ΓΗΓΑΚΣΟΡΗΚΖ ΓΗΑΣΡΗΒΖ «ΜΔΛΔΣΖ ΣΟΤ ΡΟΛΟΤ ΣΖ GEMININ ΣΖ ΓΖΜΗΟΤΡΓΗΑ ΚΑΗ ΓΗΑΦΟΡΟΠΟΗΖΖ ΣΧΝ ΠΟΛΤΓΤΝΑΜΧΝ ΚΤΣΣΑΡΧΝ ΣΟΤ ΔΓΚΔΦΑΛΗΚΟΤ ΦΛΟΗΟΤ»

Transcript

1 ΠΑΝΔΠΗΣΖΜΗΟ ΠΑΣΡΧΝ ΥΟΛΖ ΔΠΗΣΖΜΧΝ ΤΓΔΗΑ ΣΜΖΜΑ ΗΑΣΡΗΚΖ ΠΡΟΓΡΑΜΜΑ ΜΔΣΑΠΣΤΥΗΑΚΧΝ ΠΟΤΓΧΝ «ΔΦΑΡΜΟΓΔ ΣΗ ΒΑΗΚΔ ΗΑΣΡΗΚΔ ΔΠΗΣΖΜΔ» ΓΗΓΑΚΣΟΡΗΚΖ ΓΗΑΣΡΗΒΖ «ΜΔΛΔΣΖ ΣΟΤ ΡΟΛΟΤ ΣΖ GEMININ ΣΖ ΓΖΜΗΟΤΡΓΗΑ ΚΑΗ ΓΗΑΦΟΡΟΠΟΗΖΖ ΣΧΝ ΠΟΛΤΓΤΝΑΜΧΝ ΚΤΣΣΑΡΧΝ ΣΟΤ ΔΓΚΔΦΑΛΗΚΟΤ ΦΛΟΗΟΤ» ΠΔΛΛΑ ΜΑΓΓΑ ΒΗΟΛΟΓΟ ΠΑΣΡΑ 2010

2 ΠΑΝΔΠΗΣΖΜΗΟ ΠΑΣΡΧΝ ΥΟΛΖ ΔΠΗΣΖΜΧΝ ΤΓΔΗΑ ΣΜΖΜΑ ΗΑΣΡΗΚΖ ΠΡΟΓΡΑΜΜΑ ΜΔΣΑΠΣΤΥΗΑΚΧΝ ΠΟΤΓΧΝ «ΔΦΑΡΜΟΓΔ ΣΗ ΒΑΗΚΔ ΗΑΣΡΗΚΔ ΔΠΗΣΖΜΔ» ΓΗΓΑΚΣΟΡΗΚΖ ΓΗΑΣΡΗΒΖ «ΜΔΛΔΣΖ ΣΟΤ ΡΟΛΟΤ ΣΖ GEMININ ΣΖ ΓΖΜΗΟΤΡΓΗΑ ΚΑΗ ΓΗΑΦΟΡΟΠΟΗΖΖ ΣΧΝ ΠΟΛΤΓΤΝΑΜΧΝ ΚΤΣΣΑΡΧΝ ΣΟΤ ΔΓΚΔΦΑΛΗΚΟΤ ΦΛΟΗΟΤ» ΠΔΛΛΑ ΜΑΓΓΑ ΒΗΟΛΟΓΟ Δπηβιέπσλ Καζεγεηήο: ηαύξνο Σαξαβήξαο Δπίθνπξνο Καζεγεηήο Σκήκα Ηαηξηθήο Παλεπηζηήκην Παηξώλ ΠΑΣΡΑ

3 Σξηκειήο ζπκβνπιεπηηθή επηηξνπή Σανααήναξ ηαφνμξ Βανάηδξ Ηςάκκδξ Αββεθάημο Φεανςκία Δπίημονμξ Καεδβδηήξ Σιήια Ηαηνζηήξ Πακεπζζηήιζμ Παηνχκ Οιυηζιμξ Καεδβδηήξ Σιήια Ηαηνζηήξ Πακεπζζηήιζμ Παηνχκ Ακαπθδνχηνζα Καεδβήηνζα Σιήια Ηαηνζηήξ Πακεπζζηήιζμ Παηνχκ Δπηακειήο εμεηαζηηθή επηηξνπή Σανααήναξ ηαφνμξ Βανάηδξ Ηςάκκδξ Αββεθάημο Φεανςκία Μμζπμκάξ Νζηυθαμξ ηοθζακμπμφθμο Φςηεζκή Υνυκδ Δθζζάαεη Δοεοιζυπμοθμξ πφνμξ Δπίημονμξ Καεδβδηήξ Σιήια Ηαηνζηήξ Πακεπζζηήιζμ Παηνχκ Οιυηζιμξ Καεδβδηήξ Σιήια Ηαηνζηήξ Πακεπζζηήιζμ Παηνχκ Ακαπθδνχηνζα Καεδβήηνζα Σιήια Ηαηνζηήξ Πακεπζζηήιζμ Παηνχκ Καεδβδηήξ Σιήια Ηαηνζηήξ Πακεπζζηήιζμ Παηνχκ Καεδβήηνζα Σιήια Νμζδθεοηζηήξ Πακεπζζηήιζμ Αεδκχκ Καεδβήηνζα Σιήια Ηαηνζηήξ Πακεπζζηήιζμ Παηνχκ Ακαπθδνςηήξ Καεδβδηήξ Σιήια Βζμθμβίαξ Πακεπζζηήιζμ Αεδκχκ 3

4 ΠΔΡΗΔΥΟΜΔΝΑ ΠΡΟΛΟΓΟ... 8 ΠΔΡΗΛΖΦΖ ΔΗΑΓΧΓΖ Κεθάιαην 1. Μδπακζζιμί αοημ-ακακέςζδξ ηαζ δζαθμνμπμίδζδξ ζημκ εβηεθαθζηυ θθμζυ Σα κεονζηά αθαζηζηά ηφηηανα (neural stem cells) απμηεθμφκ ηδ αάζδ βζα ηδκ ακάπηολδ ημο εβηεθάθμο πδιαηζζιυξ ημο εβηεθαθζημφ θθμζμφ Πθδεοζιμί κεονζηχκ πνμβμκζηχκ ηοηηάνςκ ζημκ εβηεθαθζηυ θθμζυ Κμνοθαία πνμβμκζηά κεονζηά ηφηηανα Βαζζηά πνυδνμια κεονζηά ηφηηανα Ο ηνυπμξ δζαίνεζδξ ηςκ πνμβμκζηχκ ηοηηάνςκ νοειίγεζ ημ ιέβεεμξ ημο θθμζμφ Ζ νφειζζδ ηςκ παναιέηνςκ ημο ηοηηανζημφ ηφηθμο ηςκ πνμβμκζηχκ ηοηηάνςκ ημο εβηεθαθζημφ θθμζμφ εθέβπεζ ηζξ απμθάζεζξ αοημ-ακακέςζδξ ηαζ δζαθμνμπμίδζδξ Μμνζαηά ιμκμπάηζα νφειζζδξ ηςκ κεονζηχκ πνμβμκζηχκ ηοηηάνςκ διαημδυηδζδ απυ εηηνζηζηά ιμκμπάηζα διαημδυηδζδ απυ ιεηαβναθζημφξ πανάβμκηεξ Ρφειζζδ ηςκ κεονζηχκ πνμβμκζηχκ ηοηηάνςκ ημο θθμζμφ απυ επζβεκεηζημφξ πανάβμκηεξ Νεονςκζηή δζαθμνμπμίδζδ ηςκ πνμβμκζηχκ ηοηηάνςκ ημο θθμζμφ Μεηακάζηεοζδ ηςκ κεονχκςκ ημο θθμζμφ Κεθάιαην 2. Ζ πνςηεΐκδ Geminin απμηεθεί έκα κέμ ζοκδεηζηυ ηνίημ ηςκ δζαδζηαζζχκ πμθθαπθαζζαζιμφ ηαζ δζαθμνμπμίδζδξ ηςκ πνμβμκζηχκ ηοηηάνςκ Γμιή ηδξ πνςηεΐκδξ Ζ πνςηεΐκδ Geminin δζαζθαθίγεζ ηδκ μιαθή δζελαβςβή ημο ηοηηανζημφ ηφηθμο Ζ πνςηεΐκδ Geminin απμηεθεί έκα ζδιακηζηυ νοειζζηή ηδξ ηοηηανζηήξ δζαθμνμπμίδζδξ Ζ έηθναζδ ηδξ Geminin παναηηδνίγεζ ηδκ αδζαθμνμπμίδηδ ηαηάζηαζδ ηςκ πνμβμκζηχκ κεονζηχκ ηοηηάνςκ Ζ Geminin επάβεζ ημκ ηαεμνζζιυ ηςκ κεονζηχκ πνμβμκζηχκ ηοηηάνςκ ηαζ ηδκ μνζμεέηδζδ ηδξ κεονζηήξ πθάηαξ ηαηά ηα πνχζια ζηάδζα ηδξ ακάπηολδξ Ζ πνςηεΐκδ Geminin απμηεθεί ζδιακηζηυ νοειζζηή ηδξ κεονςκζηήξ δζαθμνμπμίδζδξ Ζ Geminin ειπθέηεηαζ ζηδκ μνζμεέηδζδ ημο πνυζεζμο-μπίζεζμο άλμκα ημο ζχιαημξ ΣΟΥΟ

5 2. ΤΛΗΚΑ & ΜΔΘΟΓΟΗ Πεζναιαηζηά γχα Γμκμηφπδζδ Γμκμηφπδζδ ηςκ Geminin flox/wt γχςκ Γμκμηφπδζδ ηςκ Geminin ko/wt γχςκ Γμκμηφπδζδ ηςκ NestinCre +/- γχςκ Απμιυκςζδ βεκςιζημφ DNA Μέεμδμζ ζζημθμβίαξ Απμιυκςζδ ειανφςκ Πνςηυημθθμ ηαηάρολδξ ηςκ ζζηχκ ζε gelatin Πνςηυημθθμ εκζςιάηςζδξ BrdU in vivo Καθθζένβεζα κεονυζθαζνςκ (neurospheres) Καθθζένβεζα κεονυζθαζνςκ ζε ζοκεήηεξ πμθθαπθαζζαζιμφ Δπαβςβή δζαθμνμπμίδζδξ ηςκ κεονυζθαζνςκ Δπίζηνςζδ ηαθοπηνίδςκ ιε πμθο-l-θοζίκδ Απμιυκςζδ RNA απυ ηζξ κεονυζθαζνεξ RT-PCR Οπήιαηα έηθναζδξ Πθαζιζδζαημί θμνείξ βζα ηα πεζνάιαηα οανζδμπμίδζδξ in situ Φμνείξ έηθναζδξ βζα ηα πεζνάιαηα ηδξ δθεηηνμδζαιυθοκζδξ ex vivo Κθςκμπμίδζδ ηδξ ιμνθήξ ΓBrg1-Geminin ζημκ θμνέα pcaggs Κθςκμπμίδζδ ηδξ ιμνθήξ Ndel-Geminin ζημκ θμνέα pcaggs Ζθεηηνμδζαιυθοκζδ ex vivo Τανζδμπμίδζδ in situ Παναβςβή βναιιζηχκ πθαζιζδζαηχκ θμνέςκ Καεανζζιυξ ημο βναιιζημφ DNA Παναβςβή ακζπκεοηχκ RNA Τανζδμπμίδζδ in situ Ακμζμθεμνζζιυξ Κθαζζζηυ πνςηυημθθμ ακμζμθεμνζζιμφ Πνςηυημθθμ ακμζμθεμνζζιμφ ιε ακάηηδζδ ακηζβυκμο (antigen retrieval) Πνςηυημθθμ ακμζμθεμνζζιμφ βζα ακίπκεοζδ BrdU Ακμζμθεμνζζιυξ ζε κεονυζθαζνεξ Ακμζμθεμνζζιυξ ζε ηφηηανα Ακμζμθεμνζζιυξ βζα ζοκεζηζαηή ιζηνμζημπία Καηάθμβμξ ακηζζςιάηςκ πμο πνδζζιμπμζήεδηακ Ακάθοζδ δεδμιέκςκ ΑΠΟΣΔΛΔΜΑΣΑ Μεθέηδ ηδξ έηθναζδξ ηςκ πνςηεσκχκ Geminin ηαζ Cdt1 ζημκ ακαπηοζζυιεκμ εβηεθαθζηυ θθμζυ

6 Οζ πνςηεΐκεξ Geminin ηαζ Cdt1 εηθνάγμκηαζ ζηα πνμβμκζηά κεονζηά ηφηηανα ημο θθμζμφ Σα επίπεδα έηθναζδξ ηςκ πνςηεσκχκ Geminin ηαζ Cdt1 ιεζχκμκηαζ ηαεχξ ηα πνμβμκζηά ηφηηανα απμηημφκ πνμηαεμνζζιέκδ ακαπηολζαηή ιμίνα Οζ πνςηεΐκεξ Geminin ηαζ Cdt1 εηθνάγμκηαζ ζηα πνμβμκζηά κεονζηά ηφηηανα ημο θθμζμφ ζε ζοβηεηνζιέκεξ θάζεζξ ημο ηοηηανζημφ ηφηθμο Τπενέηθναζδ ηδξ πνςηεΐκδξ Geminin ζηα κεονζηά πνμβμκζηά ηφηηανα ημο ακαπηοζζυιεκμο εβηεθαθζημφ θθμζμφ ημο ιουξ Γδιζμονβία πθαζιζδζαηχκ θμνέςκ πμο επζηνέπμοκ ηδκ οπενέηθναζδ ημο ιμνίμο ηδξ Geminin ζηα πνμβμκζηά ηφηηανα ηδξ ημζθζαηήξ γχκδξ ημο θθμζμφ Ζ οπενέηθναζδ ηδξ Geminin ζημ θθμζυ ιεζχκεζ ημκ ανζειυ ηςκ Sox2+ πνμβμκζηχκ ηοηηάνςκ ηδξ ημζθζαηήξ γχκδξ ηαζ Tbr2+ πνυδνμιςκ ηοηηάνςκ ηδξ οπμημζθζαηήξ γχκδξ Ζ οπενέηθναζδ ηδξ Geminin έπεζ ζακ απμηέθεζια ηδκ αφλδζδ ηςκ ηαεμνζζιέκςκ πνμξ κεονςκζηή δζαθμνμπμίδζδ Mash1+ ηοηηάνςκ Ζ πνςηεΐκδ Geminin ςεεί ηα πνμβμκζηά ηφηηανα ημο θθμζμφ πνμξ έλμδμ απυ ημκ ηοηηανζηυ ηφηθμ ηαζ κεονςκζηή δζαθμνμπμίδζδ Καηά ζοκεήηδ απμζζχπδζδ ημο βμκζδίμο ηδξ Geminin ζημκ εβηεθαθζηυ θθμζυ ημο ιουξ Γδιζμονβία ιοχκ ζημοξ μπμίμοξ έπεζ αδνακμπμζδεεί ημ βμκίδζμ ηδξ Geminin ζημ ηεκηνζηυ κεονζηυ ζφζηδια Ζ απαθμζθή ηδξ Geminin ζημ θθμζυ επδνεάγεζ ηδ δζαδμπή ηςκ πνμβμκζηχκ κεονζηχκ ηοηηάνςκ εκχ αολάκεζ ημ νοειυ ηδξ ηοηηανζηήξ ημοξ δζαίνεζδξ Ζ πνςηεΐκδ Geminin εθέβπεζ ηδκ παναβςβή ηςκ πνμβμκζηχκ ηοηηάνςκ ηδξ ημζθζαηήξ γχκδξ Ζ πνςηεΐκδ Geminin νοειίγεζ ημ ιμνζαηυ παναηηήνα ηςκ πνυδνμιςκ ηοηηάνςκ ηδξ οπμημζθζαηήξ γχκδξ Ζ απμοζία έηθναζδξ ηδξ Geminin μδδβεί ζημ ζπδιαηζζιυ αολδιέκςκ ανζειχκ ηαεμνζζιέκςκ πνυδνμιςκ κεονζηχκ ηοηηάνςκ ηαζ πθήνςξ δζαθμνμπμζδιέκςκ κεονχκςκ Ζ δζαδζηαζία ηδξ βθμζμβέκεζδξ δε ιεηααάθθεηαζ απμοζία ηδξ Geminin Kαθθζένβεζα in vitro πνμβμκζηχκ ηοηηάνςκ απυ ημ θθμζυ ηςκ WT ηαζ Fl/koNestinCre ειανφςκ Πανυιμζμξ ζπδιαηζζιυξ πνςημβεκχκ κεονυζθαζνςκ ιεηαλφ WT ηαζ Fl/koNestinCre ειανφςκ Γζενεφκδζδ ηδξ ζηακυηδηαξ αοημ-ακακέςζδξ in vitro ηςκ πνμβμκζηχκ θθμζσηχκ ηοηηάνςκ ζε ζοκεήηεξ απμοζίαξ έηθναζδξ ηδξ πνςηεΐκδξ Geminin

7 Έθεβπμξ ηδξ ζηακυηδηαξ δζαθμνμπμίδζδξ in vitro ηςκ πνμβμκζηχκ ηοηηάνςκ πμο δεκ εηθνάγμοκ Geminin ΤΕΖΣΖΖ Ζ έηθναζδ ηςκ πνςηεσκχκ Geminin ηαζ Cdt1 παναηηδνίγεζ ηα πνμβμκζηά ηφηηανα ημο θθμζμφ ηαζ ειθακίγεζ πενζμδζηυηδηα πμο ελανηάηαζ απυ ηδ θάζδ ημο ηοηηανζημφ ηφηθμο Ζ επαβςβή ηςκ πνμβμκζηχκ ηοηηάνςκ πνμξ κεονςκζηή δζαθμνμπμίδζδ έπεζ ςξ απμηέθεζια ηδ ιείςζδ ηςκ επζπέδςκ έηθναζδξ ηςκ πνςηεσκχκ Geminin ηαζ Cdt H Geminin νοειίγεζ ηδκ ηζκδηζηή ημο ηοηηανζημφ ηφηθμο ηαζ ηδ ιεηάααζδ απυ ηα κεονμεπζεδθζαηά ηφηηανα ζηα ηφηηανα ηδξ αηηζκςηήξ βθμίαξ Ζ πνςηεΐκδ Geminin εθέβπεζ ημκ ηαεμνζζιυ ηςκ ααζζηχκ πνυδνμιςκ ηοηηάνςκ Οζ δνάζεζξ ηδξ πνςηεΐκδξ Geminin θαιαάκμοκ πχνα επζθεηηζηά ζε ζοβηεηνζιέκεξ πενζμπέξ ημο θθμζμφ ΒΗΒΛΗΟΓΡΑΦΗΑ ΓΖΜΟΗΔΤΔΗ

8 ΠΡΟΛΟΓΟ Ζ μθμηθήνςζδ ιζαξ δζδαηημνζηήξ δζαηνζαήξ απμηεθεί ιζα ζοθθμβζηή πνμζπάεεζα. Ζ πανμφζα δζδαηημνζηή δζαηνζαή εηπμκήεδηε ζημ ηιήια Ηαηνζηήξ ημο Πακεπζζηδιίμο Παηνχκ, ζηα πθαίζζα ημο ιεηαπηοπζαημφ πνμβνάιιαημξ ζπμοδχκ «Δθανιμβέξ ζηζξ Βαζζηέξ Ηαηνζηέξ Δπζζηήιεξ». Θα ήεεθα κα εοπανζζηήζς εενιά ημκ επζαθέπμκηα ηαεδβδηή ιμο η. ηαφνμ Σανααήνα, επίημονμ ηαεδβδηή ημο ηιήιαημξ Ηαηνζηήξ ημο Πακεπζζηδιίμο Παηνχκ βζα ηδκ άνζζηδ ζοκενβαζία ιαξ υθα αοηά ηα πνυκζα. Ζ ζοκεπήξ ενεοκδηζηή ημο ηαεμδήβδζδ, δ αιένζζηδ δεζηή ηαζ οθζηή ζοιπανάζηαζή ημο, δ επζζηδιμκζηή ημο ζηέρδ, οπήνλακ ηαεμνζζηζημί πανάβμκηεξ βζα ηδκ μθμηθήνςζδ αοηήξ ηδξ δζαηνζαήξ. Θα ήεεθα κα εοπανζζηήζς επίζδξ ηα ιέθδ ηδξ ηνζιεθμφξ ζοιαμοθεοηζηήξ επζηνμπήξ η. Ηςάκκδ Βανάηδ ηαζ η. Φεανςκία Αββεθάημο, βζα ηζξ ενεοκδηζηέξ ζογδηήζεζξ ηαζ ηδ ζοιαμθή ημοξ ζηδκ εηπυκδζδ ηδξ πανμφζαξ δζδαηημνζηήξ δζαηνζαήξ. Θα ήεεθα επίζδξ κα εοπανζζηήζς ηα οπυθμζπα ιέθδ ηδξ επηαιεθμφξ ελεηαζηζηήξ επζηνμπήξ, η. Νζηυθαμ Μμζπμκά, η. Φςηεζκή ηοθζακμπμφθμο, η. Δθζζάαεη Υνυκδ ηαζ η. πφνμ Δοεοιζυπμοθμ, πμο δέπηδηακ κα ζοιιεηάζπμοκ ζηδκ μθμηθήνςζδ αοηήξ ηδξ δζαηνζαήξ. Πμθφηζιδ οπήνλε επίζδξ δ ζοιαμθή ηδξ η. Εςήξ Λοβενμφ, ακαπθδνχηνζαξ ηαεδβήηνζαξ ημο ενβαζηδνίμο Γεκζηήξ Βζμθμβίαξ ηδξ Ηαηνζηήξ ζπμθήξ ημο Πακεπζζηδιίμο Παηνχκ, δ μπμία ιε ηαίνζεξ παναηδνήζεζξ ηαζ εφζημπεξ οπμδείλεζξ αμήεδζε ζε πμθθά εέιαηα ηδξ πανμφζαξ δζαηνζαήξ. Θα ήεεθα επίζδξ κα εοπανζζηήζς ηδκ η. Δθεοεενία Γζακκμπμφθμο, ακαπθδνχηνζα ηαεδβήηνζα ημο ενβαζηδνίμο Γεκζηήξ Φανιαημθμβίαξ ηδξ Ηαηνζηήξ ζπμθήξ ημο Πακεπζζηδιίμο Παηνχκ βζα ηδ αμήεεζά ηδξ ζημ πεζνζζιυ ηςκ πεζναιαημγχςκ. Θα ήεεθα κα εηθνάζς ηζξ εοπανζζηίεξ ιμο πνμξ ημοξ ηαεδβδηέξ Βαζίθδ Πάπκδ ηαζ François Guillemot, group leaders ζημ ηιήια Μμνζαηήξ Νεονμαζμθμβίαξ ημο Δεκζημφ Ηκζηζημφημο Ηαηνζηήξ Ένεοκαξ (National Institute for Medical Research) ζημ Λμκδίκμ, βζα ηδκ εοηαζνία πμο ιμο έδςζακ κα ενβαζηχ ζηα ενβαζηήνζά ημοξ. Έκα ιεβάθμ εοπανζζηχ μθείθς ηαζ ζηδκ Dipa Natarajan, βζα ηδκ αζηείνεοηδ δζάεεζή ηδξ βζα αμήεεζα ηαζ βζα ηδκ αιένζζηδ ενβαζηδνζαηή ηαζ δεζηή ζοιπανάζηαζή ηδξ. Ζ ζηήνζλδ ηςκ ιεηαπηοπζαηχκ θμζηδηχκ ηςκ ενβαζηδνίςκ Φανιαημθμβίαξ ηαζ Γεκζηήξ Βζμθμβίαξ ήηακ ηαεμνζζηζηή βζα ηδκ μθμηθήνςζδ αοηήξ ηδξ δζαηνζαήξ. Ξεηζκχκηαξ απυ ηα παθαζυηενα ιέθδ ηςκ δφμ ενβαζηδνίςκ, εα ήεεθα κα εοπανζζηήζς ημοξ Κθαίνδ Πεηνμπμφθμο, Μανία Γδιάηδ, Μανία Ζθζμφ, Βαζίθδ Ρμφημ ηαζ Υανμφθα ζνζκζάκ, αθθά ηαζ ηα κευηενα ιέθδ Νζηυθα Κανακηγέθδ, Νάκζο ηαεμπμφθμο, Υνζζηίκα Κονμφζδ, Δφα Κνδηζημφ, Πακςναία Κμηακηάηδ, Γδιήηνδ Καναιήηνμ, Δθεάκκα οιεςκίδμο, Γάθκδ Πεθάκδ, Πακαβζχηδ Κςηζακηή ηαζ Σάζμ Παπακαζηαζίμο. Ζ αζηείνεοηδ δζάεεζή ημοξ ηαζ ημ θζθζηυ ηθίια πμο έπμοκ 8

9 δζαιμνθχζεζ ηάκμοκ ηζξ (πμθθέξ) χνεξ ζημ ενβαζηήνζμ κα πενκμφκ εοπάνζζηα. Σέθμξ, εα ήεεθα κα εοπανζζηήζς ηδκ μζημβέκεζά ιμο ηαζ ημκ Κχζηα, πμο ανίζημκηαζ πάκηα δίπθα ιμο ηαζ ιε οπμζηδνίγμοκ. Ζ ζηήνζλή ημοξ οπήνλε πμθφηζιδ ηαζ απμηεθεί ηδ δφκαιδ βζα ημ ιέθθμκ. 9

10 ΠΔΡΗΛΖΦΖ Ζ δδιζμονβία ημο εβηεθαθζημφ θθμζμφ ζηδνίγεηαζ ζηδ δζαδμπζηή ειθάκζζδ πθδεοζιχκ πνμβμκζηχκ ηοηηάνςκ, μζ μπμίμζ δίκμοκ βέκεζδ ζε κεονζηά ηαζ βθμζαηά ηφηηανα. Πνυηεζηαζ βζα ιία δζαδζηαζία πμο απαζηεί ημ ζοβπνμκζζιυ ηςκ δζενβαζζχκ αοημ-ακακέςζδξ ηαζ δζαθμνμπμίδζδξ ηςκ πνμβμκζηχκ κεονζηχκ ηοηηάνςκ, ηαζ δζαιεζμθααείηαζ απυ ημκ ηαοηυπνμκμ έθεβπμ ηςκ δζαδζηαζζχκ ηοηηανζημφ ηφηθμο, ιεηαβναθζηήξ νφειζζδξ ηαζ ακαδζαιυνθςζδξ ηδξ δμιήξ ηδξ πνςιαηίκδξ. Ζ πνςηεΐκδ Geminin έπεζ πνμηαεεί ςξ έκα ιυνζμ πμο νοειίγεζ ηυζμ ημκ ηοηηανζηυ πμθθαπθαζζαζιυ υζμ ηαζ ηδκ ηοηηανζηή δζαθμνμπμίδζδ. Σα απμηεθέζιαηα ηδξ πανμφζαξ δζαηνζαήξ δείπκμοκ υηζ δ πνςηεΐκδ Geminin ηαζ μ ιμνζαηυξ ηδξ ζοκενβάηδξ Cdt1 εηθνάγμκηαζ ζηα πνμβμκζηά κεονζηά ηφηηανα ηδξ ημζθζαηήξ ηαζ οπμημζθζαηήξ γχκδξ ημο ακαπηοζζυιεκμο θθμζμφ ημο ιουξ. ηα πνμηαεμνζζιέκα πνμξ κεονςκζηή δζαθμνμπμίδζδ πνυδνμια ηφηηανα πμο εηθνάγμοκ ηζξ πνμκεονζηέξ bhlh πνςηεΐκεξ Mash1 ηαζ Neurogenin2 δ έηθναζή ημοξ ιεζχκεηαζ. Δπίζδξ δείπκμοιε υηζ μζ πανάβμκηεξ Geminin ηαζ Cdt1 επζδεζηκφμοκ έκα πενζμδζηυ πνυηοπμ έηθναζδξ ζηα πνμβμκζηά κεονζηά ηφηηανα ημο θθμζμφ ημο ιουξ πμο ελανηάηαζ απυ ηδ θάζδ ημο ηοηηανζημφ ηφηθμο. Πνμηεζιέκμο κα δζενεοκδεεί μ νυθμξ ηδξ πνςηεΐκδξ Geminin in vivo ζηζξ δζαδζηαζίεξ αοημ-ακακέςζδξ, δζαδμπήξ ηαζ δζαθμνμπμίδζδξ ηςκ πνμβμκζηχκ κεονζηχκ ηοηηάνςκ ημο θθμζμφ, πναβιαημπμζήεδηακ πεζνάιαηα οπενέηθναζδξ ηαζ απμζζχπδζδξ ημο βμκζδίμο ηδξ Geminin ζημκ ακαπηοζζυιεκμ εβηεθαθζηυ θθμζυ ημο ιουξ. Σα απμηεθέζιαηά ιαξ οπμδεζηκφμοκ υηζ δ απμοζία ηδξ Geminin αολάκεζ ημκ ανζειυ ηςκ πνμβμκζηχκ ηοηηάνςκ ηδξ ημζθζαηήξ γχκδξ ημο θθμζμφ, ιεηααάθθμκηαξ ημκ νοειυ ηοηηανζηήξ δζαίνεζδξ πμο ειθακίγμοκ ηα παναπάκς ηφηηανα ηαηά ηα πνχζια ζηάδζα ηδξ θθμζσηήξ κεονμβέκεζδξ. Ζ Geminin νοειίγεζ επίζδξ ημκ ηαεμνζζιυ ηςκ ααζζηχκ πνυδνμιςκ ηοηηάνςκ ηδξ οπμημζθζαηήξ γχκδξ, εκυξ πθδεοζιμφ πνμβμκζηχκ κεονζηχκ ηοηηάνςκ πμο δίκεζ ηονίςξ βέκεζδ ζε δζαθμνμπμζδιέκα κεονζηά ηφηηανα. Δπζπθέμκ, δ οπενέηθναζδ ηδξ Geminin αολάκεζ ημκ πθδεοζιυ ηςκ πνμηαεμνζζιέκςκ πνμξ κεονςκζηή δζαθμνμπμίδζδ πνυδνμιςκ ηοηηάνςκ ηαεχξ ηαζ ημκ ανζειυ ηςκ θθμζσηχκ κεονχκςκ πνμάβμκηαξ ηδκ έλμδμ απυ ημκ ηοηηανζηυ ηφηθμ. οκμρίγμκηαξ, ηα απμηεθέζιαηά ιαξ ηαηαδεζηκφμοκ υηζ δ Geminin ζοιιεηέπεζ ζηδ νφειζζδ ημο πθδεοζιμφ ηςκ πνμβμκζηχκ ηοηηάνςκ ημο θθμζμφ ηαζ ζηδ ιεηάααζδ ιεηαλφ ηςκ δζαδμπζηχκ πνμβμκζηχκ πθδεοζιχκ νοειίγμκηαξ ηεθζηά ηδκ παναβςβή ηςκ θθμζσηχκ κεονχκςκ. Σα απμηεθέζιαηά ιαξ επμιέκςξ πνμζδίδμοκ ζηδ Geminin έκα θοζζμθμβζηυ νυθμ ζημ ζπδιαηζζιυ ημο θθμζμφ ηςκ εδθαζηζηχκ. Λέμεηο-θιεηδηά: Geminin, ζζημεζδζηή απμζζχπδζδ, ιφεξ, θθμζσηή ακάπηολδ, ηοηηανζηυξ ηφηθμξ, ηαεμνζζιυξ πνμβμκζηχκ ηοηηάνςκ 10

11 ABSTRACT Cortical development is a highly ordered process, involving the timely orchestration of the appearance of different neural progenitor lineages, which succeed one another in order to generate the neurons and glia comprising the cortex. It is a process requiring coordination of proliferation and differentiation which in turn depends upon the precise control of cell cycle parameters, chromatin remodeling and transcriptional activity. Geminin has been shown to regulate cell proliferation, fate determination and organogenesis, representing a potential link between these processes. We show here that Geminin and its binding partner Cdt1 are expressed by neural progenitor cells of the ventricular and subventricular zone of the developing mouse cortex. However, the majority of the Geminin and Cdt1 expressing cells are distinct from fate-restricted precursor cells expressing the bhlh proneural proteins Mash1 and Neurogenin2. Importantly, BrdU incorporation experiments show a cell cycle specific expression pattern of Geminin and Cdt1 in neural progenitors of the mouse cortex. In order to investigate Geminin in vivo role in the self-renewal, maintenance, lineage commitment and differentiation of cortical neural progenitors, we have specifically over-expressed and deleted Geminin in the developing cortex. Our results showed that Geminin function in the developing mouse cortex regulates the number of the apical progenitors. Interestingly, this impact on progenitor number is the consequence of the accelerated cell cycle that these apical progenitors exhibit during early stages of cortical development. Moreover, Geminin deletion and overexpression in the cortex also regulated the fate specification of the basal cortical progenitors of the subventricular zone. Furthermore, our results demonstrated that Geminin affects the population of the committed neural precursors, the rate of cell cycle exit and, subsequently, the numbers of cortical neurons. Our study assigns Geminin with a role in regulating the progenitor cell number, the timing of lineage transition, the progenitor neuronal commitment and the subsequent neuron generation. Key words: Geminin; conditional inactivation; mice; cortical development; cell cycle; lineage progenitor transition 11

12 1. Δ Η Α Γ Χ Γ Ζ

13 Δζζαβςβή Κεθάιαην 1. Μεραληζκνί απην-αλαλέσζεο θαη δηαθνξνπνίεζεο ζηνλ εγθεθαιηθό θινηό 1.1. Σα λεπξηθά βιαζηηθά θύηηαξα (neural stem cells) απνηεινύλ ηε βάζε γηα ηελ αλάπηπμε ηνπ εγθεθάινπ Ζ ιεθέηδ ηδξ αζμθμβίαξ ηςκ αθαζηζηχκ ηοηηάνςκ απμηεθεί έκα πεδίμ εηηεηαιέκδξ ένεοκαξ, ηονίςξ θυβς ηςκ αζμθμβζηχκ δζενβαζζχκ ζηζξ μπμίεξ ζοιιεηέπμοκ ηα ηφηηανα αοηά αθθά ηαζ ηςκ εκ δοκάιεζ ηθζκζηχκ εθανιμβχκ ημοξ. Ζ δζενεφκδζδ ηςκ παναπάκς παναιέηνςκ εα αμδεήζεζ ζηδκ ηαηακυδζδ ηδξ μνβάκςζδξ ηαζ ακαβέκκδζδξ ηςκ ζζηχκ αθθά ηαζ ζηδκ ακάπηολδ ηοηηανζηχκ εεναπεζχκ βζα δζάθμνεξ εηθοθζζηζηέξ αζεέκεζεξ. θα ηα ηφηηανα εκυξ μνβακζζιμφ πνμένπμκηαζ μοζζαζηζηά απυ ημκ πνχζιμ πθδεοζιυ ηςκ πμθοδφκαιςκ αθαζηζηχκ ηοηηάνςκ ηδξ επζαθάζηδξ ημο ειανφμο. Ο ζπδιαηζζιυξ ηςκ δζαθυνςκ ζζηχκ δζαιεζμθααείηαζ απυ ηδ δζαθμνμπμίδζδ ηςκ παναπάκς πμθοδφκαιςκ αθαζηζηχκ ηοηηάνςκ ζε αθαζηζηά ηφηηανα ημο εηάζημηε ζζημφ, ηα μπμία εα δζαθμνμπμζδεμφκ ηεθζηά ζε υθμοξ ημοξ ηοηηανζημφξ ηφπμοξ ημο ζζημφ. Καηά ηδκ ακάπηολδ ημο ηεκηνζημφ κεονζημφ ζοζηήιαημξ ηςκ εδθαζηζηχκ, ηα κεονζηά αθαζηζηά ηφηηανα απμηεθμφκ ηδκ πδβή πνμέθεοζδξ υθςκ ηςκ δζαθμνμπμζδιέκςκ ηοηηανζηχκ ηφπςκ ημο ζζημφ, δδθαδή ηυζμ ηςκ κεονζηχκ ηοηηάνςκ υζμ ηαζ ηςκ ηοηηάνςκ βθμίαξ (αζηνμβθμία ηαζ μθζβμδεκδνμβθμία) (Gotz and Huttner, 2005). Σα πνμζδζμνζζηζηά παναηηδνζζηζηά ηςκ ζςιαηζηχκ αθαζηζηχκ ηοηηάνςκ είκαζ δ ζηακυηδηά ημοξ κα ζοκηδνμφκ ημκ πθδεοζιυ ημοξ ιέζς ηδξ αοημακακέςζήξ ημοξ (self-renewal), ζδεαηά βζα απενζυνζζημ ανζειυ δζαζνέζεςκ, αθθά ηαζ δ δοκαηυηδηά ημοξ κα δζαθμνμπμζδεμφκ ζε πμθθμφξ, δζαθμνεηζημφξ ηοηηανζημφξ ηφπμοξ. Παν υθ αοηά, δ μιμζμβέκεζα ημο παναπάκς μνζζιμφ θαίκεηαζ κα πνμζδζμνίγεζ εεςνδηζηά ιυκμ ηα αθαζηζηά ηφηηανα, ηαεχξ ηα κευηενα αζαθζμβναθζηά δεδμιέκα οπμζηδνίγμοκ υηζ πνυηεζηαζ βζα ζδζαζηένςξ εηενμβεκείξ ηοηηανζημφξ πθδεοζιμφξ, ηυζμ ζε πθδεοζιζαηυ υζμ ηαζ ζε ηοηηανζηυ επίπεδμ (Roeder and Radtke, 2009). Καεχξ δ φπανλδ πμθοδφκαιςκ αθαζηζηχκ ηοηηάνςκ δεκ έπεζ αηυια πθήνςξ δζαθεοηακεεί ζημ ηεκηνζηυ κεονζηυ ζφζηδια (Gotz and Huttner, 2005), εα πνδζζιμπμζήζμοιε ζηδκ πανμφζα δζδαηημνζηή δζαηνζαή ημκ υνμ «κεονζηά αθαζηζηά ηφηηανα» (neural stem cells) βζα ηα αδζαθμνμπμίδηα εηείκα ηφηηανα ημο ακαπηοζζυιεκμο ηεκηνζημφ κεονζημφ ζοζηήιαημξ πμο έπμοκ ζηακυηδηα αοημακακέςζδξ ηαζ ειθακίγμοκ πμθοδφκαιμ ή ιμκμδφκαιμ δζαθμνμπμζδηζηυ δοκαιζηυ. Ακηίεεηα, εα πνδζζιμπμζήζμοιε ημκ υνμ «πνυδνμια ηφηηανα» βζα ηα δζαζνμφιεκα, αδζαθμνμπμίδηα ηφηηανα ημο ακαπηοζζυιεκμο ηεκηνζημφ κεονζημφ ζοζηήιαημξ πμο ειθακίγμοκ ιμκμδφκαιμ δζαθμνμπμζδηζηυ δοκαιζηυ (δδθαδή πμο ιεηά ηδ δζαίνεζή ημοξ εα δζαθμνμπμζδεμφκ πνμξ έκα ιυκμ ηοηηανζηυ ηφπμ). Απυ ηδκ άθθδ ιενζά, 13

14 Δζζαβςβή ηαεχξ υθα ηα παναπάκς ηφηηανα απμηεθμφκ εκενβχξ δζαζνμφιεκμοξ, αδζαθμνμπμίδημοξ πθδεοζιμφξ, εα πνδζζιμπμζήζμοιε ημκ υνμ «κεονζηά πνμβμκζηά ηφηηανα» (neural progenitor cells) βζα κα παναηηδνίζμοιε ζοκμθζηά ημοξ αδζαθμνμπμίδημοξ ηοηηανζημφξ πθδεοζιμφξ ημο ακαπηοζζυιεκμο ειανοσημφ ηεκηνζημφ κεονζημφ ζοζηήιαημξ απυ ηδ δζαθμνμπμίδζδ ηςκ μπμίςκ ιπμνεί κα πνμηφρμοκ ηυζμ κεονζηά υζμ ηαζ βθμζαηά ηφηηανα. ε ηάεε πενίπηςζδ, ιέζα απυ ημοξ ζοκεπείξ ηφηθμοξ πμθθαπθαζζαζιμφ ηαζ δζαθμνμπμίδζδξ ηςκ παναπάκς ηοηηάνςκ εα πνμηφρμοκ υθα ηα κεονζηά ηαζ βθμζαηά ηφηηανα ημο μνβακζζιμφ. Πθδεοζιμί κεονζηχκ αθαζηζηχκ ηοηηάνςκ πμο εκημπίγμκηαζ ζε ζοβηεηνζιέκεξ πενζμπέξ ημο εκήθζημο εβηεθάθμο είκαζ οπεφεοκα βζα ηδκ παναβςβή κεονχκςκ ηαζ ζημοξ εκήθζημοξ μνβακζζιμφξ (Gage, 2000; Anderson, 2001). Εχκεξ κεονμβέκεζδξ έπμοκ πανημβναθδεεί ζε δφμ πενζμπέξ ημο εκήθζημο εβηεθάθμο, ζηδκ οπμημζθζαηή γχκδ (subventricular zone, SVZ) ηςκ πθάβζςκ ημζθζχκ (lateral ventricles) ηαζ ζηδκ οπμημηηζχδδ γχκδ (subgranular zone) ηδξ μδμκηςηήξ έθζηαξ (dentate gyrus) ημο ζππμηάιπμο, εκχ ηαζ αοημί μζ πθδεοζιμί κεονζηχκ αθαζηζηχκ ηοηηάνςκ ειθακίγμοκ εηηεηαιέκδ εηενμβέκεζα. Οζ κεονχκεξ πμο βεκκζμφκηαζ ζηδκ οπμημζθζαηή γχκδ ιεηακαζηεφμοκ ιέζς ημο πνυζεζμο ιεηακαζηεοηζημφ νεφιαημξ (rostral migratory stream) ζημοξ μζθνδηζημφξ αμθαμφξ, εκχ μζ κεονχκεξ πμο πανάβμκηαζ ζηδκ οπμημηηζχδδ γχκδ ηδξ μδμκηςηήξ έθζηαξ ιεηακαζηεφμοκ ζε πμθφ πζμ ημκηζκέξ απμζηάζεζξ ηαζ επμζηίγμοκ ηδκ ημηηζχδδ γχκδ ηδξ μδμκηςηήξ έθζηαξ ημο ζππμηάιπμο (Zhao et al., 2008). Καεχξ μζ πενζμπέξ αοηέξ ζπεηίγμκηαζ ιε ηζξ θεζημονβίεξ ικήιδξ ηαζ ιάεδζδξ, οπμζηδνίγεηαζ υηζ δ παναηδνμφιεκδ κεονμβέκεζδ ζημκ εκήθζημ εβηέθαθμ δζαιεζμθααεί ηδκ εβηαείδνοζδ κέςκ πθδνμθμνζχκ. Δπζπνυζεεηα, δ νφειζζδ ηδξ κεονμβέκεζδξ ζημοξ εκήθζημοξ μνβακζζιμφξ απυ πενζααθθμκηζηά ενεείζιαηα (βζα πανάδεζβια ηδκ άζηδζδ ή έκα ειπθμοηζζιέκμ πενζαάθθμκ δζααίςζδξ) εκζζπφεζ ημκ νυθμ ηδξ ζηδ θοζζμθμβζηή ζοιπενζθμνά ηςκ μνβακζζιχκ, βεβμκυξ πμο οπμδεζηκφεζ ηδκ αιθίδνμιδ νφειζζδ εβηεθάθμο ηαζ ζοιπενζθμνάξ (Gage, 2000). Ακελανηήηςξ ηδξ εηενμβέκεζάξ ημοξ, δ ζηακυηδηα ηςκ κεονζηχκ αθαζηζηχκ ηοηηάνςκ ηςκ ειανφςκ ηαζ ηςκ εκήθζηςκ μνβακζζιχκ κα αοημ-ακακεχκμκηαζ ηαζ κα δίκμοκ βέκεζδ ζε πμθθμφξ δζαθμνεηζημφξ κεονςκζημφξ οπμηφπμοξ ηα ηαεζζηά ιζα εθπζδμθυνα εεναπεοηζηή εθανιμβή βζα ηδκ ακηζιεηχπζζδ ζμαανχκ κεονμεηθοθζζηζηχκ αζεεκεζχκ υπςξ είκαζ μζ αζεέκεζεξ Parkinson ηαζ Alzheimer, δ πθάβζα ιομηνμθζηή ζηθήνοκζδ (amyotrophic lateral sclerosis) αθθά ηαζ μζ ηναοιαηζζιμί ηδξ ζπμκδοθζηήξ ζηήθδξ (Ogawa et al., 2002; Okano, 2002; Lindvall and Kokaia, 2006). Οζ ζφβπνμκεξ εεναπεοηζηέξ πνμζεββίζεζξ βζα ηδκ ακηζιεηχπζζδ ηςκ παναπάκς δζαηαναπχκ ιε ηδ πνήζδ αθαζηζηχκ ηοηηάνςκ πνμζακαημθίγμκηαζ ζηδ δζαθμνμπμίδζδ in vitro ηςκ αθαζηζηχκ ηοηηάνςκ ζημοξ ηαηάθθδθμοξ κεονςκζημφξ ηφπμοξ ηαζ ηδ ιεηέπεζηα ιεηαιυζπεοζή ημοξ ζηδκ πενζμπή ηδξ αθάαδξ, ιε ηδκ πνμζδμηία υηζ ηα ηφηηανα, δεπυιεκα ηδκ ηαηάθθδθδ ζδιαημδυηδζδ απυ ηδκ 14

15 Δζζαβςβή πενζμπή αοηή, εα ακαπηφλμοκ δεκδνζηζηέξ ηαζ αλμκζηέξ ζοκάρεζξ ηαζ εα εκζςιαηςεμφκ ζε κέα, θεζημονβζηά κεονςκζηά ηοηθχιαηα. Μζα εκαθθαηηζηή πνμζέββζζδ είκαζ δ ιεηαιυζπεοζδ κεονζηχκ αθαζηζηχκ ηοηηάνςκ ζημκ πάζπμκηα ζζηυ, ηα μπμία ζδεαηά εα δζαθμνμπμζδεμφκ ζημ κεονςκζηυ ηφπμ πμο πανμοζζάγεζ ηδ αθάαδ. Οζ εεναπεοηζηέξ αοηέξ ζηναηδβζηέξ έπμοκ εθανιμζηεί ιέπνζ ηχνα ζε γςζηά ιμκηέθα κεονμεηθοθζζηζηχκ δζαηαναπχκ. Πνυζθαηεξ ένεοκεξ ακαθένμοκ εεαιαηζηά απμηεθέζιαηα ιεηά ηδκ ιεηαιυζπεοζδ αθαζηζηχκ ηοηηάνςκ ζε πνςηεφμκηα εδθαζηζηά ιε κεονμεηθοθζζηζηέξ δζαηαναπέξ, βεβμκυξ πμο ηαεζζηά ηδκ πνμμπηζηή ηδξ εθανιμβήξ ηδξ ιεευδμο ηαζ ζε ακενχπμοξ ζδζαίηενα αζζζυδμλδ (Lindvall et al., 2004; Daley and Scadden, 2008; Hou and Hong, 2008; Murry and Keller, 2008; Silva and Smith, 2008). Μζα αηυια ααζζηή νοειζζηζηή πανάιεηνμξ βζα ηδ θεζημονβζηή ζδιαζία ηςκ αθαζηζηχκ ηοηηάνςκ είκαζ μ έθεβπμξ ημο ηοηηανζημφ ημοξ ηφηθμο. Σα αθαζηζηά ηφηηανα ανίζημκηαζ ζοκεπχξ ακηζιέηςπα ιε ηδ δφζημθδ απμζημθή ηδξ δζαηήνδζδξ ηδξ ζζμννμπίαξ ιεηαλφ ηςκ δζαδζηαζζχκ αοημ-ακακέςζδξ ηαζ δζαθμνμπμίδζδξ. Οζ δζενβαζίεξ αοηέξ απαζημφκ ηδ αέθηζζηδ νφειζζδ ημο ηοηηανζημφ ημοξ ηφηθμο, χζηε κα οπάνπεζ ζοβπνμκζζιυξ ηςκ θαζκμιέκςκ πμο μδδβμφκ ζε ηοηηανζηυ πμθθαπθαζζαζιυ ηαζ αοημ-ακακέςζδ απυ ηδ ιζα, ηαζ ζε έλμδμ απυ ημκ ηοηηανζηυ ηφηθμ ηαζ δζαθμνμπμίδζδ απυ ηδκ άθθδ. Καεχξ μ πμθθαπθαζζαζιυξ ηςκ αθαζηζηχκ ηοηηάνςκ νοειίγεηαζ αοζηδνά ηαζ πζεακχξ εθέβπεηαζ απυ πμθοάνζειμοξ πανάβμκηεξ ζδιαημδυηδζδξ, πνέπεζ κα δςεεί ζδζαίηενδ έιθαζδ ζηδκ ηαοημπμίδζδ ηςκ ιμνίςκ πμο ζοκημκίγμοκ ημκ ηοηηανζηυ πμθθαπθαζζαζιυ ηαζ ακαβκςνίγμοκ ζήιαηα πμο δζμζημφκ ηδκ έλμδμ απυ ημκ ηοηηανζηυ ηφηθμ. Ζ πενζμπή πμο εκδεπμιέκςξ πνμζθένεηαζ πενζζζυηενμ βζα ηδκ ελαηνίαςζδ ηςκ βεβμκυηςκ πμο δζέπμοκ ημοξ ιδπακζζιμφξ πμθθαπθαζζαζιμφ ηαζ δζαθμνμπμίδζδξ ηςκ κεονζηχκ αθαζηζηχκ ηοηηάνςκ είκαζ μ εβηεθαθζηυξ θθμζυξ. Λυβς ηδξ ζδζαίηενδξ εέζδξ ημο ζηδ νφειζζδ ακχηενςκ εβηεθαθζηχκ θεζημονβζχκ, υπςξ δ ακηίθδρδ, ηα ζοκαζζεήιαηα, δ ικήιδ ηαζ δ ιάεδζδ η.α., μ εβηεθαθζηυξ θθμζυξ απμηέθεζε εηηεηαιέκμ πεδίμ ένεοκαξ. Οζ πθδεοζιμί ηςκ ειανοσηχκ κεονζηχκ αθαζηζηχκ ηαζ πνυδνμιςκ ηοηηάνςκ ημο θθμζμφ έπμοκ απμζαθδκζζηεί ζε ιεβάθμ ααειυ, υπςξ επίζδξ ηαζ ιενζηέξ απυ ηζξ ζδιακηζηυηενεξ παναιέηνμοξ ημο ηοηηανζημφ ημοξ ηφηθμο, υπςξ είκαζ δ δζάνηεζα ή μ ηνυπμξ δζαίνεζδξ. Μεβάθδ πνυμδμξ έπεζ επίζδξ ζδιεζςεεί ζηδ ζοζπέηζζδ ηςκ πνμβμκζηχκ ηοηηάνςκ ημο θθμζμφ ιε ζοβηεηνζιέκμοξ κεονςκζημφξ οπμηφπμοξ. Δπζπνυζεεηα, δ οπμημζθζαηή γχκδ ημο εβηεθαθζημφ θθμζμφ απμηεθεί ηδ ιία απυ ηζξ δφμ πενζμπέξ πμο επζδεζηκφμοκ εκενβή κεονμβέκεζδ ζημοξ εκήθζημοξ μνβακζζιμφξ, ιε ημοξ κεμζπδιαηζγυιεκμοξ κεονχκεξ κα ιεηακαζηεφμοκ ζημοξ μζθνδηζημφξ αμθαμφξ. Ζ εκδοκάιςζδ ηδξ ηαηακυδζδξ ηςκ ακαπηολζαηχκ ζοζπεηίζεςκ ιεηαλφ ηςκ πνμβμκζηχκ θθμζσηχκ ηοηηάνςκ ηαζ ηδξ δοκαηυηδηάξ ημοξ κα δχζμοκ βέκεζδ ζε δζαθμνεηζημφξ ηοηηανζημφξ ηφπμοξ ημο θθμζμφ εκδέπεηαζ κα εκζζπφζεζ ηδκ ακηίθδρδ πμο έπμοιε βζα ηζξ αζηίεξ ηςκ δζαθυνςκ 15

16 Δζζαβςβή κεονμεηθοθζζηζηχκ δζαηαναπχκ αθθά ηαζ κα ακμίλεζ κέμοξ δνυιμοξ ζηζξ πνμζπάεεζεξ ακηζιεηχπζζήξ ημοξ ιέζς ηςκ ζηναηδβζηχκ ηοηηανζηήξ ακηζηαηάζηαζδξ ρεκαηηζκόο ηνπ εγθεθαιηθνύ θινηνύ Ζ ακάπηολδ ημο κεονζημφ ζοζηήιαημξ ηςκ ζπμκδοθςηχκ ανπίγεζ ιε ηδ δζαδζηαζία ηδξ κεονζηήξ επαβςβήξ, δ μπμία πενζθαιαάκεζ ηδκ εκενβμπμίδζδ ηςκ πνμβναιιάηςκ κεονζηήξ δζαθμνμπμίδζδξ ζηδκ ελςδενιζηή ζηζαάδα ηςκ ειανφςκ (Smith and Harland, 1992; Lamb et al., 1993; Hemmati-Brivanlou et al., 1994; Sasai et al., 1994; Sasai et al., 1995). Ο κεμζπδιαηζγυιεκμξ κεονζηυξ ζςθήκαξ, πμο εα ελεθζπεεί ηεθζηά ζημ ηεκηνζηυ κεονζηυ ζφζηδια, δζαπςνίγεηαζ ηαηά ιήημξ ημο πνμζεζμο-μπίζεζμο άλμκά ημο ζε πέκηε ααζζηέξ οπμδζαζνέζεζξ: ημκ ηεθεβηέθαθμ, ημ δζεβηέθαθμ, ημ ιεζεβηέθαθμ, ημ ιεηεβηέθαθμ ηαζ ημ ιοεθεβηέθαθμ, μ μπμίμξ ηέθμξ ηαηαθήβεζ ζηδ ζπμκδοθζηή ζηήθδ (Δζηυκα 1.1). Ο ηεθεβηέθαθμξ ηαζ μ δζεβηέθαθμξ απμηεθμφκ δεοηενμβεκείξ οπμδζαζνέζεζξ ημο πνυζεζμο εβηεθάθμο, εκχ μζ δμιέξ ημο ιεηεβηεθάθμο ηαζ ημο ιοεθεβηεθάθμο είκαζ δεοηενμβεκείξ οπμδζαζνέζεζξ ημο μπίζεζμο εβηεθάθμο. θεξ μζ παναπάκς πενζμπέξ ελεθίζζμκηαζ ζηζξ πμθθέξ ηαζ Δλήιηθεο ιεηηνπξγίεο 3 πξσηνγελή θπζηίδηα επζεήθζμ ημζθία Πνυζεζμξ εβηέθαθμξ Μεζεβηέθαθμξ Οπίζεζμξ εβηέθαθμξ 5 δεπηεξνγελή θπζηίδηα ηεθεβηέθαθμξ δζεβηέθαθμξ ιεζεβηέθαθμξ ιεηεβηέθαθμξ ιοεθεβηέθαθμξ Οζθνδηζημί αμθαμί - Οζιή Ηππυηαιπμξ - Μκήιδ Δβηεθαθζηυξ θθμζυξ - Ακηίθδρδ Αιθζαθδζηνμεζδήξ Δπζεάθαιμξ Θάθαιμξ Τπμεάθαιμξ Μεζεβηέθαθμξ Πανεβηεθαθίδα Γέθονα - ναζδ - Δπίθοζδ - οζπέηζζδ μπηζηχκαημοζηζηχκ κεονχκςκ - Ρφειζζδ ακαπκμήξ, φπκμο, εενιμηναζίαξ - Άλμκεξ ιεηαλφ πνυζεζμο-μπίζεζμο εβηεθάθμο - οκημκζζιυξ ιοσηχκ ηζκήζεςκ - Άλμκεξ ιεηαλφ θθμζμφπανεβηεθαθίδαξ πμκδοθζηή ζηήθδ Πνμιήηδξ ιοεθυξ - Κέκηνμ αημφζζςκ ακηακαηθαζηζηχκ Δηθόλα 1.1. Σα πξώηκα ζηάδηα ηεο αλάπηπμεο ηνπ αλζξώπηλνπ εγθεθάινπ. Ο λεπξηθόο ζσιήλαο αξρηθά ζρεκαηίδεη ηξία θπζηίδηα, ηνλ πξόζζην εγθέθαιν (forebrain), ην κεζεγθέθαιν (mesencephalon) θαη ηνλ νπίζζην εγθέθαιν (hindbrain). Αθνινύζσο ν πξόζζηνο εγθέθαινο ππνδηαηξείηαη πεξαηηέξσ ζηνλ ηειεγθέθαιν (telencephalon) θαη ηνλ δηεγθέθαιν (diencephalon) ελώ ν νπίζζηνο εγθέθαινο ζρεκαηίδεη ηνλ κεηεγθέθαιν (metencephalon) θαη ην κπειεγθέθαιν (myelencephalon). Οη δεπηεξνγελείο απηέο δνκέο ζα αλαπηπρζνύλ ζε πεξηνρέο κε δηαθξηηέο ιεηηνπξγίεο. (Σξνπνπνηεκέλε από Gilbert, Developmental Biology, 6th Edition). 16

17 Δζζαβςβή δζαθμνεηζηέξ δμιέξ ημο εβηεθάθμο ηςκ εδθαζηζηχκ πμο δζαζηπεναζχκμοκ ηζξ θεζημονβίεξ ημο (Δζηυκα 1.1). Ο εβηεθαθζηυξ θθμζυξ ζοβηεηνζιέκα είκαζ δζαθμνμπμίδζδ ηιήιαημξ ημο ηεθεβηεθάθμο ηαζ ίζςξ απμηεθεί ηδκ πζμ πμθφπθμηδ πενζμπή ημο εβηεθάθμο ηυζμ απυ πθεονάξ θεζημονβίαξ υζμ ηαζ ιμνθμθμβίαξ, ηαεχξ πνυηεζηαζ βζα ηδ δμιή πμο ζοκημκίγεζ ηαζ νοειίγεζ ηυζμ ηζξ ηζκήζεζξ υζμ ηαζ ηζξ ακχηενεξ βκςζηζηέξ θεζημονβίεξ υπςξ ηδκ ακηίθδρδ, ηα ζοκαζζεήιαηα, ηδ ικήιδ, ηδ ιάεδζδ ηαζ ηδ ζοκείδδζδ ζημκ άκενςπμ. Αιέζςξ ιεηά ηδκ επαβςβή ημο, μ ηεθεβηέθαθμξ οπμδζαζνείηαζ ζε δφμ διζζθαίνζα, ηα μπμία εα ζπδιαηίζμοκ ηα ιεθθμκηζηά εβηεθαθζηά διζζθαίνζα. Μμνθμθμβζηά, ηάεε διζζθαίνζμ ημο ηεθεβηεθάθμο ηςκ ειανφςκ δζαηνίκεηαζ ζε δφμ ααζζηά ηιήιαηα, ζημ ναπζαίμ πζηχκζμ (pallium) ηαζ ημ ημζθζαηυ οπμπζηχκζμ (subpallium). Σμ ναπζαίμ πζηχκζμ δζαζνείηαζ πεναζηένς ζημ πμνζμεζδέξ πθέβια (choroid plexus), ημ ιέζμ πζηχκζμ (medial pallium), ημ ναπζαίμ πζηχκζμ (dorsal pallium), ημ πθάβζμ πζηχκζμ (lateral pallium) ηαζ ημ ημζθζαηυ πζηχκζμ (ventral pallium) εκχ ημ ημζθζαηυ οπμπζηχκζμ οπμδζαζνείηαζ ακηίζημζπα ζηδ ναπζαία πθάβζα βαββθζαηή πνμελμπή (dorsal lateral ganglionic eminence), ηδκ ημζθζαηή πθάβζα βαββθζαηή πνμελμπή (ventral leteral ganglionic eminence), ηδ ιέζδ βαββθζαηή πνμελμπή (medial ganglionic eminence), ημ δζάθναβια (septum), ηαζ ζε πζμ μπίζεζα εέζδ ζηδκ μπίζεζα βαββθζαηή πνμελμπή (caudal ganglionic eminence). Απυ ηζξ παναπάκς πενζμπέξ εα πνμηφρμοκ δζαηνζηέξ δμιέξ ζημκ εβηέθαθμ ηςκ εκήθζηςκ εδθαζηζηχκ: ημ ναπζαίμ πζηχκζμ εα δχζεζ βέκεζδ ζημ κεμθθμζυ (neocortex), ημ ιέζμ πζηχκζμ ζημκ ανπαζμθθμζυ (archicortex) πμο πενζθαιαάκεζ ημκ ζππυηαιπμ (hippocampus), ημ πθάβζμ πζηχκζμ εα ιεηαηναπεί ζημκ παθαζμθθμζυ (paleocortex) πμο πενζθαιαάκεζ ημκ πνςημβεκή μζθνδηζηυ θθμζυ εκχ ηέθμξ ημ ημζθζαηυ πζηχκζμ ακηζζημζπεί ζημ πνμηείπζζια (claustrum). Απυ ηδκ άθθδ ιενζά, μ ημζθζαηυξ ηεθεβηέθαθμξ εα ιεηαζπδιαηζζηεί ζημ νααδςηυ (striatum) (Puelles, 2001; Sur and Rubenstein, 2005) (Δζηυκα 1.2). Κάεε ιία απυ ηζξ παναπάκς δμιέξ ειθακίγεζ πεναζηένς οπμδζαζνέζεζξ, βζα πανάδεζβια μ κεμθθμζυξ πενζθαιαάκεζ ημκ πνμιεηςπζαίμ, ημκ ηζκδηζηυ ηαζ ημ ζςιαημαζζεδηζηυ θθμζυ, μζ μπμίμζ πανμοζζάγμκηαζ επίζδξ δζαιενζζιαημπμζδιέκμζ. Έπεζ πνμηαεεί υηζ δ αολδιέκδ εηθέπηοκζδ ηςκ βκςζζαηχκ θεζημονβζχκ ηςκ ακχηενςκ εδθαζηζηχκ μθείθεηαζ ζηδκ εηηεηαιέκδ δζεφνοκζδ ηδξ επζθάκεζαξ ηαζ ηδξ πμθοπθμηυηδηαξ ημο κεμθθμζμφ ζημοξ παναπάκς μνβακζζιμφξ (Rakic, 1995; Rakic, 2009). Ζ πθεζμκυηδηα ηςκ κεονζηχκ ηοηηάνςκ ημο θθμζμφ είκαζ πνμαθδηζημί (projection) κεονχκεξ, ηςκ μπμίςκ μζ κεονάλμκεξ πνμαάθθμοκ ζε ζπεηζηχξ ιαηνζκμφξ θθμζσημφξ ηαζ οπμθθμζσημφξ ζηυπμοξ. Ζ άθθδ ηαηδβμνία ηςκ θθμζσηχκ κεονχκςκ είκαζ μζ δζάιεζμζ κεονχκεξ (interneurons), ιε κεονάλμκεξ πμο ηενιαηίγμοκ ημπζηά, ζοκήεςξ ζημοξ ημκηζκμφξ πνμαθδηζημφξ κεονχκεξ. Σα κεονζηά ηφηηανα ημο κεμθθμζμφ ηαηακέιμκηαζ ζε έλζ δζαδμπζηέξ ζηζαάδεξ (I-VI) ηδξ θθμζσηήξ πθάηαξ (cortical plate), μζ μπμίεξ δζαθένμοκ ιεηαλφ ημοξ ςξ πνμξ ηδκ ποηκυηδηα ηαζ ημκ ηφπμ 17

18 Δζζαβςβή ηςκ ηοηηάνςκ πμο πενζέπμοκ. Οζ πνμαθδηζημί κεονχκεξ ημο εβηεθαθζημφ θθμζμφ πνμηφπημοκ απυ ημοξ πθδεοζιμφξ κεονζηχκ πνμβμκζηχκ ηοηηάνςκ πμο εδνεφμοκ ζημκ θθμζυ. Δηθόλα 1.2. Μνξθνινγία ηνπ εκβξπϊθνύ θαη ελήιηθνπ ηειεγθεθάινπ. Α) Καηά ηελ εκβξπτθή αλάπηπμε ν ηειεγθέθαινο δηαρσξίδεηαη ζην ξαρηαίν ρηηώλην (pallium) θαη ζην θνηιηαθό ππνρηηώλην (subpallium). Σν ρηηώλην ππνδηαηξείηαη πεξαηηέξσ ζην κέζν, ξαρηαίν, πιάγην θαη θνηιηαθό ρηηώλην (MP, DP, LP, θαη VP αληίζηνηρα), ελώ ην ππνρηηώλην δηαθξίλεηαη ζηελ πιάγηα, κέζε θαη νπίζζηα γαγγιηαθή πξνεμνρή (LGE, MGE θαη CGE αληίζηνηρα). Β) Οη παξαπάλσ εκβξπτθέο δνκέο ζα δηαθνξνπνηεζνύλ ζε δηαθξηηέο πεξηνρέο ζηνλ ελήιηθν εγθέθαιν. Σν ξαρηαίν ρηηώλην ζα κεηαζρεκαηηζηεί ζην θινηό (CTX) ελώ ην κέζν ρηηώλην ζηνλ ηππόθακπν (HIP). Σν ππνρηηώλην ζα ζρεκαηίζεη ην ξαβδσηό (STR). Σν πξάζηλν ρξώκα ππνδειώλεη ηηο πεξηνρέο πνπ πξνέξρνληαη από ην ρηηώλην, ην θόθθηλν ρξώκα ηηο δνκέο πνπ πξνθύπηνπλ από ην ππνρηηώλην ελώ κε πνξηνθαιί απεηθνλίδνληαη νη πεξηνρέο πνπ έρνπλ κεηθηή πξνέιεπζε. S (septum): δηάθξαγκα. A (amygdala): ακπγδαιή. (Σν Α είλαη ηξνπνπνηεκέλν από (Guillemot, 2005);Σν Β είλαη ηξνπνπνηεκέλν από ηε δηδαθηνξηθή δηαηξηβή ηνπ Πέηξνπ Ληόδε) Πιεζπζκνί λεπξηθώλ πξνγνληθώλ θπηηάξσλ ζηνλ εγθεθαιηθό θινηό θα ηα δζαθμνμπμζδιέκα ηφηηανα ημο εβηεθαθζημφ θθμζμφ πμο δζαιεζμθααμφκ ηζξ παναπάκς εηθεπηοζιέκεξ βκςζζαηέξ θεζημονβίεξ πνμηφπημοκ απυ πθδεοζιμφξ πνμβμκζηχκ, αδζαθμνμπμίδηςκ κεονζηχκ ηοηηάνςκ. Σα αδζαθμνμπμίδηα αοηά πνμβμκζηά ηφηηανα εδνεφμοκ ζε ζοβηεηνζιέκεξ γχκεξ ημο θθμζμφ. Κονίανπδ κεονμβεκεηζηή γχκδ ημο θθμζμφ είκαζ δ ημζθζαηή γχκδ (ΚΕ) (ventricular zone, VZ), δ μπμία είκαζ δ πζμ εζςηενζηή γχκδ ημο θθμζμφ, ζημ υνζμ αηνζαχξ ιε ηδκ πθάβζα ημζθία. Ακ ηαζ θαίκεηαζ κα έπεζ μιμζμβεκή ηαζ απθή δμιή, εκ ημφημζξ δ ημζθζαηή γχκδ απμηεθείηαζ απυ ακμιμζμβεκείξ πθδεοζιμφξ πνμβμκζηχκ ηοηηάνςκ πμο δζαθένμοκ ςξ πνμξ ηδ ιμνθμθμβία, ηδ ιμνζαηή δμιή αθθά ηαζ ηδκ ηζκδηζηή ημο ηοηηανζημφ ημοξ ηφηθμο (Gotz and Huttner, 2005). Απυ ηα πνμβμκζηά ηφηηανα ηδξ ημζθζαηήξ γχκδξ 18

19 Δζζαβςβή πνμηφπημοκ ηαζ ηα πνυδνμια ηφηηανα ηδξ δεφηενδξ κεονμβεκεηζηήξ γχκδξ ημο εβηεθαθζημφ θθμζμφ, ηδξ οπμημζθζαηήξ γχκδξ (ΤΚΕ) (subventricular zone, SVZ). Σα πνυδνμια αοηά ηφηηανα εκημπίγμκηαζ ζε δζαθμνεηζηή εέζδ απυ ηα ηφηηανα ηδξ ημζθζαηήξ γχκδξ ηαζ δίκμοκ βέκεζδ ζε δζαθμνεηζημφξ πθδεοζιμφξ χνζιςκ κεονζηχκ ηοηηάνςκ (Haubensak et al., 2004; Gotz and Huttner, 2005; Kriegstein et al., 2006) Κνξπθαία πξνγνληθά λεπξηθά θύηηαξα Σα πνμβμκζηά ηφηηανα πμο εκημπίγμκηαζ ζηδκ ημζθζαηή γχκδ ημο ακαπηοζζυιεκμο κεμθθμζμφ μκμιάγμκηαζ ζοθθμβζηά «ημνοθαία πνμβμκζηά ηφηηανα» (apical progenitors) βζαηί αηνζαχξ εδνεφμοκ ζηδ ζηζαάδα ημο θθμζμφ πμο ανίζηεηαζ ζε επαθή ιε ηδκ πθάβζα ημζθία (ημνοθαία ζηζαάδα). Έπμοκ ηαοημπμζδεεί ηνεζξ δζαθμνεηζημί πθδεοζιμί ηέημζςκ ηοηηάνςκ (Δζηυκα 1.3). 1. Νεπξνεπηζειηαθά θύηηαξα (neuroepithelial cells). Ζ δζαδζηαζία ηδξ παναβςβήξ κεονχκςκ ζημκ εβηεθαθζηυ θθμζυ ηςκ ειανφςκ ημο ιουξ ανπίγεζ πενίπμο ηδκ 10 δ ειανοσηή διένα ηδξ ακάπηολήξ ημοξ (Δ10) ηαζ μθμηθδνχκεηαζ πενίπμο ηδκ 17 δ ειανοσηή διένα (Δ17). Πνζκ λεηζκήζεζ δ δζαδζηαζία αοηή, δδθαδή πνζκ ημ ζηάδζμ Δ10, αθθά ηαζ ηαηά ηα ανπζηά ζηάδζα αοηήξ, δ ημζθζαηή γχκδ απμηεθείηαζ απυ ημκ πνχημ πθδεοζιυ πνμβμκζηχκ ηοηηάνςκ, ηα κεονμεπζεδθζαηά ηφηηανα. Σα ηφηηανα αοηά ζηδκ μοζία απμηεθμφκ ημκ «ζδνοηζηυ πθδεοζιυ» ηςκ πενζζζμηένςκ δζαθμνμπμζδιέκςκ ηοηηάνςκ ημο ΚΝ, ζοιπενζθαιαακμιέκςκ ηςκ κεονχκςκ, αζηνμηοηηάνςκ ηαζ μθζβμδεκδνμηοηηάνςκ. Ακ ηαζ ηα κεονμεπζεδθζαηά ηφηηανα ζοκζζημφκ ιία γχκδ ηοηηάνςκ, εκ ημφημζξ ημ κεονμεπζεήθζμ πανμοζζάγεηαζ ρεοδμπμθφζηζαμ βζαηί μζ πονήκεξ ηςκ κεονμεπζεδθζαηχκ ηοηηάνςκ ιεηαηζκμφκηαζ ζε δζαθμνεηζηή εέζδ ημο ηοηηανμπθάζιαημξ ηαηά ιήημξ ημο ημνοθαίμο (δίπθα ζηδκ ημζθία)-ααζζημφ (πνμξ ηδκ ελςηενζηή επζθάκεζα ημο θθμζμφ) άλμκα ακάθμβα ιε ηδ θάζδ ημο ηοηηανζημφ ηφηθμο απυ ηδκ μπμία δζένπεηαζ ημ ηφηηανμ (interkinetic nuclear migration). Γζα ηδκ αηνίαεζα, μ πονήκαξ ηςκ ηοηηάνςκ αοηχκ ιεηακαζηεφεζ πνμξ ηδ ααζζηή επζθάκεζα ηαηά ηδκ G1 θάζδ ημο ηοηηανζημφ ηφηθμο, υπμο θαιαάκεζ πχνα δ S θάζδ, εκχ ζηδ ζοκέπεζα, ηαηά ηδκ G2 θάζδ, μ πονήκαξ ιεηακαζηεφεζ πίζς πνμξ ηδκ ημνοθή ημο κεονμεπζεδθίμο, υπμο ημ ηφηηανμ δζαζνείηαζ ηαηά ηδκ M θάζδ (Sauer and Walker, 1959; Takahashi et al., 1993). Σα κεονμεπζεδθζαηά ηφηηανα ειθακίγμοκ έκημκδ πμθζηυηδηα ηαηά ιήημξ ημο ημνοθαίμο-ααζζημφ άλμκα: βζα πανάδεζβια, δ δζαιειανακζηή πνςηεΐκδ prominin-1 (CD133) εκημπίγεηαζ απμηθεζζηζηά ζηδκ ημνοθαία επζθάκεζα ηδξ πθαζιαηζηήξ ιειανάκδξ (Weigmann et al., 1997), ζημ ημνοθαίμ ηιήια ηδξ πθάβζαξ επζθάκεζαξ ηδξ πθαζιαηζηήξ ιειανάκδξ οπάνπμοκ ζηεκμζφκδεζιμζ (tight junctions) ηαζ ζφκδεζιμζ πνυζδεζδξ (adherens junctions) (Aaku-Saraste et al., 1996; Manabe et al., 2002), εκχ ζηδ ααζζηή επζθάκεζα ηδξ πθαζιαηζηήξ ιειανάκδξ, πμο ένπεηαζ ζε επαθή ιε ημ ααζζηυ έθαζια (basal 19

20 Δζζαβςβή lamina), ανίζημκηαζ ζοβηεκηνςιέκμζ οπμδμπείξ βζα ηδκ πνςηεΐκδ integrin α 6 (Wodarz and Huttner, 2003). Δπζπνυζεεηα, ηα κεονμεπζεδθζαηά ηφηηανα δζαηδνμφκ απμθήλεζξ πμο ηα ζοκδέμοκ ηυζμ ιε ηδκ ημζθία υζμ ηαζ ιε ημ ααζζηυ έθαζια ιάθζζηα, είκαζ αλζμζδιείςημ υηζ δ ααζζηή απυθδλδ δζαηδνείηαζ αηυια ηαζ ηαηά ηδ θάζδ ηδξ ιίηςζδξ (Huttner and Brand, 1997; Miyata et al., 2001; Noctor et al., 2001; Wodarz and Huttner, 2003). Ο πθδεοζιυξ ηςκ κεονμεπζεδθζαηχκ ηοηηάνςκ ιπμνεί κα παναηηδνζζηεί απυ ηδκ έηθναζδ ζοβηεηνζιέκςκ πνςηεσκζηχκ δεζηηχκ, υπςξ βζα πανάδεζβια ηςκ πνςηεσκχκ ηςκ εκδζάιεζςκ ζκζδίςκ nestin ηαζ RC2 αθθά ηαζ ηδξ πνςηεΐκδξ occludin, ααζζηυ ζοζηαηζηυ ηςκ ζηεκμζοκδέζιςκ (Aaku-Saraste et al., 1996; Gotz and Barde, 2005; Gotz and Huttner, 2005; Malatesta et al., 2008). Καεχξ ηα κεονμεπζεδθζαηά ηφηηανα επζδεζηκφμοκ δζαζνέζεζξ αοημ-ακακέςζδξ, ακηζπνμζςπεφμοκ ημκ πνχημ πθδεοζιυ κεονζηχκ αθαζηζηχκ ηοηηάνςκ. Σα κεονμεπζεδθζαηά ηφηηανα ιεηαζπδιαηίγμκηαζ ζηδ ζοκέπεζα ζε δφμ κέμοξ πθδεοζιμφξ πνμβμκζηχκ κεονζηχκ ηοηηάνςκ, ηα ηφηηανα ηδξ αηηζκςηήξ βθμίαξ (radial glial cells) ηαζ ηα αναπέα πνυδνμια κεονζηά ηφηηανα (short neural precursors). 2. Κύηηαξα αθηηλωηήο γινίαο (radial glial cells). Σα ηφηηανα ηδξ αηηζκςηήξ βθμίαξ ανπζηά είπακ παναηηδνζζηεί ςξ ηφηηανα-μδδβμί βζα ηδ ιεηακάζηεοζδ ηςκ κεμζπδιαηζγυιεκςκ κεονχκςκ ζηδ ζςζηή ημοξ εέζδ ζηδ θθμζσηή πθάηα (Rakic, 1972). Δηηυξ απυ αοηυκ ημ νυθμ, μ πθδεοζιυξ ηδξ αηηζκςηήξ βθμίαξ επζδεζηκφεζ επζπθέμκ κεονμβεκεηζηυ παναηηήνα, ζοιιεηέπμκηαξ ζηδκ παναβςβή ηςκ κεονχκςκ ημο θθμζμφ (Malatesta et al., 2003; Anthony et al., 2004; Gotz and Barde, 2005). Σα ηφηηανα ηδξ αηηζκςηήξ βθμίαξ πανμοζζάγμοκ πμθθά απυ ηα παναηηδνζζηζηά ηςκ κεονμεπζεδθζαηχκ ηοηηάνςκ αθθά ηαζ ηάπμζα βκςνίζιαηα αζηνμβθμζαηχκ ηοηηάνςκ (Campbell and Gotz, 2002; Kriegstein and Gotz, 2003; Gotz and Barde, 2005). πςξ ηαζ ηα κεονμεπζεδθζαηά ηφηηανα, ηα ηφηηανα ηδξ αηηζκςηήξ βθμίαξ ειθακίγμοκ ιαηνζέξ απμθήλεζξ, μζ μπμίεξ αββζζηνχκμκηαζ ζημ ααζζηυ έθαζια ηαζ ηδκ πθάβζα ημζθία ηαζ δζαηδνμφκηαζ υζμ ηα ηφηηανα δζένπμκηαζ ηδξ ιίηςζδξ, εηθνάγμοκ ηάπμζμοξ ημζκμφξ πνςηεσκζημφξ δείηηεξ (υπςξ βζα πανάδεζβια ηζξ πνςηεΐκεξ nestin ηαζ RC2), υπςξ επίζδξ παναηηδνίγμκηαζ ηαζ απυ ημ θαζκυιεκμ ηδξ ιεηακάζηεοζδξ ημο πονήκα ημοξ ακάθμβα ιε ηδκ ελέθζλδ ημο ηοηηανζημφ ηφηθμο (Hartfuss et al., 2001; Miyata et al., 2001; Noctor et al., 2001; Gotz and Barde, 2005; Gotz and Huttner, 2005). Απυ ηδκ άθθδ ιενζά, εκχ ζηα κεονμεπζεδθζαηά ηφηηανα δ ιεηακάζηεοζδ ημο πονήκα ηαθφπηεζ υθμ ημ πθάημξ ημο θθμζμφ, ζηα ηφηηανα ηδξ αηηζκςηήξ βθμίαξ ημ θαζκυιεκμ πενζμνίγεηαζ εκηυξ ηςκ μνίςκ ηδξ ημζθζαηήξ γχκδξ. Δπίζδξ ηα ηφηηανα ηδξ αηηζκςηήξ βθμίαξ πάκμοκ ηάπμζα απυ ηα παναηηδνζζηζηά ηδξ έκημκδξ πμθζηυηδηαξ ηςκ κεονμεπζεδθζαηχκ ηοηηάνςκ: βζα πανάδεζβια, δζαηδνμφκ ηδκ έηθναζδ ηδξ πνςηεΐκδξ prominin-1 ζηδκ ημνοθαία επζθάκεζα ηδξ πθαζιαηζηήξ ιειανάκδξ αθθά δεκ ειθακίγμοκ ζηεκμζοκδέζιμοξ, ιε απμηέθεζια κα ιδκ εηθνάγμοκ ηδκ πνςηεΐκδ occludin (Aaku-Saraste et al., 1996; Gotz and Huttner, 2005). Σα παναηηδνζζηζηά πμο δ αηηζκςηή βθμία ιμζνάγεηαζ ιε ηα 20

21 Δζζαβςβή αζηνμβθμζαηά ηφηηανα είκαζ δ πανμοζία ελεζδζηεοιέκςκ πνςηεσκζηχκ δεζηηχκ υπςξ δ GLAST (astrocyte-specific glutamate transporter), δ Ca ++ -δεζιεουιεκδ πνςηεΐκδ S100α, δ GFAP (glial fibrillary acidic protein) ηαζ δ BLBP (brain-lipid-binding protein) (Kriegstein and Gotz, 2003; Gotz, 2003; Gotz and Huttner, 2005). H αοζηδνή πνμκζηή νφειζζδ ηδξ δζαθμνμπμίδζδξ ηςκ κεονμεπζεδθζαηχκ ηοηηάνςκ ζε ηφηηανα ηδξ αηηζκςηήξ βθμίαξ απμηεθεί ιζα πμθφ ζδιακηζηή δζαδζηαζία βζα ηδ θοζζμθμβζηή ακάπηολδ ημο εβηεθαθζημφ θθμζμφ, ζημκ έθεβπμ ηδξ μπμίαξ θαίκεηαζ κα ζοιιεηέπμοκ ζδιαημδμηζηά ιμκμπάηζα υπςξ ημ Notch ηαζ ημ FGF (Gaiano et al., 2000; Yoon et al., 2004; Sahara and O'Leary, 2009). Σα ηφηηανα ηδξ αηηζκςηήξ βθμίαξ αοημακακεχκμοκ ημκ πθδεοζιυ ημοξ ηαζ απμηεθμφκ ημκ ηονίανπμ πθδεοζιυ κεονζηχκ αθαζηζηχκ ηοηηάνςκ ηαηά ηδ κεονμβέκεζδ ημο θθμζμφ (Hartfuss et al., 2001). Δηθόλα 1.3. Πιεζπζκνί πξoγνληθώλ θπηηάξωλ ζηνλ αλαπηπζζόκελν θινηό. Α) Σα θνξπθαία πξνγνληθά θύηηαξα ηνπ θινηνύ (apical progenitors, APs) πεξηιακβάλνπλ ηα λεπξνεπηζειηαθά θύηηαξα (NE), ηα θύηηαξα ηεο αθηηλσηήο γινίαο (RGC) θαη ηα βξαρέα πξόδξνκα λεπξηθά θύηηαξα (SNP) θαη εληνπίδνληαη ζηελ θνηιηαθή δώλε (VZ). Οη πιεζπζκνί απηνί παξνπζηάδνπλ έληνλε πνιηθόηεηα, κεηαλάζηεπζε ηνπ ππξήλα ηνπο αλάινγα κε ηε θάζε ηνπ θπηηαξηθνύ θύθινπ θαη δηέξρνληαη από ηε θάζε ηεο κίησζεο πάληα ζηελ θνξπθαία επηθάλεηα ηνπ θινηνύ, δίπια ζηελ θνηιία. Αληίζεηα, ηα βαζηθά πξόδξνκα θύηηαξα (BP) δελ εκθαλίδνπλ πνιηθόηεηα, δηαηξνύληαη καθξηά από ηελ θνηιία θαη ζρεκαηίδνπλ ηελ ππνθνηιηαθή δώλε (SVZ). Β) Γελεαινγηθέο ζπζρεηίζεηο κεηαμύ ησλ δηαθόξσλ πιεζπζκώλ πξνγνληθώλ θπηηάξσλ θαη ησλ ζρεκαηηδόκελσλ λεπξώλσλ. (Από (Merot et al., 2009)). Πεζνάιαηα in vitro ηαζ in vivo έδεζλακ υηζ ηα πενζζζυηενα ηφηηανα αηηζκςηήξ βθμίαξ ιπμνμφκ κα δχζμοκ βέκεζδ ιειμκςιέκα είηε ζε κεονχκεξ είηε ζε ηφηηανα βθμίαξ, απμδεζηκφμκηαξ υηζ μ πθδεοζιυξ αοηυξ ακηζπνμζςπεφεζ έκακ ηφπμ 21

22 Δζζαβςβή πνμβμκζηχκ ηοηηάνςκ ιε πζμ πενζμνζζιέκμ ακαπηολζαηυ δοκαιζηυ απυ ηα κεονμεπζεδθζαηά ηφηηανα (Malatesta et al., 2000; Gotz et al., 2002; Malatesta et al., 2003; Pinto and Gotz, 2007). 3. Βξαρέα πξόδξνκα λεπξηθά θύηηαξα (short neural precursors). Δηηυξ απυ ηα ηφηηανα ηδξ αηηζκςηήξ βθμίαξ, πνυζθαηα πζζημπμζήεδηε υηζ δ ημζθζαηή γχκδ πενζθαιαάκεζ ηαζ ιζα άθθδ, δεοηενεφμοζα ηαηδβμνία πνμβμκζηχκ ηοηηάνςκ. Πνυηεζηαζ βζα ημκ πθδεοζιυ ηςκ αναπέςκ πνυδνμιςκ κεονζηχκ ηοηηάνςκ (Gal et al., 2006). Σα ηφηηανα αοηά δζαθένμοκ απυ ηα αηηζκςηά ηφηηανα ζημ υηζ δ ααζζηή ημοξ απυθδλδ δεκ θηάκεζ ιέπνζ ημ ααζζηυ έθαζια αθθά πενζμνίγεηαζ ιέζα ζηδκ ημζθζαηή γχκδ (Gal et al., 2006; Fish et al., 2008) ηαεχξ επίζδξ ηαζ ζημ υηζ πζζηεφεηαζ υηζ δίκμοκ βέκεζδ ιυκμ ζε κεονχκεξ (Sawamoto et al., 2001). Απυ ηδκ άθθδ ιενζά, ηα ηφηηανα αοηά ιμζνάγμκηαζ ιε ηα ηφηηανα ηδξ αηηζκςηήξ βθμίαξ ηα παναηηδνζζηζηά ηδκ ημνοθαίαξ-ααζζηήξ πμθζηυηδηαξ (ημοθάπζζημκ ζηδκ ημνοθαία επζθάκεζα ηδξ πθαζιαηζηήξ ιειανάκδξ), ηδξ πανμοζίαξ ζοκδέζιςκ πνυζδεζδξ ηαζ ηδξ ιεηακάζηεοζδξ ημο πονήκα ημοξ ζε ζοβηεηνζιέκδ εέζδ ημο ηοηηανμπθάζιαημξ ακάθμβα ιε ηδ θάζδ ημο ηοηηανζημφ ηφηθμο (Gal et al., 2006; Fish et al., 2008). Παν υθ αοηά, δ πνμέθεοζδ αοηχκ ηςκ πνυδνμιςκ ηοηηάνςκ δεκ έπεζ πθήνςξ απμζαθδκζζηεί αηυια Βαζηθά πξόδξνκα λεπξηθά θύηηαξα Δηηυξ απυ ηα πνμβμκζηά ηφηηανα ηδξ ημνοθαίαξ ημζθζαηήξ γχκδξ, οπάνπεζ ηαζ έκαξ δζαθμνεηζηυξ ηφπμξ πνμβμκζηχκ ηοηηάνςκ πμο δζαζνμφκηαζ ιαηνζά απυ ηδκ ημζθία ηαζ μκμιάγμκηαζ ααζζηά (basal) ή δζάιεζα (intermediate) πνυδνμια ηφηηανα (Δζηυκα 1.3). Σα ηφηηανα αοηά ειθακίγμκηαζ ιυθζξ ανπίζεζ δ κεονμβεκεηζηή δζαδζηαζία ημο θθμζμφ ηαζ πνμηφπημοκ απυ ηζξ δζαζνέζεζξ ηςκ πνμβμκζηχκ ημνοθαίςκ ηοηηάνςκ ηαζ πζμ ζοβηεηνζιέκα είηε απυ ηα κεονμεπζεδθζαηά είηε απυ ηα αηηζκςηά ηφηηανα. ηδ ζοκέπεζα, απμιαηνφκμκηαζ απυ ηδκ ημζθζαηή γχκδ ηαζ ζπδιαηίγμοκ ιζα δεφηενδ γχκδ πνυδνμιςκ ηοηηάνςκ ζηδ ααζζηή επζθάκεζα ηδξ ημζθζαηήξ γχκδξ, ηδκ οπμημζθζαηή γχκδ (Haubensak et al., 2004; Miyata et al., 2004; Noctor et al., 2004). Σα ααζζηά πνυδνμια ηφηηανα δζαθμνμπμζμφκηαζ πάκηα πνμξ δφμ κεονζηά ηφηηανα, εκζζπφμκηαξ ηαη αοηυκ ημκ ηνυπμ ημ κεονμβεκεηζηυ δοκαιζηυ ηςκ ημνοθαίςκ πνμβμκζηχκ ηοηηάνςκ (Noctor et al., 2004; Miyata et al., 2004; Haubensak et al., 2004). Σα ααζζηά πνυδνμια ηφηηανα δζαθένμοκ απυ ηα ηφηηανα ηδξ ημνοθαίαξ ζηζαάδαξ ζημ υηζ δεκ ειθακίγμοκ ημ θαζκυιεκμ ηδξ ελανηχιεκδξ απυ ηδ θάζδ ημο ηοηηανζημφ ηφηθμο ιεηακάζηεοζδξ ημο πονήκα ημοξ ηαεχξ ηαζ ζημ υηζ δεκ επζδεζηκφμοκ ηάπμζα ειθακή πμθζηυηδηα. Δπίζδξ, ηα ηφηηανα αοηά πάκμοκ ηζξ απμθήλεζξ ζφκδεζδξ ιε ηδκ ημνοθαία ηαζ ααζζηή επζθάκεζα ημο θθμζμφ (Miyata et al., 22

23 Δζζαβςβή 2004). Δπζπνυζεεηα, μζ δφμ ηαηδβμνίεξ πνμβμκζηχκ ηοηηάνςκ παναηηδνίγμκηαζ απυ δζαηνζηά ιεηαβναθζηά πνυηοπα: βζα πανάδεζβια, ηα ημνοθαία ηφηηανα εηθνάγμοκ ημ ιεηαβναθζηυ πανάβμκηα Pax6 εκχ ηα ααζζηά ηφηηανα εηθνάγμοκ ημ ιεηαβναθζηυ πανάβμκηα Tbr2 δ ζηαδζαηή ελαζεέκδζδ ηςκ επζπέδςκ έηθναζδξ ημο πανάβμκηα Pax6 ηαζ δ ηαοηυπνμκδ αφλδζδ ηςκ επζπέδςκ έηθναζδξ ημο πανάβμκηα Tbr2 ζδιαημδμηεί ηδκ ιεηάααζδ απυ ηδ ιία ηαηδβμνία πνυδνμιςκ ηοηηάνςκ ζηδκ άθθδ (Englund et al., 2005). Σα ααζζηά πνυδνμια ηφηηανα ζπάκζα οθίζηακηαζ αοηoακακεςηζηέξ δζαζνέζεζξ ηαεχξ ζοκήεςξ δζαθμνμπμζμφκηαζ αιέζςξ ζε κεονζηά ηφηηανα παν υθ αοηά, μ πθδεοζιυξ ημοξ είκαζ πενζζζυηενμ άθεμκμξ ζηα πνςηεφμκηα ζε ζπέζδ ιε ηα ηνςηηζηά, βεβμκυξ πμο πζεακχξ οπμζηδνίγεζ υηζ δ αοημακακέςζδ ηςκ ηοηηάνςκ αοηχκ είκαζ πζμ ζοπκή ζημοξ ακχηενμοξ ελεθζηηζηά μνβακζζιμφξ (Smart et al., 2002; Kriegstein et al., 2006; Rakic, 2009) Ο ηξόπνο δηαίξεζεο ησλ πξνγνληθώλ θπηηάξσλ ξπζκίδεη ην κέγεζνο ηνπ θινηνύ ημκ ακαπηοζζυιεκμ εβηεθαθζηυ θθμζυ έπμοκ πενζβναθεί δφμ ηφπμζ ηοηηανζηήξ δζαίνεζδξ. Πνζκ ηδκ έκανλδ ηδξ κεονμβεκεηζηήξ θάζδξ (δδθαδή πνζκ ημ ζηάδζμ Δ10), ηα πνμβμκζηά κεονζηά ηφηηανα ηδξ ημζθζαηήξ γχκδξ (κεονμεπζεδθζαηά ηφηηανα) δζαζνμφκηαζ πνςηίζηςξ ζοιιεηνζηά, δίκμκηαξ βέκεζδ ζε δφμ πακμιμζυηοπα εοβαηνζηά πνμβμκζηά ηφηηανα. Καη αοηυκ ημκ ηνυπμ αολάκεηαζ μ πθδεοζιυξ ηςκ κεονζηχκ αθαζηζηχκ ηοηηάνςκ ζημ ααειυ πμο εα δζαζθαθίγεζ υηζ δ «δελαιεκή» αοηή επανηεί χζηε κα ζπδιαηζζημφκ υθμζ μζ κεονχκεξ ημο θθμζμφ. Ο ζοιιεηνζηυξ ηφπμξ ηοηηανζηήξ δζαίνεζδξ έπεζ ζοζπεηζζηεί ιε ηδκ πθεονζηή δζεφνοκζδ ηςκ δζαθυνςκ πενζμπχκ ημο ακαπηοζζυιεκμο θθμζμφ (Gotz and Huttner, 2005). Μυθζξ ανπίζεζ δ δζαδζηαζία ηδξ κεονμβέκεζδξ ζημ θθμζυ (Δ10), ηα κεονμεπζεδθζαηά ηφηηανα αθθάγμοκ ηνυπμ δζαίνεζδξ ηαζ οζμεεημφκ έκακ αζφιιεηνμ ηφπμ δζαίνεζδξ, απυ ημκ μπμίμ πνμηφπημοκ δζαθμνεηζημί απυβμκμζ: ηφηηανα αηηζκςηήξ βθμίαξ, ααζζηά πνυδνμια ηφηηανα αθθά ηαζ δζαθμνμπμζδιέκα κεονζηά ηφηηανα. Σα ηφηηανα ηδξ αηηζκςηήξ βθμίαξ βνήβμνα βίκμκηαζ μ ηονίανπμξ πθδεοζιυξ ημνοθαίςκ κεονζηχκ αθαζηζηχκ ηοηηάνςκ ηαζ οθίζηακηαζ ηζξ θεβυιεκεξ αζφιιεηνεξ, αοημ-ακακεςηζηέξ δζαζνέζεζξ: μζ απυβμκμζ ηςκ δζαζνέζεςκ αοηχκ είκαζ είηε έκα ηφηηανμ αηηζκςηήξ βθμίαξ ηαζ έκα ααζζηυ πνυδνμιμ ηφηηανμ, είηε έκα ηφηηανμ αηηζκςηήξ βθμίαξ ηαζ έκα κεονζηυ ηφηηανμ. ε ακηίεεζδ ιε ημ ζοιιεηνζηυ ηνυπμ δζαίνεζδξ, μζ αζφιιεηνεξ δζαζνέζεζξ μδδβμφκ ζηδκ αηηζκςηή δζεφνοκζδ ημο θθμζμφ (Rakic, 1988). Σα ααζζηά πνυδνμια ηφηηανα δζαζνμφκηαζ ζημ ιεβαθφηενμ πμζμζηυ ημοξ (πενίπμο 90%) ιυκμ ιία θμνά ηαζ ζπεδυκ πάκηα ζοιιεηνζηά, ιε ηεθζηυ απμηέθεζια ηδκ παναβςβή δφμ κεονζηχκ ηοηηάνςκ (Noctor et al., 2004; Miyata et al., 2004; 23

24 Δζζαβςβή Haubensak et al., 2004). Πζμ ζπάκζα ημ απμηέθεζια ηδξ ζοιιεηνζηήξ ημοξ δζαίνεζδξ είκαζ δ αοημ-ακακέςζή ημοξ ιε ημ ζπδιαηζζιυ δφμ αηυια ααζζηχκ πνμβμκζηχκ ηοηηάνςκ, ηα μπμία ζηδ ζοκέπεζα εα δζαζνεεμφκ ζοιιεηνζηά πνμξ ζπδιαηζζιυ κεονχκςκ. Έηζζ, δ δζαηήνδζδ ημο πθδεοζιμφ ηςκ πνυδνμιςκ ηοηηάνςκ ηδξ οπμημζθζαηήξ γχκδξ ελανηάηαζ ζπεδυκ ελ μθμηθήνμο απυ ηζξ αζφιιεηνεξ δζαζνέζεζξ ηςκ ημνοθαίςκ κεονζηχκ αθαζηζηχκ ηοηηάνςκ (Δζηυκα 1.4). Ο ζοιιεηνζηυξ ηαζ αζφιιεηνμξ ηνυπμξ δζαίνεζδξ, εηηυξ απυ ηδκ παναβςβή δζαηνζηχκ απμβυκςκ, ζπεηίγεηαζ ηαζ ιε ηδκ έκημκδ πμθζηυηδηα πμο επζδεζηκφμοκ ηα ημνοθαία πνμβμκζηά ηφηηανα ηδξ ημζθζαηήξ γχκδξ ημο θθμζμφ. Ζ πμθζηυηδηα ηςκ ηοηηάνςκ αοηχκ ηαηά ημκ ημνοθαίμ-ααζζηυ άλμκα ημο θθμζμφ ηαζ μ πνμζακαημθζζιυξ ημο επζπέδμο ηδξ ιζηςηζηήξ αηνάηημο ηαηά ιήημξ αοημφ ημο άλμκα είκαζ απμθαζζζηζηήξ ζδιαζίαξ νοειζζηζημί ιδπακζζιμί βζα ηδκ ζζμννμπία ιεηαλφ ζοιιεηνζηήξ ηαζ αζφιιεηνδξ δζαίνεζδξ (Gotz and Huttner, 2005). Πζμ ζοβηεηνζιέκα, μ ηφπμξ ηδξ δζαίνεζδξ ελανηάηαζ απυ ημ επίπεδμ δζαίνεζδξ ημο ηοηηάνμο ηαζ πχξ αοηυ ηαηακέιεζ ηα ζοζηαηζηά ηδξ ημνοθαίαξ επζθάκεζαξ ηδξ πθαζιαηζηήξ ιειανάκδξ (πνςηεΐκεξ, ζφκδεζιμζ πνυζδεζδξ, ηιήιαηα ηδξ ημνοθαίαξ πθαζιαηζηήξ ιειανάκδξ) ζηα εοβαηνζηά ηφηηανα. ηακ ημ επίπεδμ δζαίνεζδξ ημο ηοηηάνμο είκαζ ηάεεημ πνμξ Δηθόλα 1.4. Σξόπνη δηαίξεζεο ηωλ πξνγνληθώλ θπηηάξωλ ζηνλ αλαπηπζζόκελν θινηό. ηα πξώηα ζηάδηα ηεο εκβξπνγέλεζεο ηνπ κπόο, ηα λεπξηθά πξνγνληθά θύηηαξα δηαηξνύληαη θπξίσο ζπκκεηξηθά γηα λα απμήζνπλ ηνλ πιεζπζκό ηνπο (symmetric, progenitor). Μόιηο αξρίζεη ε λεπξνγελεηηθή δηαδηθαζία ζην θινηό (ζηάδην Δ10) ηα θνξπθαία πξνγνληθά θύηηαξα δηαηξνύληαη θπξίσο αζύκκεηξα πξνο ζρεκαηηζκό ελόο νκνίνπ πξνγνληθνύ θπηηάξνπ κε ηελ ηαπηόρξνλε παξαγσγή ελόο λεπξώλα ή ελόο δηάκεζνπ πξόδξνκνπ θπηηάξνπ (asymmetric neurogenic/ip-genic). Σα δηάκεζα πξόδξνκα θύηηαξα δηαηξνύληαη πάληα ζπκκεηξηθά πξνο παξαγσγή δύν λεπξώλσλ (symmetric neurogenic). VZ, θνηιηαθή δώλε. SVZ, ππνθνηιηαθή δώλε. (Από (Noctor et al., 2008)). 24

25 Δζζαβςβή ηδκ επζθάκεζα ηδξ πθάβζαξ ημζθίαξ, δ ημνοθαία επζθάκεζα ηδξ πθαζιαηζηήξ ιειανάκδξ δζπμημιείηαζ ηαζ ηα ζοζηαηζηά ηδξ ηθδνμδμημφκηαζ ζζμιενχξ ιεηαλφ ηςκ εοβαηνζηχκ ηοηηάνςκ, βεβμκυξ πμο ζοιααίκεζ ζηζξ ζοιιεηνζηέξ δζαζνέζεζξ. Σμ ζημζπείμ αοηυ είκαζ εκηοπςζζαηυ ακ ακαθμβζζηεί ηακείξ υηζ ημ πμζμζηυ ηδξ ημνοθαίαξ ιειανάκδξ είκαζ ιυθζξ ημ 1-2% ηδξ ζοκμθζηήξ επζθάκεζαξ ηδξ πθαζιαηζηήξ ιειανάκδξ. Ακηίεεηα, ζηζξ αζφιιεηνεξ δζαζνέζεζξ, ημ επίπεδμ δζαίνεζδξ ηςκ ηοηηάνςκ είκαζ ηεηθζιέκμ ζε ζπέζδ ιε ηδκ επζθάκεζα ηδξ ημζθίαξ ηαζ παναηάιπηεζ ηα ηνίζζια ζοζηαηζηά ηδξ ημνοθαίαξ ιειανάκδξ, ιε απμηέθεζια αοηά κα ηαηακέιμκηαζ ακζζμιενχξ ζηα εοβαηνζηά ηφηηανα (Δζηυκα 1.5). πακζυηενεξ είκαζ μζ πενζπηχζεζξ μνζγυκηζμο επζπέδμο δζαίνεζδξ (πανάθθδθμο ιε ηδκ επζθάκεζα ηδξ ημζθίαξ), πμο ηαζ πάθζ μδδβεί ζε αζφιιεηνδ δζαίνεζδ (Kosodo et al., 2004; Gotz and Huttner, 2005). ε ηάεε πενίπηςζδ, μ έθεβπμξ ημο ηνυπμο δζαίνεζδξ ηςκ πνμβμκζηχκ ηοηηάνςκ ημο θθμζμφ (ζοιιεηνζηυξ έκακηζ αζφιιεηνμο) απμηεθεί ηνίζζιμ πανάβμκηα βζα ηδ ζςζηή ακάπηολδ ημο εβηεθαθζημφ θθμζμφ, υπςξ ακέδεζλακ πνυζθαηεξ ένεοκεξ μζ μπμίεξ ακαθένμοκ υηζ δ αφλδζδ ημο πμζμζημφ ηςκ πνμβμκζηχκ ηοηηάνςκ πμο επζδεζηκφμοκ ζοιιεηνζηέξ, πμθθαπθαζζαζηζηέξ δζαζνέζεζξ είπε ςξ απμηέθεζια ηδ ζδιακηζηή ιεβέεοκζδ ημο εβηεθαθζημφ θθμζμφ (Chenn and Walsh, 2002). Α. πκκεηξηθή, απηό-αλαλεσηηθή δηαίξεζε Β. Αζύκκεηξε, λεπξνγελεηηθή δηαίξεζε Κάεεημξ άλμκαξ δζαίνεζδξ Κάεεημξ άλμκαξ δζαίνεζδξ Βαζζημ-πθεονζηή ιειανάκδ φκδεζιμζ πνυζδεζδξ Κμνοθαία ιειανάκδ Δηθόλα 1.5. Σξόπνη δηαίξεζεο θαη πξνζαλαηνιηζκόο δηρνηόκεζεο ηωλ θνξπθαίωλ θπηηάξωλ. Α) Όηαλ ην επίπεδν δηαίξεζεο ηνπ θπηηάξνπ είλαη αθξηβώο θάζεην πξνο ηελ πιάγηα θνηιία, ηα ζπζηαηηθά ηεο θνξπθαίαο πιεπξάο ηζνθαηαλέκνληαη ζηα δύν ζπγαηξηθά θύηηαξα κε απνηέιεζκα ηηο ζπκκεηξηθέο, πνιιαπιαζηαζηηθέο δηαηξέζεηο. Β) Αληίζεηα, όηαλ ην επίπεδν δηαίξεζεο ηνπ πξόδξνκνπ θπηηάξνπ παξαθάκπηεη ηελ θνξπθαία επηθάλεηα, ηόηε απηή θιεξνλνκείηαη κόλν από ην έλα ζπγαηξηθό θύηηαξν θαη έηζη πξνθύπηεη αζύκκεηξε δηαίξεζε. (Σξνπνπνηεκέλν από (Gotz and Huttner, 2005)). 25

26 Δζζαβςβή 1.5. Ζ ξύζκηζε ησλ παξακέηξσλ ηνπ θπηηαξηθνύ θύθινπ ησλ πξνγνληθώλ θπηηάξσλ ηνπ εγθεθαιηθνύ θινηνύ ειέγρεη ηηο απνθάζεηο απην-αλαλέσζεο θαη δηαθνξνπνίεζεο Ζ ιεηάααζδ απυ ηα κεονμεπζεδθζαηά πνμβμκζηά ηφηηανα ζηα ηφηηανα ηδξ αηηζκςηήξ βθμίαξ ηαζ απυ ηζξ ζοιιεηνζηέξ δζαζνέζεζξ αοημ-ακακέςζδξ ζηζξ αζφιιεηνεξ δζαζνέζεζξ δζαθμνμπμίδζδξ ζοκμδεφεηαζ απυ ιζα αφλδζδ ζηδ δζάνηεζα ημο ηοηηανζημφ ηφηθμο ηςκ πνμβμκζηχκ κεονζηχκ ηοηηάνςκ (Takahashi et al., 1995). Ζ δζάνηεζα ημο ηοηηανζημφ ηφηθμο ηςκ πνμβμκζηχκ κεονζηχκ ηοηηάνςκ ηδξ ημζθζαηήξ γχκδξ ημο θθμζμφ αολάκεζ απυ 8 χνεξ ζηδκ ανπή ηδξ κεονμβέκεζδξ (Δ10) ιέπνζ 18 χνεξ ζημ ηέθμξ ηδξ (Δ17), βεβμκυξ πμο ζδιαίκεζ υηζ ηα κεονμεπζεδθζαηά ηφηηανα βεκζηά δζαζνμφκηαζ πμθφ βνήβμνα εκχ δ ιεηάααζή ημοξ ζηα ηφηηανα ηδξ αηηζκςηήξ βθμίαξ ζοιπίπηεζ ιε ιζα ζηαδζαηή ιείςζδ ημο νοειμφ πμθθαπθαζζαζιμφ ημοξ. Ζ αφλδζδ ηδξ δζάνηεζαξ ημο ηοηηανζημφ ημοξ ηφηθμο μθείθεηαζ απμηθεζζηζηά ζηδκ ζηαδζαηή επζιήηοκζδ ηδξ G1 θάζδξ ημο ηοηηανζημφ ηφηθμο, απυ 3 χνεξ ζηδκ ανπή ιέπνζ 13 χνεξ ζημ ηέθμξ ηδξ κεονμβέκεζδξ. Ζ πνυμδμξ ημο ηοηηανζημφ ηφηθμο εθέβπεηαζ απυ πμθθμφξ εεηζημφξ ηαζ ανκδηζημφξ νοειζζηέξ, ηονζυηενμζ απυ ημοξ μπμίμοξ είκαζ ηα ζφιπθμηα ηοηθζκχκηοηθζκμελανηχιεκςκ ηζκαζχκ (cdk/cyclin) ηαζ μζ ακαζημθείξ ημοξ (Δζηυκα 1.6) (Ohnuma and Harris, 2003; Dehay and Kennedy, 2007). Οζ ηοηθίκεξ εηθνάγμκηαζ πενζμδζηά ζε ζοβηεηνζιέκεξ θάζεζξ ημο ηοηηανζημφ ηφηθμο ηαζ εκενβμπμζμφκ ηζξ ακηίζημζπεξ cdk πνμηεζιέκμο κα επζηεοπεεί δ ιεηάααζδ ζηδκ επυιεκδ θάζδ ημο ηοηηανζημφ ηφηθμο. Απυ ηδκ άθθδ ιενζά, μζ ακαζημθείξ ηςκ cdk εθέβπμοκ ημ νοειυ ημο ηοηηανζημφ ηφηθμο ηαζ νοειίγμοκ ηδκ είζμδμ ηςκ ηοηηάνςκ ζηδ θάζδ δνειίαξ (G0), ιζα απυθαζδ πμο ζοκήεςξ θαιαάκεηαζ ηαηά ηδκ G1 θάζδ ημο ηφηθμο (Salomoni and Calegari, 2010). Ζ G1 θάζδ απμηεθεί έκα πμθφ ηνίζζιμ ζηάδζμ ημο ηοηηανζημφ ηφηθμο, ηαεχξ επζηνέπεζ ηδκ απυηνζζδ ηςκ ηοηηάνςκ ζηα δζάθμνα ελςηοηηάνζα ενεείζιαηα πμο επάβμοκ είηε ηδκ πνμχεδζδ εκυξ αηυια ηφηθμο ηοηηανζηήξ δζαίνεζδξ είηε ηδκ έλμδμ απυ ημκ ηοηηανζηυ ηφηθμ ηαζ ηδκ επζθμβή εκυξ ιμκμπαηζμφ δζαθμνμπμίδζδξ (Dehay and Kennedy, 2007). Καεχξ δ ζοκημκζζιέκδ επζιήηοκζδ ηδξ δζάνηεζαξ ημο ηοηηανζημφ ηφηθμο ακάθμβα ιε ηδκ ελέθζλδ ηδξ κεονμβεκεηζηήξ δζαδζηαζίαξ ζημ θθμζυ ζοιααδίγεζ ιε ημκ ειπθμοηζζιυ ηςκ κεονμβεκεηζηχκ πνυδνμιςκ ηοηηάνςκ ηαζ ημ πμζμζηυ ηςκ ζπδιαηζγυιεκςκ κεονχκςκ ζημ θθμζυ, ηέεδηε ημ ενχηδια ακ ημ θαζκυιεκμ ζοιααίκεζ μιμζμβεκχξ ζε υθα ηα πνμβμκζηά ηφηηανα ή ακ δ επζιήηοκζδ παναηδνείηαζ ζοβηεηνζιέκα ζηα πνυδνμια εηείκα ηφηηανα πμο εα δχζμοκ άιεζα κεονζημφξ απμβυκμοξ. Έπεζ πθέμκ απμζαθδκζζηεί υηζ, ακ ηαζ υθα ηα θθμζσηά πνμβμκζηά ηφηηανα επζιδηφκμοκ ηδκ G1 θάζδ ημοξ, ηα ηφηηανα εηείκα πμο έπμοκ δεζιεοηεί πνμξ κεονςκζηή δζαθμνμπμίδζδ ειθακίγμοκ G1 θάζδ αηυια ιεβαθφηενδξ δζάνηεζαξ, 26

27 Δζζαβςβή πενίπμο 50% ιεβαθφηενδ απυ ηα ζοκοπάνπμκηα πμθθαπθαζζαγυιεκα πνμβμκζηά ηφηηανα (Calegari et al., 2005). Δίκαζ επίζδξ αλζμζδιείςημ υηζ δ επζιήηοκζδ ηδξ G1 ΗΝΚ CDK ακαζημθείξ (p15, p16, p18, p19) KIP/CIP CDK ακαζημθείξ (p21, p27, p57) Δηθόλα 1.6. Ρύζκηζε ηνπ θπηηαξηθνύ θύθινπ. Βαζηθά ξπζκηζηηθά κόξηα ηνπ θπηηαξηθνύ θύθινπ απνηεινύλ νη θπθιηλνεμαξηώκελεο θηλάζεο (CDK) θαη νη θπθιίλεο πνπ ηηο ελεξγνπνηνύλ (cyclins). Οη δξάζεηο ησλ ζπκπιόθσλ θπθιηλώλ-θηλαζώλ πεξηνξίδνληαη ζε ζπγθεθξηκέλεο θάζεηο ηνπ θπηηαξηθνύ θύθινπ θαη δηαζθαιίδνπλ ηε ζσζηή κεηάβαζε κεηαμύ ησλ θάζεσλ ηνπ θύθινπ. Ζ ελεξγόηεηα ησλ CDK ξπζκίδεηαη από ηελ αιιειεπίδξαζή ηνπο κε ηα κέιε δύν νηθνγελεηώλ πξσηετληθώλ αλαζηνιέσλ, ηελ νηθνγέλεηα ΗΝΚ4, πνπ επηδεηθλύεη εμεηδηθεπκέλε δξάζε έλαληη ησλ CDK4 θαη CDK6, θαη ηελ νηθνγέλεηα KIP/CIP πνπ επηδεηθλύεη επξύηεξε αλαζηαιηηθή δξάζε. Ζ ζπληνληζκέλε έθθξαζε ησλ παξαπάλσ ζπκπιόθσλ απνηειεί θξίζηκν παξάγνληα γηα ηε ξύζκηζε ησλ πξνγνληθώλ θπηηάξσλ ηνπ θινηνύ. (Σξνπνπνηεκέλν από (Dehay and Kennedy, 2007)). θάζδξ ηςκ πνμβμκζηχκ ηοηηάνςκ δεκ είκαζ δεοηενμβεκήξ απυννμζα ηδξ αθθαβήξ ηδξ ιμίναξ ηςκ ηοηηάνςκ απυ ημ κα δίκμοκ απμβυκμοξ πμο είκαζ επίζδξ αδζαθμνμπμίδηα ηφηηανα ζημ κα ζπδιαηίγμοκ κεονζηά, δζαθμνμπμζδιέκα ηφηηανα, αθθά ακηίεεηα δνα ςξ ενέεζζια βζα ηδ κεονςκζηή δζαθμνμπμίδζδ ηςκ παναπάκς ηοηηάνςκ (Calegari and Huttner, 2003; Glickstein et al., 2009; Lange et al., 2009; Pilaz et al., 2009). Πνυζθαηα δεδμιέκα ακαδεζηκφμοκ ημκ ηνίζζιμ νυθμ ηςκ ζοιπθυηςκ cycline/cdk2 ηαζ cyclind/cdk4 ζηδ νφειζζδ ηδξ δζάνηεζαξ ηδξ G1 θάζδξ, ηαεχξ δ οπενέηθναζδ ηςκ παναπάκς ζοιπθυηςκ μδδβεί ζε ιείςζδ ηδξ δζάνηεζαξ ηδξ G1 θάζδξ εκχ δ 27

28 Δζζαβςβή ακαζημθή ημοξ θένεζ ημ ακηίεεημ απμηέθεζια (Calegari and Huttner, 2003; Lange et al., 2009; Pilaz et al., 2009). Γζα κα ελδβδεεί πχξ δ δζάνηεζα ηδξ G1 θάζδξ επδνεάγεζ ηδ δζαθμνμπμίδζδ ηςκ πνμβμκζηχκ κεονζηχκ ηοηηάνςκ, πνμηάεδηε δ θεβυιεκδ «οπυεεζδ ηδξ δζάνηεζαξ ημο ηοηηανζημφ ηφηθμο (cell cycle length hypothesis)» (Δζηυκα 1.7). Ζ εεςνία αοηή πνμηείκεζ υηζ δ ζηακυηδηα ηςκ ηαεμνζζηζηχκ ιμνίςκ εθέβπμο ηςκ πνμβμκζηχκ ηοηηάνςκ κα πνμηαθέζμοκ ιζα αζμθμβζηή δνάζδ ελανηάηαζ απυ ημ πνμκζηυ δζάζηδια πμο δίκεηαζ ζε αοηά ηα ιυνζα βζα κα δνάζμοκ, εκχ επίζδξ πνμαθέπεζ ηαζ ημ ζοιιεηνζηυ ή αζφιιεηνμ ηνυπμ δζαίνεζδξ (Calegari and Huttner, 2003). Ακ μ νοειυξ ηοηηανζηήξ δζαίνεζδξ είκαζ πμθφ βνήβμνμξ ηαζ επμιέκςξ δ δζάνηεζα ημο ηοηηανζημφ Δηθόλα 1.7. Η «ππόζεζε ηεο δηάξθεηαο ηνπ θπηηαξηθνύ θύθινπ». Ζ ηαρύηεηα ηεο G1 θάζεο ηνπ θπηηαξηθνύ θύθινπ (ηεηκεκέλε) θαζνξίδεη ηε δξαζηηθόηεηα ελόο παξάγνληα θαζνξηζκνύ ηεο λεπξηθήο κνίξαο (ηεηαγκέλε). Ζ δξάζε ελόο παξάγνληα ζα είλαη ηόζν εληνλόηεξε όζν πην βξαδύο είλαη ν θπηηαξηθόο θύθινο, κε απνηέιεζκα ηελ παξαγσγή δύν λεπξώλσλ (θόθθηλν) θαη ηελ εμάληιεζε ησλ πξόδξνκσλ θπηηάξσλ. Δλδηάκεζε ηαρύηεηα ηνπ θπηηαξηθνύ θύθινπ ζα επηηξέςεη ηελ γέλεζε ελόο θνξπθαίνπ πξόδξνκνπ θπηηάξνπ (πξάζηλν) (απην-αλαλέσζε) καδί είηε κε έλα βαζηθό πξόδξνκν θύηηαξν (θίηξηλν) είηε κε έλα λεπξηθό θύηηαξν. Σέινο, έλαο γξήγνξνο ξπζκόο θπηηαξηθνύ πνιιαπιαζηαζκνύ ζα νδεγήζεη ζε ζπκκεηξηθέο δηαηξέζεηο ζρεκαηηζκνύ δύν πξόδξνκσλ θπηηάξσλ. Όηαλ ηα θύηηαξα βξίζθνληαη ζε εξεκία νη ελ ιόγσ παξάγνληεο δελ δξνπλ, κε απνηέιεζκα ηε δηαηήξεζε ηνπ πιεζπζκνύ ησλ πξόδξνκσλ θπηηάξσλ. (Από (Salomoni and Calegari, 2010)). 28

29 Δζζαβςβή ηφηθμο είκαζ πμθφ ιζηνή, ηυηε έκαξ νοειζζηζηυξ πανάβμκηαξ πμο βζα πανάδεζβια πνμςεεί ηδ κεονςκζηή δζαθμνμπμίδζδ δεκ έπεζ ανηεηυ πνυκμ ζηδ δζάεεζή ημο βζα κα δνάζεζ ηαζ επμιέκςξ ηα δφμ εοβαηνζηά ηφηηανα εα πνμηφρμοκ απυ ζοιιεηνζηή δζαίνεζδ ηαζ εα παναιείκμοκ αδζαθμνμπμίδηα, πνυδνμια ηφηηανα. Ακ μ ηοηηανζηυξ ηφηθμξ έπεζ θίβμ ιεβαθφηενδ δζάνηεζα χζηε μ νοειζζηζηυξ πανάβμκηαξ κα έπεζ ανηεηυ πνυκμ βζα κα δνάζεζ ιυκμ ζημ έκα εοβαηνζηυ ηφηηανμ, ηυηε εα πνμηφρεζ ιζα αζφιιεηνδ δζαίνεζδ δ μπμία εα δχζεζ βέκεζδ ζε έκα πνμβμκζηυ ηφηηανμ ηδξ ημζθζαηήξ γχκδξ ιαγί ιε έκα ααζζηυ πνυδνμιμ ηφηηανμ ή έκα δζαθμνμπμζδιέκμ κεονχκα. Ακ δ δζάνηεζα ημο ηοηηανζημφ ηφηθμο είκαζ αηυια ιεβαθφηενδ, ηυηε μ νοειζζηζηυξ πανάβμκηαξ εα δνάζεζ ηαζ ζηα δφμ εοβαηνζηά ηφηηανα ιεηαηνέπμκηάξ ηα ζοιιεηνζηά ζε κεονχκεξ (Δζηυκα 1.7). Έπεζ ανεεεί υηζ οπάνπεζ ζοζπέηζζδ ιεηαλφ ηδξ δζάνηεζαξ ημο ηοηηανζημφ ηφηθμο ηαζ ημο ηαεμνζζιμφ ηςκ επζιένμοξ ηφπςκ πνμαάθθμκηςκ κεονχκςκ ημο θθμζμφ (Δζηυκα 1.8). Ο νοειυξ αφλδζδξ ηδξ G1 θάζδξ ιε ηδκ πάνμδμ ηάεε ηοηηανζημφ ηφηθμο δεκ αημθμοεεί εηεεηζηή αθθά «S-shaped» ηαηακμιή (Takahashi et al., 1995; Miyama et al., 1997), ιε ηδ βνδβμνυηενδ άκμδμ ηδξ ηαιπφθδξ κα ακηζζημζπεί ζημ πνυκμ ζπδιαηζζιμφ ηςκ πενζζζυηενμ ζφκεεηςκ κεονχκςκ ηςκ ζηζαάδςκ V-III ημο θθμζμφ. ε αοηυ ημ πνμκζηυ πανάεονμ δ δζάνηεζα ηδξ G1 θάζδξ επζδεζηκφεζ ιζα απυημιδ, εεαιαηζηή αφλδζδ, απυ 3.3 χνεξ ζε 11.8 χνεξ, πμο ζοζπεηίγεηαζ ιε ημ πενζζζυηενμ πμθφπθμημ πνςηεσκζηυ «θμνηίμ» πμο πνμτπμεέημοκ μζ κεονχκεξ ηςκ ζηζαάδςκ αοηχκ. Ακηίεεηα, μζ θάζεζξ ηδξ ηαιπφθδξ νοειμφ ηδξ G1 πνζκ ηαζ ιεηά απυ ημ ιεζαίμ, βνήβμνμ ηιήια είκαζ ζπεδυκ βναιιζηέξ ηαζ ακηζπνμζςπεφμοκ ιζηνυ νοειυ αφλδζδξ ηδξ G1 πμο ακαθένεηαζ ζημοξ πζμ απθμφξ ηαζ μιμζμβεκείξ πθδεοζιμφξ κεονχκςκ ηςκ ζηζαάδςκ VI ηαζ III/II ακηίζημζπα (Takahashi et al., 1999; Caviness et al., 2009). Άπαλ ηαζ μθμηθδνςεεί μ πνμηαεμνζζιυξ ηςκ πνυδνμιςκ κεονζηχκ ηοηηάνςκ πνμξ ζοβηεηνζιέκμ κεονςκζηυ ηφπμ, πνέπεζ ζηδ ζοκέπεζα κα επζηεοπεεί δ απμδέζιεοζή ημοξ απυ ηδ δζαδζηαζία ηοηηανζημφ πμθθαπθαζζαζιμφ, ηάηζ πμο ζοκήεςξ πενζθαιαάκεζ ηδ δνάζδ ιδπακζζιχκ πμο ζηαιαημφκ ηδκ ελέθζλδ ημο ηοηηανζημφ ηφηθμο ζημ ζδιείμ εθέβπμο ηδξ G1 θάζδξ. Ο πζμ ιεθεηδιέκμξ νοειζζηήξ ημο ηοηηανζημφ ηφηθμο ζημκ ακαπηοζζυιεκμ θθμζυ απμηεθεί μ ακαζημθέαξ ηςκ ηοηθζκμελανηχιεκςκ ηζκαζχκ p27 Kip1. Ο πανάβμκηαξ αοηυξ δζεοημθφκεζ ηδκ έλμδμ απυ ημκ ηοηηανζηυ ηφηθμ ακαζηέθθμκηαξ ημ ζφιπθμημ cycline/cdk2, πμο νοειίγεζ ηδ ιεηάααζδ απυ ηδ θάζδ G1 ζηδ θάζδ S (Sherr and Roberts, 1999; Cheng et al., 1999). Σα επίπεδα έηθναζδξ ημο ακαζημθέα p27 Kip1 αολάκμκηαζ ζηα ηφηηανα ηδξ ημζθζαηήξ γχκδξ ιε ηδκ πάνμδμ ηάεε ηοηηανζημφ ηφηθμο ηαζ ζοζπεηίγμκηαζ ιε ηδκ αφλδζδ ηδξ παναβςβήξ κεονζηχκ δζαθμνμπμζδιέκςκ ηοηηάνςκ (Tarui et al., 2005; Nguyen et al., 2006). Δίκαζ ειθακέξ υηζ δ ζςζηή νφειζζδ ημο ηοηηανζημφ ηφηθμο απμηεθεί ηδ αάζδ βζα ηδκ επζηοπδιέκδ μθμηθήνςζδ ηδξ κεονμβεκεηζηήξ δζαδζηαζίαξ ζημ θθμζυ. 29

30 Δζζαβςβή Δηθόλα 1.8. πζρέηηζε θπηηαξηθνύ θύθινπ θαη ηύπνπ παξαγόκελνπ λεπξηθνύ θπηηάξνπ. Καηά ηε δηάξθεηα ηεο λεπξνγέλεζεο ζην θινηό ππάξρεη αδξά ρξόλνο γηα λα νινθιεξσζνύλ πεξίπνπ 11 θπηηαξηθνί θύθινη. Ζ αύμεζε ζηε δηάξθεηα ηεο G1 θάζεο δηαδξακαηίδεηαη ζε ηξεηο θάζεηο: ε πξώηε θάζε πεξηιακβάλεη ηνπο θύθινπο 1-3 θαη επηδεηθλύεη αξγή επηηάρπλζε ηεο G1. Σν ίδην αξγά απμάλεηαη ε δηάξθεηα ηεο G1 θάζεο θαη θαηά ηελ ηξίηε θάζε πνπ πεξηιακβάλεη ηνπο θύθινπο Αληίζεηα, ζηε κεζαία θάζε, πνπ πεξηιακβάλεη ηνπο θύθινπο 4-9, παξαηεξείηαη κηα εληππσζηαθή αύμεζε ζηε δηάξθεηα ηεο G1 θάζεο, από 3.3 ώξεο ζε 11.8 ώξεο. Δίλαη αμηνζεκείσην όηη απηή ε δξαζηηθή αύμεζε ζηε δηάξθεηα ηεο G1 θάζεο ζπκπίπηεη κε ηελ παξαγσγή ησλ πην πνιύπινθσλ λεπξσληθώλ ηύπσλ πξνβάιινλησλ λεπξώλσλ. (Από (Caviness et al., 2009)) Μνξηαθά κνλνπάηηα ξύζκηζεο ησλ λεπξηθώλ πξνγνληθώλ θπηηάξσλ Μέπνζ ζήιενα έπεζ ηαοημπμζδεεί έκαξ ιεβάθμξ ανζειυξ ιμνζαηχκ ζδιαημδμηζηχκ ιμκμπαηζχκ πμο δζεκενβμφκ ηα βεβμκυηα ηδξ δζαδζηαζίαξ ηδξ κεονμβέκεζδξ. Σα ιμκμπάηζα αοηά δζαιεζμθααμφκ πμθθαπθά ζηάδζα ηδξ δζαδζηαζίαξ ζπδιαηζζιμφ ημο εβηεθαθζημφ θθμζμφ, υπςξ ηδκ αοημ-ακακέςζδ ημο πθδεοζιμφ ηςκ κεονζηχκ ζηεθεπζαίςκ ηοηηάνςκ, ηδ ιεηάααζδ απυ ημκ έκακ ηφπμ πνμβμκζηχκ ηοηηάνςκ ζημκ επυιεκμ, ηδ δέζιεοζδ (commitment) εκυξ πνυδνμιμο ηοηηάνμο πνμξ δζαθμνμπμίδζδ ζε ηφηηανα ιζαξ ζοβηεηνζιέκδξ κεονζηήξ ζεζνάξ ηαζ ημκ ηαεμνζζιυ ημο κεονςκζημφ οπμηφπμο πνμξ ημκ μπμίμ εα ελεθζπεεί μ κεμζπδιαηζγυιεκμξ κεονχκαξ. Πνυηεζηαζ βζα έκα πμθοδζάζηαημ θαζκυιεκμ, υπμο δ νφειζζδ ηςκ 30

31 Δζζαβςβή επζιένμοξ βεβμκυηςκ ζοπκά ελανηάηαζ απυ αθθδθεπζδνάζεζξ ιεηαλφ ηςκ δζαθμνεηζηχκ ζδιαημδμηζηχκ ιμκμπαηζχκ. Κάεε πενζμπή ημο θθμζμφ, θυβς ηδξ δζαααειζζιέκδξ έηθναζδξ ηςκ πνμακαθενεέκηςκ ιμνθμβεκεηζηχκ παναβυκηςκ ηαζ ζδιαημδμηζηχκ ιμκμπαηζχκ, ακηζπνμζςπεφεηαζ απυ ιζα ιμκαδζηή ηζιή αοηχκ ηςκ νοειζζηζηχκ ιμνίςκ, δ μπμία πθδνμθμνεί ηα πανυκηα ηφηηανα ηαζ εθέβπεζ ηδ δζαθμνμπμίδζή ημοξ. Έπμοκ πνμηαεεί δφμ ααζζηά ιμκηέθα βζα ημοξ ηοηηανζημφξ ηαζ ιμνζαημφξ ιδπακζζιμφξ πμο εθέβπμοκ ηδκ ακάπηολδ ηαζ ζπδιαημπμίδζδ ημο εβηεθαθζημφ θθμζμφ. Σμ ιμκηέθμ ημο πνςημπάνηδ (protomap) αλζχκεζ υηζ δ ζπδιαημπμίδζδ ημο κεμθθμζμφ εθέβπεηαζ απυ ιμνζαημφξ ηαεμνζζηζημφξ πανάβμκηεξ πμο είκαζ εββεκείξ ηςκ ηοηηάνςκ ηςκ κεονμβεκεηζηχκ ζηζαάδςκ ημο θθμζμφ. Καεχξ ηα πνμβμκζηά αοηά ηφηηανα εκημπίγμκηαζ ζε δζαθμνεηζηέξ εέζεζξ ηαηά ιήημξ ημο πνυζεζμο-μπίζεζμο ηαζ ημο ναπζαίμ-ημζθζαημφ άλμκα, ιεηαθένμοκ ηα ηαεμνζζηζηά ιμνζαηά ζήιαηα ζημοξ κεονζημφξ απμβυκμοξ ημοξ πμο ανίζημκηαζ ζηδκ ίδζα πενζμπή (Rakic, 1988). φιθςκα ιε ημ δεφηενμ ιμκηέθμ, ημ ιμκηέθμ ημο πνςημθθμζμφ (protocortex), κεονζηέξ χζεζξ πνμενπυιεκεξ απυ ημκ εάθαιμ ιεηαθένμοκ ηζξ πθδνμθμνίεξ πμο δζαιενζζιαημπμζμφκ ημκ ηαηά ηα άθθα μιμζμβεκή θθμζυ (O'Leary, 1989). Νευηενα δεδμιέκα ζοκδέμοκ ηα δφμ ιμκηέθα ηαζ είκαζ πθέμκ απμδεηηυ υηζ δ ζπδιαημπμίδζδ ημο θθμζμφ ακαθένεηαζ ζε έκακ ηαηαννάηηδ ακαπηολζαηχκ βεβμκυηςκ πμο μθμηθδνχκεηαζ ζε δφμ θάζεζξ: δ πνχηδ θάζδ ζοιααίκεζ πνζκ ημκ ενπμιυ ηςκ κεοναλυκςκ απυ ημκ εάθαιμ, ηαηά ηδκ μπμία δ ζπδιαημπμίδζδ ημο θθμζμφ μθμηθδνχκεηαζ απυ εββεκείξ πθδνμθμνίεξ ηςκ θθμζσηχκ ηοηηάνςκ, εκχ ιεηά ηδκ άθζλδ ηςκ εαθαιζηχκ πνμαμθχκ ζημ θθμζυ (πενίπμο απυ ηδκ ειανοσηή ιένα Δ13.5 ηαζ ιεηά ζημκ ιο), δ δζαιενζζιαημπμίδζδ ημο θθμζμφ ηεθεζμπμζείηαζ ιε αάζδ ηζξ ελςβεκείξ αοηέξ πθδνμθμνίεξ (Sur and Rubenstein, 2005; Mallamaci and Stoykova, 2006). Γφμ ααζζημί ηφπμζ ιμνίςκ εεςνείηαζ υηζ δζαδναιαηίγμοκ ηνίζζιμ νυθμ βζα ηδκ πνχζιδ ζπδιαημπμίδζδ ημο θθμζμφ: πνχημκ, δ ζδιαημδυηδζδ πμο πνμένπεηαζ απυ εηηνζκυιεκμοξ πανάβμκηεξ ηαζ δεφηενμκ, δ ζδιαημδυηδζδ πμο πνμένπεηαζ απυ ιεηαβναθζημφξ πανάβμκηεξ, μζ μπμίμζ παναηηδνίγμοκ ηα πνμβμκζηά κεονζηά ηφηηανα ημο θθμζμφ ηαζ ζοκήεςξ ειθακίγμοκ δζαααειίζεζξ ζημ πνυηοπμ έηθναζήξ ημοξ ηαηά ιήημξ ηςκ κεονμβεκεηζηχκ ζηζαάδςκ ημο θθμζμφ. Οζ εηηνζκυιεκμζ πανάβμκηεξ δζαπέμκηαζ ζημκ εβηεθαθζηυ θθμζυ ηαζ απμζημδμιμφκηαζ ιε δζαθμνεηζηέξ ηζκδηζηέξ, δδιζμονβχκηαξ έηζζ ηαζ δζαθμνεηζηέξ ααειίδεξ ζοβηέκηνςζδξ. Δπζπθέμκ, δ ζδιαημδυηδζδ απυ αοημφξ ημοξ εηηνζκυιεκμοξ πανάβμκηεξ νοειίγεζ ηδκ έηθναζδ ηςκ βμκζδίςκ ηςκ ιεηαβναθζηχκ παναβυκηςκ ημο θθμζμφ ηαηά ηνυπμ ελανηχιεκμ απυ ηδ ααειίδςζδ ζοβηέκηνςζήξ ημοξ, εκζζπφμκηαξ έηζζ ηδ δζααάειζζδ ηδξ έηθναζήξ ημοξ. Σέθμξ, δ δζαααειζζιέκδ ηαζ πανμδζηή έηθναζδ ηςκ ιεηαβναθζηχκ αοηχκ παναβυκηςκ εα ηςδζημπμζήζεζ ηζξ δζαηνζηέξ ημπμβναθζηέξ ηαοηυηδηεξ ημο εβηεθαθζημφ θθμζμφ (O'Leary and Nakagawa, 2002; Mallamaci and Stoykova, 2006). 31

32 Δζζαβςβή εκαηνδόηεζε από εθθξηηηθά κνλνπάηηα Οζ ζδιαημδμηζημί πανάβμκηεξ εηηνίκμκηαζ βφνς απυ ηνεζξ δζαθμνεηζηέξ πενζμπέξ: 1) ημ θθμζσηυ πείθμξ (cortical hem), πμο ανίζηεηαζ ιεηαλφ ημο θθμζμφ ηαζ ηδξ πενζμπήξ ημο πμνζμεζδμφξ πθέβιαημξ (choroid plexus), 2) ηδκ ζοκδεζιζηή πθάηα (commissural plate), ζημκ ειπνυζεζμ-ιεζαίμ πυθμ ημο ηεθεβηεθάθμο ηαζ 3) ημ θθμζσηυ ακηζ-πείθμξ (cortical antihem), πμο ζπδιαηίγεηαζ ζημ ζφκμνμ πζηςκίμοοπμπζηςκίμο (Δζηυκα 1.9). Σα ααζζηά ζδιαημδμηζηά εηηνζηζηά ιμκμπάηζα πμο ειπθέημκηαζ ζηδ νφειζζδ ηδξ ζοιπενζθμνάξ ηςκ πνμβμκζηχκ κεονζηχκ ηοηηάνςκ ημο θθμζμφ ηαζ ηδξ πμνείαξ ηδξ κεονμβέκεζδξ είκαζ ηα ελήξ: 1. Wingless-int (Wnt) ζεκαηνδνηηθό κνλνπάηη. Απυ ηδκ ειανοσηή διένα ακάπηολδξ Δ10.5 ζημκ ιο, ημ θθμζσηυ πείθμξ (cortical hem) απμηεθεί πδβή ηςκ εηηνζκυιεκςκ πνςηεσκχκ ηδξ μζημβέκεζαξ Wnt (Wnt2b, 3a, 5a, 7b, 8b) (Lee et al., 2000; Mallamaci and Stoykova, 2006) ηαζ ζοιιεηέπεζ ζημκ έθεβπμ ηδξ ζπδιαημπμίδζδξ δμιχκ ημο ιέζμο ηαζ ναπζαίμο πζηχκζμο υπςξ μ ζππυηαιπμξ, μ κεμθθμζυξ ηαζ ημ πμνζμεζδέξ πθέβια (choroid plexus) (Grove et al., 1998). H ζδιαημδυηδζδ ηςκ Wnt πνςηεσκχκ είκαζ επίζδξ ακαβηαία βζα κα ηαηαζηείθεζ ηα ημζθζαηά ηοηηανζηά παναηηδνζζηζηά ηαζ κα ηαεζενχζεζ ιζα απυθοηα ναπζαία ιμνζαηή ηαοηυηδηα, πζεακυηαηα ζε ζοκενβαζία ιε ημ FGF ζδιαημδμηζηυ ιμκμπάηζ (Backman et al., 2005). Ζ ζδιαημδυηδζδ ιέζς ημο Wnt ιμκμπαηζμφ επίζδξ ηαηέπεζ ηεκηνζηυ νυθμ ζηδ νφειζζδ ηδξ δναζηδνζυηδηαξ ηςκ αθαζηζηχκ κεονζηχκ ηοηηάνςκ. Ζ πνυζδεζδ ηςκ Wnt πνςηεσκχκ ζημοξ επζθακεζαημφξ οπμδμπείξ ημοξ, πμο ακήημοκ ζηδκ μζημβέκεζα ηςκ Frizzled (Fz) πνςηεσκχκ, έπεζ ςξ απμηέθεζια ηδ ιείςζδ ηδξ εκενβυηδηαξ ηδξ ηζκάζδξ GSK-3α (glycogen synthase kinase) (Cook et al., 1996), δ μπμία θοζζμθμβζηά θςζθμνοθζχκεζ ηδκ πνςηεΐκδ α-ηαηεκίκδ ηαζ ηδκ μδδβεί πνμξ απμζημδυιδζδ. Σμ βεβμκυξ αοηυ έπεζ ςξ απμηέθεζια δ α-ηαηεκίκδ κα ζοζζςνεφεηαζ ζημ ηοηηανυπθαζια, κα ζπδιαηίγεζ ζφιπθμηα ιε ημοξ ιεηαβναθζημφξ πανάβμκηεξ Lef/Tcf ηαζ κα εζζένπεηαζ ζημκ πονήκα βζα κα νοειίζεζ ηδ ιεηαβναθή ηςκ βμκζδίςκ ζηυπςκ (Willert and Nusse, 1998). Δίκαζ αλζμζδιείςημ υηζ ζημκ ακαπηοζζυιεκμ εβηεθαθζηυ θθμζυ ημ Wnt/αcatenin ιμκμπάηζ ειπθέηεηαζ ζηδ εεηζηή νφειζζδ ηυζμ ηδξ επζαίςζδξ ηαζ αοημακακέςζδξ ηςκ κεονζηχκ αθαζηζηχκ ηοηηάνςκ υζμ ηαζ ηδξ κεονςκζηήξ δζαθμνμπμίδζήξ ημοξ (Chenn and Walsh, 2002; Hirabayashi et al., 2004). Ζ δζαθμνζηή αοηή απυηνζζδ ηςκ πνμβμκζηχκ κεονζηχκ ηοηηάνςκ ζηδ Wnt/α-catenin ζδιαημδυηδζδ θαίκεηαζ κα νοειίγεηαζ πνμκζηά, δδθαδή ελανηάηαζ απυ ημ πυηε ηα ζδιαημδμηζηά ιυνζα εηθνάγμκηαζ ζημ θθμζυ (Hirabayashi and Gotoh, 2005). Πζμ ζοβηεηνζιέκα, έηθναζδ ζηα ανπζηά ζηάδζα ηδξ κεονμβέκεζδξ επάβεζ ημκ πμθθαπθαζζαζιυ ηςκ αθαζηζηχκ ηοηηάνςκ, εκχ έηθναζδ ζηα ηεθεοηαία αήιαηα ηδξ δζαδζηαζίαξ πνμςεεί ηδκ ηεθζηή δζαθμνμπμίδζδ. ημ θαζκυιεκμ υιςξ αοηυ ηδξ 32

33 Δζζαβςβή δζαθμνεηζηήξ δνάζδξ ημο Wnt/α-catenin ιμκμπαηζμφ ζε δζαθμνεηζηά αζμθμβζηά πθαίζζα θαίκεηαζ κα ειπθέηεηαζ ηαζ ημ FGF ζδιαημδμηζηυ ιμκμπάηζ, ηαεχξ ανέεδηε υηζ δ δνάζδ πμο αζηεί ηεθζηά δ α-ηαηεκίκδ ηαεμνίγεηαζ απυ ηδκ πανμοζία ή απμοζία ημο πανάβμκηα FGF (Israsena et al., 2004). Με άθθα θυβζα, δ αθθδθεπίδναζδ ηςκ δφμ ιμκμπαηζχκ πανέπεζ έκα δζαηυπηδ πμο νοειίγεζ ημ πέναζια απυ ηδ θάζδ πμθθαπθαζζαζιμφ, πανμοζία FGF, ζημ ζηάδζμ ηδξ ηεθζηήξ κεονςκζηήξ δζαθμνμπμίδζδξ, απμοζία FGF. 2. Bone Morphogenetic protein (Bmp) ζεκαηνδνηηθό κνλνπάηη. Οζ BMP πνςηεΐκεξ (BMP2, 4, 5, 6, 7) εηηνίκμκηαζ επίζδξ απυ ημ θθμζσηυ πείθμξ (cortical hem) ηαζ ζοκενβαηζηά ιε ηα Wnt ιυνζα εθέβπμοκ ημ ζπδιαηζζιυ ιμηίαςκ ζημ ιέζμ ηαζ ναπζαίμ πζηχκζμ (Furuta et al., 1997; Grove et al., 1998; Lee et al., 2000; Mallamaci and Stoykova, 2006). Έπεζ επίζδξ δεζπεεί υηζ, ημοθάπζζημκ ιεηά ηδκ δθζηία Δ10.5, δ BMP ζδιαημδυηδζδ είκαζ ιυκμ ακαβηαία βζα ημκ ηαεμνζζιυ ηδξ ακαπηολζαηήξ ιμίναξ ηςκ ηοηηάνςκ ημο πμνζμεζδμφξ πθέβιαημξ ηαζ ημο θθμζσημφ πείθμοξ (Hebert et al., 2002). 3. FGF (Fibroblast Growth Factor) ζεκαηνδνηηθό κνλνπάηη. ημ ειπνυζεζμ επίπεδμ ημο ηεθεβηεθάθμο, δ δδιζμονβία δζαηνζηχκ δμιχκ νοειίγεηαζ απυ ηδ δνάζδ ηςκ FGF πνςηεσκχκ (FGF3, 8, 17, 18), μζ μπμίεξ πνμςεμφκ ηδκ ηαεζένςζδ ναπζαίαξ έκακηζ ημζθζαηήξ ηαοηυηδηαξ (Hebert et al., 2003). Απυ ηζξ παναπάκς πνςηεΐκεξ ίζςξ δ ζδιακηζηυηενδ ζδιαημδυηδζδ πνμένπεηαζ απυ ηδκ FGF8 πνςηεΐκδ (Fukuchi- Shimogori and Grove, 2001; Garel et al., 2003), δ οπενέηθναζδ ή δ απχθεζα έηθναζδξ ηδξ μπμίαξ είπε ςξ απμηέθεζια ηδκ επέηηαζδ ηςκ ειπνυζεζςκ ή μπίζεζςκ πενζμπχκ ημο ηεθεβηεθάθμο ακηίζημζπα, ηαεζενχκμκηαξ ημ νυθμ ημο FGF ζδιαημδμηζημφ ιμκμπαηζμφ ζημκ πνμζδζμνζζιυ ηδξ ημπμβναθζηήξ ηαοηυηδηαξ. Οζ ζδιαημδμηζημί ηαηαννάηηεξ πμο πνμηαθμφκηαζ απυ ηδ δνάζδ ημο FGF επίζδξ νοειίγμοκ εεηζηά ηδκ επζαίςζδ ηαζ ημκ πμθθαπθαζζαζιυ ηςκ πνμβμκζηχκ κεονζηχκ ηοηηάνςκ. Γεκεηζηά ηνμπμπμζδιέκμζ ιφεξ ζημοξ μπμίμοξ είπε ελαθεζθεεί ημ βμκίδζμ ημο FGF2 έδεζλακ ζδιακηζηή ιείςζδ ζημκ ανζειυ ηςκ πνμβμκζηχκ ηοηηάνςκ ημο κεονμεπζεδθίμο ηαζ αλζμζδιείςηδ ιείςζδ ζημκ ανζειυ ηςκ παναβυιεκςκ κεονχκςκ, εκχ ζηζξ ηαθθζένβεζεξ πνμβμκζηχκ κεονζηχκ ηοηηάνςκ in vitro μ FGF πανέπεζ ηα ιζημβυκα ηαζ ηνμθζηά ζήιαηα ηαζ αμδεά ζηδ δζαηήνδζδ ηδξ πμθοδοκαιίαξ ημοξ (Qian et al., 1997; Palmer et al., 1999; Raballo et al., 2000; Maric et al., 2003). Πνυζθαηα δεδμιέκα πζζημπμζμφκ ηδκ αθθδθεπίδναζδ ηςκ Notch ηαζ FGF ιμκμπαηζχκ, ηαεχξ ανέεδηε υηζ μ Notch1 πανάβμκηαξ πνμάβεζ ηδκ απυηνζζδ ηςκ πνμβμκζηχκ κεονζηχκ ηοηηάνςκ ζηα πμθθαπθαζζαζηζηά ενεείζιαηα ημο FGF (Yoon et al., 2004). Ζ ζδιαημδυηδζδ ιέζς FGF θαίκεηαζ υιςξ κα αθθδθμζοιπθδνχκεηαζ ηαζ ιε ημ ζδιαημδμηζηυ ιμκμπάηζ πμο δζαιεζμθααείηαζ απυ ηα ιυνζα Wnt/α-catenin. 4. Sonic Hedgehog (Shh) ζεκαηνδόηεζε. Σμ Shh ζδιαημδμηζηυ ιμκμπάηζ πνμζδίδεζ ζηα ηφηηανα ημο ηεθεβηεθάθμο ημζθζαηή ηαοηυηδηα (Gunhaga et al., 2000). Δηθνάγεηαζ ζημκ ημζθζαηυ ηεθεβηέθαθμ ηαζ ημκ οπμεάθαιμ ηαζ είκαζ ακαβηαίμ βζα ηδ 33

34 Δζζαβςβή ιμνθμπμίδζδ πμθθχκ πενζμπχκ ημο ηεθεβηεθάθμο (Britto et al., 2002; Rallu et al., 2002). ημοξ ιφεξ, μθζηή απχθεζα ηδξ θεζημονβίαξ ημο Shh ζδιαημδμηζημφ ιμκμπαηζμφ μδδβεί ζε ιζα ακςιαθία βκςζηή ςξ «holoprosencephaly (HPE)» ηαηά ηδκ μπμία παναηδνείηαζ αδοκαιία δζαπςνζζιμφ ηςκ δφμ εβηεθαθζηχκ διζζθαζνίςκ έπμκηαξ ςξ ζοκέπεζα ημ ζπδιαηζζιυ εκυξ εκζαίμο πνυζεζμο εβηέθαθμο (Sussel et al., 1999). Ζ Shh ζδιαημδυηδζδ ζοιιεηέπεζ επίζδξ ζηδ δζαηήνδζδ ηςκ κεονζηχκ αθαζηζηχκ ηοηηάνςκ ημο ακαπηοζζυιεκμο κεονζημφ ζοζηήιαημξ ηςκ εδθαζηζηχκ, ηαεχξ ανέεδηε υηζ ημ ιμκμπάηζ αοηυ είκαζ απαναίηδημ in vivo βζα ημκ πμθθαπθαζζαζιυ ηαζ ηδκ επζαίςζδ ηςκ πνμβμκζηχκ κεονζηχκ ηοηηάνςκ (Machold et al., 2003; Lai et al., 2003). Τπυ ηδ ζοβπνμκζζιέκδ δνάζδ ηςκ παναπάκς ζδιαημδμηζηχκ ιμκμπαηζχκ ηα πνμβμκζηά κεονζηά ηφηηανα ημο ηεθεβηεθάθμο εηθνάγμοκ δζαθμνεηζημφξ ιεηαβναθζημφξ πανάβμκηεξ ζε δζαθμνεηζηέξ πενζμπέξ. διαημδμηζηά ιυνζα FGF8 Wnts, BMPs Shh Γζαααειζζιέκδ έηθναζδ Δββεκείξ ιδπακζζιμί Αζοκεπήξ έηθναζδ Ακαημιζηά ηαζ θεζημονβζηά δζαηνζηέξ πενζμπέξ Δλςβεκείξ ιδπακζζιμί Δηθόλα 1.9. Μεραληζκνί κνξθνπνίεζεο ηνπ ηειεγθεθάινπ. Δθθξηηηθνί παξάγνληεο πνπ πξνέξρνληαη από ζπγθεθξηκέλεο, εμεηδηθεπκέλεο πεξηνρέο ηνπ αλαπηπζζόκελνπ ηειεγθεθάινπ πξνθαινύλ έλα δηαβαζκηζκέλν πξόηππν έθθξαζεο ησλ ζεκαηνδνηηθώλ κνλνπαηηώλ FGF, Wnt, Bmp, θαη Shh. Ζ δξάζε ησλ ζεκαηνδνηηθώλ απηώλ κνλνπαηηώλ δεκηνπξγεί δηαβαζκίζεηο ζηελ έθθξαζε ζπγθεθξηκέλσλ κεηαγξαθηθώλ παξαγόλησλ (π.ρ. Pax6, Emx2), κε απνηέιεζκα ηα πξνγνληθά λεπξηθά θύηηαξα ησλ δηαθόξσλ πεξηνρώλ ηνπ εγθεθαιηθνύ εκηζθαηξίνπ λα ραξαθηεξίδνληαη από δηαθνξεηηθά επίπεδα έθθξαζεο απηώλ ησλ παξαγόλησλ. Ζ πιεξνθνξία απηή ζα κεηαβηβαζηεί θαη ζηνπο λεπξσληθνύο απνγόλνπο ησλ θπηηάξσλ απηώλ κε ηειηθό απνηέιεζκα ηνλ θαζνξηζκό αλαηνκηθά θαη ιεηηνπξγηθά δηαθξηηώλ πεξηνρώλ. VZ, θνηιηαθή δώλε. CP, θινητθή πιάθα. (Από (O'Leary and Nakagawa, 2002)). 34

35 Δζζαβςβή εκαηνδόηεζε από κεηαγξαθηθνύο παξάγνληεο Οζ πανάβμκηεξ ιμνθμπμίδζδξ δδιζμονβμφκ δζαααειίζεζξ ζοβηεκηνχζεςκ μζ μπμίεξ ακηακαηθχκηαζ ζηδκ έηθναζδ δζαθυνςκ ιεηαβναθζηχκ παναβυκηςκ μζ μπμίμζ εθέβπμοκ ηα ζζημβεκεηζηά πνμβνάιιαηα πμθθαπθαζζαζιμφ, δζαθμνμπμίδζδξ, ιεηακάζηεοζδξ, ζφκαρδξ ηαζ επζαίςζδξ/ηοηηανζημφ εακάημο (Δζηυκα 1.9). ηδ ζοκέπεζα ακαθένμκηαζ ιενζημί απυ αοημφξ ημοξ ιεηαβναθζημφξ πανάβμκηεξ. 1. Ο κεηαγξαθηθόο παξάγνληαο Pax6. Ο πανάβμκηαξ Pax6 ζοιιεηέπεζ ζημκ ηαεμνζζιυ ηδξ ναπζαζμ-ημζθζαηήξ ηαοηυηδηαξ ηςκ πνμβμκζηχκ ηοηηάνςκ ημο ηεθεβηεθάθμο. ημκ ακαπηοζζυιεκμ πνυζεζμ εβηέθαθμ δ έηθναζδ ηδξ πνςηεΐκδξ Pax6 εκημπίγεηαζ πενζμνζζιέκδ ζηα πνμβμκζηά ηφηηανα ηδξ ημζθζαηήξ γχκδξ ημο κεμθθμζμφ αθθά ηαζ ζε ηάπμζεξ πενζμπέξ ημο δζεβηεθάθμο (Stoykova and Gruss, 1994; Mastick et al., 1997; Warren and Price, 1997). H θεζημονβία ηδξ πνςηεΐκδξ Pax6 έπεζ ιεθεηδεεί εηηεηαιέκα ιε ηδ αμήεεζα ημο βεκεηζηά ηνμπμπμζδιέκμο ιουξ Small eye, ζημκ μπμίμ έπεζ απμζζςπμζδεεί δ έηθναζδ ημο ζοβηεηνζιέκμο πανάβμκηα (Pax6 Sey -/-) (Hill et al., 1991). ημοξ ζοβηεηνζιέκμοξ ιφεξ παναηδνείηαζ αολδιέκδ ιεηακάζηεοζδ ηςκ πνμβμκζηχκ ηοηηάνςκ ηςκ βαββθζαηχκ πνμελμπχκ πνμξ ημκ θθμζυ ηαζ ημ ζφκμνμ πζηχκζμο-οπμπζηχκζμο ειθακίγεηαζ απμδζμνβακςιέκμ (Stoykova et al., 1997; Chapouton et al., 1999). Δπίζδξ, ζημοξ Pax6 Sey -/- ιφεξ, ιεηαβναθζημί πανάβμκηεξ πμο παναηηδνίγμοκ ηζξ ημζθζαηέξ πενζμπέξ ημο ηεθεβηεθάθμο επεηηείκμκηαζ ζε πζμ ναπζαίεξ εέζεζξ (Stoykova and Gruss, 1994; Stoykova et al., 1996; Stoykova et al., 1997; Toresson et al., 2000; Yun et al., 2001; Heins et al., 2002). Μζα άθθδ θεζημονβία ηδξ πνςηεΐκδξ Pax6, ζοπκά ζε ζοκδοαζιυ ιε ηδ δνάζδ ημο ιμνίμο Emx2, είκαζ δ μνζμεέηδζδ ηςκ επζιένμοξ δζαηνζηχκ πενζμπχκ ημο θθμζμφ. Ζ έηθναζδ ημο πανάβμκηα Pax6 αημθμοεεί έκα πνυηοπμ δζααάειζζδξ ζημ θθμζυ ηαηά ημ μπμίμ ειθακίγεζ αολδιέκδ έηθναζδ ζηζξ πνυζεζεξ ηαζ πθάβζεξ πενζμπέξ ημο κεμθθμζμφ ηαζ εθαηηςιέκα επίπεδα έηθναζδξ ζηζξ μπίζεζεξ ηαζ ιέζεξ πενζμπέξ απυ ηδκ άθθδ ιενζά, μ πανάβμκηαξ Emx2 παναηηδνίγεηαζ απυ ημ ακηίεεημ πνυηοπμ έηθναζδξ. Απχθεζα ηδξ θεζημοβίαξ ημο ιμνίμο Pax6 έπεζ ςξ ζοκέπεζα ηδκ πνυζεζα επέηηαζδ ηδξ πενζμπήξ έηθναζδξ ημο πανάβμκηα Emx2 ηαζ ηδκ επαηυθμοεδ πνυζεζα επέηηαζδ πενζμπχκ ημο θθμζμφ πμο ανίζημκηαζ ζε πζμ μπίζεζεξ εέζεζξ, υπςξ μ μπηζηυξ θθμζυξ, εκχ ακηίζηνμθα, δ απχθεζα ημο πανάβμκηα Emx2 επεηηείκεζ ημ πνυηοπμ έηθναζδξ ηδξ πνςηεΐκδξ Pax6 πνμξ πζμ μπίζεζεξ πενζμπέξ ημο θθμζμφ ιε ηαοηυπνμκδ δζεφνοκζδ πνμξ ηζξ πενζμπέξ αοηέξ ημο ζςιαημαζζεδηζημφ ηαζ ηζκδηζημφ θθμζμφ, μζ μπμίμζ ηακμκζηά εκημπίγμκηαζ ζημ πνυζεζμ ηιήια ημο θθμζμφ (Bishop et al., 2002; Muzio et al., 2002; Muzio and Mallamaci, 2003). Ο ιεηαβναθζηυξ πανάβμκηαξ Pax6 επδνεάγεζ επίζδξ ημ ακαπηολζαηυ δοκαιζηυ ηςκ κεονζηχκ πνμβμκζηχκ ηοηηάνςκ ημο θθμζμφ, ηαεχξ δ ηαηαζημθή ηδξ έηθναζήξ ημο ζηα ηφηηανα αοηά είπε ςξ απμηέθεζια ημ ιεζςιέκμ κεονμβεκεηζηυ δοκαιζηυ ημοξ 35

36 Δζζαβςβή (Heins et al., 2002). Απυ ηδκ άθθδ ιενζά θαίκεηαζ υηζ δ πνςηεΐκδ δζαδναιαηίγεζ ηαίνζμ νυθμ ηαζ ζημοξ ιδπακζζιμφξ πμθθαπθαζζαζιμφ ηςκ πνμβμκζηχκ θθμζσηχκ ηοηηάνςκ (Gotz et al., 1998; Estivill-Torrus et al., 2002). Μέζς ηδξ εκενβμπμίδζδξ ημο ιεηαβναθζημφ πανάβμκηα Tbr2 δ πνςηεΐκδ Pax6 δζαδναιαηίγεζ ηνίζζιμ νυθμ ηαζ ζηδκ παναβςβή ηςκ ααζζηχκ πνυδνμιςκ ηοηηάνςκ (Englund et al., 2005). 2. Ο κεηαγξαθηθόο παξάγνληαο Emx2. Πνυηεζηαζ βζα έκα μιμζμηζηυ βμκίδζμ ημ μπμίμ, υπςξ πνμακαθένεδηε, εηθνάγεηαζ ζηα πνμβμκζηά ηφηηανα ημο θθμζμφ ηαηά ιήημξ ιζαξ μπζζεζμιέζδξ ορδθήξ πνμζεζμπθάβζαξ παιδθήξ ααειίδςζδξ (Mallamaci et al., 1998). Απμοζία ημο ιεηαβναθζημφ αοημφ πανάβμκηα μδδβεί ζηδ ζοννίηκςζδ ηςκ μπίζεζμ-ιεζαίςκ πενζμπχκ ημο θθμζμφ ηαζ ηδκ δζεφνοκζδ ηςκ πνυζεζμ-πθάβζςκ (Bishop et al., 2000; Mallamaci et al., 2000), εκχ ιάθζζηα έπεζ δεζπεεί υηζ δ επίδναζδ ηδξ πνςηεΐκδξ ζηδ ζπδιαημπμίδζδ ημο θθμζμφ είκαζ δμζμελανηχιεκδ (Hamasaki et al., 2004). Σέθμξ, έπεζ επίζδξ ακαθενεεί υηζ ζε ιφεξ απυ ημοξ μπμίμοξ έπεζ βίκεζ απαθμζθή ημο πανάβμκηα Emx2 μζ ηεκηνμιυθεξ κεονζηέξ ίκεξ πμο ένπμκηαζ απυ ημ εάθαιμ ζημ θθμζυ ειθακίγμοκ ακχιαθδ ηαηακμιή (Lopez-Bendito et al., 2002). Ο ιεηαβναθζηυξ πανάβμκηαξ Emx2 δζαιεζμθααεί ημ πμθθαπθαζζαζηζηυ απμηέθεζια ημο Wnt/α-catenin ιμκμπαηζμφ ζημκ εβηεθαθζηυ θθμζυ (Muzio et al., 2005). 3. Ο κεηαγξαθηθόο παξάγνληαο Foxg1. Ο πανάβμκηαξ Foxg1 ειθακίγεζ ιζα μπζζεζμιέζδ παιδθή πνμζεζμπθάβζα ορδθή δζααάειζζδ ζοβηέκηνςζδξ ηαηά ιήημξ ημο θθμζμφ. ε απμοζία ηδξ θεζημονβίαξ ηδξ πνςηεΐκδξ αοηήξ ηα πνμβμκζηά ηφηηανα ημο θθμζμφ δίκμοκ βέκεζδ ιυκμ ζημοξ κεονχκεξ ηδξ πνμθθμζσηήξ πθάηαξ ηαζ υπζ ζε αοημφξ ηδξ θθμζσηήξ πθάηαξ, ηαηαθήβμκηαξ ηεθζηά ζηδ δδιζμονβία εκυξ ακχιαθμο εβηεθαθζημφ θθμζμφ ζημκ μπμίμ υθμζ μζ κεονχκεξ εηθνάγμοκ ηδκ πνςηεΐκδ Reelin, δείηηδ ηςκ Cajal-Retzius ηοηηάνςκ πμο απμηεθμφκ ααζζηυ πθδεοζιυ ηςκ κεονχκςκ ηδξ πνμθθμζσηήξ πθάηαξ (Hanashima et al., 2004). Έπεζ επίζδξ ανεεεί υηζ μ πανάβμκηαξ Foxg1 ακαζηέθθεζ ηδ κεονςκζηή δζαθμνμπμίδζδ ηαζ πνμάβεζ ημκ ηοηηανζηυ πμθθαπθαζζαζιυ (Dou et al., 1999; Muzio and Mallamaci, 2005). 4. Ο κεηαγξαθηθόο παξάγνληαο Coup-tf1. Ζ πνςηεΐκδ αοηή εηθνάγεηαζ απμηθεζζηζηά ζηδκ μπζζεζμπθάβζα πενζμπή ημο θθμζμφ. Ο πανάβμκηαξ Coup-tf1 θαίκεηαζ υηζ απμηεθεί ακαπυζπαζημ ημιιάηζ ηςκ ιμνζαηχκ δζαδζηαζζχκ πμο επζηνέπμοκ ζηα πνμβμκζηά κεονζηά ηφηηανα κα απμηςδζημπμζήζμοκ ηδ ζδιαημδυηδζδ ηςκ δζαθυνςκ ιμνθμβεκεηζηχκ παναβυκηςκ (Zhou et al., 2001). 5. Οη πξνλεπξηθνί κεηαγξαθηθνί παξάγνληεο κνηίβνπ bhlh. Οζ πνμκεονζηέξ πνςηεΐκεξ (proneural proteins) απμηεθμφκ ιζα απυ ηζξ ααζζηυηενεξ μιάδεξ ιεηαβναθζηχκ παναβυκηςκ πμο ζοιιεηέπμοκ ζηδ νφειζζδ ηδξ ζςζηήξ ακάπηολδξ ημο θθμζμφ, ηαεχξ οπμβναιιίγμοκ ηα βεβμκυηα πμθθαπθαζζαζιμφ/αοημ-ακακέςζδξ, ηαεμνζζιμφ κεονςκζημφ οπμηφπμο, ελυδμο απυ ημκ ηοηηανζηυ ηφηθμ, ιεηακάζηεοζδξ ηαζ ηεθζηήξ δζαθμνμπμίδζδξ ηςκ πνμβμκζηχκ θθμζσηχκ ηοηηάνςκ. Οζ ιεηαβναθζημί αοημί πανάβμκηεξ παναηηδνίγμκηαζ απυ ημ ααζζηυ έθζηα-ζηνμθή-έθζηα (basic helixloop-helix, bhlh) ιμηίαμ. 36

37 Δζζαβςβή Έπμοκ πενζβναθεί δφμ μζημβέκεζεξ ιεηαβναθζηχκ παναβυκηςκ bhlh. Ζ μζημβέκεζα achaete ζηα ζπμκδοθςηά πενζθαιαάκεζ ημ βμκίδζμ ash1, πμο ανίζηεηαζ ζε υθα ηα γςζηά ιμκηέθα πμο ιεθεηήεδηακ (Mash1 ζημκ ιο, Xash1 ζημ Xenopus laevis, Cash1 ζημ ημηυπμοθμ, Zash1 ζημ zebrafish) ηαζ ηνία αηυια βμκίδζα πμο απμιμκχεδηακ απυ δζαθμνεηζηά είδδ (Mash2 ζηα εδθαζηζηά, Xash3 ζημ Xenopus laevis ηαζ Cash4 ζημ ημηυπμοθμ). Ζ άθθδ μζημβέκεζα ηςκ ιεηαβναθζηχκ παναβυκηςκ bhlh θέβεηαζ atonal ηαζ πενζθαιαάκεζ ηα βμκίδζα Math1 ηαζ Math5 πμο έπμοκ πενζβναθεί ζημκ ιο. Τπάνπμοκ ηαζ βμκίδζα πμο ζοζπεηίγμκηαζ ιε ηδκ atonal μζημβέκεζα υπςξ είκαζ μζ μζημβέκεζεξ ηςκ Neurogenins (Ngns), NeuroD ηαζ Olig (Lee, 1997; Hassan and Bellen, 2000). Οζ πενζζζυηενμζ απυ ημοξ παναπάκς ιεηαβναθζημφξ πανάβμκηεξ εηθνάγμκηαζ ζπεδυκ απμηθεζζηζηά ζημ ακαπηοζζυιεκμ κεονζηυ ζφζηδια ηςκ ζπμκδοθςηχκ (Bertrand et al., 2002). Οζ πνμκεονζηέξ πνςηεΐκεξ ζπδιαηίγμοκ εηενμδζιενή ζοιπθέβιαηα ιε ιζα άθθδ μιάδα πνςηεσκχκ bhlh, μκμιαγυιεκςκ Δ πνςηεσκχκ, ηαζ έηζζ δεζιεφμκηαζ ζημ DNA ζηζξ εέζεζξ πνυζδεζδξ βκςζηέξ ςξ Δ-box (Cabrera and Alonso, 1991; Johnson et al., 1992; Massari and Murre, 2000). Καεχξ μ εηενμδζιενζζιυξ είκαζ ακαβηαία πνμτπυεεζδ βζα ηδ δέζιεοζδ ζημ DNA, πανάβμκηεξ πμο ειπμδίγμοκ ημ δζιενζζιυ ηςκ πνμκεονζηχκ πνςηεσκχκ ακαζηέθθμοκ ηδκ εκενβυηδηά ημοξ. Σέημζα είκαζ δ πενίπηςζδ ηςκ bhlh πνςηεσκχκ Ηd (inhibitor of differentiation), μζ μπμίεξ ειθακίγμοκ ζζπονή ζοββέκεζα βζα ηζξ Δ πνςηεΐκεξ ηαζ έηζζ ακηαβςκίγμκηαζ ηζξ πνμκεονζηέξ πνςηεΐκεξ (Massari and Murre, 2000; Campuzano, 2001; Yokota, 2001). Ζ έηθναζδ ημο bhlh ακαζημθέα Id2 πνμάβεηαζ απυ ημ Wnt/α-catenin ζδιαημδμηζηυ ιμκμπάηζ, βεβμκυξ πμο ίζςξ ελδβεί ηαζ ηδ ιζημβυκμ δνάζδ ημο ιμκμπαηζμφ (Rockman et al., 2001). Μζα άθθδ μζημβέκεζα ακαζημθέςκ ηδξ δνάζδξ ηςκ πνμκεονζηχκ βμκζδίςκ απμηεθεί δ μζημβέκεζα ηςκ ιεηαβναθζηχκ παναβυκηςκ ιμηίαμο bhlh Hes/Her/Esr (Kageyama and Nakanishi, 1997). Οζ πνςηεΐκεξ αοηέξ αθθδθεπζδνμφκ ιε ζοκ-ηαηαζημθείξ ηαζ ιε αοηυκ ημκ ηνυπμ απμηνέπμοκ ηδ ιεηαβναθή ηςκ πνμκεονζηχκ βμκζδίςκ bhlh (Paroush et al., 1994; Chen et al., 1997; Davis and Turner, 2001). Οζ πνςηεΐκεξ Hes πανειπμδίγμοκ ηαζ ηδ ιεηαβναθζηή δνάζδ ηςκ πνςηεσκχκ bhlh αθθδθεπζδνχκηαξ ιε αοηέξ ηαζ πανειααίκμκηαξ έηζζ ζημ ζπδιαηζζιυ ημο ζοιπθυημο bhlh/δ πνςηεσκχκ (Sasai et al., 1992; Alifragis et al., 1997; Kageyama and Nakanishi, 1997; Giagtzoglou et al., 2003). Οζ πνςηεΐκεξ Hes είκαζ ηα ααζζηά επζηεθεζηζηά ιυνζα ημο Notch ιμκμπαηζμφ, ιζαξ πμθφ ζδιακηζηήξ ζδιαημδυηδζδξ βζα ηδ δζαηήνδζδ ηδξ αδζαθμνμπμίδηδξ ηαηάζηαζδξ ηςκ πνμβμκζηχκ κεονζηχκ ηοηηάνςκ (Ishibashi et al., 1994; Lewis, 1996; Kageyama and Ohtsuka, 1999). Ζ νοειζζηζηή δνάζδ ημο Notch ιμκμπαηζμφ είκαζ βκςζηή ςξ «πθεονζηή ακαζημθή», ηαεχξ μζ πνμκεονζηέξ bhlh πνςηεΐκεξ Mash1 ηαζ Ngns πμο εκενβμπμζμφκηαζ ζημοξ κεμζπδιαηζγυιεκμοξ κεονχκεξ αολάκμοκ ηα επίπεδα έηθναζδξ ηςκ πνμζδεηχκ (ligands) ημο Notch οπμδμπέα, μζ μπμίμζ εκενβμπμζμφκ ηδ Notch ζδιαημδυηδζδ ζε δζπθακά ηφηηανα, ζηα μπμία επάβεηαζ δ έηθναζδ ηςκ 37

38 Δζζαβςβή πνςηεσκχκ Hes πανειπμδίγμκηαξ ηδ δζαθμνμπμίδζή ημοξ (Beatus and Lendahl, 1998). Οζ bhlh πνςηεΐκεξ Id ηαζ Hes δζαηδνμφκ επμιέκςξ ηδκ αδζαθμνμπμίδηδ ηαηάζηαζδ ηςκ πνυδνμιςκ κεονζηχκ ηοηηάνςκ ηαζ ηαηαζηέθθμοκ ηδ δζαθμνμπμίδζδ. Οζ πενζζζυηενμ ιεθεηδιέκεξ πνμκεονζηέξ πνςηεΐκεξ ζημκ ακαπηοζζυιεκμ εβηεθαθζηυ θθμζυ είκαζ μζ πνςηεΐκεξ Neurogenin2 (Ngn2) ηαζ Mash1. Οζ ιεηαβναθζημί αοημί πανάβμκηεξ εκημπίγμκηαζ υπζ ζημοξ δζαθμνμπμζδιέκμοξ κεονχκεξ αθθά ζηα ιζηςηζηχξ εκενβά πνυδνμια ηφηηανα πμο έπμοκ πθέμκ δεζιεοηεί πνμξ κεονςκζηή δζαθμνμπμίδζδ (committed neural precursors) ηαζ πμο επμιέκςξ ειθακίγμοκ πενζμνζζιέκμ ακαπηολζαηυ δοκαιζηυ. O ιεηαβναθζηυξ πανάβμκηαξ Ngn2 εκζζπφεζ ηδ δζαθμνμπμίδζδ ηςκ ημνοθαίςκ πνμβμκζηχκ ηοηηάνςκ ημο θθμζμφ πνμξ ααζζηά πνυδνμια ηφηηανα (Miyata et al., 2004; Britz et al., 2006) ηαζ εοκμεί ηδκ έλμδμ απυ ημκ ηοηηανζηυ ηφηθμ ηαζ ηδκ απανπή ηδξ κεονςκζηήξ δζαθμνμπμίδζδξ (Ross et al., 2003). Σμ ιυνζμ ηδξ Ngn2 ζοιιεηέπεζ ζηδ νφειζζδ ημο θαζκμηφπμο ηςκ πνμαθδηζηχκ κεονχκςκ ημο θθμζμφ, ζοιπενζθαιαακμιέκμο ημο βθμοηαιζκενβζημφ ηφπμο κεονμδζααίααζδξ ηαζ ηδξ ιμνθμθμβίαξ ηςκ δεκδνζηχκ ημοξ (Schuurmans et al., 2004; Hand et al., 2005). O ιεηαβναθζηυξ πανάβμκηαξ Pax6 νοειίγεζ ημ βμκίδζμ Ngn2 (Scardigli et al., 2003), εκχ επίζδξ ανέεδηε υηζ μζ δφμ αοημί ιεηαβναθζημί πανάβμκηεξ εθέβπμοκ ηδκ παναβςβή ηςκ θθμζσηχκ πνμαθδηζηχκ κεονχκςκ ηαηά έκα πνμκζηά δζαηνζηυ πνυηοπμ, ιε ηδ πνςηεΐκδ Ngn2 κα είκαζ ακαβηαία βζα ημ ζπδιαηζζιυ ηςκ κεονχκςκ ηαηά ηα πνχηα ζηάδζα ακάπηολδξ ημο θθμζμφ ηαζ ημκ πανάβμκηα Pax6 κα εθέβπεζ ημ ζπδιαηζζιυ ημοξ ζε ιεηέπεζηα ζηάδζα (Schuurmans et al., 2004). Ζ ζοιιεημπή ημο Wnt/α-catenin ιμκμπαηζμφ ζηδκ κεονςκζηή δζαθμνμπμίδζδ θαίκεηαζ κα εηηεθείηαζ ιέζς ιεηαβναθζηήξ εκενβμπμίδζδξ ηςκ βμκζδίςκ ηςκ Neurogenins απυ ημ ζφιπθμημ α-ηαηεκίκδξ/tcf (Hirabayashi et al., 2004; Israsena et al., 2004). Σμ βεβμκυξ αοηυ πνμηείκεζ έκα ιδπακζζιυ πνμχεδζδξ ηδξ κεονςκζηήξ δζαθμνμπμίδζδξ ηαηά ημκ μπμίμ δ ζδιαημδυηδζδ ιέζς ημο ιμκμπαηζμφ Wnt/α-catenin ιεηαηνέπεζ ηα ηφηηανα ηδξ αηηζκςηήξ βθμίαξ ζε ααζζηά πνυδνμια ηφηηανα ηα μπμία ζηδ ζοκέπεζα εα δχζμοκ βέκεζδ ζε χνζιμοξ κεονχκεξ (Viti et al., 2003; Guillemot, 2005). O ιεηαβναθζηυξ πανάβμκηαξ Mash1 πανμοζζάγεζ ιεβαθφηενα επίπεδα έηθναζδξ ζημκ ημζθζαηυ ηεθεβηέθαθμ, ζηζξ βαββθζαηέξ πνμελμπέξ. Έηζζ ειπθέηεηαζ ζημκ ηαεμνζζιυ ηςκ κεονχκςκ πμο πνδζζιμπμζμφκ GABA ςξ κεονμδζααζααζηή (Fode et al., 2000; Parras et al., 2002). Ζ πνςηεΐκδ Mash1 εηθνάγεηαζ ηαζ ζημ κεμθθμζυ, ακ ηαζ ζε παιδθυηενα επίπεδα απυ υηζ ζημκ ημζθζαηυ ηεθεβηέθαθμ, υπμο ανέεδηε υηζ πνμάβεζ ηδκ παναβςβή ηςκ ααζζηχκ πνυδνμιςκ ηοηηάνςκ, υηζ ειπθέηεηαζ ζημκ πνμζδζμνζζιυ ηςκ κεονςκζηχκ οπμηφπςκ ηαζ υηζ ςεεί ηα πνυδνμια ηφηηανα πνμξ έλμδμ απυ ημκ ηοηηανζηυ ηφηθμ (Nieto et al., 2001; Britz et al., 2006). Μυθζξ μνζζηζημπμζδεεί δ δέζιεοζδ ηςκ ηοηηάνςκ πνμξ κεονςκζηή δζαθμνμπμίδζδ, επζπνυζεεημζ ιεηαβναθζημί πανάβμκηεξ bhlh εκενβμπμζμφκηαζ 38

39 Δζζαβςβή χζηε κα εκζζπφζμοκ ημ θαζκυηοπμ ηςκ δζαθυνςκ οπμηφπςκ ηςκ πνμαάθθμκηςκ κεονχκςκ, υπςξ βζα πανάδεζβια μ πανάβμκηαξ NeuroD (Ross et al., 2003). Οζ πνμακαθενεέκηεξ ιεηαβναθζημί πανάβμκηεξ είκαζ ιυκμ ιενζημί απυ ηδκ πθεζάδα ηςκ πνςηεσκζηχκ ζδιάηςκ πμο δνμοκ ζηα πνμβμκζηά κεονζηά ηφηηανα ημο εβηεθαθζημφ θθμζμφ πνμηεζιέκμο κα νοειίζμοκ ηα βεβμκυηα αοημ-ακακέςζδξ ηαζ δζαθμνμπμίδζδξ. Σα ζδιαημδμηζηά ιμκμπάηζα πμο δζαιεζμθααμφκηαζ απυ εηηνζηζημφξ πανάβμκηεξ ηαζ μζ δζάθμνμζ ιεηαβναθζημί πανάβμκηεξ ακαπηφζζμοκ θεζημονβζηέξ αθθδθεπζδνάζεζξ ιέζς ηςκ δζαααειίζεςκ ζοβηέκηνςζδξ (Mallamaci and Stoykova, 2006) πμο έπμοκ ςξ απμηέθεζια ηδκ μνζμεέηδζδ πενζμπχκ ιε πνμβμκζηά ηφηηανα δζαθμνεηζημφ δοκαιζημφ, ηα μπμία ζηδ ζοκέπεζα εα ηαεμνίζμοκ ζοβηεηνζιέκμοξ οπμηφπμοξ κεονζηχκ ηοηηάνςκ Ρύζκηζε ησλ λεπξηθώλ πξνγνληθώλ θπηηάξσλ ηνπ θινηνύ από επηγελεηηθνύο παξάγνληεο Οζ πθδεοζιμί ηςκ πνμβμκζηχκ ηοηηάνςκ ημο θθμζμφ είκαζ οπεφεοκμζ βζα ηδκ παναβςβή ηςκ ηνζχκ ααζζηχκ ηφπςκ δζαθμνμπμζδιέκςκ ηοηηάνςκ ημο θθμζμφ, δδθαδή ηςκ κεονχκςκ, ηςκ αζηνμηοηηάνςκ ηαζ ηςκ μθζβμδεκδνμηοηηάνςκ. Παν υθ αοηά, δ δζαθμνμπμίδζδ ζε ηαεέκακ απυ αοημφξ ημοξ ηφπμοξ βίκεηαζ ηαηά αοζηδνχξ ηαεμνζζιέκμ πςνζηυ ηαζ πνμκζηυ ηνυπμ: ηαηά ηδκ ακάπηολδ ημο θθμζμφ ημο ιουξ, ιέπνζ ηδκ ειανοσηή διένα Δ17 θαιαάκεζ πχνα δ παναβςβή απμηθεζζηζηά ηςκ κεονχκςκ ημο θθμζμφ ηαζ ιυκμ υηακ δ κεονμβεκεηζηή δζαδζηαζία ααίκεζ πνμξ μθμηθήνςζδ ανπίγεζ μ ζπδιαηζζιυξ ηςκ ηοηηάνςκ ηδξ βθμίαξ (Qian et al., 2000). Κνίζζιμ νυθμ ζε αοηήκ ηδ ζηαδζαηή νφειζζδ ημο ηαεμνζζιμφ ημο ακαπηολζαημφ δοκαιζημφ ηςκ πνμβμκζηχκ κεονζηχκ ηοηηάνςκ δζαδναιαηίγμοκ ηαζ επζβεκεηζημί ιδπακζζιμί πμο, ζε ζοκδοαζιυ ιε ηδ δνάζδ δζαθυνςκ αολδηζηχκ παναβυκηςκ, εθέβπμοκ ηδκ έηθναζδ ζοβηεηνζιέκςκ βμκζδίςκ (Edlund and Jessell, 1999; Takizawa et al., 2001; Hsieh and Gage, 2004; Namihira et al., 2008; Sanosaka et al., 2009). Ο υνμξ «επζβεκεηζημί ιδπακζζιμί» ακαθένεηαζ ζηζξ δνάζεζξ πμο πνμάβμοκ ημκ θαζκμηοπζηυ πνμζδζμνζζιυ ηςκ ηοηηάνςκ ιέζς επζαμθήξ εκυξ ζοβηεηνζιέκμο ηαζ ηθδνμκμιζημφ πνμηφπμο βμκζδζαηήξ έηθναζδξ, πςνίξ κα πνμηαθμφκ αθθαβέξ ζηδκ αθθδθμοπία ημο DNA (Hsieh and Gage, 2004). Οζ ααζζηυηενμζ επζβεκεηζημί ιδπακζζιμί πενζθαιαάκμοκ ηδ ιεεοθίςζδ ημο DNA αθθά ηαζ ηνμπμπμζήζεζξ ηςκ ζζημκχκ υπςξ βζα πανάδεζβια αηεηοθίςζδ ηαζ ιεεοθίςζδ (Δζηυκα 1.10). 1. Μεζπιίσζε ηνπ DNA. Ζ νφειζζδ ηδξ βμκζδζαηήξ έηθναζδξ ιέζς ηδξ ιεεοθίςζδξ ημο DNA βίκεηαζ ιέζς δφμ ηφνζςκ ιδπακζζιχκ. Πνχημκ, δ ιεεοθίςζδ ζοβηεηνζιέκςκ CpG δζκμοηθεμηζδίςκ ιέζα ζηδκ πενζμπή πνυζδεζδξ ηςκ ιεηαβναθζηχκ παναβυκηςκ ειπμδίγεζ άιεζα ηδκ πνυζααζδ ηςκ ιεηαβναθζηχκ 39

40 Δζζαβςβή παναβυκηςκ ηαζ ηδκ εκενβμπμίδζδ ηδξ έηθναζδξ ημο βμκζδίμο-ζηυπμο (Watt and Molloy, 1988; Takizawa et al., 2001). Ο δεφηενμξ ηνυπμξ βμκζδζαηήξ νφειζζδξ πενζθαιαάκεζ ηδ δνάζδ πνςηεσκχκ υπςξ μζ MeCP2 ηαζ MBD1, πμο πενζέπμοκ ιζα πενζμπή πνυζδεζδξ ζε ιεεοθζςιέκα CpG δζκμοηθεμηίδζα (methyl-cpg-binding domain, MBD) ηαζ πνμζδέκμκηαζ ζε αοηά ηα ηιήιαηα βζα κα ηαηαζηείθθμοκ ηδ βμκζδζαηή έηθναζδ (Lewis et al., 1992; Cross et al., 1997; Nan et al., 1997). Ζ νφειζζδ ηδξ βμκζδζαηήξ έηθναζδξ ιέζς ιεεοθίςζδξ ημο DNA είκαζ ααζζηυ ζημζπείμ ζημ ζοκημκζζιυ ηδξ παναβςβήξ κεονχκςκ ηαζ βθμίαξ. Καηά ηδκ πενίμδμ πμο θαιαάκεζ πχνα δ κεονμβέκεζδ ζημκ ειανοσηυ θθμζυ, έκα CpG δζκμοηθεμηίδζμ ζηδκ πενζμπή πνυζδεζδξ ημο ιεηαβναθζημφ πανάβμκηα STAT (signal transducer and activator of transcription) ιέζα ζημκ οπμηζκδηή ημο βμκζδίμο ημο πνςηεσκζημφ δείηηδ ηςκ αζηνμηοηηάνςκ GFAP (glial fibrillary acidic protein) είκαζ ιεεοθζςιέκμ. Έηζζ, μ ιεηαβναθζηυξ πανάβμκηαξ STAT δεκ ιπμνεί κα επάβεζ ηδκ έηθναζδ ηδξ πνςηεΐκδξ GFAP έπμκηαξ ςξ απμηέθεζια ημ ζπδιαηζζιυ κεονζηχκ ηοηηάνςκ ηαζ υπζ αζηνμηοηηάνςκ. ηακ ααίκεζ πνμξ μθμηθήνςζδ δ παναβςβή ηςκ κεονχκςκ ημο θθμζμφ, δ πενζμπή πνυζδεζδξ ημο ιεηαβναθζημφ πανάβμκηα STAT απμιεεοθζχκεηαζ, ηαεζζηχκηαξ δοκαηή ηδκ παναβςβή πθέμκ αζηνμηοηηάνςκ (Takizawa et al., 2001; Fan et al., 2005). 2. Σξνπνπνηήζεηο ηζηνλώλ. Μζα απυ ηζξ ηαθφηενα παναηηδνζζιέκεξ ηνμπμπμζήζεζξ ζζημκχκ είκαζ δ αηεηοθίςζδ ζε ηαηάθμζπα θοζίκδξ, δ μπμία δζαιεζμθααείηαζ απυ δομ ηαηδβμνίεξ εκγφιςκ: ηζξ αηεηοθμ-ηνακζθενάζεξ ζζημκχκ (histone acetyl-transferases, HATs) ηαζ ηζξ απμ-αηεηοθάζεξ ηςκ ζζημκχκ (histone deacetylases, HDACs). Οζ HATs αηεηοθζχκμοκ ηζξ εεηζηά θμνηζζιέκεξ ζζηυκεξ, απμδοκαιχκμκηαξ έηζζ ηδκ αθθδθεπίδναζή ημοξ ιε ημ ανκδηζηά θμνηζζιέκμ DNA, βεβμκυξ πμο έπεζ ςξ επαηυθμοεμ ηδ παθάνςζδ ημο κμοηθεμζχιαημξ ηαζ ηδκ εθεφεενδ πνυζααζδ ηςκ ιεηαβναθζηχκ παναβυκηςκ πμο εα εκενβμπμζήζμοκ ηδκ έηθναζδ ηςκ βμκζδίςκ ζηυπςκ. Οζ HDACs ηαηαθφμοκ ημ ακηίζηνμθμ θαζκυιεκμ (Hsieh and Gage, 2004). Δηηυξ απυ αηεηοθίςζδ μζ θοζίκεξ οθίζηακηαζ επίζδξ ηαζ ιεεοθίςζδ. Ζ ιεεοθίςζδ ηδξ ζζηυκδξ Ζ3 ζηζξ θοζίκεξ Κ4, Κ36 ηαζ Κ79 μδδβεί ζε εκενβμπμίδζδ ηδξ ιεηαβναθήξ εκχ δ ιεεοθίςζδ ηδξ ίδζαξ ζζηυκδξ ζηζξ θοζίκεξ Κ9 ηαζ Κ27 ηαεχξ ηαζ δ ιεεοθίςζδ ηδξ ζζηυκδξ Ζ4 ζηδ θοζίκδ Κ59 ζπεηίγμκηαζ ιε ιεηαβναθζηή ηαηαζημθή (Namihira et al., 2008). Ζ πνυζααζδ ημο ιεηαβναθζημφ πανάβμκηα STAT3 ζημκ οπμηζκδηή ημο GFAP βμκζδίμο δζεοημθφκεηαζ ηαηά ηα πνχηα αήιαηα ηδξ βθμζμβέκεζδξ απυ ηδκ επαβςβή ηδξ Ζ3Κ4 ιεεοθίςζδξ ηαζ ηδκ ηαηαζημθή ηδξ Ζ3Κ9 ιεεοθίςζδξ. 3. ύκπινθν REST/NRSF. Ο πανάβμκηαξ REST/NRSF (RE1 silencing transcription factor/ neuron restricted silencing factor) δζαδναιαηίγεζ ααζζηυ νυθμ ζηδ ιεηάααζδ απυ ηα πμθοδφκαια (pluripotent) ηφηηανα ζηα ηαεμνζζιέκα πνμξ κεονςκζηή δζαθμνμπμίδζδ πνυδνμια κεονζηά ηφηηανα (Ballas et al., 2005). ηα πμθοδφκαια ηφηηανα μ ακαζημθέαξ REST/NRSF ζπδιαηίγεζ έκα ζφιπθμημ ιαγί ιε 40

41 Δζζαβςβή Νεονμεπζεδθζαηά ηφηηανα (ανπζηά ζηάδζα) Νεονμεπζεδθζαηά ηφηηανα (ηεθζηά ζηάδζα, εκήθζηα) Αθθδθμοπία ακαβκχνζζδξ Αηεηοθίςζδ (ΖΑΣ) Απμαηεηοθίςζδ (HDAC) Έηθναζδ βμκζδίςκ Νεονχκαξ (GFAP -) Αζηνμηφηηανμ (GFAP +) Ανπζηή έηθναζδ Έκανλδ ιεηαβναθζηήξ ηαηαζημθήξ Νεονςκζηή δζαθμνμπμίδζδ Έηθναζδ βμκζδίςκ Ζ3Κ27me3 Γζαηήνδζδ ιεηαβναθζηήξ ηαηαζημθήξ Ηζηόλε Ζ1 Ζ1Κ26me Δηθόλα Σξόπνη δξάζεο κεξηθώλ από ηνπο ζεκαληηθόηεξνπο επηγελεηηθνύο κεραληζκνύο. Α) Μεζπιίσζε ηνπ DNA. Ζ κεζπιησκέλε κνξθή ηνπ γνληδίνπ GFAP δελ επηηξέπεη ηε δξάζε ηνπ κεηαγξαθηθνύ παξάγνληα STAT3, κε απνηέιεζκα ην ζρεκαηηζκό λεπξώλσλ. Ζ απνκεζπιίσζε ηνπ γνληδίνπ ζεκαηνδνηεί θαη ηε κεηάβαζε ζηε γινηνγέλεζε. Β) Αθεηπιίσζε ηζηνλώλ. Οη HATs αθεηπιηώλνπλ ηε ρξσκαηίλε ελώ νη HDACs θαηαιύνπλ ηελ αληίζεηε αληίδξαζε. Ζ αθεηπιίσζε έρεη σο ζπλέπεηα ηε ραιάξσζε ηεο δνκήο ηνπ λνπθιενζώκαηνο θαη ηελ κεηαγξαθηθή ελεξγόηεηα, ελώ ε απναθεηπιίσζε έρεη ην αληίζεην απνηέιεζκα. Γ) Δπηγελεηηθόο κεραληζκόο REST/NRSF. Οη πξσηεΐλεο REST/NRSF ζηξαηνινγνύλ ζπλ-θαηαζηνιείο ζηνπο ππνθηλεηέο ησλ γνληδίσλ ζηόρσλ θαη θαηαζηέιινπλ ηε κεηαγξαθή ηνπο. Γ) ύκπινθν Polycomb. Σα PcG1 θαη 2 πξνζδέλνληαη ζηαδηαθά ζηα γνλίδηα ζηόρνπο θαη ζπλεξγαηηθά θαηαζηέιινπλ ηε κεηαγξαθή ηνπο. (Οη Α,Β,Γ από (Namihira et al., 2008). H Γ από (Rajasekhar and Begemann, 2007)). άθθμοξ ζοκ-ηαηαζημθείξ υπςξ ημοξ πανάβμκηεξ CoREST, HDAC1 ηαζ MeCP2, ηαζ πνμζδέκεηαζ ζε ιζα αθθδθμοπία ακαβκχνζζδξ (NRSE) ζημοξ οπμηζκδηέξ βμκζδίςκ πμο 41

42 Δζζαβςβή εοκμμφκ ηδκ κεονςκζηή δζαθμνμπμίδζδ. Καεχξ ηα πμθοδφκαια ηφηηανα ανπίγμοκ κα δεζιεφμκηαζ πνμξ κεονζηή ακαπηολζαηή ιμίνα, ηα επίπεδα ημο REST/NRSF εθαηηχκμκηαζ ζδιακηζηά ιε απμηέθεζια ηδκ άνζδ ηδξ ιεηαβναθζηήξ ηαηαζημθήξ ηαζ ηδ ιεηαβναθή ηςκ κεονςκζηχκ βμκζδίςκ (Ballas et al., 2005). 4. ύκπινθν Polycomb. Σα ιέθδ ηδξ μζημβέκεζαξ ηςκ ζοιπθυηςκ Polycomb (Polycomb group complex, PcG) πενζβνάθδηακ πνχηα ζηδ Drosophila melanogaster ζακ νοειζζηέξ ηδξ έηθναζδξ ηςκ μιμζμηζηχκ βμκζδίςκ Hox (Lewis, 1978; Struhl, 1981). Σα ζφιπθμηα PcG είκαζ ελεθζηηζηά δζαηδνδιέκα ηαζ είκαζ βκςζηυ υηζ δζαηδνμφκ ζοβηεηνζιέκεξ ηαηεζηαθιέκεξ ηαηαζηάζεζξ ημο πνμηφπμο έηθναζδξ ηςκ βμκζδίςκ Hox ζε ζοβηεηνζιέκα, μνζμεεηδιέκα ηιήιαηα ημο άλμκα ημο ζχιαημξ απυ ηζξ ιφβεξ ιέπνζ ημκ άκενςπμ (Levine et al., 2004; Ringrose and Paro, 2004). Τπάνπμοκ δφμ θεζημονβζηά ηαζ αζμπδιζηά δζαηνζηά πμθοπαναβμκηζηά ζφιπθμηα, ηα PRC1 ηαζ PRC2 (Polycomb repressive complex) (Ringrose and Paro, 2004; Levine et al., 2004). Με ηδκ πάνμδμ ηάεε ηοηηανζημφ ηφηθμο, ηα ζφιπθμηα PcG δζαηδνμφκ ηδκ ηαοηυηδηα ημο ηοηηάνμο ζοκηδνχκηαξ ηδκ ηαηάζηαζδ ηδξ πνςιαηίκδξ (Ringrose, 2006; Groth et al., 2007). Σα ζφιπθμηα PcG είκαζ επίζδξ ζηακά βζα ηδ δοκαιζηή νφειζζδ ηδξ βμκζδζαηήξ έηθναζδξ ηαηά ηδκ ειανοσηή ακάπηολδ ηςκ εδθαζηζηχκ. Πμθθέξ ιεθέηεξ έπμοκ ακαδείλεζ ημ νυθμ ηςκ ζοιπθυηςκ PcG ζηδ δζαηήνδζδ ηδξ πμθοδοκαιίαξ ηςκ αθαζηζηχκ ηοηηάνςκ ειανφςκ ή εκήθζηςκ μνβακζζιχκ ιέζς ηδξ απμζζχπδζδξ ζοβηεηνζιέκςκ ιεηαβναθζηχκ παναβυκηςκ πμο επάβμοκ δζαθμνμπμίδζδ (Boyer et al., 2006; Jorgensen et al., 2006). Μεθέηεξ πανημβνάθδζδξ ζε αθαζηζηά ηφηηανα ειανφςκ ιουξ ηαζ ακενχπμο έδεζλακ υηζ ηα ζφιπθμηα PcG εκημπίγμκηαζ ηονίςξ δεζιεοιέκα ζε βμκίδζα πμο ηςδζημπμζμφκ βζα πνςηεΐκεξ πμο εθέβπμοκ ηονίανπεξ ακαπηολζαηέξ δζαδζηαζίεξ, υπςξ μνβακμβέκεζδ, ιμνθμβέκεζδ, κεονμβέκεζδ, ηοηηανζηή δζαθμνμπμίδζδ, ειανοσηή ακάπηολδ η.α., οπμδεζηκφμκηαξ υηζ ηα ζφιπθμηα PcG αμδεμφκ ζηδκ απμζζχπδζδ αοηχκ ηςκ βμκζδίςκ ζηα αδζαθμνμπμίδηα αθαζηζηά ηφηηανα. Ζ εεςνία αοηή πνμτπμεέηεζ υηζ δ δζαιεζμθααμφιεκδ απυ ηα ζφιπθμηα PcG βμκζδζαηή νφειζζδ ζηα αθαζηζηά ηφηηανα πνέπεζ κα είκαζ δοκαιζηή ηαζ ακηζζηνεπηή χζηε κα είκαζ δοκαηή δ δζαθμνμπμίδζδ ηςκ ηεθεοηαίςκ, βεβμκυξ πμο έπεζ πνάβιαηζ δεζπεεί (Boyer et al., 2006). οιπεναζιαηζηά, ηα ζφιπθμηα PcG δζαηδνμφκ ηδκ πμθοδοκαιία ζημπεφμκηαξ πνμξ απμζζχπδζδ ιζα ιεβάθδ αημθμοεία ηνίζζιςκ νοειζζηζηχκ παναβυκηςκ ηςκ αθαζηζηχκ ηοηηάνςκ, μζ μπμίμζ υιςξ δζαηδνμφκ ηδ δοκαηυηδηα κα επακέθεμοκ ζε εκενβυ ιμνθή (Rajasekhar and Begemann, 2007; Schuettengruber and Cavalli, 2009). Δηηυξ απυ ημκ νυθμ ημοξ ζημκ πνμζδζμνζζιυ ηδξ ηαοηυηδηαξ ηςκ πνχζιςκ πμθοδφκαιςκ αθαζηζηχκ ηοηηάνςκ, ηα ζφιπθμηα PcG ζοιιεηέπμοκ ηαζ ζηδ νφειζζδ ηδξ ηαοηυηδηαξ ηςκ ιεηαβεκέζηενςκ, πνμβμκζηχκ κεονζηχκ ηοηηάνςκ ηαζ ηςκ δζαθμνμπμζδιέκςκ απμβυκςκ πμο πνμηφπημοκ απυ αοηά. Καηά ημ ζπδιαηζζιυ ημο θθμζμφ ηα ιυνζα PcG νοειίγμοκ πνμκζηά ηδκ ακαπηολζαηή δζαθμνμπμίδζδ ηςκ 42

43 Δζζαβςβή πνμβμκζηχκ κεονζηχκ ηοηηάνςκ, ηαεχξ ανέεδηε υηζ πενζμνίγμοκ ηδκ ζηακυηδηά ημοξ κα δίκμοκ βέκεζδ ζε κεονχκεξ εκχ ακηίεεηα πνμςεμφκ ηδ ιεηάααζδ πνμξ βθμζαηή δζαθμνμπμίδζδ (Hirabayashi et al., 2009). 5. ύκπινθν αλαδηακόξθσζεο ηεο ρξσκαηίλεο SWI/SNF. Μζα άθθδ ηαηδβμνία επζβεκεηζηχκ παναβυκηςκ νοειίγεζ ηδ βμκζδζαηή έηθναζδ ακαδζμνβακχκμκηαξ εκενβά ηδ δμιή ηδξ πνςιαηίκδξ. Πνυηεζηαζ βζα πμθοπαναβμκηζηά ζφιπθμηα ηα μπμία πνδζζιμπμζμφκ ηδκ εκένβεζα ημο ΑΣΡ βζα κα ακαδζαιμνθχζμοκ ηα κμοηθεμζχιαηα ηαζ κα δζεοημθφκμοκ ηδκ πνυζααζδ ιεηαβναθζηχκ παναβυκηςκ πμο εα νοειίζμοκ ζηδ ζοκέπεζα ηδ βμκζδζαηή έηθναζδ ηςκ βμκζδίςκ ζηυπςκ. ηδκ ηαηδβμνία αοηή ακήηεζ ημ ζφιπθμημ SWI/SNF, έκα πμθοπαναβμκηζηυ ζφιπθμημ πμο απμηεθείηαζ απυ 9-12 δζαθμνεηζηέξ οπμιμκάδεξ (de la Serna et al., 2006). H δνάζδ ΑΣΡ-άζδξ ημο ζοιπθυημο ηαηαθφεηαζ απυ δφμ δζαθμνεηζηέξ οπμιμκάδεξ: ηδκ πνςηεΐκδ Brahma (Brm) ηαζ ηδκ πνςηεΐκδ Brahma-related gene 1 (Brg1) (de la Serna et al., 2006; Yoo and Crabtree, 2009). Οζ πνςηεΐκεξ Brm ηαζ Brg1 πνμζδέκμκηαζ ηονίςξ ζε αηεηοθζςιέκεξ ζζηυκεξ (de la Serna et al., 2006). Ζ απαθμζθή ηδξ έηθναζδξ ημο πανάβμκηα Brg1 ζε ιφεξ μδήβδζε ζε θαζκμηφπμοξ ειανοσηήξ εκδζζιυηδηαξ, βεβμκυξ πμο ακαδεζηκφεζ ηδ ζδιαζία ημο ζοιπθυημο SWI/SNF ζηα πνχζια ζηάδζα ηδξ ειανομβέκεζδξ (Keenen and de la Serna, 2009). Δπζπνυζεεηα, ημ ζφιπθμημ SWI/SNF δζαδναιαηίγεζ ηνίζζιμ νυθμ ζηδ δζαηήνδζδ ηδξ πμθοδοκαιίαξ ηςκ ειανοσηχκ αθαζηζηχκ ηοηηάνςκ ιέζς ηδξ αθθδθεπίδναζήξ ημο ιε ζοβηεηνζιέκμοξ ιεηαβναθζημφξ πανάβμκηεξ νφειζζδξ ηδξ πμθοδοκαιίαξ, υπςξ είκαζ δ πνςηεΐκδ Nanog (Liang et al., 2008). Δπζπθέμκ, ημ ζφιπθμημ SWI/SNF αθθδθεπζδνά ιε ιεηαβναθζημφξ πανάβμκηεξ πμο νοειίγμοκ ηδκ ςνίιακζδ ηςκ αδζαθμνμπμίδηςκ ηοηηάνςκ ζε ζοβηεηνζιέκδ ηοηηανζηή ζεζνά (cell lineage commitment) ηαζ πνμάβεζ ηδκ ηεθζηή ημοξ δζαθμνμπμίδζδ (de la Serna et al., 2006). Έπεζ πνμηαεεί υηζ μζ παναπάκς δζαθμνεηζηέξ δνάζδξ ημο ζοιπθυημο, δδθαδή δ δζαηήνδζδ ηδξ πμθοδοκαιίαξ ηαζ δ πνμχεδζδ ηδξ ηεθζηήξ δζαθμνμπμίδζδξ, δζαιεζμθααμφκηαζ απυ ζφιπθμηα ιε δζαθμνεηζηή ζφκεεζδ οπμιμκάδςκ ηα μπμία δζαδναιαηίγμοκ ελεζδζηεοιέκμοξ νυθμοξ ζηζξ δφμ δζαδζηαζίεξ (Nagl et al., 2007; Kaeser et al., 2008; Gao et al., 2008; Yan et al., 2008; Keenen and de la Serna, 2009). Νευηενα δεδμιέκα ειπθέημοκ ημοξ επζβεκεηζημφξ ιδπακζζιμφξ ηαζ ζηδ νφειζζδ ηνίζζιςκ θεζημονβζχκ ημο εκήθζημο μνβακζζιμφ, υπςξ ζηδκ εδναίςζδ ηδξ ικήιδξ ή ζηδ κεονζηή πθαζηζηυηδηα (Colvis et al., 2005) Νεπξσληθή δηαθνξνπνίεζε ησλ πξνγνληθώλ θπηηάξσλ ηνπ θινηνύ Σεθζηυ απμηέθεζια υθςκ ηςκ παναπάκς νοειζζηζηχκ ιδπακζζιχκ ηςκ πνμβμκζηχκ ηοηηάνςκ ημο θθμζμφ είκαζ δ αοζηδνά εθεβπυιεκδ ηαζ ζοκημκζζιέκδ 43

44 Δζζαβςβή δζαθμνμπμίδζή ημοξ πνμξ ημοξ κεονζημφξ πθδεοζιμφξ ημο θθμζμφ. Ο εβηεθαθζηυξ θθμζυξ πενζθαιαάκεζ δφμ ηονίςξ ηφπμοξ κεονζηχκ ηοηηάνςκ, πνμαθδηζημφξ (projection) κεονχκεξ ηαζ δζάιεζμοξ κεονχκεξ (interneurons). Οζ πνμαθδηζημί κεονχκεξ απμηεθμφκ ηδ ιεβάθδ πθεζμρδθία ηςκ κεονχκςκ ημο θθμζμφ, πανάβμκηαζ απυ ηα πνμβμκζηά ηφηηανα ημο θθμζμφ, ιεηακαζηεφμοκ αηηζκςηά ιέπνζ ηδκ ηεθζηή ημοξ εέζδ ζημκ ζζηυ ηαζ πνδζζιμπμζμφκ βθμοηαιζκζηυ μλφ ςξ δζεβενηζηυ κεονμδζααζααζηή. Απυ ηδκ άθθδ ιενζά, μζ δζάιεζμζ κεονχκεξ πανάβμκηαζ ζημ οπμπζηχκζμ, απυ πνμβμκζηά ηφηηανα πμο εδνάγμοκ εηεί, ηαζ ζηδ ζοκέπεζα ιεηακαζηεφμοκ ζοιπηςηζηά (tangentially) πνμξ ημ θθμζυ. Οζ δζάιεζμζ κεονχκεξ ημο θθμζμφ είκαζ ακαζηαθηζημί κεονχκεξ ηαεχξ πνδζζιμπμζμφκ ημ β-αιζκμαμοηονζηυ μλφ (GABA) ςξ κεονμδζααζααζηή (Δζηυκα 1.11A). Σα κεονζηά ηφηηανα ημο θθμζμφ ζημ ζφκμθυ ημοξ ηαηακέιμκηαζ ζηζξ έλζ δζαθμνεηζηέξ ζηζαάδεξ (I-VI) ηδξ θθμζσηήξ πθάηαξ (cortical plate). Οζ δζάθμνμζ πθδεοζιμί ηςκ πνμαθδηζηχκ κεονχκςκ ημο θθμζμφ ζπδιαηίγμκηαζ ιε αάζδ έκα αοζηδνά μνζμεεηδιέκμ πνμκμθμβζηυ πνυηοπμ. Ο κεονζηυξ πθδεοζιυξ πμο πανάβεηαζ πνχημξ ζημκ ακαπηοζζυιεκμ κεμθθμζυ ιεηακαζηεφεζ αηηζκςηά έλς απυ ηδκ ημζθζαηή γχκδ ηαζ ζπδιαηίγεζ ιζα πανμδζηή γχκδ πμο μκμιάγεηαζ πνμθθμζσηή πθάηα (preplate). Καεχξ δ κεονμβεκεηζηή δζαδζηαζία ζοκεπίγεηαζ ζημ θθμζυ, μζ κεμζοκηζεέιεκμζ κεονχκεξ, ιεηακαζηεφμκηαξ αηηζκςηά, δζαιμνθχκμοκ ιζα κέα δζαζηνςιαηζηή δμιή πμο ηαθείηαζ θθμζσηή πθάηα (cortical plate) ιέζα ζηδκ πνμθθμζσηή πθάηα. Σμ βεβμκυξ αοηυ έπεζ ςξ απμηέθεζια ημ δζαπςνζζιυ ηδξ πνμθθμζσηήξ πθάηαξ ζε ιζα ελςηενζηή ζηζαάδα βκςζηή ςξ επζπείθζα ζηζαάδα (marginal zone) ηαζ ζηδκ εζςηενζηή οπμθθμζσηή πθάηα (subplate). Ζ επζπείθζα γχκδ απμηεθεί ηδ ζηζαάδα Η ημο θθμζμφ ηαζ είκαζ ιζα γχκδ ιε ζπεηζηά ιζηνυ ανζειυ ηοηηάνςκ, ιεηαλφ ηςκ μπμίςκ ηονίανπδ εέζδ ηαηέπμοκ μζ Cajal-Retzius κεονχκεξ, πμο εηθνάγμοκ ημκ ελαζνεηζηά ζδιακηζηυ βζα ηδ ζςζηή ακάπηολδ ημο θθμζμφ πανάβμκηα Reelin (Soriano and Del Rio, 2005). H οπμθθμζσηή πθάηα απυ ηδκ άθθδ ιενζά έπεζ ακαβκςνζζηεί ςξ ιζα πανμδζηή δμιή ζηδκ μπμία ηαηαθήβμοκ ηαηά ηφνζμ θυβμ μζ πνμζαβςβέξ κεονζηέξ χζεζξ απυ ημ εάθαιμ. Ζ θθμζσηή πθάηα δζεονφκεηαζ ζηδ ζοκέπεζα ιε ηδκ παναβςβή ηςκ κέςκ πθδεοζιχκ κεονχκςκ, μζ μπμίμζ ιεηακαζηεφμοκ ηαηά έκα «έζς πνμξ ηα έλς» αηηζκςηυ πνυηοπμ ηαεχξ μζ κεονχκεξ πμο ζπδιαηίγμκηαζ πνχημζ απμζηίγμοκ ηζξ ααεφηενεξ ζηζαάδεξ ηδξ θθμζσηήξ πθάηαξ ηαζ ηα ηφιαηα ηςκ ιεηέπεζηα παναβυιεκςκ κεονζηχκ ηοηηάνςκ ιεηακαζηεφμοκ ελςηενζηά ηςκ ηοηηάνςκ πμο δδιζμονβήεδηακ κςνίηενα χζηε κα εβηαηαζηαεμφκ ζηζξ πζμ επζθακεζαηέξ ζηζαάδεξ. Καη αοηυκ ημκ ηνυπμ, μζ κεονχκεξ ηςκ γςκχκ VI ηαζ V ζπδιαηίγμκηαζ πνχημζ αημθμοεμφιεκμζ απυ αοημφξ πμο απμζηίγμοκ ηζξ ζηζαάδεξ IV, III ηαζ II (Δζηυκα 1.11B). Μεηά ηδκ μθμηθήνςζδ ηδξ κεονμβεκεηζηήξ δζαδζηαζίαξ ζημκ ακαπηοζζυιεκμ θθμζυ (δδθαδή πενίπμο ζηδκ ειανοζηή δθζηία Δ17 ζημκ ιο) ανπίγεζ μ ζπδιαηζζιυξ ηςκ ηοηηάνςκ ηδξ βθμίαξ, δζαδζηαζία δ μπμία μθμηθδνχκεηαζ ιεηά ηδ βέκκδζδ ημο μνβακζζιμφ. Καεχξ μζ 44

45 Δζζαβςβή παναπάκς ακαπηολζαηέξ δζαδζηαζίεξ ααίκμοκ πνμξ μθμηθήνςζδ, ηα πνμβμκζηά ηφηηανα ηδξ ημζθζαηήξ ηαζ οπμημζθζαηήξ γχκδξ βνήβμνα ελακηθμφκηαζ, ηαζ ζηα εκήθζηα γχα ειθακίγεηαζ ιυκμ ιζα ιμκυζηζαδ επεκδοιαηζηή (ependymal) γχκδ δίπθα ζηζξ πθάβζεξ ημζθίεξ πμο απμηεθεί ιζα «θςθζά» (niche) παναβςβήξ μζθνδηζηχκ κεονχκςκ (Spassky et al., 2005; Zhao et al., 2008). Ενήλικο Δηθόλα Νεπξνγέλεζε ζηνλ εγθεθαιηθό θινηό. Α) Γηαδξνκέο κεηαλάζηεπζεο ησλ παξαγόκελσλ λεπξώλσλ ζην θινηό. Οη πξνβιεηηθνί λεπξώλεο ζρεκαηίδνληαη από πξνγνληθά θύηηαξα πνπ εληνπίδνληαη ζηηο λεπξνγελεηηθέο δώλεο ηνπ θινηνύ (έληνλε θόθθηλε γξακκή) θαη κεηαλαζηεύνπλ αθηηλσηά (θόθθηλα βέιε) γηα λα επνηθίζνπλ ηε θινητθή πιάθα. Αληίζεηα, νη δηάκεζνη λεπξώλεο ηνπ θινηνύ θαηάγνληαη από ηα πξνγνληθά θύηηαξα ηεο πιάγηαο θαη κέζεο γαγγιηαθήο πξνεμνρήο (έληνλε πξάζηλε γξακκή) θαη κεηαλαζηεύνπλ ζπκπησηηθά (πξάζηλα βέιε) γηα λα θηάζνπλ ζην θινηό. Β) Σν ζρήκα απεηθνλίδεη ηα ρξνληθά πιαίζηα ηεο λεπξνγελεηηθήο δηαδηθαζίαο ζην θινηό. Οη πξώηνη λεπξώλεο πνπ παξάγνληαη από ηα πξνγνληθά θύηηαξα ηεο θνηιηαθήο δώλεο (VZ) ζρεκαηίδνπλ ηελ πξνθινητθή πιάθα (PP). Οη κεηαγελέζηεξνη λεπξσληθνί πιεζπζκνί πνπ πξνέξρνληαη από ηελ θνηιηαθή θαη ππνθνηιηαθή δώλε (SVZ) εγθαζίζηαληαη ζηε θινητθή πιάθα (CP), δνκή ε νπνία δηαζπά ηελ πξνθινητθή πιάθα ζηελ επηρείιηα ζηηβάδα (MZ) θαη ηελ ππνθινητθή πιάθα (SP). Σα λεπξηθά θύηηαξα πνπ επνηθίδνπλ ηε θινητθή πιάθα θαηαλέκνληαη ζε έμη ζηηβάδεο θαηά ηξόπν εμαξηώκελν από ηε ρξνληθή ζηηγκή ηεο παξαγσγήο ηνπο: νη λεπξώλεο πνπ ζρεκαηίδνληαη πξώηνη θαηαιακβάλνπλ ηηο βαζύηεξεο θινητθέο ζηηβάδεο ελώ νη λεόηεξνη απνηθίδνπλ ηηο επηθαλεηαθέο ζηηβάδεο. Μεηά ηελ νινθιήξσζε ηεο δηαδηθαζίαο, νη λεπξνγελεηηθέο δώλεο κεηώλνληαη αηζζεηά θαη ζηνλ ελήιηθν θινηό ππάξρεη κόλν κηα κνλόζηηβε επελδπκαηηθή δώλε (Δ). ΗΕ, δηάκεζε δώλε. WM, ιεπθή νπζία. (Από (Merot et al., 2009)). 45

46 Δζζαβςβή Οζ πνμαθδηζημί κεονχκεξ ειθακίγμοκ δζαθμνεηζηά ιμνθμθμβζηά ηαζ ζοκαπηζηά παναηηδνζζηζηά πμο ημοξ δζαπςνίγμοκ αδνά ζε πέκηε ηαηδβμνίεξ: ηα ιεβάθα, ιεζαία ηαζ ιζηνά ποναιζδζηά ηφηηανα ηςκ ζηζαάδςκ II, III, ηαζ V, ηα ημηηζχδδ ηφηηανα ηδξ ζηζαάδαξ IV, ηαζ ηα πμθοιμνθζηά ηφηηανα ηδξ ζηζαάδαξ VI. Δπζπνυζεεηα, έπμοκ ανεεεί πμθθμί ιεηαβναθζημί πανάβμκηεξ πμο δνμοκ ζημκ πνμζδζμνζζιυ ηδξ ηαοηυηδηαξ ηςκ πνμαθδηζηχκ κεονχκςκ ημο θθμζμφ. Ο ιεηαβναθζηυξ πανάβμκηαξ Tbr1 εηθνάγεηαζ αιέζςξ ιυθζξ ηα πνυδνμια θθμζσηά ηφηηανα ανπίγμοκ κα δζαθμνμπμζμφκηαζ ηαζ ζοζζςνεφεηαζ ζημοξ κεονχκεξ πμο ηαηαθαιαάκμοκ ηδ ζηζαάδα VI ημο θθμζμφ (Bulfone et al., 1995). O πανάβμκηαξ ER81 εηθνάγεηαζ ζε έκα οπμζφκμθμ ηςκ πνυδνμιςκ ηοηηάνςκ ηαζ ζηδ ζοκέπεζα ζε έκα ιένμξ ηςκ κεονχκςκ ηδξ ζηζαάδαξ V ημο θθμζμφ, βεβμκυξ πμο πζεακχξ οπμδδθχκεζ υηζ ημ ιυνζμ ζοιιεηέπεζ ζημκ πνμζδζμνζζιυ ηςκ κεονχκςκ ηδξ ζηζαάδαξ αοηήξ (Hasegawa et al., 2004). Καηά πανυιμζμ ηνυπμ μ πανάβμκηαξ Cux2 παναηηδνίγεζ ηα πνυδνμια ηφηηανα ηδξ ΤΚΕ ηαζ ζηδ ζοκέπεζα ημοξ κεονχκεξ ηςκ ακχηενςκ ζηζαάδςκ ημο θθμζμφ (Nieto et al., 2004; Zimmer et al., 2004). Ο ιεηαβναθζηυξ πανάβμκηαξ Ctip2 εηθνάγεηαζ ζε κεονχκεξ ηςκ ζηζαάδςκ V ηαζ VI, εκχ απυ ηδκ άθθδ ιενζά μ πανάβμκηαξ Satb2 πενζμνίγεηαζ ζηζξ ζηζαάδεξ II-VI (Arlotta et al., 2005; Alcamo et al., 2008; Britanova et al., 2008). Άθθμζ ιεηαβναθζημί πανάβμκηεξ πμο ειθακίγμοκ παναηηδνζζηζηά πνυηοπα ηαηακμιήξ ζε δζαθμνεηζηέξ ζηζαάδεξ ηςκ κεονχκςκ ημο θθμζμφ είκαζ βζα πανάδεζβια μζ Foxp2 ηαζ Foxp1, Fez1 η.α. (Ferland et al., 2003; Inoue et al., 2004). Δπμιέκςξ, δζαθμνεηζημί οπυηοπμζ πνμαθδηζηχκ κεονχκςκ παναηηδνίγμκηαζ απυ ηδ ζοκδοαζιέκδ έηθναζδ δζαθμνεηζηχκ ιεηαβναθζηχκ παναβυκηςκ Μεηαλάζηεπζε ησλ λεπξώλσλ ηνπ θινηνύ Καηά ηδ κεονμβέκεζδ ζημκ εβηεθαθζηυ θθμζυ, ηα κεμζπδιαηζγυιεκα κεονζηά ηφηηανα πνέπεζ κα ιεηακαζηεφζμοκ απυ ηζξ κεονμβεκεηζηέξ γχκεξ παναβςβήξ ημοξ ζηζξ εέζεζξ θεζημονβίαξ ημοξ ζηδ θθμζσηή πθάηα, ζημ ελςηενζηυ υνζμ ημο θθμζμφ. Σζξ πενζζζυηενεξ θμνέξ δ δζαδζηαζία αοηή πνμτπμεέηεζ ηδ ιεηαηίκδζδ ηςκ κέςκ κεονχκςκ ζε ανηεηά ιεβάθεξ απμζηάζεζξ. Οζ πνμαθδηζημί κεονχκεξ ιεηακαζηεφμοκ αηηζκςηά βζα κα θηάζμοκ ζηδ θθμζσηή πθάηα ιε δφμ δζαθμνεηζημφξ ηνυπμοξ, ιε ιεηαηυπζζδ (translocation) ή ιεηαηίκδζδ (locomotion). Ο πνχημξ ηνυπμξ παναηδνείηαζ ηονίςξ ζηα πνχηα ζηάδζα ηδξ θθμζσηήξ κεονμβέκεζδξ, υηακ ημ πάπμξ ημο θθμζμφ είκαζ αηυια ιζηνυ (Nadarajah et al., 2002; Nadarajah and Parnavelas, 2002). Σα ηφηηανα πανμοζζάγμοκ ιζα ιαηνζά μδδβυ-πνμεηαμθή πμο είκαζ πνμζημθθδιέκδ ζηδκ ελςηενζηή επζθάκεζα ημο θθμζμφ (pia). ηδ ζοκέπεζα ιεηαηζκμφκ ημκ πονήκα ημοξ ηαηά ιήημξ αοηήξ ηδξ πνμεηαμθήξ ιέπνζ κα θηάζμοκ ζηδκ επζεοιδηή εέζδ ηαζ ηέθμξ απμζφνμοκ ηδκ πνμεηαμθή πμο 46

47 Δζζαβςβή αημθμοεεί (Kriegstein and Noctor, 2004). Καεχξ μ θθμζυξ ζηαδζαηά αολάκεηαζ ζε πάπμξ, ηα κεμζπδιαηζγυιεκα κεονζηά ηφηηανα οζμεεημφκ πζμ ελεγδηδιέκεξ ζηναηδβζηέξ βζα κα θηάζμοκ ζηδ εέζδ ημοξ ζηδ θθμζσηή πθάηα πμο πενζθαιαάκμοκ αζθκίδζεξ αθθαβέξ ζημ ηοηηανζηυ ζπήια, ζηδκ ηαηεφεοκζδ ηδξ ιεηαηίκδζδξ ηαζ ζηδκ ηαπφηδηα ηδξ ιεηακάζηεοζδξ (Tabata and Nakajima, 2003; Noctor et al., 2004). Οζ παναηδνήζεζξ αοηέξ μδήβδζακ ζηδ εεχνδζδ ηςκ ελήξ δζαηνζηχκ ζηαδίςκ ηαηά ηδκ αηηζκςηή ιεηακάζηεοζδ ηςκ πνμαθδηζηχκ κεονχκςκ: 1) ηα κεμζπδιαηζζεέκηα κεονζηά ηφηηανα, πμο ειθακίγμοκ παναηηδνζζηζηυ ζπήια ιε δφμ πνμεηαμθέξ, ιεηακαζηεφμοκ πνμξ ημ υνζμ οπμημζθζαηήξ-δζάιεζδξ γχκδξ 2) ζε αοηή ηδ εέζδ, μζ κέμζ κεονχκεξ παναιέκμοκ βζα έκα πνμκζηυ δζάζηδια ημ πμθφ 24 ςνχκ ηαζ ιεηαζπδιαηίγμκηαζ ζε ηφηηανα ιε ιζηνή ηζκδηζηυηδηα ηαζ ιε πμθθέξ δοκαιζηέξ πνμεηαμθέξ πμο ζοκεπχξ εηηείκμκηαζ ηαζ απμζφνμκηαζ. Μάθζζηα, ηάπμζμζ απυ αοημφξ ημοξ κεονχκεξ εηηείκμοκ πνμεηαμθέξ πμο ηαηεοεφκμκηαζ πίζς πνμξ ηδκ ημζθία ηαζ ιεηαημπίγμοκ ημ ηοηηανζηυ ημοξ ζχια πνμξ ηδκ ημζθία πνζκ ανπίζμοκ ηεθζηά κα ιεηακαζηεφμοκ αηηζκςηά 3) μζ κεονχκεξ οθίζηακηαζ βνήβμνδ ιεηαηίκδζδ μδδβμφιεκμζ απυ ηζξ ίκεξ ηςκ ηοηηάνςκ ηδξ αηηζκςηήξ βθμίαξ ιέπνζ κα θηάζμοκ ζημκ ηεθζηυ ημοξ πνμμνζζιυ, μπυηε ηαζ απαβηζζηνχκμκηαζ απυ ημ πθαίζζμ ζηήνζλδξ ηδξ αηηζκςηήξ βθμίαξ ηαζ ιεηαημπίγμοκ ημ ηοηηανζηυ ημοξ ζχια ιέζα ζηδ θθμζσηή πθάηα. ημ ζηάδζμ αοηυ μζ κεονχκεξ απμηημφκ εη κέμο δζπμθζηυ ζπήια. (Δζηυκα 1.12) (Kriegstein and Noctor, 2004; LoTurco and Bai, 2006). Οζ δζάιεζμζ κεονχκεξ ημο θθμζμφ βεκκζμφκηαζ απυ ηα πνμβμκζηά ηφηηανα ηςκ ααζζηχκ βαββθίςκ ηαζ ηονίςξ ηδξ ιέζδξ βαββθζαηήξ πνμελμπήξ (MGE) (Xu et al., 2003). Οζ δζάιεζμζ αοημί κεονχκεξ πνέπεζ ζηδ ζοκέπεζα κα ιεηακαζηεφζμοκ ζοιπηςηζηά πνμξ ημ κεμθθμζυ. Σα πνχηα ηφιαηα ηςκ δζάιεζςκ κεονχκςκ ζοζζςνεφμκηαζ ηονίςξ ζηδκ οπμημζθζαηή ηαζ ηδ δζάιεζδ γχκδ, εκχ επίζδξ εκημπίγμκηαζ ηαζ ζηδκ επζπείθζα ζηζαάδα ηαζ ηδκ οπμθθμζσηή πθάηα. Μυθζξ μζ δζάιεζμζ κεονχκεξ θηάζμοκ ζημ θθμζυ ανπίγμοκ πθέμκ κα ιεηαηζκμφκηαζ αηηζκςηά βζα κα θηάζμοκ ζηδκ ηεθζηή ημοξ εέζδ ζηδ θθμζσηή πθάηα (Kriegstein and Noctor, 2004). Δίκαζ αλζμζδιείςημ υηζ πμθθμί δζάιεζμζ κεονχκεξ θαίκεηαζ κα οζμεεημφκ πζμ πμθφπθμηα πνυηοπα ιεηακάζηεοζδξ, υπςξ βζα πανάδεζβια κα οθίζηακηαζ πνχηα ιζα ιεηαηίκδζδ πνμξ ηδκ ημζθζαηή γχκδ ηαζ ηδκ πθάβζα ημζθία πνζκ αθθάλμοκ ηαηεφεοκζδ ηαζ ανπίζμοκ κα ιεηακαζηεφμοκ αηηζκςηά πνμξ ηδ θθμζσηή πθάηα (Δζηυκα 1.12). Έπεζ πνμηαεεί υηζ ιε αοηήκ ηδ ζοιπενζθμνά μζ δζάιεζμζ κεονχκεξ δέπμκηαζ επζβεκεηζηέξ πθδνμθμνίεξ βζα ηδ ζςζηή ημοξ εέζδ ζηδ θθμζσηή πθάηα (Nadarajah et al., 2002; Nadarajah and Parnavelas, 2002). Δίκαζ αλζμεαφιαζημ υηζ μζ πνμαθδηζημί κεονχκεξ ηαζ μζ δζάιεζμζ κεονχκεξ πμο πνμμνίγμκηαζ κα επμζηίζμοκ ιζα ζοβηεηνζιέκδ ζηζαάδα ημο ακαπηοζζυιεκμο θθμζμφ θηάκμοκ ζημκ πνμμνζζιυ ημοξ ζπεδυκ ηαοηυπνμκα (Kriegstein and Noctor, 2004). 47

48 Δζζαβςβή ηακ μζ κεονχκεξ ημο θθμζμφ ηαηαθάαμοκ ηδκ ηεθζηή ημοξ εέζδ ζηδ θθμζσηή πθάηα, ανπίγεζ δ δζαδζηαζία ζπδιαηζζιμφ ηςκ δεκδνζηχκ ηαζ ηςκ αλυκςκ ημοξ χζηε κα μθμηθδνχζμοκ ηζξ ζοκάρεζξ ημοξ ιεζα ζημ ακαδουιεκμ θθμζσηυ ηφηθςια. Δηθόλα Πξόηππα κεηαλάζηεπζεο ηωλ πξνβιεηηθώλ θαη δηάκεζωλ λεπξώλωλ ηνπ θινηνύ. Σν ζρήκα απεηθνλίδεη ηε ζύγθιηζε ησλ δηαδξνκώλ κεηαλάζηεπζεο ησλ δηάκεζσλ (θόθθηλν) θαη ησλ πξνβιεηηθώλ λεπξώλσλ (ζθνύξν πξάζηλν) ηνπ θινηνύ. Οη λενζρεκαηηδόκελνη πξνβιεηηθνί λεπξώλεο κεηαλαζηεύνπλ αξρηθά πξνο ην όξην ππνθνηιηαθήο-δηάκεζεο δώλεο (SVZ-IZ) θαη από εθεί πξνο ηελ ηειηθή ηνπο ζέζε ζηε θινητθή πιάθα (CP). Έλα ππνζύλνιν απηώλ ζα θηλεζεί εθ λένπ πξνο ηελ θνηιία πξηλ ηελ ηειηθή ηνπο αθηηλσηή κεηαλάζηεπζε πξνο ηε θινητθή πιάθα. Οη δηάκεζνη λεπξώλεο πνπ πξνέξρνληαη από ηηο γαγγιηαθέο πξνεμνρέο εηζέξρνληαη ζην λενθινηό θπξίσο κέζσ ηεο ππνθνηιηαθήο δώλεο θαη ζηε ζπλέρεηα κεηαλαζηεύνπλ αθηηλσηά πξνο ηε θινητθή πιάθα. Δίλαη ραξαθηεξηζηηθό όηη θαη νη δηάκεζνη λεπξώλεο κπνξεί λα θαηεπζπλζνύλ πξώηα πξνο ηελ θνηιία πξηλ ηε κεηαλάζηεπζε ζηελ ηειηθή ηνπο ζέζε. (Από (Kriegstein and Noctor, 2004)). Ζ αηεθήξ νφειζζδ ηςκ ιδπακζζιχκ ηδξ κεονμβέκεζδξ ζημ θθμζυ απμηεθεί πδβή πμθθχκ κεονμθμβζηχκ δζαηαναπχκ υπςξ δ επζθδρία, δ ζμαανή βκςζηζηή ακζηακυηδηα, δ κμδηζηή οζηένδζδ, μ αοηζζιυξ ηαζ δ ζπζγμθνέκεζα (Ross and Walsh, 2001), εκχ αηυια ηαζ δζαηαναπέξ ζημκ πμθθαπθαζζαζιυ ηςκ πνμβμκζηχκ κεονζηχκ ηοηηάνςκ ιπμνεί κα μδδβήζεζ ζε θθμζσηέξ δοζιμνθίεξ ηυζμ ζμαανέξ υζμ βζα πανάδεζβια δ «θοζεβηεθαθία» (lissencephaly) ή δ «ακεβηεθαθία» (anencephaly). Δπζπθέμκ, έπμοκ πενζβναθεί ηαζ πενζπηχζεζξ ζοζπέηζζδξ δζαθυνςκ βκςζηζηχκ δζαηαναπχκ ιε ιεηαθθάλεζξ ζε βμκίδζα ζοβηεηνζιέκςκ ιεηαβναθζηχκ παναβυκηςκ υπςξ επίζδξ ηαζ ζε βμκίδζα πνςηεσκχκ πμο ειπθέημκηαζ ζημοξ επζβεκεηζημφξ ιδπακζζιμφξ ακαδζαιυνθςζδξ ηδξ πνςιαηίκδξ (Cho et al., 2004; Ellison-Wright et al., 2004). Δίκαζ επμιέκςξ πνμθακέξ υηζ δ δζαθεφηακζδ ηςκ νοειζζηζηχκ 48

49 Δζζαβςβή ιδπακζζιχκ ηδξ κεονμβέκεζδξ ζημκ εβηεθαθζηυ θθμζυ ηαζ δ ηαοημπμίδζδ κέςκ παναβυκηςκ πμο επζδνμφκ ζηα θαζκυιεκα αοημ-ακακέςζδξ ηαζ δζαθμνμπμίδζδξ ηςκ πνμβμκζηχκ κεονζηχκ ηοηηάνςκ ημο θθμζμφ ιπμνεί κα ζοιαάθθμοκ ζηδκ εφνεζδ κέςκ πνμζεββίζεςκ βζα ηδκ ακηζιεηχπζζδ ηςκ δζαθυνςκ κεονμθμβζηχκ δζαηαναπχκ. Κεθάιαην 2. Ζ πξσηεΐλε Geminin απνηειεί έλα λέν ζπλδεηηθό θξίθν ησλ δηαδηθαζηώλ πνιιαπιαζηαζκνύ θαη δηαθνξνπνίεζεο ησλ πξνγνληθώλ θπηηάξσλ Ζ πνςηεΐκδ Geminin ζοκζζηά έκακ πανάβμκηα πμο αθθδθμζοκδέεζ ημοξ ιδπακζζιμφξ ηοηηανζημφ πμθθαπθαζζαζιμφ ηαζ δζαθμνμπμίδζδξ, δ αοζηδνή νφειζζδ ηςκ μπμίςκ δζαζθαθίγεζ ημ ζςζηυ ζπδιαηζζιυ ημο εβηεθαθζημφ θθμζμφ. Ζ ανπζηή ηαοημπμίδζδ ημο ιμνίμο ηδξ Geminin αθμνμφζε ηδ ζοιιεημπή ημο ζηδ νφειζζδ ημο ηοηηανζημφ ηφηθμο (McGarry and Kirschner, 1998). Σαοηυπνμκα υιςξ ανέεδηε υηζ δ πνςηεΐκδ Geminin πνμάβεζ ηδ κεονμπμίδζδ ελςδενιζηχκ ηοηηάνςκ ηαηά ηδ βαζηνζδίςζδ ηςκ ειανφςκ ημο Xenopus laevis (Kroll et al., 1998) Γνκή ηεο πξσηεΐλεο Μεηά ηδκ πνχηδ ηαοημπμίδζδ ηδξ πνςηεΐκδξ ζημ Xenopus laevis, μιυθμβα βμκίδζα πενζβνάθδηακ επίζδξ ζημκ άκενςπμ (Homo sapiens), ζημκ ιο (Mus musculus), ημ ράνζ Medaka (Oryzias latipes), ηδ Drosophila melanogaster, ημ Caenorhabdtitis elegans, εκχ πνυζθαηα ηαοημπμζήεδηε ηαζ ζημ θοηυ Arabidopsis (Kroll et al., 1998; McGarry and Kirschner, 1998; Quinn et al., 2001; Del Bene et al., 2004; Yanagi et al., 2005; Wildwater et al., 2007). Καεχξ δεκ έπεζ ακαβκςνζζηεί ηάπμζμ μιυθμβμ βμκίδζμ ζε ηαηχηενμοξ ελεθζηηζηά μνβακζζιμφξ, πζζηεφεηαζ υηζ δ πνςηεΐκδ ανίζηεηαζ ιυκμ ζηα ιεηάγςα. Σμ ιέβεεμξ ηδξ πνςηεΐκδξ ηοιαίκεηαζ απυ 206 αιζκμλέα ζημκ ιο, ζε 209 αιζκμλέα ζημκ άκενςπμ ηαζ ζε 220 ζημ Xenopus laevis. Ζ δμιή ηδξ πνςηεΐκδξ έπεζ ιεθεηδεεί εηηεηαιέκα (Kroll et al., 1998; McGarry and Kirschner, 1998; Benjamin et al., 2004; Lee et al., 2004; Okorokov et al., 2004; Saxena et al., 2004; Thepaut et al., 2004; De Marco et al., 2009). Κονίανπμ παναηηδνζζηζηυ ημο ιμνίμο ηδξ Geminin απμηεθεί ημ ιμηίαμ ζπεζνμεζδμφξζπεζνάιαημξ (coiled-coil) πμο ηαηαθαιαάκεζ ημ ηεκηνζηυ ηιήια ηδξ πνςηεΐκδξ (Δζηυκα 1.13). Σμ ιμηίαμ αοηυ απμηεθείηαζ απυ πέκηε επακαθήρεζξ επηά αιζκμλέςκ ηαζ ζοκζζηά ηδκ πενζμπή πμο δζαιεζμθααεί ημ δζιενζζιυ ηαζ ηζξ πενζζζυηενεξ πνςηεσκζηέξ αθθδθεπζδνάζεζξ ηαζ δνάζεζξ ημο ιμνίμο: ιέζς ημο ζπεζνμεζδμφξ- 49

50 Δζζαβςβή ζπεζνάιαημξ δ πνςηεΐκδ Geminin αθθδθεπζδνά ιε ημ ιυνζμ Cdt1 (Wohlschlegel et al., 2000; Tada et al., 2001) ηαζ ιε πανάβμκηεξ υπςξ μζ Hox (Luo et al., 2004) ηαζ μζ ERNI ηαζ BERT (Papanayotou et al., 2008). hgeminin Destruction box Neuralizing domain NLS Cdt1 interacting domain Coiled-coil domain Replication inhibition activity Brg1 interacting domain Dimerization domain Hox interaction domain Six3 interacting domain Δηθόλα Γνκή ηεο πξωηεΐλεο Geminin ηνπ αλζξώπνπ. Σν ακηλνηειηθό άθξν ηνπ κνξίνπ πεξηθιείεη ην ζήκα γηα ηελ απνηθνδόκεζε ηεο πξσηεΐλεο (destruction box), ηελ ππεύζπλε αθνινπζία γηα ηηο λεπξνπνηεηηθέο δξάζεηο ηνπ κνξίνπ (neuralizing domain) αιιά θαη ην ζήκα ππξεληθνύ εληνπηζκνύ (NLS, nuclear localization signal). Σν θεληξηθό ηκήκα ηεο πξσηεΐλεο πεξηιακβάλεη ην κνηίβν ζπεηξνεηδνύο-ζπεηξάκαηνο (coiled-coil domain), ην νπνίν δηακεζνιαβεί πνιιέο από ηηο δξάζεηο ηνπ κνξίνπ, όπσο ην δηκεξηζκό ηνπ (dimerization domain) θαη ηηο αιιειεπηδξάζεηο κε ηνπο παξάγνληεο Cdt1, Hox, ERNI θαη BERT. ην θαξβνμπηειηθό άθξν ηνπ κνξίνπ έρεη ραξηνγξαθεζεί ε πεξηνρή αιιειεπίδξαζεο κε ηνλ παξάγνληα Brg1. Ζ αιιειεπίδξαζε κε ηνλ κεηαγξαθηθό παξάγνληα Six3 απαηηεί νιόθιεξν ην κόξην ηεο Geminin ελώ ε πεξηνρή αιιειεπίδξαζεο κε ην ζύκπινθν Polycomb δελ έρεη ραξηνγξαθεζεί αθόκα. Σμ αιζκμηεθζηυ ηιήια ηδξ πνςηεΐκδξ πενζέπεζ ηδκ αθθδθμοπία απμζημδυιδζδξ (destruction box). Σμ ιυνζμ ηδξ Geminin απμζημδμιείηαζ ηαηά ηδ ιίηςζδ, ιέζς μοαζημοσηζκοθίςζδξ (ubiquitination) απυ ημ ζφιπθμημ πνμχεδζδξ ηδξ ακάθαζδξ (anaphase promoting complex, APC) (McGarry and Kirschner, 1998). ε ημκηζκή βεζημκία ιε ηδκ αθθδθμοπία απμζημδυιδζδξ εκημπίγεηαζ ημ ζήια βζα ημκ πονδκζηυ εκημπζζιυ ηδξ πνςηεΐκδξ (nuclear localization signal, NLS), ημ μπμίμ εοεφκεηαζ βζα ημκ πονδκζηυ εκημπζζιυ ηδξ πνςηεΐκδξ πμο είκαζ απαναίηδημξ βζα ηδ δνάζδ ηδξ (Hodgson et al., 2002; Arias and Walter, 2005; Li and Blow, 2004a; Yoshida et al., 2005; Boos et al., 2006; Luo et al., 2007). ημ αιζκμηεθζηυ ηιήια ημο ιμνίμο εκημπίγεηαζ επίζδξ δ πενζμπή πμο έπεζ πνμηαεεί υηζ ιπμνεί κα ηαεμδδβήζεζ ελςδενιζηά ηφηηανα πνμξ δζαθμνμπμίδζδ ζε κεονζηυ θαζκυηοπμ ηαηά ηα ανπζηά ζηάδζα ηδξ ακάπηολδξ (neuralizing domain) (Kroll et al., 1998). 50

51 Δζζαβςβή ημ ηαναμλοηεθζηυ ηιήια ηδξ πνςηεΐκδξ εκημπίγεηαζ δ πενζμπή πμο δζαιεζμθααεί ηδκ αθθδθεπίδναζδ ημο ιμνίμο ηδξ Geminin ιε ηζξ ηαηαθοηζηέξ οπμιμκάδεξ Brahma (Brm) ηαζ Brahma-related gene 1 (Brg1) ημο ζοιπθυημο ακαδζαιυνθςζδξ ηδξ πνςιαηίκδξ SWI/SNF (Seo et al., 2005a). Ζ αθθδθεπίδναζδ αοηή είκαζ ηαεμνζζηζηήξ ζδιαζίαξ βζα ηδκ ζζμννμπία ηοηηανζημφ πμθθαπθαζζαζιμφ - δζαθμνμπμίδζδξ. Δπζπνυζεεηα, ημ ιυνζμ ηδξ Geminin θςζθμνοθζχκεηαζ απυ ηδκ ηζκάζδ CKIΗ ηαζ δ θςζθμνοθίςζδ αοηή νοειίγεζ ηδκ ηαηάηιδζδ πμο οθίζηαηαζ δ Geminin ηαηά ημ θαζκυιεκμ ημο πνμβναιιαηζζιέκμο ηοηηανζημφ εακάημο απυ ηδκ εκενβμπμζδιέκδ Caspase3 ζηζξ εέζεζξ 170 ηαζ 204 (Kulartz et al., 2004; Roukos et al., 2007; Auziol et al., 2007). Οζ πμθθαπθέξ αθθδθεπζδνάζεζξ ηδξ Geminin απμηεθμφκ ηδ αάζδ ηδξ ζηακυηδηαξ ημο ιμνίμο κα εθέβπεζ ηζξ δζαδζηαζίεξ ημο ηοηηανζημφ ηφηθμο ηαζ ηδξ ηοηηανζηήξ δζαθμνμπμίδζδξ Ζ πξσηεΐλε Geminin δηαζθαιίδεη ηελ νκαιή δηεμαγσγή ηνπ θπηηαξηθνύ θύθινπ Ζ πνχηδ ιεθέηδ ηδξ πνςηεΐκδξ Geminin ζημ Xenopus laevis έηακε θυβμ βζα έκα ιυνζμ πμο ακαζηέθθεζ ηδ δζαδζηαζία ακηζβναθήξ ημο DNA πανειπμδίγμκηαξ ημ θυνηςια ημο ζοιπθυημο MCM ζηδ πνςιαηίκδ. Καηέζηδ επίζδξ ειθακέξ υηζ ημ ιυνζμ πανμοζζάγεζ δζαηοιάκζεζξ ζηα επίπεδα έηθναζήξ ημο, ηαεχξ απμοζζάγεζ απυ ηα ηφηηανα πμο ανίζημκηαζ ζηδ G1 θάζδ ημο ηοηηανζημφ ηφηθμο ηαζ ζοζζςνεφεηαζ ζηα ηφηηανα ηαηά ηζξ θάζεζξ S, G2 ηαζ M, μπυηε ηαζ απμζημδμιείηαζ ζηδ ιεηάααζδ απυ ηδ ιεηάθαζδ ζηδκ ακάθαζδ (McGarry and Kirschner, 1998). Σμ ελεζδζηεοιέκμ αοηυ πνυηοπμ έηθναζδξ έπεζ επζαεααζςεεί ηαζ ζε άθθα αζμθμβζηά ζοζηήιαηα υπςξ δ Drosophila melanogaster (Quinn et al., 2001), δζάθμνεξ ηανηζκζηέξ ηοηηανζηέξ ζεζνέξ (Nishitani et al., 2000; Xouri et al., 2004) ηαζ ηα κεονζηά πνμβμκζηά ηφηηανα ημο ιουξ (Spella et al., 2007). Ζ δνάζδ ηδξ Geminin ζηδ νφειζζδ ηδξ ακηζβναθήξ ημο DNA δζαιεζμθααείηαζ απυ ηδκ αθθδθεπίδναζδ ιε ηδκ πνςηεΐκδ Cdt1 (Wohlschlegel et al., 2000; Tada et al., 2001) (Δζηυκα 1.14). Ζ έκανλδ ηδξ ακηζβναθήξ ημο DNA ζηα εοηανοςηζηά ηφηηανα πνμτπμεέηεζ ηδκ πνυζδεζδ ζηα ζδιεία έκανλδξ ηδξ ακηζβναθήξ (origins of replication) εκυξ ζοιπθυημο πνςηεσκχκ πμο ακαβκςνίγμοκ αοηέξ ηζξ πενζμπέξ (origin recognition complex, ORC). Οζ πανάβμκηεξ ORC ζηναημθμβμφκ ζηδ ζοκέπεζα ηαηά ηδκ G1 θάζδ ηα ιυνζα Cdc6 ηαζ Cdt1, ηα μπμία ιε ηδ ζεζνά ημοξ πνμζεθηφμοκ ηζξ πνςηεΐκεξ MCM (minichromosome maintenance complex) χζηε κα ζπδιαηζζηεί ημ θεβυιεκμ πνμ-ακηζβναθζηυ ζφιπθμημ (pre-replication complex, pre-rc). Μεηά ηδκ αδεζμδυηδζδ ηςκ ζδιείςκ έκανλδξ ηαζ ηδκ πονμδυηδζδ ηδξ ακηζβναθήξ ηαηά ηδκ έκανλδ ηδξ S θάζδξ, ημ pre-rc δζαζπάηαζ βζα κα λακαζπδιαηζζηεί ιυκμ ζηδκ 51

52 Δζζαβςβή επυιεκδ G1 θάζδ (Nishitani et al., 2000; Maiorano et al., 2000). Ζ δζαζθάθζζδ ηδξ ακηζβναθήξ ημο DNA ιυκμ ιία θμνά ακά ηοηηανζηυ ηφηθμ πενζθαιαάκεζ ηδκ αοζηδνή νφειζζδ ηςκ ιεθχκ ημο πνμ-ακηζβναθζημφ ζοιπθυημο. Σα επίπεδα ηδξ πνςηεΐκδξ Cdt1 βεκζηά εθέβπμκηαζ ιέζς πνςηευθοζδξ ιυθζξ ανπίζεζ δ ακηζβναθή ημο DNA ηαηά ηδκ S θάζδ (Nishitani et al., 2004; Fujita, 2006; Nishitani et al., 2006). ημοξ ακχηενμοξ εοηανοςηζημφξ μνβακζζιμφξ ημ ιυνζμ νοειίγεηαζ επζπθέμκ απυ ημκ πνςηεσκζηυ ακαζημθέα Geminin, μ μπμίμξ αθθδθεπζδνά ηαζ ακαζηέθθεζ ηδ θεζημονβία ημο Cdt1 ηαηά ηζξ θάζεζξ S-G2-M (Wohlschlegel et al., 2000; Tada et al., 2001). ORC Cdc6 Cdt1 Geminin Cul4-DDB1 Cdt2 SCF Skp2 MCM pre-rc Δηθόλα Ο ξόινο ηεο πξωηεΐλεο Geminin ζηε ξύζκηζε ηνπ θπηηαξηθνύ θύθινπ. Καηά ηελ G1 θάζε ηνπ θύθινπ επηηειείηαη ν ζηαδηαθόο ζρεκαηηζκόο ηνπ πξναληηγξαθηθνύ ζπκπιόθνπ (pre-rc) κε ηε ζηξαηνιόγεζε ζηα ζεκεία έλαξμεο (origins) ηεο αληηγξαθήο ηνπ DNA ησλ παξαγόλησλ Orc, Cdc6, Cdt1 θαη MCM. Μόιηο ππξνδνηεζεί ε αληηγξαθή θαηά ηελ έλαξμε ηεο θάζεο S, ηα κέιε ηνπ pre-rc ππόθεηληαη ζε απζηεξή ξύζκηζε πξνθεηκέλνπ λα δηαζθαιηζηεί όηη ε αληηγξαθή ηνπ DNA από θάζε ζεκείν έλαξμεο ζα γίλεη κόλν κία θνξά αλά θπηηαξηθό θύθιν. Ο παξάγνληαο Cdt1 πθίζηαηαη πξσηεόιπζε από ηα κνλνπάηηα Cul4-DDB1 Cdt1 θαη SCF Skp2 θαηά ηε θάζε S, αιιά επηπιένλ αλαζηέιιεηαη θαη από ηελ αιιειεπίδξαζή ηεο κε ηελ πξσηεΐλε Geminin θαηά ηηο θάζεηο S/G2/M, δηαζθαιίδνληαο κε απηόλ ηνλ ηξόπν ηε ζσζηή αληηγξαθή ηνπ γελσκηθνύ πιηθνύ θαη ηε γνληδησκαηηθή ζηαζεξόηεηα. (Σξνπνπνηεκέλν από (Pitulescu et al., 2005)). Ζ ζζμννμπδιέκδ έηθναζδ ηςκ Geminin ηαζ Cdt1 ηαηά ηδ δζάνηεζα ημο ηοηηανζημφ ηφηθμο είκαζ ελαζνεηζηήξ ζδιαζίαξ βζα ηδ δζαηήνδζδ ηδξ βμκζδζςιαηζηήξ ζηαεενυηδηαξ (Melixetian and Helin, 2004; Saxena and Dutta, 2005). Ζ απμζζχπδζδ ηδξ Geminin ηαηά ηδκ ακάπηολδ ειανφςκ Xenopus laevis έπεζ ςξ απμηέθεζια ηδκ παφζδ ημο ηοηηανζημφ ηφηθμο ζηδ θάζδ G2 (McGarry, 2002). Πεζνάιαηα ζε θοζζμθμβζηέξ ηαζ ηανηζκζηέξ ηοηηανζηέξ ζεζνέξ έδεζλακ υηζ δ απαθμζθή ηςκ επζπέδςκ 52

53 Δζζαβςβή ηδξ Geminin μδήβδζε ζηδκ εη κέμο ακηζβναθή ημο DNA ζημκ ίδζμ ηοηηανζηυ ηφηθμ ηαζ ημ ζπδιαηζζιυ βζβακηζαίςκ πονήκςκ (Melixetian et al., 2004; Zhu et al., 2004). H οπενέηθναζδ ηδξ Geminin ζε δζάθμνεξ ηοηηανζηέξ ζεζνέξ ζοκεηέθεζε ζηδκ παφζδ ημο πμθθαπθαζζαζιμφ ηαηά ηνυπμ ελανηχιεκμ απυ ημκ ηοηηανζηυ ηφπμ ηαζ ζηδκ επαβςβή ηοηηανζημφ εακάημο (Shreeram et al., 2002). Ζ ζδιαζία ηδξ Geminin βζα ηδ δζαηήνδζδ ηδξ βμκζδζςιαηζηήξ ζηαεενυηδηαξ απμηοπχκεηαζ ηαζ ζημ βεβμκυξ υηζ ηα επίπεδα έηθναζδξ ηδξ πνςηεΐκδξ ειθακίγμκηαζ απμνοειζζιέκα ζε πμθθμφξ ηφπμοξ ηανηίκμο (Wohlschlegel et al., 2002; Gonzalez et al., 2004; Karakaidos et al., 2004; Xouri et al., 2004; Bravou et al., 2005; Montanari et al., 2006; Petropoulou et al., 2008; Salabat et al., 2008). Παν υθ αοηά, ζε άθθα αζμθμβζηά ζοζηήιαηα δ ελάθεζρδ ή δ οπενέηθναζδ ηδξ Geminin δεκ μδήβδζακ ζε ηάπμζα ζδζαίηενδ βμκζδζςιαηζηή αζηάεεζα, ηαεζζηχκηαξ ειθακέξ υηζ μ ιδπακζζιυξ ηδξ ακηζβναθήξ ημο DNA εθέβπεηαζ ηαζ απυ πνυζεεημοξ πανάβμκηεξ (Saxena and Dutta, 2005) H πξσηεΐλε Geminin απνηειεί έλα ζεκαληηθό ξπζκηζηή ηεο θπηηαξηθήο δηαθνξνπνίεζεο Σαοηυπνμκα ιε ηδκ ηαοημπμίδζδ ημο νυθμο ηδξ Geminin ζηδ νφειζζδ ημο ηοηηανζημφ ηφηθμο πενζβνάθδηε μ θοζζμθμβζηυξ νυθμξ ηδξ πνςηεΐκδξ ηαηά ηα πνχζια ζηάδζα ζπδιαηζζιμφ ημο κεονζημφ ζοζηήιαημξ (Kroll et al., 1998). Πανά ημ βεβμκυξ υηζ μ ακαπηολζαηυξ νυθμξ ηδξ Geminin δζενεοκήεδηε εηηεηαιέκα, ηα δεδμιέκα ήηακ ζοπκά ακηζηνμουιεκα ηαζ ελανηχιεκα απυ ημ αζμθμβζηυ ζφζηδια πμο πνδζζιμπμζήεδηε, ιε απμηέθεζια μ ιδπακζζιυξ δνάζδξ ηδξ πνςηεΐκδξ κα παναιέκεζ αηυια άβκςζημξ Η έθθξαζε ηεο Geminin ραξαθηεξίδεη ηελ αδηαθνξνπνίεηε θαηάζηαζε ηωλ πξνγνληθώλ λεπξηθώλ θπηηάξωλ H πνςηεΐκδ Geminin ζημ Xenopus laevis εηθνάγεηαζ απυ ηα πνχηα ηζυθαξ ζηάδζα ηδξ ακάπηολήξ ημο, υπμο ηαηά ημ ζηάδζμ ημο βαζηνζδίμο ζοζζςνεφεηαζ ζημ ιεθθμκηζηυ κεονζηυ ζζηυ (Kroll et al., 1998). ημ ζηάδζμ αοηυ δ έηθναζδ ηδξ Geminin μνζμεεηεί ηδ ιεθθμκηζηή κεονζηή πθάηα ηαζ ημκ πθδεοζιυ ηςκ πνμβμκζηχκ κεονζηχκ ηοηηάνςκ (Kroll et al., 1998; Papanayotou et al., 2008). Tμ πνυηοπμ έηθναζήξ ηδξ ιάθζζηα είκαζ πανυιμζμ ιε αοηυ ηςκ ιεηαβναθζηχκ παναβυκηςκ Sox2 ηαζ Sox3, μζ μπμίμζ απμηεθμφκ ιυνζα-δείηηεξ ηςκ πνμβμκζηχκ κεονζηχκ ηοηηάνςκ (Kroll et al., 1998; Seo et al., 2005a). ε ιεηαβεκέζηενα ζηάδζα ηδξ ακάπηολδξ ημο Xenopus δ πνςηεΐκδ Geminin ιπμνεί κα ακζπκεοηεί ζε πενζμπέξ ημο εβηεθάθμο ηαζ ημο ναπζαίμο κεονζημφ ζςθήκα αθθά ηαζ ζε δμιέξ ημο ιαηζμφ, ημο αοηζμφ ηαζ ηδξ ιφηδξ, εκχ ακηίζημζπδ θαίκεηαζ κα είκαζ δ έηθναζδ ημο ιμνίμο ηαζ ηαηά ηδκ 53

54 Δζζαβςβή ακάπηολδ ημο ρανζμφ Oryzias latipes, υπμο δ Geminin ειθακίγεηαζ ζημ πνυδνμιμ κεονμελχδενια, ζηα μπηζηά ηοζηίδζα ηαζ ημκ πνυζεζμ εβηέθαθμ (Kroll et al., 1998; Del Bene et al., 2004). ηα ακαπηοζζυιεκα έιανοα ημο ιουξ δ πνςηεΐκδ Geminin ειθακίγεζ εονφ πνυηοπμ ηαηακμιήξ, ιεηαλφ άθθςκ ζηα ζπδιαηζγυιεκα ζοζηήιαηα αζιμπμζδηζηυ ηαζ ηεκηνζηυ κεονζηυ (Spella et al., 2007; Karamitros et al., 2010). Σα επίπεδα έηθναζδξ ηδξ Geminin οθίζηακηαζ πμθθαπθά ζδιεία εθέβπμο, ηα μπμία πενζθαιαάκμοκ ηδκ πνςηευθοζδ ηδξ πνςηεΐκδξ απυ ημ APC, ηδκ έλμδυ ηδξ απυ ημκ πονήκα, ηδ ιδ-πνςηεμθοηζηή ακαζημθή ηδξ αθθά ηαζ ηδ νφειζζή ηδξ ζε ιεηαβναθζηυ επίπεδμ απυ ημοξ E2F ιεηαβναθζημφξ πανάβμκηεξ (McGarry and Kirschner, 1998; Hodgson et al., 2002; Benjamin et al., 2004; Li and Blow, 2004b; Markey et al., 2004; Yoshida and Inoue, 2004) ε υθα ηα γςζηά ιμκηέθα πμο ιεθεηήεδηακ δ Geminin παναηηδνίγεζ ηα πνμβμκζηά, αδζαθμνμπμίδηα ηφηηανα ημο ακαπηοζζυιεκμο κεονζημφ ζοζηήιαημξ, εκχ ηα επίπεδα έηθναζήξ ηδξ ηαηαζηέθθμκηαζ ιε ηδκ επαβςβή ηδξ δζαθμνμπμίδζδξ (Quinn et al., 2001; Seo et al., 2005a; Spella et al., 2007). ημκ εβηέθαθμ ηςκ εκήθζηςκ ιοχκ, έηθναζδ ηδξ Geminin εκημπίγεηαζ ζηζξ δφμ πενζμπέξ ημο εβηεθάθμο πμο ζοκεπίγμοκ κα ειθακίγμοκ κεονμβεκεηζηή δναζηδνζυηδηα, δδθαδή ζηδκ οπμημζθζαηή γχκδ ημο θθμζμφ ηαζ ζηδκ μδμκηςηή έθζηα ημο ζππμηάιπμο, υπμο ηαζ πάθζ πνμζδζμνίγεζ ηα πνυδνμια ηφηηανα (Spella et al., 2007). Σα δεδμιέκα αοηά πνμηείκμοκ υηζ δ Geminin έπεζ ηάπμζμ νυθμ ζημκ ηαεμνζζιυ ηςκ κεονζηχκ πνμβμκζηχκ ηοηηάνςκ ηαζ ζηδ νφειζζδ ηδξ ιεηάααζδξ απυ ηδκ ηαηάζηαζδ πμθθαπθαζζαζιμφ ζηδκ ηαηάζηαζδ δζαθμνμπμίδζδξ Η Geminin επάγεη ηνλ θαζνξηζκό ηωλ λεπξηθώλ πξνγνληθώλ θπηηάξωλ θαη ηελ νξηνζέηεζε ηεο λεπξηθήο πιάθαο θαηά ηα πξώηκα ζηάδηα ηεο αλάπηπμεο H πνχηδ έκδεζλδ βζα ημ νυθμ ηδξ Geminin ηαηά ηδκ ακάπηολδ δυεδηε απυ πεζνάιαηα οπενέηθναζδξ ηδξ πνςηεΐκδξ ζε έιανοα Xenopus laevis ηαηά ημ ζηάδζμ ηδξ βαζηνζδίςζδξ πμο είπακ ςξ ζοκέπεζα ηδκ επέηηαζδ ηδξ κεονζηήξ πθάηαξ ηαζ ηδ ιεηαηνμπή ηςκ ελςδενιζηχκ ηοηηάνςκ ζε κεονζηά. H δνάζδ αοηή δζαιεζμθααήεδηε απυ ηδκ επαβςβή ηδξ έηθναζδξ κεονζηχκ δεζηηχκ ηαζ ηδκ ακηίζημζπδ ηαηαζημθή ηδξ έηθναζδξ ιδ κεονζηχκ δεζηηχκ, βεβμκυξ πμο μδήβδζε ζημκ παναηηδνζζιυ ηδξ πνςηεΐκδξ ςξ «κεονμπμζδηζηυ ιυνζμ». Σα έιανοα αοηά ηεθζηά ειθάκζζακ ζδζαίηενα ακαπηοβιέκδ ναπζαία κεονζηή πενζμπή εζξ αάνμξ ημο ημζθζαημφ ελςδένιαημξ (Kroll et al., 1998). Πανυιμζεξ ιεθέηεξ έβζκακ ηαζ ζε έιανοα Drosophila melanogaster, υπμο επίζδξ επζαεααζχεδηε δ κεονμπμζδηζηή δνάζδ ημο ιμνίμο ηδξ Geminin. Πεζνάιαηα οπενέηθναζδξ ζηα έιανοα αοηά μδήβδζακ ζημ ζπδιαηζζιυ εηημπζηχκ κεονζηχκ ηοηηάνςκ, βεβμκυξ πμο ζοκδβμνεί οπέν ηδξ ζηακυηδηαξ ηδξ Geminin κα επάβεζ 54

55 Δζζαβςβή κεονζηή δζαθμνμπμίδζδ. Δπζπνυζεεηα, δ ηαηαζημθή ηςκ επζπέδςκ ηδξ πνςηεΐκδξ ζηα ίδζα έιανοα ζοκεηέθεζε ζηδ ιείςζδ ηςκ πενζθενζηχκ κεονζηχκ ηοηηάνςκ (Quinn et al., 2001). ημ ημηυπμοθμ ανέεδηε υηζ ηαηά ηα πνχζια ζηάδζα ηδξ μνζμεέηδζδξ ημο κεονζημφ ζοζηήιαημξ, δ Geminin εοκμεί ημκ πνμζδζμνζζιυ ηαζ ηδκ εδναίςζδ ηδξ κεονζηήξ ιμίναξ ιέζς ηδξ ζοιιεημπήξ ηδξ ζε έκα πμθφπθμημ ηνυπμ νφειζζδξ ηδξ έηθναζδξ ημο πνχζιμο κεονζημφ δείηηδ Sox2 (Papanayotou et al., 2008). ηα πθαίζζα ημο αζμθμβζημφ αοημφ ζοζηήιαημξ, δ Geminin αθθδθεπζδνά ζε δζαηνζηά αήιαηα ιε ημοξ πανάβμκηεξ Brahma, ERNI ηαζ BERT ηαηά ημ ζηάδζμ ηδξ μνζμεέηδζδξ ηδξ κεονζηήξ πθάηαξ χζηε κα νοειζζηεί δ πνμκζηή έηθναζδ ημο ιμνίμο Sox2 ηαζ κα πνμζδζμνζζηεί μ ιεθθμκηζηυξ κεονζηυξ ζζηυξ (Δζηυκα 1.15Α). Ο ιδπακζζιυξ ιέζς ημο μπμίμο δ Geminin επδνεάγεζ ημκ ηαεμνζζιυ ηδξ ακαπηολζαηήξ ιμίναξ ηςκ ηοηηάνςκ ηαζ πνμάβεζ ηζξ κεονμπμζδηζηέξ δζαδζηαζίεξ δεκ έπεζ δζαθεοηακεεί αηυια. ημ Xenopus laevis δ έηθναζδ ημο ιμνίμο ηδξ Geminin επάβεηαζ απυ ηζξ πνςηεΐκεξ Noggin ηαζ Chordin, βκςζημφξ κεονζημφξ επαβςβζημφξ πανάβμκηεξ, εκχ ακηαβςκίγεηαζ ηδ δνάζδ ηδξ ΒΜΡ (Bone Morphogenetic Protein) ζδιαημδυηδζδξ, πνμηαθχκηαξ έηζζ κεονμπμίδζδ ημο ελςδένιαημξ ιέζς ηδξ ηαηαζημθήξ ημο επζδενιζημφ θαζκμηφπμο (Kroll et al., 1998). Νευηενα δεδμιέκα πνμηείκμοκ υηζ ηα επίπεδα ηδξ πνςηεΐκδξ Geminin νοειίγμκηαζ απυ ηδ ζδιαημδυηδζδ ηςκ FGF παναβυκηςκ, ηαεχξ δ επαβςβή ημο FGF ιμκμπαηζμφ μδήβδζε ζηδκ επαβςβή ηδξ έηθναζδξ ηδξ Geminin (Streit et al., 2000; Papanayotou et al., 2008). Δπζπθέμκ, έπεζ δεζπεεί υηζ δ έηθναζδ ηδξ Geminin εθέβπεηαζ απυ ηδ δνάζδ ηςκ ζδιαημδμηζηχκ ιμκμπαηζχκ Wnt, ΒΜΡ ηαζ Notch (Taylor et al., 2006; Yan et al., 2009). Πζμ ζοβηεηνζιέκα, πεζνάιαηα ζε έιανοα Xenopus laevis έδεζλακ υηζ ημ ιυνζμ ηδξ Geminin πενζέπεζ 5 νοειζζηζηά ζημζπεία ζηα μπμία πνμζδέκμκηαζ μ ιεηαβναθζηυξ πανάβμκηαξ Tcf, μ μπμίμξ δζαιεζμθααεί ηδ ζδιαημδυηδζδ ημο Wnt ιμκμπαηζμφ, ηαζ μζ μιμζμηζηέξ πνςηεΐκεξ Vent, μζ μπμίεξ ζοκζζημφκ ιεηαβναθζημφξ ηαηαζημθείξ πμο δζαιεζμθααμφκ ηδκ ΒΜΡ ζδιαημδυηδζδ (Taylor et al., 2006). Δπμιέκςξ ηα επίπεδα ηδξ Geminin νοειίγμκηαζ εεηζηά απυ ημ Wnt ζδιαημδμηζηυ ιμκμπάηζ ηαζ ανκδηζηά απυ ημ ΒΜΡ ζδιαημδμηζηυ ιμκμπάηζ. ημ ίδζμ αζμθμβζηυ ζφζηδια έπεζ δεζπεεί υηζ μ ιεηαβναθζηυξ πανάβμκηαξ Foxd5 επάβεζ ηδκ ζδιαημδυηδζδ απυ ημ ιμκμπάηζ Notch, ημ μπμίμ ιε ηδ ζεζνά ημο επάβεζ ηδκ έηθναζδ ηδξ Geminin (Yan et al., 2009). Ο ιεηαβναθζηυξ πανάβμκηαξ Sox3 επίζδξ ηαοημπμζήεδηε πνυζθαηα ζε έιανοα Xenopus laevis κα εθέβπεζ ηδκ έηθναζδ ηδξ Geminin ηαηά ημ ζηάδζμ ηδξ μνζμεέηδζδξ ηδξ κεονζηήξ πθάηαξ ηαζ κα επάβεζ έηζζ έιιεζα ημ ζπδιαηζζιυ κεονζηχκ πνμβμκζηχκ ηοηηάνςκ (Yan et al., 2009; Rogers et al., 2009). Ζ πμθοπαναβμκηζηή νφειζζδ ηδξ πνςηεΐκδξ δζαιμνθχκεζ ηδκ πζεακυηδηα δ ακαπηολζαηή δνάζδ ημο ιμνίμο κα δζαιεζμθααείηαζ απυ πμθθαπθμφξ, δζαηνζημφξ ιεηαλφ ημοξ ιδπακζζιμφξ. Δίκαζ άθθςζηε αλζμζδιείςημ υηζ μζ πνμακαθενεείζεξ 55

56 Δζζαβςβή θεζημονβίεξ ηδξ Geminin πανημβναθμφκηαζ ζε δζαθμνεηζηά ηιήιαηα ημο ιμνίμο: Γζα ηδ κεονμπμζδηζηή δνάζδ ηδξ πνςηεΐκδξ ζημ Xenopus laevis οπεφεοκμ είκαζ ημ ηιήια ημο αιζκμηεθζημφ άηνμο ημο ιμνίμο πμο πενζηθείεηαζ απυ ηα αιζκμλέα (Kroll et al., 1998). Ακηίεεηα, δ δνάζδ ηδξ πνςηεΐκδξ ζηδκ μνζμεέηδζδ ηδξ κεονζηήξ πθάηαξ ζημ ημηυπμοθμ πνμτπμεέηεζ ηδκ αθθδθεπίδναζή ηδξ ιε ημοξ ηαηάθθδθμοξ πανάβμκηεξ ιέζς ημο ηεκηνζημφ ηιήιαηυξ ηδξ πμο πενζθαιαάκεζ ηδκ πενζμπή ημο ζπεζνμεζδμφξ-ζπεζνάιαημξ (αιζκμλέα ) (Papanayotou et al., 2008). ε ηάεε πενίπηςζδ, ηα παναπάκς δεδμιέκα ακαδεζηκφμοκ ημκ ηεκηνζηυ νυθμ ηδξ Geminin ζηα πνχζια ζηάδζα ηδξ ειανοσηήξ ακάπηολδξ ηαζ ημκ ηαεμνζζιυ ηςκ κεονζηχκ πνμβμκζηχκ ηοηηάνςκ. Ζ ακαβηαζυηδηα ημο ιμνίμο ηδξ Geminin ζηζξ δζενβαζίεξ ακάπηολδξ, μνβακμβέκεζδξ ηαζ ηαεμνζζιμφ ηςκ ηοηηανζηχκ ηφπςκ επζαεααζχεδηε ιε ηδ δδιζμονβία knock-out ιοχκ απυ ημοξ μπμίμοξ απμοζζάγεζ ηεθείςξ δ έηθναζδ ηδξ Geminin (Gonzalez et al., 2006; Hara et al., 2006). Οζ ιφεξ αοημί ειθακίγμοκ ειανοσηή εκδζζιυηδηα ήδδ απυ ημ ακαπηολζαηυ ζηάδζμ ηςκ μηηχ ηοηηάνςκ. Σα έιανοα πμο πνμηφπημοκ απμηεθμφκηαζ ζπεδυκ απμηθεζζηζηά απυ ηφηηανα ηνμθμαθάζηδξ, ηαεχξ θαίκεηαζ υηζ δ απμοζία έηθναζδξ ηδξ Geminin δεκ επζηνέπεζ ημ ζπδιαηζζιυ ηςκ πμθοδφκαιςκ ηοηηάνςκ ηδξ έζς ηοηηανζηήξ ιάγαξ (inner cell mass). Ζ αδοκαιία ζπδιαηζζιμφ ηδξ παναπάκς δμιήξ εκδεπμιέκςξ μθείθεηαζ ζηδκ απμοζία έηθναζδξ ημο πανάβμκηα πμθοδοκαιίαξ Oct4. Ζ Geminin επμιέκςξ είκαζ απαναίηδηδ βζα ηδκ πμθοδοκαιία ηςκ ειανοσηχκ ζηεθεπζαίςκ ηοηηάνςκ, πζεακχξ ιέζς νφειζζδξ ηςκ επζπέδςκ ηδξ πνςηεΐκδξ Oct4 (Gonzalez et al., 2006; Hara et al., 2006) Η πξωηεΐλε Geminin απνηειεί ζεκαληηθό ξπζκηζηή ηεο λεπξωληθήο δηαθνξνπνίεζεο Ο νυθμξ ηδξ Geminin ζημ ζπδιαηζζιυ ημο κεονζημφ ζοζηήιαημξ ηαηά ηδκ ειανοσηή ακάπηολδ δεκ ελακηθείηαζ ζηα πνχζια αήιαηα ηδξ εδναίςζδξ ημο κεονζημφ ζζημφ. Ζ Geminin δνα ηαζ ζε ιεηαβεκέζηενα ζηάδζα ηδξ κεονμβεκεηζηήξ δζαδζηαζίαξ, ηαηά ηδ δζαθμνμπμίδζδ ηςκ πνμβμκζηχκ κεονζηχκ ηοηηάνςκ. Έπεζ πνμηαεεί υηζ δ δνάζδ αοηή δζαιεζμθααείηαζ απυ ηδκ αθθδθεπίδναζδ ηδξ Geminin ιε ηζξ δφμ ηαηαθοηζηέξ οπμιμκάδεξ Brg1 ηαζ Brm ημο ζοιπθυημο ακαδζαιυνθςζδξ ηδξ πνςιαηίκδξ SWI/SNF (Seo et al., 2005a) (Δζηυκα 1.15Β). Σμ ζφιπθμημ SWI/SNF ακαδζμνβακχκεζ ηδ δμιή ηδξ πνςιαηίκδξ (ηονίςξ ιέζς ιεηααμθήξ ηδξ εέζδξ ηαζ ηδξ δζαιυνθςζδξ ηςκ κμοηθεμζςιάηςκ) πνδζζιμπμζχκηαξ εκένβεζα απυ ημ ΑΣΡ, χζηε κα είκαζ δοκαηή δ πνυζααζδ ζημ DNA ηςκ ιεηαβναθζηχκ παναβυκηςκ ηαζ δ εκενβμπμίδζδ ηδξ έηθναζδξ ηςκ βμκζδίςκ ζηυπςκ (Becker and Horz, 2002). Έπεζ δεζπεεί υηζ μζ πνμκεονζηέξ bhlh πνςηεΐκεξ Neurogenins ηαζ NeuroD αθθδθεπζδνμφκ ιε ηδκ ηαηαθοηζηή οπμιμκάδα Brg1 ηαζ 56

57 Δζζαβςβή απαζημφκ ηδ δνάζδ ημο ζοιπθυημο SWI/SNF πνμηεζιέκμο κα εκενβμπμζήζμοκ ηδκ έηθναζδ ηςκ βμκζδίςκ ζηυπςκ ημοξ ηαζ κα επάβμοκ ηδ κεονςκζηή δζαθμνμπμίδζδ (Seo et al., 2005b). Ζ αθθδθεπίδναζδ ηδξ Geminin ιε ηδκ οπμιμκάδα Brg1 ειπμδίγεζ ηδ δέζιεοζδ ηςκ παναπάκς πνμκεονζηχκ πνςηεσκχκ, ιε απμηέθεζια ηδκ αδοκαιία επαβςβήξ κεονςκζηήξ δζαθμνμπμίδζδξ ηαζ ηδ δζαηήνδζδ ηδξ αδζαθμνμπμίδηδξ ηαηάζηαζδξ ηςκ πνμβμκζηχκ κεονζηχκ ηοηηάνςκ. Πεζνάιαηα ηαηαζημθήξ ηδξ έηθναζδξ ηδξ Geminin μδήβδζακ ζε πανυιμζα ζοιπενάζιαηα, ηαεχξ παναηδνήεδηε ακηίζημζπα πνχζιδ κεονςκζηή δζαθμνμπμίδζδ. Αοηυξ μ ακηαβςκζζιυξ ηςκ δνάζεςκ ηςκ πνςηεσκχκ Geminin-Βrg1 εθέβπεζ ηδ ιεηάααζδ απυ ηα δζαζνμφιεκα πνμβμκζηά ηφηηανα ζηα δζαθμνμπμζδιέκα κεονζηά ηφηηανα (Seo et al., 2005a). Έηζζ, εκχ ζηα ανπζηά ακαπηολζαηά ζηάδζα δ Geminin πνμάβεζ ηδ κεονμπμίδζδ ηαζ ηδκ εδναίςζδ ηδξ πενζμπήξ ημο ιεθθμκηζημφ κεονζημφ ζζημφ, ζε ιεηαβεκέζηενα ζηάδζα πνμςεεί ηδ δζαηήνδζδ ημο αδζαθμνμπμίδημο θαζκμηφπμο ηςκ πνμβμκζηχκ κεονζηχκ ηοηηάνςκ, δφμ δνάζεζξ πμο δζαιεζμθααμφκηαζ απυ δζαθμνεηζηά ηιήιαηα ηδξ πνςηεΐκδξ. Δπζπνυζεεηα, έπεζ δεζπεεί ζε ακενχπζκεξ ηοηηανζηέξ ζεζνέξ υηζ δ Geminin ζοιιεηέπεζ ζηδ νφειζζδ ηδξ ιεηαβναθήξ κεονζηχκ βμκζδίςκ ζε ιδ-κεονζηά ηφηηανα (Kim et al., 2006). Πζμ ζοβηεηνζιέκα, δ Geminin ζπδιαηίγεζ ζφιπθμημ ιε ημκ ιεηαβναθζηυ πανάβμκηα ΑΡ4, ζημ μπμίμ ζηδ ζοκέπεζα ζηναημθμβμφκηαζ μζ ζοκηαηαζημθείξ SMRT ηαζ HDAC3 βζα κα απμζζςπήζμοκ ηδκ έηθναζδ κεονζηχκ βμκζδίςκ ζε ιδ κεονζηά ηφηηανα (Δζηυκα 1.15Γ) Η Geminin εκπιέθεηαη ζηελ νξηνζέηεζε ηνπ πξόζζηνπ-νπίζζηνπ άμνλα ηνπ ζώκαηνο Ζ ιμνθμπμίδζδ ημο πνυζεζμο-μπίζεζμο άλμκα ημο ζχιαημξ ηςκ μνβακζζιχκ μδδβεί ζημ ζπδιαηζζιυ ζοβηεηνζιέκςκ ειανοσηχκ δμιχκ ζε ζοβηεηνζιέκεξ εέζεζξ ημο άλμκα. Βαζζημί νοειζζηέξ αοηήξ ηδξ δζαιενζζιαημπμίδζδξ απμηεθμφκ μζ πνςηεΐκεξ Hox. Σα πνυηοπα έηθναζδξ ηςκ δζαθυνςκ πνςηεσκχκ Hox πανμοζζάγμοκ δζαθμνεηζηέξ πμζμηζηέξ ηαζ πμζμηζηέξ ζοκδοαζηζηέξ ηαηακμιέξ ηαηά ιήημξ ημο άλμκα ημο ζχιαημξ ηςκ μνβακζζιχκ ηαζ έηζζ πνμζδίδμοκ ζοβηεηνζιέκδ ηαοηυηδηα ζηα ηφηηανα πμο ηα εηθνάγμοκ (Kessel and Gruss, 1991; Greer et al., 2000; Wellik and Capecchi, 2003). Σα βμκίδζα Hox απμηεθμφκ ιζα οπμηαηδβμνία ηςκ μιμζμηζηχκ βμκζδίςκ. Σα μιμζμηζηά βμκίδζα παναηηδνίγμκηαζ απυ ιζα πμθφ ηαθά δζαηδνδιέκδ «μιμζμηζηή» αημθμοεία αάζεςκ (homeobox) ηαζ ηςδζημπμζμφκ βζα ιζα μιάδα ιεηαβναθζηχκ παναβυκηςκ ιε ζδζαζηένςξ ζδιακηζηυ νυθμ ζηζξ ακαπηολζαηέξ δζαδζηαζίεξ, πμο δεζιεφμκηαζ ζημ DNA ιέζς ιζαξ «μιμζμηζηήξ» πενζμπήξ πνυζδεζδξ (homeodomain). Αθμφ εδναζςεεί δ έηθναζδ ηςκ πνςηεσκχκ Hox, ημ πνυηοπμ έηθναζήξ ημοξ είηε αοηυ είκαζ ηαηεζηαθιέκμ είηε εκενβμπμζδιέκμ- πνέπεζ κα δζαηδνδεεί. Σμ νυθμ ηδξ δζαηήνδζδξ ηδξ απεκενβμπμζδιέκδξ ηαηάζηαζδξ ηςκ 57

58 Δζζαβςβή Γμκίδζα κεονςκζηήξ δζαθμνμπμίδζδξ Γμκίδζα-ζηυπμζ ζε ιδ κεονζηά ηφηηανα 58

59 Δζζαβςβή Δηθόλα Μνξηαθέο αιιειεπηδξάζεηο ηεο Geminin πνπ δηακεζνιαβνύλ ηνπο ξόινπο ηεο ζηε ξύζκηζε ηνπ πνιιαπιαζηαζκνύ θαη ηεο δηαθνξνπνίεζεο ηωλ λεπξηθώλ πξνγνληθώλ θπηηάξωλ. Α) Καηά ην ζηάδην ηεο νξηνζέηεζεο ηεο λεπξηθήο πιάθαο, νη πξσηεΐλεο Brahma (Brm), Geminin θαη ERNI ζρεκαηίδνπλ έλα ζύκπινθν πάλσ ζηνλ ππνθηλεηή ηνπ γνληδίνπ ηνπ Sox2. Ο παξάγνληαο ERNI ζηξαηνινγεί παξάιιεια ηνλ θαηαζηνιέα HP1γ κε απνηέιεζκα λα κελ είλαη δπλαηή ε έθθξαζε ηνπ γνληδίνπ Sox2. Ο παξάγνληαο BERT αληαγσλίδεηαη ηνλ ERNI γηα ηελ πξόζδεζε ζηε Geminin, δηαζπώληαο ηειηθά ην παξαπάλσ ζύκπινθν θαη ζεκαηνδνηώληαο ηε κεηαγξαθή ηνπ γνληδίνπ Sox2. B) Ζ αιιειεπίδξαζε ηεο Geminin κε ηηο θαηαιπηηθέο ππνκνλάδεο ηνπ SWI/SNF ζπκπιόθνπ παξεκπνδίδεη ηε κεηαγξαθή ησλ λεπξσληθώλ γνληδίσλ-ζηόρσλ ησλ bhlh πξνλεπξηθώλ κεηαγξαθηθώλ παξαγόλησλ θαη επνκέλσο ηε λεπξσληθή δηαθνξνπνίεζε ησλ θπηηάξσλ. Γ) Ζ Geminin αιιειεπηδξά κε ηνλ κεηαγξαθηθό παξάγνληα AP4 θαη κε ηνπο ζπλ-θαηαζηνιείο SMRT θαη HDAC γηα λα θαηαζηείινπλ ηελ έθθξαζε λεπξηθώλ γνληδίσλ ζε κή-λεπξηθά θύηηαξα. Γ) Ζ Geminin ξπζκίδεη ηε ιεηηνπξγία ησλ Hox πξσηεΐλώλ είηε αλαζηέιινληαο ηε κεηαγξαθηθή ηνπο ελεξγόηεηα είηε θαηαζηέιινληαο ηε κεηαγξαθή ησλ γνληδίσλ ηνπο αιιειεπηδξώληαο κε ην ζύκπινθν Polycomb. Σν Polycomb ζύκπινθν επηπιένλ ξπζκίδεη ηελ απνηθνδόκεζε ηνπ κνξίνπ ηεο Geminin επάγνληαο ηελ νπβηθνπτηηλπιίσζή ηνπ. Δ) Ζ αιιειεπίδξαζε ησλ παξαγόλησλ Geminin-Six3 απνηειεί κνξηαθό δηαθόπηε γηα ηηο δηαδηθαζίεο θπηηαξηθνύ πνιιαπιαζηαζκνύ θαη θπηηαξηθήο δηαθνξνπνίεζεο ζηνλ ακθηβιεζηξνεηδή ρηηώλα ηνπ ςαξηνύ Oryzias latipes. πνςηεσκχκ Hox ακαθαιαάκμοκ μζ πνςηεΐκεξ Polycomb, μζ μπμίεξ δεζιεφμκηαζ απεοεείαξ ζηα νοειζζηζηά ζημζπεία ηςκ βμκζδίςκ Hox (Barna et al., 2002). Γζαπζζηχεδηε υηζ δ Geminin αθθδθεπζδνά άιεζα ηυζμ ιε πνςηεΐκεξ Hox υζμ ηαζ ιε ηδκ πνςηεΐκδ Scmh1 ημο ζοιπθυημο Polycomb (Luo et al., 2004) (Δζηυκα 1.15Γ). Οζ πνςηεΐκεξ Hox δεζιεφμκηαζ ζηδ Geminin ιέζς ηδξ μιμζμηζηήξ αημθμοείαξ ημοξ, εκχ ακηίζημζπα ημ ηιήια ημο ιμνίμο ηδξ Geminin πμο εοεφκεηαζ βζ αοηήκ ηδκ αθθδθεπίδναζδ πενζέπεηαζ ζημ ζπεζνμεζδέξ-ζπείναια (αιζκμλέα ). Καεχξ υιςξ δ πενζμπή αοηή ηδξ Geminin δζαιεζμθααεί ηαζ ηδκ αθθδθεπίδναζδ ιε ημκ πανάβμκηα Cdt1, πνμηάεδηε υηζ οπάνπεζ ακηαβςκζζιυξ ιεηαλφ ηςκ πνςηεσκχκ Hox ηαζ ημο πανάβμκηα Cdt1 βζα ηδκ πνυζδεζδ ζηδ Geminin, βεβμκυξ πμο εα ιπμνμφζε κα θεζημονβήζεζ ςξ έκαξ ιμνζαηυξ δζαηυπηδξ ιεηαλφ ημο νυθμο ηδξ πνςηεΐκδξ Geminin ζηδ νφειζζδ ημο ηοηηανζημφ πμθθαπθαζζαζιμφ ηαζ ζημκ έθεβπμ ηδξιεηαβναθζηήξ εκενβυηδηαξ ηςκ πνςηεσκχκ Hox. Δπζπνυζεεηα, ανέεδηε υηζ δ Geminin πνδζζιμπμζεί ηαζ έκα δεφηενμ, έιιεζμ ηνυπμ νφειζζδξ ηδξ έηθναζδξ ηςκ πνςηεσκχκ Hox, ςξ ιέθμξ ηςκ πνςηεσκχκ Polycomb. Έηζζ, δ δνάζδ ηδξ Geminin ζηδ νφειζζδ ηςκ πνςηεσκχκ Hox πενζθαιαάκεζ δφμ ιμκμπάηζα, έκα άιεζμ ηαηά ημ μπμίμ δ Geminin δεζιεφεηαζ ζηζξ πνςηεΐκεξ Hox ηαζ ακαζηέθθεζ ηδ ιεηαβναθζηή ημοξ εκενβυηδηα, ηαζ έκα έιιεζμ ηαηά ημ μπμίμ δ Geminin δνα ζακ ιία πνςηεΐκδ ημο ζοιπθυημο Polycomb ηαζ πανειπμδίγεζ ηδκ έηθναζδ ηςκ βμκζδίςκ Hox (Luo et al., 2004; Luo and Kessel, 2004). 59

60 Δζζαβςβή Ζ αθθδθεπίδναζδ ηδξ Geminin ιε ηζξ πνςηεΐκεξ Hox είκαζ ζδζαίηενα εκδζαθένμοζα αθμφ πνυζθαηα δείπεδηε υηζ μζ πνςηεΐκεξ Hox ειπθέημκηαζ ζηδ δζαδζηαζία ηδξ ακηζβναθήξ ημο DNA (Salsi et al., 2009). Οζ παναπάκς ενεοκδηέξ έδεζλακ υηζ μζ πνςηεΐκεξ Hoxa13, Hoxd11 ηαζ Hoxd13 δεζιεφμκηαζ ζηα ζδιεία έκανλδξ ηδξ ακηζβναθήξ. Πζμ ζοβηεηνζιέκα, δ πνςηεΐκδ Hoxd13 πνμάβεζ ημ ζπδιαηζζιυ ημο πνμ-ακηζβναθζημφ ζοιπθυημο ηαζ επζηαπφκεζ ηδκ ακηζβναθή ημο DNA, δνάζεζξ πμο υιςξ ακαζηέθθμκηαζ απυ ηδκ Geminin, δ μπμία αθθδθεπζδνά ιε ημκ πανάβμκηα Hoxd13 (Salsi et al., 2009). Σα εονήιαηα αοηά πνμηείκμοκ ιζα ηαζκμφνζα θεζημονβία βζα ηδκ αθθδθεπίδναζδ ηςκ πνςηεσκχκ Geminin-Hox, ζημ πθαίζζμ ηδξ νφειζζδξ ηδξ αδεζμδυηδζδξ ηδξ ακηζβναθήξ ημο DNA. Ζ αθθδθεπίδναζδ ηδξ Geminin ιε ηζξ πνςηεΐκεξ ημο ζοιπθυημο Polycomb είκαζ ελαζνεηζηήξ ζδιαζίαξ ηαζ βζα ηδ δζαηήνδζδ ηδξ μιμζυζηαζδξ ηςκ πμθοδφκαιςκ αζιμπμζδηζηχκ ηοηηάνςκ (hematopoietic stem cells) (Ohtsubo et al., 2008). Βνέεδηε υηζ ζε βεκεηζηά ηνμπμζδιέκμοξ ιφεξ μζ μπμίμζ δεκ εηθνάγμοκ ηδκ πνςηεΐκδ Rae28, δ μπμία είκαζ ιέθμξ ημο ζοιπθυημο Polycomb 1 (PcG1), ηα επίπεδα έηθναζδξ ηδξ Geminin ζηαεενμπμζμφκηαζ θυβς ηδξ ακαπμηεθεζιαηζηήξ απμζημδυιδζδξ ημο ιμνίμο απυ ημ ζφζηδια μοαζημοσηζκοθίςζδξ. Ζ επαηυθμοεδ ζοζζχνεοζδ ηδξ Geminin επδνεάγεζ ηδκ αδεζμδυηδζδ ηδξ ακηζβναθήξ ημο DNA, ηδκ ζηακυηδηα αοημακακέςζδξ, ηδκ επζαίςζδ ηαζ βεκζηά ηδκ εκενβυηδηα ηςκ πμθοδφκαιςκ αζιμπμζδηζηχκ ηοηηάνςκ. Ζ πνςηεΐκδ Rae28 αθθδθεπζδνά ιε ηδκ Polycomb πνςηεΐκδ Scmh1, δ μπμία ιε ηδ ζεζνά ηδξ είκαζ βκςζηυ υηζ αθθδθεπζδνά ιε ηδκ Geminin επμιέκςξ, μζ αθθαβέξ ζηδκ έηθναζδ ηδξ Geminin ιεηά απυ ηδκ απμζζχπδζδ ηδξ πνςηεΐκδξ Rae28 ιπμνεί κα δζαιεζμθααμφκηαζ απυ ηδκ πνςηεΐκδ Scmh1. Ζ ιεθέηδ αοηή ακέδεζλε ηδκ φπανλδ εκυξ εκαθθαηηζημφ ιμκμπαηζμφ απμζημδυιδζδξ ηδξ Geminin, ηαεχξ ημ PcG1 πανμοζζάγεζ δνάζδ Δ3 θζβάζδξ μοαζημοσηίκδξ έπμκηαξ ςξ οπυζηνςια ηδκ Geminin (Δζηυκα 1.15Γ). Σα εονήιαηα αοηά ακαδεζηκφμοκ ημ νυθμ ηδξ Geminin ζηδ νφειζζδ ηδξ εκενβυηδηαξ ηςκ αζιμπμζδηζηχκ πμθοδφκαιςκ ηοηηάνςκ (Ohtsubo et al., 2008). Ο νυθμξ ηδξ Geminin ζημ ακμζμπμζδηζηυ ζφζηδια ακαδεζηκφεηαζ ηαζ απυ κέεξ ιεθέηεξ ημο ενβαζηδνίμο ιαξ, υπμο δ ηαηά ζοκεήηδ απεκενβμπμίδζδ ημο βμκζδίμο ηδξ Geminin ζηα πνμβμκζηά ηφηηανα ημο ακμζμπμζδηζημφ ζοζηήιαημξ έδεζλε ηδ ζδιαζία ημο ιμνίμο βζα ημκ ζςζηυ πμθθαπθαζζαζιυ ηςκ εκενβμπμζδιέκςκ πενζθενζηχκ Σ ηοηηάνςκ (Karamitros et al., 2010). Ζ Geminin υιςξ νοειίγεζ ηαζ ημ ζπδιαηζζιυ ημο αιθζαθδζηνμεζδμφξ πζηχκα ημο ιαηζμφ ζημ ράνζ Oryzias latipes, δεζιεφμκηαξ ηαζ ακηαβςκίγμκηαξ ηδ δνάζδ ηδξ μιμζμηζηήξ πνςηεΐκδξ Six3 (Del Bene et al., 2004) (Δζηυκα 1.15Δ). πςξ ηαζ ιε ηζξ πνςηεΐκεξ Hox, έηζζ ηαζ ζε αοηήκ ηδκ πενίπηςζδ έπεζ δεζπεεί υηζ οπάνπεζ ακηαβςκζζιυξ ιεηαλφ ηςκ παναβυκηςκ Geminin, Cdt1 ηαζ Six3. Ζ εκενβυηδηα ημο ιεηαβναθζημφ πανάβμκηα Six3 εθέβπεζ ημκ ζςζηυ ζπδιαηζζιυ ημο αιθζαθδζηνμεζδμφξ (Loosli et al., 1999). ηακ δ Geminin δεζιεφεζ ημκ πανάβμκηα 60

61 Δζζαβςβή Six3, ηαηαζηέθθεζ ηδκ ζηακυηδηά ημο κα εκενβμπμζεί ηδ ιεηαβναθή ηςκ βμκζδίςκ ζηυπςκ ημο. Πανάθθδθα ιε ηδ δδιζμονβία ημο ζοιπθυημο Geminin-Six3, δ πνςηεΐκδ Cdt1 ιέκεζ εθεφεενδ βζα κα πνμςεήζεζ ημκ ηοηηανζηυ πμθθαπθαζζαζιυ. ηακ ημ ζφιπθμημ Geminin-Six3 δζαζπαζηεί, δ Geminin αθθδθεπζδνά ιε ημκ πανάβμκηα Cdt1 βζα κα ηαηαζηείθεζ ηδ δνάζδ ημο, εκχ ηαζ δ πνςηεΐκδ Six3 είκαζ εθεφεενδ βζα κα εκενβμπμζήζεζ ηδ ιεηαβναθή ηςκ βμκζδίςκ-ζηυπςκ. Ο ακηαβςκζζιυξ ηςκ δνάζεςκ ηςκ ιμνίςκ Geminin ηαζ Six3 απμηοπχκεηαζ ηαζ ζημ βεβμκυξ υηζ ηα αζμθμβζηά απμηεθέζιαηα ηδξ οπενέηθναζδξ ημο εκυξ πανάβμκηα ζημ Oryzias latipes πνμζζδζάγεζ ηζξ δνάζεζξ ηδξ απμζζχπδζδξ ημο άθθμο. Ζ αθθδθεπίδναζδ Geminin- Six3 δεκ έπεζ πανημβναθδεεί ζε ηάπμζμ ζοβηεηνζιέκμ ηιήια ημο ιμνίμο ηδξ Geminin αθθά θαίκεηαζ υηζ απαζηεί μθυηθδνα ηα ιυνζα ηαζ ηςκ δφμ πνςηεσκχκ (Del Bene et al., 2004). Ζ αθθδθεπίδναζδ ηδξ Geminin ιε ημκ ιεηαβναθζηυ πανάβμκηα Six3 ιπμνεί κα είκαζ ηνίζζιδξ ζδιαζίαξ ηαζ ζηζξ δζαδζηαζίεξ μνβακμβέκεζδξ ηαζ κεονμβέκεζδξ ζημκ εβηέθαθμ. Έπεζ δεζπεεί υηζ δ μιμζμηζηή πνςηεΐκδ Six3 είκαζ ακαβηαία βζα ηδκ ακάπηολδ ημο πνυζεζμο εβηεθάθμο ημο ιουξ. Γεκεηζηά ηνμπμπμζδιέκμζ ιφεξ ζημοξ μπμίμοξ έπεζ απμζζςπδεεί δ έηθναζδ ημο ζοβηεηνζιέκμο πανάβμκηα πανμοζζάγμοκ δναιαηζηέξ ακςιαθίεξ ημο πνυζεζμο εβηεθάθμο. Ο ιεηαβναθζηυξ πανάβμκηαξ Six3 ζοκζζηά ανκδηζηυ νοειζζηή ηδξ ζδιαημδυηδζδξ ημο Wnt ιμκμπαηζμφ, δ δνάζδ ημο μπμίμο ζπδιαημπμζεί ηζξ πενζμπέξ ημο μπίζεζμο εβηεθάθμο ηαζ επμιέκςξ πνέπεζ κα ηαηαζηαθεί ζημκ πνυζεζμ εβηέθαθμ (Lagutin et al., 2003). ημκ ακαπηοζζυιεκμ θθμζυ ημο ιουξ, μ ιεηαβναθζηυξ πανάβμκηαξ Six3 πνμάβεζ ηδ δζαηήνδζδ ηςκ αδζαθμνμπμίδηςκ πνμβμκζηχκ κεονζηχκ ηοηηάνςκ ηαζ νοειίγεζ ηζξ παναιέηνμοξ ημο ηοηηανζημφ ημοξ ηφηθμο, δνάζεζξ πμο ακηαβςκίγμκηαζ απυ ηδκ Geminin (Appolloni et al., 2008). Ο ακηαβςκζζιυξ Geminin-Six3 ιπμνεί κα θεζημονβεί ςξ ιμνζαηυξ δζαηυπηδξ ηδξ ιεηάααζδξ απυ ημκ ηοηηανζηυ πμθθαπθαζζαζιυ ζηδκ ηοηηανζηή δζαθμνμπμίδζδ ζε δζαθμνεηζηά γςζηά ιμκηέθα αθθά ηαζ ζε δζαθμνεηζηά ζοζηήιαηα. Σα παναπάκς δεδμιέκα ακαδεζηκφμοκ ηδκ πνςηεΐκδ Geminin ζε έκακ εζδζηυ νοειζζηή πμθθχκ, δζαηνζηχκ αζμθμβζηχκ δζενβαζζχκ πμο δζαιεζμθααμφκηαζ απυ ημ εκηοπςζζαηυ νεπενηυνζμ ηςκ ιμνζαηχκ αθθδθεπζδνάζεχκ ηδξ. Σμ βεβμκυξ αοηυ ηδκ ηαεζζηά ζδακζηυ οπμρήθζμ βζα ηδ θεπηή νφειζζδ αθθδθέκδεηςκ αζμθμβζηχκ δζενβαζζχκ, υπςξ βζα πανάδεζβια ηα θαζκυιεκα αοημ-ακακέςζδξ ηαζ δζαθμνμπμίδζδξ ηςκ πνμβμκζηχκ ηοηηάνςκ ηςκ ζζηχκ. Ζ ζοζζςνεφμοζα αζαθζμβναθία ιε ακαθμνέξ ζε δζαηνζηέξ αζμθμβζηέξ θεζημονβίεξ ηδξ Geminin, ζε δζαθμνεηζηά ζοζηήιαηα ηαζ ζε ζοβηεηνζιέκα ακαπηολζαηά ζηάδζα είκαζ εκδεζηηζηή ημο πμθοζήιακημο νυθμο ηδξ ζημκ ηοηηανζηυ ηαζ ακαπηολζαηυ έθεβπμ. 61

62 ηυπμξ ΣΟΥΟ Σα ζηεθεπζαία/αθαζηζηά ηφηηανα είκαζ ηαεμνζζηζηά βζα ηδ δδιζμονβία ηαζ μιμζυζηαζδ ηςκ ζζηχκ/μνβάκςκ. Συζμ ηαηά ηδκ ειανομβέκεζδ υζμ ηαζ ζηδκ εκήθζηδ γςή, ηα ζηεθεπζαία/αθαζηζηά ηφηηανα παναηηδνίγμκηαζ απυ ηδκ ζηακυηδηά ημοξ βζα αοημ-ακακέςζδ αθθά ηαζ βζα ηδ δδιζμονβία εοβαηνζηχκ ηοηηάνςκ πμο ζηαδζαηχξ εα δζαθμνμπμζδεμφκ. Ο ζοκημκζζιυξ ηςκ παναπάκς δζενβαζζχκ απαζηεί ηδ θεπηή νφειζζδ ηδξ αοημ-ακακέςζδξ ηαζ δζαθμνμπμίδζδξ ηςκ πνμβμκζηχκ ηοηηάνςκ. O ζπδιαηζζιυξ ηςκ δζαθυνςκ ζζηχκ ηαηεοεφκεηαζ απυ ζζημεζδζηά αθαζηζηά ηφηηανα. Ζ ακάπηολδ ημο ηεκηνζημφ κεονζημφ ζοζηήιαημξ μνβακχκεηαζ απυ ηα κεονζηά αθαζηζηά ηφηηανα, πμο απμηεθμφκ ηδκ πδβή πνμέθεοζδξ υθςκ ηςκ δζαθμνμπμζδιέκςκ κεονζηχκ ηαζ βθμζαηχκ ηοηηανζηχκ ηφπςκ ημο ζζημφ. Οζ ιδπακζζιμί πμο εθέβπμοκ ηζξ δζαδζηαζίεξ αοημ-ακακέςζδξ ηαζ δζαθμνμπμίδζδξ ηςκ κεονζηχκ αθαζηζηχκ ηοηηάνςκ έπμοκ ιεθεηδεεί επζζηαιέκςξ ζημκ εβηεθαθζηυ θθμζυ, μδδβχκηαξ ιαξ ζηδκ επζθμβή ηδξ ζοβηεηνζιέκδξ πενζμπήξ ςξ ζφζηδια ιεθέηδξ ζηδκ πανμφζα δζδαηημνζηή δζαηνζαή. Ζ πνςηεΐκδ Geminin θαίκεηαζ κα ειπθέηεηαζ ζηδ νφειζζδ ηδξ ηοηηανζηήξ δζαίνεζδξ ηαζ δζαθμνμπμίδζδξ αθθδθεπζδνχκηαξ ιε ιυνζα πμο εθέβπμοκ ημκ ηοηηανζηυ ηφηθμ, ιε πανάβμκηεξ ιεηαβναθήξ ηαζ ιε ζφιπθμηα ακαδζάηαλδξ ηδξ πνςιαηίκδξ, επδνεάγμκηαξ ζδιακηζηέξ παναιέηνμοξ ηδξ θεζημονβίαξ ημο κεονζημφ ζοζηήιαημξ. ηυπμξ ηδξ πανμφζαξ δζδαηημνζηήξ δζαηνζαήξ ήηακ δ ηαηακυδζδ ηςκ ιδπακζζιχκ πμο νοειίγμοκ ηδκ αοημ-ακακέςζδ ηαζ δζαθμνμπμίδζδ ηςκ πνμβμκζηχκ κεονζηχκ ηοηηάνςκ ημο εβηεθαθζημφ θθμζμφ ιέζς ηδξ ιεθέηδξ ημο νυθμο ημο ιμνίμο ηδξ Geminin. Πνχημ ιαξ ιέθδια ήηακ δ δζενεφκδζδ ημο πνμηφπμο έηθναζδξ ηδξ Geminin ζηα κεονζηά πνμβμκζηά ηφηηανα ημο ακαπηοζζυιεκμο θθμζμφ ημο ιουξ πμο εα απμηεθμφζε ηαζ ιία έκδεζλδ βζα ημ θεζημονβζηυ ηδξ νυθμ. Ζ πεναζηένς δζαθεφηακζδ ημο νυθμο ηδξ Geminin ζηδ νφειζζδ ηδξ αοημ-ακακέςζδξ ηαζ δζαθμνμπμίδζδξ ηςκ κεονζηχκ πνμβμκζηχκ ηοηηάνςκ ημο θθμζμφ πναβιαημπμζήεδηε ιε ηδ αμήεεζα πεζναιάηςκ οπενέηθναζδξ ηαζ αδνακμπμίδζδξ ηδξ Geminin ex vivo ηαζ in vivo ζημ ζοβηεηνζιέκμ ηοηηανζηυ πθδεοζιυ. Με ηδ ιεθέηδ ηςκ επζπηχζεςκ ηςκ πεζναιάηςκ αοηχκ δζενεοκήζαιε ηδ ζοιιεημπή ηδξ Geminin ζημκ έθεβπμ ημο ιεβέεμοξ ηςκ πθδεοζιχκ ηςκ κεονζηχκ πνμβμκζηχκ ηοηηάνςκ ημο θθμζμφ ηαζ ηςκ δζαδζηαζζχκ πμο πνμζδζμνίγμοκ ηδκ αοημ-ακακέςζδ ηαζ ηδ ιεηάααζδ απυ ημκ έκα πνμβμκζηυ πθδεοζιυ ζημκ επυιεκμ. Δπζπνυζεεηα, εηηζιήζαιε ηδ ζοιαμθή ηδξ Geminin ζημκ έθεβπμ ημο νοειμφ ηδξ ηοηηανζηήξ δζαίνεζδξ ηςκ πνμβμκζηχκ ηοηηάνςκ ημο θθμζμφ αθθά ηαζ ζηδκ επαβςβή ηδξ ελυδμο απυ ημκ ηοηηανζηυ ηφηθμ. Δπζπθέμκ δζενεοκήζαιε ηδ ζοιιεημπή ηδξ Geminin ζηδ νφειζζδ ηδξ ηεθζηήξ κεονςκζηήξ δζαθμνμπμίδζδξ ηςκ πνμβμκζηχκ ηοηηάνςκ ημο θθμζμφ. 62

63 2. ΤΛ Η Κ Α & Μ Δ Θ Ο Γ Ο Η

64 Τθζηά & Μέεμδμζ 2.1. Πεηξακαηηθά δώα Σα γχα πμο πνδζζιμπμζήεδηακ ζε αοηήκ ηδκ ιεθέηδ ήηακ βεκεηζημφ οπυααενμο C57Bl/6. Με ηαηάθθδθμοξ βεκεηζημφξ πεζνζζιμφξ δδιζμονβήεδηακ 4 ζεζνέξ ιοχκ ιε δζαθμνεηζημφξ βμκμηφπμοξ ςξ πνμξ ημκ βεκεηζηυ ηυπμ ημο βμκζδίμο ηδξ Geminin: 1) ιφεξ πμο έθενακ ηα αβνίμο ηφπμο (WT) αθθδθυιμνθα ημο βμκζδίμο ηδξ Geminin (Geminin wt/wt ) 2) ιφεξ πμο έθενακ loxp εέζεζξ εηαηένςεεκ ηςκ ελμκίςκ 3 ηαζ 4 ημο βμκζδίμο ηδξ Geminin ( floxed αθθδθυιμνθμ, Geminin flox/flox ) 3) ιφεξ πμο έθενακ έκα WT ηαζ έκα floxed αθθδθυιμνθμ ημο βμκζδίμο ηδξ Geminin (Geminin flox/wt ) 4) ιφεξ πμο έθενακ έκα floxed αθθδθυιμνθμ ηαζ έκα αθθδθυιμνθμ ημο βμκζδίμο απυ ημ μπμίμ ηα ελυκζα 3 ηαζ 4 έπμοκ απμημπεί ηαζ ημ μπμίμ δεκ είκαζ θεζημονβζηυ, ηαεχξ δ απμημπή αοηή μδδβεί ζε ιεηάθθαλδ αθθαβήξ ημο ακαβκςζηζημφ πθαζζίμο (ko αθθδθυιμνθμ, Geminin flox/ko ) (δζδαηημνζηή δζαηνζαή Πακςναίαξ Κμηακηάηδ; (Karamitros et al., 2010)). Σα floxed αοηά γχα επζηνέπμοκ, ιεηά απυ ηζξ ηαηάθθδθεξ δζαζηαονχζεζξ ιε γχα πμο θένμοκ ηδκ Cre νεημιπζκάζδ οπυ ημκ έθεβπμ ηςκ ηαηάθθδθςκ ζζημεζδζηχκ νοειζζηζηχκ ζημζπείςκ, ηδκ ηαηά ζοκεήηδ (conditional) ζζημεζδζηή απαθμζθή ημο βμκζδίμο ηδξ Geminin ζημκ ζζηυ ημο εκδζαθένμκηυξ ιαξ. Με ζημπυ ηδκ απμζζχπδζδ ημο βμκζδίμο ηδξ Geminin εζδζηά απυ ημ ακαπηοζζυιεκμ ηεκηνζηυ κεονζηυ ζφζηδια, πνδζζιμπμζήεδηακ ιφεξ ζημοξ μπμίμοξ δ έηθναζδ ημο εκγφιμο ηδξ Cre νεημιπζκάζδξ εθέβπεηαζ απυ ηα νοειζζηζηά ζημζπεία ημο βμκζδίμο ηδξ Nestin (NestinCre), εκυξ βμκζδίμο-δείηηδ ημο ζοβηεηνζιέκμο ζζημφ πμο εηθνάγεηαζ απυ ηα πμθφ πνχζια αηυια ζηάδζα ζπδιαηζζιμφ ημο (Δ9.5), ημοξ μπμίμοξ πνμιδεεοηήηαιε απυ ημκ Γν. Βαζίθδ Αδδίκδ (Δνεοκδηζηυ Κέκηνμ Βζμσαηνζηχκ Δπζζηδιχκ Αθέλακδνμξ Φθέιζκβη). Σα γχα αοηά θένμοκ ημ βμκίδζμ ηδξ Cre νεημιπζκάζδξ ζε εηενμγοβςηία, ηαεχξ ηα μιυγοβα γχα πεεαίκμοκ (NestinCre +/- ). Ανπζηά μζ ιφεξ αοημί δζαζηαονχεδηακ ιε Geminin δζαβμκζδζαηά γχα πμο είπακ βμκυηοπμ Geminin ko/wt, ιε ζημπυ ηδκ παναβςβή ιοχκ ιε βμκυηοπμ Geminin ko/wt ;NestinCre +/-. ηδ ζοκέπεζα αοημί μζ ιφεξ δζαζηαονχεδηακ ιε ιφεξ πμο είπακ βμκυηοπμ Geminin flox/flox, ιε ηεθζηυ ζηυπμ ηδκ παναβςβή ιοχκ ιε βμκυηοπμ Geminin flox/ko ;NestinCre +/-. ηα γχα αοηά, δ εηθναγυιεκδ ζημ ακαπηοζζυιεκμ κεονζηυ ζφζηδια Cre νεημιπζκάζδ εα ακαβκςνίζεζ ηζξ loxp εέζεζξ ζημ floxed αθθδθυιμνθμ ηδξ Geminin ηαζ εα ηζξ απμηυρεζ, ιε απμηέθεζια ημκ ηεθζηυ ζπδιαηζζιυ δφμ ιδ θεζημονβζηχκ αθθδθμιυνθςκ ημο βμκζδίμο ηδξ Geminin ηαζ ηδκ απμζζχπδζδ ημο βμκζδίμο απυ ημκ ζοβηεηνζιέκμ ζζηυ. Δπμιέκςξ, ηα Geminin flox/ko ;NestinCre +/- γχα ακηζπνμζςπεφμοκ ηα πεζναιαηζηά knock-out γχα πμο πνδζζιμπμζήζαιε, ηα μπμία ακαθένμκηαζ ζημ οπυθμζπμ αοηήξ ηδξ ιεθέηδξ ςξ «Fl/koNestinCre» γχα. Καεχξ αηυια ηαζ δ εηενυγοβδ ηαηάζηαζδ ημο βμκζδίμο ηδξ Geminin δεκ είπε ηάπμζμκ ειθακή θαζκμηοπζηυ ακηίηηοπμ ζηδκ ακάπηολδ ημο θθμζμφ ημο ιουξ, υθμζ μζ οπυθμζπμζ βμκμηοπζημί ζοκδοαζιμί απμηέθεζακ ηζξ ηαηαζηάζεζξ 64

65 Τθζηά & Μέεμδμζ εθέβπμο βζα ηα Fl/koNestinCre γχα, ηαζ αενμζζηζηά ακαθένμκηαζ ζημ ηείιεκμ ςξ «WT» γχα. θα ηα ενεοκδηζηά πνςηυημθθα πμο αθμνμφζακ ζημκ πεζνζζιυ ηςκ πεζναιαηζηχκ γχςκ έπμοκ εβηνζεεί απυ ηζξ Δπζηνμπέξ Ζεζηήξ ημο Ζκςιέκμο Βαζζθείμο, ημο Δεκζημφ Ηκζηζημφημο Ηαηνζηήξ Ένεοκαξ (National Institute for Medical Research, NIMR-MRC), ηαζ ημο Πακεπζζηδιίμο Παηνχκ Γνλνηύπεζε Ζ βμκμηφπδζδ ηςκ γχςκ έβζκε ιε αθοζζδςηή ακηίδναζδ πμθοιενάζδξ (polymerase chain reaction, PCR) ζε βεκςιζηυ DNA πμο απμιμκχεδηε απυ δείβιαηα απυ ηδκ μονά εκήθζηςκ γχςκ ηαζ ειανφςκ Γνλνηύπεζε ησλ Geminin flox/wt δώσλ Γζα ηδκ ακίπκεοζδ ηςκ floxed ηαζ wt αθθδθμιυνθςκ ημο βμκζδίμο ηδξ Geminin πνδζζιμπμζήεδηακ μζ ελήξ εηηζκδηέξ: (εηηζκδηήξ 2003) 5 - TTTGGACGCATGGGACAGACC-3 ηαζ (εηηζκδηήξ 2004) 5 - GTCCAGGCTGCAGTGTCTCAC -3. Σμ γεοβάνζ αοηυ ηςκ εηηζκδηχκ ακαβκςνίγεζ ηδκ πενζμπή εηεηένςεεκ ηδξ loxp εέζδξ πμο ανίζηεηαζ έλς απυ ημ ελυκζμ 4 ημο βμκζδίμο ηδξ Geminin, επμιέκςξ δίκεζ πνμσυκ ιεβέεμοξ 549 bp ζηδκ πενίπηςζδ ημο wt αθθδθμιυνθμο ηαζ πνμσυκ ιεβέεμοξ 597 bp ζηδκ πενίπηςζδ ημο floxed αθθδθμιυνθμο. Σμ πνυβναιια πμο αημθμοεήεδηε βζα ηδκ εκίζποζδ ηςκ παναπάκς ηιδιάηςκ DNA ηαζ μζ πμζυηδηεξ ηςκ ακηζδναζηδνίςκ απεζημκίγμκηαζ ζημοξ παναηάης πίκαηεξ: Aληηδξαζηήξην DNA 10x PCR buffer (-MgCl 2 ) (Invitrogen) MgCl 2 (50mM, Invitrogen) dntps (10mM, Invitrogen) Δηηζκδηήξ 2003 (100pmol/ιl) Δηηζκδηήξ 2004 (100pmol/ιl) Taq πμθοιενάζδ (5u/ιl, Invitrogen ) H 2 0 (Water for Injection, WFI) Tεθζηυξ υβημξ Πνζόηεηα 500ng 5ιl (1x) 1,5ιl (1,5mM) 1ιl (0,2mM) 0,5ιl (1pmol/ιl) 0,5ιl (1pmol/ιl) 0,5ιl (0,05u/ιl) 50ιl Πίλαθαο 2.1. PCR αληίδξαζε γηα ηελ αλίρλεπζε ηωλ floxed θαη wt αιιεινκόξθωλ ηεο Geminin. 65

66 Τθζηά & Μέεμδμζ Αξηζκόο θύθισλ Θεξκνθξαζία Υξόλνο 1 94 C 5 min. 94 C 45 sec C 30 sec. 72 C 1 min C 10 min. Πίλαθαο 2.2. PCR πξόγξακκα γηα ηελ ελίζρπζε ηωλ floxed θαη wt αιιεινκόξθωλ ηεο Geminin Γνλνηύπεζε ησλ Geminin ko/wt δώσλ Γζα ηδκ ακίπκεοζδ ημο ko αθθδθμιυνθμο ημο βμκζδίμο ηδξ Geminin πνδζζιμπμζήεδηε ημ ελήξ γεοβάνζ εηηζκδηχκ: (εηηζκδηήξ 250) 5 - GGAATATTTAGAGTTCTGAAATGAGATG-3 ηαζ (εηηζκδηήξ 251) 5 - CCAACTCAGTCACTGTCCTGTT-3. Οζ εηηζκδηέξ αοημί ακαβκςνίγμοκ ηδκ πενζμπή πμο ανίζηεηαζ εηαηένςεεκ ηςκ ελμκίςκ 3 ηαζ 4 ημο βμκζδίμο ηδξ Geminin, δ μπμία ιεηά ηδ δνάζδ ηδξ Cre νεημιπζκάζδξ απμηυπηεηαζ, αθήκμκηαξ έκα ηιήια DNA ιήημοξ 249 bp. Οζ εηηζκδηέξ αοημί πνμθακχξ ακαβκςνίγμοκ ηαζ ηδκ ακηίζημζπδ πενζμπή ζημ wt αθθδθυιμνθμ ημο βμκζδίμο ηδξ Geminin, αθθά θυβς ημο ιεβάθμο ιεβέεμοξ αοηήξ ηδξ πενζμπήξ (1900 bp) δεκ ζπδιαηίγεηαζ ζοκήεςξ ηάπμζμ πνμσυκ. Σμ πνυβναιια πμο αημθμοεήεδηε βζα ηδκ εκίζποζδ ημο παναπάκς ηιήιαημξ DNA ηαζ μζ πμζυηδηεξ ηςκ ακηζδναζηδνίςκ απεζημκίγμκηαζ ζημοξ παναηάης πίκαηεξ: Αληηδξαζηήξην DNA 10x PCR buffer (-MgCl 2 ) MgCl 2 (50mM) dntps (10mM) Δηηζκδηήξ 250 (100pmol/ιl) Δηηζκδηήξ 251 (100pmol/ιl) Taq πμθοιενάζδ (5u/ιl) WFI Tεθζηυξ υβημξ Πνζόηεηα 300ng 5ιl (1x) 1,5ιl (1,5mM) 1ιl (0,2mM) 0,5ιl (1pmol/ιl) 0,5ιl (1pmol/ιl) 0,5ιl (0,05u/ιl) 50ιl Πίλαθαο 2.3. PCR αληίδξαζε γηα ηελ αλίρλεπζε ηνπ ko αιιεινκόξθνπ ηεο Geminin. 66

67 Τθζηά & Μέεμδμζ Αξηζκόο θύθισλ Θεξκνθξαζία Υξόλνο 1 94 C 5 min. 94 C 45 sec ,7 C 45 sec. 72 C 1 min C 10 min. Πίλαθαο 2.4. PCR πξόγξακκα γηα ηελ ελίζρπζε ηνπ ko αιιεινκόξθνπ ηεο Geminin Γνλνηύπεζε ησλ NestinCre +/- δώσλ Γζα ηδκ ακίπκεοζδ ημο βμκζδίμο ηδξ Cre νεημιπζκάζδξ πνδζζιμπμζήεδηε ημ ελήξ γεοβάνζ εηηζκδηχκ, ημ μπμίμ εκζζπφεζ έκα εζςηενζηυ ηιήια ημο βμκζδίμο ιεβέεμοξ 411 bp: (Cre forward, 264) 5 -AGGTGTAGAGAAGGCACTCAGC-3 ηαζ (Cre reverse, 265) 5 -CTAATCGCCATCTTCCAGCAGG-3. ακ εζςηενζηυ ζδιείμ εθέβπμο ηδξ PCR ακηίδναζδξ πνδζζιμπμζήεδηε έκα δεφηενμ γεοβάνζ εηηζκδηχκ, μζ μπμίμζ εκζζπφμοκ έκα ηιήια ημο βμκζδίμο ηδξ ιζηνμζςιζηήξ επμλεζδζηήξ οδνμθάζδξ (microsomal epoxide hydrolase) ηαζ δίκμοκ πάκηα έκα πνμσυκ ιεβέεμοξ 341 bp: (ΜΔΖ forward, 266) 5 -AAGTGAGTTTGCATGGCGCAGC-3 ηαζ (MEH reverse, 267) 5 -CCCTTTAGCCCCTTCCCTCTG-3. Σμ πνυβναιια πμο αημθμοεήεδηε βζα ηδκ εκίζποζδ ηςκ παναπάκς ηιδιάηςκ DNA ηαζ μζ πμζυηδηεξ ηςκ ακηζδναζηδνίςκ απεζημκίγμκηαζ ζημοξ παναηάης πίκαηεξ: Αληηδξαζηήξην DNA 10x PCR buffer (-MgCl 2 ) MgCl 2 (50mM) dntps (10mM) Δηηζκδηήξ 264 (100pmol/ιl) Δηηζκδηήξ 265 (100pmol/ιl) Δηηζκδηήξ 266 (100pmol/ιl) Δηηζκδηήξ 267 (100pmol/ιl) Taq πμθοιενάζδ (5u/ιl) WFI Tεθζηυξ υβημξ Πνζόηεηα 500ng 5ιl (1x) 2ιl (2mM) 2ιl (0,4mM) 0,2ιl (0,4pmol/ιl) 0,2ιl (0,4pmol/ιl) 0,2ιl (0,4pmol/ιl) 0,2ιl (0,4pmol/ιl) 0,5ιl (0,05u/ιl) 50ιl Πίλαθαο 2.5. PCR αληίδξαζε γηα ηελ αλίρλεπζε ηνπ γνληδίνπ ηεο Cre ξεθνκπηλάζεο. 67

68 Τθζηά & Μέεμδμζ Αξηζκόο θύθισλ Θεξκνθξαζία Υξόλνο 1 94 C 4 min. 94 C 30 sec C 30 sec. 72 C 30 sec C 5 min. Πίλαθαο 2.6. PCR πξόγξακκα γηα ηελ αλίρλεπζε ηνπ γνληδίνπ ηεο Cre ξεθνκπηλάζεο. θεξ μζ παναπάκς PCR ακηζδνάζεζξ εθέβπμκηαζ ιε δθεηηνμθυνδζδ ζε πδηηή αβανυγδξ 2% ζε δζάθοια ΣΒΔ 0.5x. Γηαιύκαηα TBE 10x Γζα ηεθζηυ υβημ 500ml 54g Tris-base 27,6g boric acid 20ml 0.5M EDTA ph 8.0 ddh 2 O ιέπνζ ημκ ηεθζηυ υβημ TBE 0.5x Γζα ηεθζηυ υβημ 500ml 25ml TBE 10x 475ml ddh 2 O Αβανυγδ 2% Γζα ηεθζηυ υβημ 200ml 2g αβανυγδ 200ml TBE 0.5x Ζ αβανυγδ (Invitrogen ) δζαθοημπμζείηαζ ανάγμκηαξ ημ δζάθοια ζε θμφνκμ ιζηνμηοιάηςκ. Αθμφ ηνοχζεζ ημ δζάθοια, πνμζεέημοιε 10ιl ανςιζμφπμ αζείδζμ (EtBr, stock 10mg/ml). 68

69 Τθζηά & Μέεμδμζ Απνκόλσζε γελσκηθνύ DNA Ζ βμκμηφπδζδ ηςκ γχςκ είκαζ δοκαηή ιεηά απυ ηδκ επζηοπδιέκδ απμιυκςζδ βεκςιζημφ DNA απυ ηα δείβιαηα απυ ηζξ μονέξ ηςκ εκήθζηςκ γχςκ ηαζ ειανφςκ. Σμ απμιμκςιέκμ DNA απμηεθεί ζηδ ζοκέπεζα ιήηνα βζα ηζξ PCR ακηζδνάζεζξ πμο πνμακαθένεδηακ. Ζ πεζναιαηζηή δζαδζηαζία είκαζ δ ελήξ: Σα δείβιαηα επςάγμκηαζ ζε ηαηάθθδθμ δζάθοια (tail buffer) πμο πενζέπεζ ηαζ πνςηεσκάζδ Κ overnight ζημοξ 55 C βζα ηδ δζαθοημπμίδζδ ημο ζζημφ. Σμ ηάεε δείβια ημπμεεηείηαζ ζε ζςθήκα eppendorf ηαζ επςάγεηαζ ιε 500ιl tail buffer πμο πενζέπεζ ηαζ 6ιl πνςηεσκάζδ Κ (stock 10mg/ml, Sigma P2308). Πνμζεέημοιε ζε ηάεε δείβια 500ιl δζαθφιαημξ θαζκυθδξ-πθςνμθυνιζμοζζμαιοθζηήξ αθημυθδξ ζε ακαθμβία 25:24:1 (PCI, Sigma P2069) ηαζ ακαδεφμοιε ζζπονά βζα 10 min. Φοβμηεκηνμφιε ηα δείβιαηα ζε rpm ζημοξ 25 C βζα 30min ηαζ ιεηαθένμοιε ηδκ ακχηενδ οδάηζκδ θάζδ ζε κέμ eppendorf. Πνμζεέημοιε 500ιl πθςνμθυνιζμ (Sigma C2432) ηαζ ακαδεφμοιε ζζπονά βζα 10 min. Φοβμηεκηνμφιε ηα δείβιαηα ζε rpm ζημοξ 25 C βζα 15 min ηαζ ιεηαθένμοιε ηδκ ακχηενδ οδάηζκδ θάζδ ζε κέμ eppendorf. Πνμζεέημοιε 500ιl ζζμπνμπακυθδ ηαζ ακαδεφμοιε απαθά. ημ ζηάδζμ αοηυ ημ DNA θαίκεηαζ ζακ έκα θεοηυ ζφκκεθμ ιέζα ζημ δζάθοια. Αθήκμοιε ηα δείβιαηα βζα 30 min 1 hr ζημοξ -80 C. Φοβμηεκηνμφιε ηα δείβιαηα ζε rpm ζημοξ 4 C βζα 30 min ηαζ απμιαηνφκμοιε ημ οπενηείιεκμ. Ξεπθέκμοιε ημ ίγδια ιε 500ιl EtOH 70%. Φοβμηεκηνμφιε ηα δείβιαηα ζε rpm ζημοξ 4 C βζα 30 min ηαζ απμιαηνφκμοιε ημ οπενηείιεκμ. Αθήκμοιε ημ ίγδια κα ζηεβκχζεζ βζα πενίπμο 15 min ηαζ ημ επακαδζαθοημπμζμφιε ζε 100ιl απμζηεζνςιέκμο ddh 2 O. Γζα ηδ αεθηζζημπμίδζδ ηδξ ακαδζάθοζδξ επςάγμοιε ηα δείβιαηα ζημοξ 55 C βζα 1 hr. Φςημιεηνμφιε ημ απμιμκςιέκμ DNA ηαζ ημ δζαηδνμφιε ζημοξ -20 C. 69

70 Τθζηά & Μέεμδμζ Γηαιύκαηα Tail buffer 100mM Tris-HCl ph 8.5 5mM EDTA 0,2% SDS 200mM NaCl WFI (Water For Injection) 2.3. Μέζνδνη ηζηνινγίαο Απνκόλσζε εκβξύσλ Σα έιανοα πμο πνδζζιμπμζήεδηακ πνμένπμκηαζ απυ ζοβπνμκζζιέκεξ εβηοιμζφκεξ ιοχκ C57Bl/6, εέημκηαξ ζακ ειανοσηή διένα 0.5 ηδκ διένα ηδξ ειθάκζζδξ ημο παναηηδνζζηζημφ vaginal plug. Σα εδθοηά γχα εοζζάζηδηακ ιε αολδιέκδ ζοβηέκηνςζδ CO 2 ηαζ αοπεκζηή ιεηαηυπζζδ. Ζ δζαδζηαζία πμο αημθμοεείηαζ ηαηά ηδκ απμιυκςζδ ηςκ ειανφςκ είκαζ δ ελήξ: Ακαηέικμοιε ηα έιανοα απυ ηζξ ςμεήηεξ ηδξ ιδηέναξ ηαζ ηα ημπμεεημφιε ζε ηνφμ δζάθοια PBS 1x. Αθαζνμφιε υθεξ ηζξ ειανοσηέξ ιειανάκεξ. Ζ πεναζηένς επελενβαζία βίκεηαζ βζα ηα έιανοα δθζηίαξ Δ12.5 ζε μθυηθδνμ ημ έιανομ, εκχ ζηα έιανοα δθζηίαξ ιεβαθφηενδξ απυ Δ15.5 απμιμκχκμοιε ηαζ πνδζζιμπμζμφιε ιυκμ ημκ εβηέθαθμ. Ξεπθέκμοιε ηα έιανοα 3 θμνέξ, απυ 15 θεπηά ηδκ ηάεε ιία, ιε δζάθοια PBS 1x ζημοξ 4 C. Μμκζιμπμζμφιε ηα έιανοα ημπμεεηχκηαξ ηα ζε δζάθοια παναθμνιαθδεΰδδξ (PFA) 4% ζε PBS 1x overnight ζημοξ 4 C. Σδκ επυιεκδ ιένα λεπθέκμοιε ηα έιανοα 3 θμνέξ, απυ 15 θεπηά ηδκ ηάεε ιία, ιε δζάθοια PBS 1x ζημοξ 4 C. Σμπμεεημφιε ηα έιανοα ζε δζάθοια ζμοηνυγδξ 30% ζε PBS 1x ζημοξ 4 C ιέπνζ κα αοεζζημφκ. Παβχκμοιε ηα έιανοα ζημ εζδζηυ ιέζμ OCT ή ζε gelatin ιε ηδ αμήεεζα λδνμφ πάβμο ηαζ ηα δζαηδνμφιε ζημοξ -80 C. Σα έιανοα δζαηδνμφκηαζ ζημοξ -80 C ιέπνζ κα ηα ηυρμοιε ζε ημιέξ ζηδκ ηνομιζηνμηυιμ. Ο ηειαπζζιυξ ηςκ ειανφςκ ή ηςκ εβηεθάθςκ έβζκε ζε ημιέξ πάπμοξ 10ιm ζηδκ ηνομιζηνμηυιμ ζε εενιμηναζία -24 C. Οζ ημιέξ ήηακ 70

71 Τθζηά & Μέεμδμζ πνμζακαημθζζιέκεξ ηαηά ημκ ιεηςπζαίμ (coronal ή frontal) άλμκα ημο ζχιαημξ. Αθμφ αθήζμοιε ηζξ ημιέξ κα ζηεβκχζμοκ βζα πενίπμο 30 min, ιπμνμφιε ζηδ ζοκέπεζα κα ηζξ απμεδηεφζμοιε ζημοξ -80 C ιέζα ζε ακεεηηζηά ημοηζά, ζηα μπμία έπμοιε ημπμεεηήζεζ ηαζ ιία ιζηνή πμζυηδηα silica gel βζα ηδκ απμννυθδζδ ηδξ οβναζίαξ, ή κα ηζξ επελενβαζημφιε ηαηεοεείακ πεζναιαηζηά. Γηαιύκαηα PBS 10x 137mM NaCl 2.7mM KCl 4.3mM Na 2 HPO 4 1.4mM KH 2 PO 4 To ph ημο δζαθφιαημξ εα πνέπεζ κα είκαζ πενίπμο 6.8. PBS 1x Γζα ηεθζηυ υβημ 500ml 50ml PBS 10x 450ml ddh 2 O Ροειίγμοιε ημ ph ημο δζαθφιαημξ ζημ ιε HCl. PFA 4% Γζα ηεθζηυ υβημ 500ml 500ml PBS 1x 20g PFA (Sigma) Γζάθοια ζμοηνυγδξ 30% Γζα ηεθζηυ υβημ 100ml 30g ζμοηνυγδ (Sigma S0389) PBS 1x ιέπνζ ημκ ηεθζηυ υβημ Γζάθοια gelatin Γζα ηεθζηυ υβημ 500ml 75g ζμοηνυγδ (Sigma) 37,5g gelatin (Sigma G2500) ηαδζαηή πνμζεήηδ γεζημφ PBS 1x ιέπνζ ημκ ηεθζηυ υβημ οπυ ακάδεοζδ ζημοξ 37 C. Γζαηδνμφιε ηδ gelatin ζε aliquots ζημοξ -20 C. 71

72 Τθζηά & Μέεμδμζ Πξσηόθνιιν θαηάςπμεο ησλ ηζηώλ ζε gelatin Ζ ρφλδ ηςκ ζζηχκ πνδζζιμπμζχκηαξ δζάθοια gelatin πνμζθένεζ ημ πθεμκέηηδια ηδξ ημπμεέηδζδξ ημο ζζημφ ιε ημ ζςζηυ πνμζακαημθζζιυ ιέζα ζημ ηειάπζμ ηδξ gelatin, έηζζ χζηε κα έπμοιε ηζξ ηαθφηενεξ δοκαηέξ ημιέξ ηαηά ηδ δζαδζηαζία ηειαπζζιμφ ημο ζζημφ ζηδκ ηνομιζηνμηυιμ. Καεχξ ημ δζάθοια ηδξ gelatin είκαζ δζαθακέξ πνζκ ζηενεμπμζδεεί, αοηυ ιαξ δίκεζ ηδ δοκαηυηδηα κα δζμνεχζμοιε βνήβμνα ηδ εέζδ ημο ζζημφ πνζκ ημκ παβχζμοιε. Ξεπαβχκμοιε ημ δζάθοια ηδξ gelatin ημπμεεηχκηαξ ημ ζε οδαηυθμοηνμ ζημοξ 37 C Σμπμεεημφιε έκα ζηνχια gelatin ζε έκα πζάημ Petri ηαζ ημ αάγμοιε ζημοξ 4 C βζα κα ζηενεμπμζδεεί Δπςάγμοιε ημκ ζζηυ πμο πνυηεζηαζ κα ροπεεί ζε δζάθοια gelatin ζημοξ 37 C βζα 20 min. Σμπμεεημφιε ημκ ζζηυ ζημ πζάημ Petri πάκς απυ ημ ζηνχια ηδξ gelatin ηαζ ηαεμνίγμοιε ημκ επζεοιδηυ πνμζακαημθζζιυ. ηδ ζοκέπεζα πνμζεέημοιε ηζ άθθμ δζάθοια gelatin χζηε κα ηαθοθεεί ηεθείςξ μ ζζηυξ ηαζ ημπμεεημφιε λακά ημ πζάημ Petri ζημοξ 4 C βζα κα ζηενεμπμζδεεί δ gelatin. Κυαμοιε ημ ζηνχια ηδξ gelatin ζε ιζηνά ηειάπζα βφνς απυ ημκ ζζηυ. Βοείγμοιε ηα ηειάπζα ζε παβςιέκμ ζημοξ -80 C ζζμπεκηάκζμ χζηε κα ηαηαροπεμφκ αηανζαία. Γζαηδνμφιε ημοξ ζζημφξ ζημοξ -80 C Πξσηόθνιιν ελζσκάησζεο BrdU in vivo Ζ πμνήβδζδ ημο ακαθυβμο ηδξ εοιίκδξ 5-ανςιμ-2 δέμλο-μονζδίκδ (BrdU) in vivo απμηεθεί έκα πμθφηζιμ ενβαθείμ ζηδκ εηηίιδζδ ηδξ ζηακυηδηαξ ηοηηανζημφ πμθθαπθαζζαζιμφ εκυξ ζζημφ, ηαεχξ εκζςιαηχκεηαζ ζηα ηφηηανα ηαηά ηδ θάζδ ακηζβναθήξ ημο βεκςιζημφ ημοξ οθζημφ, εκχ δ εφημθδ παναηήνδζή ημο ζηδ ζοκέπεζα πανέπεζ έκακ δείηηδ ηςκ δζαζνμφιεκςκ ηοηηάνςκ. Ζ πμνήβδζδ ημο ακαθυβμο BrdU πναβιαημπμζείηαζ ιε εκδμπενζημκασηή έκεζδ ζε εβηοιμκμφκηα γχα ζηαδίμο Δ12.5 ή Δ14.5, χζηε δ δυζδ κα πενάζεζ ηαζ ζηα ακαπηοζζυιεκα έιανοα, ζε ζοβηέκηνςζδ 100ιg/g γχμο. Σα γχα εοζζάγμκηαζ είηε 30 min ανβυηενα είηε ιεηά απυ 24 hrs, ακάθμβα ιε ηδκ πεζναιαηζηή πνμζέββζζδ πμο αημθμοεείηαζ. 72

73 Τθζηά & Μέεμδμζ Γηαιύκαηα Γζάθοια BrdU Δπακαδζαθφμοιε ηo BrdU (Sigma, B9285) ζε θοζζμθμβζηυ μνυ ζε ηεθζηή ζοβηέκηνςζδ 10mg/ml. Γζαηδνμφιε ημ δζάθοια ζε aliquots ζημοξ -20 C Καιιηέξγεηα λεπξόζθαηξσλ (neurospheres) Σα πνμβμκζηά κεονζηά ηφηηανα ημο ακαπηοζζυιεκμο θθμζμφ ιπμνμφκ κα ηαθθζενβδεμφκ ηαζ κα δζαηδνδεμφκ in vitro ηαζ ηάης απυ εθεβπυιεκεξ ζοκεήηεξ ιπμνμφκ κα ακαπαναζηήζμοκ ηα βεβμκυηα πμο ζοιααίκμοκ in vivo ηαηά ηδ κεονμβέκεζδ ημο θθμζμφ. ε ζοκεήηεξ πμο εοκμμφκ ημκ πμθθαπθαζζαζιυ ημοξ, ηα ηφηηανα αοηά παναιέκμοκ ζηδκ ηαθθζένβεζα ζπδιαηίγμκηαξ «ζθαίνεξ» (κεονυζθαζνεξ), πανέπμκηαξ έηζζ έκα ενβαθείμ βζα ηδ ιεθέηδ ημο θαζκμιέκμο ηαζ ηςκ παναιέηνςκ ημο πμθθαπθαζζαζιμφ ημοξ in vitro. Απυ ηδκ άθθδ ιενζά, ιπμνμφιε κα επάβμοιε ηζξ κεονυζθαζνεξ πμο ανίζημκηαζ ζε ηαθθζένβεζα ηυζμ πνμξ κεονςκζηή υζμ ηαζ πνμξ βθμζαηή δζαθμνμπμίδζδ, εηηζιχκηαξ ηαη αοηυκ ημκ ηνυπμ ημ δοκαιζηυ δζαθμνμπμίδζήξ ημοξ Καιιηέξγεηα λεπξόζθαηξσλ ζε ζπλζήθεο πνιιαπιαζηαζκνύ Θακαηχκμοιε ημοξ ιφεξ ηαζ απμιμκχκμοιε ηα έιανοα δθζηίαξ Δ14.5. Καθυ είκαζ κα αθαζνείηαζ ημ ηνίπςια απυ ηδκ ημζθζά ηδξ ιδηέναξ πνμξ απμθοβή ιυθοκζδξ. Γζαηδνμφιε ηα έιανοα ζε ενεπηζηυ ιέζμ DMEM-F12 πμο πενζέπεζ ηαζ πεκζηζθθίκδ/ζηνεπημιοηίκδ/βθμοηαιίκδ. Απμιμκχκμοιε ημκ εβηέθαθμ απυ ηα έιανοα ηαζ απμιαηνφκμοιε ημοξ μζθνδηζημφξ αμθαμφξ (olfactory bulbs). Απμηυπημοιε ηα δφμ εβηεθαθζηά διζζθαίνζα απυ ημκ οπυθμζπμ εβηέθαθμ ηαζ πμθφ πνμζεηηζηά αθαζνμφιε ηζξ ιήκζββεξ. Γζαπςνίγμοιε ημ θθμζυ (ναπζαία) απυ ημ νααδςηυ (ημζθζαηά). Μεηαθένμοιε ημοξ 2 θθμζμφξ (απυ ηάεε διζζθαίνζμ) ζε 6-well πζάημ ηοηηανμηαθθζένβεζαξ πμο πενζέπεζ 2ml ενεπηζημφ ιέζμο Ν2 ακά well. Σμ ενεπηζηυ ιέζμ Ν2 δζαηδνεί ηζξ πμθθαπθαζζαζηζηέξ ζδζυηδηεξ ηςκ πνυδνμιςκ κεονζηχκ ηοηηάνςκ ηαζ ζοκηδνεί ηδκ ηαθθζένβεζά ημοξ. Γζαθοημπμζμφιε ημκ ζζηυ ιδπακζηά, πνχηα ιε πζπέηα 1000ml ηαζ ζηδ ζοκέπεζα ιε πζπέηα Pasteur ηδκ μπμία έπμοιε πενάζεζ απυ θθυβα χζηε κα θεπηφκεζ ημ ζηυιζυ ηδξ. Γζαθοημπμζμφιε ημκ ζζηυ ιέπνζ αοηυξ κα απμηεθείηαζ ζημ ιεβαθφηενμ πμζμζηυ ημο απυ ιμκαδζαία ηφηηανα. Ηδζαίηενδ πνμζμπή 73

74 Τθζηά & Μέεμδμζ πνέπεζ κα δμεεί ζημ ζηυιζμ ηδξ πζπέηαξ Pasteur, ηαεχξ έκα πμθφ θεπηυ ζηυιζμ ιπμνεί κα εακαηχζεζ ηα ηφηηανα εκχ έκα θανδφ ζηυιζμ δεκ εα επζηφπεζ ηδκ απμηεθεζιαηζηή δζάζπαζδ ημο ζζημφ. Σδκ επυιεκδ διένα ιεηαθένμοιε ηδκ ηαθθζένβεζα ζε κέα 6-well πζάηα ηοηηανμηαθθζένβεζαξ πνμζέπμκηαξ χζηε κα αθήζμοιε πίζς ηοπυκ ιεβάθα ζοζζςιαηχιαηα ζζημφ. Πνμζεέημοιε 2ml ενεπηζημφ ιέζμο Ν2 ζε ηάεε well. Σδκ επυιεκδ διένα πνμζεέημοιε ζηδκ ηαθθζένβεζα 2ml ενεπηζημφ ιέζμο Ν2 ζε ηάεε well. Μεηά απυ 24 hrs δζαζπμφιε ιδπακζηά ηζξ κεονυζθαζνεξ (Πνμζμπή: ακ μ ανζειυξ ηαζ δ ποηκυηδηα ηςκ κεονυζθαζνςκ είκαζ ήδδ πμθφ ιεβάθα, ιπμνμφιε κα παναθείρμοιε ημ πνμδβμφιεκμ αήια ηαζ κα δζαζπάζμοιε ηζξ κεονυζθαζνεξ ιία διένα κςνίηενα). Μεηαθένμοιε ηζξ κεονυζθαζνεξ ζε έκα 15ml Falcon ηαζ ηζξ επζζηνέθμοιε ζημκ επςαζηή ιέπνζ κα ηαηααοεζζημφκ θυβς αανφηδηαξ (εκαθθαηηζηά, ιπμνμφιε κα ηζξ θοβμηεκηνήζμοιε βζα 2 min ζηα 800 rpm). Αθαζνμφιε ιε πνμζμπή ημ οπενηείιεκμ (πνμαζνεηζηά ιπμνμφιε κα λεπθφκμοιε ηζξ κεονυζθαζνεξ ιε PBS 1x) ηαζ επακαδζαθφμοιε ημ ίγδια ζε 1ml ενεπηζηυ ιέζμ Ν2. Γζαζπάιε ηζξ κεονυζθαζνεξ πνδζζιμπμζχκηαξ πζπέηα 1000ml ηαζ πζπέηα Pasteur ζημ ααειυ πμο πεηοπαίκμοιε ηδκ φπανλδ ιμκαδζαίςκ ηοηηάνςκ. Μεηνάιε ηα ηφηηανα ιε αζιμηοηηανυιεηνμ ηάκμκηαξ πνήζδ ηαζ ηδξ πνςζηζηήξ Trypan blue χζηε κα ηαοημπμζήζμοιε ηα κεηνά ηφηηανα. «ηνχκμοιε» ηα ηφηηανα ζε 6-well πζάηα ηοηηανμηαθθζένβεζαξ ζε ποηκυηδηα 5x10 5 ηφηηανα/well. Δθέβπμοιε πνμζεηηζηά ηδκ ηαθθζένβεζα ηδκ επυιεκδ διένα χζηε ακ έπεζ ανπίζεζ μ ζπδιαηζζιυξ ιζηνχκ ζθαζνχκ (απμηεθμφιεκςκ απυ 2-4 ηφηηανα), κα αναζχζμοιε ηδκ ηαθθζένβεζα ζε αναίςζδ 1:3. Ζ αναίςζδ αοηή δζαζθαθίγεζ υηζ μζ κεονυζθαζνεξ πμο εα ζπδιαηζζημφκ πνμένπμκηαζ απυ έκα, ιμκαδζηυ ανπζηυ ηφηηανμ (clonal density). Μεηά απυ 3-4 διένεξ, μζ κέεξ κεονυζθαζνεξ εα έπμοκ δδιζμονβδεεί. Δκαθθαηηζηά, ιπμνμφιε κα «ζηνχζμοιε» ελανπήξ ηα ηφηηανα ζε πζμ αναζή ζοβηέκηνςζδ 10 4 ηφηηανα/ml (clonal density) χζηε κα ιδκ πνεζάγεηαζ κα αναζχζμοιε ηδκ ηαθθζένβεζα. Ζ ποηκυηενδ υιςξ ζοβηέκηνςζδ εοκμεί πενζζζυηενμ ηδκ επζαίςζδ ηςκ ηοηηάνςκ. ηακ μζ κεονυζθαζνεξ ιεβαθχζμοκ ανηεηά ηαζ πνζκ ανπίζμοκ κα ζπδιαηίγμοκ ζοζζςιαηχιαηα (πενίπμο ιεηά απυ 5-6 διένεξ), επακαθαιαάκμοιε ηδ δζαδζηαζία δζάζπαζήξ ημοξ ηαζ ηζξ «ζηνχκμοιε» εη κέμο ζε clonal density χζηε κα ζπδιαηζζημφκ κέεξ ζθαίνεξ. (Πνμζμπή: ακ αθήζμοιε ηζξ κεονυζθαζνεξ κα ιεβαθχζμοκ πμθφ, αοηυ δοζημθεφεζ ηδκ επζηοπδιέκδ δζάζπαζή ημοξ ηαζ επζπθέμκ ιπμνεί μζ κεονυζθαζνεξ κα ανπίζμοκ κα δζαθμνμπμζμφκηαζ). Ακ εέθμοιε κα εηηζιήζμοιε ηδκ ζηακυηδηα ηςκ ηοηηάνςκ 74

75 Τθζηά & Μέεμδμζ πμο έπμοιε ζηδκ ηαθθζένβεζα βζα αοημ-ακακέςζδ, πνέπεζ κα πνμζέλμοιε χζηε δ δζάζπαζή ημοξ κα είκαζ επζηοπδιέκδ ηαζ κα ηαηαθήβεζ ζε ιμκαδζαία ηφηηανα. Με ημ πνςηυημθθμ αοηυ ιπμνμφιε κα δζαηδνήζμοιε ζε ηαθθζένβεζα ηζξ κεονυζθαζνεξ βζα ιεβάθμ πνμκζηυ δζάζηδια, ηαεχξ ημ δοκαιζηυ ηδξ αοηo-ακακέςζήξ ημοξ είκαζ εεςνδηζηά απενζυνζζημ. Μπμνμφιε κα ηαηενβαζημφιε ηζξ κεονυζθαζνεξ ζε πεζνάιαηα ακμζμθεμνζζιμφ βζα κα εθέβλμοιε ηδκ έηθναζδ δεζηηχκ πνυδνμιςκ κεονζηχκ ηοηηάνςκ, ή κα εηηζιήζμοιε ημ ιέβεεμξ ηαζ ημκ ανζειυ ημοξ ςξ ιέηνμ απμηφπςζδξ ηδξ ζηακυηδηαξ πμθθαπθαζζαζιμφ ημοξ ηαζ ημο ανπζημφ ανζειμφ πνυδνμιςκ κεονζηχκ ηοηηάνςκ, ακηίζημζπα. Γηαιύκαηα Θνεπηζηυ ιέζμ Ν2 Γζα 50ml ενεπηζημφ ιέζμο 49ml ενεπηζηυ ιέζμ DMEM-F12 (Invitrogen 21331) 500ιl (1x) Πεκζηζθθίκδ/ηνεπημιοηίκδ/Γθμοηαιίκδ (Gibco , stock 100x) 100ιl (20ιg/ml) Ηκζμοθίκδ (Sigma Η0516, stock 10mg/ml) 500ιl N2 supplement (Gibco ) EGF (20ng/ml) (R&D Systems 236-ΔG, stock 1ιg/ιl) bfgf (20ng/ml) (R&D Systems 233-FB, stock 1ιg/ιl) Δπαγσγή δηαθνξνπνίεζεο ησλ λεπξόζθαηξσλ Γζα κα επάβμοιε ηδ δζαθμνμπμίδζδ ηςκ κεονυζθαζνςκ αημθμοεμφιε ηδκ ελήξ δζαδζηαζία: οβηεκηνχκμοιε ηζξ κεονυζθαζνεξ ζε 15ml Falcon ηαζ ηζξ αθήκμοιε κα ηαηααοεζζημφκ. Αθαζνμφιε ημ οπενηείιεκμ ηαζ ηζξ λεπθέκμοιε ιε PBS 1x. Πενζιέκμοιε κα ηαηααοεζζημφκ ηαζ αθαζνμφιε ημ οπενηείιεκμ. Ακαδζαθφμοιε ηζξ κεονυζθαζνεξ ζε ενεπηζηυ ιέζμ δζαθμνμπμίδζδξ. ε 12-well ή 24-well πζάημ ηοηηανμηαθθζένβεζαξ ημπμεεημφιε ζε ηάεε well ιζα ηοηθζηή ηαθοπηνίδα δζαιέηνμο 13mm ηδκ μπμία έπμοιε επζηαθφρεζ ιε δζάθοια πμθο-l-θοζίκδξ. Ζ επίζηνςζδ ιε πμθο-l-θοζίκδ εκζζπφεζ ηδκ πνμζηυθθδζδ ηςκ ηοηηάνςκ ζηδκ ηαθοπηνίδα. 75

76 Τθζηά & Μέεμδμζ Σμπμεεημφιε ιζα ιζηνή πμζυηδηα απυ ημ ενεπηζηυ ιέζμ ιε ηζξ κεονυζθαζνεξ αηνζαχξ πάκς ζηδκ ηαθοπηνίδα (250ιl) βζα κα δζαζθαθίζμοιε υηζ μζ κεονυζθαζνεξ δεκ εα ιεηαηζκδεμφκ εηηυξ ηαθοπηνίδαξ. Δπζζηνέθμοιε ηζξ κεονυζθαζνεξ ζημκ επςαζηή. Σδκ επυιεκδ διένα πνμζεέημοιε πνμζεηηζηά θίβμ ενεπηζηυ ιέζμ δζαθμνμπμίδζδξ ιέπνζ κα ηαθοθεεί δ ηαθοπηνίδα ηαζ ημ well. Αθήκμοιε ηζξ κεονυζθαζνεξ ζε ηαθθζένβεζα ζημκ επςαζηή βζα δφμ εαδμιάδεξ χζηε κα επαπεεί ηαζ κα μθμηθδνςεεί δ δζαθμνμπμίδζή ημοξ. Αθθάγμοιε ημ ενεπηζηυ ιέζμ ηάεε 7 διένεξ (ή πζμ ζοπκά ακ πνεζάγεηαζ). Ήδδ ιεηά ηδκ πνχηδ εαδμιάδα ηα ηφηηανα εβηαηαθείπμοκ ηζξ κεονυζθαζνεξ, πνμζημθθχκηαζ ζηδκ επζθάκεζα ηδξ ηαθοπηνίδαξ ηαζ ειθακίγμοκ ηδκ ηοπζηή ιμνθμθμβία δζαθμνμπμζδιέκςκ ηοηηάνςκ, ιε πεπθαηοζιέκμ ζχια ηαζ ειθακείξ πνμεηαμθέξ. Δπελενβαγυιαζηε ζηδ ζοκέπεζα ηζξ ηαθοπηνίδεξ ιε ηα δζαθμνμπμζδιέκα ηφηηανα βζα πεζνάιαηα ακμζμθεμνζζιμφ ιε ηαηάθθδθμοξ δείηηεξ βζα κεονζηά ηαζ βθμζαηά ηφηηανα. Γηαιύκαηα Θνεπηζηυ ιέζμ δζαθμνμπμίδζδξ Γζα 50ml ενεπηζημφ ιέζμο 49ml ενεπηζηυ ιέζμ DMEM-F12 (Invitrogen) 500ιl (1x) Πεκζηζθθίκδ/ηνεπημιοηίκδ/Γθμοηαιίκδ (Gibco, stock 100x) 100ιl (20ιg/ml) Ηκζμοθίκδ (Sigma, stock 10mg/ml) 500ιl N2 supplement (Gibco) 2% Fetal Bovine Serum (Gibco) Γζάθοια πμθο-l-θοζίκδξ Δπακαδζαθφμοιε ηδκ πμθο-l-θοζίκδ (Sigma L5501) ζε ddh 2 O ζε ηεθζηή ζοβηέκηνςζδ 100mg/ml ηαζ ηδ δζαηδνμφιε ζε ιζηνά aliquots ζημοξ -20 C. Ζ δζαδζηαζία πνέπεζ κα βίκεηαζ οπυ άζδπηεξ ζοκεήηεξ ζημκ απαβςβυ Δπίζηξσζε θαιππηξίδσλ κε πνιπ-l-ιπζίλε Απμζηεζνχκμοιε ηζξ ηαθοπηνίδεξ ζε λδνή απμζηείνςζδ ηαζ ηζξ αθήκμοιε κα ηνοχζμοκ. Πνμζμπή: υθδ δ οπυθμζπδ δζαδζηαζία βίκεηαζ οπυ άζδπηεξ ζοκεήηεξ ζημκ απαβςβυ. Αναζχκμοιε ημ stock ηδξ πμθο-l-θοζίκδξ χζηε κα έπεζ ζοβηέκηνςζδ 100ιg/ml. 76

77 Τθζηά & Μέεμδμζ Βάγμοιε ιζα πμζυηδηα απυ ημ δζάθοια πμθο-l-θοζίκδξ ζε έκα 10cm πζάημ ηοηηανμηαθθζένβεζαξ ηαζ επςάγμοιε ηζξ ηαθοπηνίδεξ βζα 15 min. Ξεπθέκμοιε ηζξ ηαθοπηνίδεξ ιε ddh 2 O πμο έπμοιε αάθεζ ζε έκα άθθμ10cm πζάημ ηοηηανμηαθθζένβεζαξ. Αθήκμοιε ηζξ ηαθοπηνίδεξ κα ζηεβκχζμοκ ηαζ ηζξ θοθάζζμοιε ζε ηαθά ηθεζζηυ απμζηεζνςιέκμ δμπείμ Απνκόλσζε RNA από ηηο λεπξόζθαηξεο Ζ απμιυκςζδ RNA απυ ηζξ κεονυζθαζνεξ έβζκε ιε ζοκδοαζιυ ηςκ πνςημηυθθςκ ημο ακηζδναζηδνίμο Trizol (Invitrogen ) ηαζ ημο RNeasy Mini kit (Qiagen 74104). Γζαζπάιε ηζξ κεονυζθαζνεξ ζε ιμκαδζαία ηφηηανα βζα κα ιεηνήζμοιε ημκ ανζειυ ηςκ ηοηηάνςκ ζηδκ ηαθθζένβεζα. φιθςκα ιε ημ πνςηυημθθμ ημο ακηζδναζηδνίμο Trizol, πνμζεέημοιε 1ml Trizol / 5-10x10 6 ηφηηανα. Ακαηαηεφμοιε επακεζθδιιέκςξ ιε ηδκ πζπέηα. Δπςάγμοιε ηα δείβιαηα βζα 5 min ζε εενιμηναζία δςιαηίμο. Πνμζεέημοιε 0,2ml πθςνμθυνιζμ (Sigma) βζα ηάεε 1ml Trizol πμο πνδζζιμπμζήζαιε ζημ πνμδβμφιεκμ αήια. Ακαηαηεφμοιε ζεεκανά ιε ημ πένζ βζα 15 sec. Δπςάγμοιε ηα δείβιαηα βζα 2-3 min ζε εενιμηναζία δςιαηίμο. Φοβμηεκηνμφιε ζε rpm ζημοξ 4 C βζα 15 min. Σμ δείβια δζαπςνίγεηαζ ζε ιζα ηαηχηενδ ηυηηζκδ θάζδ, ιζα δζάιεζδ θάζδ ηαζ ιζα ακχηενδ δζαθακή θάζδ πμο πενζέπεζ ημ RNA. οθθέβμοιε ηδκ ακχηενδ θάζδ. Πνμζεέημοιε ίζμ υβημ EtOH 70% ηαζ ακαιεζβκφμοιε ηαθά ιε ηδκ πζπέηα. Μεηαθένμοιε 700ιl απυ ημ δείβια ζε ιία ζηήθδ ημο πανέπεηαζ απυ ημ RNeasy Mini kit ηαζ θοβμηεκηνμφιε ζε rpm ζημοξ 4 C βζα 15 sec. Σμ RNA ζοβηναηείηαζ ζηδ ιειανάκδ ηδξ ζηήθδξ εκχ ημ οπυθμζπμ δζάθοια ηαηαθήβεζ ζημ οπμηείιεκμ ζςθδκάηζ. Απμιαηνφκμοιε ημ δζάθοια ηαζ επακαθαιαάκμοιε ηδ δζαδζηαζία βζα υθδ ηδκ πμζυηδηα ημο δείβιαημξ. Πνμζεέημοιε 700ιl δζαθφιαημξ RW1 ζηδ ζηήθδ ηαζ θοβμηεκηνμφιε ζε rpm ζημοξ 4 C βζα 15 sec. Πνμζεέημοιε 500ιl δζαθφιαημξ RPE ζηδ ζηήθδ ηαζ θοβμηεκηνμφιε ζε rpm ζημοξ 4 C βζα 15 sec. Πνμζεέημοιε 500ιl δζαθφιαημξ RPE ζηδ ζηήθδ ηαζ θοβμηεκηνμφιε ζε rpm ζημοξ 4 C βζα 2 min. 77

78 Τθζηά & Μέεμδμζ Σμπμεεημφιε ηδ ζηήθδ ζε ηαζκμφνζμ ζςθδκάηζ eppendorf 1.5ml ηαζ πνμζεέημοιε 30ιl WFI. Φοβμηεκηνμφιε ζε rpm ζημοξ 4 C βζα 1 min. Δπακαθαιαάκμοιε ημ πνμδβμφιεκμ αήια. οθθέβμοιε ημ απμιμκςεέκ RNA ηαζ ημ θςημιεηνμφιε βζα κα εηηζιήζμοιε ηδκ πμζυηδηά ημο ζφιθςκα ιε ημκ παναηάης ηφπμ: Φςημιέηνδζδ RNA: Σζιή μπηζηήξ απμννυθδζδξ x Αναίςζδ x 44 = x ιg/ml ε πενίπηςζδ πμο δ ζοβηέκηνςζδ ημο απμιμκςεέκημξ RNA είκαζ αναζή, ιπμνμφιε κα ζοβηεκηνχζμοιε ημ δείβια ιαξ ιε ιζα δζαδζηαζία ηαείγδζδξ, ςξ ελήξ: Πνμζεέημοιε πμζυηδηα ίζδ ιε ημ 1 / 10 ημο υβημο ημο δείβιαημξ 3Μ μλζηυ κάηνζμ ph 4.8 ηαζ ακαδεφμοιε ζζπονά ζε vortex. Πνμζεέημοιε πμζυηδηα ίζδ ιε ημκ ηνζπθυ υβημ ημο δείβιαημξ EtOH 100% εενιμηναζίαξ -20 C ηαζ ακαδεφμοιε ζζπονά ζε vortex. Δπςάγμοιε ηα δείβιαηα overnight ζημοξ -20 C. Φοβμηεκηνμφιε ζε rpm ζημοξ 4 C βζα 30 min ηαζ αθαζνμφιε ημ οπενηείιεκμ. Ξεπθέκμοιε ημ ίγδια ιε EtOH 80% εενιμηναζίαξ -20 C ηαζ θοβμηεκηνμφιε ζε rpm ζημοξ 4 C βζα 10 min. Δπακαθαιαάκμοιε ημ παναπάκς αήια άθθεξ 2 θμνέξ. Ξδναίκμοιε ημ ίγδια αθήκμκηάξ ημ ζημκ απαβςβυ βζα 15 min ιέζα ζε πάβμ. Δπακαδζαθφμοιε ημ ίγδια ζε ιζηνυηενδ πμζυηδηα (25ιl) WFI ηαζ θςημιεηνμφιε εη κέμο ημ δείβια. Γζαηδνμφιε ημ RNA ζημοξ -80 C. Γηαιύκαηα Ολζηυ Νάηνζμ (CH 3 COONa) 3M ph 4.8 Γζα ηεθζηυ υβημ 1L 408,3g NaOAcetate.3H20 Ροειίγμοιε ημ ph ιε μλζηυ μλφ ηαζ πνμζεέημοιε ddh 2 O ιέπνζ ημκ ηεθζηυ υβημ RT-PCR Σμ RNA πμο απμιμκχζαιε απυ ηζξ ηαθθζένβεζεξ ηςκ κεονυζθαζνςκ απυ WT ηαζ Fl/koNestinCre έιανοα επελενβάζηδηε ζηδ ζοκέπεζα ιε ηδ ιέεμδμ ηδξ αθοζζδςηήξ ακηίδναζδξ πμθοιενάζδξ ακάζηνμθδξ ιεηαβναθήξ (RT-PCR). Ζ ιέεμδμξ αοηή, εηιεηαθθεουιεκδ ηδκ ζηακυηδηα ημο εκγφιμο ηδξ ακάζηνμθδξ ιεηαβναθάζδξ κα ιεηαβνάθεζ ημ RNA ζε DNA, πνδζζιμπμζεί ςξ ιήηνα ημ mrna 78

79 Τθζηά & Μέεμδμζ ηαζ ημ ιεηαβνάθεζ ζημ ακηίζημζπμ cdna. Με αοηυκ ημκ ηνυπμ ιπμνμφιε κα εηηζιήζμοιε ηδκ πμζυηδηα ημο mrna ημο βμκζδίμο πμο οπάνπεζ ζημ δείβια ιαξ. Δημζιάγμοιε δφμ δζαθμνεηζηέξ ακηζδνάζεζξ: ζε έκα ζςθδκάηζ eppendorf πνμζεέημοιε 4ιl 5x first strand buffer (Invitrogen ), 1ιl dntps (stock 10mM, Invitrogen), 2ιl DTT(Invitrogen ) ηαζ 13ιl WFI ζε ηεθζηυ υβημ 20ιl, εκχ ζε έκα δεφηενμ ζςθδκάηζ eppendorf πνμζεέημοιε 800ng απυ ημ RNA πμο έπμοιε απμιμκχζεζ ηαζ 0,6ιl ιίβια ηοπαίςκ εηηζκδηχκ (random primers, Invitrogen ). Δπςάγμοιε ηδ δεφηενδ ακηίδναζδ (ημ RNA ιε ημοξ ηοπαίμοξ εηηζκδηέξ) ζημοξ 65 C βζα 5 min. Δπςάγμοιε βζα 1 min ζε πάβμ. Πνμζεέημοιε ηδκ πνχηδ ακηίδναζδ πμο εημζιάζαιε ηαζ ακαηαηεφμοιε. Δπςάγμοιε βζα 2 min ζε εενιμηναζία δςιαηίμο. Πνμζεέημοιε 1ιl ακάζηνμθδξ ιεηαβναθάζδξ SuperScript ). Δπςάγμοιε ζημοξ 25 C βζα 10 min. Δπςάγμοιε ζημοξ 42 C βζα 1 hr. Δπςάγμοιε ζημοξ 70 C βζα 15 min. II (Invitrogen Πνμζεέημοιε 1ιl RNase H (Roche) βζα κα απμζημδμιδεμφκ μπμζαδήπμηε ηαηάθμζπα RNA. Δπςάγμοιε ζημοξ 37 C βζα 20 min. Ζ δζαδζηαζία ζπδιαηζζιμφ ημο cdna έπεζ μθμηθδνςεεί ζε αοηυ ημ ζδιείμ. ηδ ζοκέπεζα εκζζπφμοιε ηδκ πμζυηδηα αοημφ ημο cdna ιε ακηίδναζδ PCR. Πναβιαημπμζήζαιε ηδκ PCR ακηίδναζδ βζα ηα βμκίδζα ηδξ mgeminin (ιε ηεθζηυ πνμσυκ ιεβέεμοξ 201bp) ηαζ mactin (ςξ βμκίδζμ ακαθμνάξ, ιε ηεθζηυ πνμσυκ ιεβέεμοξ 514bp) ιε ημοξ ελήξ εηηζκδηέξ: βζα ηδκ mgeminin: 5 - CTTCTGCAGATGGATCTCTTGTTGGC-3 ηαζ 5 - CTTCTTTCCAATACTGAGAAGTAGG-3, εκχ βζα ηδκ mactin: 5 - TGTGATGGTGGGAATGGGTCAG-3 ηαζ 5 -TTTGATGTCACGCACGATTTCC- 3. Σμ πνυβναιια πμο αημθμοεήεδηε βζα ηδκ εκίζποζδ ηςκ παναπάκς ηιδιάηςκ DNA ηαζ μζ πμζυηδηεξ ηςκ ακηζδναζηδνίςκ απεζημκίγμκηαζ ζημοξ παναηάης πίκαηεξ: 79

80 Τθζηά & Μέεμδμζ Αληηδξαζηήξην cdna 10x PCR buffer (-MgCl 2 ) MgCl 2 (10mM) dntps (10mM) Δηηζκδηήξ forward (100pmol/ιl) Δηηζκδηήξ reverse (100pmol/ιl) Taq πμθοιενάζδ (5u/ιl) WFI Tεθζηυξ υβημξ Πνζόηεηα 2ιl 5ιl (1x) 1ιl (0,2mM) 0,5ιl (0,1mM) 0,5ιl (1pmol/ιl) 0,5ιl (1pmol/ιl) 0,5ιl (0,05u/ιl) 50ιl Πίλαθαο 2.7. PCR αληίδξαζε γηα ηελ αλίρλεπζε ηνπ cdna ηεο mgeminin θαη ηεο mactin. Αξηζκόο θύθισλ Θεξκνθξαζία Υξόλνο 1 95 C 10 min. 94 C 45 sec C 30 sec. 72 C 1 min C 10 min. Ζ Taq πμθοιενάζδ πνμζηέεδηε ιεηά ημ πνχημ αήια Πίλαθαο 2.8. PCR πξόγξακκα γηα ηελ ελίζρπζε ηνπ cdna ηεο mgeminin. Αξηζκόο θύθισλ Θεξκνθξαζία Υξόλνο 1 95 C 10 min. 94 C 45 sec C 30 sec. 72 C 1 min C 15 min. Ζ Taq πμθοιενάζδ πνμζηέεδηε ιεηά ημ πνχημ αήια Πίλαθαο 2.9. PCR πξόγξακκα γηα ηελ ελίζρπζε ηνπ cdna ηεο mactin. 80

81 Τθζηά & Μέεμδμζ 2.5. Ορήκαηα έθθξαζεο Πιαζκηδηαθνί θνξείο γηα ηα πεηξάκαηα πβξηδνπνίεζεο in situ Με ηδ αμήεεζα ηδξ ιεευδμο ηδξ PCR ηθςκμπμζήεδηε μθυηθδνμ ημ ακμζπηυ ακαβκςζηζηυ πθαίζζμ ηδξ Geminin ημο ιουξ ζημκ πθαζιζδζαηυ θμνέα pbluescript KS, ζηζξ εέζεζξ πμο ηαεμνίγμκηαζ απυ ηα έκγοια πενζμνζζιμφ EcoRI/BamHI. Οζ primers πμο πνδζζιμπμζήεδηακ ήηακ μζ ελήξ: sense 5 - CGGAATTCTGAAAAATGAATCTCAGTATG-3, anti-sense 5 - GCGGATCCATAGCCCCAGGATTCAAACCTG-3 (ιεηαπηοπζαηή ενβαζία Μάβδαξ πέθθα). Σμ πθαζιίδζμ αοηυ πνδζζιμπμζήεδηε ζηδ ζοκέπεζα βζα ηδκ παναβςβή ημο ακζπκεοηή RNA ηδξ Geminin ζηα πεζνάιαηα οανζδμπμίδζδξ in situ Φνξείο έθθξαζεο γηα ηα πεηξάκαηα ηεο ειεθηξνδηακόιπλζεο ex vivo Γζα ηα πεζνάιαηα ηδξ δθεηηνμδζαιυθοκζδξ ex vivo ηθςκμπμζήζαιε ηνεζξ δζαθμνεηζηέξ ιμνθέξ ηδξ πνςηεΐκδξ Geminin ζημ υπδια έηθναζδξ pcaggs. Πνμιδεεοηήηαιε ημ θμνέα pcaggs απυ ημ ενβαζηήνζμ ημο François Guillemot ζημ Δεκζηυ Ηκζηζημφημ Ηαηνζηήξ Ένεοκαξ (National Institute for Medical Research) ζημ Λμκδίκμ. Πνυηεζηαζ βζα έκα πμθφ ζζπονυ υπδια έηθναζδξ ηαεχξ πενζέπεζ ημκ εκζζποηή ημο ακενχπζκμο ηοηηανμιεβαθμσμφ (hcmv) ηαζ ημκ οπμηζκδηή ημο βμκζδίμο ηδξ α-αηηίκδξ ημο ημηυπμοθμο. Σμ υπδια αοηυ πενζθαιαάκεζ ςξ ιέζμ ηαοημπμίδζδξ ηδκ εκζζποιέκδ πνάζζκδ θεμνίγμοζα πνςηεΐκδ (enhanced green fluorescent protein, GFP) ηθςκμπμζδιέκδ ζημ 3 άηνμ εκυξ εζςηενζημφ νζαμζςιζημφ ζδιείμο εζζυδμο (internal ribosome entry site, IRES). ημ υπδια αοηυ, ηα cdna ηςκ δζαθυνςκ ιμνθχκ ηδξ Geminin ηθςκμπμζήεδηακ ζημ 3 άηνμ ηςκ νοειζζηζηχκ ζημζπείςκ ηςκ βμκζδίςκ hcmv/α-αηηίκδξ ηαζ ζημ 5 άηνμ ηδξ αημθμοείαξ IRES-GFP, ζηδ εέζδ πμο μνζμεεηείηαζ απυ ηα ζδιεία ακαβκχνζζδξ ηςκ εκδμκμοηθεαζχκ πενζμνζζιμφ SacI/EcoRV. Οζ ηθςκμπμζήζεζξ πενζεθάιαακακ ημ cdna ηδξ αβνίμο ιμνθήξ ηδξ πνςηεΐκδξ Geminin ημο ακενχπμο, ημ cdna ιζαξ ιμνθήξ ηδξ πνςηεΐκδξ απυ ηδκ μπμία απμοζζάγμοκ ηα 30 πνχηα αιζκμηεθζηά αιζκμλέα υπμο πενζέπεηαζ ημ ζήια απμζημδυιδζδξ ημο ιμνίμο, ηαζ ηέθμξ ημ cdna ιζαξ ιμνθήξ ημο ιμνίμο απυ ηδκ μπμία απμοζζάγεζ δ ηνίζζιδ πενζμπή βζα ηδκ αθθδθεπίδναζδ ηδξ πνςηεΐκδξ ιε ημκ πανάβμκηα Brg1 (Roukos et al., 2007). θμζ μζ θμνείξ εθέβπεδηακ ιε αθθδθμφπζζδ (sequencing). 81

82 Τθζηά & Μέεμδμζ Κισλνπνίεζε ηεο κνξθήο ΓBrg1-Geminin ζηνλ θνξέα pcaggs Καεχξ δ αβνίμο ηφπμο ιμνθή ηδξ πνςηεΐκδξ οπήνπε ήδδ ηθςκμπμζδιέκδ ζημ θμνέα pcaggs ιεηαλφ ηςκ εέζεςκ ακαβκχνζζδξ ηςκ εκγφιςκ πενζμνζζιμφ EcoRV ηαζ SacI, ηθςκμπμζήζαιε ηαζ ηζξ άθθεξ ιμνθέξ ηδξ πνςηεΐκδξ ζηζξ ίδζεξ εέζεζξ. πεδζάζαιε ημοξ ελήξ εηηζκδηέξ βζα κα πνμζεέζμοιε εηαηένςεεκ ηδξ αθθδθμοπίαξ ηδξ ιμνθήξ ΓBrg1 Geminin εέζεζξ ακαβκχνζζδξ βζα ηζξ εκδμκμοηθεάζεξ πενζμνζζιμφ EcoRV ηαζ SacI: forward 5 - TACGAATTCGAGCTCATGAATCCCAGTATGAAGCAGAAACAAG-3, reverse 5 - TAGCTCGAGGATATCTCAATCAATCCAGTGATTCAAAATTATCCAGAGG- 3. Σμ πνυβναιια πμο αημθμοεήεδηε βζα ηδκ εκίζποζδ ημο παναπάκς ηιήιαημξ DNA ηαζ μζ πμζυηδηεξ ηςκ ακηζδναζηδνίςκ απεζημκίγμκηαζ ζημοξ παναηάης πίκαηεξ: Αληηδξαζηήξην DNA 10x PCR buffer (-MgCl 2 ) MgCl 2 (10mM) dntps (10mM) Δηηζκδηήξ forward (100pmol/ιl) Δηηζκδηήξ reverse (100pmol/ιl) Taq πμθοιενάζδ (5u/ιl) WFI Tεθζηυξ υβημξ Πνζόηεηα 4ιl 10ιl (1x) 12ιl 8ιl 2ιl 2ιl 1ιl 100ιl Πίλαθαο PCR αληίδξαζε γηα ηελ θιωλνπνίεζε ηεο κνξθήο ΓBrg1 Geminin. Αξηζκόο θύθισλ Θεξκνθξαζία Υξόλνο C 10 min. 94 C 45 sec C 30 sec. 72 C 1 min C 15 min. Ζ Taq πμθοιενάζδ πνμζηέεδηε ιεηά ημ πνχημ αήια Πίλαθαο PCR πξόγξακκα γηα ηελ θιωλνπνίεζε ηεο κνξθήο ΓBrg1-Geminin. 82

83 Τθζηά & Μέεμδμζ Καεανίγμοιε ημ πνμσυκ ηδξ παναπάκς PCR ακηίδναζδξ πνδζζιμπμζχκηαξ ημ kit ηαεανζζιμφ DNA NucleoSpin Extract 2 in 1 (Macherey-Nagel). Καηενβαγυιαζηε ηυζμ ημ πνμσυκ ηδξ PCR ακηίδναζδξ υζμ ηαζ ημκ θμνέα pcaggs ιε ηζξ εκδμκμοηθεάζεξ πενζμνζζιμφ EcoRV ηαζ SacI. Πνμεημζιάγμοιε ακηζδνάζεζξ πέρδξ ζε ηεθζηυ υβημ 100ιl ηαζ ηζξ επςάγμοιε overnight ζημοξ 37 C. Ζθεηηνμθμνμφιε ηζξ ακηζδνάζεζξ πέρδξ ζε πδηηή αβανυγδξ ηαζ απμιμκχκμοιε ηζξ ακηίζημζπεξ γχκεξ πνδζζιμπμζχκηαξ ημ kit NucleoSpin Extract 2 in 1 (Macherey-Nagel). Σμ πνμσυκ ηδξ PCR ακηίδναζδξ έπεζ ιέβεεμξ 600 bp εκχ μ θμνέαξ έπεζ ιέβεεμξ bp. Πναβιαημπμζμφιε ακηίδναζδ θζβάζδξ ζφιθςκα ιε ηζξ μδδβίεξ ημο ακηίζημζπμο kit (Takara Bio Inc. 6022). Αθήκμοιε ηδκ ακηίδναζδ ζημοξ 37 C βζα 1,5 hr. Με ημ πνμσυκ ηδξ παναπάκς ακηίδναζδξ ιεηαζπδιαηίγμοιε ααηηήνζα E.coli DH5a. Δθέβπμοιε ηζξ απμζηίεξ πμο ζπδιαηίγμκηαζ βζα ηδκ εκζςιάηςζδ ημο ηιήιαημξ ημο βμκζδίμο ηδξ Geminin ιε ακηζδνάζεζξ πέρδξ ιε ηζξ εκδμκμοηθεάζεξ πενζμνζζιμφ EcoRV ηαζ SacI. Δπζαεααζχκμοιε ημ απμηέθεζια ηδξ ηθςκμπμίδζδξ ηαζ ημκ ζςζηυ πνμζακαημθζζιυ εκζςιάηςζδξ ηδξ ιμνθήξ ηδξ Geminin ιε δζαδζηαζία αθθδθμφπζζδξ (sequencing) Κισλνπνίεζε ηεο κνξθήο Νdel-Geminin ζηνλ θνξέα pcaggs H πμνεία ηθςκμπμίδζδξ βζα ηδ ιμνθή Ndel-Geminin ζημκ θμνέα pcaggs είκαζ ίδζα ιε ηδ δζαδζηαζία πμο πενζβνάθδηε ζηδκ πνμδβμφιεκδ εκυηδηα. Οζ εηηζκδηέξ πμο πνδζζιμπμζήεδηακ ζε αοηήκ ηδκ πενίπηςζδ είκαζ μζ ελήξ: forward 5 - ACTGAATTCGAGCTCATGCCTTCTGCATCTGGATCTCTTG-3, reverse 5 - ACTCTCGAGGATATCTCATATACATGGCTTTGCATCCGTAG Ζιεθηξνδηακόιπλζε ex vivo Ζ πεζναιαηζηή πνμζέββζζδ ηδξ δθεηηνμδζαιυθοκζδξ ex vivo είκαζ έκα πμθφ πνήζζιμ ενβαθείμ βζα ηδ ιεθέηδ ηςκ δζαδζηαζζχκ πμο δζέπμοκ ηδκ ακάπηολδ ηαζ κεονμβέκεζδ ημο εβηεθάθμο. Δπζηνέπεζ ηδκ δζαιυθοκζδ ηςκ πνμβμκζηχκ ηοηηάνςκ ημο θθμζμφ ιε ορδθέξ ζοβηεκηνχζεζξ ηδξ οπυ ιεθέηδ πνςηεΐκδξ ηαζ ηδκ παναημθμφεδζδ ηςκ επζπηχζεςκ ηδξ οπενέηθναζδξ αοηήξ ζημοξ ιδπακζζιμφξ κεονμβέκεζδξ ημο θθμζμφ. Σμ πνςηυημθθμ πμο αημθμοεήζαιε είκαζ εονέςξ ηαεζενςιέκμ (Hand et al., 2005; Nguyen et al., 2006). 83

84 Τθζηά & Μέεμδμζ Σα πεζνάιαηα ηδξ δθεηηνμδζαιυθοκζδξ ex vivo πναβιαημπμζήεδηακ ζε έιανοα ιουξ δθζηίαξ Δ14.5 ςξ ελήξ: Απμιμκχκμοιε ηα έιανοα απυ ηδ ιδηένα ηαζ απμηυπημοιε ημ ηεθάθζ ημοξ. Γζαηδνμφιε ημοξ ζζημφξ ζε ενεπηζηυ ιέζμ L15 (Invitrogen) ζε πάβμ. Μεηαθένμοιε ημ ηεθάθζ πμο πνυηεζηαζ κα επελενβαζημφιε ζε έκα άδεζμ πζάημ Petri. Δκφμοιε ιε ηαηάθθδθα ηνζπμεζδή ημ υπδια πμο θένεζ ημ επζεοιδηυ cdna ηδξ πνςηεΐκδξ Geminin (3ιg/ιl) ζηζξ πθάβζεξ ημζθίεξ ημο ειανφμο. Γζα ηδ δζεοηυθοκζδ ηδξ δζαδζηαζίαξ ακαιεζβκφμοιε ημ cdna ιε πνςζηζηή Fast Green (Sigma) ζοβηέκηνςζδξ 1/100 (V/V) χζηε κα παναημθμοεμφιε ηδκ πμνεία ηςκ ιζηνμεκέζεςκ. Δζζάβμοιε ημ ηνζπμεζδέξ ζημ πνυζεζμ ηιήια ημο θθμζμφ ηαζ βειίγμοιε ηεθείςξ ηδκ πθάβζα ημζθία. Οζ εκέζεζξ έβζκακ ιε Femtojet microinjector (Eppendorf). Σνζπμεζδή: Harvard apparatus, borosilicate glass capillaries GC Harvard part No , 1.0mm. Σμ ζηυιζμ ηςκ ηνζπμεζδχκ επζιδηφκεδηε ιε εζδζηυ ιδπάκδια (needle/pipette puller, KORF, model 750, Tujunga, CA, USA). Σμ δείβια ημο DNA θμνηχκεηαζ ζηα ηνζπμεζδή ιε εζδζηά tips (Eppendorf ). Δθανιυγμοιε δθεηηνζηή ηάζδ ζε μθυηθδνμ ημ ηεθάθζ ηςκ ειανφςκ. Σμπμεεημφιε ιε πνμζμπή ηα δθεηηνυδζα χζηε μ εεηζηυξ πυθμξ κα ανίζηεηαζ πνμξ ηδκ ελςηενζηή επζθάκεζα ημο ηεθαθζμφ, ηαεχξ εέθμοιε κα ηαηεοεφκμοιε ημ ανκδηζηά θμνηζζιέκμ DNA πνμξ ημκ θθμζυ. Σα δθεηηνυδζα πμο πνδζζιμπμζήζαιε ήηακ ηδξ εηαζνείαξ Nepagene (CUY650P5). Δθανιυγμοιε 5 παθιμφξ ηςκ 70V δζάνηεζαξ 50ms ιε δζαθείιιαηα 1s ιε ηδ αμήεεζα εκυξ ΒΣΥ electroporator (BTX830, VWR CanLab). Μεηά ηδκ δθεηηνμδζαιυθοκζδ ιεηαθένμοιε βνήβμνα ημ ηεθάθζ ημο ειανφμο ζε ηνφμ L15 ενεπηζηυ ιέζμ. Απμιμκχκμοιε βνήβμνα ημοξ εβηεθάθμοξ ηαζ ημοξ ημπμεεημφιε ζε ηνφμ L15 ενεπηζηυ ιέζμ. ηδ ζοκέπεζα ημοξ ιεηαθένμοιε ζε 24-well πζάημ ηοηηανμηαθθζένβεζαξ πμο πενζέπεζ low-melting αβανυγδ ζε ηάεε well. Σμπμεεημφιε ημκ ζζηυ ηαηαηυνοθα ιε ημοξ μζθνδηζημφξ αμθαμφξ πνμξ ηα ηάης ηαζ επςάγμοιε ζε πάβμ βζα 1 hr. Ζ υθδ δζαδζηαζία πνέπεζ κα βίκεζ πμθφ βνήβμνα ηαζ πνμζέπμκηαξ ημκ πνμζακαημθζζιυ ημο εβηεθάθμο βζαηί δ αβανυγδ εα ζηενεμπμζδεεί πμθφ βνήβμνα. Σειαπίγμοιε ημκ εβηέθαθμ ζε Vibratome (Leica) ζε ιεηςπζαίεξ ημιέξ πάπμοξ 300ιm. Μεηαθένμοιε ηζξ θέηεξ ημο εβηεθάθμο ζε πζάηα ηαθθζένβεζαξ ιε εζδζηά εκεέιαηα πμο ηζξ δζαηδνμφκ ζε διίλδνεξ ζοκεήηεξ (0,4ιm pore size, Millicell, Millipore, PICMORG50). Καθθζενβμφιε ηζξ θέηεξ βζα 2 ή 4 διένεξ ζε Neurobasal ενεπηζηυ ιέζμ (Gibco 21103) πμο πενζέπεζ Β27 (1%, Gibco), Ν2 84

85 Τθζηά & Μέεμδμζ (1%, Gibco), βθμοηαιίκδ (1%, 200mM), πεκζηζθίκδ/ζηνεπημιοηίκδ (1%, Gibco), fungizone (0,1%, Invitrogen) ηαζ ciprofloxacine (5ιg/ml, MP Biomedicals), ακακεχκμκηαξ ηδ ιζζή πμζυηδηα ημο ιέζμο ηάεε ιένα. Μεηά ημ πέναξ ηδξ ηαθθζένβεζαξ ηαηαρφπμοιε ηζξ θέηεξ ζημ εζδζηυ ιέζμ OCT ηαζ ηζξ δζαηδνμφιε ζημοξ -80 C. Πνμζέπμοιε χζηε κα αθαζνέζμοιε υθδ ηδκ πμζυηδηα αβανυγδξ πμο πενζηθείεζ ηδ θέηα. Κυαμοιε ηζξ θέηεξ ζε ημιέξ πάπμοξ 10ιm ζηδ ιζηνμηυιμ ηαζ ηζξ επελενβαγυιαζηε βζα ακμζμθεμνζζιυ. Γηαιύκαηα L15 Θνεπηζηυ ιέζμ Γζα 500ml ενεπηζημφ ιέζμο 500ml L15 ενεπηζηυ ιέζμ (Invitrogen) 12,9ml NaHCO3 (1M) 15ml Glucose (1M) 5ml πεκζηζθίκδ-ζηνεπημιοηίκδ (1%) 100ιl ciprofloxacine (25mg/ml) 5ml Glutamine 3% low melting αβανυγδ Γζαθφμοιε 0.6g αβανυγδ (Agarose type VII, Sigma A9045) ζε 20ml ενεπηζημφ ιέζμο L15. Θενιαίκμοιε ημ ιίβια ζε θμφνκμ ιζηνμηοιάηςκ ιέπνζ κα δζαθοεεί δ αβανυγδ πνμζέπμκηαξ κα ιδ ανάζεζ. Καηά ηδ δζάνηεζα ημο πεζνάιαημξ δζαηδνμφιε ηδκ αβανυγδ ζε οδαηυθμοηνμ ζημοξ 37 C Τβξηδνπνίεζε in situ Ζ βεκζηή ανπή ηδξ ιδ ναδζεκενβήξ οανζδμπμίδζδξ in situ είκαζ δ πνήζδ ηαηάθθδθα ζδιαζιέκςκ ακζπκεοηχκ RNA βζα ηδκ ημπμβναθζηή απμηφπςζδ (ζε ημιέξ απυ έιανοα ιουξ βζα πανάδεζβια) ημο mrna εκυξ βμκζδίμο ζηυπμο. Οζ ακζπκεοηέξ RNA πνμηφπημοκ ιε εζδζηή επελενβαζία ηαηάθθδθςκ πθαζιζδζαηχκ μπδιάηςκ πμο θένμοκ ημ cdna ημο βμκζδίμο ζηυπμο. Ζ ζήιακζδ ηςκ ακζπκεοηχκ RNA βίκεηαζ ιε ημ ακηζδναζηήνζμ DIG ηαζ δ εκηυπζζδ ηδξ εζδζηήξ δέζιεοζδξ ημο ακζπκεοηή ιε ημ ιεθεημφιεκμ mrna επζηοβπάκεηαζ ιε ηδ πνήζδ εκυξ anti-dig ακηζζχιαημξ. Καεχξ ημ anti-dig ακηίζςια είκαζ ζοκδεδειέκμ ιε ιυνζα αθηαθζηήξ θςζθαηάζδξ, πνδζζιμπμζχκηαξ ζημ ηεθζηυ ζηάδζμ ηδξ δζαδζηαζίαξ ηα αζμπδιζηά οπμζηνχιαηα ηδξ αθηαθζηήξ θςζθαηάζδξ BCIP ηαζ NBT, επζηοβπάκεηαζ δ ακάπηολδ πνχιαημξ εζδζηά ζηζξ πενζμπέξ πμο έβζκε δ δέζιεοζδ ημο ακζπκεοηή ιε ημ ακηίζημζπμ 85

86 Τθζηά & Μέεμδμζ mrna. Σα αήιαηα πμο πνέπεζ κα πνμδβδεμφκ ημο πεζνάιαημξ ηδξ οανζδμπμίδζδξ in situ πενζθαιαάκμοκ ηδκ επελενβαζία ηςκ πθαζιζδζαηχκ θμνέςκ χζηε κα ανίζημκηαζ ζε βναιιζηή ηαζ ηαεανή ιμνθή ηαζ ηδκ παναβςβή ηςκ ακζπκεοηχκ RNA Παξαγσγή γξακκηθώλ πιαζκηδηαθώλ θνξέσλ πςξ ακαθένεδηε ζηδκ εκυηδηα , ηθςκμπμζήζαιε ημ cdna ηδξ Geminin ημο ιουξ ζημκ πθαζιζδζαηυ θμνέα pbluescript KS. Γζα κα είκαζ δοκαηή υιςξ δ πνδζζιμπμίδζδ ημο ζοβηεηνζιέκμο πθαζιζδζαημφ θμνέα ςξ ιήηνα βζα ηδ ιεηαβναθή ημο ακζπκεοηή RNA, πνέπεζ μ θμνέαξ κα ανίζηεηαζ ζε βναιιζηή ιμνθή χζηε κα ιπμνεί κα δνάζεζ δ RNA πμθοιενάζδ. Ζ ιεηάπηςζδ ημο πθαζιζδίμο ζε βναιιζηή ιμνθή βίκεηαζ ιεηά απυ ιζα ηαηενβαζία ιε εκδμκμοηθεάζεξ πενζμνζζιμφ. ηδκ πενίπηςζδ ηδξ Geminin δ ηαηενβαζία έβζκε ιε ηδκ εκδμκμοηθεάζδ πενζμνζζιμφ EcoRI. Ζ ακηίδναζδ πμο θαιαάκεζ πχνα απεζημκίγεηαζ ζημκ αηυθμοεμ πίκαηα: Αληηδξαζηήξην Πθαζιζδζαηυ DNA Buffer EcoRI 10x EcoRI έκγοιμ πενζμνζζιμφ (5u/ιl) WFI Σεθζηυξ υβημξ Πνζόηεηα 12ιg 10ιl 5ιl 100ιl Πίλαθαο Αληίδξαζε θαηεξγαζίαο κε ελδνλνπθιεάζεο πεξηνξηζκνύ γηα ην ζρεκαηηζκό γξακκηθνύ DNA. Αθήκμοιε ηδκ παναπάκς ακηίδναζδ overnight ζημοξ 37 C. Σδκ επυιεκδ διένα πνμζεέημοιε ζηδκ ακηίδναζδ πέρδξ άθθα 2ιl εκγφιμο EcoRI ηαζ επςάγμοιε ζημοξ 37 C βζα 1 hr. Δθέβπμοιε ηδκ επζηοπία ηδξ ακηίδναζδξ δθεηηνμθμνχκηαξ ιζα πμζυηδηα (ζοκήεςξ 1ιl) ζε πδηηή αβανυγδξ 1.0% ζε δζάθοια ΣΒΔ 0.5x. Σμ βναιιζηυ DNA εα πνέπεζ κα ειθακίγεηαζ ζε ιία γχκδ, ζε ακηίεεζδ ιε ημ ιδ ηαηενβαζιέκμ πθαζιζδζαηυ DNA πμο ειθακίγεζ πενζζζυηενεξ γχκεξ. 86

87 Τθζηά & Μέεμδμζ Καζαξηζκόο ηνπ γξακκηθνύ DNA Καεχξ μζ ακζπκεοηέξ πμο εέθμοιε κα πανάβμοιε απμηεθμφκηαζ απυ RNA, έκα πμθφ αζηαεέξ ηαζ εοαίζεδημ ιαηνμιυνζμ, είκαζ απαναίηδημ δ ιήηνα ημο DNA πμο εα πνδζζιμπμζήζμοιε κα είκαζ απυθοηα ηαεανή. Γζα ημκ ηαεανζζιυ ημο DNA ηαηαθεφβμοιε ζε έκα πεζναιαηζηυ πνςηυημθθμ πμο πενζθαιαάκεζ ηδκ ηαηενβαζία ημο DNA ιε θαζκυθδ, δ μπμία ηαηαζηνέθεζ ηζξ πνςηεΐκεξ. Ζ δζαδζηαζία πμο αημθμοεείηαζ είκαζ δ ελήξ: ηδκ πμζυηδηα ημο βναιιζημφ πθαζιζδζαημφ DNA (100ιl) πνμζεέημοιε 400ιl WFI (Water for Injection) βζα κα θηάζμοιε ζε ηεθζηυ υβημ 500ιl ηαζ ζηδ ζοκέπεζα πνμζεέημοιε ίζμ υβημ (500ιl) PCI (θαζκυθδ-πθςνμθυνιζμζζμαιοθζηή αθημυθδ ζε ακαθμβία 25:24:1, Invitrogen ). Ακαδεφμοιε ζζπονά ζε vortex. Φοβμηεκηνμφιε ζε rpm ζημοξ 4 C βζα 20 min. Μεηαθένμοιε ηδκ ακχηενδ οδάηζκδ θάζδ ζε κέμ ζςθδκάηζ eppendorf. Πνμζεέημοιε 1 / 10 ημο υβημο 3M μλζηυ κάηνζμ ph 5.3 ηαζ ακαδεφμοιε ζζπονά ζε vortex. Πνμζεέημοιε 2,5 υβημοξ 100% EtOH εενιμηναζίαξ -20 C ηαζ ακαδεφμοιε ζζπονά ζε vortex. Δπςάγμοιε ημ δείβια overnight ζημοξ -20 C. Φοβμηεκηνμφιε ημ δείβια ζε rpm ζημοξ 4 C βζα 30 min. Αθαζνμφιε ημ οπενηείιεκμ. Ξεπθέκμοιε ημ ίγδια ιε 70% EtOH εενιμηναζίαξ -20 C. Φοβμηεκηνμφιε rpm ζημοξ 4 C βζα 20 min. Αθαζνμφιε ημ οπενηείιεκμ. Ξδναίκμοιε ημ ίγδια ζημκ απαβςβυ ηαζ ημ επακαδζαθφμοιε ζε 30ιl WFI. Ζθεηηνμθμνμφιε ιζα πμζυηδηα ημο ηαεανζζιέκμο DNA ζε πδηηή αβανυγδξ 1% ζε δζάθοια ΣΒΔ 0.5x βζα κα εθέβλμοιε ηδκ ηαηάζηαζδ ημο DNA Παξαγσγή αληρλεπηώλ RNA H παναβςβή ημο ακζπκεοηή RNA βζα ημ mrna ηδξ Geminin πναβιαημπμζείηαζ ιε ιία ακηίδναζδ ιεηαβναθήξ in vitro. Ζ ακηίδναζδ ηδξ ιεηαβναθήξ βίκεηαζ πνμξ ηέημζα ηαηεφεοκζδ χζηε κα παναπεμφκ anti-sense RNA ιυνζα, ηα μπμία εα οανζδμπμζδεμφκ ιε ημ sense mrna πμο ανίζηεηαζ ζημκ ζζηυ. Σα ζπδιαηζγυιεκα αοηά ιυνζα RNA είκαζ ζδιαζιέκα ιε ηδκ μοζία δζβμλζβεκίκδ (digoxigenin, DIG). Σμ ακηζδναζηήνζμ αοηυ είκαζ έκα ιίβια κμοηθεμηζδίςκ, ζημ μπμίμ έκα πμζμζηυ ηςκ αάζεςκ μοναηίθδξ (UTP) είκαζ ζδιαζιέκμ ιε δζβμλζβεκίκδ. Γζα ηδκ 87

88 Τθζηά & Μέεμδμζ ακηίδναζδ ηδξ ιεηαβναθήξ in vitro απαζημφκηαζ ηα παναηάης ακηζδναζηήνζα, ηα μπμία ακαιζβκφμκηαζ ζηζξ πμζυηδηεξ ηαζ ιε ηδ ζεζνά πμο ακαβνάθμκηαζ: Αληηδξαζηήξην Πνζόηεηα WFI 8.5 ιl 5x transcription buffer (Promega) 4.0 ιl 0.1M DTT (Promega) 2.0 ιl 10x DIG-UTP mix (Roche ιl 073) βναιιζηυ πθαζιίδζμ 1ιg/ιl 1.5 ιl Rnasin (Promega N2111) 0.5 ιl * RNA πμθοιενάζδ 10U/ιl 1.5 ιl ζφκμθμ 20.0 ιl Πίλαθαο Αληίδξαζε κεηαγξαθήο in vitro γηα ηελ παξαγωγή αληρλεπηώλ RNA. * Ζ ιεηαβναθή ημο πθαζιζδίμο ηδξ Geminin έβζκε ιε ηδκ Σ7 RNA πμθοιενάζδ (Promega P2075). Αθήκμοιε ηδκ παναπάκς ακηίδναζδ κα πναβιαημπμζδεεί βζα 3 χνεξ ζημοξ 37 C. Μεηά ηδ ηνίςνδ ακηίδναζδ ηνέπμοιε ιία πμζυηδηα απυ ημ ιίβια, ζοκήεςξ 1ιl, ζε πδηηή αβανυγδξ 1% ζε δζάθοια ΣΒΔ 0.5x, βζα κα επζαεααζχζμοιε ηδκ επζηοπία ηδξ ακηίδναζδξ ηαζ κα ακζπκεφζμοιε ημ παναβυιεκμ RNA. Πνμζεέημοιε ζημ ιίβια ηδξ ακηίδναζδξ 2ιl DNase-1 (Roche ) ηαζ επςάγμοιε βζα 30 θεπηά ζημοξ 37 C, χζηε κα απμζημδμιδεεί δ υπμζα πμζυηδηα DNA έπεζ παναιείκεζ ιεηά ηδκ ακηίδναζδ ιεηαβναθήξ. Πνμζεέημοιε ζημ ιίβια 100ιl δζαθφιαημξ Σ.Δ. (Tris-EDTA ph 8.0), 10ιl δζαθφιαημξ LiCl 4M ηαζ 400ιl 100% παβςιέκδξ ΔtΟΖ. Ακαιζβκφμοιε πμθφ ηαθά ηαζ επςάγμοιε ζημοξ -20 C overnight χζηε κα επζηφπμοιε ηαείγδζδ ημο RNA. Σδκ επυιεκδ διένα θοβμηεκηνμφιε ηα δείβιαηα ζε rpm ζημοξ 4 C βζα 20 min. Αθαζνμφιε ημ οπενηείιεκμ ηαζ λεπθέκμοιε ημ ίγδια ιε 70% παβςιέκδ EtOH. Δπακαθαιαάκμοιε ημ πνμδβμφιεκμ αήια ηδξ θοβμηέκηνδζδξ. Αθαζνμφιε ημ οπενηείιεκμ ηαζ αθήκμοιε ημ ίγδια κα λεναεεί ζημκ πάβμ. Δπακαδζαθφμοιε ημ ίγδια ζε 50ιl Σ.Δ. ή WFI ηαζ ηνέπμοιε 1ιl ζε πδηηή αβανυγδξ 1% ζε δζάθοια ΣΒΔ 0.5x. Γζαηδνμφιε ημοξ RNA ακζπκεοηέξ ζημοξ -80 C. 88

89 Τθζηά & Μέεμδμζ Γηαιύκαηα Tris-EDTA ph 8.0 Tris-base 10mM 1mM 0.5M EDTA ph 8.0 ddh 2 O Τβξηδνπνίεζε in situ 1 δ διένα Ββάγμοιε ηζξ ημιέξ πμο πνυηεζηαζ κα επελενβαζημφιε απυ ημοξ -80 C ηαζ ηζξ αθήκμοιε ζημκ πάβημ βζα θεπηά βζα κα επακέθεμοκ ζε εενιμηναζία δςιαηίμο. Ζ υθδ δζαδζηαζία πναβιαημπμζείηαζ ζε επςαζηζηυ εάθαιμ πμο πενζέπεζ 5x SSC ή κενυ βζα κα ιδκ λεναεμφκ μζ ημιέξ. Μμκζιμπμζμφιε ηζξ ημιέξ ιε δζάθοια παναθμνιαθδεΰδδξ (PFA) 4% εενιμηναζίαξ 4 C βζα 10 θεπηά ζε εενιμηναζία δςιαηίμο. Ξεπθέκμοιε ηζξ ημιέξ ιε PBS 1x 3 θμνέξ απυ 5 θεπηά δ ηάεε ιία. Αημθμοεεί έκα αήια αηεηοθίςζδξ ηςκ ημιχκ. Ζ αηεηοθίςζδ ηςκ ημιχκ επζηοβπάκεηαζ ιε 295ml απμζηεζνςιέκμο κενμφ ζηα μπμία έπμοκ πνμζηεεεί 4ml triethanolamine (Fluka 90278) ηαζ 525ιl HCl οπυ ιαβκδηζηή ακάδεοζδ. Αθμφ έπμοκ ακαιζπεεί ηαθά, πνμζεέημοιε ζημ παναπάκς δζάθοια 750ιl μλζημφ ακοδνίηδ (Sigma A6404) αιέζςξ πνζκ ημπμεεηήζμοιε ηζξ ημιέξ. Αθήκμοιε ηζξ ημιέξ κα επςαζημφκ ζημ παναπάκς δζάθοια βζα 10 θεπηά ζε εενιμηναζία δςιαηίμο οπυ ζοκεπή ακάδεοζδ. Ξεπθέκμοιε ηζξ ημιέξ ιε PBS 1x 3 θμνέξ απυ 5 θεπηά δ ηάεε ιία. Δπςάγμοιε ηζξ ημιέξ ιε ημ δζάθοια οανζδμπμίδζδξ ζημκ επςαζηζηυ εάθαιμ ζε εενιμηναζία δςιαηίμο βζα ημοθάπζζημκ 3-4 χνεξ. Αθαζνμφιε ημ δζάθοια οανζδμπμίδζδξ ηαζ πνμζεέημοιε ζηζξ ημιέξ ιl δζάθοια οανζδμπμίδζδξ ζημ μπμίμ έπμοιε δζαθφζεζ ημοξ ακζπκεοηέξ RNA ζε ακαθμβία 1ιl ακζπκεοηή RNA: 50ιl δζάθοια οανζδμπμίδζδξ (δ ακαθμβία αοηή ιπμνεί κα αθθάλεζ ακάθμβα ιε ηδκ πμζυηδηα ημο ακζπκεοηή RNA). Πνζκ πνμζεέζμοιε ημοξ ακζπκεοηέξ ζηζξ ημιέξ, ημοξ απμδζαηάζζμοιε εενιαίκμκηάξ ημοξ ζημοξ 80 C βζα 5 θεπηά ηαζ ημπμεεηχκηαξ ημοξ αιέζςξ ζε πάβμ. Αθμφ ημοξ πνμζεέζμοιε ζηζξ ημιέξ, ημπμεεημφιε ηαθοπηνίδεξ ηαζ αθήκμοιε ηδ δζαδζηαζία οανζδμπμίδζδξ overnight ζημοξ 72 C. Πνμζέπμοιε μ επςαζηζηυξ εάθαιμξ κα πενζέπεζ ανηεηυ δζάθοια 5x SSC ηαζ κα ζθναβζζηεί ενιδηζηά χζηε μζ ημιέξ κα ιδκ λεναεμφκ ηαηά ηδκ overnight οανζδμπμίδζδ. 89

90 Τθζηά & Μέεμδμζ 2 δ διένα Πνμεημζιάγμοιε έκα δζάθοια 5x SSC ηαζ έκα δζάθοια 0.2x SSC χζηε κα έπμοκ εενιμηναζία 72 C. Κναηχκηαξ ηα πθαηάηζα ιε ηζξ ημιέξ ιε ιία θααίδα, ηα ημπμεεημφιε πνχηα ζημ δζάθοια 5x SSC βζα κα θφβμοκ μζ ηαθοπηνίδεξ ηαζ ηαηυπζκ ζημ δζάθοια 0.2x SSC, υπμο ηζξ αθήκμοιε κα επςαζημφκ βζα 1 χνα ζημοξ 72 C. Μεηαθένμοιε ηζξ ημιέξ ζε δζάθοια 0.2x SSC βζα 5 θεπηά ζε εενιμηναζία δςιαηίμο. Μεηαθένμοιε ηζξ ημιέξ ζημ δζάθοια Β1 βζα 5 θεπηά ζε εενιμηναζία δςιαηίμο. Μεηαθένμοιε ηζξ ημιέξ ζημκ επςαζηζηυ εάθαιμ ηαζ ημπμεεημφιε ζε ηάεε πθαηάηζ 0.5-1ml δζάθοια Β1 ζημ μπμίμ έπμοιε πνμζεέζεζ 10% μνυ (Fetal Bovine Serum, FBS, Gibco). Δπςάγμοιε ζε εενιμηναζία δςιαηίμο βζα 1 χνα. Σμπμεεημφιε ζηζξ ημιέξ 0.5ml δζαθφιαημξ Β1 (πμο πενζέπεζ ηαζ FBS) ζημ μπμίμ έπμοιε δζαθφζεζ ημ anti-dig ακηίζςια (Roche ) ζε αναίςζδ 1:5000. Δπςάγμοιε ιε ημ ακηίζςια ζημοξ 4 C overnight. 3 δ διένα Ξεπθέκμοιε ηζξ ημιέξ ιε δζάθοια Β1 ζε εενιμηναζία δςιαηίμο, 3 θμνέξ απυ 5 θεπηά δ ηάεε ιία. Δπςάγμοιε ιε δζάθοια Β3 βζα 10 θεπηά ζε εενιμηναζία δςιαηίμο. Πνμζεέημοιε ζηζξ ημιέξ πενίπμο 100ιl απυ ημ ηεθζηυ δζάθοια ακάπηολδξ ζήιαημξ (δζάθοια Β4). Δπςάγμοιε ζημ ζημηάδζ ιέπνζ κα ακαπηοπεεί ημ εζδζηυ πνχια. ηαιαηάιε ηδκ ακηίδναζδ αοείγμκηαξ ηζξ ημιέξ ζε κενυ. Σμπμεεημφιε ηαθοπηνίδεξ πνδζζιμπμζχκηαξ εζδζηυ ιέζμ (Glycergel mounting medium, C0563 DakoCytomation) ηαζ παναηδνμφιε ηζξ ημιέξ ζε θςημκζηυ ιζηνμζηυπζμ. Γηαιύκαηα Γζάθοια οανζδμπμίδζδξ 50% θμνιαιίδζμ (Sigma F9037) 5x SSC 5x Denhardts (Sigma D2532) 250ιg/ml baker s yeast RNA (Sigma R6750) 500ιg/ml herring sperm DNA (Promega D1815) WFI 90

91 Τθζηά & Μέεμδμζ SSC 20x ph 7.0 Γζα ηεθζηυ υβημ 100ml 17,5g NaCl 8,8g Na 3 Citrate.2H 2 O Ροειίγμοιε ημ ph ιε HCl Γζάθοια Β1 0.1Μ TrisCl ph M NaCl Γζάθοια Β3 0.1M TrisCl ph M NaCl 50mM MgCl 2 Γζάθοια Β4 3.5ιl/ml NBT (Roche ) 3.5ιl/ml BCIP (Roche ) 0.24mg/ml levamisole (Sigma L9756) ζε δζάθοια Β3 TrisCl ph M Γζα ηεθζηυ υβημ 500ml 60,5g TrisCl Ροειίγμοιε ημ ph ιε HCl NaCl 4M Γζα ηεθζηυ υβημ 100ml 23,4g NaCl WFI ιέπνζ ημκ ηεθζηυ υβημ MgCl 2 1M Γζα ηεθζηυ υβημ 1L Γζαθφμοιε 203,3g MgCl 2.6H 2 O. Πνμζεέημοιε ddh 2 O ιέπνζ ημκ ηεθζηυ υβημ Αλνζνθζνξηζκόο Δκχ δ οανζδμπμίδζδ in situ επζηνέπεζ ηδκ ζζημθμβζηή απμηφπςζδ εκυξ βμκζδίμο ζε επίπεδμ mrna, δ ηεπκζηή ημο ακμζμθεμνζζιμφ επζηνέπεζ ηδκ ημπμβναθζηή ακίπκεοζδ εκυξ βμκζδίμο ζε επίπεδμ πνςηεΐκδξ. Ζ βεκζηή ανπή ηδξ 91

92 Τθζηά & Μέεμδμζ πεζναιαηζηήξ αοηήξ πνμζέββζζδξ είκαζ ζπεηζηά απθή: ανπζηά πναβιαημπμζείηαζ επχαζδ ημο ζζημφ ιε εζδζηυ ακηίζςια έκακηζ ηδξ πνςηεΐκδξ πμο εέθμοιε κα ακζπκεφζμοιε. ηδ ζοκέπεζα βίκεηαζ ηαηενβαζία ημο ζζημφ ιε εζδζηυ δεοηενμβεκέξ θεμνίγςκ ακηίζςια πμο ακαβκςνίγεζ ημ πνςημβεκέξ ακηίζςια έηζζ, ζηζξ πενζμπέξ υπμο έπεζ επζηαεήζεζ ημ πνςημβεκέξ ακηίζςια ακαπηφζζεηαζ θεμνίγςκ ζήια Κιαζζηθό πξσηόθνιιν αλνζνθζνξηζκνύ 1 δ διένα Ββάγμοιε ηζξ ημιέξ πμο πνυηεζηαζ κα επελενβαζημφιε απυ ημοξ -80 C ηαζ ηζξ αθήκμοιε ζημκ πάβημ βζα θεπηά βζα κα επακέθεμοκ ζε εενιμηναζία δςιαηίμο. Ζ υθδ δζαδζηαζία πναβιαημπμζείηαζ ζε επςαζηζηυ εάθαιμ πμο πενζέπεζ κενυ βζα κα ιδκ λεναεμφκ μζ ημιέξ. Δκοδαηχκμοιε ηζξ ημιέξ επςάγμκηάξ ηεξ ιε PBS 1x 3 θμνέξ απυ 5 θεπηά δ ηάεε ιία. Μμκζιμπμζμφιε ηζξ ημιέξ ιε δζάθοια παναθμνιαθδεΰδδξ (PFA) 4% εενιμηναζίαξ 4 C βζα 10 θεπηά ζε εενιμηναζία δςιαηίμο. Ξεπθέκμοιε ηζξ ημιέξ ιε PBS 1x 2 θμνέξ απυ 5 θεπηά δ ηάεε ιία. Πνμζεέημοιε ζηζξ ημιέξ δζάθοια PBS-TritonX % βζα 5 θεπηά ζε εενιμηναζία δςιαηίμο. Ξεπθέκμοιε ιε PBS 1x 3 θμνέξ απυ 5 θεπηά δ ηάεε ιία. Μπθμηάνμοιε ηζξ ιδ εζδζηέξ εέζεζξ ιε επχαζδ ηςκ ημιχκ ιε δζάθοια PBS- Tween 0.1% + 10% ειανοσηυ μνυ αμμεζδμφξ (FBS) + 3% αθαμοιίκδ (Bovine Serum Albumin, BSA, Sigma Α4503) (δζάθοια blocking) βζα ημοθάπζζημκ 3 χνεξ ζε εενιμηναζία δςιαηίμο. Πνμζεέημοιε ζηζξ ημιέξ ημ πνςημβεκέξ ακηίζςια αναζςιέκμ ζηδκ ηαηάθθδθδ αναίςζδ ζε δζάθοια blocking. Δπςάγμοιε ζημοξ 4 C overnight. Μπμνμφιε κα επςάζμοιε ηζξ ημιέξ ιε δφμ πνςημβεκή ακηζζχιαηα χζηε κα εηηζιήζμοιε ακ μζ ακηίζημζπεξ πνςηεΐκεξ ζοκεηθνάγμκηαζ ζηα ίδζα ηφηηανα ημο ζζημφ (δζπθυξ ακμζμθεμνζζιυξ). ε αοηήκ πενίπηςζδ πνέπεζ κα πνμζέλμοιε ηα δφμ πνςημβεκή ακηζζχιαηα κα έπμοκ ακαπηοπεεί ζε δζαθμνεηζηυ είδμξ (π.π. ζε ημοκέθζ ημ έκα ηαζ ζε ιο ημ άθθμ), χζηε κα ακαβκςνίγμκηαζ απυ δζαθμνεηζηά δεοηενμβεκή ακηζζχιαηα ηαζ κα έπμοιε ηδκ ακάπηολδ εζδζημφ ζήιαημξ βζα ημ ηάεε πνςημβεκέξ ακηίζςια λεπςνζζηά. 92

93 Τθζηά & Μέεμδμζ 2 δ διένα Ξεπθέκμοιε ηζξ ημιέξ ιε δζάθοια PBS-Tween 0.1% 3 θμνέξ απυ 5 θεπηά δ ηάεε ιία. Δπςάγμοιε ηζξ ημιέξ ιε δεοηενμβεκέξ θεμνίγςκ ακηίζςια ζε αναίςζδ 1:1000 ζε δζάθοια blocking βζα 1 χνα ζε εενιμηναζία δςιαηίμο. Σα δεοηενμβεκή ακηζζχιαηα ακαβκςνίγμοκ ηζξ ιδ ιεηααθδηέξ πενζμπέξ ηςκ πνςημβεκχκ ακηζζςιάηςκ πμο είκαζ δζαθμνεηζηέξ ζε ηάεε είδμξ. Έηζζ, ακάθμβα ιε ημκ μνβακζζιυ ζημκ μπμίμ έπεζ παναπεεί ημ πνςημβεκέξ ακηίζςια, απαζηείηαζ δζαθμνεηζηυ δεοηενμβεκέξ ακηίζςια βζα κα ημ ακαβκςνίζεζ. Καθυ είκαζ επίζδξ κα επζθέβμοιε κα πνδζζιμπμζήζμοιε δεοηενμβεκή ακηζζχιαηα πμο έπμοκ ακαπηοπεεί ζε δζαθμνεηζηυ είδμξ απυ ηα πνςημβεκή ακηζζχιαηα. Ξεπθέκμοιε ηζξ ημιέξ ιε δζάθοια PBS-Tween 0.1% 3 θμνέξ απυ 5 θεπηά δ ηάεε ιία. ημ ηεθεοηαίμ υιςξ πθφζζιμ πνμζεέημοιε ζημ PBS-Tween 0.1% ηδ πνςζηζηή Hoechst ζε αναίςζδ 1:1500. Ζ πνςζηζηή αοηή ζπκδεεηεί ημοξ πονήκεξ ηςκ ηοηηάνςκ. Σμπμεεημφιε ηαθοπηνίδεξ πνδζζιμπμζχκηαξ ημ ιέζμ Mowiol ηαζ αθήκμοιε ηα πθαηάηζα κα ζηεβκχζμοκ βζα ημοθάπζζημκ 30 min. Αημθμοεεί παναηήνδζδ ηςκ ημιχκ ζημ ιζηνμζηυπζμ θεμνζζιμφ. Γηαιύκαηα PBS-TritonX % Γζα ηεθζηυ υβημ 50 ml Γζαθφμοιε ζε 50 ml PBS 1x 0,15ml TritonX100 (Sigma T8787) (απυ stock ζοβηέκηνςζδξ 100%) ηαζ ακαδεφμοιε ζζπονά ζε vortex βζαηί ημ TritonX100 είκαζ παπφννεοζημ. Δλαζηίαξ αοηήξ ηδξ ζδζυηδηάξ ημο ηαζ βζα κα δζαζθαθίγμοιε υηζ παίνκμοιε ηδ ζςζηή πμζυηδηα TritonX100, ηαθυ είκαζ κα ημ δζαηδνμφιε ζε stock ζοβηέκηνςζδξ 20% ζε PBS 1x, μπυηε ζε αοηήκ ηδκ πενίπηςζδ δζαθφμοιε ζε 50 ml PBS 1x 0,75ml TritonX100. PBS-Tween 0.1% Γζα ηεθζηυ υβημ 50 ml Γζαθφμοιε ζε 50 ml PBS 1x 0,05ml Tween (Sigma P7949) (απυ stock ζοβηέκηνςζδξ 100%) ηαζ ακαδεφμοιε ζζπονά ζε vortex βζαηί ημ Tween είκαζ παπφννεοζημ. πςξ ηαζ βζα ημ TritonX100, ηαθυ είκαζ κα δζαηδνμφιε ημ Tween ζε stock ζοβηέκηνςζδξ 20% ζε PBS 1x, μπυηε ζε αοηήκ ηδκ πενίπηςζδ δζαθφμοιε ζε 50 ml PBS 1x 0,25ml Tween. 93

94 Τθζηά & Μέεμδμζ Γζάθοια Hoechst Γζαθφμοιε ηδ ζηυκδ Hoechst (Sigma 33258) ζε WFI βζα ηεθζηή ζοβηέκηνςζδ 10mg/ml. Γζάθοια MOWIOL Ακαιζβκφμοιε 4,8g MOWIOL 4-88 Reagent (Calbiochem ) ιε 12g βθοηενυθδ ηαζ ηα αθήκμοιε κα ακαδεοημφκ ιέπνζ ημ ιίβια κα βίκεζ μιμζμβεκέξ. Πνμζεέημοιε 12ml H 2 O ηαζ αθήκμοιε ημ δζάθοια οπυ ακάδεοζδ overnight ζε εενιμηναζία δςιαηίμο. Σδκ επυιεκδ διένα πνμζεέημοιε 24ml δζαθφιαημξ 0.2M Tris-Cl ph 8.5. Θενιαίκμοιε ημ δζάθοια ζημοξ 50 C βζα 10 min ηαζ ακαδεφμοιε ζοκέπεζα ιέπνζ κα δζαθοεεί ηεθείςξ ημ MOWIOL. Φοβμηεκηνμφιε ζε 5.000g βζα 15 min ηαζ δζαηδνμφιε ημ δζάθοια ζε aliquots ζημοξ -20 C Πξσηόθνιιν αλνζνθζνξηζκνύ κε αλάθηεζε αληηγόλνπ (antigen retrieval) Σμ ηθαζζζηυ πνςηυημθθμ ακμζμθεμνζζιμφ είκαζ απμηεθεζιαηζηυ βζα ηα πενζζζυηενα πνςημβεκή ακηζζχιαηα. Τπάνπμοκ υιςξ ηάπμζα ακηζζχιαηα (π.π. ημ ακηίζςια έκακηζ ημο ιεηαβναθζημφ πανάβμκηα Tbr2) πμο απαζημφκ ιία επζπνυζεεηδ δζαδζηαζία πνμηεζιέκμο κα εκημπίζμοκ πάκς ζημκ ζζηυ ημ ακηζβυκμ ζημ μπμίμ πνμζδέκμκηαζ. Ζ δζαδζηαζία αοηή είκαζ βκςζηή ςξ «ακάηηδζδ ακηζβυκμο» (antigen retrieval). ε αοηήκ ηδκ πενίπηςζδ ημ πνςηυημθθμ ημο ακμζμθεμνζζιμφ δζαιμνθχκεηαζ ςξ ελήξ: 1 δ διένα Ββάγμοιε ηζξ ημιέξ πμο πνυηεζηαζ κα επελενβαζημφιε απυ ημοξ -80 C ηαζ ηζξ αθήκμοιε ζημκ πάβημ βζα θεπηά βζα κα επακέθεμοκ ζε εενιμηναζία δςιαηίμο. Ζ υθδ δζαδζηαζία πναβιαημπμζείηαζ ζε επςαζηζηυ εάθαιμ πμο πενζέπεζ κενυ βζα κα ιδκ λεναεμφκ μζ ημιέξ. Δκοδαηχκμοιε ηζξ ημιέξ επςάγμκηάξ ηεξ ιε PBS 1x βζα 5 min. Σμπμεεημφιε ηζξ ημιέξ ζε δζάθοια ηζηνζημφ καηνίμο (sodium citrate) ph 6.0 ηαζ ηζξ ανάγμοιε ζε θμφνκμ ιζηνμηοιάηςκ δζαδμπζηά βζα 1 min ζηα 800 Watt ηαζ βζα 10 min ζηα 100 Watt. Αθήκμοιε ηζξ ημιέξ κα ηνοχζμοκ ζε εενιμηναζία δςιαηίμο βζα 20 min. Ακηζηαεζζημφιε ηδ ιζζή πμζυηδηα ημο δζαθφιαημξ ηζηνζημφ καηνίμο ιε ddh 2 O ηαζ αθήκμοιε ηζξ ημιέξ κα ηνοχζμοκ βζα άθθα 10 min. Ξεπθέκμοιε ηζξ ημιέξ επςάγμκηάξ ηεξ ιε PBS 1x βζα 5 min. Μμκζιμπμζμφιε ηζξ ημιέξ ιε δζάθοια παναθμνιαθδεΰδδξ (PFA) 4% εενιμηναζίαξ 4 C βζα 10 θεπηά ζε εενιμηναζία δςιαηίμο. 94

95 Τθζηά & Μέεμδμζ Ζ πεζναιαηζηή δζαδζηαζία πμο αημθμοεείηαζ απυ εδχ ηαζ πένα είκαζ ίδζα ιε ημ πνςηυημθθμ ημο ηθαζζζημφ ακμζμθεμνζζιμφ. Γηαιύκαηα Κζηνζηυ κάηνζμ (sodium citrate) 0.01Μ ph 6.0 Γζα ηεθζηυ υβημ 1l Γζαθφμοιε 2,1g ηζηνζηυ κάηνζμ ζε ddh 2 O ή WFI. Ροειίγμοιε ημ ph ιε HCl ηαζ πνμζεέημοιε κενυ ιέπνζ ημκ ηεθζηυ υβημ Πξσηόθνιιν αλνζνθζνξηζκνύ γηα αλίρλεπζε BrdU H ακίπκεοζδ ημο ακαθυβμο BrdU απαζηεί εζδζηή επελενβαζία ημο ζζημφ. Καεχξ ημ ακάθμβμ ανίζηεηαζ εκζςιαηςιέκμ ζημ DNA, μ ζζηυξ πνέπεζ κα οπμζηεί εζδζηή ηαηενβαζία πμο εα απμηαθφρεζ ημ DNA ηαζ εα ηαηαζηήζεζ δοκαηή ηδκ πνυζδεζδ ημο ακηζζχιαημξ έκακηζ ημο ακαθυβμο. ε πενίπηςζδ πμο εέθμοιε κα πνμπςνήζμοιε ζε πεζνάιαηα δζπθμφ ακμζμθεμνζζιμφ βζα ημκ ηαοηυπνμκμ εκημπζζιυ ημο BrdU ηαζ ιζαξ δεφηενδξ πνςηεΐκδξ, αημθμοεμφιε ημ ελήξ πνςηυημθθμ: 1 δ διένα Ζ πεζναιαηζηή δζαδζηαζία ηδξ 1 δξ διέναξ ημο ακμζμθεμνζζιμφ είκαζ ίδζα ιε ημ πνςηυημθθμ ηθαζζζημφ ακμζμθεμνζζιμφ. Πνμζμπή: ζημ ηέθμξ ηδξ 1 δξ διέναξ δεκ επςάγμοιε ηζξ ημιέξ ηαζ ιε ηα δφμ πνςημβεκή ακηζζχιαηα (έκακηζ ημο BrdU ηαζ έκακηζ ηδξ δεφηενδξ πνςηεΐκδξ ζηυπμο) αθθά ιυκμ ιε ημ ακηίζςια έκακηζ ηδξ δεφηενδξ πνςηεΐκδξ πμο εέθμοιε κα ακαβκςνίζμοιε. 2 δ διένα Ξεπθέκμοιε ηζξ ημιέξ ιε δζάθοια PBS-Tween 0.1% 3 θμνέξ απυ 5 θεπηά δ ηάεε ιία. Δπςάγμοιε ηζξ ημιέξ ιε ημ εζδζηυ δεοηενμβεκέξ θεμνίγςκ ακηίζςια πμο ακαβκςνίγεζ ημ πνςημβεκέξ ακηίζςια ιε ημ μπμίμ επςάζαιε ηζξ ημιέξ ηδκ πνμδβμφιεκδ διένα. Ξεπθέκμοιε ηζξ ημιέξ ιε δζάθοια PBS-Tween 0.1% 3 θμνέξ απυ 5 θεπηά δ ηάεε ιία. Μμκζιμπμζμφιε εη κέμο ηζξ ημιέξ ιε δζάθοια παναθμνιαθδεΰδδξ (PFA) 4% εενιμηναζίαξ 4 C βζα 10 θεπηά ζε εενιμηναζία δςιαηίμο. Ξεπθέκμοιε ηζξ ημιέξ ιε PBS 1x 2 θμνέξ απυ 5 θεπηά δ ηάεε ιία. Δπςάγμοιε ζηζξ ημιέξ ιε θνέζημ δζάθοια HCl 2N βζα 30 min ζημοξ 37 C. 95

96 Τθζηά & Μέεμδμζ Ξεπθέκμοιε ιε δζάθοια αμνζημφ καηνίμο (sodium borate) ph 8.5 3x7 min βζα κα ελζζμννμπδεεί ημ ph ημο ζζημφ. Ξεπθέκμοιε ιε PBS 1x 3 θμνέξ απυ 5 θεπηά δ ηάεε ιία. Μπθμηάνμοιε ηζξ ιδ εζδζηέξ εέζεζξ ιε επχαζδ ηςκ ημιχκ ιε δζάθοια PBS- Tween 0.1% + 10% ειανοσηυ μνυ αμμεζδμφξ (FBS) + 3% αθαμοιίκδ (Bovine Serum Albumin, BSA, Sigma) (δζάθοια blocking) βζα ημοθάπζζημκ 3 χνεξ ζε εενιμηναζία δςιαηίμο. Πνμζεέημοιε ζηζξ ημιέξ ημ πνςημβεκέξ ακηίζςια έκακηζ ημο ακαθυβμο BrdU αναζςιέκμ ζηδκ ηαηάθθδθδ αναίςζδ ζε δζάθοια blocking. Δπςάγμοιε ζημοξ 4 C overnight. 3 δ διένα Ξεπθέκμοιε ηζξ ημιέξ ιε δζάθοια PBS-Tween 0.1% 3 θμνέξ απυ 5 θεπηά δ ηάεε ιία. Δπςάγμοιε ηζξ ημιέξ ιε δεοηενμβεκέξ θεμνίγςκ ακηίζςια εζδζηυ βζα ημ πνςημβεκέξ ακηίζςια έκακηζ ημο BrdU ζε ηαηάθθδθδ αναίςζδ ζε δζάθοια blocking βζα 1 χνα ζε εενιμηναζία δςιαηίμο. Ξεπθέκμοιε ηζξ ημιέξ ιε δζάθοια PBS-Tween 0.1% 3 θμνέξ απυ 5 θεπηά δ ηάεε ιία. ημ ηεθεοηαίμ υιςξ πθφζζιμ πνμζεέημοιε ζημ PBS-Tween 0.1% ηδ πνςζηζηή Hoechst ζε αναίςζδ 1:1500. Ζ πνςζηζηή αοηή ζπκδεεηεί ημοξ πονήκεξ ηςκ ηοηηάνςκ. Σμπμεεημφιε ηαθοπηνίδεξ πνδζζιμπμζχκηαξ ημ ιέζμ Mowiol ηαζ αθήκμοιε ηα πθαηάηζα κα ζηεβκχζμοκ βζα ημοθάπζζημκ 30 min. Αημθμοεεί παναηήνδζδ ηςκ ημιχκ ζημ ιζηνμζηυπζμ θεμνζζιμφ. Γηαιύκαηα Βμνζηυ κάηνζμ (Sodium borate) 0.1M ph 8.5 Γζα ηεθζηυ υβημ 1L Γζαθφμοιε 6,18g αμνζημφ μλέμξ (boric acid) ζε ddh 2 O. Ροειίγμοιε ημ ph ιε NaOH. Πνμζεέημοιε ddh 2 O ιέπνζ ημκ ηεθζηυ υβημ. Γζάθοια HCl 2N Σμ δζάθοια ποηκμφ HCl έπεζ ζοβηέκηνςζδ 11.6Ν. Ακάθμβα ιε ηδκ πμζυηδηα δζαθφιαημξ HCl 2N πμο εέθμοιε κα θηζάλμοιε, ηάκμοιε ηδκ ηαηάθθδθδ αναίςζδ. 96

97 Τθζηά & Μέεμδμζ Αλνζνθζνξηζκόο ζε λεπξόζθαηξεο Σα παναπάκς πνςηυημθθα ακμζμθεμνζζιμφ ανίζημοκ εθανιμβή ηαζ ζε άθθα δείβιαηα ζζημφ, υπςξ βζα πανάδεζβια ζε κεονυζθαζνεξ ή ζε ιειμκςιέκα ηφηηανα. ηδκ πενίπηςζδ ημο ακμζμθεμνζζιμφ ζε κεονυζθαζνεξ, δ πεζναιαηζηή δζαδζηαζία είκαζ ίδζα ιε ηα πνςηυημθθα πμο πνμακαθένεδηακ ιε ηζξ ελήξ δζαθμνμπμζήζεζξ: Καεχξ μζ κεονυζθαζνεξ δεκ πνμζημθθχκηαζ ζε ηάπμζμ οπυζηνςια (υηακ ανίζημκηαζ οπυ ζοκεήηεξ πμθθαπθαζζαζιμφ) αθθά ανίζημκηαζ εκαζςνμφιεκεξ ζημ ενεπηζηυ ιέζμ, δ υθδ δζαδζηαζία ημο ακμζμθεμνζζιμφ βίκεηαζ δζαηδνχκηαξ ηζξ κεονυζθαζνεξ εκαζςνμφιεκεξ ιέζα ζε έκα ζςθδκάηζ eppendorf. ημ ηέθμξ ηάεε επχαζδξ θοβμηεκηνμφιε βζα θίβμ ηζξ κεονυζθαζνεξ (2-3 min ζε 800rpm), αθαζνμφιε ιε πνμζμπή ημ οπενηείιεκμ ηαζ πνμζεέημοιε ημ επυιεκμ δζάθοια. Γζα κα λεηζκήζμοιε ηδ δζαδζηαζία ημο ακμζμθεμνζζιμφ, ζοθθέβμοιε ηζξ κεονυζθαζνεξ απυ ημ πζάημ ηοηηανμηαθθζένβεζαξ πμο ηζξ δζαηδνμφιε ζε έκα ζςθδκάηζ eppendorf ή Falcon ηςκ 15ml, θοβμηεκηνμφιε βζα κα απμιαηνφκμοιε ημ ενεπηζηυ ιέζμ ηδξ ηαθθζένβεζαξ, πνμζεέημοιε PBS 1x εενιμηναζίαξ 4 C βζα ηα 3 πνχηα πθοζίιαηα ηαζ ζοκεπίγμοιε ηακμκζηά ιε ημ ηθαζζζηυ πνςηυημθθμ ακμζμθεμνζζιμφ (ιμκζιμπμίδζδ ιε PFA ηθπ). Πναβιαημπμζμφιε υθεξ ηζξ επςάζεζξ οπυ ακάδεοζδ Αλνζνθζνξηζκόο ζε θύηηαξα ε αοηήκ ηδκ πενίπηςζδ εθανιυγμοιε πάθζ ηα πνςηυημθθα ακμζμθεμνζζιμφ πμο πνμακαθένεδηακ ιε ηζξ ελήξ δζαθμνμπμζήζεζξ: Σα ηφηηανα δζαηδνμφκηαζ ζηδκ ηαθθζένβεζα πάκς ζε ηαθοπηνίδεξ ιε πμθφ-lθοζίκδ πμο ανίζημκηαζ ιέζα ζηα wells ηςκ πζάηςκ ηοηηανμηαθθζένβεζαξ. Ακαννμθμφιε ημ ενεπηζηυ ιέζμ απυ ηα wells ηςκ πζάηςκ ηοηηανμηαθθζένβεζαξ, πνμζεέημοιε PBS 1x εενιμηναζίαξ 4 C βζα ηα 3 πνχηα πθοζίιαηα ηαζ ζοκεπίγμοιε ιε ημ πνςηυημθθμ ακμζμθεμνζζιμφ. Πνμζέπμοιε ζδζαίηενα κα πνμζεέημοιε ζζβά ζζβά ηα δζάθμνα δζαθφιαηα βζα κα ιδκ λεημθθήζμοκ ηα ηφηηανα απυ ηζξ ηαθοπηνίδεξ. Πνμζέπμοιε κα ιδ πάζμοιε ημκ πνμζακαημθζζιυ ηδξ ηαθοπηνίδαξ ςξ πνμξ ηδκ πθεονά πμο είκαζ πνμζημθθδιέκα ηα ηφηηανα. Πναβιαημπμζμφιε υθεξ ηζξ επςάζεζξ οπυ ακάδεοζδ. 97

98 Τθζηά & Μέεμδμζ ηζξ επςάζεζξ ιε ηα πνςημβεκή ή δεοηενμβεκή ακηζζχιαηα ιεηαθένμοιε ηζξ ηαθοπηνίδεξ ζε έκα επςαζηζηυ εάθαιμ ιε αολδιέκδ οβναζία ηαζ ημπμεεημφιε ηα ακηζζχιαηα απεοεείαξ επάκς ζηζξ ηαθοπηνίδεξ. ημ ηεθεοηαίμ αήια ηδξ πνμζεήηδξ ημο ζηενεμπμζδηζημφ δζαθφιαημξ MOWIOL, ημπμεεημφιε ιζα ζηαβυκα MOWIOL ζημ ηέκηνμ ιζαξ ακηζηεζιεκμθυνμο πθάηαξ ηαζ πάκς ζε αοηήκ ηδκ ζηαβυκα ακαπμδμβονίγμοιε ηδκ ηαθοπηνίδα (δδθαδή ιε ηα ηφηηανα πνμξ ηδκ εζςηενζηή πθεονά) Αλνζνθζνξηζκόο γηα ζπλεζηηαθή κηθξνζθνπία ηδκ πενίπηςζδ πμο εέθμοιε κα παναηδνήζμοιε ηα δείβιαηά ιαξ ζημ ζοκεζηζαηυ ιζηνμζηυπζμ αημθμοεμφιε ιζα δζαθμνεηζηή πνμζέββζζδ βζα κα ζδιάκμοιε ημοξ πονήκεξ ηςκ ηοηηάνςκ ημο ζζημφ. Καεχξ δ πνςζηζηή Hoechst εηπέιπεζ ζε ιήημξ ηφιαημξ πμο ανίζηεηαζ ζημ οπενζχδεξ ηιήια ημο θάζιαημξ βζα ημ μπμίμ ημ ζοκεζηζαηυ ιζηνμζηυπζμ δεκ δζέεεηε ακηίζημζπμ θίθηνμ, πνδζζιμπμζήζαιε εκαθθαηηζηά ηδκ πνςζηζηή Σoto-3 (Invitrogen T3604), δ μπμία εηπέιπεζ ζημ οπένοενμ ηιήια ημο θάζιαημξ βζα ημ μπμίμ οπήνπε δζαεέζζιμ θίθηνμ ζημ ζοκεζηζαηυ ιζηνμζηυπζμ. Ζ επχαζδ ημο ζζημφ ιε ηδ πνςζηζηή αοηή βίκεηαζ ηαοηυπνμκα ιε ηα δεοηενμβεκή θεμνίγμκηα ακηζζχιαηα ζε αναίςζδ 1:1500 βζα ηζξ ημιέξ ηαζ 1:2000 βζα ηα ηφηηανα. Σμ οπυθμζπμ πνςηυημθθμ ημο ακμζμθεμνζζιμφ ελεθίζζεηαζ υπςξ έπεζ ήδδ πενζβναθεί Καηάινγνο αληηζσκάησλ πνπ ρξεζηκνπνηήζεθαλ ημοξ παναηάης πίκαηεξ απεζημκίγμκηαζ υθα ηα πνςημβεκή ηαζ δεοηενμβεκή ακηζζχιαηα πμο πνδζζιμπμζήεδηακ βζα ηα πεζνάιαηα ακμζμθεμνζζιμφ. 98

99 Τθζηά & Μέεμδμζ Αληίζσκα Αξαίσζε Δηαηξεία rabbit anti-geminin 1: rabbit anti-cdt1 1:200 - mouse anti-rc2 1:10 Developmental Studies Hybridoma Bank mouse anti-pax6 1:1500 Developmental Studies Hybridoma Bank mouse anti-ngn2 1:20 Provided by F. Guillemot mouse anti-mash1 1:50 BD Biosciences mouse anti-mash1 1:10 Provided by F. Guillemot rabbit anti-ki67 1:1000 Vector Laboratories rat anti-ki67 1:50 Dako rat anti-brdu 1:20 Oxford Biotechnology mouse anti-pvimentin 1:500 Medical and Biological Laboratories rabbit anti-gfp 1:500 Molecular Probes mouse anti-gfp 1:500 Molecular Probes mouse anti-gfp 1:500 Roche rabbit anti-caspase 3 1:1000 R&D Systems rabbit anti-sox2 1:1500 Chemicon rabbit anti-tbr2 1:1000 Abcam mouse anti-p27 1:50 BD Biosciences mouse anti-tuj1 1:1500 Sigma rabbit anti-blbp 1:1000 Chemicon mouse anti-neun 1:200 Chemicon rabbit anti-olig2 1:2000 Chemicon rabbit anti-gfap 1:1000 DakoCytomation goat anti-sox10 1:200 Santa Cruz Πίλαθαο Καηάινγνο ηωλ πξωηνγελώλ αληηζωκάηωλ πνπ ρξεζηκνπνηήζεθαλ. 99

100 Τθζηά & Μέεμδμζ Αληίζσκα Αξαίσζε Δηαηξεία Alexa Fluor anti-rabbit 1:1000 Molecular Probes 488 Alexa Fluor anti-rabbit 1:1000 Molecular Probes 568 Alexa Fluor anti-mouse 1:1000 Molecular Probes 488 Alexa Fluor anti-mouse 1:1000 Molecular Probes 568 Alexa Fluor anti-goat 568 1:1000 Molecular Probes Alexa Fluor anti-rat 568 1:1000 Molecular Probes Πίλαθαο Καηάινγνο ηωλ δεπηεξνγελώλ αληηζωκάηωλ πνπ ρξεζηκνπνηήζεθαλ Αλάιπζε δεδνκέλσλ Οζ θςημβναθίεξ ηςκ ημιχκ εθήθεδζακ ζε ζοκεζηζαηυ ιζηνμζηυπζμ (Leica TCS SP5 ιε ιζηνμζηυπζμ θεμνζζιμφ Leica DMI6000B) αθθά ηαζ ιε απθυ ιζηνμζηυπζμ θεμνζζιμφ Nikon Eclipse TE2000-U ελμπθζζιέκμ ιε ηάιενα Nicon Digital Sight DS-L1. Οζ ρδθζαηέξ θςημβναθίεξ επελενβάζηδηακ ζηδ ζοκέπεζα ιε ημ πνυβναιια επελενβαζίαξ θςημβναθζχκ Adobe Photoshop. Οζ πμζμηζημπμζήζεζξ ηςκ δζαθυνςκ ηοηηανζηχκ πθδεοζιχκ ζηα πεζνάιαηα ηδκ απμζζχπδζδξ ημο βμκζδίμο ηδξ Geminin έβζκακ ζε πεδία ίδζμο ειααδμφ απυ θςημβναθίεξ πμο ηάθοπηακ υθμ ημ πάπμξ ημο επζεδθίμο ημο ζζημφ. Ηδζαίηενδ πνμζμπή δυεδηε χζηε μζ πμζμηζημπμζήζεζξ ιεηαλφ WT ηαζ Fl/koNestinCre ειανφςκ κα βίκμκηαζ ζε πανυιμζεξ ημιέξ, πμο ανίζημκηαζ ζε πανυιμζα εέζδ ηαηά ιήημξ ημο ειπνυζεζμο-μπίζεζμο άλμκα ημο εβηεθάθμο. Οζ ιεηνήζεζξ ιαξ έβζκακ ζε δφμ δζαθμνεηζηά επίπεδα ηαηά ιήημξ ημο ειπνυζεζμο-μπίζεζμο άλμκα ημο εβηεθάθμο, πμζμηζημπμζχκηαξ δφμ ημιέξ ζημ ειπνυζεζμ ηιήια ημο θθμζμφ ηαζ δφμ ημιέξ ζημ μπίζεζμ επίπεδμ ημο θθμζμφ. ε ηάεε ιία απυ αοηέξ ηζξ ημιέξ πμζμηζημπμζήζαιε δφμ δζαθμνεηζηέξ πενζμπέξ, πνχημκ ηδκ πενζμπή πμο ανίζηεηαζ ζημ ναπζαίμ ηιήια ημο θθμζμφ ηαζ δεφηενμκ ηδκ πενζμπή πμο ανίζηεηαζ αηνζαχξ ζημ υνζμ πζηςκίμοοπμπζηςκίμο. θα ηα δεδμιέκα ιαξ πνμένπμκηαζ απυ πμζμηζημπμζήζεζξ ζε ημοθάπζζημκ ηνία γεοβάνζα WT ηαζ Fl/koNestinCre ειανφςκ πμο πνμέηορακ απυ πενζζζυηενεξ απυ ιία βεκκήζεζξ ηαζ εηθνάγμκηαζ ακά πεδίμ ιέηνδζδξ, δδθαδή ακά θθμζσηή πενζμπή ίδζμο ειααδμφ. Γζα ηάεε έιανομ, μζ πμζμηζημπμζήζεζξ έβζκακ ιε θςημβναθίεξ απυ ζοκεζηζαηυ ιζηνμζηυπζμ πμο εθήθεδζακ ιε 63x θαηυ, μζ μπμίεξ ακηζπνμζχπεοακ μπηζηέξ ημιέξ ημο θθμζμφ πάπμοξ 2ιm. 100

101 Τθζηά & Μέεμδμζ ηα πεζνάιαηα οπέν-έηθναζδξ ηδξ πνςηεΐκδξ Geminin, πμζμηζημπμζήζαιε υθμ ημ εφνμξ ημο θθμζσημφ επζεδθίμο υπμο οπήνπε έηθναζδ GFP. Σα απμηεθέζιαηα ηςκ ιεηνήζεςκ πνμένπμκηαζ απυ ηζξ πμζμηζημπμζήζεζξ ημοθάπζζημκ ηνζχκ δζαθμνεηζηχκ ημιχκ πάπμοξ 10ιm απυ ηάεε θέηα θθμζμφ πάπμοξ 300ιm ηαζ απυ ημοθάπζζημκ ηνεζξ δζαθμνεηζηέξ ηέημζεξ θέηεξ. Ζ δζάηνζζδ ηςκ δζαθυνςκ γςκχκ ημο θθμζμφ ααζίζηδηε ζηδ δζαθμνεηζηή ζζημθμβζηή μνβάκςζδ ηςκ γςκχκ ηαζ ζημ δζαθμνεηζηυ ζπήια ημο πονήκα ηςκ ηοηηάνςκ πμο ηζξ απανηίγμοκ, υπςξ αοηά απμηαθφθεδηακ ιεηά απυ ηδ πνχζδ ιε ηδκ πνςζηζηή Σoto-3. Ζ ζηαηζζηζηή ζδιακηζηυηδηα ηςκ ιεηνήζεςκ εηηζιήεδηε ιε ημ student s T-test ημο πνμβνάιιαημξ Microsoft Excel. 101

102 3. Α Π Ο Σ Δ Λ Δ Μ Α Σ Α

103 Απμηεθέζιαηα Ζ εκμνπήζηνςζδ ηςκ ιδπακζζιχκ ζπδιαηζζιμφ ημο εβηεθαθζημφ θθμζμφ εθέβπεηαζ απυ ηα κεονζηά αθαζηζηά ηαζ πνμβμκζηά ηφηηανα ημο ζζημφ, ηα μπμία είκαζ οπεφεοκα βζα ηδκ παναβςβή υθςκ ηςκ δζαθμνμπμζδιέκςκ κεονζηχκ ηαζ βθμζαηχκ ηοηηάνςκ πμο ημκ απανηίγμοκ ηαζ δζαιεζμθααμφκ ηζξ θεζημονβίεξ ημο. Κμιαζηυ ζδιείμ ηδξ δζαδζηαζίαξ αοηήξ είκαζ μ ζοκημκζζιυξ ηςκ αζμθμβζηχκ δζενβαζζχκ πμο επάβμοκ ημκ πμθθαπθαζζαζιυ ή ηδ δζαθμνμπμίδζδ ηςκ πνμβμκζηχκ ηοηηάνςκ ημο θθμζμφ. Ζ απυθαζδ ηςκ πνμβμκζηχκ ηοηηάνςκ βζα δζαζνέζεζξ πμο ζοκηεθμφκ ζηδκ αοημ-ακακέςζδ ή ζηδκ εκενβμπμίδζδ ηςκ ιδπακζζιχκ δζαθμνμπμίδζήξ ημοξ είκαζ έκαξ ηαεμνζζηζηυξ πανάβμκηαξ εθέβπμο ηνίζζιςκ παναιέηνςκ ηδξ ακάπηολδξ ημο εβηεθαθζημφ θθμζμφ, υπςξ είκαζ δ παναβςβή ηςκ ζςζηχκ πθδεοζιχκ κεονςκζηχκ ηαζ βθμζαηχκ οπμηφπςκ, ημ ιέβεεμξ ηςκ εβηεθαθζηχκ διζζθαζνίςκ ηαζ ηεθζηά δ θεζημονβζηυηδηα ημο θθμζμφ. ηδκ πανμφζα δζδαηημνζηή δζαηνζαή εζηζαζηήηαιε ζηδκ απμζαθήκζζδ ημο νυθμο ηδξ πνςηεΐκδξ Geminin ζηδ νφειζζδ ηςκ ιδπακζζιχκ αοημακακέςζδξ ηαζ δζαθμνμπμίδζδξ ηςκ πνμβμκζηχκ ηοηηάνςκ ημο εβηεθαθζημφ θθμζμφ. 3.1 Μειέηε ηεο έθθξαζεο ησλ πξσηετλώλ Geminin θαη Cdt1 ζηνλ αλαπηπζζόκελν εγθεθαιηθό θινηό Οη πξσηεΐλεο Geminin θαη Cdt1 εθθξάδνληαη ζηα πξνγνληθά λεπξηθά θύηηαξα ηνπ θινηνύ Σα πνμβμκζηά κεονζηά ηφηηανα ημο εβηεθαθζημφ θθμζμφ δεκ ζοβηνμημφκ έκακ μιμζμβεκή πθδεοζιυ αθθά δζαηνίκμκηαζ ζε επζιένμοξ ηοηηανζημφξ ηφπμοξ πμο δζαθένμοκ ζηδ ιμνθμθμβία, ζηα βμκίδζα πμο εηθνάγμοκ, ζημκ ηνυπμ δζαίνεζδξ αθθά ηαζ ζημ είδμξ ηςκ ηοηηάνςκ πμο πνμηφπηεζ απυ ηδ δζαίνεζή ημοξ. Πνχημ ιέθδιά ιαξ επμιέκςξ ήηακ κα δζενεοκήζμοιε ηδκ έηθναζδ ηςκ δφμ πνςηεσκχκ ζημοξ δζαηνζημφξ πθδεοζιμφξ ηςκ θθμζσηχκ πνμβμκζηχκ ηοηηάνςκ. Ο εβηεθαθζηυξ θθμζυξ πενζθαιαάκεζ δφμ κεονμβεκεηζηέξ γχκεξ υπμο εδνεφμοκ ηα πνμβμκζηά κεονζηά ηφηηανα. Ζ ημζθζαηή γχκδ ανίζηεηαζ αηνζαχξ δίπθα ζηδκ πθάβζα ημζθία ηαζ πενζέπεζ ηα κεονμεπζεδθζαηά ηφηηανα ηαζ ηα ηφηηανα ηδξ αηηζκςηήξ βθμίαξ, ηα μπμία θυβς ηδξ εέζδξ ημοξ μκμιάγμκηαζ αενμζζηζηά ηαζ «ημνοθαία πνμβμκζηά ηφηηανα». Ζ οπμημζθζαηή γχκδ εκημπίγεηαζ εζςηενζηά ηδξ ημζθζαηήξ γχκδξ ηαζ πενζέπεζ ηα «ααζζηά πνυδνμια ηφηηανα» (Gotz and Huttner, 2005; Guillemot, 2005). Πνμηεζιέκμο κα ελεηαζηεί δ έηθναζδ ηςκ πνςηεσκχκ Geminin ηαζ Cdt1 πνδζζιμπμζήεδηακ εζδζηά ακηζζχιαηα έκακηζ ηςκ πνςηεσκχκ Geminin, Cdt1 ηαζ RC2 (Misson et al., 1988), δ μπμία παναηηδνίγεζ ηα κεονμεπζεδθζαηά ηφηηανα ηαζ ηα ηφηηανα ηδξ αηηζκςηήξ βθμίαξ (Gotz and Huttner, 2005). Πναβιαημπμζήεδηακ πεζνάιαηα δζπθμφ ακμζμθεμνζζιμφ ζε ημιέξ απυ έιανοα 103

104 Απμηεθέζιαηα ιουξ δθζηίαξ Δ15.5 (Embryonic day 15.5) (Δζηυκα 3.1), ζηα μπμία παναηδνήεδηε εηηεηαιέκμξ ζοκεκημπζζιυξ ηςκ πνςηεσκχκ Geminin ηαζ Cdt1 ιε ηδκ πνςηεΐκδ RC2, βεβμκυξ πμο οπμδεζηκφεζ υηζ ηα ημνοθαία πνμβμκζηά ηφηηανα ημο θθμζμφ εηθνάγμοκ ηαζ ηζξ δφμ πνςηεΐκεξ (Δζηυκα 3.1A-Θ). Ζ πμνεία κεονμβέκεζδξ ζημκ εβηεθαθζηυ θθμζυ είκαζ ιζα ζοκεπχξ ελεθζζζυιεκδ δζαδζηαζία, ηαηά ηδκ μπμία ελεθίζζμκηαζ ηαζ ηα παναηηδνζζηζηά ηςκ πνμβμκζηχκ ηοηηάνςκ. Ο πνχημξ πθδεοζιυξ ηοηηάνςκ ηδξ ημζθζαηήξ γχκδξ, ηα κεονμεπζεδθζαηά ηφηηανα, δζαζνμφκηαζ ανπζηά ζοιιεηνζηά χζηε κα πανάβμοκ ημκ ακαβηαίμ ανζειυ πνμβμκζηχκ ηοηηάνςκ πμο εα δζαζθαθίζμοκ ηδ δδιζμονβία ημο ζςζημφ ανζειμφ χνζιςκ κεονχκςκ. ηδ ζοκέπεζα δ ακάπηολδ ημο εβηεθαθζημφ θθμζμφ πενκάεζ ζηδ θεβυιεκδ «κεονμβεκεηζηή θάζδ» (neurogenic phase) (εκ ακηζεέζεζ ιε ηδκ πνμδβμφιεκδ «θάζδ πμθθαπθαζζαζιμφ» (expansion phase)), ηα κεονμεπζεδθζαηά ηφηηανα ανπίγμοκ κα ιεηαζπδιαηίγμκηαζ ζε ηφηηανα ηδξ αηηζκςηήξ βθμίαξ ηαζ δ θφζδ ηςκ ηοηηάνςκ πμο πνμηφπημοκ απυ ηδ δζαθμνμπμίδζή ημοξ είκαζ κεονςκζηή. Έκαξ δείηηδξ βζα αοηά ηα κεονμβεκεηζηά ηφηηανα ηδξ αηηζκςηήξ βθμίαξ είκαζ μ ιεηαβναθζηυξ πανάβμκηαξ Pax6 (Gotz et al., 1998; Englund et al., 2005). Πναβιαημπμζήεδηακ πεζνάιαηα δζπθμφ ακμζμθεμνζζιμφ ιε εζδζηά ακηζζχιαηα έκακηζ ηςκ πνςηεσκχκ Geminin, Cdt1 ηαζ Pax6 ζε ιεηςπζαίεξ ημιέξ θθμζμφ απυ έιανοα ιουξ δθζηίαξ Δ15.5 πνμηεζιέκμο κα ζοβηνζεμφκ ηα πνυηοπα έηθναζδξ ηςκ Geminin ηαζ Cdt1 ιε αοηυ ηδξ πνςηεΐκδξ Pax6 (Δζηυκα 3.1Η-Π). Ζ πνςηεΐκδ Pax6 πανμοζζάγεζ εηηεηαιέκδ έηθναζδ ζε αοηυ ημ ειανοσηυ ζηάδζμ, ζδιαίκμκηαξ ζπεδυκ υθα ηα ηφηηανα ηδξ ημζθζαηήξ γχκδξ. Σα ηφηηανα πμο εηθνάγμοκ ηζξ Geminin ή Cdt1 εηθνάγμοκ ηαοηυπνμκα ηαζ ημ ιεηαβναθζηυ πανάβμκηα Pax6 (Δζηυκα 3.1Μ,Π, ηίηνζκα ηφηηανα), οπμδεζηκφμκηαξ υηζ μζ δφμ οπυ ιεθέηδ πνςηεΐκεξ εκημπίγμκηαζ ζηα κεονμβεκεηζηά ηφηηανα ηδξ αηηζκςηήξ βθμίαξ. Ακηίεεηα, μ Pax6 εεηζηυξ ηοηηανζηυξ πθδεοζιυξ δεκ είκαζ ζημ ζφκμθυ ημο εεηζηυξ βζα ηζξ Geminin ηαζ Cdt1. Πμζμηζημπμζχκηαξ ημοξ ακηίζημζπμοξ πθδεοζιμφξ ανίζημοιε υηζ ηα Geminin+ ηφηηανα απμηεθμφκ πενίπμο ημ 52% ημο Pax6+ πθδεοζιμφ εκχ ημ πμζμζηυ ημο Pax6+ πθδεοζιμφ πμο ζοκεηθνάγεζ Cdt1 ακένπεηαζ πενίπμο ζημ 38%, οπμδεζηκφμκηαξ υηζ μζ Geminin ηαζ Cdt1 εηθνάγμκηαζ πζεακχξ ζε δζαθμνεηζημφξ ηοηηανζημφξ οπμπθδεοζιμφξ ιεηαλφ ηςκ Pax6+ πνμβμκζηχκ κεονζηχκ ηοηηάνςκ. Καεχξ μ ιεηαβναθζηυξ πανάβμκηαξ Pax6 παναηηδνίγεζ ιυκμ ηα ηφηηανα ηδξ αηηζκςηήξ βθμίαξ εκχ δεκ εκημπίγεηαζ ζηα ααζζηά πνυδνμια ηφηηανα (Gotz et al., 1998; Gotz and Barde, 2005), ημ πνυηοπμ έηθναζήξ ημο πνμζθένεζ έκα ιέζμ δζάηνζζδξ ιεηαλφ ηςκ πνμβμκζηχκ ηοηηάνςκ ηδξ ημζθζαηήξ ηαζ οπμημζθζαηήξ γχκδξ. Σα παναπάκς πεζνάιαηα ακέδεζλακ Geminin ηαζ Cdt1 εεηζηά ηφηηανα ζηδ ζηζαάδα εζςηενζηά ηδξ ημζθζαηήξ γχκδξ, ηα μπμία δεκ ελέθναγακ ηαοηυπνμκα ημκ πανάβμκηα Pax6 (Δζηυκα 3.1Μ,Π, αέθδ). Σμ εφνδια αοηυ οπμδεζηκφεζ υηζ έκα πμζμζηυ απυ ηα ααζζηά πνυδνμια ηφηηανα ηδξ οπμημζθζαηήξ γχκδξ επίζδξ εηθνάγεζ Geminin ηαζ Cdt1. 104

105 Απμηεθέζιαηα Δηθόλα 3.1. Οη Geminin θαη Cdt1 ζπλεθθξάδνληαη κε ηηο πξωηεΐλεο RC2 θαη Pax6 πνπ εληνπίδνληαη ζηα θύηηαξα ηεο αθηηλωηήο γινίαο. Φσηνγξαθίεο ζπλεζηηαθνύ κηθξνζθνπίνπ από πεηξάκαηα δηπινύ αλνζνθζνξηζκνύ πνπ πξαγκαηνπνηήζεθαλ ζε κεησπηαίεο ηνκέο θινηνύ από έκβξπα κπόο ειηθίαο Δ15.5 ρξεζηκνπνηώληαο εηδηθά αληηζώκαηα έλαληη ησλ πξσηετλώλ Geminin (πξάζηλν, Α-Γ, Η-Μ) θαη Cdt1 (πξάζηλν, ΔΘ, Ν-Π) θαη ησλ πξσηετλώλ RC2 (θόθθηλν, Α-Θ) θαη Pax6 (θόθθηλν, Η-Π) πνπ ραξαθηεξίδνπλ ηα θύηηαξα ηεο αθηηλσηήο γινίαο. Οη ππξήλεο ησλ θπηηάξσλ απεηθνλίδνληαη κε κπιε κεηά από ρξώζε κε ηε ρξσζηηθή Σνtν-3. Ο ζπλεληνπηζκόο ηεο έθθξαζεο ησλ Geminin θαη Cdt1 κε ηηο πξσηεΐλεο RC2 θαη Pax6 δείρλεη όηη νη δύν πξσηεΐλεο εθθξάδνληαη ζηα θύηηαξα ηεο αθηηλσηήο γινίαο. Σα βέιε ζηηο Γ,Θ ππνδεηθλύνπλ θύηηαξα πνπ ζπλεθθξάδνπλ ηηο πξσηεΐλεο Geminin/RC2 θαη Cdt1/RC2 αληίζηνηρα. Οη Geminin θαη Cdt1 ραξαθηεξίδνπλ επίζεο ηα Pax6- πξόδξνκα θύηηαξα ηεο ππνθνηιηαθήο δώλεο (βέιε ζηηο Μ,Π). ΚΕ, θνηιηαθή δώλε. Σα παναπάκς απμηεθέζιαηα δείπκμοκ υηζ ηα πνμβμκζηά κεονζηά ηφηηανα ημο εβηεθαθζημφ θθμζμφ, ηυζμ αοηά πμο ανίζημκηαζ ζηδκ ημζθζαηή υζμ ηαζ αοηά πμο εκημπίγμκηαζ ζηδκ οπμημζθζαηή γχκδ εηθνάγμοκ ηζξ πνςηεΐκεξ Geminin ηαζ Cdt1, πνμηείκμκηαξ έκακ πζεακυ νυθμ ηςκ δφμ πνςηεσκχκ ζε αοημφξ ημο ηοηηανζημφξ πθδεοζιμφξ. 105

106 Απμηεθέζιαηα Σα επίπεδα έθθξαζεο ησλ πξσηετλώλ Geminin θαη Cdt1 κεηώλνληαη θαζώο ηα πξνγνληθά θύηηαξα απνθηνύλ πξνθαζνξηζκέλε αλαπηπμηαθή κνίξα Ζ ιεηάααζδ απυ ηα πνμβμκζηά κεονζηά ηφηηανα ζημοξ δζαθμνμπμζδιέκμοξ κεονχκεξ ημο εβηεθαθζημφ θθμζμφ πενζθαιαάκεζ έκακ εκδζάιεζμ ηφπμ πνυδνμιςκ ηοηηάνςκ, ηα μπμία πανμοζζάγμκηαζ πνμηαεμνζζιέκα (committed) πνμξ κεονςκζηή δζαθμνμπμίδζδ, ηονίςξ θυβς ηδξ έηθναζδξ ζοβηεηνζιέκςκ ιεηαβναθζηχκ παναβυκηςκ πμο επάβμοκ ηδ δζαδζηαζία αοηή. Πνμηεζιέκμο κα εηηζιδεεί δ έηθναζδ ηςκ πνςηεσκχκ Geminin ηαζ Cdt1 ζε αοηήκ ηδκ ηαηδβμνία πνυδνμιςκ ηοηηάνςκ ελεηάζηδηε ημ εκδεπυιεκμ ζοκεκημπζζιμφ ηςκ δφμ πνςηεσκχκ ιε ηζξ πνμκεονζηέξ πνςηεΐκεξ Neurogenin2 (Ngn2) ηαζ Mash1, μζ μπμίεξ παναηηδνίγμοκ ηα πνμηαεμνζζιέκα πνυδνμια ηφηηανα. Οζ πνςηεΐκεξ αοηέξ είκαζ ιέθδ ηδξ μζημβέκεζαξ ηςκ ιεηαβναθζηχκ παναβυκηςκ ιμηίαμο bhlh ηαζ δζαδναιαηίγμοκ ηαίνζμοξ νυθμοξ ηαηά ηδκ ακάπηολδ ημο κεονζημφ ζοζηήιαημξ, ηαεχξ ειπθέημκηαζ ζηδκ πνμχεδζδ ηςκ κεονμβεκεηζηχκ ιδπακζζιχκ, ηδκ ςνίιακζδ ηςκ πνυδνμιςκ κεονζηχκ ηοηηάνςκ αθθά ηαζ ημκ ηαεμνζζιυ ημο κεονςκζημφ ηφπμο (Guillemot et al., 1993; Ma et al., 1998; Torii et al., 1999; Nieto et al., 2001; Britz et al., 2006). Πζμ ζοβηεηνζιέκα, μ πανάβμκηαξ Ngn2 είκαζ ηαεμνζζηζηήξ ζδιαζίαξ βζα ημ ζπδιαηζζιυ ημο εβηεθαθζημφ θθμζμφ, ηαεχξ εκημπίγεηαζ ζε αολδιέκα επίπεδα ζημ ζοβηεηνζιέκμ ζζηυ ηαζ επδνεάγεζ ζδιακηζηά ηδκ παναβςβή ηςκ πνυδνμιςκ ηοηηάνςκ ηδξ οπμημζθζαηήξ γχκδξ απυ ηα ηφηηανα ηδξ ημζθζαηήξ γχκδξ ηαζ ηδ ιεηέπεζηα δζαθμνμπμίδζή ημοξ ζε κεονχκεξ (Schuurmans et al., 2004; Britz et al., 2006). Ο ιεηαβναθζηυξ πανάβμκηαξ Mash1 απυ ηδκ άθθδ ιενζά παναηηδνίγεζ ηονίςξ ηζξ ημζθζαηέξ πενζμπέξ ημο ηεθεβηεθάθμο αθθά εηθνάγεηαζ επίζδξ, ακ ηαζ ζε παιδθυηενα επίπεδα, ζημ θθμζυ υπμο έπεζ δεζπεεί υηζ πνμάβεζ ηδκ παναβςβή ηςκ ααζζηχκ πνυδνμιςκ ηοηηάνςκ ηαζ ηδ κεονςκζηή δζαθμνμπμίδζδ (Britz et al., 2006). Πναβιαημπμζήεδηακ πεζνάιαηα δζπθμφ ακμζμθεμνζζιμφ ζε ιεηςπζαίεξ ημιέξ ηεθεβηεθάθμο ειανφςκ ιουξ δθζηίαξ Δ15.5 πνδζζιμπμζχκηαξ εζδζηά ακηζζχιαηα έκακηζ ηςκ πνςηεσκχκ Geminin, Cdt1 ηαζ Mash1 χζηε κα ζοβηνζεμφκ ηα πνυηοπα έηθναζήξ ημοξ ηυζμ ζημκ εβηεθαθζηυ θθμζυ υζμ ηαζ ζηζξ πθάβζεξ βαββθζαηέξ πνμελμπέξ (Δζηυκα 3.2Δ-Θ). Παναηδνήεδηε υηζ δ πθεζμρδθία ηςκ Geminin+ ηαζ Cdt1+ πνμβμκζηχκ ηοηηάνςκ ημο θθμζμφ είκαζ δζαηνζηά απυ ηα Mash1+ ηφηηανα. Σα ηφηηανα πμο θαίκεηαζ κα ζοκεηθνάγμοκ ηζξ δφμ οπυ ιεθέηδ πνςηεΐκεξ ιε ημκ πανάβμκηα Mash1 απμηεθμφκ έκα πμθφ ιζηνυ πμζμζηυ ημο ζοκμθζημφ πθδεοζιμφ ηςκ Geminin+ ηαζ Cdt1+ ηοηηάνςκ, πενίπμο 1-2% (Δζηυκα 3.2Ε,Θ, αέθδ). Σμ πμζμζηυ ηςκ Mash1+ ηοηηάνςκ πμο ζοκεηθνάγμοκ ηζξ οπυ ιεθέηδ πνςηεΐκεξ είκαζ ορδθυηενμ ζηδκ πθάβζα βαββθζαηή πνμελμπή, υπμο βεκζηά ηαζ δ έηθναζδ ημο πανάβμκηα Mash1 είκαζ πενζζζυηενμ εηηεηαιέκδ, ηαζ ακένπεηαζ ζημ 18-20% ζηδκ πενίπηςζδ ζοκεκημπζζιμφ ηςκ Cdt1/Mash1 ηαζ ζε πενίπμο 30% ζηδκ πενίπηςζδ Geminin/Mash1. 106

107 Απμηεθέζιαηα Δηθόλα 3.2. Έθθξαζε ηωλ Geminin θαη Cdt1 ζηα πξνθαζνξηζκέλα γηα λεπξωληθή δηαθνξνπνίεζε πξόδξνκα λεπξηθά θύηηαξα. Πεηξάκαηα δηπινύ αλνζνθζνξηζκνύ κε εηδηθά αληηζώκαηα έλαληη ησλ Geminin (πξάζηλν, Α,Β,Δ,Ε), Cdt1 (πξάζηλν, Γ,Γ,Ζ,Θ), Ngn2 (θόθθηλν, Α-Γ) θαη Mash1 (θόθθηλν, Δ-Θ) ζε ηνκέο ηειεγθεθάινπ εκβξύσλ κπόο ειηθίαο Δ15.5. Ζ αλάιπζε κε ζπλεζηηαθή κηθξνζθνπία ησλ πξνηύπσλ έθθξαζεο ησλ παξαπάλσ πξσηετλώλ έδεημε πεξηνξηζκέλν ζπλεληνπηζκό. Σα βέιε δειώλνπλ ηα δηπιά ζεηηθά θύηηαξα. ΚΕ, θνηιηαθή δώλε. ΤΚΕ, ππνθνηιηαθή δώλε. ΠΚ, πιάγηα θνηιία. ΠΓΠ, πιάγηα γαγγιηαθή πξνεμνρή. Ακηίζημζπα πεζνάιαηα πναβιαημπμζήεδηακ ηαζ βζα ηδ δζενεφκδζδ ηδξ ζοκέηθναζδξ ηςκ πνςηεσκχκ Geminin ηαζ Cdt1 ιε ημκ πνμκεονζηυ ιεηαβναθζηυ πανάβμκηα Ngn2 ζηα πνμβμκζηά ηφηηανα ημο θθμζμφ (Δζηυκα 3.2Α-Γ). Παναηδνήεδηε πενζμνζζιέκμξ ζοκεκημπζζιυξ ιεηαλφ ηςκ ηοηηανζηχκ πθδεοζιχκ πμο εηθνάγμοκ Geminin, Cdt1 ηαζ Ngn2, ηαεχξ ηα ακηίζημζπα πμζμζηά ζοκεκημπζζιμφ ακένπμκηαζ πενίπμο ζημ 3-4%, εκχ ηα δζπθά εεηζηά ηφηηανα εκημπίζηδηακ ζηδκ οπμημζθζαηή γχκδ ηαζ ζημ υνζμ ιεηαλφ ημζθζαηήξ ηαζ οπμημζθζαηήξ γχκδξ (Δζηυκα 3.2Β,Γ, αέθδ). Σα παναπάκς δεδμιέκα οπμδδθχκμοκ υηζ ηαηά ηδ δζαδζηαζία πνμηαεμνζζιμφ ηςκ πνμβμκζηχκ ηοηηάνςκ ημο θθμζμφ πνμξ κεονςκζηή δζαθμνμπμίδζδ δ έηθναζδ ηςκ πνςηεσκχκ Geminin ηαζ Cdt1 ιεζχκεηαζ ζδιακηζηά ηαζ παναιέκεζ ζε έκα ιζηνυ ιυκμ πμζμζηυ ηςκ ηοηηάνςκ. 107

108 Απμηεθέζιαηα Οη πξσηεΐλεο Geminin θαη Cdt1 εθθξάδνληαη ζηα πξνγνληθά λεπξηθά θύηηαξα ηνπ θινηνύ ζε ζπγθεθξηκέλεο θάζεηο ηνπ θπηηαξηθνύ θύθινπ Σα ιέπνζ ηχνα απμηεθέζιαηά ιαξ δείπκμοκ υηζ μζ πνςηεΐκεξ Geminin ηαζ Cdt1 εηθνάγμκηαζ ζε πθδεοζιμφξ αδζαθμνμπμίδηςκ πνμβμκζηχκ ηοηηάνςκ ημο εβηεθαθζημφ θθμζμφ εκχ ζπεδυκ απμοζζάγμοκ απυ ηα ηφηηανα πμο εηθνάγμοκ πνμκεονζηέξ πνςηεΐκεξ ηαζ πμο επμιέκςξ έπμοκ εκενβμπμζήζεζ ηδ κεονςκζηή ημοξ δζαθμνμπμίδζδ. Βζαθζμβναθζηά δεδμιέκα απυ ηοηηανζηέξ ζεζνέξ ηαζ μνβακζζιμφξ υπςξ μ Xenopus laevis ηαζ δ Drosophila melanogaster δείπκμοκ υηζ μζ δφμ πνςηεΐκεξ πανμοζζάγμοκ δζαηοιάκζεζξ ζηα επίπεδα έηθναζήξ ημοξ πμο ελανηχκηαζ απυ ηδ θάζδ ημο ηοηηανζημφ ηφηθμο, ιε ηδκ Cdt1 κα εκημπίγεηαζ ζηα ηφηηανα ηαηά ηδκ G1 θάζδ ηαζ ηδκ Geminin κα εηθνάγεηαζ ζηζξ θάζεζξ S/G2/M (McGarry and Kirschner, 1998; Quinn et al., 2001; Xouri et al., 2004). Πνμδβμφιεκδ ιεθέηδ ημο ενβαζηδνίμο ιαξ (ιεηαπηοπζαηή ενβαζία Μάβδαξ πέθθα) (αθθά ηαζ ηα ιέπνζ ηχνα απμηεθέζιαηα ηδξ πανμφζαξ δζαηνζαήξ, αθέπε ημκ εκημπζζιυ ηςκ Geminin ηαζ Cdt1 εεηζηχκ ηοηηάνςκ ζηζξ Δζηυκεξ 3.1. ηαζ 3.2) πενζβνάθεζ ιζα δζαηνζηή ημπμβναθζηή ημπμεέηδζδ ηςκ εεηζηχκ βζα ηα ιυνζα Geminin ηαζ Cdt1 ηοηηανζηχκ πθδεοζιχκ ζημκ ακαπηοζζυιεκμ θθμζυ. Σμ βεβμκυξ αοηυ, ζε ζοκδοαζιυ ιε ημ θαζκυιεκμ ηδξ ιεηακάζηεοζδξ ημο πονήκα ηςκ πνμβμκζηχκ ηοηηάνςκ ηδξ ημζθζαηήξ γχκδξ ζε δζαθμνεηζηέξ εέζεζξ ημο ηοηηανμπθάζιαημξ ακάθμβα ιε ηδ θάζδ ημο ηοηηανζημφ ηφηθμο (Sauer and Walker, 1959), οπμζηδνίγεζ ιζα δζαθμνζηή έηθναζδ ηςκ δφμ πνςηεσκχκ ελανηχιεκδ απυ ηδ θάζδ ημο ηοηηανζημφ ηφηθμο. Σα παναπάκς δεδμιέκα ιαξ μδήβδζακ ζηδκ πεναζηένς δζενεφκδζδ ημο πνμηφπμο έηθναζδξ ηςκ δφμ πνςηεσκχκ ζε ζπέζδ ιε ηζξ θάζεζξ ημο ηοηηανζημφ ηφηθμο. Ανπζηά πναβιαημπμζήεδηακ πεζνάιαηα δζπθμφ ακμζμθεμνζζιμφ ζε ιεηςπζαίεξ ημιέξ ειανφςκ ιουξ δθζηίαξ Δ15.5 πνδζζιμπμζχκηαξ ακηζζχιαηα έκακηζ ηςκ Geminin ηαζ Cdt1 ζε ζοκδοαζιυ ιε ημκ πνςηεσκζηυ δείηηδ Ki67, δ έηθναζδ ημο μπμίμο παναηηδνίγεζ υθα ηα πμθθαπθαζζαγυιεκα ηφηηανα, ακελανηήηςξ ηδξ θάζδξ ημο ηοηηανζημφ ηφηθμο ζηδκ μπμία ιπμνεί κα ανίζημκηαζ. Παναηδνήεδηε εηηεηαιέκμξ ζοκεκημπζζιυξ ηαζ ζηζξ δφμ πενζπηχζεζξ, ηαεχξ θαίκεηαζ υηζ ζπεδυκ ημ 100% ημο πθδεοζιμφ ηυζμ ηςκ Geminin+ υζμ ηαζ ηςκ Cdt1+ ηοηηάνςκ ζοκεηθνάγεζ ημκ δείηηδ Ki67 (ηίηνζκα ηφηηανα), βεβμκυξ πμο οπμδεζηκφεζ υηζ μζ δφμ πνςηεΐκεξ εκημπίγμκηαζ ζε δζαζνμφιεκα πνμβμκζηά κεονζηά ηφηηανα (Δζηυκα 3.3Α-Γ). Παν υθ αοηά, έκα ζδιακηζηυ πμζμζηυ ηςκ Ki67+ ηοηηάνςκ ηδξ ημζθζαηήξ γχκδξ δεκ εηθνάγεζ ηζξ πνςηεΐκεξ Geminin ηαζ Cdt1, ηαεχξ ηα ακηίζημζπα πμζμζηά ζοκεκημπζζιμφ ακένπμκηαζ πενίπμο ζημ 58% βζα ηδκ πενίπηςζδ Ki67/Geminin ηαζ ζημ 31% βζα ηδκ πενίπηςζδ Ki67/Cdt1. Σμ εφνδια αοηυ ζοκάδεζ ιε ηδκ οπυεεζδ υηζ μζ δφμ πνςηεΐκεξ ειθακίγμοκ πνυηοπμ έηθναζδξ ελανηχιεκμ απυ ηζξ θάζεζξ ημο ηοηηανζημφ ηφηθμο. Γζα κα δζενεοκδεεί ζε ιεβαθφηενδ θεπημιένεζα ημ εκδεπυιεκμ αοηυ, πναβιαημπμζήεδηακ πεζνάιαηα δζπθμφ ακμζμθεμνζζιμφ ζοβηνίκμκηαξ ηάεε 108

109 Απμηεθέζιαηα θμνά ηδκ έηθναζδ ηςκ Geminin ηαζ Cdt1 ιε ημ ακηίζημζπμ πνυηοπμ έηθναζδξ δεζηηχκ ηάεε θάζδξ ημο ηοηηανζημφ ηφηθμο. Ανπζηά πνδζζιμπμζήεδηε έκα εζδζηυ ακηίζςια έκακηζ ιζαξ θςζθμνοθζςιέκδξ ιμνθήξ ηδξ πνςηεΐκδξ αζιεκηίκδξ (phosphovimentin, p-vimentin), πμο εκημπίγεηαζ ζηα ηφηηανα πμο ανίζημκηαζ ζηα ζηάδζα πνμιεηάθαζδξ ηαζ ιεηάθαζδξ ηδξ θάζδξ Μ ημο ηοηηανζημφ ηφηθμο (Tsujimura et al., 1994; Kamei et al., 1998). Σα πεζνάιαηα δζπθμφ ακμζμθεμνζζιμφ ιεηαλφ ηδξ p- Vimentin ηαζ ηςκ πνςηεσκχκ Geminin ηαζ Cdt1 έδεζλακ υηζ υθα ηα p-vimentin+ ηφηηανα ηδξ ημζθζαηήξ ηαζ οπμημζθζαηήξ γχκδξ ζοκεηθνάγμοκ Geminin αθθά υπζ Cdt1 (Δζηυκα 3.3Ν-Π). Γζα κα πνμζδζμνζζημφκ ηα θθμζσηά πνμβμκζηά ηφηηανα πμο δζένπμκηαζ απυ ηδκ S ή ηδκ G1 θάζδ ημο ηοηηανζημφ ηφηθμο ηαηαθφβαιε ζε πεζνάιαηα ζήιακζδξ ιε ημ ακάθμβμ ηδξ εοιζδίκδξ 5-ανχιμ-2 -δέμλο-μονζδίκδ (5- bromo-2 -deoxyuridine, BrdU). Δίκαζ βκςζηυ υηζ μ ηοηηανζηυξ ηφηθμξ ηςκ πνμβμκζηχκ ηοηηάνςκ ηδξ ημζθζαηήξ γχκδξ ημο θθμζμφ ειανφςκ ιοχκ δθζηίαξ Δ15.5 δζανηεί πενίπμο 18 χνεξ, απυ ηζξ μπμίεξ δ G1 θάζδ δζανηεί 12 χνεξ, δ S θάζδ 4 χνεξ εκχ ηζξ οπυθμζπεξ 2 χνεξ ηαηαθαιαάκμοκ μζ G2/M θάζεζξ (Takahashi et al., 1995). Ζ ζήιακζδ ηςκ πνμβμκζηχκ ηοηηάνςκ πμο ανίζημκηαζ ζηδκ S θάζδ επζηοβπάκεηαζ εκφμκηαξ ημ ακάθμβμ BrdU ζε έβηομοξ εδθοημφξ ιφεξ δθζηίαξ Δ15.5 ηαζ απμιμκχκμκηαξ ηα έιανοα 30 θεπηά ανβυηενα. Με αοηυκ ημκ ηνυπμ ημ κμοηθεμηζδζηυ ακάθμβμ εκζςιαηχκεηαζ ζημ DNA ηςκ ηοηηάνςκ πμο ανίζημκηαζ εηείκδ ηδ ζηζβιή ζηδκ S θάζδ, επζηνέπμκηαξ έηζζ ηδκ ηαοημπμίδζή ημοξ (Δζηυκα 3.4Α). Οζ πονήκεξ ηςκ ηοηηάνςκ πμο δζένπμκηαζ απυ ηδκ S θάζδ ηαζ έπμοκ ζδιακεεί ιε BrdU εκημπίγμκηαζ ζημ ααζζηυ υνζμ ηδξ ημζθζαηήξ γχκδξ (Sauer and Walker, 1959), ηαζ ζηδκ οπμημζθζαηή γχκδ (Δζηυκα 3.3Ε,Θ, ηυηηζκμ). Πεζνάιαηα δζπθμφ ακμζμθεμνζζιμφ ιε ακηζζχιαηα έκακηζ ηςκ Geminin, Cdt1 ηαζ BrdU ηαηέζηδζακ ειθακέξ υηζ δ πθεζμρδθία ηςκ Geminin+ ηοηηάνςκ ηδξ ημζθζαηήξ γχκδξ ζδιαίκμκηαζ επίζδξ ιε BrdU (68%) αθθά ηαζ υηζ δ πθεζμρδθία ηςκ BrdU+ ηοηηάνςκ εηθνάγεζ επίζδξ Geminin (83%). Δπμιέκςξ, δ πνςηεΐκδ Geminin εηθνάγεηαζ ζηδκ S θάζδ ημο ηοηηανζημφ ηφηθμο. Ακηίεεηα, ηα Cdt1+ ηφηηανα ηδξ ημζθζαηήξ γχκδξ επέδεζλακ ακηίζηνμθμ πνυηοπμ ηαηακμιήξ απυ ηα BrdU ζδιαζιέκα ηφηηανα (ημ πμζμζηυ ζοκεκημπζζιμφ ήηακ 3%) (Δζηυκα 3.3Δ-Θ). Δκ ζοκεπεία ηαζ πνμηεζιέκμο κα πνμζδζμνζζημφκ ηα ηφηηανα ηδξ ημζθζαηήξ γχκδξ ημο θθμζμφ πμο ανίζημκηαζ ζηδ θάζδ G1 ημο ηοηηανζημφ ηφηθμο, εκέζαιε BrdU ζε έβηομοξ εδθοημφξ ιφεξ δθζηίαξ Δ15.5 ηαζ απμιμκχζαιε ηα έιανοα ιεηά απυ 8 χνεξ. Σμ πνμκζηυ αοηυ δζάζηδια είκαζ ανηεηυ χζηε ηα ηφηηανα πμο έπμοκ πνμζθάαεζ ημ κμοηθεμηζδζηυ ακάθμβμ κα έπμοκ πνμπςνήζεζ ζηδ θάζδ G1 (Δζηυκα 3.4Α) (Takahashi et al., 1995; Britz et al., 2006). Σα πεζνάιαηα δζπθμφ ακμζμθεμνζζιμφ ζε αοηήκ ηδκ πενίπηςζδ ηαηέδεζλακ υηζ έκα ιεβάθμ ιένμξ ηςκ ηοηηάνςκ πμο εηθνάγμοκ Cdt1 (πενίπμο ημ 77%) έπμοκ εκζςιαηχζεζ BrdU ηαζ ανίζημκηαζ ζηα πνχηα ζηάδζα ηδξ G1 θάζδξ. Απυ ηδκ άθθδ ιενζά, ιυκμ ημ 3-5% ηςκ Geminin+ ηοηηάνςκ είκαζ ζδιαζιέκα ιε BrdU. Σα δζπθά εεηζηά αοηά ηφηηανα εκημπίγμκηαζ ηονίςξ ζημ ηαηχηενμ ζδιείμ ηδξ ημζθζαηήξ γχκδξ, 109

110 Απμηεθέζιαηα Δηθόλα 3.3. Πεξηνδηθή έθθξαζε ηωλ Geminin θαη Cdt1 ζηα πξνγνληθά θύηηαξα ηνπ θινηνύ αλάινγα κε ηε θάζε ηνπ θπηηαξηθνύ θύθινπ. Φσηνγξαθίεο ζπλεζηηαθήο κηθξνζθνπίαο ζε ηνκέο θινηνύ Δ15.5 εκβξύσλ κπόο. (Α-Γ) Πεηξάκαηα δηπινύ αλνζνθζνξηζκνύ κε αληηζώκαηα γηα ηηο πξσηεΐλεο Geminin (πξάζηλν, Α,Β), Cdt1 (πξάζηλν, Γ,Γ) θαη Ki67 (θόθθηλν) έδεημαλ όηη νη δύν πξσηεΐλεο εθθξάδνληαη ζε ελεξγώο δηαηξνύκελα θύηηαξα. (Δ-Μ) Δλζσκάησζε ηνπ αλαιόγνπ BrdU δηάξθεηαο 30 ιεπηώλ απνθαιύπηεη ηα θύηηαξα πνπ βξίζθνληαη ζηελ S θάζε ηνπ θπηηαξηθνύ θύθινπ (θόθθηλν, Δ-Θ), ελώ ελζσκάησζε BrdU γηα 8 ώξεο ππνδειώλεη ηα θύηηαξα πνπ βξίζθνληαη ζηελ G1 (θόθθηλν, Η-Μ). Ζ Geminin εθθξάδεηαη θπξίσο ζηα θύηηαξα πνπ βξίζθνληαη ζηελ S θάζε (Ε) ελώ ε Cdt1 ζηα θύηηαξα πνπ δηέξρνληαη από ηελ G1 (Μ). (Ν-Π) Πεηξάκαηα δηπινύ αλνζνθζνξηζκνύ κε ηνλ δείθηε ηεο κίησζεο pvimentin (θόθθηλν, Ν-Π) απνθάιπςαλ όηη ηα θύηηαξα πνπ βξίζθνληαη ζηελ Μ θάζε εθθξάδνπλ Geminin (Ξ) αιιά όρη Cdt1 (Π). ΚΕ, θνηιηαθή δώλε. ΤΚΕ, ππνθνηιηαθή δώλε. 110

111 Απμηεθέζιαηα δίπθα αηνζαχξ απυ ηδκ πθάβζα ημζθία, υπμο είκαζ βκςζηυ υηζ εδνάγμκηαζ ηα ηφηηανα πμο δζένπμκηαζ απυ ηδκ Μ θάζδ, έηζζ είκαζ πμθφ πζεακυ αοηά ηα ηφηηανα κα ιδκ έπμοκ εζζέθεεζ αηυια ζηδκ G1 θάζδ αθθά κα ανίζημκηαζ αηυια ζημ ζηάδζμ ηδξ ιίηςζδξ (Δζηυκα 3.3Η-Μ). Σα απμηεθέζιαηά ιαξ δείπκμοκ υηζ μζ πνςηεΐκεξ Geminin ηαζ Cdt1 εηθνάγμκηαζ πενζμδζηά ζηα πνμβμκζηά, πμθθαπθαζζαγυιεκα ηφηηανα ηδξ ημζθζαηήξ γχκδξ ημο ακαπηοζζυιεκμο εβηεθαθζημφ θθμζμφ, ζδιαίκμκηαξ ηα ηφηηανα πμο ανίζημκηαζ ζηζξ S/G2/M ηαζ G1 θάζεζξ ημο ηοηηανζημφ ηφηθμο ακηίζημζπα (Δζηυκα 3.4Β). Δπζπνυζεεηα, ηα επίπεδα έηθναζήξ ημοξ ιεζχκμκηαζ ζδιακηζηά ζηα πνυδνμια ηφηηανα πμο έπμοκ εκενβμπμζήζεζ ημοξ ιδπακζζιμφξ κεονςκζηήξ δζαθμνμπμίδζδξ. Δηθόλα 3.4. ρεκαηηθή απεηθόληζε ηνπ πεξηνδηθνύ πξνηύπνπ έθθξαζεο ηωλ πξωηεϊλώλ Geminin θαη Cdt1. (Α) ηα πξνγνληθά θύηηαξα ηεο θνηιηαθήο δώλεο ηνπ θινηνύ εκβξύσλ κπόο ειηθίαο Δ15.5 ε S θάζε δηαξθεί 4 ώξεο, νη θάζεηο G2/M δηαξθνύλ 2 ώξεο ελώ ε G1 δηαξθεί 12 ώξεο (Takahashi et al., 1995). Όηαλ ε απνκόλσζε ησλ εκβξύσλ γίλεηαη 30 ιεπηά κεηά ηε ρνξήγεζε ηνπ λνπθιενηηδηθνύ αλαιόγνπ BrdU, ηα θύηηαξα πνπ ην ελζσκαηώλνπλ βξίζθνληαη εθείλε ηε ζηηγκή ζηελ S θάζε. Όηαλ ε απνκόλσζε ησλ εκβξύσλ γίλεηαη 8 ώξεο κεηά ηελ έλεζε ηνπ BrdU, ηόηε ηα θύηηαξα πνπ ην ελζσκάησζαλ ζην DNA ηνπο έρνπλ πξνρσξήζεη θαη έρνπλ θηάζεη ζηα πξώηα ζηάδηα ηεο G1 θάζεο. Ζ πξσηεΐλε p-vimentin είλαη δείθηεο θπηηάξσλ πνπ βξίζθνληαη ζηε κίησζε ελώ ν παξάγνληαο Ki67 εθθξάδεηαη θαζ όιε ηε δηάξθεηα ηνπ θπηηαξηθνύ θύθινπ. (Β) Ζ ζπλδπαζκέλε ρξήζε ησλ παξαπάλσ δεηθηώλ έδεημε όηη ε πξσηεΐλε Geminin εθθξάδεηαη ζηηο θάζεηο S/G2/M ηνπ θπηηαξηθνύ θύθινπ ελώ ε πξσηεΐλε Cdt1 ζηε θάζε G1. 111

112 Απμηεθέζιαηα 3.2 Τπεξέθθξαζε ηεο πξσηεΐλεο Geminin ζηα λεπξηθά πξνγνληθά θύηηαξα ηνπ αλαπηπζζόκελνπ εγθεθαιηθνύ θινηνύ ηνπ κπόο Σα ιέπνζ ηχνα απμηεθέζιαηά ιαξ δείπκμοκ υηζ δ πνςηεΐκδ Geminin εηθνάγεηαζ ζηα πνμβμκζηά, αδζαθμνμπμίδηα ηφηηανα ημο εβηεθαθζημφ θθμζμφ ηαζ ιάθζζηα ηαηά πενζμδζηυ ηνυπμ, παναηηδνίγμκηαξ ηα ηφηηανα πμο ανίζημκηαζ ζηζξ θάζεζξ S/G2/M ημο ηοηηανζημφ ηφηθμο. Δπζπθέμκ, ηα επίπεδα έηθναζδξ ηδξ πνςηεΐκδξ ιεζχκμκηαζ αζζεδηά ζηα ηφηηανα πμο έπμοκ πνμηαεμνζζηεί πνμξ κεονςκζηή δζαθμνμπμίδζδ. Σα εονήιαηα αοηά οπμζηδνίγμοκ έκακ πζεακυ νυθμ ηδξ Geminin ζηδ νφειζζδ ηςκ δζαθυνςκ θεζημονβζχκ ηςκ κεονζηχκ πνμβμκζηχκ ηοηηάνςκ ημο θθμζμφ, υπςξ βζα πανάδεζβια ηδξ ζηακυηδηαξ αοημ-ακακέςζήξ, ηδξ ιεηάααζδξ ιεηαλφ ηςκ δζαθυνςκ πνμβμκζηχκ θθμζσηχκ πθδεοζιχκ αθθά ηαζ ηδξ ηεθζηήξ δζαθμνμπμίδζήξ ημοξ Γεκηνπξγία πιαζκηδηαθώλ θνξέσλ πνπ επηηξέπνπλ ηελ ππεξέθθξαζε ηνπ κνξίνπ ηεο Geminin ζηα πξνγνληθά θύηηαξα ηεο θνηιηαθήο δώλεο ηνπ θινηνύ Πνμηεζιέκμο κα δζενεοκδεεί μ θεζημονβζηυξ νυθμξ ηδξ Geminin ζηα αδζαθμνμπμίδηα πνμβμκζηά ηφηηανα ημο ακαπηοζζυιεκμο εβηεθαθζημφ θθμζμφ δζεκενβήεδηακ πεζνάιαηα οπενέηθναζδξ ηδξ πνςηεΐκδξ ζηα ζοβηεηνζιέκα ηφηηανα ιε ηδκ ηεπκζηή ηδξ δθεηηνμδζαιυθοκζδξ ex vivo, δ μπμία επζηνέπεζ ηδ δζαιυθοκζδ εκυξ ζοβηεηνζιέκμο ζζημφ ιε εζδζηυ υπδια έηθναζδξ πμο πενζέπεζ ηδκ πνςηεΐκδ πμο εέθμοιε κα οπενεηθνάζμοιε. Σμ υπδια έηθναζδξ πμο πνδζζιμπμζήεδηε ζηα πεζνάιαηα αοηά ήηακ μ θμνέαξ pcaggs, μ μπμίμξ πενζθαιαάκεζ ημ βμκίδζμ ηδξ εκζζποιέκδξ πνάζζκδξ θεμνίγμοζαξ πνςηεΐκδξ (enhanced green fluorescent protein, GFP) ηθςκμπμζδιέκδ ζημ 3 άηνμ εκυξ εζςηενζημφ νζαμζςιζημφ ζδιείμο εζζυδμο (internal ribosome entry site, IRES) (Δζηυκα 3.5Α) (Hand et al., 2005; Nguyen et al., 2006). ε αοηυ ημ ανπζηυ υπδια έηθναζδξ ηθςκμπμζήεδηακ ηνεζξ δζαθμνεηζηέξ ιμνθέξ ημο βμκζδίμο ηδξ Geminin ζημ 5 άηνμ ημο IRES-GFP (Δζηυκα 3.5), βεβμκυξ πμο ζδιαίκεζ υηζ δ ιεηάθναζδ ηδξ εηάζημηε ιμνθήξ ημο ιμνίμο ηδξ Geminin βίκεηαζ ακελάνηδηα απυ ηδ ιεηάθναζδ ηδξ πνςηεΐκδξ GFP, δ μπμία εθέβπεηαζ απυ ημ εζςηενζηυ νζαμζςιζηυ ζδιείμ εζζυδμο παν υθ αοηά, ηα δφμ βεβμκυηα ζοιααίκμοκ ηαοηυπνμκα ηαζ ζηα ίδζα ηφηηανα. Οζ ιμνθέξ ημο βμκζδίμο ηδξ Geminin πμο ηθςκμπμζήεδηακ ζημ υπδια έηθναζδξ ήηακ μζ ελήξ: δ αβνίμο ηφπμο ιμνθή ημο βμκζδίμο (wt Geminin, Δζηυκα 3.5Β), ιζα ιμνθή ηδξ Geminin πμο είκαζ εκενβή ζε υθεξ ηζξ θάζεζξ ημο ηοηηανζημφ ηφηθμο, δ μπμία ηαηαζηεοάζηδηε ελαθείθμκηαξ ηδκ αθθδθμοπία απμζημδυιδζδξ ηδξ πνςηεΐκδξ δ μπμία νοειίγεζ ηδκ πενζμδζηή έηθναζή ηδξ (N-Deletion Geminin-IRES- GFP, Δζηυκα 3.5Γ), ηαζ δ ιμνθή ημο ιμνίμο ηδξ Geminin πμο δεκ πενζέπεζ ηδκ 112

113 Απμηεθέζιαηα πενζμπή αθθδθεπίδναζδξ ιε ημκ πανάβμκηα Brg1 (Roukos et al., 2007) (Γ-Brg1 Geminin-IRES-GFP, Δζηυκα 3.5Γ). Χξ ιάνηοναξ ζηα πεζνάιαηα αοηά πνδζζιμπμζήεδηε δ οπενέηθναζδ ημο μπήιαημξ πμο πενζείπε ιυκμ ηδκ GFP πνςηεΐκδ. Δκφμκηαξ ηα παναπάκς μπήιαηα έηθναζδξ ζηζξ πθάβζεξ ημζθίεξ ημο εβηεθάθμο ειανφςκ ιουξ δθζηίαξ Δ14.5 ηαζ εθανιυγμκηαξ ηαηάθθδθδ ηάζδ, ηα ανκδηζηά θμνηζζιέκα μπήιαηα ηαηεοεφκμκηαζ πνμξ ημκ θθμζυ. Με αοηυκ ημκ ηνυπμ επζηοβπάκεηαζ δ δζαιυθοκζδ ηςκ πνμβμκζηχκ ηοηηάνςκ ημο ακαπηοζζυιεκμο θθμζμφ, Δηθόλα 3.5. ρεκαηηθή απεηθόληζε ηωλ νρεκάηωλ έθθξαζεο πνπ ρξεζηκνπνηήζεθαλ ζηα πεηξάκαηα ex vivo ειεθηξνδηακόιπλζεο. (Α) Σν όρεκα pcaggs πεξηιακβάλεη έλα εζσηεξηθό ξηβνζσκηθό ζεκείν εηζόδνπ (internal ribosome entry site, IRES) πνπ ειέγρεη ηε κεηάθξαζε ηεο πξάζηλεο θζνξίδνπζαο πξσηεΐλεο (green fluorescent protein, GFP). (Β-Γ) ην 5 άθξν ηεο αιιεινπρίαο IRES θισλνπνηήζεθαλ ηξεηο δηαθνξεηηθέο κνξθέο ηνπ κνξίνπ ηεο Geminin, ε αγξίνπ ηύπνπ κνξθή ηεο πξσηεΐλεο (wt Geminin, Β), κηα κνξθή ηεο πξσηεΐλεο από ηελ νπνία απνπζηάδεη ε αιιεινπρία απνηθνδόκεζεο (N-deletion Geminin, Γ) θαη κηα κνξθή ηεο Geminin ε νπνία δελ κπνξεί λα αιιειεπηδξάζεη κε ηνλ παξάγνληα Brg1 (Γ-Brg1 Geminin, Γ). 113

114 Απμηεθέζιαηα βεβμκυξ πμο μδδβεί ζηδκ οπενέηθναζδ ηδξ εηάζημηε ιμνθήξ ηδξ Geminin εζδζηά ζε αοηά ηα ηφηηανα. Σμιέξ 300 ιm απυ ημοξ εβηεθάθμοξ αοηχκ ηςκ ειανφςκ δζαηδνμφκηαζ ζηδ ζοκέπεζα ζε ηαθθζένβεζα βζα 2 ιένεξ (Δζηυκα 3.6). Με αοηυκ ημκ ηνυπμ επζηοβπάκεηαζ δ ζοκέπζζδ ηδξ ακαπηολζαηήξ δζαδζηαζίαξ ζημ θθμζυ, δίκμκηαξ ηδ δοκαηυηδηα παναημθμφεδζδξ ηςκ επζπηχζεςκ πμο πζεακχξ έπεζ δ οπενέηθναζδ ηδξ εηάζημηε ιμνθήξ ηδξ πνςηεΐκδξ ζηζξ δζαδζηαζίεξ αοημ-ακακέςζδξ ηαζ κεονςκζηήξ δζαθμνμπμίδζδξ ηςκ πνμβμκζηχκ θθμζσηχκ ηοηηάνςκ. Δηθόλα 3.6. ρεκαηηθή απεηθόληζε ηνπ πεηξάκαηνο ειεθηξνδηακόιπλζεο. (Α,Β) Σν όρεκα έθθξαζεο πνπ πεξηέρεη ηελ θαηάιιειε κνξθή ηεο πξσηεΐλεο πνπ ππεξεθθξάδνπκε ελύεηαη ζηηο πιάγηεο θνηιίεο ηνπ εγθεθάινπ ελόο εκβξύνπ κπόο ειηθίαο Δ14.5. Σν δηάιπκα ηνπ DNA αλακηγλύεηαη κε ρξσζηηθή ώζηε λα δηεπθνιύλεηαη ε παξαηήξεζε ηεο δηαδηθαζίαο. Με ηελ εθαξκνγή ειεθηξηθήο ηάζεο θαηεπζύλνπκε ην DNA πξνο ηνλ εγθεθαιηθό θινηό. (Γ) ηε ζπλέρεηα ν εγθέθαινο ηέκλεηαη ζε θέηεο πάρνπο 300κm νη νπνίεο δηαηεξνύληαη ζε θαιιηέξγεηα γηα δύν εκέξεο ώζηε λα ζπλερηζηεί ε αλάπηπμε ηνπ θινηνύ. ην δηάζηεκα απηό ηα θινητθά θύηηαξα έρνπλ πξνζιάβεη ην όρεκα έθθξαζεο θαη έρνπλ ήδε αξρίζεη λα εθθξάδνπλ ηελ πξσηεΐλε πνπ ζέινπκε λα ππεξεθθξάζνπκε αιιά θαη ηελ πξσηεΐλε GFP κε απνηέιεζκα ην θζνξηζκό ηνπο. Ανπζηχξ πζζημπμζήεδηε δ ζοκέηθναζδ ηδξ πνςηεΐκδξ GFP ιε ηζξ δζάθμνεξ ιμνθέξ ημο ιμνίμο ηδξ Geminin. Γζα ημ ζημπυ αοηυ πναβιαημπμζήεδηακ πεζνάιαηα δζπθμφ ακμζμθεμνζζιμφ ιε εζδζηά ακηζζχιαηα έκακηζ ηςκ πνςηεσκχκ GFP ηαζ Geminin ζε ιεηςπζαίεξ ημιέξ θθμζμφ απυ εβηεθάθμοξ πμο είπακ δζαιμθοκεεί ιε ηαεέκα απυ ηα ηέζζενα μπήιαηα έηθναζδξ (Δζηυκα 3.7). ε υθεξ ηζξ πενζπηχζεζξ δ ζοκηνζπηζηή πθεζμρδθία ηςκ ηοηηάνςκ πμο εηθνάγμοκ ηδκ πνςηεΐκδ GFP έπμοκ επίζδξ εεηζηή πνχζδ ηαζ βζα ηδκ Geminin (ηα πμζμζηά ζοκεκημπζζιμφ ακένπμκηαζ ζημ 95,6% ζηδκ ηαηάζηαζδ εθέβπμο, ζημ 87% ζηδκ πενίπηςζδ ηδξ ιμνθήξ wt Geminin, ζημ 89,1% ζηδκ πενίπηςζδ ηδξ ιμνθήξ N-del Geminin ηαζ ζημ 89,2% ζηδκ πενίπηςζδ ηδξ ιμνθή Γ-Brg1 Geminin) εκχ ζζπφεζ ηαζ ημ ακηίζηνμθμ, ημ ζφκμθμ ζπεδυκ ηςκ Geminin+ ηοηηάνςκ κα ζοκεηθνάγμοκ ηαζ ηδκ πνςηεΐκδ GFP (ηίηνζκα 114

115 Απμηεθέζιαηα Δηθόλα 3.7. Έιεγρνο ηνπ ζπλεληνπηζκνύ ηωλ πξωηεϊλώλ Geminin θαη GFP ζηα πεηξάκαηα ειεθηξνδηακόιπλζεο ex vivo. Φσηνγξαθίεο ζπλεζηηαθήο κηθξνζθνπίαο από πεηξάκαηα δηπινύ αλνζνθζνξηζκνύ ζε κεησπηαίεο ηνκέο θινηνύ κε εηδηθά αληηζώκαηα γηα ηηο πξσηεΐλεο GFP (πξάζηλν) θαη Geminin (θόθθηλν) γηα ηελ πηζηνπνίεζε ηνπ ζπλεληνπηζκνύ ηνπο κεηά ηελ ππεξέθθξαζε ηεο θαηάζηαζεο ειέγρνπ (Α-Γ) θαη ησλ κνξθώλ wt Geminin (Δ-Θ), N-del Geminin (Η-Μ) θαη Γ-Brg1 Geminin (Ν-Π). Οη ππξήλεο ησλ θπηηάξσλ απεηθνλίδνληαη κε κπιε κεηά από ρξώζε κε ηε ρξσζηηθή Σoto-3. Όπσο θαίλεηαη ζηηο εηθόλεο Γ,Θ,Μ,Π, ε ζπλέθθξαζε ησλ δύν πξσηετλώλ είλαη ζρεδόλ πιήξεο ζε όιεο ηηο πεξηπηώζεηο. Γίλεηαη επίζεο εκθαλήο ε αύμεζε ζηα επίπεδα έθθξαζεο ηεο πξσηεΐλεο Geminin κεηά ηελ ειεθηξνδηακόιπλζε κε ηα νρήκαηα έθθξαζεο (ζύγθξηζε ησλ Ε,Κ,Ξ κε ηελ θαηάζηαζε ειέγρνπ Β). ΚΕ, θνηιηαθή δώλε. 115

116 Απμηεθέζιαηα ηφηηανα ζηζξ Γ,Θ,Μ,Π). Σμ απμηέθεζια αοηυ δείπκεζ υηζ μζ πνςηεΐκεξ GFP ηαζ Geminin εηθνάγμκηαζ ζηα ίδζα ηφηηανα ηαεζζηχκηαξ αζθαθή ηδ πνδζζιμπμίδζδ ημο θεμνζζιμφ ηδξ GFP πνςηεΐκδξ βζα ηδκ ηαοημπμίδζδ ηςκ ηοηηάνςκ πμο έπμοκ δζαιμθοκεεί ιε ηα μπήιαηα έηθναζδξ ηαζ οπενεηθνάγμοκ ηζξ εηάζημηε ιμνθέξ ημο ιμνίμο ηδξ Geminin. Σμ δεφηενμ αήια ήηακ κα εθέβλμοιε ακ δ οπενέηθναζδ ηςκ δζαθυνςκ ιμνθχκ ηδξ πνςηεΐκδξ Geminin ιεηααάθθεζ ηδκ επζαίςζδ ηςκ ηοηηάνςκ πμο δζαιμθφκμκηαζ. Βζαθζμβναθζηά δεδμιέκα απυ πεζνάιαηα ζε ηοηηανζηέξ ζεζνέξ ηαζ ζηδ Drosophila melanogaster έπμοκ δείλεζ υηζ δ οπενέηθναζδ ηδξ Geminin ζηα παναπάκς αζμθμβζηά ζοζηήιαηα έπεζ πνμηαθέζεζ δζαηαναπέξ ζηδκ ελέθζλδ ημο ηοηηανζημφ ηφηθμο ηαζ έπεζ μδδβήζεζ ηα ηφηηανα πνμξ απυπηςζδ (Quinn et al., 2001; Shreeram et al., 2002). Γζα ημκ έθεβπμ ηδξ επζαίςζδξ ηςκ ηοηηάνςκ πναβιαημπμζήεδηακ πεζνάιαηα δζπθμφ ακμζμθεμνζζιμφ ιε εζδζηά ακηζζχιαηα έκακηζ ηςκ πνςηεσκχκ GFP ηαζ ηδξ εκενβμπμζδιέκδξ Caspase3 ζε ημιέξ θθμζχκ πμο είπακ δζαιμθοκεεί ιε ημ ηάεε υπδια έηθναζδξ (Δζηυκα 3.8). Ζ εκενβμπμζδιέκδ Caspase3 είκαζ έκα απυ ηα εηηεθεζηζηά ιυνζα ηδξ δζαδζηαζίαξ ηδξ απυπηςζδξ ηαζ ηαηαθφεζ ηδκ πνςηεμθοηζηή δζάζπαζδ πμθθχκ ζδιακηζηχκ ηοηηανζηχκ πνςηεσκχκ (Porter and Janicke, 1999). Ζ αλζμθυβδζδ ηςκ πζεακχκ απμπηςηζηχκ επζπηχζεςκ ηδξ οπενέηθναζδξ ηδξ Geminin επζηοβπάκεηαζ ιε ηδκ πμζμηζημπμίδζδ ημο πμζμζημφ ηςκ GFP+ ηοηηάνςκ πμο ζοκεηθνάγεζ ημκ πανάβμκηα Caspase3 ηαζ ηδ ζφβηνζζδ ημο πμζμζημφ αοημφ ιε ημ ακηίζημζπμ ηδξ ηαηάζηαζδξ εθέβπμο. Σα απμηεθέζιαηα ηςκ παναπάκς πεζναιάηςκ έδεζλακ υηζ ιεηά ηδκ οπενέηθναζδ ηςκ wt Geminin, N-del Geminin ηαζ Γ-Brg1 Geminin οπάνπμοκ πνάβιαηζ ηάπμζα GFP+ ηφηηανα ηα μπμία έπμοκ ανπίζεζ κα απμπίπημοκ (Δζηυκα 3.8Γ,Ε,Θ ηίηνζκα ηφηηανα). Ζ πμζμηζημπμίδζδ ημο πθδεοζιμφ ηςκ GFP+ ηοηηάνςκ πμο εηθνάγεζ ημκ απμπηςηζηυ δείηηδ έδεζλε ζοβηνίζζια πμζμζηά απυπηςζδξ ιε ηδκ ηαηάζηαζδ εθέβπμο (Δζηυκα 3.8Η,Κ). Σα πμζμζηά ηςκ απμπηςηζηχκ ηοηηάνςκ ακένπμκηαζ ζημ 9,8%, 8%, 19,2% ηαζ 13,8% βζα ηζξ πενζπηχζεζξ οπενέηθναζδξ ηςκ πνςηεσκχκ GFP, wt Geminin, N-del Geminin ηαζ Γ-Brg1 Geminin ακηίζημζπα. οιπεναίκμοιε υηζ δ οπενέηθναζδ ηδξ πνςηεΐκδξ Geminin ζηα πνμβμκζηά ηφηηανα ημο εβηεθαθζημφ θθμζμφ δεκ μδδβεί ζε ηάπμζα ζηαηζζηζηχξ ζδιακηζηή αφλδζδ ημο ηοηηανζημφ εακάημο. 116

117 Απμηεθέζιαηα Δηθόλα 3.8. Η ππεξέθθξαζε ηεο Geminin ζηα πξνγνληθά θύηηαξα ηνπ θινηνύ δελ απμάλεη ηελ απόπηωζε. Αλάιπζε κε ζπλεζηηαθή κηθξνζθνπία πεηξακάησλ δηπινύ αλνζνθζνξηζκνύ ζε ηνκέο θινηνύ από θάζε θαηάζηαζε ππεξέθθξαζεο ηεο πξσηεΐλεο Geminin κε εηδηθά αληηζώκαηα γηα ηηο πξσηεΐλεο GFP (πξάζηλν) θαη Caspase3 (θόθθηλν), ελόο εηδηθνύ απνπησηηθνύ δείθηε. Ζ απεηθόληζε ησλ ππξήλσλ ησλ θπηηάξσλ έγηλε κε ηε ρξσζηηθή Σoto-3 (κπιε). Όπσο θαίλεηαη από ηηο εηθόλεο Β,Γ,Ε,Θ θαη ην ηζηόγξακκα Η, ε ππεξέθθξαζε ησλ δηαθνξεηηθώλ νρεκάησλ έθθξαζεο ηεο πξσηεΐλεο Geminin δελ πξνθαιεί πεξαηηέξσ θπηηαξηθό ζάλαην ζηα θύηηαξα πνπ δηακνιύλζεθαλ. Ο πίλαθαο Κ απεηθνλίδεη ηηο αληίζηνηρεο πνζνηηθνπνηήζεηο, ελώ ζηηο παξελζέζεηο αλαθέξνληαη νη ζπλνιηθνί αξηζκνί GFP θαη Caspase3 ζεηηθώλ θπηηάξσλ πνπ κεηξήζεθαλ. ΤΚΕ, ππνθνηιηαθή δώλε. ΚΕ, θνηιηαθή δώλε. Σα δεδνκέλα απνδίδνληαη σο κέζνο όξνο ± SD. n=3. 117

118 Απμηεθέζιαηα Ζ ππεξέθθξαζε ηεο Geminin ζην θινηό κεηώλεη ηνπο αξηζκνύο ησλ Sox2+ πξνγνληθώλ θπηηάξσλ ηεο θνηιηαθήο δώλεο θαη Tbr2+ πξόδξνκσλ θπηηάξσλ ηεο ππνθνηιηαθήο δώλεο Ο ζπδιαηζζιυξ ημο εβηεθαθζημφ θθμζμφ ηαεμδδβείηαζ απυ δφμ δζαθμνεηζημφξ πθδεοζιμφξ πνμβμκζηχκ ηοηηάνςκ, ηα ημνοθαία πνμβμκζηά κεονζηά ηφηηανα ηδξ ημζθζαηήξ γχκδξ πμο πενζθαιαάκμοκ ηα κεονμεπζεδθζαηά ηφηηανα ηαζ ηα ηφηηανα ηδξ αηηζκςηήξ βθμίαξ, ηαζ ηα ααζζηά πνυδνμια ηφηηανα ηδξ οπμημζθζαηήξ γχκδξ πμο πνμένπμκηαζ απυ ηζξ αζφιιεηνεξ δζαζνέζεζξ ηςκ ημνοθαίςκ ηοηηάνςκ (Haubensak et al., 2004; Gotz and Huttner, 2005; Kriegstein et al., 2006). Πνχημξ ζηυπμξ ζηδκ ακάθοζδ ηςκ πεζναιάηςκ οπενέηθναζδξ ηδξ Geminin ζημκ θθμζυ ήηακ δ δζενεφκδζδ πζεακχκ επζδνάζεχκ ηδξ ζε αοημφξ ημοξ πθδεοζιμφξ πνμβμκζηχκ ηοηηάνςκ. Πναβιαημπμζήεδηακ πεζνάιαηα δζπθμφ ακμζμθεμνζζιμφ ζε ιεηςπζαίεξ ημιέξ θθμζμφ, ζηζξ μπμίεξ είπακ οπενεηθναζηεί ηα ηέζζενα μπήιαηα έηθναζδξ, πνδζζιμπμζχκηαξ εζδζηά ακηζζχιαηα έκακηζ ηςκ πνςηεσκχκ GFP ηαζ Sox2, δ έηθναζδ ηδξ μπμίαξ παναηηδνίγεζ ηα κεονζηά πνμβμκζηά ηφηηανα ημο θθμζμφ (Zappone et al., 2000; Graham et al., 2003) (Δζηυκα 3.9). ηυπμξ ιαξ ήηακ κα ελεηάζμοιε πθδεοζιμφξ ηοηηάνςκ πμο εκημπίγμκηαζ ζε δζαθμνεηζηέξ ζζημθμβζηέξ γχκεξ ζημ θθμζυ, εκχ μζ ιεηνήζεζξ ιαξ αθμνμφζακ ηδκ ηάεε ιία ηέημζα γχκδ πςνζζηά. Σμ πμζμζηυ ηςκ GFP+/Sox2+ ηοηηάνςκ ηδξ ημζθζαηήξ γχκδξ ζηδκ ηαηάζηαζδ εθέβπμο ακένπεηαζ πενίπμο ζημ 86%. Ζ ακηίζημζπδ πμζμηζημπμίδζδ ζηζξ πενζπηχζεζξ οπενέηθναζδξ ηςκ wt Geminin, N-del Geminin ηαζ Γ-Brg1 Geminin έδεζλε υηζ ημ πμζμζηυ ηςκ GFP+/Sox2+ ηοηηάνςκ ηδξ ημζθζαηήξ γχκδξ ακένπεηαζ πενίπμο ζημ 69%, 36% ηαζ 72% ακηίζημζπα, οπμδεζηκφμκηαξ υηζ δ οπενέηθναζδ ηδξ Geminin εζδζηά ζημκ θθμζυ έπεζ ςξ απμηέθεζια ηδκ ζηαηζζηζηχξ ζδιακηζηή ιείςζδ ηςκ πνμβμκζηχκ ηοηηάνςκ ηδξ ημζθζαηήξ γχκδξ. Δπεζδή ηα ααζζηά πνυδνμια ηφηηανα πνμένπμκηαζ απυ ηα ημνοθαία πνμβμκζηά ηφηηανα ηδξ ημζθζαηήξ γχκδξ, δζενεοκήζαιε ημ απμηέθεζια ηδξ οπενέηθναζδξ ηδξ Geminin ζε αοηυκ ημκ πθδεοζιυ πνυδνμιςκ ηοηηάνςκ. Οζ πμζμηζημπμζήζεζξ ηςκ ηοηηάνςκ ηδξ οπμημζθζαηήξ γχκδξ πμο ζοκεηθνάγμοκ ηζξ πνςηεΐκεξ GFP ηαζ Sox2 έδεζλακ υηζ μ ανζειυξ ηςκ πνυδνμιςκ αοηχκ ηοηηάνςκ δεκ ιεηααάθθεηαζ ιεηά ηδκ οπενέηθναζδ ηδξ Geminin ζημκ ακαπηοζζυιεκμ θθμζυ (Δζηυκα 3.9 δζάβναιια Η). Γζα ηδκ πεναζηένς δζενεφκδζδ ηδξ πζεακήξ επίδναζδξ ηδξ πνςηεΐκδξ Geminin ζηδ δδιζμονβία ηςκ πνυδνμιςκ ηοηηάνςκ ηδξ οπμημζθζαηήξ γχκδξ ημο θθμζμφ, πναβιαημπμζήεδηακ πεζνάιαηα δζπθμφ ακμζμθεμνζζιμφ ιε εζδζηά ακηζζχιαηα βζα ηζξ πνςηεΐκεξ GFP ηαζ Tbr2. Πμζμηζημπμζήεδηε μ πθδεοζιυξ ηςκ GFP+ ηοηηάνςκ πμο ζοκεηθνάγεζ ημκ ιεηαβναθζηυ πανάβμκηα Tbr2, μ μπμίμξ παναηηδνίγεζ ηα πνυδνμια ηφηηανα ηδξ οπμημζθζαηήξ γχκδξ ηαεχξ ηαζ ηα ηφηηανα ηδξ ημζθζαηήξ γχκδξ πμο έπμοκ ανπίζεζ κα ιεηαζπδιαηίγμκηαζ ζε ααζζηά πνυδνμια ηφηηανα (Englund et al., 118

119 Απμηεθέζιαηα 2005). ε αοηήκ ηδκ πενίπηςζδ παναηδνήεδηε ζηαηζζηζηχξ ζδιακηζηή ιείςζδ ημο πθδεοζιμφ ηςκ GFP+Tbr2+ ηοηηάνςκ ζηδκ πενίπηςζδ ηδξ οπενέηθναζδξ ηςκ μπδιάηςκ πμο πενζείπακ ηζξ ιμνθέξ wt Geminin ηαζ N-del Geminin, απυ 30% πμο Δηθόλα 3.9. Η ππεξέθθξαζε ηεο πξωηεΐλεο Geminin νδεγεί ζηε κείωζε ηωλ πξνγνληθώλ λεπξηθώλ θπηηάξωλ ηεο θνηιηαθήο δώλεο. Πεηξάκαηα δηπινύ αλνζνθζνξηζκνύ ζε ηνκέο θινηνύ ζηηο νπνίεο έρνπκε ππεξεθθξάζεη ηηο πξσηεΐλεο GFP (Α-Β), wt Geminin (Γ-Γ), N-del Geminin (Δ-Ε) θαη Γ-Brg1 Geminin (Ζ-Θ). Υξεζηκνπνηήζεθαλ εηδηθά αληηζώκαηα έλαληη ησλ πξσηετλώλ GFP (πξάζηλν) θαη Sox2 (θόθθηλν). Ζ αλάιπζε ησλ πεηξακάησλ έγηλε κε ζπλεζηηαθή κηθξνζθνπία. Ζ ρξσζηηθή Σoto-3 ρξεζηκνπνηήζεθε γηα ηελ απεηθόληζε ησλ ππξήλσλ (κπιε). Ζ πνζνηηθνπνίεζε ηνπ πιεζπζκνύ GFP+Sox2+ θπηηάξσλ ζηηο ηέζζεξηο πεξηπηώζεηο θαηέδεημε όηη, ζε ζρέζε κε ηελ θαηάζηαζε ειέγρνπ, ε ππεξέθθξαζε θαη ησλ ηξηώλ κνξθώλ ηνπ κνξίνπ ηεο Geminin έρεη σο απνηέιεζκα ηε κείσζε ηνπ αξηζκνύ ησλ πξνγνληθώλ θπηηάξσλ ηεο θνηιηαθήο αιιά όρη ηεο ππνθνηιηαθήο δώλεο (δηάγξακκα Η θαη πίλαθαο Κ). Οη παξελζέζεηο ζηνλ πίλαθα Κ παξαζέηνπλ ηνπο αξηζκνύο ησλ GFP θαη Sox2 ζεηηθώλ θπηηάξσλ πνπ κεηξήζεθαλ. ΤΚΕ, ππνθνηιηαθή δώλε. ΚΕ, θνηιηαθή δώλε. Σα δεδνκέλα απνδίδνληαη σο κέζνο όξνο ± SD. n=4, *p

120 Απμηεθέζιαηα ήηακ ημ πμζμζηυ ζηδκ ηαηάζηαζδ εθέβπμο ζε 18,3% ηαζ 18,2% ακηίζημζπα (Δζηυκα 3.10). Ακηίεεηα, δεκ παναηδνήεδηε ηάπμζα δζαθμνά ζηδκ πενίπηςζδ οπενέηθναζδξ ηδξ ιμνθήξ ηδξ Geminin πμο δεκ δζαηδνεί ηδκ πενζμπή αθθδθεπίδναζδξ ιε ημκ πανάβμκηα Brg1, ηαεχξ ημ πμζμζηυ ημο πθδεοζιμφ ηςκ GFP+Tbr2+ ηοηηάνςκ (30,3%) ήηακ πανυιμζμ ιε αοηυ ηδξ ηαηάζηαζδξ εθέβπμο. Έκα πζεακυ εκδεπυιεκμ Δηθόλα Η ππεξέθθξαζε ηεο πξωηεΐλεο Geminin κεηώλεη ηνλ αξηζκό ηωλ Tbr2+ πξόδξνκωλ θπηηάξωλ. Φσηνγξαθίεο από ζπλεζηηαθό κηθξνζθόπην πεηξακάησλ δηπινύ αλνζνθζνξηζκνύ κε εηδηθά αληηζώκαηα γηα ηηο πξσηεΐλεο GFP (πξάζηλν) θαη Tbr2 (θόθθηλν). Οη ππξήλεο ησλ θπηηάξσλ απεηθνλίδνληαη κεηά από ρξώζε κε ηε ρξσζηηθή Σoto-3 (κπιε). Σα δεδνκέλα καο δείρλνπλ όηη ε ππεξέθθξαζε ησλ κνξθώλ wt Geminin (Γ-Γ) θαη N-del Geminin (Δ-Ε) αιιά όρη ηεο κνξθήο Γ-Brg1 Geminin (Ζ-Θ) έρεη σο απνηέιεζκα ηε κείσζε ησλ GFP+Tbr2+ θπηηάξσλ ζηελ θνηιηαθή δώλε ζε ζρέζε κε ηελ θαηάζηαζε ειέγρνπ (Α,Β) (ηζηόγξακκα Η). Ο πιεζπζκόο ησλ GFP+Tbr2+ εκθαλίδεηαη κεησκέλνο θαη κεηαμύ ησλ θπηηάξσλ ηεο ππνθνηιηαθήο δώλεο, αλ θαη ε κείσζε απηή δελ θηάλεη ζε ζηαηηζηηθή ζεκαληηθόηεηα. O πίλαθαο Κ απεηθνλίδεη ηηο αληίζηνηρεο πνζνηηθνπνηήζεηο θαη ην ζπλνιηθό αξηζκό θπηηάξσλ πνπ κεηξήζεθαλ. ΚΕ, θνηιηαθή δώλε. ΤΚΕ, ππνθνηιηαθή δώλε. Σα δεδνκέλα απνδίδνληαη σο κέζνο όξνο ± SD. n=4, *p

121 Απμηεθέζιαηα είκαζ υηζ δ αθθδθεπίδναζδ ιεηαλφ Geminin-Brg1 δεκ είκαζ απαναίηδηδ βζα ηδκ επίδναζδ πμο έπεζ ημ ιυνζμ ηδξ Geminin ζημ ζπδιαηζζιυ ηςκ ααζζηχκ πνυδνμιςκ ηοηηάνςκ. Ζ ιείςζδ ημο πθδεοζιμφ GFP+Tbr2+ ιεηά απυ ηδκ οπενέηθναζδ ηςκ wt Geminin ηαζ N-del Geminin ακζπκεφηδηε ιεηαλφ ηςκ ηοηηάνςκ ηδξ ημζθζαηήξ γχκδξ, οπμδεζηκφμκηαξ υηζ δ Geminin ιπμνεί κα επδνεάγεζ ηα ανπζηά ζηάδζα ζπδιαηζζιμφ ηςκ ηοηηάνςκ ηδξ οπμημζθζαηήξ γχκδξ, υηακ βίκεηαζ μ ηαεμνζζιυξ ηςκ ηοηηάνςκ ηδξ ημζθζαηήξ γχκδξ πμο εα ιεηαζπδιαηζζημφκ ζε ααζζηά πνυδνμια ηφηηανα Ζ ππεξέθθξαζε ηεο Geminin έρεη ζαλ απνηέιεζκα ηελ αύμεζε ησλ θαζνξηζκέλσλ πξνο λεπξσληθή δηαθνξνπνίεζε Mash1+ θπηηάξσλ Ζ ιεηάααζδ ηςκ πνμβμκζηχκ κεονζηχκ ηοηηάνςκ ημο θθμζμφ ζηα πνμηαεμνζζιέκα πνυδνμια ηφηηανα ηαζ ηεθζηά ημοξ δζαθμνμπμζδιέκμοξ κεονχκεξ πνμτπμεέηεζ ηδκ έηθναζδ ηςκ πνμκεονζηχκ πνςηεσκχκ bhlh, μζ μπμίεξ δζαδναιαηίγμοκ ηαθά παναηηδνζζιέκμοξ νυθμοξ ζηζξ δζαδζηαζίεξ ςνίιακζδξ ηςκ πνμβμκζηχκ ηοηηάνςκ, πνμηαεμνζζιμφ ηςκ κεονςκζηχκ ηφπςκ, ηεθζηήξ δζαθμνμπμίδζδξ ηαζ ιεηακάζηεοζδξ ηςκ κεονχκςκ (Bertrand et al., 2002; Schuurmans et al., 2004; Britz et al., 2006). Πναβιαημπμζήεδηακ πεζνάιαηα δζπθμφ ακμζμθεμνζζιμφ ζε ημιέξ θθμζμφ ζηζξ μπμίεξ είπακ οπενεηθναζηεί μζ GFP, wt Geminin, N-del Geminin ηαζ Γ-Brg1 Geminin. Υνδζζιμπμζχκηαξ εζδζηά ακηζζχιαηα έκακηζ ηςκ πνςηεσκχκ GFP ηαζ Mash1 δζενεοκήζαιε ημκ ανζειυ ηςκ Mash1+ ηοηηάνςκ ιεηά ηδκ οπενέηθναζδ ηδξ Geminin. ηδ ζοκέπεζα πμζμηζημπμζήεδηε μ πθδεοζιυξ ηςκ GFP+ ηοηηάνςκ ηδξ ημζθζαηήξ ηαζ οπμημζθζαηήξ γχκδξ ημο θθμζμφ πμο ζοκεηθνάγεζ ηδκ πνμκεονζηή bhlh πνςηεΐκδ Mash1 (Δζηυκα 3.11). Σα απμηεθέζιαηα ηςκ ιεηνήζεχκ ιαξ δείπκμοκ υηζ μ GFP+Mash1+ ηοηηανζηυξ πθδεοζιυξ πανμοζζάγεηαζ αολδιέκμξ ζηδκ ημζθζαηή γχκδ ημο θθμζμφ ζε υθεξ ηζξ ζοκεήηεξ οπενέηθναζδξ ηδξ Geminin. Πζμ ζοβηεηνζιέκα, ζηδκ πενίπηςζδ οπενέηθναζδξ ημο μπήιαημξ πμο πενζέπεζ ηδ ιμνθή ηδξ wt Geminin ημ πμζμζηυ ηςκ δζπθά εεηζηχκ ηοηηάνςκ ζηδκ ημζθζαηή γχκδ ιεηααθήεδηε απυ 7,4% ζηδκ ηαηάζηαζδ εθέβπμο ζε 15,3%. Ακηίζημζπα είκαζ ηαζ ηα απμηεθέζιαηα ζηζξ πενζπηχζεζξ οπενέηθναζδξ ηςκ N-del Geminin ηαζ Γ-Brg1 Geminin μπδιάηςκ, υπμο ημ ακηίζημζπμ πμζμζηυ ακένπεηαζ ζημ 13,4% (Δζηυκα 3.11 δζάβναιια Η). Ακηίεεηα, δ οπενέηθναζδ ηδξ Geminin δεκ επδνεάγεζ ημκ GFP+Mash1+ πθδεοζιυ πμο εκημπίγεηαζ ζηδκ οπμημζθζαηή γχκδ (Δζηυκα 3.11 δζάβναιια Η). 121

122 Απμηεθέζιαηα Δηθόλα Απμεκέλνο πιεζπζκόο θπηηάξωλ πνπ εθθξάδνπλ ηνλ πξνλεπξηθό παξάγνληα Mash1 κεηά από ππεξέθθξαζε ηεο Geminin. Πεηξάκαηα δηπινύ αλνζνθζνξηζκνύ ζε ηνκέο θινηνύ ζηηο νπνίεο έρνπλ ππεξεθθξαζηεί δηάθνξεο κνξθέο ηνπ κνξίνπ ηεο Geminin (Γ-Θ). Ο πιεζπζκόο ησλ Mash1+ (θόθθηλν) θαη GFP+ (πξάζηλν) θπηηάξσλ ηαπηνπνηήζεθε κε εηδηθά αληηζώκαηα. Οη ππξήλεο ησλ θπηηάξσλ ηαπηνπνηήζεθαλ κε ηελ ρξσζηηθή Σoto-3 (κπιε). Ο Mash1+ θπηηαξηθόο πιεζπζκόο παξνπζηάδεηαη ζεκαληηθά απμεκέλνο ζε ζύγθξηζε κε ηελ θαηάζηαζε ειέγρνπ (Α-Β) (γξάθεκα Η). ηνλ πίλαθα Κ απνηππώλνληαη νη αληίζηνηρεο πνζνηηθνπνηήζεηο θαη νη ζπλνιηθνί αξηζκνί θπηηάξσλ πνπ κεηξήζεθαλ. ΚΕ, θνηιηαθή δώλε. ΤΚΕ, ππνθνηιηαθή δώλε. Σα δεδνκέλα απνδίδνληαη σο κέζνο όξνο ± SD. n=3, *p Σα απμηεθέζιαηα αοηά πνμηείκμοκ υηζ μ πθδεοζιυξ ηςκ πνμηαεμνζζιέκςκ (committed) πνυδνμιςκ ηοηηάνςκ πμο εα δζαθμνμπμζδεμφκ ζε κεονχκεξ πανμοζζάγεηαζ αολδιέκμξ ζημκ εβηεθαθζηυ θθμζυ ιεηά απυ οπενέηθναζδ ηδξ πνςηεΐκδξ Geminin. 122

123 Απμηεθέζιαηα Ζ πξσηεΐλε Geminin σζεί ηα πξνγνληθά θύηηαξα ηνπ θινηνύ πξνο έμνδν από ηνλ θπηηαξηθό θύθιν θαη λεπξσληθή δηαθνξνπνίεζε Ζ οπενέηθναζδ ηδξ Geminin μδδβεί ζε αφλδζδ ημο πθδεοζιμφ ηςκ πνμβμκζηχκ ηοηηάνςκ πμο είκαζ ηαεμνζζιέκα πνμξ κεονςκζηή δζαθμνμπμίδζδ. ηδ ζοκέπεζα ιεθεηήζαιε ακ αοηή δ αφλδζδ ηςκ πνμηαεμνζζιέκςκ πνυδνμιςκ ηοηηάνςκ μδδβεί ζε αφλδζδ ηςκ πθήνςξ δζαθμνμπμζδιέκςκ κεονζηχκ ηοηηάνςκ. Δζδζηά ακηζζχιαηα έκακηζ ηςκ πνςηεσκχκ GFP ηαζ Tuj1 πνδζζιμπμζήεδηακ ζε πεζνάιαηα δζπθμφ ακμζμθεμνζζιμφ χζηε κα ηαοημπμζδεμφκ ηα πμζμζηά ηςκ GFP+Tuj1+ ηοηηανζηχκ πθδεοζιχκ ιεηαλφ ηδξ ηαηάζηαζδξ εθέβπμο ηαζ ηδξ οπενέηθναζδξ ηδξ Geminin (Δζηυκα 3.12). Ζ οπενέηθναζδ ηδξ Geminin έπεζ ζακ απμηέθεζια ημ πμζμζηυ ηςκ GFP+ ηοηηάνςκ πμο ζοκεηθνάγμοκ ημκ κεονςκζηυ δείηηδ Tuj1 κα ειθακίγεηαζ αολδιέκμ ζε υθεξ ηζξ γχκεξ ημο θθμζμφ ηαζ ζε υθεξ ηζξ πενζπηχζεζξ οπενέηθναζδξ ηδξ Geminin. Πζμ ζοβηεηνζιέκα, ζηδκ ημζθζαηή γχκδ ημ πμζμζηυ ηςκ GFP+/Tuj1+ ηοηηάνςκ ακένπεηαζ ζημ 2,2% ζηδκ ηαηάζηαζδ εθέβπμο εκχ ιεηά ηδκ οπενέηθναζδ ηςκ wt Geminin, N-del Geminin ηαζ Γ-Brg1 Geminin αολάκεηαζ ζημ 9,7%, 18,2% ηαζ 8,01% ακηίζημζπα. ηδκ οπμημζθζαηή γχκδ ηα ακηίζημζπα πμζμζηά είκαζ 17,5% βζα ηδκ ηαηάζηαζδ εθέβπμο ηαζ 25,2%, 24,2% ηαζ 43,6% βζα ηδκ οπενέηθναζδ ηςκ wt Geminin, N-del Geminin ηαζ Γ-Brg1 Geminin, ακηίζημζπα (ζζηυβναιια ηαζ πίκαηαξ Σ). Ζ αφλδζδ αοηή ήηακ ζηαηζζηζηχξ ζδιακηζηή ζηζξ πενζπηχζεζξ οπενέηθναζδξ ηςκ ιμνθχκ N-del Geminin ηαζ Γ-Brg1 Geminin. Σα απμηεθέζιαηα αοηά πνμηείκμοκ υηζ δ οπενέηθναζδ ηδξ Geminin πνμςεεί ηδ κεονςκζηή δζαθμνμπμίδζδ. Ζ αφλδζδ ηδξ κεονςκζηήξ δζαθμνμπμίδζδξ πμο παναηδνείηαζ ιεηά ηδκ οπενέηθναζδ ηςκ ιμνθχκ ηδξ Geminin εα ιπμνμφζε κα μθείθεηαζ ζε πνυςνδ έλμδμ απυ ημκ ηοηηανζηυ ηφηθμ ηςκ πνμβμκζηχκ ηοηηάνςκ πμο δζαιμθφκεδηακ. Κφνζμζ νοειζζηέξ ηδξ δζελαβςβήξ ημο ηοηηανζημφ ηφηθμο είκαζ ηα ζφιπθμηα ηοηθζκχκ/ηοηθζκμελανηχιεκςκ ηζκαζχκ (cyclin/cyclin-dependent kinase, cdk) ηαζ μζ ακαζημθείξ ημοξ (Dehay and Kennedy, 2007). H απυθαζδ ηςκ πνμβμκζηχκ ηοηηάνςκ ημο θθμζμφ κα ζηαιαηήζμοκ κα δζαζνμφκηαζ ηαζ κα ανπίζμοκ κα δζαθμνμπμζμφκηαζ θαιαάκεηαζ ηαηά ηδκ G1 θάζδ ημο ηοηηανζημφ ηφηθμο (Haubensak et al., 2004), ιε ηδκ ηνίζζιδ ζοιιεημπή ηςκ ακαζημθέςκ ηςκ ηοηθζκμελανηχιεκςκ ηζκαζχκ ηδξ ζοβηεηνζιέκδξ θάζδξ. Ο πζμ ιεθεηδιέκμξ ηέημζμξ ακαζημθέαξ ζηα πνμβμκζηά ηφηηανα ημο θθμζμφ είκαζ δ πνςηεΐκδ p27, δ μπμία ακαζηέθθεζ ημ ζφιπθμημ cdk2/cycline ηαζ έπεζ δεζπεεί υηζ δζαδναιαηίγεζ ζδιακηζηυ νυθμ ζηδκ έλμδμ ηςκ πνμβμκζηχκ ηοηηάνςκ απυ ημκ ηοηηανζηυ ηφηθμ ηαζ ηδκ πνμχεδζδ ηδξ κεονςκζηήξ δζαθμνμπμίδζδξ (Nguyen et al., 2006). Πεζνάιαηα δζπθμφ ακμζμθεμνζζιμφ ιε εζδζηά ακηζζχιαηα έκακηζ ηςκ πνςηεσκχκ GFP ηαζ p27 πναβιαημπμζήεδηακ πνμηεζιέκμο κα ζοβηνίκμοιε ημ πμζμζηυ ηςκ δζαιμθοκεέκηςκ πνμβμκζηχκ ηοηηάνςκ ημο θθμζμφ πμο 123

124 Απμηεθέζιαηα Ρ Σ 124

125 Απμηεθέζιαηα Δηθόλα Η ππεξέθθξαζε ηεο Geminin πξνωζεί ηελ έμνδν από ηνλ θπηηαξηθό θύθιν θαη ηε λεπξωληθή δηαθνξνπνίεζε ηωλ πξνγνληθώλ θπηηάξωλ ηνπ θινηνύ. Σα πξνγνληθά λεπξηθά θύηηαξα ηνπ θινηνύ εκβξύσλ κπόο ειηθίαο Δ14.5 ειεθηξνδηακνιύλζεθαλ κε νρήκαηα πνπ εμέθξαδαλ ηηο πξσηεΐλεο GFP (Α,Β,Η,Κ), wt Geminin (Γ,Γ,Λ,Μ), N-del Geminin (Δ,Ε,Ν,Ξ) θαη Γ-Brg1 Geminin (Ζ,Θ,Ο,Π). Πεηξάκαηα δηπινύ αλνζνθζνξηζκνύ κε εηδηθά αληηζώκαηα έλαληη ηεο πξσηεΐλεο GFP (πξάζηλν), ηνπ αλαζηνιέα ησλ θπθιηλν-εμαξηώκελσλ θηλαζώλ p27 (θόθθηλν, Α-Θ) θαη ηνπ δείθηε ησλ δηαθνξνπνηεκέλσλ λεπξώλσλ Tuj1 (θόθθηλν, Η-Π) πξαγκαηνπνηήζεθαλ ζε ηνκέο θινηνύ κεηά ηελ ειεθηξνδηακόιπλζε θαη αλαιύζεθαλ κε ζπλεζηηαθή κηθξνζθνπία. Οη ππξήλεο ησλ θπηηάξσλ ηαπηνπνηήζεθαλ κεηά από ρξώζε κε Σνtν-3 (κπιε). Οη πνζνηηθνπνηήζεηο ησλ GFP+p27+ θαη GFP+Tuj1+ θπηηαξηθώλ πιεζπζκώλ θαηέδεημαλ όηη ε ππεξέθθξαζε ηνπ κνξίνπ ηεο Geminin επλνεί ηελ έμνδν από ηνλ θπηηαξηθό θύθιν θαη ηελ ελεξγνπνίεζε ησλ κεραληζκώλ λεπξσληθήο δηαθνξνπνίεζεο (ηζηνγξάκκαηα Ρ,). Ο πίλαθαο Σ απνηππώλεη ηηο αληίζηνηρεο κεηξήζεηο. ΤΚΕ, ππνθνηιηαθή δώλε. ΚΕ, θνηιηαθή δώλε. Σα δεδνκέλα απνδίδνληαη σο κέζνο όξνο ± SD. n=4, *p ςεμφκηαζ πνμξ έλμδμ απυ ημκ ηοηηανζηυ ηφηθμ ηαζ κεονςκζηή δζαθμνμπμίδζδ ζηζξ ζοκεήηεξ οπενέηθναζδξ ηδξ Geminin ηαζ ζηδκ ηαηάζηαζδ εθέβπμο (Δζηυκα 3.12). Σμ πμζμζηυ ηςκ GFP+ πνμβμκζηχκ ηοηηάνςκ ηδξ ημζθζαηήξ γχκδξ πμο εηθνάγεζ ημκ δείηηδ p27 είκαζ ζδιακηζηά αολδιέκμ ηυζμ ζηδκ πενίπηςζδ οπενέηθναζδξ ηδξ ιμνθήξ wt Geminin υζμ ηαζ ηςκ ιμνθχκ N-del Geminin ηαζ Γ-Brg1 Geminin (40,8%, 33% ηαζ 37% ακηίζημζπα) ζε ζπέζδ ιε ηδκ ηαηάζηαζδ εθέβπμο (14,9%) (Δζηυκα 3.12 ζζηυβναιια Ρ ηαζ πίκαηαξ Σ). Σμ βεβμκυξ αοηυ οπμδεζηκφεζ υηζ δ Geminin ςεεί ηα πνμβμκζηά ηφηηανα ηδξ ημζθζαηήξ γχκδξ κα ζηαιαηήζμοκ ηδκ ηοηηανζηή δζαίνεζδ ηαζ κα δζαθμνμπμζδεμφκ ζε κεονζηά ηφηηανα. Έκαξ εκαθθαηηζηυξ ιδπακζζιυξ πμο εα ιπμνμφζε κα ελδβήζεζ ηδκ αολδιέκδ πανμοζία κεονζηχκ ηοηηάνςκ ζηζξ δφμ κεονμβεκεηζηέξ γχκεξ ημο θθμζμφ είκαζ ιζα εκδεπυιεκδ ιεζςιέκδ ζηακυηδηα ιεηακάζηεοζδξ ηςκ ζπδιαηζγυιεκςκ θθμζσηχκ κεονχκςκ έλς απυ ηζξ κεονμβεκεηζηέξ γχκεξ. Ζ απμηίιδζδ ημο θαζκμιέκμο ηδξ ιεηακάζηεοζδξ ιπμνεί κα πναβιαημπμζδεεί απυ ηδκ πμζμηζημπμίδζδ ημο πθδεοζιμφ ηςκ GFP+ ηοηηάνςκ πμο εκημπίγεηαζ ζε ηάεε θθμζσηή γχκδ ζε ζπέζδ ιε ημ ζοκμθζηυ ανζειυ ηςκ GFP+ ηοηηάνςκ πμο εκημπίγμκηαζ ζε υθμ ημ θθμζυ. Ζ ζφβηνζζδ ηςκ πμζμζηχκ αοηχκ ιεηά ηδκ οπενέηθναζδ ηςκ δζαθυνςκ ιμνθχκ ηδξ Geminin ιε ηα ακηίζημζπα πμζμζηά ηδξ ηαηάζηαζδξ εθέβπμο οπέδεζλε υηζ μ νοειυξ ιεηακάζηεοζδξ ηςκ ηοηηάνςκ ημο θθμζμφ δε ιεηααάθθεηαζ ζε ζοκεήηεξ οπενέηθναζδξ ηδξ Geminin (Δζηυκα 3.13). 125

126 Απμηεθέζιαηα Α Β Δηθόλα Η κεηαλάζηεπζε ηωλ λενζρεκαηηδόκελωλ λεπξώλωλ δελ επεξεάδεηαη από ηελ ππεξέθθξαζε ηεο Geminin. Πνζνηηθνπνίεζε ησλ GFP+ θπηηάξσλ πνπ εληνπίδνληαη ζε θάζε δώλε ηνπ θινηνύ θαη έθθξαζή ηνπο σο πνζνζηό ηνπ ζπλνιηθνύ αξηζκνύ GFP+ θπηηάξσλ όινπ ηνπ θινηνύ. Ο πίλαθαο Β απνηππώλεη ηα αληίζηνηρα πνζνζηά. Οη αξηζκνί ζηηο παξελζέζεηο αλαθέξνληαη ζηα GFP+ θύηηαξα θάζε δώλεο θαη ην αληίζηνηρν πνζνζηό πξνθύπηεη από ηε δηαίξεζε κε ηα ζπλνιηθά GFP+ θύηηαξα. ΚΕ, θνηιηαθή δώλε. ΤΚΕ, ππνθνηιηαθή δώλε. ΓΕ, δηάκεζε δώλε. ΦΠ, θινητθή πιάθα. οιπεναζιαηζηά, δ οπενέηθναζδ ηδξ Geminin ζηα πνμβμκζηά ηφηηανα ηδξ ημζθζαηήξ γχκδξ ημο ακαπηοζζυιεκμο εβηεθαθζημφ θθμζμφ ημο ιουξ έπεζ ςξ απμηέθεζια ηδ ζδιακηζηή ιείςζδ ηςκ δφμ πθδεοζιχκ πνμβμκζηχκ ηοηηάνςκ ημο ζζημφ ιε ηαοηυπνμκδ αφλδζδ ηςκ πνμηαεμνζζιέκςκ βζα κεονςκζηή δζαθμνμπμίδζδ πνυδνμιςκ ηοηηάνςκ ηαζ ηςκ δζαθμνμπμζδιέκςκ κεονχκςκ. Σα θθμζσηά πνμβμκζηά ηφηηανα ιεηά απυ ηδκ οπενέηθναζδ ηδξ Geminin ελένπμκηαζ ζε ιεβαθφηενα πμζμζηά απυ ημκ ηοηηανζηυ ηφηθμ. Σα δεδμιέκα αοηά πνμηείκμοκ έκα θεζημονβζηυ νυθμ ημο ιμνίμο ηδξ Geminin ζηδ νφειζζδ ηδξ απυθαζδξ ηςκ κεονζηχκ πνμβμκζηχκ ηοηηάνςκ βζα αοημ-ακακέςζδ ή δζαθμνμπμίδζδ. 126

127 Απμηεθέζιαηα 3.3 Καηά ζπλζήθε απνζηώπεζε ηνπ γνληδίνπ ηεο Geminin ζηνλ εγθεθαιηθό θινηό ηνπ κπόο Πεζνάιαηα ζε δζάθμνα γςζηά ιμκηέθα, υπςξ μ αάηναπμξ Xenopus laevis, ημ ράνζ Oryzias latipes, δ ιφβα Drosophila melanogaster ηαζ ημ ημηυπμοθμ, πνμηείκμοκ έκα ζδιακηζηυ νυθμ βζα ηδ Geminin ηαηά ηδκ ειανομβέκεζδ ηαζ ακάπηολδ (Kroll et al., 1998; Del Bene et al., 2004; Luo et al., 2004; Seo et al., 2005a; Papanayotou et al., 2008). Ζ Geminin είκαζ ααζζηή βζα ηδκ ειανομβέκεζδ ημο ιουξ, ηαεχξ ζηα έιανοα πμο δεκ εηθνάγεηαζ δ πνςηεΐκδ δεκ ζπδιαηίγεηαζ δ έζς ηοηηανζηή ιάγα (inner cell mass) ηαζ δ ακάπηολδ ηςκ ειανφςκ ζηαιαηάεζ ζημ ζηάδζμ ηςκ 8 ηοηηάνςκ ιε επαηυθμοεμ εάκαημ ημο μνβακζζιμφ (Gonzalez et al., 2006; Hara et al., 2006). Σμ βεβμκυξ αοηυ, ακ ηαζ ακαδεζηκφεζ ημ εειεθζχδδ νυθμ ηδξ πνςηεΐκδξ ζηδ δδιζμονβία ηςκ πμθοδφκαιςκ ειανοσηχκ ηοηηάνςκ, απμηεθεί ακαζηαθηζηυ πανάβμκηα βζα ηδ δζενεφκδζδ ημο νυθμο ηδξ Geminin ζημ ηεκηνζηυ κεονζηυ ζφζηδια. Γζ αοηυ ημ θυβμ δδιζμονβήζαιε ιφεξ πμο επζηνέπμοκ ηδκ ηαηά ζοκεήηδ απμζζχπδζδ (conditional knock-out) ημο βμκζδίμο εζδζηά ζημ ηεκηνζηυ κεονζηυ ζφζηδια Γεκηνπξγία κπώλ ζηνπο νπνίνπο έρεη αδξαλνπνηεζεί ην γνλίδην ηεο Geminin ζην θεληξηθό λεπξηθό ζύζηεκα Γζα κα δδιζμονβδεμφκ ιφεξ πμο εα επζηνέπμοκ ηδκ ζζημεζδζηή απμζζχπδζδ ημο βμκζδίμο ηδξ Geminin ζημ ηεκηνζηυ κεονζηυ ζφζηδια πνδζζιμπμζήεδηε ημ Cre- LoxP ζφζηδια. Πζμ ζοβηεηνζιέκα, δδιζμονβήεδηακ ανπζηά ιφεξ (floxed ιφεξ) μζ μπμίμζ θένμοκ LoxP εέζεζξ ζηα εζυκζα πμο ανίζημκηαζ εηαηένςεεκ ηςκ ελμκίςκ 3 ηαζ 4 ημο βμκζδίμο ηδξ Geminin (Geminin floxed allele) (δζδαηημνζηή δζαηνζαή Πακςναίαξ Κμηακηάηδ; (Karamitros et al., 2010)). Πνμηεζιέκμο κα πνμηφρμοκ ιφεξ ζημοξ μπμίμοξ δ απμζζχπδζδ ημο βμκζδίμο ηδξ Geminin θαιαάκεζ πχνα ζημ ηεκηνζηυ κεονζηυ ζφζηδια, μζ παναπάκς floxed ιφεξ δζαζηαονχεδηακ ιε ιφεξ πμο εηθνάγμοκ ηδκ Cre νεημιπζκάζδ οπυ ημκ έθεβπμ ημο οπμηζκδηή ηαζ ημο εκζζποηή ημο βμκζδίμο ηδξ Nestin (Nestin Cre) (Δζηυκα 3.14) (Zimmerman et al., 1994). Ζ πνςηεΐκδ Nestin εηθνάγεηαζ ζε μθυηθδνμ ημ ηεκηνζηυ κεονζηυ ζφζηδια πενίπμο απυ ηδκ ειανοσηή διένα Δ9.5 ηαζ παναηηδνίγεζ ηα πνμβμκζηά, αδζαθμνμπμίδηα ηφηηανα. Με αοηυκ ημκ ηνυπμ επζηοβπάκεηαζ δ έηθναζδ ηδξ Cre νεημιπζκάζδξ ζηα πνμβμκζηά κεονζηά ηφηηανα ημο ακαπηοζζυιεκμο ηεκηνζημφ κεονζημφ ζοζηήιαημξ, ηαζ επμιέκςξ ηαζ ημο εβηεθαθζημφ θθμζμφ, ήδδ απυ ηδκ δθζηία Δ11.5, επζηνέπμκηαξ έηζζ ηδκ ζζημεζδζηή απμζζχπδζδ ηδξ πνςηεΐκδξ ηδξ Geminin απυ ηα πνμβμκζηά κεονζηά ηφηηανα ημο θθμζμφ. Πνμηεζιέκμο κα ηαοημπμζήζμοιε ηδκ αδνακμπμίδζδ ημο βμκζδίμο ηδξ Geminin ιεηά ηδκ έηθναζδ ηδξ Cre νεημιπζκάζδξ εθέβλαιε ηδκ έηθναζδ ηδξ 127

128 Απμηεθέζιαηα Geminin ηυζμ ζε επίπεδμ mrna υζμ ηαζ ζε επίπεδμ πνςηεΐκδξ εζηζάγμκηαξ ζημκ εβηεθαθζηυ θθμζυ (Δζηυκα 3.15). Γζα ηζξ ιεθέηεξ ιαξ πνδζζιμπμζήεδηακ δζαβμκζδζαημί ιφεξ πμο έθενακ έκα floxed ηαζ έκα Γex3-4 (ko) αθθδθυιμνθμ ημο Geminin flox/flox Geminin ko/wt ;Nestin Cre Geminin flox/ko ;NestinCre Geminin ko/ko ;NestinCre Δηθόλα Καηά ζπλζήθε απνζηώπεζε ηνπ γνληδίνπ ηεο Geminin ζην αλαπηπζζόκελν θεληξηθό λεπξηθό ζύζηεκα. Οη Geminin floxed κύεο δηαζηαπξώζεθαλ κε κύεο πνπ εθθξάδνπλ ην έλδπκν Cre ξεθνκπηλάζε ππό ηνλ έιεγρν ησλ ξπζκηζηηθώλ ζηνηρείσλ ηνπ γνληδίνπ ηεο Nestin. Ζ πξσηεΐλε Nestin εθθξάδεηαη θπζηνινγηθά ζηα πξνγνληθά αδηαθνξνπνίεηα θύηηαξα ηνπ αλαπηπζζόκελνπ θεληξηθνύ λεπξηθνύ ζπζηήκαηνο πεξίπνπ από ηελ εκβξπτθή ειηθία Δ9.5. Καηά ζπλέπεηα ε Cre ζα εθθξαζηεί ζην αλαπηπζζόκελν θεληξηθό λεπξηθό ζύζηεκα θαη ζα αθαηξέζεη ηα εμόληα 3 θαη 4 ηνπ γνληδίνπ ηεο Geminin από ηνλ ηζηό έρνληαο σο απνηέιεζκα ηε κεηαηξνπή ησλ floxed ζε ko αιιειόκνξθα θαη ηελ ηζηνεηδηθή απαινηθή ηεο έθθξαζεο ηεο Geminin. βμκζδίμο ηδξ Geminin (δζδαηημνζηή δζαηνζαή Πακςναίαξ Κμηακηάηδ; (Karamitros et al., 2010)) ηαζ ήηακ εηενυγοβμζ ςξ πνμξ ηδκ έηθναζδ ηδξ Cre νεημιπζκάζδξ (Geminin flox/ko ;NestinCre +/- ). Ο βμκυηοπμξ ηςκ γχςκ αοηχκ ιεηαηνέπεηαζ ζε Geminin ko/ko ;NestinCre +/- ζημκ ζζηυ υπμο εηθνάγεηαζ δ Cre νεημιπζκάζδ. Οζ πεζναιαηζημί αοημί ιφεξ εα ακαθένμκηαζ απυ εδχ ηαζ πένα ςξ Fl/koNestinCre. Ζ μιάδα εθέβπμο έπεζ βμκμηφπμοξ Geminin flox/wt (μιυγοβα ςξ πνμξ ηδκ έηθναζδ ημο βμκζδίμο ηδξ Geminin) ή Geminin flox/wt ;NestinCre +/- (εηενυγοβα ςξ πνμξ ηδκ έηθναζδ ημο βμκζδίμο ηδξ Geminin, ηαεχξ δ έηθναζδ ηδξ Cre νεημιπζκάζδξ έπεζ ςξ απμηέθεζια ηδ ιεηαηνμπή ημο floxed αθθδθμιυνθμο ζημ Γex3-4 αθθδθυιμνθμ ημο βμκζδίμο ηδξ Geminin ηαζ ηδ ζοκεπαβυιεκδ έηθναζδ ιυκμ ημο wt αθθδθμιυνθμο). 128

129 Απμηεθέζιαηα Γεκ παναηδνήεδηε θαζκμηοπζηή δζαθμνά ιεηαλφ ηςκ αβνίμο ηφπμο ηαζ εηενυγοβςκ ιοχκ, επμιέκςξ μζ ιφεξ αοημί εα ακαθένμκηαζ ζοκμθζηά ςξ αβνίμο ηφπμο (wild type, WT) ιφεξ. Γζα κα εθέβλμοιε ηδκ έηθναζδ ημο mrna ηαζ ηδξ πνςηεΐκδξ ηδξ Geminin ζημοξ WT ηαζ Fl/koNestinCre ιφεξ, πναβιαημπμζήζαιε πεζνάιαηα οανζδμπμίδζδξ in situ ηαζ ακμζμθεμνζζιμφ ακηίζημζπα ζε ιεηςπζαίεξ ημιέξ ειανφςκ δθζηίαξ Δ12.5, Δ14.5 ηαζ Δ18.5 (Δζηυκα 3.15). ηα WT έιανοα ηα πεζνάιαηα αοηά ηαηέδεζλακ υηζ δ έηθναζδ ημο ιμνίμο ηδξ Geminin εκημπίγεηαζ ζηα πνμβμκζηά ηφηηανα ηδξ ημζθζαηήξ ηαζ οπμημζθζαηήξ γχκδξ ημο θθμζμφ (Δζηυκα 3.15 Α,Γ,Δ,Ζ,Η,Λ), ζε ζοιθςκία ιε πνμδβμφιεκα απμηεθέζιαηα ηδξ ενεοκδηζηήξ ιαξ μιάδαξ (Spella et al., 2007). ηα Fl/koNestinCre έιανοα, ηα επίπεδα έηθναζδξ ηυζμ ημο mrna υζμ ηαζ ηδξ πνςηεΐκδξ ηδξ Geminin πανμοζζάγμκηαζ ζδιακηζηά ιεζςιέκα ήδδ απυ ηδκ ειανοσηή δθζηία Δ12.5, εκχ ιέπνζ ηδκ δθζηία Δ14.5 δ απαθμζθή ημοξ είκαζ πθήνδξ (Δζηυκα 3.15Β,Γ,Ε,Θ,Κ,Μ). Σα παναπάκς πεζνάιαηα εθέβπμο ζοιπθδνχεδηακ ελεηάγμκηαξ ημ θαζκυιεκμ ηδξ απμζζχπδζδξ ζε επίπεδμ DNA. Απμιμκχεδηακ μζ θθμζμί απυ WT ηαζ Fl/koNestinCre ιφεξ, μιμβεκμπμζήεδηακ ζε ααειυ πμο οπήνπακ ιυκμ ιμκαδζαία ηφηηανα ηαζ ζηδ ζοκέπεζα ηα ηφηηανα δζαηδνήεδηακ ζε ηαθθζένβεζα. Έκα ζδζαίηενμ παναηηδνζζηζηυ ηςκ ηοηηάνςκ αοηχκ είκαζ υηζ υηακ ηαθθζενβμφκηαζ in vitro πμθθαπθαζζάγμκηαζ ζπδιαηίγμκηαξ ηζξ θεβυιεκεξ κεονυζθαζνεξ (neurospheres). Απμιμκχεδηε ημ DNA ηςκ ηοηηάνςκ αοηχκ ηαεχξ ηαζ ημ βεκςιζηυ DNA απυ ηζξ μονέξ ηςκ ίδζςκ ιοχκ ηαζ δ πανμοζία ηςκ δζαθυνςκ αθθδθμιυνθςκ ημο βμκζδίμο ηδξ Geminin εθέβπεδηε ιε ηδκ ηεπκζηή ηδξ αθοζζδςηήξ ακηίδναζδξ πμθοιενάζδξ (polymerase chain reaction, PCR) (Δζηυκα 3.15Ν). Ζ ακίπκεοζδ ηςκ δζαθμνεηζηχκ αθθδθμιυνθςκ είκαζ δοκαηή ιε ηδ πνήζδ ελεζδζηεοιέκςκ εηηζκδηχκ πμο μδδβμφκ ζηδκ παναβςβή δζαθμνεηζηχκ πνμσυκηςκ: έκα πνμσυκ ιεβέεμοξ 549 γεοβχκ αάζεςκ βζα ημ wt αθθδθυιμνθμ, 597 γεοβχκ αάζεςκ βζα ημ floxed αθθδθυιμνθμ ηαζ 240 γεοβχκ αάζεςκ βζα ημ Γex3-4 αθθδθυιμνθμ. ηα δείβιαηα υπμο εηθνάγεηαζ ημ έκγοιμ ηδξ Cre νεημιπζκάζδξ ημ floxed αθθδθυιμνθμ ημο βμκζδίμο ηδξ Geminin ιεηαηνέπεηαζ ζημ Γex3-4 αθθδθυιμνθμ, έπμκηαξ ςξ απμηέθεζια ηδκ μθμηθδνςηζηή απμζζχπδζδ ηδξ Geminin ζημκ ακαπηοζζυιεκμ θθμζυ (Δζηυκα 3.15Ν). Δπζπνυζεεηα, αθοζζδςηή ακηίδναζδ πμθοιενάζδξ ακάζηνμθδξ ιεηαβναθάζδξ (reverse transcriptase, RT PCR), πμο πναβιαημπμζήεδηε ζε RNA πμο απμιμκχεδηε απυ WT ηαζ Fl/koNestinCre κεονυζθαζνεξ πνδζζιμπμζχκηαξ εζδζημφξ εηηζκδηέξ βζα ημ βμκίδζμ ηδξ Geminin, πζζημπμίδζε ηδκ απμοζία ημο mrna ηδξ Geminin ιεηά ηδκ έηθναζδ ηδξ Cre νεημιπζκάζδξ (Δζηυκα 3.15Ξ). 129

130 Απμηεθέζιαηα 130

131 Απμηεθέζιαηα Δηθόλα Η θαηά ζπλζήθε απνζηώπεζε ηνπ γνληδίνπ ηεο Geminin ζηνπο Fl/koNestinCre κύεο έρεη ωο απνηέιεζκα ηελ απώιεηα έθθξαζεο ηεο Geminin. Πεηξάκαηα αλνζνθζνξηζκνύ (Α-Ε) θαη πβξηδνπνίεζεο in situ (Ζ-Μ) ζε κεησπηαίεο ηνκέο από WT (Α,Γ,Δ,Ζ,Η,Λ) θαη Fl/koNestinCre (Β,Γ,Ε,Θ,Κ,Μ) έκβξπα ειηθίαο Δ12.5, Δ14.5 θαη Δ18.5 θαηέδεημαλ όηη ηα επίπεδα ηόζν ηεο πξσηεΐλεο όζν θαη ηνπ mrna αληίζηνηρα ηεο Geminin απαιείθνληαη νινθιεξσηηθά κε ηελ έθθξαζε ηνπ ελδύκνπ ηεο Cre ξεθνκπηλάζεο. (Ν) DNA πνπ απνκνλώζεθε από νπξέο θαη λεπξόζθαηξεο WT θαη Fl/koNestinCre εκβξύσλ ρξεζηκνπνηήζεθε γηα ηνλ έιεγρν ηεο απνηειεζκαηηθόηεηαο ηνπ αλαζπλδπαζκνύ ζην γελεηηθό ηόπν ηεο Geminin κε PCR. Σν πξντόλ ηνπ wt αιιεινκόξθνπ (WT) έρεη κέγεζνο 549 δεύγε βάζεσλ, ηνπ floxed αιιεινκόξθνπ (FL) 597 δεύγε βάζεσλ θαη ηνπ Γex3-4 αιιεινκόξθνπ (KO) 240 δεύγε βάζεσλ. (Ξ) RNA πνπ απνκνλώζεθε από λεπξόζθαηξεο WT θαη Fl/koNestinCre δώσλ ρξεζηκνπνηήζεθε ζε αιπζηδσηή αληίδξαζε πνιπκεξάζεο αλάζηξνθεο κεηαγξαθάζεο (RT PCR) γηα ηελ αλίρλεπζε ηνπ mrna ηεο Geminin. Σν γνλίδην ηεο β-αθηίλεο ρξεζίκεπζε γηα ηνλ έιεγρν ηεο ηζνθόξησζεο ησλ δεηγκάησλ. οιπεναζιαηζηά, ηα παναπάκς απμηεθέζιαηα δείπκμοκ υηζ δ έηθναζδ ημο εκγφιμο ηδξ Cre νεημιπζκάζδξ οπυ ημκ έθεβπμ ηςκ νοειζζηζηχκ ζημζπείςκ ημο βμκζδίμο ηδξ Nestin μδδβεί ζηδκ απαθμζθή ημο mrna ηαζ ηδξ πνςηεΐκδξ ηδξ Geminin απυ ηα κεονζηά πνμβμκζηά ηφηηανα ημο ακαπηοζζυιεκμο ειανοσημφ θθμζμφ Ζ απαινηθή ηεο Geminin ζην θινηό επεξεάδεη ηε δηαδνρή ησλ πξνγνληθώλ λεπξηθώλ θπηηάξσλ ελώ απμάλεη ην ξπζκό ηεο θπηηαξηθήο ηνπο δηαίξεζεο Ο ζπδιαηζζιυξ ημο εβηεθαθζημφ θθμζμφ απμηεθεί ιζα αοζηδνά μνβακςιέκδ δζαδζηαζία, πμο πενζθαιαάκεζ ηδ πνμκζηή νφειζζδ ηδξ ιεηάααζδξ απυ ημκ έκα πθδεοζιυ πνμβμκζηχκ ηοηηάνςκ ζημκ επυιεκμ αθθά ηαζ ηδξ δζαθμνμπμίδζήξ ημοξ ζε κεονζηά ηφηηανα. Ζ ζςζηή εκαθθαβή ηςκ δζαθυνςκ πνμβμκζηχκ πθδεοζιχκ έπεζ ζδζάγμοζα ζδιαζία βζα ημ ζπδιαηζζιυ ημο εβηεθαθζημφ θθμζμφ, ηαεχξ δ επζηνάηδζδ εκυξ πθδεοζιμφ έκακηζ ηάπμζμο άθθμο ιπμνεί κα έπεζ ζδιακηζηέξ επζπηχζεζξ ζημ ιέβεεμξ ημο θθμζμφ (Chenn and Walsh, 2002). Σα κεονμεπζεδθζαηά ηφηηανα απμηεθμφκ ημκ πζμ πνχζιμ πθδεοζιυ ηςκ ημνοθαίςκ πνμβμκζηχκ ηοηηάνςκ. Πνζκ ανπίζεζ δ δζαδζηαζία ηδξ κεονμβέκεζδξ ζημ θθμζυ, δδθαδή πνζκ ημ ζηάδζμ Δ10.5, ηα κεονμεπζεδθζαηά ηφηηανα δζαζνμφκηαζ ζοιιεηνζηά χζηε κα αολήζμοκ ημκ πθδεοζιυ ημοξ ιυθζξ ανπίζεζ δ κεονμβεκεηζηή δζαδζηαζία, ηα ηφηηανα αοηά δίκμοκ ζηαδζαηά ηδ εέζδ ημοξ, ιέζς αζφιιεηνςκ ηοηηανζηχκ δζαζνέζεςκ, ζηα ηφηηανα ηδξ αηηζκςηήξ βθμίαξ, πμο ακηζπνμζςπεφμοκ ηδκ ηφνζα δελαιεκή πνoβμκζηχκ ηοηηάνςκ ζηδ ημζθζαηή γχκδ απυ ηα ιέζα (δθζηίεξ Δ13.5-Δ14.5) ιέπνζ ημ ηέθμξ (δθζηίεξ Δ17.5- Δ18.5) ηδξ κεονμβέκεζδξ ζημ θθμζυ. Σα ηφηηανα ηδξ αηηζκςηήξ βθμίαξ ιε ηδ ζεζνά ημοξ δζαζνμφκηαζ ζοκήεςξ αζφιιεηνα, αοημ-ακακεχκμκηαξ ημκ πθδεοζιυ ημοξ ζπδιαηίγμκηαξ πανάθθδθα είηε πνυδνμια ηφηηανα ηδξ οπμημζθζαηήξ γχκδξ είηε 131

132 Απμηεθέζιαηα κεονχκεξ. Σα ααζζηά πνυδνμια ηφηηανα ηδξ οπμημζθζαηήξ γχκδξ ηέθμξ δζαζνμφκηαζ πάκηα ζοιιεηνζηά πνμξ ημ ζπδιαηζζιυ δφμ κεονζηχκ ηοηηάνςκ (Haubensak et al., 2004; Gotz and Huttner, 2005; Kriegstein et al., 2006). H απαθμζθή ηδξ Geminin ζημ θθμζυ μδδβεί ζε ιείςζδ ηςκ επζπέδςκ έηθναζδξ ήδδ απυ ηδκ ειανοσηή δθζηία Δ12.5. Καεχξ δ δθζηία αοηή ακηζπνμζςπεφεζ έκα ζηάδζμ ηαηά ημ μπμίμ θαιαάκεζ πχνα δ ιεηάααζδ απυ ηα κεονμεπζεδθζαηά ζηα ηφηηανα ηδξ αηηζκςηήξ βθμίαξ, εεθήζαιε πνχηα κα δζενεοκήζμοιε ακ δ απμζζχπδζδ ηδξ πνςηεΐκδξ Geminin είπε ηάπμζα επίδναζδ ζε αοηυ ημ ηνίζζιμ ιεηαααηζηυ ζηάδζμ. Γζα ημ ζημπυ αοηυ ελεηάζηδηε δ έηθναζδ ημο πανάβμκηα BLBP, μ μπμίμξ απμηεθεί έκα ιμνζαηυ δείηηδ ηςκ ηοηηάνςκ ηδξ αηηζκςηήξ βθμίαξ (Hartfuss et al., 2001). Πναβιαημπμζήεδηακ πεζνάιαηα ακμζμθεμνζζιμφ ζε ιεηςπζαίεξ ημιέξ θθμζμφ ιε εζδζηυ ακηίζςια έκακηζ ηδξ πνςηεΐκδξ BLBP ηαζ ζηδ ζοκέπεζα πμζμηζημπμζήεδηε μ BLBP+ ηοηηανζηυξ πθδεοζιυξ πμο πενζηθείεηαζ ζε ιζα ακηίζημζπδ ηαζ μνζζιέκςκ δζαζηάζεςκ πενζμπή ημο θθμζμφ WT ηαζ Fl/koNestinCre ιοχκ δθζηίαξ Δ12.5 (Δζηυκα 3.16). Ο ηνυπμξ αοηυξ πμζμηζημπμίδζδξ ζζπφεζ βζα υθα ηα πεζνάιαηα πμο εα ακαθενεμφκ ζηδ ζοκέπεζα. ημκ θθμζυ απυ αβνίμο ηφπμο ιφεξ, δ έηθναζδ ηδξ πνςηεΐκδξ BLBP είκαζ ήδδ ανηεηά εηηεηαιέκδ ζηδκ ειανοσηή δθζηία Δ12.5 (Δζηυκα 3.16Α). Ακηίεεηα, ζημ θθμζυ ηςκ Fl/koNestinCre ιοχκ παναηδνήεδηε ιζα ζδιακηζηή εθάηηςζδ ζηα επίπεδα έηθναζδξ ημο δείηηδ BLBP ζε ζπέζδ ιε ημοξ WT ιφεξ (Δζηυκα 3.16Β). Ζ πμζμηζημπμίδζδ ηςκ ακηίζημζπςκ πθδεοζιχκ έδεζλε υηζ ηα BLBP+ ηφηηανα είκαζ ιεζςιέκα ηαηά ζπεδυκ 60% ζημ θθμζυ ηςκ Fl/koNestinCre ζε ζφβηνζζδ ιε ηα WT έιανοα δθζηίαξ Δ12.5 (63 BLBP+ ηφηηανα ζηα WT έιανοα ηαζ 25 BLBP+ ηφηηανα ζηα Fl/koNestinCre έιανοα, Δζηυκα 3.16 δζάβναιια Γ ηαζ πίκαηαξ Ζ). Γζα κα παναημθμοεήζμοιε πνμκζηά ηδ ιεηάααζδ ζηα ηφηηανα ηδξ αηηζκςηήξ βθμίαξ ημο θθμζμφ, πναβιαημπμζήεδηακ πεζνάιαηα ακμζμθεμνζζιμφ βζα ηδκ πνςηεΐκδ BLBP ηαζ ζε έιανοα δθζηίαξ Δ14.5 (Δζηυκα 3.16Γ-Ε). Ζ πμζμηζημπμίδζδ ηςκ BLBP+ ηοηηάνςκ ζηδκ δθζηία αοηή ηαηέδεζλε υηζ μζ ακηίζημζπμζ ηοηηανζημί πθδεοζιμί δεκ δζαθένμοκ ιεηαλφ ηςκ WT ηαζ Fl/koNestinCre ειανφςκ. Σμ βεβμκυξ αοηυ ζδιαίκεζ υηζ μ BLBP+ πθδεοζιυξ βνήβμνα απμηαηάζηαεδηε ηαζ επακήθεε ζηα θοζζμθμβζηά επίπεδα. Σα εονήιαηα αοηά οπμζηδνίγμοκ υηζ δ πνςηεΐκδ Geminin νοειίγεζ πνμκζηά ηδ ιεηάααζδ απυ ημκ πνχζιμ πθδεοζιυ ηςκ κεονμεπζεδθζαηχκ ηοηηάνςκ ζημκ πθδεοζιυ ηςκ ηοηηάνςκ ηδξ αηηζκςηήξ βθμίαξ. Ζ ιεηάααζδ ηςκ κεονμεπζεδθζαηχκ ηοηηάνςκ ζε ηφηηανα ηδξ αηηζκςηήξ βθμίαξ ηαζ δ αθθαβή ζημκ ηνυπμ δζαίνεζδξ πμο αοηή ζοκεπάβεηαζ, απυ ζοιιεηνζηυ ηνυπμ δζαίνεζδξ πμο δίκεζ βέκεζδ ιυκμ ζε κεονμεπζεδθζαηά ηφηηανα ζε αζφιιεηνμ ηνυπμ δζαίνεζδξ απυ ημκ μπμίμ πνμηφπημοκ ηυζμ ηφηηανα ηδξ αηηζκςηήξ βθμίαξ υζμ ηαζ ααζζηά πνυδνμια ηφηηανα ηαζ κεονχκεξ, ζοζπεηίγμκηαζ ιε αθθαβέξ ζηδ δζάνηεζα ημο ηοηηανζημφ ημοξ ηφηθμο (Takahashi et al., 1995; Gotz and Huttner, 2005). Ζ πνυμδμξ ηδξ κεονμβέκεζδξ ζημ θθμζυ αολάκεζ ημ πμζμζηυ ηςκ πνoβμκζηχκ ηοηηάνςκ 132

133 Απμηεθέζιαηα Δηθόλα Καζπζηεξεκέλε ωξίκαλζε ηωλ θπηηάξωλ ηεο αθηηλωηήο γινίαο ζην θινηό ηωλ Fl/koNestinCre κπώλ. Γηα λα εθηηκεζεί ε κεηάβαζε ζηα θύηηαξα ηεο αθηηλσηήο γινίαο πξαγκαηνπνηήζεθαλ πεηξάκαηα αλνζνθζνξηζκνύ κε εηδηθό αληίζσκα έλαληη ηεο πξσηεΐλεο BLBP (πξάζηλν), πνπ εθθξάδεηαη ζηα θύηηαξα ηεο αθηηλσηήο γινίαο, θαη ζηε ζπλέρεηα πνζνηηθνπνηήζεθε ν πιεζπζκόο ησλ BLBP+ θπηηάξσλ ζην θινηό WT θαη Fl/koNestinCre εκβξύσλ ειηθίαο Δ12.5 (Α-Γ) θαη Δ14.5 (Γ-Ε). Οη ππξήλεο ησλ θπηηάξσλ απνηππώλνληαη κε ηε ρξσζηηθή Σoto-3 (κπιε). Ζ αλάιπζε πξαγκαηνπνηήζεθε κε ζπλεζηηαθή κηθξνζθνπία. Ο πίλαθαο Ζ απεηθνλίδεη ηηο αληίζηνηρεο πνζνηηθνπνηήζεηο, νη νπνίεο αληηζηνηρνύλ ζην κέζν όξν ησλ πεηξακάησλ (νη αξηζκνί ζηελ παξέλζεζε αλαθέξνληαη ζην ζπλνιηθό αξηζκό θπηηάξσλ πνπ κεηξήζεθαλ). Σα απνηειέζκαηα απηά δείρλνπλ όηη ηα BLBP+ θύηηαξα εκθαλίδνληαη ζεκαληηθά κεησκέλα ζην θινηό ησλ Fl/koNestinCre εκβξύσλ ειηθίαο Δ12.5 αιιά όρη ζηα έκβξπα ειηθίαο Δ14.5. ΚΕ, θνηιηαθή δώλε. ΤΚΕ, ππνθνηιηαθή δώλε. Σα δεδνκέλα απνδίδνληαη σο κέζνο όξνο ± SD. n=3. ***p πμο έπμοκ ηαεμνζζηεί κα δχζμοκ βέκεζδ ζε κεονχκεξ, ηαζ αοηυ ζοκμδεφεηαζ απυ αφλδζδ ηδξ δζάνηεζαξ ημο ηοηηανζημφ ημοξ ηφηθμο (Takahashi et al., 1995; Calegari 133

134 Απμηεθέζιαηα et al., 2005; Dehay and Kennedy, 2007). Σα δεδμιέκα αοηά έεεζακ ςξ επυιεκμ ζηυπμ ιαξ ηδ δζενεφκδζδ πζεακχκ αθθαβχκ ζηδκ ηζκδηζηή ημο ηοηηανζημφ ηφηθμο ηςκ πνμβμκζηχκ ηοηηάνςκ ημο θθμζμφ ηςκ Fl/koNestinCre γχςκ (Δζηυκα 3.17). Γζα κα εηηζιήζμοιε ηδ δζάνηεζα ημο ηοηηανζημφ ηφηθμο αημθμοεήζαιε ηδκ ελήξ ζηναηδβζηή: έιανοα δθζηίαξ Δ12.5 ηαζ Δ14.5 απυ WT ηαζ Fl/koNestinCre ιφεξ εκέεδηακ ιε BrdU βζα 30 θεπηά χζηε κα εκζςιαηχζμοκ ημ ακάθμβμ ηαζ κα ζδιακεμφκ υζα πνμβμκζηά ηφηηανα ανίζημκηαζ ζηδκ S θάζδ ημο ηοηηανζημφ ηφηθμο. Μεηςπζαίεξ ημιέξ απυ ημοξ θθμζμφξ αοημφξ επελενβάζηδηακ ιε πεζνάιαηα δζπθμφ ακμζμθεμνζζιμφ ιε εζδζηά ακηζζχιαηα έκακηζ ημο BrdU ηαζ ημο δείηηδ Ki67, πμο παναηηδνίγεζ υθα ηα δζαζνμφιεκα ηφηηανα ακελάνηδηα ηδξ θάζδξ ημο ηοηηανζημφ ηφηθμο ζηδκ μπμία ανίζημκηαζ. Ακ μ νοειυξ ημο ηοηηανζημφ ηφηθμο εκυξ πθδεοζιμφ είκαζ πζμ βνήβμνμξ, ιεβαθφηενμ πμζμζηυ ηςκ Ki67+ ηοηηάνςκ εα έπμοκ εκζςιαηχζεζ ημ ακάθμβμ BrdU (Chenn and Walsh, 2002). Ζ πμζμηζημπμίδζδ αοηή έδεζλε υηζ μ ηοηηανζηυξ ηφηθμξ ηςκ πνμβμκζηχκ ηοηηάνςκ ηδξ ημζθζαηήξ γχκδξ ημο θθμζμφ ηςκ Δ12.5 ειανφςκ πμο πνμένπμκηαζ απυ ημοξ Fl/koNestinCre ιφεξ είκαζ ζδιακηζηά ζοκημιυηενμξ απυ ημκ ακηίζημζπμ ηςκ WT ειανφςκ, ηαεχξ ημ πμζμζηυ ηςκ Ki67+BrdU+/Ki67+ ηοηηάνςκ οπμθμβίζηδηε ζημ 50% βζα ηδκ πενίπηςζδ ηςκ WT ειανφςκ ηαζ ζημ 57% βζα ηα Fl/koNestinCre έιανοα (Δζηυκα 3.17 ζζηυβναιια Γ). Σα απμηεθέζιαηα αοηά δείπκμοκ υηζ ηα πνμβμκζηά κεονζηά ηφηηανα πμο δεκ εηθνάγμοκ Geminin δζαζνμφκηαζ βνδβμνυηενα ηαηά ηδ 12 δ ειανοσηή διένα, δζαθμνά πμο δεκ παναηδνείηαζ ηαηά ηδκ 14 δ ειανοσηή διένα (Δζηυκα 3.17 ζζηυβναιια Ε). Σα παναπάκς απμηεθέζιαηα αθμνμφκ ζημ πνυζεζμ ηιήια ημο εβηεθαθζημφ θθμζμφ, ιε ηζξ μπίζεζεξ πενζμπέξ κα ιδκ επζδεζηκφμοκ ζδζαίηενεξ δζαθμνέξ, βεβμκυξ πμο ηαηεφεοκε ηδκ οπυθμζπδ ιεθέηδ ιαξ ζηδ ζοβηεηνζιέκδ πενζμπή. οκμρίγμκηαξ, ηα απμηεθέζιαηά ιαξ οπμζηδνίγμοκ υηζ δ απμζζχπδζδ ημο βμκζδίμο ηδξ Geminin ζηα πνμβμκζηά ηφηηανα ημο θθμζμφ επδνεάγεζ ηδκ ηζκδηζηή ηδξ ηοηηανζηήξ δζαίνεζδξ ηαεχξ ηαζ ηδ ιεηάααζδ απυ ηα κεονμεπζεδθζαηά ζηα ηφηηανα ηδξ αηηζκςηήξ βθμίαξ ζηα πνχζια ζηάδζα ηδξ κεονμβέκεζδξ ζημ θθμζυ Ζ πξσηεΐλε Geminin ειέγρεη ηελ παξαγσγή ησλ πξνγνληθώλ θπηηάξσλ ηεο θνηιηαθήο δώλεο Ζ ηαεοζηενδιέκδ ιεηάααζδ ζηα ηφηηανα ηδξ αηηζκςηήξ βθμίαξ πμο επζδεζηκφμοκ ηα Fl/koNestinCre έιανοα ζημ πνυζεζμ ηιήια ημο θθμζμφ εα ιπμνμφζε κα έπεζ ςξ απμηέθεζια ηδ πνμκζηή δζεφνοκζδ ηδξ θεβυιεκδξ θάζδξ πμθθαπθαζζαζιμφ (expansion phase) ηςκ κεονμεπζεδθζαηχκ ηοηηάνςκ ηαζ ηδκ πανμδζηή αφλδζδ ημο πθδεοζιμφ ημοξ. Καεχξ ηα ιεηέπεζηα ημνοθαία ηφηηανα ηδξ ημζθζαηήξ γχκδξ ημο θθμζμφ πνμένπμκηαζ απυ ημκ πνχζιμ αοηυ ηοηηανζηυ πθδεοζιυ, ηα επυιεκα αήιαηα ηδξ ιεθέηδξ ιαξ εζηζάζηδηακ ζηα κεονζηά πνμβμκζηά ημνοθαία 134

135 Απμηεθέζιαηα Δηθόλα Η απαινηθή ηεο Geminin από ηνλ αλαπηπζζόκελν θινηό νδεγεί ζηελ επηηάρπλζε ηνπ θπηηαξηθνύ θύθινπ ηωλ πξνγνληθώλ θπηηάξωλ θαηά ηα πξώηκα ζηάδηα ηεο λεπξνγέλεζεο. WT θαη Fl/koNestinCre έκβξπα ειηθίαο Δ12.5 (Α-Γ) θαη Δ14.5 (Γ-Ε) δέρζεθαλ έλεζε BrdU δηάξθεηαο 30 ιεπηώλ ώζηε λα ζεκαλζνύλ ηα θύηηαξα πνπ βξίζθνληαη ζηελ S θάζε ηνπ θπηηαξηθνύ θύθινπ. Πξαγκαηνπνηήζεθαλ πεηξάκαηα δηπινύ αλνζνθζνξηζκνύ ζε κεησπηαίεο ηνκέο από ηα παξαπάλσ έκβξπα κε εηδηθά αληηζώκαηα έλαληη ησλ Ki67 (πξάζηλν) θαη BrdU (θόθθηλν) θαη πνζνηηθνπνηήζεθε ην πνζνζηό ησλ Ki67+ θπηηάξσλ πνπ ζπλεθθξάδεη BrdU. ηνλ πίλαθα Ζ απνηππώλνληαη νη αληίζηνηρεο πνζνηηθνπνηήζεηο. Οη ππξήλεο ησλ θπηηάξσλ απεηθνλίδνληαη κε ηε ρξσζηηθή Σνtν-3 (κπιε), ελώ ε αλάιπζε έγηλε κε ζπλεζηηαθή κηθξνζθνπία. Σα απνηειέζκαηα απηά δείρλνπλ όηη ηα πξνγνληθά θύηηαξα ηεο θνηιηαθήο δώλεο ησλ Fl/koNestinCre εκβξύσλ επηδεηθλύνπλ γξεγνξόηεξν ξπζκό θπηηαξηθήο δηαίξεζεο θαηά ην ζηάδην Δ12.5 αιιά όρη ζην ζηάδην Δ14.5. ΚΕ, θνηιηαθή δώλε. ΤΚΕ, ππνθνηιηαθή δώλε. Σα δεδνκέλα απνδίδνληαη σο κέζνο όξνο ± SD. n=4, **p ηφηηανα ζε ιεηαβεκέζηενα ειανοσηά ζηάδζα, πνμαθέπμκηαξ ιζα αφλδζδ ζημκ πθδεοζιυ ημοξ. 135

136 Απμηεθέζιαηα Ανπζηά εηηζιήεδηε μ ανζειυξ ηςκ εκενβά δζαζνμφιεκςκ πνμβμκζηχκ ηοηηάνςκ ηδξ ημζθζαηήξ γχκδξ ειανφςκ δθζηίαξ Δ14.5 πμο εηθνάγμοκ ημκ δείηηδ Ki67 (Eζηυκα 3.18). Πεζνάιαηα ακμζμθεμνζζιμφ ζε ιεηςπζαίεξ ημιέξ ζημ επίπεδμ ημο πνυζεζμο θθμζμφ απυ WT (Δζηυκα 3.18Α) ηαζ Fl/koNestinCre (Δζηυκα 3.18Β) έιανοα έδεζλακ υηζ μ ανζειυξ ηςκ Ki67+ ηοηηάνςκ ζηδκ ημζθζαηή γχκδ ημο θθμζμφ ηςκ Fl/koNestinCre ειανφςκ είκαζ αολδιέκμξ (138 Ki67+ ηφηηανα ζηα WT έιανοα ηαζ 179 Ki67+ ηφηηανα ζηα Fl/koNestinCre έιανοα, Δζηυκα 3.18 ζζηυβναιια Γ ηαζ πίκαηαξ Κ). ηδ ζοκέπεζα ελεηάζηδηε μ ανζειυξ ηςκ ηοηηάνςκ πμο ανίζημκηαζ ζηδκ S θάζδ ημο ηοηηανζημφ ηφηθμο ιεηά απυ έκεζδ BrdU ζε Δ14.5 έβηομοξ εδθοημφξ ιφεξ ηαζ απμιυκςζδ ηςκ ειανφςκ 30 θεπηά ανβυηενα. Δζδζηυ ακηίζςια έκακηζ ημο BrdU πνδζζιμπμζήεδηε ζε πεζνάιαηα ακμζμθεμνζζιμφ ζε ιεηςπζαίεξ ημιέξ πνυζεζμο θθμζμφ απυ WT (Δζηυκα 3.18Γ) ηαζ Fl/koNestinCre (Δζηυκα 3.18Δ) έιανοα. Ζ πμζμηζημπμίδζδ ηςκ BrdU+ πθδεοζιχκ ηαηέδεζλε υηζ δ ημζθζαηή γχκδ ημο θθμζμφ ηςκ Fl/koNestinCre ειανφςκ πενζέπεζ πενζζζυηενα πνμβμκζηά ηφηηανα πμο ανίζημκηαζ ζηδκ S θάζδ ημο ηοηηανζημφ ηφηθμο ζε ζπέζδ ιε ηα WT έιανοα (61 BrdU+ ηφηηανα ζηα WT έιανοα ηαζ 85 BrdU+ ηφηηανα ζηα Fl/koNestinCre έιανοα, Δζηυκα 3.18 ζζηυβναιια Ε ηαζ πίκαηαξ Κ). ηδ ζοκέπεζα δζενεοκήεδηε ακ μ παναπάκς θαζκυηοπμξ ελαημθμοεεί κα οπάνπεζ ηαζ ζε ιεηαβεκέζηενα ζηάδζα ηδξ κεονμβέκεζδξ ημο θθμζμφ. Γζα ημ ζημπυ αοηυ ελεηάζηδηε μ θθμζυξ ειανφςκ δθζηίαξ Δ18.5, έκα ηεθζηυ ζηάδζμ ζηδκ κεονμβεκεηζηή ακάπηολδ ημο θθμζμφ. Μεηά απυ πνχζδ ιεηςπζαίςκ ημιχκ ζημ πνυζεζμ επίπεδμ ημο θθμζμφ ιε Toto-3, ιζα πνςζηζηή πμο ζδιαίκεζ ημ DNA ηςκ ηοηηάνςκ, ηαζ αηυθμοεδ πμζμηζημπμίδζδ ημο ζοκμθζημφ ανζειμφ ηοηηάνςκ πμο ανίζημκηαζ ζηδκ ημζθζαηή γχκδ, παναηδνήεδηε υηζ ηα Fl/koNestinCre έιανοα πανμοζζάγμοκ ιζα αολδιέκδ ζε πάπμξ ημζθζαηή γχκδ ζε ζπέζδ ιε ηα WT έιανοα, ηαεχξ δ πνχηδ πενζθαιαάκεζ πενίπμο 20% πενζζζυηενα ηφηηανα (Δζηυκα 3.18 ζζηυβναιια Η ηαζ πίκαηαξ Κ). Σα απμηεθέζιαηά ιαξ δείπκμοκ υηζ μ πθδεοζιυξ ηςκ ηοηηάνςκ ηδξ ημζθζαηήξ γχκδξ ημο θθμζμφ ελαημθμοεεί κα ειθακίγεηαζ ζδζαίηενα αολδιέκμξ ηαζ ζε αοηυ ημ ακαπηολζαηυ ζηάδζμ (Δζηυκα 3.18Ζ-Η). Σμ επυιεκμ ενχηδια πμο δζενεοκήεδηε ήηακ μ πνμζδζμνζζιυξ ηδξ ιμνζαηήξ ηαοηυηδηαξ ηςκ παναπάκς πνμβμκζηχκ ηοηηάνςκ πμο ειθακίγμκηαζ ζε αολδιέκμοξ ανζειμφξ απμοζία ηδξ πνςηεΐκδξ Geminin. Γζα ημ ζημπυ αοηυ εθέβπεδηε ημ πνυηοπμ έηθναζδξ ημο ιεηαβναθζημφ πανάβμκηα Pax6, μ μπμίμξ παναηηδνίγεζ ηα κεονμβεκεηζηά ηφηηανα ηδξ αηηζκςηήξ βθμίαξ (Gotz and Barde, 2005), ιε πεζνάιαηα ακμζμθεμνζζιμφ ζε ιεηςπζαίεξ ημιέξ πνυζεζμο θθμζμφ απυ WT ηαζ Fl/koNestinCre έιανοα δθζηίαξ Δ18.5 ιε εζδζηυ ακηίζςια έκακηζ ημο πανάβμκηα Pax6 (Δζηυκα 3.19) Ο πθδεοζιυξ ηςκ Pax6+ ηοηηάνςκ ειθακίγεηαζ αολδιέκμξ ιεηαλφ ηςκ πνμβμκζηχκ ηοηηάνςκ ηδξ ημζθζαηήξ γχκδξ ημο θθμζμφ ηςκ Δ18.5 Fl/koNestinCre ειανφςκ ζε ζφβηνζζδ ιε ηα ακηίζημζπα WT έιανοα (Δζηυκα 3.19 ζζηυβναιια Γ). 136

137 Απμηεθέζιαηα Δλάβεηαζ επμιέκςξ ημ ζοιπέναζια υηζ δ απμοζία έηθναζδξ ηδξ πνςηεΐκδξ Geminin απυ ημκ ακαπηοζζυιεκμ εβηεθαθζηυ θθμζυ ημο ιουξ έπεζ ςξ απμηέθεζια ηδκ παναβςβή ζε αολδιέκμοξ ανζειμφξ πνμβμκζηχκ, εκενβά δζαζνμφιεκςκ, κεονμβεκεηζηχκ ηοηηάνςκ αηηζκςηήξ βθμίαξ ζηδκ ημζθζαηή γχκδ. 137

138 Απμηεθέζιαηα Δηθόλα Η απνζηώπεζε ηεο έθθξαζεο ηεο Geminin έρεη ωο απνηέιεζκα ηνλ απμεκέλν αξηζκό θνξπθαίωλ θινηϊθώλ πξνγνληθώλ θπηηάξωλ. Πξαγκαηνπνηήζεθαλ πεηξάκαηα αλνζνθζνξηζκνύ ζε κεησπηαίεο ηνκέο WT θαη Fl/koNestinCre Δ14.5 εκβξύσλ κε εηδηθά αληηζώκαηα έλαληη ησλ Ki67 (Α-Γ, πξάζηλν) θαη BrdU (Γ-Ε, θόθθηλν). Οη ππξήλεο ησλ θπηηάξσλ εκβξύσλ ειηθίαο Δ18.5 απνηππώζεθαλ κε ηε ρξσζηηθή Toto-3 θαη πνζνηηθνπνηήζεθαλ (Ζ-Η, κπιε). Οη θσηνγξαθίεο πξνέξρνληαη από ζπλεζηηαθό κηθξνζθόπην. Σα θύηηαξα ηεο θνηιηαθήο δώλεο πνπ εθθξάδνπλ ηνλ γεληθό κηησηηθό δείθηε Ki67 είλαη ζεκαληηθά πεξηζζόηεξα ζηα Fl/koNestinCre έκβξπα (δηάγξακκα Γ). Σν ίδην ηζρύεη θαη γηα ηα θύηηαξα πνπ βξίζθνληαη ζηελ S θάζε ηνπ θπηηαξηθνύ θύθινπ θαη έρνπλ ζεκαλζεί κε BrdU έλεζε δηάξθεηαο 30 ιεπηώλ (δηάγξακκα Ε). Σν θαηλόκελν απηό εμαθνινπζεί θαη ζηα Fl/koNestinCre έκβξπα ειηθίαο Δ18.5, ηα νπνία εκθαλίδνπλ απμεκέλε θπηηαξνβξύζεηα ζηελ θνηιηαθή δώλε ηνπ πξόζζηνπ θινηνύ (ηζηόγξακκα Η). Ο πίλαθαο Κ απεηθνλίδεη ηηο αληίζηνηρεο πνζνηηθνπνηήζεηο, νη νπνίεο αληηζηνηρνύλ ζην κέζν όξν ησλ πεηξακάησλ (νη αξηζκνί ζηελ παξέλζεζε αλαθέξνληαη ζην ζπλνιηθό αξηζκό θπηηάξσλ πνπ κεηξήζεθαλ). ΚΕ, θνηιηαθή δώλε. ΤΚΕ, ππνθνηιηαθή δώλε. Σα δεδνκέλα απνδίδνληαη σο κέζνο όξνο ± SD. n=4, *p 0.05, **p Δηθόλα Η απνπζία ηεο πξωηεΐλεο Geminin από ηνλ αλαπηπζζόκελν θινηό νδεγεί ζε απμεκέλν αξηζκό Pax6+ θπηηάξωλ ζηελ θνηιηαθή δώλε. Φσηνγξαθίεο ζπλεζηηαθνύ κηθξνζθνπίνπ από κεησπηαίεο ηνκέο ζην επίπεδν ηνπ πξόζζηνπ θινηνύ από WT (Α) θαη Fl/koNestinCre (Β) έκβξπα πνπ επεμεξγάζηεθαλ γηα πεηξάκαηα αλνζνθζνξηζκνύ κε εηδηθό αληίζσκα έλαληη ηνπ κεηαγξαθηθνύ παξάγνληα Pax6 (θόθθηλν). Με κπιε απεηθνλίδνληαη νη ππξήλεο ησλ θπηηάξσλ κεηά από ρξώζε κε Σνtν- 3. Ζ πνζνηηθνπνίεζε ησλ Pax6+ θπηηάξσλ έδεημε όηη ν ζπγθεθξηκέλνο θπηηαξηθόο πιεζπζκόο παξνπζηάδεηαη απμεκέλνο κεηαμύ ησλ θπηηάξσλ ηεο θνηιηαθήο δώλεο (δηάγξακκα Γ). Ο πίλαθαο Γ απεηθνλίδεη ηηο αληίζηνηρεο κεηξήζεηο, νη νπνίεο αληηζηνηρνύλ ζην κέζν όξν ησλ πεηξακάησλ (νη αξηζκνί ζηελ πaξέλζεζε αλαθέξνληαη ζην ζπλνιηθό αξηζκό θπηηάξσλ πνπ κεηξήζεθαλ). ΚΕ, θνηιηαθή δώλε. ΤΚΕ, ππνθνηιηαθή δώλε. Σα δεδνκέλα απνδίδνληαη σο κέζνο όξνο ± SD. n=3, *p

139 Απμηεθέζιαηα Ζ πξσηεΐλε Geminin ξπζκίδεη ην κνξηαθό ραξαθηήξα ησλ πξόδξνκσλ θπηηάξσλ ηεο ππνθνηιηαθήο δώλεο Σα ηφηηανα ηδξ αηηζκςηήξ βθμίαξ πμο εδνάγμκηαζ ζηδκ ημζθζαηή γχκδ ημο ακαπηοζζυιεκμο θθμζμφ δζαζνμφκηαζ ηαηά ηνυπμ ηονίςξ αζφιιεηνμ, χζηε κα δχζμοκ βέκεζδ ζε έκα ίδζμ ηφηηανμ ηαζ είηε ζε έκα ααζζηυ πνυδνμιμ ηφηηανμ ηδξ οπμημζθζαηήξ γχκδξ είηε ζε έκα δζαθμνμπμζδιέκμ κεονζηυ ηφηηανμ, πμο εα ιεηακαζηεφζεζ αηηζκςηά χζηε κα ηαηαθάαεζ ηδ εέζδ ημο ζηδ θθμζσηή πθάηα (Haubensak et al., 2004; Gotz and Huttner, 2005; Kriegstein et al., 2006). Σα εκενβχξ δζαζνμφιεκα ααζζηά πνυδνμια ηφηηανα ηαοημπμζήεδηακ ιέζς ηδξ εκζςιάηςζδξ ημο ακαθυβμο ηδξ εοιζδίκδξ BrdU βζα 30 θεπηά, πμο πνμζδζμνίγεζ ηα ααζζηά ηφηηανα πμο δζένπμκηαζ απυ ηδ θάζδ S ημο ηοηηανζημφ ηφηθμο. Σα ζδιαζιέκα ηφηηανα ηαοημπμζήεδηακ ζε WT ηαζ Fl/koNestinCre έιανοα δθζηίαξ Δ14.5 ιε πεζνάιαηα δζπθμφ ακμζμθεμνζζιμφ πνδζζιμπμζχκηαξ εζδζηά ακηζζχιαηα έκακηζ ημο BrdU αθθά ηαζ ημο βεκζημφ δείηηδ δζαζνμφιεκςκ ηοηηάνςκ Ki67 (Δζηυκα 3.18). Οζ Ki67+ ηαζ BrdU+ ηοηηανζημί πθδεοζιμί ηδξ οπμημζθζαηήξ γχκδξ πμζμηζημπμζήεδηακ ηαζ μζ ιεηνήζεζξ αοηέξ ηαηέδεζλακ υηζ μ ζπδιαηζζιυξ ηςκ ααζζηχκ πνυδνμιςκ ηοηηάνςκ δεκ επδνεάγεηαζ απυ ηδκ απμοζία έηθναζδξ ηδξ πνςηεΐκδξ Geminin, ηαεχξ μζ ιεηνμφιεκμζ πθδεοζιμί Ki67+ ηαζ BrdU+ ηοηηάνςκ ακένπμκηαζ ζε πανυιμζεξ ηζιέξ ιεηαλφ ηςκ WT ηαζ Fl/koNestinCre Δ14.5 ειανφςκ (25 Ki67+ ηαζ 20 BrdU+ ηφηηανα ζηα WT, 32 Ki67+ ηαζ 23 BrdU+ ηφηηανα ζηα Fl/koNestinCre έιανοα, ζζημβνάιιαηα Γ ηαζ Ε Δζηυκαξ 3.18). Ακηίζημζπα απμηεθέζιαηα πνμέηορακ ηαζ απυ ηδκ ελέηαζδ ημο ζοκμθζημφ πθδεοζιμφ ηδξ οπμημζθζαηήξ γχκδξ ζε WT ηαζ Fl/koNestinCre έιανοα δθζηίαξ Δ18.5 (Δζηυκα 3.18Ζ-Η). Σα δεδμιέκα αοηά οπμζηδνίγμοκ υηζ δ παναβςβή ηςκ ααζζηχκ πνυδνμιςκ ηοηηάνςκ δεκ επδνεάγεηαζ ζε ζοκεήηεξ απμοζίαξ έηθναζδξ ηδξ πνςηεΐκδξ ηδξ Geminin αθθά υηζ αοηά ζπδιαηίγμκηαζ ζε θοζζμθμβζημφξ ανζειμφξ. Ζ δζαδζηαζία ηαεμνζζιμφ ηςκ ημνοθαίςκ ηοηηάνςκ ηδξ ημζθζαηήξ γχκδξ πμο εα ιεηαζπδιαηζζημφκ ζε κεονμβεκεηζηά ααζζηά πνυδνμια ηφηηανα ηαζ εα ιεηακαζηεφζμοκ έλς απυ ηδκ ημζθζαηή γχκδ χζηε κα ζπδιαηίζμοκ ηδκ οπμημζθζαηή γχκδ πενζθαιαάκεζ ηδκ έηθναζδ εκυξ ιμνίμο-ηθεζδζμφ ημο παναπάκς ιδπακζζιμφ, ημο ιεηαβναθζημφ πανάβμκηα Tbr2 (Englund et al., 2005). Καεχξ δ έηθναζδ ημο ιμνίμο αοημφ είκαζ γςηζηήξ ζδιαζίαξ βζα ημκ ηαεμνζζιυ ηςκ ααζζηχκ ηοηηάνςκ, δζενεοκήεδηακ ηα επίπεδα έηθναζδξ αοημφ ημο ιεηαβναθζημφ πανάβμκηα (Δζηυκα 3.20). Πεζνάιαηα ακμζμθεμνζζιμφ δζεκενβήεδηακ ζε ιεηςπζαίεξ ημιέξ εβηεθάθμο ζημ επίπεδμ ημο πνυζεζμο θθμζμφ ιε εζδζηυ ακηίζςια έκακηζ ημο ιμνίμο Tbr2 (Δζηυκα 3.20Α-Β, πνάζζκμ). Μεηά απυ πμζμηζημπμίδζδ ημο Tbr2+ πθδεοζιμφ απμηαθφθεδηε υηζ ηα Tbr2+ ηφηηανα ζημ ζφκμθμ ηδξ ημζθζαηήξ ηαζ οπμημζθζαηήξ γχκδξ ειθακίγμκηαζ αολδιέκα ηαηά ζπεδυκ 27% ζηα Δ18.5 Fl/koNestinCre ζε ζφβηνζζδ ιε ηα WT έιανοα (Δζηυκα 3.20 δζάβναιια Γ ηαζ πίκαηαξ Γ). 139

140 Απμηεθέζιαηα οιπεναζιαηζηά, ηα παναπάκς δεδμιέκα οπμζηδνίγμοκ υηζ ζε ζοκεήηεξ απμοζίαξ ηδξ πνςηεΐκδξ Geminin απυ ημκ ακαπηοζζυιεκμ εβηεθαθζηυ θθμζυ, ηα ααζζηά πνυδνμια ηφηηανα ηδξ οπμημζθζαηήξ γχκδξ ζπδιαηίγμκηαζ ιεκ ζε θοζζμθμβζημφξ ανζειμφξ αθθά ημ πμζμζηυ πμο εηθνάγεζ ημκ ηαεμνζζηζηυ ιεηαβναθζηυ πανάβμκηα Tbr2 ειθακίγεηαζ ζδιακηζηά αολδιέκμ. Δηθόλα Σν πνζνζηό ηωλ βαζηθώλ πξόδξνκωλ θπηηάξωλ πνπ εθθξάδεη ηνλ παξάγνληα Tbr2 είλαη απμεκέλν απνπζία ηεο Geminin. Πξαγκαηνπνηήζεθαλ πεηξάκαηα αλνζνθζνξηζκνύ ζε κεησπηαίεο ηνκέο ζην επίπεδν ηνπ πξόζζηνπ θινηνύ από WT (Α) θαη Fl/koNestinCre (Β) Δ18.5 έκβξπα ρξεζηκνπνηώληαο εηδηθό αληίζσκα γηα ην κεηαγξαθηθό παξάγνληα θαζνξηζκνύ ησλ βαζηθώλ πξόδξνκσλ θπηηάξσλ Tbr2 (πξάζηλν). Οη πνζνηηθνπνηήζεηο ησλ Tbr2+ θπηηάξσλ θαίλνληαη ζηνλ πίλαθα Γ, όπνπ απνδίδνληαη σο κέζνο όξνο ησλ πεηξακάησλ, ελώ νη αξηζκνί ζηελ παξέλζεζε αλαθέξνληαη ζην ζπλνιηθό αξηζκό θπηηάξσλ πνπ κεηξήζεθαλ. Με κπιε απεηθνλίδνληαη νη ππξήλεο ησλ θπηηάξσλ κεηά από ρξώζε κε Σνtν-3. Οη θσηνγξαθίεο πξνέξρνληαη από ζπλεζηηαθό κηθξνζθόπην. Σα πεηξάκαηα απηά δείρλνπλ όηη κεγαιύηεξν πνζνζηό ησλ βαζηθώλ πξόδξνκσλ θπηηάξσλ είλαη ζεηηθό σο πξνο ηελ έθθξαζε ηνπ κνξίνπ Tbr2 ζηα Fl/koNestinCre έκβξπα (ηζηόγξακκα Γ). ΚΕ, θνηιηαθή δώλε. ΤΚΕ, ππνθνηιηαθή δώλε. Σα δεδνκέλα απνδίδνληαη σο κέζνο όξνο ± SD. n=3, *p Ζ απνπζία έθθξαζεο ηεο Geminin νδεγεί ζην ζρεκαηηζκό απμεκέλσλ αξηζκώλ θαζνξηζκέλσλ πξόδξνκσλ λεπξηθώλ θπηηάξσλ θαη δηαθνξνπνηεκέλσλ λεπξώλσλ Σα έςξ ηχνα απμηεθέζιαηά ιαξ δείπκμοκ υηζ δ απμοζία ηδξ Geminin μδδβεί ζε αφλδζδ ημο πθδεοζιμφ ηςκ κεονμβεκεηζηχκ πνμβμκζηχκ θθμζσηχκ ηοηηάνςκ, ηυζμ ηδξ ημζθζαηήξ (Pax6+) υζμ ηαζ ηδξ οπμημζθζαηήξ γχκδξ (Tbr2+). 140

141 Απμηεθέζιαηα Ζ δζαδζηαζία ιεηάααζδξ απυ ηα πνμβμκζηά αδζαθμνμπμίδηα ηφηηανα ζημοξ χνζιμοξ κεονχκεξ πνμτπμεέηεζ ηδ δνάζδ ηςκ θεβυιεκςκ πνμκεονζηχκ πνςηεσκχκ ηδξ μιάδαξ ηςκ ιεηαβναθζηχκ παναβυκηςκ πμο παναηηδνίγμκηαζ απυ ημ ιμηίαμ έθζηα-ζηνμθή-έθζηα (basic helix-loop-helix, bhlh). Ζ έηθναζδ ηςκ πνμκεονζηχκ αοηχκ πνςηεσκχκ πνμηαεμνίγεζ ηα πνμβμκζηά ηφηηανα πνμξ κεονςκζηή δζαθμνμπμίδζδ (Bertrand et al., 2002; Schuurmans et al., 2004; Britz et al., 2006). ηδ ζοκέπεζα δζενεοκήζαιε ηζξ πζεακέξ επζδνάζεζξ ηδξ απμοζίαξ έηθναζδξ ηδξ πνςηεΐκδξ Geminin ζηδ ιεηάααζδ πνμξ ηα πνμηαεμνζζιέκα πνυδνμια κεονζηά ηφηηανα ελεηάγμκηαξ ημ πνυηοπμ έηθναζδξ ηδξ πνμκεονζηήξ πνςηεΐκδξ Mash1 (Δζηυκα 3.21). Πεζνάιαηα ακμζμθεμνζζιμφ πναβιαημπμζήεδηακ ζε ημιέξ ζημ επίπεδμ ημο πνυζεζμο θθμζμφ απυ Δ18.5 WT (Δζηυκα 3.21Α) ηαζ Fl/koNestinCre (Δζηυκα 3.21Β) έιανοα ιε εζδζηυ ακηίζςια έκακηζ ημο ιεηαβναθζημφ πανάβμκηα Mash1 ηαζ ιεηνήεδηε μ ζοκμθζηυξ πθδεοζιυξ ηςκ Mash1+ ηοηηάνςκ, ζημ ζφκμθμ ηςκ γςκχκ ημο ακαπηοζζυιεκμο θθμζμφ. Ο Mash1+ πθδεοζιυξ πανμοζζάγεηαζ ζδζαίηενα αολδιέκμξ ζημκ πνυζεζμ θθμζυ ηςκ Fl/koNestinCre ζε ζπέζδ ιε ημκ πνυζεζμ θθμζυ ηςκ WT ειανφςκ, ηαηά έκα πμζμζηυ πμο αββίγεζ ημ 50% (Δζηυκα 3.21 ζζηυβναιια Δ ηαζ πίκαηαξ Ζ). Καεχξ δ ακάθοζδ ηδξ οπενέηθναζδξ ηδξ πνςηεΐκδξ ηδξ Geminin ζημ θθμζυ απμηάθορε υηζ ζηζξ ζοκεήηεξ αοηέξ πνμςεείηαζ δ έλμδμξ ηςκ πνμβμκζηχκ ηοηηάνςκ απυ ημκ ηοηηανζηυ ηφηθμ χζηε κα λεηζκήζεζ δ κεονςκζηή ημοξ δζαθμνμπμίδζδ, εεθήζαιε κα ελεηάζμοιε ακ ηαζ δ απμζζχπδζδ ηδξ πνςηεΐκδξ επζδνά ζημ θαζκυιεκμ αοηυ. Γζα ημ ζημπυ αοηυ πναβιαημπμζήεδηακ ΒrdU εκέζεζξ ζε έβηομοξ εδθοημφξ ιφεξ, χζηε ημ κμοηθεμηζδζηυ ακάθμβμ κα εκζςιαηςεεί ζηα ηφηηανα πμο ανίζημκηαζ ζε εκενβυ πμθθαπθαζζαζιυ, ηαζ ηα έιανοα απμιμκχεδηακ 24 χνεξ ανβυηενα. ημ δζάζηδια αοηχκ ηςκ 24 ςνχκ ηάπμζα απυ ηα πνμβμκζηά ηφηηανα πμο είπακ εκζςιαηχζεζ ημ BrdU ζηαιάηδζακ κα δζαζνμφκηαζ ηαζ άνπζζακ κα δζαθμνμπμζμφκηαζ πνμξ κεονζηά ηφηηανα, εηθνάγμκηαξ έηζζ ημ κεονςκζηυ δείηηδ Tuj1. Δπμιέκςξ, ηα ηφηηανα πμο είκαζ BrdU+Tuj1+ έπμοκ αβεζ απυ ημκ ηοηηανζηυ ηφηθμ ζηδ δζάνηεζα ηςκ 24 ςνχκ πμο δζήνηεζε δ έκεζδ BrdU (Δζηυκα 3.21). Με πεζνάιαηα δζπθμφ ακμζμθεμνζζιμφ πνμζδζμνίζηδηακ ηα BrdU+Tuj1+ ηφηηανα ζε ιεηςπζαίεξ ημιέξ ημο πνυζεζμο θθμζμφ απυ Δ15.5 WT (Δζηυκα 3.20Γ) ηαζ Fl/koNestinCre (Δζηυκα 3.20Γ) έιανοα. Ζ πμζμηζημπμίδζδ ηςκ BrdU+Tuj1+ ηοηηάνςκ δεκ ακέδεζλε δζαθμνέξ ιεηαλφ WT ηαζ Fl/koNestinCre ιοχκ (Δζηυκα 3.20 ζζηυβναιια Ε ηαζ πίκαηαξ Ζ). Ακ ηαζ μ νοειυξ δζαθμνμπμίδζδξ ηςκ πνμβμκζηχκ ηοηηάνςκ δεκ θαίκεηαζ κα αθθάγεζ ζημ θθμζυ ηςκ ειανφςκ πμο δεκ εηθνάγμοκ ηδκ πνςηεΐκδ Geminin, ημ βεβμκυξ υηζ ηα έιανοα αοηά πενζέπμοκ αολδιέκμ ανζειυ κεονμβεκεηζηχκ πνμβμκζηχκ ηοηηάνςκ ηα μπμία δζαθμνμπμζμφκηαζ ζε θοζζμθμβζημφξ νοειμφξ, πνμηείκεζ ιζα αφλδζδ ζημκ ανζειυ ηςκ χνζιςκ κεονχκςκ. Πνμηεζιέκμο κα ελεηαζηεί αοηή δ οπυεεζδ πναβιαημπμζήεδηακ πεζνάιαηα ακμζμθεμνζζιμφ πνδζζιμπμζχκηαξ εζδζηυ ακηίζςια έκακηζ ηδξ πνςηεΐκδξ NeuN πμο απμηεθεί έκα δείηηδ ηςκ πθήνςξ 141

142 Απμηεθέζιαηα δζαθμνμπμζδιέκςκ κεονζηχκ ηοηηάνςκ (Δζηυκα 3.22). Οζ πμζμηζημπμζήζεζξ ηςκ NeuN+ πθδεοζιχκ ιεηαλφ ηςκ πνυζεζςκ θθμζχκ ηςκ WT (Δζηυκα 3.22Α) ηαζ Fl/koNestinCre (Δζηυκα 3.22Β) ιοχκ επζαεααίςζακ ηδκ πνυαθερή ιαξ, ηαεχξ μ εκ Δηθόλα Η απνπζία ηεο πξωηεΐλεο Geminin νδεγεί ζηελ αύμεζε ηωλ Mash1+ θπηηάξωλ αιιά δελ επεξεάδεη ηελ έμνδν ηωλ πξνγνληθώλ θπηηάξωλ από ηνλ θπηηαξηθό θύθιν. (Α,Β,Δ) Μεησπηαίεο ηνκέο θινηνύ από WT θαη Fl/koNestinCre Δ18.5 έκβξπα ειέγρζεθαλ γηα ηελ έθθξαζε ηεο πξνλεπξηθήο πξσηεΐλεο Mash1 (θόθθηλν). Ζ πνζνηηθνπνίεζε ηνπ ζπλνιηθνύ πιεζπζκνύ ησλ Mash1+ θπηηάξσλ ζε όιεο ηηο δώλεο ηνπ πξόζζηνπ θινηνύ απεηθνλίδεηαη ζην γξάθεκα Δ, όπνπ θαίλεηαη ν απμεκέλνο αξηζκόο ηνπο ζηελ πεξίπησζε ησλ Fl/koNestinCre εκβξύσλ. (Γ,Γ,Ε) Σν πνζνζηό ησλ BrdU+Tuj1+ θπηηάξσλ (Γ,Γ, βέιε) δελ δηαθέξεη κεηαμύ ησλ WT θαη Fl/koNestinCre Δ15.5 θινηώλ (δηάγξακκα Ε). Ο ξπζκόο λεπξηθήο δηαθνξνπνίεζεο ππνινγίδεηαη εθθξάδνληαο ηνλ παξαπάλσ θπηηαξηθό πιεζπζκό ζαλ πνζνζηό ηνπ ζπλνιηθνύ BrdU+ πιεζπζκνύ. ηνλ πίλαθα Ζ απεηθνλίδνληαη νη αληίζηνηρεο κεηξήζεηο. Οη εηθόλεο πξνέξρνληαη από ηε ζύλζεζε επηκέξνπο θσηνγξαθηώλ θαη ειήθζεζαλ ζε ζπλεζηηαθό κηθξνζθόπην. Με κπιε απεηθνλίδνληαη νη ππξήλεο ησλ θπηηάξσλ κεηά από ρξώζε κε Σνtν-3. ΦΠ, θινητθή πιάθα. ΤΦΠ, ππνθινητθή πιάθα. ΓΕ, δηάκεζε δώλε. ΤΚΕ, ππνθνηιηαθή δώλε. ΚΕ, θνηιηαθή δώλε. Σα δεδνκέλα απνδίδνληαη σο κέζνο όξνο ± SD. n=3, *p

143 Απμηεθέζιαηα θυβς πθδεοζιυξ ήηακ ζδιακηζηά αολδιέκμξ ζηδκ πενίπηςζδ ηςκ Fl/koNestinCre ειανφςκ (Δζηυκα 3.22 δζάβναιια Γ ηαζ πίκαηαξ Γ). Δηθόλα Σα Fl/koNestinCre έκβξπα επηδεηθλύνπλ απμεκέλν πιεζπζκό θινηϊθώλ λεπξώλωλ. Μεησπηαίεο ηνκέο θινηνύ από WT (Α) θαη Fl/koNestinCre (Β) Δ18.5 έκβξπα επεμεξγάζηεθαλ γηα πεηξάκαηα αλνζνθζνξηζκνύ γηα ηνλ έιεγρν ηνπ πξνηύπνπ έθθξαζεο ηεο πξσηεΐλεο NeuN (θόθθηλν) ζην θινηό, πνπ είλαη δείθηεο ησλ δηαθνξνπνηεκέλσλ λεπξώλσλ. Οη εηθόλεο πξνέξρνληαη από ηε ζύλζεζε επηκέξνπο θσηνγξαθηώλ θαη πξνέξρνληαη από ζπλεζηηαθό κηθξνζθόπην. Οη ππξήλεο ησλ θπηηάξσλ απεηθνλίδνληαη κεηά από ρξώζε κε Σνtν-3 (κπιε). Οη θινηνί ησλ Fl/koNestinCre Δ18.5 εκβξύσλ απνηεινύληαη από κεγαιύηεξν αξηζκό ώξηκσλ λεπξώλσλ ζε ζύγθξηζε κε ηα αληίζηνηρα WT έκβξπα (γξάθεκα Γ). Ο πίλαθαο Γ απνηππώλεη ηηο αληίζηνηρεο πνζνηηθνπνηήζεηο. ΦΠ, θινητθή πιάθα. ΤΦΠ, ππνθινητθή πιάθα. ΓΕ, δηάκεζε δώλε. ΤΚΕ, ππνθνηιηαθή δώλε. ΚΕ, θνηιηαθή δώλε. Σα δεδνκέλα απνδίδνληαη σο κέζνο όξνο ± SD. n=3, *p Ζ δηαδηθαζία ηεο γινηνγέλεζεο δε κεηαβάιιεηαη απνπζία ηεο Geminin Ζ παναβςβή ηςκ κεονχκςκ ημο εβηεθαθζημφ θθμζμφ μθμηθδνχκεηαζ πνζκ ηδ βέκκδζδ ηςκ γχςκ, πενίπμο ιέπνζ ημ ειανοσηυ ζηάδζμ Δ17.5-Δ18.5. Με ημ πέναξ ηδξ δζαδζηαζίαξ παναβςβήξ ηςκ κεονζηχκ ηοηηάνςκ ημο θθμζμφ, ανπίγεζ δ πενίμδμξ 143

144 Απμηεθέζιαηα ζπδιαηζζιμφ ηςκ ηοηηάνςκ βθμίαξ ημο θθμζμφ, δδθαδή ηςκ αζηνμηοηηάνςκ ηαζ ηςκ μθζβμδεκδνμηοηηάνςκ. Ζ ειανοσηή πενίμδμξ βθμζμβέκεζδξ ζημ θθμζυ δζανηεί πμθφ θίβμ, ιία ή δφμ ιένεξ ημ ηφνζμ ιένμξ ηδξ δζαδζηαζίαξ λεηζκάεζ ηαζ μθμηθδνχκεηαζ ιεηά ηδ βέκκδζδ ηςκ γχςκ. Γζενεοκήεδηε ημ ενχηδια ακ μ θθμζυξ ηςκ ειανφςκ ζηα μπμία έπεζ απμζζςπδεεί δ έηθναζδ ηδξ Geminin ειθακίγεζ ηάπμζα δζαθμνά ζε αοηά ηα πμθφ πνχζια αήιαηα ηδξ βθμζμβέκεζδξ. Γζα ημ ζημπυ αοηυ πναβιαημπμζήεδηακ πεζνάιαηα ακμζμθεμνζζιμφ ζε ιεηςπζαίεξ ημιέξ ζημ επίπεδμ ημο πνυζεζμο θθμζμφ απυ WT ηαζ Fl/koNestinCre Δ18.5 έιανοα ιε δζάθμνμοξ δείηηεξ ηοηηάνςκ βθμίαξ (Δζηυκα 3.23). Πζμ ζοβηεηνζιέκα, βζα ηδ ζήιακζδ ηςκ μθζβμδεκδνμηοηηάνςκ πνδζζιμπμζήεδηακ μζ πανάβμκηεξ Olig2 (Δζηυκα 3.23Α-Β, πνάζζκμ) ηαζ Sox10 (Δζηυκα 3.23Γ-Δ, ηυηηζκμ), εη ηςκ μπμίςκ ημ ιυνζμ Olig2 εηθνάγεηαζ επίζδξ ηαζ ζηα πνυδνμια ηφηηανα ηδξ μθζβμδεκδνμβθμίαξ. Απυ ηδκ άθθδ ιενζά, βζα ηδκ απμηφπςζδ ηςκ αζηνμηοηηάνςκ πνδζζιμπμζήεδηε μ πνςηεσκζηυξ δείηηδξ GFAP (Δζηυκα 3.23Ζ-Θ, πνάζζκμ). Οζ Olig2+, Sox10+ ηαζ GFAP+ ηοηηανζημί πθδεοζιμί πμζμηζημπμζήεδηακ ζημ ζφκμθμ ηςκ γςκχκ ημο θθμζμφ. Οζ ιεηνήζεζξ αοηέξ έδεζλακ πανυιμζα πμζμζηά ιεηαλφ ηςκ WT ηαζ Fl/koNestinCre ειανφςκ (Δζηυκα 3.22 δζαβνάιιαηα Γ,Ε,Η ηαζ πίκαηαξ Κ). Φαίκεηαζ επμιέκςξ υηζ δ επαβςβή ημο θαζκμιέκμο ηδξ βθμζμβέκεζδξ ζημκ ακαπηοζζυιεκμ εβηεθαθζηυ θθμζυ ηςκ Fl/koNestinCre ειανφςκ δζελάβεηαζ θοζζμθμβζηά. οκμρίγμκηαξ ηα απμηεθέζιαηά ιαξ, δ απμοζία έηθναζδξ ηδξ πνςηεΐκδξ Geminin θαίκεηαζ κα επζδνά ακαζηαθηζηά ζηδκ ςνίιακζδ ηςκ ηοηηάνςκ ηδξ αηηζκςηήξ βθμίαξ απυ ηα κεονμεπζεδθζαηά ηφηηανα ημο θθμζμφ, εκδεπμιέκςξ θυβς ηδξ επζηάποκζδξ πμο πνμηαθεί ζημ νοειυ ηοηηανζηήξ δζαίνεζδξ ηςκ παναπάκς ηοηηάνςκ. Σμ θαζκυιεκμ αοηυ έπεζ ςξ πζεακυ απμηέθεζια ηδ ιεηέπεζηα αολδιέκδ παναβςβή ηςκ πνμβμκζηχκ ηοηηάνςκ ηδξ ημζθζαηήξ γχκδξ. Ζ απμζζχπδζδ ηδξ πνςηεΐκδξ Geminin μδήβδζε επίζδξ ζε αφλδζδ ημο πθδεοζιμφ ηςκ ηαεμνζζιέκςκ πνμξ κεονζηή δζαθμνμπμίδζδ πνυδνμιςκ ηοηηάνςκ, ηάηζ πμο είπε ςξ ηεθζηυ απμηέθεζια ημκ ειπθμοηζζιυ ηςκ χνζιςκ κεονχκςκ ημο θθμζμφ. 144

145 Απμηεθέζιαηα 145

146 Απμηεθέζιαηα Δηθόλα Η απνπζία ηεο πξωηεΐλεο Geminin δελ επεξεάδεη ηα πξώηκα ζηάδηα γινηνγέλεζεο ηνπ θινηνύ. Μειεηήζεθαλ ηα πξόηππα έθθξαζεο ησλ δεηθηώλ νιηγνδελδξνγινίαο Olig2 (Α,Β πξάζηλν) θαη Sox10 (Γ,Δ θόθθηλν) θαη ηνπ δείθηε ησλ αζηξνθπηηάξσλ GFAP (Ζ,Θ πξάζηλν) κε πεηξάκαηα αλνζνθζνξηζκνύ ζε κεησπηαίεο ηνκέο ζην επίπεδν ηνπ πξόζζηνπ θινηνύ από Δ18.5 WT θαη Fl/koNestinCre έκβξπα. Οη εηθόλεο πξνέξρνληαη από ηε ζύλζεζε επηκέξνπο θσηνγξαθηώλ θαη πξνέξρνληαη από ζπλεζηηαθό κηθξνζθόπην. Οη ππξήλεο ησλ θπηηάξσλ απνηππώλνληαη κεηά από ρξώζε κε Σνtν-3 (κπιε). Οη πνζνηηθνπνηήζεηο ησλ αληίζηνηρσλ πιεζπζκώλ (γξαθήκαηα Γ,Ε,Η θαη πίλαθαο Κ) θαλεξώλεη όηη ηα Olig2+, Sox10+ θαη GFAP+ θύηηαξα αληηπξνζσπεύνληαη ζε θπζηνινγηθνύο αξηζκνύο ζηα Fl/koNestinCre έκβξπα. Ο πίλαθαο Κ απεηθνλίδεη ηηο αληίζηνηρεο κεηξήζεηο, νη νπνίεο αληηζηνηρνύλ ζην κέζν όξν ησλ πεηξακάησλ (νη αξηζκνί ζηελ πaξέλζεζε αλαθέξνληαη ζην ζπλνιηθό αξηζκό θπηηάξσλ πνπ κεηξήζεθαλ). ΦΠ, θινητθή πιάθα. ΤΦΠ, ππνθινητθή πιάθα. ΓΕ, δηάκεζε δώλε. ΤΚΕ, ππνθνηιηαθή δώλε. ΚΕ, θνηιηαθή δώλε. Σα δεδνκέλα απνδίδνληαη σο κέζνο όξνο ± SD. n=3. 146

147 Απμηεθέζιαηα 3.4 Kαιιηέξγεηα in vitro πξνγνληθώλ θπηηάξσλ από ην θινηό ησλ WT θαη Fl/koNestinCre εκβξύσλ Σα ηεθεοηαία πνυκζα έπμοκ ακαπηοπεεί πμθθά πεζναιαηζηά πνςηυημθθα πμο επζηνέπμοκ ηδκ απμιυκςζδ ηαζ ηαθθζένβεζα in vitro ηςκ πνμβμκζηχκ ηοηηάνςκ ημο ειανοσημφ αθθά ηαζ ημο εκήθζημο- θθμζμφ. Πνυηεζηαζ βζα ιεεμδμθμβίεξ πμο πνμζθένμοκ ιμκαδζηά ενβαθεία ζηδκ πνμζπάεεζα ηαηακυδζδξ ηςκ ιδπακζζιχκ ακάπηολδξ ημο θθμζμφ, ηαεχξ επζηνέπμοκ ηδκ άιεζδ δζενεφκδζδ δζαθυνςκ ζηαδίςκ ηςκ παναπάκς ιδπακζζιχκ υπςξ ηδκ ζηακυηδηα ηςκ πνμβμκζηχκ ηοηηάνςκ βζα αοημακακέςζδ, βζα δζαηήνδζδ ημο αδζαθμνμπμίδημο δοκαιζημφ ημοξ αθθά ηαζ βζα ηδ δζαθμνμπμίδζή ημοξ ηεθζηά ηυζμ ζε κεονζηά ηφηηανα υζμ ηαζ ζε ηφηηανα βθμίαξ (Reynolds and Weiss, 1992; Gage, 2000). Σα πνςηυημθθα αοηά ακαθένμκηαζ ζηζξ θεβυιεκεξ κεονυζθαζνεξ, ηαεχξ υηακ ηα πνμβμκζηά κεονζηά ηφηηανα ηαθθζενβμφκηαζ in vitro παναιέκμοκ εκςιέκα ιεηά ηζξ δζαζνέζεζξ ημοξ ζπδιαηίγμκηαξ ζθαίνεξ. Έηζζ εεθήζαιε κα ζοιπθδνχζμοιε ηδκ in vivo ιεθέηδ ημο θαζκμηφπμο απμζζχπδζδξ ηδξ έηθναζδξ ηδξ πνςηεΐκδξ Geminin ζημ θθμζυ ιε in vitro πεζνάιαηα ηαθθζένβεζαξ κεονυζθαζνςκ απυ ηα πνμβμκζηά ηφηηανα ημο θθμζμφ Παξόκνηνο ζρεκαηηζκόο πξσηνγελώλ λεπξόζθαηξσλ κεηαμύ WT θαη Fl/koNestinCre εκβξύσλ Σμ βεκζηυ πνςηυημθθμ ηδξ ηαθθζένβεζαξ κεονυζθαζνςκ πμο αημθμοεήεδηε απεζημκίγεηαζ ζηδκ Δζηυκα φιθςκα ιε αοηυ, απμιμκχεδηε μ θθμζυξ απυ WT ηαζ Fl/koNestinCre έιανοα δθζηίαξ Δ14.5 ηαζ δζαζπάζηδηε ιδπακζηά ζε ααειυ πμο οπήνπακ ιυκμ ιμκαδζαία ηφηηανα. Σα ηφηηανα αοηά ηαθθζενβήεδηακ ζηδ ζοκέπεζα ζε παιδθή ζοβηέκηνςζδ ζε ζοκεήηεξ πμο εοκμμφζακ ημκ πμθθαπθαζζαζιυ ηαζ ηδ δζαηήνδζδ ηδξ αδζαθμνμπμίδηδξ ηαηάζηαζήξ ημοξ χζηε κα ζπδιαηζζημφκ πνςημβεκείξ κεονυζθαζνεξ. Ζ ιεεμδμθμβία αοηή επζηνέπεζ ηδκ εηηίιδζδ ηδξ ζηακυηδηαξ πμθθαπθαζζαζιμφ ηςκ πνμβμκζηχκ ηοηηάνςκ πνμζδζμνίγμκηαξ ημκ ανζειυ ηαζ ημ ιέβεεμξ ηςκ κεονυζθαζνςκ πμο εα πνμηφρμοκ. Αολδιέκμξ ανζειυξ πνςημβεκχκ κεονυζθαζνςκ ζδιαίκεζ υηζ πενζζζυηενα απυ ηα ανπζηά ηφηηανα ηδξ ηαθθζένβεζαξ είπακ ζηακυηδηα πμθθαπθαζζαζιμφ. Απυ ηδκ άθθδ ιενζά, ιεβαθφηενμ ιέβεεμξ πνςημβεκχκ κεονυζθαζνςκ οπμδεζηκφεζ υηζ ηα ηφηηανα εκδεπμιέκςξ δζαζνμφκηαζ ιε αολδιέκμ νοειυ δδιζμονβχκηαξ πενζζζυηενμοξ απμβυκμοξ. Οζ παναπάκς πανάιεηνμζ δζενεοκήεδηακ ζηζξ κεονυζθαζνεξ απυ ηδκ ηαθθζένβεζα ηςκ Fl/koNestinCre ειανφςκ ηαζ ζοβηνίεδηακ ιε ηζξ ακηίζημζπεξ απυ ηδκ ηαθθζένβεζα ηςκ WT ειανφςκ (Δζηυκα 3.25). 147

148 Απμηεθέζιαηα Δηθόλα Πξωηόθνιιν ζρεκαηηζκνύ λεπξόζθαηξωλ. Ο θινηόο εκβξύσλ κπόο ειηθίαο Δ14.5 απνκνλώλεηαη θαη νκνγελνπνηείηαη ζε βαζκό πνπ απνηειείηαη από κνλαδηαία θύηηαξα. Σα θύηηαξα απηά ζηε ζπλέρεηα θαιιηεξγνύληαη ζε ρακειή ζπγθέληξσζε θαη ζε ζπλζήθεο πνπ επηηξέπνπλ ηνλ πνιιαπιαζηαζκό ηνπο ώζηε λα δηαζθαιηζηεί όηη νη λεπξόζθαηξεο πνπ ζα πξνθύςνπλ πξνέξρνληαη από ηηο δηαηξέζεηο ελόο κόλν θπηηάξνπ, παξέρνληαο έλα εξγαιείν εθηίκεζεο ηεο πνιιαπιαζηαζηηθήο ηθαλόηεηαο ησλ θπηηάξσλ απηώλ. Δπηπξόζζεηα, νη ζρεκαηηδόκελεο λεπξόζθαηξεο κπνξνύλ λα δηαζπαζηνύλ πάιη ζε κνλαδηαία θύηηαξα θαη λα θαιιηεξγεζνύλ εθ λένπ πξνο ζρεκαηηζκό ησλ ιεγόκελσλ δεπηεξνγελώλ λεπξόζθαηξσλ, ώζηε λα δηεξεπλεζεί ε ηθαλόηεηα ησλ θπηηάξσλ γηα απην-αλαλέσζε. Καζώο ν αξρηθόο πιεζπζκόο ησλ θπηηάξσλ ηνπ θινηνύ είλαη αξθεηά αλνκνηνγελήο πεξηέρνληαο ηόζν πξνγνληθά θύηηαξα ζε δηάθνξα ζηάδηα πνιπδπλακίαο- όζν θαη δηαθνξνπνηεκέλα λεπξηθά θύηηαξα, ε δηαηήξεζε γηα κεγάιν ρξνληθό δηάζηεκα ηεο θαιιηέξγεηαο επηηξέπεη ηελ ηειηθή επηβίσζε κόλν ησλ πνιπδύλακσλ λεπξηθώλ βιαζηηθώλ θπηηάξσλ ιόγσ ηεο ζεσξεηηθά απεξηόξηζηεο ηθαλόηεηάο ηνπο γηα απην-αλαλέσζε. Σέινο, είλαη δπλαηόλ, αιιάδνληαο ηηο ζπλζήθεο ηεο θαιιηέξγεηαο έηζη ώζηε λα επλνείηαη ε δηαθνξνπνίεζε ησλ πξνγνληθώλ θπηηάξσλ, λα επαρζνύλ ηα θύηηαξα απηά πξνο ζρεκαηηζκό δηαθνξνπνηεκέλσλ απνγόλσλ ηόζν λεπξηθήο όζν θαη γινηαθήο πξνέιεπζεο. Ζ δζαδζηαζία ζπδιαηζζιμφ πνςημβεκχκ κεονυζθαζνςκ δε θαίκεηαζ κα επδνεάγεηαζ απυ ηδκ απμοζία έηθναζδξ ηδξ Geminin (Δζηυκα 3.25, ζφβηνζζδ Α ιε Β). Τπμθμβίγμκηαξ πεναζηένς ημ ιέζμ ανζειυ ηαζ ημ ιέζμ ιέβεεμξ ηςκ ζπδιαηζζεέκηςκ πνςημβεκχκ κεονυζθαζνςκ (ζζημβνάιιαηα Γ ηαζ Γ ηδξ εζηυκαξ 3.25 ακηίζημζπα), δζαπζζηχεδηε υηζ μζ παναπάκς πανάιεηνμζ δεκ δζαθμνμπμζμφκηαζ ζδζαίηενα ιεηά ηδκ ηαθθζένβεζα ηςκ πνμβμκζηχκ ηοηηάνςκ πμο πνμένπμκηαζ απυ ηα Fl/koNestinCre έιανοα, μδδβχκηαξ ζημ ζοιπέναζια υηζ δ απαθμζθή ημο βμκζδίμο ηδξ Geminin δεκ επδνεάγεζ ημκ in vitro ζπδιαηζζιυ πνςημβεκχκ κεονυζθαζνςκ. 148

149 Απμηεθέζιαηα Δηθόλα ρεκαηηζκόο πξωηνγελώλ λεπξόζθαηξωλ απνπζία έθθξαζεο ηεο Geminin. Ο θινηόο από Δ14.5 WT (Α) θαη Fl/koNestinCre (Β) έκβξπα δηαζπάζηεθε κεραληθά θαη ηα πξνθύπηνληα κνλαδηαία θύηηαξα θαιιηεξγήζεθαλ ζε ρακειή ζπγθέληξσζε πξνο ζρεκαηηζκό πξσηνγελώλ λεπξόζθαηξσλ. Μεηά από 7 κέξεο ζε θαιιηέξγεηα, ζπγθξίλακε ην κέζν αξηζκό (Γ) θαη ην κέζν κέγεζνο (Γ) ησλ λεπξόζθαηξσλ ζηηο δύν θαιιηέξγεηεο. Όπσο θαίλεηαη θαη από ηα αληίζηνηρα δηαγξάκκαηα, ε δεκηνπξγία ησλ πξσηνγελώλ λεπξόζθαηξσλ δελ επεξεάδεηαη ηδηαίηεξα ζε ζπλζήθεο απνζηώπεζεο ηεο έθθξαζεο ηεο Geminin. Ο πίλαθαο Δ απνηππώλεη ηηο αληίζηνηρεο κεηξήζεηο σο κέζν όξν ησλ πεηξακάησλ (νη αξηζκνί ζηελ παξέλζεζε απεηθνλίδνπλ ην ζπλνιηθό αξηζκό λεπξόζθαηξσλ πνπ κεηξήζεθε). Σα δεδνκέλα απνδίδνληαη σο κέζνο όξνο ± SD. n= Γηεξεύλεζε ηεο ηθαλόηεηαο απην-αλαλέσζεο in vitro ησλ πξνγνληθώλ θινητθώλ θπηηάξσλ ζε ζπλζήθεο απνπζίαο έθθξαζεο ηεο πξσηεΐλεο Geminin οκεπίγμκηαξ ημ πεζναιαηζηυ πνςηυημθθμ ηδξ ιεθέηδξ ηςκ ζδζμηήηςκ ηςκ πνμβμκζηχκ ηοηηάνςκ ημο θθμζμφ in vitro, ελεηάζηδηε ζηδ ζοκέπεζα δ ζηακυηδηα αοημ-ακακέςζδξ ηςκ ηοηηάνςκ αοηχκ. Γζα ημ ζημπυ αοηυ δζαζπάζηδηακ ιδπακζηά μζ πνςημβεκείξ κεονυζθαζνεξ ιέπνζ ημ ζηάδζμ ηςκ ιμκαδζαίςκ ηοηηάνςκ ηαζ ηα ηφηηανα 149

150 Απμηεθέζιαηα αοηά ηαθθζενβήεδηακ εη κέμο χζηε κα εηηζιδεεί δ ζηακυηδηά ημοξ βζα ζπδιαηζζιυ δεοηενμβεκχκ κεονυζθαζνςκ (Δζηυκα 3.26). Ο ζπδιαηζζιυξ ηςκ δεοηενμβεκχκ κεονυζθαζνςκ ζηδκ ηαθθζένβεζα ηςκ Fl/koNestinCre ηοηηάνςκ πναβιαημπμζήεδηε θοζζμθμβζηά, βεβμκυξ πμο οπμδεζηκφεζ υηζ δ δοκαηυηδηα αοημ-ακακέςζδξ ηςκ πνυδνμιςκ ηοηηάνςκ ημο θθμζμφ δεκ ελανηάηαζ in vitro απυ ηδ Geminin. Δηηυξ αοημφ, μζ δδιζμονβμφιεκεξ δεοηενμβεκείξ κεονυζθαζνεξ ηςκ Fl/koNestinCre ηοηηάνςκ δεκ δζέθενακ ζδιακηζηά ζε ανζειυ ηαζ Δηθόλα Η ηθαλόηεηα απην-αλαλέωζεο ηωλ πξνγνληθώλ θινηϊθώλ θπηηάξωλ δε κεηαβάιιεηαη από ηελ απνζηώπεζε ηεο πξωηεΐλεο Geminin. Οη πξσηνγελείο λεπξόζθαηξεο από ηηο θαιιηέξγεηεο ησλ WT (Α) θαη Fl/koNestinCre (Β) θινηώλ δηαζπάζηεθαλ ζε κνλαδηαία θύηηαξα θαη θαιιηεξγήζεθαλ μαλά πξνο ζρεκαηηζκό δεπηεξνγελώλ λεπξόζθαηξσλ, γεγνλόο πνπ επηηξέπεη ηελ εθηίκεζε ηεο ηθαλόηεηαο απηναλαλέσζήο ηνπο. Ο κέζνο αξηζκόο (δηάγξακκα Γ) θαη ην κέζν κέγεζνο (δηάγξακκα Γ) ησλ δεπηεξνγελώλ λεπξόζθαηξσλ είλαη παξόκνηνο κεηαμύ ησλ WT θαη Fl/koNestinCre θαιιηεξγεηώλ. Ο πίλαθαο Δ απνηππώλεη ηηο αληίζηνηρεο κεηξήζεηο σο κέζν όξν ησλ πεηξακάησλ (νη αξηζκνί ζηελ παξέλζεζε απεηθνλίδνπλ ην ζπλνιηθό αξηζκό λεπξόζθαηξσλ πνπ κεηξήζεθε). Σα δεδνκέλα απνδίδνληαη σο κέζνο όξνο ± SD. n=5. 150

151 Απμηεθέζιαηα ιέβεεμξ απυ ηζξ ακηίζημζπεξ ηςκ WT ηοηηάνςκ (Δζηυκα 3.26 δζαβνάιιαηα Γ,Γ), οπμζηδνίγμκηαξ υηζ ηα Fl/koNestinCre δεοηενμβεκή πνμβμκζηά ηφηηανα δεκ επζδεζηκφμοκ ιεηααμθέξ ζηδκ ζηακυηδηα πμθθαπθαζζαζιμφ ημοξ. Ζ παναπάκς δζαδζηαζία, δδθαδή δ δζάζπαζδ ηςκ κεονυζθαζνςκ ηαζ δ εη κέμο ηαθθζένβεζά ημοξ, ζοκεπίζηδηε βζα επακεζθδιιέκεξ ηαθθζένβεζεξ βζα έκα πνμκζηυ δζάζηδια πενίπμο ηνζχκ ιδκχκ, πςνίξ παν υθ αοηά κα δζαβκχζμοιε ηάπμζα δζαθμνά ζηδκ ζηακυηδηα πμθθαπθαζζαζιμφ ηςκ ηοηηάνςκ απυ ηα μπμία απμοζζάγεζ δ έηθναζδ ηδξ πνςηεΐκδξ Geminin Έιεγρνο ηεο ηθαλόηεηαο δηαθνξνπνίεζεο in vitro ησλ πξνγνληθώλ θπηηάξσλ πνπ δελ εθθξάδνπλ Geminin Ζ ακάθοζδ ημο θαζκμηφπμο ηδξ απμζζχπδζδξ ηδξ πνςηεΐκδξ Geminin in vitro μθμηθδνχεδηε εθέβπμκηαξ ηδ δοκαηυηδηα ηςκ οπυ ηαθθζένβεζα πνμβμκζηχκ ηοηηάνςκ κα δζαθμνμπμζδεμφκ ηαζ κα δχζμοκ απμβυκμοξ ηυζμ ηδξ κεονζηήξ υζμ ηαζ ηδξ βθμζαηήξ ζεζνάξ. WT ηαζ Fl/koNestinCre κεονυζθαζνεξ ηαθθζενβήεδηακ ζε ηαηάθθδθεξ ζοκεήηεξ πμο πνμςεμφκ ηδ δζαθμνμπμίδζδ ηςκ πνμβμκζηχκ κεονζηχκ ηοηηάνςκ. Μεηά απυ ηαθθζένβεζα 15 διενχκ ζε ζοκεήηεξ δζαθμνμπμίδζδξ, πναβιαημπμζήεδηακ πεζνάιαηα ακμζμθεμνζζιμφ πνμηεζιέκμο κα ηαοημπμζήζμοιε ημοξ δζαθμνμπμζδιέκμοξ απμβυκμοξ πμο ζπδιαηίζηδηακ (Δζηυκα 3.27). Υνδζζιμπμζήεδηακ ακηζζχιαηα έκακηζ ηςκ πνςηεσκχκ GFAP βζα ηδ ζήιακζδ ηςκ αζηνμηοηηάνςκ (Δζηυκα 3.27Α-Γ, πνάζζκμ), Olig2 βζα ηδ ζήιακζδ ηςκ μθζβμδεκδνμηοηηάνςκ (Δζηυκα 3.27Γ-Ε, πνάζζκμ) ηαζ Tuj1 βζα ηδ ζήιακζδ ηςκ κεονχκςκ (Δζηυκα 3.27Ζ-Η, ηυηηζκμ). Σα πεζνάιαηα ακμζμθεμνζζιμφ βζα ημκ έθεβπμ ζπδιαηζζιμφ GFAP+ ηοηηάνςκ (Δζηυκα 3.27Α-Γ) ηαηέδεζλακ υηζ μζ Fl/koNestinCre κεονυζθαζνεξ δζαθμνμπμζήεδηακ επζηοπχξ ζε αζηνμηφηηανα ηαζ υηζ ιάθζζηα μ ζπδιαηζζιυξ ημοξ έβζκε ζε πανυιμζα πμζμζηά ιε ηζξ WT κεονυζθαζνεξ (Δζηυκα 3.27 δζάβναιια Γ). Ακηίζημζπμ ζοιπέναζια ελάβεηαζ ηαζ βζα ηδκ πενίπηςζδ δδιζμονβίαξ μθζβμδεκδνμηοηηάνςκ, ηαεχξ ημ πμζμζηυ ηςκ Olig2+ ηοηηάνςκ ήηακ ηαοηυζδιμ ιεηαλφ ηςκ WT ηαζ Fl/koNestinCre ηαθθζενβεζχκ (Δζηυκα 3.27 δζάβναιια Ε). Σέθμξ, μ ζπδιαηζζιυξ δζαθμνμπμζδιέκςκ κεονζηχκ ηοηηάνςκ επίζδξ πναβιαημπμζήεδηε θοζζμθμβζηά ζηα ηφηηανα πμο δεκ εηθνάγμοκ ηδκ πνςηεΐκδ Geminin (Δζηυκα 3.27 δζάβναιια Η). 151

152 Απμηεθέζιαηα Δηθόλα Γηαθνξνπνίεζε ηωλ Fl/koNestinCre λεπξόζθαηξωλ. Νεπξόζθαηξεο από WT θαη Fl/koNestinCre θαιιηέξγεηεο ππνβιήζεθαλ ζε ζπλζήθεο δηαθνξνπνίεζεο θαη πξαγκαηνπνηήζεθαλ πεηξάκαηα αλνζνθζνξηζκνύ ρξεζηκνπνηώληαο εηδηθά αληηζώκαηα έλαληη ησλ πξσηετλώλ GFAP, Olig2 θαη Tuj1 ώζηε λα δηεξεπλεζεί ε ηθαλόηεηά ηνπο λα ζρεκαηίζνπλ αζηξνθύηηαξα (Α-Γ, πξάζηλν), νιηγνδελδξνθύηηαξα (Γ- Ε, πξάζηλν) θαη λεπξώλεο (Ζ-Η, θόθθηλν), αληίζηνηρα. Οη εηθόλεο πξνέξρνληαη από νπηηθό κηθξνζθόπην ελώ νη ππξήλεο ησλ θπηηάξσλ απεηθνλίδνληαη κεηά από ρξώζε κε ηε ρξσζηηθή Hoechst (κπιε). Σα πνζνζηά ησλ παξαγόκελσλ αζηξνθπηηάξσλ, νιηγνδελδξνθπηηάξσλ θαη λεπξώλσλ δελ δηαθέξνπλ κεηαμύ ησλ WT θαη Fl/koNestinCre θαιιηεξγεηώλ (ηζηνγξάκκαηα Γ, Ε, Η, αληίζηνηρα). Ο πίλαθαο Κ απνηππώλεη ηηο αληίζηνηρεο κεηξήζεηο σο κέζν όξν ησλ πεηξακάησλ (νη αξηζκνί ζηελ παξέλζεζε απεηθνλίδνπλ ην ζπλνιηθό αξηζκό θπηηάξσλ πνπ πνζνηηθνπνηήζεθε). Σα δεδνκέλα απνδίδνληαη σο κέζνο όξνο ± SD. n=4. 152

153 Απμηεθέζιαηα Σα απμηεθέζιαηα ιαξ πνμηείκμοκ υηζ δ ακαπαναβςβή ηαζ δ δζαθμνμπμίδζδ in vitro ηςκ πνμβμκζηχκ ηοηηάνςκ θθμζμφ ζημκ μπμίμ έπεζ απμζζςπμζδεεί δ έηθναζδ ηδξ Geminin πναβιαημπμζμφκηαζ ζε θοζζμθμβζημφξ νοειμφξ. οιπεναζιαηζηά, βίκεηαζ ειθακέξ υηζ δ Geminin δζαδναιαηίγεζ ηνίζζιμ νυθμ in vivo ηαηά ηδκ ακάπηολδ ημο εβηεθαθζημφ θθμζμφ ηςκ εδθαζηζηχκ νοειίγμκηαξ ηζξ ζηακυηδηεξ ηςκ πνμβμκζηχκ κεονζηχκ ηοηηάνςκ ημο θθμζμφ βζα αοημ-ακακέςζδ ηαζ δζαθμνμπμίδζδ. Ζ έηθναζδ ηδξ πνςηεΐκδξ παναηηδνίγεζ ηα αδζαθμνμπμίδηα πνμβμκζηά ηφηηανα ηδξ ημζθζαηήξ ηαζ οπμημζθζαηήξ γχκδξ ημο θθμζμφ ηαζ ειθακίγεζ πενζμδζηυ πνυηοπμ έηθναζδξ πμο ελανηάηαζ απυ ηδ θάζδ ημο ηοηηανζημφ ηφηθμο. Ζ ςνίιακζδ ηςκ ηοηηάνςκ ηδξ αηηζκςηήξ βθμίαξ θαίκεηαζ κα νοειίγεηαζ ζε ηάπμζμ ααειυ απυ ηδκ Geminin, υπςξ ηαζ δ δζάνηεζα ηδξ ηοηηανζηήξ δζαίνεζδξ ηςκ πνχζιςκ θθμζσηχκ πνμβμκζηχκ ηοηηάνςκ. Δπζπνυζεεηα, δ Geminin θαίκεηαζ κα εθέβπεζ ημ ζπδιαηζζιυ ημο ζςζημφ πθδεοζιμφ ηςκ πνμβμκζηχκ ηοηηάνςκ ημο θθμζμφ αθθά ηαζ ηδ ιεηάααζή ημοξ πνμξ χνζια κεονζηά ηφηηανα. 153

154 4. Τ Ε Ζ Σ Ζ Ζ

155 ογήηδζδ Ο ζςζηυξ ζπδιαηζζιυξ ημο θθμζμφ εηθνάγεζ πμθθέξ απυ ηζξ ακχηενεξ ηζκδηζηέξ ηαζ βκςζζαηέξ θεζημονβίεξ ηςκ εδθαζηζηχκ. Κνίζζιμξ πανάβμκηαξ βζα ηδ αέθηζζηδ θεζημονβία εκυξ ζζημφ είκαζ δ επίηεολδ ηδξ ζςζηήξ ηοηηανζηήξ ζφκεεζδξ, ηυζμ ζε επίπεδμ ανζειμφ ηοηηάνςκ υζμ ηαζ ζε επίπεδμ δζαθμνεηζηχκ ηοηηανζηχκ ηφπςκ. Σμ ιεβαθφηενμ πμζμζηυ ηςκ κεονζηχκ ηοηηάνςκ ημο κεμθθμζμφ πανάβεηαζ απυ πνμβμκζηά, αδζαθμνμπμίδηα ηφηηανα ιε ζηακυηδηα αοημ-ακακέςζδξ πμο εκημπίγμκηαζ ζε ζοβηεηνζιέκεξ κεονμβεκεηζηέξ γχκεξ ημο κεμθθμζμφ ηαζ δίκμοκ βέκεζδ ζημοξ χνζιμοξ κεονχκεξ ιέζα απυ δζαδμπζημφξ ηφηθμοξ πμθθαπθαζζαζιμφ ηαζ δζαθμνμπμίδζδξ. διακηζηά ζδιεία εθέβπμο ημο ιδπακζζιμφ αοημφ απμηεθμφκ αθ εκυξ δ νφειζζδ ηδξ αοημ-ακακέςζδξ ηαζ ηςκ παναιέηνςκ ημο ηοηηανζημφ ηφηθμο ηςκ πνμβμκζηχκ ηοηηάνςκ ηαζ αθ εηένμο μ ηαεμνζζιυξ ηδξ πνμκζηήξ ζηζβιήξ πμο ηα ηφηηανα αοηά εα ζηαιαηήζμοκ κα δζαζνμφκηαζ ηαζ εα ανπίζμοκ κα δζαθμνμπμζμφκηαζ. Ζ πνςηεΐκδ Geminin έπεζ πνμηαεεί υηζ απμηεθεί ζοκδεηζηυ ηνίημ ιεηαλφ ηςκ θεζημονβζχκ ηοηηανζημφ πμθθαπθαζζαζιμφ ηαζ ηοηηανζηήξ δζαθμνμπμίδζδξ ηαζ ηαηά ζοκέπεζα ζοκζζηά έκα ζδακζηυ ιυνζμ-ζηυπμ βζα ηδ ιεθέηδ ηςκ δζαδζηαζζχκ πμο εθέβπμοκ ηδκ αοημ-ακακέςζδ ηαζ δζαθμνμπμίδζδ ηςκ πνμβμκζηχκ ηοηηάνςκ ημο κεονζημφ ζοζηήιαημξ ηαζ ζοιαάθθμοκ ζηδκ μκημβέκεζδ ημο εβηεθαθζημφ θθμζμφ Ζ έθθξαζε ησλ πξσηετλώλ Geminin θαη Cdt1 ραξαθηεξίδεη ηα πξνγνληθά λεπξηθά θύηηαξα ηνπ θινηνύ θαη εκθαλίδεη πεξηνδηθόηεηα πνπ εμαξηάηαη από ηε θάζε ηνπ θπηηαξηθνύ θύθινπ Ζ ημζθζαηή γχκδ ημο θθμζμφ θζθμλεκεί έκακ εηενμβεκή πθδεοζιυ πνμβμκζηχκ ηοηηάνςκ, πμο πενζθαιαάκεζ ηα κεονμεπζεδθζαηά ηφηηανα ζηα πμθφ πνχζια ζηάδζα ηδξ θθμζσηήξ κεονμβέκεζδξ, ηαζ ηα ηφηηανα ηδξ αηηζκςηήξ βθμίαξ ηαζ ηα αναπεία πνυδνμια κεονζηά ηφηηανα ζε ιεηαβεκέζηενα ζηάδζα (Gotz and Huttner, 2005; Gal et al., 2006). Οζ πθδεοζιμί ηςκ κεονμεπζεδθζαηχκ ηοηηάνςκ ηαζ ηςκ ηοηηάνςκ ηδξ αηηζκςηήξ βθμίαξ ιπμνμφκ κα εεςνδεμφκ ςξ πθδεοζιμί κεονζηχκ αθαζηζηχκ ηοηηάνςκ (neural stem cells), ηαεχξ πθδνμφκ ηα ηνζηήνζα βζα ζηακυηδηα αοημακακέςζδξ ηαζ δζαθμνμπμίδζδξ ζε δζαθμνεηζημφξ ηοηηανζημφξ ηφπμοξ (McKay, 1997; Temple, 2001). Ακηίεεηα, ηα ααζζηά πνυδνμια ηφηηανα ηδξ οπμημζθζαηήξ γχκδξ έπμοκ πενζμνζζιέκδ ζηακυηδηα αοημ-ακακέςζδξ ηαζ δζαθμνμπμζμφκηαζ ιυκμ πνμξ κεονζηά ηφηηανα (Haubensak et al., 2004; Miyata et al., 2004; Noctor et al., 2004). Ζ ιεθέηδ ημο πνμηφπμο έηθναζδξ ηςκ πνςηεσκχκ Geminin ηαζ Cdt1 ζημκ ακαπηοζζυιεκμ θθμζυ απμηέθεζε ηδκ πνχηδ έκδεζλδ ηδξ πζεακήξ ζοιιεημπήξ ημοξ ζηα ακαπηολζαηά βεβμκυηα ηδξ θθμζσηήξ κεονμβέκεζδξ, ηαεχξ μζ δφμ πνςηεΐκεξ εηθνάγμκηαζ ζημοξ πθδεοζιμφξ ηςκ πνμβμκζηχκ κεονζηχκ ηοηηάνςκ ημο θθμζμφ (Spella et al., 2007), απυ ηα μπμία πνμηφπημοκ υθμζ μζ πνμαθδηζημί κεονχκεξ ημο 155

156 ογήηδζδ θθμζμφ (Malatesta et al., 2003; Anthony et al., 2004; Gotz and Barde, 2005). Ζ έηθναζδ ηςκ ιμνίςκ Geminin ηαζ Cdt1 ζε αοημφξ ημοξ ηοηηανζημφξ πθδεοζιμφξ ακαδεζηκφεζ ηζξ δφμ πνςηεΐκεξ ςξ κέμοξ ιμνζαημφξ δείηηεξ βζα ηα πνμβμκζηά, αδζαθμνμπμίδηα ηφηηανα ημο θθμζμφ. Σα πνμβμκζηά ηφηηανα ηδξ ημζθζαηήξ γχκδξ παναηηδνίγμκηαζ απυ ηδ ιεηακάζηεοζδ ημο πονήκα ημοξ ακάθμβα ιε ηδ θάζδ ημο ηοηηανζημφ ηφηθμο ζηδκ μπμία ανίζημκηαζ (Sauer and Walker, 1959). Οζ πονήκεξ ηςκ ηοηηάνςκ ηδξ ημζθζαηήξ γχκδξ πμο εηθνάγμοκ ηζξ πνςηεΐκεξ Geminin ηαζ Cdt1 ειθακίγμοκ επίζδξ δζαηνζηέξ ζζημθμβζηά εέζεζξ, ιε ηα Geminin+ ηφηηανα κα εδνεφμοκ ζημ ελςηενζηυ υνζμ ηδξ γχκδξ εκχ ηα Cdt1+ ηφηηανα κα ηείημκηαζ πζμ ημκηά ζηδκ επζθάκεζα ηδξ ημζθίαξ, βεβμκυξ πμο πζεακχξ οπμδδθχκεζ ιζα ελανηχιεκδ έηθναζδ απυ ηδ θάζδ ημο ηοηηανζημφ ηφηθμο. Υνδζζιμπμζχκηαξ ηαηάθθδθμοξ ιμνζαημφξ δείηηεξ ηςκ θάζεςκ ημο ηοηηανζημφ ηφηθμο επζαεααζχεδηε υηζ δ πνςηεΐκδ Geminin εκημπίγεηαζ ζηζξ θάζεζξ S/G2/M ημο ηοηηανζημφ ηφηθμο εκχ μ πανάβμκηαξ Cdt1 εηθνάγεηαζ απμηθεζζηζηά ζηδκ G1 θάζδ. Σμ πενζμδζηυ αοηυ πνυηοπμ ηδξ έηθναζδξ ηδξ Geminin έπεζ επίζδξ δεζπεεί ζημ Xenopus laevis, ηδ Drosophila melanogaster ηαζ ζε ακενχπζκεξ ηανηζκζηέξ ηοηηανζηέξ ζεζνέξ (McGarry and Kirschner, 1998; Nishitani et al., 2000; Quinn et al., 2001; Xouri et al., 2004). Σα δεδμιέκα ιαξ οπμζηδνίγμοκ υηζ δ έηθναζδ ηςκ δφμ πνςηεσκχκ in vivo ζηα κεονζηά πνμβμκζηά ηφηηανα ειθακίγεζ πενζμδζηυηδηα πμο ζοζπεηίγεηαζ ιε ηδ θάζδ ημο ηοηηανζημφ ηφηθμο (Spella et al., 2007). Ζ πενζμδζηυηδηα ηδξ έηθναζδξ ζοβηεηνζιέκςκ παναβυκηςκ είκαζ έκα θαζκυιεκμ πμο παναηδνείηαζ ζημκ ακαπηοζζυιεκμ θθμζυ. Παναδείβιαηα ηέημζςκ παναβυκηςκ απμηεθμφκ μζ πνςηεΐκεξ p53, Smad6 αθθά ηαζ δ NF-kB ζδιαημδυηδζδ (Lev Bar-Or et al., 2000; Hoffmann et al., 2002; Nelson et al., 2004; Yoshiura et al., 2007). Ίζςξ ημ πζμ παναηηδνζζηζηυ πανάδεζβια απμηεθεί δ πενίπηςζδ ημο bhlh ιεηαβναθζημφ πανάβμκηα Hes1, μ μπμίμξ ακηζπνμζςπεφεζ ημ ααζζηυ επζηεθεζηζηυ ιυνζμ ημο Notch ζδιαημδμηζημφ ιμκμπαηζμφ (Shimojo et al., 2008). Ζ εκενβυηδηα ημο παναπάκς ιμκμπαηζμφ είκαζ ζδζαζηένςξ ζδιακηζηή βζα ηδ δζαηήνδζδ ηδξ αδζαθμνμπμίδηδξ ηαηάζηαζδξ ηςκ πνμβμκζηχκ ηοηηάνςκ ημο θθμζμφ. Βαζζηή πανάιεηνμξ βζα ηδ θεζημονβζηυηδηα ηδξ ζδιαημδυηδζδξ είκαζ δ πενζμδζηή έηθναζδ ημο πανάβμκηα Hes1, μ μπμίμξ εκημπίγεηαζ ζηα πνμβμκζηά ηφηηανα ηαηά ηζξ θάζεζξ S/G2/M εκχ ηα επίπεδά ημο εθαηηχκμκηαζ ζδιακηζηά ηαηά ηδκ ανπή ηδξ G1 θάζδξ (Shimojo et al., 2008). Ζ πηχζδ ηςκ επζπέδςκ έηθναζδξ ηδξ πνςηεΐκδξ ζηα πνχηα ζηάδζα ηδξ G1 θάζδξ είκαζ απαναίηδηδ βζα ημκ ηαεμνζζιυ ηδξ κεονςκζηήξ δζαθμνμπμίδζδξ ηαζ ηδκ έλμδμ ημο ηοηηάνμο απυ ημκ ηοηηανζηυ ηφηθμ. Ακηίεεηα, ηα ηφηηανα πμο εα ζοκεπίζμοκ κα δζαζνμφκηαζ εα πνέπεζ κα εκενβμπμζήζμοκ εη κέμο ηδκ έηθναζδ ημο πανάβμκηα Hes1 (Shimojo et al., 2008). Δπζπνυζεεηα, θαίκεηαζ υηζ δ πενζμδζηυηδηα ηδξ έηθναζδξ ημο ιεηαβναθζημφ πανάβμκηα Hes1 νοειίγεζ εκ ζοκεπεία ηδκ έηθναζδ ηδξ πνμκεονζηήξ bhlh πνςηεΐκδξ Ngn2. Ζ έηθναζδ ημο 156

157 ογήηδζδ πανάβμκηα Hes1 απμηθείεζ ηδκ έηθναζδ ηδξ πνςηεΐκδξ Ngn2, ιε απμηέθεζια ηα δφμ ιυνζα κα ειθακίγμοκ ακηίεεηα πνυηοπα ηαηακμιήξ ηαηά ηδ δζάνηεζα ημο ηοηηανζημφ ηφηθμο, ηάηζ πμο ζοιθςκεί ηαζ ιε ηζξ ακηίεεηεξ δνάζεζξ ημοξ ζηα πνμβμκζηά ηφηηανα ημο θθμζμφ (Shimojo et al., 2008). Πμθθέξ απυ ηζξ ηαεμνζζηζηέξ ακαπηολζαηέξ απμθάζεζξ ζηδκ πμνεία ηςκ πνμβμκζηχκ κεονζηχκ ηοηηάνςκ πνμξ κεονςκζηή δζαθμνμπμίδζδ θαιαάκμοκ πχνα ζε δζαηνζηέξ θάζεζξ ημο ηοηηανζημφ ημοξ ηφηθμο: δ δέζιεοζδ ηςκ πνμβμκζηχκ ηοηηάνςκ πνμξ κεονςκζηή δζαθμνμπμίδζδ πναβιαημπμζείηαζ ηαηά ηδκ G1 θάζδ ημο ηοηηανζημφ ηφηθμο (Haubensak et al., 2004; Shimojo et al., 2008), εκχ δ επζθμβή ημο ηοηηανζημφ κεονςκζημφ ηφπμο ηαζ δ θθμζσηή ζηζαάδα ηεθζηήξ εκαπυεεζδξ βίκεηαζ ηονίςξ ηαηά ηζξ θάζεζξ S/G2, ζε ζοκενβαζία ιε ελςβεκή ζήιαηα απυ ημκ πενζαάθθμκηα ζζηυ (McConnell and Kaznowski, 1991). Σμ πενζμδζηυ πνυηοπμ έηθναζδξ ηςκ πνςηεσκχκ Geminin ηαζ Cdt1 ιπμνεί κα απμηεθεί έκδεζλδ βζα ηδ ζοιιεημπή ημοξ ζηδ θήρδ ζδιακηζηχκ ακαπηολζαηχκ απμθάζεςκ ζε δζαηνζηέξ θάζεζξ ημο ηοηηανζημφ ηφηθμο πμο εθέβπμοκ ηζξ δζαδζηαζίεξ πμθθαπθαζζαζιμφ ηαζ δζαθμνμπμίδζδξ ηςκ κεονζηχκ πνμβμκζηχκ ηοηηάνςκ Ζ επαγσγή ησλ πξνγνληθώλ θπηηάξσλ πξνο λεπξσληθή δηαθνξνπνίεζε έρεη σο απνηέιεζκα ηε κείσζε ησλ επηπέδσλ έθθξαζεο ησλ πξσηετλώλ Geminin θαη Cdt1 Οζ πνμκεονζημί ιεηαβναθζημί πανάβμκηεξ bhlh, υπςξ μζ πνςηεΐκεξ Mash1 ηαζ Ngn2, εηθνάγμκηαζ ζηα ημνοθαία πνυδνμια ηφηηανα ημο ακαπηοζζυιεκμο θθμζμφ ζηα μπμία αζημφκ δνάζεζξ υπςξ δ ιεηάααζδ πνμξ ημκ πθδεοζιυ ηςκ ααζζηχκ πνυδνμιςκ ηοηηάνςκ ηδξ οπμημζθζαηήξ γχκδξ, δ πνμχεδζδ ηδξ κεονςκζηήξ δζαθμνμπμίδζδξ αθθά ηαζ μ ηαεμνζζιυξ ημο κεονςκζημφ οπμηφπμο ζημκ μπμίμ εα δζαθμνμπμζδεμφκ (Guillemot et al., 1993; Kageyama and Nakanishi, 1997; Torii et al., 1999; Nieto et al., 2001; Sun et al., 2001; Bertrand et al., 2002; Schuurmans et al., 2004; Britz et al., 2006). ημκ θθμζυ ηςκ Δ15.5 ειανφςκ ιουξ μζ πνςηεΐκεξ Geminin/Cdt1 ηαζ Mash1/Ngn2 εκημπίγμκηαζ ιεκ ζηδκ ίδζα πενζμπή αθθά εηθνάγμκηαζ ζε ιεβάθμ ααειυ ζε δζαθμνεηζηά ηφηηανα, ηαεχξ ηα ηφηηανα πμο ζοκεηθνάγμοκ Mash1 ακηζζημζπμφκ ζημ 1-2% ημο πθδεοζιμφ ηςκ Geminin+ ηαζ Cdt1+ ηοηηάνςκ εκχ ηα ηφηηανα πμο ζοκεηθνάγμοκ Ngn2 ακηζζημζπμφκ ζημ 3-4% ημο πθδεοζιμφ ηςκ Geminin+ ηαζ Cdt1+ ηοηηάνςκ (Spella et al., 2007). Έπεζ δεζπεεί υηζ μζ παναπάκς πνμκεονζηέξ πνςηεΐκεξ δεκ εηθνάγμκηαζ ζηα ηφηηανα ηδξ ημζθζαηήξ γχκδξ πμο έπμοκ ζηακυηδηα αοημ-ακακέςζδξ αθθά ζε αοηά πμο εηημπίγμκηαζ απυ ηδκ ημζθζαηή γχκδ, ηα μπμία ιπμνεί κα είκαζ είηε κεμζπδιαηζγυιεκα ααζζηά πνυδνμια ηφηηανα ηδξ οπμημζθζαηήξ γχκδξ είηε δζαθμνμπμζμφιεκα κεονζηά ηφηηανα (Britz et al., 2006; Shimojo et al., 2008). Ο ζοκεκημπζζιυξ ηςκ παναβυκηςκ Geminin/Cdt1 ιε ηζξ πνςηεΐκεξ Mash1/Ngn2 ιεηαλφ ηςκ ηοηηάνςκ ηδξ οπμημζθζαηήξ γχκδξ είκαζ 157

158 ογήηδζδ πενζζζυηενμ έκημκμξ, ηαεχξ ηα ακηίζημζπα πμζμζηά ακένπμκηαζ ζε ηζιέξ 8,5% ηαζ 15,6% βζα ηζξ πενζπηχζεζξ ζοκεκημπζζιμφ Mash1/Cdt1 ηαζ Mash1/Geminin ακηίζημζπα, ηαζ θηάκμοκ ζε ηζιέξ 46,7% ηαζ 42,3% βζα ηζξ πενζπηχζεζξ ζοκεκημπζζιμφ Ngn2/Cdt1 ηαζ Ngn2/Geminin ακηίζημζπα. Σα εονήιαηα αοηά επζαεααζχκμοκ ηα ιέπνζ ηχνα δεδμιέκα ιαξ υηζ μζ πνςηεΐκεξ Geminin ηαζ Cdt1 εηθνάγμκηαζ ζηα κεονζηά πνμβμκζηά ηφηηανα ηδξ ημζθζαηήξ γχκδξ ημο θθμζμφ πμο έπμοκ ζηακυηδηα αοημ-ακακέςζδξ αθθά ηαζ ζηα ααζζηά πνυδνμια ηφηηανα ηδξ οπμημζθζαηήξ γχκδξ. Μζα άθθδ πζεακή ελήβδζδ βζα ηα δζαηνζηά πνυηοπα έηθναζδξ ηςκ παναπάκς ιμνίςκ είκαζ υηζ αοηά είκαζ πανυκηα ζηα πνμβμκζηά ηφηηανα ζε δζαθμνεηζηέξ θάζεζξ ημο ηοηηανζημφ ημοξ ηφηθμο. Έπεζ δεζπεεί υηζ ηαζ μζ πνμκεονζημί πανάβμκηεξ Mash1/Ngn2 ειθακίγμοκ δζαθμνζηή έηθναζδ ηαηά ηδκ ελέθζλδ ημο ηοηηανζημφ ηφηθμο, ιε ηδκ πνςηεΐκδ Mash1 κα πανμοζζάγεηαζ ζδζαζηένςξ αολδιέκδ ηαηά ηα πνχηα ζηάδζα ηδξ G1 θάζδξ, εκχ δ πνςηεΐκδ Ngn2 εηθνάγεηαζ ηονίςξ ηαηά ηα ηεθζηά ζηάδζα ηδξ G1 ηαζ ζηδ G0 θάζδ (Britz et al., 2006). Σμ πνυηοπμ αοηυ ζζπφεζ βζα ηα πνμβμκζηά ηφηηανα ηδξ ημζθζαηήξ γχκδξ πμο πνμηαεμνίγμκηαζ κα δζαθμνμπμζδεμφκ είηε πνμξ ααζζηά πνυδνμια ηφηηανα είηε πνμξ κεονζηά ηφηηανα ηαζ υπζ βζα ηα πνμβμκζηά ηφηηανα πμο εα ζοκεπίζμοκ κα δζαζνμφκηαζ ζηδκ ημζθζαηή γχκδ (Britz et al., 2006). Ζ πενζμνζζιέκδ ζοκέηθναζδ ηςκ Geminin ηαζ Cdt1 ιε ηζξ παναπάκς πνμκεονζηέξ πνςηεΐκεξ είκαζ πζεακυ κα παναηηδνίγεζ έκα εκδζάιεζμ αήια ζηα πνμβμκζηά εηείκα ηφηηανα πμο εκδεπμιέκςξ εα δζαζνεεμφκ βζα ηεθεοηαία θμνά ζηδκ ημζθζαηή γχκδ ηαζ ζηδ ζοκέπεζα εα ηδκ εβηαηαθείρμοκ πνμηεζιέκμο κα δζαθμνμπμζδεμφκ ζε ααζζηά πνυδνμια ηφηηανα ή ζε χνζιμοξ κεονχκεξ. ε αοηυ ημ βεβμκυξ ιπμνεί κα ζοιαάθθεζ ηαζ ημ βεβμκυξ υηζ μζ πνςηεΐκεξ Geminin ηαζ Cdt1 εηθνάγμκηαζ ζε πθδεοζιμφξ πνμβμκζηχκ ηοηηάνςκ ηδξ ημζθζαηήξ γχκδξ ημο ακαπηοζζυιεκμο θθμζμφ πμο ανίζημκηαζ ζε δζαθμνεηζηέξ θάζεζξ ημο ηοηηανζημφ ηφηθμο ζε ζπέζδ ιε ημοξ πνμκεονζημφξ πανάβμκηεξ Mash1 ηαζ Ngn2. ηδκ πθάβζα βαββθζαηή πνμελμπή, υπμο ηα επίπεδα έηθναζδξ ηδξ πνςηεΐκδξ Mash1 είκαζ ζδιακηζηά αολδιέκα ζε ζπέζδ ιε ημκ θθμζυ, ηα πμζμζηά ζοκεκημπζζιμφ ημο πανάβμκηα ιε ηζξ πνςηεΐκεξ Geminin/Cdt1 πανμοζζάγμκηαζ αολδιέκα (18-20% ζηδκ πενίπηςζδ ζοκεκημπζζιμφ ηςκ Cdt1/Mash1 ηαζ ζπεδυκ 30% ζηδκ πενίπηςζδ Geminin/Mash1) (Spella et al., 2007). ε ακηίεεζδ ιε ημκ εβηεθαθζηυ θθμζυ, υπμο ηα πνυδνμια ηφηηανα ηδξ οπμημζθζαηήξ γχκδξ ζοιιεηέπμοκ ιε ημ ιζηνυηενμ πμζμζηυ ζημκ ζοκμθζηυ πνμβμκζηυ πθδεοζιυ, ζηζξ βαββθζαηέξ πνμελμπέξ ηα ακηίζημζπα ηφηηανα ακηζπνμζςπεφμοκ ημκ ιζζυ πενίπμο πθδεοζιυ ηςκ πνμβμκζηχκ ηοηηάνςκ (Malatesta et al., 2003). H έηθναζδ ημο ιεηαβναθζημφ πανάβμκηα Mash1 είκαζ ζδιακηζηή βζα ημκ ηαεμνζζιυ αοηχκ ηςκ πνυδνμιςκ κεονζηχκ ηοηηάνςκ ημο ημζθζαημφ ηεθεβηεθάθμο (Malatesta et al., 2003), βεβμκυξ πμο ελδβεί ηα αολδιέκα πμζμζηά ζοκεκημπζζιμφ ημο πνμκεονζημφ πανάβμκηα ιε ηζξ πνςηεΐκεξ Geminin ηαζ Cdt1. 158

159 ογήηδζδ Έπεζ δεζπεεί υηζ δ ιεηαβναθζηή εκενβυηδηα ηςκ πνμκεονζηχκ πνςηεσκχκ bhlh ελανηάηαζ απυ ημ ζφιπθμημ ακαδζμνβάκςζδξ ηδξ πνςιαηίκδξ SWI/SNF (Seo et al., 2005b), ηαεχξ επίζδξ ηαζ υηζ δ ηαηαθοηζηή οπμιμκάδα Brg1 ημο παναπάκς ζοιπθυημο δζαδναιαηίγεζ ηνίζζιμ νυθμ ζηδ δζαηήνδζδ ημο πθδεοζιμφ ηςκ πνμβμκζηχκ κεονζηχκ ηοηηάνςκ ημο θθμζμφ ηαζ ζηδ δδιζμονβία ηςκ ηοηηάνςκ βθμίαξ (Matsumoto et al., 2006). Έπεζ πνμηαεεί υηζ δ πνςηεΐκδ Geminin δεζιεφεηαζ ζηδκ πνςηεΐκδ Brg1 ηαζ ακηαβςκίγεηαζ ηδκ αθθδθεπίδναζδ ηςκ παναβυκηςκ bhlh ιε ημ ζφιπθμημ SWI/SNF (Seo et al., 2005a). Δίκαζ επμιέκςξ πζεακυ δ πενζμδζηυηδηα ηδξ έηθναζδξ ηδξ Geminin κα επζηνέπεζ ηδκ εθεβπυιεκδ έηθναζδ ηςκ βμκζδίςκ-ζηυπςκ ηςκ πνμκεονζηχκ βμκζδίςκ. Ζ δζαεεζζιυηδηα παναβυκηςκ πμο ζοιιεηέπμοκ ζε πμθθαπθά ακαπηολζαηά αήιαηα ηαηά ημ ζπδιαηζζιυ ημο θθμζμφ, υπςξ δ νφειζζδ ημο ηοηηανζημφ ηφηθμο, δ επζβεκεηζηή ηνμπμπμίδζδ ηδξ πνςιαηίκδξ ηαζ μ έθεβπμξ ηδξ ιεηαβναθζηήξ εκενβυηδηαξ ιπμνεί κα απμηεθεί ημκ ηαεμνζζηζηυ πανάβμκηα ζε ηοηηανζηυ επίπεδμ βζα ηδ ιεηάααζδ απυ ηα αδζαθμνμπμίδηα πνμβμκζηά ηφηηανα ζε ζηαδζαηχξ πζμ ηαεμνζζιέκμοξ πνμβμκζημφξ ηφπμοξ ηοηηάνςκ Ζ Geminin ξπζκίδεη ηελ θηλεηηθή ηνπ θπηηαξηθνύ θύθινπ θαη ηε κεηάβαζε από ηα λεπξνεπηζειηαθά θύηηαξα ζηα θύηηαξα ηεο αθηηλσηήο γινίαο Πνμηεζιέκμο κα δζεοηνζκζζηεί μ νυθμξ ημο ιμνίμο ηδξ Geminin ζηδ νφειζζδ ημο πμθθαπθαζζαζιμφ ηαζ ηδξ δζαθμνμπμίδζδξ ηςκ πνμβμκζηχκ ηοηηάνςκ ημο θθμζμφ, πναβιαημπμζήεδηακ πεζνάιαηα απμζζχπδζδξ ηαζ οπενέηθναζδξ ηδξ πνςηεΐκδξ ηαηά ηδκ ακάπηολδ ημο εβηεθαθζημφ θθμζμφ. Ζ ζζημεζδζηή απμζζχπδζδ ημο βμκζδίμο ηδξ Geminin είπε ςξ ζοκέπεζα ηδκ αφλδζδ ημο πθδεοζιμφ ηςκ πνμβμκζηχκ ηοηηάνςκ ηδξ ημζθζαηήξ γχκδξ ημο θθμζμφ εκχ δ οπενέηθναζδ ηδξ Geminin επέδεζλε ηα ακηίζηνμθα απμηεθέζιαηα. Δίκαζ παναηηδνζζηζηυ υηζ μζ πζμ έκημκεξ θοζζμθμβζηέξ αθθαβέξ παναηδνήεδηακ ζηδκ πενίπηςζδ ηδξ οπενέηθναζδξ ηδξ ιδ-απμζημδμιήζζιδξ ιμνθήξ ηδξ πνςηεΐκδξ, βεβμκυξ πμο οπμδεζηκφεζ υηζ δ πανμοζία ηδξ Geminin ζηδκ G1 θάζδ ημο ηοηηανζημφ ηφηθμο, ηαηά ηδκ μπμία θοζζμθμβζηά δεκ εηθνάγεηαζ, επδνεάγεζ ζδιακηζηά ημοξ ιδπακζζιμφξ νφειζζδξ ηςκ πνμβμκζηχκ ηοηηάνςκ, ακαδεζηκφμκηαξ ηδ ζδιαζία ηδξ πενζμδζηυηδηαξ ηδξ έηθναζδξ ηδξ πνςηεΐκδξ ηαηά ηδκ ελέθζλδ ημο ηοηηανζημφ ηφηθμο. οκμθζηά, ηα δεδμιέκα αοηά ακαδεζηκφμοκ ηδκ πνςηεΐκδ Geminin ζε έκα νοειζζηή ημο πθδεοζιμφ ηςκ ημνοθαίςκ πνμβμκζηχκ ηοηηάνςκ ηδξ ημζθζαηήξ γχκδξ. Ο νοειυξ ηδξ ηοηηανζηήξ δζαίνεζδξ απμηεθεί έκακ απυ ημοξ ηνίζζιμοξ πανάβμκηεξ εθέβπμο ημο πθδεοζιμφ ηςκ πνμβμκζηχκ ηοηηάνςκ ηδξ ημζθζαηήξ γχκδξ, ηαεχξ έπεζ δεζπεεί υηζ δ δζάνηεζα ηδξ G1 θάζδξ ημο ηοηηανζημφ ηφηθμο αολάκεηαζ ιε ηδκ πνυμδμ ηδξ κεονμβέκεζδξ ζημ θθμζυ. Ζ επζιήηοκζδ ηδξ G1 θάζδξ ζοζπεηίγεηαζ 159

160 ογήηδζδ ιε ηδ ιείςζδ ηδξ ζηακυηδηαξ ηςκ πνμβμκζηχκ ηοηηάνςκ ηδξ ημζθζαηήξ γχκδξ βζα δζαζνέζεζξ αοημ-ακακέςζδξ ηαζ ηδκ αφλδζδ ηςκ δζαζνέζεςκ δζαθμνμπμίδζδξ (Caviness et al., 1995; Takahashi et al., 1995; Calegari et al., 2005; Dehay and Kennedy, 2007). Ζ απμοζία ηδξ Geminin έπεζ ζακ απμηέθεζια ηα κεονζηά πνμβμκζηά ηφηηανα κα πανμοζζάγμοκ βνδβμνυηενμ νοειυ ηοηηανζηήξ δζαίνεζδξ ηαηά ηα πνχζια ζηάδζα ηδξ θθμζσηήξ κεονμβέκεζδξ (Δ12.5) αθθά υπζ ζε ιεηαβεκέζηενα ακαπηολζαηά ζηάδζα (Δ14.5). Ο νυθμξ ηδξ Geminin επμιέκςξ θαίκεηαζ κα εκημπίγεηαζ ηονίςξ ζηα ηαπέςξ δζαζνμφιεκα πνμβμκζηά ημνοθαία ηφηηανα ηςκ ανπζηχκ ζηαδίςκ ηδξ θθμζσηήξ κεονμβέκεζδξ (ζηα μπμία δ δζάνηεζα ηδξ G1 θάζδξ ηοιαίκεηαζ ζηζξ 3.3 χνεξ) ηαζ υπζ ηυζμ ζηα πνμβμκζηά ημνοθαία ηφηηανα ιεηαβεκέζηενςκ ζηαδίςκ (ζημ ζηάδζμ Δ14.5 ηα ηφηηανα αοηά ειθακίγμοκ G1 θάζδ δζάνηεζαξ πενίπμο 9.3 ςνχκ) (Caviness et al., 2009). Καεχξ δ δζάνηεζα ηδξ G1 θάζδξ έπεζ ζοκδεεεί ιε ηδκ πανμπή ημο απαναίηδημο πνυκμο ζημ ηφηηανμ βζα κα ζοκεέζεζ ηζξ πνςηεΐκεξ πμο εα επάβμοκ ηδ κεονςκζηή δζαθμνμπμίδζή ημο (Caviness et al., 2009), δ επζηάποκζδ ημο ηοηηανζημφ ηφηθμο πμο επζθένεζ δ απμοζία ηδξ Geminin πανειπμδίγεζ πανμδζηά αοηή ηδ δζαδζηαζία μδδβχκηαξ ζημκ ειπθμοηζζιυ ηςκ αδζαθμνμπμίδηςκ πνμβμκζηχκ ηοηηάνςκ. Δίκαζ εκδζαθένμκ υηζ ημ ειανοσηυ ζηάδζμ ζημ μπμίμ δζαθαίκεηαζ δ δνάζδ ηδξ Geminin ζημκ πμθθαπθαζζαζιυ ηςκ πνμβμκζηχκ ημνοθαίςκ ηοηηάνςκ (Δ12.5) απμηεθεί επίζδξ έκα ηνίζζιμ αήια βζα ηδ ιεηάααζδ απυ ηα πνχζια κεονμεπζεδθζαηά ηφηηανα ημο θθμζμφ ζηα ηφηηανα ηδξ αηηζκςηήξ βθμίαξ. Ο έθεβπμξ ηδξ ιεηαααηζηήξ αοηήξ δζαδζηαζίαξ πνδζζιμπμζχκηαξ ημκ πνςηεσκζηυ δείηηδ ηςκ ηοηηάνςκ ηδξ αηηζκςηήξ βθμίαξ BLBP έδεζλε υηζ δ απμοζία έηθναζδξ ηδξ Geminin πνμηαθεί ιζα ηαεοζηένδζδ ζηδκ έηθναζδ ημο δείηηδ BLBP, βεβμκυξ πμο πνμηείκεζ ιζα πανμδζηή ηαεοζηένδζδ ζηδ ιεηάααζδ απυ ηα κεονμεπζεδθζαηά ηφηηανα ζηα ηφηηανα ηδξ αηηζκςηήξ βθμίαξ, ηαεχξ ημ θαζκυιεκμ απμηαείζηαηαζ ιέπνζ ημ ειανοσηυ ζηάδζμ Δ14.5. Σμ εφνδια αοηυ πζεακχξ οπμδεζηκφεζ υηζ δ Geminin είκαζ ιένμξ ημο νοειζζηζημφ ιδπακζζιμφ πμο πνμζδζμνίγεζ ημκ ηνυπμ δζαίνεζδξ ηςκ κεονμεπζεδθζαηχκ ηοηηάνςκ, ηαεχξ δ ιεηάααζδ ζηα ηφηηανα ηδξ αηηζκςηήξ βθμίαξ πνμτπμεέηεζ ηδκ αθθαβή ημο ηνυπμο δζαίνεζδξ ηςκ κεονμεπζεδθζαηχκ ηοηηάνςκ απυ ζοιιεηνζηυ ζε αζφιεηνμ (Gotz and Huttner, 2005). Ζ ηαεοζηένδζδ ημο ζπδιαηζζιμφ ηςκ ηοηηάνςκ ηδξ αηηζκςηήξ βθμίαξ εοκμεί ηδκ παναηεηαιέκδ πανμοζία ηςκ κεονμεπζεδθζαηχκ ηοηηάνςκ ζηδκ ημζθζαηή γχκδ ημο ακαπηοζζυιεκμο θθμζμφ, ηα μπμία δζαζνμφιεκα ζοιιεηνζηά αολάκμοκ ημκ πθδεοζιυ ημοξ, βεβμκυξ πμο πνμζθένεζ ιζα επζπθέμκ ελήβδζδ βζα ημκ αολδιέκμ πθδεοζιυ πνμβμκζηχκ ηοηηάνςκ ηδξ ημζθζαηήξ γχκδξ πμο παναηδνείηαζ απμοζία έηθναζδξ ηδξ Geminin. Σμ βεβμκυξ υηζ δ απμζζχπδζδ ηδξ πνςηεΐκδξ Geminin είπε ςξ απμηέθεζια ηδκ πανμδζηή ηαεοζηένδζδ ηαζ υπζ ηδκ μθμηθδνςηζηή πανειπυδζζδ ηδξ ςνίιακζδξ ηςκ ηοηηάνςκ ηδξ αηηζκςηήξ βθμίαξ οπμδεζηκφεζ υηζ οπάνπμοκ πζεακυηαηα ηαζ άθθμζ πανάβμκηεξ πμο ζοιιεηέπμοκ ζηδ νφειζζδ ημο θαζκμιέκμο. Ακ ηαζ δεκ οπάνπμοκ πμθθά αζαθζμβναθζηά δεδμιέκα 160

161 ογήηδζδ βζα ημοξ ιδπακζζιμφξ πμο εθέβπμοκ αοηήκ ηδ ιεηαααηζηή δζαδζηαζία, έπεζ πνμηαεεί υηζ δ ζδιαημδυηδζδ απυ ημοξ πανάβμκηεξ Notch ηαζ FGF δζαδναιαηίγεζ ηάπμζμ νοειζζηζηυ νυθμ (Gaiano et al., 2000; Yoon et al., 2004; Anthony et al., 2005; Sahara and O'Leary, 2009). Γζα πανάδεζβια, δ οπενέηθναζδ ιζαξ εκενβμπμζδιέκδξ ιμνθήξ ημο πανάβμκηα Notch1 ζημκ ηεθεβηέθαθμ ημο ιουξ εοκυδζε ηδ ιεηάααζδ πνμξ ημκ πθδεοζιυ ηδξ αηηζκςηήξ βθμίαξ (Gaiano et al., 2000), εκχ δ έηθναζδ ημο δείηηδ BLBP εθαηηχκεηαζ ζε ιφεξ πμο δεκ εηθνάγμοκ ηζξ πνςηεΐκεξ Notch1 ηαζ Notch3 (Anthony et al., 2005). Απυ ηδκ άθθδ ιενζά, δ οπενέηθναζδ ημο FGF οπμδμπέα FGFR2 ζηα κεονμεπζεδθζαηά ηφηηανα πνμςεεί ηδ ιεηάααζή ημοξ ζε ηφηηανα ηδξ αηηζκςηήξ βθμίαξ (Yoon et al., 2004), εκχ δ απμζζχπδζδ ημο πανάβμκηα FGF10 απυ ημκ ηεθεβηέθαθμ ημο ιουξ μδδβεί ζηδκ ηαεοζηένδζδ αοηήξ ηδξ ιεηάααζδξ (Sahara and O'Leary, 2009). Ζ αθθδθμζφκδεζδ ηςκ παναπάκς παναβυκηςκ ιε ηδ θεζημονβία ηδξ Geminin δεκ έπεζ αηυια δζεοηνζκζζηεί παν υθ αοηά, είκαζ πζεακυ δ πνςηεΐκδ Geminin κα δνα ηαεμδζηά ημο FGF ιμκμπαηζμφ, ηαεχξ έπεζ παναηδνδεεί ζε έιανοα ημηυπμοθμο επαβςβή ηδξ έηθναζδξ ηδξ Geminin, ζε πενζμπέξ υπμο ηακμκζηά δ πνςηεΐκδ δεκ εηθνάγεηαζ, ιεηά απυ ηδκ ελακαβηαζιέκδ έηθναζδ ζηζξ πενζμπέξ αοηέξ ηδξ FGF ζδιαημδυηδζδξ (Papanayotou et al., 2008). Ζ φπανλδ επζπνυζεεηςκ ιδπακζζιχκ in vivo πμο δνμοκ πανάθθδθα ιε ηδ Geminin ιπμνεί επίζδξ κα ελδβήζεζ ηαζ ηδ ιδ-ακαβηαζυηδηα ημο ιμνίμο βζα ημκ πμθθαπθαζζαζιυ ηαζ ηδ δζαηήνδζδ ηςκ πνυδνμιςκ ηοηηάνςκ ημο θθμζμφ in vitro. Φαίκεηαζ θμζπυκ υηζ δ Geminin δεκ είκαζ μ ιμκαδζηυξ πανάβμκηαξ νφειζζδξ ηςκ θαζκμιέκςκ αοηχκ, αθθά υηζ δ δνάζδ ημο in vivo ζοιπθδνχκεηαζ απυ ηδ θεζημονβία επζπνυζεεηςκ, ελςηοηηάνζςκ ή εκδμηοηηάνζςκ ζδιαημδμηζηχκ ιμκμπαηζχκ. οκμρίγμκηαξ, δ θθμζσηή κεονμβέκεζδ ιπμνεί κα δζαηνζεεί ζε επζιένμοξ θάζεζξ (Gotz and Huttner, 2005), λεηζκχκηαξ απυ ηδ θάζδ πμθθαπθαζζαζιμφ (expansion phase), πμο παναηηδνίγεηαζ απυ ηζξ ζοιιεηνζηέξ δζαζνέζεζξ ηςκ κεονμεπζεδθζαηχκ ηοηηάνςκ ιε ζημπυ ημκ ειπθμοηζζιυ ημο πθδεοζιμφ ηςκ πνυδνμιςκ ηοηηάνςκ. Ζ θάζδ αοηή μθμηθδνχκεηαζ ηαεχξ ηα κεονμεπζεδθζαηά ηφηηανα ιεηαηνέπμκηαζ ζε ηφηηανα αηηζκςηήξ βθμίαξ, ηα μπμία δζαζνμφκηαζ αζφιιεηνα βζα κα δχζμοκ βέκεζδ ζε κεονχκεξ ηαζ ααζζηά πνυδνμια ηφηηανα (κεονμβεκεηζηή θάζδ, neurogenic phase). Ζ ηεθζηή θάζδ ηδξ θθμζσηήξ κεονμβέκεζδξ παναηηδνίγεηαζ πάθζ απυ ζοιιεηνζηέξ κεονμβεκεηζηέξ δζαζνέζεζξ ηςκ πνυδνμιςκ ηοηηάνςκ, ηα μπμία ζηδ ζοκέπεζα εζζένπμκηαζ ζε θάζδ δνειίαξ (quiescence). Ο ζςζηυξ πνμκζζιυξ ηδξ ιεηάααζδξ απυ ηα κεονμεπζεδθζαηά ζηα ηφηηανα ηδξ αηηζκςηήξ βθμίαξ έπεζ ηνίζζιεξ επζπηχζεζξ βζα ηδ θθμζμβέκεζδ, ηαεχξ έζης ηαζ εθάζζμκμξ ζδιαζίαξ αθθαβέξ ζημ πμζμζηυ ηςκ πνυδνμιςκ ηοηηάνςκ πμο επζδεζηκφμοκ ημκ έκακ ή ημκ άθθμ ηνυπμ δζαίνεζδξ ιπμνεί κα μδδβήζεζ ζε μοζζαζηζηέξ αθθαβέξ ζημκ ανζειυ ηςκ πνυδνμιςκ ηοηηάνςκ ηαζ πζεακχξ ηαζ ζημ ιέβεεμξ ημο θθμζμφ (Caviness et al., 1995; Rakic, 1995; Chenn and Walsh, 2002). Σα δεδμιέκα ιαξ επμιέκςξ πνμηείκμοκ υηζ δ δνάζδ ηδξ Geminin ζημκ ακαπηοζζυιεκμ 161

162 ογήηδζδ θθμζυ πνμζδζμνίγεζ ηδκ μθμηθήνςζδ ηδξ θάζδξ αοημ-ακακέςζδξ ηαζ ηδκ έκανλδ ηδξ θάζδξ δζαθμνμπμίδζδξ Ζ πξσηεΐλε Geminin ειέγρεη ηνλ θαζνξηζκό ησλ βαζηθώλ πξόδξνκσλ θπηηάξσλ Ζ πμνεία ηδξ κεονμβέκεζδξ ζημ θθμζυ ζοκεπίγεηαζ ιε ημ ζπδιαηζζιυ ηςκ ααζζηχκ πνυδνμιςκ ηοηηάνςκ ηδξ οπμημζθζαηήξ γχκδξ, ηα μπμία ιε ηζξ ζοιιεηνζηέξ κεονμβεκεηζηέξ δζαζνέζεζξ ημοξ εκζζπφμοκ ηδ κεονμβεκεηζηή απυδμζδ ζημκ ακαπηοζζυιεκμ θθμζυ. Ζ πνςηεΐκδ Geminin εηθνάγεηαζ ζηα πνυδνμια ηφηηανα ηδξ οπμημζθζαηήξ γχκδξ, αθθά ηα απμηεθέζιαηα ηδξ ιεθέηδξ ιαξ οπμδεζηκφμοκ υηζ ημ ιυνζμ δεκ αζηεί ηάπμζα δνάζδ ζηδ δζαδζηαζία ζπδιαηζζιμφ ηςκ ηοηηάνςκ αοηχκ. Ζ ηαοημπμίδζδ ημο πθδεοζιμφ ηςκ δζαζνμφιεκςκ ηοηηάνςκ ηδξ οπμημζθζαηήξ γχκδξ ιε ακηζζχιαηα έκακηζ ηςκ δεζηηχκ Ki67 ηαζ BrdU ηαηέδεζλε υηζ, ζε ακηίεεζδ ιε ηα πνμβμκζηά ηφηηανα ηδξ ημζθζαηήξ γχκδξ, μ πθδεοζιυξ ηςκ πμθθαπθαζζαγυιεκςκ ααζζηχκ πνυδνμιςκ ηοηηάνςκ παναιέκεζ αιεηάαθδημξ ιεηά απυ ηδκ ζζημεζδζηή απμζζχπδζδ ηδξ Geminin ζημκ ακαπηοζζυιεκμ θθμζυ. Ο πθδεοζιυξ υιςξ ηςκ Tbr2+ ηοηηάνςκ επδνεάγεηαζ ζδιακηζηά απυ ηδ θεζημονβία ημο ιμνίμο ηδξ Geminin, ηαεχξ δ απμοζία ηδξ έηθναζήξ ηδξ μδήβδζε ζηδκ αφλδζδ ημο ανζειμφ ηςκ Tbr2+ ηοηηάνςκ εκχ δ οπενέηθναζδ ημο ιμνίμο είπε ςξ απμηέθεζια ηδκ εθάηηςζδ ημο πθδεοζιμφ ημοξ. Ο ιεηαβναθζηυξ πανάβμκηαξ Tbr2 απμηεθεί ιυνζμ-ηθεζδί βζα ημκ ηαεμνζζιυ ηςκ ααζζηχκ πνυδνμιςκ ηοηηάνςκ (Englund et al., 2005). Ακ ηαζ ηα πενζζζυηενα Tbr2+ ηφηηανα εκημπίγμκηαζ ζηδκ οπμημζθζαηή γχκδ ημο ακαπηοζζυιεκμο θθμζμφ, έκα ζδιακηζηυ πμζμζηυ ανίζηεηαζ ηαζ ζηδκ ημζθζαηή γχκδ, ημ μπμίμ ακηζπνμζςπεφεζ είηε ηφηηανα πμο ιεηακαζηεφμοκ πνμξ ηδκ οπμημζθζαηή γχκδ είηε ηφηηανα πμο δζαζνμφκηαζ ζοιιεηνζηά ζηδκ ημζθζαηή γχκδ πνμξ παναβςβή δφμ κεονχκςκ (Kowalczyk et al., 2009). Οζ παναπάκς ενεοκδηέξ ιάθζζηα ηαηαθήβμοκ ζημ ζοιπέναζια υηζ μ πθδεοζιυξ ηςκ Tbr2+ ηοηηάνςκ πμο δζαζνείηαζ ζηδκ ημζθζαηή γχκδ πζεακχξ ακηζπνμζςπεφεζ ημκ πθδεοζιυ ηςκ αναπέςκ πνυδνμιςκ κεονζηχκ ηοηηάνςκ (short neural precursors), ηα μπμία δίκμοκ βέκεζδ ιυκμ ζε κεονχκεξ ηαζ επμιέκςξ ζοκάδμοκ ιε ημ κεονμβεκεηζηυ παναηηήνα ηςκ Tbr2+ ηοηηάνςκ. Καεχξ ηα απμηεθέζιαηά ιαξ οπμδεζηκφμοκ υηζ ηα ααζζηά πνυδνμια ηφηηανα ζπδιαηίγμκηαζ ζε θοζζμθμβζημφξ ανζειμφξ ιεηά ηδκ απμζζχπδζδ ή ηδκ οπενέηθναζδ ηδξ Geminin, είκαζ πζεακυ μζ αθθαβέξ πμο παναηδνήεδηακ ζημκ ζοκμθζηυ Tbr2+ ηοηηανζηυ πθδεοζιυ κα ακηακαηθμφκ αθθαβέξ ζημκ ανζειυ ηςκ Tbr2+ ηοηηάνςκ πμο δζαζνμφκηαζ ζηδκ ημζθζαηή γχκδ. Δλάθθμο μ πθδεοζιυξ ηςκ ηοηηάνςκ ηδξ ημζθζαηήξ γχκδξ ειθακίγεζ ζδιακηζηέξ αθθαβέξ ηυζμ ιεηά ηδκ απμζζχπδζδ υζμ ηαζ ιεηά ηδκ οπενέηθναζδ ηδξ Geminin. Γζα πανάδεζβια, δ αφλδζδ ημο ανζειμφ ηςκ ηοηηάνςκ 162

163 ογήηδζδ πμο εηθνάγμοκ Tbr2 απμοζία ηδξ Geminin ιπμνεί κα μθείθεηαζ ζημκ αολδιέκμ πθδεοζιυ ηςκ Pax6+ ηοηηάνςκ ηδξ ημζθζαηήξ γχκδξ, ηαεχξ μ ιεηαβναθζηυξ πανάβμκηαξ Tbr2 είκαζ βκςζηυξ ζηυπμξ ημο ιεηαβναθζημφ πανάβμκηα Pax6 (Englund et al., 2005). Δκαθθαηηζηά, ιπμνμφιε κα οπμεέζμοιε υηζ δ Geminin, ιέζς ηδξ ζηακυηδηάξ ηδξ κα ζοιιεηέπεζ ζε ιμνζαηέξ αθθδθεπζδνάζεζξ πμο εθέβπμοκ ηδ βμκζδζαηή έηθναζδ, επδνεάγεζ ηδκ έηθναζδ ημο ιεηαβναθζημφ πανάβμκηα Tbr2. Μία άθθδ πζεακή ελήβδζδ ημο παναπάκς θαζκμηφπμο απμηεθεί δ πενίπηςζδ ηα αολδιέκα Tbr2+ ηφηηανα κα ακηζπνμζςπεφμοκ κεμζπδιαηζγυιεκμοξ κεονχκεξ. Έπεζ δεζπεεί υηζ μ ιεηαβναθζηυξ πανάβμκηαξ Tbr2 εηθνάγεηαζ πανμδζηά ζημοξ κεμζπδιαηζγυιεκμοξ κεονχκεξ ιε ηα επίπεδά ημο κα ελαθείθμκηαζ ηαεχξ δ κεονςκζηή δζαθμνμπμίδζδ μθμηθδνχκεηαζ (Englund et al., 2005). Γεδμιέκδξ ηδξ επίδναζδξ ηδξ Geminin ζημοξ πθδεοζιμφξ ηςκ πνμκεονζηχκ πνςηεσκχκ αθθά ηαζ ηςκ δζαθμνμπμζδιέκςκ κεονχκςκ, δ πζεακυηδηα αοηή πανμοζζάγεηαζ ζδζαζηένςξ εθηοζηζηή. Οζ πνμκεονζηέξ πνςηεΐκεξ bhlh νοειίγμοκ πμθθαπθά αήιαηα ηαηά ηδ θθμζσηή κεονμβέκεζδ. Ο πνμκεονζηυξ bhlh ιεηαβναθζηυξ πανάβμκηαξ Mash1 επζδεζηκφεζ εκημκυηενδ έηθναζδ ζημκ ημζθζαηυ ηεθεβηέθαθμ, παν υθ αοηά εκημπίγεηαζ ηαζ ζημ κεμθθμζυ, ακ ηαζ ζε πμθφ παιδθυηενα επίπεδα, υπμο έπεζ ανεεεί υηζ πνμςεεί ημ ζπδιαηζζιυ ηςκ ααζζηχκ πνυδνμιςκ ηοηηάνςκ, εθέβπεζ ημκ ηαεμνζζιυ ημο κεονςκζημφ οπμηφπμο ηαζ ςεεί ηα πνυδνμια ηφηηανα πνμξ έλμδμ απυ ημκ ηοηηανζηυ ηφηθμ ηαζ κεονςκζηή δζαθμνμπμίδζδ (Nieto et al., 2001; Britz et al., 2006). Σα απμηεθέζιαηά ιαξ δείπκμοκ υηζ μ πθδεοζιυξ ηςκ Mash1+ ηοηηάνςκ αθθά ηαζ μ πθδεοζιυξ ηςκ δζαθμνμπμζδιέκςκ κεονχκςκ αολάκμκηαζ ηυζμ ζηζξ ζοκεήηεξ απμζζχπδζδξ υζμ ηαζ οπενέηθναζδξ ημο ιμνίμο ηδξ Geminin. Ακ ηαζ ζε πνχηδ ακάβκςζδ ηα εονήιαηα αοηά ίζςξ θαίκμκηαζ ακηζηνμουιεκα, εκ ημφημζξ ιπμνεί κα ακηακαηθμφκ ημοξ πμθθαπθμφξ νυθμοξ ηδξ πνςηεΐκδξ Geminin. Σμ βεβμκυξ αοηυ βίκεηαζ ζδζαίηενα ειθακέξ ακ ακαθμβζζημφιε ημοξ δζαθμνεηζημφξ ηνυπμοξ ιέζς ηςκ μπμίςκ δ Geminin θαίκεηαζ κα μδδβεί ζημκ αολδιέκμ ζπδιαηζζιυ κεονχκςκ: ηα δεδμιέκα ιαξ οπμζηδνίγμοκ υηζ ζε ζοκεήηεξ οπενέηθναζδξ ηδξ πνςηεΐκδξ δ κεονςκζηή δζαθμνμπμίδζδ εοκμείηαζ θυβς ηςκ αολδιέκςκ πμζμζηχκ ελυδμο απυ ημκ ηοηηανζηυ ηφηθμ ηςκ πνυδνμιςκ κεονζηχκ ηοηηάνςκ ηδξ ημζθζαηήξ γχκδξ. Απυ ηδκ άθθδ ιενζά, δ ζζημεζδζηή απμζζχπδζδ ηδξ Geminin απυ ημκ ακαπηοζζυιεκμ θθμζυ δεκ είπε ηάπμζα επίδναζδ ζημ νοειυ ελυδμο απυ ημκ ηοηηανζηυ ηφηθμ, αθθά δ ελ ανπήξ φπανλδ πενζζζμηένςκ πνμβμκζηχκ ημνοθαίςκ ηοηηάνςκ ηαζ μ ζπδιαηζζιυξ δοκδηζηά πζμ απμηεθεζιαηζηχκ ζηδ κεονμβεκεηζηή ζηακυηδηά ημοξ πνυδνμιςκ ηοηηάνςκ (ιε αάζδ ηδκ έηθναζδ ημο πανάβμκηα Tbr2), ιπμνεί κα ελδβήζεζ ημκ αολδιέκμ κεονζηυ πθδεοζιυ. Ακηίζημζπα, μ αολδιέκμξ πθδεοζιυξ ηςκ Mash1+ ηοηηάνςκ ιεηά απυ ηδκ οπενέηθναζδ ηδξ Geminin ιπμνεί κα ζπεηίγεηαζ ιε ηδκ δνάζδ ημο πνμκεονζημφ ιμνίμο ζηδκ επαβςβή ηδξ ελυδμο απυ ημκ ηοηηανζηυ ηφηθμ, εκχ ζηδκ πενίπηςζδ ηδξ απαθμζθήξ ηδξ Geminin δ αφλδζδ ηςκ Mash1+ ηοηηάνςκ ιπμνεί κα ελδβδεεί απυ ηδ ζοιιεημπή ημο πνμκεονζημφ πανάβμκηα ζηδ βεκζηή 163

164 ογήηδζδ πνμχεδζδ ηδξ κεονςκζηήξ δζαθμνμπμίδζδξ. Δίκαζ παναηηδνζζηζηυ υηζ μζ παναπάκς νυθμζ ηςκ πνμκεονζηχκ πνςηεΐκχκ είκαζ δζαηνζημί ηαζ ακελάνηδημζ ιεηαλφ ημοξ (Britz et al., 2006). Έκαξ πζεακυξ ηνυπμξ ιέζς ημο μπμίμο δ πνςηεΐκδ Geminin ιπμνεί κα επδνεάγεζ ηδκ εκενβυηδηα ημο πνμκεονζημφ πανάβμκηα Mash1 είκαζ μ ακηαβςκζζιυξ βζα ηδκ ηαηαθοηζηή οπμιμκάδα Brg1 ημο ζοιπθυημο SWI/SNF (Seo et al., 2005a; Seo et al., 2005b). O πμθοδζάζηαημξ νυθμξ ηδξ Geminin ζηδ νφειζζδ ηςκ ακαπηολζαηχκ βεβμκυηςκ εκζζπφεηαζ απυ ηα απμηεθέζιαηα πνυζθαηςκ ενεοκχκ πμο ακαθένμοκ ζδιακηζηέξ δνάζεζξ ηςκ αθθδθεπζδνχκηςκ ιε ηδ Geminin ιμνίςκ Six3 ηαζ Polycomb ηαηά ημ ζπδιαηζζιυ ημο θθμζμφ. Ζ δνάζδ ημο ιεηαβναθζημφ πανάβμκηα Six3 ζημκ ειανοσηυ ηεθεβηέθαθμ ζοιαάθθεζ ζηδ δζαηήνδζδ ηςκ πνμβμκζηχκ ηοηηάνςκ ηδξ ημζθζαηήξ γχκδξ ημο θθμζμφ ζε αδζαθμνμπμίδηδ ηαηάζηαζδ εκχ δ θεζημονβία ηδξ Geminin ιπμνεί κα ακηζζηαειίζεζ αοηυ ημ θαζκυιεκμ, ηαεχξ δ οπενέηθναζή ηδξ επδνεάγεζ ανκδηζηά ηδκ ζηακυηδηα πμθθαπθαζζαζιμφ ηςκ ηοηηάνςκ αοηχκ (Appolloni et al., 2008). Απυ ηδκ άθθδ ιενζά, μζ πνςηεΐκεξ Polycomb θαίκεηαζ κα εθέβπμοκ ημκ ηφπμ δζαθμνμπμζδιέκςκ απμβυκςκ πμο εα πνμηφρμοκ απυ ηζξ δζαζνέζεζξ ηςκ πνμβμκζηχκ ηοηηάνςκ ημο θθμζμφ, νοειίγμκηαξ έηζζ ηδ ιεηάααζδ απυ ημ ζπδιαηζζιυ κεονχκςκ ζηδκ παναβςβή αζηνμηοηηάνςκ. Υαναηηδνζζηζηά, δ απμζζχπδζδ ηςκ πνςηεσκχκ Polycomb πανέηεζκε ηδ κεονμβεκεηζηή θάζδ ηδξ θθμζμβέκεζδξ ηαζ μδήβδζε ζημ ζπδιαηζζιυ οπενάνζειςκ κεονχκςκ, πζεακχξ ιέζς ημο ειπθμοηζζιμφ ημο πθδεοζιμφ ηςκ κεονζηχκ πνμβμκζηχκ ηοηηάνςκ ημο θθμζμφ (Hirabayashi et al., 2009). Ακ ηαζ δ ζοβηεηνζιέκδ ιεθέηδ δεκ δζενεοκά ηδκ πζεακή ειπθμηή ηδξ Geminin, μζ παναπάκς δνάζεζξ ζοκάδμοκ ιε ηα δζηά ιαξ απμηεθέζιαηα, βεβμκυξ πμο πνμηείκεζ ηδκ πανυιμζα δνάζδ ηςκ δφμ παναβυκηςκ. Σα δεδμιέκα αοηά εκζζπφμοκ ημκ θαζκυηοπμ πμο οπμζηδνίγμοκ ηα απμηεθέζιαηά ιαξ, ακαδεζηκφμκηαξ ημ ζδιακηζηυ νυθμ ηδξ Geminin ζηδκ ακάπηολδ ημο θθμζμφ Οη δξάζεηο ηεο πξσηεΐλεο Geminin ιακβάλνπλ ρώξα επηιεθηηθά ζε ζπγθεθξηκέλεο πεξηνρέο ηνπ θινηνύ Ζ ιεθέηδ ηδξ ζζημεζδζηήξ απαθμζθήξ ημο βμκζδίμο ηδξ Geminin απυ ημκ ακαπηοζζυιεκμ εβηεθαθζηυ θθμζυ ακέδεζλε ιζα πζεακή πςνμ-εζδζηή δνάζδ ηδξ πνςηεΐκδξ, ηαεχξ υθεξ μζ παναηδνμφιεκεξ θεζημονβίεξ ηδξ Geminin πενζμνίγμκηαζ ζημ πνυζεζμ ηιήια ημο θθμζμφ. Σμ βεβμκυξ αοηυ ιπμνεί κα εοεφκεηαζ βζα ηδ ιδακαβηαζυηδηα ημο ιμνίμο ζημκ πμθθαπθαζζαζιυ ηαζ ηδ δζαθμνμπμίδζδ ηςκ πνμβμκζηχκ ηοηηάνςκ in vitro, ηαεχξ μζ ηαθθζένβεζεξ ηςκ κεονυζθαζνςκ πνμένπμκηαζ απυ μθυηθδνμ ημκ θθμζυ. Μία εκδεπυιεκδ ενιδκεία βζ αοηυ ημ ελεζδζηεοιέκμ πςνζηυ πνυηοπμ απμηεθεί δ πζεακυηδηα δ έηθναζδ ηδξ πνςηεΐκδξ κα πανμοζζάγεζ ηάπμζμ δζαααειζζιέκμ πνυηοπμ ηαηά ιήημξ ημο πνυζεζμο-μπίζεζμο 164

165 ογήηδζδ άλμκα ημο θθμζμφ, χζηε κα ειθακίγεζ εκημκυηενδ έηθναζδ ζηζξ πνυζεζεξ πενζμπέξ ημο θθμζμφ. Απυ ηδκ άθθδ ιενζά, είκαζ πζεακυ δ θεζημονβία ημο ιμνίμο ζηζξ οπυθμζπεξ πενζμπέξ ημο θθμζμφ κα ακηζζηαειίγεηαζ απυ άθθμοξ πανάβμκηεξ πμο δνμοκ ζηζξ πενζμπέξ αοηέξ. Μζα εκαθθαηηζηή πζεακυηδηα είκαζ υηζ δ Geminin νοειίγεηαζ απυ ηάπμζμκ πανάβμκηα πμο αζηεί δνάζδ ζοβηεηνζιέκα ζηδκ πνυζεζα πενζμπή ημο θθμζμφ. Έκακ ηέημζμ οπμρήθζμ πανάβμκηα απμηεθεί ημ FGF ζδιαημδμηζηυ ιμκμπάηζ, δ δνάζδ ημο μπμίμο ηονζανπεί ζημκ πνυζεζμ θθμζυ ηαζ ειπθέηεηαζ ζηδ δζαηήνδζδ ηςκ πνμβμκζηχκ ηοηηανζηχκ πθδεοζιχκ (Yoon et al., 2004; Rakic et al., 2009). Υαναηηδνζζηζηά, δ οπενέηθναζδ ή δ απχθεζα έηθναζδξ ημο πανάβμκηα FGF8 είπε ςξ απμηέθεζια ηδκ επέηηαζδ ηςκ ειπνυζεζςκ ή μπίζεζςκ πενζμπχκ ημο ηεθεβηεθάθμο ακηίζημζπα (Fukuchi-Shimogori and Grove, 2001; Garel et al., 2003). Δπίζδξ, βεκεηζηή απαθμζθή ημο FGF2 βμκζδίμο είπε ςξ απμηέθεζια ηδ ζδιακηζηή ιείςζδ ημο ανζειμφ ηςκ πνμβμκζηχκ ηοηηάνςκ ημο κεονμεπζεδθίμο αθθά ηαζ ηςκ παναβυιεκςκ κεονχκςκ (Qian et al., 1997; Palmer et al., 1999; Raballo et al., 2000; Maric et al., 2003). Τπμζηδνίγμκηαξ ηδκ παναπάκς πζεακυηδηα, έπεζ ανεεεί υηζ δ κεονμπμζδηζηή δνάζδ ηδξ πνςηεΐκδξ Geminin ηαηά ηδ βαζηνζδίςζδ ειανφςκ ημο Xenopus laevis πνμζμιμζάγεζ ηδκ ακηίζημζπδ κεονμεπαβςβζηή θεζημονβία ηδξ FGF ζδιαημδυηδζδξ (Kroll et al., 1998). Δπζπνυζεεηα, έπεζ δεζπεεί υηζ δ έηθναζδ ηδξ Geminin επάβεηαζ απυ ηδ δνάζδ ημο FGF ιμκμπαηζμφ ηαηά ηα ζηάδζα ζπδιαηζζιμφ ηδξ κεονζηήξ πθάηαξ ζε έιανοα ημηυπμοθμο (Papanayotou et al., 2008). Καηά ηδ κεονμβέκεζδ ημο εβηεθαθζημφ θθμζμφ ηςκ εδθαζηζηχκ, έπεζ ανεεεί υηζ δ FGF ζδιαημδυηδζδ δζαδναιαηίγεζ ηνίζζιμ νυθμ ηαηά ηδ ιεηάααζδ απυ ηα ηφηηανα ηδξ αηηζκςηήξ βθμίαξ ζηα ααζζηά πνυδνμια ηφηηανα (Kang et al., 2009), εκχ είκαζ επίζδξ αλζμζδιείςημ υηζ έκα ιέθμξ ηδξ μζημβέκεζαξ ηςκ FGF πνςηεσκχκ, μ πανάβμκηαξ FGF10, νοειίγεζ ηνίζζια αήιαηα ηδξ θθμζμβέκεζδξ επζθεηηζηά ζημκ πνυζεζμ θθμζυ, ιεηαλφ ηςκ μπμίςκ ηαζ ηδ ιεηάααζδ απυ ηα κεονμεπζεδθζαηά ηφηηανα ζηα ηφηηανα ηδξ αηηζκςηήξ βθμίαξ (Sahara and O'Leary, 2009). Οζ ειθακείξ μιμζυηδηεξ ιεηαλφ ηςκ θεζημονβζχκ ηδξ Geminin ηαζ ημο FGF ζδιαημδμηζημφ ιμκμπαηζμφ ηαηά ηδ κεονμβέκεζδ ημο θθμζμφ εκζζπφμοκ αηυια πενζζζυηενμ ηδκ πνμμπηζηή ηδξ ζοκενβαηζηήξ δνάζδξ ηςκ δφμ παναβυκηςκ. Ο αολακυιεκμξ ανζειυξ παναβυκηςκ πμο επζδεζηκφμοκ επζθεηηζηή δνάζδ ζε ζοβηεηνζιέκεξ πενζμπέξ ηαηά ιήημξ ημο πνυζεζμο-μπίζεζμο άλμκα ημο εβηεθαθζημφ θθμζμφ (Sahara and O'Leary, 2009; Pinto et al., 2009) επζαεααζχκμοκ ηαζ ακαδεζηκφμοκ ηδκ πμθοπθμηυηδηα ηδξ δμιήξ ημο θθμζμφ. Καείζηαηαζ ειθακέξ υηζ δ ζςζηή μθμηθήνςζδ ημο εβηεθαθζημφ θθμζμφ απαζηεί ηδκ αοζηδνά ζοβπνμκζζιέκδ δνάζδ πμθθαπθχκ ηνίζζιςκ παναβυκηςκ πμο εα νοειίγμοκ ημοξ πνμβμκζημφξ ηοηηανζημφξ πθδεοζιμφξ ηαζ ηδκ παναβςβή κεονζηχκ ηοηηάνςκ ζε ζοβηεηνζιέκεξ θθμζσηέξ πενζμπέξ. Σα απμηεθέζιαηά ιαξ πνμηείκμοκ ηδκ πνςηεΐκδ Geminin ςξ έκακ ηέημζμ νοειζζηζηυ πανάβμκηα ηδξ θθμζσηήξ ακάπηολδξ ημο ιουξ (Δζηυκα 4.1). 165

166 ογήηδζδ 166