηβιηνγξαθία

19

20

21

22 Πεξίιεςε Δ νζαμκμοηθεάζδ Ρ (RNase P) είκαζ έκα πακηαπμφ πανυκ έκγοιμ, ημ μπμίμ εναφεζ εκδμκμοηθεμθοηζηά ηα πνυδνμια ιεηάβναθα ηςκ trna, πανάβμκηαξ ηα χνζια 5 άηνα ημοξ. Πνυζθαηα, ανέεδηε πςξ δ RNase P ζοιιεηέπεζ ζηδκ ιεηαβναθή βμκζδίςκ πμο ηςδζημπμζμφκ trna, rrna ηαζ άθθα ιζηνά ιδ ηςδζημπμζμφκηα RNA. Δ RNase P έπεζ ακζπκεοεεί ζε ακηζπνμζχπμοξ ηαζ ηςκ ηνζχκ πενζμπχκ ηδξ γςήξ (ααηηήνζα, ανπαία, εοηανοχηεξ), ηαεχξ επίζδξ ζε ιζημπυκδνζα ηαζ πθςνμπθάζηεξ, ιε ιμκαδζηή ελαίνεζδ ημ ανπαίμ Nanoarchaeum equitans. ε ζπεδυκ υθμοξ ημοξ μνβακζζιμφξ, δ RNase P είκαζ έκα νζαμκμοηθεμπνςηεσκζηυ ζφιπθμημ απμηεθμφιεκμ απυ ιία απαναίηδηδ RNA οπμιμκάδα ηαζ πμζηίθμ ανζειυ πνςηεσκχκ. Τπάνπμοκ ιυκμ δφμ, πνυζθαηα, ακαθενυιεκεξ ελαζνέζεζξ, αοηέξ ηςκ ακενχπζκςκ ιζημπμκδνίςκ ηαζ ηςκ πθαζηζδίςκ ημο θοημφ A. thaliana, ηςκ μπμίςκ δ RNase P είκαζ απμηθεζζηζηά πνςηεσκζηήξ θφζεςξ. Δ RNA οπμιμκάδα είκαζ οπεφεοκδ βζα ηδκ ηαηαθοηζηή θεζημονβία ημο μθμεκγφιμο ηδξ RNase P απυ ηα ααηηήνζα, ηα ανπαία ηαζ ημοξ εοηανοχηεξ. Οζ πνςηεσκζηέξ οπμιμκάδεξ είκαζ απαναίηδηεξ βζα ηδκ ηαηάθοζδ in vivo ηαζ παίγμοκ πμθθμφξ νυθμοξ ζηδ δμιή ηαζ θεζημονβία ημο μθμεκγφιμο. Δ πονδκζηή RNase P απυ ημ Dictyostelium discoideum είκαζ ημ πζμ πθμφζζμ, ζε πνςηεσκζηή ζφζηαζδ, μθμέκγοιμ ακάιεζα ζηα εοηανοςηζηά έκγοια RNase P πμο έπμοκ ιεθεηδεεί ιέπνζ ζήιενα. Βίκαζ έκα νζαμκμοηθεμπνςηεσκζηυ ζφιπθμημ, ημ μπμίμ απμηεθείηαζ απυ ιζα RNA οπμιμκάδα ηαζ μπηχ πνςηεύκεξ (DRpp40, DRpp30, DRpp29, DRpp25, DRpp21, DRpp20, DPop1, DPop5). Ώοηέξ μζ πνςηεύκεξ πανμοζζάγμοκ μιμζυηδηεξ ιε ηζξ μιυθμβέξ ημοξ απυ ακχηενα εοηανοςηζηά έκγοια, υπςξ ημο ακενχπμο, εκχ πανάθθδθα δζαηδνμφκ ζδζμζοβηναζζαηά παναηηδνζζηζηά. ηδκ πανμφζα ιεθέηδ, πενζβνάθμοιε ηδκ ηθςκμπμίδζδ ηαζ ηζξ ζδζυηδηεξ αθθδθεπίδναζδξ ηδξ πνςηεύκδξ DRpp29 ιε ηδκ RNA οπμιμκάδα ηδξ RNase P ημο D. discoideum. Πεζνάιαηα δθεηηνμθμνδηζηήξ ηζκδηζηυηδηαξ έδεζλακ, πςξ δ DRpp29 δεζιεφεηαζ εζδζηά ιε ηδκ RNA οπμιμκάδα, έκα παναηηδνζζηζηυ πμο επζαεααζχεδηε πεναζηένς ιε ημκ ζπεδζαζιυ ημο ιμκηέθμο ηδξ δμιήξ ηδξ DRpp29. Βπζπθέμκ, ηαηαζηεοάζηδηακ ιεηαθθάβιαηα απμθμζθήξ ηδξ DRpp29, βζα κα ιεθεηδεμφκ μζ πενζμπέξ ηδξ DRpp29 πμο ζοκεζζθένμοκ ή/ηαζ είκαζ οπεφεοκεξ βζα ηδκ άιεζδ αθθδθεπίδναζή ηδξ ιε ηδκ RNA οπμιμκάδα. Βκημπίζηδηε ιζα πενζμπή, ιεηαλφ ηςκ εοηανοςηζηχκ μιμθυβςκ, πθμφζζα ζε θοζίκεξ ηαζ ανβζκίκεξ, δ μπμία θαίκεηαζ κα δζεοημθφκεζ ηδκ αθθδθεπίδναζδ ηςκ δφμ αοηχκ οπμιμκάδςκ. Πνμζδζμνίζαιε, επίζδξ, ιε ηδ δζελαβςβή ακάθοζδξ απμηοπχιαημξ ηαζ ηδ πνήζδ δεδμιέκςκ αζμπθδνμθμνζηήξ, ηδ δεοηενμηαβή δμιή ηδξ RNA οπμιμκάδαξ ηδξ RNase P ημο D. discoideum. Με ακάθοζδ απμηοπχιαημξ απμηαθφθεδηε, πςξ δ DRpp29 αθθδθεπζδνά ιε ηδκ πενζμπή ελεζδίηεοζδξ 21

23 Πεξίιεςε ( S-domain ) ηδξ RNA οπμιμκάδαξ, δείπκμκηαξ, υηζ δ DRpp29 επδνεάγεζ ηδκ ζηακυηδηα δέζιεοζδξ ημο οπμζηνχιαημξ απυ ημ έκγοιμ. ηδ ζοκέπεζα, εθέβπεδ δ ζηακυηδηα ηδξ DRpp29 ηαζ ηςκ ιεηαθθαβιάηςκ ηδξ κα ζπδιαηίγμοκ, ιαγί ιε ηδκ RNA οπμιμκάδα ημο E. coli, εκενβά εκγοιζηά ζφιπθμηα ιε δναζηζηυηδηα RNase P. Σέθμξ, εθέβπεδ μ ζπδιαηζζιυξ εκυξ εθάπζζηα ηαηαθοηζημφ πονήκα ηδξ RNase P ημο D. discoideum, ιε ηδκ πναβιαημπμίδζδ πεζναιάηςκ μιυθμβδξ ακαζφζηαζδξ ιε ηδκ DRpp29, ημκ πνςηεσκζηυ ηδξ ζοκενβάηδ DRpp21 ηαζ ηδκ RNA οπμιμκάδα. 22

24 Abstract Ribonuclease P (RNase P) is a ubiquitous enzyme, which endonucleolytically cleaves the precursor trna transcripts to produce their mature 5 ends. Recently, RNase P has been found to participate in the transcription of trna, rrna and other small non-coding RNA genes. RNase P occurs in representatives of all domains of life (bacteria, archaea, eukarya), as well as in mitochondria and chloroplasts, apart from the archeon Nanoarchaeum equitans. In almost every organism, RNase P is a ribonucleoprotein complex, with one essential RNA and a multiple number of protein subunits. There are only two exceptional cases, that of the human mitochondria and the plastids from A. thaliana, whose RNase P lacks an RNA subunit. The RNA subunit is responsible for the main catalytic function of the RNase P holoenzyme in bacteria, archaea and eukarya. Protein subunits are essential for catalysis in vivo and they play multiple roles in structure and function of the holoenzyme. Dictyostelium discoideum nuclear RNase P is the most proteinaceous holoenzyme among the eukaryal RNase P studied so far. It s a ribonucleoprotein complex, which consists of one RNA and eight protein subunits (DRpp40, DRpp30, DRpp29, DRpp25, DRpp21, DRpp20, DPop1, DPop5). These proteins display similarities with its counterparts from higher eukaryotes, such as the human enzyme, but at the same time they retain distinctive characteristics. In the present study, we report the molecular cloning and interaction details of DRpp29 and RNase P RNA. Electromobility shift assays exhibited that DRpp29 binds specifically to the RNase P RNA subunit, a feature that was further confirmed by the molecular modeling of the DRpp29 structure. Moreover, deletion mutants of DRpp29 were constructed in order to investigate the domains of DRpp29 that contribute to and/or are responsible for the direct interaction with the D. discoideum RNase P RNA. A eukaryotic specific, lysine and arginine rich region was revealed, which seems to facilitate the interaction between these two subunits. We determined the D. discoideum RNase P RNA secondary structure based on footprinting analysis and bioinformatic data. Furthermore, footprinting analysis revealed that DRpp29 interact with the specificity domain ( S-domain ) of the RNA subunit, suggesting that DRpp29 influence the enzyme s substrate binding ability. Furthermore, we tested the ability of wild type and mutant DRpp29 to form active RNase P enzymatic particles with the E. coli s RNase P RNA. Finally, we tested the formation of a minimal catalytic core of the D. discoideum RNase P, by performing homologous reconstitution experiments with DRpp29, its protein partner DRpp21 and the RNA subunit. 23

25

26

27

28 Δηζαγσγή Έκα απυ ηα πζμ πμθοζογδηδιέκα ηαζ δζθμνμφιεκα εέιαηα, επζζηδιμκζηά ηαζ θζθμζμθζηά, είκαζ ημ γήηδια ηδξ πνμέθεοζδξ ηδξ γςήξ ζηδ Γδ. Ώκ ηαζ ιπμνμφιε κα έπμοιε ιζα δζαζζεδηζηή ηαηακυδζδ ημο ηζ ζδιαίκεζ γςή ηαζ κα είζαζ γςκηακυξ, δ ηαηακυδζδ ηαζ μ πνμζδζμνζζιυξ ηδξ πνμέθεοζδξ ηδξ γςήξ ελαημθμοεεί κα απμηεθεί έκα δίθδιια βζα ημοξ επζζηήιμκεξ. Σμ ιοζηζηυ ηδξ γςήξ ζζπονίζηδηε πςξ ανήηε μ Francis Crick, υηακ ιαγί ιε ημκ James Watson πνυηεζκακ ηδ δμιή ηδξ δζπθήξ έθζηαξ ημο DNA ιέζς ημο ζπδιαηζζιμφ γεοβχκ αάζεςκ ηαζ ηδκ ζηακυηδηά ημο κα δζπθαζζάγεηαζ. Δ ιεθέηδ ημο Watson ηαζ Crick μδήβδζε ζηδκ πνυηαζδ ημο ηεκηνζημφ δυβιαημξ ηδξ αζμθμβίαξ ζφιθςκα ιε ημ μπμίμ δ βεκεηζηή πθδνμθμνία νέεζ απυ ημ DNA ζημ RNA, ημ μπμίμ ιεηαθένεζ ηαζ ζοιιεηέπεζ ζηδκ απμηςδζημπμίδζδ ηδξ πθδνμθμνίαξ βζα ηδ παναβςβή πνςηεσκχκ. Ο δζπθαζζαζιυξ ημο DNA δεκ είκαζ αοευνιδηδ δζαδζηαζία, αθμφ απαζηεί ηδκ πανμοζία πμθθαπθχκ πνςηεσκχκ πμο ηαηαθφμοκ αοηή ηδ δζαδζηαζία. Οζ πνςηεύκεξ πάθζ είκαζ ιαηνμιυνζα πμο πανάβμκηαζ ιυκμ απυ ηδκ έηθναζδ ηςκ βμκζδίςκ. Γζ αοηυ ημ θυβμ, ζηα ηέθδ ηδξ δεηαεηίαξ ημο 60 ζδιακηζημί επζζηήιμκεξ, ακάιεζά ημοξ ηαζ μ Crick, πνυηεζκακ ιζα θφζδ ζημ αίκζβια αοηυ. Θεχνδζακ πςξ ημ ανπέβμκμ ιυνζμ δεκ είκαζ μφηε ημ DNA, μφηε μζ πνςηεύκεξ, αθθά ημ ιυνζμ ημο RNA. Ώοηή δ εεςνία ημο RNA ηυζιμο δεκ έβζκε εονέςξ απμδεηηή, αθμφ μζ βκςζηέξ ιέπνζ ηυηε ζδζυηδηεξ ημο RNA δεκ πενζεθάιαακακ δομ ααζζηέξ θεζημονβίεξ πμο εα έπνεπε κα δζαεέηεζ ημ ανπέβμκμ βεκεηζηυ οθζηυ: ηδκ ζηακυηδηα κα ακηζβνάθεζ ημκ εαοηυ ημο ηαζ ηδκ δοκαηυηδηα κα ηαηαθφεζ ακηζδνάζεζξ απαναίηδηεξ βζα ηδκ ζφκεεζδ ηςκ πνςηεσκχκ. Δ εεςνία ημο RNA ηυζιμο ανέεδηε λακά ζημ πνμζηήκζμ ζηζξ ανπέξ ηδξ δεηαεηίαξ ημο 80, υηακ μζ Thomas Cech ηαζ Sidney Altman, λεπςνζζηά, ακαηάθορακ RNA ιυνζα ζηακά κα ηαηαθφμοκ ακηζδνάζεζξ. 1. Αλαθάιπςε ησλ ξηβνελδύκσλ Ώνπζηά μ Thomas Cech ηαζ δ ενεοκδηζηή ημο μιάδα ιεθεημφζακ ηδ δζαδζηαζία ημο ιαηίζιαημξ ηαζ ηδκ απμιάηνοκζδ ημο ζκηνμκίμο ηςκ 413 αάζεςκ απυ ημ πνυδνμιμ νζαμζςιζηυ 26S RNA απυ ημ πνςηυγςμ Tetrahymena thermophila. ηδ πνμζπάεεζά ημοξ κα απμιμκχζμοκ ηάπμζμ πνςηεσκζηυ πανάβμκηα οπεφεοκμ βζα ηδκ ςνίιακζδ ημο πνυδνμιμο 26S rrna, δζαπίζηςζακ πςξ ημ πνυδνμιμ αοηυ ιεηάβναθμ ςνζιάγεζ ιυκμ ημο, in vitro, απμοζία πνςηεσκζηχκ ιμνίςκ ηαζ πανμοζία ιυκμ δζζεεκχκ ηαηζυκηςκ Mg 2+ ηαζ κμοηθεμηζδίςκ βμοακίκδξ (Kruger et al 1982). πεδυκ ηαοηυπνμκα, μ Sidney Altman ηαζ μζ ζοκενβάηεξ ημο ιεθεημφζακ ηδ νζαμκμοηθεάζδ Ρ (RNase P) απυ ημ ααηηήνζμ Escherichia 27

29 Δηζαγσγή coli, έκα έκγοιμ πμο ςνζιάγεζ ηα 5 άηνα ηςκ πνυδνμιςκ trna ιμνίςκ. Σμ έκγοιμ αοηυ ανέεδηε κα είκαζ έκα νζαμκμοηθεμπνςηεσκζηυ ζφιπθμημ, κα απμηεθείηαζ, δδθαδή, απυ πνςηεύκδ ηαζ RNA. Δ ίδζα ενεοκδηζηή μιάδα ανήηε πςξ δ δναζηζηυηδηα ηδξ RNase P μθείθεηαζ απμηθεζζηζηά ζηδκ RNA οπμιμκάδα, δ μπμία υηακ εθέβπεδηε in vitro, δζαπζζηχεδηε πςξ ιπμνεί κα ηαηαθφζεζ ηδκ ςνίιακζδ ηςκ πνυδνμιςκ ιμνίςκ trna απμοζία ηδξ πνςηεσκζηήξ οπμιμκάδαξ ηδξ RNase P ηαζ ιε ιμκαδζηή απαίηδζδ ηδ πανμοζία ζυκηςκ Mg 2+ (Guerrier-Takada et al 1983). Γζα ηδκ ακαηάθορδ ηςκ ηαηαθοηζηχκ αοηχκ RNA, πμο ζηδ ζοκέπεζα μκμιάζηδηακ νζαμέκγοια, μζ Cech ηαζ Altman έθααακ απυ ημζκμφ ημ ανααείμ Nobel Υδιείαξ ημ Ο θόζκνο ηνπ RNA Δ ακαηάθορδ ηςκ νζαμεκγφιςκ ιαγί ιε άθθεξ ένεοκεξ πμο πνμδβήεδηακ ηαζ αθμνμφζακ ηζξ ζδζυηδηεξ ηςκ RNA ιμνίςκ, υπςξ δ ακαηάθορδ ηςκ νεηνμσχκ πμο θένμοκ RNA ςξ πνςημβεκέξ βεκεηζηυ οθζηυ, μδήβδζε ζηδκ ηνμπμπμίδζδ ημο ηεκηνζημφ δυβιαημξ ηδξ ΐζμθμβίαξ (Δηθόλα 1), ηαεχξ επίζδξ ηαζ ζηδκ επακαθμνά ηαζ εκίζποζδ ηδξ εεςνίαξ ημο RNA ηυζιμο (Gilbert 1986). Εικόνα 1: Κεκηνζηυ δυβια ηδξ Μμνζαηήξ ΐζμθμβίαξ. ( ) Δ ανπζηή δζαηφπςζδ ημο ηεκηνζημφ δυβιαημξ ηδξ Μμνζαηήξ ΐζμθμβίαξ. ( ) Δ ηνμπμπμζδιέκδ ιμνθή ημο ηεκηνζημφ δυβιαημξ ηδξ Μμνζαηήξ ΐζμθμβίαξ, υπμο ημ RNA ειθακίγεηαζ ςξ έκα ιυνζμ ζηακυ κα ακηζβνάθεζ ημκ εαοηυ ημο, κα απμεδηεφεζ ηαζ ηαοηυπνμκα κα ιεηαθένεζ ηδ βεκεηζηή πθδνμθμνία, εκχ πθέμκ δ ζπέζδ ιεηαηνμπήξ ημο DNA ζε RNA είκαζ αιθίδνμιδ. Δ εεςνία ημο ηυζιμο ημο RNA πενζβνάθεζ πςξ ημ πνμαζμηζηυ πενζαάθθμκ πενζείπε μνβακζηά ιυνζα, υπςξ αιζκμλέα, οδνυλο-μλέα, ζάηπανα, πμονίκεξ, πονζιζδίκεξ ηαζ θζπανά μλέα, ηα μπμία ιπυνεζακ κα ζοκδοαζημφκ ηαζ κα ζπδιαηίζμοκ πμθοιενή ηοπαίαξ 28

30 Δηζαγσγή αθθδθμοπίαξ ηαζ ηαη επέηηαζδ ηοπαίαξ ζηενεμπδιείαξ (Δηθόλα 1. 1). Κάπμζα απυ αοηά ηα πμθοιενή, εκδεπμιέκςξ έπμκηαξ ζοβηεηνζιέκεξ ζδζυηδηεξ, υπςξ πνμζηυθδζδ ζε ακυνβακεξ επζθάκεζεξ, ακηίζηαζδ ζε απμζημδυιδζδ ή ηδκ ηάζδ κα ζπδιαηίγμοκ ιμνζαηά ζοζζςιαηχιαηα, ήηακ πζμ ζηαεενά ζηδκ δζάζπαζδ. Έηζζ, εεςνείηαζ πςξ πνμέηορε ημ πνχημ αζμθμβζηυ ζφζηδια ςξ ιζα ανπέβμκδ δελαιεκή (primordial pool) ιέζα ζηδκ μπμία ζοκοπήνπακ πμθοιενή νζαμκμοηθεμηζδίςκ ιε ηδκ ζηακυηδηα κα ακηζβνάθμοκ ημκ εαοηυ ημοξ, ιέζς ηδξ δδιζμονβίαξ γεοβχκ αάζεςκ ηαηά Watson-Crick. Με αοηυ ημ ηνυπμ ακηζβναθήξ, ηα ιυνζα οθίζηακηαζ ακαπυθεοηηα θάεδ, ηα μπμία πνμζδίδμοκ πμζηζθμιμνθία ζηα παναβυιεκα RNA ιυνζα, πςνίξ υιςξ αοηά κα πάκμοκ ηδκ θεζημονβζηυηδηά ημοξ. ε αοηυ ημ ζφζηδια υπμο οπήνπε έκαξ βεκζηυξ ιδπακζζιυξ ακηζβναθήξ-πμζηζθμιμνθίαξ, λεηίκδζε δ επίδναζδ ηδξ Ααναίκεζαξ ελεθζηηζηήξ πίεζδξ, ζφιθςκα ιε ηδκ μπμία ηα µυνζα RNA εα επζθέβμκηακ ακάθμβα ιε ηδκ αοημακηζβναθζηή ημοξ ζδζυηδηα ηαζ ηδκ ηαηαθοηζηή ημοξ δοκαηυηδηα ηαζ εα ζοζζςνεφμκηακ. Ώοηή δ δζαδζηαζία παναηηδνίγεζ ηδκ ανπή ηδξ γςήξ (Joyce 2002). Εικόνα 1. 1: ηάδζα ελέθζλδξ ηδξ ειθάκζζδξ ηδξ γςήξ ζηδ Γδ, ιε ηαηά πνμζέββζζδ πνμκμθμβίεξ ζε δζζεηαημιιφνζα έηδ. ηδκ ζοκέπεζα δδιζμονβήεδηακ ηα πνχηα αηοηηανζηά ζοζηήιαηα ιε ηδκ δζαιενζζιαημπμίδζδ αοηήξ ηδξ δελαιεκήξ απυ ιζα ζημζαάδα θζπζδίςκ ηαζ απυ ηα μπμία πνμέηορε μ μζημοµεκζηυξ πνμβεκκήημναξ (universal ancestor), υπςξ ημκ θακηάζηδηε μ Carl Woese (Woese 1998). Σέημζα ζοζηήµαηα εα µμζνάγμκηακ ηζξ µμνζαηέξ πνμζανµμβέξ µε μνζγυκηζα µεηαθμνά ηςκ βμκζδίςκ ηαζ εα ζοκελεθίζζμκηακ ζε ζοκεήηεξ έκημκδξ µεηαθθαηηζηυηδηαξ ζημοξ πνμβυκμοξ ηςκ ηοηηάνςκ, μζ μπμίμζ ζηδ ζοκέπεζα δδµζμφνβδζακ μ ηαεέκαξ ηδκ δζηζά ημο βεκεαθμβζηή ζζημνία. ε πνυζθαηδ πεζναιαηζηή ένεοκα δείπεδηε πςξ είκαζ εθζηηή δ ηαηαζηεοή εκυξ ζοζηήιαημξ δομ RNA εκγφιςκ ζηακχκ κα ηαηαθφμοκ ημ ηαεέκα ηδ ζφκεεζδ ημο εαοημφ ημο ηαζ ημο άθθμο, ιε ηδκ πανμοζία ηςκ ηεζζάνςκ ιυκμ ααζζηχκ κμοηθεμηζδίςκ, ζε ζηαεενή εενιμηναζία, απμοζία πνςηεσκζηχκ παναβυκηςκ ή άθθςκ αζμθμβζηχκ οθζηχκ. 29

31 Δηζαγσγή Μεηά απυ πμθθέξ ακηζβναθέξ πνμηφπημοκ ηαζκμφνβζα ιυνζα ιε ιεηαθθαβέξ πμο ζηζξ ζοβηεηνζιέκεξ ζοκεήηεξ ακηίδναζδξ οπενζζπφμοκ ηαζ επζηναημφκ ημο οπυθμζπμο πθδεοζιμφ. Ώοηυ οπήνλε ημ πνχημ πανάδεζβια ελεθζηηζηήξ πνμζανιμβήξ ηαζ εθανιμβήξ ημο πνχζιμο RNA ηυζιμο ζε ιμνζαηυ βεκεηζηυ ζφζηδια (Joyce 2009) Δμειηθηηθά θαηάινηπα ηνπ RNA θόζκνπ ζηνπο ζύγρξνλνπο νξγαληζκνύο Σδκ φπανλδ ημο RNA ηυζιμο ένπεηαζ κα οπμζηδνίλεζ δ ιεθέηδ ημο εκδζάιεζμο ιεηααμθζζιμφ ζημοξ ζφβπνμκμοξ μνβακζζιμφξ. ΐάζεζ ηδξ αζμπδιείαξ, υπςξ είκαζ αοηή βκςζηή ζήιενα, ζε ηάεε ηφηηανμ: I. Δ ζφκεεζδ ηςκ δεμλονζαμκμοηθεμηζδίςκ αημθμοεεί ηδ ζφκεεζδ ηςκ νζαμκμοηθεμηζδίςκ. II. Πνχηα πναβιαημπμζείηαζ δ ζφκεεζδ ηδξ μοναηίθδξ ηαζ έπεηαζ δ ιεεοθίςζή ηδξ βζα ηδκ παναβςβή ηδξ εοιίκδξ. III. Δ έκανλδ ηδξ ακηζβναθήξ ημο DNA πνμαπαζηεί ηδκ ζφκεεζδ RNA εηηζκδηχκ, πμο αέααζα ζηδ ζοκέπεζα απμζοκηίεεκηαζ ηαζ ακηζηαείζηακηαζ απυ DNA. IV. Δ ηνζθςζθμνζηή αδεκμζίκδ (ΏΣΡ) είκαζ μ θμνέαξ εκένβεζαξ ζε υθα ηα αζμθμβζηά ζοζηήιαηα ηαζ ιαγί ιε ημ camp απμηεθμφκ ηα εκδζάιεζα ιυνζα πμο ιεηαθένμοκ ιδκφιαηα ζε ηαηαννάηηεξ ακηζδνάζεςκ. V. Αζάθμνα αδεκζκμ-ζοκέκγοια ζοιιεηέπμοκ ζηα ιεηααμθζηά ιμκμπάηζα ηςκ μνβακζζιχκ, υπςξ NADH, NADPH, FADH 2, CoA. VI. Σα ιυνζα trna ειπθέημκηαζ ζηδ δζαδζηαζία ηδξ πνςηεσκμζφκεεζδξ, αθθά ηαζ ζηδ ζφκεεζδ ημο ηοηηανζημφ ημζπχιαημξ. VII. Δ φπανλδ RNA ιμνίςκ ιε ηαηαθοηζηέξ ζδζυηδηεξ, υπςξ δ RNase P, ηα αοημιαηζγυιεκα ζκηνυκζα ηαζ ημ νζαυζςια (23S rrna) ύγρξνλνο θόζκνο ηνπ RNA Ο RNA ηυζιμξ, υπςξ ημκ βκςνίγμοιε ζήιενα, δζαθένεζ απυ ημκ ανπέβμκμ, πμο πενζβνάθδηε πνμδβμοιέκςξ. Σα RNA ιυνζα ελαημθμοεμφκ ηαζ έπμοκ ζδιακηζηυ νυθμ ζηζξ ηοηηανζηέξ δζαδζηαζίεξ ηαζ ειθακίγμκηαζ, είηε ιε κέεξ πνμζανιμβέξ ηαζ ελεθζβιέκα απυ ηα ακηίζημζπα ανπέβμκα, είηε ςξ ιμνζαηά απμθζεχιαηα αοηχκ. 30

32 Δηζαγσγή Σα ηξία βαζηθά κόξηα RNA Σδκ πθεζμρδθία ηςκ RNA ιμνίςκ ζηα ζφβπνμκα αζμθμβζηά ζοζηήιαηα απμηεθμφκ ηνία ααζζηά είδδ RNA, ημ rrna (ribosomal RNA, νζαμζςιαηζηυ RNA), ημ mrna (messenger RNA, αββεθζμθυνμ RNA) ηαζ ημ trna (transfer RNA, ιεηαθμνζηυ RNA). Καζ ηα ηνία είκαζ απαναίηδηα βζα ηδκ μιαθή δζελαβςβή ηδξ δζαδζηαζίαξ ηδξ πνςηεσκμζφκεεζδξ. Σμ rrna ζοκηίεεηαζ ζημκ πονδκίζημ, ηαζ ιαγί ιε πμθθέξ πνςηεύκεξ μνβακχκεηαζ βζα κα δδιζμονβδεεί δ πνςηεσκμζοκεεηζηή δμιζηή ιμκάδα, ημ νζαυζςια. Σμ 2000 μ Thomas Steitz ηαζ μζ ζοκενβάηεξ ημο, ιε ηνοζηαθθμβναθζηέξ ιεευδμοξ, απέδεζλακ πςξ ημ εκενβυ ηέκηνμ ηδξ πεπηζδοθμηνακζθενάζδξ απμηεθείηαζ απμηθεζζηζηά απυ RNA, πμο ακήηεζ ζηδκ 23S οπμιμκάδα ημο ανπαίμο νζαμζχιαημξ (Nissen et al 2000). Σμ mrna ζοιαάθεζ ζηδκ πνςηεσκμζφκεεζδ, ιεζμθααχκηαξ ζηδκ πνυζηαζνδ απμεήηεοζδ ηδξ βεκεηζηήξ πθδνμθμνίαξ ηαζ ηδκ ιεηαθμνά ηδξ απυ ημκ πονήκα ζημ ηοηηανυπθαζια, υπμο ανίζημκηαζ ηα νζαμζχιαηα. Σμ trna είκαζ οπεφεοκμ βζα ηδ ζςζηή ιεηάθναζδ ημο βεκεηζημφ ηχδζηα, αθμφ είκαζ αοηυ πμο ιεηαθένεζ εζηενμπμζδιέκμ ζημ 3 άηνμ ημ ζοββεκέξ αιζκμλφ, πμο ηάεε θμνά πνέπεζ κα εκζςιαηςεεί ζηδκ ζςζηή εέζδ ηδξ κεμζοκηζεέιεκδξ πεπηζδζηήξ αθοζίδαξ. Σμ trna βζα ηάεε ηνζπθέηα αάζεςκ ημο ακηζηςδζηίμο θένεζ ηαζ ημ ακηίζημζπμ αιζκμλφ ζημ 3 άηνμ ημο ηαζ ημ ιεηαθένεζ ζημ νζαυζςια, υπμο δζελάβεηαζ δ ζφκεεζδ ηςκ πνςηεσκχκ Με θσδηθνπνηόλ RNA (non coding RNA) Μέπνζ ηζξ ανπέξ ηδξ δεηαεηίαξ ημο 80 δ επζζηδιμκζηή ημζκυηδηα εεςνμφζε πςξ ιυθζξ ημ 10% ημο βμκζδζχιαημξ είκαζ πνήζζιμ, δδθαδή αοηυ πμο ηςδζημπμζεί πνςηεύκεξ ηαζ ηα βκςζηά έςξ ηυηε ιυνζα RNA. Ώπυ ηυηε, υιςξ, µζα µεβάθδ πμζηζθία µμνίςκ RNA πμο δεκ ακήημοκ ζηα ηνία πνμακαθενεέκηα είδδ έπμοκ ακαηαθοθεεί, ηαζ βίκεηαζ υθμ ηαζ πζμ ζαθέξ υηζ έκα µεβάθμ πμζμζηυ ηδξ µεηαβναθζηήξ δναζηδνζυηδηαξ ημο βμκζδζχµαημξ έπεζ ζακ απμηέθεζµα ηδ ζφκεεζδ ηέημζςκ µμνίςκ, ηαηαννίπημκηαξ έηζζ ηδκ άπμρδ ημο άπνδζημο βεκεηζημφ οθζημφ (junk DNA). Σα ιυνζα αοηά βζα κα δζαηνίκμκηαζ απυ ημ mrna έπμοκ μκμιαζηεί ιδ ηςδζημπμζμφκηα RNA (noncoding RNAs, ncrnas) ηαζ έπμοκ πμζηίθεξ θεζημονβίεξ, υπςξ νφεµζζδ ηδξ µεηαβναθήξ, ειπθμηή ζημ ζπδιαηζζιυ ηςκ πνςµμζςµάηςκ, ζοιιεημπή ημοξ ζηδκ ηνμπμπμίδζδ ημο RNA, ζηαεενυηδηα ηαζ µεηάθναζδ ημο mrna ηαζ αηυµα απμζημδυµδζδ ηαζ πςνμεέηδζδ πνςηεσκχκ (Storz 2002). 31

33 Δηζαγσγή ε αοηή ηδκ ηαηδβμνία πενζθαιαάκμκηαζ ηα microrna (mirna), ιυνζα RNA πμο θαίκεηαζ κα ζοµµεηέπμοκ ζηδ νφειζζδ ηδξ έηθναζδξ ζοβηεηνζµέκςκ µμνίςκ mrna, πνμηαθχκηαξ ηδκ απμζημδυιδζή ημοξ (Krol et al 2010). Σα mirna είκαζ ιζηνά ιμκυηθςκα ιυνζα RNA ιεβέεμοξ κμοηθεμηζδίςκ (nt), ηα μπμία ιεηαβνάθμκηαζ, είηε απυ ηδκ ακηζκμδιαηζηή αθοζίδα ζε ζπέζδ ιε βκςζηά βμκίδζα (Rodriguez et al 2004). Σα πνυδνμια ιυνζα (pre-mirna, 70 nt) ιεηαβνάθμκηαζ απυ ηδκ RNA πμθοιενάζδ ΕΕ, θηζάπκμοκ παναηηδνζζηζηέξ δμιέξ θμονηέηαξ, μζ μπμίεξ απμηυπημκηαζ απυ ημ premirna απυ ιζα εζδζηή βζα δίηθςκμ RNA εκδμκμοηθεάζδ, ηδκ Drosha, ηαζ αθμφ ιεηαθενεμφκ ζημ ηοηηανυπθαζια εναφμκηαζ πνμξ χνζια mirna απυ ημ εκδμκμοηθεμθοηζηυ ζφιπθμημ DICER. Σα mirnas εεςνείηαζ υηζ ιπμνμφκ κα δνμοκ ιέζς ζηυπεοζδξ ιενζηχξ ζοιπθδνςιαηζηχκ πενζμπχκ ηςκ mrna ζηυπςκ, ηαηαζηέθμκηαξ έηζζ ηδκ ιεηάθναζή ημοξ. Βπίζδξ, δνμοκ πνμζδεκυιεκα ιε ηζξ πνςηεύκεξ ηδξ μζημβέκεζαξ Argonaute δδιζμονβχκηαξ έηζζ ημ ζφιπθμημ RISC (RNA Interference Silencing Complex), ημ μπμίμ πνμηαθεί εζδζηή εναφζδ ηςκ mrna ζηυπςκ (Valencia-Sanchez 2006) (Δηθόλα Η). Έπμοκ παναηηδνζζηεί πάκς απυ 400 mirna ζημκ άκενςπμ, ηαζ μ ανζειυξ ημοξ αολάκεηαζ ζοκεπχξ (Landgraf et al 2007). Πνμαέπεηαζ υηζ πενίπμο 30% υθςκ ηςκ ακενχπζκςκ βμκζδίςκ νοειίγμκηαζ απυ mirna (Lewis et al 2005). Πνχηα ημ θαζκυιεκμ αοηυ παναηδνήεδηε ζημ θοηυ πεημφκζα (Napoli et al 1990) ηαζ ιυθζξ ημ 1998 ιεθεηήεδηε εηηεκχξ ζημ βαζμζηχθδηα Caenorhabditis elegans (Fire et al 1998). ε αοηυκ ημκ μνβακζζιυ εκημπίζηδηακ ηα mirna, lin-4 ηαζ let-7, πμο ανέεδηε πςξ ηαηαζηέθθμοκ ηδκ έηθναζδ µμνίςκ mrna, µέζς ηδξ ζοιπθδνςιαηζηυηδηαξ πμο ειθακίγμοκ ιε ηα πνμξ απμζημδυιδζδ ιυνζα mrna (Fire et al 1998, Ruvkun 2001). Πανυµμζα µυνζα ακαηαθφθεδηακ ζηδ ζοκέπεζα ηαζ ζε άθθμοξ μνβακζζιμφξ ηαζ ζηα ζπμκδοθςηά, υπμο νοεµίγμοκ ημκ ζοβπνμκζζµυ ακαπηολζαηχκ θαζκμµέκςκ (Lagos-Quintana et al 2001). Πνυζθαηα πζζημπμζήεδηε υηζ ημ mirna ηδξ μζημβέκεζαξ ηςκ let-7 είκαζ ηαηαζημθέαξ ημο Εικόνα I: ΐζμζφκεεζδ ηςκ mirna. ακενχπζκμο RAS βμκζδίμο (Johnson et al 2005). Δ θακεαζιέκδ έηθναζδ πμθθχκ mirna έπεζ δεζπεεί 32

34 Δηζαγσγή κα είκαζ οπεφεοκδ βζα ηδκ ειθάκζζδ πμθθχκ αζεεκεζχκ ιεηαλφ ηςκ μπμίςκ ηαζ βζα ημκ ηανηίκμ (He et al 2005, Mraz et al 2009). Σα ιυνζα mirna ιαγί ιε ηα ιζηνά πανειααθθυιεκα RNA (sirna, small interfering RNA) ειπθέημκηαζ ζημ θαζκυιεκμ ηδξ ηαηαζημθήξ ιέζς RNA (RNA interference, RNAi). Σα sirna, επίζδξ, δνμφκ ςξ ακηζσηυξ ιδπακζζιυξ ή ζοιιεηέπμοκ ζημ ζπδιαηζζιυ ηδξ δμιήξ ηδξ πνςιαηίκδξ. H ζίβαζδ βμκζδίςκ, ιέζς RNA, απμηεθεί ακηζηείιεκμ έκημκδξ ενεοκδηζηήξ δναζηδνζυηδηαξ, ζημ μπμίμ έπμοκ εκαπμηεεεί πμθθέξ εθπίδεξ βζα ηδκ εεναπείαξ δζαθυνςκ αζεεκεζχκ (Slack ηαζ Weidhaas 2006). Πνυζθαηα ηαζ ζηα ααηηήνζα εκημπίζηδηε έκα άθθμ είδμξ ncrna, ημ tmrna (transfermessenger) (Δηθόλα ΗΗ). Σα µυνζα tmrna είκαζ πμθφ ζδιακηζηά βζα ηδκ μνεή δζελαβςβή ηδξ πνςηεσκμζφκεεζδξ, αθμφ έπμοκ ηδκ ζηακυηδηα κα εκημπίγμοκ ηςθουιεκα νζαμζχµαηα απυ ακχµαθεξ µμνθέξ mrna. Σμ ηµήµα m ημο tmrna απμδεζµεφεζ ημ πνμαθδµαηζηυ mrna απυ ημ νζαυζςµα, μπυηε ηαζ δζεοημθφκεηαζ δ απμζημδυιδζή ημο, εκχ ημ ηιήια t ημπμεεηείηαζ ζηδ εέζδ Ώ ημο νζαμζχιαημξ ηαζ εκζςιαηχκεζ ζημ οπυ ζφκεεζδ πμθοπεπηίδζμ ιζα αθακίκδ. Σμ ηµήµα m ηςδζημπμζεί µζα πεπηζδζηή αθθδθμοπία δ μπμία δίκεζ ημ ζήια ζημ οπυ ζπδµαηζζµυ πμθοπεπηίδζμ κα πνςηεμθοεεί. Πνυηεζηαζ βζα έκα θαζκυµεκμ, πμο εοκμεί ηδκ αζςζζµυηδηα Εικόνα ΙI: Σμ tmrna δζαεέηεζ δμιζηά ηςκ ααηηδνζαηχκ ηοηηάνςκ, ζε ζοκεήηεξ ζημζπεία υιμζα ηυζμ ιε ημ trna, υζμ ηαζ ιε ημ ακχµαθδξ µεηαβναθήξ βμκζδίςκ (Withey ηαζ mrna. TLD: trna-like domain, MLD: Friedman 2002). mrna-like domain. Άθθα ζδιακηζηά ncrna ιυνζα είκαζ ημ Xist πμο είκαζ απαναίηδημ βζα ηδκ απεκενβμπμίδζδ ημο Υ πνςµμζχµαημξ ζηζξ βοκαίηεξ (Wutz ηαζ Jaenisch 2000), ημ SRA (Steroid Receptor Activator) ζημκ άκενςπμ, ημ μπμίμ εκενβμπμζεί ημκ οπμδμπέα ηςκ ζηενμεζδχκ μνµμκχκ, δ RNA οπμµμκάδα ηδξ ακενχπζκδξ ηεθμµενάζδξ, ηα U18 C/D snorna (small nucleolar RNA) ηαζ snr8 H/ACA snorna ζημ Saccharomyces cerevisiae, ηα μπμία είκαζ οπεφεοκα βζα ηζξ πδµζηέξ ηνμπμπμζήζεζξ κμοηθεμηζδίςκ ημο rrna ηαζ ημο trna (Storz 2002, Kiss 2002). Σα snorna (Small nucleolar RNAs, snornas) είκαζ ιζα μιάδα ιζηνχκ RNA ιμνίςκ, πμο ηςδζημπμζμφκηαζ απυ ζκηνυκζα ηαζ είκαζ οπεφεοκα βζα ηζξ πδιζηέξ ηνμπμπμζήζεζξ κμοηθεμηζδίςκ πμο οθίζηακηαζ άθθα RNA, υπςξ νζαμζςιζηά, ιεηαθμνζηά ηαζ άθθα ιζηνά πονδκζηά RNA. Τπάνπμοκ δομ ηάλεζξ snorna, ηα C/D snorna, ηα μπμία ζπεηίγμκηαζ ιε 33

35 Δηζαγσγή ηδκ πναβιαημπμίδζδ 2 -Ο ιεεοθζχζεςκ ηςκ νζαμγχκ ηαζ ηα H/ACA snorna, ηα μπμία ζπεηίγμκηαζ ιε ημ ζπδιαηζζιυ ρεοδμμονζδζκχκ (Maden ηαζ Hughes 1997). Βπίζδξ, αοηυ ημ είδμξ ncrna ειπθέηεηαζ ζηδκ επελενβαζία mrna ηαζ ζηδκ δζεηπεναίςζδ επζβεκεηζηχκ ιδπακζζιχκ (Michalak 2006). Μζα άθθδ ηαηδβμνία θεζημονβζηχκ RNA ιμνίςκ είκαζ μζ RNA-δζαηυπηεξ (riboswitches). Πνυηεζηαζ βζα πενζμπέξ ζημ 5 άηνμ ηδξ ιδ ιεηαθναγυιεκδξ πενζμπήξ (5 - UTR) ηςκ ααηηδνζαηχκ mrna, πμο έπμοκ ηδκ ζδζυηδηα κα δεζιεφμοκ ιζηνά ιυνζα ζηυπμοξ, ζοκήεςξ ιεηααμθίηεξ, δ δέζιεοζδ ηςκ μπμίςκ επδνεάγεζ ηδκ έηθναζδ ημο βμκζδίμο (Batey 2006). Έκαξ RNA-δζαηυπηδξ είκαζ έκα απηαιενέξ ηαζ απμηεθεί έκα cis νοειζζηζηυ ζημζπείμ, ημ μπμίμ δεζιεφμκηαξ ημ ιυνζμ ζηυπμ πνμηαθεί δμιζηέξ αθθαβέξ ζημ mrna πμο ημ πενζέπεζ, ηέημζεξ χζηε κα επδνεάγεηαζ δ έηθναζή ημο. ΐάζεζ μιμθμβίαξ ηαζ ηδξ φπανλδξ ζοβηεηνζιέκςκ ιμηίαςκ, RNA-δζαηυπηεξ έπμοκ ανεεεί, εηηυξ απυ ηα ααηηήνζα ηαζ ζε ηάπμζα θοηά ηαζ ιφηδηεξ (Sudarsan et al 2003), εκχ ιυκμ έκα είδμξ RNA-δζαηυπηδ (ΣΡΡ: δεζιεφεζ πονμθςζθμνζηή εεζαιίκδ ηαζ νοειίγεζ ηδ αζμζφκεεζδ ηαζ ιεηαθμνά ηδξ εεζαιίκδξ) έπεζ ακζπκεοεεί κα είκαζ θεζημονβζηυ ζε εοηανοςηζημφξ μνβακζζιμφξ (Bocobza ηαζ Aharoni 2008). Μζα εζδζηή ηαηδβμνία RNA-δζαημπηχκ ηα RNA T-ημοηζμφ (Σ-box RNAs) πμο εκημπίγμκηαζ ζηδ 5' UTR πενζμπή ηςκ βμκζδίςκ πμο ηςδζημπμζμφκ αιζκμάηοθμ-trna ζοκεεηάζεξ ζε Gram εεηζηά ααηηήνζα (Maumita ηαζ Breaker 2004). ε πνυζθαηεξ ένεοκεξ έπεζ ανεεεί ιζα αηυια ηαηδβμνία ιζηνχκ RNA ιμνίςκ πμο εηθνάγμκηαζ ζε ζπμκδοθςηά ηαζ ζε αζπυκδοθα ηαζ μκμιάγμκηαζ pirna (Piwi-interacting RNA) (Seto et al 2007). Σα pirna ζπδιαηίγμοκ ζφιπθμηα, αθθδθεπζδνχκηαξ ιε ηζξ Piwi πνςηεύκεξ, πμο ακήημοκ ζηδκ μζημβέκεζα ηςκ Ώνβμκαοηχκ πνςηεσκχκ (Ago proteins). Ώοηά ηα ζφιπθμηα είκαζ οπεφεοκα βζα ηδ βμκζδζαηή απμζζχπδζδ ηςκ ιεηαεεηχκ ζημζπείςκ (transposons) ζηζξ βαιεηζηέξ ηοηηανζηέξ ζεζνέξ ηαζ ζοβηεηνζιέκα αοηχκ πμο ζοιιεηέπμοκ ζηδ ζπενιαημβέκεζδ. Πανυηζ δ αζμβέκεζδ ηςκ pirna δεκ είκαζ αηυια λεηάεανδ ηαζ δεκ δζαεέημοκ ζοκηδνδιέκεξ δμιέξ ή αθθδθμοπίεξ μιυθμβεξ ιεηαλφ ημοξ, έπεζ απμδεζπεεί πςξ ιπμνμφκ κα ηθδνμκμιδεμφκ απυ ηζξ ιδηένεξ ηαζ κα ζοιιεηάζπμοκ ζε επζβεκεηζημφξ ιδπακζζιμφξ (Brennecke et al 2008). Δ ακαηάθορδ υθςκ αοηχκ ηςκ ncrna έδςζε κέεξ δζαζηάζεζξ ζηδκ ένεοκα ηςκ ηοηηανζηχκ δζαδζηαζζχκ, πνμζδμηίεξ βζα ηδκ εεναπεία πμθθχκ βεκεηζηχκ αζεεκεζχκ, ηαεχξ ηαζ ηδκ επζαεααίςζδ βζα ηδκ φπανλδ πμθθχκ ηεκχκ, υζμκ αθμνά ηζξ βκχζεζξ ιαξ βζα ηδ βμκζδζαηή νφειζζδ. 34

36 Δηζαγσγή 2. Καηαιπηηθό RNA Όζηενα απυ ηδκ ακαηάθορδ ηδξ RNase P ηαζ ηςκ ζκηνμκίςκ ηδξ μιάδαξ Ε, ηαοημπμζήεδηακ ηαζ άθθα νζαμέκγοια ζηα μπμία εεςνείηαζ υηζ ακήηεζ ηαζ ημ νζαυζςια. ηδκ ηαηδβμνία ηςκ ηαηαθοηζηχκ RNA ζοβηαηαθθέβμκηαζ, επίζδξ, ηαζ άθθα θοζζηά νζαμέκγοια υπςξ ηα ζκηνυκζα ηδξ μιάδαξ ΕΕ, ημ ζθονμηέθαθμ νζαμέκγοιμ, ημ νζαμέκγοιμ θμονηέηα, αοηυ ημο ζμφ ηδξ δπαηίηζδαξ δ ηαζ ημ νζαμέκγοιμ Neurospora crassa. θα αοηά ηαηαηάζζμκηαζ, αάζεζ ημο ιεβέεμοξ ημοξ ηαζ ημκ ιδπακζζιυ ακηίδναζήξ ημοξ, ζε ιζηνά ηαζ ιεβάθα, υπςξ θαίκεηαζ ζημκ παναηάης πίκαηα. Μικπά πιβοένδςμα Ριβοένδσμο ηοσ ιού ηες επαηίηιδας δ Ριβοένδσμο θοσρκέηα θσροκέθαλο ριβοένδσμο Μεγάλα πιβοένδςμα Ινηρόνια ηες ομάδας Ι Ινηρόνια ηες ομάδας ΙΙ RNA σπομονάδα ηες RNase P Ριβοένδσμο ηες Neurospora crassa Πίνακας 2: Καηδβμνζμπμίδζδ νζαμεκγφιςκ αάζεζ ημο ιεβέεμοξ ημοξ. θα ηα ιζηνά νζαμέκγοια ηαζ ηα ζκηνυκζα ηςκ μιάδςκ Ε ηαζ ΕΕ ηαηαθφμοκ ακηζδνάζεζξ in cis, δδθαδή εκδμιμνζαηά, εκχ δ RNA οπμµμκάδα ηδξ νζαμκμοηθεάζδξ Ρ απμηεθεί ηδ ιμκαδζηή ελαίνεζδ ζημ υηζ δνα in trans, δδθαδή δνα δζαιμνζαηά, πνδζζιμπμζχκηαξ πμθθά ελςηενζηά οπμζηνχιαηα ηαζ είκαζ ιαγί ιε ημ νζαυζςια ηα δομ θοζζηά νζαμέκγοια πμο απακηχκηαζ ζε υθα ηα ηφηηανα (Hartmann et al 1995). Άθθα νζαμέκγοια πμο πνυζθαηα έπμοκ ακαηαθοθεεί είκαζ μ RNA-δζαηυπηδξ glms πμο ανίζηεηαζ ζηδ 5 ιδ ιεηαθναγυιεκδ πενζμπή ημο βμκζδίμο πμο ηςδζημπμζεί ηδ ζοκεεηάζδ ηδξ 6 θςζθμνζηήξ βθοημγαιίκδξ (GlcN6P) ηαζ πμο νοειίγεζ ηδ ζφκεεζδ αοημφ ημο εκγφιμο ιε αοημηαηάθοζδ ημο ίδζμο mrna (Collins et al 2007) ηαζ ημ νζαμέκγοιμ GIR1, πμο έπεζ ακαηαθοθεεί ζημ πνχηζζημ Didymium iridis ηαζ πανυηζ ιμζάγεζ δμιζηά ιε ηα ζκηνυκζα ηδξ μιάδαξ Ε, εκημφημζξ ηαηαθφεζ ηδκ οδνυθοζδ εκυξ θςζθμδζεζηενζημφ δεζιμφ ιε δζαθμνεηζηυ ιδπακζζιυ ηαηάθοζδξ (Nielsen ηαζ Johansen 2005). Σμ νζαμέκγοιμ ηςκ εδθαζηζηχκ CPEB3 ανίζηεηαζ ζημ δεφηενμ ζκηνυκζμ ημο βμκζδίμο CPEB3 ηαζ ακήηεζ ζε ιζα μζημβέκεζα βμκζδίςκ πμο νοειίγμοκ ηδκ πμθοαδεκοθίςζδ ηςκ mrna (Salehi- Ashtian et al 2006). Σέθμξ, έπεζ ανεεεί ημ νζαμέκγοιμ ηδξ α-ζθαζνίκδξ ζημκ άκενςπμ (Beta-globin co-transcriptional cleavage ribozyme, CotC ribozyme), πμο ανίζηεηαζ ζηδ 3 ιδ ιεηαθναγυιεκδ πενζμπή ημο βμκζδίμο ηδξ α-ζθαζνίκδξ ηαζ ζοιιεηέπεζ ζημ ηενιαηζζιυ 35

37 Δηζαγσγή ηδξ ιεηαβναθήξ ημο βμκζδίμο απυ ηδκ RNA πμθοιενάζδ ΕΕ (Σeixeira et al 2004). ζμκ αθμνά ηα ηαηαθοηζηά παναηηδνζζηζηά ηςκ νζαμεκγφιςκ, ιζηνχκ ηαζ ιεβάθςκ, μ θυβμξ k cat / K m είκαζ παµδθυξ ηαζ ημ K m ιε ημ k cat έπμοκ παιδθή ηζιή, οπμδδθχκμκηαξ ορδθή ζοββέκεζα βζα ηα οπμζηνχιαηά ημοξ ηαζ ανβή απεθεοεένςζδ ηςκ πνμσυκηςκ ακηίζημζπα, ιε απμηέθεζια ημκ βνήβμνμ ημνεζµυ ημο ηαηαθοηζημφ ημοξ ηέκηνμο. οιπεναζιαηζηά, ηα νζαμέκγοια είκαζ, ζοβηνζηζηά ιε ηα πνςηεσκζηά έκγοια, πμθφ πζμ ανβμί ηαηαθφηεξ. Ώοηά, υµςξ, ηα ηζκδηζηά παναηηδνζζηζηά ηαζνζάγμοκ µε ηδ θεζημονβία ηςκ νζαμεκγφιςκ, δ μπμία βζα ηζξ πενζζζυηενεξ πενζπηχζεζξ είκαζ δ ηαηάθοζδ µζαξ ακηίδναζδξ εκυξ ηφηθμο (single turnover reaction), υπςξ είκαζ δ απμημπή ημοξ απυ έκα µεβαθφηενμ µυνζμ. Σα νζαμέκγοια ηαζ ηςκ δομ μιάδςκ έπμοκ απμηεθέζεζ εθηοζηζηυ ενεοκδηζηυ ενβαθείμ ζηδκ ζαηνζηή αζμπδιεία βζα εεναπεία βεκεηζηχκ αζεεκεζχκ ιε ηδ ιέεμδμ ηδξ βμκζδζαηήξ εεναπείαξ (Kalavrizioti et al 2006) Μηθξά ξηβνέλδπκα ε αοηήκ ηδκ ηαηδβμνία ακήηεζ ημ νζαμέκγοιμ θμονηέηα (hairpin ribozyme), ημ νζαμέκγοµμ ημο ζμφ ηδξ δπαηίηζδαξ δ (HDV ribozyme), ημ νζαμέκγοµμ απυ ηα µζημπυκδνζα ηδξ Neurospora crassa (VS RNA) ηαζ ημ ζθονμηέθαθμ νζαμέκγοιμ (hammerhead ribozyme). Σμ µέβεεμξ ημοξ ηοιαίκεηαζ απυ ~35 έςξ ~164 ntα ηαζ πνμηαθμφκ εζδζηή οδνυθοζδ ημο εαοημφ ημοξ. Δ ακηίδναζδ πμο ηαηαθφμοκ είκαζ ιζα ηνακζεζηενμπμίδζδ ιε ιδπακζζιυ S N 2, υπμο δ 2 οδνμλοθμµάδα ηδξ νζαυγδξ δνά ζακ ημ κμοηθευθζθμ, βζα ηδκ πνμζαμθή ηαζ εναφζδ ημο θςζθμδζεζηενζημφ δεζµμφ ηαζ ηα πνμσυκηα πμο πνμηφπημοκ έπμοκ 2-3 ηοηθζηυ θςζθμνζηυ άηνμ ηαζ 5 οδνμλφθζμ (Δηθόλα 2. 1). Εικόνα 2. 1.: Μδπακζζιυξ ηαηάθοζδξ ηςκ ιζηνχκ νζαμεκγφιςκ. Μέζα ζε πανέκεεζδ ηαζ ιε ημ ζφιαμθμ ffi ζδιεζχκμκηαζ μζ ιεηαααηζηέξ ηαηαζηάζεζξ. (Fedor ηαζ Williamson 2005). 36

38 Δηζαγσγή Σα νζαμέκγοια θμονηέηα ηαζ ζθονμηέθαθμ έπμοκ ανεί εηηεκή πνήζδ ζε εθανιμβέξ βμκζδζαηήξ απμζζχπδζδξ, υπςξ ηδ εναφζδ ζσηχκ RNA, ηδκ ανκδηζηή νφειζζδ μβημβυκςκ mrna, ημκ έθεβπμ ηδξ βμκζδζαηήξ έηθναζδξ in vivo ηαζ εα πενζβναθμφκ ζηδ ζοκέπεζα ακαθοηζηά θπξνθέθαιν ξηβνέλδπκν (hammerhead ribozyme) Tμ ζθονμηέθαθμ νζαμέκγοιμ είκαζ έκα ιζηνυ RNA πμο έπεζ ακζπκεοεεί ηαζ απμιμκςεεί απυ ανηεημφξ παεμβυκμοξ ζμφξ ηαζ ζμεζδή ηςκ θοηχκ, υπςξ ημ δμνοθμνζηυ RNA ημο δαηηοθζμεζδή ζμφ ημο ηαπκμφ [αθοζίδα (+), +strsv], ζημοξ μπμίμοξ δζεοημθφκεζ ηδκ ακηζβναθή ημο βμκζδζχιαηυξ ημοξ (Forster ηαζ Symons 1987, Long ηαζ Uhlenbeck 1993). ημοξ παεμβυκμοξ ζμφξ ηςκ θοηχκ δ ακηζβναθή ημο βεκεηζημφ οθζημφ βίκεηαζ ιε ημκ ιδπακζζιυ ημο ηοθζυιεκμο ηφηθμο (rolling cycle mechanism, Branch ηαζ Robertson 1984). Σμ ηοηθζηυ ημοξ πνςιυζςια ακηζβνάθεηαζ ηαη επακάθδρδ ηαζ ηα πμθθαπθά ιεηάβναθα ιεηαηνέπμκηαζ, ζηδκ ζοκέπεζα, ζε απθά ακηίβναθα ιε ηδκ αοημηαηαθοηζηή δνάζδ ζθονμηέθαθςκ ιμηίαςκ. Έπεζ, επίζδξ, ανεεεί ζε ανηεημφξ εοηανοςηζημφξ μνβακζζιμφξ ηαζ γχα, υπςξ ζηδ ζαθαιάκδνα, υπμο ειπθέηεηαζ ζηδκ αοημηαηάθοζδ ηςκ ιεηαβνάθςκ ημο δμνοθμνζημφ ημοξ DNA (Epstein ηαζ Gall 1987). Σμ ζθονμηέθαθμ νζαμέκγοιμ απαζηεί ηδκ πανμοζία δζζεεκχκ ηαηζυκηςκ βζα ηδκ θεζημονβζηή ημο δζαιυνθςζδ, υπςξ ημ Mg +2. Πανυθα αοηά, ιεθέηεξ έπμοκ δείλεζ πςξ ορδθέξ ζοβηεκηνχζεζξ ιμκμζεεκχκ ζυκηςκ, ακάιεζά ημοξ ημ Na +, ημ Li + + ηαζ ημ NH 4 ιπμνμφκ κα ακηζηαηαζηήζμοκ επανηχξ ημ Mg 2+ (O Rear et al 2001, Curtis ηαζ Bartel 2001). Δ πζμ ηαθά παναηηδνζζιέκδ πενζμπή ζημ νζαμέκγοιμ αοηυ πμο δεζιεφεζ ζυκηα είκαζ ηα κμοηθεμηίδζα A9/ G10.1, εκχ άθθα βκςζηά κμοηθεμηίδζα πμο αθθδθεπζδνμφκ ιε ηα ζυκηα είκαζ ηα G5 ηαζ A13 πμο ανίζημκηαζ ημκηά ζημ ηαηαθοηζηυ ηέκηνμ (Hansen et al 1999) (Δηθόλα A). Δ δεοηενμηαβήξ δμιή είκαζ ημζκή ζε υθα ηα ιμηίαα ηςκ ζθονμηέθαθςκ νζαμεκγφιςκ ηαζ απμηεθείηαζ απυ ηνεζξ έθζηεξ πμο ανζειμφκηαζ απυ ημ Ε έςξ ΕΕΕ, μζ μπμίεξ ζοκδέμκηαζ ιέζς δομ πενζμπχκ ιμκήξ αθοζίδαξ, πμο θένμοκ ηαζ ημκ ηαηαθοηζηυ πονήκα ημο ιμνίμο (Δηθόλα ) (Rujner et al 1990). Οζ εθζημεζδείξ πενζμπέξ απμηεθμφκηαζ απυ ιδ ζοκηδνδιέκα κμοηθεμηίδζα, εκχ μζ πενζμπέξ ηςκ ιμκχκ αθοζίδςκ πενζέπμοκ δζαηδνδιέκα κμοηθεμηίδζα πμο είκαζ ζδιακηζηά βζα ηδκ ηαηάθοζδ. Ώοηυ ημ νζαμέκγοιμ έπεζ ηνμπμπμζδεεί, έηζζ χζηε κα δνα δζαιμνζαηά, έκακηζ άθθςκ RNA ιμνίςκ ζηυπςκ ηαζ κα ηαηαθφεζ ηδ εναφζδ εκυξ ζοβηεηνζιέκμο θςζθμδζεζηενζημφ 37

39 Δηζαγσγή δεζιμφ βζα ηδκ παναβςβή πνμσυκηςκ ιε 2-3 -ηοηθζηά θςζθμνζηά ηαζ 5 -οδνμλοθζηά άηνα (Uhlenbeck 1987, Haseloff ηαζ Gerlach 1988). Εικόνα : Σμ ζθονμηέθαθμ νζαμέκγοιμ. (Α) Αεοηενμηαβήξ δμιή εκυξ θοζζημφ νζαμεκγφιμο (Schistosoma mansoni). Δ αθοζίδα πμο δζαζπάηαζ είκαζ πνςιαηζζιέκδ ιε ηυηηζκμ. Σα ζοκηδνδιέκα κμοηθεμηίδζα είκαζ ζδιεζςιέκα ιε πθάβζα βνάιιαηα. Οζ ιαφνεξ βναιιέξ ηαζ μζ ηεθείεξ ακαπανζζημφκ γεφβδ αάζεςκ ζπδιαηζγυιεκα, είηε ηαηά Watson-Crick, είηε υπζ, ακηίζημζπα. Οζ πνςιαηζζηέξ βναιιέξ ζοιαμθίγμοκ ηδ ζοκέπεζα ημο ζηεθεημφ ηςκ θςζθμδζεζηενζηχκ δεζιχκ ημο ιμνίμο. Σμ κμοηθεμηίδζμ πμο ανίζηεηαζ ζημ 5 άηνμ ημο ζδιείμο εναφζδξ (C17) ζδιεζχκεηαζ ιε πμνημηαθί πνχια. Σμ αέθμξ δείπκεζ ημκ δζαζπυιεκμ δεζιυ. Σα ιπθέ αέθδ δείπκμοκ ηα οπεφεοκα κμοηθεμηίδζα πμο δεζιεφμοκ ηα Mg 2+. (Β) Κνοζηαθθζηή δμιή ημο ίδζμο ιμνίμο (PDBID. 2GOZ, Martick ηαζ Scott 2006). Δ δζαζπυιεκδ αθοζίδα θαίκεηαζ ιε ηυηηζκμ ηαζ ημ κμοηθεμηίδζμ ζημ 5 άηνμ ημο ζδιείμο εναφζδξ ιε πμνημηαθί Ρηβνέλδπκν θνπξθέηα (hairpin ribozyme) Σμ ιμηίαμ ημο νζαμεκγφιμο θμονηέηα, ανπζηά, ακζπεεφεδηε ζηδκ αθοζίδα (-) ημο δμνοθμνζημφ RNA ημο δαηηοθμεζδή ζμφ ημο ηαπκμφ (-strsv) (Buzayan et al 1986), ημ ίδζμ RNA πμο θένεζ έκα ζθονμηέθαθμ νζαμέκγοιμ ζηδκ εεηζηή ημο αθοζίδα ( 2.1.1). Σμ νζαμέκγοιμ θμονηέηα ζοιιεηέπεζ ζηδκ ςνίιακζδ πμθθχκ ιεηαβνάθςκ ημο βμκζδζχιαημξ ημο ζμφ, αθθά είκαζ οπεφεοκμ ηαζ βζα ηδκ ζοκκέκςζδ ηςκ ιεηαβνάθςκ αοηχκ, πανάβμκηαξ ηοηθζηά RNA ιυνζα (Fedor 2000). Σμ ηαηαθοηζηυ ιμηίαμ απμηεθείηαζ απυ δφμ ακελάνηδηα ακαδζπθχιεκεξ πενζμπέξ (Ε, ΕΕ) πμο ζοκδέμκηαζ ιε δζαζηαφνςζδ ηεζζάνςκ ηαηεοεφκζεςκ (four-way junction) (Δηθόλα ). Δ ηάεε πενζμπή, Ε ηαζ ΕΕ, απμηεθείηαζ απυ δφμ έθζηεξ πμο δζαπςνίγμκηαζ απυ ιζα εζςηενζηή εδθεζά (εδθεζά Ώ ηαζ ΐ, ακηίζημζπα). Καζ μζ δομ εδθεζέξ πενζέπμοκ ζοκηδνδιέκα κμοηθεμηίδζα απαναίηδηα βζα ηδκ ηαηάθοζδ, εκχ βζα κα επζηεοπεεί δ ηαηάθοζδ, ημ νζαμέκγοιμ οζμεεηεί ιζα ζοιπαβή δζαιυνθςζδ ( docked state ), πμο 38

40 Δηζαγσγή δζεοημθφκεζ ηζξ αθθδθεπζδνάζεζξ ηαηά Watson-Crick ιεηαλφ ηςκ εδθεζχκ Ώ ηαζ ΐ (Rupert ηαζ Ferré-D Amaré 2001). Μεθέηεξ ιεηαθθάλεςκ έδεζλακ πςξ δ αθθδθμοπία N*GUC είκαζ απαναίηδηδ βζα ηδ δναζηζηυηδηα ημο νζαμεκγφιμο (υπμο μ αζηενίζημξ ζοιαμθίγεζ ημ ζδιείμ εναφζδξ ημο δεζιμφ (Anderson et al 1994). πςξ ζοιααίκεζ ηαζ ζηδ πενίπηςζδ ημο ζθονμηέθαθμο νζαμεκγφιμο, ηα δζζεεκή ηαηζυκηα δεκ ζοιιεηέπμοκ άιιεζα ζημ ιδπακζζιυ ηαηάθοζδξ ημο νζαμεκγφιμο θμονηέηα, αθθά θαίκεηαζ κα παίγμοκ νυθμ ζηδκ οζμεέηδζδ ηδξ ζςζηήξ ημο δζαιυνθςζδξ. Δ ζςζηή ακαδίπθςζδ ημο νζαμεκγφιμο ιπμνεί κα επζηεοπεεί ηυζμ απυ δζζεεκή (Mg 2+, Ca 2+, Sr 2+ ), υζμ ηαζ απυ ιμκμζεεκή ζυκηα (Na +, Li +, NH + 4 ), ζε ιεβαθφηενεξ, αέααζα, ζοβηεκηνχζεζξ ζοβηνζηζηά ιε ηα δζζεεκή (Chowrira et al 1993, Murray et al 1998, Walter et al 1998). Έπεζ, επίζδξ, δεζπεεί πςξ μζ ζμκηζηέξ απαζηήζεζξ βζα ηδκ ακηίδναζδ ηδξ ζοκέκςζδξ είκαζ πανυιμζεξ ιε αοηέξ ηδξ δζάζπαζδξ ημο θςζθμδζεζηενζημφ δεζιμφ (Chowrira et al 1993). Εικόνα : Σμ νζαμέκγοιμ θμονηέηα. (A) Αεοηενμηαβήξ δμιή ηαζ (Β) Σνζημηαβήξ δμιή (PDBID. 1M5K, Rupert et al 2002) εκυξ θοζζημφ ιμηίαμο θμονηέηαξ (Pley et al 1994). Οζ πενζμπέξ Ώ ηαζ ΐ πνςιαηίγμκηαζ ιε ιπθέ ηαζ ηυηηζκμ, ακηίζημζπα. Σα ιυα κμοηθεμηίδζα ζπδιαηίγμοκ ηδ δζαζηαφνςζδ ηεζζάνςκ ηαηεοεφκζεςκ. Σμ κμοηθεμηίδζμ πμο ανίζηεηαζ ζημ 5 άηνμ ημο ζδιείμο εναφζδξ ζδιεζχκεηαζ ιε πμνημηαθί. Σμ αέθμξ δείπκεζ ημ ζδιείμ εναφζδξ Μεγάια ξηβνέλδπκα ηδ ηαηδβμνία ηςκ ιεβάθςκ νζαμεκγφιςκ ακήημοκ ηα αοημηαηαθουιεκα ζκηνυκζα ηδξ μιάδαξ Ε ηαζ ΕΕ, δ RNA οπμιμκάδα ημο μθμεκγφιμο RNase P, ηαεχξ επίζδξ, θυβς ημο ιεβέεμοξ ημο, ημ νζαυζςια. Σμ ιέβεευξ ημοξ πμζηίθεζ απυ 200 ιέπνζ ηαζ 3000 nt ηαζ ηαηαθφμοκ ακηζδνάζεζξ ηνακζεζηενμπμίδζδξ ιε S N 2 πονδκυθζθδ ακηζηαηάζηαζδ, πανάβμκηαξ πνμσυκηα ιε 5 -Ρ and 3 -OH άηνα (Steitz ηαζ Steitz 1993) (Δηθόλα 2. 2). ηζξ επυιεκεξ παναβνάθμοξ εα βίκεζ πζμ δζελμδζηή ακαθμνά ζηα ιεβάθα νζαμέκγοια. 39

41 Δηζαγσγή Καζ ηα ιεβάθα νζαμέκγοµα έπμοκ απαίηδζδ ζε δζζεεκή ηαηζυκηα ηαζ ηονίςξ ζε Mg 2+, βζα δναζηζηυηδηα ηαζ εεςνμφκηαζ ζακ µζα ηαηδβμνία µεηαθθμεκγφµςκ (Pyle 2002). Έπεζ πνμηαεεί έκα βεκζηυ µμκηέθμ µδπακζζµμφ ακηίδναζδξ ζημ μπμίμ ζοµµεηέπμοκ δφμ ηαηζυκηα µεηάθθμο (two metal ion reaction mechanism). Σμ µμκηέθμ αοηυ είκαζ ααζζζµέκμ ζημ µδπακζζµυ ακηίδναζδξ ηςκ πνςηεσκζηχκ µεηαθθμεκγφµςκ ηαζ εα ακαθενεεί ακαθοηζηά ζηδ ζοκέπεζα (Steitz ηαζ Steitz 1993). Εικόνα 2. 2.: Μδπακζζιυξ ηαηάθοζδξ ηςκ ιεβάθςκ νζαμεκγφιςκ. Μέζα ζε πανέκεεζδ ηαζ ιε ημ ζφιαμθμ ffi ζδιεζχκμκηαζ μζ ιεηαααηζηέξ ηαηαζηάζεζξ. (Fedor ηαζ Williamson 2005) Ηληξόληα ηεο νκάδαο Η θαη ΗΗ Σα ζκηνυκζα μιάδαξ I, ηςκ μπμίςκ ημ ιέβεεμξ πμζηίθεζ απυ 200 ιέπνζ 1500 nt, έπμοκ ακζπκεοεεί ζε ζπεδυκ υθμοξ ημοξ μνβακζζιμφξ, ηυζμ ζε πνμηανοχηεξ ηαζ εοηανοχηεξ, υζμ ηαζ ζε οπμηοηηανζηά μνβακίδζα ηαζ ημκ T4 ααηηδνζμθάβμ. Ώοηά ηα νζαμέκγοια ανπζηά απμιμκχεδηακ απυ ημ ααηηήνζμ T. thermophila ηαζ μ ιδπακζζιυξ αοημηαηάθοζήξ ημοξ πενζβνάθδηε, υπςξ πνμακαθένεδηε, απυ ημκ Cech (Cech 1990). Δ δεοηενμηαβήξ δμιή ηςκ ζκηνμκίςκ ηδξ μιάδαξ Ε απμηεθείηαζ απυ δέηα ζοκηδνδιέκεξ δίηθςκεξ πενζμπέξ πμο ζοιαμθίγμκηαζ ςξ Ρ1-Ρ10 (Δηθόλα Η Β) (Puerta-Fernandez et al 2003). Σμ 5 άηνμ ημο ζδιείμο εναφζδξ ηαεμνίγεηαζ απυ ημ ζπδιαηζζιυ ημο ζοκηδνδιέκμο γεφβμοξ αάζεςκ U-G ακμδζηά ηδξ εέζδξ ιαηίζιαημξ. Σμ ελυκζμ ζημ 5 άηνμ ημο ζκηνμκίμο, ζηδ ζοκέπεζα, πνμζαάθεζ ημ 3 άηνμ ημο ζκηνμκίμο, ημ μπμίμ ανίζηεηαζ ηαεμδζηά εκυξ κμοηθεμηζδίμο G ηαζ ηαηαθήβεζ ζηδ ζφκδεζδ ηςκ δομ ελμκίςκ ηαζ ηδκ απεθεοεένςζδ ημο βναιιζημφ ζκηνμκίμο (Flor et al 1989, Cech 1990) (Δηθόλα Η Α). Σα δμιζηά πζμ πμθφπθμηα νζαμέκγοια πμο απακηχκηαζ ζηδ θφζδ είκαζ ηα ζκηνυκζα ηδξ μιάδαξ ΕΕ. Σα ζκηνυκζα μιάδαξ II έπμοκ ανεεεί ζε πνμηανοςηζημφξ μνβακζζιμφξ, αθθά ηαζ ζε ανηεηά οπμηοηηανζηά μνβακίδζα. Σμ ιέβεευξ ημοξ ηοιαίκεηαζ απυ 300 ιέπνζ 3000 nt. Αμιζηά απμηεθμφκηαζ απυ 6 έθζηεξ (I-VI) πμο πνμελέπμοκ απυ έκα ηεκηνζηυ πονήκα 40

42 Δηζαγσγή (Bonen ηαζ Vogel 2001) (Δηθόλα II), αθθά ιυκμ μζ πενζμπέξ I ηαζ V έπεζ ανεεεί κα παίγμοκ ζδιακηζηυ νυθμ ζηδκ ηαηάθοζδ. Δ έθζηα Ε πενζέπεζ ηζξ εζδζηέξ αθθδθμοπίεξ EBS1 ηαζ EBS2 (Exon Binding Sequence 1 and 2), μζ μπμίεξ αθθδθεπζδνμφκ ιε ηζξ αθθδθμοπίεξ IBS1 ηαζ IBS2 (Intron Binding Sequence 1 and 2) (Δηθόλα II Α). Δ αθθδθεπίδναζδ αοηή είκαζ απαναίηδηδ βζα ηδκ ακαβκχνζζδ ημο 5 ελμκίμο. ζμκ αθμνά ηδκ πενζμπή V, έπεζ ακαθενεεί πςξ θένεζ ημ ηαηαθοηζηυ ηέκηνμ ημο νζαμεκγφιμο (Koch et al 1992, Michel et al 1989). Δ ηαηάθοζδ ηςκ ζκηνμκίςκ ηδξ μιάδαξ ΕΕ πενζθαιαάκεζ δφμ ακηζδνάζεζξ ηνακζεζηενμπμίδζδξ, υπςξ ζηδκ πενίπηςζδ ηςκ ζκηνμκίςκ ηδξ μιάδαξ Ε. Ο ιδπακζζιυξ ηαηάθοζδξ πανμοζζάγεζ ηάπμζεξ ααζζηέξ δζαθμνέξ, υπςξ βζα πανάδεζβια δ πνμζαμθή ηδξ εέζδξ ιαηίζιαημξ 5 πναβιαημπμζείηαζ απυ ηδκ 2 -ΟΔ ιζαξ αδεκμζίκδξ πμο είκαζ ιένμξ ημο ζκηνμκίμο (Δηθόλα II Α), ζε ακηίεεζδ ιε έκα ελςηενζηυ κμοηθεμηίδζμ βμοακίκδξ πμο απαζηείηαζ βζα ηδκ ηαηάθοζδ ηςκ ζκηνμκίςκ ηδξ μιάδαξ Ε. Πνυζθαηα δδιμζζεφηδηε απυ ηδκ Pyle ηαζ ημοξ ζοκενβάηεξ ηδξ δ ηνοζηαθθζηή δμιή ημο ζκηνμκίμο ηδξ μιάδαξ ΕΕ, πμο απμιμκχεδηε απυ ημ ααηηήνζμ Oceanobacillus iheyensis δίκμκηαξ απακηήζεζξ βζα ηδ ημζκή ελέθζλδ αοηήξ ηδξ μιάδαξ ζκηνμκίςκ απυ ηα ααηηήνζα εχξ ημκ άκενςπμ (Toor et al 2008) (Δηθόλα II Β). Εικόνα Ι: Εκηνυκζμ ηδξ μιάδαξ Ε. (Α) Μδπακζζιυξ ηαηάθοζδξ ηςκ ζκηνμκίςκ ηδξ μιάδαξ Ε. (Β) Σνζημηαβήξ δμιή ημο ζκηνμκίμο ηδξ μιάδαξ Ε (PDBID. 1U6B, Saito ηαζ Inoue 2007). Σα δμιζηά ζημζπεία είκαζ πνςιαηζζιέκα. Με πνάζζκμ ειθακίγεηαζ δ πενζμπή Ρ4-Ρ6 πμο είκαζ οπεφεοκδ βζα ηδ πνυζδεζδ ηςκ ζυκηςκ Mg 2+. Σα ζκηνυκζα ηαζ ηςκ δφμ μµάδςκ πανμοζζάγμοκ πμθφπθμηδ δεοηενμηαβή ηαζ ηνζημηαβή δμµή, δ μπμία ζηαεενμπμζείηαζ µε ηδ αμήεεζα δζζεεκχκ ηαηζυκηςκ, υπςξ ημ Mg 2+ (Pyle 2002, Rangan ηαζ Woodson 2003). Πανυθμ πμο ηα ζκηνυκζα ηςκ δφμ μµάδςκ δζαθένμοκ ζηζξ δμµέξ ηαζ ζημοξ µδπακζζµμφξ µαηίζµαημξ, πανμοζζάγμοκ αλζμζδµείςηδ μµμζυηδηα 41

43 Δηζαγσγή ζημκ ηνυπμ µε ημκ μπμίμ ελεθίπεδηακ μζ ακηζδνάζεζξ πμο ηαηαθφμοκ. Βίκαζ πμθφ εκδζαθένμκ πςξ ημοθάπζζημκ μνζζµέκεξ απυ ηζξ πνςηεύκεξ πμο ηςδζημπμζμφκηαζ εκηυξ ηςκ ζκηνμκίςκ, υπςξ μζ DNA εκδμκμοηθεάζεξ βζα ηα ζκηνυκζα ηδξ μµάδαξ Ε ηαζ μζ ακηίζηνμθεξ µεηαβναθάζεξ ηςκ ζκηνμκίςκ ηδξ μµάδαξ ΕΕ, ζοιιεηέπμοκ ζηδκ ηζκδηζηυηδηα ηςκ ζκηνμκίςκ ςξ µεηαεεηά βεκεηζηά ζημζπεία (Lambowitz ηαζ Zimmerly 2010). Εικόνα IΙ: Αμιή ζκηνμκίμο ηδξ μιάδαξ ΕΕ. (Α) Αεοηενμηαβήξ δμιή ζκηνμκίμο ηδξ μιάδαξ ΕΕ. Με ιπθέ θαίκμκηαζ μζ αθθδθμοπίεξ EBS1 ηαζ IBS1 ηαζ ιε πνάζζκμ EBS2 ηαζ IBS2. Βπίζδξ, θαίκμκηαζ ηα δφμ αήιαηα ιαηίζιαημξ πμο πναβιαημπμζμφκηαζ. (Β) Κνοζηαθθζηή δμιή ζκηνμκίμο ηδξ μιάδαξ ΕΕ απυ ημ Oceanobacillus iheyensis (PDBID. 3BWP, Toor et al 2008) Ρηβόζσκα Σμ νζαυζςια, υπςξ πνμακαθένεδηε, απμηεθεί έκα νζαμέκγοιμ ηαζ ημ ιμκαδζηυ έκγοιμ ζηδ θφζδ ιε δνάζδ πμθοιενάζδξ πμο ααζίγεηαζ ζηδ πανμοζία ημο RNA. Σμ νζαμζςιζηυ RNA ειπθέηεηαζ ζε υθα ηα αήιαηα ηδξ πνςηεσκμζφκεεζδξ, ζηδ δέζιεοζδ ηςκ ιεηαθναζηζηχκ παναβυκηςκ, ζηδ δέζιεοζδ ημο mrna, ζηδ ζοβηνυηδζδ ηςκ οπμιμκάδςκ, ζηδ ημπμεέηδζδ ηαζ ιεηαηυπζζδ ηςκ οπμζηνςιάηςκ trna, ζηδκ ακαβκχνζζδ ηςκ ζςζηχκ trna ηαζ ζηδ δναζηζηυηδηα ηδξ πεπηζδοθμηνακζθενάζδξ. Σμ νζαυζςµα εεςνείηαζ µζα δμµή πμο ζπδµαηίζηδηε ηδκ επμπή πμο επζηναημφζακ ηα RNA µυνζα ηαζ απμηεθμφηακ απμηθεζζηζηά απυ RNA, εκχ ζηδ ζοκέπεζα ζοκέααθθε ηαεμνζζηζηά ζηδκ εβηαείδνοζδ ηςκ πνςηεσκχκ ζημοξ µμνζαημφξ µδπακζζµμφξ ηςκ πνςημηοηηάνςκ. Λυβς ηδξ ειθάκζζήξ ημο ζημκ ανπέβμκμ ηυζιμ ημο RNA, ηδξ ελεθζηηζηήξ ημο πμνείαξ ηαζ ηδξ θεζημονβζηήξ ημο ζδιακηζηυηδηαξ, ημ νζαυζςια ηαζ πζμ ζοβηεηνζιέκα 42

44 Δηζαγσγή ημ νζαμζςιαηζηυ RNA πνδζζιμπμζείηαζ πμθφ ζοπκά βζα θοθμβεκεηζηέξ ιεθέηεξ, βζ αοηυ ηαζ δ πεναζηένς δζαθεφηακζδ ηςκ θεζημονβζηχκ παναηηδνζζηζηχκ αοημφ ημο ιμνίμο εα δχζεζ ζδµακηζηέξ πθδνμθμνίεξ βζα ηδκ µμνζαηή θοθμβέκεζδ ηςκ ζοζηαηζηχκ ημο ηοηηάνμο. ΐζμπδιζηέξ ηαζ ηνοζηαθθμβναθζηέξ ιεθέηεξ ηδξ 50S οπμιμκάδαξ ημο νζαμζχιαημξ απυ ημ ανπαίμ Haloarcula martismortui έδεζλακ πςξ ημ 23S rrna απμηεθεί ημ θεζημονβζηυ ζοζηαηζηυ ημο ηαηαθοηζημφ ηέκηνμο ηδξ πεπηζδοθμηνακζθενάζδξ (Noller 1992, Green ηαζ Noller 1997, Ban et al 2000, Nissen et al 2000) (Δηθόλα Α). Με αοηυκ ημκ ηνυπμ επζηνάηδζε δ άπμρδ υηζ ημ νζαυζςια απμηεθεί έκα νζαμέκγοιμ (Steitz και Moore 2003). Ώπυ ηζξ ανπέξ ηδξ δεηαεηίαξ ημο 90 οπήνπακ ζζπονέξ εκδείλεζξ βζα ημ βεβμκυξ αοηυ, υηακ μ Noller ηαζ μζ ζοκενβάηεξ ημο είπακ οπμαάθθεζ ημ νζαυζςµα ζε ελακηθδηζηή απμπνςηεύκςζδ ηαζ είπακ δζαπζζηχζεζ υηζ δ δναζηζηυηδηα πεπηζδοθμηνακζθενάζδξ πανέµεκε, έζης ηαζ ζε παιδθά επίπεδα (Noller 1992). Πνυζθαηεξ ένεοκεξ δείπκμοκ πςξ δ πνςηεύκδ L27 ηδξ ιεβάθδξ νζαμζςιζηήξ οπμιμκάδαξ επεηηείκεζ ημ άιζκμ-ηεθζηυ ηδξ άηνμ ζημ ηαηαθοηζηυ ηέκηνμ ηδξ πεπηζδοθμηνακζθενάζδξ, ημοθάπζζημκ ζηδκ πενίπηςζδ ημο ααηηδνίμο E. coli. Δ απμοζία αοηήξ ηδξ πνςηεύκδξ ιεζχκεζ δναιαηζηά ηδ δναζηζηυηδηα ηδξ πεπηζδοθμηνακζθενάζδξ (Maguire et al 2005). Σμ ηαηαθοηζηυ ηέκηνμ ημο νζαμζχιαημξ δζαιμνθχκεηαζ ιέζς ζπδιαηζζιμφ εκυξ ηαθά πνμζανιμζιέκμο δζηηφμο δεζιχκ Δ, ζημκ μπμίμκ ειπθέημκηαζ ηα ζοκηδνδιέκα κμοηθεμηίδζα C2063, C2064, A2451, U2584 ηαζ U2585, ηαεχξ ηαζ ανηεηά ιυνζα Δ 2 Ο, πμο δνμφκ ςξ βέθονεξ ζε αοηέξ ηζξ αθθδθεπζδνάζεζξ. διακηζηυ νυθμ παίγεζ ζημ ιδπακζζιυ ηαηάθοζδξ μ ζπδιαηζζιυξ εκυξ δεζιμφ Δ, υπμο πνμζαάθθμοζα μιάδα είκαζ δ 2 -ΟΔ ημο κμοηθεμηζδίμο Ώ76 ημο trna ηδξ εέζδξ Ρ (Δηθόλα Β). Δ 2 -ΟΔ μιάδα ημο Ώ2451 (ανίειδζδ ααζζγυιεκδ ζημ E. coli) ζηαεενμπμζεί ηδκ εκδζάιεζδ αοηή ηαηάζηαζδ ιε ηδ δδιζμονβία εκυξ επζπθέμκ δεζιμφ Δ ιε ηδκ 2 -ΟΔ ηδξ Ώ76. Ο νζαμζςιζηυξ ιδπακζζιυξ ηαηάθοζδξ, ζφιθςκα ιε ημοξ Moore ηαζ Steitz, θαίκεηαζ πςξ ααζίγεηαζ ζηδκ εθάηηςζδ ηδξ εκηνμπίαξ βζα ηδκ απμηαηάζηαζδ ηδξ ιεηαααηζηήξ ηαηάζηαζδξ εκυξ εκδζαιέζμο ηεηναεδνζημφ ζοιπθυημο (Moore ηαζ Steitz 2003). Ώλίγεζ κα ζδιεζςεεί πςξ ημ 2009 ανααεφηδηακ απυ ημζκμφ ιε ημ Nobel Υδιείαξ, βζα ηδ θφζδ ηδξ ηνοζηαθθζηήξ δμιήξ ηςκ οπμιμκάδςκ ημο νζαμζχιαημξ, μζ Venkatraman Ramakrishnan, Thomas A. Steitz ηαζ Ada E. Yonath (Schluenzen et al 2000, Ban et al 2000, Wimberly et al 2000). 43

45 Δηζαγσγή Εικόνα : Αμιή ηαζ θεζημονβία ημο νζαμζχιαημξ. (Α) Κνοζηαθθζηή δμιή ηδξ ιεβάθδξ νζαμζςιζηήξ οπμιμκάδαξ ημο ανπαίμο H. marismortui. Φαίκεηαζ δ επζθάκεζα πμο αθθδθεπζδνά ιε ηδκ ιζηνή οπμιμκάδα (PDBID. 1JJ2, Ban et al 2000). ημ ηέκηνμ ζδιεζχκεηαζ ιε θεοηυ πενίβναιια δ ζφνναβα ελυδμο. (Β) Σμ δθεηηνμζηαηζηυ δίηηομ πμο ακαπηφζζεηαζ βζα ηδκ ζηαεενμπμίδζδ ηςκ εκδζαιέζςκ πνμσυκηςκ ηαζ ημκ ζπδιαηζζιυ ημο πεπηζδζημφ δεζιμφ ζημ νζαυζςια. 3. Ρηβνλνπθιεάζε Ρ (RNase P) ηα ιεβάθα νζαμέκγοια ακήηεζ ηαζ δ RNA οπμµμκάδα ηδξ νζαμκμοηθεάζδξ Ρ (RNase P). Δ δναζηζηυηδηα RNase P, υπςξ ακαθένεδηε πνμδβμοιέκςξ, εκημπίζηδηε ανπζηά ζημ ααηηήνζμ E. coli απυ ημκ Sidney Altman. ηδ ζοκέπεζα, εα πενζβναθεί ακαθοηζηά δ θεζημονβία ηαζ δ ανπζηεηημκζηή αοημφ ημο εκγφιμο, ημ μπμίμ απμηεθεί ηαζ ηδ ιεθέηδ αοηήξ ηδξ δζαηνζαήξ Σα ππνζηξώκαηα ηεο RNase P Σμ οπυζηνςια ημο εκγφιμο RNase P, ζημ μπμίμ πανμοζζάγεζ ιεβάθδ ελεζδίηεοζδ, είκαζ ηα πνυδνμια ιυνζα trnas (pre-trnas). Σα ιυνζα αοηά είκαζ ιζηνμφ ιεβέεμοξ ιυνζα πμο ιεηά ηδ ζφκεεζή ημοξ οπυηεζκηαζ ζε πθδεχνα ιεηα-ιεηαβναθζηχκ ηνμπμπμζήζεςκ. Σα πνυδνμια trnas θένμοκ επζπνυζεεηεξ αθθδθμοπίεξ ζηα 5 ηαζ 3 άηνα ημοξ, ηαεχξ ηαζ εζςηενζηά πανειααθυιεκεξ αθθδθμοπίεξ, ηα ζκηνυκζα, μζ μπμίεξ πνέπεζ κα απμιαηνοκεμφκ βζα κα πνμηφρμοκ ηα χνζια ηαζ θεζημονβζηά ιυνζα. ημοξ εοηανοςηζημφξ μνβακζζιμφξ είκαζ απαναίηδηδ ηαζ δ πνμζεήηδ, ηδξ αθθδθμοπίαξ CCA, ζημ 3 άηνμ ημοξ, υπμο δεζιεφεηαζ ημ εκενβμπμζδιέκμ αιζκμλφ. Οζ πνμηανοχηεξ ηαζ ηα ανπαία δζαεέημοκ ζημ βεκεηζηυ ημοξ οθζηυ αοηή ηδκ αθθδθμοπία, δ μπμία ηςδζημπμζείηαζ ιαγί ιε ημ οπυθμζπμ ιυνζμ ηαζ παίγεζ επζπθέμκ νυθμ ζηδκ ακαβκχνζζδ ημο οπμζηνχιαημξ απυ ηδκ RNase P. 44

46 Δηζαγσγή Πανά ημ ιζηνυ ημοξ ιέβεεμξ, ηα µυνζα trna οθίζηακηαζ πδµζηέξ ηνμπμπμζήζεζξ ζε μνζζµέκα κμοηθεμηίδζα, πμθθέξ πενζζζυηενεξ απυ μπμζαδήπμηε άθθδ ιμνθή θεζημονβζημφ ιμνίμο (Δηθόλα 3. 1). 5 οδηγόρ αλληλοςσία Βπασίοναρ ππόζδεζηρ αμινοξέορ Βπασίοναρ D Βπασίοναρ Τ Ώπιμο trna Ππόδπομο μόπιο trna Ινηπόνιο Ανηικωδίκιο Εικόνα 3. 1: Χνίιακζδ ημο trna. Με αέθμξ ζδιεζχκεηαζ ημ ζδιείμ υπμο δνα δ RNase P. Βπζζδιαίκμκηαζ ηα ημζκά, ζοκηδνδιέκα δμιζηά ζημζπεία ηςκ ιμνίςκ, ηαεχξ επίζδξ ηαζ ηα ηαηάθμζπα πμο οθίζηακηαζ πδιζηή ηνμπμπμίδζδ: ιε πνάζζκμ ηφηθμ δ ηνμπμπμίδζδ δζτδνμμονζδίκδξ, ιε πμνημηαθί δ πμθφ ζοκηδνδιέκδ ηνμπμπμίδζδ ΣρC ηαζ ιε ηυηηζκμοξ ηφηθμοξ άθθεξ ζοπκέξ εέζεζξ ηνμπμπμζήζεςκ. φιθςκα ιε πνυζθαηεξ ένεοκεξ δ εοηανοςηζηή RNase P απαζηείηαζ βζα ηδκ ςνίιακζδ ηαζ άθθςκ πνυδνμιςκ RNA ιμνίςκ, εηηυξ ηςκ trna, αθθά ηαζ βζα ηδ ιεηαβναθή βμκζδίςκ απυ ηζξ RNA πμθοιενάζεξ Ε ηαζ ΕΕΕ, ηα μπμία ηςδζημπμζμφκ trna, rrna ηαζ δζάθμνα ιδ ηςδζημπμζμφκηα RNA (Reiner et al 2006, Jarrous ηαζ Reiner 2007, Reiner et al 2008). Σα ιυνζα αοηά εεςνείηαζ πςξ δμιζηά πνμζμιμζάγμοκ ιε ηα pre-trna. Έκα πανάδεζβια είκαζ δ ςνίιακζδ ημο ιεηαβνάθμο HRA1 (hiding in reading-frame antisense RNA), πμο πνμηφπηεζ απυ ιεηαβναθή ακηζκμδιαηζηήξ αθοζίδαξ, απυ ηδκ πονδκζηή RNase P ημο Sacharomyces cerevisiae (Yang ηαζ Altman 2007). Βπίζδξ, δ πονδκζηή RNase P ημο S. cerevisiae έπεζ δεζπεεί πςξ ειπθέηεηαζ ζε έκα απυ ηα ιμκμπάηζα ςνίιακζδξ ηςκ snorna, πμο ηςδζημπμζμφκηαζ απυ ηα C/D ζκηνυκζα (Coughlin et al 2008). Μζα πθδεχνα αηυια RNA ιμνίςκ πμο ζοκεηθμφμκηαζ ιαγί ιε δναζηζηυηδηα RNase P ηαζ ηςκ μπμίςκ δ πμζυηδηα ηαζ ημ ιέβεεμξ επδνεάγεηαζ απυ ηδκ απμοζία ηδξ RNA οπμιμκάδαξ ηαζ ηςκ πνςηεσκχκ Rpr2, Pop1, έπμοκ ανεεεί κα απμηεθμφκ οπμζηνχιαηα ημο εκγφιμο αοημφ. Ώπμζζχπδζδ ημο βμκζδίμο ηδξ ακενχπζκδξ πνςηεύκδξ Rpp29 δεκ επζδνά ζηδκ μνβάκςζδ 45

47 Δηζαγσγή ηαζ ζηναημθυβδζδ ηςκ οπμιμκάδςκ ηδξ RNA πμθοιενάζδξ ΕΕΕ, εκημφημζξ ακαζηέθθεηαζ δ ιεηαβναθή ηςκ βμκζδίςκ trna ηαζ 5S rrna απυ αοηή ηδ πμθοιενάζδ, απμδεζηκφμκηαξ πςξ δ RNase P δζαεέηεζ ηαζ ζδζυηδηεξ ιεηαβναθζημφ πανάβμκηα. Άθθα οπμζηνχιαηα ηδξ RNase P απμηεθμφκ ηαζ mrna οπμιμκάδςκ ηςκ RNA πμθοιεναζχκ Ε, ΕΕ ηαζ ΕΕΕ, ηαεχξ ηαζ mrna παναβυκηςκ έκανλδξ ηδξ ιεηάθναζδξ (Reiner et al 2006) RNase P: ηδηόηεηεο ηνπ ξηβνλνπθιενπξσηετληθνύ ζπκπιόθνπ πςξ ήδδ ακαθένεδηε, δ ηφνζα θεζημονβία βζα ηδκ μπμία είκαζ βκςζηή ηαζ ηαθά ιεθεηδιέκδ δ RNase P είκαζ δ απμημπή ηδξ 5 μδδβμφ αθθδθμοπίαξ (flank) ηςκ πνυδνμιςκ trna ιμνίςκ, πανάβμκηαξ πνμσυκηα πμο θένμοκ 3 -ΟΔ ηαζ 5 -PO 4 άηνα (Frank ηαζ Pace 1998). Δ απαναίηδηδ πανμοζία δζζεεκχκ ηαηζυκηςκ ηαζ ζδζαίηενα ζυκηςκ Mg 2+, βζα ηδκ πναβιαημπμίδζδ ηδξ πδιζηήξ ακηίδναζδξ, θαίκεηαζ κα πνμζδίδεζ ζηα Mg 2+ ζπμοδαίμ νυθμ ζοιιεημπήξ, ηυζμ ζημκ µδπακζζµυ ηδξ ακηίδναζδξ, υζμ ηαζ ζηδ δζαιυνθςζδ ηαζ ηδ ζηαεενμπμίδζδ ηςκ ακχηενςκ δμιχκ ημο εκγφιμο (Yarus 1993 ηαζ Cowan 1995, Frank ηαζ Pace 1998, Pan 1995, Yarus 1993). Σμ μθμέκγοιμ ηδξ RNase P έπεζ απμµμκςεεί απυ ακηζπνμζχπμοξ ηαζ ηςκ ηνζχκ θοθμβεκεηζηχκ ααζζθείςκ, δδθαδή ηςκ ΐαηηδνίςκ, ηςκ Ώνπαίςκ ηαζ ηςκ Βοηανοςηχκ, ηαεχξ ηαζ απυ ηα διζαοηυκμια οπμηοηηανζηά μνβακίδζα, ηα µζημπυκδνζα ηαζ ημοξ πθςνμπθάζηεξ. θα ηα ηφηηανα ηαζ ηα μνβακίδζα πμο ζοκεέημοκ πνυδνμµμ trna ακαµέκεηαζ κα δζαεέημοκ δναζηζηυηδηα RNase P (Frank 1998), ςζηυζμ ηαζ βζα αοηυκ ημκ ηακυκα θαίκεηαζ υηζ οπάνπμοκ ελαζνέζεζξ. ε ηοηηανζηά εηποθίζιαηα ημο οπενεενιυθζθμο ααηηδνίμο Aquifex aeolicus (Willkomm 2002) ηαζ ημο ανπαίμο Nanoarchaeum equitans (Randau 2008) δεκ έπεζ ακζπκεοεεί δναζηζηυηδηα RNase P. Eπζπθέμκ, εηηεκήξ αζμπθδνμθμνζηή ακάθοζδ ηςκ βμκζδζςιάηςκ ηςκ δομ μνβακζζιχκ δεκ έδςζε απμηεθέζιαηα βζα ηδκ φπανλδ μιυθμβςκ βμκζδίςκ πμο ηςδζημπμζμφκ οπμιμκάδεξ ηδξ RNase P. Πεναζηένς αζμπδιζηή ακάθοζδ έδεζλε πςξ ζε αοημφξ ημοξ δφμ μνβακζζιμφξ ηα βμκίδζα ηςκ trna ιεηαβνάθμοκ χνζια trna, πςνίξ εηηεηαιέκα 5 άηνα, ζηακά κα ακαβκςνίγμκηαζ απυ ηζξ ζοββεκείξ ημοξ αιζκμάηοθμ-trna ζοκεεηάζεξ. Ώοηέξ μζ ένεοκεξ απμδεζηκφμοκ πςξ δ θφζδ ακηζιεηςπίγεζ ηδκ απχθεζα εκγφιςκ, υπςξ ηδξ RNase P, ιέζς ακαζοκδοαζιμφ εναοζιάηςκ ιεηαβνάθςκ ηςκ βμκζδίςκ trna. πεδυκ ζε υθεξ ηζξ πενζπηχζεζξ, δ RNase P είκαζ έκα νζαμκμοηθεμπνςηεσκζηυ ζφιπθμημ ηαζ απμηεθείηαζ απυ ιζα RNA ηαζ ημοθάπζζημκ ιζα πνςηεσκζηή οπμιμκάδα. Βλαίνεζδ ημο ηακυκα απμηεθμφκ δφμ πενζπηχζεζξ ηαζ πενζθαιαάκμοκ ηδκ RNase P πμο απμιμκχεδηε απυ ηα µζημπυκδνζα ηςκ ηοηηάνςκ HeLa, ηαεχξ ηαζ ηδκ RNase P απυ οπμηοηηανζηά 46

48 Δηζαγσγή μνβακίδζα, ηυζμ πθαζηίδζα, υζμ ηαζ ιζημπυκδνζα, ημο θοημφ Arabidopsis thaliana (Holzmann 2008, Gobert et al 2010). Καζ ζηζξ δομ πενζπηχζεζξ δ δναζηζηυηδηα RNase P μθείθεηαζ απμηθεζζηζηά ζε πνςηεύκεξ, εκχ δεκ ακζπκεφεηαζ ηαιία RNA οπμιμκάδα. Βκδείλεζξ βζα ηδκ πνςηεσκζηή θφζδ ηδξ RNase P ζηα θοηά οπήνπακ απυ ημ 1988 ιε ηδ ιεθέηδ ημο εκγφιμο απυ ημοξ πθςνμπθάζηεξ ζπακαηζμφ (Wang et al 1988). Πζμ ζοβηεηνζιέκα ζηα ιζημπυκδνζα ημο ακενχπμο δ RNase P είκαζ έκα πνςηεσκζηυ ζφιπθμημ απμηεθμφιεκμ απυ ηνεζξ πνςηεύκεξ, MRPP1, MRPP2 ηαζ MRPP3, εκχ ζηα μνβακίδζα ημο A. thaliana δ RNase P είκαζ ιζα ιμκμιενήξ πνςηεύκδ, δ PRORP1. Δ πανμοζία πνςηεσκχκ ζημ μθμέκγοµμ αολάκεηαζ ακεααίκμκηαξ ελεθζηηζηή ααειίδα (Δηθόλα 3. 2-Η). Έηζζ, μ ανζειυξ ηςκ πνςηεσκζηχκ οπμιμκάδςκ ηδξ RNase P είκαζ ιυθζξ 1 ζηα ααηηήνζα, 4-5 ζηα ανπαία ηαζ θηάκεζ ιέπνζ 10 ηαζ 9 ζημκ άκενςπμ ηαζ ζημ S. cerevisiae, ακηίζημζπα. Βζηάγεηαζ πςξ δ εκίζποζδ ηδξ πανμοζίαξ ηςκ πνςηεσκζηχκ οπμµμκάδςκ απυ ηα ααηηήνζα ζηα ανπαία ηαζ ημοξ εοηανοχηεξ ακηζηαημπηνίγεζ ηδκ µεηαθμνά θεζημονβζχκ, υπςξ δ πνυζδεζδ ημο οπμζηνχµαημξ ηαζ δ ηαηάθοζδ απυ ηδκ RNA οπμµμκάδα ζηζξ πνςηεύκεξ ηαηά ηδκ ελέθζλδ ημο εκγφµμο ηαζ ημ θοθμβεκεηζηυ δζαπςνζζιυ ηςκ ααηηδνίςκ απυ ηα ανπαία ηαζ ημοξ εοηανοςηζημφξ μνβακζζµμφξ (Frank 1998). Οζ πνςηεσκζηέξ οπμιμκάδεξ ηδξ RNase P ζηα ανπαία πανμοζζάγμοκ μιμθμβία ζηδκ πνςημηαβή δμιή ημοξ ιε ηάπμζεξ απυ ημ εοηανοςηζηυ μθμέκγοιμ, ζε ακηίεεζδ ιε ηζξ ααηηδνζαηέξ πνςηεύκεξ πμο δεκ ειθακίγμοκ ηαιζά μιμζυηδηα ιε ηζξ αθθδθμοπίεξ πνςηεσκχκ απυ ανπαία ηαζ εοηανοχηεξ. ημοξ εοηανοχηεξ, εκημπίγεηαζ ηαζ άθθμ έκα νζαμκμοηθεμπνςηεσκζηυ έκγοιμ ιε ημζκή πνμέθεοζδ ιε ηδκ RNase P, δ RNase MRP δ μπμία είκαζ οπεφεοκδ βζα ηδκ ςνίιακζδ ηάπμζςκ ιζημπμκδνζαηχκ rrna ιμνίςκ. Δ RNase MRP ιμζνάγεηαζ ιε ηδκ RNase P ηζξ πενζζζυηενεξ πνςηεσκζηέξ οπμιμκάδεξ ηαζ δζαεέηεζ ιζα απαναίηδηδ οπμιμκάδα RNA, πμο εεςνείηαζ υηζ πνμένπεηαζ ελεθζηηζηά απυ ηδκ ακηίζημζπδ ηδξ RNase P (Walker ηαζ Engelke 2006). Δ RNA οπμµμκάδα ηδξ νζαμκμοηθεάζδξ Ρ πμζηίθεζ ζε ιέβεεμξ ιεηαλφ ηςκ δζαθυνςκ μνβακζζιχκ ηαζ θηάκμοκ ζε ιέβεεμξ ιέπνζ ~ nt. Ώπμηεθεί, υιςξ, ιμκαδζηή ελαίνεζδ ζημ υηζ δνα in trans, δδθαδή ηαηαθφεζ ακηζδνάζεζξ δζαιμνζαηά ιεηαλφ πμθθχκ ελςηενζηχκ οπμζηνςιάηςκ (Vourekas et al 2008). πςξ έπεζ πνμακαθενεεί, δ RNA οπμιμκάδα ηςκ ααηηδνζαηχκ RNase P δζαηδνεί ελ μθμηθήνμο ηδ ηαηαθοηζηή δναζηζηυηδηα in vitro, ιυκμ ηαζ εθυζμκ δ οδνυθοζδ ημο θςζθμνζεζηενζημφ δεζιμφ πναβιαημπμζδεεί πανμοζία ορδθήξ ζοβηέκηνςζδξ δζζεεκχκ ηαηζυκηςκ (Guerrier-Takada 1983). Ρζαμέκγοια, επίζδξ, είκαζ ηαζ μζ RNA οπμιμκάδεξ απυ ηάπμζα ανπαία ηαζ ημκ άκενςπμ (Pannucci et al 1999, Kikovska et al 2007). ηδκ πενίπηςζδ ηςκ RNA 47

49 Δηζαγσγή οπμιμκάδςκ δεκ παναηδνείηαζ μιμθμβία αθθδθμοπίαξ ιεηαλφ ημοξ, ςζηυζμ δζαεέημοκ πανυιμζα δεοηενμηαβή δμιή ιε πμθθά ημζκά ζοκηδνδιέκα δμιζηά ζημζπεία (Δηθόλα ΗΗ). In vivo είκαζ απαναίηδηδ δ πανμοζία ηαζ ηςκ πνςηεσκζηχκ οπμιμκάδςκ, μζ μπμίεξ ζοιιεηέπμοκ ζηδκ ζςζηή ακαδίπθςζδ ημο μθμεκγφιμο ηαζ ζηδκ ακαβκχνζζδ ημο οπμζηνχιαημξ, επζαεααζχκμκηαξ έηζζ ηαζ ηδκ νζαμκμοηθεμπνςηεσκζηή θφζδ ημο εκγφιμο (Chamberlain et al 1998, Niranjanakumari et al 1998, Kurz ηαζ Fierke 2000). Εικόνα 3. 2-Ι: Σμ θοθμβεκεηζηυ δέκηνμ ηδξ RNase P. ε υθεξ ηζξ θοθμβεκεηζηέξ πενζμπέξ δ RNase P δζαεέηεζ ιζα πανυιμζα RNA οπμιμκάδα (ιπθε) ηαζ ιία πνςηεύκδ ζηα ΐαηηήνζα (ιςα μαάθ), ηέζζενζξ πνςηεύκεξ ζηα Ώνπαία (πνάζζκα μαάθ) ηαζ εκκέα ή δέηα πνςηεύκεξ ζηα Βοηάνοα (πνάζζκα ηαζ βηνζ μαάθ). Σα πνάζζκα μαάθ ακαπανζζημφκ ηζξ μιυθμβεξ πνςηεύκεξ ιεηαλφ Ώνπαίςκ ηαζ Βοηανοςηζηχκ. H RNase MRP ακαπανίζηαηαζ ιε πνάζζκμ πνχια ηαζ ιε πμνημηαθί μαάθ ζοιαμθίγμκηαζ μζ ζδζμζοβηναζζαηέξ πνςηεύκεξ ηδξ. ηδκ δεοηενμηαβή δμιή ημο RNA ιε ηυηηζκμ ζδιεζχκμκηαζ ηα ηιήιαηα ηδξ αθθδθμοπίαξ πμο δδιζμονβμφκ ζε ηνζημηαβέξ επίπεδμ ηδκ ζοκηδνδιέκδ έθζηα Ρ Η RNA ππνκνλάδα ηεο RNase P Πμθθέξ απυ ηζξ πθδνμθμνίεξ πμο αθμνμφκ ηδκ δμµή ημο RNA ηδξ RNase P πνμένπμκηαζ απυ ηδκ ζφβηνζζδ ηςκ πνςημηαβχκ δμµχκ απυ δζαθμνεηζημφξ μνβακζζµμφξ. Σα βμκίδζα πμο ηςδζημπμζμφκ ηζξ RNA οπμµμκάδεξ έπμοκ εκημπζζηεί πνδζζµμπμζχκηαξ δφμ ααζζηέξ µεευδμοξ: Ε) Γεκεηζηέξ ζανχζεζξ βζα πανάβμκηεξ πμο απαζημφκηαζ βζα ηδκ ςνίµακζδ ηςκ πνυδνμµςκ µμνίςκ trna. 48

50 Δηζαγσγή II) Τανζδμπμίδζδ ηςκ µμνίςκ RNA πμο απμµμκχκμκηαζ απυ ορδθήξ ηαεανυηδηαξ δείβµα RNase P. Βθ υζμκ ηαοημπμζδεμφκ μζ αθθδθμοπίεξ ηςκ RNA οπμµμκάδςκ µπμνμφκ κα πνδζζµμπμζδεμφκ, βζα κα απμµμκςεμφκ μµυθμβα µυνζα RNA απυ άθθμοξ μνβακζζµμφξ, είηε δζελάβμκηαξ πεζνάιαηα οανζδμπμίδζδξ ή/ηαζ PCR, είηε πναβµαημπμζχκηαξ ακαγήηδζδ ζε ρδθζαηέξ ηνάπεγεξ δεδμµέκςκ µε ημ πνυβναµµα BLAST. Ώθθδθμοπίεξ οπμµμκάδςκ RNA έπμοκ απμµμκςεεί απυ µζα µεβάθδ πμζηζθία ααηηδνίςκ ηαζ ανπαίςκ, εκχ μζ πενζζζυηενεξ αθθδθμοπίεξ απυ εοηανοςηζημφξ μνβακζζµμφξ πνμένπμκηαζ απυ µφηδηεξ ηαζ ζπμκδοθςηά. Δ ηνάπεγα δεδμµέκςκ ηδξ RNase P (RNase P database), είκαζ δ ζζημζεθίδα, υπμο ανίζημκηαζ απμεδηεοµέκεξ υθεξ μζ αθθδθμοπίεξ αοηέξ ( Brown 1999). Δ ηαοημπμίδζδ µζαξ πζεακήξ RNA οπμµμκάδαξ επαθδεεφεηαζ µε δζάθμνμοξ ηνυπμοξ. Γζα ηζξ ααηηδνζαηέξ RNA οπμµμκάδεξ αοηυ είκαζ εφημθμ, βζαηί είκαζ ηαηαθοηζηά εκενβέξ απμοζία πνςηεύκδξ ηαζ ανηεί δ απθή in vitro δμηζµαζία ημο µεηάβναθμο ημο οπυ ελέηαζδ ηθχκμο βζα εκγοµζηή δναζηζηυηδηα. ηδκ πενίπηςζδ, υµςξ, απμοζίαξ εκγοµζηήξ δναζηζηυηδηαξ απυ ηδκ οπμµμκάδα RNA, υπςξ ζζπφεζ βζα ηζξ εοηανοςηζηέξ ηαζ βζα πμθθέξ οπμµμκάδεξ ανπαίςκ, δ ηαοημπμίδζδ µπμνεί κα απμδεζπεεί πμθφπθμηδ δζαδζηαζία. Δ πνχηδ έκδεζλδ υηζ έκα µυνζμ RNA µπμνεί κα απμηεθεί ηδκ οπμµμκάδα RNA ηδξ RNase P είκαζ δ ακμζμηαηαηνήµκζζή ημο ιαγί µε ηδκ εκγοµζηή δναζηζηυηδηα ημο εκγφµμο. Ώπυ µυκμ ημο ημ ζημζπείμ αοηυ, πανυηζ εκεαννοκηζηυ, δεκ είκαζ ηαζ δ ηεθζηή απυδεζλδ ηαοημπμίδζδξ. Δ ηαοημπμίδζδ ηδξ οπμµμκάδαξ RNA ηδξ RNase P, βίκεηαζ ιε θοθμβεκεηζηή ζφβηνζζδ ιε παναηηδνζζιέκεξ οπμµμκάδεξ RNA απυ ζοββεκείξ μνβακζζιμφξ ηαζ ιε ιεθέηδ ηδξ δζαηήνδζδξ ηςκ ζημζπείςκ δεοηενμηαβμφξ δμιήξ πμο δίκμοκ ζημ ιυνζμ ηδ παναηηδνζζηζηή δμιή ημο Γεπηεξνηαγήο δνκή ηνπ RNA - Ο ζπληεξεκέλνο θνηλόο δνκηθόο ππξήλαο ηνπ RNA Οζ αθθδθμοπίεξ ημο RNA ζπδιαηίγμοκ ζηδ δεοηενμηαβή δμιή ημοξ έθζηεξ ιέζς γεοβανχιαημξ ζοιπθδνςιαηζηχκ αάζεςκ ηαηά Watson-Crick ηαζ ακαπηφζζμκηαζ, επζπθέμκ, αθθδθεπζδνάζεζξ ιεηαλφ ηςκ εθίηςκ βζα ημκ ζπδιαηζζιυ ηδξ ηνζημηαβμφξ δμιήξ ημοξ. Ο πνμζδζμνζζιυξ ηςκ δεοηενμηαβχκ δμιχκ πναβιαημπμζείηαζ ιε ζοβηνζηζηέξ θοθμβεκεηζηέξ ακαθφζεζξ, ηαηά ηζξ μπμίεξ μιμπαναηίεεκηαζ μιυθμβεξ αθθδθμοπίεξ, δδθαδή αθθδθμοπίεξ ημζκήξ πνμέθεοζδξ ηαζ θεζημονβίαξ (Fox ηαζ Woese 1975). Με ηδ ιέεμδμ αοηή ηαοημπμζμφκηαζ ελανηδιέκεξ αθθαβέξ αάζεςκ ζηα ιυνζα, δδθαδή ακζπκεφμκηαζ 49

51 Δηζαγσγή ελεθζηηζηέξ ιεηααμθέξ αάζεςκ, πμο πνμηάθεζακ ηέημζα αθθαβή ζηδκπνςημηαβή δμιή, χζηε κα ιδκ ηαηανβείηαζ δ ζοιπθδνςιαηζηυηδηά ημοξ ηαζ έηζζ κα δζαηδνείηαζ δ ακχηενδ δμιή ηςκ ιμνίςκ RNA ηαζ δ θεζημονβζηυηδηά ημοξ (Pace et al 1989). Με αοηέξ ηζξ ιεθέηεξ έπμοκ ελαηνζαςεεί πμθθέξ δεοηενμηαβείξ δμιέξ RNA οπμιμκάδςκ απυ RNase P έκγοια. RNA ππνκνλάδα ηεο βαθηεξηαθήο RNase P ηα ααηηήνζα μζ RNA οπμιμκάδεξ ηςκ RNase P (Ρ RNAs) έπμοκ ιέβεεμξ πενίπμο 400 nt ηαζ μζ δεοηενμηαβείξ ημοξ δμιέξ έπμοκ πμθφ ηαθά παναηηδνζζηεί ιέζς ζοβηνζηζηχκ ιεθεηχκ (James et al 1989, Brown et al 1991, Tranguch ηαζ Engelke 1993, Harris et al 2001). Οζ δεοηενμηαβείξ δμιέξ ηςκ ααηηδνζαηχκ Ρ RNA δζαηνίκμκηαζ ζε δομ ααζζημφξ ηφπμοξ, Ώ ηαζ ΐ, υπμο μ ηαεέκαξ ιπμνεί κα δζαζνεεεί ζε επζπθέμκ οπυηοπμοξ. Σα ααηηδνζαηά Ρ RNA δζαεέημοκ έκα ημζκυ δμιζηυ πονήκα, μ μπμίμξ δζαεέηεζ υθα ηα απαναίηδηα δμιζηά ζημζπεία βζα ηδκ ακαβκχνζζδ ημο οπμζηνχιαημξ ηαζ ηδκ ηαηαθοηζηή δναζηζηυηδηα ημο εκγφιμο (Δηθόλα I) (Pace et al 1989, Waugh et al 1989). Ώοηυξ μ πονήκαξ είκαζ ιυθζξ 225 nt ηαζ πανυηζ ηα γεφβδ αάζεςκ είκαζ ζοκηδνδιέκα, θζβυηενμ απυ 20 % ηδξ πνςημηαβμφξ αθθδθμοπίαξ ηςκ Ρ RNA, δ δεοηενμηαβήξ δμιή είκαζ ηαοηυζδιδ. Δ πζμ ζοκηδνδιέκδ πενζμπή είκαζ δ Ρ4 έθζηα δ μπμία ζπδιαηίγεηαζ απυ ηζξ ιμκυηθςκεξ πενζμπέξ CRI ηαζ CRV (Conserved Regions). οκηδνδιέκα κμοηθεμηίδζα παναηδνμφκηαζ ζηδ ιεβάθδ εδθεζά ιεηαλφ ηςκ Ρ11 ηαζ Ρ12 (CRII ηαζ CRIII) ηαζ ζηδ Ρ18 έθζηα (CRIV). Σμ ηαηαθοηζηυ ηέκηνμ ημο RNA ζοκηίεεηαζ απυ ηζξ πενζμπέξ CR I, CRIV ηαζ CRV (Torres- Larios et al 2006). ηδ εδθεζά L15, πμο ζπδιαηίγεηαζ ζηδκ έθζηα Ρ15, παναηδνείηαζ δ ζοκηδνδιέκδ αθθδθμοπία GGU, δ μπμία είκαζ οπεφεοκδ βζα ηδκ ακαβκχνζζδ ημο 3 ΝCCA άηνμο ημο πνυδνμιμο trna (Knap et al 1990, Harris et al 1994). οκηδνδιέκα δζαηδνμφκηαζ ηαζ ηα δμιζηά ζημζπεία Ρ7, Ρ8, Ρ9 ηαζ Ρ10, ηα μπμία ειπθέημκηαζ ζηδκ ακαβκχνζζδ ηδξ Σ εδθεζάξ ημο οπμζηνχιαημξ, αθθά μζ θεπημιένεζεξ αοηήξ ηδξ αθθδθεπίδναζδξ παναιέκμοκ άβκςζηεξ. Σα ααηηδνζαηά P RNA απμηεθμφκηαζ απυ δομ ακελάνηδηα ελεθζβιέκεξ πενζμπέξ πμο πςνίγμκηαζ απυ ηδκ Ρ7 πενζμπή. Σμ RNA ηαεμδζηά ηδξ Ρ7 πενζέπεζ υθεξ ηζξ απαναίηδηεξ αθθδθμοπίεξ ηαζ δμιέξ, βζα ηδκ ηαηάθοζδ ηαζ βζ αοηυ ακαθένεηαζ ςξ δ ηαηαθοηζηή πενζμπή ημο RNA ( C-domain ). Ώθθαβέξ ζηζξ δμιέξ ηαζ ζηδκ αθθδθμοπία ημο RNA ακμδζηά ηδξ Ρ7 ιεηααάθθμοκ ηδκ ελεζδίηεοζδ ημο RNA βζα ημ οπυζηνςια ηαζ αοηή δ πενζμπή είκαζ βκςζηή ςξ πενζμπή ελεζδίηεοζδξ ( S-domain ). 50

52 Δηζαγσγή Εικόνα I: Αεοηενμηαβήξ δμιή ηδξ ααηηδνζαηήξ RNA οπμιμκάδαξ. A: Σφπμξ Ώ, ΐ: Σφπμξ ΐ. Δ εθάπζζηδ ζοκηδνδιέκδ δμιή πανμοζζάγεηαζ ζημ ηέκηνμ. Πενζμπέξ δίηθςκςκ εθίηςκ επζζδιαίκμκηαζ P1, P2 η.υ.η. ηαηά ζεζνά ειθάκζζδξ απυ ημ 5 άηνμ ηδξ αθθδθμοπίαξ. Οζ πενζμπέξ πμο ζοκδέμοκ έθζηεξ, υπςξ δ J15/16 μκμιάγμκηαζ ζφιθςκα ιε ηα μκυιαηα ηςκ πενζμπχκ πμο ζοκδέμοκ. Οζ ζοκηδνδιέκεξ πενζμπέξ (CR, Conserved Regions) ανζειμφκηαζ απυ Ε έςξ V. Σα ζοκηδνδιέκα κμοηθεμηίδζα ζηζξ RNA οπμιμκάδεξ υθςκ ηςκ μνβακζζιχκ πανμοζζάγμκηαζ ζε ιπθέ ηφηθμοξ, ηα ζοκηδνδιέκα ζε υθεξ ηζξ ααηηδνζαηέξ RNA οπμιμκάδεξ ιε ηεθαθαία, εκχ ηα ζοκηδνδιέκα ζημ 80% ηςκ ααηηδνζαηχκ Ρ RNA ιε ιζηνά βνάιιαηα. ηζξ εέζεζξ ηςκ ιπθέ ηαζ ηίηνζκςκ ηεθεζχκ ζοκακηάιε ηάπμζμ ηαηάθμζπμ ζημ 100% ηαζ ζημ 80% ηςκ αθθδθμοπζχκ, ακηίζημζπα. Ο πνμβμκζηυξ ή Ώ ηφπμξ αθμνά ηδκ πθεζμρδθία ηςκ ααηηδνίςκ, ζοιπενζθαιαακμιέκδξ ηαζ ηδξ RNA οπμιμκάδαξ ημο E. coli, εκχ δ ηφπμο ΐ δμιή ααζίγεηαζ ζηδκ RNA οπμιμκάδα απυ ημ B. subtilis (Δηθόλα I). Ο ηφπμξ Ώ δζαηνίκεηαζ απυ ημκ ΐ απυ ηδκ πανμοζία ηςκ δμιζηχκ ζημζπείςκ Ρ16, Ρ17 ηαζ Ρ6 ηαζ ηδκ απμοζία ηςκ Ρ5.1, Ρ10.1, Ρ15.1 ηαζ Ρ15.2 (Haas ηαζ Brown 1998). Δ πθεζμρδθία ηςκ ηφπμο Ώ RNA δζαεέηεζ ηαζ ηζξ πενζμπέξ Ρ13, Ρ14 ηαζ Ρ18. Δ Ρ19, ιζα θοθμβεκεηζηά εοιεηάαθδηδ δμιή, είκαζ πανμφζα ζηδ δμιή πμθθχκ RNA μπμζμοδήπμηε ηφπμο, απμοζζάγεζ, υιςξ, απυ ημ E. coli. ημκ ηφπμ Ώ RNA δζαηνίκμοιε ημκ οπυηοπμ Ώ1, ιε ααζζηυ ακηζπνυζςπμ ημ RNA ημο E. coli. Ώοηά ηα ιυνζα απμηεθμφκηαζ απυ ημοθάπζζημκ 18 έθζηεξ, Ρ1-Ρ18, αθθά δζαεέημοκ ηαζ ζδζμζοβηναζζαηά παναηηδνζζηζηά, υπςξ δ έθζηα Ρ19 (δ μπμία, υπςξ πνμακαθένεδηε, απμοζζάγεζ απυ ημ E. coli). ημκ οπυηοπμ Ώ2 ακήημοκ ηα P RNA ηςκ α-πνςηεμααηηδνίςκ, απυ ηα μπμία θείπμοκ μζ έθζηεξ Ρ13 ηαζ Ρ14 (Δηθόλα ΗΗ). ημοξ οπμηφπμοξ Ώ3 ηαζ 51

53 Δηζαγσγή Ώ4 ακήημοκ ηα P RNA ημο βέκμοξ Chlamydiae ηαζ ηςκ ηοακμααηηδνίςκ, ακηίζημζπα, ζηα μπμία παναηδνείηαζ έκημκδ δζαθμνά ζηδ εδθεζά L15 (Vioque 1992, Vioque 1997). Βπίπνυζεεηα, ζηα Ρ RNA ημο Ώ3 οπυηοπμο θείπεζ δ ζοκηδνδιέκδ αθθδθμοπία RGGUA απυ ηδκ δζαζηαφνςζδ J16/15, πμο είκαζ απαναίηδηδ βζα ηδκ ακαβκχνζζδ ημο οπμζηνχιαημξ (Herrmann et al 2000). Εικόνα II: Ώκηζπνμζςπεοηζηέξ δεοηενμηαβείξ δμιέξ RNA οπμιμκάδςκ ηφπμο Ώ. Σφπμξ Ώ1: ακηζπνμζςπεφεηαζ απυ ημ E. coli, ηφπμξ Ώ2 (οπμθείπμκηαζ μζ Ρ13 ηαζ Ρ14 δμιέξ): ανίζηεηαζ ζηα α- πνςηεμααηηήνζα, ηφπμξ Ώ3 ηαζ Ώ4 (δζαθμνέξ ζηδ εδθεζά L15): ανίζημκηαζ ζηα ααηηήνζα ημο βέκμοξ Chlamydiae ηαζ ζηα ηοακμααηηήνζα, ακηίζημζπα, ηφπμξ Ώ5 (οπμθείπεηαζ δ Ρ18 δμιή): ανίζηεηαζ ζε ααηηήνζα ημο βέκμοξ Chlorobi ηαζ Aquificae. 52

54 Δηζαγσγή Πανυθα αοηά, ηα RNA αοηά είκαζ ζηακά κα πνμζδέκμοκ ηα οπμζηνχιαηά ημοξ, αθθά μζ δζαθμνέξ ζηδκ ζηακυηδηα ηαζ ημ ιδπακζζιυ πνυζδεζδξ ημο οπμζηνχιαημξ δεκ έπμοκ ιεθεηδεεί. Ώοηή δ αθθάβή εκδέπεηαζ κα ζπεηίγεηαζ ιε ημ βεβμκυξ υηζ ηα βμκίδζα ηςκ trna ζημοξ μνβακζζιμφξ ημο βέκμοξ Chlamydiae δεκ ηςδζημπμζμφκ ζημ 3 άηνμ ημοξ ηδκ αθθδθμοπία NCCA. ημκ ηφπμ ΐ ηςκ P RNA, μ οπυηοπμξ ΐ1 ακηζπνμζςπεφεηαζ απυ ημ P RNA ημο B. subtilis, ζημκ μπμίμ μζ δμιέξ Ρ6, Ρ16, Ρ17 ηςκ P RNA ηφπμο Ώ ακηζηαείζηακηαζ απυ ηα Ρ5.1, Ρ15.1 ηαζ Ρ15.2 (Haas et al 1996). Δ Ρ12 παναιέκεζ ίδζα ζε ιήημξ ζε αοηά ηα P RNA ηαζ αθθδθεπζδνά ιε ιζα εζςηενζηή εδθεζά πμο ειθακίγεηαζ ζε αοηέξ ηζξ δμιέξ, ηδκ Ρ10.1. Σα P RNA ημο οπμηφπμο ΐ2 ακήημοκ ζε ιέθδ ηδξ ηάλδξ Mollicutes ηαζ δζαθένμοκ απυ ηα ηφπμο ΐ1 ζημ υηζ δζαεέημοκ επζιδηοζιέκεξ ηζξ έθζηεξ Ρ12, Ρ15.2, Ρ3 ηαζ ηαευθμο ηδ Ρ10.1 (Ushida et al 1995, Siegel et al 1996, Haas et al 1996). Εδζαίηενδ πενίπηςζδ ηνμπμπμζδιέκμο ΐ ηφπμο P RNA είκαζ μ οπυηοπμξ ΐ3 πμο ακήηεζ ζημκ μνβακζζιυ Mycoplasma fermentans, απυ ημ μπμίμ απμοζζάγεζ, ηυζμ δ έθζηα Ρ10.1, υζμ ηαζ δ ζοκηδνδιέκδ Ρ12. Σμ P RNA ημο M. fermentans είκαζ ημ ιζηνυηενμ βκςζηυ πμο έπεζ ανεεεί ζηδ θφζδ (Siegel et 1996) (Δηθόλα ΗΗΗ). Εικόνα ΙΙΙ: Ώκηζπνμζςπεοηζηέξ δεοηενμηαβείξ δμιέξ RNA οπμιμκάδςκ ηφπμο B. Σφπμξ B1: ακηζπνμζςπεφεηαζ απυ ημ B. subtilis, ηφπμξ B2 (οπμθείπεηαζ δ Ρ10.1 δμιή): ανίζηεηαζ ζε ηάπμζα είδδ ημο βέκμοξ Mycoplasma, ηφπμξ ΐ3 (οπμθείπεηαζ δ Ρ12 δμιή): έπεζ ανεεεί ιυκμ ζημ ααηηήνζμ M. fermentans. 53

55 Δηζαγσγή Σέθμξ, έπεζ δζαηνζεεί μ ηφπμξ C P RNA πμο έπεζ ανεεεί ζημ ααηηήνζμ Thermomicrobium roseum ηαζ ιμζάγεζ ιε ιζα εκδζάιεζδ ηςκ ηφπςκ Ώ ηαζ ΐ δμιή. Σμ P RNA αοηυ δζαηδνεί ηζξ έθζηεξ Ρ6, Ρ16 ηαζ Ρ17 (παναηηδνζζηζηυ ηςκ P RNA Ώ ηφπμο), ηαεχξ ηαζ ηζξ Ρ10.1 ηαζ Ρ15.2, εκχ δεκ δζαεέηεζ ηζξ Ρ13 ηαζ Ρ14 (παναηηδνζζηζηυ ΐ ηφπμο). Πανυηζ αοημφ ημο ηφπμο ημ P RNA ιμζάγεζ ζδιακηζηά ιε ημο ηφπμο ΐ ζηα πνμακαθενεέκηα ζδιεία, δ αθθδθμοπία αοημφ ημο RNA δεκ ζπεηίγεηαζ ιε αοηέξ ημο ηφπμο ΐ ηαζ βζ αοηυ είκαζ πζμ πζεακυκ κα απμηεθεί πανάδεζβια ζοβηθίκμοζαξ ελέθζλδξ, πανά μνζγυκηζαξ ιεηαθμνάξ βμκζδίςκ (Haas ηαζ Brown 1998). RNA ππνκνλάδα ηεο RNase P από αξραία Δ πθεζμρδθία ηςκ P RNA απυ ανπαία είκαζ υιμζα ιε ηα ααηηδνζαηά ηφπμο Ώ ηαζ πνμθακχξ πνμδβμφκηαζ ελεθζηηζηά ζηα ανπαία απυ ηα άθθα δομ P RNA, ηφπμο Μ ηαζ Σ, πμο έπμοκ παναηδνδεεί ζε αοημφξ ημοξ μνβακζζιμφξ. Σοπζηά υθα ηα P RNA ηςκ ανπαίςκ δζαεέημοκ ιεβαθφηενδ Ρ12 έθζηα ζοβηνζηζηά ιε ηα ααηηήνζα, ζηδκ μπμία πενζθαιαάκεηαζ ιζα εζςηενζηή εδθεζά ιε ζοκηδνδιέκδ αθθδθμοπία πθμφζζα ζε πμονίκεξ (Δηθόλα ΗV). Σα ηφπμο Ώ P RNA ειθακίγμοκ ιεβάθδ μιμζυηδηα ιε ηα ίδζμο ηφπμο ααηηδνζαηά, αθθά λεπςνίγμοκ απυ ηδκ έθθεζρδ ηδξ έθζηαξ Ρ18 ηαζ Ρ13/14 (Δηθόλα IV) (Brown ηαζ Haas 1995, Haas et al 1996). Ώοημφ ημο ηφπμο ηα P RNA, απμοζία πνςηεσκχκ ηαζ ζε πμθφ ορδθέξ ζοκεήηεξ ζμκηζηήξ ζζπφμξ, είκαζ ηαηαθοηζηά εκενβά (Pannucci et al 1999). Ώπυ ηα ηφπμο Μ P RNA, ηα μπμία ακήημοκ ζηα βέκδ Methanococci ηαζ Archaeoglobi, απμοζζάγμοκ ζδιακηζηά δμιζηά ζημζπεία, υπςξ δ έθζηα Ρ8 (απαναίηδηδ βζα ηδκ ακαβκχνζζδ ηδξ ΣΦC εδθεζάξ ημο οπμζηνχιαημξ) ηαζ δ εδθεζά L15 (απαναίηδηδ βζα ηδκ ακαβκχνζζδ ηδξ 3 -NCCA αθθδθμοπίαξ ημο οπμζηνχιαημξ) (Δηθόλα IV) (Harris et al 2001). Ώοηά ηα P RNA, υπςξ πνμαθέπεηαζ, ζηενμφκηαζ ηαηαθοηζηήξ δναζηζηυηδηαξ απμοζία ηςκ πνςηεσκζηχκ οπμιμκάδςκ. Βπίζδξ, ηα Μ P RNA ζηενμφκηαζ ηςκ δμιχκ Ρ6, Ρ16 ηαζ Ρ17, εκχ δζαεέημοκ ιζα πζμ εηηεκή Ρ10 έθζηα. Σέθμξ, ηα ηφπμο T P RNA ανίζημκηαζ ζε ανπαία ηδξ ηάλδξ ηςκ Thermoproteaceae ηαζ έπμοκ πμθφ παναηηδνζζηζηή δμιή δζυηζ ζε αοηά απμοζζάγμοκ ηα δμιζηά ζημζπεία Ρ8, Ρ11, Ρ12, J11/12, ηαεχξ ηαζ μζ ζοκηδνδιέκεξ πενζμπέξ CRII ηαζ CRIII, δδθαδή δεκ δζαεέηεζ ζπεδυκ ηαευθμο ηδκ πενζμπή ελεζδίηεοζδξ ( S-domain ). Βπζπθέμκ, δ έθζηα Ρ10 ηαηαθήβεζ ζε ιζα ιζηνή εδθεζά (Δηθόλα IV) (Ellis ηαζ Brown 2009). ηδκ οπυθμζπδ αθθδθμοπία ημοξ ειθακίγμοκ ιεβάθδ μιμθμβία ιε ηα ηφπμο Ώ P RNA. Δ ιείςζδ αοηή ζημ ιέβεεμξ ηςκ ηφπμο Σ P RNA ιπμνεί κα ζπεηίγεηαζ ιε ηδ ιείςζδ ημο ιεβέεμοξ ηςκ 5 54

56 Δηζαγσγή αθθδθμοπζχκ ηςκ πνμδνυιςκ trna ζε θίβα κμοηθεμηίδζα ζε αοηά ηα ααηηήνζα. Γζ αοηυ ηα Σ P RNA δζαηδνμφκ ηδκ ζδζυηδηα ηςκ νζαμεκγφιςκ, δδθαδή ηαηαθφμοκ ηδκ ςνίιακζδ ηςκ οπμζηνςιάηςκ ημοξ απμοζία πνςηεσκζηχκ παναβυκηςκ in vitro. Εικόνα IV: Ώκηζπνμζςπεοηζηέξ δεοηενμηαβείξ δμιέξ RNA οπμιμκάδςκ απυ ανπαία. Σφπμξ Ώ (πανυιμζα ιε ηδκ μιχκοιδ ααηηδνζαηή δμιή, αθθά οπμθείπμκηαζ ηα δμιζηά ζημζπεία Ρ13, Ρ14 ηαζ Ρ18): ακηζπνμζςπεφεηαζ απυ ημ ανπαίμ M. thermoautotrophicus, ηφπμξ Μ (οπμθείπμκηαζ ηα δμιζηά ζημζπεία Ρ6, Ρ8, Ρ16 ηαζ Ρ17): ανίζηεηαζ ζε ανπαία ημο βέκμοξ Methanococci ηαζ Archaeoglobi, ηφπμξ T (οπμθείπεηαζ δ πενζμπή ελεζδίηεοζδξ S): ανίζηεηαζ ζε ανπαία ημο βέκμοξ Thermoproteaceae. RNA ππνκνλάδα ηεο επθαξπσηηθήο RNase P ηζξ πενζζζυηενεξ πενζπηχζεζξ ημ RNA απυ ηζξ εοηανοςηζηέξ RNase P είκαζ ιζηνυηενμ ζε ιέβεεμξ ζε ζφβηνζζδ ιε αοηυ ηςκ ααηηδνζαηχκ, αθμφ ηα πνχηα ζηενμφκηαζ ηοπζηχκ δμιζηχκ πενζμπχκ πμο είκαζ οπεφεοκεξ βζα ηδκ ζηαεενυηδηα ηδξ δμιήξ ημο ιμνίμο ζηα ααηηήνζα. ε ακηίεεζδ, ηα P RNA ηςκ ανπαίςκ έπμοκ πανυιμζμ ιέβεεμξ ιε αοηά ηςκ ααηηδνίςκ. Σα εοηανοςηζηά P RNA πμο έπμοκ ακζπεεοεεί ιέπνζ ηχνα, είηε ακήημοκ ζημ πονδκζηυ μθμέκγοιμ, είηε ζημ ιζημπυκδνζαηυ ή/ηαζ ηςκ πθαζηζδίςκ ηαζ έπμοκ εθάπζζηδ ή ηαευθμο δναζηζηυηδηα απμοζία ηςκ πνςηεσκζηχκ ημοξ οπμιμκάδςκ. Σα πονδκζηά P RNA έπμοκ ζοζηδιαηζηά ιεθεηδεεί ζε ιήηοηεξ ηαζ πμνδςηά, εκχ ηα P RNA ηςκ μνβακζδίςκ ηονίςξ ζε πνχηζζηα. Σα πενζζζυηενα P RNA μνβακζδίςκ, πανυηζ εα πενίιεκε ηακείξ κα ζπεηίγμκηαζ 55

57 Δηζαγσγή ιε αοηά ηςκ ααηηδνζαηχκ πνμβυκςκ ημοξ (πνςηεμααηηήνζα ηαζ ηοακμααηηήνζα), πανμοζζάγμοκ ιεβάθεξ δζαθμνέξ απυ αοηά. Γζ αοηυ ημ θυβμ, δεκ είκαζ δοκαηυκ κα δζαπςνζζημφκ αοηά ηα P RNA ζε ηφπμοξ. ε υθμοξ ημοξ ιεθεηδιέκμοξ έςξ ηχνα εοηανοχηεξ δφμ δζαθμνεηζηά P RNA οπάνπμοκ, έκα ζημ πονήκα ηαζ έκα ζηα ιζημπυκδνζα. Βλαίνεζδ απμηεθμφκ ηα θφηδ ζηα μπμία έπεζ ακζπκεοεεί ηαζ ηνίημ P RNA ζηα πθαζηίδζα. Σα πονδκζηά P RNA δζαεέημοκ πμθθά δμιζηά ζημζπεία πμο ανίζημκηαζ ηαζ ζηα πνμακαθοεέκηα P RNA, υπςξ μζ έθζηεξ Ρ1, Ρ2, Ρ3, Ρ4, Ρ7, Ρ10/11, Ρ12 ηαζ Ρ15 (Δηθόλα V) (Frank et al 2000). Πμθθά απυ αοηά ηα δμιζηά ζημζπεία ιπμνεί κα ιδκ ιμζάγμοκ ζηδκ αθθδθμοπία ιε αοηά ηςκ ααηηδνίςκ ηαζ ηςκ ανπαίςκ, εκημφημζξ εκημπίγμκηαζ ζηδκ ίδζα εέζδ ςξ ζοκηδνδιέκεξ δμιέξ. Ώοηέξ μζ πενζμπέξ βζα κα δζαηνίκμκηαζ ζδιεζχκμκηαζ ςξ ep (eukaryal paired), υπςξ βζα πανάδεζβια ep8, ep9, ep15 ηαζ ep19. Δ Ρ3 ζηδ πθεζμρδθία ηςκ πονδκζηχκ P RNA πενζέπεζ ιζα ιεβάθδ εζςηενζηή εδθεζά ημκηά ζημ ηέκηνμ ηδξ θμονηέηαξ, δ μπμία δεκ οπάνπεζ ζηα ααηηδνζαηά ηαζ ηςκ ανπαίςκ ηα P RNAs. Ώοηή δ εδθεζά (L3) πςνίγεζ ηδκ Ρ3 ζε δομ δζαηνζηέξ δμιέξ θμονηέηαξ, ηδκ P3a ηαζ ηδκ P3b. Ώοηή δ πενζμπή ελοπδνεηεί ηδκ δέζιεοζδ ηςκ πνςηεσκχκ Pop1 ή ημο εηενμδζιενμφξ Pop6/7 ηαζ εκδεπμιέκςξ ηδκ ζηναημθυβδζδ ηαζ άθθςκ ζδιακηζηχκ πνςηεσκζηχκ οπμιμκάδςκ βζα ηδκ ζοβηνυηδζδ ημο μθμεκγφιμο (Perederina et al 2010, Ziehler et al Εικόνα V: Ώκηζπνμζςπεοηζηέξ δεοηενμηαβείξ δμιέξ P RNA οπμιμκάδςκ απυ εοηανοχηεξ. Δ δμιή ηςκ πονδκζηχκ P RNA ηςκ ιοηήηςκ ακηζπνμζςπεφεηαζ απυ ηδ γφιδ S. cerevisiae, εκχ αοηή ηςκ ζπμκδοθςηχκ απυ ημ H. sapiens. Οζ δμιέξ ηςκ πονδκζηχκ P RNA άθθςκ θοθμβεκεηζηχκ μιάδςκ δεκ είκαζ ηαθά ιεθεηδιέκεξ, αθθά δ πμζηζθμιμνθία ζηζξ δμιέξ ηςκ P RNA αοηχκ ηςκ μνβακζζιχκ θαίκεηαζ ηαζ απυ ηδ δμιή ζημκ μνβακζζιυ Giardia lamblia. 56

58 Δηζαγσγή 2001). Οζ έθζηεξ Ρ13, Ρ14 ηαζ δ εδθεζά L15, πανυηζ οπάνπμοκ ζηζξ δμιέξ ηςκ P RNAs απυ ηα ααηηήνζα ηαζ ηα ανπαία, θείπμοκ απυ ηζξ δμιέξ ηςκ πονδκζηχκ P RNA. Λίβα ιζημπμκδνζαηά P RNA έπμοκ ακζπκεοεεί ηαζ αηυια θζβυηενςκ μζ δεοηενμηαβείξ δμιέξ έπμοκ ιεθεηδεεί. Σμ ιζημπμκδνζαηυ P RNA ημο Reclinomonas americana είκαζ πανυιμζμ ιε αοηυ ηςκ α-πνςηεμααηηδνίςκ, πενζέπμκηαξ υθα ηα δμιζηά ημοξ ζημζπεία εηηυξ απυ ηδκ πενζμπή Ρ15-L15 (Brown et al 1994). Άθθα P RNA ηςκ μπμίςκ μζ δμιέξ έπμοκ ιεθεηδεεί είκαζ αοηά ημο βέκμοξ Zygomycetes. Ώοηέξ μζ δεοηενμηαβείξ δμιέξ πμζηίθμοκ ζε ιέβεεμξ απυ 188 ιέπνζ 982 nt (Seif et al 2005). Οζ έθζηεξ Ρ12 ηαζ Ρ15 αοηχκ ηςκ P RNA πμζηίθμοκ ζε ιέβεεμξ, αθθδθμοπία ηαζ δζαιυνθςζδ. Ώπυ ηδκ άθθδ ιενζά, ηα ιζημπμκδνζαηά P RNA ηςκ αζημιδηφηςκ είκαζ πμθφ ιζηνά ζε ιέβεεμξ ηαζ ζηενμφκηαζ πμθθχκ δμιζηχκ ζημζπείςκ, πμο ηαηά ηα άθθα είκαζ ζοκηδνδιέκα ζε υθεξ ηζξ οπυθμζπεξ δμιέξ ηςκ P RNA (Bullerwell et al 2003, Seif et al 2003, Kachouri et al 2005, Seif et al 2006). Δ ακενχπζκδ ιζημπμκδνζαηή RNase P ηαζ ημο θοημφ A. thaliana, υπςξ πνμακαθένεδηε, είκαζ απμηθεζζηζηά πνςηεσκζηήξ θφζεςξ (Holzmann et al 2008, Gobert et al 2010). οιπεναζιαηζηά, ζηα P RNA υθςκ ηςκ μνβακζζιχκ ειθακίγμκηαζ ηα δίηθςκα ηιήιαηα Ρ1-Ρ4 ηαζ Ρ7-Ρ11, ιε ιενζηή ιυκμ ιεηααμθή ζημ ιήημξ ημοξ, ηαεχξ επίζδξ ηαζ πέκηε δζαηνζηέξ ηαζ ζοκηδνδιέκεξ πενζμπέξ CRI-CRV (Chen et al 1997). Ώοηά ηα παναηηδνζζηζηά απμηεθμφκ ημκ απαναίηδημ δμιζηυ ηαζ θεζημονβζηυ πονήκα ηςκ RNA οπμιμκάδςκ (Δηθόλα VI). Βκημφημζξ, επζπθέμκ δμιέξ πμο ζηαεενμπμζμφκ ημκ ζοκηδνδιέκμ πονήκα είκαζ απαναίηδηεξ βζα ηδ θεζημονβζηυηδηα αοηχκ ηςκ ιμνίςκ (Darr et al 1992, Brown 1996). Εικόνα VI: Δ δμιή ημο ημζκμφ δμιζημφ πονήκα ακάιεζα ζηζξ RNA οπμιμκάδεξ ηδξ RNase P απυ ααηηήνζα, ανπαία ηαζ πονήκεξ εοηανοςηζηχκ μνβακζζιχκ. οιπενζθαιαάκμκηαζ ηαζ δμιέξ πμο απμοζζάγμοκ ζε ηάπμζεξ ιειμκςιέκεξ ελεθζηηζηά μιάδεξ, υπςξ δ Ρ12 (απμοζζάγεζ ζημ M. fermentans) ηαζ δ Ρ2 (πενζμνζζιέκδ ζε ιέβεεμξ ή απμοζζάγεζ εκηεθχξ απυ ημ βέκμξ Pyrobaculum). Οζ βηνί βναιιέξ δείπκμοκ ζοκδέζεζξ πμο πμζηίθμοκ ζε ιέβεεμξ ιεηαλφ ηςκ ζοκηδνδιέκςκ δμιζηχκ ζημζπείςκ. Οζ εθζημεζδείξ δμιέξ ζοιαμθίγμκηαζ ςξ Ρ1-Ρ12 ηαζ μζ ζοκηδνδιέκεξ πενζμπέξ ςξ CRI-V. 57

59 Δηζαγσγή Tξηηνηαγήο δνκή ηνπ RNA Δ απμηάθορδ ηδξ ηνζημηαβμφξ δμµήξ ημο RNA ηςκ RNase P ααζίζηδηε ανπζηά ζε θοθμβεκεηζηέξ ζοβηνίζεζξ ηαζ ζε πεζνάιαηα απμηφπςζδξ (footprinting) (Tsai et al 2003, Brown et al 1996). ηδ ζοκέπεζα, πνμζδζμνίζεδηε ιε ηνοζηαθθμβναθζηέξ ιεευδμοξ δ πενζμπή ελεζδίηεοζδξ S ηδξ RNA οπμιμκάδαξ ηφπμο ΐ απυ ημ B. subtilis, υπμο ακαθφεδηακ μζ δίηθςκεξ πενζμπέξ Ρ7-Ρ12 (Krasilnikov et al 2003). Έκα πνυκμ ανβυηενα δδιμζζεφεδηακ δεδμιέκα βζα ηδ ηνοζηαθθζηή δμιή ηδξ πενζμπήξ ελεζδίηεοζδξ S απυ ημ RNA ηφπμο Ώ απυ ημ ααηηήνζμ Thermus thermophilus, υπμο πναβιαημπμζήεδηε ακάθοζδ ηςκ εθζημεζδχκ πενζμπχκ Ρ7-Ρ14 (Kraslinikov et al 2004). Μυθζξ ημ 2005 πνμζδζμνίζηδηε ιε ηνοζηαθθμβναθζηέξ ιεευδμοξ δ δμιή ημο Ρ RNA ηφπμο ΐ απυ ημ ααηηήνζμ Bacillus stearothermophilus ιε δζαηνζηζηή ζηακυηδηα πμο θηάκεζ ζηα 3.3 Å. Σιήιαηα ηδξ πενζμπήξ ελεζδίηεοζδξ S, υπςξ μζ πενζμπέξ P10.1, P12, J11/12 ηαζ J12/11, δεκ ηαηάθενακ κα ακαθοεμφκ θυβς αζηάεεζαξ ηδξ δζαιυνθςζδξ αοηχκ ηςκ πενζμπχκ, αθθά δ οπυθμζπδ δμιή ηδξ πενζμπήξ ελεζδίηεοζδξ S πμο πνμζδζμνίζηδηε ζοιθςκεί ιε αοηή απυ ημ B. subtilis (Kazantsev et al 2005) (Δηθόλα Η). Δ ενεοκδηζηή μιάδα ημο Modragon έθοζε ηδκ ίδζα πενίμδμ ηδ δμιή ημο RNA ηδξ RNase P απυ ημ Thermotoga maritima ιε ακάθοζδ ημο ηνοζηάθθμο ζηα 3.85 Å. Ώκαθφεδηακ ιυκμ κμοηθεμηίδζα πμο ανίζημκηαζ ζε εθζημεζδείξ πενζμπέξ ηαζ παναηδνήεδηε πςξ ηα ηαηάθμζπα ημπμεεημφκηαζ αάζεζ ηδξ δμιήξ ηδξ πενζμπήξ ελεζδίηεοζδξ S ημο T. thermophilus (Torres- Larios et al 2005) (Δηθόλα Η). ηζξ δμιέξ αοηέξ θαίκμκηαζ μζ αθθδθεπζδνάζεζξ ηςκ επζιένςκ δμιζηχκ ζημζπείςκ πμο ηζξ ζηαεενμπμζμφκ, υπςξ βζα πανάδεζβια ηζξ έθζηεξ Ρ6, Ρ14 ηαζ Ρ18 ηαζ μζ P5.1 ηαζ P15.1 πμο οπάνπμοκ ζηα Ώ ηφπμο ηαζ ΐ ηφπμο ααηηδνζαηά RNase P RNA, ακηίζημζπα. Σα βεκζηά παναηηδνζζηζηά ηαζ ηςκ δφμ ηφπςκ, Ώ ηαζ ΐ, είκαζ πςξ ζπδιαηίγμκηαζ απυ ζημζπεία έθζηαξ ηα μπμία παναηάζζμκηαζ πανάθθδθα ηαζ ζοκδέμκηαζ ιε αθθδθεπζδνάζεζξ ιεηαλφ απμιαηνοζιέκςκ ζημζπείςκ. Πμθθά ζημζπεία πμο ανίζημκηαζ ζηδκ επζθάκεζα ημο δμιζημφ πονήκα ηαζ δδιζμονβμφκ αθθδθεπζδνάζεζξ πμο ζοκεζζθένμοκ ζηδκ ζηαεενυηδηα ηδξ ηαηαθοηζηήξ δζαιυνθςζδξ είκαζ ιεηααθδηά απυ θοθμβεκεηζηήξ άπμρδξ ηαζ μζ δζαθμνέξ πμο πανμοζζάγμοκ ιπμνεί κα ελδβμφκ ηάπμζεξ πανεηθίζεζξ πμο παναηδνμφκηαζ ζηζξ δμιέξ ηςκ δφμ ηφπςκ. Γζα πανάδεζβια, δ πενζμπή ελζδείηεοζδξ S έπεζ ζοιπαβή δζαιυνθςζδ ζημ Ρ RNA Ώ ηφπμο, ςξ απμηέθεζια ηδξ αθθδθεπίδναζδξ ημο ζδζμζοβηναζζαημφ ζημζπείμο Ρ14 ιε ημ πμθφ ζοκηδνδιέκμ ζημζπείμ Ρ8. Ώκάθμβδ αθθδθεπίδναζδ δεκ εκημπίγεηαζ ζημ Ρ RNA 58

60 Δηζαγσγή (Α) (B) Εικόνα Ι: Κνοζηαθθζηέξ δμιέξ ηςκ ααηηδνζαηχκ Ρ RNA ηφπμο Ώ ηαζ ΐ. Ώνζζηενά: Ώ-ηφπμο δμιή απυ ημ ααηηήνζμ T. maritima (PDB ID: 2A2E). Αελζά: ΐ-ηφπμο δμιή απυ ημ ααηηήνζμ B. stearothermophilus (PDB ID: 2A64). Ώκάθμβα δμιζηά ζημζπεία ηδξ δεοηενμηαβμφξ δμιήξ ημοξ πανμοζζάγμκηαζ ιε ημ ίδζμ πνχια. (Α) Οζ ηνζημηαβείξ δμιέξ ηςκ RNA ιμνίςκ απυ δφμ δζαθμνεηζηέξ υρεζξ. (Β) Αεοηενμηαβείξ δμιέξ ηςκ P RNA. Σα κμοηθεμηίδζα πμο δεκ ακαπανζζηχκηαζ ζηζξ ηνοζηαθθζηέξ δμιέξ ζδιεζχκμκηαζ ιε βηνί πνχια ηαζ μζ ηαιπφθεξ βναιιέξ δείπκμοκ ηζξ ηνζημηαβείξ αθθδθεπζδνάζεζξ ηςκ δμιζηχκ ζημζπείςκ. 59

61 Δηζαγσγή ηφπμο ΐ ηαζ αοηυ ιπμνεί κα ελδβήζεζ ηδκ απμδζμνβάκςζδ ηδξ πενζμπήξ S ζηδκ ηνοζηαθθζηή δμιή ημο B. stearothermophilus. Έκα ιμκηέθμ ηνζημηαβμφξ δμιήξ βζα ημ εοηανοςηζηυ Ρ RNA απυ ημκ ζπζγμζαηπανμιήηοηα Schizosaccharomyces pombe δδιζμονβήεδηε ζημ ενβαζηήνζμ ημο Norman Pace ιε ηδ πνήζδ δεδμιέκςκ απυ πεζνάιαηα ζηαονμζφκδεζδξ (crosslinking experiments) ηαζ ηδ ηνοζηαθθζηή δμιή ηςκ ααηηδνζαηχκ P RNA (Δηθόλα ΗΗ) (Marquez et al 2006). Σμ ιμκηέθμ αοηυ δείπκεζ ηδκ απμοζία δμιζηχκ ζημζπείςκ απαναίηδηςκ βζα ηδκ ηαηάθοζδ ηαζ πνυζδεζδ ημο οπμζηνχιαημξ, υπςξ δ L15 εδθεζά, ηαεχξ ηαζ δίηθςκςκ πενζμπχκ απαναίηδηςκ βζα ηδ ζηαεενμπμίδζδ ηδξ ζςζηήξ δζαιυνθςζήξ ημο, υπςξ μζ πενζθενζηέξ έθζηεξ Ρ5.1-Ρ15.1 ζημ B. stearothermophilus ηαζ μζ Ρ8-Ρ14 ζημ E. coli (Brown et al 1996, Darr et al 1992, Kirsebom ηαζ Svard 1994). Ώοηυ ιπμνεί κα ελδβεί βζαηί ηα εοηανοςηζηά Ρ RNA είκαζ θζβυηενμ ζηαεενά απυ ηα ααηηδνζαηά ηαζ ακεκενβά ζηζξ ζοκεήηεξ πμο ηα ααηηδνζαηά ηαηαθφμοκ ακηζδνάζεζξ. Πνυζθαηα πναβιαημπμζήεδηε ηνοζηαθθμβναθία ημο Ρ3 δμιζημφ ζημζπείμο απυ ηδκ RNase MRP ηδξ γφιδξ S. cerevisiae ζε ζφιπθμημ ιε ηζξ πνςηεύκεξ Pop6 ηαζ Pop7 πμο ζοιιεηέπμοκ ηαζ ζηα δφμ μθμέκγοια ηδξ RNase P ηαζ RNase MRP. Δ δζαηνζηζηή ζηακυηδηα ημο ηνοζηάθθμο ήηακ 2.7 Å. Ο ηνφζηαθθμξ δείπκεζ πανυιμζα μνβάκςζδ ηδξ Ρ3 πενζμπήξ ιεηαλφ ηδξ RNase P ηαζ RNase MRP, εκχ μζ πζεακέξ θεζημονβίεξ ηδξ ιεηά ηδκ πνυζδεζδ ηςκ πνςηεσκχκ είκαζ δ ζηαεενμπμίδζδ ηδξ δμιήξ ημο μθμεκγφιμο ηαζ δ αθθδθεπίδναζδ ιε ημ οπυζηνςια. Δ ιεθέηδ αοηή πανέπεζ ηζξ πνχηεξ πθδνμθμνίεξ ζπεηζηά ιε ηδκ μνβάκςζδ ηδξ δμιήξ ηςκ εοηανοςηζηχκ μθμεκγφιςκ RNase P/ RNase MRP (Perederina et al 2010). Σα Ρ RNA ησλ ηύπσλ Α θαη Β πηνζεηνύλ θνηλέο δηακνξθώζεηο γηα ηελ πεξηνρή εμεηδίθεπζεο θαη θαηάιπζεο οβηνίκμκηαξ ηζξ ηνοζηαθθζηέξ δμιέξ ηςκ Ρ RNA ηαζ ηςκ δφμ ηφπςκ πνμηφπηεζ πςξ, πανυθμ πμο μζ δεοηενμηαβείξ ηαζ μζ ηνζημηαβείξ δμιέξ ημοξ δζαθένμοκ, ιία ζπζζιή ζηδ πενζμπή ελεζδίηεοζδξ S, πμο πενζαάθθεηαζ απυ ειπθεηυιεκα ζηδκ αθθδθεπίδναζδ ιε ηδκ ΣρC εδθεζά ημο οπμζηνχιαημξ κμοηθεμηίδζα, είκαζ δμιζηά ζοκηδνδιέκμ (Krasilnikov et al 2003, Krasilnikov et al 2004). Δ ζοκηδνδιέκδ αοηή πενζμπή ηαζ ζημοξ δφμ ηφπμοξ Ρ RNA ζπδιαηίγεηαζ απυ ιζα ιδ εθζημεζδή δμιή απμηεθμφιεκδ απυ ηα ζοκδεηζηά δμιζηά ζημζπεία J11/12 ηαζ J12/11, ηαεχξ ηαζ απυ ηα ζηεθέπδ Ρ9, Ρ10 ηαζ Ρ11. Ο πανυιμζμξ πνμζακαημθζζιυξ αοηχκ ηςκ δμιχκ ημπμεεηεί ηα κμοηθεμηίδζα πμο αθθδθεπζδνμφκ ιε ημ 60

62 Δηζαγσγή οπυζηνςια, Ώ108 απυ ημ Ρ9, Ώ226 απυ Ρ11 ηαζ Ώ172 απυ J12/11 (δ ανίειδζδ ααζίγεηαζ ζηδ δμιή ημο T. thermophilus), ζε ζπεδυκ ηαοηυζδιεξ εέζεζξ. (Α) B. Stearothermophilus RNA (Κρσζηαλλική δομή) S. pombe RNA (Μονηέλο) (B) Εικόνα ΙΙ: φβηνζζδ ιεηαλφ ηςκ δμιχκ ημο ααηηδνζαημφ ηαζ ημο εοηανοςηζημφ Ρ RNA. (Α) Οζ δεοηενμηαβείξ δμιέξ ηςκ P RNA ηςκ B. stearothermophilus ηαζ S. pombe. Οζ δζαηεημιιέκεξ βναιιέξ ζοιαμθίγμοκ ηζξ ηνζημηαβείξ αθθδθεπζδνάζεζξ ιεηαλφ ηςκ εθίηςκ. (Β) Οζ ηνζημηαβείξ δμιέξ ηςκ Ρ RNA ηςκ B. stearothermophilus ηαζ S. pombe. ημ ιμκηέθμ Ρ RNA ημο S. pombe δεκ πενζθαιαάκεηαζ δ πενζμπή κμοηθεμηζδίςκ , θυβς ιδ ζοιθςκίαξ ηςκ δεδμιέκςκ ηςκ πεζναιάηςκ ζηαονμζφκδεζδξ ηαζ ηδξ ηνοζηαθθζηήξ δμιήξ ημο Ρ RNA ημο T. maritimα. Σμ δζπθυ αέθμξ δείπκεζ ηζξ αθθδθεπζδνάζεζξ ιεηαλφ ηςκ δμιχκ Ρ5.1 ηαζ Ρ15.1. Δ δμιή ηδξ εδθεζάξ Ρ3 ηαζ Ρ3b δεκ ιμκηεθμπμζήεδηε. Οζ μιυθμβεξ πενζμπέξ ιεηαλφ ηςκ δφμ δμιχκ είκαζ πνςιαηζζιέκεξ ιπθέ, μζ ιδ μιυθμβεξ βηνί ηαζ μζ πενζμπέξ, ηςκ μπμίςκ δ δμιή δε έπεζ πνμζδζμνζζηεί απυ ημκ ηνφζηαθθμ ημο B. stearothermophilus, ιαφνεξ. Οζ ηυηηζκεξ ζθαίνεξ ηαζ μζ πενζμπέξ ιε πνοζυ πνχια ακαπανζζημφκ ηα ζδιεία ζηαονμζφκδεζδξ ηςκ 5 ηαζ ηςκ 3 άηνςκ ηςκ trna, ακηίζημζπα. 61

63 Δηζαγσγή Ο ημζκυξ αοηυξ πονήκαξ ζηαεενμπμζείηαζ απυ δζαθμνεηζηά δμιζηά ζημζπεία ζημ ηάεε Ρ RNA. Δ δζαιυνθςζδ ηφπμο Ώ ζηαεενμπμζείηαζ απυ αθθδθεπζδνάζεζξ ιεηαλφ ηςκ δίηθςκςκ πενζμπχκ Ρ14 ηαζ Ρ8, ηαεχξ ηαζ ιεηαλφ ηςκ Ρ12 ηαζ Ρ13. Δ ακαδίπθςζδ ηδξ πενζμπήξ ελεζδίηεοζδξ S ημο ηφπμο ΐ Ρ RNA, εθυζμκ απμοζζάγμοκ ηα δμιζηά ζημζπεία Ρ13 ηαζ Ρ14, οπμζηδνίγεηαζ απυ αθθδθεπζδνάζεζξ ιεηαλφ ηςκ Ρ10.1 ηαζ L12, ηαεχξ ηαζ ιεηαλφ ηςκ Ρ10.1 ηαζ Ρ7 (Δηθόλα ΗΗΗ). Δ ιεθέηδ ηςκ ηνοζηαθθζηχκ δμιχκ έδεζλε βζα πνχηδ θμνά πχξ δφμ δζαθμνεηζηά ιυνζα RNA, ιε ηδκ ίδζα θεζημονβία, δφκακηαζ κα ζπδιαηίζμοκ ιζα πενζμπή ιε πανυιμζμ δμιζηυ πονήκα, πνδζζιμπμζχκηαξ δζαθμνεηζηά ανπζηεηημκζηά ζημζπεία (Δηθόλα ΗΗΗ). πςξ ιε ηζξ πενζμπέξ ελεζδίηεοζδξ S ηςκ Ρ RNA ηφπμο Ώ ηαζ ΐ, δ ζφβηνζζδ μθυηθδνςκ ηςκ δμιχκ ηςκ Ρ RNA Ώ ηαζ ΐ ηφπμο απμηαθφπηεζ ημζκή επζθάκεζα ηαζ βζα ηδκ ηαηαθοηζηή ημοξ πενζμπή C, δ μπμία, επίζδξ, ζηαεενμπμζείηαζ απυ δζαθμνεηζηά δμιζηά ζημζπεία. Αζαθαίκεηαζ, θμζπυκ, πςξ πανά ηδ δζαθμνεηζηή ανπζηεηημκζηή ηςκ Ρ RNA Ώ ηαζ ΐ ηφπμο, ζπδιαηίγμκηαζ μζ δμιζηά ζοκηδνδιέκμζ πονήκεξ ηςκ πενζμπχκ ηαηάθοζδξ ηαζ ελεζδίηεοζδξ, μζ μπμίμζ πενζθαιαάκμοκ ηζξ μιμαλμκζηέξ έθζηεξ Ρ1/Ρ4/Ρ5, Ρ2/Ρ3, Ρ8/Ρ9 ηαζ Ρ15, ιζα ιδ ηακμκζηή ζοκδεηζηή πενζμπή ιεηαλφ ηςκ ζηεθεπχκ Ρ3 ηαζ Ρ4, ηαεχξ ηαζ ηδ ζοκδεηζηή πενζμπή J11/12-J12/11. Αμιζηά ζημζπεία πμο δεκ ακήημοκ ζημκ ημζκυ ζοκηδνδιέκμ πονήκα ζηαεενμπμζμφκ ηζξ επζθάκεζεξ πμο αθθδθεπζδνμφκ ιε ημ οπυζηνςια ιε δζαθμνεηζηυ ηνυπμ ζε ηάεε ηφπμ Ρ RNA. Γζα πανάδεζβια, ζηα ηφπμο Ώ Ρ RNA, δ Ρ18 πενζμπή ημπμεεηείηαζ ζε ιζα δεφηενδ ζημζαάδα ζε ζπέζδ ιε ηδκ οπυθμζπδ δμιή, πίζς ηαζ δζαβχκζα ιε ηζξ δέζιεξ Ρ1/Ρ4/Ρ5 ηαζ Ρ8/Ρ9. Δ Ρ18 απμοζζάγεζ απυ ηα RNA ηςκ εοηανοςηχκ ηαζ εκδεπμιέκςξ ακηζηαείζηαηαζ απυ ηάπμζα πνςηεσκζηή οπμιμκάδα. Δ έθζηα Ρ14 επίζδξ εκημπίγεηαζ ζε αοηήκ ηδ δεφηενδ ζημζαάδα ηαζ παίγεζ ημ νυθμ οπμζηδνζηηζημφ ζημζπείμο. Σα ΐ ηφπμο Ρ RNA, ακηί ηδξ Ρ18 έθζηαξ έπμοκ ηδ Ρ15.2 ηαζ αθθδθεπζδνάζεζξ ιεηαλφ ηδξ L15.1 ηαζ ηδξ L5.1 εδθεζάξ, δμιέξ πμο απμοζζάγμοκ απυ ηα Ρ RNA Ώ ηφπμο, πνμζακαημθίγμκηαζ έηζζ χζηε κα ένεμοκ ζε επαθή μζ μιμαλμκζηέξ δέζιεξ Ρ15.1/Ρ15.2 ηαζ Ρ1/Ρ4/Ρ5/Ρ5.1. Ο αναπίμκαξ Ρ15 ανίζηεηαζ ζηδκ ίδζα εέζδ ηαζ ζηζξ δφμ δμιέξ (Torres- Larios et al 2006). Σμ βεκζηυ ζοιπέναζια είκαζ πςξ ηαζ μζ δφμ δμιέξ είκαζ πανυιμζεξ ζηζξ πενζμπέξ πμο ζοιιεηέπμοκ ζηδκ ακαβκχνζζδ ηαζ ζηδκ ηαηάθοζδ ημο οπμζηνχιαημξ, πανυθμ πμο ζπδιαηίγμκηαζ απυ δζαθμνεηζηά δμιζηά ζημζπεία, εκχ ακαιέκεηαζ μζ αθθδθεπζδνάζεζξ ιε ημ οπυζηνςια κα βίκμκηαζ ιε ημκ ίδζμ ηνυπμ ιεηαλφ ηςκ δφμ ηφπςκ Ρ RNA. 62

64 Δηζαγσγή Α ηύποσ Ρ RNA B ηύποσ Ρ RNA (Α) (B) Εικόνα ΙΙΙ: Ο δμιζηυξ πονήκαξ ηςκ Ρ RNA. (Α) Αεοηενμηαβείξ δμιέξ ηςκ ηφπμο Ώ (ανζζηενά) ηαζ ηφπμο ΐ (δελζά) Ρ RNA. Ο ημζκυξ δμιζηυξ πονήκαξ ιεηαλφ ηςκ δφμ ηφπςκ RNA είκαζ πνςιαηζζηυξ. Ο ζοκδεηζηυξ ζπδιαηζζιυξ J11/12 ηαζ J12/11, πμο απμηεθεί ιένμξ ημο ημζκμφ πονήκα, δεκ πανμοζζάγεηαζ ιε πνχια θυβς ηδξ αζηάεεζαξ πμο πανμοζζάγεζ ζηδ δμιή ΐ ηφπμο. Σα οπυθμζπα δμιζηά ζημζπεία ειθακίγμκηαζ ιε βηνί πνχια. (Β) Τπένεεζδ ηςκ δμιζηχκ πονήκςκ. Δ Ώ ηφπμο δμιή πανμοζζάγεηαζ ιε ημκ ίδζμ πνςιαηζζιυ υπςξ ζημ (Ώ), εκχ δ ΐ ηφπμο δμιή πανμοζζάγεηαζ ιε ηυηηζκμ. Οζ δφμ δμιέξ απμηθίκμοκ ημκηά ζηδ πενζμπή ελεζδίηεοζδξ, πζεακχξ ελαζηίαξ ηδξ απμδζμνβάκςζδξ ζηδ πενζμπή ζημ ηνφζηαθθμ ηδξ δμιήξ ΐ ηφπμο. Δ απυηθζζδ είκαζ πζμ ειθακήξ ζηα δμιζηά ζημζπεία Ρ8/Ρ9. 63

65 Δηζαγσγή Ο κεραληζκόο ηεο αληίδξαζεο Δ ακηίδναζδ ηδξ ςνίµακζδξ ημο ptrna απυ ηδκ RNase P έπεζ µεθεηδεεί ζε πθδεχνα μνβακζζµχκ ηαζ απυ ηζξ ηνεζξ θοθμβεκεηζηέξ πενζμπέξ. Δ ηαθφηενα παναηηδνζζµέκδ απυ αοηέξ, είκαζ δ ακηίδναζδ πμο ηαηαθφεζ δ ααηηδνζαηή RNA οπμµμκάδα, ημ νζαμέκγοµμ Μ1 RΝΏ. Δ ακηίδναζδ έπεζ µεθεηδεεί ηαζ ζε εοηανοςηζηά ζοζηήµαηα, αθθά ηονίςξ ζε µενζηχξ ηαεανζζµέκα μθμέκγοµα, απυ πονήκεξ (Stathopoulos et al 1995, Tekos et al 1998) ηαζ οπμηοηηανζηά μνβακίδζα (Martin ηαζ Lang 1997). Δ δζάζπαζδ ημο θςζθμδζεζηενζημφ δεζιμφ ζημ 5 άηνμ ηςκ πνυδνμιςκ trna (ηαζ άθθςκ οπμζηνςιάηςκ) απυ ηδκ RNase P ηαζ ηδκ RNA οπμιμκάδα ηδξ ηαηαθήβεζ ζε πνμσυκηα ιε 3 -ΟΔ ηαζ 5 -Ρ άηνα (Δηθόλα Α). ε αέθηζζηεξ ηαηαθοηζηέξ ζοκεήηεξ, δ RNase P απαζηεί ζυκηα Mg 2+. Ο πζμ πζεακυξ µδπακζζµυξ βζα ηδκ ακηίδναζδ αοηή είκαζ µζα S N 2 πνμζαμθή απυ έκα κμοηθευθζθμ ημο δζαθφιαημξ ακηίδναζδξ ζημκ θςζθμνζηυ δζεζηένα ημο δεζµμφ πμο ηυαεηαζ, µε µία ηνζβςκζηή δζποναµζδζηή µεηαααηζηή ηαηάζηαζδ (Steitz ηαζ Steitz 1993). Δ ακηίδναζδ απμηεθείηαζ απυ ηνία δζαδμπζηά ηζκδηζηά ζηάδζα: α) ηδκ πνυζδεζδ οπμζηνχµαημξ, α) ηδκ εναφζδ ημο δεζµμφ ηαζ β) ηδκ απεθεοεένςζδ ημο πνμσυκημξ (ελίζςζδ 1). Έπεζ πνμηαεεί πςξ ημοθάπζζημκ δφμ ζυκηα Mg 2+ ζοιιεηέπμοκ άιεζα ζημ ιδπακζζιυ ηαηάθοζδξ ημ έκα έκοδνμ ζυκ Mg 2+ πανάβεζ ημ οδνμλοθζςιέκμ κμοηθευθζθμ ηαζ ημ άθθμ ζοκημκίγεζ ηαζ ζηαεενμπμζεί ημ εκαπμιείκακ 3 ζυκ μλοβυκμο, ελμοδεηενχκμκηαξ ημ ανκδηζηυ θμνηίμ πμο δδιζμονβείηαζ (Chen et al 1997, Cassano et al 2004). Ώοηυξ μ ιδπακζζιυξ απμηεθεί εκαθθαηηζηή εηδμπή ημο ηαηαθοηζημφ ιδπακζζιμφ δφμ ιεηάθθςκ, μ μπμίμξ ανπζηά παναηδνήεδηε ζε πνςηεσκζηά έκγοια πμο ηαηαθφμοκ ακηζδνάζεζξ ιεηαθμνάξ θςζθμνζηχκ μιάδςκ, υπςξ βζα πανάδεζβια δ αθηαθζηή θςζθαηάζδ (Kim ηαζ Wyckoff 1991, Steitz ηαζ Steitz 1993). Γζα ηδκ επίηεολδ ηδξ ηαηάθοζδξ απαζηείηαζ ηα Mg 2+ κα ημπμεεηδεμφκ έηζζ χζηε κα δζαζπαζηεί μ ζςζηυξ θςζθμδζεζηενζηυξ δεζιυξ. οβηεηνζιέκεξ πδιζηέξ μιάδεξ ζηδ εέζδ δζάζπαζδξ ζοκεζζθένμοκ ζηδ δέζιεοζδ ημο Mg 2+ ηαζ ζηδ ηαηάθοζδ: δ 2 -ΟΔ ηςκ κμοηθεμηζδίςκ ζηζξ εέζεζξ -1, -2 (Ν -1, Ν -2 ) ηαζ R +73 (υπμο R= A, G ή U) ημ pro-rp μλοβυκμ ημ 3 μλοβυκμ (εκαπμιείκμοζα μιάδα) ηαζ δ αιζκμιάδα ζημ κμοηθεμηίδζμ G +1 (Δηθόλα Β) (Brannvall et al 2004, Brannvall ηαζ Kirsebom 2005, Kikovska et al 2006). ημ ιδπακζζιυ ηαηάθοζδξ θαίκεηαζ κα ζοιιεηέπεζ ηαζ έκα 64

66 Δηζαγσγή ηνίημ ζυκ Mg 2+, ημ μπμίμ ζοκδέεηαζ ιε δεζιυ ζοκανιμβήξ ιε ηδκ 2 -ΟΔ ζηδ Ν -1 ημο οπμζηνχιαημξ. Σμ ζυκ αοηυ αθθδθεπζδνά ιε ιυνζα Δ 2 Ο ηαζ δζεοημθφκεζ ημ ζπδιαηζζιυ μλοακζυκημξ ζηδκ 3 εέζδ (Δηθόλα B) (Smith ηαζ Pace 1993). ε δζαθμνεηζηέξ ιεθέηεξ ηδξ RNase P έπεζ δεζπεεί πςξ ημ Mg 2+ ιπμνεί κα ακηζηαηαζηαεεί ιενζηχξ απυ άθθα δζζεεκή ζυκηα υπςξ ημ Mn 2+, Ca 2+, Zn 2+ ηαζ Pb 2+, ζοκήεςξ ζε ζοκδοαζιυ ιε ζυκηα Ba 2+, Sr 2+ ηαζ Co(NH 3 ) ηζξ πενζπηχζεζξ αοηέξ δ δναζηζηυηδηα ημο εκγφιμο ανέεδηε κα είκαζ ιεζςιέκδ (Guerrier-Takada et al 1986, Kazakov ηαζ Altman 1991, Tekos et al 1998, Brannvall ηαζ Kirsebom 2001). Βπζπθέμκ, ακηζηαεζζηχκηαξ ηδ 2 -ΟΔ ημο G +1 ιε Δ ηαζ ημ pro-sp μλοβυκμ ζηδ εέζδ εναφζδξ ιε S ιεηααάθθεηαζ δ εέζδ δζάζπαζδξ (Perreault ηαζ Altman 1992, Warnecke et al 1999), αθθά ιε πμζυ ηνυπμ αοηέξ μζ μιάδεξ ζοκεζζθένμοκ ζηδκ πνυζδεζδ ηςκ ζυκηςκ Mg 2+ ηαζ ζημ ιδπακζζιυ ηαηάθοζδξ ημο νζαμεκγφιμο δεκ είκαζ αηυια ηαηακμδηυ. Ώπυ ηδκ άθθδ πθεονά, ζε ιεθέηεξ ακηζηαηάζηαζδξ ημο Mg 2+ απυ Cd 2+ ή Mn 2+, υηακ ημ Rp μλοβυκμ, ηδξ θςζθμνζηήξ μιάδαξ ημο δεζιμφ πμο εναφεηαζ, είπε οπμηαηαζηαεεί απυ S, εδείπεδ πςξ δ εκγοιζηή δναζηζηυηδηα RNase P απμηαείζηαηαζ πθήνςξ (Warnecke et al 1996, Pfeiffer et al 2000, Warnecke et al 2000). Ώοηυ ζοιααίκεζ, δζυηζ ημ S δεκ αθθδθεπζδνά ζηακμπμζδηζηά ιε ηα Mg 2+, ιε απμηέθεζια ζδιακηζηή ιείςζδ ηδξ εκγοιζηήξ δναζηζηυηδηαξ. Ώκηίεεηα ημ S ζοκημκίγεηαζ ιε εεζμθζθζηά ηαηζυκηα, υπςξ Cd 2+ ή Mn 2+ ηαζ έηζζ, δ ακηζηαηάζηαζδ ηςκ Mg 2+ ζημ δζάθοια ηδξ ακηίδναζδξ ιε ηα πνμακαθενεέκηα εεζμθζθζηά ηαηζυκηα μδδβεί ζε απμηαηάζηαζδ ηδξ εκγοιζηήξ δναζηζηυηδηαξ ηδξ RNase P ιε οπυζηνςια εεζμοπμηαηεζηδιέκμ pre-trna. Δ πνυζδεζδ ημο trna ελανηάηαζ απυ ηζξ ζμκηζηέξ ζοκεήηεξ. ε αέθηζζηεξ ζμκηζηέξ ζοκεήηεξ, δ ααηηδνζαηή RNA οπμµμκάδα απυ µυκδ ηδξ έπεζ µεβάθδ ζοββέκεζα ηαζ βζα ημ πνυδνμµμ ηαζ βζα ημ χνζµμ trna, εκχ δ πνμζεήηδ ηδξ πνςηεσκζηήξ οπμµμκάδαξ πνμηαθεί αφλδζδ ηδξ ζοββέκεζαξ βζα ημ πνυδνμµμ trna πενίπμο 1000 θμνέξ (Kurz et al 1998). ε παµδθέξ ζοβηεκηνχζεζξ οπμζηνχµαημξ, ημ αήµα πμο ηαεμνίγεζ ηδκ ηαπφηδηα ηδξ ακηίδναζδξ είκαζ δ πνυζδεζδ ημο οπμζηνχµαημξ, πμο ελανηάηαζ ζπεδυκ ελ μθμηθήνμο απυ ηδ δζάποζδ ημο. Ώκηίεεηα ζε ορδθέξ ζοβηεκηνχζεζξ οπμζηνχµαημξ, δ ηαπφηδηα ηδξ ακηίδναζδξ ηαεμνίγεηαζ απυ ηδκ απμµάηνοκζδ ημο πνμσυκημξ. Οζ εοηανοςηζηήξ θφζεςξ RNases P, πανυθμ πμο δζαεέημοκ πμθθέξ πενζζζυηενεξ πνςηεσκζηέξ οπμιμκάδεξ ζοβηνζηζηά ιε ηα ααηηδνζαηά έκγοια, δζαηδνμφκ ημκ ίδζμ ιδπακζζιυ ηαηάθοζδξ ιε ηζξ ααηηδνζαηέξ. Οζ πνςηεσκζηέξ οπμιμκάδεξ θαίκεηαζ κα ειπθέημκηαζ ζηδκ ελεζδζηεοιέκδ δέζιεοζδ ηςκ οπμζηνςιάηςκ ηαζ ιαγί ιε ηδ αμήεεζα πμο πνμζθένμοκ βζα ηδ ζςζηή δζαιυνθςζδ ημο RNA, δίκμοκ ηδ δοκαηυηδηα ζε αοηυ κα 65

67 Δηζαγσγή ηαηαθφεζ ηδ δζάζπαζδ ηςκ ζςζηχκ θςζθμδζεζηενζηχκ δεζιχκ Αλαγλώξηζε ππνζηξώµαηνο από ην νινέλδπµν Με δεδμµέκμ υηζ δ RNase P είκαζ επζθμνηζζµέκδ µε ηδκ ςνίµακζδ υθςκ ηςκ πνυδνμµςκ µμνίςκ trna ημο ηοηηάνμο, είκαζ ακαµεκυµεκμ ηαζ έπεζ απμδεζπεεί υηζ δ ακαβκχνζζδ ηςκ οπμζηνςµάηςκ βίκεηαζ πενζζζυηενμ µέζς αθθδθεπίδναζδξ µε δζαηδνδµέκεξ ακχηενεξ δμµέξ ζημ µυνζμ ημο trna, υπςξ επίζδξ ηαζ µε ζοβηεηνζµέκα ηαηάθμζπα κμοηθεμηζδίςκ, ηα μπμία οπάνπμοκ δζαηδνδµέκα ζε υθα ηα µυνζα trna. Σζξ ηεθεοηαίεξ δφμ δεηαεηίεξ, ζοκδοαζµυξ απμηεθεζµάηςκ απυ δζάθμνεξ πεζναµαηζηέξ πνμζεββίζεζξ, υπςξ πεζνάµαηα ζηαονμζφκδεζδξ (cross-linking), πδµζηήξ πνμζηαζίαξ, πδµζηήξ ηνμπμπμίδζδξ αάζεςκ ηαζ δμηζµέξ ηεπκδηχκ οπμζηνςµάηςκ, έπμοκ δχζεζ µζα ζπεηζηά θεπημµενή εζηυκα βζα ηζξ αθθδθεπζδνάζεζξ εκγφµμο-οπμζηνχµαημξ, πμο είκαζ οπεφεοκεξ βζα ηδκ πνυζδεζδ ηαζ ζςζηή ημπμεέηδζδ ημο οπμζηνχµαημξ ζημ ηαηαθοηζηυ ηέκηνμ ημο εκγφµμο (Frank ηαζ Pace 1998). Οζ πενζζζυηενεξ µεθέηεξ έπμοκ βίκεζ µε ημ Μ1 RNA. Πεζνάιαηα ζηαονμζφκδεζδξ έδεζλακ πςξ ημ ζοκηδνδιέκμ ηαηάθμζπμ Ώ248 ημο Μ1 RNA αθθδθεπζδνά ιε ημ Ν -1 κμοηθεμηίδζμ ημο πνυδνμιμο trna (pre-trna), ημ μπμίμ ζοκήεςξ πνυηεζηαζ βζα ιζα U, πμο ελ μνζζιμφ ζπδιαηίγεζ δεζιυ ηαηά Watson-Crick ιε Ώ (Brannvall et al 2003, Zahler et al 2003). ΐέααζα ανηεηά επζπνυζεεηα κμοηθεμηίδζα ημο Μ1 RNA ημπμεεημφκηαζ ημκηά ζηδ εέζδ Ν -1 : Ώ249, C252, C253, G332 ηαζ A333. Δ πθδνμθμνία αοηή δείπκεζ υηζ ιπμνεί αοηά ηα κμοηθεμηίδζα κα ζπδιαηίγμοκ ιζα επζθάκεζα πνυζδεζδξ βζα ημ οπυζηνςια, ιε ηδκ Ώ248 κα απμηεθεί ημ κμοηθεμηίδζμ ηθεζδί. Ώκάθμβα ιε ηδκ ηαοηυηδηα ημο Ν -1 κμοηθεμηζδίμο, δζαθμνεηζηέξ πδιζηέξ μιάδεξ ηδξ επζθάκεζαξ αοηήξ ιπμνεί κα αθθδθεπζδνμφκ ιε ζοβηεηνζιέκα άημια ημο Ν -1 κμοηθεμηζδίμο (Christian et al 1998, Siew et al 1999, Heide et al 2001). Τπάνπεζ, επίζδξ, δζαθμνεηζηή απαίηδζδ Mg 2+, ακάθμβα εάκ ζηδ -1 εέζδ ανίζηεηαζ U ή C, απμδεζηκφμκηαξ ημ ζδιακηζηυ νυθμ ηςκ ζυκηςκ αοηχκ ζηδκ αθθδθεπίδναζδ Ώ248/Ν -1 (Δηθόλα I Α) (Brannvall et al 2003, Kikovska et al 2005). Γεκεηζηά δεδμιέκα ηαζ ακάθοζδ απμηοπχιαημξ (footprinting analysis) έπμοκ απμδείλεζ ηδκ αθθδθεπίδναζδ ιεηαλφ ηδξ αθθδθμοπίαξ RCCA ζημ 3 άηνμ ηςκ pre-trnas ηαζ ημο ζοκηδνδιέκμο ιμηίαμο GGU ζηδ εδθεζά ημο αναπίμκα Ρ15 (L15) ημο P RNA (Δηθόλα I) (Kirsebom ηαζ Svard 1994, Svard et al 1996). Ώοηή δ αθθδθεπίδναζδ εεςνείηαζ πςξ αβηονμαμθεί ημ οπυζηνςια πάκς ζημ P RNA, εηεέημκηαξ ημ ζδιείμ εναφζδξ ηαζ 66

68 Δηζαγσγή ζοκημκίγμκηαξ ηα Mg 2+, επζηνέπμκηαξ, έηζζ, ηδ ζςζηή ηαζ απμηεθεζιαηζηή ηαηάθοζδ (Δηθόλα I). Βπίζδξ έπεζ δεζπεεί υηζ δ πενζμπή Ρ7-Ρ11 ζημ P RNA ακαβκςνίγεζ ηδκ εδθεζά ηαζ ημκ αναπίμκα Σ ημο οπμζηνχιαημξ ιέζς δφμ ζοκηδνδιέκςκ ηαηαθμίπςκ Ώ (Ώ130 ηαζ Ώ230, δ ανίειδζδ αάζεζ ημο P RNA ημο B. subtilis) ηαζ ακαθένεηαζ ςξ TBS πενζμπή (Σ-stem-loop Binding Site) (Loria ηαζ Pan 1997). Μεθέηεξ πμο δζελήπεδζακ, ηυζμ ζημ P RNA ημο E. coli, υζμ ηαζ ημο B. subtilis, απμηάθορακ πςξ αοηή δ αθθδθεπίδναζδ είκαζ πμθφ ζδιακηζηή, αθμφ πνμηαθεί αθθαβέξ ζηδ δζαιυνθςζδ ηςκ ιμνίςκ επδνεάγμκηαξ ημ νοειυ ηδξ ηαηάθοζδξ (Δηθόλα I) (Kirsebom 2007). Βκδζαθένμκ πανμοζζάγεζ δ ζδιακηζηή πενζμπή Ρ4, ζηδκ μπμία ημ κμοηθεμηίδζμ U69 (ανίειδζδ αάζεζ ημο P RNA ημο E. coli) αθθδθεπζδνά ιε ημ κμοηθεμηίδζμ πμο ανίζηεηαζ 5 εέζεζξ ακμδζηά απυ ημ 3 άηνμ ημο pre-trna (Δηθόλα I Α) (Christian et al 2006). Βπζπνυζεεηα, δ έθζηα Ρ4 είκαζ ζδιακηζηή βζα ηδκ δέζιεοζδ ηςκ θεζημονβζηά ζδιακηζηχκ ζυκηςκ Mg 2+ (Christian et al 2000, Kaye et al 2002). Ώκηζηαηαζηάζεζξ ή απαθμζθέξ αάζεςκ ηδξ Ρ4 έθζηαξ επδνεάγμοκ ημ νοειυ ηαηάθοζδξ, αθθά υπζ ηδ δέζιεοζδ ημο οπμζηνχιαημξ. Χζηυζμ, δ απαθμζθή ημο U69 απυ ηδκ Ρ4 πνμηαθεί αφλδζδ ημο ηαηαθοηζημφ νοειμφ, ιυκμ υηακ δ ακηίδναζδ πναβιαημπμζείηαζ πανμοζία ζυκηςκ Ca 2+, απμδεζηκφμκηαξ ηδ ζπμοδαζυηδηα ηδξ πενζμπήξ αοηήξ, ηαοηυπνμκα ζηδ δέζιεοζδ ηςκ Mg 2+ ηαζ ημο οπμζηνχιαημξ, ηαεχξ ηαζ ζηδ ηαηάθοζδ. Βπίζδξ, έπεζ δεζπεεί πςξ δ παναηείιεκδ 2 -ΟΔ ημο ζδιείμο εναφζδξ παίγεζ ζπμοδαίμ νυθμ ζηδ δέζιεοζδ ημο οπμζηνχιαημξ, ζημ νοειυ ηδξ ηαηάθοζδξ, ζηδκ ακαβκχνζζδ ημο ζδιείμο εναφζδξ ηαζ ζηδ δέζιεοζδ ηςκ ζυκηςκ ιεηάθθμο (Δηθόλα I Β) (Perreault ηαζ Altman 1992, Perreault ηαζ Altman 1993, Kleineidam et al 1993, Persson et al 2003, Zahler et al 2005). Σέθμξ, ηαζ θαιαάκμκηαξ οπ υρζκ πςξ δ πθεζμρδθία ηςκ pre-trna θένμοκ ιζα G ζηδ εέζδ +1 (G +1 ), απαθμζθή ή ακηζηαηάζηαζδ αοημφ ημο κμοηθεμηζδίμο επδνεάγεζ ηδ εέζδ εναφζδξ, ηδ δέζιεοζδ ηαζ δζάζπαζδ ημο οπμζηνχιαημξ, πνμηάζζμκηαξ πςξ ημ G +1 ζηα pre-trna δνά ςξ κμοηθεμηίδζμ-μδδβυξ (Burkard et al 1988, Mans et al 1990, Svard ηαζ Kirsebom 1993, Hardt et al 1993, Loria ηαζ Pan 1998). Πζμ ζοβηεηνζιέκα, έπεζ δεζπεεί πςξ δ ελςηοηθζηή αιζκμιάδα ημο G +1 ημπμεεηείηαζ ημκηά ζηδ 2 -ΟΔ ηαζ ημ Ν7 ημο G +73, πμο αθθδθεπζδνά ιε ημ U294 ημο Ρ RNA. Δ αθθδθεπίδναζδ αοηή επδνεάγεζ ηδ ημπμεέηδζδ ηςκ ζυκηςκ ιεηάθθμο ηαζ πζζηεφεηαζ πςξ δ ελςηοηθζηή αιζκμιάδα ημο G +1 ειπθέηεηαζ ζηδ ζηαεενμπμίδζδ αοηήξ ηδξ αθθδθεπίδναζδξ ηαζ ειιέζςξ ζηδ δέζιεοζδ ηςκ Mg 2+ (Brannvall et al 2003, Brannvall et al 2004). Οζ Loria ηαζ Pan πνδζζιμπμζχκηαξ έκα ηφπμο 67

69 Δηζαγσγή Εικόνα I: Ώκαβκχνζζδ οπμζηνχιαημξ ptrna απυ ηδ ααηηδνζαηή RNase P. (A) Ώκαπανάζηαζδ ηδξ δεοηενμηαβμφξ δμιήξ ηδξ RNA οπμιμκάδαξ ηδξ RNase P ημο E. coli (ανζζηενά) ηαζ εκυξ ptrna (δελζά). Ώπεζημκίγμκηαζ μζ πενζμπέξ πμο απαζημφκηαζ κα αθθδθεπζδνάζμοκ βζα ηδ ηαηάθοζδ. Φαίκεηαζ δ αθθδθεπίδναζδ ηδξ 5 μδδβμφ αθθδθμοπίαξ ημο ptrna (έκημκδ δζαηεημιιέκδ βναιιή) ιε ηδκ πνςηεσκζηή οπμιμκάδα ηδξ RNase P. TBS: T stem-loop-binding site. (B) Οζ αθθδθεπζδνάζεζξ P RNA-RCCA ηαζ Ώ248- Ν -1, υπμο ηα αθθδθεπζδνχκηα κμοηθεμηίδζα ζδιεζχκμκηαζ ιε βηνί θυκημ. διεζχκμκηαζ ηα ηαηάθμζπα -2, -1, +1, +72 ηαζ +76 ημκηά ζηδ εέζδ εναφζδξ. Ώπεζημκίγμκηαζ, επίζδξ, δ αιζκμιάδα ημο G +1 ηαζ δ 2 -ΟΔ ζηδ εέζδ -1 ημο οπμζηνχιαημξ πμο ζοκεζζθένμοκ ζηδ δέζιεοζδ ηαζ ηδ ηαηάθοζδ. Σμ αέθμξ δείπκεζ ηδ εέζδ εναφζδξ. Φαίκμκηαζ ηαζ ηα Mg 2+, υπμο ημ Mg A ζηαεενμπμζεί ηδκ P RNA-RCCA αθθδθεπίδναζδ ηαζ ημ Mg B ειπθέηεηαζ ζηδ δδιζμονβία ημο κμοηθευθζθμο ακηζδναζηδνίμο. (Γ) Μμκηέθμ ημο ζοιπθυημο P RNA (T. maritima)-ptrna. Ο αναπίμκαξ ΣρC ημπμεεηείηαζ ιέζα ζηδ ζπζζιή ηδξ πενζμπήξ ελεζδίηεοζδξ S ημο P RNA ηαζ ημ 5 άηνμ ημο ptrna ανίζηεηαζ ημκηά ιε ηδκ Ρ4/Ρ5 πενζμπή (εκενβυ ηέκηνμ ημο P RNA). Σμ 3 -CCA άηνμ ανίζηεηαζ ημκηά ζηδ εδθεζά L15 βζα κα αθθδθεπζδνάζεζ. Με ζημφνμ ιπθέ θαίκμκηαζ ηα κμοηθεμηίδζα ζηζξ ηαεμθζηά ζοκηδνδιέκεξ πενζμπέξ, ιε νμγ ηα ζοκηδνδιέκα κμοηθεμηίδζα ζηα ααηηήνζα, ιε ηίηνζκμ δ εδθεζά L15 πμο αθθδθεπζδνά ιε ημ 3 -CCA άηνμ ημο ptrna. ΐ P RNA πνυηεζκακ πςξ δ 2 -ΟΔ ζηδ εέζδ -2 ημο οπμζηνχιαημξ επδνεάγεζ ηδ δέζιεοζή ημο ζημ έκγοιμ (Loria ηαζ Pan 1998). Βπίζδξ, ημ είδμξ ημο κμοηθεμηζδίμο ζηδ εέζδ -2 ημο 68

70 Δηζαγσγή οπμζηνχιαημξ επζδνά, ηυζμ ζηδκ ακαβκχνζζδ ηδξ εέζδξ εναφζδξ, υζμ ηαζ ζημ νοειυ ηαηάθοζδξ (Brannvall et al 1998). Βαθηεξηαθή έλαληη επθαξπσηηθήο/αξραίαο RNase P Δ ααζζηή δζαθμνά ζηζξ δμιέξ πμο ακαβκςνίγμοκ ημ οπυζηνςια ιεηαλφ ηςκ ααηηδνζαηχκ ηαζ ηςκ εοηανοςηζηχκ P RNA είκαζ δ απμοζία απυ ηα ηεθεοηαία ηδξ εδθεζάξ L15. Δ δμιή αοηή θείπεζ ηαζ απυ ηάπμζα P RNA ανπαίςκ ηφπμο Μ (Δηθόλα ΗΗ) (Brown 1999, Ellis ηαζ Brown 2009). Δ πνςηεσκζηή οπμµμκάδα αθθδθεπζδνά ηονίςξ µε ηδκ 5 επζπνυζεεηδ μδδβυ αθθδθμοπία ηαζ αολάκεζ ηδκ ζοββέκεζα ημο pre-trna έκακηζ ημο χνζµμο πνμσυκημξ, αολάκμκηαξ, έηζζ, ηδκ k cat ηδξ ακηίδναζδξ (Frank ηαζ Pace 1998). Οζ πνςηεύκεξ ηςκ ανπαίςκ θαίκεηαζ, πςνίξ κα έπεζ πνμζδζμνζζηεί, κα επδνεάγμοκ ηαζ ηδκ ακαβκχνζζδ ημο οπμζηνχιαημξ ηαζ ηδ εέζδ εναφζδξ (Lai et al 2010). Πανυθα αοηά, ιέκεζ κα δζεοηνζκζζηεί εάκ μζ πνςηεσκζηέξ οπμιμκάδεξ ηςκ εοηανοςηχκ ηαζ ηςκ ανπαίςκ ζοκεζζθένμοκ άιεζα ζηδ ηαηάθοζδ ή απθά ελοπδνεημφκ νυθμ οπμζηδνζηηζηυ βζα ηα P RNA, θένκμκηαξ ζε επαθή ηα ηαηάθθδθα κμοηθεμηίδζα πμο απαζημφκηαζ βζα ηαηάθοζδ. Καζ θοζζηά εα πνέπεζ κα απακηδεμφκ ενςηήιαηα πμο βεκκχκηαζ βζα ημ ιδπακζζιυ ηαηάθοζδξ ηςκ πνςηεσκζηήξ θφζεςξ RNase P πμο έπμοκ ανεεεί ζηα ακενχπζκα ιζημπυκδνζα ηαζ ζηα διζαοηυκμια μνβακίδζα ημο θοημφ A. thaliana (Holzmann et al 2008, Gobert et al 2010). Εικόνα II: Ώπεζηυκζζδ ηςκ δεοηενμηαβχκ δμιχκ δζαθμνεηζηχκ ηφπςκ RNA οπμιμκάδςκ ηδξ RNase P. Σφπμξ Ώ RNA: Δ. coli ηφπμξ ΐ RNA: Mycoplasma hyopneumoniae ηφπμξ Μ RNA: Archaeoglobus fulgidus εοηανοςηζηυ RNA: H. sapiens. Οζ πενζμπέξ ιε ζηίαζδ ακηζζημζπμφκ ζηζξ πενζμπέξ πμο αθθδθεπζδνμφκ ιε ημ οπυζηνςια pre-trna ηαζ πενζθαιαάκμοκ ηζξ Ρ7- Ρ11 ηδξ πενζμπήξ ελεζδίηεοζδξ S, δ μπμία είκαζ οπέοεοκδ βζα ηδκ αθθδθεπίδναζδ ιε ημ αναπίμκα TΦC ημο pre-trna ηαζ ηδκ Ώ248-Ν -1 αθθδθεπίδναζδ. Τπυ ζηίαζδ ανίζημκηαζ δ Ρ4 έθζηα πμο αθθδθεπζδνά ιε ιζα 2 -ΟΔ ημο αναπίμκα οπμδμπήξ ημο pre-trna ηαζ δ L15, πμο πενζέπεζ ημ ιμηίαμ GGU, πμο αθθδθεπζδνά ιε ημ 3 - RCCA άηνμ ημο pre-trna. Δ L15 απμοζζαγεζ απυ ηα εοηανοςηζηά ηαζ απυ ηα ηφπμο Μ P RNA. 69

71 Δηζαγσγή Οη πξσηετληθέο ππνκνλάδεο ηεο RNase P πςξ έπεζ ήδδ ακαθενεεί, δ RNase P ζηδκ πθεζμρδθία ηςκ πενζπηχζεςκ είκαζ έκα νζαμκμοηθεμπνςηεσκζηυ ζφιπθμημ, ζημ μπμίμ πανυθμ πμο δ ηαηάθοζδ ζπεηίγεηαζ ιε ηδκ RNA οπμιμκάδα, μζ πνςηεσκζηέξ οπμιμκάδεξ δζαδναιαηίγμοκ ζδιακηζημφξ οπμζηδνζηηζημφξ νυθμοξ, οπμδεζηκφμκηαξ ημκ αηνζαή θεζημονβζηυ ζοκημκζζιυ ιεηαλφ ηςκ οπμιμκάδςκ ημο μθμεκγφιμο. Δ αφλδζδ ηδξ ακαθμβίαξ πνςηεύκδξ: RNA ζηζξ RNase P ηςκ ανπαίςκ ηαζ ηςκ εοηανοςηχκ, ζοβηνζηζηά ιε ηα ααηηδνζαηά έκγοια, πνμζθένεζ έκα ηαθυ πανάδεζβια βζα κα ηαηακμήζμοιε ημκ πζεακυ ηνυπμ ιεηααίααζδξ θεζημονβζηχκ ηαζ δμιζηχκ νυθςκ απυ ημ RNA ζε πνςηεσκζημφξ πανάβμκηεξ πμο ζηναημθμβήεδηακ ηαηά ηδκ ελέθζλδ Βαθηεξηαθή πξσηετληθή ππνκνλάδα Σμ ααηηδνζαηυ μθμέκγοιμ δζαεέηεζ ιζα πνςηεσκζηή οπμιμκάδα πενίπμο 14 kda, πμο ηςδζημπμζείηαζ απυ ημ βμκίδζμ rnpa ηαζ είκαζ απαναίηδηδ βζα ηδκ ηαηάθοζδ in vivo, αθθά υπζ βζα ηδκ ηαηάθοζδ in vitro, αθμφ δ RNA οπμιμκάδα δζαεέηεζ ηαηαθοηζηέξ ζδζυηδηεξ ζε ζοκεήηεξ ορδθήξ ζμκηζηήξ ζζπφξ (50 mm MgCl 2, 100 mm NH 4 Cl), απμοζία ηδξ πνςηεύκδξ. Έπμοκ ιέπνζ ζήιενα ηνοζηαθθμβναθδεεί ηαζ ακαθοεεί ιε NMR μζ πνςηεσκζηέξ οπμιμκάδεξ ηδξ RNase P (RPP) απυ ηνία θοθμβεκεηζηά απμιαηνοζιέκα ααηηήνζα, ηα B. subtilis (Stams et al 1998), Staphylococcus aureus (Spitzfaden et al 2000) ηαζ T. maritimα (Kazantsev et al 2003), ακηζπνμζςπεφμκηαξ ηαζ ημοξ δομ ηφπμοξ P RNA, Ώ ηαζ ΐ (Δηθόλα Η). Οζ δμιέξ αοηχκ ηςκ πνςηεσκχκ δείπκμοκ πςξ ηάεε πνςηεύκδ ακαδζπθχκεηαζ ιε πανυιμζμ ηνυπμ ζηδ πενζμπή υπμο ακαβκςνίγεηαζ ηαζ δεζιεφεηαζ ημ RNA, πανυηζ δ πνςημηαβήξ ημοξ δμιή πανμοζζάγεζ ιζηνή αιζκμλζηή μιμθμβία (20-30 %) (Avis et al 1996). Δ μιμζυηδηα ζηδ δμιή ημοξ ακηζηαημπηνίγεζ ηαζ ακάθμβδ θεζημονβία, βεβμκυξ ημ μπμίμ έπεζ επζαεααζςεεί ιε πεζνάιαηα ακαζφζηαζδξ, ζηα μπμία δ πνςηεσκζηή οπμιμκάδα ηφπμο Ώ ακηζηαεζζηά ηδκ ηφπμο ΐ ηαζ ακηίεεηα, ηυζμ in vitro, υζμ ηαζ in vivo (Wegscheid ηαζ Hartmann 2006). Δ πνςηεύκδ απυ ημ B. subtilis δεζιεφεζ ιε ηδκ ίδζα απμηεθεζιαηζηυηδηα, ηυζμ μθυηθδνμ Ρ RNA, υζμ ηαζ ηδκ ηαηαθοηζηή ημο πενζμπή C, απμδεζηκφμκηαξ πςξ δ πνςηεύκδ δεζιεφεηαζ ιυκμ ζε αοηή ηδ πενζμπή ημο RNA (Day- Storms et al 2004). Οζ πνςηεύκεξ αοηέξ οζμεεημφκ ιζα δζαιυνθςζδ α-α ζάκημοζηξ ιε δζαζηάζεζξ 40x35x30 Å. ημ ιυνζυ ημοξ ακαβκςνίγμκηαζ 3 πενζμπέξ ςξ πζεακέξ κα δεζιεφμοκ RNA ηαζ μζ δφμ απυ αοηέξ έπμοκ επζαεααζςεεί ηαζ ιε αζμπδιζηέξ ιεθέηεξ. Δ πνχηδ πενζμπή ακαδζπθχκεηαζ 70

72 Δηζαγσγή ςξ ιζα αζοκήεδξ ανζζηενυζηνμθδ α-α-α δμιή, ζηδκ μπμία πενζέπεηαζ ιζα ορδθά ζοκηδνδιέκδ, ιεηαλφ ηςκ ααηηδνζαηχκ RPP, αθθδθμοπία απμηεθμφιεκδ απυ 18 ηαηάθμζπα εεηζηά θμνηζζιέκςκ αιζκμλέςκ (RNP domain) (Δηθόλα Η) (Stams et al 1998). Βλαζηίαξ αοηήξ ηδξ αζοκήεζζηδξ ακαδίπθςζδξ ηαζ ηδξ ηαοηυπνμκδξ φπανλδξ ημο ζοκηδνδιέκμο ιμηίαμο, πνμζδίδεηαζ ιεβάθδ θεζημονβζηή ζπμοδαζυηδηα ζε αοηή ηδ πενζμπή. Μεηαθθάλεζξ ζηα αιζκμλέα αοηχκ ηςκ εέζεςκ πνμηαθμφκ εθαηηςιαηζηή ςνίιακζδ ηςκ pre-trna απυ ημ μθμέκγοιμ (Stams et al 1998). Δ δεφηενδ πενζμπή, πμο θαίκεηαζ κα ιεζμθααεί ζηδ πνυζδεζδ ηδξ πνςηεύκδξ ιε ημ RNA, είκαζ ιζα ηεκηνζηή ζπζζιή πμο ζπδιαηίγεηαζ απυ ηδκ έθζηα ζημ άιζκμ-ηεθζηυ άηνμ ηδξ πνςηεύκδξ ηαζ ηδκ επζθάκεζα ημο ηεκηνζημφ α πηοπςημφ θφθθμο. Δ ζπζζιή αοηή πενζέπεζ εηηεεεζιέκα ηνία ανςιαηζηά αιζκμλέα (Phe16, Phe20 ηαζ Tyr34), πμο πενζαάθθμκηαζ απυ 15 ηαηάθμζπα Arg ηαζ Lys. Ώκηζηαηάζηαζδ ηςκ ανςιαηζηχκ ηαηαθμίπςκ ζηδ ζπδιαηζγυιεκδ ηεκηνζηή ζπζζιή, επδνεάγεζ ανκδηζηά ηδκ ηαηαθοηζηή δναζηζηυηδηα ημο μθμεκγφιμο (Stams et al 1998). Μεθέηδ ηδξ δέζιεοζδξ ηςκ ηνζχκ αοηχκ πνςηεσκχκ ζηα P RNA απμηαθφπηεζ ημζκή εέζδ πνυζδεζδξ, δ μπμία είκαζ ημκηά ζηδ ηαηαθοηζηή πενζμπή (ζηδ Ρ4 έθζηα ηαζ ηα πενζθενζηά δμιζηά ζημζπεία Ρ2 ηαζ Ρ3). Δ δέζιεοζδ ηδξ πνςηεύκδξ ζημ RNA πνμηαθεί δζαιμνθςηζηέξ αθθαβέξ ζε πανυιμζα δμιζηά ζημζπεία, ηυζμ ζηα RNA ηφπμο Ώ (P5-P8, L15/16), υζμ ηαζ ζηα RNA ηφπμο ΐ (P15.1-P5.1, L15) (Buck et al 2005). Εικόνα : Αμιή ηςκ ααηηδνζαηχκ πνςηεσκζηχκ οπμιμκάδςκ ηδξ RNase P. Ώπυ ανζζηενά πνμξ ηα δελζά απεζημκίγμκηαζ μζ δμιέξ απυ ηα ααηηήνζα Σ. maritima (PDBID. 1NZ0), B. subtilis (PDBID. 1A6F) ηαζ S. aureus (PDBID. 1D6T). Με ηυηηζκμ πνςιαηίγεηαζ δ έθζηα πμο πενζέπεζ ημ ορδθά ζοκηδνδιέκμ ιμηίαμ (RNP domain). 71

73 Δηζαγσγή Ο αηνζαήξ νυθμξ ηςκ ααηηδνζαηχκ πνςηεσκχκ ανίζηεηαζ οπυ ζογήηδζδ ηαζ ζοκεπή ένεοκα. Οζ πζεακέξ θεζημονβίεξ πμο απμδίδμκηαζ ζηζξ ααηηδνζαηέξ RPP αθμνμφκ ηδ ζηαεενμπμίδζδ ηδξ ανπζηεηημκζηήξ ημο μθμεκγφιμο (Guerrier-Takada et al 1983, Westhof et al 1996, Kim et al 1997) ηαζ ηδκ αθθδθεπίδναζδ ηδξ πνςηεύκδξ ιε ημ 3 -CCA άηνμ ημο pre-trna, βεβμκυξ πμο αεθηζχκεζ ηδκ ελεζδίηεοζδ ημο εκγφιμο βζα ημ πνυδνμιμ trna έκακηζ ημο ςνίιμο. Βπίζδξ, δ πνςηεύκδ αεθηζχκεζ ηδκ ηαηαθοηζηή δναζηζηυηδηα ημο εκγφιμο, παιδθχκεζ ηζξ απαζηήζεζξ Mg 2+ ημο μθμεκγφιμο ηαζ δζεονφκεζ ηδκ ζηακυηδηα ημο εκγφιμο κα ακαβκςνίγεζ ηαζ άθθα οπμζηνχιαηα (Sun et al 2006, Gopalan et al 1997) Πξσηετληθέο ππνκνλάδεο από ηα αξραία Οζ ανπζηέξ ιεθέηεξ βζα ημ μθμέκγοιμ ηδξ RNase P απυ ανπαία έβζκακ ζημ Haloferax volcanii (Lawrence et al 1987) ηαζ ζημ Sulfolobus acidocaldarius (Darr et al 1990, LaGrandeur et al 1993), υπμο απμδείπεδηε πςξ ηαζ ζημοξ δφμ μνβακζζιμφξ ηα έκγοια απμηεθμφκηαζ απυ RNA, υιςξ δ πνςηεσκζηή ημοξ ζφζηαζδ ήηακ ανηεηά δζαθμνεηζηή, υπςξ απμηαθφθεδηε απυ ηδ ποηκυηδηα επζπμθήξ ιε δζααάειζζδ CsCl. Δ ζφζηαζδ ημο εκγφιμο ημο H. volcanii ήηακ πανυιμζα ιε ημ ααηηδνζαηυ μθμέκγοιμ, εκχ αοηυ ημο S. acidocaldarius είπε πμθφ ιεβαθφηενδ πνςηεσκζηή πενζεηηζηυηδηα ηαζ πνμζμιμίαγε πενζζζυηενμ ζηα εοηανοςηζηά έκγοια. Μεηέπεζηα ζοβηνζηζηέξ ηαζ αζμπδιζηέξ ιεθέηεξ έδεζλακ πςξ δ πθεζμρδθία ηςκ RNase P εκγφιςκ απυ ανπαία δζαεέημοκ ηέζζενεξ πνςηεύκεξ μιυθμβεξ ιε ακηίζημζπεξ πνςηεσκζηέξ οπμιμκάδεξ ηδξ RNase P απυ ηδ γφιδ ηαζ ημκ άκενςπμ, εκχ δεκ πανμοζζάγμοκ ηαιία μιμζυηδηα ζηδκ αθθδθμοπία ημοξ ιε ηζξ ααηηδνζαηέξ πνςηεύκεξ (Hall ηαζ Brown 2002, Hartmann ηαζ Hartmann 2003). Γζα πανάδεζβια, ζημ βμκζδίςια ημο Methanothermobacter thermoautotrophicus έπμοκ εκημπζζηεί μζ πνςηεύκεξ Mth11 (μζ μιυθμβεξ πνςηεύκεξ ζηδ γφιδ ηαζ ζημκ άκενςπμ ακηίζημζπα είκαζ μζ Pop4 ηαζ Rpp29), Mth687 (Pop5/hPop5), Mth688 (Rpp1/Rpp30) ηαζ Mth1618 (Rpr2/Rpp21), δ ζοιιεημπή ηςκ μπμίςκ ζηδκ δμιή ημο μθμεκγφιμο επζαεααζχεδηε ιε ακμζμαζμπδιζηέξ ιεευδμοξ. ζμκ αθμνά ηδκ ηνζημηαβή δμιή ηςκ πνςηεσκζηχκ οπμιμκάδςκ, ζδιακηζηή πνυμδμξ έπεζ βίκεζ ζδζαζηένςξ ζηα ανπαία θυβς ηδξ ζηαεενυηδηαξ ηςκ πνςηεσκχκ αοηχκ. ημ P. horikoshii, έκα οπενεενιυθζθμ ανπαίμ, δ RNase P δζαεέηεζ πέκηε πνςηεσκζηέξ οπμιμκάδεξ, Ph1481, Ph1601, Ph1771, Ph1877 ηαζ Ph1496 (μζ ακηίζημζπεξ μκμιαζίεξ αάζεζ ηδξ ανίειδζδξ ηςκ πνςηεσκχκ ζημκ άκενςπμ είκαζ PhoPop5, PhoRpp21, PhoRpp29, 72

74 Δηζαγσγή PhoRpp30 ηαζ PhoRpp38). ηζξ 4 απυ αοηέξ ηζξ πνςηεύκεξ, αθθά ηαζ ζε μιυθμβέξ ημοξ απυ άθθα ανπαία, έπεζ ακαθοεεί δ δμιή ιε ηνοζηαθθμβναθζηέξ ηαζ NMR ιεθέηεξ. Σξηηνηαγήο δνκή ηεο Ph1771 Οζ μιυθμβεξ ηςκ Pop4/Rpp29 πνςηεύκεξ απυ ηα ανπαία M. thermoautotrophicus (Boomershine et al 2003) ηαζ A. fulgidus (Sidote ηαζ Hoffman 2003) πανμοζζάγμοκ ζδζαίηενα παναηηδνζζηζηά ζηδ ηνζημηαβή δμιή ημοξ πμο ηζξ ηαηαηάζζμοκ ζηδκ μζημβέκεζα ηςκ πνςηεσκχκ πμο δεζιεφμοκ μθζβμιενή κμοηθεσηχκ μλέςκ (Oligomer-Binding ή Οΐ fold proteins). Δ ακαδίπθςζή ημοξ ζημ πχνμ πενζθαιαάκεζ έκα δμιδιέκμ πονήκα α-πηοπςημφ θφθθμο ιε εοέθζβηηεξ ηζξ άιζκμ- ηαζ ηαναυλο-ηεθζηέξ πενζμπέξ. Μεηέπεζηα ηνοζηαθθμβναθζηέξ ιεθέηεξ έδεζλακ πςξ ηα άηνα ηςκ μιμθυβςκ πνςηεσκχκ απυ ημ P. horikoshii (Numata et al 2004) ηαζ ημ A. fulgidus (Sidote et al 2004) οζμεεημφκ δμιή α- έθζηαξ (Δηθόλα Η). Οζ δζαθμνέξ ιεηαλφ αοηχκ ηςκ ιεθεηχκ πανμοζζάγεζ εκδζαθένμκ, αθμφ ζε αοηέξ ηζξ πενζμπέξ ηδξ πνςηεύκδξ πενζθαιαάκμκηαζ ανηεηά απυ ηα πζμ ζοκηδνδιέκα αιζκμλέα ημο ιμνίμο. Βάκ πνάβιαηζ αοηά ηα ηαηάθμζπα δεκ ζοκεζζθένμοκ άιεζα ζηδ δμιή ηδξ πνςηεύκδξ, εκδέπεηαζ κα ειπθέημκηαζ ζε αθθδθεπζδνάζεζξ ιε ηζξ οπυθμζπεξ οπμιμκάδεξ ημο μθμεκγφιμο ηδξ RNase P ή ηαζ ιε ημ οπυζηνςια. Βκδεζηηζηά, μζ αθθδθμοπίεξ ηςκ μιυθμβςκ εοηανοςηζηχκ πνςηεσκχκ Pop4/Rpp29 δζαεέημοκ εηηεηαιέκα άιζκμ-ηεθζηά άηνα πμο απμοζζάγμοκ απυ ηζξ μιυθμβεξ ανπαίεξ πνςηεύκεξ, δείπκμκηαξ πςξ αοηή δ πενζμπή ιπμνεί κα ελοπδνεηεί ιζα λεπςνζζηή θεζημονβία ζηα εοηανοςηζηά έκγοια. Εικόνα Ι: Αμιέξ ηςκ μιυθμβςκ ηςκ Pop4/ Rpp29 πνςηεσκχκ απυ ανπαία. Οζ δφμ ανζζηενά δμιέξ πνμέηορακ απυ ακαθφζεζξ ιε NMR (M. thermoautotrophicus PDBID. 1OQK, A. fulgidus PDBID. 1PC0) ηαζ μζ δφμ δελζά απυ ηνοζηαθθμβναθζηέξ ιεθέηεξ (P. Horikoshii PDBID. 1V76, A. fulgidus PDBID. 1TS9). 73

75 Δηζαγσγή Σξηηνηαγήο δνκή ηεο Ph1601 Δ ηνοζηαθθζηή δμιή ηδξ Ph1601(Rpr2/Rpp21) ημο P. horikoshii δείπκεζ ιζα πνςηεσκζηή ανπζηεηημκζηή απμηεθμφιεκδ απυ δφμ ακαδζπθςιέκεξ πενζμπέξ πμο ζοκδέμκηαζ ιε ιζα ιδ δμιδιέκδ πενζμπή (Δηθόλα ΗΗ) (Kakuta et al 2005). οβηεηνζιέκα, δ αιζκμ-ηεθζηή πενζμπή έπεζ δφμ α-έθζηεξ πμο αθθδθεπζδνμφκ ιεηαλφ ημοξ ιέζς οδνμθμαζηχκ αιζκμλέςκ ηαζ ζοκδέμκηαζ ιε ηδ ηαναμλο-ηεθζηή πενζμπή ιε ιζα ηεκηνζηή, πςνίξ ζοβηεηνζιέκδ δμιή πενζμπή. Σμ ηαναμλο-ηεθζηυ άηνμ πανμοζζάγεζ μιμθμβία ιε πνςηεσκζηέξ δμιέξ πμο δεζιεφμοκ ρεοδάνβονμ. Πναβιαηζηά, δ πενζμπή αοηή ηδξ Ph1601 δεζιεφεζ έκα ζυκ Zn 2+ πμο ζπδιαηίγεζ δεζιμφξ ζοκανιμβήξ ιε ηέζζενα ζοκηδνδιέκα ηαηάθμζπα Cys. Μεθέηεξ έπμοκ δείλεζ πςξ ημ ζυκ ημο Zn 2+ έπεζ ηαεμνζζηζηυ νυθμ ζηδ δζαιυνθςζδ ηδξ πνςηεύκδξ, πςνίξ κα απμηθείεηαζ δ επίδναζή ημο ζηδ εκγοιζηή δναζηζηυηδηα. Βπίζδξ, ιεηαθθάλεζξ ηςκ ζοκηδνδιέκςκ αιζκμλέςκ ζηδ ηεκηνζηή ζοκδεηζηή πενζμπή επδνεάγεζ άιεζα ηδ δναζηζηυηδηα ημο ακαζοζηαιέκμο μθμεκγφιμο. Εικόνα IΙ: Αμιή ηδξ Ph1601, ηδξ μιυθμβδξ ηςκ Rpr2/Rpp21 απυ ημ ανπαίμ P. horikoshii (PDBID. 1X0T). Με νμγ πνςιαηίγμκηαζ μζ α-έθζηεξ, ιε ηίηνζκμ ηα α-πηοπςηά θφθθα ηαζ ιε άζπνμ μζ ζοκδεηζηέξ πενζμπέξ. Φαίκεηαζ επίζδξ ημ ζυκ Zn 2+, πμο πανμοζζάγεηαζ ςξ βηνί ζθαίνα. Σξηηνηαγήο δνκή ηεο Ph1877 Δ ηνοζηαθθμβναθζηή ακάθοζδ ηδξ Ph1877(Rpp1/Rpp30) απμηάθορε πςξ δ πνςηεύκδ αοηή οζμεεηεί ιζα αα ηοθζκδνζηή δμιή (αα barrel), απμηεθμφιεκδ απυ 10 α-έθζηεξ ηαζ 7 α- πηοπςηά θφθθα, υιμζα ιε ηδ δμιή πμο παναηηδνίγεζ ηδκ μζημβέκεζα ηςκ ιεηαθθμελανηχιεκςκ οδνμθαζχκ (Δηθόλα ΗΗΗ) (Takagi et al 2004). Ώκάθοζδ ηδξ επζθάκεζαξ ηδξ δμιήξ ηδξ Ph1877 δείπκεζ ηδκ πανμοζία 5 ζοκηδνδιέκςκ, εεηζηά θμνηζζιέκςκ αιζκμλέςκ. Μεηαθθάλεζξ ηαεεκυξ απυ αοηά ηα αιζκμλέα επδνεάγμοκ ζδιακηζηά ηδ δναζηζηυηδηα ημο ακαζοζηαιέκμο μθμεκγφιμο. 74

76 Δηζαγσγή Εικόνα IIΙ: Αμιή ηδξ Ph1877, ηδξ μιυθμβδξ ηςκ Rpp1/Rpp30 απυ ημ ανπαίμ P. horikoshii (PDBID. 1V77). Με νμγ πνςιαηίγμκηαζ μζ α-έθζηεξ, ιε ηίηνζκμ ηα α- πηοπςηά θφθθα ηαζ ιε άζπνμ μζ ζοκδεηζηέξ πενζμπέξ. Σξηηνηαγήο δνκή ηεο Ph1481 θαη Pf1378 Γζα ηδκ ανπαία, μιυθμβδ ηδξ Pop5/hPop5, πνςηεύκδ έπμοκ δδιμζζεοεεί δφμ ηνοζηαθθζηέξ δμιέξ, ιία απυ ημ ανπαίμ P. furiosus (Pf1378) (Wilson et al 2006) ηαζ ιζα απυ ημ P. horikoshii (Ph1481) (Karwano et al 2006). Δ δμιή ηδξ Ph1481 ακαθφεδηε ζε ζφιπθμημ ιε ηδκ πνςηεύκδ Ph1877 (Rpp1/Rpp30). Καζ μζ δφμ, υιςξ, ακαθφζεζξ είκαζ ζφιθςκεξ ηαζ δείπκμοκ πςξ δ ανπαία Pop5/hPop5 ακαδζπθχκεηαζ ζε δμιή α/α ζάκημοζηξ, απμηεθμφιεκδ ηεκηνζηά απυ 5 ακηζπανάθθδθα α-πηοπςηά θφθθα πμο πενζαάθθμκηαζ απυ 4 α-έθζηεξ (Δηθόλα ΗV). Δ ζοκμθζηή δμιή ηδξ πνςηεύκδξ είκαζ πανυιμζα ιε ηδκ RNP πενζμπή πμο εκημπίγεηαζ ζηζξ ααηηδνζαηέξ οπμιμκάδεξ ηδξ RNase P, υιςξ δ αιζκμλζηή αθθδθμοπία ηδξ ανπαίαξ Pop5/hPop5 είκαζ λεπςνζζηή απυ αοηή ηδξ ααηηδνζαηήξ. Αεδμιέκα απυ θοθμβεκεηζηέξ ακαθφζεζξ αθθδθμοπζχκ δεκ δείπκμοκ ηαιία άιεζδ ελέθζλδ μπμζαζδήπμηε ανπαίαξ ή εοηανοςηζηήξ πνςηεύκδξ απυ ηάπμζα πνμβμκζηή ααηηδνζαηή πνςηεύκδ (Hall ηαζ Brown 2002, Hartmann ηαζ Hartmann 2003). Έηζζ, δ δμιζηή αοηή ζοζπέηζζδ δεκ έπεζ αηυια ελδβδεεί. Καζ μζ δφμ δμιέξ ηςκ ανπαίςκ Pop5/hPop5 απμηαθφπημοκ πςξ δ οπμιμκάδα αοηή ιπμνεί ηαζ δζιενίγεηαζ. πδιαηίγεηαζ έκα ηεκηνζηυ μιμδζιενέξ, ζημ μπμίμ ηάεε οπμιμκάδα αθθδθεπζδνά ιε ιζα Ph1877 (Rpp1/Rpp30) (Karwano et al 2006). Δ αθθδθεπίδναζδ ιεηαλφ αοηχκ ηςκ δφμ πνςηεσκχκ είκαζ ζε ζοιθςκία ιε ανπζηέξ NMR ακαθφζεζξ πμο είπακ δζελαπεεί ζε πνςηεύκεξ ημο P. furiosus (Wilson et al 2006). 75

77 Δηζαγσγή Εικόνα IV: Αμιή ηςκ Ph1481 ηαζ Pf1378, ηςκ μιυθμβςκ ηςκ Pop5/hPop5, απυ ηα ανπαία P. horikoshii ηαζ P. furiosus, ακηίζημζπα. Ώνζζηενά πανμοζζάγεηαζ δ δμιή ηδξ Ph1481 (PDBID. 2CZW) ηαζ δελζά ημ μιμδζιενέξ πμο ζπδιαηίγεζ δ Pf1378 (PDBID. 2AV5). Λεηηνπξγηθέο κειέηεο Πνυζθαηα, πεζνάιαηα ακαζφζηαζδξ ηδξ δναζηζηυηδηαξ RNase P απυ ημ ανπαίμ P. horikoshii, απμηάθορακ πςξ μ εθάπζζημξ θεζημονβζηυξ πονήκαξ, ζηακυξ κα ςνζιάγεζ ηα pretrna, απμηεθείηαζ απυ ημ P RNA ημο ανπαίμο αοημφ ηαζ ηζξ ηνεζξ πνςηεσκζηέξ ημο οπμιμκάδεξ PhoRpp21, PhoRpp29, PhoPop5 (Kouzuma et al 2003). Δ πνςηεσκζηή οπμιμκάδα PhoRpp30 αεθηζχκεζ ηδ ηαηαθοηζηή δνάζδ ημο εκγφιμο. Δ PhoRpp38 παίγεζ ζδιακηζηυ νυθμ ζηδ ζηαεενμπμίδζδ ηδξ RNA οπμιμκάδαξ ζε ορδθέξ εενιμηναζίεξ, υπμο ηαζ γεζ μ μνβακζζιυξ (70 μ C). ε πεζνάιαηα ακαζφζηαζδξ, πμο αημθμφεδζακ, απμηαθφθεδηε ημ πμζμζηυ ζοκεζζθμνάξ ηάεε πνςηεσκζηήξ οπμιμκάδαξ ζηδκ δναζηζηυηδηα ημο μθμεκγφιμο ηαζ πνμέηορε δ ελήξ δζάηαλδ: PhoPop5> PhoRpp30> PhoRpp21>> PhoRpp29> PhoRpp38 (Kouzuma et al 2003). ηδ πενίπηςζδ ημο μθμεκγφιμο απυ ημ P. furiosus (Pfu) ηαζ ημο Methanocaldococcus jannaschii (Mja), ημ P RNA ζε ζοκδοαζιυ λεπςνζζηά ιε ηα γεφβδ ηςκ πνςηεσκχκ Pfu/MjaRpp29-Pfu/MjaRpp21 ηαζ Pfu/MjaPop5-Pfu/MjaRpp30 ζπδιαηίγεζ θεζημονβζηυ έκγοιμ (Tsai et al 2006, Pulukkunat ηαζ Gopalan 2008). Κζκδηζηή ακάθοζδ ηςκ ακαζοζηαιέκςκ εκγφιςκ απμηάθορε πςξ ημ γεφβμξ Pfu/MjaPop5-Pfu/MjaRpp30 αεθηζχκεζ ηδκ ηαηαθοηζηή ζηαεενά (k cat ) ημο P RNA πενίπμο 40 θμνέξ, απμδεζηκφμκηαξ πςξ ημ εηενμδζιενέξ Pfu/MjaPop5-Pfu/MjaRpp30 ζοιιεηέπεζ ζδιακηζηά ζηδ ηαηάθοζδ ηαζ ζηδκ απεθεοεένςζδ ηςκ πνμσυκηςκ. Ώπυ ηδκ άθθδ πθεονά, ημ γεφβμξ ηςκ πνςηεσκχκ PfuRpp21-PfuRpp29 δεκ ιεηααάθθεζ ηδκ k cat ημο P RNA, εκχ ιεζχκεζ 5 θμνέξ ηδ ζηαεενά 76

78 Δηζαγσγή ζοββεκείαξ (K m ) ηαζ πανάθθδθα ιεζχκεζ ηζξ απαζηήζεζξ ζε Mg 2+. Πανυηζ μζ πνςηεσκζηέξ οπμιμκάδεξ ηςκ ανπαίςκ δεκ πανμοζζάγμοκ ηαιία μιμθμβία ιε ηζξ ααηηδνζαηέξ, εκημφημζξ ηάπμζα P RNA ανπαίςκ ηαηαθένκμοκ κα είκαζ ηαηαθοηζηά εκενβά πανμοζία ααηηδνζαηήξ πνςηεύκδξ ηαζ ημ ακηίζηνμθμ. Πζμ ζοβηεηνζιέκα, μζ MjaRpp29 ηαζ MjaRpp21 ηςκ ανπαίςκ θαίκεηαζ κα ζπδιαηίγμοκ έκα ηαηαθοηζηά εκενβυ ζφιπθμημ ιε ημ Μ1 RNA. Σα απμηεθέζιαηα αοηά απμηαθφπημοκ πςξ αοηέξ μζ πνςηεύκεξ απυ ηα ανπαία δζαεέημοκ ημζκά δμιζηά ζημζπεία ηαζ θεζημονβίεξ ιε ηζξ ααηηδνζαηέξ, πμο ιέπνζ ηχνα παναιέκμοκ άβκςζηεξ (Pannucci et al 1999, Tsai et al 2006). Αιιειεπηδξάζεηο πξσηετλώλ-πξσηεΐλώλ θαη RNA-πξσηετλώλ Κνοζηαθθμβναθζηέξ ηαζ βεκεηζηέξ ακαθφζεζξ δείπκμοκ πςξ ζηα ανπαία οπάνπεζ ζζπονή αθθδθεπίδναζδ ιεηαλφ ηςκ πνςηεσκζηχκ οπμιμκάδςκ Rpp29 ηαζ Rpp21, ηαεχξ ηαζ ιεηαλφ ηςκ Rpp30 ηαζ Pop5 (Hall ηαζ Brown 2004, Amero et al 2008). Πνυζθαηεξ ιεθέηεξ, ααζζζιέκεξ ζε ακαθφζεζξ απμηοπχιαημξ (footprinting analysis), ηυζμ ζε ηφπμο Ώ υζμ ηαζ ηφπμο Μ RNA, δείπκμοκ πςξ ημ ηάεε έκα γεφβμξ πνςηεσκχκ (Rpp29-Rpp21 ηαζ Rpp30-Pop5) δεζιεφεηαζ ζε δζαθμνεηζηή εέζδ πάκς ζημ P RNA ημο ανπαίμο μθμεκγφιμο, δζηαζμθμβχκηαξ έηζζ ηαζ ηζξ δζαθμνεηζηέξ ζδζυηδηεξ πμο πνμζδίδμοκ ζηδ θεζημονβία ημο μθμεκγφιμο. Οζ Rpp29 ηαζ Rpp21 ζπδιαηίγμοκ εηενμδζιενή, εκχ μζ Pop5 ηαζ Rpp30 ζπδιαηίγμοκ εηενμηεηναιενή ζημοξ ηνοζηάθθμοξ πμο δδιζμονβμφκ. Βπίζδξ, θαίκεηαζ πςξ ημ εηενμδζιενέξ ηςκ Rpp29-Rpp21 δεζιεφεηαζ ζηζξ πενζμπέξ P9, P10/11 ηαζ P12 ηδξ πενζμπήξ ελεζδίηεοζδξ S ηδξ RNA οπμιμκάδαξ, ζηαεενμπμζχκηαξ ηδκ ηαζ επζδνχκηαξ ζηδκ ζηακυηδηα ιε ηδκ μπμία ακαβκςνίγεζ ηαζ δεζιεφεζ ημ οπυζηνςια. ε ακηίεεζδ, ημ εηενμδζιενέξ Pop5-Rpp30 δεζιεφεηαζ ζηδκ ηαηαθοηζηή πενζμπή C ηδξ RNA οπμιμκάδαξ, επδνεάγμκηαξ ηδκ k cat ημο ακαζοζηαιέκμο εκγφιμο (Δηθόλα V) (Xu et al 2009, Kosaka et al 2010, Honda et al 2010). Βπζπθέμκ, ιεθέηεξ δζπθμφ οανζδίμο (two-yeast hybrid) έδεζλακ πςξ ζημ P. horikoshii δ PhΡμν5 αθθδθεπζδνά ηαζ ιε ηδκ PhνRpp21, αζεεκέζηενα αέααζα απ υηζ ιε ηδκ PhνRpp30 (Kifusa et al 2005). ε πανυιμζα ιεθέηδ ζημ M. thermoautotrophicus δ πνςηεσκζηή οπμιμκάδα Mth11 (Pop4/Rpp29) θαίκεηαζ κα αθθδθεπζδνά ηαζ ιε ηδκ Mth687 (Pop5/hPop5) (Hall ηαζ Brown 2004). 77

79 Δηζαγσγή Εικόνα V: πδιαηζηή απεζηυκζζδ ηςκ εέζεςκ δέζιεοζδξ ζημ Ρ RNA ημο P. furiosus ηςκ πνςηεσκζηχκ γεοβχκ PfuRpp29-PfuRpp21 ηαζ PfuPop5-PfuRpp30. Με ιπθέ ηαζ ηυηηζκμ πνχια ζδιεζχκμκηαζ μζ πενζμπέξ αθθδθεπίδναζδξ ηςκ PfuPop5-PfuRpp30 ηαζ PfuRpp29-PfuRpp21, ακηίζημζπα. Σμ πνάζζκμ αέθμξ δείπκεζ ηδ εέζδ ημο P RNA υπμο πνμζδέκεηαζ, είηε ημ εηενμδζιενέξ PfuPop5-PfuRpp30, είηε ηαζ μζ ηέζζενζξ πνςηεσκζηέξ οπμιμκάδεξ Δπθαξπσηηθέο πξσηετληθέο ππνκνλάδεο ησλ ππξεληθώλ RNase P ελδύκσλ Βκχ ηα ααηηδνζαηά μθμέκγοια ζηαεενμπμζμφκηαζ ιε ηζξ επζπθέμκ πενζμπέξ ηδξ RNA οπμιμκάδαξ ημοξ, μζ RNase P απυ ανπαία ηαζ εοηανοχηεξ ηαηάθενακ ελεθζηηζηά κα απμηηήζμοκ αοηή ηδκ ζηαεενυηδηα ιε ηδκ εκζςιάηςζδ επζπνυζεεηςκ πνςηεσκζηχκ οπμιμκάδςκ. Οζ πζμ δζελμδζηά ιεθεηδιέκεξ πνςηεύκεξ απυ εοηανοςηζηά έκγοια RNase P είκαζ αοηέξ ημο S. cerevisiae ηαζ H. sapiens. Δ πνςηεσκζηή ζφζηαζδ ηδξ ααηηδνζαηήξ RNase P είκαζ ιυθζξ ημ 10 % ηδξ μθζηήξ ιάγαξ ημο μθμεκγφιμο, εκχ αοηή ημο εοηανοςηζημφ μθμεκγφιμο είκαζ ημοθάπζζημκ ημ 70 %. Βκκέα ηαζ δέηα είκαζ ζε ανζειυ μζ πνςηεσκζηέξ οπμιμκάδεξ ζηα νζαμκμοηθεμπνςηεσκζηά ζφιπθμηα ηδξ γφιδξ ηαζ ημο ακενχπμο, ακηίζημζπα. Σμ ιμνζαηυ αάνμξ ηςκ πνςηεσκχκ πμζηίθεζ ηαζ ηοιαίκεηαζ απυ 15 ιέπνζ ηαζ >100 kda, εκχ ζηδ ιεβάθδ πθεζμρδθία ημοξ δζαεέημοκ ορδθυ pi (>9). Σμ μθμέκγοιμ ημο ακενχπμο ηαζ ηδξ γφιδξ δζαεέημοκ απυ ιία πνςηεύκδ ιε υλζκμ pi (Rpp40: 5.2 ηαζ Pop8: 4.6 ακηίζημζπα). ηδ γφιδ, μζ 9 πνςηεσκζηέξ οπμιμκάδεξ μκμιάγμκηαζ: Pop1, Pop3, Rpp1, Pop4, Pop5, Pop6, Pop7, Pop8 ηαζ Rpr2 (Chamberlain et al 1998). Πεζνάιαηα απαθμζθήξ βμκζδίςκ ζηδ γφιδ απμηάθορακ πςξ υθεξ μζ πνςηεσκζηέξ οπμιμκάδεξ ηδξ RNase P είκαζ απαναίηδηεξ βζα ηδ θεζημονβία ηδξ RNase P in vivo, αθθά ηαζ βζα ηδκ επζαίςζδ ημο ηοηηάνμο (Lee et al 1991, Lygerou et al 1994, Stolc ηαζ Altman 1997, Chamberlain et al 1998). Οζ ακενχπζκεξ πνςηεσκζηέξ οπμιμκάδεξ ηδξ RNase P μκμιάγμκηαζ Rpp14, Rpp20, Rpp21, Rpp25, Rpp29, Rpp30, Rpp38, Rpp40, Pop5 ηαζ Pop1, ιε ηδκ Rpp40 κα απμηεθεί 78

80 Δηζαγσγή ηδ ιμκαδζηή πνςηεύκδ ηδξ μπμίαξ δεκ οπάνπεζ μιυθμβδ ζηδ γφιδ. Βπηά απυ αοηέξ ηζξ πνςηεύκεξ είκαζ μιυθμβεξ ιε πνςηεύκεξ ηζξ γφιδξ, εκχ ηαιία απυ αοηέξ δεκ πανμοζζάγεζ μιμζυηδηα ιε ηζξ ααηηδνζαηέξ πνςηεσκζηέξ οπμιμκάδεξ. Πανυθμ πμο πεζνάιαηα ζηαονμζφκδεζδξ ηαζ ακάθοζδ δζπθμφ ή ηνζπθμφ οανζδίμο έπμοκ απμηαθφρεζ δζάθμνεξ αθθδθεπζδνάζεζξ ιεηαλφ πνςηεσκχκ ή πνςηεσκχκ ιε ηα Ρ RNA ηαζ ηα RNA οπμζηνχιαηα ζε αοηά ηα ιεβάθα νζαμκμοηθεμπνςηεσκζηά ζφιπθμηα, μ θεζημονβζηυξ νυθμξ λεπςνζζηά αοηχκ ηςκ πνςηεσκχκ παναιέκεζ άβκςζημξ. Μεθέηεξ, ααζζγυιεκεξ ζηδκ μιμθμβία ηςκ αθθδθμοπζχκ, έπμοκ δείλεζ πςξ πμθθέξ απυ ηζξ ακενχπζκεξ πνςηεσκζηέξ οπμιμκάδεξ απμοζζάγμοκ ζε πμθθμφξ μνβακζζιμφξ (Kalavrizioti et al 2007). ΐέααζα δεκ είκαζ βκςζηυ εάκ αοηυ μθείθεηαζ ζε πναβιαηζηή απμοζία ηςκ αθθδθμοπζχκ απυ ημ βμκζδίςια ηςκ μνβακζζιχκ ή απθά ζε ιδ φπανλδ μιμθμβίαξ ιεηαλφ ηςκ αθθδθμοπζχκ. ζμκ αθμνά ημ D. discoideum, δ ακαγήηδζδ ιέζς μιμθμβίαξ πμο πναβιαημπμζήεδηε ηαηά ηδκ δζάνηεζα ηδξ πανμφζαξ δζαηνζαήξ, εκηυπζζε 8 πνςηεύκεξ μιυθμβεξ ζημ ζφκμθυ ημοξ ιε ακηίζημζπεξ ηδξ RNase P απυ ημκ άκενςπμ: DRpp20, DRpp21, DRpp25, DRpp29, DRpp30, DRpp40, DPop5, DPop1. Οζ πενζζζυηενεξ πνςηεύκεξ ημο Dictyostelium δζαεέημοκ ιεβαθφηενμ ιμνζαηυ αάνμξ απυ ηζξ μιυθμβεξ απυ άθθμοξ μνβακζζιμφξ. Αφμ απυ αοηέξ (DRpp20, DPop5) πανυθδ ηδκ μιμθμβία ημοξ ζηδκ πνςημηαβή ημοξ δμιή δζαεέημοκ δζαθμνεηζηυ ζζμδθεηηνζηυ ζδιείμ ζε ζπέζδ ιε ηζξ ακενχπζκεξ μνευθμβεξ. Δ ζφζηαζδ ημο μθμεκγφιμο ηαζ μνζζιέκεξ απυ ηζξ ζδζυηδηεξ απυ ημοξ 3 εοηανοχηεξ ηαζ έκα ανπαίμ πανμοζζάγμκηαζ βζα ζφβηνζζδ ζημκ Πίλαθα Βίκαζ πμθφ εκδζαθένμκ υηζ ζημ μθμέκγοιμ ημο Dictyostelium εκημπίγμοιε 3 υλζκεξ πνςηεύκεξ (DRpp40 pi: 5.5, DRpp20 pi: 5.6, DPop5 pi: 5.2). Δ έθθεζρδ πθδνμθμνίαξ, υζμκ αθμνά ηζξ ηνζζδζάζηαηεξ δμιέξ ηςκ ιμνίςκ αοηχκ, ειπμδίγεζ ζηδκ πανμφζα θάζδ ηδκ πεναζηένς δζαηφπςζδ οπμεέζεςκ βζα ηα θεζημονβζηά παναηηδνζζηζηά ηςκ πνςηεύκχκ αοηχκ. Δ ζπέζδ ηςκ πνςηεύκχκ Rpp14, Rpp25 ηαζ Rpp40 ιε ηζξ οπμιμκάδεξ ηδξ γφιδξ δεκ είκαζ ζαθήξ, ηαεχξ δεκ πανμοζζάγμοκ μιμθμβία ιε αοηέξ. H πνςηεύκδ Pop7 ηδξ γφιδξ ηαζ μζ ακενχπζκεξ Rpp20 ηαζ Rpp25 (DRpp20 ηαζ DRpp25 ζημ Dictyostelium) πανμοζζάγμοκ μιμζυηδηα ζηδκ πνςημηαβή ημοξ αθθδθμοπία ιε πνςηεύκεξ ηδξ μζημβέκεζαξ Alba, μζ μπμίεξ εεςνείηαζ υηζ πνμένπμκηαζ ελεθζηηζηά απυ πνςηεύκεξ πμο πνμζδέκμοκ RNA ιυνζα ηαζ είκαζ πανμφζεξ ζε πμθθά νζαμκμοηθεμπνςηεσκζηά ζφιπθμηα (Aravind et al 2003). Βπζπνμζεέηςξ, οπάνπεζ παιδθή αθθά πζεακχξ αζμθμβζηά ζδιακηζηή μιμζυηδηα ηςκ αθθδθμοπζχκ ηςκ πνςηεσκχκ Rpp14 ηαζ Pop5, ηάηζ πμο έπεζ μδδβήζεζ ζηδκ οπυεεζδ υηζ μζ δφμ πνςηεύκεξ έπμοκ ημζκυ πνυβμκμ, αθθά ελεθίπεδηακ έηζζ χζηε κα ελοπδνεημφκ δζαθμνεηζηέξ θεζημονβίεξ, είκαζ, δδθαδή, πανάθμβεξ. Βπζπθέμκ, ακαβκςνίζηδηε δ ημζκή 79

81 Δηζαγσγή πνμέθεοζδ ηςκ οπμιμκάδςκ Pop3 ηδξ γφιδξ ηαζ Rpp38 ημο ακενχπμο ιε ηζξ νζαμζςιαηζηέξ πνςηεύκεξ L7Ae (Rosenblad et al 2006, Cho et al 2010). H. sapiens S. cerevisiae D. discoideum P. horikoshii Πρωτεΐνη ΜΒ pi Πρωτεΐνη ΜΒ pi Πρωτεΐνη ΜΒ pi Πρωτεΐνη ΜΒ pi hpop Pop DPop Rpp DRpp Rpp Pop (Ph1496) Rpp Rpp DRpp Ph Rpp Pop DRpp Ph Rpp DRpp hpop Pop DPop Ph Rpp Rpr DRpp Ph Rpp Pop DRpp20* Rpp Pop Pop Πίνακας : φζηαζδ ημο πνςηεσκζημφ ζοιπθδνχιαημξ ηαζ αζμπδιζηά παναηηδνζζηζηά ηςκ πνςηεσκζηχκ οπμιμκάδςκ ηδξ RNase P απυ ηνεζξ εοηανοχηεξ ηαζ έκα ανπαίμ. Οζ πνςηεσκζηέξ αθθδθμοπίεξ εκημπίζηδηακ ζημ GenBank, εκχ ημ ιμνζαηυ αάνμξ (Μΐ, ζε kda) ηαζ ημ ζζμδθεηηνζηυ ζδιείμ (pi) ηδξ ηάεε πνςηεύκδξ οπμθμβίζηδηε ιε ηδ αμήεεζα εζδζημφ πνμβνάιιαημξ ( Οζ μιυθμβεξ πνςηεύκεξ παναηίεεκηαζ ζηδκ ίδζα μνζγυκηζα ζεζνά. *Δ DRpp20 ημο Dictyostelium πανμοζζάγεζ ζδιακηζηή μιμθμβία ιε ηδκ ακενχπζκδ Rpp20 αθθά πμθφ παιδθή (πζεακχξ πςνίξ αζμθμβζηή ζδιαζία) ιε ηδκ Pop7 ηδξ γφιδξ. Γζα ηδκ Ph1496 δεκ οπάνπμοκ επανηείξ απμδείλεζξ υηζ ζοιιεηέπεζ ζημ ζφιπθμημ ηδξ RNase P ημο Pyrococcus, ηαζ βζα ημ θυβμ αοηυ ακαβνάθεηαζ ζε πανέκεεζδ. Αιιειεπηδξάζεηο πξσηετλώλ-πξσηετλώλ θαη RNA-πξσηετλώλ Με ηδ ιέεμδμ ημο δζπθμφ ηαζ ηνζπθμφ οανζδίμο ζηδ γφιδ έπμοκ ιεθεηδεεί μζ αθθδθεπζδνάζεζξ ιεηαλφ ηςκ πνςηεσκζηχκ οπμιμκάδςκ ηαζ ιεηαλφ αοηχκ ηαζ ημο RNA ηδξ RNase P ζηδ γφιδ ηαζ ζημκ άκενςπμ (Jiang ηαζ Altman 2001). Μεθέηεξ έπμοκ δείλεζ πςξ ζημ S. cerevisiae ηάεε πνςηεσκζηή οπμιμκάδα ηδξ RNase P αθθδθεπζδνά ιε ημοθάπζζημκ ιία άθθδ οπμιμκάδα ημο μθμεκγφιμο. Δ Pop4 απμηεθεί ηεκηνζηυ ζοζηαηζηυ ημο μθμεκγφιμο ηδξ γφιδξ, αθμφ αθθδθεπζδνά ιε 7 απυ ηζξ οπυθμζπεξ 8 πνςηεύκεξ ημο εκγφιμο (Houser-Scott et al 2002). Τπάνπμοκ, ςζηυζμ, δφμ πνςηεύκεξ, μζ 80

82 Δηζαγσγή Pop3 ηαζ Rpr2, πμο θαίκεηαζ κα πνμζηίεεκηαζ ιεηά απυ ημ ζπδιαηζζιυ εκυξ πνυδνμιμο εκενβμφ ζοιπθυημο (Srisawat et al 2002). Οζ δφμ αοηέξ πνςηεύκεξ ιπμνεί κα ιδκ είκαζ απαναίηδηεξ βζα ηδ δέζιεοζδ ημο pre-trna ηαζ ηδκ ηαηάθοζδ in vitro, αθθά ημ βεβμκυξ υηζ ζοιιεηέπμοκ ζημ μθμέκγοιμ ηςκ RNase P ζημ ηφηηανμ δείπκεζ πζεακυ ζδιακηζηυ νυθμ ζηδ θεζημονβία ημο ζοιπθυημο in vivo (Srisawat et al 2002). H Pop1 ηαζ δ Pop4 αθθδθεπζδνμφκ ιεηαλφ ημοξ, αθθά ηαζ ιε ηδκ RNA οπμιμκάδα ηαζ ζοβηεηνζιέκα δ Pop1 είκαζ βκςζηυ υηζ αθθδθεπζδνά εζδζηά ιέζς αθθδθμοπίαξ ιε ηδκ Ρ3 εδθεζά ηςκ εοηανοςηζηχκ P RNA ηαζ υηζ είκαζ απαναίηδηδ αοηή δ αθθδθεπίδναζδ βζα ηδκ ςνίιακζδ ημο πνυδνμιμο RNase P RNA (Ziehler 2001, Houser-Scott et al 2002). Βπζπνυζεεηα, μζ πνςηεύκεξ ηδξ γφιδξ Pop6 ηαζ Pop7 ζπδιαηίγμοκ έκα εηενμδζιενέξ ηαζ δεζιεφμκηαζ εζδζηά ζηδ Ρ3 εδθεζά ηδξ RNA οπμιμκάδαξ ηςκ εοηανοςηζηχκ εκγφιςκ, δ μπμία, υπςξ έπεζ πνμακαθενεεί, είκαζ ηδξ ιμνθήξ έθζηα-εδθεζά-έθζηα ηαζ είκαζ δζαηνζηή απυ αοηή ηςκ ααηηδνζαηχκ P RNA (Perederina et al 2010). Έηζζ, θαίκεηαζ πςξ δ P3 εδθεζά ζοιιεηέπεζ ζηζξ αθθδθεπζδνάζεζξ πμθθχκ πνςηεσκχκ. Οζ οπυθμζπεξ πνςηεύκεξ δεκ έπεζ δεζπεεί κα δεζιεφμκηαζ άιεζα ζηo P RNA ηδξ γφιδξ (Δηθόλα ). ηδκ ακενχπζκδ πονδκζηή RNase P έπεζ δεζπεεί πςξ μζ πνςηεσκζηέξ οπμιμκάδεξ Rpp29, Rpp14 ηαζ Rpp21 δεζιεφμοκ ημ ptrna in vitro, πςνίξ υιςξ κα είκαζ βκςζηυξ μ ιδπακζζιυξ ηςκ αθθδθεπζδνάζεςκ αοηχκ (Jarrous 2002). ιςξ, επεζδή δ RNase P ιμζνάγεηαζ ηδκ Rpp29 ηαζ ηδκ Rpp14 ιε ηδκ εκδμκμοηθεάζδ RNase MRP, ιπμνεί κα εεςνδεεί πςξ ηα δφμ αοηά πμθοπεπηίδζα ακαβκςνίγμοκ δζαιμνθχζεζξ ηςκ RNA οπμζηνςιάηςκ ηςκ δφμ μθμεκγφιςκ, ακηί βζα ζοβηεηνζιέκεξ αθθδθμοπίεξ. Μζα ααζζηή δοζημθία ζε αοημφ ημο είδμοξ ηα πεζνάιαηα είκαζ πςξ δ πθεζμρδθία ηςκ πνςηεσκχκ πμο ζοιιεηέπμοκ ζημ μθμέκγοιμ ηδξ RNase P πενζέπμοκ ζηδκ αθθδθμοπία ημοξ ιεβάθα ηιήιαηα απμηεθμφιεκα απυ ααζζηά αιζκμλέα ηαζ βζ αοηυ ημ θυβμ, οπάνπεζ ιεβάθδ πζεακυηδηα κα ειθακίγμοκ ηδκ ζδζυηδηα κα δεζιεφμοκ ιμκυηθςκα ιυνζα RNA (Xiao et al 2002). Ώοηυ θαίκεηαζ απυ ηζξ ηζιέξ ηςκ pi, μζ μπμίεξ ζηζξ 7 απυ ηζξ 9 είκαζ ορδθυηενμ ημο 9. Ώοηά ηα ιμηίαα ιπμνεί κα ελοπδνεημφκ ηδκ εζδζηή δέζιεοζδ, είηε ιε ημ RNA οπυζηνςια, είηε ιε ηδκ P RNA οπμιμκάδα, υηακ ένπμκηαζ ζε ζςζηή επαθή in vivo. ηακ, υιςξ, μζ πνςηεύκεξ εηθνάγμκηαζ in vitro, αοηέξ μζ αθθδθμοπίεξ εα ιπμνμφζακ κα αθθδθεπζδνμφκ ιδ εζδζηά. Ώκάθοζδ ηνζπθμφ οανζδίμο ηαζ ζηαονμζφκδεζδξ έδεζλε πςξ μζ πνςηεύκεξ Rpp21, Rpp29, Rpp30 ηαζ Rpp38 πνμζδέκμκηαζ ζημ Ρ RNA ηδξ ακενχπζκδξ RNase P (Jiang et al 2001) (Δηθόλα ). Βπίζδξ, μζ Rpp20 ηαζ Rpp25 αθθδθεπζδνμφκ ζζπονά ιεηαλφ ημοξ ηαζ δ επαθή πναβιαημπμζείηαζ ιέζς ηςκ πενζμπχκ ηςκ δφμ πνςηεσκχκ πμο ιμζάγμοκ ιε ηζξ πνςηεύκεξ ηδξ μζημβέκεζαξ Alba. Ο ζπδιαηζζιυξ αοημφ ημο 81

83 Δηζαγσγή εηενμδζιενμφξ είκαζ απαναίηδηδ πνμοπυεεζδ βζα ηδκ αθθδθεπίδναζή ημο ιε RNA ηαζ ζοβηεηνζιέκα ιε ημκ αναπίμκα ημο Ρ3 δμιζημφ ζημζπείμο ημο RNA ηδξ RNase MRP ηαζ ηδξ RNase P (Hands-Taylor et al 2010, Welting et al 2007). ζμκ αθμνά ηζξ ιέπνζ ηχνα ιεθεηδιέκεξ πνςηεσκζηέξ οπμιμκάδεξ ηδξ RNase P απυ ημ D. discoideum (DRpp20, DRpp30 ηαζ DRpp40) ιυκμ δ DRpp30 δζαεέηεζ ζδζυηδηεξ δέζιεοζδξ RNA ιμνίςκ. οβηεηνζιέκα αθθδθεπζδνά εζδζηά ιε ημ P RNA ημο μθμεκγφιμο ηαζ ημ pre-trna (Vourekas et al 2007, Kalavrizioti et al 2007). Διάρηζηνο θαηαιπηηθόο ππξήλαο Πανυθμ πμο υθεξ μζ πνςηεσκζηέξ οπμιμκάδεξ ηδξ εοηανοςηζηήξ RNase P είκαζ απαναίηδηεξ βζα ηδκ ζςζηή θεζημονβία ημο μθμεκγφιμο in vivo, in vitro έπεζ απμδεζπεεί ιε πεζνάιαηα ακαζφζηαζδξ πςξ δφκαηαζ κα ζπδιαηζζηεί ηαηαθοηζηά εκενβυ ζφιπθμημ ιε ηδκ αθθδθεπίδναζδ ιενζηχκ απυ ηζξ οπμιμκάδεξ πμο ζοιιεηέπμοκ ζηδκ ανπζηεηημκζηή ημο μθμεκγφιμο ηδξ RNase P. οβηεηνζιέκα, μζ ακενχπζκεξ πνςηεσκζηέξ οπμιμκάδεξ Rpp21 ηαζ Rpp29, μζ μπμίεξ, υπςξ πνμακαθένεδηε, αθθδθεπζδνμφκ ηαζ ιεηαλφ ημοξ, ιαγί ιε ηδκ RNA οπμιμκάδα (H1 RNA) ζπδιαηίγμοκ έκα ιίκζ-ζφιπθμημ πμο είκαζ ζηακυ κα ηαηαθφζεζ ηδκ εκδμκμοηθεμθοηζηή εναφζδ ηςκ πνυδνμιςκ ιμνίςκ trna (Mann et al 2003). (A) (B) Εικόνα : Τπμεεηζηά ιμκηέθα ηδξ εοηανοςηζηήξ RNase P. (Α) Μμκηέθμ ημο ακενχπζκμο μθμεκγφιμο. Με ηυηηζκμ θαίκμκηαζ μζ πνςηεσκζηέξ οπμιμκάδεξ πμο αθθδθεπζδνμφκ ιε ημ H1 RNA, ημ μπμίμ ακαπανίζηαηαζ ςξ ιαφνδ βναιιή. (Β) Μμκηέθμ ημο μθμεκγφιμο ηδξ γφιδξ. Δ αθθδθμεπζηάθορδ οπμδδθχκεζ αθθδθεπίδναζδ. Οζ Pop1 ηαζ Pop4, μζ μπμίεξ αθθδθεπζδνμφκ ιε ηδκ RNA οπμιμκάδα πανμοζζάγμκηαζ ζηζαζιέκεξ. Δ Pop1 αθθδθεπζδνά ιε ηδκ Ρ3 έθζηα ηδξ RNA οπμιμκάδαξ (ζοκεπέξ αέθμξ), εκχ δ αθθδθεπίδναζδ ηδξ Pop4 δεκ έπεζ αηυια ηαοημπμζδεεί ηαζ ακαπανίζηαηαζ ιε δζαηεημιιέκδ αβηφθδ. 82

84 Δηζαγσγή Λεηηνπξγηθέο ηδηόηεηεο ησλ πξσηετληθώλ ππνκνλάδσλ Βηηυξ απυ ηδκ ζοιιεημπή ημοξ ζηδκ ζοκανιμθυβδζδ ημο ζοιπθυημο ηδξ RNase P, ένεοκεξ έπμοκ δείλεζ βζα μνζζιέκεξ απυ ηζξ πνςηεσκζηέξ οπμιμκάδεξ πςξ δζαεέημοκ ηαζ λεπςνζζηέξ ζδζυηδηεξ. Υαναηηδνζζηζηυ πανάδεζβια απμηεθεί δ ακενχπζκδ Rpp20, δ μπμία ανέεδηε πςξ δζαεέηεζ δναζηζηυηδηα ΏΣΡάζδξ in vitro (Li ηαζ Altman 2001). Ο νυθμξ αοηήξ ηδξ δναζηζηυηδηαξ ζε ιζα πνςηεύκδ πμο ειπθέηεηαζ ζηδ δνάζδ ηδξ RNase P δεκ είκαζ αηυια λεηάεανμξ, εθυζμκ δ Rpp20 δεκ πνμζδέκεηαζ άιεζα μφηε ζημ Δ1 RNA (Jiang et al 2001), μφηε ζηα pre-trna (Jarrous et al 2001). Βπζπθέμκ, δ RNase P δεκ απαζηεί ΏΣΡ ή GTP βζα κα δνάζεζ in vitro. Χζηυζμ, δεκ απμηθείεηαζ δ πζεακυηδηα δ RNase P κα πνδζζιμπμζεί ΏΣΡ ή GTP ιέζα ζημ ηφηηανμ. Δ Rpp20 ζοιιεηέπεζ ηαζ ζημ ζφιπθμημ ηδξ RNase MRP (van Eenennaam et al 2001). Βκδεπμιέκςξ, αοηή δ πνςηεύκδ κα ειπθέηεηαζ ζηδκ ςνίιακζδ rrna ιμνίςκ, υπμο ανηεηέξ ΏΣΡ-ελανηχιεκεξ RNA εθζηάζεξ επίζδξ ζοιιεηέπμοκ. Σέθμξ, δ Rpp20 ανέεδηε υηζ αθθδθεπζδνά εζδζηά ιε ηδκ heat shock protein 27 (Hsp27) ηαζ εκζζπφεζ ηδκ δναζηζηυηδηα παναζηεοάζιαημξ RNase P ορδθήξ ηαεανυηδηαξ (Jiang ηαζ Altman 2001). Δ DRpp20 ημο D. discoideum δεκ θαίκεηαζ κα δζαεέηεζ δναζηζηυηδηα ΏΣΡάζδξ (Kalavrizioti et al 2007). Μζα άθθδ ακενχπζκδ οπμιμκάδα, δ Rpp14 έπεζ δναζηζηυηδηα 3-5 ελςνζαμκμοηθεάζδξ υηακ ζοκδοάγεηαζ ιε ηδκ πνςηεύκδ OIP2 (opacity-associated protein), πμο πνυηεζηαζ βζα ιζα πνςηεύκδ ηδξ ελςηενζηήξ ιειανάκδξ ημο ααηηδνίμο Neisseria gonorrhoeae (Jiang ηαζ Altman 2002). Σα δφμ θαζκυιεκα δεκ έπμοκ ιεθεηδεεί πεναζηένς. Γζα ηζξ πνςηεσκζηέξ οπμιμκάδεξ Pop1, Rpp38 ηαζ Rpp30 ημο ακενχπμο έπεζ δεζπεεί υηζ θένμοκ αοημακηζβμκζηέξ ζδζυηδηεξ, δδθαδή ακμζμηαηαηνδικίγμκηαζ απυ μννυ αζεεκχκ πμο πάζπμοκ απυ αοημάκμζα κυζδιαηα, ηάηζ πμο ιπμνεί κα απμδεζπηεί πνήζζιμ ζημ ιέθθμκ βζα ηδκ ακάπηολδ δζαβκςζηζηχκ δεζηηχκ (Lygerou et al 1996, Jarrous et al 1998) Δπθαξπσηηθέο πξσηετληθέο ππνκνλάδεο ηεο RNase P ησλ νξγαληδίσλ Βηηυξ απυ ηςκ ακενχπζκςκ ιζημπμκδνζαηχκ RNase P ηαζ αοηχκ ηςκ πθαζηζδίςκ ημο θοημφ A. thaliana πμο είκαζ πνςηεσκζηήξ θφζεςξ, δ βκχζδ ζπεηζηά ιε ηδ ζφζηαζδ ηδξ RNase P ηςκ διζαοηυκμιςκ μνβακζδίςκ παναιέκεζ πενζμνζζιέκδ. Σα μνβακίδζα αοηά πνμήθεακ απυ εκδμζοιαίςζδ ηςκ ααηηδνίςκ ζηα εοηανοςηζηά ηφηηανα ηαζ βζ αοηυ έκα έκγοιμ πανυιμζμ ηςκ ααηηδνζαηχκ εα ήηακ ιζα θμβζηή πνμζδμηία βζα ηζξ RNase P ηςκ μνβακζδίςκ αοηχκ. Πανυθα αοηά, αοηή δ οπυεεζδ, υπςξ θαίκεηαζ απυ ηα ηεθεοηαία 83

85 Δηζαγσγή δεδμιέκα, απμηεθεί ηδκ ελαίνεζδ πανά ημκ ηακυκα. Μυκμ βζα ηα μνβακίδζα ηδξ γφιδξ, ημο ακενχπμο ηαζ ημο A. thaliana οπάνπεζ μθμηθδνχιεκδ εζηυκα ηαζ πθδνμθμνία βζα ηδκ πνςηεσκζηή ζφκεεζδ ηδξ RNase P. Καιία πνςηεσκζηή οπμιμκάδα ηδξ RNase P απυ αοηά ηα μνβακίδζα δεκ πανμοζζάγεζ μιμθμβία ιε ηζξ ααηηδνζαηέξ. ηδ γφιδ έπεζ ακζπκεοεεί ημ πονδκζηυ βμκίδζμ πμο ηςδζημπμζεί ηδκ πνςηεύκδ RPM2, δ μπμία έπεζ πεζναιαηζηά δεζπεεί πςξ απαζηείηαζ βζα ηδκ δναζηζηυηδηα ηδξ ιζημπμκδνζαηήξ RNase P (Morales et al 1992). Πνυηεζηαζ βζα ιζα πνςηεύκδ 105 kda πμο δεκ ζπεηίγεηαζ ηαευθμο ιε ηζξ πνςηεσκζηέξ οπμιμκάδεξ ηδξ RNase P ηςκ ααηηδνίςκ, ηςκ ανπαίςκ ή ηςκ εοηανοςηχκ. Δ ακενχπζκδ ιζημπμκδνζαηή RNase P (mtrnase P) απμηεθείηαζ απυ ηνείξ πνςηεύκεξ, ηδκ MRPP1, ηδκ MRPP2 ηαζ ηδκ MRPP3 ηαζ ηαιία δεκ πανμοζζάγεζ μιμθμβία ιε μπμζαδήπμηε βκςζηή πνςηεύκδ ηδξ RNase P (Holzmann et al 2008). Δ MRPP1 είκαζ ιζα ιεεοθμ-ηνακζθενάζδ ηςκ trna (trna m1g methyltransferase ή Trm10), δ MRPP2 απμηεθεί ιέθμξ ηδξ μζημβέκεζαξ ηςκ αθοδνμβμκαζχκ/ακαβςβαζχκ ημκηήξ αθοζίδαξ, εκχ δ MRPP3 πνυηεζηαζ βζα ιζα ιεηαθθμκμοηθεάζδ πμο εεςνείηαζ πςξ ζηεβάγεζ ημ ηαηαθοηζηυ ηέκηνμ ημο εκγφιμο. Σέθμξ, ζηα ιζημπυδνζα ηαζ ηα πθαζηίδζα ημο θοημφ A. thaliana δ δναζηζηυηδηα ηδξ RNase P έπεζ απμδμεεί ζε ιζα απμηθεζζηζηά πνςηεύκδ. ημ Arabidopsis έπμοκ ανεεεί 3 μνευθμβεξ ηδξ MRPP3 πνςηεύκεξ, πμο έπμοκ μκμιαζηεί PRORP1, PRORP2 ηαζ PRORP3. Οιυθμβεξ, ηςκ πνςηεσκχκ αοηχκ, πνςηεύκεξ οπάνπμοκ ζε υθμοξ ημοξ εοηανοχηεξ, ιε ελαίνεζδ ημοξ ιφηδηεξ. ηα ιζημπυκδνζα ηαζ ζηα πθαζηίδζα ημο A. thaliana έπεζ δεζπεεί πςξ ιυκδ δ PRORP1, δ μπμία ηςδζημπμζείηαζ απυ ημ βμκζδίςια ηςκ μνβακζδίςκ, έπεζ ηδ ηαηαθοηζηή δναζηζηυηδηα RNase P (Gobert et al 2010). 4. Θεξαπεπηηθέο εθαξκνγέο ηεο RNase P Σα παναηηδνζζηζηά ηδξ RNase P, υζμκ αθμνά ηδκ ακαβκχνζζδ ηαζ ηδκ εναφζδ πμζηίθςκ οπμζηνςιάηςκ, έδςζακ ηδκ ζδέα κα πνδζζιμπμζδεεί δ εκδμκμοηθεμθοηζηή δναζηζηυηδηα ημο νζαμεκγφιμο ζε εεναπεοηζηέξ πνμζεββίζεζξ in vivo, δδθαδή κα ζημπεφεζ ηαζ κα εναφεζ παεμβυκα RNA ιυνζα. Ώπμδείπεδηε, πνάβιαηζ, υηζ δ ζπεδίαζδ νζαμεκγφιςκ ααζζζιέκςκ ζημ RNA ηδξ RNase P ιπμνεί κα μδδβήζεζ ζηδ ζφκεεζδ εκενβχκ εεναπεοηζηχκ ενβαθείςκ. Σα ζπεδζαζιέκα ιυνζα ιπμνμφκ κα ακαβκςνίγμοκ παεμβυκα mrna ηαζ ζσηά RNA, δνχκηαξ έηζζ πνζκ ημκ ζπδιαηζζιυ ηςκ θεζημονβζηχκ πνςηεσκχκ. Με ημκ ηνυπμ αοηυ ζημζπεζμεεηείηαζ έκα κέμ είδμξ βμκζδζαηήξ εεναπείαξ. 84

86 Δηζαγσγή Δ ηεκηνζηή ζδέα, ηαηά ηδ ζπεδίαζδ εεναπεοηζηχκ νζαμεκγφιςκ, είκαζ δ πνήζδ ιζαξ μδδβμφ αθθδθμοπίαξ, ζοιπθδνςιαηζηήξ πνμξ ημ ιυνζμ ζηυπμ. Δ οανζδμπμίδζδ ηςκ δφμ ιμνίςκ έπεζ ζακ απμηέθεζια ημκ ζπδιαηζζιυ ιζαξ δμιήξ πμο δζαεέηεζ δμιζηέξ μιμζυηδηεξ ιε ηα θοζζηά οπμζηνχιαηα ηδξ RNase P., Έηζζ, δ δμιή ακαβκςνίγεηαζ απυ ημ έκγοιμ ηαζ εναφεηαζ δ αθθδθμοπία ζηυπμξ. Γζα ηδκ επίηεολδ αοημφ ημο ζηυπμο αημθμοεμφκηαζ δφμ ζηναηδβζηέξ: 1) φιθςκα ιε ηδκ πνχηδ πνμζέββζζδ, πμνδβείηαζ ιζα ελςηενζηή μδδβυξ αθθδθμοπία (external guide sequence, EGS) ζοιπθδνςιαηζηή πνμξ ημ ιυνζμ ζηυπμ ηαζ δ δμιή πμο ζπδιαηίγεηαζ εναφεηαζ απυ ηδκ εκδμβεκή δναζηζηυηδηα RNase P (Δηθόλα 4-Α) (Yuan ηαζ Altman 1994). Δ ιέεμδμξ έπεζ ηάπμζα ιεζμκεηηήιαηα, υπςξ βζα πανάδεζβια, ελάνηδζδ ημο εεναπεοηζημφ απμηεθέζιαημξ απυ ημκ εκημπζζιυ ζηδκ ίδζα οπμηοηηανζηή πενζμπή ημο ιμνίμο ζηυπμο, ηδξ μδδβμφ αθθδθμοπίαξ ηαζ ηδξ δναζηζηυηδηαξ εκδμβεκμφξ RNase P. 2) Δ δεφηενδ ζηναηδβζηή πνδζζιμπμζεί ηδκ ηαηαθοηζηή οπμιμκάδα Μ1 RNA, ζε ζοκδοαζιυ ιε ηδκ μδδβυ αθθδθμοπία, ζε έκα πζιαζνζηυ ιυνζμ. Δ εζςηενζηή πθέμκ μδδβυξ αθθδθμοπία (internal guide sequence, IGS) ζοιπθδνςιαηζηή πνμξ ημκ RNA-ζηυπμ, ζοκδέεηαζ μιμζμπμθζηά ζημ 3 άηνμ ημο M1 RNA (Μ1-GS). Σμ νζαμέκγοιμ έπεζ πθέμκ ελεζδίηεοζδ αθθδθμοπίαξ (sequence specific ribozyme) πμο δζαιεζμθααείηαζ απυ ηδκ IGS, ζε ακηίεεζδ ιε ημ θοζζηυ νζαμέκγοιμ πμο παναηηδνίγεηαζ υπςξ έπεζ ακαθενεεί απυ ελεζδίηεοζδ δμιήξ (structure specific ribozyme) (Δηθόλα 4-Β) (Liu ηαζ Altman 1995). Κάπμζεξ απυ ηζξ απαζηήζεζξ πμο πνέπεζ κα ζηακμπμζμφκηαζ είκαζ δ ιμκαδζηυηδηα ηδξ αθθδθμοπίαξ ζηυπμο ηαζ δ πνμζααζζιυηδηά ηδξ in vivo, δ ακεεηηζηυηδηα ημο ελςβεκμφξ πμνδβμφιεκμο νζαμεκγφιμο ζηζξ εκδμβεκείξ κμοηθεάζεξ (επζηοβπάκεηαζ ιε πδιζηή ηνμπμπμίδζδ ηςκ ηαηαθμίπςκ ημο νζαμεκγφιμο ή ηδξ EGS), δ έηθναζδ ημο εκδμβεκμφξ νζαμεκγφιμο ιε πνήζδ ηαηάθθδθμο πθαζιζδζαημφ θμνέα ηαζ ηέθμξ, δ ορδθή ζοββέκεζα βζα ημ οπυζηνςια ζηυπμ ζε ζοκδοαζιυ ιε βνήβμνδ απεθεοεένςζδ ηςκ πνμσυκηςκ, χζηε ημ έκγοιμ κα πναβιαημπμζεί πμθθαπθμφξ ηφηθμοξ ηαηάθοζδξ. Δ ενεοκδηζηή μιάδα ημο Fenyong Liu έπεζ πνμζθένεζ πμθθά εθπζδμθυνα απμηεθέζιαηα πνδζζιμπμζχκηαξ ηαζ ηζξ δφμ ζηναηδβζηέξ βζα ηδκ ηαηαπμθέιδζδ ζσηχκ θμζιχλεςκ (HCV, HSV1, HIV, Kaposi) ηαζ παεμβυκςκ mrna (BCR-ABL) ηαζ είκαζ απυ ηζξ πνςημπυνεξ μιάδεξ ζημ πεδίμ αοηυ (Trang et al 2004, Raj ηαζ Liu 2003). Άθθεξ πνήζεζξ ηδξ ιεεμδμθμβίαξ πμο πενζβνάθδηε, αθμνμφκ ηδκ ηαηαζημθή έηθναζδξ βμκζδίςκ ζε εκαθθαηηζηέξ ζηναηδβζηέξ knock down ιεηαβναθζηχκ παναβυκηςκ ή ακαπηολζαηχκ νοειζζηχκ ζηδ εεναπεία ή ηδκ ααζζηή ένεοκα. Σμ πθεμκέηηδια ηδξ πνμζέββζζδξ εζδζηά βζα ηδκ ιεθέηδ ακαπηολζαηχκ βμκζδίςκ αθμνά ηδκ ιεθέηδ γςηζηχκ 85

87 Δηζαγσγή βμκζδίςκ πμο δεκ ιπμνμφκ κα απαθεζθεμφκ (ηα knock out γχα πεεαίκμοκ ζημ ζηάδζμ ημο ειανφμο). (A) (B) Εικόνα 4: πεδζαζιυξ εεναπεοηζηχκ πνμζεββίζεςκ ιε αάζδ ηδκ RNase P. (A) Ώκαπανάζηαζδ ηςκ θοζζηχκ οπμζηνςιάηςκ (pre-trna ηαζ 4.5S RNA, ιε ιαφνμ επζζδιαίκμκηαζ μζ εθάπζζηεξ δμιζηέξ απαζηήζεζξ βζα ηδκ ακαβκχνζζδ ηαζ ηαηάθοζδ) ηαζ εκυξ εθαπζζημπμζδιέκμο ηεπκδημφ οπμζηνχιαημξ (EGS: mrna) ηδξ RNase P ηαζ ημο M1 RNA. Σμ ζδιείμ εναφζδξ οπμδεζηκφεηαζ ιε αέθμξ. (B) Ώκαπανάζηαζδ ημο πζιαζνζημφ M1GS RNA (ιπθε πνχια) ηαζ ηδξ πνυζδεζήξ ημο ζηδκ αθθδθμοπία ζηυπμ (ηυηηζκμ πνχια). 5. Ο θπηηαξνκπμνκύθεηαο D. discoideum πζηεκαηηθή θαηάηαμε Δ ακαηάθορδ ημο ηοηηανμιολμιφηδηα Dictyostelium discoideum έβζκε ημ 1935 απυ ημκ Raper. Οζ ηοηηανμιολμιφηδηεξ (cellular slime molds) είκαζ ιμκμηφηηανμζ, απθμεζδείξ ιζηνμμνβακζζιμί, πςνίξ ηοηηανζηυ ημίπςια. Σα ηφηηανα μκμιάγμκηαζ ιολαιμζαάδεξ (myxamoebae) ηαζ πενζαάθθμκηαζ ιυκμ απυ ηοηηανζηή ιειανάκδ. Σνέθμκηαζ ιε ααηηήνζα, ηα μπoία εβημθπχκμοκ ζημ ηοηηανυπθαζια ιε θαβμηοηηάνςζδ ηαζ ζηδ ζοκέπεζα ηα ηαηακαθχκμοκ. Οζ ιολαιμζαάδεξ ηζκμφκηαζ ιε ρεοδμπυδζα. 86

88 Δηζαγσγή Σμ ηφνζμ παναηηδνζζηζηυ βκχνζζια ηςκ ηοηηανμιολμιοηήηςκ είκαζ ημ ρεοδμπθαζιχδζμ. Σμ ρεοδμπθαζιχδζμ είκαζ ιζα ιάγα ιολαιμζαάδςκ πμο θεζημονβεί ζακ εκζαίμ ζφκμθμ ηαζ ςξ πνμξ αοηυ ιμζάγεζ ιε ζζηυ ακχηενςκ μνβακζζιχκ. Οζ ιολαιμζαάδεξ ζημ ρεοδμπθαζιχδζμ δζαηδνμφκ πάκηα ηδκ ακελάνηδηδ φπανλή ημοξ ηαζ πμηέ δεκ ζοβπςκεφμκηαζ. Σα ηφηηανα ζε αοηή ηδκ ηαηάζηαζδ πανμοζζάγμοκ παναηηδνζζηζηά δζαθμνμπμίδζδξ πμο ιμζάγεζ ιε αοηήκ ακχηενςκ μνβακζζιχκ ηαζ βζα ημ θυβμ αοηυ ημ D. discoideum είκαζ πνυηοπμ πεζναιαηυγςμ βζα ηδκ δζαθμνμπμίδζδ. Δ ζοζηδιαηζηή ηαηάηαλδ ημο μνβακζζιμφ αοημφ έπεζ ςξ ελήξ: ςνομοηαξία (Division): Τποζςνομοηαξία (Subdivision): Ομοηαξία (Class): Τθομοηαξία (Subclass): Σάξε (Order): Οικογένεια (Family): Γένορ (Genus): Δίδορ: Gymnomycota Acrasiogymnomicotina (cellular slime molds) Acrasiomycetes Dictyosteliomycetidae Dictyosteliales Dictyosteliaceae Dictyostelium Dictyostelium discoideum Βηνινγηθόο θύθινο ηνπ D. discoideum Έκαξ βεκζηεοιέκμξ ηφηθμξ γςήξ ηςκ ηοηηανμιολμιοηήηςκ θαίκεηαζ ζηδκ Δηθόλα 5.2 (Υνζζηζάξ 1999). Σα ζπυνζα (aώ) αθαζηαίκμοκ ηαζ πανάβμοκ ιολαιμζαάδεξ (aΐ, c, d). Οζ ιολαιμζαάδεξ ηνέθμκηαζ ιε ααηηήνζα ηαζ ιε ηοηηανμδζαίνεζδ πανάβμοκ ιεβάθμοξ πθδεοζιμφξ ηοηηάνςκ. ηακ μ πθδεοζιυξ ηςκ ηοηηάνςκ θηάζεζ ηζξ πενίπμο ανπίγεζ δ θάζδ ηδξ ζοζζχνεοζδξ (aγ, e). οζζχνεοζδ (aggregation) ηαθείηαζ δ ηίκδζδ ηςκ ιολαιμζαάδςκ πνμξ ζοβηεηνζιέκα ηέκηνα. Σα ηέκηνα αοηά είκαζ ηφηηανα ιέζα ζημκ πθδεοζιυ ηςκ ιολαιμζαάδςκ. Σα ηφηηανα αοηά εηηνίκμοκ έκα πδιζηυ ιήκοια, αηηζκςηά βφνς ημοξ. Σα ηφηηανα πμο ανίζημκηαζ ημκηά ζηα ηέκηνα ακηζδνμφκ ζημ πδιζηυ αοηυ ιήκοια ιε δφμ ηνυπμοξ: εηηνίκμοκ ηαζ αοηά ημ ίδζμ πδιζηυ ιήκοια ηαζ ηζκμφκηαζ πνμξ ημ ανπζηυ ηέκηνμ. Ο ηφηθμξ παναβςβήξ ηαζ έηηνζζδξ ημο πδιζημφ ιδκφιαημξ επακαθαιαάκεηαζ, έηζζ χζηε ηα ηφηηανα ημο πθδεοζιμφ ηςκ ιολαιμζαάδςκ κα ηζκμφκηαζ ηαηά ηφιαηα πνμξ ημ ανπζηυ ηέκηνμ (aγ, e). ηδκ ανπή ηδξ ζοζζχνεοζδξ δ ηίκδζδ ηςκ ιολαιμζαάδςκ πνμξ ημ ηέκηνμ έπεζ ηδ ιμνθή μιυηεκηνςκ ηφηθςκ (e). Με ημκ πνυκμ, 87

89 Δηζαγσγή υιςξ, ημ ηοηθζηυ αοηυ ζπήια παθάεζ ηαζ παίνκεζ ημ ζπήια εκυξ ζοζηήιαημξ ηακαθζχκ πμο ζοβηθίκμοκ πνμξ ημ ηέκηνμ ηαζ ιέζς ηςκ μπμίςκ μζ ιολαιμζαάδεξ ηζκμφκηαζ πνμξ αοηυ (aγ). Σμ πδιζηυ ιήκοια πμο πνμηαθεί αοηήκ ηδκ ακηίδναζδ μκμιάζηδηε ανπζηά αηναζίκδ (acrasin), βζα αοηυ ηαζ μζ ηοηηανμιολμιφηδηεξ είκαζ βκςζημί ηαζ ζακ αηναζζμιφηδηεξ. Ώνβυηενα απμδείπεδηε υηζ ημ ιήκοια αοηυ ήηακ ημ c-amp. ηακ μζ ιολαιμζαάδεξ ζοζζςνεοημφκ υθεξ ζημ ανπζηυ ηέκηνμ ζπδιαηίγμοκ ιζα ιάγα ηοηηάνςκ βκςζηή ζακ ρεοδμπθαζιχδζμ (pseudoplasmodium, aα), ημ μπμίμ έπεζ ιμνθή βοικμζαθίββανμο. Σα ηφηηανα ημο ρεοδμπθαζιςδίμο δζαθμνμπμζμφκηαζ κςνίξ, πνζκ αηυιδ ζηαιαηήζεζ δ ηίκδζή ημο. Σα ηφηηανα ημο πνυζεζμο ιένμοξ ημο ρεοδμπθαζιςδίμο δζαθμνμπμζμφκηαζ ζε ζηεθεπζηά ηφηηανα (πενίπμο ημ 20% ημο μθζημφ πθδεοζιμφ ηςκ ηοηηάνςκ ηςκ ρεοδαιμζαάδςκ). Σα οπυθμζπα δζαθμνμπμζμφκηαζ ζε ζπμνμβυκα ηφηηανα. ηακ δ ηίκδζδ ημο ρεοδμπθαζιςδίμο ζηαιαηήζεζ ημ ζπήια ημο αθθάγεζ. ηδκ ανπή βίκεηαζ ζθαζνζηυ, ιεηά βίκεηαζ επίπεδμ ζηδ αάζδ, δ δζάιεηνυξ ημο αθθάγεζ ζε ζπέζδ ιε ημ φρμξ ηαζ ζημ πάκς ιένμξ ζπδιαηίγεζ ιζα εδθή (b). Σα ζηεθεπζηά ηφηηανα ηδξ ημνοθήξ πζέγμοκ ηδ ιάγα ηςκ ηοηηάνςκ πνμξ ηα ηάης, δδιζμονβμφκ έκα ηφθζκδνμ απυ ηοηηανίκδ ηαζ ιέζα ζε αοηυκ ζπδιαηίγμοκ ημ ζηέθεπμξ ημο ζςνμηάνπμο (aβ-aγ). Καεχξ ηα ζηεθεπζηά ηφηηανα ζοζζςνεφμκηαζ βζα κα ζπδιαηίζμοκ ημ ζηέθεπμξ δ οπυθμζπδ ιάγα ηςκ ηοηηάνςκ (ζπμνμβυκα ηφηηανα) ακορχκεηαζ πνμξ ηδκ ημνοθή ημο ζπδιαηζγυιεκμο ζςνμηάνπμο. ημκ χνζιμ ζςνυηανπμ ηα ζπμνμβυκα ηφηηανα ιεηαηνέπμκηαζ ζε ζπυνζα. Ο χνζιμξ ζςνυηανπμξ απμηεθείηαζ απυ έκα πμθφ θεπηυ ηαζ ιαηνφ ζηέθεπμξ, ημ μπμίμ ζηδνίγεηαζ ζε ιζα ζηνμββοθή αάζδ (οπμθείιιαηα ημο ρεοδμπθαζιςδίμο), πμο θένεζ παναηηδνζζηζημφξ δαηηοθίμοξ ηαζ αοθαηχζεζξ (f). ηδκ ημνοθή ημο ζηεθέπμοξ ζπδιαηίγεηαζ δ ηανπμθμνία (πμο ακαθένεηαζ επίζδξ ηαζ ζακ ζπμνζάββεζμ), δ μπμία απμηεθείηαζ απυ ζπυνζα. οκήεςξ έπεζ ζπήια ςμεζδέξ, ηαζ ηαηαθήβεζ ζε ιζα εδθή (g). 88

90 Δηζαγσγή a b c d e f g Δηθόλα 5. 2: Κφηθμξ γςήξ ημο ηοηηανμιολμιφηδηα Dictyostelium discoideum. a) πδιαηζηή ακαπανάζηαζδ ηςκ ζηαδίςκ ημο ηφηθμο γςήξ. Α: Βηαθάζηδζδ ζπμνίςκ, Β: ηάδζμ ιολαιμζαάδαξ, Γ: Υδιεζμηαηηζηή ζοζζςιάηςζδ ηοηηάνςκ, Γ-Δ: Φεοδμπθαζιχδζμ, Σ: ςνμηάνπζμ, Ε: νζιμ ζςνμηάνπζμ. b) οκδοαζηζηή Βζηυκα δθεηηνμκζηήξ ιζηνμζημπίαξ ηςκ πμθοηοηηανζηχκ ζηαδίςκ ημο μνβακζζιμφ. c) Μολαιμζαάδα ζημ μπηζηυ ιζηνμζηυπζμ. d) Μολαιμζαάδα ζημ ιζηνμζηυπζμ ζάνςζδξ. e) Ώνπζηυ ζηάδζμ πδιεζμηαηηζηήξ ηίκδζδξ. f) ΐάζδ ηαζ ζηέθεπμξ χνζιμο ζςνμηανπίμο. g) Κανπμθμνία ή ζπμνζάββεζμ Ο θπηηαξνκπμνκύθεηαο D. discoideum σο εξεπλεηηθό εξγαιείν. Δ απμηνοπημβνάθδζδ ημο βμκζδζχιαημξ ημο D. discoideum, ημκ ημπμεέηδζε θοθμβεκεηζηά ιεηά ημ δζαπςνζζιυ θοηχκ ηαζ γχςκ, ζημκ ηθάδμ πμο μδδβεί ζηα ιεηάγςα, μ μπμίμξ δζαπςνίγεηαζ ελεθζηηζηά πνχηα ζημ D. discoideum, ιεηά ζημοξ ιφηδηεξ ηαζ ανβυηενα ζηα ιεηάγςα (Δηθόλα 5. 3). Πανυηζ μ δζαπςνζζιυξ ζοκέαεζ κςνίξ ζηδκ θοθμβεκεηζηή ζζημνία ηςκ εοηανοςηζηχκ μνβακζζιχκ, πμθθέξ απυ ηζξ πνςηεύκεξ ημο πανμοζζάγμοκ ιεβαθφηενδ μιμζυηδηα ιε ηζξ μνευθμβεξ ημο ακενχπμο πανά ιε αοηέξ ημο S. cerevisiae (Eichinger et al 2005). Ο Dictyostelium έπεζ ζπεηζηά ιζηνυ βμκζδίςια ιε ιζηνή πμθοπθμηυηδηα, ζε ζπέζδ ιε ημ βμκζδίςια ηςκ ακχηενςκ εδθαζηζηχκ. Ο D. discoideum αημθμοεεί, υπςξ πνμακαθέναιε, έκα ηαθά ηαεμνζζιέκμ ηφηθμ ακάπηολδξ ηαζ δζαθμνμπμίδζδξ ηαζ έπεζ ηαεζενςεεί ςξ έκα 89

91 Δηζαγσγή εονφηαηα πνδζζιμπμζμφιεκμ ζφζηδια βζα ιεθέηεξ πμο αθμνμφκ ηδκ ακάπηολδ ηαζ ηδ δζαθμνμπμίδζδ (Loomis 1982). Έπμοκ πνμηαεεί ανηεηά εεςνδηζηά ιμκηέθα βζα ηδκ ενιδκεία ηςκ θαζκμιέκςκ δζαθμνμπμίδζδξ πμο παναηδνμφκηαζ ζημ ρεοδμπθαζιχδζμ, υηακ μζ αδζαθμνμπμίδηεξ ιολαιμζαάδεξ επζθέβμοκ δζαθμνεηζημφξ δνυιμοξ δζαθμνμπμίδζδξ, ηάης απυ ηδκ επίδναζδ δζαθμνεηζηχκ ιμνθμβεκεηζηχκ παναβυκηςκ (camp, DIF ηηθ.). Μεθέηεξ ηδξ δνάζδξ δζαθυνςκ βμκζδίςκ ιε μιυθμβμ ακαζοκδοαζιυ έπμοκ πναβιαημπμζδεεί ζημ D. discoideum ιέζς ιενζηήξ ή μθζηήξ ακηζηαηάζηαζδξ ηςκ οπυ ιεθέηδ βμκζδίςκ (Ruppel ηαζ Spudich 1987, Manstein et al 1989). Δ απθμεζδήξ ιολαιμζαάδα ημο D. discoideum απμηεθεί έκα εφπνδζημ ενβαζηδνζαηυ ηοηηανζηυ ζφζηδια, βζα ηδ ιεθέηδ θαζκμιέκςκ πμο έπμοκ ζπέζδ ιε ηδκ ηζκδηζηυηδηα ηςκ ηοηηάνςκ, ηαεχξ επίζδξ ηαζ ηδ ιεθέηδ ημο νυθμο ηςκ πνςηεσκχκ πμο δεζιεφμοκ αηηίκδ (actin-binding proteins). Βπίζδξ, θαίκεηαζ υηζ μ ιδπακζζιυξ ηδξ αζζεδηήνζαξ ιεηαβςβήξ δείπκεζ ανηεηέξ μιμζυηδηεξ ιε αοηυκ ηςκ ηοηηάνςκ ζπμκδοθςηχκ. Σέθμξ, μ D. discoideum άνπζζε κα ηαεζενχκεηαζ ςξ έκα πμθφ ηαθυ εοηανοςηζηυ ζφζηδια βζα ηδ ιεθέηδ νφειζζδξ ηδξ έηθναζδξ βμκζδίςκ ιε ηδ πνδζζιμπμίδζδ ιδ-κμδιαηζημφ RNA (antisense RNA) (Drainas 1996). Δηθόλα Φοθμβεκεηζηυ δέκηνμ ααζζζιέκμ ζημ πνςηέςια ακηζπνμζςπεοηζηχκ εοηανοςηζηχκ μνβακζζιχκ. Σμ δέκηνμ ζπεδζάζηδηε πνδζζιμπμζχκηαξ 5,279 μιμπαναεέζεζξ μνευθμβςκ πνςηεσκχκ ηςκ 17 εοηανοςηχκ πμο πανμοζζάγμκηαζ. Οζ ζπεηζηέξ απμζηάζεζξ ηςκ ηθάδςκ δίκμκηαζ ζε ιμκάδεξ Darwin (1 Darwin = 1/2,000 ηδξ απυηθζζδξ ιεηαλφ S. cerevisiae ηαζ ακενχπμο). 90

92 Δηζαγσγή Δ πνυζθαηδ απμηνοπημβνάθδζδ ημο βμκζδζχιαηυξ ημο υπζ ιυκμ επζαεααίςζε, αθθά επέηεζκε ηδκ αλία ημο ςξ ενεοκδηζηυ ενβαθείμ (Eichinger et al 2005). Σμ εκδζαθένμκ είκαζ υηζ πανά ημ υηζ δζαπςνίζηδηε κςνίηενα απυ ημοξ ιφηδηεξ, μζ μιμζυηδηεξ ηςκ πνςηεσκχκ ημο ιε ηζξ μνευθμβεξ ημο ακενχπμο είκαζ πενζζζυηενεξ απυ αοηέξ ημο S. cerevisiae ιε ηζξ ακηίζημζπεξ ημο ακενχπμο. Σα 6 πνςιμζχιαηά ημο (ζοκμθζημφ ιεβέεμοξ 34 Mb) πνμαθέπεηαζ υηζ ηςδζημπμζμφκ πενίπμο πνςηεύκεξ, ανζειυξ πμο είκαζ πζμ ημκηά ζημκ ανζειυ ηςκ βμκζδίςκ πμο πνμαθέπμκηαζ βζα έκα πμθοηφηηανμ μνβακζζιυ, πανά βζα έκα ιμκμηφηηανμ εοηανοςηζηυ. Σμ 20% ηςκ πνμαθεπυιεκςκ πνςηεσκχκ έπμοκ πνμηφρεζ απυ βμκζδζαημφξ δζπθαζζαζιμφξ, μζ μπμίμζ εηηζιάηαζ υηζ πνμήθεακ, είηε ηοπαία (tandem duplication), είηε ιε ημπζηή ακαζηνμθή (local inversion), είηε ιε δζαπνςιμζςιαηζηή ακηαθθαβή (interchromosomal exchange). Σα ζκηνυκζα ημο Dictyostelium είκαζ θίβα ηαζ ιζηνά ηαζ μζ δζαβμκζδζαηέξ πενζμπέξ πενζμνζζιέκεξ. Ώοηυ έπεζ ζακ απμηέθεζια ημ ζπδιαηζζιυ εκυξ ζοιπαβμφξ βμκζδζχιαημξ, ημ μπμίμ ζε πμζμζηυ 62% ηςδζημπμζεί πνςηεύκεξ (Eichinger et al 2005). Ο ανζειυξ ηςκ βμκζδίςκ πμο ηςδζημπμζμφκ ιυνζα trna είκαζ 390 ηαζ πθδζζάγεζ ημκ ανζειυ ηςκ ακχηενςκ εοηανοςηζηχκ μνβακζζιχκ (Plasmodium falciparum = 43, Drosophila melanogaster = 284, Homo sapiens = 496). Σμ βεβμκυξ αοηυ έδςζε κέα πνμμπηζηή ζηδ ιεθέηδ ημο μνβακζζιμφ, ηαεχξ ιπμνεί αθεκυξ, ςξ πζμ απθυ ζφζηδια, κα αμδεήζεζ κα ηαηακμήζμοιε θεζημονβίεξ ηςκ πζμ ζφκεεηςκ ακχηενςκ μνβακζζιχκ ηαζ αθ εηένμο κα αμδεήζεζ ζηδκ ένεοκα βζα εεναπεία αζεεκεζχκ ημο ακενχπμο. Σνζάκηα ηνεζξ πνςηεύκεξ ζπεηζγυιεκεξ ιε αζεέκεζεξ ανέεδηακ ίδζεξ ιε ηζξ μνευθμβεξ ζημκ άκενςπμ, ακαδεζηκφμκηαξ ημ D. discoideum ζε εφημθμ, πεζναιαηζηά ηαζ εκδζάιεζμ ζε πμθοπθμηυηδηα (ιεηαλφ γοιμιοηήηςκ ηαζ ακχηενςκ πμθοηφηηανςκ εοηανοςηζηχκ μνβακζζιχκ) υπδια ιεθέηδξ Σμ βμκζδίςια ημο Dictyostelium είκαζ πθμφζζμ ζε Ώ ηαζ Σ αάζεζξ (77.57%) ηαζ οπάνπεζ αθεμκία απθχκ επακαθαιαακυιεκςκ πενζμπχκ (simple sequence repeats, SSRs) ζε πμζμζηυ πμο λεπενκά ημ 11% ηςκ αάζεςκ ημο. Δ επακάθδρδ αοηή ζε βεκεηζηυ επίπεδμ ακηζηαημπηνίγεηαζ ιε ηδκ ειθάκζζδ πνςηεσκζηχκ πενζμπχκ πθμφζζςκ ζε έκα αιζκμλφ, υπςξ πμθοαζπαναβίκδ ή πμθοβθμοηαιίκδ ή πενζμπχκ παιδθήξ πμθοπθμηυηδηαξ, υπςξ π.π. QLQLQQQQQQLQLQQ ηαζ παναηδνείηαζ ζημ 34% ηςκ βμκζδίςκ πμο πνμαθέπεηαζ υηζ ηςδζημπμζμφκ πνςηεύκεξ. Οζ επακαθήρεζξ ηνζκμοηθεμηζδίςκ (ή αηυια 6, 9, 12, η.μ.η. κμοηθεμηζδίςκ) ζε βεκεηζηυ επίπεδμ είκαζ πζεακυκ κα πνμένπμκηαζ απυ έκακ απθυ ιδπακζζιυ επακάθδρδξ, αθθά ζε επίπεδμ πνςηεύκδξ έπμοκ επζθεβεί ελεθζηηζηά ηαζ έπμοκ παναιείκεζ. Έκδεζλδ βζα ηδκ επζθμβή ημοξ ζε πνςηεσκζηυ επίπεδμ είκαζ ημ βεβμκυξ υηζ μπμζαδήπμηε επακάθδρδ ηνζκμοηθεμηζδίμο ιεηαθνάγεηαζ ζοκήεςξ ζε έκα απυ ηα ηνία 91

93 Δηζαγσγή πθαίζζα ακάβκςζδξ. Γζα πανάδεζβια δ επακάθδρδ ACAACAACAACA ηςδζηεφεζ ζοκήεςξ πμθοβθμοηαιίκδ ([CAA]n) πανά ζε πμθοενεμκίκδ ([ACA]n) ή πμθοαζπαναβίκδ ([AAC]n). Μζα αηυια έκδεζλδ απμηεθεί ημ βεβμκυξ υηζ απυ ηζξ ιεηαθθάλεζξ πμο οθίζηακηαζ μζ επακαθήρεζξ ηνζκμοηθεμηζδίςκ, επζθέβμκηαζ ιυκμ αοηέξ πμο πανάβμοκ ζοκχκοια ηςδζηυκζα. Βπζπθέμκ, δ ηαηακμιή ηςκ επακαθήρεςκ ηαζ ηςκ πενζμπχκ παιδθήξ πμθοπθμηυηδηαξ δεκ είκαζ μιμζυιμνθδ: δ πθεζμρδθία ηςκ πνςηεσκχκ δεκ έπμοκ ηέημζα παναηηδνζζηζηά (62%) ή έπμοκ δφμ ή παναπάκς (18%), ηάηζ πμο ζδιαίκεζ υηζ αοηυ ημ παναηηδνζζηζηυ βίκεηαζ ακεηηυ ζε ζοβηεηνζιέκμοξ ηφπμοξ πνςηεσκχκ. Γζα πανάδεζβια, πενζμπέξ πμθοβθμοηαιίκδξ ηαζ πμθοαζπαναβίκδξ εκημπίγμκηαζ ηονίςξ ζε πνςηεσκζηέξ ηζκάζεξ, ζε θζπζδζηέξ ηζκάζεξ, ζε ιεηαβναθζημφξ πανάβμκηεξ, ζε RNA εθζηάζεξ ηαζ ζε πνςηεύκεξ πμο πνμζδέκμκηαζ ζε mrna, υπςξ μζ πνςηεύκεξ ημο επακαζοκδεμζχιαημξ. Βθυζμκ πμθθέξ αζεέκεζεξ ημο ακενχπμο απμδίδμκηαζ ζε επακαθαιαακυιεκεξ ηνζπθέηεξ κμοηθεμηζδίςκ πμο ηςδζημπμζμφκ βζα πανάδεζβια πμθοβθμοηαιίκδ, δ ιεθέηδ ημο Dictyostelium ιπμνεί κα δζαζαθδκίζεζ ημ νυθμ αοηχκ ηςκ ιμηίαςκ ζηδκ πνςηεσκζηή θεζημονβία ή δοζθεζημονβία. φβηνζζδ ημο βμκζδζχιαηυξ ημο Dictyostelium ιε παεμβυκα, υπςξ δ Entamoeba histolytica, εα αμδεήζεζ ζημκ πνμζδζμνζζιυ ηςκ βμκζδίςκ πμο είκαζ οπεφεοκα βζα ηδκ ιμθοζιαηζηυηδηά ηδξ. Πανάθθδθα, δ μιμζυηδηά ημο ιε ηα ακενχπζκα θεοημηφηηανα ζε πδιεζμηαλία ηαζ θαβμηοηηάνςζδ ιπμνεί κα απμηεθέζεζ ιμκηέθμ λεκζζηή βζα ηδ ιεθέηδ ηδξ ααηηδνζαηήξ παεμβέκεζαξ. Βπίζδξ, ζημ βμκζδίςια ημο D. discoideum εκημπίζηδηακ βμκίδζα πμο ηςδζημπμζμφκ πμθοηεηζδζηέξ ζοκεάζεξ (polyketide synthases) ηαζ ABC δζαιειανακζημφξ ιεηαθμνείξ (ABC transporters), οπμδδθχκμκηαξ έκακ εηηεηαιέκμ δεοηενμβεκή ιεηααμθζζιυ. Οζ 66 ABC δζαιειανακζημί ιεηαθμνείξ, πμο ηςδζημπμζμφκηαζ απυ ημ βμκζδίςια, έπμοκ ηαλζκμιδεεί ζφιθςκα ιε ηζξ οπμμζημβέκεζεξ ηςκ ακενχπζκςκ ABC ιεηαθμνέςκ (ABCA, ABCB, ABCC, ABCD, ABCE, ABCF ηαζ ABCG). Πανάθθδθα, δ ιεθέηδ ημο Dictyostelium ιπμνεί κα δζαθςηίζεζ ηδ δμιή ηαζ ημ πενζεπυιεκμ ημο πνςηανπζημφ εοηανοςηζημφ βμκζδζχιαημξ ηαζ ηδκ ελέθζλή ημο ζηζξ ακχηενεξ ζφκεεηεξ ιμνθέξ. Δ εφνεζδ οπμδμπέςκ G- πνςηεσκχκ ηςκ μζημβεκεζχκ 2, 3 ηαζ 5, μζ μπμίεξ ιέπνζ πνυζθαηα εεςνμφκηακ εζδζηέξ ηςκ γχςκ, έδεζλε υηζ βμκίδζα αοηά δεκ ειθακίζηδηακ πνυζθαηα, υπςξ πζζηεφαιε ςξ ηχνα, αθθά οπήνπακ κςνίηενα ηαζ θοθμβεκεηζηά πάεδηακ ζημοξ ιφηδηεξ. Δ απμηνοπημβνάθδζδ ημο βμκζδζχιαημξ ημο Dictyostelium θακένςζε ιεβάθδ πμζηζθία βμκζδίςκ πμο ηςδζημπμζμφκ πνςηεύκεξ πμο 92

94 Δηζαγσγή πνμζμιμζάγμοκ ιε αοηέξ θοηχκ, ιοηήηςκ ηαζ γχςκ, εκχ δείπκεζ υηζ μ ημζκυξ πνυβμκυξ ημοξ είπε ιεβαθφηενμ ανζειυ βμκζδίςκ απυ υηζ οπμθμβίγαιε (Eichinger et al 2005) Υαξαθηεξηζηηθά ηεο RNase P από ην D. discoideum Δ RNase P απυ ημκ D. discoideum είκαζ έκα ελαζνεηζηά εκδζαθένμκ έκγοιμ, δεδμιέκμο υηζ επεζδή μ ιολμιφηδηαξ D. discoideum είκαζ ηαηχηενμξ εοηανοςηζηυξ μνβακζζιυξ, ημ έκγοιμ αοηυ πνμζθένεηαζ βζα ζφβηνζζδ, ηυζμ ιε έκγοια RNase P ακχηενςκ εοηανοςηζηχκ μνβακζζιχκ, υζμ ηαζ ιε ηα ηαθφηενα παναηηδνζζιέκα ααηηδνζαηά μθμέκγοια. Δ RNase P ημο D. discoideum είκαζ ακηζηείιεκμ ιεθέηδξ ηδξ ενεοκδηζηήξ μιάδαξ ημο ηαεδβδηή Αζμκοζίμο ΑναΎκα ηαζ είκαζ ημ ιμκαδζηυ ζήιενα ενβαζηήνζμ, παβημζιίςξ, πμο αζπμθείηαζ ιε ηδκ RNase P απυ ημκ μνβακζζιυ αοηυκ. Έπεζ πναβιαημπμζδεεί μ ιενζηυξ παναηηδνζζιυξ ημο μθμεκγφιμο (Stathopoulos et al 1995, Drainas 1996) ηαζ έπεζ ανεεεί υηζ είκαζ ηαζ αοηή ιζα νζαμκμοηθεμπνςηεύκδ. Ώοηυ απμδεζηκφεηαζ απυ ηδκ εοαζζεδζία ημο εκγφιμο ζε επελενβαζία, ηυζμ ιε ιζηνμημηηζηή κμοηθεάζδ, υζμ ηαζ ιε πνςηεσκάζδ Κ. Ο θυβμξ πνςηεύκδξ/rna ζημ εοηανοςηζηυ αοηυ μθμέκγοιμ είκαζ ιεβαθφηενμξ απυ υηζ ζηα ακηίζημζπα ααηηδνζαηά, υπςξ πνμηφπηεζ απυ ηδ ζφβηνζζδ ηςκ ηζιχκ πμο έπμοκ οπμθμβζζεεί βζα ηζξ ποηκυηδηεξ επζπμθήξ ζηα έκγοια αοηά. Πζμ ζοβηεηνζιέκα, δ ποηκυηδηα επζπμθήξ ζε ααειίδςζδ ζοβηέκηνςζδξ Cs 2 SO 4, πμο οπμθμβίζεδηε βζα ηδκ RNase P απυ ημκ D. discoideum, είκαζ παιδθή (1.23 g/ml) ηαζ είκαζ πανυιμζα ιε αοηή εκυξ πνςηεσκζημφ ιμνίμο (Stathopoulos et al 1995). Χξ ιεηαθθμέκγοιμ δ RNase P ημο D. discoideum απαζηεί ηδκ πανμοζία, ηυζμ ιμκμζεεκχκ (Κ +, ΝΔ + 4 ), υζμ ηαζ δζζεεκχκ ηαηζυκηςκ Mg 2+ βζα δναζηζηυηδηα in vitro. Δ αέθηζζηδ δναζηζηυηδηα in vitro επζηοβπάκεηαζ πανμοζία 5 mm MgCl 2 ηαζ 10 mm NH 4 Cl ή 5 mm KCl ζε ph 7.6 ηαζ εενιμηναζία ακηίδναζδξ 37 C. Δ θαζκμιεκζηή ζηαεενά Michaelis (Κ m ) οπμθμβίζηδηε βζα ηδκ ςνίιακζδ ημο pre-trna Ser ημο S. pombe απυ ηδκ RNase P ημο D. discoideum ηαζ ανέεδηε κα έπεζ ηζιή 240 nμ. ε ζφβηνζζδ ιε έκγοια RNase P απυ άθθμοξ μνβακζζιμφξ, θαίκεηαζ υηζ μζ ζοβηεκηνχζεζξ ιμκμζεεκχκ ηαηζυκηςκ πμο απαζημφκηαζ (5 mm KCl, 10 mm NH 4 Cl) βζα αέθηζζηδ δναζηζηυηδηα in vitro είκαζ ιζηνυηενεξ. Ίζςξ αοηυ κα ζπεηίγεηαζ ιε ηδ παιδθή ποηκυηδηα επζπμθήξ ημο μθμεκγφιμο πμο απμηεθεί έκδεζλδ ορδθμφ πνςηεσκζημφ πενζεπμιέκμο. Αδθαδή, ημ πνςηεσκζηυ ζοζηαηζηυ ημο μθμεκγφιμο επανηεί βζα κα δνάζεζ ςξ πνμζηαηεοηζηή αζπίδα ηαζ κα ιεζχζεζ ηζξ ζζπονέξ δθεηηνμζηαηζηέξ απχζεζξ ιεηαλφ ηςκ 93

95 Δηζαγσγή ανκδηζηά θμνηζζιέκςκ ιαηνμιμνίςκ ημο οπμζηνχιαημξ ηαζ ηδξ οπμιμκάδαξ RNA ημο εκγφιμο. Έηζζ, δ πανμοζία ηςκ πνςηεσκζηχκ οπμιμκάδςκ ζοιαάθθεζ ζηδκ ηαηάθθδθδ δζαιυνθςζδ ημο εκγφιμο, χζηε κα επζηοβπάκεηαζ δ ζςζηή αθθδθεπίδναζδ εκγφιμοοπμζηνχιαημξ. Μζα αλζμζδιείςηδ ζδζυηδηα ηδξ RNase P ημο D. discoideum είκαζ δ ζηακυηδηα ημο εκγφιμο, ηαηυπζκ ελακηθδηζηήξ απμπνςηεύκςζδξ (ηαηενβαζία ιε πνςηεσκάζδ Κ/ εηπφθζζδ ιε θαζκυθδ/ εκγοιζηή δμηζιή πανμοζία SDS), κα ειθακίγεζ ιζα κέα ελεζδζηεοιέκδ εκδμκμοηθεμθοηζηή δναζηζηυηδηα in vitro, πανμοζία αολδιέκςκ ζοβηεκηνχζεςκ ηαηζυκηςκ Μg 2+ + (10 mm) ηαζ ΝΔ 4 (100 mμ). Σμ ηνμπμπμζδιέκμ έκγοιμ ηυαεζ δφμ κμοηθεμηίδζα ακμδζηά απυ ημ ηακμκζηυ ζδιείμ εναφζδξ ημ ζοβηεηνζιέκμ οπυζηνςια (psups1) ηαζ πανάβεζ πνμσυκηα ιε 3 -Ρ ηαζ 5 -ΟΔ άηνα, ακηί 3 -ΟΔ ηαζ 5 -Ρ άηνα πμο είκαζ παναηηδνζζηζηά ηδξ ελεζδίηεοζδξ υθςκ ηςκ εκγφιςκ RNase P (Stathopoulos et al 2001). Αδθαδή, θαίκεηαζ πςξ μζ πνςηεσκζηέξ οπμιμκάδεξ ίζςξ κα ζπεηίγμκηαζ ιε ηδκ ελεζδίηεοζδ ημο εκγφιμο, ηυζμ βζα ηδκ επζθμβή ημο ζςζημφ ζδιείμο εναφζδξ, υζμ ηαζ βζα ημκ ηαηαθοηζηυ ιδπακζζιυ. Δ RNase P απυ ημ D. discoideum, υπςξ πνμακαθέναιε, έπεζ απυθοηδ απαίηδζδ ηαηζυκηςκ ιεηάθθςκ βζα ηδ δναζηζηυηδηά ηδξ. Σα ιέηαθθα ιεηάπηςζδξ Mn 2+, Co 2+, Ni 2+, ηαζ Cd 2+ είκαζ ακαζημθείξ ηδξ εκγοιζηήξ δναζηζηυηδηαξ ημο μθμεκγφιμο. Σα ιέηαθθα Ca 2+, Sr 2+, ηαζ Ba 2+ ηςκ αθηαθζηχκ βαζχκ, ηάης απυ ηαηάθθδθεξ ζοκεήηεξ, ιπμνμφκ κα ακηζηαηαζηήζμοκ ιενζηχξ ημ Mg 2+. Πανμοζία Mg 2+, ηα ιέηαθθα αοηά επζδεζηκφμοκ ιζα δζηηή δνάζδ ζηδκ ηαηαθοηζηή ζηαεενά ημο εκγφιμο. Κζκδηζηή ακάθοζδ ζηδ θάζδ ηδξ εκενβμπμίδζδξ θακένςζε υηζ ηα Ca 2+, Sr 2+, ηαζ Ba 2+ δνμοκ ςξ ιδ απαναίηδημζ ιδ ζοκαβςκζζηζημί εκενβμπμζδηέξ. Βπζπθέμκ, αφλδζδ ηδξ ζοβηέκηνςζδξ ηςκ Ca 2+, Sr 2+, ή Ba 2+ πνμηαθεί ιδ ζοκαβςκζζηζηή ακαζημθή ζηδκ ακηίδναζδ ηδξ RNase P, δείπκμκηαξ υηζ δ RNase P έπεζ ιζα δεφηενδ εέζδ δέζιεοζδξ βζα ημ ακαζηαθηζηυ απμηέθεζια ηςκ Ca 2+, Sr 2+, ηαζ Ba 2+. Καζ μζ δομ εέζεζξ, ακαζημθήξ ηαζ εκενβμπμίδζδξ, ιπμνμφκ κα ηαηαθαιαάκμκηαζ ηαοηυπνμκα (Tekos et al 1998). Βπζπθέμκ, έπεζ ιεθεηδεεί εηηεκχξ δ επίδναζδ πμθθχκ ακηζαζμηζηχκ, ηδξ ηάλδξ ηςκ αιζκμβθοημζζδίςκ, ζηδ δναζηζηυηδηα ηδξ RNase P απυ ημ D. discoideum. Λεπημιενήξ ηζκδηζηή ακάθοζδ έδεζλε υηζ ηα ακηζαζμηζηά αοηά ζοιπενζθένμκηαζ ςξ ηθαζζζημί ιδζοκαβςκζζηζημί ακαζημθείξ, ιε ηδ κεμιοηίκδ ςξ ημκ πθέμκ ζζπονυ ακαζημθέα. Δ ηζκδηζηή ακάθοζδ έδεζλε υηζ ηα αιζκμβθοημζίδζα ζοκαβςκίγμκηαζ ιε ημ Mg 2+ βζα ημζκέξ εέζεζξ δέζιεοζδξ ζημ μθμέκγοιμ (Tekos et al 2000). 94

96 Δηζαγσγή Βπίζδξ, πναβιαημπμζήεδηε θεπημιενήξ ηζκδηζηή ιεθέηδ ακαζημθέςκ ηδξ πνςηεσκμζφκεεζδξ, υπςξ δ αιζζεηίκδ, δ αθαζηζζζδίκδ S ηαζ δ πμονμιοηίκδ ζηδκ εκγοιζηή δναζηζηυηδηα ηδξ RNase P απυ ημ D. discoideum. Δ πμονμιοηίκδ ζοιπενζθένεηαζ ζακ ηθαζζζηυξ ζοκαβςκζζηζηυξ ακαζημθέαξ, εκχ δ αιζζεηίκδ ηαζ δ αθαζηζζζδίκδ S, πανά ηδκ μιμζυηδηά ημοξ ιε ηδκ πμονμιοηίκδ, ζοιπενζθένμκηαζ ζακ ηθαζζζημί ιδ ζοκαβςκζζηζημί ακαζημθείξ. Σμ ακαζηαθηζηυ απμηέθεζια ηδξ πμονμιοηίκδξ ηαζ ηδξ αιζζεηίκδξ ή ηδξ αθαζηζζζδίκδξ S, υηακ πνμζηίεεκηαζ ηαοηυπνμκα, είκαζ αενμζζηζηυ ηάηζ πμο ζοκάδεζ ιε ηδκ φπανλδ δφμ δζαθμνεηζηχκ, ιδ αιμζααίςξ απμηθεζυιεκςκ εέζεςκ ακαζημθήξ, πάκς ζημ μθμέκγοιμ ηδξ RNase P (Stathopoulos et al 2000). Βπζπνυζεεηα, έβζκε ιεθέηδ ηδξ επίδναζδξ ηςκ νεηζκμεζδχκ 1 δξ, 2 δξ ηαζ 3 δξ βεκζάξ ζηδκ εκγοιζηή δναζηζηυηδηα ηδξ RNase P απυ ημ D. discoideum, υπςξ ηδξ νεηζκυθδξ, ηςκ παναβχβςκ ημο νεηζκμσημφ μλέμξ ηαζ ηςκ ανμηζκμεζδχκ. Παναηδνήεδηε υηζ υθα ηα νεηζκμεζδή ζοιπενζθένμκηαζ ςξ απθμί ζοκαβςκζζηζημί ακαζημθείξ. Σα απμηεθέζιαηα αοηά μδήβδζακ ζημ ζοιπέναζια υηζ ηα ιυνζα αοηά ιπμνμφκ κα δνμφκ ζηδ αζμβέκεζδ ημο trna ιέζς ιδπακζζιχκ πμο είκαζ ακελάνηδημζ απυ ημοξ οπμδμπείξ ημοξ. Βπίζδξ, ανέεδηε υηζ ηα ακάθμβα ηδξ αζηαιίκδξ D αζημφκ ακαζηαθηζηή δνάζδ ζηδκ εκγοιζηή εκενβμηδηα ηδξ RNase P απυ ημ D. discoideum (Papadimou et al 1998, Papadimou et al 2000, Vourekas et al 2009). Σα ιζηνά ιυνζα πμο δνμοκ ςξ ακαζημθείξ ηδξ RNase P ιπμνμφκ κα βίκμοκ πνήζζια ενβαθεία βζα ηδ ιεθέηδ ημο ιδπακζζιμφ ηαηάθοζδξ ηαζ ηδκ δζενεφκδζδ ηδξ δμιήξ ημο εκγφιμο, υπςξ αμήεδζακ ζηδ ιεθέηδ ηδξ δμιήξ ηαζ θεζημονβίαξ ημο νζαμζχιαημξ. Ώπυ ηδκ άθθδ, δ RNase P απμηεθεί έκα πνήζζιμ πεζναιαηζηυ ενβαθείμ βζα ηδκ in vitro ιεθέηδ ηδξ αζμθμβζηήξ δνάζδξ ηςκ ακηζαζμηζηχκ, ειπθμοηίγμκηαξ έηζζ ηζξ βκχζεζξ ιαξ βφνς απυ ημ ιδπακζζιυ δνάζδξ ημοξ ηαζ ηδκ ακάπηολδ κέςκ ακαζημθέςκ (Tekos et al 2004, Vourekas et al 2006). 95

97 θνπόο ηεο κειέηεο θνπόο ηεο κειέηεο Σα ηεθεοηαία πνυκζα μζ ιεθέηεξ πμο πναβιαημπμζμφκηαζ ζημ ενβαζηήνζμ ημο Καεδβδηή Α. ΑναΎκα έπμοκ ςξ ακηζηείιεκμ ημκ εκημπζζιυ ηςκ βμκζδίςκ ηςκ οπμιμκάδςκ ημο νζαμκμοηθεμπνςηεσκζημφ ζοιπθυημο ηδξ RNase P απυ ημ D. discoideum (απμηεθέζιαηα πανμφζαξ δζαηνζαήξ, Ώκαζηάζζζμξ ΐμονεηάξ Αζδαηημνζηή Αζαηνζαή 2007, Αήιδηνα Καθαανζγζχηδ Αζδαηημνζηή Αζαηνζαή 2006, Vourekas et al 2006, Kalavrizioti et al 2007). Σα πνχηα απμηεθέζιαηα είκαζ ζοιααηά ιε έκα πθμφζζμ πνςηεσκζηυ ζοιπθήνςια, απμηεθμφιεκμ απυ ημοθάπζζημκ 8 πνςηεύκεξ μιυθμβεξ πνμξ ακηίζημζπεξ ακενχπζκεξ: DPop1/hPop1, DRpp40/Rpp40, DRpp30/Rpp30, DRpp29/Rpp29, DRpp25/Rpp25, DRpp20/Rpp20, DPop5/hPop5, DRpp21/Rpp21. O ανζειυξ ημοξ οπμθείπεηαζ απυ ηςκ ανζειυ ηςκ οπμιμκάδςκ ημο μθμεκγφιμο απυ ημκ άκενςπμ ηαζ ηδκ γφιδ (10 ηαζ 9 ακηίζημζπα), αθθά 4 απυ αοηέξ δζαεέημοκ ζδιακηζηά ιεβαθφηενα ιμνζαηά αάνδ (DRpp30, DRpp40, DRpp25, DRpp20, Πίλαθαο ), δζηαζμθμβχκηαξ έηζζ ηδ παιδθή ποηκυηδηα επζπμθήξ ημο εκγφιμο. Οζ πνςηεύκεξ ημο D. discoideum δζαεέημοκ ζδζμζοβηναζζαηά ζημζπεία, υπςξ πενζμπέξ παιδθήξ πμθοπθμηυηδηαξ πθμφζζεξ ζε αζπαναβίκδ, ενεμκίκδ ηαζ άθθα αιζκμλέα, εκχ μζ πνχηεξ θεζημονβζηέξ ιεθέηεξ θακενχκμοκ δζαθμνέξ ηαζ μιμζυηδηεξ ιε παναηηδνζζιέκεξ μιυθμβεξ οπμιμκάδεξ απυ άθθμοξ μνβακζζιμφξ. Βίκαζ θακενυ υηζ δ ελεθζηηζηή εέζδ ημο Dictyostelium ιπμνεί κα πανέπεζ ιζα κέα άπμρδ βζα ηδκ ανπζηεηημκζηή ημο ιαηνμιμνζαημφ ζοιπθυημο ηδξ RNase P ηαζ κα δχζεζ πμθφηζια ζημζπεία βζα ηδκ θοθμβεκεηζηή ελέθζλδ ημο ανπέβμκμο εκγφιμο ηαζ ημκ ειπθμοηζζιυ ημο ιε πνςηεύκεξ. ηδκ ενβαζία αοηή έβζκε πνμζπάεεζα κα παναηηδνζζηεί ιζα επζπθέμκ οπμιμκάδα, πένακ ηςκ ηνζχκ πνμδβμφιεκςκ ιεθεηδιέκςκ πνςηεσκχκ (DRpp20, DRpp30, DRpp40), δ DRpp29, μφηςξ χζηε κα δςεεί επζπθέμκ πθδνμθμνία βζα ηδκ μθμηθήνςζδ ηδξ ανπζηεηημκζηήξ ημο ιαηνμιμνζαημφ ζοιπθυημο ηδξ RNase P απυ ημ D. discoideum. Βπίζδξ, ε ζοκδοαζιυ ιε ηδκ ιεθέηδ ηδξ πνςηεύκδξ DRpp29, επυιεκμξ ζηυπμξ ηδξ ιεθέηδξ αοηήξ ήηακ μ πνμζδζμνζζιυξ ημο εθάπζζημο ηαηαθοηζημφ πονήκα αοημφ ημο εκγφιμο RNase P ηαζ παναηηδνζζιυξ ηςκ οπμιμκάδςκ πμο ημκ απμηεθμφκ. 96

98

99

100 Τιηθά θαη Μέζνδνη A. Τιηθά [α- 32 P] GTP (800 Ci/mmol, SBP-808) απυ IZOTOP [β- 32 P] ΏΣΡ (6000 Ci/mmol, SBP-501) απυ IZOTOP Acetic Acid (glacial) (MERCK, ) Acrylamide 2X (SERVA, 10675) Agar (SERVA, 11393) Agarose (INVITROGEN, ) Ammonium acetate (MERCK, ) Ammonium chloride (MERCK, ) Ammonium persulfate (APS) (SERVA, 13375) Ammonium sulfate (MERCK, ) Ampicillin (Na + Salt) (SERVA, 13399) Boric acid (MERCK, ) Bovine Serum Albumin (BSA) (SIGMA, A4503) Bradford reagent (SIGMA, B6916) 5-Bromo-4-chloro-3-indoyl-β-D-galactopyranoside (Υ-Gal) (SIGMA, B4252) Bromophenol blue (SIGMA, B7021) 2-Butanol (MERCK, ) Cesium sulfate (SIGMA, C5205) Chloramphenicol (SERVA, 16785) Citric acid monohydrate (MERCK, ) Coomassie brilliant blue R250 (MERCK, ) Coomassie brilliant blue G250 (MERCK, ) Deoxynucleotides (dntps) (SIGMA, DNTP100A) Diethylpyrocarbinol (DEPC) (SIGMA, D5758) Dimethyl Sulfoxide (DMSO) (SERVA, 39757) Ditheiothreitol (DTT) (SERVA, 20710) DNA MW Standard Marker (3407A) Ethanol (MERCK, ) Ethylendiaminetetra-acetic acid (EDTA) (SERVA, 11280) Formaldehyde 37% (MERCK, ) Formamide, deionized (SIGMA, F9037) 99

101 Τιηθά θαη Μέζνδνη Freund s complete adjuvant (SIGMA, F5881) Freund s incomplete adjuvant (SIGMA, F5506) D(+)-Glucose (MERCK, ) Gel Red Nucleic Acid Gel Stain (BIOTIUM, 41003) Glycerol (SERVA, 23176) Glycine (SERVA, 23390) Hydrochloride 37% (MERCK, ) Imidazole (ALDRICH, 49399) Immobilon-P transfer membranes (SIGMA, P2563) Isopropanol (MERCK, ) Isopropyl-1-thio-α-D-galactopyranoside (IPTG) (SERVA, 26600) Kanamycin A monosulfate (SIGMA, K0879) Magnesium chloride, hexahydrate (MERCK, ) Magnesium sulfate, heptahydrate (MERCK, ) α Mercaptoethanol (SERVA, 39563) Methanol (MERCK, ) N-N methylen bis acrylamide (SERVA, 29195) Nickel nitrilotriacetic acid (Ni-NTA) Agarose (QIAGEN, 30310) Nickel sulfate (MERCK, ) Nonidet P-40 (SIGMA, N6507) Peptone, casein HCl hydrolysate (SERVA, 48614) Peptone, pancreatic (SERVA, 48620) Peptone, tryptic (SERVA, 48600) Phenol/chloroform/isoamyl alcohol (25:24:1) (SERVA, 34566) Phenylmethylsulfonylfluoride (PMSF) (SERVA, 32395) Polyethylene glycol (MW 4000) (MERCK, ) Ponceau S (SERVA, 33429) Potassium chloride (MERCK, ) Precision Plus Protein Standards (BIO-RAD, ) Potassium dihydrogen phosphate (MERCK, ) di Potassium hydrogen phosphate (MERCK, ) Protein A Sepharose (SIGMA, P3391) 100

102 Τιηθά θαη Μέζνδνη Ribonucleotides triphosphates (PROMEGA, P1132, P1142, P1152, P1162) Silver nitrate (MERCK, ) Sodium chloride (MERCK, ) Sodium dodecyl sulfate (SDS) (ICN, ) Sodium di-hydrogen phosphate, monohydrate (MERCK, ) di Sodium hydrogen phosphate, (MERCK, ) Tetracyclin HCl (SERVA, 35866) N, N, N, N Tetramethylethylendiamine (TEMED) (SERVA, 35924) Tris hydroxylmethylaminomethane (SERVA, ) Triton X-100 (MERCK, ) Tween 20 (APPLICHEM, A1389) Urea (SERVA, 24540) Xylene cyanol (SERVA, 38503) Yeast extract (SERVA, 24540) Zeta probe membrane (BIO-RAD, ) Έλδπκα: Antarctic Phosphatase (NEB, M0289S) AMV reverse transcriptase (FINNZYMES, F-570) BamH1 (TAKARA, 1010S) DNase I (TAKARA, 2215A) Dynazyme II DNA polymerase (FINNZYMES, F-501) Dynazyme EXT DNA polymerase (FINNZYMES, F-505) EcoRI (TAKARA, 1040A) FokI (TAKARA, 1046A) Lysozyme (SIGMA, 62971) NdeI (TAKARA, 1161A) Ribonuclease A (AMBION, AM2274) Ribonuclease T1 (AMBION, AM2283) Ribonuclease H (TAKARA, 2150A) Ribonuclease V1 (AMBION, AM2275) RNasin (PROMEGA, N2111) 101

103 Τιηθά θαη Μέζνδνη SP6 RNA polymerase (TAKARA, 2520A) SpeI (NEB, R0133S) T4 DNA Ligase (TAKARA, 2011A) T7 RNA polymerase (TAKARA, 2540A) TaqI (PROMEGA, R6151) XhoI (TAKARA, 1094S) TNK T4 Nucleotide Kinase (TAKARA, 2021A) Αληηζώκαηα: Goat anti-mouse IgG peroxidase conjugated antibody (CHEMICON, AP124P) His-Tag monoclonal antibody, mouse IgG 1 (NOVAGEN, ) Goat anti-rabbit IgG horseradish peroxidase conjugated antibody (CHEMICON, AP132P) Βαθηεξηαθά ζηειέρε: DH5α subcloning efficiency competent cells [βμκυηοπμξ: F - θ80lacγαμ15 Α(lacΓΤ Ώ-argF)U169 deor reca1 enda1 hsdr17(r - k, m + k ) phoa supe44 thi-1 gyra96 rela1 θ - ] (INVITROGEN) XL1-Blue MRF [βμκυηοπμξ: Α(mcrA)183 Α(mcrCB-hsdSMR-mrr)173 enda1 supe44 thi-1 reca1 gyra96 rela1 lac [F proab lac1 q ZΓΜ15 Σn10 (Σet r )] ΒL21 (DE3) {βμκυηοπμξ: E. coli B F - dcm ompt hsds(r - B m - B ) gal ι (DE3)} BL21 (DE3) Rosetta [βμκυηοπμξ: E. coli F - ompt hsdsb(r - B, m - B ) gal dcm prare2 (Cam r )] BL21 (DE3) Codon Plus [βμκυηοπμξ: E. coli B F ompt hsds(r B, m B ) dcm+ Tetr gal ι(de3) enda Hte (argu iley leuw Cam r )] Πιαζκίδηα: puc19 (FERMENTAS, SD0061) pet-29c(+) (NOVAGEN, 69873) pdw98 (Waugh, D., 1989 PhD Thesis, Indiana University, Bloomington, IN.) psp64 Poly(A) (PROMEGA, P1241) 102

104 Τιηθά θαη Μέζνδνη Σα ζηεθέπδ ΐL21(DE3) ηαζ ημ πθαζιίδζμ pet-29c ήηακ ιζα εοβεκζηή πνμζθμνά ημο ηαεδβδηή η. Κςκ/κμο ΑναΎκα (Σιήια Υδιείαξ, Πακεπζζηήιζμ Εςακκίκςκ), εκχ ηα ζηεθέπδ BL21 (DE3) Rosetta BL21 (DE3) Codon Plus ημο ακαπθδνςηή ηαεδβδηή η. Κςκ/κμο ηαευπμοθμο (Σιήια Εαηνζηήξ, Πακεπζζηήιζμ Παηνχκ). Σμ pdw98 ηαζ ημ psp64 ήηακ ιζα πνμζθμνά ημο ηαεδβδηή Roland Hartmann. Κηη: ChemiLucent Western blot detection system (AMERSHAM, RPN2109) Mini Quick Spin Columns (ROCHE, ) Nucleospin Plasmid DNA Mini Prep (MACHEREY NAGEL) Nucleospin Extract II (MACHEREY NAGEL) Nucleospin RNA II (MACHEREY NAGEL) Genopure Plasmid Maxi Kit (ROCHE, ) TOPO TA Cloning kit (INVITROGEN, ) Δ cdna ημο ζηεθέπμοξ ΏΥ4 ημο Dictyostelium discoideum (πανήπεδ ζε ζφζηδια two hybrid ζε πθαζιίδζμ pgad424) ήηακ ιζα εοβεκζηή πνμζθμνά ημο Marc Vincelli (Dicty Stock Center Lab Technician Northwestern University Chicago). Γζα ηδ ζφκεεζδ ηδξ cdna αζαθζμεήηδξ πνδζζιμπμζήεδηε RNA πμο απμιμκχεδηε απυ ηφηηανα υθςκ ηςκ ζηαδίςκ ακάπηολδξ ημο D. discoideum. 103

105 Τιηθά θαη Μέζνδνη Β. Μέζνδνη 1. Καιιηέξγεηα D. discoideum Σα ηφηηανα ημο D. discoideum (ζηέθεπμξ ΏΥ2, DSMZ 1499) πμο πνδζζιμπμζήεδηακ ζηδκ πανμφζα ενβαζία πνμένπμκηαζ απυ ηδκ Deutsche Sammlung von Mikroorganism und Zellkulturen GmbH (DSMZ) ηαζ ηαθθζενβήεδηακ ζε απμζηεζνςιέκμ ενεπηζηυ ιέζμ HL-5 ζημοξ 23 C. Γζα ιαγζηή ηαθθζένβεζα ημο D. discoideum, δείβια ηδξ ιδηνζηήξ ηαθθζένβεζαξ ειαμθζάγεηαζ ζε 10 ml HL-5 ηαζ ηίεεηαζ οπυ ακάδεοζδ ζε ακαηζκμφιεκδ ηνάπεγα (orbital incubator). Δ ποηκυηδηα ηδξ ηαθθζένβεζαξ παναημθμοεείηαζ ιε ιέηνδζδ δείβιαημξ ζε αζιμηοηηυιεηνμ ηαζ υηακ θηάζεζ ηα ~4x10 6 cells/ml αναζχκεηαζ ζε δεηαπθάζζμ υβημ ενεπηζημφ ιέζμο. Δ δζαδζηαζία επακαθαιαάκεηαζ ιέπνζ δ ηαθθζένβεζα θηάζεζ ηα 10 L. Tα ηφηηανα ζοθθέβμκηαζ ιε θοβμηέκηνδζδ ζηα 3000 g βζα 5 min ζημοξ 4 C, υηακ δ ζοβηέκηνςζδ ημοξ θηάζεζ ηα ~6x10 6 cells/ml. Σα ζοθθεπεέκηα ηφηηανα επακαζςνμφκηαζ ζε ml νοειζζηζημφ δζαθφιαημξ θςζθμνζηχκ ηαζ θοβμηεκηνμφκηαζ λακά υπςξ πνμδβμοιέκςξ. Δ δζαδζηαζία απμδίδεζ πενίπμο 50 gr ηοηηάνςκ (κςπυ αάνμξ) ακά 10 L ηαθθζένβεζαξ. Θξεπηηθό κέζν HL-5: 14.3 gr/l peptone from meat, 7.1 gr/l yeast extract, 0.49 gr/l KH 2 PO 4, 0.64 gr/l Na 2 HPO 4 x 2H 2 O, 1% w/v βθοηυγδ, 250 mg/l αιπζηζθθίκδ, 50 mg/l ζηνεπημιοηίκδ, 15 mg/l ηεηναηοηθίκδ. Γηάιπκα θσζθνξηθώλ: 2 mm Na 2 HPO 4, 14,7 mm KH 2 PO Μεξηθόο θαζαξηζκόο RNase P από D. discoideum Οκνγελνπνίεζε θαη παξαιαβή θπηηαξηθνύ εθρπιίζκαηνο (S-100) Κφηηανα D. discoideum εκαζςνμφκηαζ ζε νοειζζηζηυ δζάθοια ΏΚ-50 (1 ml δζαθφιαημξ ακά βναιιάνζμ ηοηηάνςκ). Σμ εκαζχνδια μιμβεκμπμζείηαζ ιε ηδκ αμήεεζα βοάθζκςκ ζθαζνζδίςκ (glass beads) δζαιέηνμο 0.5 mm, ηα μπμία ακαιεζβκφμκηαζ ιε ημ εκαζχνδια ηςκ ηοηηάνςκ ζε ακαθμβία 1 gr ζθαζνζδίςκ ακά 1 ml εκαζςνήιαημξ ηοηηάνςκ. Σμ ζοκμθζηυ ιίβια ιεηαββίγεηαζ ζημ δμπείμ ημο ζθαζνυιοθμο (bead beater cell disruptor) ημ μπμίμ δζαηδνείηαζ ζημκ πάβμ. Σμ ιίβια ζθαζνζδίςκ-ηοηηάνςκ ακαδεφεηαζ αίαζα 10 θμνέξ βζα 1 min, ιε δζαθείιιαηα ηςκ 2 min, χζηε δ εενιμηναζία ημο μιμβεκμπμζήιαημξ κα δζαηδνδεεί ζημοξ 0 C. Σμ μιμβεκμπμίδια οπυηεζηαζ ζε δφμ δζαδμπζηέξ θοβμηεκηνήζεζξ ζηα 8000 g βζα 10 min ζημοξ 4 C, χζηε κα απαθθαπεεί απυ ηα ηοηηανζηά οπμθείιιαηα ηαζ ηα ηφηηανα πμο δεκ 104

106 Τιηθά θαη Μέζνδνη έπμοκ ζπάζεζ. Σμ κέμ οπενηείιεκμ θοβμηεκηνείηαζ ηεθζηά ζε g βζα 1 h ζημοξ 4 C. Σμ ηεθζηυ οπενηείιεκμ απμηεθεί ημ ηθάζια S-100. Γηάιπκα Α: 10 mm MgCl 2, 10% v/v βθοηενυθδ, 10 mm α-mercaptoethanol, 1 mm PMSF, 50 mm Tris-HCl, ph 8.0. Γηάιπκα ΑΚ-50: Ροειζζηζηυ δζάθοια Ώ, 50 mm KCl Υξσκαηνγξαθία αληνληναληαιιαγήο Πξνεηνηκαζία Γζα ηδκ παναζηεοή ηδξ ζηήθδξ DEAE-ηοηηανίκδξ (DEAE-cellulose, DE-52), πμζυηδηα πνςιαημβναθζημφ οθζημφ εκαζςνείηαζ ζε δζάθοια 10xΏΚ-50, ζε ακαθμβία 5 ml ακά gr ζηήθδξ ηαζ ακαδεφεηαζ ήπζα βζα 1 min. ηδ ζοκέπεζα ημ εκαζχνδια αθήκεηαζ κα δνειήζεζ ηαζ αθαζνείηαζ ημ οπενηείιεκμ, υπμο ανίζημκηαζ ζπαζιέκα ζςιαηίδζα ημο πνςιαημβναθζημφ οθζημφ. Δ δζαδζηαζία επακαθαιαάκεηαζ 3 θμνέξ. ημ ζηάδζμ αοηυ ιεηνμφιε ημ ph ημο οπενηεζιέκμο ηαζ νοειίγμοιε ζηδκ ηζιή 8.0. Δ ζηήθδ παηεηάνεηαζ ιε νμή 4 ml/min πνδζζιμπμζχκηαξ πενζζηαθηζηή ακηθία, ηαζ ελζζμννμπείηαζ ιε 5 υβημοξ δζαθφιαημξ ΏΚ-50 ζημοξ 4 C. Δ ελζζμννυπδζδ ηδξ ζηήθδξ εθέβπεηαζ ιε αβςβζιμιεηνία Υξσκαηνγξαθία θαη ζπιινγή θιαζκάησλ Σμ ηθάζια S-100 (30-40 ml) θμνηχκεηαζ ζηδ ζηήθδ (2 x 20 cm) ιε νμή 2 ml/min, εκχ ημ δζάθοια πμο δζένπεηαζ ηδξ ζηήθδξ ζοθθέβεηαζ (flow-through). Ώημθμοεεί έηπθοζδ ηδξ ζηήθδξ ιε 3 υβημοξ δζαθφιαημξ ΏΚ50 ηαζ ζοθθμβή ημο εηπθφιαημξ. Ώημθμφεςξ δ ζηήθδ εηθμφεηαζ ιε βναιιζηή ααειίδςζδ (linear gradient) ζοβηέκηνςζδξ mm KCl ζε νοειζζηζηυ δζάθοια Ώ ιε νμή 2 ml/min. οθθέβμκηαζ ηθάζιαηα ηαζ ζηδ ζοκέπεζα βίκμκηαζ μζ αηυθμοεμζ πνμζδζμνζζιμί: Πνμζδζμνζζιυξ ηδξ ζοβηέκηνςζδξ πνςηεύκδξ ιε ηδ ιέεμδμ BRADFORD Ώκίπκεοζδ δναζηζηυηδηαξ RNase P υπςξ εα πενζβναθεί ζηδ ζοκέπεζα Έθεβπμξ ηδξ βναιιζηυηδηαξ ηδξ ααειίδςζδξ ζοβηέκηνςζδξ KCl ιε αβςβζιμιεηνία Κθάζιαηα ιε δναζηζηυηδηα RNase P εηθμφμκηαζ ηοπζηά ζε ζοβηέκηνςζδ mm KCl. Σα ηθάζιαηα ιε εκγοιζηή δναζηζηυηδηα ζοβηεκηνχκμκηαζ, δζαπζδφμκηαζ ζε 5 L νοειζζηζημφ δζαθφιαημξ ΏΚ-50 ηαζ πνςιαημβναθμφκηαζ εη κέμο ηαζ ιε ημκ ίδζμ ηνυπμ ζε ζηήθδ DE

107 Τιηθά θαη Μέζνδνη Σα ηθάζιαηα ιε δναζηζηυηδηα απυ ηδ δεφηενδ ζηήθδ ακζμκημακηαθθαβήξ δζαεέημοκ ζηακμπμζδηζηυ ααειυ ηαεανυηδηαξ (πενίπμο 20 θμνέξ ζε ζπέζδ ιε ημ ηθάζια S-100) Υξσκαηνγξαθία θαηηνληναληαιιαγήο Σμ δναζηζηά ηθάζιαηα ακαιζβκφμκηαζ ηαζ δζαπζδφμκηαζ ζε 2 L νοεµζζηζημφ δζαθφµαημξ b ηαζ πνςµαημβναθμφκηαζ ζε ζηήθδ θςζθμηοηηανίκδξ (Phosphocellulose, P-11) Πξνεηνηκαζία Γζα ηδκ παναζηεοή ηδξ ζηήθδξ, πνςµαημβναθζηυ οθζηυ ακαδεφεηαζ ήπζα βζα 5 min µε 2.5 υβημοξ δζαθφµαημξ 0.5 M NaOH /gr ζηήθδξ. ηδ ζοκέπεζα, ημ εκαζχνδµα αθήκεηαζ κα δνεµήζεζ ηαζ αθαζνείηαζ ημ οπενηείµεκμ, υπμο ανίζημκηαζ ζπαζµέκα ζςµαηίδζα ημο πνςµαημβναθζημφ οθζημφ. Ώημθμοεεί λέπθοια ιε απμζηεζνςιέκμ H 2 O, ιέπνζξ υημο ημ ph ημο εκαζςνήιαημξ βίκεζ < 11. Έπεζηα πνμζηίεεκηαζ ζημ πνςιαημβναθζηυ οθζηυ 2.5 υβημζ δζαθφιαημξ 0.5 Μ HCl /gr ζηήθδξ. ημ ζηάδζμ αοηυ αημθμοεμφκηαζ ηα ίδζα αήιαηα πμο πνμακαθένεδηακ ιέπνζ ημ ph ημο οπενηεζµέκμο νοεµζζηεί ζε ηζµή < 3. Δ ζηήθδ παηεηάνεηαζ µε ηδ νμή ηδξ αανφηδηαξ ηαζ ελζζμννμπείηαζ µε 5 υβημοξ δζαθφµαημξ b ζημοξ 4 C. Δ ελζζμννυπδζδ ηδξ ζηήθδξ εθέβπεηαζ µε αβςβζµμµεηνία Υξσκαηνγξαθία θαη ζπιινγή θιαζκάησλ Σμ δζαπζδοιέκμ έηθμοια θμνηχκεηαζ ζηδ ζηήθδ µε ηδ νμή ηδξ αανφηδηαξ, εκχ ημ δζάθοµα πμο δζένπεηαζ ηδξ ζηήθδξ ζοθθέβεηαζ (flow-through). Ώημθμοεεί έηπθοζδ ηδξ ζηήθδξ µε 5 υβημοξ δζαθφµαημξ b ηαζ ζοθθμβή ημο εηπθφµαημξ. Ώημθμφεςξ, δ ζηήθδ εηθμφεηαζ µε βναµµζηή ααεµίδςζδ (linear gradient) ζοβηέκηνςζδξ mm NH 4 Cl ζε νοεµζζηζηυ δζάθοµα b. οθθέβμκηαζ ηθάζµαηα ηςκ 2 ml. Γηάιπκα b: 50 mm K 2 HPO 4 + KH 2 PO 4 ph 7.0, 1 mm DTT, 10% glycerol Αλίρλεπζε δξαζηηθόηεηαο RNase P Δ ακίπκεοζδ ηδξ εκγοιζηήξ δναζηζηυηδηαξ ηδξ RNase P απυ D. discoideum βίκεηαζ ιέζς ηδξ ακίπκεοζδξ ηςκ πνμσυκηςκ ηδξ ακηίδναζδξ ημο εκγφιμο ιε ημ πνυδνμιμ ηαηαζηαθηζηυ trna ηδξ ζενίκδξ απυ ημκ S. pombe (SupS1). Γζα ημ ζημπυ αοηυ 106

108 Τιηθά θαη Μέζνδνη παναζηεοάγμοιε ναδζεκενβά ζδιαζιέκo πνυδνμιμ trna, ιε ιεηαβναθή in vitro ημο βμκζδίμο ημο Mεηαγξαθή in vitro ηνπ γνληδίνπ ηνπ πξνδξόκνπ trna SupS1 Σμ βμκίδζμ ημο SupS1 ανίζηεηαζ ζε πθαζιίδζμ psp64, 3 ηαεμδζηά ημο οπμηζκδηή ηδξ SP6 RNA πμθοιενάζδξ. ημ 3 άηνμ ημο βμκζδίμο ανίζηεηαζ δ αθθδθμοπία ακαβκχνζζδξ ημο πενζμνζζηζημφ εκγφιμο TaqI. Δ ιεηαβναθή ημο βμκζδίμο ημο SupS1 ιε οπυζηνςια πθαζιίδζμ βναιιμπμζδιέκμ απυ TaqI ηενιαηίγεηαζ ηαεχξ δ SP6 RNA πμθοιενάζδ ζοκακηά ημ θοζζηυ ηέθμξ ημο βμκζδίμο (run off transcription). Πμζυηδηα πθαζιζδίμο psp64 απμιμκχκεηαζ, υπςξ εα πενζβναθεί παναηάης ( 3.8), ηαζ αημθμφεςξ βναιιμπμζείηαζ ζε ακηίδναζδ πμο πενζέπεζ ηα ελήξ: Ροειζζηζηυ δζάθοια Β (10x) 10 ιl Πθαζιίδζμ psp64 (0,5 ιg/ιl) 30 ιl TaqI (10 U/ιL) 5 ιl dd H 2 O 55 ιl Σμ ιίβια επςάγεηαζ ζημοξ 65 o C βζα 2 h. Σα πνμσυκηα ηδξ ακηίδναζδξ εθέβπμκηαζ ιε δθεηηνμθυνδζδ ζε πήηηςια αβανυγδξ 0,9% ηαζ παναηήνδζδ ζε θάιπα οπενζχδμοξ. Γζα ηδκ απμιάηνοκζδ ημο εκγφιμο δ ακηίδναζδ βναιιμπμίδζδξ οθίζηαηαζ εηπφθζζδ ιε πνμζεήηδ ίζμο υβημο δζαθφιαημξ θαζκυθδξ/πθςνμθμνιίμο/ζζμαιοθζηήξ αθημυθδξ (25: 24: 1), εκχ ημ βναιιμπμζδιέκμ πθαζιίδζμ psp64 παναθαιαάκεηαζ ηαεανυ ιεηά απυ ηαηαηνήικζζδ ιε 2.5 υβημοξ απυθοηδξ αζεακυθδξ ηαζ επχαζδ ζημοξ -20 μ C βζα 30 min. Σμ ίγδια ημο πθαζιζδίμο ακαδζαθφεηαζ ζε 30 ιl απμζηεζνςιέκμο dd H 2 O, επελενβαζιέκμ ιε DEPC. Γζα ηδκ ιεηαβναθή ημο βμκζδίμο ημο SupS1, πμζυηδηα βναιιμπμζδιέκμο πθαζιζδίμο psp64 πνμζηίεεηαζ ζε ακηίδναζδ ιεηαβναθήξ: Ροειζζηζηυ δζάθοια SP6 (10x) DTT 100 mm RNasin (2 U/ιL) Μίβια ATP,CTP,UTP (2,5 mm ημ ηαεέκα) GTP 0,1 mm Γναιιζηυ πθαζιίδζμ psp64 [α- 32 P]GTP (10 ιci/ιl>400 Ci/mMol) 4 ιl 2 ιl 0.5 ιl 5 ιl 2.5 ιl 3 ιl 2 ιl 107

109 Τιηθά θαη Μέζνδνη SP6 RNA πμθοιενάζδ (20 U/ιL) 1 ιl Σμ ιίβια επςάγεηαζ βζα 2 h ζημοξ 37 o C. Ώημθμφεςξ πνμζηίεεηαζ 1 ιl DNase I (5 U/ ιl) ηαζ ημ ιίβια επςάγεηαζ βζα άθθα 15 min ζημοξ 37 o C. Δ ακηίδναζδ ηενιαηίγεηαζ ιε πνμζεήηδ ίζμο υβημο 20 mm EDTA. ημ ιίβια πνμζηίεεκηαζ 5 ιl δζαθφιαημξ πνςζηζηχκ ηαζ δθεηηνμθμνείηαζ ζε απμδζαηαηηζηυ πήηηςια αηνοθαιζδίμο (PAGE) 10%-8 Μ μονίαξ. Δ δθεηηνμθυνδζδ πναβιαημπμζείηαζ ζε νοειζζηζηυ δζάθοια TBE. Δ γχκδ πμο ακηζζημζπεί ζημ πνυδνμιμ ιυνζμ trna βίκεηαζ μναηή ιε αοημναδζμβναθία, εηηέικεηαζ ηαζ εηθμφεηαζ ζε νοειζζηζηυ δζάθοια έηθμοζδξ (300 ιl) βζα 16 h (o/n) ζε εενιμηναζία δςιαηίμο. Δ έηθμοζδ επακαθαιαάκεηαζ ιε 100 ιl δζαθφιαημξ έηθμοζδξ βζα 2 hrs ζε εενιμηναζία δςιαηίμο, ηα δφμ δζαθφιαηα εκμπμζμφκηαζ ηαζ αημθμοεεί ηαηαηνήικζζδ ημο RNA ιε 2.5 υβημοξ απυθοηδξ αζεακυθδξ πανμοζία 1/10 ημο υβημο 3Μ μλζημφ καηνίμο ph 5.2 βζα 30 min ζημοξ -70 C. Σμ ίγδια παναθαιαάκεηαζ ιε θοβμηέκηνδζδ ζε επζηναπέγζα θοβυηεκηνμ ζηα g βζα 30 min ζημοξ 4 o C ηαζ αθαίνεζδ ημο οπενηεζιέκμο. Σμ ίγδια εηπθέκεηαζ ιε 70% αζεακυθδ ηαζ παναθαιαάκεηαζ ιε θοβμηέκηνδζδ, υπςξ πνζκ. Σέθμξ, ακαδζαθφεηαζ ιε 100 ιl απμζηεζνςιέκμ dd H 2 O επελενβαζιέκμ ιε DEPC ηαζ θοθάζζεηαζ ζημοξ -20 C. Δ ακηίδναζδ βζα ηδ ιεηαβναθή ιδ ζδιαζιέκμο SupS1 in vitro ζε ιεβάθδ ηθίιαηα πενζέπεζ: Ροειζζηζηυ δζάθοια SP6 (10x) 10 ιl DTT 100 mm 10 ιl RNasin (2 U/ιL) 2 ιl ATP,CTP,UTP, GTP (100 mm ημ ηαεέκα) 2 ιl Γναιιζηυ πθαζιίδζμ psp64 3 ιg SP6 RNA πμθοιενάζδ (20 U/ιL) 4 ιl Σμ ιίβια ζοιπθδνχκεηαζ ιε ddδ 2 Ο ιέπνζ ηεθζηυ υβημ 100 ιl. θα ηα ζοζηαηζηά πνμζεέημκηαζ ζε εενιμηναζία δςιαηίμο ηαζ ημ ιίβια επςάγεηαζ βζα 3 hrs ζημοξ 37 μ C. ηδ ζοκέπεζα πνμζεέημκηαζ 4 ιl DNase I βζα 15 min ζημοξ 37 μ C. Δ ακηίδναζδ ζηαιαηά ιε 10 ιl EDTA (200 mm) ηαζ πνμζηίεεηαζ επζπθέμκ 1 ιl ζδιαζιέκμο SupS1. Δ πμνεία ζηδ ζοκέπεζα πμο αημθμοεείηαζ βζα ηδκ παναθααή ημο ηαεανμφ SupS1 είκαζ ίδζα ιε αοηή πμο πνμακαθένεδηε βζα ηδκ παναθααή ημο ναδζεκενβά ζδιαζιέκμο οπμζηνχιαημξ. Γηάιπκα Δ: 60 mm Tris-HCl ph 7.5, 1 M NaCl, 60 mm MgCl 2, 10 mm DTT. Γηάιπκα SP6: 400 mm Tris-HCl ph 7.5, 60 mm MgCl 2, 10 mm ζπενιζδίκδ. 108

110 Τιηθά θαη Μέζνδνη Γηάιπκα ρξσζηηθώλ: 90% θμνιαιίδζμ, 0.05% bromophenol blue, 0.05% xylene cyanol. Γηάιπκα έθινπζεο: 10 mm Tris-HCl ph 7.5, 300 mm KCl, 1 mm EDTA Γνθηκή γηα ηελ αλίρλεπζε ελδπκηθήο δξαζηηθόηεηαο RNase P Γζα ηδκ ακίπκεοζδ εκγοιζηήξ δναζηζηυηδηαξ RNase P, δείβια απυ ηα οπυ ελέηαζδ ηθάζιαηα ακαιεζβκφεηαζ ζε ακηίδναζδ πμο πενζέπεζ ηα ελήξ: Ροειζζηζηυ δζάθοια CD (10x) SupS1 (~2 fmol/ιl, 10 cps) Αείβια απυ ηθάζια έηθμοζδξ RNase P Ώπμζηεζνςιέκμ ddδ 2 Ο 2 ιl 1 ιl 2 ιl 15 ιl Σμ ιίβια ηδξ ακηίδναζδξ επςάγεηαζ βζα 30 min ζημοξ 37 C. Δ ακηίδναζδ ηενιαηίγεηαζ ιε ηδκ πνμζεήηδ 5 ιl δζαθφιαημξ ηενιαηζζιμφ. Σα πνμσυκηα ηδξ ακηίδναζδξ ακαθφμκηαζ ζε απμδζαηαηηζηυ πήηηςια πμθοαηνοθαιζδίμο 10%-8Μ μονίαξ. Οζ γχκεξ πμο ακηζζημζπμφκ ζηα πνμσυκηα ηδξ ακηίδναζδξ βίκμκηαζ μναηέξ ιε αοημναδζμβναθία. Γηάιπκα CD : 50 mm Tris-HCl ph 7.6, 10 mm NH 4 Cl, 5 mm MgCl 2. Γηάιπκα ηεξκαηηζκνύ: 80% v/v θμνιαιίδζμ, 50 mm EDTA, 0.1% w/v xylene cyanol, 0.1% w/v bromophenol blue. 3. Κισλνπνίεζε ησλ γνληδίσλ drpp29 θαη drpp ρεδηαζκόο εθθηλεηώλ γηα ηα γνλίδηα drpp29 θαη drpp Αλαδήηεζε ζε ςεθηαθέο ηξάπεδεο δεδνκέλσλ Γζα ηδκ εφνεζδ κμοηθεμηζδζηχκ αθθδθμοπζχκ πμο πζεακχξ ηςδζημπμζμφκ πνςηεσκζηέξ οπμιμκάδεξ πμο ακήημοκ ζημ νζαμκμοηθεμπνςηεσκζηυ ζφιπθμημ ηδξ RNase P πναβιαημπμζήεδηε ακαγήηδζδ ζηδκ ηνάπεγα cdna αθθδθμοπζχκ ημο D. discoideum ( πνδζζιμπμζχκηαξ αθθδθμοπίεξ cdna πμο ηςδζημπμζμφκ ήδδ παναηηδνζζιέκεξ πνςηεσκζηέξ οπμιμκάδεξ ηδξ RNase P απυ άθθμοξ μνβακζζιμφξ. Γζα ημκ ίδζμ ζημπυ έβζκε πνήζδ ηαζ ηδξ ρδθζαηήξ ηνάπεγαξ ημο βμκζδζςιαηζημφ DNA ημο Dictyostelium ( Ο πεζνζζιυξ ηςκ αθθδθμοπζχκ έβζκε ηονίςξ ιε ηδ αμήεεζα ημο θμβζζιζημφ BioEdit ( εκχ ζηζξ δζαδζηηοαηέξ δζεοεφκζεζξ ηαζ 109

111 Τιηθά θαη Μέζνδνη bioinformatics.html οπάνπεζ πθδεχνα ζοκδέζιςκ βζα ενβαθεία ακάθοζδξ κμοηθεμηζδζηχκ ηαζ πεπηζδζηχκ αθθδθμοπζχκ. Γζα ημκ ζπεδζαζιυ εηηζκδηχκ πνδζζιμπμζήεδηε ημ θμβζζιζηυ PerlPrimer ( πμο ήηακ δοκαηυ πνμηζιήεδηακ εηηζκδηέξ κμοηθεμηζδίςκ, ιε ζδιείμ ηήλδξ C, πμο δζέεεηακ βμοακίκεξ ηαζ ηοημζίκεξ πενζζζυηενεξ απυ 40% ηαζ θζβυηενεξ απυ 60% ημο ζοκυθμο, ηαζ ηέθμξ 2 απυ ηα 3 ηεθεοηαία κμοηθεμηίδζα ζημ 3 άηνμ ημοξ είκαζ G ή C. ημκ πίκαηα πανμοζζάγμκηαζ μζ αθθδθμοπίεξ ηςκ εηηζκδηχκ ιε οπμβναιιζζιέκεξ ηζξ εέζεζξ πενζμνζζιμφ, δ εέζδ οανζδμπμίδζήξ ημοξ πάκς ζημ ακηίζημζπμ βμκίδζμ drpp29 ηαζ drpp21 ηαζ ημ ιέβεεμξ ηςκ πνμσυκηςκ πμο πνμηφπηεζ ζηδκ αθοζζδςηή ακηίδναζδ πμθοιενάζδξ (Polymerase Chain Reaction, PCR). Θέζε Έλδπκν Δθθηλεηήο Αιιεινπρία (5-3) πβξηδνπνίεζεο πεξηνξηζκνύ ζην γνλίδην drpp29f CATATG ATGAAAAAAATAATAAAAAAG Nde I 1 nt drpp29r CTCGAGTCATAATTCGATATTCTTACGAG Xho I 735 nt p21γ404f CATATGAATAATGAACAACTTGTAGTAA Nde I 267 nt p21r CTCGAGTAATTTGATTTGTCAGCCAATTT Xho I 651 nt p21f CATATGGTTCAGATAACAGTGTCTTCA NdeI 15 nt p21r CTCGAGTAATTTGATTTGTCAGCCAATTT Xho I 651 nt Πίνακας : Βηηζκδηέξ βζα ηα βμκίδζα drpp29 ηαζ drpp21. Πξντόλ 759 bp 404 bp 658 bp ρεδηαζκόο εθθηλεηώλ γηα ηε θισλνπνίεζε ησλ ηκεκάησλ ηνπ γνληδίνπ drpp29, δ75, δ155 θαη ntr Γζα ηδ δζελμδζηή ιεθέηδ ημο βμκζδίμο drpp29 ηαηαζηεοάζηδηακ ηνζα ηιήιαηά ημο, ηα δομ εη ηςκ μπμίςκ ηςδζημπμζμφκ πμθοπεπηίδζα πμο ειθακίγμοκ ιεβάθδ μιμζυηδηα ιε ηζξ μιυθμβεξ πνςηεύκεξ απυ ημκ άκενςπμ (δ75) ηαζ ηα ανπαία (δ155). Σμ ηνίημ ημιιάηζ πμο ηθςκμπμζήεδηε λεπςνζζηά ακηζζημζπεί ζημ 5 άηνμ ημο drpp29 (ntr) πμο ηςδζημπμζεί ημ άιζκμ ηεθζηυ άηνμ ηδξ Drpp29, ιζα αθθδθμοπία πμο παναηδνείηαζ απμηθεζζηζηά ζε αοηήκ ηδκ πνςηεύκδ ημο D. Discoideum. Γζα ηδκ ηθςκμπμίδζδ αοηχκ ηςκ ηιδιάηςκ ζπεδζάζηδηακ ηαηάθθδθμζ εηηζκδηέξ, μζ μπμίμζ πνδζζιμπμζήεδηακ βζα ηδκ εκίζποζδ ηςκ ημιιαηζχκ ιε ηδ ιέεμδμ ηδξ PCR. Χξ εηιαβείμ ιυνζμ πνδζζιμπμζήεδηε ημ ήδδ ηθςκμπμζδιέκμ ζε θμνέα έηθναζδξ βμκίδζμ drpp29. ημκ παναηάης πίκαηα θαίκμκηαζ μζ εηηζκδηέξ πμο ζπεδζάζηδηακ ηαζ πνδζζιμπμζήεδηακ βζα ηδκ εκίζποζδ ηςκ ηιδιάηςκ δ75, δ155 ηαζ ntr. 110

112 Τιηθά θαη Μέζνδνη Θέζε Έλδπκν Δθθηλεηήο Αιιεινπρία (5-3) πβξηδνπνίεζεο πεξηνξηζκνύ ζην γνλίδην δ75f CATATGGAGAATATAGATAAACCATTTGTA Nde I 225 nt δ75r CTCGAGTCATAATTCGATATTCTTACGAG Xho I 735 nt δ155f CATATG CCCGCTCTTGTAAATAAA Nde I 468 nt δ155r CTCGAGTCATAATTCGATATTCTTACGAG XhoI 735 nt ntrf CATATGATGAAAAAAATAATAAAAAAG NdeI 1 nt ntrr CTCGAGΣCΏCΏΣCΏΏCΣΏΣΏΣCΣΣΣCC Xho I 205 nt Πξντόλ 533 bp 293 bp 226 bp Πίνακας : Δθθηλεηέο γηα πνπ ρξεζηκνπνηήζεθαλ γηα ηελ ελίζρπζε ησλ ηκεκάησλ δ75, δ155 θαη ntr Απνκόλσζε γνληδησκαηηθνύ DNA από ην D. discoideum οθθέβμκηαζ πενίπμο ηφηηανα ιε θοβμηέκηνδζδ ζηα 1000 g βζα 5 min. Σμ ίγδια ηςκ ηοηηάνςκ ακαδζαθφεηαζ ζε 1 ml νοειζζηζημφ δζαθφιαημξ Ν, ημ μπμίμ είκαζ οπένημκμ ηαζ έηζζ δζαννδβκφμκηαζ μζ ηοηηανζηέξ ιειανάκεξ. ημ εκαζχνδια πνμζεέημκηαζ 200 ιl Triton X-100, αημθμοεεί επχαζδ 5 min ζημκ πάβμ ηαζ θοβμηέκηνδζδ βζα 5 min ζηα 2000 g βζα ηδκ παναθααή ημο ζγήιαημξ ηςκ πονήκςκ. Σμ ίγδια ακαδζαθφεηαζ ζε 300 ιl δζαθφιαημξ πνςηεσκάζδξ Κ ηαζ επςάγεηαζ βζα 20 min ζημοξ 65 μ C. Ώημθμοεεί εηπφθζζδ ιε πνμζεήηδ ίζμο υβημο δζαθφιαημξ θαζκυθδξ/πθςνμθμνιίμο/ζζμαιοθζηήξ αθημυθδξ (25:24:1) βζα ηδκ απμιάηνοκζδ ηςκ πνςηεσκχκ ημο ιίβιαημξ. Σα κμοηθεσηά μλέα ηαηαηνδικίγμκηαζ ιε πνμζεήηδ 2.5 υβηςκ αζεακυθδξ 100% ηαζ επχαζδ ζημκ πάβμ βζα 5 min. Ώημθμοεεί θοβμηέκηνδζδ ζηα g βζα 15 min ηαζ ακαδζάθοζδ ημο ζγήιαημξ ζε 50 ιl δζαθφιαημξ ΣΒ/RNase A ηαζ επχαζδ ζε εενιμηναζία δςιαηίμο βζα 10 min. ηδ ζοκέπεζα, ημ ηαεανυ πθέμκ βμκζδζςιαηζηυ DNA, ηαηαηνδικίγεηαζ ιε αζεακυθδ, υπςξ ήδδ πενζβνάθδηε, ηαζ ακαδζαθφεηαζ ζε 50 ιl νοειζζηζημφ δζαθφιαημξ ΣΒ. Δ πμζυηδηα ηαζ δ πμζυηδηα ημο απμιμκςεέκημξ DNA εθέβπεηαζ ιε δθεηηνμθυνδζδ ζε πήηηςια αβανυγδξ 0.8% ηαζ νοειζζηζηυ δζάθοια 1xΣΏΒ. Δ αηνζαήξ ζοβηέκηνςζδ ημο ηεθζημφ δζαθφιαημξ ζε DNA πζζημπμζείηαζ ιε θςημιέηνδζδ. Γηάιπκα Ν: 20 mm Tris-HCl ph 7.4, 5 mm MgOAc, 0,5 mm EDTA, 5% ζαηπανυγδ. Γηάιπκα πξσηετλάζεο Κ: 100 mm Tris-HCl ph 7.4, 5 mm EDTA, 0,1 mg/ml πνςηεσκάζδ Κ, 1% SDS, νφειζζδ ημο ph ζημ 7.5. Γηάιπκα ΣΔ: 10 mm Tris-HCl ph 8.0, 1 mm EDTA ph 8.0. Γηάιπκα ΣΔ/RNase A: TE, 0,1 mg/ml RNase A. Γηάιπκα 50xΣΑΔ: 2 Μ Tris, 1 Μ glacial acetic acid, 50 mm EDTA, ph

113 Τιηθά θαη Μέζνδνη Πνζνηηθόο πξνζδηνξηζκόο λνπθιετθώλ νμέσλ κε θσηνκέηξεζε Πμζυηδηα ημο δείβιαημξ κμοηθεσημφ μλέμξ αναζχκεηαζ ζε κενυ ή δζάθοια ΣΒ ηαζ θςημιεηνείηαζ ζε ηοαέηηα παθαγία. Μία ιμκάδα μπηζηήξ απμννυθδζδξ (Optical Density, OD) ζε ιήημξ ηφιαημξ 260 nm ακηζζημζπεί πενίπμο ζε 50 ιg/ml δίηθςκμο DNA, 40 ιg/ml ιμκυηθςκμο DNA ηαζ RNA ηαζ 20 ιg/ml βζα ιμκυηθςκα μθζβμκμοηθεμηίδζα. Ο ααειυξ ηδξ ηαεανυηδηαξ ημο δείβιαηυξ ιαξ απυ πνςηεύκεξ ή/ηαζ θαζκυθδ οπμδεζηκφεηαζ απυ ημ θυβμ ηςκ ηζιχκ ηδξ μπηζηήξ απμννυθδζδξ ζηα 260 nm ηαζ ζηα 280 nm (OD 260 /OD 280 ). Καεανά δείβιαηα DNA ηαζ RNA δίκμοκ ηζιέξ ~1.8 ηαζ ~2.0 ακηίζημζπα Αιπζηδσηή αληίδξαζε πνιπκεξάζεο (Polymerase Chain Reaction, PCR) Δ ιέεμδμξ ζοκίζηαηαζ ζηδκ εηθεηηζηή εκίζποζδ εκυξ ηιήιαημξ DNA ιε ηδκ δνάζδ ιζαξ εενιμακεεηηζηήξ DNA πμθοιενάζδξ ηαζ ηδ πνήζδ δφμ μθζβμκμοηθεμηζδίςκ (DNA εηηζκδηχκ). Ο κμδιαηζηυξ εηηζκδηήξ (sense, forward) οανζδμπμζείηαζ ιε ηδκ ακηζκμδιαηζηή αθοζίδα ημο βμκζδίμο ηαζ μνίγεζ ημ 5 άηνμ ημο οπυ εκίζποζδ ηιήιαημξ DNA, εκχ μ ακηζκμδιαηζηυξ εηηζκδηήξ (antisense, reverse) οανζδμπμζείηαζ ιε ηδκ κμδιαηζηή αθοζίδα ημο βμκζδίμο ηαζ μνίγεζ ημ 3 άηνμ. Χξ εηιαβείμ ιπμνεί κα πνδζζιμπμζδεεί βμκζδζςιαηζηυ DNA, πθαζιζδζαηυ DNA, δείβια απυ βμκζδζςιαηζηή ή cdna αζαθζμεήηδ, ή αηυια ηαζ απεοεείαξ οθζηυ ααηηδνζαηήξ απμζηίαξ (colony PCR). Γζα ηδκ εκίζποζδ ηιδιάηςκ DNA πνμηεζιέκμο κα ηθςκμπμζδεμφκ πνδζζιμπμζήεδηε δ πμθοιενάζδ DyNAzyme EXT (Finnzymes) δ μπμία δζαεέηεζ δναζηζηυηδηα δζμνεςηζηήξ ακάβκςζδξ (proofreading), χζηε κα εθαπζζημπμζείηαζ δ πζεακυηδηα εζζαβςβήξ ιεηαθθάλεςκ. Γζα ακηζδνάζεζξ νμοηίκαξ (δζαπίζηςζδ φπανλδξ αθθδθμοπίαξ ζε παναζηεφαζια DNA) πνδζζιμπμζήεδηε δ πμθοιενάζδ DyNAzyme II. Σμ ιίβια ηδξ ακηίδναζδξ (50 ιl) πενζέπεζ: 10x Dynazyme II ή ΒΥΣ νοει. δζάθοια 5 ιl 100 ιm dntps (ATP, CTP, GTP, TTP) 0.5 ιl απυ 10 mm 0,5 pmole απυ ηάεε εηηζκδηή 0.5 ιl απυ 25 pmole/ιl U DNA πμθοιενάζδ ιl απυ 1 U/ιL Δ ζοβηέκηνςζδ ημο Mg 2+ ζηδκ ακηίδναζδ παίγεζ ζδιακηζηυ νυθμ ζηδκ ακηίδναζδ, ηαεχξ επδνεάγεζ ηδκ δναζηζηυηδηα ηδξ πμθοιενάζδξ, αθθά ηαζ ηδκ πνυζδεζδ ηςκ εηηζκδηχκ ζηζξ ζοιπθδνςιαηζηέξ ημο αθθδθμοπίεξ. οκήεςξ ζοβηέκηνςζδ 1.5 mm δίκεζ ζηακμπμζδηζηά απμηεθέζιαηα. Γζα εηηζκδηέξ πμο έπμοκ ηάζδ κα οανζδμπμζμφκηαζ ζε παναπθήζζεξ αθθδθμοπίεξ ηαζ έηζζ κα δίκμοκ ιδ εζδζηά πνμσυκηα ιπμνμφιε κα 112

114 Τιηθά θαη Μέζνδνη πνδζζιμπμζήζμοιε ζοβηεκηνχζεζξ απυ 0.5 έςξ 1.5 mm. ε αοηήκ ηδκ πενίπηςζδ πνδζζιμπμζμφιε 10x δζάθοια ακηίδναζδξ πςνίξ Mg 2+ ηαζ ημ πνμζεέημοιε ελςηενζηά. Σμ πμζυ ημο DNA πμο πνμζηίεεηαζ ζηδκ ακηίδναζδ ιπμνεί κα πμζηίθθεζ απυ ng πθαζιζδζαημφ DNA, ιg βμκζδζςιαηζημφ DNA ή cdna αζαθζμεήηδξ, ή εθάπζζηδ πμζυηδηα ααηηδνζαηήξ απμζηίαξ πνμηεζιέκμο βζα PCR ιε οθζηυ απμζηίαξ (colony PCR). Δ ακηίδναζδ πναβιαημπμζείηαζ ζε εενιζηυ ηοηθμπμζδηή (thermal cycler) T-CY ή DNA Engine PTC-200. Δ ακηίδναζδ πςνίγεηαζ ζε δζαηνζηά ζηάδζα ιε δζαθμνεηζηή εενιμηναζία ηαζ δζάνηεζα επχαζδξ. Ώνπζηά ημ ιίβια επςάγεηαζ ζημοξ 95 C βζα 2-4 min χζηε κα απμδζαηαπηεί ημ δίηθςκμ DNA. ηδκ colony PCR ζημ αήια αοηυ δζαννδβκφμκηαζ ηα ααηηδνζαηά ηφηηανα ηαζ απεθεοεενχκεηαζ ημ βμκζδζςιαηζηυ DNA. ημ επυιεκμ ζηάδζμ δ ακηίδναζδ επςάγεηαζ δζαδμπζηά ζημοξ 94 C βζα 30 sec (απμδζάηαλδ), ζημοξ C βζα sec (οανζδμπμίδζδ εηηζκδηή), ηαζ ζημοξ C βζα sec (επζιήηοκζδ αθοζίδαξ). Σα ηνία αοηά αήιαηα επακαθαιαάκμκηαζ θμνέξ (ηφηθμζ) ηαζ ημ πνυβναιια ηδξ ακηίδναζδξ ηεθεζχκεζ ιε έκα ηεθζηυ αήια επζιήηοκζδξ πμο δζανηεί 10 min. Δ οανζδμπμίδζδ ηςκ εηηζκδηχκ βίκεηαζ ζε εενιμηναζία πενίπμο 3 C πζμ παιδθά απυ ηδ εενιμηναζία ηήλδξ ημοξ (Σ m ), δ μπμία ελανηάηαζ απυ ηδκ αθθδθμοπία. Δ εενιμηναζία επζιήηοκζδξ ελανηάηαζ απυ ηδκ T m ημο ζοκηζεέιεκμο DNA ηαζ ιπμνεί κα είκαζ απυ 65 C πνμηεζιέκμο βζα αθθδθμοπίεξ πθμφζζεξ ζε Ώ ηαζ Σ ιέπνζ 72 C πμο είκαζ δ αέθηζζηδ εενιμηναζία βζα ηδκ δναζηζηυηδηα ηδξ εενιμακεεηηζηήξ πμθοιενάζδξ. Γζα ηδκ δζάνηεζα ημο ζηαδίμο ηδξ επζιήηοκζδξ αημθμοεμφιε ημκ ηακυκα 1 min ακά 1 kb παναβυιεκμο DNA. Οζ ζοκεήηεξ ηδξ PCR βζα ηα ηνία γεφβδ εηηζκδηχκ πμο ακαθένεδζακ πζμ πάκς πανμοζζάγμκηαζ ζημκ αηυθμοεμ πίκαηα. Γεφβμξ Βηηζκδηχκ ΐήια Ώνπζηή απμδζάηαλδ drpp29 δ75 δ155 ntr δ C, 2 min 94 C, 4 min 94 C, 4 min 94 o C, 4 min 95 o C, 2 min Απνδηάηαμε* 94 C, 30 sec 94 C, 30 sec 94 C, 30 sec 94 C, 30 sec 95 o C, 30 sec Τβξηδνπνίεζε εθθηλεηή* 50 C, 45 sec 51 C, 45 sec 53 C, 45 sec 50 o C, 45 sec 50 o C, 45 sec Δπηκήθπλζε* 70 C, 1 min 70 C, 1 min 70 C, 1 min 70 o C, 1 min 67 o C, 1 min Σεθζηή επζιήηοκζδ 70 C, 10 min 70 C, 10 min 70 C, 10 min 70 o C, 10 min 67 o C, 10 min Πίνακας 3. 4: πλζήθεο PCR γηα δηάθνξνπο εθθηλεηέο. * Σα βήκαηα απηά επαλαιακβάλνληαη 30 θνξέο (θύθινη) πξνηνύ μεθηλήζεη ην βήκα ηεο ηειηθήο επηκήθπλζεο. 113

115 Τιηθά θαη Μέζνδνη 10x DyNAzyme EXT ξπζκ. δηάιπκα: 500 mm Tris-HCl ph 9.0, 15 mm MgCl 2, 150 mm (NH 4 ) 2 SO 4, 1% Triton X x DyNAzyme ΙΙ ξπζκ. δηάιπκα: 100 mm Tris-HCl ph 8.8, 15 mm MgCl 2, 500 mm KCl, 1% Triton X Αληίζηξνθε κεηαγξαθή αιπζηδσηή αληίδξαζε πνιπκεξάζεο (reverse transcription PCR) Απνκόλσζε νιηθνύ RNA Δ απμιυκςζδ μθζημφ RNA απυ ηφηηανα D. discoideum, έβζκε ιε πνήζδ ημο ηίη Nucleospin RNA II. Πενίπμο 5x10 6 ηφηηανα ζοθθέπεδηακ ηαζ μιμβεκμπμζήεδηακ ιε πνμζεήηδ 350 ιl δζαθφιαημξ RA1/3.5 ιl α-etsh ηαζ έκημκδ ακάδεοζδ ζημ vortex. Σμ ζλχδεξ ημο μιμβεκμπμζήιαημξ ιεζχεδηε ιε ηδ αμήεεζα θίθηνμο πμο πανείπε ημ ηζη. Ώημθμφεςξ, πνμζηέεδηακ 350 ιl 70% αζεακυθδξ ηαζ ημ ιίβια θμνηχεδηε ζε ζηήθδ δ μπμία δεζιεφεζ ημ RNA. Δ ζηήθδ θοβμηεκηνείηαζ βζα 45 sec ζηα g, ηαζ πνμζηίεεηαζ δζάθοια λεπθφιαημξ MDB ημ μπμίμ απμιαηνφκεζ ηδκ πενίζζεζα ηςκ αθάηςκ, χζηε δ επχαζδ ηδξ ζηήθδξ ιε δζάθοια DNase I ζημ επυιεκμ αήια κα βίκεζ ζηζξ αέθηζζηεξ ζοκεήηεξ. Δ επχαζδ ιε DNase I (15 min ζε εενιμηναζία δςιαηίμο, 5 min ζημοξ 37 C) αημθμοεείηαζ απυ έκα αήια λεπθφιαημξ ιε 250 ιl δζαθφιαημξ RA2 ηαζ δφμ αήιαηα ιε 600 ηαζ 250 ιl δζαθφιαημξ RA3. Σμ ηαεανυ RNA εηθμφεηαζ ιε πνμζεήηδ 60 ιl κενυ εθεφεενμ κμοηθεαζχκ ηαζ θοβμηέκηνδζδ ζηα g βζα 1 min. Σμ δείβια θςημιεηνείηαζ ( 3.3) βζα ημκ οπμθμβζζιυ ηδξ ζοβηέκηνςζδξ ημο παναζηεοάζιαημξ. Δ αηνζαήξ ζφζηαζδ ηςκ δζαθοιάηςκ RA1, RA2, RA3 δεκ δίκεηαζ απυ ηδκ εηαζνία RT-PCR Δ ακηίδναζδ ηδξ ακηίζηνμθδξ ιεηαβναθήξ ηαζ ηδξ αθοζζδςηήξ ακηίδναζδξ πμθοιενάζδξ βίκμκηαζ ζημ ίδζμ ζςθδκάηζ ηαεχξ ηα έκγοια AMV RT ηαζ DyNAzyme EXT έπμοκ ημζκυ νοειζζηζηυ δζάθοια. Σμ ιίβια ηδξ ακηίδναζδξ (50 ιl) πενζέπεζ: 10x νοει. Αζάθοια RobusT 5 ιl dntps 1 ιl (απυ 10 mm) drpp29r/ p21α404r ή drpp29f/ p21α404f 1 ιl (απυ 25 pmol/ιl) Αείβια μθζημφ RNA 500 ng-2 ιg DyNAzyme DNA πμθοιενάζδ 2 ιl (2 U) 114

116 Τιηθά θαη Μέζνδνη H 2 O (RNase free) ιέπνζ 50 ιl Σμ ιίβια επςάγεηαζ 4 min ζημοξ 70 C βζα κα απμδζαηαπηεί ημ RNA ηαζ αημθμφεςξ αθμφ ημ ιίβια απμηηήζεζ εενιμηναζία 42 C πνμζηίεεηαζ AMV ακηίζηνμθδ ιεηαβναθάζδ 1 ιl (20 U). Δ ακηίζηνμθδ ιεηαβναθή βίκεηαζ ζημοξ 42 C βζα 45 min, ηαζ ζηδ ζοκέπεζα αημθμοεεί ημ πνυβναιια ηδξ PCR βζα ημ γεφβμξ drpp29f/r ( 3.4). Δ αηνζαήξ ζφζηαζδ ημο δζαθφιαημξ 10Υ RobusT δεκ δίκεηαζ απυ ηδκ εηαζνία Ηιεθηξνθνξεηηθόο δηαρσξηζκόο θαη αλάθηεζε κνξίσλ DNA από πήθησκα αγαξόδεο Σα πνμσυκηα ηδξ ακηίδναζδξ δζαπςνίγμκηαζ ιε δθεηηνμθυνδζδ (5 V/cm βζα 2 hrs) ζε νοειζζηζηυ δζάθοια 1xΣΏΒ ηαζ πήηηςια αβανυγδξ 0.8% βζα ιυνζα DNA πάκς απυ 1000 bp, % βζα ιυνζα ιέπνζ 500 bp, ηαζ 2 % βζα ιυνζα DNA bp. Δ ακάηηδζδ ιμνίμο DNA απυ πήηηςια αβανυγδξ πναβιαημπμζείηαζ ιε πνήζδ ημο ηζη Nucleospin extract αημθμοεχκηαξ ηζξ μδδβίεξ ημο ηαηαζηεοαζηή. Δ επζεοιδηή γχκδ απμηυπηεηαζ απυ ημ πήηηςια ηαζ πνμζηίεεκηαζ ζ αοηυ 300 ιl δζαθφιαημξ ΝΣ1 ακά 100 mg πδηηχιαημξ. Σμ ιίβια εενιαίκεηαζ ζημοξ 50 C βζα 10 min ηαζ ακαδεφεηαζ χζηε δ αβανυγδ κα δζαθοεεί πθήνςξ, πανμοζία παμηνμπζημφ άθαημξ πμο πενζέπεηαζ ζημ δζάθοια NT1 (GuCl). Σμ δζάθοια θμνηχκεηαζ ζε εζδζηή ζηήθδ ηαζ αημθμοεεί θοβμηέκηνδζδ ζε επζηναπέγζα θοβυηεκηνμ ζηα g βζα 1 min. Σμ DNA δεζιεφεηαζ ζημ οθζηυ ηδξ ζηήθδξ ζε εθαθνχξ υλζκεξ ζοκεήηεξ ηαζ απμιαηνφκεηαζ δ δζαθοιέκδ αβανυγδ. ηδ ζοκέπεζα δ ζηήθδ εηπθέκεηαζ δζαδμπζηά ιε 600 ηαζ 200 ιl αθημμθμφπμο δζαθφιαημξ ΝΣ3 ημ μπμίμ απμιαηνφκεηαζ ιε θοβμηέκηνδζδ ζηα g βζα 1 ηαζ 2 min ακηίζημζπα. Σμ DNA εηθμφεηαζ ηάης απυ παιδθήξ ζζπφμξ ζμκηζηέξ ζοκεήηεξ ηαζ εθαθνχξ αθηαθζηυ ph ιε ηδκ πνμζεήηδ ζηδκ ζηήθδ 50 ιl δζαθφιαημξ ΝΒ, παναιμκή βζα 1 min ηαζ θοβμηέκηνδζδ ζηα g βζα 30 sec. Γηάιπκα ΝΔ: 5 mm Tris-HCl ph 8.5 Δ αηνζαήξ ζφζηαζδ ηςκ δζαθοιάηςκ ΝΣ1 ηαζ ΝΣ3 δεκ δίκεηαζ απυ ηδκ εηαζνία Κισλνπνίεζε ησλ πξντόλησλ ηεο PCR ζε πιαζκηδηαθό θνξέα pcr II TOPO. Δ εενιμακεεηηζηή DNA πμθοιενάζδ δζαεέηεζ δναζηζηυηδηα ηεθζηήξ ηνακζθενάζδξ, ακελάνηδηδξ οπμζηνχιαημξ, πάνζκ ηδξ μπμίαξ πνμζεέηεζ ιζα ιμκαδζηή δεμλο-αδεκμζίκδ ζηα 3 άηνα ηςκ πνμσυκηςκ ηδξ PCR. Ο βναιιζηυξ θμνέαξ pcrii TOPO δζαεέηεζ 115

117 Τιηθά θαη Μέζνδνη πνμελέπμκ (overhanging) ηαηάθμζπμ εοιίκδξ ζηα 3 άηνα ημο, χζηε κα είκαζ δοκαηή δ έκεεζδ πνμσυκημξ PCR (Δηθόλα ). Βπζπθέμκ μ θμνέαξ pcrii TOPO δζαεέηεζ ιυνζα ημπμζζμιενάζδξ Ε δεζιεοιέκα μιμζμπμθζηά ζηα 3 άηνα ιέζς ημο ηαηάθμζπμο ηονμζίκδξ ζηδ εέζδ 274. Δ ημπμζζμιενάζδ ιπμνεί κα ηαηαθφζεζ ηδκ ακηίδναζδ ζφκδεζδξ ημο 5 άηνμο ημο πνμσυκημξ PCR ιε ημ 3 άηνμ ημο θμνέα. Εικόνα : οκέκςζδ πνμσυκημξ PCR ιε θμνέα pcrii TOPO. Ο πθαζιζδζαηυξ θμνέαξ pcrii TOPO θένεζ ςξ ιάνηονεξ επζθμβήξ ημ βμκίδζμ ιζαξ α θαηηαιάζδξ (πνμζδίδεζ ακεεηηζηυηδηα ζηδκ αιπζηζθθίκδ), ηαζ ημ βμκίδζμ πμο πνμζδίδεζ ακηίζηαζδ ζηδκ ηακαιοηίκδ. Βπζπθέμκ, δ έκεεζδ ημο πνμσυκημξ ηδξ PCR βίκεηαζ εκηυξ ημο βμκζδίμο ηδξ α-βαθαηημζζδάζδξ, ιε ηέημζμ ηνυπμ χζηε ημ βμκίδζμ αοηυ κα απεκενβμπμζείηαζ. Έηζζ δίκεηαζ δ δοκαηυηδηα βζα επζθμβή θεοηχκ έκακηζ ιπθε απμζηζχκ. Σμ ιίβια ηδξ ακηίδναζδξ ζοκέκςζδξ (6 ιl) πενζέπεζ ηα ελήξ: Αζάθοια αθάηςκ 1 µl pcrii TOPO πθαζιζδζαηυξ θμνέαξ 1 µl Πνμσυκ PCR ( ng) 4 µl Ώημθμοεεί επχαζδ ζε εενιμηναζία δςιαηίμο (23 o C) βζα 5 έςξ 30 min. Γηάιπκα αιάησλ: 1.5 Μ NaCl, 100 mm MgCl Παξαζθεπή δεθηηθώλ θπηηάξσλ θαη κεηαζρεκαηηζκόο κε αλαζπλδπαζκέλν πιαζκίδην Σμ ακαζοκδοαζιέκμ πθαζιίδζμ εζζάβεηαζ ζε δεηηζηά ηφηηανα DH5a ή XL-1 blue ιε ηδ ιέεμδμ ημο ιεηαζπδιαηζζιμφ (transformation). Γζα ηδκ παναζηεοή δεηηζηχκ ηοηηάνςκ, 5 ml οβνμφ ενεπηζημφ ιέζμο LB ειαμθζάγμκηαζ ιε ιζηνή πμζυηδηα ηοηηάνςκ απυ stock βθοηενυθδξ ηαζ επςάγμκηαζ βζα 16 hrs ζημοξ 37 C. Δ ηαθθζένβεζα αοηή ζηδ ζοκέπεζα ιεηαββίγεηαζ ζε ηςκζηή θζάθδ ιε 200 ml οβνμφ ενεπηζημφ LB ηαζ ακαπηφζζεηαζ ιέπνζ δ μπηζηή απμννυθδζδ ημο εκαζςνήιαημξ ζηα 600 nm κα βίκεζ ~0.5. Σα ηφηηανα ζοθθέβμκηαζ ιε θοβμηέκηνδζδ ζηα 1000 g βζα 10 min. Σμ ίγδια ηςκ ηοηηάνςκ ακαδζαθφεηαζ ζε δζάθοια 116

118 Τιηθά θαη Μέζνδνη TSB υβημο ίζμ ιε ημ 1/10 ηδξ ηαθθζένβεζαξ απυ ηδκ μπμία απμιμκχεδηακ ηα ηφηηανα δδθαδή 20 ml. Ώημθμοεεί επχαζδ ζημκ πάβμ βζα 30 min. Σμ εκαζχνδια ηςκ ηφηηανςκ ζηδ ζοκέπεζα πςνίγεηαζ ζε πμζυηδηεξ ηςκ 250 ιl ηαζ απμεδηεφεηαζ ζημοξ -70 C ιέπνζ κα πνδζζιμπμζδεεί. Σα πνμσυκηα ηδξ ακηίδναζδξ ζοκέκςζδξ ακαιεζβκφμκηαζ ιε 250 ιl εκαζςνήιαημξ δεηηζηχκ ηοηηάνςκ ηαζ επςάγμκηαζ ζημκ πάβμ βζα 30 min. ηδ ζοκέπεζα, ημ εκαζχνδια οπυηεζηαζ ζε εενιζηυ ζμη (heat shock) βζα 60 sec ζημοξ 42 μ C. Ώημθμφεςξ, ημ εκαζχνδια ιεηαθένεηαζ βζα 2 min ζημκ πάβμ, πνμζηίεεκηαζ 750 ιl ενεπηζημφ ιέζμο SOC, ηαζ ηίεεηαζ οπυ ακάδεοζδ ζηα 225 rpm βζα 1 h ζημοξ 37 o C. ημ ζηάδζμ αοηυ ηα ηφηηανα πμο θένμοκ ημ πθαζιίδζμ ζοκεέημοκ ηα έκγοια πμο ημοξ πνμζδίδμοκ ακηίζηαζδ ζηα ακηζαζμηζηά επζθμβήξ. Σμ εκαζχνδια ηαηυπζκ θοβμηεκηνείηαζ ζε επζηναπέγζα θοβυηεκηνμ ζηζξ g ηαζ ηα ηφηηανα πμο ζοθθέβμκηαζ επζζηνχκμκηαζ ζε ηνοαθία LB άβαν/αιπζηζθθίκδ ή ηνοαθία LB άβαν/ηακαιοηίκδ ζηα μπμία έπμοκ επζζηνςεεί πνμδβμοιέκςξ ιε 20 ιl X-Gal. Σα ηνοαθία επςάγμκηαζ ζημοξ 37 μ C βζα 16 hrs. Μεηά ημ πέναξ ηςκ 16 hrs, παναηδνμφιε ηδκ ακάπηολδ ιπθε ηαζ θεοηχκ απμζηζχκ. Σα ααηηήνζα πμο ακαπηφζζμκηαζ πανμοζία ακηζαζμηζημφ θένμοκ πθαζιίδζμ. Οζ ιπθε απμζηίεξ μθείθμκηαζ ζημκ ιεηααμθζζιυ ημο X-Gal απυ ηδκ εκενβή α-βαθαηημζζδάζδ, άνα ηα ααηηήνζα αοηά θένμοκ επακαηοηθμπμζδιέκμ πθαζιίδζμ πςνίξ έκεεημ. Οζ θεοηέξ απμζηίεξ ακήημοκ ζηα ααηηήνζα πμο θένμοκ ημ ακαζοκδοαζιέκμ πθαζιίδζμ. Εηακυξ ανζειυξ (6-12) απμζηζχκ δμηζιάγμκηαζ ιε ηδκ ιέεμδμ colony PCR βζα κα δζαπζζηςεεί δ φπανλδ ηδξ αθθδθμοπίαξ ημο έκεεημο ζε αοηέξ. Ώπυ 2-4 εεηζηέξ θεοηέξ απμζηίεξ ειαμθζάγμκηαζ δφμ ηαθθζένβεζεξ ηςκ 5 ml ενεπηζημφ ιέζμο LB/αιπζηζθθίκδ ή LB/ηακαιοηίκδ, μζ μπμίεξ επςάγμκηαζ βζα 16 hrs ζημοξ 37 μ C. Γζα ηδκ δδιζμονβία ζημη βθοηενυθδξ βζα ηδκ ιαηνμπνυκζα θφθαλδ ηδξ απμζηίαξ, ζε 800 ιl απυ ηάεε ηαθθζένβεζα πνμζηίεεκηαζ 200 ιl 80% βθοηενυθδ ηαζ ημ ιίβια θοθάζζεηαζ ζημοξ -70 C (glycerol stock). Γηάιπκα TSB: LB, 10% PEG (4000), 5% DMSO, 10 mm MgCl 2, 10 mm Mg 2 SO 4 x7h 2 O. Θξεπηηθό κέζν SOC: 2% tryptone, 0.5% Yeast extract, 0.05% NaCl, 20 mm βθοηυγδ, 2.5 mm KCl, 10 mm MgCl 2. Θξεπηηθό κέζν LB: 1% tryptone, 1% NaCl, 0.5% Yeast extract. Θξεπηηθό κέζν LB/ακπηθηιιίλε: LB, 100 ιg/ml αιπζηζθθίκδ. Tξπβιία LB άγαξ: LB, 12gr/L άβαν. Tξπβιία LB άγαξ/ακπηθηιιίλε: LB/άβαν, 100 ιg/ml αιπζηζθθίκδ. Θξεπηηθό κέζν LB/θαλακπθίλε: LB, 50 ιg/ml ηακαιοηίκδ. 117

119 Τιηθά θαη Μέζνδνη Απνκόλσζε πιαζκηδίνπ από βαθηεξηαθή θαιιηέξγεηα Δ απμιυκςζδ πθαζιζδίμο ζε ιζηνή (mini prep) ή ιεβάθδ ηθίιαηα (maxi prep) βίκεηαζ πνδζζιμπμζχκηαξ ηα ηζη NucleoSpin Plasmid DNA ηαζ QIAGEN Plasmid Maxi Kit ακηίζημζπα. Ώπυ ημ stock βθοηενυθδξ ηδξ ααηηδνζαηήξ ηαθθζένβεζαξ ειαμθζάγμοιε ηνοαθίμ ιε ηαηάθθδθμ ακηζαζμηζηυ. Σμ ηνοαθίμ επςάγεηαζ βζα 16 hrs ζημοξ 37 μ C ηαζ αημθμφεςξ ειαμθζάγμοιε ιε ιμκαδζηή απμζηία 5 ml ενεπηζημφ ιέζμο LB ιε ηαηάθθδθμ ακηζαζμηζηυ. Δ ηαθθζένβεζα επςάγεηαζ βζα 16 hrs ζημοξ 37 μ C. Γζα ηδκ απμιυκςζδ ιζηνήξ πμζυηδηαξ πθαζιζδίμο (ιέπνζ 30 ιg) πνδζζιμπμζμφιε ηα 5 ml ηαθθζένβεζαξ ηαζ αημθμοεμφιε ημ πνςηυημθθμ βζα ημ ηζη NucleoSpin Plasmid. Γζα πμζυηδηα πθαζιζδίμο ιέπνζ 500 ιg πνδζζιμπμζμφιε 100 ml ηαθθζένβεζαξ βζα απμιυκςζδ ιε ημ QIAGEN Plasmid Maxi Kit Απνκόλσζε πιαζκηδίνπ ζε κηθξή θιίκαθα (mini prep) Σα ααηηδνζαηά ηφηηανα ζοθθέβμκηαζ ιε θοβμηέκηνδζδ ζηα g βζα 1 min ζε επζηναπέγζα θοβυηεκηνμ, απμιαηνφκεηαζ ημ οπενηείιεκμ ηαζ ημ ίγδια ακαδζαθφεηαζ ζε 250 ιl δζαθφιαημξ Ώ1 ιέπνζ πθήνμοξ ακαδζάθοζδξ. Σμ δζάθοια Ώ1 πενζέπεζ RNase A δ μπμία πέπηεζ ημ ααηηδνζαηυ RNA πμο εα απεθεοεενςεεί ιε ηδκ θφζδ ηςκ ηοηηάνςκ. Ώημθμφεςξ πνμζηίεεκηαζ 250 ιl δζαθφιαημξ Ώ2 ημ μπμίμ θφεζ ηα ηφηηανα. Σμ ιίβια ακαδεφεηαζ ήπζα βζα κα ιδκ ενοιιαηζζηεί ημ πνςιμζςιζηυ DNA ηαζ πνμμδεοηζηά δζαοβάγεζ ηαεχξ ηα ηφηηανα θφμκηαζ πμζμηζηά. ημ επυιεκμ αήια πνμζηίεεκηαζ 250 ιl δζαθφιαημξ Ώ3 ημ μπμίμ ελμοδεηενχκεζ ημ ζζπονά αθηαθζηυ πενζαάθθμκ πμο είπε δδιζμονβδεεί ζηα πνμδβμφιεκα αήιαηα. Οζ πνςηεύκεξ ηαζ ημ πνςιμζςιζηυ DNA ζε αοηυ ημ αήια ιεημοζζχκμκηαζ ηαζ πέθημοκ ζακ ίγδια ιε θοβμηέκηνδζδ ζηα g βζα 10 min ζε επζηναπέγζα θοβυηεκηνμ. Σμ οπενηείιεκμ, ζημ μπμίμ παναιέκεζ δζαθοιέκμ ημ πθαζιζδζαηυ DNA, θμνηχκεηαζ ζε εζδζηή ζηήθδ ηαζ αημθμοεεί θοβμηέκηνδζδ ζηα g βζα 1 min. Σμ πθαζιζδζαηυ DNA δεζιεφεηαζ έηζζ ζηδκ ζηήθδ ηαζ αημθμοεεί έηπθοζδ ημο ιε 600 ιl αθημμθμφπμο δζαθφιαημξ Ώ4 ηαζ θοβμηέκηνδζδ ζηα g βζα 2 min χζηε κα απμιαηνοκεεί πθήνςξ δ αθημυθδ απυ ηδ ζηήθδ. Σμ πθαζιζδζαηυ DNA εηθμφεηαζ ηάης απυ παιδθήξ ζζπφμξ ζμκηζηέξ ζοκεήηεξ ηαζ εθαθνχξ αθηαθζηυ ph ιε ηδκ πνμζεήηδ ζηδκ ζηήθδ 50 ιl δζαθφιαημξ ΏΒ, παναιμκή βζα 1 min ηαζ θοβμηέκηνδζδ ζηα g βζα 30 sec. Δ δζαδζηαζία απμδίδεζ ng/ιl πθαζιζδζαημφ DNA. Γηάιπκα ΑΔ: 5 mm Tris-HCl, ph

120 Τιηθά θαη Μέζνδνη Δ αηνζαήξ ζφζηαζδ ηςκ δζαθοιάηςκ Ώ1, Ώ2, Ώ3 ηαζ Ώ4 δεκ δίκεηαζ απυ ηδκ εηαζνία Απνκόλσζε πιαζκηδίνπ ζε κεγάιε θιίκαθα (maxi prep) Δ ιέεμδμξ ααζίγεηαζ μοζζαζηζηά ζηζξ ίδζεξ ανπέξ ιε ηδκ απμιυκςζδ πθαζιζδίμο ζε ιζηνή ηθίιαηα. Σμ πνςηυημθθμ ηδξ ιεευδμο απμηεθεί ιζα παναθθαβή ημο πνςημηυθθμο πμο πενζβνάθδηε ζηδκ πανάβναθμ βζα ιζηνμφξ υβημοξ. 4. Τπεξέθθξαζε ηνπ γνληδίνπ drpp29, δ404 θαη ησλ ηκεκάησλ δ75, δ155 θαη ntr Σα βμκίδζα εζζάβμκηαζ ζε θμνείξ οπενέηθναζδξ, μζ μπμίμζ ηςδζημπμζμφκ ελαπεπηίδζα ζζηζδζκχκ πμο εζζάβμκηαζ ζημ ηαναυλο-ηεθζηυ άηνμ ηςκ ακαζοκδοαζιέκςκ πμθοπεπηίδίςκ. Μέζς ημο επζηυπμο αοημφ βίκεηαζ δοκαηή δ ακίπκεοζδ ηςκ πμθοπεπηζδίςκ ιε ημ ηαηάθθδθμ ακηίζςια, ηαζ δ απμιυκςζή ημοξ απυ ηοηηανζηά εηποθίζιαηα ιε πνςιαημβναθία ζοββεκείαξ Τπνθισλνπνίεζε ζε θνξέα έθθξαζεο θαη κεηαζρεκαηηζκόο δεθηηθώλ BL21(DE3)Codon plus, BL21(DE3) θαη BL21(DE3)Rosetta DRpp29 θαη Γ404 Πναβιαημπμζχκηαξ RT-PCR ιε ημ γεφβμξ εηηζκδηχκ drpp29f/r ( 3.10) παναθαιαάκμοιε ημ βμκίδζμ drpp29 ιε ηζξ αθθδθμοπίεξ πενζμνζζιμφ βζα ηα έκγοια NdeI ηαζ XhoI ζημ 5 ηαζ 3 άηνμ ακηίζημζπα, χζηε κα εζζαπεεί ζε θμνέα οπενέηθναζδξ pet29c(+). Σμ πνμσυκ ηθςκμπμζείηαζ ζε θμνέα pcrii TOPO, υπςξ έπεζ πενζβναθεί. Έηζζ, δδιζμονβείηαζ ημ pcrii/drpp29. Ώημθμοεεί δζπθή πέρδ ημο pcrii/drpp29 ηαζ ημο θμνέα pet29c(+) ηαζ ακηίδναζδ ζφκδεζδξ βζα ηδκ παναθααή ημο pet29c(+)/drpp29. Δ ηάεε ιζα ακηίδναζδ πενζέπεζ ηα ελήξ: Ροειζζηζηυ δζάθοια 10xH 4 ιl NdeI 10U/ιL 1 ιl XhoI 10U/ιL 1 ιl Plasmid DNA 10 ιg ddh 2 O sterile ιέπνζ ηεθζημφ υβημο 40 ιl Ώημθμοεεί επχαζδ βζα 2 hrs ζημοξ 37 o C. 119

121 Τιηθά θαη Μέζνδνη ηδ πενίπηςζδ ημο pcrii/drpp29 ηαζ επεζδή ημ βμκίδζμ πενζέπεζ εζςηενζηή εέζδ πενζμνζζιμφ ημο εκγφιμο NdeI πναβιαημπμζήεδηε ιενζηή πέρδ ημο πθαζιζδίμο ιε ημ NdeI (βζα πενίπμο 15 θεπηά). Σα πνμσυκηα δθεηηνμθμνμφκηαζ ζε πήηηςια αβανυγδξ βζα ημκ έθεβπμ ηδξ ακηίδναζδξ ηαζ ημκ δζαπςνζζιυ ηςκ πνμσυκηςκ. Οζ γχκεξ πμο ακηζζημζπμφκ ζημ βναιιζηυ πθαζιίδζμ pet29c(+) ηαζ ζημ έκεεημ drpp29 ιε ημθθχδδ άηνα απμιμκχκμκηαζ υπςξ πενζβνάθδηε ( 3.6) ηαζ πνδζζιμπμζμφκηαζ ζε ακηίδναζδ ζοκέκςζδξ βζα ηδ δδιζμονβία ακαζοκδοαζιέκμο pet29c(+)/drpp29. Δ Σ4 DNA θζβάζδ ηαηαθφεζ ημκ ζπδιαηζζιυ θςζθμδζεζηενζημφ δεζιμφ ιεηαλφ 3 -ΟΔ ηαζ 5 -Ρ άηνςκ. Σμ ιίβια ηδξ ακηίδναζδξ πενζθαιαάκεζ ηα ελήξ: drpp29 20 ng/ιl pet29c(+) 40 ng/ιl T4 DNA Ligase (350 U/ιL) 10x T4 DNA Ligase Buffer 4ιL 4ιL 1ιL 1ιL Ώημθμοεεί επχαζδ ζημοξ 16 C βζα 16 hrs. Σα πνμσυκηα ηδξ ακηίδναζδξ ζοκέκςζδξ πνδζζιμπμζμφκηαζ βζα ιεηαζπδιαηζζιυ δεηηζηχκ DH5a ηαζ ημ ακαζοκδοαζιέκμ pet29c(+)/drpp29 απμιμκχκεηαζ απυ ιεηαζπδιαηζζιέκα ηφηηανα ζε ιζηνή ηθίιαηα, υπςξ πενζβνάθδηε ( 3.9.1). 50 ng πθαζιζδίμο pet29c(+)/drpp29 πνδζζιμπμζμφκηαζ βζα ημ ιεηαζπδιαηζζιυ δεηηζηχκ BL21(DE3)Codon plus, ηα μπμία πανάβμκηαζ ζφιθςκα ιε ηδ δζαδζηαζία πμο πενζβνάθδηε ζηδκ πανάβναθμ 3.8. Σα δεηηζηά ηφηηανα BL21(DE3)Codon plus πενζέπμοκ επζπθέμκ ακηίβναθα trna βμκζδίςκ πμο ακαβκςνίγμοκ ηα ηςδίηζα ηδξ ανβζκίκδξ AGA ηαζ AGG, ηδξ ζζμθεοηίκδξ AUA ηαζ ηέθμξ ηδξ θεοηίκδξ CUA. Δ έθθεζρδ αοηχκ ηςκ ηςδζηίςκ απμηεθεί ημκ πζμ ζοπκυ πενζμνζζιυ ηδξ ιεηάθναζδξ εηενυθμβςκ πνςηεσκχκ ζε ζηεθέπδ E. coli. Σμ βμκίδζμ ημο drpp29 πενζέπεζ δφμ ηςδίηζα ανβζκίκδξ AGG ηαζ βζ αοηυ ημ θυβμ πνδζζιμπμζήεδηε αοηυ ημ ζηέθεπμξ βζα οπενέηθναζδ ηδξ DRpp29. Σα ιεηαζπδιαηζζιέκα ηφηηανα επζζηνχκμκηαζ ζε ηνοαθία LB/πθςναιθαζκζηυθδηακαιοηίκδ (ημ πθαζιίδζμ pet29c(+) πνμζδίδεζ ακεεηηζηυηδηα ζηδκ ηακαιοηίκδ) ηαζ απυ ηζξ απμζηίεξ πμο ακαπηφζζμκηαζ επζθέβμκηαζ μζ πζμ εοιεβέεεζξ βζα ημ επυιεκμ αήια, πμο είκαζ δ έηθναζδ ημο ακαζοκδοαζιέκμο βμκζδίμο. Δ ζδζα δζαδζηαζία αημθμοεείηαζ βζα ηδκ ηθςκμπμίδζδ ημο βμκζδίμο δ404 ιε ημοξ ακηίζημζπμοξ εηηζκδηέξ ( 3.1.1) ιε ιυκδ δζαθμνά υηζ δ οπενέηθναζδ ημο βμκζδίμο πναβιαημπμζείηαζ ζε ηφηηανα BL21(DE3). Θξεπηηθό κέζν LB/θαλακπθίλε - ρισξακθαηληθόιε: LB, 50 ιg/ml ηακαιοηίκδ, 25 ιg/ml πθςναιθαζκζηυθδ. 120

122 Τιηθά θαη Μέζνδνη Ρπζκηζηηθό δηάιπκα 10xH: 500 mm Tris-HCl ph 7.5, 100 mm MgCl 2, 10 mm DTT, 1 M NaCl. Ρπζκηζηηθό δηάιπκα 10x T4 DNA Ligase: 660 mm Tris-HCl ph 7.6, 66 mm MgCl 2, 100 mm DTT, 1 mm ATP Γ75, Γ155 θαη NTR Πναβιαημπμζχκηαξ PCR ιε ημ γεφβμξ εηηζκδηχκ δ75f/δ75r ηαζ εηιαβείμ ημ πθαζιζδζαηυ DNA pet29c(+)/drpp29 πνμηφπηεζ ημ δ75 ιε ηζξ αθθδθμοπίεξ ακαβκχνζζδξ ηςκ πενζμνζζηζηχκ εκγφιςκ NdeI ηαζ XhoI ζημ 5 ηαζ 3 άηνμ ημο ακηίζημζπα. Σμ πνμσυκ ηδξ PCR ηαεανίγεηαζ ηαζ ηθςκμπμζείηαζ ζε θμνέα pcrii TOPO, υπςξ πενζβνάθδηε ζηζξ παναβνάθμοξ 3.6 ηαζ 3.7, ακηίζημζπα. Σμ ακαζοκδοαζιέκμ πθαζιίδζμ (pcrii/δ75) πμθθαπθαζζάγεηαζ ιε ιεηαζπδιαηζζιυ δεηηζηχκ ηοηηάνςκ DH5a ηαζ απμιμκχκεηαζ απυ ιεηαζπδιαηζζιέκα ηφηηανα, υπςξ πενζβνάθδηε ζηζξ παναβνάθμοξ Ώημθμοεεί δζπθή πέρδ ημο ακαζοκδοαζιέκμο πθαζιζδίμο ηαζ ημο pet29c(+) ιε ηα έκγοια NdeI ηαζ XhoI, υπςξ αηνζαχξ πενζβνάθδηε παναπάκς ( 4.1.1). Πμζυηδηα 50 ng ακαζοκδοαζιέκμο pet29c(+) (μ υβημξ ημο δζαθφιαημξ πμο πενζέπεζ ημ πθαζιίδζμ δεκ πνέπεζ κα είκαζ ιεβαθφηενμξ απυ 5% ημο υβημο ημο εκαζςνήιαημξ ηςκ ηοηηάνςκ) ακαιεζβκφεηαζ ιε 100 ιl δεηηζηχκ BL21(DE3)Codon plus ( 3.7) ηαζ αημθμοεεί ιεηαζπδιαηζζιυξ. Οζ ακηζδνάζεζξ ιεηαζπδιαηζζιμφ επζζηνχκμκηαζ ζε ηνοαθία LB άβαν/ ηακαιοηίκδ/ πθςναιθαζκζηυθδ [ημ ζηέθεπμξ BL21(DE3)Codon plus είκαζ ακεεηηζηυ ζηδκ πθςναιθαζκζηυθδ]. Γζα ηδκ επζαεααίςζδ ημο επζηοπμφξ ιεηαζπδιαηζζιμφ πναβιαημπμζμφιε colony PCR ιε ημ γεφβμξ εηηζκδηχκ δ75f/δ75r ζηζξ απμζηίεξ πμο ακαπηφζζμκηαζ ζηα ηνοαθία ιεηά απυ επχαζδ ζημοξ 37 o C βζα 16 hrs. Δ ίδζα δζαδζηαζία αημθμοεείηαζ βζα ηδκ οπμηθςκμπμίδζδ ηςκ ηιδιάηςκ δ155 ηαζ ntr ζημ θμνέα έηθναζδξ pet29c(+) Δπαγσγή ηεο έθθξαζεο ησλ αλαζπλδπαζκέλσλ γνληδίσλ Σα ζηεθέπδ BL21(DE3)Codon plus ηαζ BL21(DE3) είκαζ θοζζβμκζηά ημο ααηηδνζμθάβμο DE3, δζαεέημοκ δδθαδή εκζςιαηςιέκμ ζημ πνςιυζςιά ημοξ ημ πνςιυζςια ημο θάβμο ημ μπμίμ θένεζ ημ βμκίδζμ ηδξ Σ7 RNA πμθοιενάζδξ ηάης απυ ηδκ νφειζζδ ημο οπμηζκδηή lacuv5. Ο οπμηζκδηήξ lacuv5 εκενβμπμζείηαζ απυ ηδκ πανμοζία IPTG ηαζ επάβεηαζ έηζζ δ ιεηαβναθή ηαζ δ έηθναζδ ημο βμκζδίμο ηδξ Σ7 RNA πμθοιενάζδξ. Δ παναβυιεκδ Σ7 RNA πμθοιενάζδ ακαβκςνίγεζ ηαζ πνμζδέκεηαζ ζημκ οπμηζκδηή ηδξ πμο ανίζηεηαζ ζημ pet29c(+) ακμδζηά ημο ακαζοκδοαζιέκμο βμκζδίμο ηαζ 121

123 Τιηθά θαη Μέζνδνη ημ ιεηαβνάθεζ. Δ παναβυιεκδ ακαζοκδοαζιέκδ πνςηεύκδ ιπμνεί εεςνδηζηά κα θηάζεζ ηαζ ημ 50% ηδξ ζοκμθζηήξ πνςηεύκδξ ημο ααηηδνζαημφ ηοηηάνμο. Μεηαζπδιαηζζιέκα ηφηηανα BL21(DE3)Codon plus ή BL21(DE3) ηαθθζενβμφκηαζ ζε οβνυ ενεπηζηυ LB υβημο 150 ml ιε ηα ηαηάθθδθα ακηζαζμηζηά ζημοξ 37 C, ιέπνζ δ OD 600 κα βίκεζ ~0.5. ηδ ζοκέπεζα πνμζηίεεηαζ δζάθοια IPTG ζε ηεθζηή ζοβηέκηνςζδ 1 mm. Γζα κα δζαπζζηςεεί ακ δ εενιμηναζία ζηδκ μπμία βίκεηαζ δ επαβςβή επδνεάγεζ ηδκ έηθναζδ πμζμηζηά ή/ηαζ πμζμηζηά, δ ανπζηή πμζυηδηα ηςκ 150 ml πςνίγεηαζ ζε ηνεζξ πμζυηδηεξ ηςκ 50 ml ηαζ δ επχαζδ ζοκεπίγεηαζ βζα 4-8 h ζημοξ 23 C, 30 C ηαζ 37 C. Κάεε ιζα χνα ζοθθέβεηαζ πμζυηδηα 2 ml βζα κα εθεβπεεί ζηδ ζοκέπεζα δ πμνεία ηδξ έηθναζδξ ζε ζπέζδ ιε ημ πνυκμ. Σα ηφηηανα ζημ ηέθμξ ηδξ επχαζδξ ζοθθέβμκηαζ ιε θοβμηέκηνδζδ ζηα 5000 g βζα 5 min ζημοξ 4 o C. Ώπυ 50 ml ηαθθζένβεζαξ ζοθθέβμκηαζ πενίπμο 0.4 gr ηφηηανα, ηα μπμία πςνίγμκηαζ ζηα δφμ. Σμ ίγδια ηςκ ηοηηάνςκ θοθάζζεηαζ ζημοξ -20 o C ιέπνζ κα μιμβεκμπμζδεεί. Γηάιπκα IPTG: 2.38 gr IPTG/100 ml (100 mm) Αλίρλεπζε ησλ αλαζπλδπαζκέλσλ πνιππεπηηδίσλ κε ειεθηξνθόξεζε ζε απνδηαηαθηηθό πήθησκα SDS/πνιπαθξπιακηδίνπ θαη αλάιπζε θαηά western Ζιεθηξνθόξεζε ζε πήθησκα SDS/πνιπαθξπιακηδίνπ Αείβια εηποθίζιαημξ μθζηήξ πνςηεύκδξ εημζιάγεηαζ ιε πνμζεήηδ 300ιL 2x Sample Buffer ζε ιζηνή πμζυηδηα ζγήιαημξ ηοηηάνςκ απυ ηα πνμδβμφιεκα αήιαηα. Σα δείβιαηα ανάγμοκ ζημοξ 100 o C βζα 10 min ηαζ ζηδ ζοκέπεζα θοβμηεκηνμφκηαζ βζα κα απμιαηνοκεμφκ ηα ηοηηανζηά οπμθείιιαηα ζηα g βζα 5 min. Σα δείβιαηα δθεηηνμθμνμφκηαζ ζε απμδζαηαηηζηυ πήηηςια SDS/πμθοαηνοθαιζδίμο (SDS-PAGE). Σμ ακχηενμ ιένμξ ημο πδηηχιαημξ (πήηηςια παηεηανίζιαημξ, stacking gel) είκαζ πενζεηηζηυηδηαξ 4% ζε αηνοθαιίδζμ ηαζ έπεζ ph 6.8. Δ πενζεηηζηυηδηα ημο ηαηχηενμο ιένμοξ ημο πδηηχιαημξ (πήηηςια δζαπςνζζιμφ, separating gel) ελανηάηαζ απυ ημ εφνμξ ιμνζαηχκ αανχκ ηςκ πνςηεσκχκ βζα ημ μπμίμ ημ πήηηςια επζεοιμφιε κα έπεζ ηδκ ιέβζζηδ δζαπςνζζηζηή ζηακυηδηα, εκχ ημ ph είκαζ 8.8. Γζα ημκ αέθηζζημ δζαπςνζζιυ πνςηεσκχκ ιε ιμνζαηά αάνδ απυ 20 έςξ 90 kda ημ δζαπςνζζηζηυ πήηηςια πνέπεζ κα είκαζ 10 %, εκχ βζα εφνμξ 10 έςξ 50 kda δ πενζεηηζηυηδηα πνέπεζ κα είκαζ 16 %. Οζ δζαζηάζεζξ ημο πδηηχιαημξ είκαζ 7 cm x 9 cm x 1 mm ηαζ δ δθεηηνμθυνδζδ βίκεηαζ ζηα 120V βζα 2 hrs. 122

124 Τιηθά θαη Μέζνδνη 2x Sample Buffer: 90 mm Tris HCl ph 6.8, 20% βθοηενυθδ, 2% SDS, 0.02% bromo-phenol blue, 0.1 M DTT. Ρπζκηζηηθό δηάιπκα ειεθηξνθόξεζεο: 192 mm βθοηίκδ, 25 mm Tris, 0.1% SDS Υξώζε κε Coomassie Brilliant Blue Μεηά ημ πέναξ ηδξ δθεηηνμθυνδζδξ αθαζνμφιε ημ πήηηςια δζαπςνζζιμφ ηαζ ημ θένμοιε ζε δζάθοια πνχζδξ (staining solution) Coomassie Brilliant Blue. Σμ δζάθοια εενιαίκεηαζ εθαθνχξ βζα 10 min ηαζ ζηδ ζοκέπεζα ημ πήηηςια ηαηενβάγεηαζ ιε δζάθοια απμπνςιαηζζιμφ 1 h οπυ ακάδεοζδ βζα ηδκ ειθάκζζδ ηςκ πνςηεσκζηχκ γςκχκ. Γηάιπκα ρξώζεο: 1gr/L Coomassie Brilliant Blue, 48% ιεεακυθδ, 10% μλζηυ μλφ. Γηάιπκα απνρξσκαηηζκνύ: 45% ιεεακυθδ, 10% μλζηυ μλφ Υξώζε κε άξγπξν Σμ πήηηςια δζαπςνζζιμφ επςάγεηαζ βζα πενζζζυηενμ απυ 1 h ζε δζάθοια ιμκζιμπμίδζδξ. ηδ ζοκέπεζα λεπθέκεηαζ ιε δζάθοια 50% αζεακυθδξ, 3 θμνέξ απυ 20 min. Ώημθμοεεί πνμηαηενβαζία ημο πδηηχιαημξ βζα 1 min ιε δζάθοια 0.02% (w/v) Na 2 S 2 O 3 ηαζ λέπθοια ιε απζμκζζιέκμ κενυ, 3 θμνέξ απυ 20 sec. ηδ ζοκέπεζα, ημ πήηηςια επςάγεηαζ ιε δζάθοια κζηνζημφ ανβφνμο, λεπθέκεηαζ 2 θμνέξ ιε απεζηαβιέκμ H 2 O απυ 20 sec, ηαζ ειθακίγεηαζ ιε επχαζδ ημοθάπζζημκ 10 min ζε δζάθοια ειθάκζζδξ. Ώθμφ λεπθοεεί ιε απεζηαβιέκμ H 2 O εη κέμο 2 θμνέξ απυ 2 min, δ ακηίδναζδ ειθάκζζδξ ζηαιαηά ιε επχαζδ 10 min ζε δζάθοια ηενιαηζζιμφ. Σμ πήηηςια λεπθέκεηαζ ηεθζηά ιε δζάθοια 50% ιεεακυθδξ βζα ημοθάπζζημκ 20 min. Γηάιπκα κνληκνπνίεζεο: 50% ιεεακυθδ, 12% μλζηυ μλφ, 0.05% θμνιαθδεΰδδ 37%. Γηάιπκα ληηξηθνύ αξγύξνπ: 0.2% AgNO 3, 74 ιl/100 ml θμνιαθδεΰδδ 37%. Γηάιπκα εκθάληζεο (100mL): gr Na 2 CO 3, 50 ιl θμνιαθδεΰδδ 37%, 0.4 mg Na 2 S 2 O 3. Γηάιπκα ηεξκαηηζκνύ: 50% ιεεακυθδ, 12% μλζηυ μλφ Αλάιπζε θαηά western Με αοηή ηδ ιεεμδμθμβία μζ πνςηεύκεξ ιεηαθένμκηαζ ιε δθεηηνμιεηαθμνά απυ ημ πήηηςια SDS/πμθοαηνοθαιζδίμο (SDS-PAGE) ζε ιειανάκδ πμθοαζκοθζδέκζμο θεμνίμο (PVDF). Μεηά απυ SDS-PAGE δθεηηνμθυνδζδ, υπςξ πενζβνάθδηε, ημ πήηηςια δζαπςνζζιμφ λεπθέκεηαζ απυ ηδκ πενίζζεζα SDS ιε νοειζζηζηυ δζάθοια ιεηαθμνάξ. 123

125 Τιηθά θαη Μέζνδνη Κυαμοιε ηδ ιειανάκδ PVDF ζηζξ δζαζηάζεζξ ημο πδηηχιαημξ δζαπςνζζιμφ ηαζ ηδκ ηαεζζημφιε οδνυθζθδ, ειααπηίγμκηάξ ηδκ βζα 2 sec ζε απυθοηδ ιεεακυθδ. Σμπμεεημφιε ιε ηδ ζεζνά 3 ημιιάηζα πανηζμφ Whatman 3ΜΜ, ημ πήηηςια, ηδ ιειανάκδ PVDF ηαζ 3 ημιιάηζα πανηί Whatman (υθα ειπμηζζιέκα ιε δζάθοια ιεηαθμνάξ) πςνίξ κα εβηθςαζζημφκ θοζαθίδεξ αένα. Ώημθμφεςξ, ημπμεεημφιε ημ «ζάκημοζηξ» ζηδ ζοζηεοή δθεηηνμιεηαθμνάξ ιε ηδκ ιειανάκδ πνμξ ηδκ άκμδμ. Δ δθεηηνμιεηαθμνά πναβιαημπμζείηαζ ζηα 100 V βζα 1 h ζημοξ 4 C. Μεηά ημ πέναξ, δ ιειανάκδ επςάγεηαζ ζε δζάθοια δέζιεοζδξ ηςκ ιδ εζδζηχκ εέζεςκ ηδξ ιειανάκδξ ζημοξ 4 C βζα ημοθάπζζημκ 1 h. Δ ιειανάκδ ιεηά ημ ηέθμξ ηδξ δέζιεοζδξ εηπθέκεηαζ ιε δζάθοια TBS-Tween/Triton δφμ θμνέξ απυ 10 min ηαζ ιε δζάθοια TBS βζα 10 min. Ώημθμοεεί επχαζδ ιε ακηίζςια έκακηζ ηδξ μονάξ ζζηζδζκχκ, αναζςιέκμ 1/1000 ζε δζάθοια δέζιεοζδξ, βζα 1 h ζε εενιμηναζία δςιαηίμο. Ώημθμοεεί λέπθοια, υπςξ αηνζαχξ πνμδβήεδηε ιε ημ δζάθοια δέζιεοζδξ ηςκ ιδ εζδζηχκ εέζεςκ ηαζ δ ιειανάκδ επςάγεηαζ βζα 1 h ζε εενιμηναζία δςιαηίμο ιε ημ δεφηενμ ακηίζςια, ημ μπμίμ ανίζηεηαζ δζαθοιέκμ (αναίςζδ 1/2000) ζε δζάθοια TBS/10% άπαπμ βάθα. Σμ ηεθζηυ λέπθοια βίκεηαζ ιε δζάθοια TBS-Tween/Triton, 4 θμνέξ απυ 10 min. H ιειανάκδ επςάγεηαζ ιε δζάθοια ακίπκεοζδξ οπενμλεζδάζδξ (Chemicon) βζα 1.5 min ηαζ ζηδ ζοκέπεζα εηηίεεηαζ ζε θζθι. Ρπζκηζηηθό δηάιπκα κεηαθνξάο: 25 mm Tris, 150 mm βθοηίκδ, 20% ιεεακυθδ, ph 8.3. Ρπζκηζηηθό δηάιπκα TBS: 10 mm Tris HCl ph 7.5, 150 mm NaCl. Γηάιπκα δέζμευζης: TBS, 3% BSA. Γηάιπκα TBS-Tween/Triton: 20 mm Tris-HCl ph 7.5, 500 mm NaCl, 0.05% (v/v) Tween 20, 0.2% (v/v) Triton X Καζαξηζκόο αλαζπλδπαζκέλσλ πνιππεπηηδίσλ κε ρξσκαηνγξαθία ζπγγελείαο αθηλεηνπνηεκέλνπ ληθειίνπ Ώθμφ επζαεααζςεεί δ έηθναζδ ηδξ ακαζοκδοαζιέκδξ πνςηεύκδξ, ζεζνά έπεζ μ ηαεανζζιυξ ηδξ ζε ζηήθδ ζοββεκείαξ Ni-NTA. Σα ηαηάθμζπα ηςκ έλζ ζοκεπυιεκςκ ζζηζδζκχκ αθθδθεπζδνμφκ ιέζς ηςκ ζιζδαγμθζηχκ δαηηοθίςκ ιε ημ κζηέθζμ ημο πνςιαημβναθζημφ οθζημφ (Δηθόλα 4.4) ιε ελαζνεηζηά ιεβάθδ ζοββέκεζα πμο θηάκεζ αοηήκ ημο εκγφιμο-οπμζηνχιαημξ ή ηδ ζοββέκεζα ακηζβυκμο-ακηζζχιαημξ. Δ αθθδθεπίδναζδ παναιέκεζ ζζπονή ζηα δζάθμνα ζηάδζα έηπθοζδξ ηδξ ζηήθδξ, ηαζ παφεζ ζε παιδθυ ph ( ) ή ζε ορδθέξ ζοβηεκηνχζεζξ ζιζδαγμθίμο ( mm). Σμ ηεθεοηαίμ ακηαβςκίγεηαζ ηδκ μονά ζζηζδζκχκ βζα ηδκ πνυζδεζδ ζηδ ζηήθδ. Με ηδκ 124

126 Τιηθά θαη Μέζνδνη ελαζεέκζζδ ηδξ αθθδθεπίδναζδξ ηςκ ζζηζδζκχκ ιε ημ κζηέθζμ, δ ακαζοκδοαζιέκδ πνςηεύκδ εηθμφεηαζ ιέπνζ ηαζ 95%, απαθθαβιέκδ απυ άθθεξ πνςηεύκεξ ημο εηποθίζιαημξ. Δ ακαζοκδοαζιέκδ πνςηεύκδ ιπμνεί κα ζοκηίεεηαζ ζε δζαθοηή ιμνθή, εκχ ζε πμθθέξ πενζπηχζεζξ ηα παναβυιεκα ιυνζα ζοζζςιαηχκμκηαζ ηαζ ζπδιαηίγμοκ αδζάθοηα έβηθεζζηα ζςιάηζα (inclusion bodies). Ο ζπδιαηζζιυξ ηςκ έβηθεζζηςκ ζςιαηίςκ επδνεάγεηαζ απυ δζάθμνμοξ πανάβμκηεξ, υπςξ δ θφζδ ημο πνςηεσκζημφ ιμνίμο, ημ είδμξ ημο ααηηδνζαημφ ζηεθέπμοξ ηαζ ημο πθαζιζδίμο έηθναζδξ ημο ζοζηήιαημξ, ηαζ ηονίςξ, απυ ηζξ ζοκεήηεξ ηαθθζένβεζαξ ηαζ επαβςβήξ ηδξ έηθναζδξ ημο εηενυθμβμο βμκζδίμο. Σα ηφηηανα πμο έπμοκ ζοθθεπεεί ιεηά ηδκ επαβςβή ιε IPTG ( 4.2) ηαηενβάγμκηαζ ιε ηνυπμ, χζηε κα παναθαιαάκμοιε πςνζζηά ημ εηπφθζζια ηςκ δζαθοηχκ πνςηεσκχκ απυ ημ εηπφθζζια ηςκ αδζάθοηςκ πνςηεσκχκ, υπμο ανίζημκηαζ ηα έβηθεζζηα ζςιάηζα. Σα δφμ ηθάζιαηα ηαεανίγμκηαζ ζε ζηήθδ Ni-NTA Agarose αημθμοεχκηαξ δζαθμνεηζηά πνςηυημθθα. Εικόνα 4. 4: Ώθθδθεπίδναζδ ιεηαλφ βεζημκζηχκ ηαηαθμίπςκ ζζηζδίκδξ ζε μονά ζζηζδζκχκ ιε άημιμ κζηεθίμο ημο οθζημφ Ni-NTA. Με ιπθε πνχια ακαπανίζηαηαζ δ πεπηζδζηή αθοζίδα υπμο δζαηνίκμκηαζ μζ δαηηφθζμζ ζιζδαγμθίμο ηςκ ζζηζδζκχκ, ηαζ ιε ηυηηζκμ πνχια μ πδθζηυξ πνμζνμθδηήξ ημο κζηεθίμο, ημ κζηνζθμ-μλζηυ μλφ Οκνγελνπνίεζε θπηηάξσλ Παξαιαβή θιαζκάησλ δηαιπηώλ θαη αδηάιπησλ πξσηετλώλ Ώθμφ ηαεμνζζηεί δ δζάνηεζα ηδξ επαβςβήξ ηαζ δ εενιμηναζία, επάβμοιε ηδκ έηθναζδ ημο ακαζοκδοαζιέκμο βμκζδίμο ζε ηαθθζένβεζα υβημο 1-2 L. Σμ ίγδια ηςκ ηοηηάνςκ (~3 gr/l) ζοκηδνείηαζ ζημοξ -20 C, ηαζ πνζκ ηδκ μιμβεκμπμίδζδ επςάγεηαζ ζημκ πάβμ βζα 30 min, ημπμεεηείηαζ λακά ζημοξ -20 C βζα 30 min ηαζ αθήκεηαζ ηεθζηά κα λεπαβχζεζ. ηδ ζοκέπεζα ακαδζαθφεηαζ ζε 3-5 ml δζαθφιαημξ θφζδξ/gr κςπμφ αάνμοξ ηοηηάνςκ. Σμ δζάθοια θφζδξ πενζέπεζ απυ 2 έςξ 10 mm ζιζδαγυθζμ, ημ μπμίμ ακηαβςκίγεηαζ ηαηάθμζπα 125

127 Τιηθά θαη Μέζνδνη ζζηζδζκχκ βζα ηδκ πνυζδεζδ ζηδ ζηήθδ, πνμηαθχκηαξ έηζζ ιείςζδ ηδξ ιδ εζδζηήξ πνυζδεζδξ πνςηεσκχκ ιε ζζηζδίκεξ ηαηά ηδ πνςιαημβναθία. ημ ηοηηανζηυ δζάθοια πνμζηίεεηαζ θοζμγφιδ ζε ηεθζηή ζοβηέκηνςζδ 1 mg/ml, χζηε κα δζεοημθοκεεί δ θφζδ ηςκ ηοηηανζηχκ ημζπςιάηςκ ηαζ αημθμοεεί επχαζδ ζημ πάβμ βζα 30 min ηαζ ακάδεοζδ ακά ηαηηά πνμκζηά δζαζηήιαηα. Δ μιμβεκμπμίδζδ ηςκ ηοηηάνςκ βίκεηαζ ζε ζοζηεοή οπενήπςκ ιε 10 πηοπήιαηα (bursts) ζε ζζπφ W, δζάνηεζαξ 30 sec ημ ηαεέκα, ζημκ πάβμ. Ώημθμοεεί θοβμηέκηνδζδ ζηα g βζα 60 min ζημοξ 4 o C. Σμ οπενηείιεκμ (~25 ml) απμηεθεί ημ εηπφθζζια ηςκ δζαθοηχκ πνςηεσκχκ. Σμ ίγδια, πμο απμηεθεί ημ αδζάθοημ ηθάζια, δζαθφεηαζ ζε απμδζαηαηηζηυ (8 Μ μονία) δζάθοια θφζδξ (3 ml δζαθφιαημξ/gr κςπμφ αάνμοξ ζγήιαημξ) βζα 3 h οπυ έκημκδ ακάδεοζδ ζε εενιμηναζία δςιαηίμο. Γηάιπκα ιύζεο: 50 mm NaH 2 PO 4, 300 mm NaCl, 10 mm Imidazole, ph 8.0 (NaOH). Απνδηαηαθηηθό δηάιπκα ιύζεο: 100 mm NaH 2 PO 4, 10 mm Tris HCl, 8M μονία, ph Καζαξηζκόο εθρπιίζκαηνο δηαιπηώλ πξσηετλώλ ημ εηπφθζζια πνμζηίεεηαζ 6 ml εκαζςνήιαημξ Ni-NTA αβανυγδ (πενζέπεζ οθζηυ βζα 3 ml παηεηανζζιέκδξ ζηήθδξ) ηαζ ημ ιίβια ηίεεηαζ οπυ εθαθνά ακαηίκδζδ ζημοξ 4 C βζα 1.5 h, χζηε κα πνμζδεεεί δ ακαζοκδοαζιέκδ πνςηεύκδ ζημ πνςιαημβναθζηυ οθζηυ. Ώημθμφεςξ ημ εκαζχνδια παηεηάνεηαζ ζε ζηήθδ ιε ηδ νμή πμο πνμηαθείηαζ απυ ηδκ δφκαιδ ηδξ αανφηδηαξ. Σμ δζάθοια πμο δζένπεηαζ ηδξ ζηήθδξ ζοθθέβεηαζ (flow-through). Δ ζηήθδ εηπθέκεηαζ ιε >30 ml δζαθφιαημξ W1 ηαζ ζηδ ζοκέπεζα ιε δζάθοια ααειίδςζδξ ζοβηέκηνςζδξ ζιζδαγμθίμο ( mm) ζοκμθζημφ υβημο 9 ml, υπμο δ ακαζοκδοαζιέκδ πνςηεύκδ εηθμφεηαζ ζηα 250 mm ζιζδαγμθίμο. Σμ απμηέθεζια ηδξ δζαδζηαζίαξ πζζημπμζείηαζ ιε SDS/PAGE. Σμ ακαζοκδοαζιέκμ πμθοπεπηίδζμ NTR, επεζδή ζοκεηθμφζηδηε ιε άθθεξ πνςηεύκεξ, ηαεανίζηδηε ηαζ ζε ζηήθδ ηαηζμκημακηαθθαβήξ, θςζθμηοηηανίκδξ ( 2.3). Σα δείβιαηα ηαεανήξ πνςηεύκδξ δζαπζδφμκηαζ ζε δζάθοια P29 ηαζ θοθάζζμκηαζ ζημοξ 4 C. Γηάιπκα W1: 50 mm NaH 2 PO 4, 300 mm NaCl, 20 mm Εmidazole, ph 8.0 (NaOH). Γηάιπκα έθινπζεο: 50 mm NaH 2 PO 4, 300 mm NaCl, mm Imidazole, ph 8.0 (NaOH). Γηάιπκα P29: 10 mm Tris HCl ph 7.6, 100 mm NaH 2 PO 4, 200 mm NaCl, 25 % βθοηενυθδ. 126

128 Τιηθά θαη Μέζνδνη Καζαξηζκόο εθρπιίζκαηνο αδηάιπησλ πξσηετλώλ ημ εηπφθζζια πνμζηίεεηαζ, υπςξ ηαζ πνμδβμοιέκςξ, 6 ml εκαζςνήιαημξ πνςιαημβναθζημφ οθζημφ, ηαζ ημ ιίβια ηίεεηαζ οπυ εθαθνά ακαηίκδζδ ζε εενιμηναζία δςιαηίμο βζα 1.5 h. Ώημθμφεςξ, ημ εκαζχνδια παηεηάνεηαζ ζε ζηήθδ ηαζ ημ δζάθοια πμο δζένπεηαζ ηδξ ζηήθδξ ζοθθέβεηαζ. Δ ζηήθδ εηπθέκεηαζ ιε >30 ml δζαθφιαημξ DW1. Οζ εζδζηά δεζιεοιέκεξ πνςηεύκεξ εηθμφμκηαζ ιε ιείςζδ ημο ph ηδξ ζηήθδξ πμο πνμηαθείηαζ απυ δζέθεοζδ 5 ml δζαθφιαημξ Β1 (ph 5.9) ηαζ 10 ml δζαθφιαημξ Β2 (ph 4.5). οθθέβμοιε ηθάζιαηα ημο εκυξ ml. Βκαθθαηηζηά, δ ακαζοκδοαζιέκδ πνςηεύκδ εηθμφεηαζ ζε ζοβηέκηνςζδ ζιζδαγμθίμο 300 mm ζε απμδζαηαηηζηυ δζάθοια θφζδξ. Ώημθμοεεί δθεηηνμθμνδηζηή ακάθοζδ, υπςξ πενζβνάθδηε ζηδκ πανάβναθμ Γηάιπκα DW1: 100 mm NaH 2 PO 4, 10 mm Tris-Cl, 8M μονία, ph 6.3 (NaOH). Γηάιπκα Δ1: 100 mm NaH 2 PO 4, 10 mm Tris-Cl, 8M μονία, ph 5.9 (NaOH). Γηάιπκα Δ2: 100 mm NaH 2 PO 4, 10 mm Tris-Cl, 8M μονία, ph 4.5 (NaOH). Δ ζοβηέκηνςζδ ηδξ ηαεανήξ ακαζοκδοαζιέκδξ πνςηεύκδξ πνμζδζμνίγεηαζ ιε ηδκ ιέεμδμ Bradford, αθμφ πνμδβμοιέκςξ ηα ηθάζιαηα οπμζημφκ δζαδμπζηέξ δζαπζδφζεζξ ζε δζάθοιαηα πμο πενζέπμοκ 100 mm NaH 2 PO 4, 10 mm Tris-Cl ph 8.0 ηαζ ιεζμφιεκδ ζοβηέκηνςζδ μονίαξ. Σα ηαεανά ακαζοκδοαζιέκα πμθοπεπηίδζα δζαπζδφμκηαζ ηεθζηά ζημ δζάθοια Ρ29 ( 4.4.2) ηαζ θοθάζζμκηαζ ζημοξ 4 μ C. 5. Παξαζθεπή πνιπθισληθώλ αληηζσκάησλ-πεηξάκαηα αλνζνρεκείαο Αλνζνπνίεζε θνπλειηώλ θαη παξαιαβή νξξνύ Αείβια ηαεανήξ ακαζοκδοαζιέκδξ DRpp29 πνδζζιμπμζείηαζ βζα ηδκ ακμζμπμίδζδ 2 ημοκεθζχκ. Δ ακμζμπμίδζδ βίκεηαζ αημθμοεχκηαξ πνυβναιια οπμδυνζαξ πμνήβδζδξ πνςηεύκδξ ηαζ ζοθθμβήξ μννμφ αίιαημξ. Σδκ διένα έκανλδξ ημο πνμβνάιιαημξ ακμζμπμίδζδξ, ζοθθέβμοιε 12 ml αίια απυ θθέαα ζημ αοηί ημο γχμο, ηαζ πμνδβμφιε οπμδυνζα ηδκ πνχηδ πμζυηδηα πνςηεύκδξ. 100 ιg πνςηεύκδξ (ζε 500ιL ιε 0.9% NaCl) ακαιεζβκφμκηαζ ιε ίζμ υβημ πθήνμοξ ακμζμεκζζποηζημφ ημο Freund (Freund s complete adjuvant). Σμ ιείβια βαθαηηςιαημπμζείηαζ ιε ζοκεπείξ ακαννμθήζεζξ/εηννμθήζεζξ ηαζ πμνδβείηαζ οπμδυνζα ζηδκ πενζμπή ακάιεζα απυ ηζξ δφμ ςιμπθάηεξ ημο γχμο. Σμ αίια πμο ζοθθέβεηαζ (~15 ml) αθήκεηαζ ιία χνα κα πήλεζ ηαζ αημθμοεεί θοβμηέκηνδζδ ζηα 2000 g βζα 2 min. Σμ 127

129 Τιηθά θαη Μέζνδνη οπενηείιεκμ ηδξ θοβμηέκηνδζδξ (~4 ml) απμηεθεί ημκ μννυ ημο αίιαημξ υπμο πενζέπμκηαζ ηα ακηζζχιαηα. Σμ δείβια μννμφ ηδξ πνχηδξ ιέναξ απμηεθεί ημ ανκδηζηυ δείβια. Σδκ 21 δ διένα ημο πνμβνάιιαημξ επακαθαιαάκεηαζ δ αζιμθδρία ηαζ δ παναθααή ημο μννμφ (1 μξ εεηζηυξ μννυξ), ηαεχξ ηαζ δ οπμδυνζα πμνήβδζδ πμζυηδηαξ 100 ιg ακαζοκδοαζιέκδξ πνςηεύκδξ. Δ πμζυηδηα ημο δζαθφιαημξ ηδξ πνςηεύκδξ ακαιεζβκφεηαζ ιε 0.9% NaCl ιέπνζ ηεθζηυ υβημ 500ιL ηαζ πνμζεέημκηαζ επζπθέμκ 500ιL αηεθμφξ ακμζμεκζζποηζημφ (Freund s incomplete adjuvant). Σμ ιείβια βαθαηηςιαημπμζείηαζ ηαζ εκίεηαζ ζηδκ ίδζα πενζμπή. Σδκ 28 δ διένα ηάκμοιε αζιμθδρία ηαζ παναθαιαάκμοιε μννυ (2 μξ εεηζηυξ μννυξ). Σδκ 35 δ διένα πναβιαημπμζμφιε κέα αζιμθδρία (3 μξ εεηζηυξ μννυξ). Ο μννυξ δμηζιάγεηαζ ζε απμηφπςζδ ηδθίδαξ (dot blot) βζα ηδκ φπανλδ ακηζζςιάηςκ, υπςξ πενζβνάθεηαζ ζηδκ επυιεκδ πανάβναθμ. Σδκ 42 δ διένα παναθαιαάκμοιε ημκ 4 μ εεηζηυ μννυ ηαζ πμνδβμφιε κέα πμζυηδηα πνςηεύκδξ (100 ιg πνςηεύκδξ ακαιεζβκφμκηαζ ιέπνζ ηεθζηυ υβημ 500 ιl ιε 0.9% NaCl ηαζ 500 ιl αηεθμφξ ακμζμεκζζποηζημφ). Ο μννυξ αοηυξ επίζδξ δμηζιάγεηαζ ιε ηδ ιέεμδμ dot blot. Σδκ 49 δ ιε 52 δ διένα βίκεηαζ αζιμθδρία ηαζ ηδκ 59 δ διένα παναθαιαάκεηαζ μ ηεθεοηαίμξ μννυξ ιε αζιμθδρία Γνθηκαζία dot blot Δ δμηζιαζία dot blot είκαζ έκαξ ζφκημιμξ ηνυπμξ βζα κα δζαπζζηχζεζ ηακείξ ακ ζημκ οπυ ελέηαζδ μννυ οπάνπμοκ ακηζζχιαηα έκακηζ ζοβηεηνζιέκςκ πνςηεσκχκ. Αείβια ακαζοκδοαζιέκδξ πνςηεύκδξ ζε αναζχζεζξ 1/1, 1/10, 1/20 ηαζ 1/50 (πενίπμο 1, 0.1, 0.08 ηαζ 0.03 ιg πνςηεύκδξ), υπςξ επίζδξ δείβια RNase P ζηζξ ίδζεξ αναζχζεζξ εκαπμηίεεκηαζ ζε ιειανάκδ PVDF. Δ ιειανάκδ πνμδβμοιέκςξ αοείγεηαζ βζα 2-3 sec ζε απυθοηδ ιεεακυθδ βζα κα βίκεζ οδνυθζθδ, ζε Δ 2 Ο βζα 30 sec, χζηε κα λεπθοεεί δ ιεεακυθδ ηαζ ζηδ ζοκέπεζα ελζζμννμπείηαζ ζε δζάθοια TBS βζα 2 min. Δ ιειανάκδ ιεηά ηδκ εκαπυεεζδ λεναίκεηαζ ζημκ αένα βζα 5 min ηαζ αημθμφεςξ επακαθαιαάκεηαζ δ δζαδζηαζία οδνμθζθμπμίδζδξ ηαζ ελζζμννυπδζήξ ηδξ. Δ ηαηενβαζία ηδξ ιειανάκδξ βζα ηδκ δέζιεοζδ ηςκ ιδ εζδζηχκ εέζεςκ ηαζ ηα λεπθφιαηα βίκμκηαζ, υπςξ έπεζ πενζβναθεί βζα ηδκ ακάθοζδ ηαηά western. Ο μννυξ ακμζμπμζδιέκμο ημοκεθζμφ πνδζζιμπμζείηαζ ζε αναίςζδ 1/500, εκχ ςξ δεφηενμ ακηίζςια πνδζζιμπμζείηαζ anti-rabbit IgG horseradish peroxidase-linked whole antibody. 128

130 Τιηθά θαη Μέζνδνη Χξ οπυζηνςια ημο εκγφιμο horseradish peroxidase πνδζζιμπμζείηαζ ημ luminol (5- Amino-2,3-dihydro-1,4-phthalazinedione) ηαζ ςξ μλεζδμακαβςβζηυξ πανάβμκηαξ ημ Δ 2 Ο 2. Σμ δζάθοια οπμζηνχιαημξ/ δείηηδ πνμηφπηεζ απυ ακάιζλδ ίζςκ υβηςκ δζαθφιαημξ 1 ηαζ 2 απυ ημ ηίη ECL (ηςκ μπμίςκ δ αηνζαήξ ζφζηαζδ δεκ δίκεηαζ απυ ηδκ εηαζνεία) ηαζ παναζηεοάγεηαζ θίβμ πνζκ πνδζζιμπμζδεεί. Γζα ηδκ ειθάκζζδ ηςκ εεηζηχκ ηδθίδςκ, δ ιειανάκδ επςάγεηαζ ιε 1 ml δζαθφιαημξ οπμζηνχιαημξ/ δείηηδ ζε εενιμηναζία δςιαηίμο (RT) βζα 5~15 min, ιέπνζξ υημο δ έκηαζδ ημο ζήιαημξ βίκεζ ζηακμπμζδηζηή. Δ ακηίδναζδ ζηαιαηά ιε λέπθοια ηδξ ιειανάκδξ ιε απζμκζζιέκμ κενυ Έκκεζε ELISA (enzyme-linked immunosorbent assay) γηα ηηηινδόηεζε ησλ αληηνξξώλ Δ έιιεζδ ELISA πνδζζιμπμζείηαζ βζα ηδκ ακίπκεοζδ ηαζ ηδκ ηζηθμδυηδζδ ακηζζςιάηςκ έκακηζ ζοβηεηνζιέκςκ πνςηεσκχκ. Βπζηαθφπημοιε ηνοαθίμ ELISA ιε 100 ιl ακαζοκδοαζιέκδξ πνςηεύκδξ/αμενίμ (~30 ng) ζε 0.1 Μ NaHCO 3 ph 9.5 ηαζ ημ αθήκμοιε κα επςαζηεί βζα 16 hrs ζε εενιμηναζία δςιαηίμο ηαζ οβναζία. Ο ανκδηζηυξ ιάνηοναξ δεκ πενζθαιαάκεζ πνςηεύκδ. Σμ ηνοαθίμ ζηδκ ζοκέπεζα εηπθέκεηαζ ηνεζξ θμνέξ ιε 200 ιl δζαθφιαημξ PBS-Tween βζα κα απμιαηνοκεεί δ πενίζζεζα ακηζβυκμο, επζηαθφπηεηαζ ιε 300 ιl 4% BSA ζε PBS βζα ηδκ δέζιεοζδ ιδ εζδζηχκ εέζεςκ ηαζ επςάγεηαζ οπυ ακάδεοζδ ζημοξ 37 C βζα 1 h. Ώημθμοεεί λέπθοια ιε PBS-Tween ηαζ ζηδ ζοκέπεζα πνμζεέημοιε 100 ιl ακηζμννμφ ζε ηέζζενζξ ημοθάπζζημκ δζαθμνεηζηέξ αναζχζεζξ (1/1000, 1/2000, 1/4000, 1/8000) ζε δζάθοια PBS-Tween ph 7.4 βζα ημκ ηάεε ακηζμννυ (100 ιl/αμενίμ). Σα ηνοαθία επςάγμκηαζ βζα 2 hrs ζε εενιμηναζία δςιαηίμο (RT) ηαζ οβναζία. Ώημθμοεεί λέπθοια ηαζ επχαζδ βζα 1.5 h ζε RT ιε ημ δεφηενμ ακηίζςια (goat anti rabbit IgG peroxidase-conjugated antibody) ημ μπμίμ ανίζηεηαζ δζαθοιέκμ (αναίςζδ 1/5000) ζε PBS-Tween ph 7.4. Χξ οπυζηνςια ηδξ οπενμλεζδάζδξ πνδζζιμπμζείηαζ ημ δζάθοια Δ 2 Ο 2 - OPD (o-phenylenediamine dihydrochloride) ημ μπμίμ επζηνέπεζ ηδκ έιιεζδ ακίπκεοζδ ηδξ ακηίδναζδξ. Υνςζηζηή OPD εημζιάγεηαζ ζε αναίςζδ 2 mg/ml ζε δζάθοια 0.1 Μ ηζηνζηχκ ph 5.2 ηαζ πνδζζιμπμζείηαζ ζε ακαθμβία 1 ιl/ml Δ 2 Ο 2. Μεηά ηδκ πνμζεήηδ ημο οπμζηνχιαημξ ημ ηνοαθίμ επςάγεηαζ ζημ ζημηάδζ βζα 5-30 min ηαζ δ ακηίδναζδ ηενιαηίγεηαζ ιε ηδκ πνμζεήηδ 100 ιl H 2 SO 4 2 Μ. Σμ απμηέθεζια πμζμηζημπμζείηαζ ιε θςημιέηνδζδ ζηα 492 nm. Γηάιπκα PBS-Tween: 150 mm NaCl, 0.05% Tween 20, 10 mm δζάθοια PO 2+ 4 ph

131 Τιηθά θαη Μέζνδνη Καζαξηζκόο αληηζσκάησλ κε ζηήιε ζπγγελείαο Protein A-Sepharose Ο ηαεανζζιυξ ηςκ ακηζζςιάηςκ ιε Protein A-Sepharose ααζίγεηαζ ζηδκ δέζιεοζδ ηδξ πνςηεύκδξ A ζηδκ Fc πενζμπή ηςκ ακμζμζθαζνζκχκ ιέζς αθθδθεπίδναζδξ ηδξ ιε ηδκ αανζά αθοζίδα. Δ αθθδθεπίδναζδ παναιέκεζ ζζπονή ζηα δζάθμνα ζηάδζα έηπθοζδξ ηδξ ζηήθδξ ηαζ παφεζ ζε ph 3.0. ημκ ακηζμννυ πνμζηίεεηαζ ίζμξ υβημξ εκαζςνήιαημξ πνςιαημβναθζημφ οθζημφ (ζε ΕΡΡ- 500) ηαζ ημ ιίβια ηίεεηαζ οπυ εθαθνά ακαηίκδζδ ζημοξ 4 μ C βζα ημοθάπζζημκ 2 hrs. Ώημθμφεςξ ημ εκαζχνδια παηεηάνεηαζ ζε ζηήθδ ιε ηδκ νμή πμο πνμηαθείηαζ απυ ηδκ δφκαιδ ηδξ αανφηδηαξ. Δ ζηήθδ εηπθέκεηαζ ιε 20 υβημοξ ζηήθδξ δζαθφιαημξ ΕPΡ-500, χζηε κα απμιαηνοκεμφκ μζ ιδ εζδζηά δεζιεοιέκεξ πνςηεύκεξ ηαζ δ έηθμοζδ βίκεηαζ ιε 2 υβημοξ ζηήθδξ δζαθφιαημξ 100 mμ ηζηνζηχκ ph 3.0. Σμ έηθμοζια ζοθθέβεηαζ ζε ζςθδκάηζ eppendorf πμο πενζέπεζ 1 Μ Tris-HCl ph 9.0, έηζζ χζηε ημ ηεθζηυ ph ημο δζαθφιαημξ κα είκαζ 7.5. IPP-500: 500 mm NaCl, 0,1% NP-40, 10 mm Tris HCl ph Αλνζνθαηαθξήκληζε δξαζηηθόηεηαο RNase P κε πνιπθισληθά αληηζώκαηα Δ εζδζηή αθθδθεπίδναζδ ακηζβυκμο ακηζζχιαημξ πνδζζιμπμζείηαζ ζε αοηήκ ηδκ ιέεμδμ βζα κα δζαπζζηςεεί δ ζοκεφνεζδ ηδξ πνςηεύκδξ ακηζβυκμο ιε ηδκ εκγοιζηή δναζηζηυηδηα πμο δζαεέηεζ ημ ιαηνμιμνζαηυ ζφιπθμημ ηδξ RNase P. 50 ιl εκαζςνήιαημξ 1:1 protein A-sepharose ζε IPP-500 επςάγμκηαζ ιε 25 ιl ακηζμννμφ ή μθζηχκ IgG ζημοξ 4 C βζα 16 hrs. Χξ ανκδηζηυξ ιάνηοναξ πνδζζιμπμζείηαζ μ μννυξ πμο ζοθθέπεδηε πνζκ ηδκ ακμζμπμίδζδ. Ώημθμφεςξ ημ εκαζχνδια εηπθέκεηαζ ηνεζξ θμνέξ ιε 1 ml ΕΡΡ-500 (θοβμηεκηνείηαζ βζα 1 min ζηζξ 3200 g ηαζ αθαζνείηαζ ημ οπενηείιεκμ) ηαζ ηνεζξ θμνέξ ιε IPP-150. ηδ ζοκέπεζα πνμζηίεεκηαζ 100 ιl δζαθφιαημξ CD, 10 U RNasin ηαζ 6 ιl RNase P ηα μπμία επςάγμκηαζ βζα 3 hrs ζημοξ 4 o C οπυ πενζζηνμθή. Μεηά ημ πέναξ ηδξ επχαζδξ αημθμοεεί θοβμηέκηνδζδ ζηζξ 3200 g βζα 1 min ηαζ ημ οπενηείιεκμ θοθάζεηαζ βζα κα δμηζιαζηεί βζα εκγοιζηή δναζηζηυηδηα. Σμ ίγδια εηπθέκεηαζ 3 θμνέξ ιε ΕΡΡ-150 ηαζ 3 θμνέξ ιε δζάθοια CD. Βκ ζοκεπεία, ημ ίγδια δμηζιάγεηαζ βζα δναζηζηυηδηα RNase P ιε επακαζχνδζδ ζε 20 ιl δζαθφιαημξ CD πανμοζία ~8 fmol/ιl SupS1, 2 U RNasin, 1.25 mm EGTA ηαζ επχαζδ ζημοξ 37 C βζα 30 min οπυ πενζζηνμθή. Σα πνμσυκηα ηδξ ακηίδναζδξ ακαθφμκηαζ ζε απμδζαηαηηζηυ πήηηςια πμθοαηνοθαιζδίμο 10% / 8 Μ μονίαξ ηαζ βίκμκηαζ μναηά ιε αοημναδζμβναθία. 130

132 Τιηθά θαη Μέζνδνη IPP-150: 150 mm NaCl, 0.1% Nonidet P-40, 0.5 mm PMSF, 10 mm Tris-HCl ph 8.0. Ρπζκηζηηθό δηάιπκα CD: 10 mm NH 4 Cl, 5 mm MgCl 2, 0.5 mm PMSF, 50 mm Tris-HCl ph Μεηαγξαθή in vitro ηνπ RNA ηεο RNase P Δ RNA οπμιμκάδα ηδξ RNase P απυ ημ D. Discoideum ανίζηεηαζ ηθςκμπμζδιέκδ ζε θμνέα puc19 ηαζ ημπμεεηδιέκδ ιεηά απυ ηδκ αθθδθμοπία ημο πνμαβςβέα Σ7. Γζα ηδκ ιεηαβναθή in vitro ημο RNA βίκεηαζ πέρδ ιε ημ έκγοιμ SpeI, χζηε κα βναιιμπμζδεεί ζημ 3 άηνμ ηδξ αθθδθμοπίαξ ημο RNA ζφιθςκα ιε ηδκ παναηάης ακηίδναζδ: Ροειζζηζηυ δζάθοια 4 (10x) Πθαζιίδζμ puc19/drna (1 ιg/ιl) Spe I (10U/ιL) dd H 2 O 5 ιl 10 ιl 3 ιl 32 ιl Σμ ιίβια επςάγεηαζ βζα 2 hrs ζημοξ 37 μ C. Ώημθμοεεί εηπφθζζδ ιε θαζκυθδ ηαζ ηαηαηνήικζζδ ημο βναιιμπμζδιέκμο πθαζιζδίμο ιε αζεακυθδ. Σμ ίγδια ακαδζαθφεηαζ ζε κενυ ζε ηεθζηή ζοβηέκηνςζδ 0.5 ιg/ιl. Γζα ηδκ παναζηεοή ιδ ζδιαζιέκςκ ιμνίςκ ζε ιεβάθδ ηθίιαηα, δ ακηίδναζδ πμο πναβιαημπμζείηαζ ζε ηεθζηυ υβημ 100 ιl πενζέπεζ: 10x δζάθοια Σ7 RNA πμθοιενάζδξ DTT, 100 mm UTP, 100 mm GTP, 100 mm CTP, 100 mm ATP, 100 mm RNasin, 40 U/ιL Plasmid DNA 0.5 ιg/ιl T7 RNA πμθοιενάζδ 10 ιl 5 ιl 1.95 ιl 1.5 ιl 1.15 ιl 3.4 ιl 1 ιl 15 ιl 7.5 ιl Ώημθμοεεί επχαζδ ζημοξ 37 C βζα 16 hrs. ηδκ ακηίδναζδ πνμζεέημκηαζ 4 ιl DNase I (5 U/ ιl) ηαζ αημθμοεεί επχαζδ βζα 15 min ζημοξ 37 μ C. Δ ακηίδναζδ ζηαιαηά ιε ηδ πνμζεήηδ 10 ιl EDTA (200 mm). Ώημθμοεεί εηπφθζζδ ιε θαζκυθδ ηαζ ηαηαηνήικζζδ ημο RNA ιεηαβναθήιαημξ ιε αζεακυθδ. Σμ ίγδια ακαδζαθφεηαζ ζε 40 ιl ddδ 2 Ο ηαζ απαθθάζεηαζ απυ κμοηθεμηίδζα ηαζ αηεθή ιεηαβναθήιαηα ζε ζηήθδ ιμνζαηήξ δζήεδζδξ Sephadex (Mini Quick Spin Columns). Ώνπζηά δ ζηήθδ παηεηάνεηαζ ιε θοβμηέκηνδζδ ζηα 1000 g βζα 1 min ζε RT. Σμ έηθμοια απμιαηνφκεηαζ ηαζ πνμζηίεεηαζ 300 ιl H 2 O ζηδ 131

133 Τιηθά θαη Μέζνδνη ζηήθδ, δ μπμία θοβμηεκηνείηαζ οπυ ηζξ ίδζεξ ζοκεήηεξ. ηδ ζοκέπεζα θμνηχκεηαζ ημ δείβια ηαζ εηθμφεηαζ ιε θοβμηέκηνδζδ βζα 4 min ζηα 1000 g ηαζ ζε RT. Γζα ηδ ζήιακζδ ημο RNA ζημ 5 άηνμ πνμδβείηαζ ιζα ακηίδναζδ απμθςζθμνοθίςζδξ ηαζ αημθμοεεί δ ακηίδναζδ ηδξ ζήιακζδξ. Γζα ηδκ ακηίδναζδ ηδξ απμθςζθμνοθίςζδξ ακαιζβκφμοιε ηα ελήξ ζοζηαηζηά: 10x νοειζζηζηυ δζάθοια Antarctic Phosphatase 2 ιl Antarctic Phosphatase (5 U/ιL) 1.5 ιl RNA ιεηάβναθμ (1 ιg) 2 ιl ddδ 2 Ο 35.5 ιl Δ ακηίδναζδ επςάγεηαζ βζα 15 min ζημοξ 37 o C ηαζ δ θςζθαηάζδ απεκενβμπμζείηαζ βζα 6 min ζημοξ 65 o C. Σεθζηά πνμζεέημκηαζ 3 ιl EDTA (20 mm) ηαζ ημ απμθςζθμνοθζςιέκμ RNA παναθαιαάκεηαζ ςξ ίγδια ιεηά απυ εηπφθζζδ ιε θαζκυθδ ηαζ ηαηαηνήικζζδ ιε αζεακυθδ. Σμ ίγδια ακαδζαθφεηαζ ζε 16.5 ιl ddh 2 O ηαζ ζε αοηυ πνμζεέημκηαζ επζπθέμκ: 10x δζάθοια Σ4 πμθοκμοηθεμηζδζηήξ ηζκάζδξ 2 ιl T4 PNK (10 U/ιL) 1 ιl [β- 32 Ρ] ΏΣΡ (6000 Ci/mmol) 0.5 ιl Σμ ιίβια επςάγεηαζ βζα 1 h ζημοξ 37 μ C ηαζ δ ακηίδναζδ ζηαιαηά ιε απεκενβμπμίδζδ ημο εκγφιμο βζα 2 min ζημοξ 95 μ C ηαζ ιε πνμζεήηδ 1 ιl EDTA (20 mm). Όζηενα απυ εηπφθζζδ ιε θαζκυθδ ηαζ ηαηαηνήικδζδ ιε αζεακυθδ, ημ ναδζεκενβυ RNA παναθαιαάκεηαζ ηαεανυ ιε πνςιαημβναθία ιμνζαηήξ δζήεδζδξ ιε ηδ πνήζδ ιζηνήξ ζηήθδξ Sephadex, υπςξ αηνζαχξ πενζβνάθδηε παναπάκς ζηδκ ίδζα πανάβναθμ. 10x ξπζκηζηηθό δηάιπκα Σ7 RNA πνιπκεξάζεο: 400 mm Tris-HCl (ph 8.0), 80 mm MgCl 2, 20 mm spermidine. 10x ξπζκηζηηθό δηάιπκα Antarctic Phosphatase: 500 mm Bis-Tris-Propane-HCl, 10 mm MgCl 2, 1mM ZnCl 2, ph x ξπζκηζηηθό δηάιπκα 4: 200 mm Tris-acetate at ph 7.9, 500 mm CH 3 COOK, 100mM Mg(CH 3 COO) 2, 10 mm DTT. 10x ξπζκηζηηθό δηάιπκα T4 πνιπλνπθιενηηδηθήο θηλάζεο: 500 mm Tris-HCl at ph 8.0, 100 mm MgCl 2, 50 mm DTT. 132

134 Τιηθά θαη Μέζνδνη 7. Γνθηκή αιιαγήο ειεθηξνθνξεηηθήο θηλεηηθόηεηαο (Electrophoretic Mobility Shift Assay, EMSA) Δ ηεπκζηή EMSA ααζίγεηαζ ζηδκ παναηήνδζδ, υηζ ζφιπθμηα πνςηεύκδξ-dna ή πνςηεύκδξ-rna πανμοζζάγμοκ ιεζςιέκδ δθεηηνμθμνδηζηή ηζκδηζηυηδηα ζε έκα ιδ απμδζαηαηηζηυ πήηηςια απυ υηζ ηα εθεφεενα ιυνζα DNA ή RNA, ακηίζημζπα. 30 fmol εζςηενζηά ζδιαζιέκμο πνμδνυιμο trna (pre-sups1) ιε α- 32 Ρ-[GTP] ή 60 fmoles ζδιαζιέκμο ιεηαβνάθμο ημο RNA ηδξ RNase P ζημ 5 άηνμ ιε β- 32 P-[ATP], επςάγμκηαζ ιε αολακυιεκδ ζοβηέκηνςζδ ηαεανήξ ακαζοκδοαζιέκδξ πνςηεύκδξ Drpp29 ζε 20 ιl δζαθφιαημξ πνυζδεζδξ ΐ πανμοζία 1 U RNasin ηαζ 1 mm EGTA βζα 20 min ζημοξ 30 C. Χξ εζδζημί ακηαβςκζζηέξ πνδζζιμπμζμφκηαζ ηα ίδζα ιυνζα RNA ιδ ζδιαζιέκα, ηαζ ςξ ιδ εζδζημί μθζηυ RNA απυ γφιδ. Οζ αβςκζζηέξ πνμεπςάγμκηαζ ιε ηδκ πνςηεύκδ πνζκ ηδκ πνμζεήηδ ηςκ ζδιαζιέκςκ ιμνίςκ RNA, βζα 10 min ζημοξ 30 C. θα ηα ιυνζα RNA πνζκ ηδκ πνήζδ ημοξ απμδζαηάζζμκηαζ ζημοξ 90 C βζα 1 min ηαζ επακαδζαηάζζμκηαζ βζα >1 min ζημκ πάβμ. Μεηά ηδ επχαζδ πνμζηίεεκηαζ 4 ιl 50% βθοηενυθδξ ηαζ ηα πνμσυκηα ηδξ ακηίδναζδξ ακαθφμκηαζ δθεηηνμθμνδηζηά ζε ιδ απμδζαηαηηζηυ πήηηςια πμθοαηνοθαιζδίμο ποηκυηδηαξ 4% ζε 1xTBΜ ζηα 7 ma ηαζ 4 C. Σμ πήηηςια δθεηηνμθμνείηαζ πνζκ ημ θυνηςια ηςκ δεζβιάηςκ (pre-run), ζηα 10 ma βζα 30 min ζημοξ 4 C. Οζ γχκεξ πμο ακηζζημζπμφκ ζηα πνμσυκηα ηδξ ακηίδναζδξ βίκμκηαζ μναηέξ ιε αοημναδζμβναθία. Δ ίδζα πμνεία αημθμοεείηαζ ηαζ βζα ηζξ δμηζιέξ αθθδθεπίδναζδξ ιεηαλφ ηδξ RNA οπμιμκάδαξ ηαζ ηςκ ακαζοκδοαζιέκςκ πμθοπεπηζδίςκ Α75, Α155 ηαζ NTR. Γηάιπκα πξόζδεζεο Β: 10mM Tris-Cl at ph 8, 100mM KCl, 5mM MgCl 2, 1mM DTT, 1mM EDTA ηαζ 10% βθοηενυθδ. Γηάιπκα ΣΒΜ: mm Tris-Cl, mm ΐμνζηυ μλφ, 1mM MgCl 2 ηαζ 5% βθοηενυθδ. 8. Αλαιύζεηο απνηππώκαηνο Αλάιπζε απνηππώκαηνο ηεο RNA ππνκνλάδαο ηεο RNase P ηνπ D. discoideum Γζα κα πνμζδζμνζζηεί δ δεοηενμηαβήξ δμιή ηδξ RNA οπμιμκάδαξ ηδξ RNase P ημο D. discoideum εθανιυγεηαζ δ ιέεμδμξ ακάθοζδξ απμηοπχιαημξ, πνδζζιμπμζχκηαξ ςξ δμηζιαζηέξ (probes) ηζξ νζαμκμοηθεάζεξ Σ1 ηαζ Ώ. Δ Σ1 νζαμκμοηθεάζδ είκαζ ιζα εκδμκμοηθεάζδ πμο οδνμθφεζ RNA ιυνζα ζε ηαηάθμζπα βμοακίκδξ πμο ανίζημκηαζ ζε ιμκυηθςκεξ πενζμπέξ ημο ιμνίμο, εκχ δ νζαμκμοηθεάζδ Ώ πνυηεζηαζ βζα ιζα εκδμκμοηθεάζδ πμο δζαζπά εζδζηά ιμκυηθςκεξ πενζμπέξ RNA ιμνίςκ ιεηά απυ ηαηάθμζπα 133

135 Τιηθά θαη Μέζνδνη πονζιζδζκχκ, δδθαδή ηοημζίκδξ ηαζ μοναηίθδξ. Δ δζαδζηαζία πμο αημθμοεείηαζ πενζθαιαάκεζ ιζα ακηίδναζδ αθηαθζηήξ οδνυθοζδξ, ιζα ακηίδναζδ αθθδθμφπζζδξ ηαζ ηέθμξ ιζα ακηίδναζδ, υπμο ημ RNA ζηδ θοζζηή ηνζημηαβή δμιή ημο επςάγεηαζ ιε ηζξ νζαμκμοηθεάζεξ Σ1 ηαζ Ώ. Γζα ηδκ ακηίδναζδ ηδξ αθηαθζηήξ οδνυθοζδξ, ακαιοβκφμκηαζ ιg ζδιαζιέκμο RNA ζημ 5 άηνμ ιε β-[ 32 P]-ATP ηαζ 3 ιg μθζημφ trna, ζε ηεθζηυ υβημ 5 ιl. Πνμζηίεεηαζ ζηδ ζοκέπεζα πμζυηδηα 1x δζαθφιαημξ αθηαθζηήξ οδνυθοζδξ ηέημζα, χζηε κα ιδ λεπεναζηεί μ υβημξ ηςκ 15 ιl. Σμ ιίβια δζαπςνίγεηαζ ζε 3 δείβιαηα ηςκ 5 ιl ημ ηαεέκα ηαζ υθα ιαγί εενιαίκμκηαζ ζημοξ 95 C, βζα 2 min ημ δείβια 1, βζα 5 min ημ δείβια 2 ηαζ βζα 15 min ημ δείβια 3. θα ηα δείβιαηα ιεηά ημ πέναξ ηδξ επχαζήξ ημοξ αθήκμκηαζ ζημκ πάβμ. Σεθζηά πνμζηίεεκηαζ 10 ιl δζαθφιαημξ θμνηχιαημξ (gel loading buffer II) ηαζ ηαοηυπνμκα εημζιάγεηαζ ςξ δείβια εθέβπμο 1ιL ζδιαζιέκμο RNA ιε 8 ιl δζαθφιαημξ θμνηχιαημξ. Οζ ηνεζξ ακηζδνάζεζξ δίκμοκ εζηυκα οδνμθοιέκςκ ιμνίςκ RNA αολακυιεκμο ααειμφ οδνυθοζδξ. Βπζθέβεηαζ δ ακηίδναζδ ιε ηδ ηαθφηενδ ηαηακμιή ηςκ οδνμθοιέκςκ ιμνίςκ ηαε υθμ ημ ιήημξ ημο RNA. Γζα ηδκ ακηίδναζδ αθθδθμφπζζδξ ημο RNA, ημ ναδζμζδιαζιέκμ ιυνζμ απμδζαηάζζεηαζ ηαζ ζηδ ζοκέπεζα επςάγεηαζ ιε ηδκ Σ1 ή Ώ νζαμκμοηθεάζδ. Σμ 1x δζάθοια αθθδθμφπζζδξ πενζέπεζ 7 M μονία ηαζ αμδεά ζηδκ απμδζάηαλδ ηδξ δεοηενμηαβμφξ δμιήξ ημο RNA. Σμ RNA πνμηείκεηαζ κα ακαδζαθοεεί ημοθάπζζημκ 5 θμνέξ ζημ δζάθοια αθθδθμφπζζδξ. Δ δζαδζηαζία πμο αημθμοεείηαζ είκαζ δ ελήξ: Ώκαιεζβκφμκηαζ ιg ζδιαζιέκμο RNA ηαζ 3 ιg μθζημφ RNA απυ γφιδ ζε ηεθζηυ υβημ 10 ιl. Ώημθμοεεί πνμζεήηδ πμζυηδηαξ απυ ημ 1x δζάθοια αθθδθμφπζζδξ, ηέημζαξ χζηε μ ηεθζηυξ υβημξ ακηίδναζδξ κα είκαζ 27 ιl. Σμ ιίβια δζαπςνίγεηαζ ζε 3 ακηζδνάζεζξ ηςκ 9 ιl. Κάεε ιζα εενιαίκεηαζ ζημοξ 50 C βζα 5 min ηαζ ηεθζηά αθήκεηαζ κα ηνοχζεζ ζε εενιμηναζία δςιαηίμο. ηδ δεφηενδ ακηίδναζδ πνμζηίεεηαζ 1ιL RNase Σ1 ή A ηαζ ιεηά απυ ακάιεζλδ ιεηαθένεηαζ 1 ιl απυ ηδκ ακηίδναζδ 2 ζηδκ 3. θα ηα δείβιαηα επςάγμκηαζ βζα 15 min ζε εενιμηναζία δςιαηίμο ηαζ μζ ακηζδνάζεζξ ζηαιαημφκ ιε ηδκ πνμζεήηδ 20 ιl δζαθφιαημξ απεκενβμπμίδζδξ (inactivation buffer) ηαζ αθήκμκηαζ βζα 15 min ζημοξ 20 C. Σα ιυνζα RNA ηαηαηνδικίγμκηαζ ζε επζηναπέγζα θοβυηεκηνμ ζε g βζα 15 min ζημοξ 4 C. Tμ ίγδια λεπθέκεηαζ ιε 70 % αζεακυθδ. Σμ ίγδια αθήκεηαζ ζε εενιμηναζία δςιαηίμο βζα λήνακζδ ηαζ ζηδ ζοκέπεζα πνμζεέημκηαζ 7 ιl δζαθφιαημξ θμνηχιαημξ. Σεθζηά, ηα δείβιαηα εενιαίκμκηαζ βζα 5 min ζημοξ 95 C. Σέθμξ, βζα ηδκ ακηίδναζδ, υπμο ημ RNA ζηδ θοζζηή δμιή ημο επςάγεηαζ ιε ηζξ νζαμκμοηθεάζεξ Σ1 ηαζ Ώ, ακαιζβκφμκηαζ 4 ιl απυ 10x δζαθφιαημξ δμιήξ (structure 134

136 Τιηθά θαη Μέζνδνη buffer) ιε ιg ζδιαζιέκμο RNA, 4 ιg μθζημφ RNA γφιδξ ηαζ ηαεανυ απμζηεζνςιέκμ Δ 2 Ο απαθθαβιέκμ απυ κμοηθεάζεξ ιέπνζ ηεθζηυ υβημ 36 ιl. Σμ ιίβια δζαπςνίγεηαζ ζε 4 ακηζδνάζεζξ πμο δ ηαεειία πενζέπεζ 9 ιl. ηα δείβιαηα 2, 3 ηαζ 4 πνμζηίεεηαζ 1 ιl απυ ηδ νζαμκμοηθεάζδ Σ1 ή Ώ ηαζ επςάγμκηαζ βζα 15 min ζε εενιμηναζία δςιαηίμο. Σμ δείβια 1 απμηεθεί ημ ανκδηζηυ δείβια εθέβπμο (negative control) πμο πενζέπεζ ημ ζδιαζιέκμ RNA πςνίξ ηδ νζαμκμοηθεάζδ. Έηζζ μπμζαδήπμηε εοηαζνζαηή οδνυθοζδ ημο RNA ιμνίμο εα θακεί ζε αοηή ηδκ ακηίδναζδ, μφηςξ χζηε κα ιδκ ζοιπενζθδθεεί ζηδκ πεναζηένς ακάθοζδ ηδξ δμιήξ ημο RNA. Οζ ακηζδνάζεζξ ζηα δείβιαηα 2, 3 ηαζ 4 πενζέπμοκ ιεζμφιεκδ πμζυηδηα νζαμκμοηθεάζδξ ηαζ μζ γχκεξ πμο ειθακίγμκηαζ ζηζξ ακηζδνάζεζξ ιε ηδ θζβυηενδ πμζυηδηα εκγφιμο, ηοπζηά, ακηζζημζπμφκ ζε κμοηθεμηίδζα πμο είκαζ πζμ πνμζαάζζια απυ ημ έκγοιμ. Ώημθμοεεί δ ίδζα δζαδζηαζία ηαηαηνήικζζδξ ηςκ RNA ιμνίςκ, υπςξ ηαζ ζηζξ ακηζδνάζεζξ αθθδθμφπζζδξ. Σεθζηά, 3 ιl απυ υθςκ ηςκ εζδχκ ηζξ ακηζδνάζεζξ θμνηχκμκηαζ ζε PAGE 6 % - 8 Μ μονία. Σα πνμσυκηα ηςκ ακηζδνάζεςκ ειθακίγμκηαζ ιε ηδ πνήζδ ημο Phosphorimager Fujifilm FLA 3000 ηαζ δ πμζμηζημπμίδζδ ηςκ γςκχκ πναβιαημπμζήεδηε ιε ηδ αμήεεζα ημο θμβζζιζημφ AIDA. Gel Loading Buffer II: 95% θμνιαιίδζμ, 18mM EDTA ηαζ 0.025% SDS, Xylene Cyanol ηαζ Bromophenol Blue. Δ αηνζαήξ ζφζηαζδ ηςκ οπυθμζπςκ δζαθοιάηςκ πμο πνδζζιμπμζήεδηακ δε δίκμκηαζ απυ ηδκ εηαζνία Αλάιπζε απνηππώκαηνο ηεο RNA ππνκνλάδαο ηεο RNase P ηνπ D. discoideum παξνπζία ηεο DRpp29 ΐαζζγυιεκμζ ζηδ δεοηενμηαβή δμιή ηδξ RNA οπμιμκάδαξ ηδξ RNase P πμο πνμζδζμνίζηδηε υπςξ πενζβνάθδηε ζηδ πανάβναθμ 8.1, πναβιαημπμζήεδηε ακάθοζδ απμηοπχιαημξ ημο RNA αοημφ πανμοζία ηδξ ακαζοκδοαζιέκδξ πνςηεύκδξ DRpp29. Αζελήπεδζακ μζ ακηζδνάζεζξ αθθδθμφπζζδξ ηαζ πνμζδζμνζζιμφ ηδξ δεοηενμηαβμφξ δμιήξ ημο RNA ιε Σ1 νζαμκμοηθεάζδ αηνζαχξ υπςξ πνμακαθένεδηε ( 8.1). Σαοηυπνμκα 3 επζπθέμκ ακηζδνάζεζξ πναβιαημπμζήεδηακ, υπμο ημ ναδζεκενβά ζδιαζιέκμ RNA αθθδθεπίδναζε ιε αολακυιεκεξ ζοβηεκηνχζεζξ (5x, 15x ηαζ 30x πενίζζεζα) ακαζοκδοαζιέκδξ DRpp29 βζα 20 min ζημοξ 30 μ C, πανμοζία 2 ιg μθζημφ RNA γφιδξ. ηδ ζοκέπεζα αημθμφεδζε δ δζαδζηαζία επελενβαζίαξ ιε ηδκ Σ1 νζαμκμοηθεάζδ, υπςξ αηνζαχξ ακαθένεηαζ ζηδκ πνμδβμφιεκδ πανάβναθμ. 135

137 Τιηθά θαη Μέζνδνη 9. Αλαζύζηαζε ελδπκηθήο δξαζηηθόηεηαο RNase P in vitro Δηεξόινγε αλαζύζηαζε δξαζηηθόηεηαο RNase P (DRpp29-M1 RNA) Γζα ηδκ εηηίιδζδ ηδξ ζηακυηδηαξ ηδξ DRpp29 κα αθθδθεπζδνά ιε ημ Μ1 RNA ηαζ ιαγί κα δδιζμονβμφκ έκα δναζηζηυ ζφιπθμημ ζηακυ κα ςνζιάγεζ ημ πνυδνμιμ ιυνζμ trna Ser (psups1), M1 RNA (3.5 pmol) επςάγεηαζ ιε 17.5, 35, 70 and 105 pmol ορδθήξ ηαεανυηδηαξ DRpp29 ζε 20ιL δζαθφιαημξ Μ βζα 2 hrs ζημοξ 37 μ C. Μεηά αημθμοεεί δ πνμζεήηδ ναδζεκενβά ζδιαζιέκμο οπμζηνχιαημξ psups1 (1 nm) ηαζ ημ ιίβια ηδξ ακηίδναζδξ επςάγεηαζ βζα 1 επζπθέμκ χνα ζημοξ 37 o C. Γζα ημκ πνμζδζμνζζιυ ηςκ ηζκδηζηχκ ζηαεενχκ K m ηαζ k cat δζελάβεηαζ ηζκδηζηή ακάθοζδ ηαηά Michaelis-Menten, υπμο 5 pmol M1 RNA ηαζ 50 pmol ηαεανήξ DRpp29 επςάγμκηαζ βζα 3 hrs ζημοξ 37 o C ζε 20ιL δζαθφιαημξ Μ ( 7.1). Μεηά ημ πέναξ ηδξ επχαζδξ, πνμζηίεεκηαζ ζημ ακαζοζηάιεκμ ζφιπθμημ αολάκμιεκεξ ζοβηεκηνχζεζξ οπμζηνχιαημξ SupS1 (0.5-2 ιm), ηαεχξ επίζδξ ηαζ ιζηνή πμζυηδηα ζδιαζιέκμο SupS1 (1 nm). Σμ ιίβια ηδξ ακηίδναζδξ επςάγεηαζ βζα άθθδ 1 hr ζημοξ 37 o C. ηδ πενίπηςζδ ηδξ ηζκδηζηήξ ακάθοζδξ ημο μιυθμβμο ακαζοζηαιέκμο μθμεκγφιμο ηδξ C5 πνςηεύκδξ (δ πνςηεσκζηή οπμιμκάδα ηδξ RNase P απυ ημ E. coli) ιε ημ M1 RNA, 0.5 pmol ημο M1 RNA ηαζ 2.5 pmol ηδξ C5 πνςηεύκδξ επςάγμκηαζ ζε 20 ιl δζαθφιαημξ Μ ( 7.1), βζα 30 min ζημοξ 37 o C. ηδ ζοκέπεζα, πνμζηίεεκηαζ αολακυιεκεξ ζοβηεκηνχζεζξ οπμζηνχιαημξ SupS1 (10-100nM) ιαγί ιε ζδιαζιέκμ SupS1 (~1 nm). Σα δείβιαηα επςάγμκηαζ βζα 5 min ζημοξ 37 o C. Κζκδηζηή ιεθέηδ πναβιαημπμζήεδηε ηαζ βζα ημ νζαμέκγοιμ Μ1 ιε ηδ πνήζδ ημο SupS1 ςξ οπυζηνςια, αημθμοεχκηαξ ηδκ ίδζα δζαδζηαζία, υπςξ ζηδ πανάβναθμ 9.1.2, ιε ιμκαδζηή δζαθμνά ηδκ απμοζία ηδξ πνςηεύκδξ ηαζ ηδκ αφλδζδ ηδξ ζοβηέκηνςζδξ MgCl 2 ζημ δζάθοια Μ απυ 10 ζε 50 mm. θεξ μζ ακηζδνάζεζξ ζηαιαημφκ ιε 5 ιl δζαθφιαημξ ηενιαηζζιμφ ( 2.4.2) ηαζ ηα πνμσυκηα ηδξ ακηίδναζδξ δζαπςνίγμκηαζ ζε PAGE 10% - 8 Μ μονία. Σα απμηέθεζιαηα μπηζημπμζμφκηαζ ιε αοημναδζμβναθία ιε ηδ πνήζδ ημο Phosphorimager Fujifilm FLA 3000 ηαζ δ πμζμηζημπμίδζδ ηςκ γςκχκ πναβιαημπμζείηαζ ιε ηδ αμήεεζα ημο θμβζζιζημφ AIDA. Γηάιπκα Μ: 50 mm Tris-HCl ζε ph 7.6, 10 mm MgCl 2, 100 mm NH 4 Cl Δηεξόινγε αλαζύζηαζε δξαζηηθόηεηαο RNase P (Γ75-M1 RNA) Δ ίδζα πεζναιαηζηή δζαδζηαζία ακαζφζηαζδξ πμο πενζβνάθεηαζ ζηδκ πανάβναθμ

138 Τιηθά θαη Μέζνδνη αημθμοεήεδηε βζα ηδκ ελαηνίαςζδ εάκ δ εκενβή δζαιυνθςζδ ημο Μ1 RNA απμηαείζηακηαζ πανμοζία ηςκ ακαζοκδοαζιέκςκ πμθοπεπηζδίςκ Α75, Α155 ηαζ NTR. Βπεζδή ιυκμ ημ Α75 δφκαηαζ κα ζπδιαηίζεζ εκενβυ ζφιπθμημ ιε ημ Μ1 RNA ιε δναζηζηυηδηα RNase P, ζηδ ζοκέπεζα πανμοζζάγεηαζ δ ηζκδηζηή ακάθοζδ ημο εηενυθμβμο αοημφ ζοιπθυημο βζα πνμζδζμνζζιυ ηςκ ηζκδηζηχκ ζηαεενχκ K m, k cat ηαζ ζφβηνζζδ ιε ηα παναπάκς απμηεθέζιαηα Κηλεηηθή αλάιπζε ηνπ αλαζπζηακέλνπ ζπκπιόθνπ Γ75-M1 RNA 5 pmol M1 RNA ηαζ 50 pmol ηαεανμφ Α75 επςάγεηαζ βζα 3 hrs ζημοξ 37 o C ζε 20ιL δζαθφιαημξ Μ ( 7.1). Μεηά ημ πέναξ ηδξ επχαζδξ πνμζηίεεκηαζ ζημ ακαζοζηάιεκμ ζφιπθμημ αολάκμιεκεξ ζοβηεκηνχζεζξ οπμζηνχιαημξ SupS1 (0.5-2 ιm), ηαεχξ επίζδξ ηαζ ιζηνή πμζυηδηα ζδιαζιέκμο SupS1 (1 nm). Σμ ιίβια ηδξ ακηίδναζδξ επςάγεηαζ βζα άθθδ 1 h ζημοξ 37 o C ηαζ δ ακηίδναζδ ζηαιαηά ιε πνμζεήηδ 5 ιl δζαθφιαημξ ηενιαηζζιμφ ( 2.4.2). Σα πνμσυκηα ηδξ ακηίδναζδξ δζαπςνίγμκηαζ ηαζ πμζμηζημπμζμφκηαζ, υπςξ ακαθένεηαζ ζηζξ παναβνάθμοξ ηαζ Οκόινγε αλαζύζηαζε δξαζηηθόηεηαο RNase P Γζα ηδκ εηηίιδζδ ηδξ δναζηζηυηδηαξ ηδξ RNA οπμιμκάδαξ ηδξ RNase P απυ ημ D. discoideum πανμοζία ηςκ ακαζοκδοαζιέκςκ πνςηεσκχκ DRpp29 ηαζ Α404, 10 pmol απυ ηδκ RNA οπμιμκάδα ακαιεζβκφμκηαζ ιε ηζξ πνςηεύκεξ DRpp29 (δ πνςηεύκδ ανίζηεηαζ ζε δζάθοια 3 Μ μονία) ηαζ Α404 (ημ πμθοπεπηίδζμ αοηυ ανίζηεηαζ ζε δζάθοια πμο πενζέπεζ 6 Μ μονία) ζε ακαθμβία 1: 2: 2 ή 1: 1: 2, ζε δζάθοια CD ( 2.4) (ηεθζηυξ υβημξ 20 ιl). Σμ ιίβια ακαζφζηαζδξ επςάγεηαζ ζε εενιμηναζία δςιαηίμο ή ζημοξ 4 o C βζα 16 h. Μεηά ημ πέναξ ηδξ πενζυδμο ακαζφζηαζδξ ζηδκ ακηίδναζδ πνμζηίεεηαζ ναδζεκενβά ζδιαζιέκμ οπυζηνςια SupS1 (~1 nm) ηαζ επςάγεηαζ βζα 1 επζπθέμκ h ζημοξ 37 μ C. Δ ακηίδναζδ ζηαιαηά ιε ηδκ πνμζεήηδ 5 ιl δζαθφιαημξ ηενιαηζζιμφ ( 2.4.2) ηαζ ηα πνμσυκηα ηδξ ακηίδναζδξ δζαπςνίγμκηαζ ηαζ μπηζημπμζμφκηαζ, υπςξ ακαθένεηαζ ζηζξ παναβνάθμοξ ηαζ

139 Τιηθά θαη Μέζνδνη 10. Μνληέιν δνκήο ηεο DRpp Μνληεινπνίεζε ηεο DRpp29 βάζεη νκνινγίαο Οζ αιζκμλζηέξ αθθδθμοπίεξ πμο πνδζζιμπμζήεδηακ απμηηήεδηακ ζηζξ αάζεζξ δεδμιέκςκ SWISS/PROT (Bairoch ηαζ Apweiler 2000) ηαζ Protein Data Bank (Berman et al 2000), εκχ δ πμθθαπθή μιμπανάεεζδ ηςκ αθθδθμοπζχκ αοηχκ πναβιαημπμζήεδηε ιε ηδ πνήζδ ημο αθβυνζειμο CLUSTALW, 1.83 (Thompson et al 1994). Δ ιέεμδμξ TopLign δζελήπεδ βζα ηδκ πνυαθερδ ηδξ δεοηενμηαβμφξ δμιήξ ηδξ οπυ ιεθέηδ Drpp29 ηαζ ααζίγεηαζ ζηδκ μιμπανάεεζδ ηςκ αθθδθμοπζχκ μιυθμβςκ πνςηεσκχκ (Thiele et al 1999). Δ ακαγήηδζδ ηαζ ζφβηνζζδ ηνζημηαβχκ δμιχκ ααζίζηδηε ζηα πνμβνάιιαηα DALI (Holm ηαζ Sander 1993), FSSP (Holm ηαζ Sander 1996), SCOP (Murzin et al 1995), VAST (Gibrat et al 1996) ηαζ CATH (Orengo et al 1997). Δ πνυαθερδ ηδξ δμιήξ ηδξ DRpp29 (20 πζεακέξ δζαιμνθχζεζξ) πναβιαημπμζήεδηε ιε ζοβηνζηζηή ιμκηεθμπμίδζδ, ιε ηδ πνήζδ ημο πνμβνάιιαημξ MODELER v6.1 (Sali et al 1995), ααζζγυιεκδ ζηζξ ήδδ οπάνπμοζεξ ηνοζηαθθζηέξ δμιέξ μιυθμβςκ ιμνίςκ ηαζ ηονίςξ ηδξ μιυθμβδξ PhoRpp29 απυ ημ ανπαίμ P. horikoshii ηαζ ηδξ PfuRpp29 απυ ημ P. furiosus (PDB i.d.: 1ZAE). Ώπυ ηα 20 πζεακά ιμκηέθα, επζθέπεδηε δ πζμ εενιμδοκαιζηά ζηαεενή (Sippl 1993, Laskowski et al 1993). Οζ αθβυνζειμζ PROFILER3D (Luthy et al 1992) ηαζ ERRAT (Colovos ηαζ Yeates 1993) πνδζζιμπμζήεδηακ βζα επαθήεεοζδ ηαζ παναηηδνζζιυ ηδξ δζαιυνθςζδξ ηςκ ηαηαθμίπςκ ηςκ πνςηεσκζηχκ δμιχκ πμο έπμοκ πνμζδζμνζζηεί ηνοζηαθθμβναθζηά, έηζζ χζηε κα ακαπηοπεεί έκα αλζυπζζημ ιμκηέθμ ηδξ DRpp29. Καζ ηα δομ θμβζζιζηά έδςζακ ζοβηνίζζια απμηεθέζιαηα. Πνμζδζμνζζιυξ ηςκ ημζθμηήηςκ πναβιαημπμζήεδηε ιε ημ CASTp (Liang et al 1998) ηαζ μζ δοκδηζημί δθεηηνμζηαηζημί πάνηεξ οπμθμβίζηδηακ ιε ημ MOLMOL (Koradi et al 1996) Πξόβιεςε ησλ πηζαλώλ θαηαινίπσλ ηεο DRpp29 πνπ αιιειεπηδξνύλ κε RNA Γζα ηδκ πνυαθερδ ηςκ ηαηαθμίπςκ ηδξ DRpp29 πμο αθθδθεπζδνμφκ ιε RNA πνδζζιμπμζήεδηακ ηνεζξ δζαθμνεηζημί servers: α) μ PPRINT ( (Kumar et al 2008), υπμο δ πνυαθερδ βίκεηαζ αάζεζ ημο SVM (support vector machine), εζηζάγμκηαξ ζε πθδνμθμνίεξ ελέθζλδξ (οπυ ιμνθή PSSM ζε ακαγήηδζδ ζημ PSI-BLAST), β) μ BindN ( (Wang ηαζ Brown 2006), πμο εθανιυγεζ πάθζ SVMs βζα ηδκ πνυαθερδ ηαηαθμίπςκ πμο αθθδθεπζδνμφκ ιε RNA, αάζεζ ηςκ παναηηδνζζηζηχκ ηδξ αθθδθμοπίαξ, θαιαάκμκηαξ οπ 138

140 Τιηθά θαη Μέζνδνη υρζκ ηδκ ηζιή pka ηςκ πθεονζηχκ αθοζίδςκ, ηδκ οδνμθμαζηυηδηα ηαζ ημ ιμνζαηυ αάνμξ ηάεε αιζκμλέμξ ηαζ γ) μ RNABindR ( (Terribilini et al 2007), πμο ηαλζκμιεί ζφιπθμηα πνςηεύκδξ-rna απυ ηδ πνςηεσκζηή αάζδ δεδμιέκςκ (PDB) ηαζ πνμαθέπεζ πμζά αιζκμλέα ζε ιζα πνςηεσκζηή αθθδθμοπία είκαζ πζμ πζεακυ κα δεζιεφμκηαζ ζε RNA. 139

141

142

143

144 Απνηειέζκαηα 1. Κισλνπνίεζε ηνπ γνληδίνπ drpp Πξνζδηνξηζκόο πξσηνηαγνύο αιιεινπρίαο θαη θισλνπνίεζε ηνπ γνληδίνπ drpp29 Δ ακαγήηδζδ ζηδ βμκζδζςιαηζηή ηνάπεγα δεδμιέκςκ dictybase ( είπε ςξ απμηέθεζια ηδκ εφνεζδ εκυξ βμκζδίμο, πμο αάζεζ μιμθμβίαξ θαζκυηακ κα απμηεθεί ημ βμκίδζμ πμο ηςδζημπμζεί ηδκ πνςηεσκζηή οπμιμκάδα ηδξ RNase P απυ ημ ιολμιφηδηα D. discoideum, ιε ηςδζηυ DDB_G Δ πνςηεύκδ αοηή μκμιάζηδηε DRpp29 (Dictyostelium RNase P Protein 29), θυβς ηδξ μιμθμβίαξ ηδξ ιε ηδκ ακενχπζκδ Rpp29. ΐαζζγυιεκμζ ζηδκ αθθδθμοπία πμο δίκεηαζ απυ ηδκ παναπάκς ηνάπεγα δεδμιέκςκ ζπεδζάζηδηε έκα γεφβμξ εηηζκδηχκ βζα ημ βμκίδζμ drpp29 (drpp29f/drpp29r, 3.1.1), χζηε κα ηθςκμπμζδεεί. Γζα ηδκ εκίζποζδ ημο ακμζπημφ πθαζζίμο ακάβκςζδξ ημο drpp29, πνδζζιμπμζήεδηε μθζηυ RNA απυ ημκ ιολμιήηοηα ηαζ ιε ηδ ιέεμδμ ηδξ RT-PCR δζαπζζηχεδηε δ φπανλδ ημο βμκζδίμο ζημκ μνβακζζιυ ζημ ακαιεκυιεκμ ιέβεεμξ (Δηθόλα 1. 1). Εικόνα 1. 1: Δθεηηνμθυνδζδ ζε πήηηςια αβανυγδξ 2 %. Αζαδνμιή 1: DNA ιάνηοναξ, δζαδνμιή 2: πνμσυκ ηδξ RT-PCR. Με ηυηηζκμ αέθμξ ζδιεζχκεηαζ ημ επζεοιδηυ πνμσυκ πμο απμιμκχκεηαζ βζα ηδκ ηθςκμπμίδζδ ημο βμκζδίμο. Σμ πνμσυκ ηδξ RT-PCR, ημ μπμίμ απμιμκχεδηε ηαζ εηποθίζηδηε απυ ημ πήηηςια αβανυγδξ (Μέεμδμζ, 3.6), πνδζζιμπμζήεδηε βζα έκεεζή ημο ζε πθαζιζδζαηυ θμνέα pcrii βζα ηθςκμπμίδζή ημο ιε ηδ ιέεμδμ ΣΏ (Μέεμδμζ, 3.7). Σμ ακαζοκδοαζιέκμ πθαζιίδζμ pcrii/drpp29 ιεηαζπδιάηζζε δεηηζηά ηφηηανα DH5a, απυ υπμο απμιμκχεδηε ζηδ ζοκέπεζα ζε ιζηνή ηθίιαηα (Μέεμδμζ 3.8 ηαζ 3.9.1) ηαζ πνμζδζμνίζεδηε δ πνςημηαβήξ δμιή ημο έκεεημο cdna ηδξ DRpp

145 Απνηειέζκαηα Οκνπαξάζεζε ηεο DRpp29 κε νξζόινγεο πξσηεΐλεο από άιινπο νξγαληζκνύο Σμ βμκίδζμ drpp29 έπεζ ιέβεεμξ 759 γεφβδ αάζεςκ (bp) ηαζ ηςδζημπμζεί ηδκ DRpp29, ιζα εεηζηά θμνηζζιέκδ πνςηεύκδ (pi 9.6) πμο απμηεθείηαζ απυ 252 αιζκμλέα ηαζ ιε ιμνζαηυ αάνμξ kda. Δ πμθθαπθή μιμπανάεεζδ αθθδθμοπζχκ ακάιεζα ζηδκ αιζκμλζηή αθθδθμοπία ηδξ DRpp29 ηαζ ζε ήδδ παναηηδνζζιέκεξ πνςηεύκεξ απυ εοηανοςηζημφξ μνβακζζιμφξ ηαζ ανπαία (υπςξ H. sapiens, M. musculus, D. melanogaster S. cerevisiae, S. pombe ηαζ P. horikoshii, M. jannaschii, ακηίζημζπα), πνδζζιμπμζχκηαξ ημκ αθβυνζειμ Clustal W (Thompson et al 1994), απμηάθορε ιζα ημζκή πενζμπή ζημ ηαναμλοηεθζηυ άηνμ αοηχκ ηςκ πνςηεσκχκ (Δηθόλα 1. 2). Βπίζδξ, απμηάθορε ιζα λεπςνζζηή πενζμπή πανμφζα ιυκμ ζηα εοηανοςηζηά μνευθμβα ημκηά ζημ αιζκμ-ηεθζηυ ημοξ άηνμ (Δηθόλα 1. 2). Δ DRpp29 θένεζ ζημ αιζκμ-ηεθζηυ ηδξ άηνμ ιζα πενζμπή 75 αιζκμλέςκ, δ μπμία ανίζηεηαζ απμηθεζζηζηά ζε αοηή ηδκ πνςηεύκδ ηαζ πμο δεκ πανμοζζάγεζ μιμθμβία ιε ηαιία άθθδ (Δηθόλα 1. 2). Εικόνα 1. 2: Οιμπανάεεζδ ηδξ DRpp29 ιε μιυθμβεξ πνςηεύκεξ. Υνδζζιμπμζήεδηε μ αθβυνζειμξ ClustalW (1.83, Blosum scoring matrix). Σα υιμζα αιζκμλέα ζηζάγμκηαζ ιε ιαφνμ πνχια, εκχ ηα πανυιμζα ιε βηνζ, ιε ηαηχθθζ 60%. Οζ πνςηεύκεξ Rpp29 απυ ημκ άκενςπμ (NP_006404), ημκ M. musculus (NC_ ), ηδκ D. melanogaster (NP_648168), Pop4 απυ ημ S. cerevisiae (NP_011929), ημκ S. pombe (XP_ ), Pfu1771 απυ ημ ανπαίμ P. furiosus (NP_579545) ηαζ απυ ημ M. jannaschii (NP_247439) είκαζ παναηηδνζζιέκεξ οπμιμκάδεξ ηδξ RNase P. 142

146 Απνηειέζκαηα Τπνθισλνπνίεζε ηνπ drpp29 ζε πιαζκηδηαθό θνξέα έθξθαζεο Ο πθαζιζδζαηυξ θμνέαξ πμο επζθέπεδηε βζα ηδκ οπενέηθναζδ ημο drpp29 είκαζ μ pet29c(+). Αζαεέηεζ ςξ ιάνηονα επζθμβήξ ημ βμκίδζμ ακεεηηζηυηδηαξ ζηδκ ηακαιοηίκδ, εκχ ζηδκ πενζμπή οπμηθςκμπμίδζδξ (Δηθόλα 1. 3) οπάνπμοκ ιεηαλφ άθθςκ μζ αθθδθμοπίεξ ακαβκχνζζδξ ηςκ πενζμνζζηζηχκ κμοηθεαζχκ NdeI ηαζ XhoI, ζημ 5 ηαζ 3 ζδιείμ έκεεζδξ, ακηίζημζπα. Δ αθθδθμοπία πενζμνζζιμφ ημο NdeI πενζέπεζ ιζα ηνζπθέηα ATG, δ μπμία παίγεζ ημ νυθμ ηδξ εκανηηήνζαξ ιεεεζμκίκδξ ηαηά ηδ ιεηάθναζδ ημο ακαζοκδοαζιέκμο βμκζδίμο. Μεηά ηδκ αθθδθμοπία ημο XhoΗ, δ κμοηθεμηζδζηή αθθδθμοπία ημο θμνέα ηςδζημπμζεί 6 ζζηζδίκεξ ηαζ αιέζςξ ιεηά ανίζηεηαζ ημ ηςδζηυκζμ θήλδξ TGA. Δ ακαζοκδοαζιέκδ πνςηεύκδ πμο πανάβεηαζ εα θένεζ ζημ ηαναμλο-ηεθζηυ άηνμ μονά 6 ζζηζδζκχκ βζα ημκ ηαεανζζιυ ηδξ ιε πνςιαημβναθία ζοββεκείαξ. Εικόνα 1. 3: Πενζμπή οπμηθςκμπμίδζδξ ημο θμνέα pet29c(+). Αζαηνίκμκηαζ μζ εέζεζξ πενζμνζζιμφ βζα ηζξ δζάθμνεξ κμοηθεάζεξ. ε ιπθε πθαίζζμ θαίκμκηαζ μζ εέζεζξ πενζμνζζιμφ NdeI ηαζ XhoI πμο πνδζζιμπμζήεδηακ βζα ηδκ οπμηθςκμπμίδζδ ημο drpp29. Βπίζδξ, ζδιεζχκμκηαζ μ οπμηζκδηήξ ηδξ Σ7 RNA πμθοιενάζδξ, δ πενζμπή πνυζδεζδξ ημο mrna ζημ πνμηανοςηζηυ νζαυζςια (rbs) ηαζ δ μονά ζζηζδζκχκ πμο ηςδζημπμζείηαζ πνζκ απυ ημ ηςδζηυκζμ θήλδξ TGA Παξαιαβή drpp29 θαη θνξέα έθθξαζεο κε ζπλεθηηθά άθξα Σμ έκεεημ drpp29 ζημ ακαζοκδοαζιέκμ θμνέα pcrii θένεζ ηζξ αθθδθμοπίεξ ακαβκχνζζδξ ηςκ πενζμνζζηζηχκ εκγφιςκ NdeI ηαζ XhoI ζημ 5 ηαζ 3 άηνμ ημο ακηίζημζπα. Ώοηυ πνμέηορε, θυβς ημο υηζ δ εκίζποζδ ημο drpp29 έβζκε ιε ημ γεφβμξ εηηζκδηχκ drpp29f/drpp29r, ζημοξ μπμίμοξ ηαηά ημκ ζπεδζαζιυ πνμζεέζαιε αοηέξ ηζξ αθθδθμοπίεξ. ηδ ζοκέπεζα, ημ απμιμκςιέκμ ακαζοκδοαζιέκμ πθαζιίδζμ pcrii/drpp29, υπςξ επίζδξ ηαζ ημ πθαζιίδζμ pet29c(+) οπυηεζκηαζ ζε δζπθή πέρδ ιε ηα έκγοια NdeI ηαζ XhoI ηαζ ηα πνμσυκηα δθεηηνμθμνμφκηαζ ζε πήηηςια αβανυγδξ 2% (Δηθόλα ). 143

147 Απνηειέζκαηα Ήηακ βκςζηυ υηζ δ αθθδθμοπία ημο drpp29, εηηυξ απυ ηδκ εέζδ NdeI πμο εζζαβάβμοιε ζημ 5 άηνμ, πενζέπεζ ιζα εέζδ πενζμνζζιμφ βζα ημ ίδζμ έκγοιμ ζε εζςηενζηυ ζδιείμ ηδξ αθθδθμοπίαξ. Γζα ημ θυβμ αοηυ πναβιαημπμζήεδηε ιενζηή πέρδ ημο πθαζιζδίμο, χζηε κα Εικόνα : Δθεηηνμθυνδζδ ζε πήηηςια αβανυγδξ 1.5 % ηςκ πθαζιζδίςκ ιεηά απυ δζπθή πέρδ ιε ηα έκγοια NdeI ηαζ XhoI. Αζαδνμιή 1: ιάνηοναξ DNA, δζαδνμιή 2: πθαζιίδζμ pcrii/drpp29 ιεηά απυ πέρδ ιε NdeI ηαζ XhoI, δζαδνμιή 3: άημπμ πθαζιίδζμ pcrii/drpp29 ηαζ δζαδνμιή 4: πθαζιίδζμ pet29a(+) ιεηά απυ πέρδ ιε NdeI ηαζ XhoI. Σα πνμσυκηα ιε ιεβέεδ 759 bp οπάνπμοκ ιυνζα ημο εκεέημο πμο κα έπμοκ δεπεεί εναφζδ ιυκμ ζηδ εέζδ NdeΗ πμο ανίζηεηαζ ζημ 5 άηνμ ημο βζα κα πάνμοιε ημ πνμσυκ πμο εέθμοιε. Οζ γχκεξ πμο ηαζ 5229 bp, είκαζ ηα επζεοιδηά πμο απμηυπημκηαζ ηαζ αθμνμφκ ημ drpp29 ηαζ ημ βναιιμπμζδιέκμ pβσ29a(+), ακηίζημζπα. Σμ πνμσυκ ιεβέεμοξ 496 bp πνμηφπηεζ απυ ηδκ εζςηενζηή εέζδ ακαβκχνζζδξ πμο οπάνπεζ ζημ βμκίδζμ drpp29 ακηζζημζπμφκ ζημ drpp29 ηαζ ζημ (εέζδ: 263 nt) απυ ημ έκγοιμ NdeI. βναιιμπμζδιέκμ pet29c(+) ζδιεζχκμκηαζ ιε αέθμξ. Οζ γχκεξ απμηυπημκηαζ, ηαεανίγμκηαζ ηαζ αημθμοεεί ακηίδναζδ ζοκδεηάζδξ (Μέεμδμζ, 4.1.1) Μεηαζρεκαηηζκόο δεθηηθώλ BL21(DE3)Codon plus Μεηά ημκ ζπδιαηζζιυ ημο ακαζοκδοαζιέκμο θμνέα έηθναζδξ pet29c(+)/drpp29, πναβιαημπμζήεδηε ιεηαζπδιαηζζιυξ δεηηζηχκ ηοηηάνςκ BL21(DE3)Codon plus (Μέεμδμζ, 3.8). Δ αιζκμλζηή αθθδθμοπία ηδξ DRpp29 πενζέπεζ δομ ανβζκίκεξ (Arg, R) ζηζξ εέζεζξ 70 ηαζ 239, μζ μπμίεξ ηςδζημπμζμφκηαζ απυ ηδ ηνζπθέηα AGG. Βλ αζηίαξ ημο εηθοθζζιμφ ημο βεκεηζημφ ηχδζηα, ημ ηςδζηυκζμ αοηυ απακηάηαζ ζπάκζα ζηα ααηηδνζαηά βμκίδζα (rare codon). Σμ βεβμκυξ αοηυ λεπενκάηαζ ιε ηδ πνήζδ ζοβηεηνζιέκςκ ζηεθεπχκ E. coli, ηα μπμία έπμοκ επελενβαζηεί, έηζζ χζηε κα θένμοκ trna βμκίδζα πμο ακαβκςνίγμοκ ηζξ ζπάκζεξ αοηέξ ηνζπθέηεξ. Σέημζα ααηηδνζαηά ζηεθέπδ είκαζ ηα BL21(DE3)Codon plus, ηαεχξ επίζδξ ηαζ ηα BL21(DE3)Rosetta. Οζ πζμ εοιεβέεεζξ απμζηίεξ (πμο ζδιαίκεζ ηαθή ακάπηολδ πανμοζία ακηζαζμηζημφ, άνα ζηαεενυ πθαζιίδζμ) απυ ηα ιεηαζπδιαηζζιέκα ηφηηανα εθέβπεδζακ ιε colony PCR βζα 144

148 Απνηειέζκαηα ηδκ πανμοζία ημο drpp29 ηαζ ιζα ελ αοηχκ πνδζζιμπμζήεδηε βζα επαβςβή ηδξ έηθναζδξ ημο ηιήιαημξ drpp Παξαιαβή θαζαξήο αλαζπλδπαζκέλεο πξσηεΐλεο DRpp Δπαγσγή ηεο έθθξαζεο ηνπ drpp29 Δ επαβςβή ηδξ έηθναζδξ ηδξ DRpp29 πναβιαημπμζήεδηε πανμοζία 1 mm IPTG (Μέεμδμζ, 4.2) βζα 4 hrs. Δ DRpp29 απμηεθείηαζ απυ 252 αιζκμλέα ηαζ έπεζ ιμνζαηυ αάνμξ ~30 kda. Δ πανμοζία DRpp29-His 6 εθέβπεδηε ζε δείβια μιμβεκμπμζδιέκςκ ηοηηάνςκ ιε ακάθοζδ western πνδζζιμπμζχκηαξ anti-his mouse IgG (Δηθόλα 2. 1-Α). Σαοηυπνμκα, απυ ηδκ μιμβεκμπμίδζδ ηςκ ηοηηάνςκ πανεθήθεδ ημ ηθάζια ηςκ δζαθοηχκ ηαζ αδζάθοηςκ πνςηεσκχκ, υπμο ηαζ δζελήπεδ ακάθοζδ ηαηά western βζα κα δζαπζζηςεεί ζε πζμ ηθάζια παναθαιαάκεηαζ ημ ιεβαθφηενμ πμζμζηυ ηδξ ακαζοκδοαζιέκδξ Εικόνα 2. 1: Ώκάθοζδ ηαηά western βζα ακίπκεοζδ ηδξ πνςηεύκδξ. Ώθμφ επζαεααζχεδηε δ DRpp29 ιεηά απυ επαβςβή ηδξ έηθναζήξ ηδξ. (A) Ώκίπκεοζδ ηδξ οπενεηθναζιέκδξ DRpp29 ζε ηφηηανα έηθναζδ ημο ακαζοκδοαζιέκμο BL21(DE3)Codon plus, ζε δζαθμνεηζημφξ πνυκμοξ ηαζ ζημοξ 30 μ C, ιε ηδ πνήζδ Anti-His. Αζαδνμιή ΝΕ (Non πμθοπεπηζδίμο ηαζ δ ζε ιεβάθμ πμζμζηυ φπανλή ημο ζημ αδζάθοημ Induced): δείβια ηοηηανζημφ μιμβεκμπμζήιαημξ πνζκ ηδκ ηθάζια ηςκ πνςηεσκχκ (Δηθόλα 2. επαβςβή ηδξ έηθναζδξ. Αζαδνμιέξ 1-5: δείβιαηα 1-Β), αημθμφεςξ έβζκε επαβςβή ηδξ ηοηηανζημφ μιμβεκμπμζήιαημξ ζημοξ ακαβναθυιεκμοξ πνυκμοξ επαβςβήξ ηδξ έηθναζδξ. (Β) Ώκίπκεοζδ ηδξ έηθναζδξ ηδξ DRpp29 ζε ακαζοκδοαζιέκδξ DRpp29 ζημ αδζάθοημ (δζαδνμιή 1) ηαζ ιεβαθφηενδ ηθίιαηα, ηαζ δζαθοηυ (δζαδνμιή 2) ηθάζια πνςηεσκχκ, ιεηά απυ 4 hrs επαβςβήξ ηδξ έηθναζδξ ηαζ ιε ηδ πνήζδ Anti-His. ηαεανζζιυξ ηδξ ιε πνςιαημβναθία ζοββεκείαξ Απνκόλσζε ηεο DRpp29 κε ρξσκαηνγξαθία ζπγγελείαο αθηλεηνπνηεκέλνπ ληθειίνπ Κφηηανα BL21(DE3)Codon plus - pet29c(+)/drpp29, απυ ηαθθζένβεζα υβημο 1 L, ζοθθέπεδζακ, μιμβεκμπμζήεδηακ ηαζ απυ ημ μιμβεκμπμίδια πανεθήθεδ ημ ηθάζια ηςκ 145

149 Απνηειέζκαηα αδζάθοηςκ πνςηεσκχκ πνμηεζιέκμο κα πνςιαημβναθδεμφκ ζε ζηήθδ ζοββεκείαξ βζα ηδκ απμιυκςζδ ημο ακαζοκδοαζιέκμο πμθοπεπηζδίμο (Μέεμδμζ, 4.4). Σμ εηπφθζζια ημο ηθάζιαημξ ηςκ αδζάθοηςκ πνςηεσκχκ θμνηχεδηε ζε ζηήθδ NiNTA, δ μπμία είκαζ ελζζμννμπδιέκδ ζε ph 8.0, βζα κα εοκμείηαζ δ αθθδθεπίδναζδ ημο ελαπεπηζδίμο ζζηζδζκχκ ιε ημ κζηέθζμ ηδξ ζηήθδξ. Οζ ιδ εζδζηά δεζιεοιέκεξ πνςηεύκεξ απμιαηνφκεδηακ ιε εθαθνχξ υλζκμ δζάθοια (ph 6.3), ηαζ δ έηθμοζδ ηδξ ακαζοκδοαζιέκδξ πνςηεύκδξ έβζκε ζε δφμ αήιαηα, ιε ηδ πνήζδ νοειζζηζηχκ δζαθοιάηςκ ιε ph 5.9 ηαζ 4.5. Αείβιαηα απυ ηα ηθάζιαηα ηδξ ζηήθδξ ακαθφεδηακ ιε δθεηηνμθυνδζδ ζε πήηηςια SDS/πμθοαηνοθαιζδίμο (SDS PAGE, Δηθόλα 2. 2). Εικόνα 2. 2: Πήηηςια SDS PAGE, ποηκυηδηαξ 14%, ηςκ ηθαζιάηςκ πμο ζοθθέπεδζακ απυ ημ ηαεανζζιυ ζε ζηήθδ Ni-NTA. Αζαδνμιή 1: δείβια ηοηηανζημφ εηποθίζιαημξ (CE, Cell Extract), δζαδνμιή 2: δείβια απυ ημ ηθάζια λεπθφιαημξ ηδξ ζηήθδξ (W, Wash), δζαδνμιή 3: δείβια πνςηεσκχκ πμο δζένπμκηαζ ηδξ ζηήθδξ (FT, Flow Through), δζαδνμιέξ 4-12 πενζθαιαάκμοκ ηα ηθάζιαηα πμο εηθμφζηδηακ ιε ιείςζδ ημο ph ηαζ δζαδνμιή 13: ιάνηοναξ (M, Marker). ηδ δζαδνμιή CE είκαζ ειθακήξ δ οπενεηθναζιέκδ DRpp29, ηαεχξ ηαζ ημ ιεβάθμ πμζμζηυ ηαεανυηδηαξ πμο επζηοβπάκεηαζ ιε ηδ πνήζδ πνςιαημβναθίαξ ζοββεκείαξ. Παναηδνμφιε υηζ ημ ιεβαθφηενμ πμζμζηυ ηςκ ιδ επζεοιδηχκ πνςηεσκχκ, είηε δεκ δεζιεφμκηαζ, είηε απμιαηνφκμκηαζ απυ ηδ ζηήθδ ηαηά ημ λέπθοια, εκχ δ ακαζοκδοαζιέκδ πνςηεύκδ εηθμφεηαζ πμζμηζηά, ιε εθάπζζηδ ιυθοκζδ απυ άθθεξ πνςηεύκεξ, ζηα ηθάζιαηα 7 έςξ 12. Σα ηθάζιαηα έηθμοζδξ 9-12, πμο πενζέπμοκ ιεβάθδ πμζυηδηα ηδξ DRpp29, ζοβηεκηνχεδηακ ζε ημζκυ ηθάζια ηαζ δζαπζδφεδηακ ζηαδζαηά ζε δζάθοια 100 mm NaH 2 PO 4, 10 mm Tris-Cl ph 8.0, 150 mm NaCl ηαζ 25% βθοηενυθδξ, βζα κα απμιαηνοκεεί δ μονία ηαζ κα θάαεζ δ ακαζοκδοαζιέκδ πνςηεύκδ ηδ ζςζηή ηδξ δζαιυνθςζδ ζημ πχνμ. Δ ζοβηέκηνςζδ ηδξ μθζηήξ πνςηεύκδξ ημο δζαπζδοιέκμο ηθάζιαημξ πνμζδζμνίζηδηε ιε ηδ ιέεμδμ Bradford ηαζ ανέεδηε κα είκαζ 1.7 ιg/ιl. 146

150 Απνηειέζκαηα 3. Παξαζθεπή πνιπθισληθώλ αληηζσκάησλ Αλνζνπνίεζε θνπλειηώλ Γζα ηδκ ακμζμπμίδζδ 2 ημοκεθζχκ, αημθμοεήεδηε πνυβναιια οπμδυνζαξ πμνήβδζδξ ακαζοκδοαζιέκδξ πνςηεύκδξ DRpp29, βζα δζάζηδια 59 διενχκ (Μέεμδμζ, 5.1). Δ πνχηδ έκεζδ πενζείπε ~100 ιg πνςηεύκδξ ηαζ 500 ιl πθήνμοξ ακμζμεκζζποηζημφ ημο Freund. Οζ δομ επυιεκεξ εκέζεζξ πμο βζκυηακ ηάεε 21 διένεξ, πενζείπακ ~100 ιg πνςηεύκδξ ηαζ 500 ιl αηεθμφξ ακμζμεκζζποηζημφ. Παναηδνήεδηε δ ακάπηολδ μζδήιαημξ ζηδκ πενζμπή υπμο έβζκακ μζ εκέζεζξ. To μίδδια πνμηαθείηαζ απυ ημ πθήνεξ ακμζμεκζζποηζηυ ημο Freund. Οζ μννμί, μζ μπμίμζ θαιαάκμκηαζ απυ ηδκ αζιμθδρία πμο πναβιαημπμζείηαζ ηδκ 1 δ, 21 δ, 28 δ, 35 δ, 42 δ, 49 δ, 52 δ ηαζ 59 δ διένα θοθάζζμκηαζ ζημοξ -20 o C (Μέεμδμζ, 5.1) Αλνζναπνηύπσζε θειίδαο (dot blot) Δ ακμζμαπμηφπςζδ ηδθίδαξ ιαξ έδςζε ιζα βνήβμνδ ηαζ αλζυπζζηδ εζηυκα βζα ηδκ φπανλδ εζδζηχκ ακηζζςιάηςκ πμο ακαβκςνίγμοκ ηυζμ ημ ακαζοκδοαζιέκμ πμθοπεπηίδζμ, υζμ ηαζ ημ ιαηνμιμνζαηυ ζφιπθμημ ηδξ RNase P ζηδ θοζζηή ημο δζαιυνθςζδ (Μέεμδμζ, 5.2). Υνδζζιμπμζήεδηε δείβια DRpp29 ζε αναζχζεζξ 1/10, 1/20, 1/50 ηαζ δείβια εκγφιμο RNase P ζηζξ ίδζεξ αναζχζεζξ. Δ ιειανάκδ επςάζηδηε ιε αναίςζδ μννμφ 5 δξ εαδμιάδαξ 1/500. ηδκ Δηθόλα 3. 2 θαίκμκηαζ μζ ηδθίδεξ πνχιαημξ πμο ειθακίζηδηακ ζηα ζδιεία υπμο ημπμεεηήεδηακ ηα δείβιαηα. Εικόνα 3. 2: Ώκμζμαπμηφπςζδ ηδθίδαξ. Ώκίπκεοζδ ηδξ DRpp29 ζε δείβιαηα ακαζοκδοαζιέκδξ DRpp29 ηαζ RNase P ιε μννυ ακμζμπμζήιεκμο ημοκεθζμφ Έκκεζε ELISA γηα ηηηινδόηεζε αληηνξξώλ Ο ηίηθμξ ηςκ ακηζμννχκ πμο ζοθθέπεδζακ εθέβπεδηε ιε έιιεζδ ELISA (Μέεμδμζ, 5.3). Υνδζζιμπμζήεδηακ 8 ng ακαζοκδοαζιέκδξ πνςηεύκδξ DRpp29 ηαζ ηέζζενζξ δζαθμνεηζηέξ ζοβηεκηνχζεζξ βζα ημκ ηάεε ακηζμννυ (1/500, 1/1000, 1/2000, 1/4000). Δ 147

151 Απνηειέζκαηα πμζυηδηα ημο δεζιεοιέκμο ακηζζχιαημξ ακζπκεφεδηε ιε 2 μ ακηίζςια έκακηζ IgG ακηζζςιάηςκ ημοκεθζμφ εκςιέκμ ιε οπενμλεζδάζδ ηαζ δ πμζμηζημπμίδζδ έβζκε ιε θςημιέηνδζδ ζηα 492 nm. πςξ θαίκεηαζ ζημ δζάβναιια ηδξ Δηθόλαο 3. 3, ημ ακμζμπμζδιέκμ ημοκέθζ ακέπηολε ορδθυ ηίηθμ ακηζζςιάηςκ ηδκ 8 δ εαδμιάδα (59 διένεξ απυ ηδκ ανπζηή ακμζμπμίδζδ). Ώπυ ημκ ζοβηεηνζιέκμ ακηζμννυ έβζκε απμιυκςζδ μθζηχκ IgG ιε ζηήθδ ζοββεκείαξ protein A- sepharose. Εικόνα 3. 3: Αζάβναιια Έιιεζδξ ELISA. ημ δζάβναιια αοηυ θαίκμκηαζ μζ μπηζηέξ απμννμθήζεζξ ημο ηάεε ακηζμννμφ (αναίςζδ 1/1000). Βπίζδξ, θαίκμκηαζ μζ διένεξ, ζηζξ μπμίεξ πναβιαημπμζήεδηε δ έκεζδ ημο ακηζβυκμο DRpp Η DRpp29 ζπκκεηέρεη ζην καθξνκνξηαθό ζύκπινθν RNase P Δ ζοιιεημπή ηδξ DRpp29 ζημ νζαμκμοηθεμπνςηεσκζηυ ζφιπθμημ ηδξ RNase P πζζημπμζήεδηε ιε ακάθοζδ ηαηά western εκενβχκ ηθαζιάηςκ RNase P ηαζ ακμζμηαηαηνήικζζδ δναζηζημφ εκγφιμο, πνδζζιμπμζχκηαξ ημ πμθοηθςκζηυ ακηίζςια πμο παναζηεοάζηδηε έκακηζ ηδξ οπυ ιεθέηδ πνςηεύκδξ Αλάιπζε θαηά western Κθάζιαηα απυ ημ ηνίημ αήια ηαεανζζιμφ ηδξ RNase P (ζηήθδ ακζμκημακηαθθαβήξ DE- 52, Μέεμδμζ, 2.4, Δηθόλα 4. 1-Α) ακαθφεδηακ δθεηηνμθμνδηζηά ζε πήηηςια SDS/πμθοαηνοθαιζδίμο (SDS-PAGE) ηαζ εθέπεδζακ βζα ηδκ πανμοζία ηδξ DRpp29 ζε ακμζμαπμηφπςια western, πνδζζιμπμζχκηαξ ακηζμννυ έκακηζ ηδξ DRpp29. πςξ θαίκεηαζ ζηδκ Δηθόλα 4. 1-Β, ηα ακηζζχιαηα ακαβκχνζζακ ιζα πνςηεσκζηή γχκδ, ηδξ μπμίαξ δ πανμοζία ζοιπίπηεζ επαηνζαχξ ιε ηδκ ειθάκζζδ δναζηζηυηδηαξ RNase P ζηα ηθάζιαηα. Δ πνςηεσκζηή αοηή γχκδ, αάζεζ ηςκ πνςηεσκζηχκ δεζηηχκ πμο πνδζζιμπμζήεδηακ, ακηζζημζπεί ζε θαζκμιεκζηυ ιμνζαηυ αάνμξ πενίπμο 30 kda, ημ μπμίμ ανίζηεηαζ ζε ζοιθςκία ιε ημ οπμθμβζγυιεκμ ιμνζαηυ αάνμξ ηδξ DRpp29 ( kda). Ο μννυξ πμο 148

152 Απνηειέζκαηα ζοθθέπεδηε πνζκ ηδκ ακμζμπμίδζδ (μννυξ 0) δμηζιάζηδηε ζηζξ ίδζεξ ζοκεήηεξ πςνίξ ηακέκα απμηέθεζια. Εικόνα 4. 1: (Α) Ώοημναδζμβναθία δμηζιήξ δναζηζηυηδηαξ RNase P ζε ηθάζιαηα απυ ηαεανζζιυ ζε ζηήθδ ακζμκημακηαθθαβήξ DE-52. Αζαδνμιή 1: οπυζηνςια SupS1, δζαδνμιή 2: δείβια πνςηεσκχκ πμο δζαπενκμφκ ηδ ζηήθδ, δζαδνμιή 3: δείβια απυ ημ ηθάζια λεπθφιαημξ ηδξ ζηήθδξ, δζαδνμιέξ 4-16: ηθάζιαηα έηθμοζδξ. (Β) Ώκάθοζδ ηαηά western ηςκ ακηίζημζπςκ ηθαζιάηςκ πνδζζιμπμζχκηαξ πμθοηθςκζηά ακηζζχιαηα έκακηζ ηδξ DRpp29. Μ: πνςηεσκζηυξ ιάνηοναξ, ζηα ανζζηενά ημο μπμίμο ακαβνάθμκηαζ ηα ιμνζαηά αάνδ ηςκ πνςηεσκζηχκ δεζηηχκ Αλνζνθαηαθξήκληζε δξαζηηθόηεηαο RNase P από αληίζσκα έλαληη ηεο DRpp29 149

153 Απνηειέζκαηα Με ζημπυ κα επζαεααζςεεί δ ζοιιεημπή ηδξ DRpp29 ζηδκ ανπζηεηημκζηή ημο μθμεκγφιμο, δμηζιάζηδηε δ ζηακυηδηα ηςκ ακηζ-drpp29 πμθοηθςκζηχκ ακηζζςιάηςκ κα ακαβκςνίγμοκ ημ ζφιπθμημ ηδξ RNase P ζηδκ θοζζηή ημο δζαιυνθςζδ. θαζνίδζα ζεθανυγδξ πνςηεύκδξ Ώ, πμο είπακ επςαζηεί ιε μννυ ημοκεθζμφ, επςάζηδηακ ιε δείβια ηαεανζζιέκδξ RNase P. Σα ζθαζνίδζα εηπθφεδηακ ηάης απυ αοζηδνέξ ζοκεήηεξ (Μέεμδμζ, 5.5), χζηε κα ελαζθαθζζηεί δ εζδζηυηδηα ηδξ αθθδθεπίδναζδξ πμο είκαζ οπεφεοκδ βζα ηδκ ηαηαηνήικζζδ δναζηζηυηδηαξ ηαζ δζαπςνίζηδηακ απυ ημ οπενηείιεκμ ιε θοβμηέκηνδζδ. Δ δμηζιή βζα εκγοιζηή δναζηζηυηδηα πμο αημθμφεδζε πζζημπμίδζε ηδκ πανμοζία ηαηαθοηζηά εκενβμφ εκγφιμο ιυκμ ζημ ίγδια ηςκ ζθαζνζδίςκ πμο είπακ επςαζηεί ιε ακηζμννυ απυ ακμζμπμζδιέκμ ημοκέθζ, ζε ακηίεεζδ ιε ηα ζθαζνίδζα πμο είπακ επςαζηεί ιε μννυ 0 (Δηθόλα 4. 2). διακηζηή ήηακ, επίζδξ, δ ιείςζδ ηδξ δναζηζηυηδηαξ ζημ οπενηείιεκμ δζάθοια ηδξ RNase P πμο είπε επελενβαζηεί ιε ζθαζνίδζα ακηζμννμφ ζε ζπέζδ ιε ημ οπενηείιεκμ πμο επςάζηδηε ιε μννυ 0 (~ 85 %). Εικόνα 4. 2: Ώκμζμηαηαηνήικζζδ δναζηζηυηδηαξ RNase P ιε πμθοηθςκζηά ακηζζχιαηα έκακηζ ηδξ DRpp29. Αζαδνμιή 1: οπυζηνςια psups1 (S), δζαδνμιή 2: control ακηίδναζδ RNase P δναζηζηυηδηαξ (C), δζαδνμιέξ 3, 4: ζθαζνίδζα ζεθανυγδξ πνςηεύκδξ Ώ πμο επςάζηδηακ ιε μννυ 0 (Pre) ηαζ δζαδνμιέξ 5, 6: ζθαζνίδζα ζεθανυγδξ πνςηεύκδξ Ώ πμο επςάζηδηακ ιε μννυ πμο ζοκεθέβδ 59 διένεξ ιεηά ηδκ ακμζμπμίδζδ (Post). Ώημθμφεδζε ακάιζλή ημοξ ιε παναζηεφαζια RNase P εκγφιμο ηαζ ιεηά απυ λεπθφιαηα, ηυζμ ηα οπενηείιεκα (δζαδνμιέξ 3 ηαζ 5, Sup) υζμ ηαζ ηα ζγήιαηα (δζαδνμιέξ 4 ηαζ 6, P) δμηζιάζηδηακ βζα δναζηζηυηδηα RNase P πανμοζία 32 [Ρ] - psups1 βζα 30 min ζημοξ 37 C. 150

154 Απνηειέζκαηα 5. Λεηηνπξγηθή κειέηε ηεο αλαζπλδπαζκέλεο πξσηεΐλεο DRpp Ιδηόηεηεο πξόζδεζεο ηεο DRpp29 κε RNA κόξηα Ζ DRpp29 δεζκεύεη εηδηθά ηελ RNA ππνκνλάδα ηεο RNase P ηνπ D. discoideum - Αιιαγή ηεο ειεθηξνθνξεηηθήο θηλεηηθόηεηαο (EMSA) Δ ζηακυηδηα ηδξ DRpp29 κα αθθδθεπζδνά άιεζα ιε ημ RNA ηδξ RNase P απυ ημ D. discoideum εθέπεδηε ιε δμηζιή αθθαβήξ δθεηηνμθμνδηζηήξ ηζκδηζηυηδηαξ. Υνδζζιμπμζήεδηε RNA ιεηάβναθμ ελςηενζηά ζδιαζιέκμ ζημ 5 άηνμ ιε 32 Ρ-[ΏΣΡ] ηαζ αολακυιεκεξ ζοβηεκηνχζεζξ ακαζοκδοαζιέκδξ πνςηεύκδξ DRpp29. Ώημθμφεδζε επχαζδ ζημοξ 30 μ C ηαζ δθεηηνμθυνδζδ ζε ιδ απμδζαηαηηζηυ πήηηςια πμθοαηνοθαιζδίμο (Μέεμδμζ, 7). πςξ θαίκεηαζ ζηδκ Δηθόλα , δ DRpp29 ζπδιαηίγεζ εζδζηυ ζφιπθμημ ιε ηδκ RNA οπμιμκάδα (Δηθόλα , δζαδνμιέξ 2-4), βεβμκυξ πμο ένπεηαζ ζε ζοιθςκία ιε πνμδβμφιεκα δεδμιέκα απυ ιεθέηεξ ζημκ άκενςπμ, ζηδ γφιδ ηαζ ζηα ανπαία (Jiang et al 2001, Houser-Scott et al 2002, Kouzuma et al 2003). Ο ζπδιαηζζιυξ αοημφ ημο ζοιπθυημο ακαζηέθθεηαζ, υπςξ θαίκεηαζ ηαζ ζηδκ αοημναδζμβναθία ηδξ Δηθόλαο , πανμοζία ιζηνχκ πμζμηήηςκ ιδ ζδιαζιέκμο RNA (Δηθόλα , δζαδνμιέξ 5-7). Ώκηίεεηα, δ πνμζεήηδ πενίζζεζαξ μθζημφ RNA απυ γφιδ, ημ μπμίμ πνδζζιμπμζήεδηε ζε αοηυ ημ πείναια ςξ ιδ εζδζηυξ ακηαβςκζζηήξ, επδνεάγεζ εθάπζζηα ηδ δδιζμονβία ημο ζοιπθυημο DRpp29-RNA (Δηθόλα , δζαδνμιέξ 8). 151

155 Απνηειέζκαηα Εικόνα : Ώοημναδζμβναθία ιδ απμδζαηαηηζημφ πδηηχιαημξ πμθοαηνοθαιζδίμο, ποηκυηδηαξ 4%. Αμηζιή αθθαβήξ δθεηηνμθμνδηζηήξ ηζκδηζηυηδηαξ ηδξ 32 [P]-RNA οπμιμκάδαξ ηδξ RNase P πανμοζία ηδξ DRpp29. Αζαδνμιή 1: ναδζεκενβά ζδιαζιέκμ RNA, δζαδνμιέξ 2-4: ναδζεκενβά ζδιαζιέκμ RNA πανμοζία αολακυιεκδξ ζοβηέκηνςζδξ DRpp29, δζαδνμιέξ 5-7: ναδζεκενβά ζδιαζιέκμ RNA + DRpp29 (30x) + αολακυιεκεξ πμζυηδηεξ ιδ ναδζεκενβά ζδιαζιέκμο RNA, δζαδνμιή 8: ναδζεκενβά ζδιαζιέκμ RNA + DRpp29 (30x) + αολακυιεκεξ πμζυηδηεξ μθζημφ RNA απυ γφιδ. Με αέθδ ζδιεζχκμκηαζ ημ εθέοεενμ RNA ηαζ ημ ζπδιαηζγυιεκμ ζφιπθμημ DRpp29-RNA Ζ DRpp29 δελ αιιειεπηδξά εηδηθά κε ην ππόζηξσκα SupS1 - Αιιαγή ηεο ειεθηξνθνξεηηθήο θηλεηηθόηεηαο (EMSA) ε ιζα πανυιμζα πεζναιαηζηή δζαδζηαζία, δ DRpp29 δεκ θάκδηε κα αθθδθεπζδνά εζδζηά ιε εζςηενζηά ζδιαζιέκμ οπυζηνςια psups1. πςξ θαίκεηαζ ηαζ ζηδκ Δηθόλα , ημ ζφιπθμημ DRpp29 - psups1 ελαθακίγεηαζ πανμοζία μθζημφ RNA απυ γφιδ, εκχ πανμοζία ιζηνήξ πμζυηδηαξ ιδ ναδζεκενβά ζδιαζιέκμο psups1 ημ ζφιπθμημ ελαημθμοεεί κα είκαζ ειθακέξ, επζαεααζχκμκηαξ ηδκ ιδ εζδζηή δέζιεοζδ ηδξ DRpp29 ιε ημ psups1. 152

156 Απνηειέζκαηα Εικόνα : Αμηζιή αθθαβήξ δθεηηνμθμνδηζηήξ ηζκδηζηυηδηαξ ημο α- 32 [P]-GTP SupS1 οπμζηνχιαημξ πανμοζία ηδξ DRpp29. Ώοημναδζμβναθία ιδ απμδζαηαηηζημφ πδηηχιαημξ πμθοαηνοθαιζδίμο ποηκυηδηαξ 4%. Αζαδνμιή 1: ναδζεκενβά ζδιαζιέκμ SupS1, δζαδνμιέξ 2-4: ναδζεκενβά ζδιαζιέκμ SupS1 πανμοζία αολακυιεκδξ ζοβηέκηνςζδξ DRpp29, δζαδνμιέξ 5-7: ναδζεκενβά ζδιαζιέκμ SupS1 + DRpp29 (300x) + αολακυιεκεξ πμζυηδηεξ ιδ ναδζεκενβά ζδιαζιέκμο SupS1 (Unlabeled), δζαδνμιέξ 8-10: ναδζεκενβά ζδιαζιέκμ SupS1 + DRpp29 (300x) + αολακυιεκεξ πμζυηδηεξ μθζημφ RNA γφιδξ (Total Yeast RNA). Με ιαφνμ αέθμξ ζδιεζχκεηαζ ημ εθεφεενμ SupS1 ηαζ ιε θεοηυ ημ ζπδιαηζγυιεκμ ζφιπθμημ Καηαζθεύε θαη κειέηε ησλ δηαθξηηώλ πεξηνρώλ ηεο DRpp29 Βπυιεκμξ ζηυπμξ ήηακ κα πνμζδζμνζζηεί δ πενζμπή ηδξ DRpp29, πμο είκαζ οπεφεοκδ βζα ηδ δέζιεοζδ ηδξ RNA οπμιμκάδαξ. Γζ αοηυ ημ ζημπυ ηαζ θαιαάκμκηαξ οπ υρζκ ηα απμηεθέζιαηα ηδξ πμθθαπθήξ μιμπανάεεζδξ ηδξ αιζκμλζηήξ αθθδθμοπίαξ ηδξ DRpp29 ηαζ άθθςκ μνευθμβςκ πνςηεσκχκ, πμο πενζβνάθδηε ζηδκ πανάβναθμ 1.2, ηαηαζηεοάζηδηακ ηνία δζαθμνεηζηά πμθοπεπηίδζα ηδξ DRpp29. Δ παναηήνδζδ ηδξ Δηθόλαο 1. 2, πμο δείπκεζ ηδκ μιμπανάεεζδ ηδξ DRpp29 ιε άθθεξ μιυθμβεξ πνςηεύκεξ επζηνέπεζ ηδ δζάηνζζδ ηδξ αθθδθμοπίαξ ηδξ DRpp29 ζε ηνεζξ λεπςνζζηέξ πενζμπέξ (Δηθόλα 5. 2). Δ ιζα πενζμπή πανμοζζάγεζ μιμθμβία ιε ηζξ μνευθμβεξ ανπαίεξ πνςηεύκεξ, πενζθαιαάκεζ ηα αιζκμλζηά ηαηάθμζπα απυ 156 ιέπνζ 252 ηδξ αθθδθμοπίαξ ηδξ DRpp29 ηαζ μκμιάζηδηε Α155, θυβς ηδξ απμοζίαξ ηςκ 155 πνχηςκ αιζκμλέςκ απυ ηδκ αθθδθμοπία ηδξ DRpp29. Δ δεφηενδ παναηηδνζζηζηή πενζμπή ηδξ DRpp29 είκαζ δ μιυθμβδ ιε ηζξ εοηανοςηζηέξ πνςηεύκεξ, μκμιάζηδηε Α75 ηαζ απμηεθείηαζ απυ ηδκ αθθδθμοπία ηδξ DRpp29 πςνίξ ηα 75 πνχηα αιζκμλέα (δδθαδή ζηδ Α75 πενζμπή πενζθαιαάκμκηαζ ηα αιζκμλέα 76 ιέπνζ 252). Σέθμξ, δ ηνίηδ πενζμπή, NTR, αθμνά ηα πνχηα 75 αιζκμλέα ημο άιζκμ-ηεθζημφ άηνμο ηδξ 153

157 Απνηειέζκαηα DRpp29 ηαζ είκαζ παναηηδνζζηζηή αθθδθμοπία ημο D. discoideum, δ μπμία δεκ πανμοζζάγεζ ηαιία μιμθμβία ιε μπμζαδήπμηε άθθδ μιυθμβδ πνςηεύκδ πμο έπεζ ζοβηνζεεί. Εικόνα 5. 2: πδιαηζηή πανάζηαζδ ηςκ ηνζχκ δζαηνζηχκ πενζμπχκ ηδξ DRpp29. I: Δ αθθδθμοπία ηδξ DRpp29 ηαζ ιε δζαθμνεηζηέξ απμπνχζεζξ μζ δζαηνζηέξ πενζμπέξ ηδξ αθθδθμοπίαξ ηδξ. II ηαζ III: ηα Α75 ηαζ Α155 πμθοπεπηίδζα, πμο απμηεθμφκ ηδκ αθθδθμοπία ηδξ DRpp29, ηδκ μιυθμβδ ιε ηζξ εοηανοςηζηέξ ηαζ ανπαίεξ πνςηεύκεξ, ακηίζημζπα. IV: ημ NTR πμθοπεπηίδζμ πμο ακηζζημζπεί ζημ ιμκαδζηυ ηιήια ηδξ DRpp29 ηαζ απμοζζάγεζ απυ ηζξ μνευθμβέξ ηδξ Κισλνπνίεζε ησλ ηκεκάησλ δ75, δ155 θαη ntr Γζα ηδκ εκίζποζδ ηςκ ηιδιάηςκ δ75, δ155 ηαζ ntr ζπεδζάζηδηακ ηνία γεφβδ εηηζκδηχκ, δ75f/δ75r, δ155f/δ155r ηαζ ntrf/ntrr, ακηίζημζπα (Μέεμδμζ, 3.1.2). Με ηδ ιέεμδμ ηδξ PCR ηαζ πνδζζιμπμζχκηαξ ςξ εηιαβείμ ημ ακαζοκδοαζιέκμ πθαζιζδζαηυ θμνέα pcrii/drpp29, εκζζπφεδηακ ηα ηνία ηιήιαηα ημο drpp29 (Δηθόλα ). Σα πνμσυκηα ηςκ ακηζδνάζεςκ αοηχκ επελενβάζηδηακ αημθμοεχκηαξ ηδκ ίδζα δζαδζηαζία πμο πναβιαημπμζήεδηε βζα ηδκ ηθςκμπμίδζδ ημο drpp29 ηαζ πενζβνάθδηε ακαθοηζηά ζηζξ παναβνάθμοξ 1.4 ηαζ 1.5. ηδ ζοκέπεζα, ηα ηιήιαηα δ75, δ155 ηαζ ntr οπμηθςκμπμζήεδηακ ζε πθαζιζδζαηυ θμνέα έηθναζδξ pet29c(+), ζφιθςκα ιε ηζξ παναβνάθμοξ ηαζ Εικόνα : Δθεηηνμθυνδζδ ζε πήηηςια αβανυγδξ 2 % ηςκ εκζζποιέκςκ δ75, δ155 ηαζ ntr ηιδιάηςκ. Αζαδνμιή 1: DNA ιάνηοναξ, δζαδνμιή 2: πνμσυκ RT- PCR ημο δ75, δζαδνμιή 3: πνμσυκ RT- PCR ημο δ155 ηαζ δζαδνμιή 4: πνμσυκ RT-PCR ημο ntr. Με ηυηηζκα αέθδ ζδιεζχκμκηαζ ηα επζεοιδηά πνμσυκηα ηαζ ηα ιεβέεδ ημοξ πμο απμιμκχκμκηαζ βζα ηδκ ηθςκμπμίδζδ ημοξ.

158 Απνηειέζκαηα Δπαγσγή ηεο έθθξαζεο ησλ πνιππεπηηδίσλ Γ75, Γ155 θαη NTR Σα ακαζοκδοαζιέκα πθαζιίδζα pet29c(+)/δ75, pet29c(+)/δ155 ηαζ pet29c(+)/ntr, αθμφ ζηάθεδηακ βζα αθθδθμφπζζδ ηαζ πζζημπμίδζδ ηδξ απμοζίαξ ακεπζεφιδηςκ ιεηαθθάλεςκ, ιεηαζπδιάηδζακ δεηηζηά ηφηηανα BL21(DE3)codon plus. Δ επαβςβή ηδξ έηθναζδξ ηςκ ηνζχκ πμθοπεπηζδίςκ δζελήπεδ πανμοζία 1 mm IPTG βζα 4 h. Δ επζαεααίςζδ ηδξ έηθναζήξ ημοξ έβζκε ιε ακάθοζδ ηαηά western ηαζ πνήζδ ακηζζςιάηςκ έκακηζ ηδξ μονάξ ζζηζδζκχκ (anti-his) πμο θένμοκ ηα Α75-His 6, Α155-His 6 ηαζ NTR-His 6 (Δηθόλα Α). Βπίζδξ, ιε ηδ αμήεεζα ηδξ ακμζμαπμηφπςζδξ western δζαπζζηχεδηε ζε πζμ ηθάζια ημο ηοηηανζημφ μιμβεκμπμζήιαημξ θαιαάκεηαζ ημ ηάεε πμθοπεπηίδζμ. πςξ δζαθαίκεηαζ ηαζ ζηδκ Δηθόλα Β, ημ ιεβαθφηενμ πμζμζηυ ηςκ ακαζοκδοαζιέκςκ πμθοπεπηίδζςκ Α75 ηαζ Α155 ανίζηεηαζ ζημ αδζάθοημ ηθάζια ηςκ πνςηεσκχκ, εκχ ημο Εικόνα : Ώκάθοζδ ηαηά western βζα εκημπζζιυ ηςκ ακαζοκδοαζιέκςκ πμθοπεπηζδίςκ Α75, Α155 ηαζ NTR ιεηά απυ επαβςβή ηδξ έηθναζήξ ημοξ. (A) Βκημπζζιυξ ηςκ οπενεηθναζιέκςκ πμθοπεπηζδίςκ Α75, Α155 ηαζ NTR ιεηά απυ 4 hrs επαβςβήξ ηδξ έηθναζήξ ημοξ ζημοξ 37 μ C, ιε ηδ πνήζδ Anti-His. Αζαδνμιή 1: δείβια ηοηηανζημφ μιμβεκμπμζήιαημξ πνζκ ηδκ επαβςβή ηδξ έηθναζδξ (ΝΕ, Non Induced), δζαδνμιέξ 2-5: δείβιαηα ηοηηανζημφ μιμβεκμπμζήιαημξ ιεηά απυ οπενέηθναζδ ημο Α75, NTR ηαζ Α155, ακηίζημζπα. (Β) Βκημπζζιυξ ηςκ ακαζοκδοαζιέκςκ Α75 ηαζ Α155 ζημ αδζάθοημ ηθάζια πνςηεσκχκ (δζαδνμιή 3 ηαζ 5, ακηίζημζπα) ηαζ ημο NTR ζημ δζαθοηυ ηθάζια πνςηεσκχκ (δζαδνμιή 6) ιεηά απυ 4 hrs επαβςβήξ ηδξ έηθναζήξ ημοξ ιε ηδ πνήζδ Anti-His. πμο S: Τπενηείιεκμ (Supernatant) ηαζ P: ίγδια (Pellet). NTR ζημ δζαθοηυ. 155

159 Απνηειέζκαηα Καζαξηζκόο ησλ πνιππεπηηδίσλ Γ75, Γ155 θαη NTR Σα πνςηεσκζηά πμθοπεπηίδζα Α75 ηαζ Α155 παναθήθεδζακ ηαεανά απυ ημ αδζάθοημ ηθάζια ηςκ πνςηεσκχκ ιε πνςιαημβναθία ζοββεκείαξ ηαζ ζοβηεηνζιέκα ιε ηδ πνήζδ ζηήθδξ κζηεθίμο, αημθμοεχκηαξ επαηνζαχξ ηδ δζαδζηαζία πμο πενζβνάθεηαζ ζηδ πανάβναθμ 2.2 ηαζ ηδκ Δηθόλα θαίκμκηαζ ηιήιαηα απυ ηα πδηηχιαηα SDS/πμθοαηνοθαιζδίμο (SDS-PAGE), υπμο έπμοκ ακαθοεεί ηα ηθάζιαηα ηαεανζζιμφ ηςκ πμθοπεπηζδίςκ αοηχκ. ε ακηίεεζδ ιε ηα ακαζοιδοαζιέκα πμθοπεπηίδζα Α75 ηαζ Α155, ημ NTR πανεθήθεδ απυ ημ δζαθοηυ ηθάζια πνςηεσκχκ ηαζ ηδ πναβιαημπμίδζδ δφμ ζηαδίςκ ηαεανζζιμφ. ε αοηή ηδ πενίπηςζδ ημ εηπφθζζια πενκάεζ απυ ζηήθδ κζηεθίμο ηαζ δ έηθμοζδ βίκεηαζ ιε ααειίδςζδ ζοβηέκηνςζδξ ζιζδαγμθίμο, ακηί ιε ιείςζδ ημο ph πμο πναβιαημπμζείηαζ βζα ηδκ απμιυκςζδ ηςκ Α75 ηαζ Α155 (Μέεμδμζ, 4.4.2). Βπεζδή, υιςξ, ιαγί ιε ηδκ επζεοιδηή πνςηεύκδ NTR ζοκεηθμφεηαζ ηαζ ζδιακηζηυ πμζμζηυ ιδ επζεοιδηχκ πνςηεσκχκ, ηα ηθάζιαηα πμο πενζέπμοκ ημ NTR ζοβηεκηνχκμκηαζ ηαζ δζαπζδφμκηαζ ζε νοειζζηζηυ δζάθοια b, μφηςξ χζηε κα ηαεανζζηεί ιε ηαηζμκημακηαθθαηηζηή πνςιαημβναθία ηαζ ηδ πνήζδ ζηήθδξ θςζθμηοηηανίκδξ (Ρ-11) (Μέεμδμζ, 2.3). Ώοηυ ημ είδμξ πνςιαημβναθίαξ επζθέπεδηε θυβς ημο ορδθμφ ζζμδθεηηνζημφ ζδιείμο πμο ειθακίγεζ ημ NTR (pi 9.38), υπςξ θαίκεηαζ ζηδκ Δηθόλα , πναβιαημπμζήεδηε ηαεανζζιυξ ζε πμζμζηυ πάκς απυ 90%. Εικόνα : Δθεηηνμθυνδζδ ζε πδηηχιαηα SDS PAGE, ποηκυηδηαξ 14%, ηςκ ηαεανχκ ηαζ ειπθμοηζζιέκςκ ηθαζιάηςκ πμο ζοθθέπεδζακ απυ ημ ηαεανζζιυ ζε ζηήθδ Ni-NTA βζα ημ Α75 ηαζ Α155 ηαζ ζε ζηήθδ Ρ-11 βζα ημ NTR. Δ έηθμοζδ ηςκ ηαεανχκ, ακαζοκδοαζιέκςκ Α75 (δζαδνμιέξ 1, 2) ηαζ Α155 (δζαδνμιέξ 3-5) πμθοπεπηζδίςκ πναβιαημπμζήεδηε ιε ιείςζδ ημο ph (step gradient), εκχ δ έηθμοζδ ημο NTR (δζαδνμιέξ 6-8) ιε βναιιζηή ααειίδςζδ NH 4 Cl. Αζαδνμιή 9: πνςηεσκζηυξ ιάνηοναξ (Μ) ζηα δελζά ημο μπμίμο ακαβνάθεηαζ ημ ιέβεεμξ ηάεε γχκδξ. 156

160 Απνηειέζκαηα Μειέηε ηεο αιιειεπίδξαζεο ησλ πνιππεπηηδίσλ Γ75, Γ155 θαη NTR κε ηελ RNA ππνκνλάδα ηεο RNase P ηνπ D. discoideum 157

161 Απνηειέζκαηα Ώολακυιεκεξ ζοβηεκηνχζεζξ ηςκ πμθοπεπηζδίςκ Α75, Α155 ηαζ NTR επςάζηδηακ πανμοζία ναδζεκενβά ζδιαζιέκμο RNA ζημοξ 30 μ C ηαζ ηα πνμσυκηα ηςκ δεζβιάηςκ δζαπςνίζηδηακ ζε ιδ απμδζαηαηηζηυ πήηηςια πμθοαηνοθαιζδίμο. Βκδζαθένμκ πανμοζίαζε ημ βεβμκυξ υηζ ηα πμθοπεπηίδζα Α155 ηαζ NTR δεκ δζαεέημοκ δεζιεοηζηέξ ζηακυηδηεξ βζα Εικόνα : Ώοημναδζμβναθία ιδ απμδζαηαηηζημφ πδηηχιαημξ πμθοαηνοθαιζδίμο, ποηκυηδηαξ 4% βζα δμηζιή αθθαβήξ δθεηηνμθμνδηζηήξ ηζκδηζηυηδηαξ ηδξ β- 32 [P]-ΏΣΡ RNA οπμιμκάδαξ ηδξ RNase P πανμοζία ηςκ πμθοπεπηζδίςκ απαθμζθήξ Α155, Α75 ηαζ NTR. Σμ Α155 ηαζ ημ NTR δεκ αθθδθεπζδνμφκ ιε ηδκ RNA οπμιμκάδα ηδξ RNase P, ζε ακηίεεζδ ιε ημ Α75 πμο πνμζδέκεηαζ εζδζηά ιε αοηήκ. Αζαδνμιή 1: ναδζεκενβά ζδιαζιέκμ RNA, δζαδνμιέξ 2-4: ναδζεκενβά ζδιαζιέκμ RNA πανμοζία αολακυιεκδξ ζοβηέκηνςζδξ Α155, δζαδνμιέξ 5-7: ναδζεκενβά ζδιαζιέκμ RNA πανμοζία αολακυιεκδξ ζοβηέκηνςζδξ NTR, δζαδνμιέξ 8-10: ναδζεκενβά ζδιαζιέκμ RNA πανμοζία αολακυιεκδξ ζοβηέκηνςζδξ Α75, δζαδνμιέξ 11-13: ναδζεκενβά ζδιαζιέκμ RNA + Α75 (40x) + αολακυιεκεξ πμζυηδηεξ ιδ ναδζεκενβά ζδιαζιέκμο RNA, δζαδνμιέξ 14: ναδζεκενβά ζδιαζιέκμ RNA + Α75 (40x) + αολακυιεκεξ πμζυηδηεξ μθζημφ RNA γφιδξ. Με αέθδ ζδιεζχκμκηαζ ημ εθεφεενμ RNA ηαζ ημ ζπδιαηζγυιεκμ ζφιπθμημ Α75-RNA. ηδκ RNA οπμιμκάδα ηδξ RNase Ρ (Δηθόλα ), πανυθμ πμο ημ Α155 ακηζζημζπεί ζηδκ μιυθμβδ ιε ηζξ ανπαίεξ πνςηεύκεξ πενζμπή, μζ μπμίεξ ζε πνμδβμφιεκεξ ιεθέηεξ έπεζ δεζπεεί κα αθθδθεπζδνμφκ ιε ηδκ μιυθμβδ ημοξ RNA οπμιμκάδα ηδξ RNase P (Xu et al 2009, Kosaka et al 2010, Honda et al 2010). Ώκηίεεηα ημ Α75 θαίκεηαζ κα δεζιεφεζ εζδζηά ηδκ RNA οπμιμκάδα ηδξ RNase P απυ ημ D. discoideum, αθμφ πανμοζία εζδζημφ ζοκαβςκζζηή RNA ιδ ζδιαζιέκμο ημ ζφιπθμημ Α75-RNA ελαθακίγεηαζ απυ ημ αοημναδζμβνάθδια, εκχ ημ ζφιπθμημ αοηυ δζαηδνείηαζ υηακ ζηζξ ακηζδνάζεζξ πνμζηίεεηαζ πενίζζεζα μθζημφ RNA γφιδξ, ςξ ιδ εζδζηυξ ζοκαβςκζζηήξ (Δηθόλα ). 158

162 Απνηειέζκαηα Πξόβιεςε ησλ πηζαλώλ θαηαινίπσλ ηεο DRpp29 πνπ αιιειεπηδξνύλ κε ηελ RNA ππνκνλάδα ηεο RNase P Πανυθμ πμο δ άιεζδ αθθδθεπίδναζδ ηδξ Rpp29 ιε ηδκ RNA οπμιμκάδα ηδξ ακενχπζκδξ RNase P έπεζ απμδεζπεεί πεζναιαηζηά, o πνμζδζμνζζιυξ ηςκ πζεακχκ εέζεςκ αθθδθεπίδναζδξ ηδξ ακενχπζκδξ Rpp29 ζημ ζφιπθμημ Rpp29-RNA δεκ έπεζ πναβιαημπμζδεεί ιέπνζ ηχνα. ηεθηυιεκμζ ακάθμβα βζα ηδκ DRpp29 ηαζ ιε ζημπυ κα εκημπζζημφκ μζ πενζμπέξ πάκς ζηδκ DRpp29 πμο ζοιιεηέπμοκ ζηδκ αθθδθεπίδναζή ηδξ ιε RNA αημθμοεήζαιε, δφμ δζαθμνεηζηέξ πνμζεββίζεζξ. Έηζζ, πανάθθδθα ιε ηδκ πεζναιαηζηή δζαδζηαζία, πμο ακαθένεδηε πνμδβμοιέκςξ ζηδκ πανάβναθμ 5.2.4, έβζκε πνυαθερδ ηςκ πζεακχκ ηαηαθμίπςκ πμο αθθδθεπζδνμφκ ιε RNA ηυζμ ζηδ DRpp29, υζμ ηαζ ζε άθθεξ εοηανοςηζηέξ μιυθμβεξ πνςηεύκεξ (Homo sapiens, Mus musculus, Drosophila melanogaster, Schizosaccharomyces pombe), εθανιυγμκηαξ ηνία δζαθμνεηζηά θμβζζιζηά (Wang ηαζ Brown 2006, Terribilini et al 2007, Kumar et al 2008) πμο πνδζζιμπμζμφκ SVM (support vector machine) ηαζ πμο ααζίγμκηαζ ζε ζδζαίηενα ζέη ζοιπθυηςκ πνςηεύκδξ-rna. Ώκ ηαζ ηα απμηεθέζιαηα δεκ ζοκέπζπηακ πάκηα πνδζζιμπμζχκηαξ δζαθμνεηζηυ θμβζζιζηυ, ηαηέζηδ δοκαηυκ κα πνμζδζμνζζεμφκ δζάθμνεξ οπμρήθζεξ πενζμπέξ βζα δέζιεοζδ RNA. Σα πνμηεζκυιεκα ηαηάθμζπα ηδξ DRpp29 πμο αθθδθεπζδνμφκ δοκδηζηά ιε RNA θαίκμκηαζ ζηδκ Δηθόλα Αομ πενζμπέξ ακαβκςνίζηδηακ ζηδκ αθθδθμοπία ηδξ DRpp29 δ πνχηδ πενζμπή πμο πενζθαιαάκεζ ηα ηαηάθμζπα απυ 95 ιέπνζ 118 ηαζ ανίζηεηαζ ζημ αιζκμ-ηεθζηυ άηνμ ηδξ ζοκηδνδιέκδξ Sm πενζμπήξ ηαζ ιζα δεφηενδ ιεηαλφ ηςκ αιζκμλέςκ 233 ηαζ 252, πμο ανίζηεηαζ ζημ ηαναμλο-ηεθζηυ άηνμ ηδξ πνςηεύκδξ. Βίκαζ άλζμ εκδζαθένμκημξ πςξ δ αθθδθμοπία ηδξ πνμηεζκυιεκδξ πενζμπήξ ηδξ DRpp29 (DRpp ) πανμοζζάγεζ ορδθή ζοκηήνδζδ ιε ηζξ άθθεξ μιυθμβεξ εοηανοςηζηέξ πνςηεύκεξ (Δηθόλα 5. 3-Β). Σμ ζφιπθεβια βναιιάηςκ αοηήξ ηδξ μιμπανάεεζδξ (Crooks et al 2004) (Δηθόλα 5. 3-Γ) έδεζλε ηδκ πανμοζία ημο ιμηίαμο R-x(9)-K-x-K-x-L-x-x-[RK]-x-[RK] [υπμο x(9) ακηζζημζπεί ζε 9 μπμζαδήπμηε αιζκμλέα ηαζ [RK] ζηδ πανμοζία ηαηαθμίπςκ R ή Κ]. άνςζδ ιε ηδ πνςηεσκζηή αάζδ δεδμιέκςκ UniProtKB/Swiss-Prot βζ αοηυ ημ ιμηίαμ απέδςζε πθδεχνα πνςηεσκχκ πμο αθθδθεπζδνμφκ ιε RNA ιυνζα, υπςξ νζαμζςιζηέξ πνςηεύκεξ, πεπηίδοθtrna οδνμθάζεξ, RNA εθζηάζεξ (Πίλαθαο 5. 3), εκζζπφμκηαξ έηζζ ηδκ πζεακυηδηα, αοηή δ πενζμπή κα ειπθέηεηαζ ζε επαθέξ ιε ημ RNA. Δ πνυαθερδ αοηή πμο ααζίζηδηε ζηδκ αζμπθδνμθμνζηή ακάθοζδ ζοιπίπηεζ ιε ηα πεζναιαηζηά απμηεθέζιαηα ηδξ παναβνάθμο φιθςκα ιε αοηά, θμζπυκ, ηα πμθοπεπηίδζα NTR ηαζ Α155, πμο δεκ πενζέπμοκ ημ ιμηίαμ R-x(9)-K-x-K-x-L-x-x-[RK]-x- 159

163 Απνηειέζκαηα [RK], δεκ πνμζδέκμκηαζ ζηδκ RNA οπμιμκάδα, πανυηζ ημ Α155 πενζέπεζ ημκ πονήκα p29 (Sm-like fold). ε ακηίεεζδ, ημ Α75 αθθδθεπζδνά ιε ημ RNA ηδξ RNase P εζδζηά, αθμφ είκαζ ημ ιμκαδζηυ ακαζοκδοαζιέκμ πμθοπεπηίδζμ πμο πενζέπεζ αοηήκ ηδκ παναηηδνζζηζηή αθθδθμοπία (Δηθόλα ). Εικόνα 5. 3: Πνυαθερδ ηςκ ηαηαθμίπςκ ηδξ DRpp29 πμο ειπθέημκηαζ δοκδηζηά ζε αθθδθεπζδνάζεζξ ιε RNA. (A) Σα πνμαθεπυιεκα ηαηάθμζπα ζοιαμθίγμκηαζ ιε έκημκδ βναθή. Δ πζεακμηένδ πενζμπή ηδξ DRpp29 κα ακαπηφλεζ αθθδθεπζδνάζεζξ ιε RNA πενζθαιαάκεζ ημ ιμηίαμ R-x(9)-K-x-K-x-L-x-x-[RK]-x- [RK] ηαζ ανίζηεηαζ ιέζα ζημ πθαίζζμ. Δ οπμβναιιζζιέκδ πενζμπή ακηζζημζπεί ζε αοηήκ πμο θαιαάκεζ ηδ δζαιυνθςζδ ηςκ Sm πνςηεσκχκ. (B) Οιμπανάεεζδ ηδξ αθθδθμοπίαξ ηδξ πενζμπήξ ηδξ DRpp29 ιε άθθεξ εοηανοςηζηέξ μιυθμβεξ πνςηεύκεξ (HRpp29, βζα ημ H. sapiens, MRpp29, βζα ημ M. musculus, SRpp29 βζα ημ S. pombe). (Γ) Δ αθθδθμοπία ημο ιμηίαμο πμο πνμηφπηεζ απυ ηδκ μιμπανάεεζδ ζημ (B), υπμο δ ζοπκυηδηα ειθάκζζδξ ημο ηάεε αιζκμλέμξ ζηδ ζοβηεηνζιέκδ πενζμπή είκαζ ακάθμβδ ιε ημ ιέβεεμξ ιε ημ μπμίμ πανμοζζάγεηαζ (υπςξ πνμηφπηεζ απυ ημ WebLogo). 160

164 Απνηειέζκαηα Protein Name 30S ribosomal protein S20. rrna-processing protein EBP2 50S ribosomal protein L2. ATP-dependent RNA helicase SUV3 U3 snornp-associated protein Utp11 Chromodomain-helicase-DNA-binding protein Mi-2 homolog Protein containing peptidyl-trna hydrolase domain 30s ribosomal protein s14 40S ribosomal protein S15 60S ribosomal protein L7 DEAH box RNA helicase DHR1 Ribosome biogenesis protein BMS1 Peptidyl-tRNA hydrolase family protein Ribosomal RNA methyltransferase RrmJ/FtsJ 40S ribosomal protein S15/S19 Pre-rRNA processing protein Utp22 3'-5' exonuclease 40S ribosomal protein S9 Essential protein required for the maturation of 25S rrna and 60S ribosomal subunit assembly RNA helicase Sequence region that comprise the sequence motif R-x(9)-K-x-K-x-L-x-x-[RK]-x-[RK] RaasssidkaKsKgLihKnK RqlekretleKiKsLknKrK RkhpkspwgqKsKgLktRkR RkgdcvvafsKkKvLdlKlK RaadhrqkkaKlKiLseKaR RrpsgkvptlKiKlLgkRkR RkktkptrasKiKrLkaKkK RheakvqrnlKrKyLieRyK RrkfkrgiskKeKsLlkKlR RkreeewalaKkKqLdaKkK RvkvskrklrKlKqLeeRkR RleqalpyknKpKnLekRkK RkatkptyssKlKrLetKsK RenyparsvyKlKeLdaKfR RrkfqrgiskKaKsLlkKiR ReqtlleqqlKkKdLaaRqK RpsksdldanKeKtLsqKeK RpgnpyqqqlKpKeLdnKgR RqkekketldKiKsLkrKrK RkleqrhevrKaKrLrkRkR Πίνακας 5. 3: ΠνςηεΎκεξ πμο δεζιεφμοκ RNA ιυνζα ηαζ ζηζξ μπμίεξ ακζπκεφεηαζ ημ παναηηδνζζηζηυ ιμηίαμ πμο εκημπίγμοιε ζηδκ αθθδθμοπία ηδξ DRpp Μειέηε ηεο δνκήο ηεο RNA ππνκνλάδαο θαη ηεο DRpp Πξνζδηνξηζκόο ηεο δεπηεξνηαγνύο δνκήο ηεο RNA ππνκνλάδαο Δ πνςημηαβήξ δμιή ηδξ RNA οπμιμκάδαξ ηδξ RNase P ημο D. discoideum είπε ανπζηά ιεθεηδεεί ιέζς θοθμβεκεηζηήξ ζοβηνζηζηήξ ακάθοζδξ απυ ημκ Norman Pace ηαζ ημοξ ζοκενβάηεξ ημο (Marquez et al 2005). ηδ ζοκέπεζα, ζημ ενβαζηήνζυ ιαξ, πνμζδζμνίζηδηε 161

165 Απνηειέζκαηα πεζναιαηζηά δ αθθδθμοπία ημο βμκζδίμο ηδξ RNA οπμιμκάδαξ, ιεηά ηδκ ηαοημπμίδζδ ηςκ 5 ηαζ 3 άηνςκ ημο ιμνίμο (ΐμονεηάξ Ώ, δζδαηημνζηή δζαηνζαή 2007). Ώπυ ηδ ιεθέηδ αοηή πνμέηορε πςξ δ RNA οπμιμκάδα δζαεέηεζ 369 nt ηαζ πςξ ιεηαβνάθεηαζ ςξ πνυδνμιμ ιυνζμ ηςκ 390 nt πενίπμο. Δ δεοηενμηαβήξ δμιή ημο RNA έπεζ πνμαθεθεεί ηαζ ζπεδζαζηεί απυ δομ ακελάνηδηεξ ενβαζίεξ, μζ μπμίεξ είπακ ααζζζηεί ηαζ μζ δομ ζε θοθμβεκεηζηέξ ακαθφζεζξ (Piccinelli et al 2005, Zhu et al 2006). Παναηδνμφιεκεξ δζαθμνέξ ζηα ιμκηέθα ηςκ δομ παναπάκς ιεθεηχκ ηαζ δ έθθεζρδ πεζναιαηζηήξ οπμζηήνζλδξ ιαξ μδήβδζε ζηδκ ακάβηδ επακαπνμζδζμνζζιμφ ηδξ δεοηενμηαβμφξ δμιήξ ημο RNA ηδξ RNase P, ιέζς ακάθοζδξ απμηοπχιαημξ. Σμ RNA ιεηάβναθμ επςάζηδηε πανμοζία ηςκ εκδμνζαμκμοηθεαζχκ Σ1 ηαζ Ώ (Μέεμδμζ 8.1), μζ μπμίεξ ακαβκςνίγμοκ ηαζ δζαζπμφκ θςζθμδζεζηενζημφξ δεζιμφξ ζε ιμκυηθςκα ηαηάθμζπα βμοακίκδξ ηαζ ζε ιμκυηθςκα ηαηάθμζπα πονοιζδζκχκ, ακηίζημζπα (Δηθόλα 6. 1-Α). ηδνζγυιεκμζ ζηα απμηεθέζιαηα ηδξ ακάθοζδξ απμηοπχιαημξ, αθθά ηαζ ζηζξ πνμδβμφιεκεξ θοθμβεκεηζηέξ ακαθφζεζξ, ζπεδζάζαιε ηδκ πζεακή δεοηενμηαβή δμιή ηδξ RNA οπμιμκάδαξ. ηδκ Δηθόλα 6. 1-Β, πανμοζζάγεηαζ δ πνμηεζκυιεκδ δμιή ημο RNA ηδξ RNase P απυ ημ D. discoideum, δ μπμία, υπςξ θαίκεηαζ, θένεζ υθα ηα ζοκηδνδιέκα παναηηδνζζηζηά ηςκ εοηανοςηζηχκ RNA οπμιμκάδςκ ηςκ RNase Ρ. ε αοηέξ πενζθαιαάκμκηαζ μζ ζοκηδνδιέκεξ πενζμπέξ CR I V, P1, P2, P3, P4, P12, ηαεχξ επίζδξ ηαζ ημ δμιζηυ ζημζπείμ ιε ηζξ ηέζζενεζξ εδθεζέξ ep5/7, P8, P9 ηαζ P10/11. Βπίζδξ, παναηδνείηαζ ιζα εηηεηαιέκδ έθζηα P3 - πμο εκημπίγεηαζ ιε ηδ ζοβηεηνζιέκδ ιμνθή απμηθεζζηζηά ζηζξ εοηανοςηζηέξ RNA οπμιμκάδεξ ηαζ είκαζ απαναίηδηδ βζα ηδκ πνυζδεζδ ζε αοηήκ ημοθάπζζημκ ηνζχκ πνςηεσκζηχκ οπμιμκάδςκ ημο μθμεκγφιμο (Pop1, Pop6, Pop7) δ μπμία δζαζνείηαζ ζε δομ ιζηνυηενεξ P3a ηαζ P3b, πμο ζοκδέμκηαζ ιεηαλφ ημοξ ιε ηδκ εζςηενζηή εδθεζά L3. ηδκ πνμηεζκυιεκδ αοηή δεοηενμηαβή δμιή παναηδνείηαζ ιζα εηηεηαιέκδ πενζμπή ελεζδίηεοζδξ S (S- domain) ιε παναηηδνζζηζηυ ηδ πανμοζία ηςκ δμιζηχκ ζημζπείςκ P10/11.1 ηαζ P10/11.2. Βπζπθέμκ, ζηδκ πενζμπή ελεζδίηεοζδξ ζπδιαηίγεηαζ δ έθζηα P19, δ μπμία πενζέπεζ ηδ εδθεζά L19, ιεβέεμοξ 15 κμοηθεμηζδίςκ ηαζ ζφζηαζδξ πθμφζζα ζε αδεκίκεξ. Βίκαζ εκδζαθένμκ, υηζ ημ P15 δμιζηυ ζημζπείμ απμοζζάγεζ απυ αοηήκ ηδ δμιή. 162

166 Απνηειέζκαηα (Α) (B) Εικόνα 6. 1: Πνμζδζμνζζιυξ ηδξ δεοηενμηαβμφξ δμιήξ ηδξ RNA οπμιμκάδαξ ηδξ RNase P ημο D. discoideum. (A) Βκγοιζηή ακάθοζδ απμηοπχιαημξ ημο ιεηαβνάθμο ηδξ RNA οπμιμκάδαξ ηδξ RNase P βζα ημ πνμζδζμνζζιυ ηδξ δεοηενμηαβμφξ δμιήξ ημο. Αζαδνμιή 1: Ώπμδζαηαβιέκμ RNA επελενβαζιέκμ ιε Σ1 νζαμκμοηθεάζδ, δζαδνμιή 2: Ώθηαθζηή οδνυθοζδ ημο RNA, δζαδνμιή 3: Μδ απμδζαηαβιέκμ RNA επελενβαζιέκμ ιε Σ1 νζαμκμοηθεάζδ ηαζ δζαδνμιή 4: Μδ απμδζαηαβιέκμ RNA επελενβαζιέκμ ιε Ώ νζαμκμοηθεάζδ. Ώνζζηενά ζδιεζχκμκηαζ ηα δμιζηά ζημζπεία ηδξ δεοηενμηαβμφξ δμιήξ ημο RNA, ιε δζαηεημιιέκεξ βναιιέξ εκχκμκηαζ μζ αθοζίδεξ πμο γεοβανχκμοκ, εκχ δ έκημκδ βναιιή εκχκεζ ηζξ ζοκηδνδιέκεξ πενζμπέξ CRI ηαζ CRII, πμο ζπδιαηίγμοκ ηδκ Ρ4 πενζμπή. (Β) Δ πνμηεζκυιεκδ δεοηενμηαβήξ δμιή ηδξ RNA οπμιμκάδαξ. Σα ζοκηδνδιέκα, ζε υθεξ ηζξ ιεθεηδιέκεξ RNA οπμιμκάδεξ ηςκ RNase P, ηαηάθμζπα είκαζ ιε έκημκα βνάιιαηα. Οζ ζοκηδνδιέκεξ πενζμπέξ ζδιεζχκμκηαζ (CRI-CRV) ηαζ ανίζημκηαζ ζε βηνί ζηζά ηαζ μζ πενζμπέξ πμο ζπδιαηίγμοκ έθζηα ανζειμφκηαζ ςξ Ρ1-Ρ

167 Απνηειέζκαηα Λεηηνπξγηθή κειέηε ηεο RNA ππνκνλάδαο ηνπ D. discoideum Έπεζ, πνμδβμοιέκςξ, πενζβναθεί απυ ημ ενβαζηήνζυ ιαξ πςξ εηηεκήξ απμπνςηεύκμπμίδζδ ηδξ RNase P ημο D. discoideum απμηαθφπηεζ ιζα εκδμκμοηθεμθοηζηή δναζηζηυηδηα πμο απμδυεδηε ζηδκ εκαπμιείκμοζα RNA οπμιμκάδα (Stathopoulos et al 2001). Δ δναζηζηυηδηα αοηή αθήκεζ 5 OH ηαζ 3 P άηνα, ακηίεεηα απυ ημ μθμέκγοιμ ηδξ RNase P ηαζ δζαζπά ημ πνυδνμιμ ιυνζμ trna ~2 nt ακμδζηά ημο ζδιείμο εναφζδξ ηδξ RNase P. Γζ αοηυ ημ θυβμ, δμηζιάζηδηε ημ ιεηάβναθμ ηδξ RNA οπμιμκάδαξ ζε ιζα πθδεχνα δζαθμνεηζηχκ ζοκεδηχκ πνυκμο, εενιμηναζίαξ, ιμκμζεεκχκ ηαζ δζζεεκχκ ηαηζυκηςκ, ph ηαζ πανμοζία πμθοηαηζμκηζηχκ ιμνίςκ, βζα πζεακή δναζηζηυηδηά ηδξ. Αοζηοπχξ ηαιζά απυ ηζξ δμηζιαγυιεκεξ ζοκεήηεξ δεκ ηαηάθενε κα πνμζδχζεζ ιζα πεζναιαηζηά επακαθαιαακυιεκδ δναζηζηή δζαιυνθςζδ ζημ RNA Αλάιπζε Απνηππώκαηνο ηεο RNA ππνκνλάδαο παξνπζία ηεο DRpp29 πςξ ακαθένεδηε ζηδκ πανάβναθμ 5.1.1, δ DRpp29 αθθδθεπζδνά ελεζδζηεοιέκα ιε ηδκ RNA οπμιμκάδα ηδξ RNase P ημο D. discoideum ηαζ έκα απυ ηα μοζζαζηζηά ενςηήιαηα πμο έπνεπε κα απακηδεεί ήηακ πμζά απυ ηα δμιζηά ζημζπεία ηδξ RNA οπμιμκάδαξ αθθδθεπζδνμφκ ιε ηδκ DRpp29. Ώοηυ απμηέθεζε ημ ηίκδηνμ, βζα ημ μπμίμ πναβιαημπμζήεδηακ πεζνάιαηα ακάθοζδξ απμηοπχιαημξ. ε αοηή ηδ ζεζνά πεζναιάηςκ, RNA ιεηάβναθμ, ναδζεκενβά ζδιαζιέκμ ζημ 5 άηνμ ιε 32 Ρ-[ΏΣΡ], αθέεδηε κα αθθδθεπζδνάζεζ ιε δζαθμνεηζηέξ ζοβηεκηνχζεζξ DRpp29 οπυ ηζξ ίδζεξ ζοκεήηεξ πμο πναβιαημπμζήεδηακ ηα πεζνάιαηα αθθαβήξ δθεηηνμθμνδηζηήξ ηζκδηζηυηδηαξ, πμο πενζβνάθδηακ ζηδκ πανάβναθμ ηδ ζοκέπεζα, ημ ζπδιαηζζιέκμ ζφιπθμημ DRpp29- RNA επελενβάζηδηε ιε ηδ νζαμκμοηθεάζδ Σ1 ηαζ ηα πνμσυκηα ηδξ ακηίδναζδξ ακαθφεδηακ ζε απμδζαηαηηζηυ πήηηςια πμθοαηνοθαιζδίμο (PAGE) ποηκυηδηαξ 6%. Ώπυ ηδ ιεθέηδ ημο αοημναδζμβναθήιαημξ πμο πανμοζζάγεηαζ ζηδκ Δηθόλα 6. 2-A θαίκεηαζ υηζ δ DRpp29 δεζιεφεηαζ ζηα ηαηάθμζπα G114, G116, G127, G128 ηαζ G158. Σα G114 ηαζ G116 ζοιπενζθαιαάκμκηαζ ζημ δμιζηυ ζημζπείμ ep5/7, εκχ ηα G127 ηαζ G128 ζοιπενζθαιαάκμκηαζ ζηζξ αάζεζξ πμο ζοιιεηέπμοκ ζημ ζπδιαηζζιυ ημο Ρ8 δμιζημφ ζημζπείμο ηδξ RNA οπμιμκάδαξ. Σέθμξ, ημ G158 ανίζηεηαζ ζηδκ Ρ10.1 πενζμπή, υπςξ δείπκεηαζ ζημ ιμκηέθμ ηδξ δμιήξ ζηδκ Δηθόλα 6. 2-Β. διακηζηυ είκαζ ημ βεβμκυξ πςξ ηαζ μζ ηνεζξ δμιζηέξ πενζμπέξ, ep5/7, Ρ8 ηαζ P10.1 ακήημοκ ζηδ πενζμπή ελεζδίηεοζδξ S ημο RNA (S-domain). Σμ απμηέθεζια αοηυ ένπεηαζ ζε ζοιθςκία ιε πνμδβμφιεκα 164

168 Απνηειέζκαηα Εικόνα 6. 2: Πνμζδζμνζζιυξ ηςκ πενζμπχκ ηδξ RNA οπμιμκάδαξ ηδξ RNase P απυ ημ D. discoideum πμο πνμζδέκεηαζ δ DRpp29. (A) Ώκάθοζδ απμηοπχιαημξ ηδξ RNA οπμιμκάδαξ πανμοζία αολακυιεκδξ ζοβηέκηνςζδξ DRpp29 (πανμοζζάγεηαζ ημ ηιήια ηδξ αοημναδζμβναθίαξ πμο παναηδνήεδηε ιείςζδ ηδξ έκηαζδξ ηςκ γςκχκ). Αζαδνμιή 1: RNA ιεηάβναθμ, δζαδνμιή 2: απμδζαηαβιέκμ RNA ιεηάβναθμ επελενβαζιέκμ ιε Σ1 νζαμκμοηθεάζδ, δζαδνμιέξ 3-5: RNA ιεηάβναθμ επελενβαζιέκμ ιε Σ1 νζαμκμοηθεάζδ πανμοζία πενίζζεζαξ DRpp29 (15, 30 ηαζ 60 θμνέξ πενζζζυηενδ πμζυηδηα πνςηεύκδξ έκακηζ ηδξ πμζυηδηαξ ημο RNA). Αελζά ανίζηεηαζ ιε δζαθμνεηζηυ πνχια δ αοημιαημπμζδιέκδ πμζμηζημπμίδζδ ηδξ ιείςζδξ ηδξ έκηαζδξ ηςκ γςκχκ πανμοζία δζαθμνεηζηήξ πμζυηδηαξ πνςηεύκδξ (βαθάγζμ: 1/15, ηυηηζκμ: 1/30 ηαζ πνάζζκμ: 1/60 ακαθμβία RNA/DRpp29). Ώκαβνάθμκηαζ ηα ηαηάθμζπα ηα μπμία θαίκμκηαζ κα αθθδθεπζδνμφκ ιε ηδκ DRpp29. (B) Δ δεοηενμηαβήξ δμιή ημο RNA, υπμο δείπκμκηαζ ιε ιπθέ αέθδ ηα ηαηάθμζπα G πμο αθθδθεπζδνμφκ ιε ηδκ DRpp

169 Απνηειέζκαηα δδιμζζεοιέκεξ ιεθέηεξ, μζ μπμίεξ απμδεζηκφμοκ πςξ μζ μιυθμβεξ ηδξ DRpp29 πνςηεύκεξ δεζιεφμκηαζ απμηθεζζηζηά ζηζξ πενζμπέξ ελεζδίηεοζδξ S ηςκ RNA οπμιμκάδςκ ημοξ ηαζ υπζ ζηζξ ηαηαθοηζηέξ ημοξ πενζμπέξ (C-domain), επδνεάγμκηαξ έηζζ ηδ δέζιεοζδ ημο οπμζηνχιαημξ ηαζ υπζ ημ νοειυ ηαηάθοζδξ ημοξ (Xu et al 2009, Kosaka et al 2010, Honda et al 2010). 7. Aλαζύζηαζε δξαζηηθόηεηαο RNase P in vitro Γνθηκέο εηεξόινγεο αλαζύζηαζεο δξαζηηθόηεηαο RNase P ρεκαηηζκόο ελεξγνύ ζπκπιόθνπ από ηελ DRpp29 θαη ην M1 RNA ΐαζζγυιεκμζ ζε πνμδβμφιεκδ δδιμζζεοιέκδ ιεθέηδ, ζφιθςκα ιε ηδκ μπμία δ ακενχπζκδ πνςηεύκδ Rpp29 ζπδιαηίγεζ ιαγί ιε ηδκ RNA οπμιμκάδα ηδξ RNase P απυ ημ E. coli (M1 RNA) εκενβυ ζφιπθμημ RNase P (Mann et al 2003), ημ μπμίμ είκαζ ζηακυ κα αθαζνεί ηδκ 5 επζπνυζεεηδ αθθδθμοπία, εθέβπεδηε εάκ δ DRpp29 ιπμνεί κα εκενβμπμζήζεζ ημ M1 RNA ζηδ αέθηζζηδ ζοβηέκηνςζδ ιαβκδζίμο (10 mm Mg 2+ ) (Guerrier-Takada et al 1983). Πναβιαημπμζήεδηακ πεζνάιαηα ακαζφζηαζδξ, ηαηά ηα μπμία δ DRpp29 ηαζ ημ Μ1 RNA πανέιεζκακ ζημοξ 37 μ C βζα 3 hrs βζα κα ένεμοκ ζε επαθή ηαζ κα αθθδθεπζδνάζμοκ (Μέεμδμζ, 9.1) ηαζ ζηδ ζοκέπεζα, ζημ ιίβια αοηυ πνμζηέεδηε ημ πνυδνμιμ SupS1 ςξ οπυζηνςια (psups1) ηαζ επςάζηδηε βζα επζπθέμκ 1 h. Σα απμηεθέζιαηα ηςκ πεζναιάηςκ αοηχκ έδεζλακ πςξ ηα δομ αοηά ιυνζα ζπδιαηίγμοκ εηενυθμβμ ζφιπθμημ ζηακυ κα απμιαηνφκεζ ηδκ 5 μδδβυ αθθδθμοπία απυ ημ πνυδνμιμ ιυνζμ ημο οπμζηνχιαημξ (Δηθόλα Α). Δ ακηίδναζδ ςνίιακζδξ ημο 5 άηνμο ημο psups1 αεθηζχκεηαζ αολάκμκηαξ ηδκ ζοβηέκηνςζδ ηδξ DRpp29 ηαζ δ δναζηζηυηδηα ημο ζοιπθυημο DRpp29-M1 RNA βίκεηαζ αέθηζζηδ ζε ιμνζαηή ακαθμβία ημο Μ1 RNA έκακηζ ηδξ πνςηεύκδξ, 1: 20. Χξ ακηζδνάζεζξ ανκδηζηήξ επαθήεεοζδξ (negative controls) εθέβπεδζακ λεπςνζζηά, είηε ημ M1 RNA, είηε δ DRpp29 ζηζξ ίδζεξ ζοκεήηεξ εενιμηναζίαξ, πνυκμο επχαζδξ ηαζ ζμκηζηήξ ζζπφμξ. πςξ θαίκεηαζ ζηδκ Δηθόλα Α (δζαδνμιέξ 3 ηαζ 4), ζε ηαιία πενίπηςζδ δεκ παναηδνήεδηε ςνίιακζδ ημο οπμζηνχιαημξ. Βθέπεδζακ, επίζδξ, ηα δείβιαηα ηδξ ακαζοκδοαζιέκδξ DRpp29 βζα ηοπυκ επζιυθοκζδ απυ ηδκ πνςηεύκδ C5, δ μπμία απμηεθεί ηδκ πνςηεσκζηή οπμιμκάδα ηδξ RNase P απυ ημ ααηηήνζμ E. coli. Ώκάθοζδ ηαηά western ζηα δείβιαηα ηδξ ηαεανήξ πνςηεύκδξ DRpp29, πνδζζιμπμζχκηαξ πμθοηθςκζηά ακηζζχιαηα έκακηζ ηδξ C5, επζαεααίςζακ ηδκ απμοζία ηδξ ζηα δείβιαηα αοηά (Δηθόλα Β). Με 166

170 Απνηειέζκαηα αοηυ ημ ηνυπμ δζαπζζηχεδηε πςξ δ ακηίδναζδ RNase P, πμο παναηδνήεδηε ζηδκ Δηθόλα Α, μθείθεηαζ ζηδκ πανμοζία απμηθεζζηζηά ηδξ DRpp29 ηαζ υπζ ζε πζεακή επζιυθοκζή ηδξ απυ ηδκ μιυθμβδ ημο Μ1 RNA, πνςηεύκδ C5. Εικόνα : Ώκαζφζηαζδ δναζηζηυηδηαξ RNase P απυ ηδ DRpp29 ηαζ ημ Μ1 RNA. (A) Ώπμδζαηαηηζηυ πήηηςια πμθοαηνοθαιζδίμο, ποηκυηδηαξ 10 %. Αζαδνμιή 1: psups1 ιυκμ ημο (S), δζαδνμιή 2: control ακηίδναζδ (C), δζαδνμιή 3: M1 RNA ιυκμ ημο, δζαδνμιή 4: DRpp29 ιυκδ ηδξ ηαζ δζαδνμιέξ 5-7: M1- DRpp29 ζφιπθμημ ζε δζαθμνεηζηέξ ακαθμβίεξ. Αελζά δείπκμκηαζ ιε αέθδ ημ psups1 ηαζ ηα πνμσυκηα ςνίιακζήξ ημο. (Β) Ώκάθοζδ ηαηά western ιε ηδκ πνήζδ anti-c5 ακηζζχιαημξ ζε δείβιαηα πμο πενζέπμοκ ακαζοκδοαζιέκδ C5 (δζαδνμιή 2) ηαζ ακαζοκδοαζιέκδ DRpp29 (δζαδνμιή 3). Ώνζζηενά ζδιεζχκεηαζ ημ ιέβεεμξ ηδξ ιμκαδζηήξ γχκδξ πμο παναηδνείηαζ ρεκαηηζκόο ελεξγνύ ζπκπιόθνπ από ην πνιππεπηίδην Γ75 θαη ην M1 RNA Πανάθθδθα, εεθήζαιε κα εθέβλμοιε εάκ δ πανμοζία ηάπμζμο απυ ηα ακαζοκδοαζιέκα πμθοπεπηίδζα Α75, Α155 ηαζ NTR ιπμνεί κα επζηνέρεζ ζημ Μ1 RNA κα θάαεζ ηδκ ηαηαθοηζηά δναζηζηή ημο δζαιυνθςζδ ζε παιδθέξ ζοβηεκηνχζεζξ Mg 2+ (10 mm). Σα πεζνάιαηα αοηά ακαζφζηαζδξ ηαηέδεζλακ υηζ ημ Μ1 RNA δεκ εκενβμπμζείηαζ απυ ημ Α155 ή ημ NTR, εκχ ημ Α75 πμο ακηζζημζπεί ζηδκ αθθδθμοπία ηδξ DRpp29 ηδκ μιυθμβδ ιε ηζξ εοηανοςηζηέξ πνςηεύκεξ, δδιζμονβεί ιε ημ Μ1 RNA έκα απμηεθεζιαηζηυ ζφιπθμημ βζα ηδκ ςνίιακζδ ημο πνυδνμιμο ιμνίμο psups1 (Δηθόλα ). 167

171 Απνηειέζκαηα Εικόνα : Ώπμδζαηαηηζηυ πήηηςια πμθοαηνοθαιζδίμο, ποηκυηδηαξ 10 % βζα ηδκ ακαζφζηαζδ δναζηζηυηδηαξ RNase P απυ ημ Α75 ηαζ ημ Μ1 RNA. Αζαδνμιή 1: control ακηίδναζδ (C), δζαδνμιή 2: psups1 ιυκμ ημο (S), δζαδνμιή 7: Μ1 RNA ιυκμ ημο ηαζ δζαδνμιή 8: ακαζοκδοαζιέκμ πμθοπεπηίδζμ Α75 ιυκμ ημο, δζαδνμιέξ 3-6: M1-Α75 ζφιπθμημ ζε δζαθμνεηζηέξ ακαθμβίεξ. Ώνζζηενά δείπκμκηαζ ιε αέθδ ημ psups1 ηαζ ηα πνμσυκηα ςνίιακζήξ ημο Κηλεηηθή αλάιπζε ησλ αλαζπζηακέλσλ ζπκπιόθσλ DRpp29-M1 RNA, C5-M1 RNA, Γ75-Μ1 RNA, θαζώο θαη ηνπ Μ1 ξηβνελδύκνπ ηδ ζοκέπεζα βεκκήεδηακ εφθμβα ενςηήιαηα ςξ πνμξ ημ πυζμ αεθηζχκεζ δ DRpp29 ηζξ ηαηαθοηζηέξ ζδζυηδηεξ ημο Μ1. Γζ αοηυ ημ θυβμ, πναβιαημπμζήεδηε ηθαζζζηή ηζκδηζηή ακάθοζδ ηαηά Michaelis-Menten βζα ηα ζφιπθμηα DRpp29-M1 RNA, C5-M1 RNA, Α75- M1 RNA ηαζ βζα ημ Μ1 νζαμέκγοιμ. Έηζζ, οπμθμβίζηδηακ μζ ηζκδηζηέξ ζηαεενέξ K m ηαζ k cat βζα ηάεε έκα απυ αοηά ηα ζφιπθμηα ηαζ ζοβηνίεδηακ ιεηαλφ ημοξ. Δ ανπζηή ηαπφηδηα πνμζδζμνίζηδηε απυ ηδκ ανπζηή ηθίζδ ηςκ δζαβναιιάηςκ δναζηζηυηδηαξ έκακηζ ημο πνυκμο ακηίδναζδξ (time plots). Δ ζηαεενά K m ηαζ βζα ηα ηέζζενα έκγοια οπμθμβίζηδηε απυ ηα δζαβνάιιαηα δζπθμφ ακηζζηνυθμο (double-reciprocal plot), υπςξ θαίκεηαζ ζηδκ Δηθόλα Οζ K m ηςκ ζοιπθυηςκ DRpp29-M1 RNA ηαζ C5-M1 RNA ανέεδηακ κα είκαζ ζπεδυκ ηαοηυζδιεξ (211 ηαζ 202 nm, ακηίζημζπα), εκχ ημο Α75-Μ1 RNA ηαζ ημο Μ1 RNA ήηακ 455 ηαζ 402 nm, ακηίζημζπα. Ώοηυ ημ απμηέθεζια δείπκεζ αθεκυξ, πςξ πανμοζία είηε ηδξ C5 πνςηεύκδξ, είηε ηδξ DRpp29 αεθηζχκεηαζ δ ζηακυηδηα ημο Μ1 RNA κα δεζιεφεζ ημ οπυζηνςια ηαζ αθεηένμο, πςξ ηαζ ηα δομ ακαζοζηαιέκα ζφιπθμηα πνμζδέκμοκ ημ οπυζηνςια ιε ηδκ ίδζα ζοββέκεζα. Ώπυ ηδκ άθθδ πθεονά, ημ Α75 δεκ αεθηζχκεζ ηδκ ζηακυηδηα δέζιεοζδξ ημο οπμζηνχιαημξ απυ ημ Μ1 RNA. Βκημφημζξ, θαίκεηαζ πςξ πανμοζία ημο Α75 πμθοπεπηζδίμο ιεηααάθθεηαζ δ δζαιυνθςζδ ημο Μ1 RNA ιε ηέημζμ ηνυπμ, χζηε κα ιεζχκεηαζ δ απαίηδζή ημο ζε Mg 2+ απυ 50 (αέθηζζηδ ζοβηέκηνςζδ Mg

172 Απνηειέζκαηα ημο νζαμεκγφιμο M1 RNA) ζε 10 mm (αέθηζζηδ ζοβηέκηνςζδ Mg 2+ ημο μθμεκγφιμο C5- M1 RNA). Ώπυ ηζξ οπμθμβζζιέκεξ ηζιέξ ηςκ k cat, αβαίκεζ ημ ζοιπέναζια, πςξ ηυζμ ημ ζφιπθμημ DRpp29-M1 RNA, υζμ ηαζ ημ Α75-Μ1 RNA ηαηαθφμοκ ηδκ ςνίιακζδ ημο οπμζηνχιαημξ psups1 ιε πμθφ πζμ ανβυ νοειυ. (ηαηαθοηζηέξ ζηαεενέξ: min -1 ηαζ 0.03 min -1, ακηίζημζπα), ζοβηνζηζηά ιε ημ μιυθμβμ μθμέκγοιμ C5-M1 RNA, ημο μπμίμο δ ηαηαθοηζηή ζηαεενά ζζμφηαζ ιε min -1. Δ ηαηαθοηζηή ζηαεενά ημο Μ1 RNA νζαμεκγφιμο ανέεδηε κα είκαζ min -1, βεβμκυξ πμο οπμζηδνίγεζ πςξ δ C5 αεθηζχκεζ εθάπζζηα ηδκ ηαηαθοηζηή δναζηζηυηδηα ημο M1 RNA, υηακ πνδζζιμπμζείηαζ ημ οπυζηνςια psups1 βζα ηδκ ηζκδηζηή ακάθοζδ. Εικόνα : Kζκδηζηή ακάθοζδ ηαηά Michaelis-Menten ηςκ ακαζοζηαιέκςκ δναζηζημηήηςκ RNase P. (A) Αζάβναιια δζπθμφ ακηζζηνυθμο ημο εηενυθμβμο ζοιπθυημο M1-DRpp29. (B) Αζάβναιια δζπθμφ ακηζζηνυθμο ημο εηενυθμβμο ζοιπθυημο M1-Α75. (Γ) Αζάβναιια δζπθμφ ακηζζηνυθμο ημο μιυθμβμο ζοιπθυημο M1-C5. (Γ) Αζάβναιια δζπθμφ ακηζζηνυθμο ημο νζαμεκγφιμο M1 RNA. ηα ημοηζά ακαβνάθμκηαζ μζ οπμθμβζγυιεκεξ ζηαεενέξ K m ηαζ k cat βζα ημ ηάεε ακαζοζηαιέκμ έκγοιμ. 169

173 Απνηειέζκαηα Γνθηκέο νκόινγεο αλαζύζηαζεο δξαζηηθόηεηαο RNase P Δ DRpp29, εθυζμκ δζαπζζηχεδηε πςξ πνμζδέκεηαζ ζηδκ RNA οπμιμκάδα ηδξ RNase P ημο D. discoieum, ιεθεηήεδηε βζα ηδκ ζηακυηδηά ηδξ κα ζπδιαηίγεζ έκα εθάπζζημ ηαηαθοηζηυ πονήκα ιε αοηυ ημ RNA, ςνζιάγμκηαξ πνυδνμια ιυνζα trna. Αμηζιάζηδηακ ηαζ εθέπεδζακ πμθθέξ δζαθμνεηζηέξ ακαθμβίεξ πνςηεύκδξ ηαζ RNA, δζαθμνεηζηέξ ζοκεήηεξ εενιμηναζίαξ, πνυκμο, ζμκηζηήξ ζζπφμξ, ηαεχξ επίζδξ ηαζ δζάθμνα μιυθμβα (ptrna Ser ηαζ ptrna Leu απυ ημ D. discoideum) ηαζ εηενυθμβα οπμζηνχιαηα (psups1 απυ ημ S. pombe ptrna Tyr απυ ημ E. coli). Αοζηοπχξ, δεκ θάααιε ηάπμζμ αλζυπζζημ ηαζ επακαθαιαακυιεκμ απμηέθεζια. Βπίζδξ, πναβιαημπμζήεδηακ πεζνάιαηα ιεηαβναθήξ ηδξ RNA οπμιμκάδαξ, in vitro, πανμοζία ηδξ DRpp29, δ μπμία πνμζηέεδηε βζα κα παίλεζ ημ νυθμ ηδξ ζοκμδμφ πνςηεύκδξ ηαζ κα αμδεήζεζ ημ RNA ιεηάβναθμ κα οζμεεηήζεζ ηδ δναζηζηή ημο δζαιυνθςζδ. Σμ ζοβηεηνζιέκμ πείναια, πανυθμ πμο δζελήπεδ ηάης απυ πμθθέξ δζαθμνεηζηέξ ζοκεήηεξ, ήηακ ακεπζηοπέξ. πςξ έπεζ πνμακαθενεεί ζηδκ εζζαβςβή (Βζζαβςβή, 3.4.2), πςξ ηυζμ ζηα ανπαία, υζμ ηαζ ζημκ άκενςπμ, δ Rpp29 αθθδθεπζδνά ιε ηδκ πνςηεσκζηή οπμιμκάδα Rpp21 ηαζ ιαγί δδιζμονβμφκ έκα εηενμδζιενέξ ζφιπθμημ ημ μπμίμ δεζιεφεηαζ ηαζ ζηαεενμπμζεί ηδ πενζμπή ελεζδίηεοζδξ (S- domain) ηδξ RNA οπμιμκάδαξ (Honda T et al 2010, Kosaka S et al 2010, Xu Y et al 2009, Jiang T et al 2001). Βπζπθέμκ, ημ ζφιπθμημ Rpp29-Rpp21 πνμηαθεί ιείςζδ ηςκ ζμκηζηχκ απαζηήζεςκ ημο RNA ηαζ αεθηζχκεζ ηδκ ζοββέκεζα δέζιεοζδξ ημο οπμζηνχιαημξ απυ ημ RNA. ε ιενζηέξ ιάθζζηα πενζπηχζεζξ μζ δομ πνςηεύκεξ ιαγί ιε ηδκ RNA οπμιμκάδα ζπδιαηίγμοκ ζφιπθμημ ιε δναζηζηυηδηα RNase P (Pulukkunat ηαζ Gopalan 2008, Tsai et al 2006). Λαιαάκμκηαξ οπ υρζκ ηζξ παναπάκς ιεθέηεξ, δ πνςηεύκδ DRpp21 ημο D. discoideum ηθςκμπμζήεδηε ηαζ εηθνάζηδηε, βζα κα πνδζζιμπμζδεεί πεναζηένς ζε πεζνάιαηα ακαζφζηαζδξ Πξνζδηνξηζκόο ηεο πξσηνηαγνύο αιιεινπρίαο θαη νκνπαξάζεζε ηεο DRpp21 κε νξζόινγεο πξσηεΐλεο από άιινπο νξγαληζκνύο ΐάζεζ ηδξ βμκζδζςιαηζηήξ ηνάπεγαξ δεδμιέκςκ dictybase ( ανέεδηε δ αθθδθμοπία ημο βμκζδίμο drpp21, πμο ηςδζημπμζεί ηδκ πνςηεσκζηή οπμιμκάδα ηδξ RNase P απυ ημ ιολμιφηδηα D. discoideum, ιε ηςδζηυ DDB_G Σμ βμκίδζμ drpp21 έπεζ ιέβεεμξ 675 nts ηαζ ηςδζημπμζεί ιζα πνςηεύκδ 232 αιζκμλέςκ ιε pi 9.94 ηαζ ιμνζαηυ αάνμξ kda. 170

174 Απνηειέζκαηα Δ πμθθαπθή μιμπανάεεζδ αθθδθμοπζχκ, ακάιεζα ζηδκ αιζκμλζηή αθθδθμοπία ηδξ DRpp21 ηαζ ζε ήδδ παναηηδνζζιέκεξ πνςηεύκεξ απυ εοηανοςηζημφξ μνβακζζιμφξ ηαζ ανπαία (H. sapiens, M. musculus, P. horikoshii, P. furiosus ηαζ M. maripaludis), πνδζζιμπμζχκηαξ ημκ αθβυνζειμ Clustal W (Thompson et al 1994), δείπκεζ πςξ δ DRpp21 δζαεέηεζ ιζα ιμκαδζηή αθθδθμοπία πμο απμοζζάγεζ απυ ηζξ μιυθμβέξ ηδξ. Πνυηεζηαζ βζα ιζα αθθδθμοπία πμο πενζθαιαάκεζ ηα 91 πνχηα αιζκμλέα ημο άιζκμ-ηεθζημφ άηνμο ηδξ πνςηεύκδξ, ιε ααζζηυ παναηηδνζζηζηυ ηδ παιδθή πμθοπθμηυηδηά ηδξ, αθμφ ηςδζημπμζεί ηαηά ~ 70% ηαηάθμζπα αζπαναβίκδξ (Δηθόλα ). Βπίζδξ, παναηδνείηαζ πςξ δ DRpp21 ζοκηδνεί ηα 3 ααζζηά ηαηάθμζπα, R105, L109, Y130, ηα μπμία αάζεζ ηδξ ηνοζηαθθζηήξ δμιήξ ηδξ μιυθμβδξ πνςηεύκδξ απυ ημ P. furiosus, είκαζ απαναίηδηα βζα ηδ δέζιεοζδ ζυκηςκ Zn 2+ (Βζζαβςβή, 3.4.2). Σα αιζκμλέα αοηά ιαγί ιε ηα ζοκηδνδιέκα ηαηάθμζπα ηοημζίκδξ, C162, C165, C192, C195, πμο ζοιιεηέπμοκ ζημ ζπδιαηζζιυ δομ βεθονχκ εείμο, είκαζ ζδιακηζηά βζα ηδ δζαηήνδζδ ηδξ θεζημονβζηήξ δμιήξ ηδξ πνςηεύκδξ DRpp21 ηαζ ηςκ μνευθμβςκ αοηήξ (Amero et al 2008) (Δηθόλα ). 171

175 Απνηειέζκαηα Εικόνα : Οιμπανάεεζδ ηδξ DRpp29 ιε μιυθμβεξ πνςηεύκεξ. Υνδζζιμπμζήεδηε μ αθβυνζειμξ Clustal W (1.83, Blosum scoring matrix). Σα υιμζα αιζκμλέα ζηζάγμκηαζ ιε ιαφνμ πνχια, εκχ ηα πανυιμζα ιε βηνζ, ιε ηαηχθθζ 60%. Οζ πνςηεύκεξ Rpp21 απυ ημκ άκενςπμ (NP_079115), ημκ M. musculus (NP_080584), ημκ S. pombe (NP_596472), Pho1601 απυ ημ ανπαίμ P. horikoshii (NP_143456), Pfu1613 απυ ημ ανπαίμ P. furiosus (NP_579342) ηαζ απυ ημ M. maripaludis (YP_ ) είκαζ παναηηδνζζιέκεξ οπμιμκάδεξ ηδξ RNase P. Γζα ηζξ αθθδθμοπίεξ απυ ημ M. musculus, S. pombe ηαζ ημ M. maripaludis δεκ έπεζ απμδεζπεεί πεζναιαηζηά δ ζοιεημπή ημοξ ζημ ζφιπθμημ ηδξ RNase P. Με ηυηηζκμ ζδιεζχκμκηαζ ηα ζοκηδνδιέκα ηαηάθμζπα πμο είκαζ απαναίηδηα βζα ηδ δζαηήνδζδ ηδξ ηνζημηαβμοξ δμιήξ ηδξ DRpp

176 Απνηειέζκαηα Κισλνπνίεζε θαη ππνθισλνπνίεζε ηνπ ηκήκαηνο ηεο DRpp21, δ404 Γζα ηδκ εκίζποζδ ημο βμκζδίμο drpp21 ζπεδζάζηδηε έκα γεφβμξ εηηζκδηχκ drpp21f/drpp21r (Μέεμδμζ 3.1.1), αάζεζ ηδξ αθθδθμοπίαξ ζηδκ ηνάπεγα δεδμιέκςκ. Δ εκίζποζδ έβζκε πνδζζιμπμζχκηαξ ςξ εηιαβείμ μθζηυ RNA απυ ημ D. discoideum. Λυβς ηδξ απμηθεζζηζηήξ πανμοζίαξ Ώ ηαζ Σ ημκηά ζημ 5 άηνμ ημο βμκζδίμο, δ εκίζποζδ ημο ακμζπημφ πθαζζίμο ακάβκςζδξ ημο drpp21 απέηοπε. Γζ αοηυ ημ θυβμ, ζπεδζάζηδηε έκαξ ηαζκμφνβζμξ κμδιαηζηυξ εηηζκδηήξ, πμο οανζδμπμζείηαζ πζμ εζςηενζηά ζημ 5 άηνμ ηδξ αθθδθμοπίαξ. Δ πνήζδ ημο ηαζκμφνβζμο γεφβμοξ εηηζκδηχκ (p21α404f/p21r) ιε ηδ ιέεμδμ ηδξ RT-PCR έδςζε πνμσυκ ζημ ακαιεκυιεκμ ιέβεεμξ ηςκ 404 κμοηθεμηζδίςκ, ημ μπμίμ μκμιάζηδηε δ404 (Δηθόλα I). ηδ ζοκέπεζα, δ επζεοιδηή γχκδ απμιμκχεδηε απυ ημ πήηηςια (Μέεμδμζ, 3.6) ηαζ αθμφ εηποθίζηδηε, επςάζηδηε ιαγί ιε θμνέα ηθςκμπμίδζδξ pcrii ηαζ ηθςκμπμζήεδηε ιε ηδ ιέεμδμ ΣΏ - ηθςκμπμίδζδ (Μέεμδμζ, 3.7). Σμ ακαζοκδοαζιέκμ πθαζιίδζμ ιεηαζπδιάηζζε δεηηζηά ηφηηανα DH5a, άπ υπμο απμιμκχεδηε ζε ιζηνή ηθίιαηα (Μέεμδμζ, 3.9.1). Δ ηθςκμπμίδζδ ημο ζςζημφ εκεέημο επζαεααζχεδηε ιε αθθδθμφπζζδ ημο πθαζιζδίμο pcrii/δ404. Εικόνα I: Δθεηηνμθυνδζδ ζε πήηηςια αβανυγδξ 2 %, βζα ηδκ εκίζποζδ ημο δ404 βμκζδίμο. Αζαδνμιή 1: ιάνηοναξ, δζαδνμιή 2 ηαζ 3: πνμσυκ ακηίδναζδξ ηδξ RT- PCR ηαζ δζαδνμιή 4: ακηίδναζδ πςνίξ ηδ πνμζεήηδ RNA εηιαβείμο. Με ηυηηζκμ αέθμξ ζδιεζχκεηαζ ημ επζεοιδηυ πνμσυκ πμο απμιμκχκεηαζ βζα ηδκ ηθςκμπμίδζδ ημο βμκζδίμο. 173

177 Απνηειέζκαηα Καζ ζε αοηήκ ηδ πενίπηςζδ, βζα ηδκ οπμηθςκμπμίδζδ ημο δ404 πνδζζιμπμζήεδηε μ πθαζιζδζαηυξ θμνέαξ έηθναζδξ pet29c(+). Ώημθμφεδζε δ δζαδζηαζία έκεεζδξ ημο εκζζποιέκμο DNA ιεηαλφ ηςκ αθθδθμοπζχκ ακαβκχνζζδξ ηςκ πενζμνζζηζηχκ εκγφιςκ NdeI ηαζ XhoI, υπςξ αηνζαχξ πενζβνάθδηε ζηδκ πανάβναθμ 1.3. Σμ έκεεημ δ404 ηαζ ημ πθαζιίδζμ pet29c(+) οπέζηδζακ δζπθή πέρδ ιε ηα έκγοια NdeI ηαζ XhoI (Δηθόλα ΗΗ) ηαζ ηα πνμσυκηα ηδξ πέρδξ δθεηηνμθμνήεδηακ ζε πήηηςια αβανυγδξ. Οζ επζεοιδηέξ γχκεξ απμιμκχεδηακ, ηαεανίζεδηακ ηαζ επςάζεδηακ ιαγί, πανμοζία ημο εκγφιμο ζοκδεηάζδ Σ4 (Μέεμδμζ, 4.1.1). Σμ ακαζοκδοαζιέκμ πθαζιίδζμ pβσ29a(+)/δ404 πμο πνμέηορε, ιεηαζπδιάηζζε δεηηζηά ηφηηανα BL21(DE3) (Μέεμδμζ, 3.8). Οζ πζμ εοιεβέεεζξ απμζηίεξ (πμο ζδιαίκεζ ηαθή ακάπηολδ πανμοζία ακηζαζμηζημφ, άνα ζηαεενυ πθαζιίδζμ) απυ ηα ιεηαζπδιαηζζιέκα ηφηηανα εθέπεδζακ ιε colony PCR βζα ηδκ πανμοζία ημο δ404. Μζα ελ αοηχκ πνδζζιμπμζήεδηε βζα επαβςβή ηδξ έηθναζδξ ημο ηιήιαημξ δ404. Εικόνα II: Δθεηηνμθυνδζδ ζε πήηηςια αβανυγδξ, ποηκυηδηαξ 1.5 % ηςκ πθαζιζδίςκ ιεηά απυ δζπθή πέρδ ιε ηα έκγοια NdeI ηαζ XhoI. Αζαδνμιή 1: άημπμ πθαζιίδζμ pcrii/δ404, δζαδνμιή 2 ηαζ 3: πθαζιίδζμ pcrii/δ404 ιεηά απυ πέρδ ιε NdeI ηαζ XhoI, δζαδνμιή 4: DNA ιάνηοναξ, δζαδνμιή 5: άημπμ πθαζιίδζμ pet29a(+) ηαζ δζαδνμιή 6 ηαζ 7: βναιιμπμζδιέκμ πθαζιίδζμ pet29a(+) ιεηά απυ πέρδ ιε NdeI ηαζ XhoI. Σα πνμσυκηα ιε ιεβέεδ 404 bp ηαζ 5229 bp, αθμνμφκ ημ δ404 ηαζ ημ βναιιμπμζδιέκμ pβσ29a(+), ακηίζημζπα, απμιμκχεδηακ ηαζ πνδζζιμπμζήεδηακ βζα ηδκ ηαηαζηεοή ημο πθαζιζδίμο pet29a(+)/δ

178 Απνηειέζκαηα Παξαιαβή θαζαξνύ αλαζπλδπαζκέλνπ πνιππεπηηδίνπ Γ404 Δ επαβςβή ηδξ έηθναζδξ ημο δ404 πναβιαημπμζήεδηε πανμοζία 1 mm IPTG (Μέεμδμζ, 4.2) βζα 4 hrs, υπςξ ηαζ ζηδ πενίπηςζδ ηδξ DRpp29. Δ πνςηεύκδ Α404 απμηεθείηαζ απυ 135 αιζκμλέα ηαζ έπεζ ιμνζαηυ αάνμξ ~16 kda. Δ έηθναζδ ημο Α404-His 6 εθέβπεδηε ζε δείβια μιμβεκμπμζδιέκςκ ηοηηάνςκ ιε ακάθοζδ ηαηά western, πνδζζιμπμζχκηαξ Anti-His mouse IgG (Δηθόλα I Α). Ώπυ ημ μιμβεκμπμίδια ηςκ ηοηηάνςκ πανεθήθεδζακ ηα ηθάζιαηα ηςκ δζαθοηχκ ηαζ αδζάθοηςκ πνςηεσκχκ, ζηα μπμία δζελήπεδζακ ακάθοζδ ηαηά western βζα κα δζαπζζηςεεί ζε πζμ ηθάζια παναθαιαάκεηαζ ημ ιεβαθφηενμ πμζμζηυ ηδξ ακαζοκδοαζιέκδξ πνςηεύκδξ. Ώθμφ επζαεααζχεδηε δ έηθναζδ ημο ακαζοκδοαζιέκμο πμθοπεπηζδίμο ηαζ δ ζπεδυκ ελ μθμηθήνμο φπανλή ημο ζημ αδζάθοημ ηθάζια ηςκ πνςηεσκχκ (Δηθόλα I Β), αημθμφεδζε παναζηεοή ζε ιεβαθφηενδ ηθίιαηα ηαζ ηαεανζζιυξ ιε πνςιαημβναθία ζοββεκείαξ. Εικόνα Ι: Ώκάθοζδ ηαηά western βζα ακίπκεοζδ ημο πμθοπεπηζδίμο Α404 ιεηά απυ επαβςβή ηδξ έηθναζήξ ημο. (A) Ώκίπκεοζδ ημο οπενεηθναζιέκμο Α404 ζε ηφηηανα BL21(DE3), ζε δζαθμνεηζημφξ πνυκμοξ ηαζ ζημοξ 37 μ C, ιε ηδ πνήζδ Anti-His. Αζαδνμιή ΝΕ (Non Induced): δείβια ηοηηανζημφ μιμβεκμπμζήιαημξ πνζκ ηδκ επαβςβή ηδξ έηθναζδξ. Αζαδνμιέξ 1-4: δείβιαηα ηοηηανζημφ μιμβεκμπμζήιαημξ ζημοξ ακαβναθυιεκμοξ πνυκμοξ επαβςβήξ ηδξ έηθναζδξ. (Β) Ώκίπκεοζδ ημο ακαζοκδοαζιέκμο Α404 ζημ δζαθοηυ (δζαδνμιή 1) ηαζ αδζάθοημ (δζαδνμιή 2) ηθάζια πνςηεσκχκ ιεηά απυ 4 hrs επαβςβήξ ηδξ έηθναζήξ ημο ηαζ ιε ηδ πνήζδ Anti-His. Κφηηανα BL21(DE3)-pET29c(+)/δ404 απυ ηαθθζένβεζα υβημο 1 L, ζοθθέπεδηακ, μιμβεκμπμζήεδηακ ηαζ απυ ημ μιμβεκμπμίδια πανεθήθεδ ημ ηθάζια ηςκ αδζάθοηςκ πνςηεσκχκ (Μέεμδμζ, 4.4.3). Σμ εηπφθζζια ημο ηθάζιαημξ ηςκ αδζάθοηςκ πνςηεσκχκ θμνηχεδηε ζε ζηήθδ Ni-NTA, ελζζμννμπδιέκδ ζε ph 8.0 ηαζ μ ηαεανζζιυξ ημο πμθοπεπηζδίμο Α404 πναβιαημπμζήεδηε ιε ααειζδςηή ιείςζδ ημο ph (Ώπμηεθέζιαηα, 2.2). Οζ ιδ εζδζηά δεζιεοιέκεξ πνςηεύκεξ απμιαηνφκεδηακ ιε εθαθνχξ υλζκμ δζάθοια (ph 6.3), εκχ δ έηθμοζδ ηδξ 175

179 Απνηειέζκαηα ακαζοκδοαζιέκδξ πνςηεύκδξ έβζκε ζε δφμ αήιαηα ιε νοειζζηζηά δζαθφιαηα ζε ph 5.9 ηαζ 4.5. Αείβιαηα απυ ηα ηθάζιαηα ηδξ ζηήθδξ ακαθφεδηακ ιε δθεηηνμθυνδζδ ζε πήηηςια SDS/πμθοαηνοθαιζδίμο (SDS-PAGE) (Δηθόλα II). Παναηδνμφιε, υηζ δ ακαζοκδοαζιέκδ πνςηεύκδ Α404 εηθμφεηαζ πμζμηζηά, ιε εθάπζζηδ επζιυθοκζδ απυ άθθεξ πνςηεύκεξ, ζηα ηθάζιαηα 10 έςξ 13. Σα ηθάζιαηα αοηά ζοβηεκηνχεδηακ ζε έκα ηαζ δζαπζδφεδηακ ζηαδζαηά ζε δζαθφιαηα ιε ζφζηαζδ 100 mm NaH 2 PO 4, 10 mm Tris-Cl ph 8.0, 150 mm NaCl ηαζ 25% βθοηενυθδξ ηαζ ιεζμφιεκδ ζοβηέκηνςζδ μονίαξ. Δ ζοβηέκηνςζδ ηδξ μθζηήξ πνςηεύκδξ ημο δζαπζδοιέκμο ηθάζιαημξ πνμζδζμνίζηδηε ιε ηδ ιέεμδμ Bradford ηαζ ανέεδηε κα είκαζ 1.7 ιg/ιl. Εικόνα II: Πήηηςια SDS-PAGE, ποηκυηδηαξ 14%, ηςκ ηθαζιάηςκ πμο ζοθθέπεδζακ απυ ημ ηαεανζζιυ ημο οπενεηθναζιέκμο πμθοπεπηζδίμο Α404 ζε ζηήθδ Ni-NTA. Αζαδνμιή 1: δείβια ηοηηανζημφ εηποθίζιαημξ πνζκ ηδκ επαβςβή ηδξ έηθναζδξ ημο Α404 (NI, Non Induced), δζαδνμιή 2: δείβια ηοηηανζημφ εηποθίζιαημξ (CE, Cell Extract) ιεηά απυ 4 hrs επαβςβήξ ηδξ έηθναζδξ ημο πμθοπεπηζδίμο, δζαδνμι 4: δείβιαηα πνςηεσκχκ πμο δζένπμκηαζ απυ ηδ ζηήθδ (FT, Flow Through), δζαδνμιή 5: δείβια απυ ημ ηθάζια λεπθφιαημξ ηδξ ζηήθδξ (W, Wash) ηαζ δζαδνμιέξ 7-13: δείβιαηα ηθαζιάηςκ πμο εηθμφζηδηακ ιε ιείςζδ ημο ph. Αζαδνμιέξ Μ: πνςηεσκζηυξ ιάνηοναξ. ηδ δζαδνμιή CE είκαζ ειθακήξ δ οπενεηθναζιέκδ DRpp29. Βπίζδξ, ειθακέξ είκαζ ημ ιεβάθμ πμζμζηυ ηαεανυηδηαξ πμο επζηοβπάκεηαζ ιε ηδ πνήζδ πνςιαημβναθίαξ ζοββεκείαξ Αλαζύζηαζε δξαζηηθόηεηαο RNase P από ηε DRpp29, Γ404 θαη ηελ RNA ππνκνλάδα Μεηά ημ ηαεανζζιυ ημο ακαζοκδοαζιέκμο πμθοπεπηζδίμο Α404, εθέβπεδηε, εάκ πνάβιαηζ δ πνμζεήηδ ημο ζημ ζφιπθμημ DRpp29-RNA πνμηαθεί ημ ζπδιαηζζιυ εκυξ εθάπζζημο ηαηαθοηζημφ πονήκα ημο μθμεκγφιμο RNase P απυ ημ D. discoideum. Σα DRpp29, Α404 ηαζ prna ημο D. discoideum πνμεπςάζηδηακ ζε νοειζζηζηυ δζάθοια CD πνζκ ηδκ πνμζεήηδ οπμζηνχιαημξ ζε δζαθμνεηζηέξ ακαθμβίεξ, δζαθμνεηζημφξ πνυκμοξ ηαζ 176

180 Απνηειέζκαηα εενιμηναζίεξ (Μέεμδμζ 2.4.2). Μεηά απυ ηάεε πνμεπχαζδ αημθμφεδζε επχαζδ ζημοξ 37 μ C βζα 1 h πανμοζία ημο οπμζηνχιαημξ psups1. Μεηά απυ πμθθέξ πνμζπάεεζεξ ανέεδηε υηζ υηακ ημ prna πνμεπςάζηδηε ιε ηζξ DRpp29 ηαζ Α404 ζε ακαθμβία 1:2:2 βζα 16 hrs ζημοξ 4 μ C ακαηηά ζε ιζηνυ ααειυ ηδκ εκγοιζηή ημο δναζηζηυηδηα (Δηθόλα 7. 3, δζαδνμιή 6). Σμ ίδζμ ζοιααίκεζ εάκ δ πνμεπχαζδ βίκεζ ζημοξ 23 μ C, αθθά ημ prna ακαηηά, ζοβηνζηζηά, ιζηνυηενδ δναζηζηυηδηα (Δηθόλα 7. 3, δζαδνμιή 5). Εικόνα 7. 3: Ώπμδζαηαηηζηυ πήηηςια πμθοαηνοθαιζδίμο, ποηκυηδηαξ 10 % βζα ακίπκεοζδ δναζηζηυηδηαξ RNase P ιεηά απυ ακαζφζηαζδ ημο εκγφιμο απυ ηδ DRpp29, ημ Α404 ηαζ ημ ιεηάβναθμ ηδξ RNA οπμιμκάδαξ ηδξ RNase P ημο D. discoideum. Αζαδνμιή 1: psups1 ιυκμ ημο (S), δζαδνμιή 2: control ακηίδναζδ (C), δζαδνμιή 3: prna οπμιμκάδα ιυκδ ηδξ, δζαδνμιή 4: ακαζοκδοαζιέκα πμθοπεπηίδζα DRpp29 ηαζ Α404 ιαγί, δζαδνμιή 5: ακαζοζηαιέκμ ζφιπθμημ DRpp29-Α404-RNA οπμιμκάδα ζε εενιμηναζία πνμεπχαζδξ 23 o C ηαζ δζαδνμιή 6: ακαζοζηαιέκμ ζφιπθμημ DRpp29- Α404-RNA οπμιμκάδα ζε εενιμηναζία επχαζδξ 4 o C. Αελζά δείπκεηαζ ιε αέθμξ ημ πνμσυκ ςνίιακζδξ ημο psups1. 8. Μνληέιν δνκήο ηεο DRpp Η DRpp29 αλαδηπιώλεηαη ζύκθσλα κε ην ραξαθηεξηζηηθό κνηίβν ησλ Sm πξσηετλώλ Ώπυ ηα 252 αιζκμλέα ηδξ DRpp29 ιυκμ δ πενζμπή απυ ημ 137 ιέπνζ ημ 252 αιζκμλφ (DRpp ) ιμκηεθμπμζήεδηε, αάζεζ ηδξ μιμθμβίαξ πμο πανμοζζάγεζ ιε ηζξ ήδδ 177

181 Απνηειέζκαηα δζαεέζζιεξ ηνοζηαθθζηέξ δμιέξ πνςηεσκχκ. Σμ ιμκηέθμ ημο DRpp απμηεθείηαζ απυ 6 ακηζπανάθθδθεξ α-πηοπςηέξ επζθάκεζεξ (α1 - α6) ηαζ πέκηε α-έθζηεξ (Δηθόλα 8. 1-Η). Ο πονήκαξ ημο α-αανεθζμφ ημο DRpp έπεζ δζαιυνθςζδ πμο ιμζάγεζ ιε ηζξ Sm πνςηεύκεξ. Ο πονήκαξ ηδξ πνςηεύκδξ είκαζ πμθφ ηαθά παηεηανζζιέκμξ ηαζ πενζέπεζ ζοκηδνδιέκα οδνμθμαζηά ηαηάθμζπα. Ώιζκμλέα ζοκηδνδιέκα ιέζα ζηδκ μζημβέκεζα ηςκ Rpp29 πνςηεσκχκ (Δηθόλα 8. 1) ηαηέπμοκ ηεκηνζηέξ εέζεζξ ζηδ δμιή ηδξ DRpp29. Δ ορδθή ακάθοζδ ηδξ δμιήξ ηςκ ζοιπθυηςκ Rpp29-Rpp21 απυ ημ P. furiosus (pdbid: 2KI7) (Xu et al 2009) ηαζ P. horikoshii (pdbid: 2ZAE) (Honda et al 2008) επέηνερε κα πανημβναθδεμφκ ηα ηαηάθμζπα ηα οπεφεοκα βζα ηδκ ιεηαλφ ηςκ δομ αοηχκ πνςηεσκχκ αθθδθεπίδναζδ (Δηθόλα 8. 1-Η Δ). Δ πθεζμρδθία ηςκ αιζκμλέςκ πμο ζοιιεηέπμοκ ζηδκ αθθδθεπίδναζδ ιε ηζξ πνςηεύκεξ ζηα P. furiosus (PfuRpp29) ηαζ P. horikoshii (PhoRpp29) ζοκηδνμφκηαζ ηαζ ζηδκ DRpp29 ηαζ έηζζ, έβζκε εθζηηυξ μ πνμζδζμνζζιυξ ηδξ επζθάκεζαξ ηδξ DRpp29 πμο ιπμνεί κα ειπθέηεηαζ ζηδκ ακαβκχνζζδ ηαζ ζημ ζπδιαηζζιυ αθθδθεπζδνάζεςκ ιε άθθεξ πνςηεύκεξ (Δηθόλα 8. 1-Η Α). Βλέηαζδ ημο ιμκηέθμο ηδξ DRpp29 απμηάθορε πςξ δ πθεονζηή μιάδα ημο αιζκμλέμξ Κ211 πμο ανίζηεηαζ ζε έκα ανυπμ ιεηαλφ ηςκ αθοζίδςκ α4 ηαζ α5, ιαγί ιε ηδ πθεονζηή μιάδα ημο R239, πμο ανίζηεηαζ ζηδκ α5 έθζηα, ζπδιαηίγεζ έκα δίηηομ δεζιχκ οδνμβυκμο ιε ηδκ πθεονζηή μιάδα ημο Β192 ζηδκ α2 αθοζίδα (Δηθόλα 8. 1-ΗΗ). Έκα ζπεηζηυ δίηηομ δεζιχκ οδνμβυκμο παναηδνείηαζ ηαζ ζηζξ ηνοζηαθθζηέξ δμιέξ ημο ζοιπθυημο PhoRpp29- PhoRpp21 (ηαηάθμζπα Κ90 ηαζ Β73 ζηδκ PhoRpp29) ηαζ έπεζ δεζπεεί πςξ είκαζ ηνίζζιμ βζα ηδ δναζηζηυηδηα RNase P (Honda et al 2008). Πζμ ζοβηεηνζιέκα, ημ Κ90 ζηδκ PhoRpp29 ιέζς ημο ζπδιαηζζιμφ αοημφ ημο δζηηφμο δεζιχκ οδνμβυκμο πνμζακαημθίγεζ ηδκ πθεονζηή μιάδα ημο Β73, έηζζ χζηε κα αθθδθεπζδνάζεζ ιε ηδκ πθεονζηή μιάδα ημο R43 ηδξ PhoRpp21, βζα κα ζπδιαηζζηεί ηαζ κα ζηαεενμπμζδεεί ημ ζφιπθμημ PhoRpp29- PhoRpp21. Πανυιμζα εα ιπμνμφζε κα πνμηαεεί πςξ ημ δίηηομ δεζιχκ οδνμβυκμο ηςκ Κ211, R239 ηαζ Β192 ιπμνεί κα πνμζακαημθίγεζ ηδκ πθεονζηή μιάδα ημο Β192, βζα αθθδθεπίδναζδ ιε ηδκ DRpp21 ζημ ζφιπθμημ DRpp29-DRpp21. Ώοηή δ παναηήνδζδ οπμζηδνίγεζ πεναζηένς ηδκ ηαοημπμίδζδ ηδξ επζθάκεζαξ ηδξ DRpp29 πμο ειπθέηεηαζ ζηδκ αθθδθεπίδναζδ ιε πνςηεύκεξ. Δ ακηίεεηδ πθεονά, πμο απμηεθείηαζ απυ ηζξ αθοζίδεξ α1, α2, α5, α6 ηαζ ηζξ έθζηεξ α3 ηαζ α4, εα ιπμνμφζε κα είκαζ οπεφεοκδ βζα ηδκ αθθδθεπίδναζδ ιε RNA ιυνζα. Πνάβιαηζ, NMR ιεθέηεξ ηδξ μιυθμβδξ Rpp29 πνςηεύκδξ απυ ημ ανπαίμ Methanothermobacter thermoautotrophicus (Mth Rpp29) ιαγί ιε ηδκ RNA οπμιμκάδα (Mth RNA) απμηάθορε ανηεηά αιζκμλέα πμο ζοιιεηέπμοκ 178

182 Απνηειέζκαηα ζε αθθδθεπζδνάζεζξ ιε RNA (Boomershine et al 2003) (Δηθόλα 8. 1-Η Α). Ώοηά ηα ηαηάθμζπα είκαζ ζοκηδνδιέκα ζηδκ DRpp29 ηαζ ανίζημκηαζ ζηδκ ακηίεεηδ επζθάκεζά ηδξ απυ αοηή, υπμο πζεακχξ κα δεζιεφμκηαζ μζ πνςηεσκεξ. Ο δοκδηζηυξ δθεηηνμζηαηζηυξ πάνηδξ ηδξ DRpp29 δείπκεζ ιζηνέξ πενζμπέξ ζηδκ επζθάκεζα ιε εεηζηά ηαηάθμζπα ζε δζαθμνεηζηέξ πθεονέξ ημο ζοιπθυημο (Δηθόλα 8. 1-Η Β θαη Γ). Δ ιεβαθφηενδ απυ αοηέξ ηζξ εεηζηά θμνηζζιέκεξ πενζμπέξ εηηείκεηαζ ζηδκ πθεονά ηδξ πνςηεύκδξ πμο δεκ ειπθέηεηαζ ζηδκ ακαβκχνζζδ πνςηεσκχκ (Δηθόλα 8. 1-Η Γ). Πμθθά ζοκηδνδιέκα ηαηάθμζπα Arg ηαζ Lys ανίζημκηαζ ζε αοηή ηδκ πενζμπή. Σμ Κ161 ανίζηεηαζ ζηδκ έθζηα α3, ημ Κ176 ζηδ α1, ημ Κ178 ζε έκα ανυπμ ακάιεζα ζηζξ αθοζίδεξ α1 ηαζ α2, ημ Κ186 ζηδκ α2, ημ Κ202 ζημ ανυπμ ιεηαλφ ηςκ α3 ηαζ α4, ημ Κ205 ζηδ α4, ημ Κ230 ζηδκ α4 ηαζ ηα Κ242, Κ243, R247, K248 ημπμεεημφκηαζ ζημ ηαναμλο-ηεθζηυ άηνμ ημο πονήκα ημο α-αανεθζμφ ημο DRpp

183 Απνηειέζκαηα Εικόνα 8. 1-Ι: Μμκηέθμ δμιήξ ηδξ DRpp29 απυ ημ Dictyostelium discoideum. (A) Δ επζθάκεζα ηδξ πνςηεύκδξ πμο πζεακυκ ειπθέηεηαζ ζε αθθδθεπζδνάζεζξ ιε άθθεξ πνςηεύκεξ. (Γ) Δ ακηίεεηδ επζθάκεζα ηδξ DRpp29 απυ αοηή πμο απεζημκίγεηαζ ζημ (Α), δ οπεφεοκδ βζα αθθδθεπίδναζδ ιε RNA. Καηάθμζπα πμο ειπθέημκηαζ ζε αθθδθεπζδνάζεζξ ιε πνςηεύκεξ ηαζ RNA ακαπανζζηχκηαζ ιε ιμα πνχια ζημ (A) ηαζ ζημ (Γ), ακηίζημζπα. (Β) (μ ίδζμξ πνμζακαημθζζιυξ ιε ημ Α) ηαζ (Γ) (μ ίδζμξ πνμζακαημθζζιυξ ιε ημ Γ) Ο δθεηηνμζηαηζηυξ πάνηδξ ηδξ DRpp29. Φαίκεηαζ δ δζααάειζζδ πνχιαημξ απυ ηυηηζκμ (ανκδηζηά θμνηζζιέκα αιζκμλέα) ζε ιπθέ (εεηζηά θμνηζζιέκα αιζκμλέα). (E) Αμιή ηδξ DRpp29 ααζζγυιεκδ ζε μιμπανάεεζή ηδξ ιε αθθδθμοπίεξ άθθςκ μιυθμβςκ πνςηεσκχκ βκςζηήξ δμιήξ: Rpp29 απυ ημ P. furiosus (pdbid: 2KI7), arpp29 απυ ημ A. fulgidus (pdbid: 1TSF), MthRpp29 απυ ημ M. thermoautotrophicus (pdbid: 1OQK) ηαζ PhoRpp29 απυ ημ P. horikoshii (pdbid: 2ZAE). Καηάθμζπα πμο είκαζ ιδ πνμζαάζζια απυ ημ δζαθφηδ ζδιεζχκμκηαζ ιε ηεθαθαία (X), εκχ αοηά πμο είκαζ πνμζαάζζια ιε ιζηνά (x). Καηάθμζπα πμο ζοιιεηέπμοκ ζε α-έθζηα είκαζ ηυηηζκα (x), ζε α-πηοπςηή επζθάκεζα είκαζ ιπθέ (x), ζε έθζηα 3-10 είκαζ ηαθέ (x), υζα ειπθέημκηαζ ζε δεζιμφξ οδνμβυκμο ιε ηδκ αιζδζηή ηαζ ηδκ ηαναμκοθζηή μιάδα ημο πεπηζδζημφ δεζιμφ πανμοζζάγμκηαζ ιε έκημκδ βναθή (x) ηαζ οπμβναιιζζιέκα, ακηίζημζπα, εκχ ηα ηαηάθμζπα ιε εεηζηή ηδ θ βςκία ζδιεζχκμκηαζ ιε πθάβζα βνάιιαηα (x). Σα ζφιαμθα, and ζδιεζχκμοκ αιζκμλέα πμο παίνκμοκ ιένμξ ζε αθθδθεπζδνάζεζξ πνςηεσκχκ, υπςξ ιε ηδκ Rpp21 (δεζιμί οδνμβυκμο ηαζ βέθονεξ άθαημξ), αιζκμλέα ζηδ δζεπζθάκεζα ηαζ αιζκμλέα πμο αθθδθεπζδνμφκ ιε RNA, ακηίζημζπα. 180

184 Απνηειέζκαηα Εικόνα 8. 1-ΙΙ: Καηάθμζπα ηδξ DRpp29 πμο εκδεπμιέκςξ αθθδθεπζδνμφκ ιε ηδκ DRpp21. Σμ δίηηομ ηςκ δεζιχκ οδνμβυκμο ηςκ ηαηαθμίπςκ K211, R239 ηαζ E192 πζεακχξ πνμζακαημθίγεζ ηδκ πθεονζηή μιάδα ημο E192, έηζζ χζηε κα αθθδθεπζδνά ιε ηδκ DRpp

185

186

187

188

189

190 πδήηεζε 1. Η RNase P ηνπ D. discoideum ηδ πανμφζα δζαηνζαή έβζκε ιεθέηδ ηδξ πνςηεσκζηήξ οπμιμκάδαξ DRpp29, ζε ζοκδοαζιυ ιε ηδκ πνςηεύκδ ζοκενβάηδ ηδξ, DRpp21, ηαζ ηδκ RNA οπμιμκάδα ημο νζαμκμοηθεμπνςηεσκζημφ ζοιπθυημο ηδξ RNase P απυ ημ D. discoideum. Δ RNase P απυ αοηυ ημ ιολμιφηδηα πανμοζζάγεζ ενεοκδηζηυ εκδζαθένμκ, θυβς ηςκ ζδζαίηενςκ παναηηδνζζηζηχκ πμο δζαεέημοκ μζ οπμιμκάδεξ ημο. Πζμ ζοβηεηνζιέκα, έλζ απυ ηζξ μπηχ πνςηεύκεξ θένμοκ επζπνυζεεηεξ αθθδθμοπίεξ, ελαζηίαξ ηςκ μπμίςκ έπμοκ ιεβαθφηενμ ιμνζαηυ αάνμξ, ζοβηνζηζηά ιε ηζξ μιυθμβεξ πνςηεύκεξ απυ άθθμοξ μνβακζζιμφξ. Βπίζδξ, ηνείξ απυ ηζξ πνςηεύκεξ (DRpp20, DRpp25, DRpp30) θένμοκ πενζμπέξ παιδθήξ πμθοπθμηυηδηαξ ζημ ηαναμλο-ηεθζηυ ημοξ άηνμ, εκχ δ DRpp21 θένεζ αθθδθμοπία παιδθήξ πμθοπθμηυηδηαξ (LCR: Low Complexity Region) ζημ αιζκμ-ηεθζηυ ηδξ άηνμ (Δηθόλα 1). Οζ πενζμπέξ αοηέξ δεκ έπμοκ ζοβηεηνζιέκδ δζαιυνθςζδ ζημ πχνμ ηαζ εεςνείηαζ πςξ δζεοημθφκμοκ ηζξ αθθδθεπζδνάζεζξ πμο ακαπηφζζμκηαζ ιεηαλφ ηςκ πνςηεσκχκ. Πνυζθαηα δεδμιέκα δείπκμοκ, πςξ μζ πνςηεύκεξ πμο δζαεέημοκ πενζμπέξ LCR, ηείκμοκ κα έπμοκ ζζπονή δεζιεοηζηή ζηακυηδηα ηαζ κα αθθδθεπζδνμφκ ιε πενζζζυηενα πνςηεσκζηά ιυνζα ζε ζπέζδ ιε αοηέξ πμο δε δζαεέημοκ ηέημζεξ πενζμπέξ (Coletta et al 2010). Γζ αοηυ, εεςνμφιε πςξ μζ DRpp30, DRpp25, DRpp21 ηαζ DRpp20 εα πνέπεζ κα Εικόνα 1: οβηνζηζηή απεζηυκζζδ ιεηαλφ ηςκ πνςηεσκζηχκ οπμιμκάδςκ ηδξ RNase P ημο D. discoideum (ανζζηενά) ηαζ ημο ακενχπμο (δελζά). Ο πνςιαηζζιυξ ηςκ πνςηεσκχκ έβζκε αάζεζ ηδξ ηζιήξ ημο ζζμδθεηηνζημφ ημοξ ζδιείμο. Οζ βηνίγεξ πενζμπέξ ζηζξ πνςηεύκεξ ημο Dictyostelium ακαθένμκηαζ ζηζξ επζπθέμκ αθθδθμοπίεξ πμο θένμοκ, ζοβηνζηζηά ιε ηζξ ακενχπζκεξ. πμο LCR: Low Complexity Region, ζδιεζχκμκηαζ μζ πενζμπέξ παιδθήξ πμθοπθμηυηδηαξ. Με αζηενίζημ ζδιεζχκμκηαζ μζ πνςηεύκεξ πμο ζοκακηχκηαζ ηαζ ζηα ανπαία. 185

191 πδήηεζε έπμοκ ηεκηνζηυ νυθμ ζηζξ αθθδθεπζδνάζεζξ ιε ηζξ οπυθμζπεξ πνςηεσκζηέξ οπμιμκάδεξ ηδξ RNase P. Βπίζδξ, είκαζ πζεακυ, αοηυ ημ παναηηδνζζηζηυ ηςκ DRpp30, DRpp25, DRpp21 ηαζ DRpp20, κα ημοξ πνμζδίδεζ ζηακυηδηα αθθδθεπίδναζδξ ιε πνςηεύκεξ δζαθμνεηζηήξ θεζημονβζηυηδηαξ. πεηζηά ιε άθθμοξ μνβακζζιμφξ πμο δζαεέημοκ ιυκμ ιία πνςηεύκδ ηδξ RNase P ιε υλζκδ ηζιή ημο ζζμδθεηηνζημφ ηδξ ζδιείμο, ζημ D. discoideum οπάνπμοκ ηνεζξ υλζκεξ πνςηεύκεξ, δ DRpp40, DPop5 ηαζ DRpp20 (Δηθόλα 1). Σέθμξ, είκαζ παναηηδνζζηζηυ πςξ απμοζζάγεζ δ μιυθμβδ ηδξ Rpp38, δ μπμία ακζπκεφεηαζ ζε RNase P ηςκ ζπμκδοθςηχκ ηαζ ηςκ ανπαίςκ (Δηθόλα 1). 2. Υαξαθηεξηζηηθά ηεο DRpp29 ηδ πανμφζα ενβαζία έβζκε αζμπδιζηυξ παναηηδνζζιυξ ηδξ ακαζοκδοαζιέκδξ πνςηεσκζηήξ οπμιμκάδαξ ηδξ RNase P ημο ιολμιφηδηα D. discoideum, DRpp29, δ μπμία εκημπίζηδηε θυβς ηδξ μιμθμβίαξ πμο πανμοζζάγεζ ιε ηζξ ακηίζημζπεξ πνςηεύκεξ (π.π. Pop4/Rpp29/Ph1771) ηςκ RNase P μθμεκγφιςκ απυ εοηανοςηζημφξ μνβακζζιμφξ ηαζ ανπαία (Jarrous et al 1999, Boomershine et al 2003, Numata et al 2004, Tsai et al 2006). Δ πανημβνάθδζδ μθυηθδνμο ημο βμκζδζχιαημξ ημο D. discoideum έηακε πζμ εφημθδ ηδκ ακαγήηδζδ ηαζ ημκ εκημπζζιυ ηςκ βμκζδίςκ ζε αοηυκ ημκ μνβακζζιυ. Δ DRpp29 είκαζ ιζα εεηζηά θμνηζζιέκδ πνςηεύκδ απμηεθμφιεκδ απυ 252 αιζκμλέα, ιε ζζμδθεηηνζηυ ζδιείμ 9.6 ηαζ ιε ιμνζαηυ αάνμξ Da. Σμ ζδζαίηενμ παναηηδνζζηζηυ ηδξ DRpp29 είκαζ πςξ θένεζ ζημ αιζκμ-ηεθζηυ ηδξ άηνμ ιζα ζδζμζοβηναηζηή πενζμπή 75 αιζκμλέςκ, δ μπμία υηακ μιμπαναηίεεηαζ ιε μιυθμβεξ πνςηεύκεξ απυ άθθμοξ μνβακζζιμφξ δεκ πανμοζζάγεζ ηαιία μιμθμβία (Ώπμηεθέζιαηα, Δηθόλα 1. 2) Η DRpp29 ζπκκεηέρεη ζην ξηβνλνπθιενπξσηετληθό ζύκπινθν ηεο RNase P Μεηά ηδκ ηθςκμπμίδζδ ηαζ ηδκ επαβςβή ηδξ έηθναζδξ ηδξ DRpp29, πναβιαημπμζήεδηε ακμζμπμίδζδ ημοκεθζχκ, ζηα μπμία εκέεδηε ηαεανή ακαζοκδοαζιέκδ πνςηεύκδ. Σα πμθοηθςκζηά ακηζζχιαηα, πμο πανήπεδζακ έκακηζ ηδξ DRpp29, πνδζζιμπμζήεδηακ ζε ακάθοζδ ηαηά western δεζβιάηςκ πμο πνμήθεακ απυ ιενζηυ ηαεανζζιυ ημο μθμεκγφιμο RNase P απυ ηφηηανα D. discoideum. Σα anti-drpp29 ακαβκςνίγμοκ ιζα ιμκαδζηή γχκδ ζημ ακαιεκυιεκμ ιέβεεμξ ηςκ ~30 kda, πμο ζοιπίπηεζ ιε ηδκ ειθάκζζδ δναζηζηυηδηαξ ζηα ηθάζιαηα ηαεανζζιμφ ημο εκγφιμο (Ώπμηεθέζιαηα, Δηθόλα 4. 1). Σα παναβυιεκα ακηζζχιαηα πνδζζιμπμζήεδηακ βζα ηαηαηνήικζζδ εκγοιζηήξ 186

192 πδήηεζε δναζηζηυηδηαξ RNase P, αάζεζ ηδξ εζδζηήξ αθθδθεπίδναζδξ πμο ακαπηφζζεηαζ ιεηαλφ ακηζβυκμο (DRpp29) ηαζ ακηζζχιαημξ (anti-drpp29). Με αοηή ηδ πεζναιαηζηή δζαδζηαζία επζαεααζχεδηε δ ζοιιεημπή ηδξ DRpp29 ζημ νζαμκμοηθεμπνςηεσκζηυ ζφιπθμημ ηδξ RNase P (Ώπμηεθέζιαηα, Δηθόλα 4. 2). ηα πεζνάιαηα αοηά θαίκεηαζ, επίζδξ, πςξ ηα ακηζζχιαηα υηακ δεζιεφμκηαζ ζηδκ ακαζοκδοαζιέκδ πνςηεύκδ δεκ ιεηααάθθμοκ ηδκ δζαιμνθςζή ηδξ, αθμφ δεκ πανειπμδίγεηαζ, μφηε δ ζοιιεημπή ηδξ πνςηεύκδξ ζηδκ ανπζηεηημκζηή ημο ζοιπθυημο ηδξ RNase P, μφηε δ θεζημονβία αοηήξ ηαζ ημο μθμεκγφιμο Η DRpp29 πξνζδέλεηαη ζε κόξηα RNA ηδ πνμζπάεεζά ιαξ κα ενεοκήζμοιε ηζξ ζδζυηδηεξ ηδξ DRpp29, πναβιαημπμζήεδηακ πεζνάιαηα ιεηααμθήξ ηδξ δθεηηνμθμνδηζηήξ ηζκδηζηυηδηαξ, ηα μπμία απμηάθορακ, πςξ δ DRpp29 πνμζδέκεηαζ ζηδκ ζοββεκή RNA οπμιμκάδα ηδξ RNase P (Ρ RNA). Δ δέζιεοζδ είκαζ ζζπονή ηαζ εζδζηή, αθμφ ημ ζφιπθμημ πμο ζπδιαηίγεηαζ, ιεηαλφ ηδξ DRpp29 ηαζ ημο ναδζεκενβά ζδιαζιέκμο ζημ 5 άηνμ P RNA, ηαηανβείηαζ πθήνςξ πανμοζία ιζηνήξ πμζυηδηαξ ροπνμφ P RNA (ιδ ναδζεκενβά ζδιαζιέκμ). Ώκηίεεηα, ημ ζπδιαηζγυιεκμ ζφιπθμημ DRpp29-P RNA δεκ επδνεάγεηαζ απυ ηδκ πανμοζία πενίζζεζαξ μθζημφ RNA απυ γφιδ, ημ μπμίμ δνα ςξ ιδ εζδζηυξ ακηαβςκζζηήξ (Ώπμηεθέζιαηα, Δηθόλα ). Σμ απμηέθεζια αοηυ ένπεηαζ ζε ζοιθςκία ιε ηζξ ζδζυηδηεξ ηςκ μιμθυβςκ ηδξ πνςηεσκχκ απυ ανπαία ηαζ άθθμοξ εοηανοςηζημφξ μνβακζζιμφξ (γφιδ ηαζ άκενςπμ), υπμο ηαζ αοηέξ δεζιεφμκηαζ ζηζξ RNA οπμιμκάδεξ ηςκ ακηίζημζπςκ εκγφιςκ RNase P. Δ ίδζα πεζναιαηζηή δζαδζηαζία πναβιαημπμζήεδηε βζα ημκ έθεβπμ πζεακήξ αθθδθεπίδναζδξ ηδξ DRpp29 ιε ημ πνυδνμιμ trna Ser απυ ημ S. pombe (psups1). ε ακηίεεζδ ιε ηδκ ακενχπζκδ μιυθμβή ηδξ, Rpp29, δ DRpp29 δεκ δεζιεφεζ εζδζηά ημ εοηανοςηζηυ psups1 οπυζηνςια in vitro (Ώπμηεθέζιαηα, Δηθόλα ) Μνληεινπνίεζε-ε DRpp29 αλαδηπιώλεηαη όπσο νη Sm πξσηεΐλεο Με ζημπυ κα ζοζπεηίζμοιε ηζξ θεζημονβζηέξ ζδζυηδηεξ ηδξ DRpp29 ιε ηδ δζαιυνθςζδ πμο οζμεεηεί ζημ πχνμ, πναβιαημπμζήεδηε ιμκηεθμπμίδζή ηδξ ααζζγυιεκδ ζηζξ ιέπνζ ηχνα βκςζηέξ ηνοζηαθθζηέξ δμιέξ ηςκ μιυθμβςκ πνςηεσκχκ απυ ηα ανπαία P. horikoshii ηαζ P. furiosus. ΐάζεζ, θμζπυκ, μιμθμβίαξ ζηδ πνςημηαβή δμιή ηςκ πνςηεσκχκ αοηχκ ιμκηεθμπμζήεδηε ημ ηιήια ηδξ πνςηεύκδξ πμο εηηείκεηαζ απυ ημ 137 έςξ ημ 252 αιζκμλφ ηδξ DRpp29 (DRpp ). Σμ ηιήια DRpp οζμεεηεί ακαδίπθςζδ ιμνθήξ πμο 187

193 πδήηεζε ιμζάγεζ ζηζξ Sm πνςηεύκεξ, μζ μπμίεξ πνυηεζηαζ βζα ιζα μζημβέκεζα πνςηεσκχκ ιε ηφνζμ παναηηδνζζηζηυ ηδκ ζηακυηδηά ημοξ κα δεζιεφμοκ ιυνζα νζαμκμοηθεμηζδίςκ. Έκα ακηζπνμζςπεοηζηυ πανάδεζβια Sm πνςηεσκχκ είκαζ μ εηενμεπηαιενήξ δαηηφθζμξ Sm ζημοξ εοηανοςηζημφξ μνβακζζιμφξ, μ μπμίμξ απμηεθείηαζ απυ ηζξ οπμιμκάδεξ SmE, SmG, SmD3, SmB, SmD1, SmD2 ηαζ SmF ηαζ πνμζδέκεηαζ ζε ιζηνά ιυνζα RNA (U snrnas), ζπδιαηίγμκηαξ ημ ζςιάηζμ ιαηίζιαημξ (spliceosome). οβηεηνζιέκα, ημ ιμκηέθμ ημο ηιήιαημξ ηδξ DRpp απμηεθείηαζ απυ 6 ακηζπανάθθδθεξ α πηοπςηέξ επζθάκεζεξ (α1- α6) ηαζ πέκηε α έθζηεξ (Ώπμηεθέζιαηα, Δηθόλα Η). ημκ εεςνδηζηυ δθεηηνμζηαηζηυ πάνηδ ημο ιμκηέθμο DRpp , ακζπκεφμκηαζ δζαζημνπζζιέκα εεηζηά θμνηζζιέκα ηαηάθμζπα, ηα μπμία εκδεπμιέκςξ κα ιεζμθααμφκ ζε αθθδθεπζδνάζεζξ ιεηαλφ πνςηεσκχκ ηαζ πνςηεσκχκ ιε ιυνζα RNA. Έηζζ, πανέπεηαζ πθδνμθμνία βζα ιεθθμκηζηέξ ιεθέηεξ ααζζγυιεκεξ ζε εζζαβςβή ιεηαθθάλεςκ ζε ηέημζεξ θεζημονβζηά ζδιακηζηέξ πενζμπέξ Σν πνιππεπηίδην Γ75 επζύλεηαη γηα ηελ πξόζδεζε ηεο DRpp29 ζην Ρ RNA ηνπ D. discoideum Μεηά απυ παναηήνδζδ ηδξ μιμπανάεεζδξ ηςκ αθθδθμοπζχκ ηδξ DRp29 ηαζ ηςκ μιυθμβχκ ηδξ (Ώπμηεθέζιαηα, Δηθόλα 1. 2), εκημπίζαιε ηνεζξ δζαηνζηέξ πενζμπέξ ζηδκ πνςημηαβή δμιή ηδξ DRpp29 (Ώπμηεθέζιαηα, Δηθόλα 5. 2) λεηζκχκηαξ απυ ημ ηαναμλοηεθζηυ άηνμ ηδξ DRpp29, δζαηνίκμοιε ιζα πενζμπή ημζκή ζηα ανπαία ηαζ ζημοξ εοηανοςηζημφξ μνβακζζιμφξ ( πονήκαξ p29 ), ιζα πενζμπή παναηηδνζζηζηή ζημοξ εοηανοχηεξ, πθμφζζα ζε θοζίκεξ ηαζ ανβζκίκεξ (πενζμπή K-R) ηαζ ηέθμξ, ιζα αιζκμ-ηεθζηή πενζμπή, δ μπμία είκαζ απμηθεζζηζηή ηδξ DRpp29, αθμφ πανμοζζάγεζ ζδζαίηενα παιδθή μιμθμβία ακάιεζα ζηζξ μιυθμβεξ πνςηεύκεξ (Ώπμηεθέζιαηα, Δηθόλα 5. 2). ΐαζζγυιεκμζ ζηζξ παναπάκς παναηδνήζεζξ, ζπεδζάζαιε ηνία ιεηαθθαβιέκα ηιήιαηα ηδξ DRpp29, ηα μπμία εκζζπφεδηακ, ηθςκμπμζήεδηακ ηαζ εηθνάζηδηακ. Σα πμθοπεπηίδζα αοηά μκμιάζηδηακ Α155, NTR ηαζ Α75. Σμ Α155 πμθοπεπηίδζμ, απυ ημ μπμίμ απμοζζάγμοκ ηα 155 πνχηα αιζκμλέα απυ ημ αιζκμ-ηεθζηυ άηνμ ηδξ πνςηεύκδξ ηαζ πενζέπεζ ηδκ ηαναμλοηεθζηή πενζμπή πμο ιμζάγεζ ιε ηζξ Sm πνςηεύκεξ, είκαζ εεηζηά θμνηζζιέκμ ηαζ ακηζζημζπεί ζημκ πονήκα p29. Σμ NTR πμθοπεπηίδζμ απμηεθείηαζ απυ ηα 75 πνχηα ηαηάθμζπα ημο αιζκμ-ηεθζημφ άηνμο ηδξ DRpp29 ηαζ ημ Α75 δεκ δζαεέηεζ ηα 75 πνχηα αιζκμλέα, αθθά πενζθαιαάκεζ ηδκ Sm πενζμπή ( πονήκαξ p29 ) ηαζ ηδκ K-R πενζμπή. Μεηά ηδκ απμιυκςζή ημοξ, ηα ηνία αοηά πμθοπεπηίδζα πνδζζιμπμζήεδηακ ζε πεζνάιαηα βζα ημκ πνμζδζμνζζιυ ηςκ θεζημονβζχκ ημοξ. Εδζαίηενμ εκδζαθένμκ πανμοζίαζακ ηα 188

194 πδήηεζε απμηεθέζιαηα ηςκ πεζναιάηςκ EMSA πμο δζελήπεδζακ ιεηαλφ ηςκ πμθοπεπηζδίςκ ηαζ ημο ναδζεκενβά ζδιαζιέκμο P RNA ημο D. discoideum. Πζμ ζοβηεηνζιέκα, δ πενζμπή ημο πονήκα p29 (πμθοπεπηίδζμ Α155) δεκ ζπδιαηίγεζ ζηαεενυ ζφιπθμημ ιε ηδκ Ρ RNA οπμιμκάδα ημο D. discoideum, πανυθμ πμο δζαεέηεζ υθα ηα απαναίηδηα δμιζηά ζημζπεία βζα ηδκ ζςζηή ακαδίπθςζδ. Βπίζδξ, δ αιζκμ-ηεθζηή πενζμπή ηδξ DRpp29 (πμθοπεπηίδζμ NTR) δεκ δεζιεφεηαζ εζδζηά ζημ Ρ RNA (Ώπμηεθέζιαηα, Δηθόλα , δζαδνμιέξ 5-7). ε ακηίεεζδ, ημ πμθοπεπηίδζμ Α75, ημ μπμίμ ακηζπνμζςπεφεζ ημκ εθάπζζημ πνςηεσκζηυ πονήκα ηςκ μιυθμβςκ εοηανοςηζηχκ πνςηεσκχκ ηδξ DRpp29, αθθδθεπζδνά ζζπονά ηαζ εζδζηά ιε ημ ζοββεκέξ P RNA (Ώπμηεθέζιαηα, Δηθόλα , δζαδνμιέξ 8-10). Σμ ζφιπθμημ, πμο ζπδιαηίγεηαζ ιεηαλφ ημο Α75 ηαζ ημο ναδζεκενβά ζδιαζιέκμο P RNA, παναιέκεζ πανμοζία πενίζζεζαξ ιδ εζδζημφ ζοκαβςκζζηή, αθθά ακαζηέθθεηαζ απυ ιζηνέξ πμζυηδηεξ εζδζημφ ζοκαβςκζζηή (Ώπμηεθέζιαηα, Δηθόλα , δζαδνμιέξ 11-14). Βπζπνυζεεηα ηαζ ζε ζοκδοαζιυ ιε ηα παναπάκς πεζναιαηζηά απμηεθέζιαηα πνδζζιμπμζήζαιε ηνία δζαθμνεηζηά θμβζζιζηά, ιε ζημπυ ηδκ πνυαθερδ ηςκ πζεακχκ εέζεςκ ζηδκ αθθδθμοπία ηδξ DRpp29 πμο αθθδθεπζδνμφκ ιε RNA (Kumar et al 2008, Wang and Brown 2006, Terribilini et al 2007). H ιεβαθφηενδ ζοιθςκία αθθδθμοπζχκ, ιεηαλφ ηδξ DRpp29 ηαζ ηςκ μιυθμβχκ ηδξ, ανέεδηε ζε πενζμπέξ πμο εκημπίγμκηαζ ζημ ηαναμλο-ηεθζηυ άηνμ ηδξ DRpp29, ιεηαλφ ημο 233 ηαζ 252 αιζκμλέμξ (K242, K243, R247, K248) ηαζ ζημ αιζκμ-ηεθζηυ ηιήια ηδξ πνςηεύκδξ πμο εηηείκεηαζ ιεηαλφ ημο 95 ηαζ 118 αιζκμλέμξ (DRpp ). Σμ ιμηίαμ R-x(9)-K-x-K-x-L-x-x-[RK]-x-[RK], πμο ακζπκεφεδηε ζηδκ πενζμπή DRpp , πανμοζζάγεζ μιμζυηδηα ζηδκ αθθδθμοπία ιε ηζξ εοηανοςηζηέξ μιυθμβεξ πνςηεύκεξ (Ώπμηεθέζιαηα, Δηθόλα 5. 3), εκχ πανάθθδθα εκημπίγεηαζ ηαζ ζε πθδεχνα άθθςκ πνςηεσκχκ πμο είκαζ βκςζηυ πςξ αθθδθεπζδνμφκ ιε RNA, επζηονχκμκηαξ, έηζζ, ηδκ ζπμοδαζυηδηά ημο ζηδκ αθθδθεπίδναζδ ηδξ DRpp29 ιε ηδκ RNA οπμιμκάδα ηδξ RNase P ημο D. discoideum. Ώπυ υθα ηα παναπάκς πνμηφπηεζ πςξ δ αιζκμ-ηεθζηή πενζμπή ημο πμθοπεπηζδίμο Α75 δζεοημθφκεζ ημ ζπδιαηζζιυ ζοιπθυημο ιε ημ P RNA. Πανυθα αοηά, δεκ ιπμνμφιε κα οπμεέζμοιε πςξ μ πονήκαξ p29 δεκ είκαζ απαναίηδημξ βζα αοηήκ ηδκ αθθδθεπίδναζδ. Πζμ πζεακυκ είκαζ υηζ μ πονήκαξ p29 απαζηείηαζ βζα ηδκ ακαβκχνζζδ ηαζ ηδ ζςζηή ημπμεέηδζδ ηςκ μιυθμβςκ, ηδξ DRpp29, εοηανοςηζηχκ πνςηεσκχκ πάκς ζηδ ζοββεκή RNA οπμιμκάδα ηδξ RNase P. Σα απμηεθέζιαηά ιαξ δείπκμοκ πςξ ζηδκ επζθάκεζα αθθδθεπίδναζδξ ηςκ εοηανοςηζηχκ πνςηεσκχκ ιε ηζξ ακηίζημζπεξ RNA οπμιμκάδεξ έπμοκ ακαπηοπεεί δζαθμνεηζηά παναηηδνζζηζηά, ηα μπμία ηδκ ηάκμοκ δζαηνζηή απυ ηδκ ακηίζημζπδ ηςκ ανπαίςκ. 189

195 πδήηεζε Πξνζδηνξηζκόο ηεο δεπηεξνηαγνύο δνκήο ηνπ P RNA ηεο RNase P από ην D. discoideum Δ RNA οπμιμκάδα ηδξ RNase P απυ ημ D. discoideum έπεζ ηθςκμπμζδεεί ζε πνμδβμφιεκδ ιεθέηδ ημο ενβαζηδνίμο ιαξ ηαζ ημ ιεηάβναθυ ηδξ έπεζ ιέβεεμξ 370 nt. Δ πζεακή δεοηενμηαβήξ δμιή αοημφ ημο RNA ιμνίμο έπεζ ζπεδζαζηεί απυ δφμ λεπςνζζηέξ ενεοκδηζηέξ μιάδεξ, ααζζγυιεκδ ζε ζοβηνζηζηή θοθμβεκεηζηή ακάθοζδ (Piccinelli et al 2005, Zhu et al 2006). Οζ πνμηαεείζεξ δμιέξ ειθακίγμοκ ανηεηέξ δζαθμνέξ ηαζ ηαιία δεκ επζαεααζχεδηε ιε αζμπδιζηά δεδμιέκα. Γζ αοηυ ημ θυβμ, πναβιαημπμζήζαιε πεζνάιαηα εκγοιζηήξ απμηφπςζδξ, ιε ηδ πνήζδ ηςκ νζαμκμοηθεάζςκ Σ1 ηαζ V1 ηαζ ζπεδζάζαιε ηδ δεοηενμηαβή δμιή ηδξ RNA οπμιμκάδαξ ημο D. discoideum. H πνμηεζκυιεκδ δμιή ημο RNA ηδξ RNase P απυ ημ D. discoideum, θένεζ υθα ηα ζοκηδνδιέκα παναηηδνζζηζηά ηςκ εοηανοςηζηχκ RNA οπμιμκάδςκ ηςκ εκγφιςκ RNase P, υπςξ μζ πενζμπέξ CR I V, P1, P2, P3, P4, P12, ηαεχξ επίζδξ ημ δμιζηυ ζημζπείμ ιε ηζξ ηέζζενεζξ εδθζέξ ep5/7, P8, P9 ηαζ P10/11. Βπίζδξ, παναηδνμφιε ιζα εηηεηαιέκδ έθζηα P3 πμο δζαζνείηαζ ζε δφμ ιζηνυηενεξ P3a ηαζ P3b, μζ μπμίεξ ζοκδέμκηαζ ιε ηδκ εζςηενζηή εδθεζά L3, πμο είκαζ παναηηδνζζηζηή ζηζξ εοηανοςηζηέξ RNA οπμιμκάδεξ ηαζ πμθφ ζδιακηζηή βζα ηζξ αθθδθεπζδνάζεζξ πμθθχκ πνςηεσκζηχκ οπμιμκάδςκ, υπςξ δ Ρμp1. Βπίζδξ, δζαεέηεζ ιζα εηηεηαιέκδ πενζμπή ελεζδίηεοζδξ (S- domain) (Ώπμηεθέζιαηα, Δηθόλα 6. 1-Β). Δ απμηάθορδ ηδξ δεοηενμηαβμφξ δμιήξ ημο P RNA ηδξ RNase Ρ ημο D. discoideum ιπμνεί κα πανάζπεζ πθδνμθμνίεξ ζπεηζηά ιε ημ ηνυπμ δνάζδξ ιζηνχκ ιμνίςκ πμο έπμοκ ακαθενεεί πςξ επζδνμφκ ακαζηαθηζηά ζηδ δναζηζηυηδηα ηδξ εοηανοςηζηήξ RNase P, υπςξ μζ ακαζημθείξ ηδξ πνςηεσκζηήξ ζφκεεζδξ ηαζ ηα νεηζκμεζδή (Tekos et al 2000, Tekos et al 2004, Vourekas et al 2006). Πνέπεζ κα ζδιεζςεεί, υηζ παν υθεξ ηζξ πνμζπάεεζεξ πμο έβζκακ, δεκ ακζπκεφεδηε εκγοιζηή δναζηζηυηδηα RNase P ζημ in vitro ιεηάβναθμ ηδξ RNA οπμιμκάδαξ. Πζεακυκ, αοηυ κα μθείθεηαζ ζε αδοκαιία ημο RNA ιεηαβνάθμο κα θάαεζ ηδ ζςζηή ημο δζαιυνθςζδ ηάης απυ ηζξ ζοκεήηεξ πμο έπμοκ πνδζζιμπμζδεεί. Βπζπθέμκ, δεκ είκαζ αηυια βκςζηυ ηαζ εα πνέπεζ κα εθεβπεεί, εάκ δ RNA οπμιμκάδα ηδξ RNase P οθίζηαηαζ ιεηα-ιεηαβναθζηέξ ηνμπμπμζήζεζξ in vivo, μζ μπμίεξ πζεακυκ κα είκαζ ζδιακηζηέξ ή ηαζ απαναίηδηεξ βζα ηδ δζαηήνδζδ ηδξ ηαηαθοηζηήξ δναζηζηυηδηάξ ηδξ. 190

196 πδήηεζε Η DRpp29 πξνζδέλεηαη ζηελ πεξηνρή εμεηδίθεπζεο S ηεο RNA ππνκνλάδαο Ο επυιεκμξ ζηυπμξ ήηακ κα πνμζδζμνζζηεί δ εέζδ ηδξ RNA οπμιμκάδαξ, ζηδκ μπμία πνμζδέκεηαζ δ DRpp29. Δ ακάθοζδ απμηοπχιαημξ ημο P RNA, πμο δζελήπεδ πανμοζία αολακυιεκδξ πμζυηδηαξ ηδξ ακαζοκδοαζιέκδξ DRpp29, έδεζλε πςξ δ DRpp29 πνμζδέκεηαζ ζηα δμιζηά ζημζπεία P8 ηαζ P10.1, ηα μπμία εκημπίγμκηαζ ζηδκ πενζμπή ελεζδίηεοζδξ S ηδξ RNA οπμιμκάδαξ (Ώπμηεθέζιαηα, Δηθόλα 6. 2). Σμ απμηέθεζια αοηυ ανίζηεηαζ ζε ζοιθςκία ιε πνμδβμφιεκεξ ακαθμνέξ, ζφιθςκα ιε ηζξ μπμίεξ ημ εηενμδζιενέξ Rpp29-Rpp21 ζηαεενμπμζεί ηδκ ακαβκχνζζδ ηςκ δζαθυνςκ οπμζηνςιάηςκ απυ ηδκ ακενχπζκδ RNase P (Mann et al 2003). Πνυζθαηεξ ιεθέηεξ επζαεααίςζακ αοηή ηδ παναηήνδζδ, απμδεζηκφμκηαξ πςξ ημ ζφιπθμημ Rpp29-Rpp21 πνμζδέκεηαζ ηαζ ζηαεενμπμζεί ηδκ πενζμπή ελεζδίηεοζδξ S ηδξ H1 RNA οπμιμκάδαξ (Xu et al 2009, Honda et al 2010, Kosaka et al 2010). Βπζπνυζεεηα, έπεζ δεζπεεί πςξ δ πνυζδεζδ ηςκ ανπαίςκ μιυθμβςκ πνςηεσκχκ PfuRpp29 ηαζ PfuRpp21 ζηδκ RNA οπμιμκάδα δεκ επδνεάγεζ ηδκ ηαηαθοηζηή ζηαεενά, k cat, ηδξ ακηίδναζδξ ηδξ RNA οπμιμκάδαξ απυ ημ P. furiosus, αθθά πνμηαθεί ιείςζδ ηδξ ζηαεενάξ ζοββεκείαξ K m, αεθηζχκμκηαξ ηδ ζοββέκεζα ημο εκγφιμο βζα ημ οπυζηνςια πενίπμο πέκηε θμνέξ. Σαοηυπνμκα, ημ ζφιπθμημ PfuRpp29-PfuRpp21 ιεζχκεζ ηζξ απαζηήζεζξ ημο εκγφιμο ζε ζυκηα Mg 2+ (Tsai et al 2006). Σέθμξ, πεζνάιαηα ακαζφζηαζδξ ηδξ RNase P απυ ημ ανπαίμ M. jannaschii, πνμζδεδειέκδξ ιε ημ οπυζηνςια pre-trna, δείπκμοκ πςξ ημ ζφιπθμημ Rpp29-Rpp21 αεθηζχκεζ ηδ ζοββέκεζα ημο εκγφιμο βζα ημ οπυζηνςια, ιέζς πνυζδεζήξ ημο ζηδ πενζμπή ελεζδίηεοζδξ S (Pulukkunat and Gopalan 2008) Η DRpp29 θαη ην M1 RNA ζρεκαηίδνπλ ελεξγό ζύκπινθν κε δξαζηηθόηεηα RNase P Πανά ημ βεβμκυξ υηζ δ ακενχπζκδ μιυθμβδ πνςηεύκδ Rpp29 ζπδιαηίγεζ εκενβυ ζφιπθμημ ιε ηδ ααηηδνζαηή RNA οπμιμκάδα (Μ1 RNA) (Sharin et al 2005), ηα ιέπνζ ζήιενα δεδμιέκα ακαθένμοκ πςξ ιεηαλφ ηςκ μιυθμβςκ Rpp29 πνςηεσκχκ ηαζ ηδξ ααηηδνζαηήξ πνςηεύκδξ ηδξ RNase P ημο E. coli (πνςηεύκδ C5) δεκ οπάνπεζ ηαιία μιμζυηδηα, μφηε ζηδκ αθθδθμοπία, μφηε ζηδ δμιή ημοξ. Λαιαάκμκηαξ οπ υρζκ αοηή ηδ πθδνμθμνία, πναβιαημπμζήζαιε πεζνάιαηα ακαζφζηαζδξ ηδξ DRpp29 ιε ημ Μ1 RNA ηαζ απμδείπεδηε πςξ δ DRpp29 ιπμνεί κα ακηζηαηαζηήζεζ ιενζηχξ ηδ πνςηεύκδ C5, αθμφ ιπμνεί ηαζ εκενβμπμζεί ημ Μ1 RNA πανμοζία παιδθήξ ζμκηζηήξ ζζπφμξ (10 mm Mg 2+ ) 191

197 πδήηεζε (Ώπμηεθέζιαηα, Δηθόλα ). Συζμ δ DRpp29, υζμ ηαζ δ C5 αεθηζχκμοκ ηαηά 2-θμνέξ ηδκ ζηακυηδηα ημο Μ1 RNA κα δεζιεφεζ ημ οπυζηνςιά ημο (μζ K m βζα ηα ζφιπθμηα DRpp29-M1 RNA, C5-M1 RNA ηαζ M1 RNA ανέεδηακ ίζεξ ιε 211, 202 ηαζ 402 nm, ακηίζημζπα). Πανυθα αοηά, ημ ζφιπθμημ DRpp29-M1 RNA ηαηαθφεζ ηδκ ςνίιακζδ ημο οπμζηνχιαημξ psups1 ιε πμθφ πζμ ανβυ νοειυ, ζφιθςκα ιε ηδκ ηαηαθοηζηή ζηαεενά πμο οπμθμβίζηδηε κα είκαζ min -1, ζοβηνζηζηά ιε αοηή ημο μιυθμβμ μθμέκγοιμ C5-M1 RNA (k cat min -1 ) (Ώπμηεθέζιαηα, Δηθόλα ). Βπζπθέμκ, δζελήπεδζακ πεζνάιαηα ακαζφζηαζδξ ακάιεζα ζηα ιεηαθθαβιέκα πμθοπεπηίδζα πμο ηαηαζηεοάζαιε ηαζ ζημ M1 RNA. Ο νυθμξ ηδξ DRpp29 κα πνμάβεζ αοηή ηδκ ηαηαθοηζηή δναζηζηυηδηα θαίκεηαζ κα μθείθεηαζ ζε δμιζηά ζημζπεία πμο ανίζημκηαζ ζηδκ αιζκμ-ηεθζηή ηδξ πενζμπή, αθμφ ιεηαλφ ηςκ ηνζχκ ακαζοκδοαζιέκςκ ιεηαθθαβιάηςκ, ιυκμ ημ Α75, ημ μπμίμ πενζέπεζ ημ ιμηίαμ ηδξ πενζμπήξ DRpp , ιπμνεί κα ζπδιαηίγεζ εκενβυ ζφιπθμημ ιε ημ M1 RNA (Ώπμηεθέζιαηα, Δηθόλα ). Δ ηζκδηζηή ακάθοζδ ημο ακαζοζηαιέκμο ζοιπθυημο Α75-Μ1 RNA δείπκεζ υηζ ημ Α75 δεκ αεθηζχκεζ ηδκ ζηακυηδηα δέζιεοζδξ ημο οπμζηνχιαημξ απυ ημ Μ1 RNA (Km βζα ημ ζφιπθμημ Α75-Μ1 RNA ηαζ M1 RNA ιυκμ ημο ανέεδηακ ίζεξ ιε 456 ηαζ 402 nm, ακηίζημζπα), εκημφημζξ θαίκεηαζ πςξ πανμοζία ημο πμθοπεπηζδίμο Α75 ιεηααάθθεηαζ δ δζαιυνθςζδ ημο Μ1 RNA, ιε ηέημζμ ηνυπμ, χζηε κα ιεζχκεηαζ δ απαίηδζή ημο ζε Mg 2+. Ο Nayef Jarrous ιαγί ιε ημοξ ζοκενβάηεξ ημο ακαθένεζ πςξ δ ηαναμλο-ηεθζηή πενζμπή ηδξ ακενχπζκδξ Rpp29 είκαζ οπεφεοκδ βζα ηδκ εκενβμπμίδζδ ημο M1 RNA (Sharin et al 2005). Δ εκενβμπμίδζδ ημο Μ1 RNA έπεζ ηονίςξ απμδμεεί ζηα ζοκηδνδιέκα ηαηάθμζπα αιζκμλέςκ Lys162 ηαζ His163, πμο απμηεθμφκ ημ ιμηίαμ ΚΔ ( KH motif ). Ώοηυ ημ ιμηίαμ απμοζζάγεζ απυ ηδκ DRpp29 ηαζ ζηδ εέζδ ημο αιζκμλέμξ Lys162 ημο ΚΔ ιμηίαμο ανίζηεηαζ έκα ανκδηζηά θμνηζζιέκμ αιζκμλφ Glu194. Σμ βεβμκυξ αοηυ ιπμνεί κα δζηαζμθμβήζεζ, βζαηί ημ πμθοπεπηίδζμ Α155 δεκ εκενβμπμζεί ημ M1 RNA. ε ιζα πνυζθαηδ ένεοκα ακαθένεηαζ, πςξ δ πνςηεύκδ PhoRpp29 απυ ημ ανπαίμ P. horikoshii, πανυθμ πμο πανμοζζάγεζ μιμθμβία ιε ηα 2/3 ημο ηαναμλο-ηεθζημφ άηνμο ηδξ ακενχπζκδξ Rpp29, δεκ εκενβμπμζεί ημ Μ1 RNA (Honda et al 2010). Σμ απμηέθεζια αοηυ μδήβδζε ζηδκ άπμρδ, πςξ δ PhoRpp29 ιπμνεί κα ιδκ έπεζ ζζμδφκαιδ θεζημονβία ιε ηδκ Rpp29. Δ απμοζία ημο ζοκηδνδιέκμο, ζηζξ DRpp29 ηαζ Rpp29, ιμηίαμο R-x(9)-K-x-K-x-L-x-x-[RK]-x-[RK] απυ ηζξ μιυθμβεξ πνςηεύκεξ ζηα ανπαία, ιπμνεί κα ελδβεί αοηή ηδκ αζοιθςκία ηςκ απμηεθεζιάηςκ. 192

198 πδήηεζε Κισλνπνίεζε ηνπ γνληδίνπ drpp21 θαη ραξαθηεξηζκόο ηνπ πξντόληνο πνπ θσδηθνπνηεί Δ Rpp21 ζηα ανπαία ηαζ ζηα εοηανοςηζηά ζπδιαηίγεζ δζιενέξ ιε ηδκ ακηίζημζπδ Rpp29 ηαζ ζηδκ πενίπηςζδ ημο ακενχπμο, ιαγί ιε ηδκ RNA οπμιμκάδα απμηεθμφκ ημκ εθάπζζημ θεζημονβζηυ πονήκα ηδξ RNase P. ε ιζα πνμζπάεεζα κα ιεθεηήζμοιε εάκ ηαζ ζηδ πενίπηςζδ ημο D. discoideum ζπδιαηίγεηαζ απυ αοηέξ ηζξ ηνείξ οπμιμκάδεξ ηαηαθοηζηά εκενβυ ζφιπθμημ, ηθςκμπμζήζαιε ημ βμκίδζμ drpp21. Δ δζαδζηαζία ηδξ ηθςκμπμίδζδξ ήηακ υιμζα ιε αοηή πμο αημθμοεήζαιε βζα ημ βμκίδζμ drpp29 (Μέεμδμζ, 3.1.1). Σμ drpp21 έπεζ ιέβεεμξ 675 nt ηαζ ηςδζημπμζεί ιζα πνςηεύκδ πμο απμηεθείηαζ απυ 232 αιζκμλέα, ιε pi 9.94 ηαζ ιμνζαηυ αάνμξ kda. Δ DRpp21, ζοβηνζηζηά ιε ηζξ μιυθμβέξ ηδξ πνςηεύκεξ, δζαεέηεζ ιζα ιμκαδζηή αθθδθμοπία, δ μπμία πενζθαιαάκεζ ηα 91 πνχηα αιζκμλέα ημο αιζκμ-ηεθζημφ άηνμο ηδξ πνςηεύκδξ, ιε ααζζηυ παναηηδνζζηζηυ ηδκ ηαηά ~ 70% ζφζηαζή ηδξ απυ ηαηάθμζπα αζπαναβίκδξ (Ώπμηεθέζιαηα, Δηθόλα ). Λυβς ηδξ παιδθήξ πμθοπθμηυηδηαξ αοηήξ ηδξ πενζμπήξ, ηθςκμπμζήεδηακ ηα 404 nt ημο βμκζδίμο (δ404), ηα μπμία ακηζζημζπμφκ ζημ ηαναυλο-ηεθζηυ ηιήια πςνίξ ηα 273 πνχηα κμοηθεμηίδζα. Σμ πμθοπεπηίδζμ Α404 αέααζα πενζθαιαάκεζ ηα ηνία ααζζηά ηαηάθμζπα, R105, L109, Y130, ηα μπμία αάζεζ ηδξ ηνοζηαθθζηήξ δμιήξ ηδξ μιυθμβδξ πνςηεύκδξ απυ ημ P. furiosus (Amero et al 2008), είκαζ απαναίηδηα βζα ηδ δέζιεοζδ ζυκηςκ Zn 2+ ηαζ ηδ ζςζηή δζαιυνθςζδ ημο ιμνίμο. Δ ηθςκμπμζδιέκδ αθθδθμοπία εηθνάζηδηε ηαζ ημ ακαζοκδοαζιέκμ Α404 πμθοπεπηίδζμ ηαεανίζηδηε ηαζ πνδζζιμπμζήεδηε ζε πεζνάιαηα ακαζφζηαζδξ RNase P δναζηζηυηδηαξ Η DRpp29 καδί κε ηo Γ404 θαη ηελ RNA ππνκνλάδα ζρεκαηίδνπλ ελεξγό ζύκπινθν κε δξαζηηθόηεηα RNase P Δ DRpp29 ιεθεηήεδηε βζα ηδκ ζηακυηδηά ηδξ κα ζπδιαηίγεζ έκα εθάπζζημ ηαηαθοηζηυ πονήκα ιε ημ RNA ηδξ RNase P ημο D. Discoideum ηαζ κα ςνζιάγεζ ηα 5 άηνα ηςκ πνυδνμιςκ ιμνίςκ trna. Αμηζιάζηδηακ δζαθμνεηζηέξ ακαθμβίεξ πνςηεύκδξ ηαζ RNA, ζε δζαθμνεηζηέξ ζοκεήηεξ εενιμηναζίαξ, πνυκμο επχαζδξ, ζμκηζηήξ ζζπφμξ, ηαεχξ επίζδξ πνδζζιμπμζήεδηακ δζάθμνα μιυθμβα (ptrna Ser ηαζ ptrna Leu απυ ημ D. discoideum) ηαζ εηενυθμβα (psups1 απυ ημ S. pombe ηαζ ημ ααηηδνζαηυ ptrna Tyr απυ ημ E. coli) οπμζηνχιαηα, πςνίξ κα θάαμοιε ηάπμζμ αλζυπζζημ ηαζ επακαθαιαακυιεκμ απμηέθεζια. Ώπυ ηα παναπάκς πεζνάιαηα θάκδηε πςξ δ DRpp29 ιυκδ ηδξ δεκ έπεζ ηδκ δοκαηυηδηα, 193

199 πδήηεζε ζηζξ ζοκεήηεξ πμο δμηζιάζηδηακ, κα πνμηαθεί ηδ ζςζηή ηαζ θεζημονβζηή δζαιυνθςζδ ηδξ RNA οπμιμκάδαξ. ηδκ ζοκέπεζα αημθμφεδζακ πεζνάιαηα ακαζφζηαζδξ ηδξ RNA οπμιμκάδαξ ηδξ RNase P ημο D. discoideum ιαγί ιε ημ πνςηεσκζηυ γεφβμξ DRpp29 ηαζ Α404. Έηζζ, υηακ πνμεπςάζηδηακ ηα ακαζοκδοαζιέκα πμθοπεπηίδζα DRpp29 ηαζ Α404 ιαγί ιε ημ ιεηάβναθμ ηδξ RNA οπμιμκάδαξ, ζε ακαθμβία 2:2:1 βζα 16 hrs ζημοξ 4 o C ηαζ βζα επζπθέμκ 1 h ζημοξ 37 μ C ιεηά απυ ηδ πνμζεήηδ ημο οπμζηνχιαημξ psups1, παναηδνήζαιε πςξ ημ P RNA ακαηηά, έζης ηαζ ζε ιζηνυ ααειυ, ηδκ εκγοιζηή ημο δναζηζηυηδηα (Ώπμηεθέζιαηα, Δηθόλα 7. 3, δζαδνμιή 4). Πανυιμζμ απμηέθεζια θάααιε υηακ δ πνμεπχαζδ ηςκ ηνζχκ ιμνίςκ δζελήπεδ ζημοξ 23 μ C (Ώπμηεθέζιαηα, Δηθόλα 7. 3, δζαδνμιή 5). ε ζοιθςκία ιε ηδ αζαθζμβναθία, υπμο ακαθένεηαζ πςξ ζηα ανπαία ηαζ ζημκ άκενςπμ ημ ζφιπθμημ Rpp29- Rpp21 πνμζδίδεζ ηαηαθοηζηή εκενβυηδηα ζηδκ RNA οπμιμκάδα ιε ζφβπνμκδ ιείςζδ ηςκ ζμκηζηχκ απαζηήζεςκ ηδξ (Pulukkunat ηαζ Gopalan 2008, Tsai et al 2006), ημ ηνζιενέξ ζφιπθμημ DRpp29-Α404-P RNA ηαηαθφεζ ηδκ ακηίδναζδ ςνίιακζδξ ημο οπμζηνχιαημξ psups1 ζε παιδθή ζοβηέκηνςζδ Mg 2+ (5 mm), ίζδ ιε ηζξ αέθηζζηεξ ζμκηζηέξ ζοκεήηεξ ημο απμιμκςιέκμο μθμεκγφιμο ηδξ RNase P απυ ημ D. discoideum (Ώπμηεθέζιαηα, Δηθόλα 7. 3). Σα απμηεθέζιαηα ηδξ πανμφζαξ δζαηνζαήξ δίκμοκ πθδνμθμνίεξ βζα ηζξ ζδζυηδηεξ ηδξ πνςηεύκδξ DRpp29, δ μπμία δείπεδηε υηζ απμηεθεί ιζα απυ ηζξ οπμιμκάδεξ ημο νζαμκμοηθεμπνςηεσκζημφ ζοιπθυημο ηδξ RNase P ημο D. discoideum. Δ DRpp29 ηαηέπεζ ηεκηνζηυ νυθμ ζηδ δμιή ημο μθμεκγφιμο, αθμφ, υπςξ, πνμηφπηεζ ηαζ απυ ηα απμηεθέζιαηά ιαξ ένπεηαζ ζε άιεζδ επαθή ιε ηδκ RNA οπμιμκάδα ηαζ εκημπίγμκηαζ πζεακέξ πενζμπέξ πμο αθθδθεπζδνμφκ ιε άθθεξ πνςηεύκεξ. Βλεθζηηζηά δ DRpp29, υπςξ ηαζ μζ μιυθμβέξ ηδξ απυ ανπαία ηαζ εοηανοχηεξ, εκδέπεηαζ κα είκαζ απυ ηζξ πνχηεξ πμο ζηναημθμβήεδηε βζα κα πθαζζζχζεζ ημ νζαμκμοηθεμπνςηεσκζηυ ζφιπθμημ ηδξ RNase P. Σμ ζοιπέναζια αοηυ πνμηφπηεζ ηαζ απυ ημ δεδμιέκμ, υηζ δ DRpp29 είκαζ δ ιμκαδζηή απυ ηζξ πνςηεσκζηέξ οπμιμκάδεξ, ηδξ μπμίαξ μιυθμβεξ έπμοκ εκημπζζηεί ζε υθεξ ηζξ RNase P ηςκ ανπαίςκ ηαζ ηςκ εοηανοςηχκ, πμο έπμοκ ιεθεηδεεί ιέπνζ ζήιενα, πνζκ δδθαδή δζαπςνζζημφκ ηα ααζίθεζα ηςκ εοηανοςηχκ απυ ηα ανπαία. Σμ ηφνζμ παναηηδνζζηζηυ πμο ηάκεζ ηδκ DRpp29 κα λεπςνίγεζ απυ ηζξ οπυθμζπεξ εοηανοςηζηέξ μιυθμβέξ ηδξ είκαζ δ επζπθέμκ αιζκμλζηή αθθδθμοπία πμο δζαεέηεζ ζημ αιζκμ-ηεθζηυ άηνμ ηδξ, δ μπμία πζεακυκ κα ηδξ πνμζδίδεζ, αθεκυξ επζπθέμκ ζηακυηδηεξ πνυζδεζδξ ιε άθθα πνςηεσκζηά ή/ηαζ 194

200 πδήηεζε νζαμκμοηθεσκζηά ιυνζα ηαζ αθεηένμο θεζημονβζηέξ ζδζυηδηεξ, υπςξ βζα πανάδεζβια ιεηαβναθζηή νφειζζδ, ημπμεέηδζδ ζηα ακάθμβα ηοηηανζηά δζαιενίζιαηα, η.η.θ.. Οζ επζπνυζεεηεξ πενζμπέξ ηςκ πνςηεσκζηχκ οπμιμκάδςκ ηδξ RNase P ημο D. discoideum είκαζ παναηηδνζζηζηυ ημο μνβακζζιμφ αοημφ, δεκ είκαζ, υιςξ, βκςζηυ βζα πμζμκ θυβμ ημ D. discoideum δζαηήνδζε αοηέξ ηζξ επζπθέμκ αθθδθμοπίεξ. Οζ πενζμπέξ αοηέξ ιπμνεί κα πνμέηορακ απυ ζφιπηολδ βμκζδίςκ, μζ μπμίεξ ελεθζηηζηά κα απαθεζθεήηακ. Σμ θοθμβεκεηζηυ δέκηνμ ηδξ DRpp29, ιε ηζξ μιυθμβέξ ηδξ απυ ημοξ μνβακζζιμφξ H. sapiens, M. musculus, S. cerevisiae, S. pombe, P. furiosus ηαζ M. jannaschii, ελδβεί αοηή ηδκ οπυεεζδ, αθμφ, υπςξ θαίκεηαζ ζηδκ Δηθόλα 2. 1, δ DRpp29 ημπμεεηείηαζ πζμ απμιαηνοζιέκα απυ ηζξ οπυθμζπεξ εοηανοςηζηέξ ηαζ πζμ ημκηά ζε αοηέξ ηςκ ανπαίςκ πνςηεύκεξ. Εικόνα 2. 1: Φοθμβεκεηζηυ δέκηνμ ηδξ DRpp29 ηαζ ηςκ μιμθυβςκ ηδξ απυ ημοξ μνβακζζιμφξ H. sapiens, M. musculus, S. cerevisiae, S. pombe, P. furiosus ηαζ M. jannaschii, υπςξ πνμηφπηεζ απυ ημ πνυβναιια ClustalW (1.83, Blosum scoring matrix, Thompson et al 1994). Δ ζοκμθζηή βκχζδ ιαξ ζπεηζηά ιε ηδκ RNase P ημο D. discoideum ακαπανζζηάηαζ ζηδκ παναηάης εζηυκα. Δ DRpp29 δεζιεφεηαζ ζηδκ πενζμπή ελεζδίηεοζδξ S ημο RNA, εκχ απυ επζπθέμκ πεζνάιαηα βκςνίγμοιε, πςξ αθεκυξ δ DRpp21 ηαζ δ DRpp30 αθθδθεπζδνμφκ ιε ηδκ RNA οπμιμκάδα εζδζηά, αθεηένμο μζ DRpp20 ηαζ DRpp40 δεκ ειθακίγμοκ ζηακυηδηεξ πνυζδεζδξ ιαγί ηδξ. Βζδζηά ηαζ ζζπονά ιε ημ οπυζηνςια δεζιεφεηαζ, απυ ηζξ ιέπνζ ηχνα ιεθέηεξ, ιυκμ δ DRpp30. Αεδμιέκμο ηςκ απμηεθεζιάηςκ ιαξ ηαζ ηδξ βεκζηυηενδξ πθδνμθμνίαξ, μζ DRpp20 ηαζ DRpp40 εα πνέπεζ κα ζοιιεηέπμοκ ζε πνςηεσκζηέξ αθθδθεπζδνάζεζξ, εκχ μζ DRpp21 ηαζ DPop5 κα αθθδθεπζδνμφκ, ακηίζημζπα, ιε ηζξ DRpp29 ηαζ DRpp30, υπςξ θαίκεηαζ ζηδκ Δηθόλα

201 πδήηεζε Εικόνα 2. 2: πδιαηζηή ακαπανάζηαζδ ηδξ ανπζηεηημκζηήξ ηδξ RNase P ημο D. discoideum, αάζεζ ηςκ ιέπνζ ζήιενα δεδμιέκςκ. Με ιπθέ πνχια ακαπανζζηχκηαζ μζ εεηζηά θμνηζζιέκεξ πνςηεσκζηέξ οπμιμκάδεξ ηαζ ιε ηυηηζκμ μζ ανκδηζηά. Πανυθα αοηά, πεναζηένς ιεθέηεξ εα πνέπεζ κα δζελαπεμφκ βζα κα μθμηθδνςεεί δ βκχζδ ιαξ, ζπεηζηά ιε ηδκ απμηάθορδ ηαζ ηαηακυδζδ ηδξ ανπζηεηημκζηήξ αοημφ ημο νζαμκμοηθεμπνςηεσκζημφ ζοιπθυημο ηαζ κα δμεμφκ απακηήζεζξ βζα ηδκ ελεθζηηζηή πμνεία αοηήξ ηδξ απαναίηδηδξ νζαμκμοηθεάζδξ, απυ ημκ ημζκυ ανπέβμκμ πνυβμκμ ζημοξ ζδιενζκμφξ μνβακζζιμφξ. Ένεοκεξ, πμο έπμοκ δζελαπεεί, ηυζμ ζημ δζηυ ιαξ, υζμ ηαζ ζε άθθα ενβαζηήνζα, έπμοκ δείλεζ πςξ δ RNase P απμηεθεί ζδιακηζηυ ζηυπμ πμθθχκ ιζηνχκ ιμνίςκ, υπςξ ηςκ ακηζαζμηζηχκ ηαζ ηςκ νεηζκμεζδχκ ηαζ ημ βεβμκυξ αοηυ πνμζδίδεζ επζπθέμκ αλία ζηδ ιεθέηδ αοημφ ημο εκγφιμο. Βπίζδξ, δ πθμφζζα πνςηεσκζηή ζφζηαζδ αοημφ ηαζ ηςκ οπμθμίπςκ εοηανοςηζηχκ μθμεκγφιςκ ζίβμονα επδνεάγεζ, εεηζηά ή ανκδηζηά, ηδ δνάζδ αοηχκ ηςκ ακαζημθέςκ, επμιέκςξ δ ηαηακυδζδ ηδξ δζαιυνθςζδξ ηαζ ηςκ θεζημονβζηχκ ζδζμηήηςκ ηςκ οπμιμκάδςκ, πμο ζοκζζημφκ ηδκ RNase Ρ απυ ημκ οπυ ιεθέηδ μνβακζζιυ, εκδεπμιέκςξ κα απμηεθέζεζ ηίκδηνμ ή/ηαζ κα δχζεζ ζδέεξ βζα ημκ ζπεδζαζιυ κέςκ θανιάηςκ. 196