ΠΑΝΕΠΙΣΗΜΙΟ ΠΑΣΡΧΝ ΥΟΛΗ ΘΕΣΙΚΧΝ ΕΠΙΣΗΜΧΝ ΣΜΗΜΑ ΒΙΟΛΟΓΙΑ ΣΟΜΕΑ ΓΕΝΕΣΙΚΗ, ΒΙΟΛΟΓΙΑ ΚΤΣΣΑΡΟΤ & ΕΞΕΛΙΞΗ

Transcript

1 ΠΑΝΕΠΙΣΗΜΙΟ ΠΑΣΡΧΝ ΥΟΛΗ ΘΕΣΙΚΧΝ ΕΠΙΣΗΜΧΝ ΣΜΗΜΑ ΒΙΟΛΟΓΙΑ ΣΟΜΕΑ ΓΕΝΕΣΙΚΗ, ΒΙΟΛΟΓΙΑ ΚΤΣΣΑΡΟΤ & ΕΞΕΛΙΞΗ «Κπηηαξηθή αλάιπζε ησλ ηληεγθξηληθώλ ζπλδέζεσλ ζηε Drosophila melanogaster» ΓΗΓΑΚΣΟΡΗΚΖ ΓΗΑΣΡΗΒΖ ΕΛΕΝΗ ΦΑΡΡΑ ΠΑΣΡΑ 2011

2 Ζ παξνύζα εξγαζία εθπνλήζεθε ζην εξγαζηήξην Γελεηηθήο & Γνληδηαθήο ζεξαπείαο ηνπ Ηδξύκαηνο Ηαηξνβηνινγηθώλ Δξεπλώλ ηεο Αθαδεκίαο Αζελώλ (Η.Η.Β.Δ.Α.Α.) ζην πιαίζην ηνπ κεηαπηπρηαθνύ πξνγξάκκαηνο ζπνπδώλ ηνπ Σκήκαηνο Βηνινγίαο ηνπ Παλεπηζηεκίνπ Παηξώλ ππό ηελ επίβιεςε ηνπ Δξεπλεηή Γ Υ. Εέξβα. Ωο επηβιέπσλ κέινο ηεο ηξηκεινύο ζπκβνπιεπηηθήο επηηξνπήο ήηαλ ν Καζεγεηήο Α. Μίληδαο. ΣΡΙΜΕΛΗ ΤΜΒΟΤΛΕΤΣΙΚΗ ΕΠΙΣΡΟΠΗ Μίληδαο Αλαζηάζηνο Καζεγεηήο Σκήκαηνο Βηνινγίαο Παλεπηζηήκηνπ Παηξώλ Φιπηδάλεο Κσλζηαληίλνο Αλ. Καζεγεηήο Σκήκαηνο Βηνινγίαο Παλεπηζηήκηνπ Παηξώλ Εέξβαο Υξήζηνο Δξεπλεηήο Γ ΗΗΒΔΑΑ ΕΠΣΑΜΕΛΗ ΕΞΕΣΑΣΙΚΗ ΕΠΙΣΡΟΠΗ Μίληδαο Αλαζηάζηνο Καζεγεηήο Σκήκαηνο Βηνινγίαο Παλεπηζηήκηνπ Παηξώλ Φιπηδάλεο Κσλζηαληίλνο Αλ. Καζεγεηήο Σκήκαηνο Βηνινγίαο Παλεπηζηήκηνπ Παηξώλ Εέξβαο Υξήζηνο Δξεπλεηήο Γ Η.Η.Β.Δ.Α.Α. Καηζώξεο Παλαγηώηεο Aλ. Καζεγεηήο Σκήκαηνο Βηνινγίαο Παλεπηζηήκηνπ Παηξώλ Μπνύξηδεο Κσλζηαληίλνο Καζεγεηήο Σκήκαηνο Γηαρείξηζεο Πεξηβάιινληνο & Φπζηθώλ Πόξσλ Παλεπηζηεκίνπ Ησαλλίλσλ αββάθεο Υαξάιακπνο Δπηζηεκνληθόο Γηεπζπληήο & Πξόεδξνο ηνπ πκβνπιίνπ ηνπ Δξεπλεηηθνύ Κέληξνπ «Αιέμαλδξνο Φιέκηλγθ» θνπιάθεο Δπζύκηνο Δξεπλεηήο Β «Αι.Φιέκηλγθ»

3 Ζ παξνύζα δηδαθηνξηθή δηαηξηβή ρξεκαηνδνηήζεθε από ηε Γεληθή Γξακκαηεία Έξεπλαο θαη Σερλνινγίαο θαη ην πξόγξακκα ΠΔΝΔΓ03-777ΔΓ. Σν έξγν ζπγρξεκαηνδνηήζεθε θαηά: 75% ηεο Γεκόζηαο Γαπάλεο από ηελ Δπξσπατθή Δλσζε-Δπξσπατθό Κνηλσληθό Σακείν. 25% ηεο Γεκόζηαο Γαπάλεο από ην Διιεληθό Γεκόζην- Τπνπξγείν Αλάπηπμεο- Γεληθή Γξακκαηεία Δξεπλαο θαη Σερλνινγίαο θαη από ηνλ Ηδησηηθό Σνκέα ζην πιαίζην ηνπ Μέηξνπ 8.3 ηνπ Δ.Π Αληαγσληζηηθόηεηα Γ Κνηλνηηθό Πιαίζην ηήξημεο.

4 Ευχαριστώ Πεξίεξγν, ζηα ρξόληα ηνπ δηδαθηνξηθνύ κνπ, πνιιά άιιαμαλ ζηελ πεηξακαηηθή κνπ πνξεία, ζέκαηα θαη βηνινγηθά εξσηήκαηα ελαιιάζζνληαλ, αιιά ηνπο αλζξώπνπο πνπ ζα επραξηζηνύζα όηαλ ζα έθηαλε απηή ε «άγηα» ώξα ηνπο ήμεξα από ηελ αξρή. Απιά ίζσο ζηελ πνξεία λα πξνζηέζεθαλ έλαο δπν Σν Γξ. Υξήζην Εέξβα (boss), εξεπλεηή Γ ζην Η.Η.Β.Δ.Α.Α. γηα ηελ επθαηξία πνπ κνπ έδσζε ζην εξγαζηήξην. Γηα ηελ ππνκνλή θαη ηελ επηκνλή ηνπ ζε κέλα. Με έκαζε λα ζθέθηνκαη δηαθνξεηηθά, λα ακθηζβεηώ ηα πάληα. Δξσηήζεηο όπσο «είζαη ζίγνπξε;;;» θαη «δειαδή πόζα είδεο;;; Θα ζνπ πξόηεηλα λα...» αληερνύλ αθόκε ζηα απηηά κνπ. Μνπ έδεημε όηη ηα όξηα καο είλαη απιά εθεί γηα λα ηα μεπεξλάκε. Σα θνξίηζηα ζην εξγαζηήξην, ηελ Καηεξίλα, ηηο Μαξίεο (ΜΜ &ΜΥ) θαη ηε Γηνλπζία, πνπ από ην flyroom γπξίδακε ηνλ θόζκν. ην ηέινο, θαηαθέξακε λα γπξίζνπκε έζησ ηελ Αζήλα (by night). Aλ θαη δε κε άθελαλ λα αθνύσ sportfm ζην flyroom, ε θηιία ηνπο ήηαλ πνιιέο θνξέο ην κόλν πνπ είρε ζεκαζία ζην ίδξπκα Φίινπο από ηα γεηηνληθά εξγαζηήξηα, ηελ Διελίηζα, ηε Μαξία, ηνλ Πάλν ην κεγάιν, ηνλ Πάλν ην κηθξό, ην Θαλαζάθε θαη ηε κηθξή ηε Υξύζα. Όζν βξάδηαδε ηόζν πην κεγαιεπήβνια γίλνληαλ ηα ζρέδηα καο λα θαηαθηήζνπκε ηνλ θόζκν σο άιινη Pinky θαη Brain, ην Ννκπέι ήηαλ δηθό καο, όινη ζπκθσλνύζακε άιισζηε πόζν κεγάινη επηζηήκνλεο είκαζηε. Ήηαλ ζέκα ρξόλνπ, ην Cell ήηαλ ζηε γσλία Άιια θαη θίινπο από ηε δσή πξηλ ην ίδξπκα. O πήιησ, ε Καηεξίλα, ε Μαξηάλλα, ν Πεηξάθεο, ε Georgetta θαη ν Άγγεινο, πάληα κε ηελ απνξία: «θ ηώξα εζύ ηί ςάρλεηο λα βξεηο είπακε;;;, θαη δειαδή απηό πώο εθαξκόδεηαη ζηνλ άλζξσπν;;;», αηώληα αλαπάληεηα εξσηήκαηα. Πάληα όκσο, πξόζπκνη λα γεκίζνπλ ηηπάθηα, αλ θαη πνηέ δελ θαηάιαβαλ γηαηί όηαλ ην staining δελ δνπιεύεη πξέπεη λα πάκε γηα κπύξεο. Σε κεηέξα κνπ, ηε γηαγηά κνπ θαη ηελ αδεξθή κνπ, γηα ηελ αγάπε ηνπο θαη ηελ άπεηξε ππνκνλή ηνπο, θαη κάιηζηα ε ηειεπηαία δε θεκίδεηαη γη απηήλ Οη κόλεο αλεζπρίεο ηεο κεηέξαο κνπ: «παηδί κνπ είζαη θαιά; Έθαγεο; Καη ζα γπξίζεηο ζπίηη από ην εξγαζηήξην λα αιιάμνπκε καδί ην ρξόλν, ε;». Σνλ θαζεγεηή Γξ. Σάζν Μίληδα, θαη ηνλ αλαπιεξσηή θαζεγεηή Γξ. Κώζηα Φιπληδάλε, κέιε ηεο ηξηκεινύο ζπκβνπιεπηηθήο επηηξνπήο. Αλ θαη ε έδξα ηνπο είλαη ζηελ Πάηξα, έδεημαλ νπζηαζηηθό ελδηαθέξνλ θαηά ηε δηάξθεηα εθπόλεζεο ηεο παξνύζαο δηδαθηνξηθήο δηαηξηβήο

5 Σνλ Γξ. ηακάηε Παγθάθε, δηεπζπληή ηεο κνλάδαο κηθξνζθνπίαο ηνπ I.I.B.E.A.A. Με ηηο άξηηεο γλώζεηο ηνπ ζην αληηθείκελν αιιά θαη ηε δηάζεζε ηνπ λα κε βνεζήζεη ζε νπνηαδήπνηε «θαεηλή» ηδέα είρα ή ζε νπνηνδήπνηε πξόβιεκα κνπ παξνπζηαδόηαλ. «Έια, Διέλε, πεο, ηί ζνπ έθαλε πάιη ην confocal;». Σνλ επίθνπξν θαζεγεηή Γξ. Γηώξγν Υξπζάλζε, ν νπνίνο κε ηηο επθπέζηαηεο θαηαζθεπέο ηνπ ζε κηθξνεξγαιεία θαη εμνπιηζκό έθαλε εθηθηά κηα ζεηξά από πεηξάκαηα θαη αλαηνκίεο. Όηαλ πξσηνπήγα ζην εξγαζηήξην, ην boss κνύ είπε όηη ην δηδαθηνξηθό θάλεη «building character», θαη είρε απόιπην δίθην. Διπίδσ λα ήηαλ γηα θαιό!!!

6 Στον πατέρα μου, Σταμάτη

7 ΠΕΡΙΛΗΦΗ Ζ δηδαθηνξηθή κνπ δηαηξηβή εζηηάδεη ζηε ιεηηνπξγηθή αλάιπζε ηνπ κνξηαθνύ κεραληζκνύ ιεηηνπξγίαο ηεο ηληεγθξηλν-ζπλδεόκελεο θηλάζεο (ILK) θαηά ηελ αλάπηπμε ζηε Drosophila. Έγηλε δηεξεύλεζε: α) ηεο ιεηηνπξγηθήο ζπληήξεζεο ηεο ILK θαηά ηελ εμέιημε, β) ηνπ πηζαλνύ ξόινπ ζπγθεθξηκέλσλ ακηλνμηθώλ κνηίβσλ ζηνλ θπηηαξηθό εληνπηζκό θαη ηε ιεηηνπξγία ηεο πξσηεΐλεο θαη γ) ησλ ιεηηνπξγηθώλ ηδηνηήησλ ηεο ILK όηαλ είλαη νκνηνπνιηθά ζπδεπγκέλε ζηελ πιαζκαηηθή κεκβξάλε. Παξάιιεια, αλαδεηήζακε λένπο ιεηηνπξγηθνύο ξόινπο ηεο ILK θαηά ηελ αλάπηπμε: α) ζε άιινπο ηζηνύο εθηόο από ην κπτθό ζύζηεκα θαη β) ζηελ σνγέλεζε. Ζ ILK ζην επίπεδν ηεο ακηλνμηθήο αιιεινπρίαο παξνπζηάδεη 60% ηαπηόηεηα θαη 75% νκνινγία κε ηελ αληίζηνηρε πξσηεΐλε ησλ ζειαζηηθώλ. Με βάζε απηή ηελ νκνινγία, ειέγμακε ηελ πηζαλή θπινγελεηηθή ζπληήξεζε ηεο ιεηηνπξγίαο ηεο ILK. Γηα ην ζθνπό απηό θαηαζθεπάζηεθαλ δηαγνληδηαθά ζηειέρε πνπ πεξηείραλ ηελ θσδηθή πεξηνρή ηεο ILK ηνπ αλζξώπνπ (hilk) θαη ηνπ πνληηθνύ (milk) αληίζηνηρα. Ζ ILK ηνπ πνληηθνύ θαη ηνπ αλζξώπνπ αθνινπζεί παξαπιήζην πξόηππν ππνθπηηαξηθήο θαηαλνκήο κε ηελ ελδνγελή πξσηεΐλε ζηα κπτθά θύηηαξα Drosophila. Οη δπν εηεξόινγεο πξσηεΐλεο ππνθαζηζηνύλ ηε ιεηηνπξγία ηεο ILK ζηε Drosophila. Ωζηόζν, ε ILK ηνπ αλζξώπνπ παξνπζηάδεη κεησκέλε δπλαηόηεηα πξόζδεζεο κε ηελ parvin ηεο Drosophila. Πξνθεηκέλνπ λα δηεξεπλήζνπκε ην κνξηαθό κεραληζκό ξύζκηζεο θαη δξάζεο ηεο ILK θαηά ηελ αλάπηπμε, ειέγμακε εάλ ε θσζθνξπιίσζε ησλ ακηλνμέσλ S176 θαη T180 ππεηζέξρεηαη ζηε ξύζκηζε ηεο ιεηηνπξγίαο ηεο ILK. ε πεηξάκαηα θπηηαξηθώλ ζεηξώλ έρεη δεηρζεί όηη ζηηο ζέζεηο απηέο ε θσζθνξπιίσζε ειέγρεη ηελ ππνθπηηαξηθή θαηαλνκή ηεο πξσηεΐλεο ζηνλ ππξήλα. Ωζηόζν, απνδείμακε όηη ε πηζαλή θσζθνξπιίσζε ζηηο ηζρπξά ζπληεξεκέλεο ζέζεηο S176 θαη T180 δελ είλαη απαξαίηεηε γηα ηνλ εληνπηζκό ηεο ILK ζηηο κπνηελνληηθέο ζπλδέζεηο θαη ηε ιεηηνπξγία ηεο ILK. Έλα άιιν ακηλνμηθό θαηάινηπν πνπ είλαη απαξαίηεην γηα ηνλ εληνπηζκό ηεο ILK ζηηο εζηηαθέο ζέζεηο πξνζθόιιεζεο είλαη ην F436, ην νπνίν εδξάδεηαη ζηελ ηειεπηαία α έιηθα ηνπ θαξβνμπηειηθνύ ινβνύ ηεο πεξηνρήο θηλάζεο. Ο ππνθπηηαξηθόο εληνπηζκόο ηεο ILK θαη ε ιεηηνπξγία ηεο δελ επεξεάδνληαη από ηε ζεκεηαθή κεηαιιαγή F436Α ζε αληίζεζε κε πεηξάκαηα ζε θπηηαξηθά κνληέια. Ζ

8 ζεκεηαθή κεηαιιαγή F436A απνδπλακώλεη ηελ ηθαλόηεηα αιιειεπίδξαζεο ηεο ILK κε ηελ parvin. Δμεηάζακε αλ ε κεκβξαλνδεζκεπόκελε ILK κέζσ παικπηπιίσζεο ή θαξλεζπιίσζεο κπνξεί λα ππνθαηαζηήζεη ηελ απνπζία ηεο ελδνγελνύο, θαζώο θαη εάλ κπνξεί λα πξνζειθύζεη πξσηεΐλεο ηνπ ζπλδενζώκαηνο αλεμάξηεηα ησλ ηληεγθξηλώλ. Καηαζθεπάζηεθαλ δπν ελαιιαθηηθέο κνξθέο κεκβξαλνδεζκεπκέλεο ILK, νη GAP-ILK-GFP θαη ILK-GFP-HRAS εληνπίδνληαη κε επηηπρία ζηαζεξά ζηελ πιαζκαηηθή κεκβξάλε ησλ εκβξπτθώλ κπτθώλ θπηηάξσλ. Δπίζεο, νη GAP-ILK-GFP θαη ILK-GFP-HRAS ππνθαζηζηνύλ πιήξσο ηελ ελδνγελή ILK ζε όια ηα αλαπηπμηαθά ζηάδηα ηεο δσήο ηεο κύγαο. Σέινο, ε GAP-ILK-GFP ζπγθεληξώλεη ζηηο ΜΣ ηα άιια δπν κέιε ηνπ IPP ζπκπιόθνπ αιιά θαη ηελ talin ζηηο ΜΣ εκβξύσλ ηειηθνύ ζηαδίνπ ηόζν αγξίνπ ηύπνπ όζν θαη νκνδπγώησλ γηα aps2. Παξάιιεια, κειεηήζακε, ηόζν ζε γελεηηθό όζν θαη ζε κνξηαθό επίπεδν, ην ξόιν ηεο ILK ζηε κνξθνγέλεζε ηνπ σνζπιαθίνπ, ηελ νξγάλσζε θαη νκνηόζηαζε ηνπ ζπιαθώδνπο επηζειίνπ θαηά ηε δηάξθεηα ηεο σνγέλεζεο ζηε Drosophila. Απνζησπήζακε ηελ ilk θαηαζθεπάδνληαο γελεηηθά κσζατθά αιιά θαη ηζηνεηδηθά δηαζσζκέλα άηνκα. Παξαηεξήζακε όηη ε ILK είλαη απαξαίηεηε γηα ηε δηαδηθαζία ηεο σνγέλεζεο ζηε κύγα. Ζ απνπζία ηεο ILK πξνθαιεί δηαηαξαρέο ζην ζρεκαηηζκό ησλ δηαζπιηαθώλ κίζρσλ θαη αλσκαιία ζην δηαρσξηζκό ησλ λενζρεκαηηδόκελσλ δηαδνρηθώλ σνζπιαθίσλ (ζηακαία σνζπιάθηα). Δπίζεο, ηα πεηξάκαηά καο απνθάιπςαλ όηη ε ILK είλαη απαξαίηεηε γηα ηελ νξγάλσζε ησλ ηληδίσλ αθηίλεο θαηά ηα ηειεπηαία ζηάδηα ηεο σνγέλεζεο θαη γηα ηελ νκνηόζηαζε ηνπ θπηηαξνζθειεηνύ αθηίλεο θαηά ηνλ αθξαην-βαζηθό άμνλα ηνπ θπηηάξνπ. Αθόκε, ε ILK είλαη απαξαίηεηε γηα ηελ νξγάλσζε θαη δηαηήξεζε ησλ βαζν-πιεπξηθώλ θπηηαξηθώλ ζπλδέζεσλ ζηα ζπιαθηνθύηηαξα, αιιά όρη ησλ ζπλδέζεσλ δώλεο. Ζ απνπζία ηεο ILK δηαηαξάζζεη ηνλ εληνπηζκό ησλ ηληεγθξηλώλ ζηα άθξα ησλ ηληδίσλ ηάζεο ηεο αθηίλεο ζηα ζπιαθηνθύηηαξα ησλ ηειεπηαίσλ ζηαδίσλ. Δπηπιένλ, ε ILK ζπκκεηέρεη ζηε ξύζκηζε ηεο δπλακηθήο ηεο F-αθηίλεο κεηνξξπζκίδνληαο ην Dia θαη απμνξξπζκίδνληαο ηελ profilin. H ILK εκπιέθεηαη ζηνλ έιεγρν ηεο ζπζηαιηόηεηαο ησλ ηληδίσλ αθην-κπνζίλεο ζηα ζπιαθηνθύηηαξα ησλ ηειεπηαίσλ ζηαδίσλ, πηζαλόηαηα κέζσ ηεο δηαηαξαρήο ζηνλ ππνθπηηαξηθό εληνπηζκό ηνπ RhoI, θαζώο θαη κέζσ ηεο εθηνπηθήο ζπζζώξεπζεο ηεο κπνζίλεο (zipper). Σέινο, ε ilk αιιειεπηδξά γελεηηθά κε ηε dpak ζην επηζήιην ηνπ σνζπιαθίνπ. Ζ ΗLK επεξεάδεη ηνλ εληνπηζκό ηεο dpak ζηα ζπιαθηνθύηηαξα ηειεπηαίσλ ζηαδίσλ.

9 Δπίζεο, ε dpak είλαη απαξαίηεηε γηα ηνλ εληνπηζκό ησλ ηληεγθξηλώλ θαη ηεο ILK ζηα άθξα ησλ ηληδίσλ ηάζεο ηεο αθηίλεο. Δλώ, ε απνπζία ηεο dpak, όπσο θαη ηεο ilk, δηαηαξάζζεη ηελ νξγάλσζε ησλ ηληδίσλ ηάζεο ηεο αθηίλεο ζε ζπιαθηνθύηηαξα ηειεπηαίσλ ζηαδίσλ.

10 ABSTRACT My thesis is focused on the functional analysis of the molecular mechanism of the integrin-linked kinase (ILK) during development in Drosophila. We studied: a) the functional conservation of ILK in evolution, b) the possible role of specific amino acid motifs in the subcellular localization and function of ILK and c) the functional properties of ILK, when covalently bound to the plasma membrane. Furthermore, we sought new functional roles for ILK during development: a) in other tissues besides muscle system and b) in oogenesis. ILK protein sequence shares 60% identity and 75% similarity with the mammalian ILK. Based on these data, we tested the possible phylogenetic conservation of ILK function. For this purpose, we generated transgenic lines carrying the coding sequence of either human ILK (hilk) or mouse ILK (milk). The mammalian ILK has localizes similarly to the endogenous protein, in the muscle cells of Drosophila. Both mammalian proteins can substitute for the ILK function in Drosophila. However, human ILK binds to Dparvin with reduced affinity compared to the fly ILK. In order to investigate the molecular mechanism through which ILK regulates and acts during development, we tested whether the phosphorylation on the amino acids S176 and T180 contributes to the regulation of ILK function. It has been shown, in cell culture models, that the phosphorylation on these sites controls the subcellular localization of the protein in the nucleus. However, we proved that the possible pgoshorylation of these highly conserved residues is dispensable for the ILK localization at the muscle attachment sites (MAS) as well as for the function of ILK. Another residue which is necessary to localise ILK at the focal adhesion sites is F436. It is located on the last a helix of the carboxyl-terminal lobe of the kinase-like domain. The subcellular localization and the ILK function are unaffected by the point mutation F436A, in contrast to the experimental data on cell culture models. The point mutation F436A affects the ability of ILK to bind to parvin. We examined, whether membrane-bound ILK, through palmytoylation or farnesylation, is able to substitute the absence of the endogenous ILK, if ii can recruit proteins of the adhesome, independently of integrins. We generated two alternative forms of membrane-bound ILK, GAP-ILK-GFP and ILK-GFP-HRAS, which both

11 localize successfully at the plasma membrane of the embryonic muscle cells. Also, GAP-ILK-GFP and ILK-GFP-HRAS can substitute for the endogenous ILK throughout development. Moreover, GAP-ILK-GFP is able to recruit both PINCH and Parvin, as well as talin at the MAS, in both wild type and aps2 mutant embryonic muscle cells. Furthermore, we studied, in genetic molecular level, the role of ILK in the morphogenesis of the egg chambers, the organization and the homeostasis during oogenesis in Drosophila. We used two experimental approaches in order to silence ilk: a) we generated genetic mosaics for ilk and b) we used conditionally rescued ilk-/- flies. We observed that ILK is indispensable for the process of oogenesis in the fly. Loss of ILK disrupts the stalk cell formation and the separation of the successive newly formed egg chambers (twin egg chambers). Also, our experiments revealed that ILK is essential for the organization of the actin stress fibers at the late developmental stages of oogenesis and for the homeostasis of the actin cytoskeleton along apico-basal axis of the cell. ILK is indispensable for the organization and the maintenance of the baso-lateral cell junctions in the follicle cells, but not for the adherens junctions. Loss of ILK disrupts the localization of integrins at the tips of the actin stress fibers of the follicle cells at late developmental stages. Moreover, ILK participates in the regulation of the F-actin dynamics by down-regulating Dia and up-regulating profilin. ILK is involved in the control of the contractility of the acto-myosin fibers in the follicle cells at late developmental stages, probably by affecting the subcellular localization of Rho1, and causing ectopic accumulation of myosin (zipper). Finally, ilk interacts genetically with dpak in the follicular epithelium. ILK affects dpak localization in the follicle cells at late developmental stages. Furthermore, dpak is essential for the localization of both integrins and ILK at the tips of actin stress fibers. Loss of dpak, similarly to ilk, disrupts the organization of actin stress fibers in follicle cells at late developmental stages.

12 ΠΙΝΑΚΑ ΠΔΡΙΔΥΟΜΔΝΩΝ Δηζαγσγή Γελεηηθή αλάιπζε ζηε Drosophila melanogaster Ζ Drosophila ςξ μνβακζζιυξ-ιμκηέθμ Πξσηεΐλεο πνπ ζπκκεηέρνπλ ζηε δηακεζνιάβεζε ηεο θπηηαξηθήο ζύλδεζεο κε ην εμσθπηηάξην πιηθό (ECM) Ηκηεβηνίκεξ Οζ ζκηεβηνίκεξ ζηδ Drosophila Οζ θεζημονβίεξ ηςκ ζκηεβηνζκχκ i. Πνυζθοζδ ηοηηάνμο-ελςηοηηάνζμο οθζημφ ii. οβηνυηδζδ ημο ελςηοηηάνζμο οθζημφ iii. Δδναίςζδ ηδξ αηναζμ-ααζζηήξ ηοηηανζηήξ πμθζηυηδηαξ Σμ ΗΡΡ πνςηεσκζηυ ζφιπθμημ (IPP complex): (ILK-PINCH-PARVIN) Ηκηεβηνζκμζοκδευιεκδ ηζκάζδ (ILK) i. Γμιή ηδξ ILK ii. Λεζημονβία ηδξ ILK iii. Δίκαζ δ ILK θεζημονβζηή ηζκάζδ; iv. Ζ ILK ζηδ Drosophila v. H ILK ζε άθθα ιμκηέθα ζοζηήιαηα PINCH (Particularly Interesting New Cysteine-Histidine rich protein) Parvins Talin Wech dpak Δλςηοηηάνζμ οθζηυ (ECM) i. Κμθθαβυκμ ii. Λαιζκίκδ Α iii. Fibronectins iv. Βαζζηή ιειανάκδ (ΒΜ) Μπνηελνληηθέο ζπλδέζεηο Αηηίκδ-Μομζίκδ ζημοξ ιφεξ Η σνγέλεζε ζηε Drosophila Δπζζηυπδζδ ηδξ ςμβέκεζδξ Σμ βενιάνζμ: ιζα ζφκεεηδ δμιή ιε πμθθαπθμφξ ηφπμοξ πνυδνμιςκ ηοηηάνςκ

13 1.3.4 πδιαηζζιυξ ηςκ αθαζηζηχκ ηαζ ηςκ ιζζπμεζδχκ ηοηηάνςκ Σμ χνζιμ βενιάνζμ Βθαζηζηά εοθαηζμηφηηανα Πνυδνμια εοθαηζμηφηηανα ηαζ ζπδιαηζζιυξ ςμεοθαηίμο Πνμ-πμθζηά ηφηηανα ηαζ μ δζαπςνζζιυξ ηςκ ηφζηεςκ πδιαηζζιυξ ημο εοθαηχδμοξ επζεδθίμο Χνίιακζδ ηςκ πμθζηχκ ηοηηάνςκ Χνίιακζδ ηςκ επζεδθζαηχκ εοθαηζμηοηηάνςκ πδιαηζζιυξ ηςκ πενζμπχκ ημο πθαηχδμοξ ηαζ ημο ηοθζκδνζημφ εοθαηχδμοξ επζεδθίμο Γζαηήνδζδ ημο εοθαηχδμοξ επζεδθίμο Σα ηλίδηα ηάζεο ηεο F-αθηίλεο ζηηο ηληεγθξηληθέο ζπλδέζεηο Ονβάκςζδ ηαζ πνμζακαημθζζιυξ ηςκ ζκζδίςκ ηάζδξ ηδξ F-αηηίκδξ Σα ζπιαθηνθύηηαξα εκθαλίδνπλ αθξαην-βαζηθή πνιηθόηεηα θαη πνιηθόηεηα θαηά ηνλ επίπεδν άμνλα (planar polarity) Γπλακηθή ηεο αθηίλεο Ο αοευνιδημξ πμθοιενζζιυξ ηδξ αηηίκδξ (πονήκςζδ) Σμ ζζμγφβζμ ηδξ αηηίκδξ Γεκδνζηζηή πονήκςζδ αηηίκδξ-ζφιπθεβια Αrp2/3 ηαζ πνςηεΐκεξ WASp/Scar Μζηνέξ πνςηεΐκεξ πμο δεζιεφμοκ GTP (smgtpases) Σν ζύζηεκα αθην-κπνζίλεο (κε κπτθά θύηηαξα) Οζ ηάλεζξ ηςκ άηοπςκ ιομζζκχκ ηαζ μ νυθμξ ημοξ ζηδκ ηοηηανζηή ηίκδζδ Πνςηεΐκεξ ηςκ πθαηχκ ή εζηζχκ πνμζηυθθδζδξ - νυθμξ ηδξ αηημιομζίκδξ Τιηθά & Μέζνδνη Καιιηέξγεηα ζηειερώλ D. Melanogaster πιινγή θαη απνρνξηνπνίεζε εκβξύσλ Πξνεηνηκαζία εκβξύσλ θαη ηζηώλ γηα ρξώζε κε θζνξίδνληα αληηζώκαηα Μμκζιμπμίδζδ ειανφςκ Μμκζιμπμίδζδ ειανφςκ ιε θμνιαθδετδδ/ιεεακυθδ Μμκζιμπμίδζδ ειανφςκ ιε εένιακζδ Δπαγσγή γελεηηθώλ κσζατθώλ FLP/FRT ζφζηδια Αλαηνκία, κνληκνπνίεζε θαη ρξώζε κε αληηζώκαηα/ρξσζηηθέο νπζίεο ησλ σνζπιαθίσλ Ακμζμθεμνζζιυξ

14 2.4.3 Υνχζδ DAPI Γεκηνπξγία δηαγνληδηαθώλ ζηειερώλ Πνμεημζιαζία δείβιαημξ DNA οθθμβή ειανφςκ ηαζ ιεηαζπδιαηζζιυξ βαιεηζηήξ ζεζνάξ ιε έκεζδ πθαζιζδζαημφ DNA Σαοημπμίδζδ ηαζ πνςιμζςιζηή πανημβνάθδζδ εκεέζεςκ Κισλνπνίεζε γνληδίσλ ζε πιαζκηδηαθνύο θνξείο Παναζηεοή δεηηζηχκ ηοηηάνςκ E. Coli Μεηαζπδιαηζζιυξ δεηηζηχκ ηοηηάνςκ E. coli ιε πθαζιζδζαηέξ ηαηαζηεοέξ Απμιυκςζδ πθαζιζδζαημφ DNA Λφζδ ααηηδνζαηχκ ηοηηάνςκ ιε αναζιυ Πμζμηζημπμίδζδ κμοηθεσηχκ μλέςκ (DNA) Πμζμηζημπμίδζδ κμοηθεσηχκ μλέςκ (DNA) ιε θςημιέηνδζδ Πμζμηζημπμίδζδ κμοηθεσηχκ μλέςκ (DNA) ιε δθεηηνμθυνδζδ ζε πήηηςια αβανυγδξ Ζθεηηνμθυνδζδ κμοηθεσηχκ μλέςκ (DNA) ζε πήηηςια αβανυγδξ Απμιυκςζδ DNA απυ πήηηςια αβανυγδξ Δκγοιζηή πέρδ αθθδθμοπίαξ DNA ιε πενζμνζζηζηέξ εκδμκμοηθεάζεξ Ακηίδναζδ ζφκδεζδξ ηιήιαημξ DNA ιε πθαζιζδζαηυ θμνέα Αιπζηδσηή αληίδξαζε πνιπκεξάζεο (Polymerase Chain Reaction) Μέζνδνη επαγσγήο δηαγνληδίσλ Ηζημ-εζδζηή οπενέηθναζδ δζαβμκζδίςκ Ηζημ-εζδζηή επαβςβή RNAi ΠΑΡΑΡΣΖΜΑ Α-ηεθέπδ Drosophila ΠΑΡΑΡΣΖΜΑ Β-Μμνζαηά Δνβαθεία ΠΑΡΑΡΣΖΜΑ Γ- Ακηζδναζηήνζα ΠΑΡΑΡΣΖΜΑ Δ- Ακηζζχιαηα ΠΑΡΑΡΣΖΜΑ Σ- Απεζημκζζηζηή ακάθοζδ Απνηειέζκαηα Μεραληζηηθέο ιεηηνπξγίεο ηεο ILK Ζ θεζημονβία ηδξ ILK είκαζ ζοκηδνδιέκδ ηαηά ηδκ ελέθζλδ Ακάθοζδ ημο οπμηοηηανζημφ εκημπζζιμφ ηδξ ILK ηςκ εδθαζηζηχκ ζημοξ ιφεξ ηδξ Drosophila Ζ ILK ηςκ εδθαζηζηχκ ιπμνεί κα οπμηαηαζηήζεζ ηδκ μιυθμβδ πνςηεΐκδ ζηδ Drosophila Ζ hilk ειθακίγεζ ιεζςιέκδ ζοκάθεζα ιε ηδκ parvin ηδξ Drosophila

15 ΤΝΟΦΖ ΑΠΟΣΔΛΔΜΑΣΧΝ ΔΝΟΣΖΣΑ Έθεβπμξ ημο θεζημονβζημφ νυθμο ηςκ ζοκηδνδιέκςκ αιζκμλέςκ S176, T180 F436 ηδξ ILK Ο οπμηοηηανζηυξ εκημπζζιυξ ηαζ δ θεζημονβία ηδξ ILK δεκ επδνεάγεηαζ απυ πζεακή θςζθμνοθίςζδ ζηζξ εέζεζξ S176 ηαζ T Ζ πζεακή θςζθμνοθίςζδ ηςκ εέζεςκ S176 ηαζ Σ180 δεκ επδννεάγεζ ημκ οπμηοηηανζηυ εκημπζζιυ ηδξ ILK ζηζξ ΜΣ Οζ ιεηαθθαβιέκεξ πνςηεΐκεξ οπμηαεζζημφκ πθήνςξ ηδ θεζημονβία ηδξ εκδμβεκμφξ πνςηεΐκδξ Ζ ζδιεζαηή ιεηάθθαλδ F436A δεκ επδνεάγεζ ημκ οπμηοηηανζηυ εκημπζζιυ ηαζ ηδ θεζημονβία ηδξ ILK Ζ ζδιεζαηή ιεηαθθαβή F436A δεκ επδνεάγεζ ημ πνυηοπμ ημο οπμηοηηανζημφ εκημπζζιμφ ηδξ ILK ζηα ειανοσηά ηαζ πνμκοιθζηά ιοσηά ηφηηανα H θεζημονβία ηδξ ILK δεκ επδνεάγεηαζ απυ ηδ ζδιεζαηή ιεηαθθαβή F436A Ζ ζδιεζαηή ιεηαθθαβή F436A ιεζχκεζ ηδ ζοκάθεζα ηδξ πνςηεΐκδξ ιε ηδκ parvin ΤΝΟΦΖ ΑΠΟΣΔΛΔΜΑΣΧΝ ΔΝΟΣΖΣΑ Λεζημονβζηή ακάθοζδ ηδξ ιειανακμδεζιεουιεκδξ ILK Καηαζηεοή ηςκ δζάθμνςκ δζαβμκζδίςκ ηδξ ιεανακμζογεοβιέκδξ ILK Τπμηοηηανζηυξ εκημπζζιυξ ηαζ ακάθοζδ ηδξ θεζημονβζηυηδηαξ ηςκ δζαβμκζδίςκ ηδξ ιειανακμδεζιεουιεκδξ ILK Ζ ιειανακμδεζιεοιέκδ ILK είκαζ ζηακή κα ζοβηεκηνχζεζ ιυνζα ημο ζοκδεμζχιαημξ ζηζξ ΜΣ απμοζία ζκηεβηνζκχκ Ζ ιειανακμδεζιεοιέκδ ILK δεκ οπμηαεζζηά ηζξ ζκηεβηνίκεξ ζηδ δζαιεζμθάαδζδ ηδξ ζφκδεζδξ ημο ηοηηανμζηεθεημφ αηηίκδξ ηαζ ηδξ πθαζιαηζηήξ ιειανάκδξ ΤΝΟΦΖ ΑΠΟΣΔΛΔΜΑΣΧΝ ΔΝΟΣΖΣΑ Νένη ιεηηνπξγηθνί ξόινη ηεο ILK θαηά ηε δηάξθεηα ηεο αλάπηπμεο Λεζημονβζημί νυθμζ ηδξ ΗLK ζε άθθμοξ ζζημφξ εηηυξ ημο ιοσημφ ζζημφ 149 ΤΝΟΦΖ ΑΠΟΣΔΛΔΜΑΣΧΝ ΔΝΟΣΖΣΑ Ζ ILK είκαζ απαναίηδηδ ηαηά ηδ δζάνηεζα ηδξ ςμβέκεζδξ ζηδ Drosophila Πνυηοπμ έηθναζδξ ηδξ ILK ζηδκ ακαπηοζζυιεκδ ςμεήηδ οβηνζηζηή ιεθέηδ ηςκ δζαθμνεηζηχκ πεζναιαηζηχκ ιεευδςκ βζα ηδ ιεθέηδ ημο νυθμο ηδξ ILK ζηδκ ςμβέκεζδ, Πθεμκεηηήιαηα- Μεζμκεηηήιαηα

16 i. Μεθέηδ ηςκ ςμεδηχκ ηςκ ζζημεζδζηά δζαζςζιέκςκ εκήθζηςκ αηυιςκ ιέζς ηδξ έηθναζδξ ημο δζαβμκζδίμο ηδξ ilk οπυ ημκ έθεβπμ ημο 24ΒGal ii. Καηαζηεοή βεκεηζηχκ ιςζασηχκ βζα ημ βμκίδζμ ηδξ ilk ζηδκ εκήθζηδ ςμεήηδ επαβυιεκμζ ιέζς ημο ζοζηήιαημξ hsflp/frt iii. Καηαζηεοή βεκεηζηχκ ιςζασηχκ βζα ημ βμκίδζμ ηδξ ilk ζηδκ εκήθζηδ ςμεήηδ επαβυιεκμζ ιέζς ημο ζοζηήιαημξ UAS:FLP/Gal iv. Υνήζδ ημο ζοζηήιαημξ απμζζχπδζδξ UAS:IR/Gal Ακάθοζδ ημο νυθμο ηδξ ILK ζηα ανπζηά ζηάδζα ηδξ ςμβέκεζδξ Πενζβναθή ηςκ εκδζάιεζςκ δοκαιζηχκ ηαηαζηάζεςκ ηδξ μνβάκςζδξ ηςκ ζκζδίςκ ηάζδξ ηδξ αηηίκδξ ζε άβνζμο ηφπμο ςμεοθάηζμ i. Φαζκυηοπμζ αηηίκδξ απμοζία ilk ii. Φαζκυηοπμζ ιζηνμζςθδκίζηςκ απμοζία ilk Ζ ILK είκαζ απαναίηδηδ βζα ηδ δζαηήνδζδ ηδξ μιμζυζηαζδξ ημο ζκηεβηνζκμ-ελανηχιεκμο ιδπακζζιμφ ηοηηανζηήξ πνμζηυθθδζδξ Δπίδναζδ ηδξ απμοζίαξ ilk ζηδ δζαηήνδζδ ηςκ ηοηηανζηχκ ζοκδέζεςκ ηαηά ημκ αηναζμ-ααζζημ άλμκα ημο εοθαηζμηοηηάνμο Ζ ILK ζοιιεηέπεζ ζηδ νφειζζδ ηδξ μιμζυζηαζδξ ηδξ αηηίκδξ Ζ ILK επδνεάγεζ ηδκ μιμζυζηαζδ ημο ιδπακζζιμφ ηδξ αηημιομζίκδξ ζημ επζεήθζμ ημο ςμεοθαηίμο Ζ ilk αθθδθεπζδνά βεκεηζηά ιε ηδ dpak ζημ επζεήθζμ ημο ςμεοθαηίμο ΤΝΟΦΖ ΑΠΟΣΔΛΔΜΑΣΧΝ ΔΝΟΣΖΣΑ πδήηεζε Μεραληζηηθέο ιεηηνπξγίεο ηεο ILK Ζ θεζημονβία ηδξ ILK είκαζ ζοκηδνδιέκδ ηαηά ηδ δζάνηεζα ηδξ ελέθζλδξ Ζ θςζθμνοθίςζδ ηςκ αιζκμλζηχκ ηαηαθμίπςκ S176 & T180 δε νοειίγεζ ημκ οπμηοηηανζηυ εκημπζζιυ ηδξ ILK ζημοξ ιφεξ Σμ αιζκμλζηυ ηαηάθμζπμ F436 δεκ είκαζ απαναίηδημ βζα ηδ θεζημονβία ηδξ ILK Ζ ιειανακμδεζιεοιέκδ ILK είκαζ ζηακή κα ζοβηεκηνχζεζ ιυνζα ημο ζοκδεμζχιαημξ ζηζξ ΜΣ απμοζία ζκηεβηνζκχκ Λεηηνπξγία ηεο ILK ζηελ σνγέλεζε ζηε Drosophila Ζ απμοζία ηδξ ILK μδδβεί ζε ιεζςιέκδ βμκζιυηδηα Ζ ILK είκαζ απαναίηδηδ βζα ηδ δζαθμνμπμίδζδ ηςκ οπμπθδεοζιχκ ηςκ εοθαηζμηοηηάνςκ ζηα πνχζια ζηάδζα ηδξ ςμβέκεζδξ Ζ ILK επδνεάγεζ ημ ιήημξ ημο χνζιμο ςμεοθαηίμο Ζ ILK ζοιιεηέπεζ ζηδ νφειζζδ ηδξ ζοζηαθηυηδηαξ ηδξ αηημ-ιομζίκδξ Ζ ILK ζοιιεηέπεζ ζηδ νφειζζδ ηδξ δοκαιζηήξ ηδξ αηηίκδξ

17 4.2.6 Ζ ΗLK είκαζ απαναίηδηδ βζα ηδκ μνβάκςζδ/δζαηήνδζδ ηςκ ααζμπθεονζηχκ ηοηηανζηχκ ζοκδέζεςκ H ILK ηαζ δ dpak είκαζ αιμζααία ελανηχιεκεξ βζα ηδκ μιαθή μνβάκςζδ ηαζ δζαηήνδζδ ηςκ ζκζδίςκ αηηίκδξ Βηβιηνγξαθία

18 7 Εηζαγωγή

19 8

20 1.1 Γελεηηθή αλάιπζε ζηε Drosophila melanogaster Ζ Drosophila απμηεθεί έκα απυ ηα ηαθφηενα ιεθεηδιέκα πεζναιαηζηά γςσηά ιμκηέθα πμο πνδζζιμπμζμφκηαζ ζημ πθαίζζμ ηδξ ααζζηήξ βζα ηδ δζενεφκδζδ ιμνζαηχκ ιμκμπαηζχκ ηαζ ηδ ηαθφηενδ ηαηακυδζδ ηςκ θεζημονβζχκ ηςκ αζμθμβζηχκ ιμνίςκ απυ ημ επίπεδμ ημο DNA ιέπνζ ημ ζηάδζμ ηςκ πνςηεσκζηχκ αθθδθεπζδνάζεςκ. Ζ ιφβα απμηεθεί έκα ζδιακηζηυ ιμκηέθμ ζφζηδια βζα ηδκ ηαηακυδζδ ηςκ ηακυκςκ πμο δζέπμοκ ηδ αζμθμβία αθθά ηα έκα in vivo ενβαζηήνζμ βζα ηδ δζενεφκδζδ ηδξ θεζημονβίαξ ηαζ ηςκ ζδζμηήηςκ ηςκ αζμιμνίςκ ιε ζηυπμ ηδκ εθανιμβή αοηήξ ηδξ ζοζζςνεοιέκδξ ααζζηήξ βκχζδξ ζηδκ ηθζκζηή ζαηνζηή ένεοκα Ζ Drosophila ςξ μνβακζζιυξ-ιμκηέθμ Ζ Drosophila melanogaster ακήηεζ ζηα μθμιεηάαμθα δίπηενα έκημια ηδξ μζημβέκεζαξ Drosophilidae. Ζ ακάπηολδ ηδξ μθμηθδνχκεηαζ ζε ηνία ζηάδζα ιεηά ηδκ ειανομβέκεζδ, πμο πενζθαιαάκμοκ ηα ζηάδζα ηδξ πνμκφιθδξ ηαζ ηδξ κφιθδξ ηαζ ηδ ιεηάααζδ ζημ εκήθζημ άημιμ. Ζ ακάπηολδ ηδξ Drosophila μθμηθδνχκεηαζ ζε πενίπμο δέηα διένεξ ζε εενιμηναζία 25 μ C. Ζ ειανομβέκεζδ πςνίγεηαζ ζε δεηαεπηά ζηάδζα ηαζ δζανηεί ιζα διένα. Αημθμοεεί δ εηηυθαρδ ημο αοβμφ ηαζ δ ιεηάααζδ ζηα πνμκοιθζηά ζηάδζα, ηαηά ηα μπμία δζαηδνμφκηαζ μζ ζζημί πμο έπμοκ ζπδιαηζζηεί ηαηά ηδκ ειανοσηή ακάπηολδ ηαζ μ μνβακζζιυξ αολάκεζ ζε ιέβεεμξ. Τπάνπμοκ ηνία πνμκοιθζηά ζηάδζα, εη ηςκ μπμίςκ ημ πνχημ ηαζ ημ δεφηενμ δζανημφκ απυ ιζα διένα. Σμ ηνίημ πνμκοιθζηυ ζηάδζμ μθμηθδνχκεηαζ ζε δομ διένεξ ηαζ ημ ζηάδζμ ηδξ κφιθδξ ζε πέκηε διένεξ πενίπμο. Καηά ημ ζηάδζμ ηδξ κφιθδξ θαιαάκεζ πχνα δ ιεηαιυνθςζδ ζημ εκήθζημ άημιμ πμο ζδιαημδμηείηαζ απυ ζζηυθοζδ ηςκ πνμκοιθζηχκ δμιχκ ηαζ δδιζμονβία ηςκ ζζηχκ ημο εκήθζημο αηυιμο. Ζ Drosophila melanogaster έπεζ 4 γεφβδ πνςιμζςιάηςκ: ημ γεφβμξ ηςκ θοθεηζηχκ (ΥΥ ζηα εδθοηά, ΥΤ ζηα ανζεκζηά άημια) ηαζ 3 γεφβδ αοημζςιζηχκ (2 μ, 3 μ, 4 μ ). Σμ Τ ηαζ ημ 4 μ πνςιυζςια είκαζ ιζηνά ηαζ απμηεθμφκηαζ ηονίςξ απυ εηενμπνςιαηίκδ, έηζζ ιεθεηχκηαζ ηονίςξ ηα βμκίδζα ζηα πνςιμζχιαηα Υ, 2 μ ηαζ 3 μ. 9

21 Δηθόλα 1: Ο θύθινο δσήο ηεο Drosophila (απυ Δηηυξ ημο παιδθμφ ηυζημοξ ηαζ ηδξ εοημθίαξ ζοκηήνδζδξ ηδξ Drosophila ζημ ενβαζηήνζμ, επζπθέμκ θυβμζ ζοκδβμνμφκ οπέν ηδξ ηαηαθθδθυηδηαξ ηδξ ςξ μνβακζζιμφ-ιμκηέθμο: Μηθξφο θχθινο δσήο: Ζ ακάπηολδ ηδξ μθμηθδνχκεηαζ ζε 10 διένεξ ηαζ ηάεε εδθοηυ άημιμ πανάβεζ ιεβάθμ ανζειυ απμβυκςκ, βεβμκυξ πμο ηαεζζηά δοκαηή ηδκ ακάθοζδ ιεβάθμο πθδεοζιμφ ζε ιζηνυ πνυκμ (Δηθ.1). Δπθνιία ζηελ παξαηήξεζε: Σα έιανοα ηδξ Drosophila είκαζ δζάθακα ηαζ δ ειανομβέκεζδ θαιαάκεζ πχνα εηηυξ ημο ζχιαημξ ημο εδθοημφ αηυιμο, βεβμκυξ πμο επζηνέπεζ ηδκ άιεζδ παναηήνδζδ ηςκ ιμνθμβεκεηζηχκ δζενβαζζχκ πμο ζοιααίκμοκ ηαηά ηδκ ακάπηολδ ημο ειανφμο. Δπζπθέμκ, μ ελςζηεθεηυξ ημο εκήθζημο αηυιμο θένεζ πθήεμξ ελανηδιάηςκ, υπςξ, βζα 10

22 πανάδεζβια, μζ θθέαεξ ηςκ θηενχκ, ηα μπμία είκαζ πνμζαάζζια ζε παναηήνδζδ. Τςειφο βαζκφο ζπληήξεζεο: Έκαξ ιεβάθμξ ανζειυξ ακαπηολζαηχκ δζαδζηαζζχκ είκαζ ζοκηδνδιέκεξ ακάιεζα ζηδ Drosophila ηαζ ζηα ζπμκδοθςηά. Αλίγεζ κα ζδιεζςεεί υηζ ημ 70% πενίπμο ηςκ βμκζδίςκ πμο εκέπμκηαζ ζε αζεέκεζεξ ημο ακενχπμο δζαεέημοκ μιυθμβα ζηδ Drosophila (Fortini, Skupski et al. 2000; Reiter, Potocki et al. 2001), εκχ, ηαοηυπνμκα, έπεζ δζαπζζηςεεί υηζ μζ ιεηααμθέξ ζηδκ έηθναζδ ηςκ μιυθμβςκ βμκζδίςκ ηςκ ζπμκδοθςηχκ ζηδ Drosophila επάβμοκ πανυιμζμοξ θαζκμηφπμοξ. Μεγάινο αξηζκφο δηαζέζηκσλ ζηειερψλ: Ζ αθθδθμφπζζδ ημο βμκζδζχιαημξ ηδξ Drosophila έπεζ μθμηθδνςεεί ηαζ έπμοκ ανεεεί πενίπμο βμκίδζα. Γζα έκα ιεβάθμ ανζειυ αοηχκ οπάνπμοκ δζαεέζζιεξ ιεηαθθάλεζξ, μζ μπμίεξ έπμοκ πνμέθεεζ είηε απυ ηδκ έκεεζδ Ρ-ιεηαεεηχκ ζημζπείςκ ή απυ ηδ δδιζμονβία εκημπζζιέκςκ πνςιμζςιζηχκ εθθείρεςκ ή απυ πεζνάιαηα ηοπαίαξ ιεηαθθαλζβέκεζδξ ιε EMS (Loukeris, Arca et al. 1995; Spradling, Stern et al. 1999; Huet, Lu et al. 2002; Bellen, Levis et al. 2004; Thibault, Singer et al. 2004). Μεγάινο αξηζκφο δηαζέζηκσλ γελεηηθψλ εξγαιείσλ: Έκαξ ιεβάθμξ ανζειυξ ιεεμδμθμβζχκ έπεζ ακαπηοπεεί, μζ μπμίεξ επζηνέπμοκ ηδ δδιζμονβία ηθδνμκμιήζζιςκ αθθαβχκ ζημ βμκζδίςια. Ζ δζαηήνδζδ ηςκ αθθαβχκ αοηχκ επζηοβπάκεηαζ ιε ηδ πνήζδ ζζμγοβζζιέκςκ πνςιμζςιάηςκ (balancer chromosomes), πμο δεκ επζηνέπμοκ ημκ ακαζοκδοαζιυ ιεηαλφ μιμθυβςκ πνςιμζςιάηςκ ηαηά ηδ ιείςζδ. 11

23 1.2 Πξσηεΐλεο πνπ ζπκκεηέρνπλ ζηε δηακεζνιάβεζε ηεο θπηηαξηθήο ζύλδεζεο κε ην εμσθπηηάξην πιηθό (ECM) Ηκηεβηνίκεξ Οζ ζκηεβηνίκεξ είκαζ ιζα μζημβέκεζα δζαιειανακζηχκ οπμδμπέςκ πμο δζαιεζμθααμφκ ηδκ πνμζηυθθδζδ ημο ηοηηάνμο ζημ ελςηοηηάνζμ οθζηυ. Οζ ζκηεβηνίκεξ είκαζ εηενμδζιενείξ οπμδμπείξ πμο απμηεθμφκηαζ απυ δφμ ιδ μιμζμπμθζηά δεζιεοιέκεξ δζαιειανακζηέξ πνςηεΐκεξ ηάλδξ Η, ιζα α ηαζ ιζα α οπμιμκάδα. Καζ μζ δομ οπμιμκάδεξ ηςκ ζκηεβηνζκχκ πενζέπμοκ ιεβάθεξ ελςηοηηάνζεξ πενζμπέξ, μζ μπμίεξ αθθδθεπζδνμφκ ηονίςξ ιε πνςηεΐκεξ ημο ελςηοηηάνζμο πχνμο ηαζ ιζηνέξ ηοηηανμπθαζιαηζηέξ μονέξ ιέζς ηςκ μπμίςκ αθθδθεπζδνμφκ ιε πθδεχνα εκδμηοηηάνζςκ πνςηεσκχκ ηαζ δζαιεζμθααμφκ ηδ ζφκδεζδ ιε ημκ ηοηηανμζηεθεηυ αηηίκδξ. Οζ ζκηεβηνίκεξ νοειίγμοκ ανηεηέξ εειεθζχδεζξ δζαδζηαζίεξ ηαηά ηδ ιμνθμβέκεζδ ημο επζεδθίμο εκμνπδζηνχκμκηαξ ηδ ζοβηέκηνςζδ ηυζμ πνςηεσκχκ ζοκδεηχκ υζμ ηαζ ιμνίςκ ζδιαημδυηδζδξ πμο νοειίγμοκ ηδκ πνυζθοζδ ηοηηάνμοελςηοηηάνζμο οθζημφ, ηδ ζοκανιμθυβδζδ ημο ελςηοηηάνζμο οθζημφ, ηδκ ηοηηανζηή ιεηακάζηεοζδ ηαζ ημ ηοηηανζηυ ζπήια. Δπίζδξ, ειπθέημκηαζ ζηδ νφειζζδ ημο ηοηηανζημφ πμθθαπθαζζαζιμφ ηαζ ηδξ ηοηηανζηήξ επζαίςζδξ, ηαζ ηαηεοεφκμοκ ηδ δζαθμνμπμίδζδ ζζηχκ (Brown, Gregory et al. 2000). Οζ ζκηεβηνίκεξ ηάκμοκ ηδκ ειθάκζζή ημοξ βζα πνχηδ θμνά ζε ιμκμηφηηανμοξ μνβακζζιμφξ (Απμοζυγςα) (Sebe-Pedros and Ruiz-Trillo). Δίκαζ ελαζνεηζηά ορδθά ζοκηδνδιέκεξ ηαηά ηδ δζάνηεζα ηδξ ελέθζλδξ. ημ C. elegans οπάνπμοκ δομ α οπμιμκάδεξ ηαζ ιζα α. ηδ Drosophila οπάνπμοκ δομ α οπμιμκάδεξ, αps ηαζ ακ, ηαζ πέκηε α οπμιμκάδεξ, αps1έςξ aps5. ηα πμνδςηά, οπάνπμοκ 8 α οπμιμκάδεξ ηαζ 18 α οπμιμκάδεξ βζα κα ζπδιαηίζμοκ ημοθάπζζημκ 24 δζαθμνεηζημφξ οπμδμπείξ. Πανυθμ ημ ιεβαθφηενμ ανζειυ ζκηεβηνζκχκ ζηα πμνδςηά, μζ ζκηεβηνίκεξ ηυζμ ηςκ πμνδςηχκ υζμ ηαζ ηςκ ιδ πμνδςηχκ επζδεζηκφμοκ δζαηδνδιέκα δμιζηά ηαζ θεζημονβζηά βκςνίζιαηα. Βαζζγυιεκμζ ζηδκ εζδζηυηδηά ημοξ ςξ πνμξ ημοξ ελςηοηηάνζμοξ πνμζδέηεξ, μζ ζκηεβηνίκεξ ιπμνμφκ κα ηαηδβμνζμπμζδεμφκ ζε ηνεζξ ηφπμοξ: 1) RGD οπμδμπείξ πμο δεζιεφμκηαζ ζε ζοζηαηζηά ημο ελςηοηηάνζμο οθζημφ πμο πενζέπμοκ ημ πνυηοπμ ανβζκίκδ-βθοηίκδ-αζπανηζηυ μλφ (Arg-Gly-Asp), υπςξ δ fibronectin ηαζ αζηνμκεηηίκδ, 2) οπμδμπείξ θαιζκίκδξ ηαζ 3) οπμδμπείξ ημθθαβυκμο (Brown 2000). 12

24 Φοθμβεκεηζηέξ ιεθέηεξ έπμοκ δείλεζ υηζ δφμ απυ αοηέξ ηζξ οπενμζημβέκεζεξ ηςκ ζκηεβηνζκχκ πνμέηορακ κςνίξ ηαηά ηδκ ελέθζλδ ηςκ ιεηαγχςκ: ιζα εζδζηή βζα ηδ θαιζκίκδ ηαζ ιζα βζα ηζξ RGD αθθδθμοπίεξ (Δηθ.2). Ζ οπμιμκάδα αps1 ηδξ Drosophila, μζ α3,6 ηαζ7 ηςκ εδθαζηζηχκ ηαζ δ αg8.3 ημο C. elegans δεζιεφμοκ ηδ θαιζκίκδ, εκχ δ αps2 ηδξ Drosophila μζ α5,8 ηαζ κ ηςκ εδθαζηζηχκ ηαζ δ αf2.1 δεζιεφμοκ ηζξ RGD-πενζέπμοζεξ πνςηεΐκεξ. Οζ αps3,4 ηαζ 5 οπμιμκάδεξ ηδξ Drosophila είκαζ ζηεκά ζπεηζγυιεκεξ ηαζ ζπδιαηίγμοκ ιζα λεπςνζζηή ελεθζηηζηή μιάδα πςνίξ μνευθμβα ζε άθθα είδδ. ηα Υμνδςηά έπμοκ ελεθζπεεί πμθθέξ πενζζζυηενεξ α οπμιμκάδεξ, μζ ιζζέξ εη ηςκ μπμίςκ πενζέπμοκ ιζα επζπθέμκ πενζμπή Η (δ μπμία πανμοζζάγεζ μιμθμβία ιε ηζξ von Willebrand πενζμπέξ), δ μπμία δεκ είκαζ πανμφζα ζηζξ α οπμιμκάδεξ ηςκ ζκηεβηνζκχκ ηδξ ιφβαξ ηαζ ημο C. elegans. Δηηυξ απυ ηα ζοζηαηζηά ημο ελςηοηηάνζμο οθζημφ, ιενζηέξ ζκηεβηνίκεξ υπςξ δ οπμιάδα ηςκ α2 ζκηεβηνζκχκ δζαιεζμθααεί ηδκ πνυζθοζδ ηοηηάνμο-ηοηηάνμο ηαεχξ δεζιεφεηαζ ζε οπμδμπείξ ηςκ άθθςκ ηοηηάνςκ. 13

25 Δηθόλα 2: Φπινγελεηηθό δέλδξν επηιεγκέλσλ ηληεγθξηληθώλ ππνκνλάδσλ, ηνμπμπμζδιέκδ απυ ( A4188) Έκαξ απυ ημοξ θυβμοξ πμο ηα ηφηηανα εηθνάγμοκ ανηεηέξ δζαθμνεηζηέξ ζκηεβηνίκεξ πμο πνμζδέκμοκ ημ ίδζμ ιυνζμ είκαζ υηζ, ζε μπμζαδήπμηε ζηζβιή, ιζα ηαηδβμνία ιπμνεί κα εκενβμπμζδεεί (π.π. ιε ηδκ πνυζδεζδ ζε ιζα εζδζηή ηοηηανμπθαζιαηζηή πνςηεΐκδ) ηαζ έηζζ κα βίκεζ ζηακή κα ζοκδεεεί ζε έκα ζοζηαηζηυ ηδξ ECM, εκχ ιζα άθθδ ηαηδβμνία ζκηεβηνζκχκ κα παναιείκεζ ακεκενβή. Οζ ζκηεβηνίκεξ ιπμνμφκ κα θεζημονβήζμοκ, ςξ ιεηαβςβείξ ζήιαημξ, εκενβμπμζχκηαξ πμζηίθα εκδμηοηηάνζα ιμκμπάηζα, υηακ εκενβμπμζμφκηαζ απυ εζδζηέξ ζοκδέζεζξ ηδξ ελςηοηηάνζαξ μοζίαξ. Οζ ζκηεβηνίκεξ ηαεχξ επίζδξ ηαζ μζ ζοκήεεζξ 14

26 οπμδμπείξ ιεηαβςβήξ ζήιαημξ ζοκενβάγμκηαζ ζοπκά βζα ηδκ επίηεολδ ηδξ ηοηηανζηήξ ακάπηολδξ, ηδξ ηοηηανζηήξ επζαίςζδξ ηαζ ηδξ ηοηηανζηήξ δζαίνεζδξ Οη ηληεγθξίλεο ζηε Drosophila ηδ Drosophila, ηα βμκίδζα πμο ηςδζημπμζμφκ βζα ηζξ δζαθμνεηζηέξ οπμιμκάδεξ ηςκ ζκηεβηνζκχκ έπμοκ ηαοημπμζδεεί ηαζ ιεηαθθάβιαηα βζα αοηά ηα βμκίδζα έπμοκ απμιμκςεεί. Καζ μζ 5 α οπμιμκάδεξ, δ αps1 πμο ηςδζημπμζείηαζ απυ ημ multiple edematous wing (mew), δ αps2 πμο ηςδζημπμζείηαζ απυ ημ inflated (if), μζ αps3-4 ηςδζημπμζμφκηαζ απυ ημ scab, ηαζ δ αps5, ζοκήεςξ ζπδιαηίγμοκ εηενμδζιενή ιε ηδ αps οπμιμκάδα πμο ηςδζημπμζείηαζ απυ ημ myospheroid (mys). Αοηυ έπεζ δεζπεεί βζα ηζξ οπμιμκάδεξ αps1, αps2 ηαζ αps3, μζ μπμίεξ έπμοκ απμιμκςεεί αζμπδιζηά (Brower, Wilcox et al. 1984; Wilcox, Brown et al. 1984; Gotwals, Paine-Saunders et al. 1994; Stark, Yee et al. 1997; Grotewiel, Beck et al. 1998). H αθθδθμοπία ηδξ ακ οπμιμκάδαξ είκαζ θζβυηενμ δζαηδνδιέκδ ζε ζπέζδ ιε ηζξ οπυθμζπεξ α οπμιμκάδεξ ηαζ είκαζ ημ ιυκμ ιυνζμ πνυζθοζδξ ζηδ Drosophila πμο πενζέπεζ πενζμπή μιυθμβδ ηδξ von Willebrand A πενζμπήξ. Μέπνζ ηχνα, δ ιυκδ βκςζηή οπμιμκάδα ηςκ ζκηεβηνζκχκ πμο ζπδιαηίγεζ εηενμδζιενέξ ιε ηδ ακ οπμιμκάδα είκαζ δ αps3 οπμιμκάδα (Devenport and Brown 2004). Λυβς ηδξ ορδθήξ μιμθμβίαξ ηςκ αθθδθμοπζχκ ιεηαλφ ηςκ οπμιμκάδςκ αps3, αps4 ηαζ αps5, είκαζ πζεακυ υηζ δ ακ οπμιμκάδα ζπδιαηίγεζ εηενμδζιενή ηαζ ιε αοηέξ ηζξ οπμιμκάδεξ. Ζ ακ οπμιμκάδα ζηδ Drosophila εηθνάγεηαζ ηονίςξ ζηα εκδμδενιζηά ηφηηανα ημο ακαπηοζζυιεκμο εκηένμο (midgut) ημο ειανφμο ηαζ δ έηθναζδ ηδξ δζαηδνείηαζ ηαζ ηαηά ημ πνμκοιθζηυ ηαζ κοιθζηυ ζηάδζμ (Yee and Hynes 1993). Ζ ακ οπμιμκάδα δεκ είκαζ απαναίηδηδ βζα ηδκ επζαίςζδ ηαζ ηδ βμκζιυηδηα ημο μνβακζζιμφ. Αοηή δ οπμιμκάδα απαζηείηαζ ιυκμ ζημ έκηενμ υπμο ιπμνεί κα οπμηαηαζηήζεζ ιενζηχξ ηδ θεζημονβία ηδξ αps οπμιμκάδαξ, αθθά δεκ έπμοκ ακζπκεοηεί άθθμζ νυθμζ βζα αοηή ηδκ οπμιμκάδα ηαηά ηδ δζάνηεζα ηδξ ειανομβέκεζδξ, ηδκ ακάπηολδ ηςκ ακαπηολζαηχκ ειανοσηχκ δίζηςκ ή ηαηά ηδκ ςμβέκεζδ (Devenport and Brown 2004). 15

27 Οη ιεηηνπξγίεο ησλ ηληεγθξηλψλ Όπςξ ακαθένεδηε ηαζ πνμδβμοιέκςξ, μζ ζκηεβηνίκεξ, έπεζ δεζπεεί, κα επζηεθμφκ δζαθμνεηζημφξ νυθμοξ ηαηά ηδ δζάνηεζα ηδξ ιμνθμβέκεζδξ ζοβηεηνζιέκςκ ηφπςκ επζεδθίςκ ηαηά ηδκ ακάπηολδ υπςξ: i. Πξφζθπζε θπηηάξνπ-εμσθπηηάξηνπ πιηθνχ Οζ ζκηεβηνίκεξ δζαιεζμθααμφκ ηδ ζηαεενή πνυζθοζδ ακάιεζα ζηα ηφηηανα ηαζ ημ οπυζηνςιά ημοξ ζοκδέμκηαξ ημ ελςηοηηάνζμ οθζηυ ιε ημκ ηοηηανμζηεθεηυ αηηίκδξ (Hynes 1992). Ζ πνυζθοζδ ζημ ελςηοηηάνζμ οθζηυ ιέζς ηςκ ζκηεβηνζκχκ απαζηεί ηζξ ελςηοηηάνζεξ πενζμπέξ ηαζ ηςκ δομ οπμιμκάδςκ, ηαεχξ ζοκεζζθένμοκ ζημ ζπδιαηζζιυ ηδξ εέζδξ πνυζδεζδξ βζα ημοξ πνμζδέηεξ πμο είκαζ πανυκηεξ ζημ ελςηοηηάνζμ οθζηυ (Xiong, Stehle et al. 2002). Δπεζδή μζ ζκηεβηνίκεξ εδνάγμκηαζ ζηδ ααζζηή πενζμπή ηδξ ηοηηανζηήξ ιειανάκδξ ζηα πενζζζυηενα είδδ ηοηηάνςκ, μζ ζοκδέζεζξ ιε ημκ ηοηηανμζηεθεηυ αηηίκδξ ζηζξ ζοκδέζεζξ διζπνυζδεζδξ (hemiadherens junctions) ηαζ ιε ηα εκδζάιεζα ζκίδζα ζηα διζδεζιμζχιαηα δζαιεζμθααμφκηαζ ζηζξ ααζζηέξ πθεονέξ. Ζ α ηοηηανμπθαζιαηζηή πενζμπή είκαζ πνςηανπζηά οπεφεοκδ βζα ηδ δέζιεοζδ ηοηηανμπθαζιαηζηχκ πνςηεσκχκ, μζ μπμίεξ απαζημφκηαζ βζα ηδ θεζημονβία ηςκ πνςηεσκχκ ςξ πνμξ ηδ ιεηαβςβή ζδιάηςκ ηαζ ηδ πνυζθοζδ (Hynes 2002). Οζ ιζηνέξ ηοηηανμπθαζιαηζηέξ μονέξ ηςκ α ηαζ α οπμιμκάδςκ δεκ έπμοκ ηαηαθοηζηή θεζημονβία. Μάθθμκ ιεηαδίδμοκ ζήιαηα δεζιεφμκηαξ ιζα πμζηζθία πνςηεσκχκ ηεθεζηχκ (effectors) πμο αοηέξ ιε ηδ ζεζνά ημοξ ιπμνεί κα αθθδθεπζδνμφκ είηε άιεζα είηε έιιεζα ιε ημκ ηοηηανμζηεθεηυ αηηίκδξ. Οζ αθθδθεπζδνάζεζξ ηςκ ζκηεβηνζκχκ ιε ημκ ηοηηανμζηεθεηυ έπμοκ ιεθεηδεεί εηηεκχξ ζηα πμνδςηά ηαζ θαίκεηαζ κα είκαζ ζδιακηζηά δζαηδνδιέκεξ ζηδ Drosophila. Οζ ηοπζημί ζοκδέηεξ ηςκ ζκηεβηνζκχκ ιε ηα ιζηνμσκίδζα αηηίκδξ υπςξ δ talin, α- αηηζκίκδ, αζκημοθίκδ, παλζθθίκδ ηαζ ηεκζίκδ είκαζ πανμφζεξ ιε έκα ιμκαδζηυ ακηίβναθμ ζηδ Drosophila ηαζ ιε πμθθαπθά ζηα πμνδςηά (Hynes and Zhao 2000). Οζ ζκηεβηνίκεξ ηαζ μζ ηοηηανμπθαζιαηζηέξ πνςηεΐκεξ μνβακχκμκηαζ ζε ιεβαθμιμνζαηά δοκαιζηά πμθοπνςηεσκζηά ζφιπθμηα ηαζ ζπδιαηίγμοκ ηζξ εέζεζξ εζηζαηήξ πνμζηυθθδζδξ (focal adhesions). Ζ πνμζηυθθδζδ ιέζς ηςκ ζκηεβηνζκχκ είκαζ απαναίηδηδ βζα ηδκ ακάπηολδ ηςκ ιοχκ ζηδ Drosophila ηαζ ζημ C. elegans (Wright 1960; Brown 2000). Δπίζδξ, δ 16

28 πνμζημθθδηζηή θεζημονβία ηςκ ζκηεβηνζκχκ είκαζ απαναίηδηδ ηαηά ηδ δζάνηεζα ηδξ ιμνθμβέκεζδξ ηδξ επζδενιίδαξ ζημ θηενυ (Wilcox, DiAntonio et al. 1989). Σμ εκήθζημ θηενυ ηδξ Drosophila πνμηφπηεζ απυ δομ κοιθζηά ιμκυζηζαα επζεήθζα ηοηηάνςκ ηαηά ημ κοιθζηυ ζηάδζμ, ηα μπμία ζοβηναημφκηαζ ιαγί ιέζς εκυξ θεπημφ ελςηοηηάνζμο ζηνχιαημξ ζηζξ ααζζηέξ ημοξ πθεονέξ. Οζ ζκηεβηνίκεξ απαζημφκηαζ βζα κα δζαηδνδεμφκ αοηά ηα ζηνχιαηα εκςιέκα ηαζ απχθεζα ηςκ ζκηεβηνζκχκ ηαηαθήβεζ ζηδ δδιζμονβία θμφζηαξ ζηα θηενά (Wilcox, DiAntonio et al. 1989; Zusman, Patel- King et al. 1990), (Brower and Jaffe 1989). Πανυιμζα, πεζνάιαηα ζζημεζδζηήξ απμζζχπδζδξ ζε πμκηίηζα ηαζ μ παναηηδνζζιυξ ηάπμζςκ ηθδνμκμιμφιεκςκ δενιαηζηχκ ακςιαθζχκ ζημοξ ακενχπμοξ ένζλακ θςξ ζηδ ζδιακηζηυηδηα ηαζ ζημοξ πμθθαπθμφξ νυθμοξ ηςκ ζκηεβηνζκχκ ζηδκ επζδενιίδα. Ζ επζδενιίδα ηςκ εδθαζηζηχκ είκαζ έκα επζεήθζμ πάκς απυ έκα παπφ ζηνχια ελςηοηηάνζμο οθζημφ, απμηεθμφιεκμ απυ ιζα ααζζηή ιειανάκδ πμο ζοκδέεηαζ ιε ηδκ πθμφζζα ζε ημθθαβυκμ ιεζεβποιαηζηή δενιίδα ιέζς ζκζδίςκ. Αζεεκείξ πμο πάζπμοκ απυ πμιθμθοββχδδ επζδενιυθοζδ (epidermolysis bullosa), ιζα παεμθμβζηή ηαηάζηαζδ ζημκ άκενςπμ θυβς εθαηηςιαηζηήξ πνμζηυθθδζδξ ηδξ επζεδθζαηήξ δενιαηζηήξ ζημζαάδαξ ζηδ ααζζηή ιειανάκδ πμο δζαιεζμθααείηαζ ιέζς ηςκ ζκηεβηνζκχκ, πανμοζζάγμοκ θθφηηαζκεξ ζημ δένια θυβς απμηυθθδζδξ ημο βναιιςημφ επζδενιζημφ επζεδθίμο απυ ηδ ααζζηή ιειανάκδ. Άθθεξ παεμθμβζηέξ ηαηαζηάζεζξ πμο μθείθμκηαζ ζε ιδ θεζημονβζηέξ ζκηεβηνίκεξ είκαζ δ ιοσηή δοζηνμθία ηαζ αζεέκεζα ηςκ ηζκδηζηχκ κεονχκςκ (Pulkkinen and Uitto 1999; McGrath and Eady 2001). ημ πμκηίηζ, ιεηαθθάλεζξ ζηα ζοζηαηζηά ηςκ διζδεζιμζςιάηςκ, ιζα ελεζδζηεοιέκδ ζφκδεζδ ζκηεβηνζκχκ, ηαηαθήβεζ επίζδξ ζε δδιζμονβία θμοζηάθαξ ζημ δένια (Borradori and Sonnenberg 1999). Ακ ηαζ πανυιμζεξ θεζημονβίεξ ηςκ ζκηεβηνζκχκ έπμοκ πενζβναθεί ζημ C.elegans, ηδ Drosophila, ηα πμκηίηζα ηαζ ημκ άκενςπμ (Arcangelis 2000; Bokel and Brown 2002), άθθεξ δνάζεζξ ηςκ ζκηεβηνζκχκ δζαθένμοκ πενζζζυηενμ ακάιεζα ζηα ιμκηέθα μνβακζζιμφξ. ii. πγθξφηεζε ηνπ εμσθπηηάξηνπ πιηθνχ Σμ ελςηοηηάνζμ οθζηυ απμηεθείηαζ απυ έκα ιείβια βθοημπνςηεσκχκ πμο ζπδιαηίγμοκ έκα δίηηομ ζημ ελςηοηηάνζμ πχνμ ιεηαλφ ηςκ ηοηηανζηχκ ζηνςιάηςκ. Σα ζοζηαηζηά ημο ελςηοηηάνζμο οθζημφ είκαζ ορδθά ζοκηδνδιέκα ηαηά ηδ δζάνηεζα ηδξ ελέθζλδξ (Hynes and Zhao 2000). Σα ααζζηά ζοζηαηζηά είκαζ δ θαιζκίκδ, 17

29 ημθθαβυκμ ηφπμξ ΗV, κζδμβυκμ/εκηαηηίκδ, ηαζ πνμηεμβθοηάκεξ ηφπμο πενθεηάκδξ. Ζ θαιζκίκδ είκαζ έκα ηνζιενέξ πμο απμηεθείηαζ απυ 3 οπμιμκάδεξ, ιζα α, ιζα α ηαζ ιζα β. Σμ βμκζδίςια ηδξ Drosophila πενζέπεζ 2 α, 1 α ηαζ 1 β οπμιμκάδεξ, μζ μπμίεξ ζπεηίγμκηαζ ιε ηζξ θαιζκίκεξ ηςκ πμνδςηχκ ηαζ ημο C. elegans. ηδ Drosophila ηαζ ημ C. elegans οπάνπεζ έκα γεφβμξ βμκζδίςκ πμο ηςδζημπμζμφκ βζα ημ ημθθαβυκμ ηφπμο ΗV ηαζ ζηα εδθαζηζηά οπάνπμοκ ηνία ηέημζα γεφβδ βμκζδίςκ. Συζμ ημ κζδμβυκμ/εκηαηηίκδ υζμ ηαζ δ πνςηεμβθοηάκδ πενθαηάκδ έπμοκ μιυθμβα ζημ C. elegans, ηδ Drosophila ηαζ ηα πμνδςηά. Σα ζοζηαηζηά ημο ελςηοηηάνζμο οθζημφ μνβακχκμκηαζ ζε δζάθμνεξ δμιέξ ιέζς αθθδθεπζδνάζεςκ ιε επζθακεζαημφξ ηοηηανζημφξ οπμδμπείξ. Αοηέξ μζ δμιέξ ηοιαίκμκηαζ απυ ηζξ ααζζηέξ ιειανάκεξ πμο ζπδιαηίγμκηαζ απυ άιμνθμ ελςηοηηάνζμ οθζηυ οπμβναιιίγμκηαξ ηα επζεδθζαηά ηφηηανα ζε πενζζζυηενμ ελεζδζηεοιέκα ζηνζχιαηα υπςξ μζ ηέκμκηεξ. Οζ ηέκμκηεξ απμηεθμφκηαζ απυ ίκεξ ημθθαβυκμο μνβακςιέκα ζε πανάθθδθδ δζεοεέηδζδ ζπδιαηίγμκηαξ δμιέξ πμο ζοκδέμοκ ημοξ ιφεξ ζημ μζηυ (Adams and Watt 1993). Σμ ελςηοηηάνζμ οθζηυ δεκ είκαζ ιζα παεδηζηή δμιή, ηαεχξ ιπμνεί κα απμηεθέζεζ ιζα ζδιακηζηή πδβή ζδιάηςκ πμο πνμάβμοκ ημκ πμθθαπθαζζαζιυ ηαζ ηδ δζαθμνμπμίδζδ. Γζα ημ θυβμ αοηυ, μ ζςζηυξ ζοκημκζζιυξ ηδξ μνβάκςζδξ ηαζ ηδξ δνάζδξ ημο ελςηοηηάνζμο οθζημφ έπεζ ααεζέξ επζπηχζεζξ ζηδ θεζημονβία ημο ηαζ ηδκ επαηυθμοεδ ζοιπενζθμνά ηςκ ηοηηάνςκ πμο επζηάεμκηαζ πάκς ζε αοηυ ή ανίζημκηαζ ιέζα ζε αοηυ. Καηά ηδκ ακάπηολδ, δ μνβάκςζδ ηςκ ζζηχκ ζοκδέεηαζ ιε ηδ ζοβηνυηδζδ ημο ελςηοηηάνζμο οθζημφ. διακηζηυ είκαζ υηζ ζηδ ζοβηνυηδζδ ημο ελςηοηηάνζμο οθζημφ ειπθέημκηαζ μζ ζκηεβηνίκεξ (Schwarzbauer and Sechler 1999). iii. Δδξαίσζε ηεο αθξαην-βαζηθήο θπηηαξηθήο πνιηθφηεηαο Οζ ζκηεβηνίκεξ ειπθέημκηαζ ζηδκ εδναίςζδ ηδξ ηοηηανζηήξ πμθζηυηδηαξ ηαηά ημκ αηναζμ-ααζζηυ άλμκα ζε πμθθμφξ ηοηηανζημφξ ηφπμοξ ηαζ ζζημφξ ηςκ ζπμκδοθςηχκ (Giancotti and Ruoslahti 1999). Πεζνάιαηα ζε ηφηηανα εδθαζηζηχκ έδεζλακ υηζ μζ ζκηεβηνίκεξ είκαζ απαναίηδηεξ ηυζμ βζα ηδκ αηναζμ-ααζζηή πμθζηυηδηα (Juliano 1996). In vivo ηαζ in vitro ιεθέηεξ έδεζλακ υηζ μζ ζκηεβηνίκεξ έπμοκ ζδιακηζηυ νυθμ ζηδκ ανπζηεηημκζηή ηαζ ηδκ πμθζηυηδηα ημο επζεδθίμο ημο πκεφιμκα (Sheppard 2003; Zegers, O'Brien et al. 2003). Χζηυζμ, ακηίζημζπεξ θεζημονβίεξ δεκ έπμοκ δεζπεεί βζα ηζξ ζκηεβηνίκεξ ζηδ Drosophila ηαζ ημ C.elegans. ε έιανοα Drosophila, μζ ζκηεβηνίκεξ δεκ είκαζ απαναίηδηεξ βζα ηδκ εδναίςζδ ηδξ ηοηηανζηήξ 18

30 πμθζηυηδηαξ, μφηε βζα ηδ δζαηήνδζή ηδξ. Μεθέηεξ ζημ ζάημ ημο επζεδθζαημφ ακαπηολζαημφ δίζημο ημο θηενμφ (wing pouch) ηαζ ζημ επζεήθζμ ημο ιέζμο εκηένμο (midgut) δεκ απαζημφκηαζ μφηε βζα ηδκ μνβάκςζδ ηςκ επζεδθζαηχκ ηοηηάνςκ ημο δίζημο μφηε βζα ηδκ ανπζηή αηναζμ-ααζζηή πμθζηυηδηα ηςκ εκδμδενιζηχκ ηοηηάνςκ ημο εκηένμο (Brower, Bunch et al. 1995; Brown, Gregory et al. 2000) Σμ ΗΡΡ πνςηεσκζηυ ζφιπθμημ (IPP complex): (ILK-PINCH-PARVIN) Γεκεηζηή απαθμζθή ημο ορδθά ζοκηδνδιέκμο βμκζδίμο ηδξ α1 ζκηεβηνίκδξ απυ δζάθμνμοξ μνβακζζιμφξ μδήβδζε ζε θαζκμηοπζηέξ ακςιαθίεξ πμο ζπεηίγμκηαζ ιε ηδκ πνμζηυθθδζδ, ημκ πμθθαπθαζζαζιυ, ηδκ επζαίςζδ ηαζ ηδκ πμθζηυηδηα ηςκ ηοηηάνςκ. Δλαζνεηζηά πανυιμζμζ θαζκυηοπμζ παναηδνήεδηακ ηαζ ηαηά ηδ βεκεηζηή απεκενβμπμίδζδ βμκζδίςκ πνςηεσκχκ εζηζαηήξ πνμζηυθθδζδξ, βεβμκυξ πμο οπμδδθχκεζ υηζ αοηέξ μζ πνςηεΐκεξ δζαδναιαηίγμοκ ημιαζημφξ νυθμοξ ζημκ έθεβπμ ηδξ θεζημονβίαξ ηςκ ζκηεβηνζκχκ. Απυ ηζξ παναπάκς ιεθέηεξ πνμέηορακ πάνα πμθθέξ πνςηεΐκεξ ςξ ζδιακηζημί νοειζζηέξ ηςκ θεζημονβζχκ πμο δζαιεζμθααμφκηαζ ιέζς ηςκ ζκηεβηνζκχκ. Ακάιεζα ημοξ οπάνπμοκ ηαζ ηνεζξ πνςηεΐκεξ πμο εεςνείηαζ, ιέζα απυ ιία πθδεχνα ιεθεηχκ, υηζ απμηεθμφκ ημκ πονήκα ημο ηοηηανμπθαζιαηζημφ πνςηεσκζημφ ζοιπθυημο πμο ζπδιαηίγεηαζ βφνς απυ ηδκ ηοηηανμπθαζιαηζηή πθεονά ηςκ ζκηεβηνζκχκ. Οζ πνςηεΐκεξ αοηέξ είκαζ δ ζκηεβηνζκμ-ζοκδευιεκδ ηζκάζδ (ILK), δ PINCH ηαζ δ parvin. Έπεζ δεζπεεί, υηζ δ ILK δεζιεφεηαζ ηαζ ιε ηα δφμ άθθα ιέθδ ημο ηνζιενμφξ ζοιπθυημο. Οζ ηνεζξ αοηέξ πνςηεΐκεξ ζε ηοηηανζηά πεζναιαηζηά ιμκηέθα δζαιενζζιαημπμζμφκηαζ ηαζ θεζημονβμφκ ςξ ηνζιενέξ ζφιπθμημ, ημ μπμίμ βζα θυβμοξ ζοκημιίαξ εα ακαθένεηαζ ζημ ελήξ ςξ IPP, απυ ηα ανπζηά ηςκ ιεθχκ πμο ημ απανηίγμοκ. Μεθέηεξ πμο πναβιαημπμζήεδηακ ακαθμνζηά ιε ηδ δοκαηυηδηα ζπδιαηζζιμφ ημο ζοιπθυημο ΗΡΡ ζε ηφηηανα έδεζλακ, υηζ ημ ηνζιενέξ ζφιπθμημ ιπμνεί κα ζπδιαηζζηεί ζημ ηοηηανυπθαζια ακελάνηδηα απυ ζζκζάθα πνμζηυθθδζδξ (Zhang, Chen et al. 2002). Δπζπθέμκ δζαπζζηχεδηε, υηζ δ ζηαεενυηδηα ηδξ ηάεε ιζαξ πνςηεΐκδξ ελανηάηαζ απυ ημκ ζπδιαηζζιυ ημο ζοιπθυημο. H ζζχπδζδ ηδξ βμκζδζαηήξ έηθναζδξ πςνζζηά ηάεε εκυξ ιέθμοξ ημο IPP, μδήβδζε ζηδκ απμζημδυιδζδ ηαζ ηςκ άθθςκ ιεθχκ (Fukuda, Chen et al. 2003). Σέθμξ δζαπζζηχεδηε, υηζ μ ζπδιαηζζιυξ ημο ζοιπθυημο ΗΡΡ είκαζ απαναίηδημξ βζα ημκ εκημπζζιυ ημο ζηζξ εέζεζξ εζηζαηήξ πνμζηυθθδζδξ. 19

31 Ζ θεζημονβία ημο ζοιπθυημο ΗΡΡ έπεζ ιεθεηδεεί ζε δζάθμνμοξ ηοηηανζημφξ ηφπμοξ ηαζ ζπεηίγεηαζ ιε δζαδζηαζίεξ πμο αθμνμφκ ηονίςξ ζηδκ πνμζηυθθδζδ ημο ηοηηάνμο, π.π. νοειίγεζ ηδκ πνμζηυθθδζδ, επέηηαζδ ηαζ επζαίςζδ πμδμηοηηάνςκ (Yang, Guo et al. 2005). Δπίζδξ έπεζ δεζπεεί υηζ ημ ζφιπθμημ αοηυ παίγεζ νυθμ ζηδ ιεηάδμζδ ζδιάηςκ πμο δζαιεζμθααμφκηαζ ιέζς ηςκ ζκηεβηνζκχκ ηαζ εθέβπμοκ ηδκ οπενηνμθία ημο ηανδζαημφ ιομηοηηάνμο ηαζ ηδκ ακεεηηζηυηδηα ημο ζηδκ απυπηςζδ (Chen, Huang et al. 2005). ε μνβακζζιμφξ υπςξ δ D.melanogaster ηαζ μ C.elegans θαίκεηαζ κα οπάνπεζ ιζα ζενανπία ζηδ δζαιενζζιαημπμίδζδ ηςκ πνςηεσκχκ ηαζ ημ IPP δε ιεηαθένεηαζ ςξ ηνζιενέξ ζφιπθμημ απυ ημ ηοηηανυπθαζια ζηζξ εέζεζξ ζοζζχνεοζδξ ηςκ ζκηεβηνζκχκ. Ζ πανμοζία ηςκ ζκηεβηνζκχκ είκαζ απαναίηδηδ βζα ημκ εκημπζζιυ ηςκ πενζζζυηενςκ ηοηηανμπθαζιαηζηχκ πνςηεσκχκ ζηζξ ιομηεκμκηζηέξ ζοκδέζεζξ ημο ακαπηοζζυιεκμο ειανφμο. Ακάθμβα εονήιαηα δζαπζζηχεδηακ ηαζ βζα ηζξ πνςηεΐκεξ ημο ζοιπθυημο ΗΡΡ (Zervas, Psarra et al. 2011). Γζα ημκ εκημπζζιυ ηδξ ILK ζηζξ ΜΣ απαζημφκηαζ μζ ζκηεβηνίκεξ. Ζ ILK δζαιενζζιαημπμζείηαζ θοζζμθμβζηά ζηζξ εέζεζξ ζφκδεζδξ ηςκ ιοσηχκ ηοηηάνςκ, υηακ απμοζζάγεζ δ PINCH ή δ parvin απυ έιανοα Drosophila ηαζ ημ ίδζμ ηαζ ζημ C.elegans (Zervas, Psarra et al. 2011);Vakaloglou, Chountala et Zervas, αδδιμζίεοηα απμηεθέζιαηα). Όηακ απμοζζάγεζ υιςξ δ ILK, μζ άθθεξ δομ πνςηεΐκεξ δεκ ιπμνμφκ κα δζαιενζζιαημπμζδεμφκ, βεβμκυξ ημ μπμίμ δδθχκεζ, υηζ δ ILK πνμδβείηαζ ζηδ δζαιενζζιαημπμίδζδ ηαζ είκαζ απαναίηδηδ βζα κα ζοβηεκηνςεμφκ ηαζ μζ άθθεξ δφμ (Zervas, Psarra et al. 2011);Vakaloglou, Chountala et Zervas, αδδιμζίεοηα απμηεθέζιαηα) Ιληεγθξηλνζπλδεφκελε θηλάζε (ILK) i. Γνκή ηεο ILK Οζ ηοηηανμπθαζιαηζηέξ ιμκάδεξ ηςκ ζκηεβηνζκχκ είκαζ ζπεηζηά ιζηνέξ ηαζ δεκ δζαεέημοκ εκγοιζηή δναζηζηυηδηα. Αοηυ έπεζ ςξ απμηέθεζια δ ιεηάδμζδ ζδιάηςκ κα βίκεηαζ ιε ηδ αμήεεζα ιζαξ ιεβάθδξ μιάδαξ πνςηεσκχκ πμο μκμιάγμκηαζ πνςηεΐκεξ ζοκδέηεξ (adaptor proteins) ηαζ αθθδθεπζδνμφκ ιε ηζξ ηοηηανμπθαζιαηζηέξ μονέξ ηςκ ζκηεβηνζκχκ. Ζ ILK ακαηαθφθεδηε ημ 1996 ζε ζάνςζδ ιε ημ ζφζηδια ημο δζπθμφ οανζδίμο ηδξ γφιδξ (yeast two hybrid screen) ςξ ιζα κέα πνςηεΐκδ πμο αθθδθεπζδνά ιε ηδκ ηοηηανμπθαζιαηζηή μονά ηδξ α1 ζκηεβηνίκδξ (Hannigan, Leung-Hagesteijn et al. 20

32 1996) εκχ πθέμκ βκςνίγμοιε υηζ αθθδθεπζδνά ηαζ ιε ηδκ α3 ζκηεβηνίκδ. Δίκαζ ιζα εονέςξ εηθναγυιεκδ ηζκάζδ ζενίκδξ/ενεμκίκδξ πμο απμηεθείηαζ απυ 453 αιζκμλέα. Γμιζηά δζαηνίκεηαζ ζε ηνία ιένδ: Α) Σδκ αιζκμηεθζηή πενζμπή υπμο οπάνπμοκ πέκηε επακαθήρεζξ μιυθμβεξ ιε ηδκ αβηονίκδ (ankyrin repeats) (Chiswell, Zhang et al. 2008). Οζ επακαθήρεζξ αβηονίκδξ είκαζ ζοκηδνδιέκα ιμηίαα πμο απμηεθμφκηαζ απυ 33 αιζκμλέα ηαζ δζαιεζμθααμφκ ζε πνςηεσκζηέξ αθθδθεπζδνάζεζξ. Μέζς ηςκ επακαθήρεςκ αβηονίκδξ, δ ILK αθθδθεπζδνά ιε ηδκ PINCH ηαζ ηδκ ILK-ζπεηζγυιεκδ πνςηεΐκδ (ILKAP). Ζ δδιζμονβία ημο ζοιπθυημο ILK-PINCH είκαζ απαναίηδηδ βζα ηδ ζηαεενμπμίδζδ ηαζ ηδκ επζαίςζδ ηςκ δφμ πνςηεσκχκ ζημ ηοηηανυπθαζια εκχ δ ILKAP είκαζ ιζα θςζθαηάζδ πμο ακαζηέθθεζ ηδ δνάζδ ηδξ ILK (Li, Zhang et al. 1999; Leung- Hagesteijn, Mahendra et al. 2001). B) Μία επζηνάηεζα μιυθμβδ ιε επζηνάηεζα ηδξ πθεληνίκδξ (pleckstrin homology, (PH)-like domain), ζημ ιεζαίμ ηιήια ημο ιμνίμο ηδξ ILK. Ζ PH-like πενζμπή είκαζ πμθφ ημζκή ζε πνςηεΐκεξ πμο ζπεηίγμκηαζ ιε ηδκ εκδμηοηηάνζα ζδιαημδυηδζδ ή ημκ ηοηηανμζηεθεηυ (Delcommenne, Tan et al. 1998). Μέζς ηδξ πενζμπήξ αοηήξ, δ ILK αθθδθεπζδνά ιε ηδκ 3,4,5 ηνζθςζθμνζηή θςζθαηίδοθμ-ζκμζζηυθδ (PIP3). Ζ αθθδθεπίδναζδ αοηή εκενβμπμζεί ηδ δναζηζηυηδηα ηζκάζδξ ηδξ ILK (Delcommenne, Tan et al. 1998). Γ) Σδκ ηαναμλο-ηεθζηή πενζμπή πμο έπεζ αιθζζαδημφιεκδ ηαηαθοηζηή εκενβυηδηα, ηδκ ζηακυηδηα αθθδθεπίδναζδξ ιε ηζξ ζκηεβηνίκεξ αθθά ηαζ ηδ δοκαηυηδηα αθθδθεπίδναζδξ ιε άθθεξ πνςηεΐκεξ ιεηαλφ ηςκ μπμίςκ δ paxillin ηαζ μζ parvins (α, α, β parvin). Ζ δδιζμονβία ημο ηνζιενμφξ ζοιπθυημο (ΗΡΡ complex) είκαζ απαναίηδηδ χζηε μζ ηνεζξ πνςηεΐκεξ κα επζηεθέζμοκ ηζξ ηοηηανζηέξ ημοξ θεζημονβίεξ (Δηθ.3). 21

33 Δηθόλα 3: Γνκή θαη αιιειεπηδξάζεηο ηεο ILK. Η ILK ζρεκαηίδεη ζύκπινθα κε πξσηεΐλεο πνπ είηε ζπλδένληαη κε ηνλ θπηηαξνζθειεηό είηε ζπκκεηέρνπλ ζηε κεηαγσγή ζήκαηνο. Ζ αιζκμηεθζηή πενζμπή αθθδθεπζδνά ιε δζάθμνεξ πνςηεΐκεξ ιεηαλφ ηςκ μπμίςκ δ ILKAP ηαζ δ PINCH δ μπμία ζοκδέεηαζ ηαζ ιε ημοξ οπμδμπείξ ηζκαζχκ ηονμζίκδξ (receptor tyrosine kinase). Σμ ηαναμλοηεθζηυ άηνμ δζαεέηεζ εκγοιζηή δναζηζηυηδηα ηαζ θςζθμνοθζχκεζ οπμζηνχιαηα υπςξ δ Akt ηαζ δ GSK3α εκχ πανάθθδθα αθθδθεπζδνά ιε ηδ α ζκηεβηνίκδ ηαζ δζάθμνεξ πνςηεΐκεξ ιεηαλφ ηςκ μπμίςκ δ α ηαζ α parvins ηαζ δ παλζθθίκδ. Οζ parvins ηαζ δ παλζθίκδ ζοκδέμοκ ημ ζφιπθμημ, άιεζα ή έιιεζα, ιε ημκ ηοηηανμζηεθεηυ αηηίκδξ. Σμ ηεκηνζηυ ηιήια δζαεέηεζ έκα PH-like ιμηίαμ ιέζς ημο μπμίμο αθθδθεπζδνά ιε ηδκ PIP3. ILKAP: ILK associated protein, ANK: ankyrin repeat, PH: pleckstrin homology, PIP3: phosphatidylinositol (3,4,5)-triphosphate (Hannigan, Troussard et al. 2005) ii. Λεηηνπξγία ηεο ILK Όπςξ πνμακαθένεδηε, δ ILK ζπδιαηίγεζ πνςηεσκζηά ζφιπθμηα θεζημονβχκηαξ ςξ πνςηεΐκδ ζοκδέηδξ (adaptor protein). Μέζς ηδξ αθθδθεπίδναζδξ ηδξ ILK ιε ηζξ ηοηηανμπθαζιαηζηέξ μονέξ ηδξ α1 ηαζ α3 ζκηεβηνίκδξ, ηα ζφιπθμηα αοηά ζοκδέμοκ άιεζα ή έιιεζα ημκ ηοηηανμζηεθεηυ αηηίκδξ ιε ηζξ ζκηεβηνίκεξ ηαζ επμιέκςξ ιε ημ ελςηοηηάνζμ ζηνχια. Καηά ζοκέπεζα, ιέζς ηδξ ΗLK ελοπδνεημφκηαζ δζάθμνεξ θεζημονβίεξ υπςξ δ ηίκδζδ, δ ακημπή ζηζξ ιδπακζηέξ πζέζεζξ ηαζ δ δζαηήνδζδ ημο ηοηηανζημφ ζπήιαημξ. iii. Δίλαη ε ILK ιεηηνπξγηθή θηλάζε; Ο νυθμξ ηδξ ILK ςξ ηζκάζδξ δεκ είκαζ ηαεμθζηά απμδεηηυξ. Αοηυ μθείθεηαζ ζημ υηζ πανυθμ πμο δ αθθδθμοπία ηδξ ηαηαθοηζηήξ ηδξ πενζμπήξ έπεζ ιεβάθμ ααειυ 22

34 μιμζυηδηαξ ιε αοηή ηςκ ηζκαζχκ, δεκ δζαεέηεζ δφμ ζοκηδνδιέκα ιμηίαα πμο είκαζ οπεφεοκα βζα ηδκ ηαηαθοηζηή δνάζδ ηςκ ηζκαζχκ (Hannigan, Troussard et al. 2005). Σα ηνίζζια αιζκμλέα ηα μπμία απανηίγμοκ ημ εκενβυ ηέκηνμ ημο εκγφιμο, ηαεχξ ηαζ ηδκ πενζμπή πνυζδεζδξ ημο ATP απμοζζάγμοκ. Βζμπδιζηέξ ηονίςξ, ιεθέηεξ μζ μπμίεξ ζηδνίπηδηακ ηονίςξ ζηδκ απμιυκςζδ ηδξ ILK ιε ακμζμηαηαηνήικζζδ απυ ηοηηανζηά εηποθίζιαηα έδεζλακ υηζ δ ILK ιπμνεί κα θςζθμνοθζχκεζ ιζα ζεζνά απυ ζδιαημδμηζηέξ πνςηεΐκεξ (Legate, Montanez et al. 2006). Σα ααζζηυηενα οπμζηνχιαηα ηδξ ILK είκαζ δ πνςηεσκζηή ηζκάζδ Β (protein kinase B, PKB ή Akt) ηαζ δ ηζκάζδ ηδξ ζοκεάζδξ ημο βθοημβυκμο- 3α (GSK3α) (Delcommenne, Tan et al. 1998; Persad, Attwell et al. 2001). φιθςκα ιε ηζξ ενβαζίεξ αοηέξ, δ ILK θςζθμνοθζχκεζ ηδκ Akt ζηδ ζενίκδ 473 εκενβμπμζχκηαξ ηδκ εκχ θςζθμνοθζχκεζ ηαζ ηδκ GSK3α απεκενβμπμζχκηαξ ηδκ. Ζ ειπθμηή ηδξ ILK ζηδ νφειζζδ ηδξ δναζηζηυηδηαξ δφμ ηυζμ ζδιακηζηχκ εκγφιςκ βζα ημ ηφηηανμ ζδιαίκεζ υηζ, έζης ηαζ έιιεζα, δ ILK ειπθέηεηαζ ζηδ νφειζζδ πμθθχκ ζδιαημδμηζηχκ ιμκμπαηζχκ ηαζ θεζημονβζχκ. οβηεηνζιέκα, δ εκενβμπμίδζδ ηδξ Akt μδδβεί ζηδκ εκενβμπμίδζδ ακηζ-απμπηςηζηχκ ιμκμπαηζχκ αθθά ηαζ ζηδκ επαβςβή ηδξ αββεζμβέκεζδξ. Ζ απεκενβμπμίδζδ ηδξ GSK3α μδδβεί ζηδ ζοζζχνεοζδ ηδξ α- ηαηεκίκδξ ζημ ηοηηανυπθαζια ηαζ ηαηυπζκ ζηδ ιεηαηίκδζδ ηδξ ζημκ πονήκα υπμο ζπδιαηίγμκηαξ ζφιπθμημ ιε ημοξ ιεηαβναθζημφξ πανάβμκηεξ LEF-1/TCF επάβεζ ηδ ιεηαβναθή βμκζδίςκ πμο ζπεηίγμκηαζ ιε ημκ πμθθαπθαζζαζιυ ηαζ ηδκ ηοηηανζηή ιεηακάζηεοζδ (Novak, Hsu et al. 1998; Manning, Plowman et al. 2002; Grashoff, Thievessen et al. 2004). Θα πνέπεζ επίζδξ κα ζδιεζςεεί υηζ οπάνπμοκ δζάθμνα παναδείβιαηα ιδ ηοπζηχκ ηζκαζχκ πμο απμδεδεζβιέκα έπμοκ ηδκ ζηακυηδηα κα θςζθμνοθζχκμοκ οπμζηνχιαηα (Manning, Plowman et al. 2002). Χζηυζμ, in vivo ιεθέηεξ απέδεζλακ υηζ δ ILK δνα ςξ πνςηεΐκδ ζοκδέηδξ πανά ςξ ηζκάζδ ηυζμ ζηδ Drosophila, (Zervas, Gregory et al. 2001) υζμ ηαζ ζημκ C. elegans, (Mackinnon, Qadota et al. 2002). Πνυζθαηεξ ιεθέηεξ βζα ηδκ ILK ζημ πμκηίηζ επζαεααζχκμοκ υηζ δ δνάζδ ηδξ ILK ςξ ηζκάζδ δεκ θαίκεηαζ κα είκαζ απαναίηδηδ βζα ηδκ ειανοσηή ακάπηολδ ημο πμκηζημφ (Lange, Wickstrom et al. 2009). Οζ ιεθέηεξ αοηέξ ααζίζηδηακ ζηδκ οπμηαηάζηαζδ ηςκ δφμ ιμκαδζηχκ ζοκηδνδιέκςκ αιζκμλέςκ K219, E356 πμο ανίζημκηαζ ζηδ εέζδ πνυζδεζδξ ημο ATP ηαζ ζηδ πενζμπή ακαβκχνζζδξ ημο οπμζηνχιαημξ ακηίζημζπα. Αλίγεζ κα ακαθενεεί υηζ δ επζθμβή ηςκ δφμ ζοβηεηνζιέκςκ αιζκμλέςκ ζηδνίπηδηε ζε ιζα ζεζνά πανυιμζςκ ιεθεηχκ βζα άθθεξ ηζκάζεξ. Οζ ιεηαθθαβιέκεξ ιμνθέξ ηδξ ILK βζα Κ219Μ ηαζ 23

35 Δ356Κ ήηακ ζηακέξ κα οπμηαηαζηήζμοκ πθήνςξ ηδκ εκδμβεκή δνάζδ ημο βμκζδίμο. Χζηυζμ, ζδιεζαηέξ ιεηαθθάλεζξ ζηδκ επζηνάηεζα ηζκάζδξ ηδξ ΗLK, επδνεάγμοκ ηαοηυπνμκα ηζξ πνςηεΐκζηέξ αθθδθεπζδνάζεζξ ηδξ ILK ηαεχξ ηαζ ηδκ ζηακυηδηά ηδξ κα εκημπίγεηαζ ζηζξ εέζεζξ εζηζαηήξ πνμζηυθθδζδξ. Γζα πανάδεζβια δ ζδιεζαηή ιεηαθθαβή Κ220Α απμηνέπεζ ηδκ πνυζδεζδ ηδξ α-parvin ζηδκ ILK (Filipenko, Attwell et al. 2005). οβηνζηζηή ακάθοζδ ηδξ πνςηεΐκζηήξ αθθδθμοπίαξ ηδξ ILK ηαζ ηςκ εοηανοςηζηχκ ηζκαζχκ ζενίκδξ/ενεμκίκδξ έδεζλε υηζ δ ΗLK δεκ πενζέπεζ ζηδκ αθθδθμοπία ηδξ ζδιακηζηά αιζκμλέα, ορδθά δζαηδνδιέκα, βζα ηδκ ηαηαθοηζηή δνάζδ αοηήξ ηδξ μιάδαξ ηςκ πνςηεσκχκ. Ακ ηαζ δ ILK θένεζ ημ αιζκμλζηυ ηαηάθμζπμ ηδξ θοζίκδξ ζηδκ οπμ-επζηνάηεζα (subdomain) ΗΗ, ημ μπμίμ είκαζ απαναίηδημ βζα ηδ ιεηαθμνά ηδξ θςζθμνζηήξ μιάδαξ ηαζ ημ Α/SPE ιμηίαμ ζηδ οπμ-επζηνάηεζα VΗΗΗ πμο ειπθέηεηαζ ζηδκ ακαβκχνζζδ ημο οπμζηνχιαημξ, δ GxGxxG αθθδθμοπία ζηδκ οπμεπζηνάηεζα Η ηδξ ηζκάζδξ δ μπμία είκαζ απαναίηδηδ βζα ηδκ ηάθορδ ηςκ ιδ ιεηαθενυιεκςκ θςζθμνζηχκ μιάδςκ ημο ΑΣΡ δεκ είκαζ δζαηδνδιέκδ ζηδκ ILK ζηα δζάθμνα είδδ. Δπίζδξ δ ILK δεκ έπεζ ηδκ ηαηαθοηζηή ααζζηή μιάδα ζηδκ οπμεπζηνάηεζα VIb, δ μπμία δέπεηαζ ημ πνςηυκζμ απυ ηδκ οδνμλοθ-μιάδα ημο οπμζηνχιαημξ ηαηά ηδ ιεηαθμνά ηδξ θςζθςνζηήξ μιάδαξ, υπςξ ηαζ ημ DGF ιμηίαμ ζηδκ οπμ-επζηνάηεζα VII, ημ μπμίμ απαζηείηαζ βζα κα εοεοβναιιζζηεί δ β-θςζθμνζηή μιάδα ημο ΑΣΡ. Μζα ζοκηδνδιέκδ θοζίκδ, δ μπμία ελμοδεηενχκεζ ημ θμνηίμ ηδξ β- θςζθμνζηή μιάδα ημο ΑΣΡ, ηαζ ιζα επίζδξ ζοκηδνδιέκδ αζπαναβίκδ, πμο δνα ςξ πδθζηυξ πανάβμκηαξ ζηα ζυκηα ιαβκδζίμο, ηαζ μζ δομ ζηδκ οπμ-επζηνάηεζα VIb απμοζζάγμοκ απυ ηδκ αιζκμλζηή αθθδθμοπία ηδξ ILK ζηα δζάθμνα είδδ (Δηθ.4) (Boudeau, Miranda-Saavedra et al. 2006). Δηθόλα 4: Η νκόινγε-θηλάζεο επηθξάηεηα ηεο ΙLK δελ πεξηέρεη ζεκαληηθά ακηλνμέα πνπ είλαη παξόληα ζηηο θηλάζεο ζεξίλεο/ζξενλίλεο ησλ επθαξπσηηθώλ. ηνίρηζε πςειά ζπληεξεκέλσλ ακηλνμέσλ κέζα ζε 12 ππν-επηθξάηεηεο ησλ επθαξπσηηθώλ θηλαζώλ κε ηελ ILK ηεο Drosophila θαη ηνπ πνληηθνύ (Hanks, Quinn et al. 1988), ηνμπμπμζδιέκδ απυ (Wickstrom, Lange et al.) 24

36 Σέθμξ, δ ηνοζηαθθμβναθζηή ακάθοζδ ηδξ δμιήξ ηδξ πενζμπήξ ηζκάζδξ ηδξ ILK, υηακ είκαζ δεζιεοιέκδ ιε ηδκ CH2 πενζμπή ηδξ α-parvin απέδεζλε υηζ δ ILK δε δζαεέηεζ ηαηαθοηζηή εκενβυηδηα, ηαηαηάζζμκηαξ ηδκ μνζζηζηά ζηζξ ρεοδμηζκάζεξ (Boudeau, Miranda-Saavedra et al. 2006; Fukuda, Gupta et al. 2009). iv. Η ILK ζηε Drosophila Απμοζία ηδξ ILK ζηδ D.melanogaster έπεζ ςξ απμηέθεζια ηδκ απμηυθθδζδ ηςκ ιοσηχκ ηοηηάνςκ ζηα ηεθεοηαία ακαπηολζαηά ζηάδζα ηδξ ειανομβέκεζδξ ιε επαηυθμοεμ ημ έιανομ κα αδοκαηεί κα εηημθαθεεί ηαζ κα πεεαίκεζ (Zervas, Gregory et al. 2001). Λεπημιενέζηενδ ακάθοζδ ημο ηοηηανζημφ θαζκμηφπμο πμο ειθάκζγακ ηα ιεηαθθαβιέκα έιανοα έδεζλε, υηζ απμοζία ηδξ ILK μ ζφκδεζιμξ αηηίκδξ ηαζ πθαζιαηζηήξ ιειανάκδξ πάκεηαζ ιε απμηέθεζια, θυβς ακάπηολδξ ιδπακζηήξ ηάζδξ ζε αοηυ ημ ακαπηολζαηυ ζηάδζμ, ηυζμ ηοηηανμζηεθεηζηά ζκίδζα ηδξ αηηίκδξ υζμ ηαζ ηιήιαηα πθαζιαηζηήξ ιειανάκδξ κα απμημθθχκηαζ. Ζ παναηήνδζδ αοηή, ζε ζοκδοαζιυ ιε άθθα απμηεθέζιαηα ζημ ενβαζηήνζυ ιαξ, οπμδδθχκμοκ υηζ απχθεζα ηδξ ILK έπεζ ςξ ζοκέπεζα ηδ ιδ θεζημονβζηή πνμζηυθθδζδ ημο ιομηοηηάνμο ζημ ελςηοηηάνζμ οθζηυ ηαηά ηα ηεθεοηαία ειανοσηά ακαπηολζαηά ζηάδζα. Αλίγεζ κα ακαθενεεί υηζ ημ πνμκζηυ ζηάδζμ υπμο εκημπίγεηαζ μ θαζκυηοπμξ ζπεηίγεηαζ άιεζα ιε ηδκ αφλδζδ ηδξ ζοζηαθηυηδηαξ ημο ιοσημφ ζοζηήιαημξ. Πνμηεζιέκμο κα ιεθεηδεμφκ επζπθέμκ θεζημονβίεξ ζηζξ μπμίεξ εκδέπεηαζ κα οπεζζένπεηαζ δ ILK ζε ιεηαβεκέζηενα ακαπηολζαηά ζηάδζα, ηαηαζηεοάζηδηακ βεκεηζηά ιςζασηά. ηα πεζνάιαηα αοηά ανέεδηε υηζ ηθχκμζ ηοηηάνςκ απυ ημοξ μπμίμοξ απμοζζάγεζ δ ILK έπμοκ ςξ απμηέθεζια ηδκ απμζφκδεζδ ηςκ δφμ επζεδθζαηχκ ζηζαάδςκ πμο δμιμφκ ημ θηενυ ηαζ ζηζξ ιφβεξ αοηέξ δδιζμονβείηαζ ιζα θμοζηάθα ζηα θηενά. Αλίγεζ κα ακαθενεεί υηζ πεζνάιαηα εκημπζζιμφ ηδξ ILK ζημ επζεήθζμ ηςκ θηενχκ έδεζλε, υηζ δ πνςηεΐκδ εκημπίγεηαζ ζηζξ πενζμπέξ πμο δζαιεζμθααμφκ ηδκ πνμζηυθθδζδ ναπζαίαξ ηαζ ημζθζαηήξ επζθάκεζαξ ημο θηενμφ, υπςξ ηαζ μζ ζκηεβηνίκεξ. v. H ILK ζε άιια κνληέια ζπζηήκαηα Γζα ημκ πνμζδζμνζζιυ ηδξ ILK ζηδκ ακάπηολδ έπμοκ βίκεζ ιεθέηεξ ζε δζάθμνα ιμκηέθα ζπμκδοθςηχκ ηαζ αζπυκδοθςκ. ηα πμκηίηζα, δ βεκεηζηή απαθμζθή ημο βμκζδίμο (knockout) ηδξ ILK μδδβεί ζε εάκαημ ηαηά ηδκ ειανοσηή θάζδ ηδξ ακάπηολδξ, ζοβηεηνζιέκα ηαηά ηδκ έηηδ διένα 25

37 (Sakai, Li et al. 2003). Γζα κα ακηζιεηςπζζηεί ημ πνυαθδια αοηυ, δδιζμονβήεδηακ δζάθμνα ιμκηέθα ζημπεοιέκδξ βεκεηζηήξ απαθμζθήξ ημο βμκζδίμο ηδξ ILK (conditional knockout). Μενζηά παναηηδνζζηζηά παναδείβιαηα είκαζ δ απαθμζθή ηδξ ILK απυ ηα πμκδνμηφηηανα, ηα εκδμεδθζαηά ηφηηανα ηαζ ηα ιαηνμθάβα. ηδκ πενίπηςζδ ηςκ πμκδνμηοηηάνςκ, δ απαθμζθή ηδξ ILK μδδβεί ζηδκ ακάπηολδ πμκδνμδοζπθαζίαξ ηαζ ζημ εάκαημ ηαηά ηδ βέκκδζδ θυβς ακαπκεοζηζηχκ πνμαθδιάηςκ (Grashoff, Aszodi et al. 2003). ηα εκδμεδθζαηά ηφηηανα, δ απαθμζθή ηδξ ILK πνμηαθεί ιδ θοζζμθμβζηυ ζπδιαηζζιυ ηςκ αββείςκ ηαζ εάκαημ ηαηά ηδ βέκκδζδ (Friedrich, Liu et al. 2004). ηα ιαηνμθάβα, δ απαθμζθή ηδξ ILK έπεζ ςξ απμηέθεζια ηδ ιεζςιέκδ θςζθμνοθίςζδ ηδξ Akt ζηδ ζενίκδ 473 (Troussard, Mawji et al. 2003) ηάηζ πμο έπεζ παναηδνδεεί ιε ηδ αμήεεζα άθθςκ ηεπκζηχκ ηυζμ ζημοξ κεονχκεξ (Mills, Digicaylioglu et al. 2003) υζμ ηαζ ζηα θεοημηφηηανα. ε ηάεε πενίπηςζδ, ηα δεδμιέκα αοηά οπμβναιιίγμοκ ηδ ζδιακηζηυηδηα ηδξ ILK βζα ημκ μνβακζζιυ ηαεχξ ηαζ ηδκ πμθοθεζημονβζηυηδηά ηδξ. Μεθέηδ ζημ D.rerio απμηάθορε ημ νυθμ ηδξ ILK ζηδ θεζημονβία ηδξ ηανδζάξ. Μζα ιεηάθθαλδ (lost-contact (loc)) ζημ βμκίδζμ ηδξ ilk ζοκμδεφεηαζ απυ ζμαανή δοζθεζημονβία ημο ιομηανδίμο, δ μπμία μθείθεηαζ ζε εθαηηχιαηα ηυζμ ζηα ηανδζμιομηφηηανα, υζμ ηαζ ζηα εκδμεδθζαηά ηφηηανα (Postel, Vakeel et al. 2008). Σέθμξ δ αιζκμλζηή ακηζηαηάζηαζδ Α262V ζημ βμκίδζμ ηδξ ilk ζε ακενχπμοξ ζοκδέεηαζ ιε ζμαανή δζαηαηζηή ιομηανδζμπάεεζα. Ζ ιεθέηδ αοηή απμηεθεί ηδκ πνχηδ ακαθμνά, υπμο ιεηαθθαβή ζημ βμκίδζμ ηδξ ilk ειπθέηεηαζ ζε ηανδζμπάεεζεξ ηαζ πανέπεζ ιζα κέα βεκεηζηή αάζδ βζα αοηή ηδκ αζεέκεζα ζημκ άκενςπμ (Knöll et al., 2007) PINCH (Particularly Interesting New Cysteine-Histidine rich protein) Ζ PINCH μζημβέκεζα είκαζ πνςηεΐκεξ-ζοκδέηεξ μζ μπμίεξ ζοιιεηέπμοκ ζημ ιδπακζζιυ ηδξ ηοηηανζηήξ πνμζηυθθδζδξ ηαζ απμηεθμφκηαζ απυ πέκηε LIM (LIN-11, Isl1 and MEC-3) πενζμπέξ ηαζ ιζα ιζηνή ηαναμλοηεθζηή μονά (Wu 2004). ηα εδθαζηζηά οπάνπμοκ δομ βμκίδζα πμο ηςδζημπμζμφκ βζα πνςηεΐκεξ PINCH, ηζξ PINCH-1 ηαζ PINCH-2. Ζ PINCH-1 εηθνάγεηαζ κςνίξ ζηδκ ειανοσηή ακάπηολδ ηαζ εονέςξ ζε δζάθμνμοξ ηφπμοξ ηοηηάνςκ ηαζ ζζηχκ (Rearden 1994; Tu, Li et al. 1999; Wu 1999; Zhang, Chen et al. 2002; Braun, Bordoy et al. 2003; Fukuda, Chen et al. 26

38 2003; Wu 2004; Liang, Zhou et al. 2005). Ζ έηθναζδ ηδξ PINCH-2 είκαζ πενζζζυηενμ πενζμνζζιέκδ ηαηά ηδκ ειανοσηή ακάπηολδ, αθθά δεκ εκημπίγεηαζ ζε πμθθμφξ ηοηηανζημφξ ηφπμοξ ηςκ εδθαζηζηχκ (10,12). Συζμ δ PINCH-1 υζμ ηαζ δ PINCH-2 δεζιεφμκηαζ ζηδκ ILK ιέζς ηςκ LIM1/2 πενζμπχκ πμο ανίζημκηαζ ζημ ηαναμλοηεθζηυ άηνμ ημο ιμνίμο (Li, Zhang et al. 1999; Zhang, Chen et al. 2002). ηδ Drosophila οπάνπεζ ιυκμ έκα βμκίδζμ πμο ηςδζημπμζεί βζα PINCH. ηα ιεηαθθαβιέκα έιανοα βζα pinch, ηα ιοσηά ειανοσηά ηφηηανα ειθακίγμοκ απμηυθθδζδ ζκζδίςκ αηηίκδξ απυ ηδκ ηοηηανμπθαζιαηζηή ιειανάκδ, θαζκυηοπμξ παναπθήζζμξ ηςκ ilk-/- ειανφςκ. Χζηυζμ, ζηα pinch-/- ιοσηά ηφηηανα δ ILK εκημπίγεηαζ ζηζξ ιομηεκμκηζηέξ ζοκδέζεζξ (Clark, McGrail et al. 2003), εκχ ζηα ilk-/- ηφηηανα μ εκημπζζιυξ ηαζ ηα επίπεδα ηδξ PINCH δζαηανάζζμκηαζ, οπμδδθχκμκηαξ υηζ δ ILK είκαζ απαναίηδηδ βζα ηδ δζαηήνδζδ ηυζμ ηςκ επζπέδςκ ηδξ PINCH υζμ ηαζ ημο εκημπζζιμφ ηδξ ζηζξ ιομηεκμκηζηέξ ζοκδέζεζξ (Zervas, Psarra et al. 2011) Parvins Οζ parvins είκαζ ιία μζημβέκεζα πνςηεσκχκ, μζ μπμίεξ ζοιιεηέπμοκ ζημ ζπδιαηζζιυ ημο πνςηεσκζημφ ηοηηανμπθαζιαηζημφ ζοιπθυημο πμο δζαιεζμθααεί ηδ ζφκδεζδ ηςκ ζκηεβηνζκχκ ιε εκδμηοηηανζηά ιμκμπάηζα πμο εθέβπμοκ ηδκ μνβάκςζδ ημο ηοηηανμζηεθεημφ ηδξ αηηίκδξ ηαζ ηδκ επζαίςζδ ηςκ ηοηηάνςκ. Οζ parvins έπμοκ ακαβκςνζζεεί ζηα ιεηάγςα, αθθά υπζ ζηδ γφιδ ή ζημ Dictyostelium. ηα εδθαζηζηά δ μζημβέκεζα ηςκ παναζκχκ απμηεθείηαζ απυ ηνία ιέθδ: ηζξ actopaxin/ch-ilkbp/α-parvin, affixin/α-parvin ηαζ β-parvin. Oζ α- ηαζ α- parvins εηθνάγμκηαζ ζε υθμοξ ημοξ ζζημφξ πμο εθέβπεδηακ, εκχ δ β-parvin έπεζ πζμ πενζμνζζιέκμ πνυηοπμ έηθναζδξ. Οζ parvins αθθδθεπζδνμφκ ιε ηδκ ILK ιέζς ηδξ δεφηενδξ calponin homology (CH) επζηνάηεζάξ ημοξ. Ζ αθθδθεπίδναζδ ηςκ ILK ηαζ α-parvin ελανηάηαζ απυ ηα PtdIns(3,4,5)P 3 (Attwell, Mills et al. 2003) ηαζ ηδ θςζθμνοθίςζδ ηδξ α-parvin απυ ηζξ CDC2 ηαζ εκενβμπμζμφιεκδ απυ ημ ιζημβυκμ πνςηεσκζηή ηζκάζδ mitogen-activated protein kinase (MAPK) (Curtis, Nikolopoulos et al. 2002; Clarke, Brown et al. 2004; Yang, Guo et al. 2005). Γεκ είκαζ λεηάεανμ εάκ ηαζ μζ άθθεξ δομ parvins νοειίγμκηαζ ηαη αοηυκ ημκ ηνυπμ, ακ ηαζ δ α-parvin ιπμνεί επίζδξ κα θςζθμνοθζςεεί (Yamaji, Suzuki et al. 2001). Έπεζ δεζπεεί υηζ δεζιεφεηαζ ηαζ αοηή ιε ηδκ ILK ιέζς ηδξ CH2 27

39 πενζμπήξ ηδξ ηαζ δζαιενζζιαημπμζείηαζ ζε εέζεζξ εζηζαηήξ πνμζηυθθδζδξ ζηδκ ηοηηανζηή ζεζνά θεοημηοηηάνςκ U937 (Yoshimi, Yamaji et al. 2006). Ζ έθθεζρδ ημο βμκζδίμο ηδξ α-parvin ζημ πμκηίηζ μδδβεί ζε ειανοσηή εκδζζιυηδηα, ελαζηίαξ ζμαανχκ ηανδζαββεζαηχκ πνμαθδιάηςκ, ζφιθςκα ιε πνυζθαηδ ιεθέηδ (Montanez, Wickstrom et al. 2009). Απαθμζθή ηδξ β-parvin απυ πμκηίηζα δεκ είπε ηαιία επίδναζδ ζηδκ δζαθμνμπμίδζδ, ζημκ πμθθαπθαζζαζιυ ηαζ ζηδκ επζαίςζδ ηςκ ηοηηάνςκ ημο αίιαημξ, ηαεχξ ηαζ ζηδ ιεηακάζηεοζδ δεκδνζηζηχκ ηοηηάνςκ ηαζ θειθμηοηηάνςκ, εκχ ηα πμκηίηζα ακαπηφζζμκηακ θοζζμθμβζηά. ηδ Drosophila melanogaster ηαζ ζημ Caenorhabditis elegans έπεζ ακαβκςνζζηεί ιυκμ ιία parvin. Έπεζ βίκεζ βεκεηζηή ακάθοζδ ημο βμκζδίμο ζημ C.elegans ηαζ δ απαθμζθή ημο μδήβδζε ζημκ ίδζμ θαζκυηοπμ πμο πνμηφπηεζ απυ ηδκ αθαίνεζδ, είηε ηςκ ζκηεβηνζκχκ, είηε ηδξ ILK, είηε ηδξ PINCH, ζε πανάθοηα άημια, ηαζ ιδ μθμηθδνςιέκδ ςνίιακζδ ηςκ εέζεςκ ζφκδεζδξ ηςκ ιοχκ. Οζ ζκηεβηνίκεξ ηαζ δ ILK δεκ πνεζάγμκηαζ ηδκ parvin βζα ηδ δζαιενζζιαημπμίδζδ ημοξ ζηζξ εέζεζξ ζφκδεζδξ ηςκ ιοχκ, εκχ μζ ίδζεξ είκαζ απαναίηδηεξ βζα ηδκ δζαιενζζιαημπμίδζδ ηδξ parvin (Lin, Qadota et al. 2003). ηδ Drosophila αθαίνεζδ ημο εκδμβεκμφξ βμκζδίμο ηδξ parvin μδδβεί ζε ειανοσηή εκδζζιυηδηα. Σα έιανοα ειθακίγμοκ θαζκμηοπζηέξ ακςιαθίεξ ζημ ιοσηυ ημοξ ζφζηδια ηαζ πζμ ζοβηεηνζιέκα, υπςξ ζηδκ πενίπηςζδ ηδξ απχθεζαξ ILK, έηζζ ηαζ ηαηά ηδκ βεκεηζηή απαθμζθή ηδξ parvin οπάνπεζ απμηυθθδζδ ηςκ ζκζδίςκ ηδξ αηηίκδξ απυ ηδκ πθαζιαηζηή ιειανάκδ. Σέθμξ, ζε ζοιθςκία ιε ηα απμηεθέζιαηα ζημ C.elegans, ηαζ ζηδ ιφβα μζ ζκηεβηνίκεξ ηαζ δ ILK είκαζ απαναίηδηεξ βζα ημκ οπμηοηηανζηυ εκημπζζιυ ηδξ parvin (Vakaloglou, Chountala and Zervas, αδδιμζίεοηα απμηεθέζιαηα) Talin Ζ Talin είκαζ έκα ζδιακηζηυ ζοζηαηζηυ ηςκ ζοιπθυηςκ εζηζαηήξ πνμζηυθθδζδξ. Ζ Talin είκαζ ιζα ηοηηανμπθαζιαηζηή πνςηεΐκδ πμο πνμζδέκεηαζ ζηδκ αηηίκδ ηαζ ζηζξ ζκηεβηνίκεξ (Horwitz, Duggan et al. 1986), ελαζθαθίγμκηαξ άιεζα ή έιιεζα ηδ ζφκδεζδ ημοξ ιε ημκ ηοηηανμζηεθεηυ αηηίκδξ. Ζ Talin ζπδιαηίγεζ μιμδζιενή ιέζς ηςκ αθθδθεπζδνάζεςκ ηςκ ιμνίςκ ηδξ ιέζς ηδξ νααδμεζδμφξ επζηνάηεζαξ (rod domain) ζημ ηαναμλοηεθζηυ άηνμ ημο ιμνίμο (Goldmann, Bremer et al. 1994). Ζ ζθαζνζηή πενζμπή ηδξ Talin πενζέπεζ ιζα FERM (Four-point-one, Ezrin, 28

40 Radixin, Moesin) πενζμπή. Ζ FERM πενζμπή δεζιεφεηαζ ιε ιεβάθδ ζοκάθεζα ζημ ΝpxY ιμηίαμ ηδξ ηοηηανμπθαζιαηζηήξ μονάξ ηςκ ζκηεβηνζκχκ α 1, α 2, α 3 ηαζ α 5 (Calderwood, Zent et al. 1999; Garcia-Alvarez, de Pereda et al. 2003). Ζ Talin ζοιιεηέπεζ ζηα πνχηα ζηάδζα ημο ζπδιαηζζιμφ ηςκ ζοκδέζεςκ ηςκ ζκηεβηνζκχκ ιε ημ ελςηοηηάνζμ οθζηυ. Ζ ζοκημκζζιέκδ ζοβηέκηνςζδ Talin, ηςκ ΡΗΡΚ ηαζ vinculin ζηζξ εκενβμπμζδιέκεξ ζκηεβηνίκεξ ζοκεζζθένεζ ζημ ζπδιαηζζιυ εκημπζζιέκςκ ζοιπθυηςκ, ζηδ ζφκδεζή ημοξ ιε ημκ ηοηηανμζηεθεηυ αηηίκδξ ηαζ πνμάβεζ ηδκ ςνίιακζδ ημοξ ζε εζηίεξ πνμζηυθθδζδξ (169, 197, 198). Δπμιέκςξ, δ Talin εηηυξ ημο δμιζημφ ηδξ νυθμο, έπεζ ηεκηνζηυ νυθμ ζηδκ εκενβμπμίδζδ ηςκ ζκηεβηνζκχκ (Calderwood, Zent et al. 1999; Calderwood, Huttenlocher et al. 2001; Martel, Racaud-Sultan et al. 2001; Calderwood, Yan et al. 2002; Vinogradova, Velyvis et al. 2002; Cram and Schwarzbauer 2004; Nayal, Webb et al. 2004). ηδ Drosophila,ημ C.elegans ηαζ ημ πμκηίηζ, μ θαζκυηοπμξ ηδξ απαθμζθήξ ηδξ talin είκαζ πανυιμζμξ αοημφ ηδξ απαθμζθήξ ηδξ οπμιμκάδαξ ηςκ ζκηεβηνζκχκ mys/ Pat- 3/β 1, οπμδδθχκμκηαξ υηζ δ Talin απαζηείηαζ βζα ηζξ πενζζζυηενεξ θεζημονβίεξ ηςκ ζκηεβηνζκχκ (Monkley, Zhou et al. 2000; Brown, Gregory et al. 2002; Cram, Clark et al. 2003). Ζ Σalin είκαζ απαναίηδηδ βζα ημκ εκημπζζιυ ηδξ ILK ζηζξ ιομηεκμκηζηέξ ζοκδέζεζξ, ηαεχξ ζε ιεηαθθάβιαηα βζα talin δ ILK παναιέκεζ ζημ ηοηηανυπθαζια. Ζ Talin είκαζ απαναίηδηδ βζα ηδ ζηαεενή ζφκδεζδ ηςκ ζκηεβηνζκχκ ηαζ ημο ηοηηανμζηεθεημφ αηηίκδξ, βζα ηδκ μνβάκςζδ ημο δζηηφμο αηηίκδξ ηαζ ηδξ ζδιαημδυηδζδξ πμο δζαιεζμθααείηαζ ιέζς ηςκ ζκηεβηνζκχκ Wech Ζ πνςηεΐκδ Wech είκαζ έκαξ ζζπονά ζοκηδνδιέκμξ νοειζζηήξ ηδξ δζαηήνδζδξ ηδξ πνμζηυθθδζδξ ζηδ Drosophila. Σα ιεηαθθαβιέκα έιανοα βζα wech ειθακίγμοκ θαζκμηφπμοξ πανυιμζμοξ ιε αοημφξ ιε ηα έιανοα πμο θένμοκ άιμνθδ ιεηάθθαλδ βζα talin ηαζ βζα ζκηεβηνίκεξ ακηίζημζπα, ζοιπενζθαιαακμιέκδξ ηδξ απμηυθθδζδξ ηςκ ιοχκ. Ζ πνςηεΐκδ Wech πενζέπεζ έκα Β-box- δάπηοθμ-ρεοδανβφνμο, ιζα coiled-coil πενζμπή ηαζ ιζα NHL πενζμπή. ηα ιεηαθθάβιαηα βζα α-ζκηεβηνίκδ ή Σalin, δ Wech δεκ εκημπίγεηαζ ζηζξ ιομηεκμκηζηέξ ζοκδέζεζξ υπςξ ζε έιανοα αβνίμο ηφπμο. H πνςηεΐκδ Wech είκαζ έκαξ ζζπονά ζοκηδνδιέκμξ νοειζζηήξ ηδξ δζαηήνδζδξ ηδξ πνμζηυθθδζδξ ζηδ Drosophila. Σα ιεηαθθαβιέκα έιανοα βζα wech ειθακίγμοκ θαζκμηφπμοξ πανυιμζμοξ ιε αοημφξ ιε ηα έιανοα πμο θένμοκ άιμνθδ ιεηάθθαλδ βζα 29

41 talin ηαζ βζα ζκηεβηνίκεξ ακηίζημζπα, ζοιπενζθαιαακμιέκδξ ηδξ απμηυθθδζδξ ηςκ ιοχκ. Ζ πνςηεΐκδ Wech πενζέπεζ έκα B-box-δάηηοθμ-ρεοδανβφνμο, ιζα coiled-coil πενζμπή ηαζ ιζα NHL πενζμπή (Slack and Ruvkun 1998). ηα ιεηαθθάβιαηα βζα α- ζκηεβηνίκδ ή talin, δ Wech δεκ εκημπίγεηαζ ζηζξ ΜΣ, παναιέκεζ ηοηηανμπθαζιαηζηή (Loer, Bauer et al. 2008). O εκημπζζιυξ ηδξ ILK ελανηάηαζ απυ ηδ Wech. ε έιανοα Drosophila ιεηαθθαβιέκα βζα wech δ ILK παναιέκεζ ζημ ηοηηανυπθαζια. Ζ Wech αθθδθεπζδνά ιε ηδκ πενζμπή ηδξ ηεθαθήξ ηδξ Talin ηαζ ηδκ επζηνάηεζα μιμζάγμοζα ηζκάζδξ (kinase like domain) ηδξ ILK Συζμ δ NHL υζμ ηαζ δ Β-box/coiled-coil πενζμπέξ ηδξ Wech απαζημφκηαζ βζα ηδκ αθθδθεπίδναζδ ηδξ πνςηεΐκδξ ιε ηζξ Talin ηαζ ILK. Σμ ιμκαδζηυ μνευθμβμ ηδξ Wech ζημ πμκηίηζ, ζοκεκημπίγεηαζ ιε ηζξ Σalin ηαζ ILK ζημ ιοσηυ ζζηυ (Loer, Bauer et al. 2008). Οζ Wech πνςηεΐκεξ είκαζ γςηζηήξ ζδιαζίαξ ηαζ ελεθζηηζηά ζδιακηζηά ζοκηδνδιέκμζ νοειζζηέξ ηδξ ζφκδεζδξηοηηανμζηεθεημφ dpak Οζ ηζκάζεξ ζενίκδξ/ενεμκίκδξ PAK είκαζ ακάιεζα ζημοξ ηαθφηενα παναηηδνζζιέκμοξ ηεθεζηέξ ηςκ Rac ηαζ Cdc42 (Bokoch 2003) αθθά μ νυθμξ ημοξ ζηδ ιμνθμβέκεζδ έπεζ εθάπζζηα πνμζδζμνζζηεί, ακ ηαζ πνυζθαηεξ ένεοκεξ ζηδ Drosophila οπμδδθχκμοκ υηζ δ θεζημονβία ημοξ είκαζ γςηζηήξ ζδιαζίαξ βζα ηδκ μθμηθήνςζδ ηδξ ακάπηολδξ. Σμ ιέθμξ ηδξ μζημβέκεζαξ ηςκ ΡΑΚ, Mushroom bodies tiny (Mbt) νοειίγεζ ηζξ ζοκδέζεζξ γχκδξ ηαζ ημκ ηοηηανμζηεθεηυ αηηίκδξ ηαηά ηδ ιμνθμβέκεζδ ηςκ ηοηηάνςκ θςημ-οπμδμπέςκ ημο ιαηζμφ ζηδ Drosophila. Έκα άθθμ ιέθμξ ηςκ PAK ηδξ Drosophila, δ dpak, ανπζηά απμιμκχεδηε ηαζ παναηηδνίζηδηε ςξ πνςηεΐκδ πμο ιπμνεί κα πνμζδεεεί ζηζξ εκενβμπμζδιέκεξ Rac ηαζ Cdc42. Ζ ηαηακμιή ηδξ πνςηεΐκδξ ζημ έιανομ πανμοζζάγεζ μιμζυηδηεξ ιε ηδκ ηαηακμιή ηςκ ζκηεβηνζκχκ, ηαζ ηςκ ιμνίςκ ημο ελςηοηηάνζμο οθζημφ. Ζ dpak πζεακά είκαζ πνςηεΐκδ πμο ζοιιεηέπεζ ζηδκ ηοηηανζηή πνμζηυθθδζδ ιε ημ ελςηοηηάνζμ οθζηυ, ζε έκα ιδπακζζιυ ακελάνηδημ ηςκ ζκηεβηνζκχκ. Αοηυ εκζζπφεηαζ απυ ημ βεβμκυξ υηζ ηα ιεηαθθάβιαηα βζα dpak πεεαίκμοκ ηαηά ηα πνμκοιθζηά ζηάδζα ηαζ υπζ ηαηά ηδκ ειανομβέκεζδ εκχ ημ ιοσηυ ζφζηδια δεκ ειθακίγεζ ακςιαθίεξ. 30

42 Δπίζδξ, δ dpak απαζηείηαζ βζα ηδκ μιμζυζηαζδ ημο ηοηηανμζηεθεημφ αηηίκδξ ηαζ ηδκ αθθαβή ημο ηοηηανζημφ ζπήιαημξ ζηδκ επζδενιίδα ηαηά ηδ ιεηακάζηεοζδ ηςκ ηοηηάνςκ ηαηά ηδκ ναπζαία ειανοσηή πενάηςζδ ηδξ επζδενιίδαξ, οπμδδθχκμκηαξ έκα νυθμ βζα ηδ PAK βζα ηδκ πμθςιέκδ ζοβηνυηδζδ ηδξ αηηίκδξ ηαηά ηδκ ιμνθμβέκεζδ ημο επζεδθίμο (Menzel, Schneeberger et al. 2007). Πνυζθαηδ ενβαζία ειπθέηεζ ηδκ ηζκάζδ ζενίκδξ/ενεμκίκδξ dpak ζηδκ μνβάκςζδ ηαζ ημ ζςζηυ πνμζακαημθζζιυ ηςκ ζκζδίςκ αηηίκδξ ζηα εοθαηζμηφηηανα ανπζηχκ ηαζ ιέζςκ ακαπηολζαημφ ζηαδίςκ ςμεοθάηζα. Δπίζδξ δ ίδζα ιεθέηδ πνμηείκεζ υηζ δ dpak ζοιιεηέπεζ ζημ ιδπακζζιυ ηοηηανζηήξ πνμζηυθθδζδξ ζημ ελςηοηηάνζμ οθζηυ ζηα επζεδθζαηά ηφηηανα (Conder, Yu et al. 2007). Σέθμξ, δ ILK ηςκ εδθαζηζηχκ έπεζ ηέζζενζξ πζεακέξ εέζεζξ θςζθμνοθίςζδξ βζα ηδκ p21-εκενβμπμζμφιεκδ ηζκάζδ (PAK1), πμο πενζέπμοκ ημ ιμηίαμ K/RxxT/S (Acconcia, Barnes et al. 2007). ε ηοηηανζηέξ ζεζνέξ εδθαζηζηχκ έπεζ δεζπεεί υηζ δ PAK1 ελανηχιεκδ θςζθμνοθίςζδ ηδξ ILK εκζζπφεζ ηδκ οπμηοηηανζηή ηδξ ηαηακμιή ζημ ηοηηανυπθαζια, εκχ δ βεκεηζηή αθαίνεζδ ηδξ PAK1 επάβεζ ηδ ιεηαηυπζζδ ηδξ ILK ζημκ πονήκα (Acconcia, Barnes et al. 2007) Δμσθπηηάξην πιηθφ (ECM) Ζ επζθάκεζα ηάεε ηοηηάνμο (ιε εθάπζζηεξ ελαζνέζεζξ) πενζθαιαάκεζ εθάπζζηεξ ζαηπανζηέξ μιάδεξ ζοκδεδειέκεξ ιε ηα ηιήιαηα ηςκ δζαιειανακζηχκ πνςηεσκχκ πμο πνμελέπμοκ απυ ηδ πθαζιαηζηή ιειανάκδ. i. Κνιιαγφλν Σμ ημθθαβυκμ είκαζ δ ηφνζα ηαηδβμνία ηςκ αδζάθοηςκ ζκςδχκ πνςηεσκχκ ηδξ ECM ηαζ ημο ζοκδεηζημφ ζζημφ. Τπάνπμοκ ημοθάπζζημκ δχδεηα ααζζημί ηφπμζ ημθθαβυκμο. Οζ ηφπμζ Η, ΗΗ ηαζ ΗΗΗ είκαζ μζ πθέμκ ηονίανπμζ. Σα ιυνζα ημθθαβυκμο παηεηάνμκηαζ ιεηαλφ ημοξ βζα κα ζπδιαηίζμοκ ιαηνζά θεπηά ζκίδζα πανυιμζαξ δμιήξ. Ο ηφπμξ IV, ακηίεεηα, ζπδιαηίγεζ έκα δζζδζάζηαημ δίηηομ ηαζ είκαζ ηφνζμ ζοζηαηζηυ ηδξ ααζζηήξ ιειανάκδξ. Τπάνπμοκ ηαζ ανηεηά επζεδθζαηά ηφηηανα πμο ζοκεέημοκ μνζζιέκμοξ ηφπμοξ ημθθαβυκμο. οκμπηζηά, ημ ζκχδεξ ημθθαβυκμ ζοβηνμηείηαζ απυ δζαθμνεηζηά είδδ αθοζίδςκ ημθθαβυκμο ηαζ μνβακχκεηαζ ιε δζαθμνεηζημφξ ηνυπμοξ ζε δζαθμνεηζημφξ ζζημφξ βζα κα ηαθφπηεζ εζδζηέξ ακάβηεξ. Οζ ίκεξ ημθθαβυκμο δζεοεεημφκηαζ ζε 31

43 ζηνχιαηα. Ίκεξ ζε ηάεε ζηνχια ημπμεεημφκηαζ πανάθθδθα δ ιζα ιε ηδκ άθθδ, αθθά ηάεεηα ζηζξ ίκεξ ηςκ βεζημκζηχκ ζηνςιάηςκ, δμιή πμο πνμζδίδεζ ζημκ ζζηυ θεζημονβία δζαθάκεζαξ ηαζ ζοκμπήξ (Hulmes 2002). Αοηή δ δζεοεέηδζδ δδιζμονβεί έκα παπφ, ιδ παναιμνθχζζιμ οθζηυ πμο ελαζθαθίγεζ ηδ θεζημονβία δζαθάκεζαξ ηαζ ζοκμπήξ. ii. Λακηλίλε Α Ζ θαιζκίκδ είκαζ ιζα βθοημπνςηεΐκδ πνμζηυθθδζδξ ηαζ ακήηεζ ζε ιζα μζημβέκεζα ιμνίςκ πμο μκμιάγμκηαζ θαιζκίκεξ (Timpl, Rohde et al. 1979). Σμ ιήημξ ημοξ είκαζ υζμ ηαζ ημ πάπμξ ηδξ ααζζηήξ ιειανάκδξ ηαζ ηονίςξ εκημπίγμκηαζ εηεί. Ζ θαιζκίκδ έπεζ εέζεζξ ιε ορδθή ζοββέκεζα πνυζδεζδξ βζα ηα άθθα ζοζηαηζηά ηδξ ααζζηήξ ιειανάκδξ, υπςξ ημ ημθθαβυκμ ηφπμο IV, ηδκ δπανίκδ, ηδ εεζζηή δπανάκδ ηαζ ηδκ εκηαηηίκδ (κζδμβυκμ) ηαεχξ ηαζ ημοξ πνςηεσκζημφξ οπμδμπείξ ηςκ θαιζκζκχκ. Πμθθέξ απυ ηζξ ζζμιμνθέξ ημο ηάεε ηφπμο αθοζίδαξ ηδξ θαιζκίκδξ ιπμνμφκ κα ζοκδεεμφκ ζε δζαθμνεηζημφξ ζοκδοαζιμφξ θηζάπκμκηαξ ηδ ιεβάθδ μζημβέκεζα ηςκ θαιζκζκχκ (Colognato and Yurchenco 2000). Οζ πενζζζυηενμζ οπμδμπείξ ηοηηανζηήξ επζθακείαξ βζα ηδ θαιζκίκδ υπςξ ηαζ βζα ημ ημθθαβυκμ ηφπμο IV ακήημοκ ζηδκ μζημβέκεζα ηςκ ζκηεβηνζκχκ (Paulsson 1992). Έκαξ άθθμξ ηφπμξ ηοηηανζημφ οπμδμπέα θαιζκίκδξ απμηεθεί δ πνςηεΐκδ δζζηνμβθοηάκδ, δ μπμία ιαγί ιε ηζξ ζκηεβηνίκεξ πζεακά αμδεμφκ ζηδ ζοβηνυηδζδ ηδξ ααζζηήξ ιειανάκδξ. iii. Fibronectins Οζ fibronectins απμηεθμφκ ιζα αηυιδ ζδιακηζηή ηαηδβμνία πνςηεσκχκ πμθθαπθήξ πνμζηυθθδζδξ ηδξ ECM. Ο ηφνζμξ νυθμξ ημοξ είκαζ δ πνυζδεζδ ηοηηάνςκ ζε ιζα πμζηζθία ECM, δδθαδή υθα ηα ECM πμο πενζέπμοκ ζκχδεξ ημθθαβυκμ. Με ηζξ ζοκδέζεζξ ημοξ, μζ fibronectins νοειίγμοκ ημ ζπήια ηςκ ηοηηάνςκ ηαζ ηδκ μνβάκςζδ ημο ηοηηανμζηεθεημφ (Wierzbicka-Patynowski and Schwarzbauer 2003). Ζ fibronectin δζαεέηεζ εζδζηέξ εέζεζξ πνυζδεζδξ ορδθήξ ζοββέκεζαξ βζα ζκηεβηνίκεξ ηοηηανζηήξ επζθακείαξ, απμδζαηαβιέκεξ ιμνθέξ ημθθαβυκμο (Lapiere, Chen et al. 1994), θζιπνίκδ ηαζ εεζζηέξ πνςηεμβθοηάκεξ (Schwarzbauer and Sechler 1999). Μεθέηεξ ιε ζοκεεηζηά πεπηίδζα πμο ακηζζημζπμφζακ ζε ηιήιαηα ηδξ πενζμπήξ αοηήξ ηαοημπμίδζακ ηδκ αθθδθμοπία ημο ηνζπεπηζδίμο Arg-Gly-Asp ςξ ηδκ εθάπζζηδ δμιή πμο απαζηείηαζ βζα ηδκ ακαβκχνζζδ απυ οπμδμπείξ ηδξ ηοηηανζηήξ επζθακείαξ. 32

44 ηδ ηνζζδζάζηαηδ δμιή αοηήξ ηδξ επακάθδρδξ fibronectin ηφπμο ΗΗΗ, δ αθθδθμοπία Arg-Gly-Asp ανίζηεηαζ ζηδ ημνοθή ιζαξ εδθζάξ πμο πνμελέπεζ απυ ημ ιυνζμ, ζε ιζα εέζδ χζηε κα πνμζδέκεηαζ ζε ζκηεβηνίκδ ή άθθδ πνςηεΐκδ. iv. Βαζηθή κεκβξάλε (ΒΜ) Ζ ααζζηή ιειανάκδ (ΒΜ) (basement membrane ή basal laminae) απμηεθείηαζ απυ ελςηοηηάνζεξ ζημζαάδεξ πάκς ζηζξ μπμίεξ "ηάεμκηαζ" επζεδθζαηά ηονίςξ ηφηηανα δζαπςνζγυιεκα απυ ιζα άθθδ αζμθμβζηή μκηυηδηα, π.π. ζοκδεηζηυ ζζηυ (Paulsson 1992). Δίκαζ ζπεδυκ αέααζμ υηζ ηα ηφηηανα πνμζημθθχκηαζ ζημ ζφιπθεβια ηδξ ΒΜ ιε ηδ αμήεεζα ηςκ ιμνίςκ ζκηεβηνίκδξ ηαζ δζζηνμβθοηάκδξ. Όθεξ μζ ααζζηέξ ιειανάκεξ πενζέπμοκ έκα ημζκυ ζφκμθμ πνςηεσκχκ ηαζ βθοημγαιζκμβθοηάκςκ, υπςξ ημθθαβυκμ ηφπμο IV, πνςηεμβθοηάκεξ εεζσηήξ δπανάκδξ, πενθεηάκδξ, εκηαηηίκδξ ή κζδμβυκμο ηαζ θαιζκίκδξ (Stanley, Woodley et al. 1982). Έκα ζδιακηζηυ ζοζηαηζηυ ηδξ ααζζηήξ ιειανάκδξ είκαζ ημ ημθθαβυκμ ηφπμο IV ημ μπμίμ ζπδιαηίγεζ έκα δζζδζάζηαημ πθέβια, έκα δίηηομ ςξ ζονιαηυπθεβια πμο δίκεζ ζηδ ααζζηή ιειανάκδ ζπήια ηαζ ζηαεενυηδηα. Δηηυξ απυ ηδ θεζημονβία ημοξ ςξ ιμνζαηά θίθηνα, μζ "ααζζηέξ ιειανάκεξ", ζοιιεηέπμοκ ζηδ νφειζζδ ηδξ ηοηηανζηήξ δζαθμνμπμίδζδξ, ηδξ ιεηακάζηεοζδξ ηςκ ηοηηάνςκ, η.ά. 1.3 Μπνηελνληηθέο ζπλδέζεηο ηζξ ιομηεκμκηζηέξ ζοκδέζεζξ ηδξ D. melanogaster εκημπίγμκηαζ δομ είδδ ζκηεβηνζκζηχκ οπμδμπέςκ: μ α PS1 α PS, μ μπμίμξ εηθνάγεηαζ ζηα ηεκυκηζα ηφηηανα ηαζ μ α PS2 α PS, μ μπμίμξ εκημπίγεηαζ ζηα ιοσηά ηφηηανα. Ζ ελάθεζρδ ηςκ βμκζδίςκ myospheroid (mys) ηαζ inflated (if) πμο ηςδζημπμζμφκ ηζξ αps ηαζ αps2 οπμιμκάδεξ ακηίζημζπα μδδβεί ζε εκδζζιυηδηα ιε θαζκυηοπμ απμηυθθδζδξ ηςκ ιοχκ απυ ηα ηεκυκηζα ηφηηανα ιεηά ηδκ έκανλδ ηδξ ιοσηήξ ζφζπαζδξ ζημ ειανοσηυ ζηάδζμ 16 (Brown, 1994). Ακηίεεηα, ηαηά ηδκ ελάθεζρδ ημο βμκζδίμο multiple edematous wings (mew) πμο ηςδζημπμζεί ηδκ εηθναγυιεκδ ζηα ηεκυκηζα ηφηηανα αps1 οπμιμκάδα μζ ιφεξ πανμοζζάγμοκ ιμνθμθμβία αβνίμο ηφπμο ηαζ εκδζζιυηδηα παναηδνείηαζ ζε πνμκοιθζηά ζηάδζα (Brower et al., 1995). H αps1 οπμιμκάδα πζζηεφεηαζ υηζ ζοκδέεηαζ ιε ηδκ πνςηεΐκδ θαιζκίκδ α3,5, δ απμοζία ηδξ μπμίαξ δεκ μδδβεί ζε δναιαηζηυ θαζκυηοπμ απμηυθθδζδξ ηςκ ιοχκ (Prokop et al., 1998), εκχ δ αps2 33

45 ζοκδέεηαζ ιε ηζξ θαιζκίκδ α1,2 (Martin et al., 1999) ηαζ ηζβηνίκδ (Σiggrin) (Bunch et al., 1998). Όπςξ ακαιέκεηαζ, δ ελάθεζρδ ηυζμ ηδξ θαιζκίκδξ α1,2 υζμ ηαζ ηδξ ηζβηνίκδξ μδδβεί ζε αζεεκή θαζκυηοπμ απμηυθθδζδξ ηςκ ιοχκ, ηαεχξ οπάνπμοκ πενζζζυηενμζ ημο εκυξ πνμζδέηεξ βζα ηδκ αps2 οπμιμκάδα. Ζ ζοζζχνεοζδ ηςκ ζκηεβηνζκζηχκ οπμδμπέςκ ζηα άηνα ηςκ ιοχκ θαιαάκεζ πχνα ηαηά ηδκ άθζλδ ημοξ ζηζξ ηαηάθθδθεξ εέζεζξ πνυζδεζδξ. Ζ επαηυθμοεδ αθθδθεπίδναζδ ηςκ οπμδμπέςκ ζκηεβηνίκδξ ιε ημ ελςηοηηάνζμ οθζηυ έπεζ ςξ απμηέθεζια ηδκ πνμζέθηοζδ πνςηεσκχκ πμο δζαιεζμθααμφκ ηδ δζαζφκδεζδ ηςκ ζκηεβηνζκχκ ιε ημκ ηοηηανμζηεθεηυ, υπςξ είκαζ δ talin (Talin) (Brown et al., 2002), δ Wech (Löer et al., 2008), δ PINCH (Clark et al., 2003), δ ζκηεβηνζκμ-ζοκδευιεκδ ηζκάζδ (Integrin-linked kinase, ILK) (Zervas et al., 2001), δ αζκημοθίκδ (Vinculin) (Ziegler et al., 2008), δ ηεκζίκδ (Tensin) (Torgler et al., 2004) ηαζ δ parvin (Parvin) (Vakaloglou et al., 2007) πνμξ ηδκ ηοηηανμπθαζιαηζηή επζθάκεζα ηςκ εέζεςκ πνυζδεζδξ ηςκ ιοχκ. Οζ πνςηεΐκεξ πμο πνμακαθένεδηακ ζοιιεηέπμοκ ζε έκα εονφηενμ ζφιπθμημ βκςζηυ ςξ ζοκδευζςια (adhesome) (Δηθ.5). Λεζημονβζηέξ ιεθέηεξ οπμδεζηκφμοκ υηζ οπάνπεζ ηάπμζμ είδμξ ζενανπίαξ ζηδκ ημπμεέηδζδ ηςκ πνςηεσκχκ ημο ζοκδεμζχιαημξ ζηζξ εέζεζξ πνυζδεζδξ ηςκ ιοχκ, υπςξ επίζδξ ηαζ δζαθμνεηζημί ααειμί ζοιιεημπήξ ημοξ ζηδ δζαηήνδζδ ηςκ ζηαεενχκ πνμζδέζεςκ. Δηθόλα 5 : ρεκαηηθή απεηθόληζε ησλ ηελόληησλ θπηηάξσλ ζε ζπλάξηεζε ηεο ζέζεο ηνπο σο πξνο ηελ επηδεξκίδα θαη ηα κπτθά θύηηαξα. ηδκ πανμφζα εζηυκα παναηδνείηαζ ηαζ δ ηαηακμιή ηςκ ζκηεβηνζκχκ ζηζξ ιομηεκμκηζηέξ ζοκδέζεζξ, ηνμπμπμζδιέκδ απυ (Bokel and Brown 2002). Γζα πανάδεζβια, δ talin ηαζ δ αps ζκηεβηνζκζηή οπμιμκάδα θαίκεηαζ υηζ είκαζ απαναίηδηεξ βζα ημκ εκημπζζιυ ηδξ Wech ζηζξ εέζεζξ πνυζδεζδξ ηςκ ιοχκ ηαζ, 34

46 αημθμφεςξ, δ Wech νοειίγεζ ηδκ ηαηακμιή ηςκ ILK ηαζ ηεκζίκδξ ζηζξ εέζεζξ αοηέξ (Löer et al., 2008). Δπζπθέμκ, δ απαθμζθή ηςκ βμκζδίςκ πμο ηςδζημπμζμφκ ηδκ talin ηαζ ημ Wech μδδβεί ζε θαζκμηφπμοξ απμηυθθδζδξ ηςκ ιοχκ πμο ιμζάγμοκ ιε αοηυκ πμο επάβεηαζ ηαηά ηδκ απμοζία ηδξ αps ζκηεβηνζκζηήξ οπμιμκάδαξ (Brown et al., 2002, Löer et al., 2008), εκχ δ ελάθεζρδ ηςκ βμκζδίςκ ilk ηαζ stck (steamer duck) (πμο ηςδζημπμζεί ηδκ PINCH) μδδβεί ζε θζβυηενμ ζζπονμφξ θαζκμηφπμοξ, μζ μπμίμζ παναηηδνίγμκηαζ απυ απμηυθθδζδ ημο ηοηηανμζηεθεημφ απυ ηδ ιειανάκδ ημο ιοσημφ ηοηηάνμο (Zervas et al., 2001, Clark et al., 2003) ηαζ πανμοζζάγμοκ μιμζυηδηα ιε ημοξ θαζκμηφπμοξ πμο επάβμοκ οπμιμνθζηέξ ιεηαθθάλεζξ ημο if (Devenport et al, 2007). Ζ ζφκδεζδ ιε ημκ ηοηηανμζηεθεηυ επζηοβπάκεηαζ είηε ιε άιεζδ ζφκδεζδ ηδξ talin ζηδκ αηηίκδ (Franco-Cea et al., 2010) ή ιε ηδ ζοζζχνεοζδ πνςηεσκχκ πμο δεζιεφμοκ αηηίκδ, υπςξ είκαζ δ αζκημοθίκδ (Ziegler et al., 2008), δ parvin (Vakaloglou et al., 2007) ηαζ δ ηεκζίκδ (Torgler et al., 2004) ζημ ζοκδευζςια Αηηίκδ-Μομζίκδ ζημοξ ιφεξ Σα ιοσηά ηφηηανα δμιμφκηαζ απυ ιεβάθμ ανζειυ επακαθαιαακυιεκςκ ιμκάδςκ ζφζπαζδξ πμο μκμιάγμκηαζ ζανημιενή. ε ηάεε ζανημιενέξ εκημπίγμκηαζ δφμ ζοζηήιαηα ζκζδίςκ: α) ηα παπζά ζκίδζα πμο απμηεθμφκηαζ απυ ιομζίκδ ΗΗ ηαζ α) ηα θεπηά ζκίδζα πμο απανηίγμκηαζ απυ ζκχδδ αηηίκδ ηαζ ημ ζφιπθμημ ηνμπμιομζίκδξηνμπμκίκδξ (Tn-Tm complex). Σα δφμ ζοζηήιαηα ζκζδίςκ δζαζοκδέμκηαζ ιέζς πνςηεσκχκ ιε εθαζηζηέξ ζδζυηδηεξ πμο ακήημοκ ζηδκ μζημβέκεζα ηδξ ηζηίκδξ (titin). Σα ζδιεία επαθήξ ιεηαλφ βεζημκζηχκ ζανημιενχκ μκμιάγμκηαζ Ε-γχκεξ ηαζ ειθακίγμκηαζ ηαηά ημ ζηάδζμ 17 ζημοξ ζςιαηζημφξ ιφεξ ημο ειανφμο (Bernstein et al., 1993). O ζπδιαηζζιυξ ηςκ Ε-γςκχκ λεηζκά απυ ηα άηνα ημο ιουξ ηαζ πνμμδεοηζηά ιεηαθένεηαζ ζημ εζςηενζηυ ημο (Kreisköther et al., 2006). Σα ζκίδζα ηδξ αηηίκδξ δζαζοκδέμκηαζ ζηζξ Ε-γχκεξ ιέζς ηδξ α-αηηζκίκδξ (Deatherage et al., 1989), εκχ ηα ζκίδζα ιομζίκδξ ΗΗ αθθδθεπζδνμφκ ιε ηα θεπηά ζκίδζα ιε ιζα δζαδζηαζία πμο εθέβπεηαζ απυ ημ ζφιπθμημ ηνμπμκίκδξ-ηνμπμιομζίκδξ. Σα παπζά ζκίδζα εκημπίγμκηαζ ζηζξ Α-γχκεξ ηαζ δζαζοκδέμκηαζ ιεηαλφ ημοξ ζηζξ Μ-γχκεξ, μζ μπμίεξ ηαηαθαιαάκμοκ ημ ιέζμκ ημο ζανημιενμφξ. Ζ Η-γχκδ είκαζ δ πενζμπή ζηδκ μπμία δεκ οπάνπεζ επζηάθορδ ιεηαλφ θεπηχκ ηαζ παπζχκ ζκζδίςκ. Οζ μιυθμβεξ ηδξ ηζηίκδξ πνςηεΐκεξ, πανέπμοκ έκα ζφκδεζιμ ακάιεζα ζηα παπζά ζκίδζα ιομζίκδξ ηαζ ζηζξ Ε-γχκεξ ηαζ νοειίγμοκ ηδκ εθαζηζηυηδηα ημο ιουξ. Ζ μθίζεδζδ ηςκ ζοζηδιάηςκ παπζχκ ηαζ 35

47 θεπηχκ ζκζδίςκ έπεζ ςξ απμηέθεζια ηδ ιεηααμθή ημο ιήημοξ ηςκ ζανημιενχκ, ηδκ παναβςβή δφκαιδξ ζημ εζςηενζηυ ημο ιουξ ηαζ ηδ ιοσηή ζφζπαζδ. Συζμ ζηα ζπμκδοθςηά υζμ ηαζ ζηα αζπυκδοθα, ηα άηνα ηςκ ιομσκζδίςκ ζοκδέμκηαζ ιε ημ ζηεθεηυ ιε ημοξ ιομ-ηεκμκηζημφξ ζοκδέζιμοξ. Βαζζηυ δμιζηυ ηαζ θεζημονβζηυ ζοζηαηζηυ ηςκ ζοκδέζιςκ αοηχκ απμηεθμφκ μζ ζκηεβηνζκζημί οπμδμπείξ. Δπζπθέμκ, δ ιειανάκδ ηςκ ιομσκζδίςκ ζοκδέεηαζ πθεονζηά ιε ημ ζοκδεηζηυ ζζηυ πμο πενζαάθθεζ ημ ιο ζηδκ πενζμπή ηςκ Ε-γςκχκ. Αοηέξ μζ εέζεζξ πνυζδεζδξ μκμιάγμκηαζ ημζηαιενή ηαζ έπεζ ανεεεί υηζ δμιμφκηαζ απυ ζοζηαηζηά ηςκ ζκηεβηνζκζηχκ ζοιπθυηςκ (Volk et al., 1990). O ζπδιαηζζιυξ ηςκ ζκζδίςκ αηηίκδξ λεηζκά ιε ηδ ζφκδεζδ ιζηνμφ ανζειμφ ιμκμιενχκ αηηίκδξ ιε ιία δζαδζηαζία πμο είκαζ βκςζηή ςξ πονήκςζδ ηαζ πενζθαιαάκεζ ημ ζπδιαηζζιυ ιίαξ ιήηναξ πμο εα πνδζζιμπμζδεεί ςξ οπυζηνςια βζα ημκ πμθοιενζζιυ. Σα ζκίδζα ηδξ αηηίκδξ πανμοζζάγμοκ πμθζηυηδηα. Σα άηνα ηάεε ζκζδίμο, πμο δζαηνίκμκηαζ ζε ηοθθυ (+) ηαζ αηζδςηυ (-) αάζεζ ημο ζπεηζημφ νοειμφ πμθοιενζζιμφ ημοξ, δεζιεφμκηαζ ακηίζημζπα απυ ηζξ πνςηεΐκεξ SALS ηαζ ηνμπμιμκημοθίκδ (Tmod). Ο πμθοιενζζιυξ ηςκ ζκζδίςκ αηηίκδξ ζημοξ ιφεξ ηδξ Drosophila θαιαάκεζ πχνα ζημ αηζδςηυ άηνμ ηαζ οπυηεζηαζ ζε ανκδηζηή νφειζζδ απυ ηδκ ηνμπμιμκημοθίκδ, δ μπμία ηςδζημπμζείηαζ απυ ημ βμκίδζμ sanpodo (spdo) (Mardahl-Dumesnil and Fowler, 2001). Ακηίεεηα δ πνςηεΐκδ SALS (sarcomere length short) εοκμεί ημκ πμθοιενζζιυ (Bai et al., 2007). Σμ ιήημξ ηςκ θεπηχκ ζκζδίςκ ηαεμνίγεηαζ απυ ημ ζπεηζηυ νοειυ πμθοιενζζιμφ/απμπμθοιενζζιμφ ηςκ ζκζδίςκ αηηίκδξ, πμζηίθθεζ ακάθμβα ιε ημκ ηφπμ ηςκ ιοχκ ηαζ πζζηεφεηαζ υηζ ζπεηίγεηαζ ιε ηζξ ιδπακζηέξ ζδζυηδηεξ ημοξ (Burkholder et al., 1994). Σα παπζά ζκίδζα είκαζ πμθοιενή ιομζίκδξ, ηα μπμία αθθδθεπζδνμφκ ιε ηα θεπηά ζκίδζα ιε ζημπυ ηδκ παναβςβή δφκαιδξ ηαζ ηδ ιείςζδ ημο ιήημοξ ηςκ ζανημιενχκ ηαηά ηδ ζφζπαζδ ηςκ ιοχκ. Ζ ιομζίκδ ΗΗ απμηεθείηαζ απυ δφμ αανζέξ αθοζίδεξ ιομζίκδξ (myosin heavy chains, MHCs) ηαζ ηέζζενζξ εθαθνζέξ αθοζίδεξ. Οζ ηεθεοηαίεξ δζαηνίκμκηαζ ζηζξ νοειζζηζηέξ (regulatory light chains, RLCs) ηαζ ζηζξ αθηαθζηέξ εθαθνζέξ αθοζίδεξ ηδξ ιομζίκδξ (essential light chains, ELCs). Οζ αανζέξ αθοζίδεξ ηδξ ιομζίκδξ δμιμφκηαζ απυ ηδκ πενζμπή ηδξ ηεθαθήξ ηαζ ιία νααδυιμνθδ πενζμπή (rod). ηδκ Α-γχκδ ηα παπζά ζκίδζα ακαιεζβκφμκηαζ ηαζ αθθδθεπζδνμφκ ιε ηα θεπηά ζκίδζα ιέζς ηδξ ζθαζνζηήξ ηεθαθήξ ηδξ MHC, εκχ δ νααδυιμνθδ πενζμπή δζαιεζμθααεί ηδκ αθθδθεπίδναζδ ιε έκα επζπθέμκ ιυνζμ MHC. Έπεζ δζαπζζηςεεί υηζ δ ηεθαθή ηδξ ιομζίκδξ είκαζ απαναίηδηδ βζα ηδκ ΑΣΡ-ελανηχιεκδ μθίζεδζδ ηςκ 36

48 ζκζδίςκ αηηίκδξ ηαζ ιομζίκδξ ηαζ ηδκ επαηυθμοεδ ζφζπαζδ ημο ιουξ. Δπζπθέμκ, θαίκεηαζ υηζ ζοιιεηέπεζ ζημκ ηαεμνζζιυ ημο ιήημοξ ηςκ ζανημιενχκ (Cripps et al., 1999). ηδ Drosophila δ απαθμζθή ημο βμκζδίμο mhc μδδβεί ζε πανάθοζδ ηαζ εκδζζιυηδηα ζε υρζια ειανοσηά ή ζε πνμκοιθζηά ζηάδζα, εκχ δ ίδζα ιεηαθθαβή ζε εηενμγοβςηία μδδβεί ζε δζαηαναπή ηδξ ιμνθμθμβίαξ ηςκ ιομσκζδίςκ ηαζ αδοκαιία πηήζδξ ζηα εκήθζηα άημια (Mogami et al., 1986, O Donnell and Bernstein, 1988). Οζ αθθδθεπζδνάζεζξ ηςκ παπζχκ ζκζδίςκ ιε ηα ζκίδζα ηδξ αηηίκδξ οπυηεζηαζ ζε νφειζζδ απυ ηζξ αθοζίδεξ RLC. οβηεηνζιέκα, δ θςζθμνοθίςζδ ηςκ αθοζίδςκ RLC ζηδκ αιζκμ-ηεθζηή πενζμπή θαίκεηαζ υηζ αεθηζζημπμζεί ηδ δζαζφκδεζδ παπζχκ ηαζ θεπηχκ ζκζδίςκ (Farman et al., 2009), εκχ δ ελάθεζρδ ημο MLC-2 βμκζδίμο πμο ηδκ ηςδζημπμζεί μδδβεί ζε εκδζζιυηδηα ζε ειανοσηυ ζηάδζμ, πςνίξ ακζπκεφζζιμ θαζκυηοπμ ζημ ιοσηυ ζφζηδια. Σαοηυπνμκα, δ ίδζα ιεηαθθαβή ζε εηενμγοβςηία ζοκηεθεί ζηδ δζαηαναπή ηδξ θεζημονβία ηδξ πηήζδξ ζημ εκήθζημ άημιμ (Warmke et al., 1992). Ο νυθμξ ηςκ ELC αθοζίδςκ ζηδ Drosophila δεκ είκαζ βκςζηυξ. 1.4 Η σνγέλεζε ζηε Drosophila Σμ εοθαηχδεξ επζεήθζμ, ημ μπμίμ πενζαάθθεζ ημ ακαπηοζζυιεκμ ςμηφηηανμ ζηδ ιφβα, απμηεθεί έκα άνζζημ ζφζηδια ιεθέηδξ ηςκ ηοηηανζηχκ αζμθμβζηχκ δζενβαζζχκ πμο δζέπμοκ ηδ ιμνθμβέκεζδ ηςκ ζζηχκ. Ακαπηολζαηέξ ηαζ βεκεηζηέξ ιεθέηεξ έπμοκ απμηαθφρεζ υηζ αοηυ ημ επζεήθζμ ακαπηφζζεηαζ ζοκημκζζιέκα ιε ημ ςμηφηηανμ ηαζ ηαεμνίγεζ ημοξ άλμκεξ ημο ζχιαημξ ημο επαηυθμοεμο ειανφμο. Ζ ηοηηανζηή επζημζκςκία ζοκημκίγεζ ηδ ιμνθμβέκεζδ ημο εοθαηχδμοξ επζεδθίμο ιε ηα βεζημκζηά βαιεηζηά ηφηηανα, ιε ακηίζημζπμ ηνυπμ πμο μζ επζεδθζαηέξ-ιεζεβποιαηζηέξ αθθδθεπζδνάζεζξ μδδβμφκ ημ ζπδιαηζζιυ ηςκ ζζηχκ ζηα ζπμκδοθςηά. Αθμφ ζπδιαηζζηεί ημ εοθαηχδεξ επζεήθζμ οπμδζαζνείηαζ βζα κα παναβάβεζ δζαηνζηέξ πενζμπέξ επζεδθζαηήξ μνβάκςζδξ, ιζηνχκ μιάδςκ ιεηακαζηεοηζηχκ εοθαηζμηοηηάνςκ, ηαζ ηεθζηά εκυξ εηηνζηζημφ επζεδθίμο ημ μπμίμ πνμμδεοηζηά εκαπμεέηεζ ζηνχιαηα πμνίμο. Σμ εοθαηχδεξ επζεήθζμ απμηεθεί ζδιακηζηυ ζφζηδια ιεθέηδξ ηδξ ιεηαβςβήξ ζήιαημξ ημο οπμδμπέα ηδξ ηζκάζδξ ηδξ ηονμζίκδξ (Nilson and Schupbach 1999; Van Buskirk and Schupbach 1999; van Eeden and St Johnston 1999)), ηδξ πμθζηυηδηαξ ηςκ επζεδθζαηχκ ηοηηάνςκ (Dobens and Raftery 2000; 37

49 Horne-Badovinac and Bilder 2005), ηαζ ηδ αζμθμβία ηςκ ηοηηάνςκ ηαζ ηςκ ιζζπμεζδχκ ηοηηάνςκ (Lin 2002; Xie, Kawase et al. 2005) Δπζζηυπδζδ ηδξ ςμβέκεζδξ Κάεε εκήθζηδ ςμεήηδ απμηεθείηαζ απυ «ημιπμθυβζα» δζαδμπζηά ακαπηοζζυιεκςκ ςμεοθαηίςκ (ovarioles), ηα μπμία πενζέπμοκ ζεζνέξ απυ ακαπηοζζυιεκα δζαδμπζηά ςμεοθάηζα πνμμδεοηζηχκ δθζηζχκ (Δηθ.6). ημ ηέθμξ ηάεε εκυξ ovariole οπάνπμοκ 2-3 πνυδνμια βαιεηζηά ηφηηανα (GSCs) ζε ιζα δμιή απμηαθμφιεκδ βενιάνζμ (germarium). Σα δζαθμνμπμζμφιεκα εοβαηνζηά ηφηηανα, μζ ηοζημαθάζηεξ (cystoblasts), οπμαάθθμκηαζ ζε ηέζζενζξ ιζηςηζηέξ δζαζνέζεζξ βζα κα δζαιμνθχζμοκ έκα ζοβηφηζμ 16 ηοηηάνςκ, ή ηδκ ηφζηδ. Έκα βαιεηζηυ ηφηηανμ εα βίκεζ ςμηφηηανμ ηαζ ηα οπυθμζπα 15 εα βίκμοκ ηνμθζηά ηφηηανα (nurse cells). Πενίπμο 16 πνυδνμια εοθαηζμηφηηανα εζζαάθθμοκ ιεηαλφ ηςκ ηφζηεςκ, παφμοκ κα δζαζνμφκηαζ ηαζ βίκμκηαζ πνμ-πμθζηά (prepolar) ηφηηανα, ηα μπμία βίκμκηαζ ηεθζηά πμθζηά ηφηηανα ηαζ ιζζπμεζδή ηφηηανα (stalk cells) (Ruohola, Bremer et al. 1991; Gonzalez-Reyes, Elliott et al. 1995; Roth, Neuman-Silberberg et al. 1995). Άθθα πνυδνμια ηφηηανα δζαιμνθχκμοκ έκα απθυ επζεήθζμ βφνς απυ ηδκ ηφζηδ, δδιζμονβχκηαξ έκα ςμεοθάηζμ. Πέκηε-μηηχ δζαθμνμπμζμφιεκα ιζζπμεζδή ηφηηανα δζαπςνίγμοκ ημ κεμζπδιαηζγυιεκμ ςμεοθάηζμ απυ ημ βενιάνζμ. Σμ ςμηφηηανμ αολάκεηαζ ζδιακηζηά θυβς ηδξ πνυζθδρδξ θέηζεμο δ μπμία ζοκηίεεηαζ ζηα εοθαηζμηφηηανα, ηαζ ηαηαθαιαάκεζ ζπεδυκ ημ ιζζυ ςμεοθάηζμ ηαηά ημ ζηάδζμ 10A (Koch and King 1966; King, Aggarwal et al. 1968). Δηθόλα 6: Αλαπηπμηαθά ζηάδηα ηνπ σνζπιαθίνπ, πνχζδ ιε νμδαιίκδ-θαθθμσδίκδ, ηνμπμπμζδιέκδ απυ (Wu, Yamada-Mabuchi et al. 2008) Σα εοθαηζμηφηηανα (FCs) ζπδιαηίγμοκ έκα ηοαμεζδέξ επζεήθζμ ιέπνζ ημ ζηάδζμ 8. Ανπίγμκηαξ ζημ ζηάδζμ 9, ακαδζμνβακχκμκηαζ ιέζς ιζαξ ζεζνάξ ιεηακαζηεφζεςκ. Σα 6-10 εοθαηζμηφηηανα πμο ανίζημκηαζ ζημ άηνμ ημο πνυζεζμο 38

50 ηιήιαημξ ημο ςμεοθαηίμο βίκμκηαζ border cells, ηα μπμία ιεηακαζηεφμοκ ιέζς ηςκ ηνμθζηχκ ηοηηάνςκ πνμξ ημ ςμηφηηανμ. Άθθα πεκήκηα (50) εοθαηζμηφηανμ πνυζεζμο ηιήιαημξ δζαιμνθχκμοκ έκα πθαηχδεξ (squamous) επζεήθζμ πμο επζηαθφπηεζ ηα ηνμθζηά ηφηηανα. Σα πενζζζυηενα εοθαηζμηφηηανα ζπδιαηίγμοκ έκα ηοθζκδνζηυ (columnar) επζεήθζμ πάκς απυ ημ ςμηφηηανμ. Καηά ηδ δζάνηεζα ημο ζηαδίμο 10B, ηα εοθαηζμηφηηανα ηζκμφκηαζ πνμξ ημ εζςηενζηυ βζα κα ηαθφρμοκ ημ πνυζεζμ ηιήια ημο ςμηοηηάνμο. Καηά ηδ δζάνηεζα ηςκ ζηαδίςκ 10B ςξ ηαζ 14, ηα ηνμθζηά ηφηηανα ιεηαθένμοκ ημ ηοηηανμπθαζιαηζηυ πενζεπυιεκυ ημοξ ζημ ςμηφηηανμ (Cooley, Verheyen et al. 1992). Σα εοθαηζμηφηηανα εκαπμεέημοκ ηδ αζηεθθζκζηή ιειανάκδ ηαζ πυνζμ πάκς απυ ημ ςμηφηηανμ. Ζ ςνίιακζδ ημο ςμηοηηάνμο μθμηθδνχκεηαζ ηαζ ηα ηνμθζηά ηφηηανα απμπίπημοκ. Σμ πνυζεζμ ηιήια ημο χνζιμο αοβμφ θένεζ έκα γεφβμξ ναπζαίςκ πνμζανηδιάηςκ βζα ηδκ ειανοζηή ακαπκμή, έκα άκμζβια βζα ηδκ έλμδμ ηδξ πνμκφιθδξ, ηαζ ηδ ιζηνμπφθδ βζα ηδκ είζμδμ ημο ζπένιαημξ (Δζη.7) (Koch and King 1966; King, Aggarwal et al. 1968; Spradling 1993). Δηθόλα 7: Μηθξνγξαθία ρνξίνπ ώξηκνπ απγνύ από ειεθηξνληθό κηθξνζθόπην (ξαρηαν-πιεπξηθή όςε), ηνμπμπμζδιέκδ απυ (Dobens, Jaeger et al. 2005) Σμ βενιάνζμ: ιζα ζφκεεηδ δμιή ιε πμθθαπθμφξ ηφπμοξ πνυδνμιςκ ηοηηάνςκ Ζ εκήθζηδ ςμεήηδ ακαπηφζζεηαζ απυ ημ πνμκοιθζηυ ανπέβμκμ (primordium), ημ μπμίμ απμηεθείηαζ απυ ζςιαηζηά εκενβά ιζηςηζηά ζςιαηζηά ηφηηανα ιεζμδενιζηήξ πνμέθεοζδξ ηαζ ανπέβμκα βαιεηζηά ηφηηανα (PGCs). Μζα ηεκηνζηή ιάγα ιεζεβποιαηζηχκ ηαζ ανπέβμκςκ βαιεηζηχκ ηοηηάνςκ ζπδιαηίγεζ ηα ovarioles. Καηά ηδ δζάνηεζα ηδξ πνμκοιθζηήξ ακάπηολδξ, δ ιεηαβςβή ζδιάηςκ ακάιεζα 39

51 ιεηαλφ ηςκ PGCs ηαζ ηςκ ζςιαηζηχκ ηοηηάνςκ ζζμννμπεί ημοξ ανζειμφξ ημοξ (Gilboa and Lehmann 2006). Καηά ηδ ιεηάααζδ απυ ημ πνμκοιθζηυ ζημ κοιθζηυ ακαπηολζαηυ ζηάδζμ, ηα μπίζεζα PGCs δζαθμνμπμζμφκηαζ ζε ηοζημαθάζηεξ, μζ μπμίεξ εα δχζμοκ ηα πνχηα αοβά πμο εκαπμηίεεκηαζ απυ ημ εκήθζημ εδθοηυ πδιαηζζιυξ ηςκ αθαζηζηχκ ηαζ ηςκ ιζζπμεζδχκ ηοηηάνςκ Ο ζπδιαηζζιυξ ηςκ «ημιπμθμβζχκ» δζαδμπζηά ακαπηοζζυιεκςκ ςμεοθαηίςκ (μvarioles) ανπίγεζ ηαηά ημ ηνίημ πνμκοιθζηυ ζηάδζμ, υηακ μζ ιεηακαζηεφζεζξ ζςιαηζηχκ ηοηηάνςκ ζπδιαηίγμοκ ηδ εέζδ ζημ βενιάνζμ υπμο ανίζημκηαζ ηα GSCs, ηαζ ηα FCSCs (King, Aggarwal et al. 1968). Σα ηεκηνζηά ιεζεβποιαηζηά ηφηηανα δζαιμνθχκμοκ ιζα niche αοηή δζαηδνεί ηα πνυζεζα PGCs αδζαθμνμπμίδηα (Gilboa and Lehmann 2004) αοηά ηα PGCs εα βίκμοκ ηα GSCs (King, Aggarwal et al. 1968). Σα ηφηηανα ηςκ ηεθζηχκ ζκχκ (terminal filaments), ηα μπμία εδνάγμκηαζ ζημ πνυζεζμ άηνμ ημο ηάεε βενιάνζμο (Δηθ.8), ανπζηά δζαθμνμπμζμφκηαζ ζπδιαηίγμκηαξ ιζα ζεζνά 8-9 ηοηηάνςκ. Ο Bric-a-brac ιεηαβναθζηυξ πανάβμκηαξ (Bab) εηθνάγεηαζ ζηδ niche υπμο ζπδιαηίγμκηαζ ηα ζςιαηζηά ηφηηανα. Σα ηφηηανα ηςκ ηεθζηχκ ζκχκ ζπδιαηίγμοκ ζοζηάδεξ απυ ηδκ πανειαμθή ηαζ ηδ ζοβηέκηνςζδ ηοηηάνςκ (Godt and Laski 1995; Sahut-Barnola, Godt et al. 1995). Ζ μνβάκςζδ ηςκ ηοηηάνςκ ηεθζηχκ ζκχκ απαζηεί ημ ιεηαβναθζηυ πανάβμκηα Engrailed, αθθά μ πανάβμκηαξ αοηυξ δεκ είκαζ απαναίηδημξ βζα ηδκ επαηυθμοεδ πθάηοκζδ αοηχκ ηςκ ηοηηάνςκ (Bolivar, Pearson et al. 2006). 40

52 Δηθόλα 8: (A) Γηάγξακκα ηνπ γεξκάξηνπ ηεο Drosophila, (B) Υξώζε σνζπιαθίσλ γηα Fas3 (θόθθηλν) θαη γηα DNA κε ρξώζε Topro3 (ιεπθό). Πνιηθά θύηηαξα, ηνμπμπμζδιέκδ απυ (Wu, Yamada-Mabuchi et al. 2008) Σμ χνζιμ βενιάνζμ Σα ηφηηανα ημο ιζηνμπενζαάθθμκημξ ηςκ αθαζηζηχκ ηοηηάνςκ (niche), ηα GSCs ηαζ μζ ιζηςηζηά δζαζνμφιεκεξ ηοζημαθάζηεξ ανίζημκηαζ ζηδκ πενζμπή 1 ημο βενιάνζμο (Δζη 3). Ζ πνυζθαηα ζπδιαηζζιέκδ ηφζηδ 16 ηοηηάνςκ ηζκείηαζ πνμξ ηδκ πενζμπή 2a ηαεχξ δ δζαθμνμπμίδζδ ςμηοηηάνςκ πνμπςνεί (Huynh and St Johnston 2004). Σα FCSCs ανίζημκηαζ ζημ υνζμ ηςκ πενζμπχκ 2a/2b (Margolis and Spradling 1995). ηδκ πενζμπή 2b, δ ηφζηδ ακαδζμνβακχκεηαζ, ιε ημ ςμηφηηανμ κα ημπμεεηείηαζ ζημ ηέκηνμ ηδξ. Σα πνυδνμια εοθαηζμηφηηανα πενζαάθθμοκ ηδκ ηφζηδ, ακηζηαεζζηχκηαξ ηα ζοκμδεοηζηά ηφηηανα (escort cells). Δκχ ηδκ πενζμπή 3 ημο βενιάνζμο ηδκ ηαηαθαιαάκεζ ημ κεμζπδιαηζγυιεκμ ςμεοθάηζμ (Koch and King 1966; King, Aggarwal et al. 1968), (Koch, Smith et al. 1967). 41

53 ηα εκήθζηα άημια, ηα ηφηηανα ηεθζηχκ ζκχκ ηαζ ηα ηφηηανα ηάθορδξ (cap cells) δζαιμνθχκμοκ ιζα εέζδ ζημ βενιάνζμ (niche) δ μπμία δζαηδνεί ηα GSCs ζε αδζαθμνμπμίδηδ ηαηάζηαζδ (Lin 2002; Fuchs, Tumbar et al. 2004; Decotto and Spradling 2005; Xie, Kawase et al. 2005; Gilboa and Lehmann 2006; Fuller and Spradling 2007; Xie and Li 2007). ηδ αάζδ ηδξ ηεθζηήξ ίκαξ, ιζα ζοζηάδα ηςκ ηοηηάνςκ ηάθορδξ ένπεηαζ ζε επαθή ιε ηα GSCs. Καεχξ ηα εοβαηνζηά ηφηηανα ηςκ GSCs δζαθμνμπμζμφκηαζ ηαζ απμιαηνφκμκηαζ απυ ηα ηφηηανα ηάθορδξ, ζςιαηζηά ζοκμδεοηζηά ηφηηανα ηοθίβμκηαζ βφνς ημοξ ηαζ οπμζηδνίγμοκ ηδ δζαθμνμπμίδζδ ηδξ ηοζημαθάζηδξ (Decotto and Spradling 2005). Σα ηφηηανα ηςκ ηεθζηχκ ζκχκ ηαζ ηα ηφηηανα ηάθορδξ πνμάβμοκ ηδκ αοηυ-ακακέςζδ ηαζ απμηνέπμοκ ηδ δζαθμνμπμίδζδ ηςκ GSCs. Οζ επαθέξ ιεηαλφ ηςκ ηοηηάνςκ ηάθορδξ ηαζ ηςκ GSCs (Lin and Spradling 1997) είκαζ απαναίηδηεξ βζα κα δζαηδνήζμοκ ηα GSCs αδζαθμνμπμίδηα. Οζ ζοκδέζεζξ γχκδξ (adherens junctions), πμο απμηεθμφκηαζ απυ DE-Cadherin (shotgun) α-catenin (armadillo). Δκημπίγμκηαζ ιεηαλφ ηςκ ηοηηάνςκ ηάθορδξ ηαζ ηςκ βαιεηζηχκ ηοηηάνςκ ηαζ είκαζ απαναίηδηεξ βζα ηδ δζαηήνδζδ ηςκ GSCs. Μάθζζηα, ηα ηφηηανα ηάθορδξ ηαοημπμζμφκηαζ ηαζ θυβς ηςκ ορδθχκ επζπέδςκ ηδξ πνςηεΐκδξ armadillo (Song, Zhu et al. 2002). Οζ παζιαημζφκδεζιμζ (gap junctions) είκαζ πανυκηεξ ιεηαλφ ηςκ βαιεηζηχκ ηαζ ηςκ ζςιαηζηχκ ηοηηάνςκ, ηαζ πζεακά είκαζ ζδιακηζημί βζα ηδ δζαηήνδζδ ηςκ GSCs ηαζ ηςκ απμβυκςκ ημοξ (Tazuke, Schulz et al. 2002). Σα ηφηηανα ηάθορδξ νοειίγμοκ επίζδξ ηα GSCs, ιέζς ζδιαημδμηχκπνςηεσκχκ πμο εηηνίκμοκ, εζδζηυηενα ηδ Decapentaplegic (Dpp), ημ μιυθμβμ ηςκ ιμνθμβυκςκ ηςκ μζηχκ (BMP) 2/4 ζηδ Drosophila (Xie and Spradling 2000). Σμ Dpp είκαζ απαναίηδημ βζα ηδ δζαηήνδζδ ηςκ GSCs ζε ιζα αδζαθμνμπμίδηδ ηαηάζηαζδ (McKearin and Spradling 1990; Ohlstein and McKearin 1997; Xie and Spradling 1998; Chen and McKearin 2003; Song, Wong et al. 2004). Ζ niche νοειίγεζ ημοξ ανζειμφξ ηυζμ ηςκ πνμβυκςκ ηοηηάνςκ ηςκ GSCs υζμ ηαζ ηςκ ζοκμδεοηζηχκ ηοηηάνςκ ιέζς ημο Jak/ημο STAT (Janus ηζκάζδ/ιεηαβςβέαξ ζήιαημξ ηαζ εκενβμπμζδηέξ ιεηαβναθήξ) ιμκμπαηζμφ. Ακηίεεηα, ηα GSCs νοειίγμοκ ημκ ανζειυ ηαζ ηδ θεζημονβία ηςκ ηοηηάνςκ ηάθορδξ ιέζς ημο ζδιαημδμηζημφ ιμκμπαηζμφ Delta-Notch (Ward, Shcherbata et al. 2006; Song, Call et al. 2007). Έηημπδ έηθναζδ ηςκ Delta ηαζ Notch πνςηεσκχκ μδδβεί ζημκ έηημπμ ζπδιαηζζιυ ηοηηάνςκ ηάθορδξ ηα μπμία είκαζ επανηή βζα ηδ δζαηήνδζδ ηςκ GSCs ιέζς ηδξ ημπζηήξ ζδιαημδυηδζδξ ημο Dpp (Song, Call et al. 2007). Καηά ζοκέπεζα, δ 42

54 ιεηαβςβή ζήιαημξ απυ ηα GSC οπμηζκεί ηδ niche ηςκ ζςιαηζηχκ ηοηηάνςκ κα πανάβεζ πνμσυκηα βζα ηδ δζαηήνδζδ ηςκ αθαζημηοηηάνςκ (Ward, Shcherbata et al. 2006) Βθαζηζηά εοθαηζμηφηηανα Ζ παναβςβή ηυζμ ηςκ βαιεηζηχκ ηοηηάνςκ υζμ ηαζ ηςκ εοθαηζμηοηηάνςκ νοειίγεηαζ ηαζ ζοκημκίγεηαζ απυ ηα αθαζημηφηηανα ημο βενιάνζμο. Σα εοθαηζμηφηηανα πνμένπμκηαζ απυ 2-3 ζςιαηζηά πνυδνμια ηφηηανα, ζηα μπμία ηαθμφιε πνυδνμια εοθαηζμηφηηανα (FCSCs) (Bolivar, Pearson et al. 2006). Σα FCSCs ανίζημκηαζ 2-5 δζάιεηνμζ ηοηηάνςκ ιαηνζά απυ ηα ηφηηανα ηάθορδξ ηαζ ηα ηφηηανα ηεθζηήξ ίκαξ, ηα μπμία δζαηδνμφκ ηα FCSCs ιε ηδκ παναβςβή Hh, Wingless (WG), ηαζ Dpp (Forbes, Lin et al. 1996; Zhang and Kalderon 2001; Song and Xie 2003; Kirilly, Spana et al. 2005). Όπςξ ηα GSCs ηαζ ηα FCSCs είκαζ αναπφαζα εάκ δεκ ιπμνμφκ κα ακηαπμηνζεμφκ ζηα BMP ζήιαηα (Kirilly, Spana et al. 2005). Σμ Hh νοειίγεζ ημκ ανζειυ ηςκ FCSCs (Forbes, Lin et al. 1996; Zhang and Kalderon 2001), εκχ ημ Wg νοειίγεζ ημκ πμθθαπθαζζαζιυξ ηαζ ηδ δζαθμνμπμίδζδ ημοξ (Song and Xie 2003). Λίβα εζςηενζηά ηφηηανα ημο βενιανζαημφ εθφηνμο ανίζημκηαζ ιεηαλφ ηςκ ηοηηάνςκ ηάθορδξ ηαζ ηςκ FCSCs. Οζ DE-Cadherin ηαζ armadillo εκημπίγμκηαζ έκημκα ζηδκ επζθάκεζα επαθήξ ιεηαλφ ηςκ FCSCs ηαζ ηςκ εζςηενζηχκ ηοηηάνςκ ημο βενιανζαημφ εθφηνμο, ηαζ είκαζ απαναίηδηεξ βζα ηδ ιαηνμπνυεεζιδ δζαηήνδζδ ηςκ FCSCs (Song and Xie 2002). Ο νυθμξ ηςκ ζοκδέζεςκ γχκδξ ηυζμ βζα ηα GSCs υζμ ηαζ βζα ηα FCSCs παναιέκεζ αζαθήξ: ιπμνμφκ κα ιεηαδχζμοκ δμιζηυ ή εηηαηυ ζήια, ή ιπμνμφκ κα ηναηήζμοκ ηα πνυδνμια ηφηηανα ιίζπςκ ημκηά ζηδ niche. Γζαηάναλδ ζημ ζοκημκζζιέκμ πμθθαπθαζζαζιυ ηςκ GSCs ηαζ ηςκ FCSCs μδδβεί ζε εθαηηςιαηζηή ακάπηολδ ηςκ ςμεοθαηίςκ (Forbes, Lin et al. 1996). Όηακ ηα ηφηηανα ηδξ niche είκαζ ιεηαθθαβιέκα βζα Yb, ηα FCSCs είκαζ θζβυηενα ηαζ ηα GSCs ελαθακίγμκηαζ, εκχ δ οπενέηθναζδ ηδξ Yb αολάκεζ ημκ ανζειυ ηαζ ηςκ δφμ πθδεοζιχκ (King and Lin 1999; King, Szakmary et al. 2001) Πνυδνμια εοθαηζμηφηηανα ηαζ ζπδιαηζζιυξ ςμεοθαηίμο Ζ ιεηακάζηεοζδ ηςκ πνυδνμιςκ εοθαηζμηοηηάνςκ πνμξ ημ εζςηενζηυ δζαπςνίγεζ ηζξ ιειμκςιέκεξ βαιεηζηέξ ηφζηεζξ ζε ςμεοθάηζα. Αοηή δ δζαδζηαζία 43

55 πενζθαιαάκεζ ημκ ηαεμνζζιυ ηνζχκ ηφπςκ εοθαηζμηοηηάνςκ: πμθζηά ηφηηανα, ιζζπμεζδή ηφηηανα ηαζ ηα επζεδθζαηά εοθαηζμηφηηανα Πνμ-πμθζηά ηφηηανα ηαζ μ δζαπςνζζιυξ ηςκ ηφζηεςκ Μζα πμθοηθςκζηή μιάδα πνυδνμιςκ εοθαηζμηοηηάνςκ ιεηακαζηεφεζ ακάιεζα ζηζξ ηφζηεζξ, ζηαιαηά κα δζαζνείηαζ ηαζ ιεηαηνέπμκηαζ ζε πνμ-πμθζηά ηφηηανα, δδιζμονβχκηαξ ηδ βεκεά ηςκ πμθζηχκ/ιζζπμεζδχκ ηοηηάνςκ (Tworoger, Larkin et al. 1999). Αοηή δ ιεηακάζηεοζδ απαζηεί ηδ ζδιαημδυηδζδ ημο Hedgehog (Hh) ιέζς ημο Fused-ελανηχιεκμο ιμκμπαηζμφ (Besse, Busson et al. 2002). Ζ α-ζκηεβηνίκδ είκαζ απαναίηδηδ ζηα πνυδνμια εοθαηζμηφηηανα χζηε κα ηα ειπμδίζεζ απυ ημ κα ιεηακαζηεφζμοκ ζημ εζςηενζηυ ηδξ ηφζηδξ (Bolivar, Pearson et al. 2006). Ζ δζαθμνμπμίδζδ ηςκ πνμ-πμθζηχκ ηοηηάνςκ ζε πμθζηά ηαζ ιζζπμεζδή ηφηηανα δζαηδνεί ημ δζαπςνζζιυ ηςκ ςμεοθαηίςκ. Ζ επζθμβή ηδξ ηοηηανζηήξ ιμίναξ ηςκ πμθζηχκ ηοηηάνςκ απαζηεί έκα Delta ζήια απυ ηα βαιεηζηά ηφηηανα βζα κα οπμηζκήζεζ ηδ δνάζδ ημο Notch ζηα πνμπμθζηά ηφηηανα. Ο Notch οπμδμπέαξ έπεζ δφμ ιεανακμζοκδευιεκμοξ πνμζδέηεξ, ημοξ Delta ηαζ Serrate. Ζ βθοημζοθ-ηνακζθενάζδ Fringe μδδβεί ζηδ δέζιεοζδ ημο Delta απυ ημ Notch (Fleming, Gu et al. 1997; Panin, Papayannopoulos et al. 1997; Moloney, Panin et al. 2000; Okajima, Xu et al. 2003). H Fringe εηθνάγεηαζ ζηα πνμπμθζηά ηφηηανα πμο πανειαάθθμκηαζ ιεηαλφ ηςκ ηφζηεςκ ηαζ ηαεμνίγεζ ηδκ ζζμννμπία ιεηαλφ ηςκ πμθζηχκ ηαζ ηςκ ιζζπμεζδχκ ηοηηάνςκ (Grammont and Irvine 2001). Κακέκα πμθζηυ ηφηηανμ δε ζπδιαηίγεηαζ πςνίξ ηδ Fringe,εκχ αολδιέκα επίπεδα ηδξ Fringe αολάκεζ ημκ ανζειυ ημοξ. Μςζασηά εοθαηζμηφηηανα βζα Notch ιεηαθθάβιαηα ακαπηφζζμκηαζ ηακμκζηά υπμηε ηα πμθζηά ηφηηανα είκαζ αβνίμο ηφπμο. Ζ απμοζία ημο Delta απυ ηα βαιεηζηά ηφηηανα ζοκδέεηαζ ιε ηδκ απμοζία πμθζηχκ ηοηηάνςκ ηαζ ιε πμθοηοζηζηά ςμεοθάηζα (Ruohola, Bremer et al. 1991; Larkin, Holder et al. 1996; Gonzalez-Reyes and St Johnston 1998; Keller Larkin, Deng et al. 1999). Καηά ζοκέπεζα, ηα πμθζηά ηφηηανα είκαζ απαναίηδηα βζα ημ δζαπςνζζιυ ηςκ ηφζηεςκ ζε ιειμκςιέκα ςμεοθάηζα. Μζα θεζημονβία βζα ηα πμθζηά ηφηηανα είκαζ κα ηαεμνίζμοκ ηα ιζζπμεζδή ηφηηανα. Σα πνμ-πμθζηά ηφηηανα ιεηαλφ ηςκ ςμεοθαηίςκ ζηαδίςκ 1&2 επάβμκηαζ κα ηαεμνίζμοκ ηα ιζζπμεζδή ηφηηανα ιέζς ημο Delta πνμζδέηδ απυ ηα πνυζεζα πμθζηά ηφηηανα ημο ςμεοθαηίμο ζηαδίμο (Torres, Lopez-Schier et al. 2003). Σα δζαθμνεηζηά επίπεδα εκενβμπμίδζδξ ημο Notch δζαηνίκμοκ ηδκ ηοηηανζηή ιμίνα ηςκ 44

56 πμθζηχκ απυ αοηή ηςκ ιζζπμεζδχκ ηοηηάνςκ. ηα πμθζηά ηφηηανα, δ ιεηαθθμπνςηεάζδ kuzbanian-like ιεζχκεζ ημ ζήια ημο Delta βζα κα επάβεζ ημ ηαεμνζζιυ ηςκ ιζζπμεζδχκ ηοηηάνςκ (Assa-Kunik, Torres et al. 2007). Ζ οπενέηθναζδ είηε ημο Notch ημο Delta ζηα εοθαηζμηφηηανα μδδβεί ζε ακχιαθα ιαηνζμφξ ιίζπμοξ ιεηαλφ ηςκ ςμεοθαηίςκ (Larkin, Holder et al. 1996). Δπζπθέμκ ζήιαηα δζαιμνθχκμοκ ηδ δζαθμνμπμίδζδ ηςκ πμθζηχκ ηαζ ιζζπμεζδχκ ηοηηάνςκ. Ζ Upd/Jak-STAT ζδιαημδυηδζδ είκαζ απαναίηδηδ βζα ηα ιζζπμεζδή ηφηηανα, υηακ ηα εοθαηζμηφηηανα δεκ ιπμνμφκ κα απμηνζεμφκ ζημ Upd, ζπδιαηίγμκηαζ οπεναμθζηά ιεβάθμξ ανζειυξ πμθζηχκ ηοηηάνςκ (Baksa, Parke et al. 2002; McGregor, Xi et al. 2002). Ζ ζεζνζαηή μνβάκςζδ ηςκ ιζζπμεζδχκ ηοηηάνςκ ιίζπςκ απαζηεί Hh ζδιαημδυηδζδ ιέζς ημο Fused, ιζζπμεζδή ηφηηανα πςνίξ Fused δζαθμνμπμζμφκηαζ ζπδιαηίγμκηαξ ζοζηάδα ηοηηάνςκ (Besse, Busson et al. 2002). Ακηίεεηα, δ Fused-ακελάνηδηδ ζδιαημδυηδζδ ημο μδδβεί ζηδ ιεηαηνμπή ηςκ πνμπμθζηχκ ηοηηάνςκ ζε πμθζηά ηφηηανα (Besse and Pret 2003). Αηυιδ ηαζ ακάιεζα ζηα επζεδθζαηά εοθαηζμηφηηανα, δ εηημπζηή δνάζδ ημο Hh ιπμνεί κα πνμηαθέζεζ ηα εηημπζηά πμθζηά ηφηηανα (Forbes, Lin et al. 1996), ηαηαζηέθθμκηαξ έκα βμκίδζμ πμο ηαεμνίγεζ ηδκ επζεδθζαηή ηοηηανζηή ιμίνα ηςκ εοθαηζμηοηηάνςκ (Bai and Montell 2002) πδιαηζζιυξ ημο εοθαηχδμοξ επζεδθίμο Ζ ανπζηή εκεοθάηςζδ ηςκ βαιεηζηχκ ηφζηεςκ πενζθαιαάκεζ ιζα ιεζεβποιαηζηή ζε επζεδθζαηή ιεηάααζδ. Σα ιεζεβποιαηζηά πνυδνμια εοθαηζμηφηηανα δζαζνμφκηαζ ιενζηέξ θμνέξ αηυιδ, ηαηυπζκ πενζηθείμοκ ημ ςμεοθάηζμ ιέζα ζημ εοθαηχδεξ επζεήθζμ (Margolis and Spradling 1995; Tworoger, Larkin et al. 1999). Γζαθμνζηή πνμζηυθθδζδ, ιέζς ηδξ μπμίαξ μζ ζζημί ακαδζμνβακχκμκηαζ αθθάγμκηαξ ηδκ πνυζθοζή ημοξ ιε ημοξ βείημκέξ ημοξ (Steinberg 2007), ηαηεοεφκεζ πμθθέξ απυ ηζξ ακαδζμνβακχζεζξ ηςκ εοθαηζμηοηηάνςκ ηαηά ηδ δζάνηεζα ηδξ ςμβέκεζδξ. Ζ DE-Cadherin δζαιεζμθααεί ηδκ πνμζηυθθδζδ ηςκ πνυδνμιςκ εοθαηζμηοηηάνςκ ζηα βαιεηζηά ηφηηανα ηαηά ηδ δζάνηεζα ημο ζπδιαηζζιμφ ημο επζεδθίμο. Σα πνμ-πμθζηά ηφηηανα δζαηδνμφκ ηδ ζπεηζηή εέζδ ημο ςμηοηηάνμο ζημ μπίζεζμ ηιήια ημο ςμεοθαηίμο ιέζς πζμ ορδθχκ επζπέδςκ DE- Cadherin (Oda, Uemura et al. 1997; Godt and Tepass 1998; Gonzalez-Reyes and St Johnston 1998; Wandall, Pedersen et al. 2003). 45

57 Μενζηά βμκίδζα ηδξ μιάδαξ Polycomb (PcG) πνμςεμφκ ηδ δζαθμνμπμίδζδ ηυζμ ηςκ πνμ-πμθζηχκ υζμ ηαζ ηςκ επζεδθζαηχκ εοθαηζμηοηηάνςκ ηαηά ημ ζπδιαηζζιυ ημο ςμεοθαηίμο (Narbonne, Besse et al. 2004). Δπεζδή μζ πνςηεΐκεξ PcG δζαιεζμθααμφκ ηδ ζίβαζδ βμκζδίςκ ηαζ ακαδζαιυνθςζδ ηδξ πνςιαηίκδξ (Muller and Kassis 2006), είκαζ θμβζηυ ηακείξ κα οπμεέζεζ υηζ αοηέξ μζ δομ βεκεέξ ηαεμνίγμκηαζ αιεηάηθδηα ζημ βενιάνζμ. Δκημφημζξ, δ επαβυιεκδ έηθναζδ μνζζιέκςκ ζδιάηςκ, υπςξ Hh (Forbes, Lin et al. 1996; Bai and Montell 2002) ή Delta (Assa-Kunik, Torres et al. 2007), ιπμνμφκ κα ιεηαηνέρμοκ άςνα επζεδθζαηά εοθαηζμηφηηανα ζε πμθζηά ηφηηανα. Καηά ζοκέπεζα, ιζα ααειζαία δζαθμνμπμίδζδ ηςκ πμθζηχκ ηοηηάνςκ ηαζ ηςκ επζεδθζαηχκ εοθαηζμηοηηάνςκ είκαζ έκα πζεακυηενμ ζεκάνζμ Χνίιακζδ ηςκ πμθζηχκ ηοηηάνςκ Σα πμθζηά ηφηηανα εκημπίγμκηαζ ζηα πνυζεζα ηαζ μπίζεζα άηνα ηςκ ςμεοθαηίςκ (Δηθ.3) (Ruohola, Bremer et al. 1991) ηαζ μνβακχκμοκ ηδκ ηοηηανζηή ιμίνα ηςκ εοθαηζμηοηηάνςκ ηαηά ηδ δζάνηεζα ηδξ ςμβέκεζδξ. Πανέπμοκ ηα ζήιαηα βζα ηδ δζαιυνθςζδ ηςκ αλυκςκ ζημ έιανομ, δδιζμονβμφκ έκα άκμζβια βζα ηδκ είζμδμ ημο ζπένιαημξ, ηαζ μνβακχκμοκ ελεζδζηεοιέκεξ πενζμπέξ ημο πμνίμο μζ μπμίεξ εεςνείηαζ υηζ εκζζπφμοκ ηδκ ειανοζηή επζαίςζδ (Tworoger, Larkin et al. 1999; Zhang and Kalderon 2001; Beccari, Teixeira et al. 2002; Grammont and Irvine 2002; Besse and Pret 2003; Xi, McGregor et al. 2003). Ανπζηά, δζαηνίεδηακ απυ ηα επζεδθζαηά εοθαηζμηφηηανα απυ ηδκ έηθναζή εκυξ neutralized-reporter (Ruohola, Bremer et al. 1991). Καηά ηδ δζάνηεζα ηςκ ζηαδίςκ 1 ηαζ 2, ηυζμ ηα πμθζηά ηφηηανα υζμ ηαζ ηα επζεδθζαηά εοθαηζμηφηηανα εηθνάγμοκ ζε ορδθά επίπεδα ηδ Fasciclin ΗΗΗ (Fas3), έκα μιμθοθζηυ ιυνζμ πνμζηυθθδζδξ (Snow, Bieber et al. 1989), ζηζξ πθεονζηέξ ιειανάκεξ ημοξ. Σα πμθζηά ηφηηανα δζαηδνμφκ ορδθά ηα επίπεδα ηδξ FasΗΗΗ ηαεχξ δ ςμβέκεζδ πνμπςνά (Δηθ.4). Ανπζηά, μζ ζοζηάδεξ πενίπμο 3-5 πμθζηχκ ηοηηάνςκ εκχκμοκ ηα άηνα ηάεε ςμεοθαηίμο (Besse and Pret 2003). Καηά ηδ δζάνηεζα ηςκ ζηαδίςκ 2-5, ηα οπενάνζεια πμθζηά ηφηηανα οπμαάθθμκηαζ ζε απυπηςζδ, παναιέκμκηαξ ιυκμ δφμ ζε ηάεε ζοζηάδα. Καηά ηδ δζάνηεζα ηςκ ζηαδίςκ 6-8, ηα πμθζηά ηφηηανα βίκμκηαζ ζηνμββοθεοιέκα, ακαδζμνβακχκμοκ ηζξ πνςηεΐκεξ ηςκ ζοκδέζεςκ γχκδξ ηαζ οπμαάθθμκηαζ ζε πανμδζηή αηναία ηάθορδ ηςκ πνςηεσκχκ ηδξ ααζζηήξ ιειανάκδξ, ηαζ απμημθθμφκηαζ απυ ηδ ααζζηή ιειανάκδ (Ruohola, Bremer et al. 1991; Peifer, Orsulic et al. 1993; Medioni and Noselli 2005). Καηά ζοκέπεζα, δ ςνίιακζδ ηςκ 46

58 πμθζηχκ ηοηηάνςκ πενζθαιαάκεζ ιζα πνμμδεοηζηή απχθεζα ηςκ επζεδθζαηχκ παναηηδνζζηζηχκ βκςνζζιάηςκ ηςκ ηοηηάνςκ Χνίιακζδ ηςκ επζεδθζαηχκ εοθαηζμηοηηάνςκ Έκαξ απυ ημοξ πζμ πνυςνμοξ δείηηεξ βζα ηδ ηαοημπμίδζδ ηςκ επζεδθζαηχκ εοθαηζμηοηηάνςκ είκαζ ημ Eyes absent (Eya) (Bai and Montell 2002), ιζα θςζθαηάζδ πμο δεζιεφεηαζ ζημ DNA (Tootle, Silver et al. 2003; Jemc and Rebay 2007). Σμ Eya ηαηαζηέθθεζ ηδκ ηοηηανζηή ιμίνα ηςκ πμθζηχκ ηαζ ιζζπμεζδχκ ηοηηάνςκ, επζεδθζαηά ηφηηανα πμο δεκ εηθνάγμοκ Eya ζπδιαηίγμοκ έηημπα πμθζηά ηφηηανα, εκχ δ οπενέηθναζδ ημο Eya απμηνέπεζ ή ηαεοζηενεί ηδ δζαθμνμπμίδζή ημοξ. Ο ιεηαβςβέαξ interruptis Cubitus (CI) ημο Hh ιπμνεί κα εκζζπφζεζ ηδκ απυθαζδ ιεηαλφ ηδξ ηοηηανζηήξ ιμίναξ ηςκ πμθζηχκ ηοηηάνςκ ηαζ ηςκ επζεδθζαηχκ ηοηηάνςκ. Σμ extra machrochaetae (EMC), απαζηείηαζ ζηα επζεδθζαηά εοθαηζμηφηηανα βζα ηδκ έηθναζδ ημο Eya, ηαζ βζα άθθεξ πηοπέξ ηδξ ςνίιακζήξ ημοξ (Adam and Montell 2004). Σμ EMC ειπμδίγεζ ηδ ιεηαβναθζηή δνάζδ ααζζηχκ πνςηεσκχκ έθζηα-εδθζάέθζηα helix-loop-helix, υπςξ ηα μιυθμβά ημο ζηα εδθαζηζηά, μζ Id πνςηεΐκεξ (Ellis, Spann et al. 1990; Garrell and Modolell 1990). Σμ EMC ακζπκεφεηαζ ζηα πνυδνμια εοθαηζμηφηηανα, αθθά δεκ ακζπκεφεηαζ ζηα πμθζηά ηφηηανα ή ζηα ιζζπμεζδή ανπήξ βεκμιέκδξ απυ ημ ζηάδζμ 2. Δθθείρεζ ημο EMC, ηα επζεδθζαηά εοθαηζμηφηηανα ζοκεπίγμοκ κα εηθνάγμοκ ηδ FasΗΗΗ ζε ορδθά επίπεδα, ηαζ δεκ ζηαιαημφκ. Σα επζεδθζαηά εοθαηζμηφηηανα παφμοκ κα δζαζνμφκηαζ ζημ ηέθμξ ημο ζηαδίμο 6, ηαζ ιπαίκμοκ ζε έκα ηνμπμπμζδιέκμ ηοηηανζηυ ηφηθμ υπμο ημ DNA ακηζβνάθεηαζ πςνίξ ηοηηανμδζαίνεζδ (Lopez-Schier and St Johnston 2001). Σμ Hh ημ μπμίμ ζδιαημδμηεί ιέζς ημο εκενβμπμζδιέκμο CI πνμάβεζ ημκ πμθθαπθαζζαζιυ ηςκ εοθαηζμηοηηάνςκ (Forbes, Lin et al. 1996; Zhang and Kalderon 2001). Σμ Delta ζηα βαιεηζηά ηφηηανα ηαζ ημ Notch ζηα εοθαηζμηφηηανα απαζημφκηαζ βζα ηδ ιεηάααζδ απυ ημοξ ιζηςηζημφξ ηφηθμοξ ζηδκ εκδμ-ακηζβναθή. Σμ Notch εκενβμπμζεί αοηή ηδ ιεηάααζδ (Sun and Deng 2007). Αοηή δ αθθαβή ζημκ ηφηθμ ηοηηάνςκ ηαθείηαζ ιενζηέξ θμνέξ δ ανπή ηδξ δζαθμνμπμίδζδξ, ή δ ιεηάααζδ απυ ηα ακχνζια ζηα δζαθμνμπμζδιέκα εοθαηζμηφηηανα (Lopez-Schier and St Johnston 2001; Roth 2001; Sun and Deng 2007). Ta επζεδθζαηά εοθαηζμηφηηανα ανπίγμοκ κα δζαθμνμπμζμφκηαζ απυ ημ ζηάδζμ 2, ιε ηδκ πνμμδεοηζηή ιεζμννφειζζδ ηδξ FasΗΗΗ. 47

59 Καηά ηδ δζάνηεζα ηςκ ζηαδίςκ 7-9, ηα εοθαηζμηφηηανα μθμηθδνχκμοκ ηνεζξ ηφηθμοξ εκδμ-ακηζβναθήξ (Edgar and Orr-Weaver 2001), δ επαηυθμοεδ πμθοπθμεζδία είκαζ απαναίηδηδ βζα ημ ηεθζηυ ιέβεευξ ημοξ (Deng, Althauser et al. 2001; Lopez-Schier and St Johnston 2001). Σμ Myc ηδξ Drosophila απαζηείηαζ βζα ηδκ εκδμ-ακηζβναθή ηαζ ηδκ επαηυθμοεδ αφλδζδ (Maines, Stevens et al. 2004). Όπςξ ζε άθθμοξ ζζημφξ, δ ηζκάζδ Akt απαζηείηαζ βζα ημ ηακμκζηυ ιέβεεμξ ηςκ εοθαηζμηοηηάνςκ ηαζ ημ PTEN πενζμνίγεζ ηδκ αφλδζδ ημο ιεβέεμοξ (Stocker and Hafen 2000; Cavaliere, Donati et al. 2005; Ruggero and Sonenberg 2005) πδιαηζζιυξ ηςκ πενζμπχκ ημο πθαηχδμοξ ηαζ ημο ηοθζκδνζημφ εοθαηχδμοξ επζεδθίμο Σα εοθαηζμηφηηανα ημο ηονίςξ ζχιαημξ ιεηακαζηεφμοκ πνμξ ημ μπίζεζμ ηιήια βζα κα ηαθφρμοκ ημ ςμηφηηανμ. Αοηή δ ακαδζμνβάκςζδ πενζθαιαάκεζ ημ ζπδιαηζζιυ εκυξ πθαηχδμοξ επζεδθίμο απυ ηα ηεθζηά πνυζεζα εοθαηζμηφηηανα ηαζ έκα ηοθζκδνζηυ απυ ηα εοθαηζμηφηηανα ημο ηονίςξ ζχιαημξ ηαζ ηςκ ηεθζηχκ μπίζεζςκ εοθαηζμηοηηάνςκ. ηδκ ανπή ημο ζηαδίμο 10, ημ υνζμ βζα ηα πθαηχδδ ηαζ ηα ηοθζκδνζηά εοθαηζμηφηηανα εοεοβναιιίγεηαζ ιε ηδκ επζθάκεζα επαθήξ ημο ςμηοηηάνμο ιε ηα ηνμθζηά ηφηηανα. Σμ ηοθζκδνζηυ επζεήθζμ είκαζ έκα εηηνζηζηυ επζεήθζμ, ημ μπμίμ ηαηαεέηεζ δζαδμπζηά ζοζηαηζηά ημο πμνίμο. Πενίπμο 50 ηεθζηά εοθαηζμηφηηανα ηεκηχκμκηαζ ηαζ πθαηαίκμοκ βζα κα ηαθφρμοκ ηα ηνμθζηά ηφηηανα. Αοηά ηα ηεκηςιέκα ηφηηανα ηαθμφκηαζ επίζδξ εοθαηζμηφηηανα ηνμθζηχκ ηοηηάνςκ (nurse cell FCs) ή πθαηχδδ εοθαηζμηφηηανα. Σα ηεθζηά εοθαηζμηφηηανα εα πθαηφκμοκ εηηυξ ακ επαπεεί μπίζεζα ηαοηυηδηα ιέζς ηδξ δνάζδξ ημο EGFR (Gonzalez-Reyes, Elliott et al. 1995; Roth, Neuman- Silberberg et al. 1995). Δκημφημζξ, απμοζία ημο EGFR δεκ είκαζ ανηεηή βζα ηδκ πθάηοκζδ, μπίζεζα εοθαηζμηφηηανα πμο οπμθείπμκηαζ ηδξ δνάζδξ ημο EGFR βίκμκηαζ ηοθζκδνζηά εκχ εηθνάγμοκ πνυζεζμοξ δείηηεξ. Ζ ζοζημθή ηδξ αηναίαξ επζθάκεζαξ είκαζ ζδιακηζηή χζηε ηα ηοαμεζδή εοθαηζμηφηηανα κα βίκμοκ ηοθζκδνζηά, αοηυ απαζηεί ημ karst, ημ βμκίδζμ βζα ηδκ ημνοθαία α Heavy -Spectrin (α Ζ ) (Zarnescu and Thomas 1999). Σα εοθαηζμηφηηανα ημο ηονίςξ ζχιαημξ πμο οπμθείπμκηαζ α Heavy - Spectrin δε ιεηακαζηεφμοκ βζα κα επζηαθφρμοκ ημ ςμηφηηανμ, ιενζηά ηαεοζηενμφκ πάκς απυ ηα ηνμθζηά ηφηηανα. Αοηυ οπμδδθχκεζ υηζ δ μπίζεζα ιεηακάζηεοζδ μδδβείηαζ εκ ιένεζ απυ ηδ ζοιπίεζδ ηαεχξ ηα ηφηηανα βίκμκηαζ ηοθζκδνζηά. 48

60 Γζαηήνδζδ ημο εοθαηχδμοξ επζεδθίμο Πμθθμί πανάβμκηεξ επδνεάγμοκ ηδ δζαηήνδζδ ημο ιμκυζημζαμο επζεδθίμο, ζοιπενζθαιαακμιέκςκ ηςκ ηοηηανζηχκ ζοκδέζεςκ, ηδκ αηναίμ-ααζζηή πμθζηυηδηα ηςκ ηοηηάνςκ, ηαζ ηδκ πνμζηυθθδζδ ηςκ ηοηηάνςκ ζημ ελςηοηηάνζμ οθζηυ (ECM). Απχθεζα ηςκ ζοκδέζεςκ γχκδξ (adherens junctions), θυβς ιεηαθθάλεςκ ζημ βμκίδζμ armadillo, δζαηανάζζεζ ημ ιειανακζηυ ηοηηανμζηεθεηυ, ιε ζοκέπεζα ηδκ ακχιαθδ ιμνθμθμβία ηςκ εοθαηζμηοηηάνςκ ηαζ ημκ εηθοθζζιυ ηςκ ςμεοθαηίςκ (Tanentzapf, Smith et al. 2000). Μενζημί ιδπακζζιμί πμο απαζημφκηαζ βζα ημκ ανπζηυ ζπδιαηζζιυ ημο επζεδθίμο ζημ βενιάνζμ απαζημφκηαζ επίζδξ ηαζ βζα ηδ δζαηήνδζδ ημο ιμκυζημζαμο παναηηήνα ημο επζεήθζμο, ζδζαίηενα απαζηείηαζ δ Notch ζδιαημδυηδζδ. Σα εοθαηζμηφηηανα είκαζ πμθςιέκα ηφηηανα, ιε δζαθμνζηή ηαηακμιή ηςκ ιειανακζηχκ πνςηεσκχκ ηαηά ιήημξ ημο αηναίμ-ααζζημφ άλμκα (Knust 2000; Tepass, Tanentzapf et al. 2001; Knust 2002; Horne-Badovinac and Bilder 2005). Γζαηαναπή ζε δζαθμνεηζηά ζφιπθμηα αηναίμ-ααζζηήξ πμθζηυηδηαξ έπεζ δζαθμνεηζηέξ ζοκέπεζεξ. Πνχζιδ απχθεζα ημο αηναίμο ηαεμνζζηή Crumbs μδδβεί ζε πμθφζημζαμ επζεήθζμ ή ζε ζπδιαηζζιυ αζοκεπεζχκ ζημ επζεήθζμ (Tanentzapf, Smith et al. 2000), ςζηυζμ αθμφ ζπδιαηζζηεί ημ επζεήθζμ, ημ Crumbs δεκ είκαζ πθέμκ απαναίηδημ βζα ημκ ζζηυ. Ακηίεεηα, δ απχθεζα ααζμ-πθεονζηχκ πνςηεσκχκ έπεζ ζδιακηζηέξ ζοκέπεζεξ βζα ηδκ αηεναζυηδηα ημο επζεδθίμο. Θοθαηζμηφηηανα ιεηαθθαβιέκα βζα dics large (dlg) εζζαάθθμοκ ακάιεζα ζηα βαιεηζηά ηφηηανα ηαζ οπεν-πμθθαπθαζζάγμκηαζ ζηζξ πενζμπέξ ηςκ πυθςκ (Goode and Perrimon 1997; Bilder, Li et al. 2000; Goode, Wei et al. 2005). Σα εοθαηζμηφηηανα πμο ζηενμφκηαζ είηε Scribble είηε Lethal giant larvae (Lgl) πανμοζζάγμοκ ημκ ίδζμ θαζκυηοπμ (Bilder, Li et al. 2000), βεβμκυξ πμο ένπεηαζ ζε ζοιθςκία ιε ηδ θεζημονβία ημοξ ςξ αθθδθμελανηχιεκμ πνςηεσκζηυ ζφιπθμημ. Ζ αηναία πνςηεΐκδ Bazooka απαζηείηαζ βζα ηδκ ηοηηανζηή εζζαμθή ζηα ιεηαθθάβιαηα βζα dlg ειπθέημκηαξ ηδκ αηναία πενζμπή ζηδ δζαδζηαζία ηδξ πανεηηθίκμοζα πνμζηυθθδζδ ιεηαλφ εοθαηζμηοηηάνςκ ηαζ βαιεηζηχκ ηοηηάνςκ (Abdelilah- Seyfried, Cox et al. 2003; Bilder 2004). Καηά ηνυπμ εκδζαθένμκηα, μζ ακενχπζκεξ ααζμ-πθεονζηέξ πνςηεΐκεξ, υπςξ ημ Dlg1, ειπθέημκηαζ ζηδκ μβημβέκεζδ (Fuja, Lin et al. 2004). Ζ ηοηθμθμνία ηςκ πνςηεσκχκ (protein trafficking) είκαζ απαναίηδηδ βζα ηδκ αηναίμ-ααζζηή πμθζηυηδηα, ιέζς ηδξ ζημπμεέηδζδ πνςηεσκχκ ζε ζοβηεηνζιέκεξ εκδμηοηηανζηέξ εέζεζξ. Γφμ ηονίανπα ζοζηαηζηά ημο ιδπακζζιμφ ηδξ ηοηθμθμνίαξ ηςκ ηοζηζδίςκ, δ syntaxin (Avl) ηαζ δ πνςηεΐκδ Rab (Rab5) απαζημφκηαζ ζηδ 49

61 δζαηήνδζδ ηδξ αηεναζυηδηαξ ημο επζεδθίμο. Απχθεζα ηαεειίαξ απυ αοηέξ ηζξ δομ πνςηεΐκεξ μδδβεί ζηδ ζοζζχνεοζδ ιειανακζηχκ πνςηεσκχκ υπςξ ημο Notch ηαζ ημο Crumbs, ζε απχθεζα ηδξ ηοηηανζηήξ πμθζηυηδηαξ, ηαζ ζε οπένιεηνμ πμθθαπθαζζαζιυ (Lu and Bilder 2005). Ο ιειανακζηυξ ηοηηανμζηεθεηυξ απαζηείηαζ βζα ηδ δζαηήνδζή ηδξ μνβάκςζδξ ηςκ ηεθζηχκ μπίζεζςκ εοθαηζμηοηηάνςκ. Απχθεζα ηδξ α-spectrin μδδβεί ζε πμθφζημζαμ επζεήθζμ ηαζ οπενπθαζία αοηήξ ηδξ πενζμπήξ ημο επζεδθίμο (Lee, Brandin et al. 1997). Ζ πνςηεμβθοηάκδ Perlecan απαζηείηαζ βζα ηδ δζαηήνδζδ ημο ιμκυζημζαμο επζεδθίμο ζε αοηέξ ηζξ εέζεζξ ηαζ ηδκ μνβάκςζδ ηαζ ημκ ηαηάθθδθμ εκημπζζιυ ηςκ πνςηεσκχκ πμθζηυηδηαξ (Schneider, Khalil et al. 2006). Ο οπμδμπέαξ ημο ECM, Dystroglycan, είκαζ απαναίηδημξ βζα ηδ δζαηήνδζδ ηδξ αηναίμ-ααζζηήξ πμθζηυηδηαξ ηςκ μπίζεζςκ εοθαηζμηοηηάνςκ (Deng, Schneider et al. 2003). Οζ ζκηεβηνίκεξ, δζαηδνμφκ ημ επζεήθζμ ζε ιμκυζημζαδ δζεοεέηδζδ ηαεχξ πνμζακαημθίγμοκ ηδκ ηοηηανζηή δζαίνεζδ κα ζοιααίκεζ ζημκ ηάεεημ άλμκα ζε ζπέζδ ιε ημκ αηναζμ-ααζζηυ άλμκα ηςκ εοθαηζμηοηηάνςκ (Fernandez-Minan, Martin- Bermudo et al. 2007). 1.5 Σα ηλίδηα ηάζεο ηεο F-αθηίλεο ζηηο ηληεγθξηληθέο ζπλδέζεηο Πνυζθαηδ ιεθέηδ επζαεααίςζε υηζ μζ ζκηεβηνζκζηέξ δμιέξ ηςκ εοθαηζμηοηηάνςκ πμο ζοκδέμκηαζ ιε ηα ζκίδζα ηάζδξ είκαζ ακάθμβεξ δμιέξ ιε αοηέξ ηςκ ζπμκδοθυγςςκ (Δηθ.9). Πζμ ζοβηεηνζιέκα, έδεζλακ υηζ παναηηδνζζηζηέξ πνςηεΐκεξ ημο ζοκδεμζχιαημξ εκημπίγμκηαζ ζε αοηέξ ηζξ δμιέξ πνυζθοζδξ ηςκ εοθαηζμηοηηάνςκ ζημκ ελςηοηηάνζμ πχνμ. Γζαπίζηςζακ υηζ πνςηεΐκεξ υπςξ paxillin, talin, ILK,PINCH, tensin ηαζ Zasp ήηακ πανμφζεξ, εκχ δ πνυζθαηα παναηηδνζζιέκδ Wech (Loer et al., 2008) δε ανέεδηε ζηζξ εζηζαηέξ εέζεζξ πνμζηυθθδζδξ, ακ ηαζ ζοκεκημπίγεηαζ ιε ηζξ ζκηεβηνίκεξ ηαζ ηδκ ILK ζηα ιζζπμεζδή ηφηηανα, βεβμκυξ πμο οπμδδθχκεζ υηζ δ wech δεκ είκαζ απαναίηδηδ βζα ηδ δνάζδ ηςκ ζκηεβηνζκχκ ηαζ ηδξ ILK ζε υθεξ ηζξ εέζεζξ. Οζ ζκηεβηνζκζηέξ ζοκδέζεζξ ημο εοθαηχδμοξ επζεδθίμο επζηεθμφκ δζαθμνεηζηέξ θεζημονβίεξ ηαηά ηδ δζάνηεζα ηδξ ςμβέκεζδξ. Μάθζζηα δ ζπεηζηή ζφζηαζδ ημο ζοκδεμζχιαημξ δζέθενε ακάθμβα ιε ημ ακαπηολζαηυ ζηάδζμ ημο ςμεοθαηίμο. Σμ εηενμδζιενέξ ηςκ ζκηεβηνζκχκ, ζηα ανπζηά ζηάδζα ηδξ ςμβέκεζδξ, είκαζ ημ α PS1 α PS εκχ ζηα ηεθεοηαία ζηάδζα ιεηαηνέπεηαζ ζε α PS2 α PS. 50

62 Δπίζδξ δ tensin εκημπίγεηαζ ιυκμ ζηα ηεθζηά ζηάδζα ηδξ ςμβέκεζδξ ζηζξ εζηζαηέξ εέζεζξ πνμζηυθθδζδξ υπςξ ζοιααίκεζ ηαζ ζε ηοηηανζηέξ ζεζνέξ. Δηθόλα 9: (Α) Δληνπηζκόο κνξίσλ ηνπ ζπλδενζώκαηνο ηα άθξα ησλ ηληδίσλ ηάζεο σνζπιαθίσλ ηειηθώλ ζηαδίσλ ηεο Drosophila, (B) Θέζεηο εζηηαθήο πξνζθόιιεζεο ζε θύηηαξα ζειαζηηθώλ, ηνμπμπμζδιέκδ απυ (Delon and Brown 2009) Ονβάκςζδ ηαζ πνμζακαημθζζιυξ ηςκ ζκζδίςκ ηάζδξ ηδξ F-αηηίκδξ Ο δμιέξ ηςκ ζκζδίςκ ηάζδξ αηηίκδξ είκαζ ζδζαίηενα δοκαιζηέξ δμιέξ ηαζ ημ πνυηοπμ μνβάκςζδξ ημοξ πανμοζζάγεζ ανηεηή εηενμβέκεζα. Καηά ζοκέπεζα μ αηνζαήξ 51

63 πνμζδζμνζζιυξ ημο πνμηφπμο μνβάκςζδξ ηςκ ζκζδίςκ αηηίκδξ πμζηίθθεζ ηυζμ ιεηαλφ δζαθμνεηζηχκ ζηαδίςκ υζμ ηαζ ιεηαλφ δζαθμνεηζηχκ πεζναιαηζηχκ ζοκεδηχκ ιμκζιμπμίδζδξ ηςκ ςανίςκ. Καηά ημ ακαπηολζαηυ ζηάδζμ 10A, ηα ζκίδζα ηάζδξ είκαζ μνβακςιέκα ηάεεηα ζημκ πνμζεζμ-μπίζεζμ άλμκα ημο ςμεοθαηίμο, πενζαάθθμκηαξ ημ ςμηφηηανμ. ηδ ζοκέπεζα αθθάγμοκ πνμζακαημθζζιυ, ανπζηά, βίκμκηαζ πζμ παπζά ηαζ θζβυηενμ μνβακςιέκα (ζηάδζμ 10B). Δηθόλα 10: Πξνζαλαηνιηζκόο ησλ ηληδίσλ ηάζεο, ηνμπμπμζδιέκδ απυ (Delon and Brown 2009) ημ ζηάδζμ 11, έπμοκ απμηηήζεζ ιζα παναηηδνζζηζηή μνβάκςζδ «αεκηάθζαξ» (fan-shaped organization) πνμζακαημθζζιέκα ηαηά ημκ πνμζεζμ-μπίζεζμ άλμκα, ιεηαημπζζιέκα δδθαδή ηαηά 90 ζε ζπέζδ ιε ημκ πνμδβμφιεκμ πνμζακαημθζζιυ ημοξ, ιε ηδ αάζδ ηδξ «αεκηάθζαξ» κα δείπκεζ πνμξ ημ μπίζεζμ άηνμ ημο ςμεοθαηίμο. Έηζζ ηαθφπημοκ ιεβαθφηενδ επζθάκεζα, ακηακαηθχκηαξ ηαζ ηδκ πθάηοκζδ ημο εοθαηζμηοηηάνμο (Δηθ.10). 52

64 Δηθόλα 11: Αιιαγή πξνζαλαηνιηζκνύ ησλ ηληδίσλ ηάζεο κε de novo ζύλζεζε αθηίλεο, ηνμπμπμζδιέκδ απυ (Delon and Brown 2009) Σεθζηά, ζημ ζηάδζμ 12, ηα ζκίδζα αηηίκδξ βονκμφκ ζημκ ανπζηυ ημοξ πνμζακαημθζζιυ, βίκμκηαζ αηυιδ πζμ παπζά. Ο επακαπνμζακαημθζζιυξ ηςκ ζκζδίςκ ηάζδξ ηδξ αηηίκδξ θαίκεηαζ κα ζοιααίκεζ ιε απμζφκεεζδ ηςκ οπανπυκηςκ ζκζδίςκ αηηίκδξ ηαζ ιε ζφκεεζδ κέςκ ζκζδίςκ, ηαζ υπζ ιε ζηνμθή ηςκ ηοηηάνςκ (Δηθ.11). Αοηυ εκζζπφεηαζ απυ ηδκ παναηήνδζδ υηζ ζηα εκδζάιεζα ζηάδζα δ αηηίκδ ηαζ ζκηεβηνίκεξ εκημπίγμκηαζ ζε έκα εζςηενζηυ ζδιείμ ζηδ ααζζηή πθεονά ηςκ ηοηηάνςκ, ζε εέζδ πμο οπμδδθχκεζ υηζ εα βίκεζ δ αάζδ ηδξ αεκηάθζαξ. 1.6 Σα ζπιαθηνθύηηαξα εκθαλίδνπλ αθξαην-βαζηθή πνιηθόηεηα θαη πνιηθόηεηα θαηά ηνλ επίπεδν άμνλα (planar polarity) Σμ εοθαηχδεξ επζεήθζμ πανμοζζάγεζ παναηηδνζζηζηά πνςημβεκμφξ ηαζ δεοηενμβεκμφξ επζεδθίμο. πδιαηίγεηαζ ιέζς ιεζεβποιαηζηήξ-επζεδθζαηήξ ιεηάααζδξ, υπςξ ηα δεοηενμβεκή επζεήθζα. Καηά ηδ δζάνηεζα αοηήξ ηδξ ιεηάααζδξ, ηα εοθαηζμηφηηανα είκαζ ζε επαθή ιε ηδ ααζζηή ιειανάκδ ηαζ δ ααζζηή πενζμπή αοηχκ ηςκ ηοηηάνςκ ηαεμνίγεηαζ. Οπίζεζα επαθή ιε ηα βαιεηζηά ηφηηανα, ζηδ 2α πενζμπή ημο βενιάνζμο, μδδβεί ζημκ ηαεμνζζιυ ηςκ αηναίςκ ηαζ πθεονζηχκ πενζμπχκ ζηδ ιειανάκδ ηςκ εοθαηζμηοηηάνςκ. Οπυηε, μζ ζοκδέζεζξ γχκδξ (adherens junctions) εκημπίγμκηαζ απυ ημ ζηάδζμ 2. Μέπνζ ημ ζηάδζμ 6, μζ ανπζημί δζαθναβιαημδεζιμί (septate adherens), υπμο εκημπίγεηαζ ημ Discs large (Dlg), ειθακίγμκηαζ ηαζ ιέπνζ ημ ζηάδζμ 10 έπμοκ ζπδιαηζζηεί πθήνςξ (Woods and Bryant 1991). Όπςξ ηα πνςημβεκή επζεήθζα, ημ εοθαηχδεξ επζεήθζμ πανμοζζάγεζ ζοκδέζεζξ γχκδξ (zonula adherens) υπμο μζ Da-catenin ηαζ armadillo (α-catenin) εκημπίγμκηαζ (Peifer, Orsulic et al. 1993; de Cuevas, Lee et al. 1996; Gonzalez-Reyes and St Johnston 1998). ε πζμ αηναία εέζδ απυ ηζξ ζοκδέζεζξ γχκδξ, ζηδκ μνζαηή γχκδ (marginal zone), εκημπίγμκηαζ πνςηεσκζηά ζφιπθμηα υπςξ ημ Crumbs-DPatj-Stardust, ηαζ ημ Bazooka-atypical Protein Kinase (apkc)-dmpar6 (Tepass, Theres et al. 1990; Wodarz, Ramrath et al. 2000). Οζ πθεονζηέξ ααζζηέξ πενζμπέξ ηςκ εοθαηζμηοηηάνςκ ανίζημκηαζ ζε επαθή ιε ελςηοηηάνζμ οθζηυ πθμφζζμ ζε Laminin. Οζ ζκηεβηνζκζημί 53

65 οπμδμπείξ εκημπίγμκηαζ ζηδ ααζμ-πθεονζηή πενζμπή αοηχκ ηςκ ηοηηάνςκ ζε υθα ηα ζηάδζα ηδξ ςμβέκεζδξ (Bateman, Reddy et al. 2001). Δηηυξ απυ ηδκ πθαζιαηζηή ιειανάκδ, μ ηοηηανμζηεθεηυξ ηςκ ιζηνμζςθδκίζηςκ ειθακίγεζ παναηηδνζζηζηά πμθζηυηδηαξ. Σμ δίηηομ ηςκ ιζηνμζςθδκίζηςκ είκαζ πμθςιέκμ ιε ηα (-) άηνα ηςκ ιζηνμζςθδκίζηςκ ζηδκ αηναία πενζμπή (Clark, Jan et al. 1997). Δπίζδξ, ηάπμζα απυ ηα ζοζηαηζηά ημο δζηηφμο ηδξ spectrin έπμοκ δζαθμνζηυ εκημπζζιυ. Έηζζ δ οπμιμκάδα ηδξ a-spectrin ηαηακέιεηαζ μιμζυιμνθα, δ α Ζ -spectrin εκημπίγεηαζ ζηδκ αηναία πενζμπή, ζηζξ ζοκδέζεζξ γχκδξ ηαζ δ α-spectrin εκημπίγεηαζ πθεονζηά (Pesacreta, Byers et al. 1989; Thomas and Kiehart 1994). Έπεζ δεζπεεί υηζ ηάπμζμοξ απυ ημοξ ιάνηονεξ πμθζηυηδηαξ ειπθέημκηαζ ζημ ζπδιαηζζιυ ημο εοθαηχδμοξ επζεδθίμο ηαζ ηδ δζαηήνδζή ημο. Γζα πανάδεζβια, μζ δζαθναημζφκδεζιμζ είκαζ απαναίηδημζ βζα κα δζαηδνήζμοκ ημ επζεήθζμ ιμκυζηζαμ. Απχθεζα μπμζμοδήπμηε ζοζηαηζημφ ημο ζοιπθυημο ηςκ Discs large-scribble-lethal giant Larvae ηαηαθήβεζ ζε ιαγζηυ οπεν-πμθθαπθαζζαζιυ ηαζ δζείζδοζδ ηςκ εοθαηζμηοηηάνςκ ζηδ ζοζηάδα ηςκ βαιεηζηχκ ηοηηάνςκ (Goode and Perrimon 1997; Bilder, Li et al. 2000). Αοηυξ μ νυθμξ ηςκ δζαθναβιαημζοκδέζιςκ είκαζ ζε ακηίεεζδ ιε ηδκ ακάβηδ ηςκ ζοκδέζεςκ γχκδξ βζα ηδ δζαηήνδζδ ηδξ δμιήξ ημο εοθαηχδμοξ επζεδθίμο. Σμ ζφιπθμημ ηςκ cadherin-catenin απαζηείηαζ βζα ηδ δζαηήνδζδ ημο ηοηηανζημφ ζπήιαημξ ηαζ ηδκ ιεηαλφ επαθή ηςκ εοθαηζμηοηηάνςκ. Πνάβιαηζ, απχθεζα ημο armadillo (α-catenin) ζηα εοθαηζμηφηηανα έπεζ ζακ απμηέθεζια ηδκ απχθεζα ημο ηοηηανζημφ ζπήιαημξ ηαζ ηδκ επαθή ηςκ εοθαηζμηοηηάνςκ (Tanentzapf, Smith et al. 2000). Χζηυζμ, απχθεζα ηδξ DE-cadherin δεκ έπεζ ακηίηηοπμ ζηδκ εκ βέκεζ δμιή ημο επζεδθίμο. Αοηυ πζεακά μθείθεηαζ ζηδκ πενζηηή πανμοζία ηδξ DNcadherin, ιζαξ άθθδξ ιδ ηοπζηήξ cadherin (Tepass 1999). Ακάθμβα ιε ηα ζοζηαηζηά ηςκ δζαθναβιαημδεζιχκ ηαζ ηςκ ζοκδέζεςκ γχκδξ, ηα ζοζηαηζηά ηδξ αηναίαξ πενζμπήξ ημο ηοηηάνμο είκαζ απαναίηδηα βζα ηδ δζαηήνδζδ ημο ιμκυζημζαμο επζεδθίμο. Γζα πανάδεζβια, εοθαηζμηφηηανα ιεηαθθαβιέκα βζα crumbs ηαζ DPatj, πμο εκημπίγμκηαζ ζηδκ μνζαηή γχκδ (marginal zone), ειθακίγμοκ δζαηαναπέξ ζηδκ πμθζηυηδηα ηαζ ζπδιαηίγμοκ πμθφζημζαμ επζεήθζμ (Tepass, Theres et al. 1990; Tanentzapf, Smith et al. 2000). Δηηυξ απυ ηδκ αηναζμ-ααζζηή πμθζηυηδηα, ηα εοθαηζμηφηηανα ειθακίγμοκ πμθζηυηδηα ηαηά ημκ άλμκα ημο επζεδθίμο, ηδκ επίπεδδ πμθζηυηδηα (planar polarity). Σα εοθαηζμηφηηανα ζπδιαηίγμοκ ιζα ζοζημζπία δεζιίδςκ αηηίκδξ ηάεεηα ζημκ 54

66 πνμζεζμ-μπίζεζμ άλμκα ημο ςμεοθαηίμο (Gutzeit 1990). Αοηυ ημ πνυηοπμ εδναζχκεηαζ, ανπζηά, ηαηά ηα ζηάδζα 5-6 βφνς απυ ηα πμθζηά ηφηηανα ζημοξ πυθμοξ ημο ςμεοθαηίμο ηαζ επεηηείκμκηαζ πνμξ ημ ηέκηνμ. ημ ζηάδζμ 7, υθα ηα εοθαηζμηφηηανα ειθακίγμοκ αοηή ηδκ μνβάκςζδ ηδξ ααζζηήξ αηηίκδ, δ μπμία δζαηδνείηαζ ιέπνζ ημ ζηάδζμ 14 (Gutzeit 1990; Frydman and Spradling 2001). Σα ηφνζα ζοζηαηζηά ημο ααζζημφ ελςηοηηάνζμ οθζημφ πμο πενζαάθθεζ ημ ςμεοθάηζμ δ laminin A ηαζ ημ ημθθαβυκμ μνβακχκμκηαζ ηαηά ζοιπθδνςιαηζηυ ηνυπμ ιε ηδκ αηηίκδ ζπδιαηίγμκηαξ πενζιεηνζηέξ ίκεξ (Gutzeit, Eberhardt et al. 1991). Αοηή δ πμθςιέκδ μνβάκςζδ ηδξ αηηίκδξ ηαζ ηςκ ζοζηαηζηχκ ημο ελςηοηηάνζμο οθζημφ πζζηεφεηαζ υηζ θεζημονβμφκ ζακ ιμνζαηυξ «ημνζέξ» βζα ηδ δδιζμονβία εκυξ επζιδηοιέκμο αοβμφ. Μεηαθθάλεζξ ζε πνςηεΐκεξ πμο δζαιεζμθααμφκ ηδκ αθθδθεπίδναζδ ημο ελςηοηηάνζμ οθζημφ ιε ημκ ηοηηανμζηεθεηυ αηηίκδξ, υπςξ δ dystroglycan, μ οπμδμπέαξ ηδξ θςζθαηάζδξ ηδξ ηονμζίκδξ (DLar) ηαζ δ α οπμιμκάδα ηςκ ζκηεβηνζκχκ, πνμηαθμφκ ζθαζνζηά αοβά ζηα μπμία ηα ζκίδζα ηδξ αηηίκδξ έπμοκ ζπδιαηζζηεί αθθά δεκ είκαζ πνμζακαημθζζιέκα ςξ πνμξ ημκ επίπεδμ άλμκα (Bateman, Reddy et al. 2001; Frydman and Spradling 2001). 1.7 Γπλακηθή ηεο αθηίλεο Οζ δοκαιζηέξ δμιέξ ηδξ αηηίκδξ είκαζ πμθφ ζδιακηζηέξ βζα ημ εοηανοςηζηυ ηφηηανμ δζυηζ ηαεμνίγμοκ ζε ιεβάθμ ααειυ ημ ζπήια ημο ηοηηάνμο, ηδ ηζκδηζηυηδηά ημο, ηδ ηοημηίκδζδ, ηδκ εκδμηφηςζδ ηαζ άθθεξ θεζημονβίεξ θοζζμθμβζηέξ ηαζ παεμθμβζηέξ Ο αοευνιδημξ πμθοιενζζιυξ ηδξ αηηίκδξ (πονήκςζδ) Ζ ιμκμιενήξ G-αηηίκδ είκαζ ιζα ζθαζνζηή πνςηεΐκδ πμο ζπδιαηίγεζ αοευνιδηα ηνζιενή ή ηεηναιενή (θαζκυιεκμ πονήκςζδξ) ιε πμθφ ιζηνή ηαπφηδηα, ζπδιαηίγμκηαξ πμθοιενή (F-αηηίκδ). In vitro έπεζ ανεεεί υηζ μ πμθοιενζζιυξ εοκμείηαζ απυ ηδκ αολδιέκδ ζοβηέκηνςζδ G-αηηίκδξ ηαζ ηδκ αολδιέκδ ζμκηζηή ζζπφ ημο δζαθφιαημξ. Ανπζηά, παναηδνείηαζ ιζα θάζδ πνμζανιμβήξ (lag phase) υπμο ιε αναδφ νοειυ ζπδιαηίγμκηαζ ηα ηνζιενή/ηεηναιενή. Σμ έκα άηνμ ημο πμθοιενμφξ παναηηδνίγεηαζ ςξ "αβηαεςηυ" (barbed end) ή ςξ ζοκ (+) ηαζ ζε αοηυ πνμζηίεεκηαζ μζ κέεξ 55

67 οπμιμκάδεξ ιε ηαπφηενμ νοειυ απυ υηζ ζημ άθθμ άηνμ πμο παναηηδνίγεηαζ ςξ "αηζδςηυ" (pointed end) ή ιείμκ (-). ε in vitro ζοκεήηεξ δ F-αηηίκδ ιπμνεί κα ζπδιαηίγεζ πμθφ ιεβάθα ζε ιήημξ δζαπθεηυιεκα ζκίδζα. Δκημφημζξ, υηακ δ εθεφεενδ G-αηηίκδ θεάζεζ ιζα μνζζιέκδ ζοβηέκηνςζδ, βκςζηή ςξ ηνίζζιδ ζοβηέκηνςζδ, επένπεηαζ ζζμννμπία ιεηαλφ ζοκανιμθυβδζδξ-απμζοκανιμθυβδζδξ ζκζδίςκ. Ζ ηνίζζιδ ζζμννμπία επένπεηαζ ζε παιδθυηενδ ζοβηέκηνςζδ βζα ημ (-) άηνμ απυ υηζ βζα ημ (+) άηνμ. Ζ αηηίκδ έπεζ ηδ παναηηδνζζηζηή ζδζυηδηα κα πνμζδέκεηαζ ζημ ιυνζμ ΑΣΡ: υηακ δ G-αηηίκδ δεζιεφεηαζ ζημ ΑΣΡ ηυηε εοκμείηαζ δ πνμζεήηδ ιμκμιενχκ ζηα άηνα ηςκ ζκζδίςκ. Σμ ΑΣΡ πνμζδεκυιεκμ ζηδκ αηηίκδ οδνμθφεηαζ ζε ADP ηαηά ηδ δδιζμονβία ημο πμθοιενμφξ. Ζ οδνυθοζδ ημο ΑΣΡ παίγεζ νυθμ ζηδκ αολδιέκδ αζηάεεζα ημο (-) άηνμο ηαζ ζημκ έθεβπμ ηδξ αηαιρίαξ ηςκ ζκζδίςκ Σμ ζζμγφβζμ ηδξ αηηίκδξ Ο έθεβπμξ ημο πμθοιενζζιμφ ηδξ αηηίκδξ επζηοβπάκεηαζ ζημ ηφηηανμ ιε ηδ αμήεεζα ελεζδζηεοιέκςκ πνςηεσκχκ υπςξ ηδξ profilin, ιζαξ ιζηνήξ δζαθοηήξ πνςηεΐκδξ ιε ιμνζαηυ αάνμξ 12-15kDa ηαζ πνςηεσκχκ ηδξ μζημβεκείαξ ηςκ εοιμζζκχκ (π.π. εοιμζίκδ α4, εκυξ ιζηνμφ πεπηζδίμο 43 αιζκμλζηχκ ηαηαθμίπςκ). Οζ ηεθεοηαίεξ ανίζημκηαζ ζε πμθθά, άθθα υπζ ζε υθα ηα ηφηηανα ηαζ ακαζηέθθμοκ ηδκ αοευνιδηδ πονήκςζδ ηδξ αηηίκδξ ηαζ ημκ πμθοιενζζιυ ηδξ F-αηηίκδξ. Ζ profilin, ελάθθμο, θαίκεηαζ υηζ αθθάγεζ ηζξ ζοκεήηεξ ζζμννμπίαξ ηαηά ημκ πμθοιενζζιυ. οκδέεηαζ ζηα ιμκμιενή ADP-αηηίκδξ, ακηαθθάζεζ ημ ADP ιε ΑΣΡ ηαζ επάβεζ ημκ πμθοιενζζιυ ηδξ αηηίκδξ. ηδκ πενίπηςζδ πμο ημ αβηαεςηυ (+) άηνμ είκαζ ηαθοιιέκμ, μ πμθοιενζζιυξ ακαζηέθθεηαζ. Δπίζδξ, έπεζ παναηδνδεεί υηζ ηα πμθοθςζθμσκμζζηίδζα, υπςξ ημ ΡΗΡ 2, ακαζηέθθμοκ ηδκ ζηακυηδηα ηδξ profilin κα ζοκδέεηαζ ζηδκ αηηίκδ, εθέβπμκηαξ έηζζ ημκ πμθοιενζζιυ ηδξ ηαζ επίζδξ, υηζ δ profilin ζοκδέεζ πμθοπνμθίκδ εοκμχκηαξ ηδκ πνυζδεζδ νοειζζηζηχκ πεπηζδίςκ πθμφζζςκ ζε πνμθίκδ. Οζ α-εοιμζίκεξ ζοπκά οπάνπμοκ ζε ορδθέξ ζοβηεκηνχζεζξ, πνμζδέκμκηαζ εηθεηηζηά ζημ ζφιπθμημ ΑΣΡαηηίκδξ ηαζ ημ δεζιεφμοκ χζηε κα ιδκ πνδζζιμπμζδεεί. Χζηυζμ, ζηδ πνάλδ, θαίκεηαζ υηζ ηεθζηά ζηα άηνα (+) ηαζ (-) πνμζδέκμκηαζ οπμιμκάδεξ έζης ηαζ ιε παιδθμφξ νοειμφξ αθθά ιε δζαθμνεηζηέξ ηαπφηδηεξ (δζαθμνζηή πνμζεήηδ), δδθαδή ημ ζφζηδια profilin-α-εοιμζίκδξ δεκ ιπμνεί απυθοηα κα απμηνέρεζ ηδκ πνμζεήηδ οπμιμκάδςκ ζε ζκίδζα F-αηηίκδξ. Σμ πνυαθδια θφκμοκ 56

68 ηάπμζεξ πνςηεΐκεξ μζ θεβυιεκεξ πνςηεΐκεξ ηάθορδξ, μζ μπμίεξ ακαθαιαάκμοκ κα πνμζηαηεφζμοκ ημ (+) άηνμ ηδξ F-αηηίκδξ απυ ηδ πεναζηένς πνμζεήηδ ιμκμιενχκ, ζδζαίηενα ζε πενζυδμοξ δνειίαξ ημο ηοηηάνμο. Με ηδ αμήεεζα πεζναιάηςκ in vitro ηαζ in vivo έπεζ ανεεεί υηζ απυ ηδ ζηζβιή πμο εα πνμζηαηεοηεί ημ (+) άηνμ ηδξ αηηίκδξ απυ ηάπμζα εζδζηή πνςηεΐκδ ημ ζκίδζμ δεκ πμθοιενίγεηαζ απυ αοηυ ημ άηνμ. Μέπνζ ζηζβιήξ μζ ιυκεξ πδιζηέξ μοζίεξ πμο ιπμνμφκ κα παίλμοκ ημ νυθμ ηδξ αθαίνεζδξ ηςκ ηαθοπηήνζςκ πνςηεσκχκ είκαζ ιενζηά θςζθμθζπίδζα ηδξ ζκζζζηυθδξ. Σμ νυθμ ηδξ ηαθφπηναξ παίγμοκ πνςηεΐκεξ πμο ακήημοκ ζε δφμ μζημβέκεζεξ πνςηεσκχκ ιε ηονζυηενμοξ εηπνμζχπμοξ ηζξ πνςηεΐκεξ πδηηςθοιαηίκδ (gelsolin) ηαζ αζθθίκδ. Απυ αοηέξ, άθθεξ ηαθφπημοκ ιυκμ ημ (+) άηνμ υπςξ δ CapG ηαζ ηα ζφιπθμηα CapZ, εκχ άθθεξ ηαζ ηαθφπημοκ ηαζ ηενιαηίγμοκ (severing) ημ ζκίδζμ υπςξ δ πδηηςθοιαηίκδ, δ αζθθίκδ ηαζ δ ακηζεαενίκδ. Ζ πδηηςθοιαηίκδ απμηεθεί παναηηδνζζηζηή πνςηεΐκδ πμο ηαθφπηεζ ηα (+) άηνα ηδξ F- αηηίκδξ. Πνςηεΐκεξ ηφπμο πδηηςθοιαηίκδξ επζηαπφκμοκ ηδ πονήκςζδ ηδξ αηηίκδξ in vitro εθαπζζημπμζχκηαξ ηδ θάζδ πνμζανιμβήξ. ημ ηφηηανμ βζα κα πμθοιενζζηεί έκα ζκίδζμ αηηίκδξ εα πνέπεζ πνχηα κα θφβεζ απυ ημ άηνμ (+) δ ηαθοπηήνζα πνςηεΐκδ. Σμ ζφιπθμημ CapZ απμηεθεί έκα εηενμδζιενέξ πμο ανίζηεηαζ ηαζ ζηδ γχκδ Ε ηςκ ζανημιενχκ. Έηζζ θαίκεηαζ υηζ ζημ ηφηηανμ δ ηαηάζηαζδ πμθοιενζζιμφ ηδξ αηηίκδξ εθέβπεηαζ ηυζμ ζημ επίπεδμ ηδξ πονήκςζδξ υζμ ηαζ ζημ επίπεδμ ημο εθέβπμο ημο πμθοιενζζιμφ οπανπυκηςκ ζκζδίςκ F-αηηίκδξ. Ζ απμζοκανιμθυβδζδ (ηενιαηζζιυξ) ηδξ F-αηηίκδξ βεκζηά ζοιααίκεζ ιε ηδ αμήεεζα πνςηεσκχκ ηδξ μζημβεκείαξ ηδξ πδηηςθοιαηίκδξ (εκενβμπμζείηαζ απυ ζυκηα αζαεζηίμο) ηαζ απυ ιέθδ ηδξ μζημβεκείαξ ηςκ παναβυκηςκ απμπμθοιενζζιμφ ηδξ αηηίκδξ ADF/ημθζθίκδξ (ακελάνηδηεξ απυ ημ αζαέζηζμ) υπςξ μζ αηημθμνίκδ, δεζηνίκδ ηαζ δεπαηηίκδ. Ζ μζημβέκεζα ADF/ημθζθίκδ απμηεθείηαζ απυ ιζηνέξ πνςηεΐκεξ ιε ιέβεεμξ 15-18kDa πμο επζηαπφκμοκ ημκ απμθοιενζζιυ απυ ηα (-) άηνα ηςκ ζκζδίςκ ηαζ απμηυπημοκ ηιήιαηα απυ ηα άηνα αοηά. Απμηεθμφκ πανάβμκηεξ πμο παίγμοκ ζδιακηζηυ νυθμ ζηδκ ηοηηανμηίκδζδ, ζηδκ εκδμηφηςζδ, ζηδκ ακάπηολδ ηςκ ειανομκζηχκ ζζηχκ ηαζ ζε μνζζιέκεξ παεμθμβζηέξ ηαηαζηάζεζξ υπςξ δ ζζπαζιία, ημ μλεζδςηζηυ ηαζ ςζιςηζηυ ζηνεξ ηαζ δ ακάπθαζδ ηςκ ζζηχκ Γεκδνζηζηή πονήκςζδ αηηίκδξ-ζφιπθεβια Αrp2/3 ηαζ πνςηεΐκεξ WASp/Scar Σμ ζφιπθεβια Arp2/3 απμηεθείηαζ απυ 7 πνςηεσκζηέξ οπμιμκάδεξ, ηζξ Arp2 ηαζ Arp3, πμο ζπεηίγμκηαζ ιε αηηίκδ ηαζ πέκηε αηυιδ κέεξ οπμιμκάδεξ ιε 57

69 αδζεοηνίκζζημ νυθμ. Οζ Arps ζοκδέμκηαζ ζηδ πθεονά εκυξ πνμτπάνπμκημξ ζκζδίμο F- αηηίκδξ ηαζ δδιζμονβμφκ ηζξ πνμτπμεέζεζξ βζα ηδ πθεονζηή επζιήηοκζδ ημο ζκζδίμο αηηίκδξ (δζαηθάδςζδ) ζε βςκία ηδ δζαδζηαζία αοηή απαζηείηαζ δ ζφκδεζδ ημο ΑΣΡ απυ ηδκ Arp2 πνςηεΐκδ. Δπζπθέμκ, απαζηείηαζ δ ζοιιεημπή ηςκ πνςηεσκχκ WASp/Scar, πμο εκενβμπμζμφκ ημ ζφιπθεβια Arp2/3( ). Ζ μζημβέκεζα ηςκ πνςηεσκχκ ημο ζοκδνυιμο Wiscott-Aldrich απμηεθείηαζ απυ ηζξ πνςηεΐκεξ WASp, N- WASp,Scar-1,-2, ηαζ -3. Οζ πνςηεΐκεξ WASp εκενβμπμζμφκηαζ απυ ιζα ιζηνή GTPάζδ, ηδκ Cdc42 ηαζ απυ ηδκ 4,5-δζθςζθμνζηή θςζθαηζδοθμσκμζζηυθδ ιε ιδπακζζιυ πμο δεκ έπεζ αηυιδ πθήνςξ δζεοηνζκζζηεί. Πνυζθαηεξ ιεθέηεξ έπμοκ δείλεζ υηζ ζηδκ εκενβμπμζδιέκδ WASp πνμζδέκεηαζ έκα ιμκμιενέξ αηηίκδξ ζηδ πενζμπή WA ημο ηαναμλοηεθζημφ άηνμο. Σμ ζφιπθμημ WASp-αηηίκδ ζοκδέεηαζ ιε ημ ζφιπθμημ Arp2/3 ιε απμηέθεζια ηδκ έκανλδ ηδξ πθεονζηήξ επζιήηοκζδξ ημο ζκζδίμο αηηίκδξ. ηδ δεκδνζηζηή πονήκςζδ ειπθέημκηαζ πμθθμί άθθμζ πνςηεσκζημί πανάβμκηεξ υπςξ μζ πνςηεΐκεξ ηάθορδξ, δ ADF/ημθζθίκδ ηαζ δ LIM-ηζκάζδ. Ζ δεκδνζηζηή πονήκςζδ ηδξ αηηίκδξ είκαζ ιζα δζαδζηαζία πμο αθμνά ζημ ιδπακζζιυ δδιζμονβίαξ ηςκ ηοηηανμπθαζιαηζηχκ πνμεηαμθχκ Μζηνέξ πνςηεΐκεξ πμο δεζιεφμοκ GTP (smgtpases) ηδκ μζημβέκεζα ηςκ ιμκμιενχκ ιζηνχκ GTPαζχκ πενζθαιαάκεηαζ δ οπενμζημβέκεζα ηςκ Ras πνςηεσκχκ. Οζ Ras GTPάζεζξ ηςδζημπμζμφκηαζ απυ 50 πενίπμο δζαθμνεηζηά βμκίδζα (δεκ ζπεηίγμκηαζ ιε ηδκ εζδζηή πνςηεΐκδ Ras πμο είκαζ πνμσυκ ημο βμκζδίμο ras) ηαζ ειπθέημκηαζ ζε έκα εονφ θάζια θοζζμθμβζηχκ θεζημονβζχκ ζηδκ οπμμζημβέκεζα ηςκ Ras ζοζπεηζγυιεκςκ Rho ιζηνχκ GTPαζχκ πενζθαιαάκμκηαζ μζ πνςηεΐκεξ Rac1, RhoA ηαζ Cdc42, πμο ιέζς ηδξ ζηακυηδηάξ ημοξ κα εθέβπμοκ ηδ δοκαιζηή ημο ηοηηανμζηεθεημφ ηδξ αηηίκδξ, επδνεάγμοκ ηοηηανζηά θαζκυιεκα υπςξ μ πμθθαπθαζζαζιυξ, δ δζαθμνμπμίδζδ, δ ηζκδηζηυηδηα, δ δδιζμονβία πνμεηαμθχκ ηαζ δ ακάπηολδ ηςκ κεονχκςκ. Γεκζηυηενα, μζ Rho πνςηεΐκεξ είκαζ ζδιακηζηέξ βζα ηδ ζοβηνυηδζδ ηδξ δμιήξ ζοζηαθηυηδηαξ ηδξ αηημιομζίκδξ ηαζ βζα ηδ δδιζμονβία ηςκ εζηζχκ πνμζηυθθδζδξ, μζ μπμίεξ εκχκμοκ ημκ ηοηηανμζηεθεηυ αηηίκδξ ιε ηδκ ελςηοηηάνζα μοζία, ηονίςξ ιε ηζξ πνςηεΐκεξ fibronectin ηαζ ημθθαβυκμ, δζαιέζμο ηςκ δζαιειανακζηχκ ζκηεβηνζκχκ ηαζ ηςκ ζοζπεηζγυιεκςκ εκδμηοηηανζηχκ πνςηεσκχκ, υπςξ δ αζκημοθίκδ, δ talin ηαζ δ α-αηηίκδ. Ζ Cdc42 ζοιιεηέπεζ ιέζς ηςκ WASp ηαζ Arp2/3 πνςηεσκχκ ζηδ de novo πονήκςζδ ηδξ αηηίκδξ ηαζ ζηδκ επέηηαζδ ηςκ θζθμπμδίςκ. Ζ Rac ιπμνεί κα 58

70 επδνεάγεζ ημκ απμπμθοιενζζιυ/απμζοβηνυηδζδ ηςκ ζκζδίςκ αηηίκδξ δζαιέζμο ηδξ LIM-ηζκάζδξ ιεζμθααμφιεκδξ απεκενβμπμίδζδξ ηςκ πνςηεσκχκ ημθζθίκδξ/adf. Δηηυξ απυ ηζξ δμιέξ πμο ααζίγμκηαζ ζηδκ αηηίκδ μζ ιζηνέξ GTPάζεζξ ειθακίγμκηαζ κα επδνεάγμοκ ηαζ ημοξ ιζηνμζςθδκίζημοξ. Οζ Rho-GTPάζεζξ είκαζ ιμνζαημί δζαηυπηεξ πμο δ θεζημονβζηή ημοξ ηαηάζηαζδ αημθμοεεί ιζα ηοηθζηή δζαδνμιή απυ ηδκ ακεκενβή ιμνθή πμο δεζιεφεζ ημ GTP. Ζ εκενβυηδηα ηςκ Rho πνςηεσκχκ εθέβπεηαζ απυ ημοξ πανάβμκηεξ ακηαθθαβήξ κμοηθεμηζδίςκ βμοακζδίκδξ (GEFs) ηαζ απυ ηζξ πνςηεΐκεξ πμο εκενβμπμζμφκηαζ απυ GTPάζεζξ (GAPs). Οζ πανάβμκηεξ Rho-GEFs παναηηδνίγμκηαζ απυ ηδ πανμοζία πάκς ζημ ιυνζμ ηςκ δμιζηχκ πενζμπχκ (DH ηαζ PH) πμο ακαβκςνίγμκηαζ ςξ ιειανακζηά ή ηοηηανμπθαζιαηζηά ιμηίαα ζηυπεοζδξ. Δπζπθέμκ, ζηζξ Rho-GEFs εδνάγμκηαζ πμθοάνζειεξ πενζμπέξ πνςηεσκζηήξ αθθδθεπίδναζδξ, πμο επζηνέπμοκ ζε αοηέξ ηζξ πνςηεΐκεξ κα ζοιιεηέπμοκ ζε δζαθμνεηζηέξ μδμφξ ιεηαβςβήξ ζήιαημξ ζημ ηφηηανμ. πεηζηά πνυζθαηα, ανέεδηε δ πμθοθεζημονβζηή πνςηεΐκδ Trio, πμο έπεζ ηδκ ζηακυηδηα κα ζοκδέεηαζ ζηδ δζαιειανακζηή θςζθαηάζδ ηδξ ηονμζίκδξ LAR. ηδκ αθθδθμοπία ηδξ πενζέπεζ δφμ πενζμπέξ Rho-GEFs, ιζα πενζμπή ιε εκενβυηδηα ηζκάζδξ ηδξ ζενίκδξ ηαζ ανηεηέξ αμδεδηζηέξ πενζμπέξ, υπςξ μζ επακαθήρεζξ ζπεηηνίκδξ, μζ SH 3 ηαζ μζ πενζμπέξ ιε δμιή ακμζθαζνζκχκ. 1.8 Σν ζύζηεκα αθην-κπνζίλεο (κε κπτθά θύηηαξα) Ακ ηαζ ανπζηά είπε ηαεζενςεεί υηζ δ ιομζίκδ είκαζ απμηθεζζηζηυ ζοζηαηζηυ ης ιοσηχκ ηοηηάνςκ, εκημφημζξ δεδμιέκα ηδξ δεηαεηίαξ ημο 1970 ακέηνερακ ηδκ πεπμίεδζδ αοηή, αθμφ άνπζζακ ζηαδζαηά κα απμιμκχκμκηαζ ιομζίκεξ απυ ιδ ιοσηά ηφηηανα ηαζ εζδζηυηενα απυ πνςηυγςα πμο εηηεθμφκ αιμζααδμεζδή ηίκδζδ. Μέπνζ ηαζ ζήιενα έπμοκ παναηηδνζζηεί δεηάδεξ ηέημζα ιυνζα ιομζζκχκ πμο μκμιάγμκηαζ άηοπεξ ιομζίκεξ Οζ ηάλεζξ ηςκ άηοπςκ ιομζζκχκ ηαζ μ νυθμξ ημοξ ζηδκ ηοηηανζηή ηίκδζδ Οζ ιομζίκεξ ηςκ ιδ ιοσηχκ ηοηηάνςκ, πμο μκμιάγμκηαζ άηοπεξ ιομζίκεξ, παίνκμοκ ιένμξ ζε έκα εονφ θάζια θεζημονβζχκ πμο ζπεηίγμκηαζ ιε ηζκδηζηά ηοηηανζηά θαζκυιεκα πμο ααζίγμκηαζ ζηα ζκίδζα αηηίκδξ. 59

71 Ζ ιδ ιοσηή ιομζίκδ ΗΗ έπεζ ανεεεί υηζ δδιζμονβεί ζφιπθμηα ιε ηδκ F-αηηίκδ ακάθμβα ιε αοηά ηςκ ιοσηχκ ηοηηάνςκ. Σα ιυνζα ηδξ ιομζίκδξ ΗΗ ημπμεεημφκηαζ ακηζπανάθθδθα ζπδιαηίγμκηαξ δζιενή ηα μπμία αθθδθεπζδνμφκ ιε βεζημκζηά ιζηνμσκίδζα αηηίκδξ. Με ημ ηνυπμ αοηυ ζπδιαηίγμκηαζ δεζιίδεξ ζκζδίςκ αηηίκδξ πμο αθθδθμζοκδέμκηαζ ιε δζιενή ιομζίκδξ ΗΗ δδιζμονβχκηαξ έκα "ζοζηαθηυ" δίηηομ υπςξ ηα κήιαηα πίεζδξ ζηα ηφηηανα in vitro. Ζ ιομζίκδ ΗΗ νοειίγεηαζ απυ ημ αζαέζηζμ. ηα ιδ ιοσηά ηφηηανα ηαζ ζηα θεία ιοσηά ηφηηανα δ ιομζίκδ ΗΗ εκενβμπμζείηαζ απυ ημ ζφιπθμημ αζαεζηίμο-ηαθιμδμοθίκδξ ηαζ θςζθμνοθζχκεηαζ. Έηζζ αολάκεηαζ δ ζοββέκεζά ηδξ ιε ηδκ αηηίκδ ηαζ δδιζμονβείηαζ ηίκδζδ πνμξ ημ (+) άηνμ πμο πενζθαιαάκεζ οδνυθοζδ ημο ΑΣΡ πνμξ ADP απυ ηδ ιομζίκδ. Οζ ιομζίκεξ θαίκεηαζ υηζ εηηυξ απυ ηδ δδιζμονβία ηαζ δζαηήνδζδ ηςκ κδιαηίςκ ηάζδξ ζοιιεηέπμοκ ηαζ ζηδ δδιζμονβία πθεονζηήξ ηάζδξ ζηα ηφηηανα, ζηδ δδιζμονβία πνμςεδηζηχκ ηάζεςκ ζε επζιδηοκυιεκεξ ηοηηανμπθαζιαηζηέξ πνμεηαμθέξ αθθά παίγμοκ νυθμ ηαζ ζηδ ηοημηίκδζδ Πνςηεΐκεξ ηςκ πθαηχκ ή εζηζχκ πνμζηυθθδζδξ - νυθμξ ηδξ αηημιομζίκδξ Ζ ηοηηανζηή πνμζηυθθδζδ είκαζ ιζα θεζημονβία ημο ηοηηάνμο πμο ζπεηίγεηαζ ιε ιζα πμζηζθία θοζζμθμβζηχκ θαζκμιέκςκ, υπςξ δ ειανομβέκεζδ, δ δζαηήνδζδ ηδξ δμιήξ ηςκ ζζηχκ, δ επμφθςζδ ηναοιάηςκ, δ ακμζμαπυηνζζδ ηαζ δ ιεηάζηαζδ. Ο υνμξ "πνμζηυθθδζδ" ακαθένεηαζ ζηδκ ζηακυηδηα ηςκ ηοηηάνςκ κα ζπδιαηίγμοκ εζηίεξ επαθήξ ιε ημ οπυζηνςια. Ζ αθθδθεπίδναζδ ηςκ ηοηηάνςκ ιεηαλφ ημοξ, αθθά ηαζ ιε ηδκ ελςηοηηάνζα μοζία πμο ηα πενζαάθθεζ, ιέζς εζδζηχκ ηοηηανζηχκ δμιχκ επαθήξ, εθέβπεζ ηδ ιμνθμθμβία, ημκ πμθθαπθαζζαζιυ, ηδ ιεηακάζηεοζδ, ηδκ επζαίςζδ ηαζ ηδ δζαθμνμπμίδζδ ηςκ ηοηηάνςκ αοηχκ. Οζ πθάηεξ επαθήξ ή πνμζηυθθδζδξ είκαζ ζφκδεζιμζ ιεηαλφ ηδξ επζθάκεζαξ ημο οπμζηνχιαημξ ηαζ ηδξ ηοηηανζηήξ ιειανάκδξ ζε απυζηαζδ 10-15nm. ηδκ ελςηενζηή επζθάκεζα ηςκ πθαηχκ επαθήξ εκημπίγμκηαζ μζ ζκηεβηνίκεξ ( ), εκχ ζηδκ εζςηενζηή ιενζηέξ δμιζηέξ πνςηεΐκεξ, talin, παλζθθίκδ, αζκημοθίκδ, ηεκζίκδ, πμο αθθδθεπζδνμφκ ιε ηα ζκίδζα αηηίκδξ. Πμθθέξ άθθεξ θεζημονβζηέξ πνςηεΐκεξ εκημπίγμκηαζ ζηζξ πθάηεξ πνμζηυθθδζδξ, υπςξ πνςηεάζεξ, πνςηεσκζηέξ ηζκάζεξ ηαζ θςζθαηάζεξ, ιυνζα-ζδιαημδυηεξ, ηοηηανμζηεθεηζηέξ πνςηεΐκεξ η.ά., πμο ειπθέημκηαζ ζηδ ιεηαβςβή ζήιαημξ. Κφνζμζ πανάβμκηεξ ζηδ δζαδζηαζία αοηή είκαζ δ ηζκάζδ FAK, δ Src ηαζ δ p130 cas, πμο ιέζς GTPαζχκ (Ras, Rho) επζηοβπάκμοκ ηδ 60

72 ιεηαβςβή ημο ζήιαημξ απυ ηδκ ελςηοηηάνζα μοζία ζημ ηοηηανυπθαζια, ιε απμηέθεζια ηδκ ακαδζμνβάκςζδ ηδξ αηηίκδξ ηαζ ηδ δδιζμονβία ηςκ κδιαηίςκ πίεζδξ. Σα ζκίδζα ηάζδξ είκαζ δέζιεξ ζκζδίςκ αηηίκδξ-ιομζίκδξ ΗΗ, αθθά ηαζ αμδεδηζηχκ πνςηεσκχκ, πμο ακαπηφζζμκηαζ ζημοξ ηφπμοξ ηοηηάνςκ πμο έπμοκ ηδκ ζηακυηδηα κα πνμζημθθχκηαζ ζηζξ επζθάκεζεξ. Σα ζκίδζα αηηίκδξ απθχκμκηαζ ζε υθμ ημ ιήημξ ηςκ κδιαηίςκ ηαζ δζεοεεημφκηαζ ζε ακηζπανάθθδθδ ηαηεφεοκζδ. Έπεζ παναηδνδεεί ζε απμιμκςιέκα κδιάηζα πίεζδξ υηζ ιε ηδκ πνμζεήηδ ΑΣΡ έπμοκ ηδκ ζηακυηδηα ηδξ ζοζημθήξ. Σα ζκίδζα ηάζδξ παίγμοκ ηαεμνζζηζηυ νυθμ ζηδ ηοηηανζηή πνμζηυθθδζδ, πζέγμοκ ηδκ επζθάκεζα ηαζ πνμηαθμφκ ηάζδ ιέζα ζημκ ηοηηανμζηεθεηυ. Σα ζκίδζα ηάζδξ απμηεθμφκ πανμδζηέξ δμιέξ ημο ηοηηάνμο, μζ μπμίεξ ζπδιαηίγμκηαζ ςξ ακηίδναζδ ζηδ δδιζμονβδεείζα ηάζδ ηαζ απμδζμνβακχκμκηαζ ζηζξ πενζπηχζεζξ πμο δεκ οθίζηαηαζ δ ηάζδ αοηή, υπςξ βζα πανάδεζβια ηαηά ηδ δζάνηεζα ηδξ ιίηςζδξ. 61

73 62

74 Υιηθά & Μέζοδοη 63

75 64

76 2.1 Καιιηέξγεηα ζηειερώλ D. Melanogaster Ζ ηαθθζένβεζα ηςκ ζηεθεπχκ ηδξ D. melanogaster έβζκε ζε δζαθακή πθαζηζηά ηοθζκδνζηά δμπεία, ηα μπμία θένμοκ ζηδ αάζδ ημοξ ενεπηζηυ ιέζμ ζε ζηενεή ιμνθή ηαζ ηαθφπημκηαζ ζημ επάκς ιένμξ ιε έκα πχια απυ ααιαάηζ. Σα ζηεθέπδ πμο πνδζζιμπμζήεδηακ ακαθένμκηαζ ζημ πανάνηδια Α. Αληηδξαζηήξηα Γμπεία ιε ενεπηζηυ ιέζμ πμο πενζέπεζ: 0,75% άβαν, 3,5% αθεφνζ ηαθαιπμηζμφ, 5% λδνή γφιδ, 3,5% ιαφνδ γάπανδ, 2% D-βθοηυγδ, 0.4% πνμπζμκζηυ μλφ, 0.25% Nipagin M Γηαδηθαζία Ζ ακάπηολδ ηςκ ζηεθεπχκ πναβιαημπμζείηαζ ζε εαθάιμοξ επχαζδξ ζηαεενήξ εενιμηναζίαξ. Οζ ζοκήεεζξ εενιμηναζίεξ επχαζδξ ήηακ 18 μ C ή 25 μ C ακάθμβα ιε ηδκ επζεοιδηή δζάνηεζα ημο ηφηθμο γςήξ. ημοξ 25 μ C δ ακάπηολδ μθμηθδνχκεηαζ ζε δζάζηδια 10 διενχκ πενίπμο, εκχ ιεζχκμκηαξ ηδ εενιμηναζία επζηοβπάκεηαζ επζανάδοκζδ ηδξ ακάπηολδξ. 2.2 πιινγή θαη απνρνξηνπνίεζε εκβξύσλ Αληηδξαζηήξηα ηενευ ενεπηζηυ ιέζμκ βζα ηδ ζοθθμβή ειανφςκ: 2% άβαν, 1,25% ιαφνδ γάπανδ, 25% ποιυξ θνμφηςκ, 0,5% Nipagin M Γηαδηθαζία 1. Νεανέξ εκήθζηεξ ιφβεξ (3-4 διενχκ) ηαηάθθδθςκ βμκμηφπςκ ημπμεεημφκηαζ ζε εζδζηά δζαιμνθςιέκμοξ ηθςαμφξ, μζ μπμίμζ θένμοκ άκμζβια ζηδ αάζδ ημοξ. ημ άκμζβια ημπμεεημφκηαζ πθαζηζηά ηνοαθία petri ηαηάθθδθδξ δζαιέηνμο, ηα μπμία πενζέπμοκ ζηενευ ενεπηζηυ ιέζμκ. 2. ημ ηέκηνμ ημο ενεπηζημφ ιέζμο ημπμεεηείηαζ ιζηνή πμζυηδηα κςπήξ γφιδξ αναζςιέκδξ ιε κενυ. Ζ γφιδ πνδζζιμπμζείηαζ ςξ ηνμθή απυ ηα εκήθζηα άημια, εκχ ημ ζηενευ ενεπηζηυ ιέζμκ πνδζζιεφεζ ςξ οπυζηνςια, πάκς ζημ μπμίμ ηα εδθοηά άημια εκαπμεέημοκ έιανοα. 3. Ζ ζοθθμβή ειανφςκ πναβιαημπμζείηαζ ιε ακηζηαηάζηαζδ ημο ηνοαθίμο ζε πνμδζαβεβναιιέκα πνμκζηά δζαζηήιαηα, ακάθμβα ιε ημ ζηάδζμ ηδξ ακάπηολδξ πμο ιαξ εκδζαθένεζ. 65

77 4. Ζ απμπμνζμπμίδζδ ηςκ ειανφςκ ιπμνεί κα επζηεοπεεί είηε ιε ιδπακζηή απμιάηνοκζδ ημο πμνίμο ή ιε ηδ πνήζδ οδαηζημφ δζαθφιαημξ πθςνίκδξ, Γζα ηζξ ακάβηεξ ηςκ πεζναιάηςκ ιαξ πνδζζιμπμζήεδηε 50% οδαηζηυ δζάθοια πθςνίκδξ. Με ηδκ απμπμνζμπμίδζδ ηα έιανοα ηαείζηακηαζ πνμζαάζζια ζηδκ παναηήνδζδ. Δπζπθέμκ, απμηεθεί απαναίηδημ αήια βζα ηδ ιμκζιμπμίδζδ ηςκ ειανφςκ. 2.3 Πξνεηνηκαζία εκβξύσλ θαη ηζηώλ γηα ρξώζε κε θζνξίδνληα αληηζώκαηα Μμκζιμπμίδζδ ειανφςκ Ζ ιμκζιμπμίδζδ ηςκ ειανφςκ ιπμνεί κα επζηεοπεεί ιε δζάθμνεξ ιεευδμοξ. Ζ ιέεμδμξ πμο εθανιυγεηαζ ηάεε θμνά πμζηίθθεζ ακάθμβα ιε ημ ζηάδζμ ηδξ ειανοσηήξ ακάπηολδξ ηαζ ημκ ζζηυ πμο ιαξ εκδζαθένεζ, ημκ ανζειυ ηςκ δζαεέζζιςκ ειανφςκ ηαζ, ηονίςξ, ηδ θφζδ ηςκ πνδζζιμπμζμφιεκςκ ακηζζςιάηςκ. Σα ακηζζχιαηα πμο πνδζζιμπμζμφκηαζ πνέπεζ κα είκαζ απμθφηςξ ζοιααηά ιε ηδ ιέεμδμ ιμκζιμπμίδζδξ πμο έπεζ επζθεπεεί. Γζα ηδκ πανμφζα ενεοκδηζηή ενβαζία πνδζζιμπμζήεδηακ δφμ δζαθμνεηζηέξ ιέεμδμζ: δ ιμκζιμπμίδζδ ιε εένιακζδ ηαζ δ ιμκζιμπμίδζδ ιε θμνιαθδετδδ/ιεεακυθδ. Ζ πνχηδ είκαζ θζβυηενμ ήπζα ιέεμδμξ ζε υηζ αθμνά ηδ δζαηήνδζδ ηδξ ιμνθμθμβίαξ ηςκ ειανφςκ, ηαεχξ έκαξ ιεβάθμξ ανζειυξ ηαηαζηνέθεηαζ. Ζ πνδζζιυηδηα υιςξ ηδξ ιεευδμο αοηήξ έβηεζηαζ ζημ υηζ ζηα εκαπμιείκακηα έιανοα πμο δζαηδνμφκ αηέναζα ηδ ιμνθμθμβία ημοξ ηα ακηζζχιαηα ιπμνμφκ ηαζ δζαπενκμφκ ημ πζηζκχδεξ πενίαθδια πμο εκαπμηίεεηαζ ιεηά ημ ζηάδζμ 16 ηδξ ειανοσηήξ ακάπηολδξ. Αληηδξαζηήξηα PBS 10x (100ml): 8g NaCl, 0.2g KCl, 1.44g Na 2 HPO 4, 0.24g KH 2 PO 4, dh 2 O Ροειίγμοιε ζε ph 7.4. Γζάθοια ιμκζιμπμίδζδξ ιε θμνιαθδεΰδδξ/ιεεακυθδ: 720ιl PBS 1x, 80ιl θμνιαθδεΰδδ 37%, 2ml επηάκζμ Γζάθοια ιμκζιμπμίδζδξ ιε εένιακζδ 1x (50ml): 0.35g πθςνζμφπμ κάηνζμ, 0,125ml Triton X-100 (20%), dh 2 O 66

78 Μνληκνπνίεζε εκβξχσλ κε θνξκαιδευδε/κεζαλφιε Γηαδηθαζία 1. Μεηά ηδκ απμπμνζμπμίδζδ (πμο ακαθένεδηε ζηδκ πανάβναθμ 2) ηα έιανοα λεπθέκμκηαζ ιε άθεμκμ κενυ ιέζα ζε ηαηάθθδθμ ηαθαεάηζ, ημ μπμίμ θένεζ ιζηνμφξ πυνμοξ. 2. Αημθμοεεί ιεηαθμνά ηςκ ειανφςκ ιε ηδ πνήζδ πζκέθμο ζε βοάθζκα ηοθζκδνζηά δμπεία, ηα μπμία πενζέπμοκ ημ δζάθοια ιμκζιμπμίδζδξ. Σμ ηεθεοηαίμ πανμοζζάγεζ δφμ θάζεζξ, ιεηαλφ ηςκ μπμίςκ ζοζζςνεφμκηαζ ηα έιανοα. Αημθμοεεί ήπζα ακάδεοζδ βζα 30 θεπηά πενίπμο. 3. ηδ ζοκέπεζα, ιε βοάθζκδ πζπέηα pasteur αθαζνμφκηαζ δζαδμπζηά δ ηαηχηενδ θάζδ ηαζ ημ επηάκζμ πμο ζπδιαηίγεζ ηδκ ακχηενδ θάζδ. 4. Με ηδ δζαδζηαζία πμο αημθμοεεί επζηοβπάκεηαζ δ απμιάηνοκζδ ηδξ αζηεθθζκζηήξ ιειανάκδξ ημο ειανφμο. οβηεηνζιέκα, ζημ δμπείμ πμο πενζέπεζ ηα έιανοα πνμζηίεεηαζ επηάκζμ ηαζ δζπθάζζμξ υβημξ ιεεακυθδξ ιε ηδ ζεζνά πμο ακαθένεδηακ. Μεηά απυ ζζπονή ακάδεοζδ, βζα πενίπμο 30 δεοηενυθεπηα, ηα έιανοα, ζηα μπμία έπεζ αθαζνεεεί επζηοπχξ δ αζηεθθζκζηή ιειανάκδ, αοείγμκηαζ ηαζ ζοβηεκηνχκμκηαζ ζημκ ποειέκα ημο δμπείμο. 5. Σα έιανοα πμο επζηάεμκηαζ ζημκ ποειέκα ζοθθέβμκηαζ ιε ηδ πνήζδ βοάθζκδξ πζπέηαξ pasteur ηαζ ιεηαθένμκηαζ ζε πθαζηζηυ ζςθδκάνζμ 2ml. Αημθμοεμφκ ζφκημιεξ πθφζεζξ ηςκ ειανφςκ ιε ιεεακυθδ βζα 2-3 θεπηά πενίπμο ιε ήπζα ακάδεοζδ. 6. Σα έιανοα ιπμνμφκ κα πνδζζιμπμζδεμφκ απεοεείαξ βζα πνχζδ ιε ακηζζχιαηα ή ιπμνμφκ κα απμεδηεοημφκ ιέζα ζε ιεεακυθδ ζε εενιμηναζία -20 μ C Μνληκνπνίεζε εκβξχσλ κε ζέξκαλζε 1. Έιανοα πμο έπμοκ οπμζηεί απμπμνζμπμίδζδ ιε 50% πθςνίκδξ λεπθέκμκηαζ ιέζα ζε δζάηνδημ ηαθαεάηζ ιε άθεμκμ κενυ. 2. ε έκα βοάθζκμ ηοθζκδνζηυ δμπείμ έπμοιε πνμζεέζεζ 2ml (5ml) δζαθφιαημξ βζα ιμκζιμπμίδζδ ιε εένιακζδ. Θενιαίκμοιε ιέπνζ ημ ζδιείμ αναζιμφ ημο δζαθφιαημξ ηαζ ζημ γεζηυ δζάθοια ιεηαθένμοιε ηα έιανοα ιε πζκέθμ. 3. πεδυκ αιέζςξ πνμζεέημοιε 16 ml (40ml) ηνφμο δζαθφιαημξ ζημ δμπείμ ιε ηα έιανοα ηαζ ιεηαθένμοιε ζε πάβμ ιέπνζ κα αοεζζημφκ ηα έιανοα. Δίκαζ 67

79 πμθφ ζδιακηζηυ δ πνμζεήηδ ημο παβςιέκμο δζαθφιαημξ κα βίκεζ ζε ζφκημιμ πνμκζηυ δζάζηδια πνμηεζιέκμο κα εθαπζζημπμζδεεί μ πνυκμξ έηεεζδξ ηςκ ειανφςκ ζηδκ πμθφ ορδθή εενιμηναζία ημο δζαθφιαημξ ιμκζιμπμίδζδξ. 4. Με ιία πζπέηα pasteur ιεηαθένμοιε ηα ιμκζιμπμζδιέκα έιανοα, ηα μπμία έπμοκ ζοζζςνεοεεί ζημκ ποειέκα ημο δμπείμο, ζε έκα ιζηνυηενμ βοάθζκμ ηοθζκδνζηυ δμπείμ ηαζ ηα αθήκμοιε κα αοεζζημφκ. 5. Αθαζνμφιε ημ οπενηείιεκμ δζάθοια ιμκζιμπμίδζδξ ηαζ αημθμοεεί δ δζαδζηαζία απμιάηνοκζδξ ηδξ αζηεθθζκζηήξ ιειανάκδξ ιε επηάκζμ ηαζ ιεεακυθδ, υπςξ ακαθένεδηε ζε πνμδβμφιεκδ εκυηδηα. 6. Μεηά ηζξ πθφζεζξ ιε ιεεακυθδ ηα έιανοα πνδζζιμπμζμφκηαζ απεοεείαξ βζα πνχζδ ιε ακηζζχιαηα ή ιπμνμφκ κα απμεδηεοημφκ ζημοξ -20 μ C ζε ιεεακυθδ. 2.4 Δπαγσγή γελεηηθώλ κσζατθώλ FLP/FRT ζφζηδια Αξρή κεζφδνπ Δηθόλα 1: Γελεηηθά ειεγρόκελνο κηησηηθόο αλαζπλδπαζκόο, ηνμπμπμζδιέκδ απυ (Golic 1991). 68

80 Γηαδηθαζία 1. Γζαζηαονχκμοιε ημ ζηέθεπμξ πμο θένεζ ημ ακαζοκδοαζιέκμ πνςιυζςια ιε ηδκ ιεηάθθαλδ ηαζ ημ FRT2A (ηδξ ακηίζημζπδξ βεκεηζηήξ πενζμπήξ πμο εδνάγεηαζ ημ βμκίδζμ ηδξ ilk) ιε ημ ζηέθεπμξ πμο θένεζ ημ nls-gfp,frt2a πνςιυζςια ηαζ ηδκ θθζπάζδ, ηδξ μπμίαξ μ οπμηζκδηήξ εκενβμπμζείηαζ ιε εενιμηναζζαηυ ζμη (hsflp) (Δηθ.2Α) (Xu and Harrison 1994). 2. Σμπμεεημφιε ηδ δζαζηαφνςζδ ζε εάθαιμ ζηαεενήξ εενιμηναζίαξ 25 0 C. 3. Μεηά απυ 2-3 διένεξ, ιεηαθένμοιε ηα εκήθζηα άημια ζε κέμ πθαζηζηυ ηοθζκδνζηυ δμπείμ (vial) ηα πενζζζυηενα άημια ζημ vial 1 μ -2 μ πνμκοιθζηυ ζηάδζμ 4. Δπάβμοιε εενιμηναζζαηυ ζμη ιεηαθένμκηαξ ημ vial ζε οδαηυθμοηνμ εενιμηναζίαξ 37 0 C βζα 1h (Δηθ.2Β). 5. Δπακαθένμοιε ημ vial ζε εενιμηναζία δςιαηίμο βζα 1h. 6. Δπακαθαιαάκμοιε ημ εενιμηναζζαηυ ζμη βζα 1h. 7. Σμπμεεημφιε ημ vial ζε εάθαιμ ζηαεενήξ εενιμηναζίαξ 25 0 C βζα ημκ οπυθμζπμ πνυκμ ηδξ ακάπηολδξ ηδξ Drosophila. 8. Μεηαθένμοιε ηα κεμβέκκδηα άημια (δθζηίαξ ιέπνζ 24h) ζε κέμ vial. 9. Δπάβμοιε εενιμηναζζαηυ ζμη ιεηαθένμκηαξ ημ vial ζε εάθαιμ εενιμηναζίαξ 37 0 C βζα 1h (Δηθ.2Γ). 10. Δπακαθένμοιε ηo vial ζε εενιμηναζία δςιαηίμο βζα 1h. 11. Δπακαθαιαάκμοιε ημ εενιμηναζζαηυ ζμη βζα 1h. 12. Δπακαθένμοιε ημ vial ζε εάθαιμ ζηαεενήξ εενιμηναζίαξ 25 0 C βζα ηζξ επυιεκεξ 24h ηαζ ζηδ ζοκέπεζα πνμπςνμφιε ζηδκ ακαημιία ηςκ ςμεδηχκ. Α Β Γ X w-;;ilk54,frt2a,e11/mkrs hsflp;;frt2a,nlsgfp Θεξκνθξαζηαθό ζνθ θαηά ηα 1 ν -2 ν πξνλπκθηθά ζηάδηα Θεξκνθξαζηαθό ζνθ λενγέλλεησλ αηόκσλ Δηθόλα 2: ρεκαηηθή απεηθόληζε ηεο δηαζηαύξσζεο γηα ηελ παξαγσγή ησλ ελήιηθσλ αηόκσλ πνπ θέξνπλ ilk-/- θιώλνπο. 69

81 2.5 Αλαηνκία, κνληκνπνίεζε θαη ρξώζε κε αληηζώκαηα/ρξσζηηθέο νπζίεο ησλ σνζπιαθίσλ Αληηδξαζηήξηα 10xEBR (Ringer s solution): 0,13M NaCl, 47uM KCl, 22uM CaCl 2, 0,1M HEPES PBS 10x (πενζβνάθεηαζ ζηδκ πανάβναθμ 3.1) 1x PBT: 0,25% Triton-X100, 1% BSA, 1xPBS 4% παναθμνιαθδεΰδδ ζε 1xPBS (8% παναθμνιαθδεΰδδ ζε 1xPBS βζα ηδ δζαηήνδζδ ηςκ αζηαεχκ ζκζδίςκ ηάζδξ ηαηά ηα πεζνάιαηα ακμζμθεμνζζιμφ ζηζξ ςμεήηεξ ηςκ ζζημεζδζηά δζαζςζιέκςκ εδθοηχκ). Α Β Γ Γ Δηθόλα 3: ρεκαηηθή απεηθόληζε ηεο αλαηνκίαο ησλ σνζεθώλ, ηνμπμπμζδιέκδ απυ (Prasad, Jang et al. 2007) Γηαδηθαζία 1. Μεηαθένμοιε ακαζζεδημπμζδιέκα εδθοηά άημια, ζε βοάθζκδ πθάηα, πμο θένεζ ημίθςια ηαζ πενζέπεζ 1xEBR. 70

82 2. ηαεενμπμζμφιε ηδ ιφβα ιε ηδ αμήεεζα ηδξ θααίδαξ ηαζ αάγμκηαξ ηδκ άθθδ θααίδα ιέζα ζημκ ςαβςβυ ζηδκ ημζθζά ηδξ, ηνααάιε ανβά ηαζ ζηαεενά ημ γεφβμξ ηςκ ςμεδηχκ έλς απυ ηδκ ημζθζαηή πχνα (Δηθ.3Α& Δηθ.3Β). 3. Μεηαθένμοιε ημ γεφβμξ ηςκ ςμεδηχκ ζε άθθδ βοάθζκδ πθάηα ιε 1xEBR. 4. ηαεενμπμζμφιε ηδκ ςμεήηδ ιε ηδ ιζα θααίδα ηαζ ιε ηδ δεφηενδ απμιμκχκμοιε ηα ςμεοθάηζα ηνααχκηαξ ανβά ηαζ ζηαεενά ηα ovarioles πζάκμκηαξ απυ ηδκ άηνδ (ζηδκ πενζμπή ημο βενιάνζμο) (Δηθ.3Γ& Δηθ.3Γ). 5. Απμιμκχκμοιε ημκ ζζηυ πμο ιαξ εκδζαθένεζ ηαζ ιεηαθένμοιε ζε δζάθοια ιμκζιμπμίδζδξ (4% παναθμνιαθδεΰδδξ ζε 1xPBS). Δπςάγμοιε βζα 10 θεπηά ζε εενιμηναζία δςιαηίμο. Αημθμοεεί πνχζδ ιε ακηζζχιαηα Ακμζμθεμνζζιυξ Με ημκ ακμζμθεμνζζιυ επζηοβπάκεηαζ δ ακίπκεοζδ πνςηεσκχκ ιε ηδ πνήζδ εζδζηχκ ακηζζςιάηςκ. οκήεςξ, πνδζζιμπμζείηαζ ζοκδοαζιυξ πνςημβεκμφξ ακηζζχιαημξ, εζδζημφ βζα ζοβηεηνζιέκδ πνςηεΐκδ ηαζ δεοηενμβεκμφξ ακηζζχιαημξ εζδζημφ βζα ημ πνςημβεκέξ ακηίζςια, ημ μπμίμ είκαζ ζογεοβιέκμ ιε ηδ θεμνίγμοζα πνςζηζηή. Οζ θεμνίγμοζεξ πνςζηζηέξ ακζπκεφμκηαζ θυβς ηδξ ζδζυηδηαξ ημοξ κα απμννμθμφκ θςξ ζοβηεηνζιέκμο ιήημοξ ηφιαημξ ηαζ κα εηπέιπμοκ θςξ ιεβαθφηενμο ιήημοξ ηφιαημξ. Ζ παναηήνδζδ βίκεηαζ ζε ιζηνμζηυπζμ θεμνζζιμφ ή ζοκεζηζαηυ ιζηνμζηυπζμ. Αληηδξαζηήξηα 1xPBT Γζάθοια πνςημβεκμφξ ακηζζχιαημξ ηαηάθθδθδξ αναίςζδξ ζε 1x PBT Γζάθοια δεοηενμβεκμφξ ακηζζχιαημξ ηαηάθθδθδξ αναίςζδξ ζε 1x PBT Γζάθοια έβηθεζζδξ Vectashield Γηαδηθαζία 1. Ξεπθέκμοιε ιε 1xPBS 3x15 θεπηά πνμηεζιέκμο κα απμιαηνφκμοιε ηα οπμθείιιαηα ημο δζαθφιαημξ ιμκζιμπμίδζδξ, πνμζεέημοιε 1x PBT ηαζ επςάγμοιε βζα 30 θεπηά. Ζ BSA, πμο πενζέπεηαζ ζημ δζάθοια, δεζιεφεζ ηζξ ιδ εζδζηέξ εέζεζξ πνυζδεζδξ ηςκ ακηζζςιάηςκ. 71

83 2. Απμιαηνφκμοιε ημ PBT ηαζ πνμζεέημοιε δζάθοια πνςημβεκμφξ ακηζζχιαημξ ηαηάθθδθδξ αναίςζδξ ζε 1xPBT. Δπςάγμοιε βζα πενίπμο 16 χνεξ ζημοξ 4 μ C οπυ ακαηίκδζδ. 3. Αθαζνμφιε ημ πνςημβεκέξ ακηίζςια ηαζ λεπθέκμοιε ιε 1x PBT 3x15 θεπηά ζε εενιμηναζία δςιαηίμο οπυ ακαηίκδζδ, πνμηεζιέκμο κα απμιαηνοκεμφκ ηα οπμθείιιαηα ημο ακηζζχιαημξ. 4. Πνμζεέημοιε δζάθοια δεοηενμβεκμφξ ακηζζχιαημξ ηαηάθθδθδξ αναίςζδξ ζε 1x PBT. Δπςάγμοιε βζα 2 χνεξ ζημ ζημηάδζ, ζε εενιμηναζία δςιαηίμο οπυ ακαηίκδζδ. ε αοηυ ημ ζηάδζμ βίκεηαζ ηαζ δ πνχζδ ιε θαθθμσδίκδ. 5. Αθαζνμφιε ημ δεοηενμβεκέξ ακηίζςια ηαζ λεπθέκμοιε ιε 1x PBT, 3x15 θεπηά ζημ ζημηάδζ, ζε εενιμηναζία δςιαηίμο οπυ ακαηίκδζδ, πνμηεζιέκμο κα απμιαηνοκεμφκ ηα οπμθείιιαηα ημο ακηζζχιαημξ. 6. ε αοηυ ημ ζηάδζμ, εάκ ημ επζεοιμφιε, ηάκμοιε πνχζδ DAPI. 7. Μεηαθένμοιε ημ δείβια ζε ακηζηεζιεκμθυνμ πθάηα ηαζ αθαζνμφιε ηδκ πενίζζεζα ημο δζαθφιαημξ PBT. Πνμζεέημοιε ακάθμβμ υβημ δζαθφιαημξ έβηθεζζδξ Vectashield, ηαθφπημοιε ιε ηαθοπηνίδα. Σα δείβιαηα θοθάζζμκηαζ ζημοξ 4 μ C Υνχζδ DAPI Σμ DAPI είκαζ ιία θεμνίγμοζα πνςζηζηή πμο δεζιεφεζ ζζπονά DNA ηαζ θζβυηενμ ζζπονά RNA ηαζ πνδζζιμπμζείηαζ βζα ηδ ζήιακζδ ηςκ πονήκςκ ηυζμ ζε γςκηακμφξ υζμ ηαζ ζε ιμκζιμπμζδιέκμοξ ζζημφξ. Γζεβείνεηαζ απυ οπενζχδεξ θςξ ηαζ πανμοζζάγεζ δζαθμνεηζηά ιέβζζηα εηπμιπήξ, ακάθμβα ιε ημ ακ ζοκδέεηαζ ιε DNA ή RNA. Αληηδξαζηήξηα 1x PBT Γζάθοια DAPI 1:2500. Γηαδηθαζία 1. Μεηά ηδκ πνμζεήηδ δεοηενμβεκμφξ ακηζζχιαημξ ηαζ ηδκ έηπθοζδ ημο, αημθμοεεί πνμζεήηδ δζαθφιαημξ DAPI αναίςζδξ 1:2500 ηαζ επχαζδ βζα 10 72

84 θεπηά (ζηδκ πενίπηςζδ ηςκ θηενχκ ημο εκδθίημο δ δζάνηεζα ηδξ επχαζδξ ήηακ 30 θεπηά), ζημ ζημηάδζ ηαζ ζε εενιμηναζία δςιαηίμο οπυ ακαηίκδζδ. 2. ηδ ζοκέπεζα, απμιαηνφκμοιε ημ DAPI ηαζ λεπθέκμοιε ιε 1xPBT 3x15 θεπηά ζημ ζημηάδζ, ζε εενιμηναζία δςιαηίμο οπυ ακαηίκδζδ, πνμηεζιέκμο κα απμιαηνοκεμφκ ηα οπμθείιιαηα ημο. 3. Αημθμοεεί ιεηαθμνά ημο ζζημφ ζε ακηζηεζιεκμθυνμ πθάηα, έβηθεζζδ ημο ιε δζάθοια Vectashield ηαζ παναηήνδζδ. 2.6 Γεκηνπξγία δηαγνληδηαθώλ ζηειερώλ Γζα ηδ δδιζμονβία δζαβμκζδζαηχκ ζηεθεπχκ ηθςκμπμζήζαιε ημ επζεοιδηυ ηιήια DNA ζε θμνείξ πμο θένμοκ άηνα P-ιεηαεεηχκ ζημζπείςκ. Ζ πθαζιζδζαηή ηαηαζηεοή εζζήπεδ ιε έκεζδ ζε έιανοα Drosophila πνζκ ημ ζηάδζμ ζπδιαηζζιμφ ημο ηοηηανζημφ αθαζημδένιαημξ. Πνμηεζιέκμο κα επζηεοπεεί δ εκζςιάηςζδ ημο δζαβμκζδίμο ζημ βμκζδίςια ηδξ Drosophila, έβζκε ηαοηυπνμκδ έκεζδ πθαζιζδίμο Helper, ημ μπμίμ θένεζ ημ βμκίδζμ ηδξ Γ2-3 ηνακζπμγάζδξ. Πανμοζία ηνακζπμγάζδξ επζηοβπάκεηαζ δ ηζκδημπμίδζδ ηςκ P-ιεηαεεηχκ ζημζπείςκ. Ζ έκεζδ έβζκε ζημ μπίζεζμ ηιήια ημο ειανφμο, δεδμιέκμο υηζ ζε αοηήκ ηδ εέζδ εκημπίγμκηαζ ηα βαιεηζηά ηφηηανα, πμο είκαζ βκςζηά ςξ πμθζηά ηφηηανα (pole cells) Πνμεημζιαζία δείβιαημξ DNA Αληηδξαζηήξηα Γζάθοια εκέζεςκ: 5mΜ ΚCl, 10mΜ ΝaΖ 2 PΟ 4, pζ % αζεακυθδ 70% αζεακυθδ 3Μ CH 3 COONa ph 5,2 Γηαδηθαζία 1. Ακαιεζβκφμοιε 10ιg ηδξ επζεοιδηήξ πθαζιζδζαηήξ ηαηαζηεοήξ ηαζ 1ιg πθαζιζδίμο Helper. 2. Καηαηνδικίγμοιε ημ DNA πνδζζιμπμζχκηαξ 2,5V (1ml) 100% αζεακυθδξ ηαζ 1/10V CH 3 COONa. Δπχαζδ βζα 1 χνα ζημοξ -80 μ C. 3. Φοβμηέκηνζζδ ζε 13000rpm (Biofuge fresco, Hereus) βζα 30 θεπηά ζημοξ 4 μ C. 73

85 4. Απμιάηνοκζδ ημο οπενηεζιέκμο ηαζ πνμζεήηδ 500ιl 70% παβςιέκδξ αζεακυθδξ. 5. Φοβμηέκηνζζδ ζε 13000rpm (Biofuge fresco, Hereus) βζα 15 θεπηά ζημοξ 4 μ C. 6. Απμιάηνοκζδ ημο οπενηεζιέκμο ηαζ ακαδζάθοζδ ζε 10ιl δζαθφιαημξ εκέζεςκ, έηζζ χζηε δ ηεθζηή ζοβηέκηνςζδ ημο πθαζιζδίμο κα είκαζ 1ιg/ιl. 7. Φοβμηέκηνζζδ ζε 13000rpm (Biofuge fresco, Hereus) βζα 15 θεπηά. 8. Ακαννυθδζδ ημο οπενηεζιέκμο ιε εζδζηή αεθυκα οθθμβή ειανφςκ ηαζ ιεηαζπδιαηζζιυξ βαιεηζηήξ ζεζνάξ ιε έκεζδ πθαζιζδζαημφ DNA Αληηδξαζηήξηα ηενευ ενεπηζηυ ιέζμκ βζα ηδ ζοθθμβή ειανφςκ Γμπεία ιε ενεπηζηυ ιέζμ ηαθθζένβεζαξ Halocarbon oil, series 700 Γηαδηθαζία Ζ δζαδζηαζία είκαζ δ ίδζα ιε αοηήκ πμο ακαθένεηαζ ζηδκ πανάβναθμ 2 (αήιαηα 1-3). Σμ ζηέθεπμξ πμο πνδζζιμπμζείηαζ είκαζ ημ w,f. Σα έιανοα ζοθθέβμκηαζ ακά 30 θεπηά ηαζ ημπμεεημφκηαζ ζε ζεζνά ζηδκ άηνδ ηαθοπηνίδαξ, ζηδκ μπμία έπεζ βίκεζ επίζηνςζδ ιε ηυθθα, ιε ημ μπίζεζμ άηνμ ημοξ πνμξ ηδκ έλς πθεονά (έηζζ χζηε κα είκαζ δοκαηή δ πνυζααζδ ηδξ αεθυκαξ). ηδ ζοκέπεζα, ηαθφπημκηαζ ιε εζδζηυ θάδζ (Halocarbon oil) βζα κα ιδκ αθοδαηςεμφκ. Μεηά ηδκ έκεζδ ηα έιανοα ακαπηφζζμκηαζ ζε εενιμηναζία 18 μ C ηαζ ζε ζοκεήηεξ ορδθήξ οβναζίαξ. Οζ εηημθαπηυιεκεξ πνμκφιθεξ ιεηαθένμκηαζ ζε πθαζηζηά ηοθζκδνζηά δμπεία ιε ενεπηζηυ ιέζμκ, υπμο ακαπηφζζμκηαζ ιέπνζ ηδκ εκδθζηίςζδ Σαοημπμίδζδ ηαζ πνςιμζςιζηή πανημβνάθδζδ εκεέζεςκ Αληηδξαζηήξηα Γμπεία ιε ενεπηζηυ ιέζμ ηαθθζένβεζαξ Γηαδηθαζία 1. Θεςνδηζηά, ηα εκήθζηα άημια πμο πνμηφπημοκ ιεηά ηδ δζαδζηαζία ιεηαζπδιαηζζιμφ ιε έκεζδ πθαζιζδζαημφ DNA εα θένμοκ ζε ηάπμζα 74

86 βαιεηζηά ηφηηανα έκεεζδ ημο δζαβμκζδίμο. Πνμηεζιέκμο κα ηαοημπμζδεμφκ μζ πζεακέξ εκεέζεζξ ηα άημια αοηά δζαζηαονχκμκηαζ ιε άημια ημο ζηεθέπμοξ w,f. Καζ ηα δφμ ζηεθέπδ έπμοκ θεοηυ πνχια ιαηζχκ. ημοξ απμβυκμοξ ηδξ δζαζηαφνςζδξ ιε ηα w,f άημια δ πανμοζία εκεέζεςκ βίκεηαζ ακηζθδπηή ιε ηδκ αθθαβή πνχιαημξ ζημ ιάηζ. Αοηυ μθείθεηαζ ζημ βεβμκυξ, υηζ ημ πθαζιίδζμ ιεηαζπδιαηζζιμφ θένεζ ημ βμκίδζμ-ιάνηονα white (w). 2. Σα άημια πμο θένμοκ πνςιαηζζηυ ιάηζ δζαζηαονχκμκηαζ ιε άημια ημο ζηεθέπμοξ w; Bl 1 /CyO;TM2/TM6B,Tb 1. ε αοηυ ημ ζηάδζμ ιπμνμφκ κα ηαοημπμζδεμφκ εκεέζεζξ ζημ Υ πνςιυζςια (Δηθ.4Α). 3. Αημθμοεεί δζαζηαφνςζδ ηςκ απμβυκςκ ηδξ F1 ιε άημια ημο ζηεθέπμοξ w; Bl 1 / CyO ; TM2 / TM6B, Tb 1. ε αοηυ ημ ζηάδζμ ηαοημπμζμφκηαζ εκεέζεζξ ζηα Υ (Δηθ.4Β), 2 μ ηαζ 3 μ πνςιμζχιαηα (Δηθ.4Γ). Α. w, f,?/y ;?/+ ;?/+ X w ; Bl 1 / CyO ; TM2 / TM6B, Tb 1 Αλ ζηελ F1 πξνθύςνπλ κόλν άηνκα κε ρξσκαηηζηά κάηηα, ε έλζεζε βξίζθεηαη ζην Υ ρξσκόζσκα Β. w, f,? ;?/+ ;?/+ X w/τ ; Bl 1 / CyO ; TM2 / TM6B, Tb 1 F1: w;bl 1 /CyO ;TM2/TM6B,Tb1 Υ w,f,?/y;?/ Bl 1 (ή CyO);?/ ΣΜ2 (ή TM6B, Tb 1 ) Αλ ζηελ F2 πξνθύςνπλ κόλν άηνκα κε ρξσκαηηζηά κάηηα, ε έλζεζε βξίζθεηαη ζην Υ Γ. F1: w ; Bl 1 /CyO;TM2/TM6B,Tb1 Υ w,f,?/y;?/ Bl 1 (ή CyO);?/ ΣΜ2(ή TM6B, Tb 1 ) Αλ ζηελ F2 πξνθύςνπλ άηνκα ΣΜ2/ΣΜ6Β κε ρξσκαηηζηά κάηηα, ε έλζεζε βξίζθεηαη ζην 2 ν ρξσκόζσκα. Αλ ζηελ F2 πξνθύςνπλ άηνκα Bl 1 /CyO κε ρξσκαηηζηά κάηηα, ε έλζεζε βξίζθεηαη ζην 3 o ρξσκόζσκα. Δηθόλα 4: ρεκαηηθή απεηθόληζε ηεο δηαδηθαζίαο ρξσκνζσκηθήο ραξηνγξάθεζεο ησλ ελζέζεσλ 75

87 2.7 Κισλνπνίεζε γνληδίσλ ζε πιαζκηδηαθνύο θνξείο Παναζηεοή δεηηζηχκ ηοηηάνςκ E. Coli Σα δεηηζηά ηφηηανα έπμοκ ηδκ ζηακυηδηα κα πνμζθαιαάκμοκ πθαζιζδζαηυ DNA απυ ημ πενζαάθθμκ ιε ιία δζαδζηαζία ιεηαζπδιαηζζιμφ ηαζ πνμηφπημοκ ιε ηαηάθθδθδ επελενβαζία ααηηδνζαηχκ ζηεθεπχκ E. coli. Τπάνπμοκ δφμ ηνυπμζ ιεηαζπδιαηζζιμφ ηαζ δζάθμνεξ ιέεμδμζ δδιζμονβίαξ δεηηζηχκ ηοηηάνςκ ακάθμβα ιε ηδκ πνμηζιχιεκδ δζαδζηαζία ιεηαζπδιαηζζιμφ. οβηεηνζιέκα, ηα δεηηζηά ηφηηανα ιπμνμφκ κα ιεηαζπδιαηζζημφκ ιε δθεηηνμδζάηνδζδ, ηαηά ηδκ μπμία οπυηεζκηαζ ζε ζφκημιμ δθεηηνζηυ ζμη, ή ιε εενιζηυ ζμη πανμοζία CaCl 2. Σμ CaCl 2 πνμςεεί ηδ δέζιεοζδ ημο DNA πάκς ζηα ηφηηανα, ημ μπμίμ εζζένπεηαζ ζε αοηά ιε ηδκ εθανιμβή εενιζημφ ζμη. Γζα ηδ δδιζμονβία δεηηζηχκ ηοηηάνςκ πνδζζιμπμζήεδηε ημ πνςηυημθθμ ηςκ (Inoue, Nojima et al. 1990). Αληηδξαζηήξηα LB άβαν: 35gr/1L dh 2 O Τβνυ ενεπηζηυ ιέζμ LB: 20gr/1L dh 2 O Τβνυ ενεπηζηυ ιέζμ SOB: 28.09gr ενεπηζηυ Hanahan s/1l dh 2 O, 10mM MgCl 2. Σα ενεπηζηά ιέζα παναζηεοάγμκηαζ ηαζ απμζηεζνχκμκηαζ απεοεείαξ Γζάθοια TB:10mM HEPES ph 6.7, 15mM CaCl 2, 55mM MnCl 2, 250mM KCl. Ακαιεζβκφμοιε υθα ηα ακηζδναζηήνζα εηηυξ ημο MnCl 2 ηαζ νοειίγμοιε ημ ph ζε 6.7 ιε ΚOH. ηδ ζοκέπεζα πνμζεέημοιε ηo MnCl 2. DMSO (dimethyl-sulfoxide) Γηαδηθαζία 1. Με ηδ αμήεεζα ιίαξ πζπέηαξ pasteur, πμο έπμοιε εενιάκεζ έηζζ χζηε κα ζηνμββοθμπμζδεεί ημ νφβπμξ ηδξ θαιαάκμοιε ηφηηανα ημο ααηηδνζαημφ ζηεθέπμοξ πμο ιαξ εκδζαθένεζ ηαζ απθχκμοιε ζε έκα ηνοαθίμ petri, ημ μπμίμ πενζέπεζ LB άβαν πςνίξ ακηζαζμηζηυ. Δπςάγμοιε ζε εάθαιμ ζηαεενήξ εενιμηναζίαξ 37 μ C βζα 16 χνεξ πενίπμο. Ζ υθδ δζαδζηαζία βίκεηαζ ζε ζηείνεξ ζοκεήηεξ. 76

88 2. Με αηνμνφβπζμ ιl θαιαάκμοιε ιία ιμκαδζηή απμζηία ηαζ ιεηαθένμοιε ζε 3ml οβνμφ ενεπηζημφ ιέζμο LB. Αημθμοεεί επχαζδ οπυ ζζπονή ακαηίκδζδ ζηα 225rpm ζε εενιμηναζία 37 μ C βζα 16 χνεξ πενίπμο. 3. Με ηδκ μθμκφηηζα ηαθθζένβεζα ειαμθζάγμοιε 500ml οβνμφ ενεπηζημφ ιέζμο SOB. Δπςάγμοιε οπυ ζζπονή ακαηίκδζδ ζηα 225rpm ζε εενιμηναζία 37 μ C ιέπνζ δ μπηζηή απμννυθδζδ ζηα 600nm κα πάνεζ ηζιή ιεηαλφ 0,5 ηαζ 0,6. ε αοηυ ημ εφνμξ ηζιχκ δ ηαθθζένβεζα ανίζηεηαζ ζε εηεεηζηή θάζδ ακάπηολδξ. 4. Αημθμοεεί επχαζδ ζημκ πάβμ βζα 10 θεπηά ημοθάπζζημκ ηαζ θοβμηέκηνζζδ βζα 10 θεπηά ζηα 2500rpm (Rotina 35, Hettich) ζε εενιμηναζία 4 μ C. 5. Απμιάηνοκζδ ημο οπενηεζιέκμο ηαζ ήπζα ακαδζάθοζδ ημο ζγήιαημξ πμο πενζέπεζ ηα ααηηδνζαηά ηφηηανα ζε 100ml δζαθφιαημξ ΣΒ εενιμηναζίαξ 4 μ C. Δπχαζδ ζημκ πάβμ βζα 10 θεπηά. 6. Φοβμηέκηνζζδ ζηα 2500rpm (Rotina 35, Hettich) ζε εενιμηναζία 4 μ C βζα 10 θεπηά. 7. Απμιάηνοκζδ ημο οπενηεζιέκμο ηαζ ήπζα ακαδζάθοζδ ημο ζγήιαημξ ζε 18,6ml δζαθφιαημξ ΣΒ ηαζ 1,4ml DMSO. To DMSO δνα ςξ πανάβμκηαξ ηνομπνμζηαζίαξ ηςκ ηοηηάνςκ. Δπχαζδ βζα 10 θεπηά ζημκ πάβμ. 8. Γζακέιμοιε 100ιl ζε παβςιέκα ζςθδκάνζα eppendorf ηαζ ρφπμοιε απεοεείαξ πνδζζιμπμζχκηαξ είηε οβνυ άγςημ ή έκα δζάθοια 70% αζεακυθδξ ζε κενυ πμο έπεζ απμηηήζεζ ζδζαίηενα παιδθή εενιμηναζία θυβς δζαηήνδζδξ ημο ζε δμπείμ πμο πενζέπεζ λδνυ πάβμ. 9. Μεηαθένμοιε ζημοξ -80 μ C, υπμο θοθάζμκηαζ ιέπνζ κα πνδζζιμπμζδεμφκ Μεηαζπδιαηζζιυξ δεηηζηχκ ηοηηάνςκ E. coli ιε πθαζιζδζαηέξ ηαηαζηεοέξ Με ημ ιεηαζπδιαηζζιυ δεηηζηχκ ααηηδνζαηχκ ηοηηάνςκ επζηοβπάκεηαζ μ πμθθαπθαζζαζιυξ πθαζιζδζαηχκ ηαηαζηεοχκ. ηδκ πανμφζα ενεοκδηζηή ενβαζία αημθμοεήεδηε δ δζαδζηαζία ιεηαζπδιαηζζιμφ ιε εθανιμβή εενιζημφ ζμη πανμοζία CaCl 2. Γζα ημ ιεηαζπδιαηζζιυ ηςκ ααηηδνίςκ πνδζζιμπμζήεδηακ 10ng οπενεθζηςιέκμο πθαζιζδίμο ή μθυηθδνδ δ ακηίδναζδ ζφκδεζδξ ηιήιαημξ DNA ιε πθαζιζδζαηυ θμνέα. 77

89 Αληηδξαζηήξηα Τβνυ ενεπηζηυ ιέζμ LB Γζάθοια X-Gal: Γζαθφμοιε ηδκ ηαηάθθδθδ πμζυηδηαξ X-Gal ζε DMF (2-methylformamide), έηζζ χζηε δ ηεθζηή ζοβηέκηνςζδ κα είκαζ 40 mg/ml ηαζ θζθηνάνμοιε. Σμ δζάθοια θοθάζζεηαζ ζε εενιμηναζία -20 μ C Γζάθοια IPTG (Isopropyl α-d-1-thiogalactopyranoside)100mμ ηακαιοηίκδ (50 mg/ml) αιπζηζθθίκδ (100 mg/ml) Γηαδηθαζία 1. Μεηαθένμοιε έκα ζςθδκάνζμ eppendorf ιε δεηηζηά ηφηηανα απυ ημοξ -80 μ C ζε δμπείμ ιε πάβμ ηαζ ηα αθήκμοιε κα λεπαβχζμοκ. 2. Πνμζεέημοιε ηαηάθθδθδ πμζυηδηα DNA, ακαδεφμοιε εθαθνά ηαζ επςάγμοιε ζημκ πάβμ βζα 30 θεπηά. ε αοηή ηδ θάζδ ημ DNA πνμζημθθάηαζ πάκς ζηα ααηηδνζαηά ηφηηανα πανμοζία CaCl 2 πμο πενζέπεηαζ ζημ δζάθοια ηςκ ηοηηάνςκ. 3. Δθανιυγμοιε εενιζηυ ζμη ζημοξ 42 μ C βζα 45 δεοηενυθεπηα ηαζ αημθμφεςξ ιεηαθένμοιε ζημκ πάβμ βζα 1 1/2 θεπηυ. 4. Πνμζεέημοιε 900ιl LB ενεπηζημφ ιέζμο ζημ δζάθοια ηςκ ηοηηάνςκ ηαζ επςάγμοιε ζημοξ 37 μ C οπυ ακαηίκδζδ ζε 225rpm βζα 1 χνα. 5. Φοβμηεκηνμφιε ηδκ οβνή ηαθθζένβεζα ζε παιδθή ηαπφηδηα (2000rpm ζε Biofuge pico, Hereus) ηαζ απμιαηνφκμοιε ημκ ιεβαθφηενμ υβημο οπενηείιεκμο αθήκμκηαξ πενίπμο 100ιl. Ακαδζαθφμοιε ηα ηφηηανα ηαζ απθχκμοιε ζε ηνοαθίμ petri πμο θένεζ ζηενευ ενεπηζηυ ιέζμ LB άβαν ηαζ ακηζαζμηζηυ (ηακαιοηίκδ ή αιπζηζθθίκδ ζε ηεθζηή ζοβηέκηνςζδ 50ιg/ml ηαζ 100 ιg/ml ακηίζημζπα). Ζ πανμοζία ακηζαζμηζημφ επζηνέπεζ ηδκ ακάπηολδ ιυκμ ηςκ ηοηηάνςκ πμο έπμοκ πνμζθάαεζ ηδκ πθαζιζδζαηή ηαηαζηεοή, δεδμιέκμο υηζ αοηή θένεζ βμκίδζμ ακεεηηζηυηδηαξ ζε ζοβηεηνζιέκμ ακηζαζμηζηυ. 6. ηδκ πενίπηςζδ πμο ηα δεηηζηά ηφηηανα ιεηαζπδιαηίγμκηαζ ιε ημ πνμσυκ ηδξ ακηίδναζδξ ζφκδεζδξ ηιήιαημξ DNA ιε πθαζιζδζαηυ θμνέα ηαζ μ δεφηενμξ θένεζ ημ βμκίδζμ lacz πμο επζηνέπεζ ημ πνςιαηζηυ δζαπςνζζιυ ηςκ απμζηζχκ πμο έπμοκ πνμζθάαεζ ημ ακαζοκδοαζιέκμ DNA, ηα ηνοαθία επζζηνχκμκηαζ ιε 78

90 40 ιl δζαθφιαημξ X-Gal 40mg/ml ηαζ 40ιl IPTG 100mM. Σμ βμκίδζμ lacz ηςδζημπμζεί ημ έκγοιμ ηδξ α-βαθαηημζζδάζδξ. Σμ X-Gal οθίζηαηαζ ηαηάηιδζδ απυ ηδ α-βαθαηημζζδάζδ πανμοζία IPTG ιε απμηέθεζια κα ζπδιαηίγεηαζ έκα αδζάθοημ πνμσυκ πνχιαημξ ιπθε. ηδκ πενίπηςζδ πμο μ ααηηδνζαηυξ θμνέαξ έπεζ πνμζθάαεζ έκεεια, αοηυ δζαηανάζζεζ ημ ακμζηηυ πθαίζζμ ακάβκςζδξ (open reading frame, ORF) ημο βμκζδίμο lacz ιε απμηέθεζια κα ιδκ πανάβεηαζ θεζημονβζηή α-βαθαηημζζδάζδ ηαζ δ απμζηία κα θένεζ θεοηυ πνχια. Μεηά ηδκ επίζηνςζδ ημο ηνοαθίμο ιε X-Gal ηαζ 40ιl IPTG αημθμοεείηαζ δ δζαδζηαζία ημο αήιαημξ Δπχαζδ ζε εάθαιμ ζηαεενήξ εενιμηναζίαξ 37 μ C βζα 16 χνεξ πενίπμο Απμιυκςζδ πθαζιζδζαημφ DNA Γζα ηδκ απμιυκςζδ πθαζιζδζαημφ DNA αημθμοεήεδηακ δφμ δζαθμνεηζηά πνςηυημθθα. οβηεηνζιέκα, βζα εθανιμβέξ, ζηζξ μπμίεξ απαζηείηαζ DNA ορδθήξ ηαεανυηδηαξ, υπςξ είκαζ δ αθθδθμφπζζδ DNA, μζ εκέζεζξ ειανφςκ Drosophila βζα ηδκ δδιζμονβία δζαβμκζδζαηχκ ζηεθεπχκ, δ εκγοιζηή πέρδ ηαζ ακηίδναζδ ζφκδεζδξ ηιήιαημξ DNA ζε πθαζιζδζαηυ θμνέα ή δ in vitro ιεηαβναθή, πνδζζιμπμζήεδηακ ηα QIAGEN Plasmid Mini ηαζ Midi kit (Qiagen). Ζ δζαδζηαζία πμο αημθμοεήεδηε είκαζ δ ακαβναθυιεκδ ζημ εβπεζνίδζμ ηδξ εηαζνείαξ. Ακηίεεηα, ζε πενζπηχζεζξ, υπμο δεκ είκαζ ακαβηαία δ παναβςβή DNA ορδθήξ ηαεανυηδηαξ, υπςξ βζα πανάδεζβια βζα ηδκ επζθμβή απμζηζχκ πμο θένμοκ ακαζοκδοαζιέκμ DNA ιε δζαβκςζηζηή εκγοιζηή πέρδ, εθανιυζηδηε ημ πνςηυημθθμ θφζδξ ηςκ ααηηδνίςκ ιε αναζιυ πμο πενζβνάθεηαζ ζηδ ζοκέπεζα Λχζε βαθηεξηαθψλ θπηηάξσλ κε βξαζκφ Αληηδξαζηήξηα Τβνυ ενεπηζηυ ιέζμ LB (πανάβναθμξ 6.1) Γζάθοια STET: 100mM NaCl, 10mM Tris-HCl ph 8,0, 1mM EDTA ph 8,0, 5% TritonX-100 Γζάθοια Μ13-PEG (50ml): 10g PEG, 2.5M NaCl Λοζμγφιδ: 10 mg/ml ζε 10mM Tris-HCl, ph 8.0 RNAse A (10mg/ml) 79

91 Γζάθοια TE: 10mM Tris-HCl, 0.1mM EDTA Γηαδηθαζία 1. Διαμθζαζιυξ 2ml οβνμφ ενεπηζημφ ιέζμο LB ιε ιμκαδζηή ηαθθζένβεζα πμο έπεζ ακαπηοπεεί ζε ηνοαθίμ ιε ζηενευ ενεπηζηυ ιέζμ LB άβαν ηαζ επχαζδ βζα 16 χνεξ πενίπμο ζε εάθαιμ ζηαεενήξ εενιμηναζίαξ 37 μ C οπυ ζζπονή ακάδεοζδ (225rpm). 2. Φοβμηέκηνδζδ ζε 2500rpm (Biofuge pico, Hereus) βζα 5 θεπηά ζε εενιμηναζία δςιαηίμο ηαζ απμιάηνοκζδ ημο οπενηεζιέκμο. 3. Ακαδζάθοζδ ημο ζγήιαημξ, πμο πενζέπεζ ηα ααηηδνζαηά ηφηηανα ζε 350ιl δζαθφιαημξ STET ηαζ ιεηαθμνά ζε ζςθδκάνζα eppendorf 1,5ml. 4. Πνμζεήηδ 20ιl δζαθφιαημξ θοζμγφιδξ ζοβηέκηνςζδξ 10 mg/ml ηαζ ακάδεοζδ. 5. Μεηαθμνά ηςκ ζςθδκανίςκ ζε δμπείμ πμο πενζέπεζ κενυ, ημ μπμίμ έπεζ εενιακεεί ζημοξ 100 μ C ηαζ επχαζδ βζα 40 δεοηενυθεπηα. Πανμοζία θοζμγφιδξ ηαζ ορδθχκ εενιμηναζζχκ ηα ααηηήνζα οθίζηακηαζ θφζδ. 6. Φοβμηέκηνδζδ βζα 5 θεπηά ζε 13000rpm (Biofuge pico, Hereus) ζε εενιμηναζία δςιαηίμο. ηζξ ζοκεήηεξ αοηέξ ηαηαηνδικίγμκηαζ ηα οπμθείιιαηα ηςκ ααηηδνζαηχκ ηοηηάνςκ ηαζ ζημ εκαζχνδια πενζέπμκηαζ ηα κμοηθεσηά μλέα. 7. Μεηαθμνά ημο οπενηεζιέκμο ζε ηαεανυ ζςθδκάνζμ eppendorf 1,5ml, πνμζεήηδ 2ιl δζαθφιαημξ RNase A ηαζ επχαζδ βζα 30 θεπηά ζε εενιμηναζία δςιαηίμο. 8. Πνμζεήηδ 150ιl δζαθφιαημξ Μ13-PEG ηαζ πμθφ ηαθή ακάδεοζδ. 9. Φοβμηέκηνδζδ βζα 5 θεπηά ζε 13000rpm (Biofuge pico, Hereus) ζε εενιμηναζία δςιαηίμο. Πανμοζία άθαημξ ηαζ πμθφαζεοθεκμ-βθοηυθδξ ημ DNA ζπδιαηίγεζ ίγδια ζημκ ποειέκα ημο ζςθδκανίμο. 10. Απμιάηνοκζδ ημο οπενηεζιέκμο ηαζ ακαδζάθοζδ ημο ζγήιαημξ ζε 30ιl δζαθφιαημξ TE Πμζμηζημπμίδζδ κμοηθεσηχκ μλέςκ (DNA) Ζ πμζμηζημπμίδζδ ηςκ κμοηθεσηχκ έβζκε ιε δφμ ηνυπμοξ: α) ιε θςημιέηνδζδ ηαζ α) ιε δθεηηνμθυνδζδ ζε πήηηςια αβανυγδξ. 80

92 Πνζνηηθνπνίεζε λνπθιετθψλ νμέσλ (DNA) κε θσηνκέηξεζε Ζ ιέεμδμξ ααζίγεηαζ ιέηνδζδ ηδξ απμννυθδζδξ δείβιαημξ κμοηθεσηχκ μλέςκ ζε ιήηδ ηφιαημξ 260nm ηαζ 280nm. Σα δείβιαηα αναζχκμκηαζ ζε ηαηάθθδθμ υβημ κενμφ ή TE. Ανπζηά, δ μπηζηή απμννυθδζδ ιδδεκίγεηαζ πνδζζιμπμζχκηαξ ηοθθυ δείβια, ημ μπμίμ πενζέπεζ κενυ δ ΣΔ ακηίζημζπα. ηδ ζοκέπεζα ιεηνάηαζ ημ δζάθοια πμο πενζέπεζ ηα κμοηθεσηά μλέα ηαζ δ ζοβηέκηνςζδ ημοξ πνμζδζμνίγεηαζ απυ ημοξ ηφπμοξ: Α 260 x πανάβμκηαξ δζάθοζδξ x 50=ιg/ml DNA ηαζ Α 260 x πανάβμκηαξ δζάθοζδξ x 40=ιg/ml βζα RNA. Ο παναπάκς ηφπμξ πνμηφπηεζ απυ ημ βεβμκυξ υηζ δ Α 260 =1 ακηζζημζπεί ζε 50 ιg/ml DNA ή 40 ιg/ml RNA. Ο πανάβμκηαξ δζάθοζδξ είκαζ ημ ακηίζηνμθμ ηθάζια ηδξ αναίςζδξ πμο πνδζζιμπμζήεδηε, εκχ ιε ημοξ ηφπμοξ πμο πνμακαθένεδηακ πνμζδζμνίγεηαζ δ ζοβηέκηνςζδ ηςκ κμοηθεσηχκ μλέςκ ζημ ανπζηυ ηαζ υπζ ζημ αναζςιέκμ δείβια. Ζ ακαθμβία Α 260 /Α 280 απμηεθεί δείηηδ ηδξ ηαεανυηδηαξ ημο δείβιαημξ. Ακαθμβία ίζδ ιε 1,8 είκαζ εκδεζηηζηή ηαεανμφ δείβιαημξ DNA. Δίκαζ βκςζηυ υηζ μζ πνςηεΐκεξ απμννμθμφκ θςξ ζηα 280nm ηαζ, υηακ δ ακαθμβία Α 260 /Α 280 απμηηά ηζιή ιζηνυηενδ ημο 1,5, είκαζ αέααζμ υηζ ημ δείβια πενζέπεζ πνςηεσκζηέξ πνμζιίλεζξ Πνζνηηθνπνίεζε λνπθιετθψλ νμέσλ (DNA) κε ειεθηξνθφξεζε ζε πήθησκα αγαξφδεο Πνυηεζηαζ βζα ιία εκαθθαηηζηή ιέεμδμ πνμζδζμνζζιμφ ηδξ πμζυηδηαξ DNA ή RNA ιμνίςκ, δ μπμία ιπμνεί κα πνδζζιμπμζδεεί ζε ζοκδοαζιυ ιε ηδκ πμζμηζημπμίδζδ ιε θςημιέηνδζδ. Υνδζζιμπμζείηαζ ηονίςξ ζε πενζπηχζεζξ υπμο δ ζοβηέκηνςζδ ηςκ κμοηθεσηχκ μλέςκ είκαζ ζδζαίηενα παιδθή, βεβμκυξ πμο ηαεζζηά αδφκαημ ημκ αηνζαή πνμζδζμνζζιυ ηδξ ιε θςημιέηνδζδ. Ζ ιέεμδμξ ζηδνίγεηαζ ζημκ πνμζδζμνζζιυ δζα βοικμφ μθεαθιμφ ηδξ έκηαζδξ ημο θεμνζζιμφ πμο πανάβεηαζ ηαηά ηδκ εκζςιάηςζδ πνςζηζηχκ, υπςξ είκαζ ημ ανςιζμφπμ αζείδζμ, ζηα κμοηθεσηά μλέα. Ζ εηηίιδζδ ηδξ πμζυηδηα ηςκ κμοηθεσηχκ μλέςκ βίκεηαζ ιε ζφβηνζζδ ηδξ έκηαζδξ θεμνζζιμφ ημο άβκςζημο δείβιαημξ ιε δείβιαηα ακαθμνάξ βκςζηήξ ζοβηέκηνςζδξ Ζθεηηνμθυνδζδ κμοηθεσηχκ μλέςκ (DNA) ζε πήηηςια αβανυγδξ Δηηυξ απυ ηδκ πμζμηζημπμίδζδ ηςκ κμοηθεσηχκ μλέςκ δ δθεηηνμθυνδζδ ζε πήηηςια αβανυγδξ πανμοζζάγεζ επζπθέμκ εθανιμβέξ. Γζα πανάδεζβια, πανέπεζ ιία 81

93 μπηζηή εηηίιδζδ ηδξ πμζυηδηαξ ημο δείβιαημξ ηςκ κμοηθεσηχκ μλέςκ ηαζ πνδζζιεφεζ ζηδ δζάβκςζδ ηδξ απμηεθεζιαηζηυηδηαξ ακηζδνάζεςκ εκγοιζηήξ πέρδξ ή PCR. Δπζπθέμκ, ιπμνεί κα πνδζζιμπμζδεεί βζα ημ δζαπςνζζιυ ηαζ ηδκ απμιυκςζδ ηιδιάηςκ DNA ζοβηεηνζιέκμο ιήημοξ, ηα μπμία έπμοκ πνμηφρεζ ιεηά απυ εκγοιζηή πέρδ ή PCR. ηδνίγεηαζ ζημ βεβμκυξ υηζ ηα κμοηθεσηά μλέα θένμοκ ανκδηζηυ θμνηίμ ηαζ, ζοκεπχξ, ιπμνμφκ κα ιεηαηζκδεμφκ πνμξ ηδκ άκμδμ ηαηά ηδκ εθανιμβή δθεηηνζημφ πεδίμο. Με ηδκ δθεηηνμθυνδζδ ζε πήηηςια αβανυγδξ ηα κμοηθεσηά μλέα δζαπςνίγμκηαζ ηςκ αάζεζ ημο ιεβέεμοξ ημοξ, ακ ηαζ δ δζαιυνθςζδ ημοξ ζοιαάθθεζ ζδιακηζηά ζηδκ ιεηαηίκδζδ ημοξ. Σα ιζηνυηενα ιυνζα ιεηαηζκμφκηαζ βνδβμνυηενα, ηαεχξ ιπμνμφκ κα δζένπμκηαζ εοημθυηενα απυ ημοξ πυνμοξ ημο πδηηχιαημξ. Ζ αφλδζδ ηδξ ζοβηέκηνςζδξ αβανυγδξ ζημ πήηηςια πενζμνίγεζ ηδκ ηαπφηδηα ιεηαηίκδζδξ ηαζ επζηνέπεζ ημ δζαπςνζζιυ κμοηθεσηχκ μλέςκ ιζηνμφ ιμνζαημφ αάνμοξ. Ακηίεεηα, ηα παιδθήξ πενζεηηζηυηδηαξ ζε αβανυγδ πδηηχιαηα πνδζζιμπμζμφκηαζ βζα ημ δζαπςνζζιυ κμοηθεσηχκ μλέςκ ιεβάθμο ιεβέεμοξ. Δπζπθέμκ, δ αφλδζδ ηδξ εθανιμγυιεκδξ ηάζδξ μδδβεί ζε ιείςζδ ηδξ ζηακυηδηαξ δζαπςνζζιμφ Αληηδξαζηήξηα 50x TΑE (1L): 242gr Tris-Base, 57,1ml CH 3 COOH, 100ml 0,5M EDTA ph 8,0, dh 2 O. Βνςιζμφπμ αζείδζμ (20 mg/ml) 5x Γζάθοια πνςζηζηήξ: 50% βθοηενυθδ, 10mM EDTA ph 8, 0.4% ηοακμφ ηδξ ανςµμθαζκυθδξ (bromophenol blue) αβανυγδ Γηαδηθαζία 1. Παναζηεοάγμοιε ημ πήηηςια ιε πνμζεήηδ ηαηάθθδθδξ πμζυηδηαξ αβανυγδξ ζε 1X ΣΑΔ ηαζ εένιακζδ. οκήεςξ πνδζζιμπμζμφιε πδηηχιαηα πενζεηηζηυηδηαξ 1%w/v. 2. Αθήκμοιε κα ηνοχζεζ εθάπζζηα ζε εενιμηναζία δςιαηίμο ηαζ πνμζεέημοιε ανςιζμφπμ αζείδζμ έηζζ χζηε δ ηεθζηή ημο ζοβηέκηνςζδ κα είκαζ 1ιg/ml ηαζ ακαδεομοιε. 82

94 3. Μεηαθένμοιε ημ δζάθοια ζε ζοζηεοή πμο θεζημονβεί ςξ εηιαβείμ ηαζ ζε ημπμεεημφιε ζε εζδζηά δζαιμνθςιέκεξ εέζδξ ηδξ ζοζηεοήξ εζδζηυ πθαζηζηυ πηεκάηζ πνμηεζιέκμο κα δδιζμονβήζμοιε ηζξ εέζεζξ ζηζξ μπμίεξ εα θμνηςεμφκ ηα δείβιαηα. Αθήκμοιε κα ζηενεμπμζδεεί ημ πήηηςια. 4. Αθαζνμφιε ημ πηεκάηζ ηαζ πνμζεέημοιε 1x δζάθοια TAE ιέπνζ κα ηαθοθεεί πθήνςξ ημ πήηηςια. 5. Φμνηχκμοιε ιε πνμζμπή ηα δείβιαηα, ζηα μπμία έπμοιε πνμζεέζεζ ημ δζάθοια πνςζηζηήξ ζε ηεθζηή ζοβηέκηνςζδ 1x ζηζξ ηαηάθθδθα δζαιμνθςιέκεξ εέζεζξ. 6. οκδέμοιε ιε πνμζμπή ηα δθεηηνυδζα ηαζ νοειίγμοιε ηδκ ηάζδ, ακάθμβα ιε ηδκ επζεοιδηή ακάθοζδ. οκήεςξ, νοειίγμοιε ζηα V, αθθά ζε πενζπηχζεζξ πμο απαζηείηαζ ηαθφηενμξ δζαπςνζζιυξ ηςκ γςκχκ ιπμνμφιε κα νοειίζμοιε ζηα 30-50V. 7. Αημθμοεεί παναηήνδζδ ιε ηδ πνήζδ θάιπαξ UV Απμιυκςζδ DNA απυ πήηηςια αβανυγδξ Ζ δζαδζηαζία αοηή πνδζζιμπμζήεδηε βζα ηδκ απμιυκςζδ ηιδιάηςκ DNA πμο πνμέηορακ ιεηά απυ εκγοιζηή πέρδ ή PCR ηαζ πνδζζιμπμζήεδηακ ζε ακηζδνάζεζξ ζφκδεζδξ ή βζα ηδκ απμιυκςζδ ηιδιάηςκ DNA, ηα μπμία απμηέθεζακ ιήηνα βζα ηδκ ακηίδναζδ ζφκδεζδξ ηιήιαημξ DNA ιε πθαζιζδζαηυ θμνέα. Γζα ηδκ απμιυκςζδ DNA απυ πήηηςια αβανυγδξ πνδζζιμπμζήζαιε ηνία δζαθμνεηζηά ζηεοάζιαηα, ηα: α) QIAquick Gel Extraction Kit (Qiagen), πμο είκαζ ηαηάθθδθμ βζα ηιήιαηα DNA ιεβέεμοξ 70bp-10Kb, α) QIAEX II Gel Extraction Kit (Qiagen), πμο είκαζ ηαηάθθδθμ βζα ηιήιαηα DNA ιεβέεμοξ 40bp-50Kb ηαζ β) Wizard SV Gel and PCR Clean-Up system (Promega), πμο πνδζζιμπμζήεδηε βζα ηδκ απμιυκςζδ ηςκ ηιδιάηςκ DNA πμο πνμήθεακ ιεηά απυ PCR ηαζ επνυηεζημ κα απμηεθέζμοκ ημ οπυζηνςια βζα ηδκ in vitro ιεηαβναθή. ε υθεξ ηζξ πενζπηχζεζξ αημθμοεήεδηακ ηα πνςηυημθθα πμο ακαβνάθμκηαζ ζηα ακηίζημζπα εβπεζνίδζα ηςκ εηαζνεζχκ. 83

95 2.7.7 Δκγοιζηή πέρδ αθθδθμοπίαξ DNA ιε πενζμνζζηζηέξ εκδμκμοηθεάζεξ Οζ πενζμνζζηζηέξ εκδμκμοηθεάζεξ είκαζ έκγοια, ηα μπμία ηυαμοκ δίηθςκα ιυνζα DNA ζε ζοβηεηνζιέκεξ εέζεζξ ακαβκχνζζδξ (εέζεζξ πενζμνζζιμφ). Φοζζμθμβζηά εκημπίγμκηαζ ζηα ααηηήνζα, υπμο πανέπμοκ έκα ιδπακζζιυ άιοκαξ έκακηζ ηςκ ζχκ. Ακαβκςνίγμοκ παθζκδνμιζηέξ αθθδθμοπίεξ ηαζ δδιζμονβμφκ ημιέξ ζηδκ ίδζα αηνζαχξ εέζδ ζε ηάεε ηθχκμ. ηδ ιμνζαηή αζμθμβία πνδζζιμπμζμφκηαζ εηηεκχξ βζα ηδκ απμιυκςζδ ζοβηεηνζιέκςκ ηιδιάηςκ DNA ηαζ ηδ ζφκδεζδ ημοξ ιε πθαζιζδζαημφξ θμνείξ. Αληηδξαζηήξηα 10x δζάθοια πενζμνζζηζηήξ εκδμκμοηθεάζδξ Έκγοιμ πενζμνζζιμφ Πθαζιζδζαηυ ή βεκςιζηυ DNA 10mg/ml BSA (δ BSA δνα ςξ πανάβμκηαξ ζηαεενμπμίδζδξ ηςκ εκγφιςκ) 5x δζάθοια πνςζηζηήξ βζα DNA Γηαδηθαζία 1. Πνμεημζιάγμοιε ηδκ ακηίδναζδ πέρδξ (10-20ιl): V 1 ιl DNA, 1x δζάθοια πενζμνζζηζηήξ εκδμκμοηθεάζδξ, 1x BSA (υηακ απαζηείηαζ), πμζυηδηα εκγφιμο ακάθμβα ιε ηδκ πμζυηδηα ημο DNA (ζε ηαιία πενίπηςζδ μ υβημξ ημο εκγφιμο πμο πνδζζιμπμζείηαζ δε εα πνέπεζ κα οπενααίκεζ ημ 1/10 ημο υβημο ηδξ ζοκμθζηήξ ακηίδναζδξ, δζυηζ δ βθοηενυθδ, ζηδκ μπμία δζαθφμκηαζ ηα έκγοια, δνα ακαζηέθθμκηαξ ηδξ ακηίδναζδ πέρδξ), ddh 2 O. 2. Ακαδεφμοιε ηαζ επςάγμοιε βζα 2 χνεξ πενίπμο ζηδκ ηαηάθθδθδ εενιμηναζία (ζοκήεςξ ζημοξ 37 μ C, οπάνπμοκ, υιςξ ηαζ έκγοια πμο δνμοκ ζε παιδθυηενεξ ή ορδθυηενεξ εενιμηναζίεξ). 3. Απεκενβμπμίδζδ ημο εκγφιμο ιε εένιακζδ (ζοκήεςξ ζημοξ 65 μ C βζα 20 θεπηά, οπάνπμοκ, υιςξ έκγοια ηα μπμία δεκ απεκενβμπμζμφκηαζ ιε ημκ ηνυπμ αοηυ). Δκαθθαηηζηά, δ απεκενβμπμίδζδ βίκεηαζ ιε ηδκ πνμζεήηδ δζαθφιαημξ πνςζηζηήξ βζα DNA ζε ηεθζηή ζοβηέκηνςζδ 1x. ε αοηήκ ηδκ πενίπηςζδ ηα πενζμνζζηζηά έκγοια απεκενβμπμζμφκηαζ θυβς ηδξ πανμοζίαξ EDTA ζημ δζάθοια ηδξ πνςζηζηήξ. 4. Ζθεηηνμθυνδζδ ηςκ δεζβιάηςκ. 84

96 2.7.8 Ακηίδναζδ ζφκδεζδξ ηιήιαημξ DNA ιε πθαζιζδζαηυ θμνέα Ζ ακηίδναζδ δζαιεζμθααείηαζ απυ ημ έκγοιμ Σ4 DNA θζβάζδ, ημ μπμίμ ηαηαθφεζ ημ ζπδιαηζζιυ θςζθμδζεζηενζηχκ δεζιχκ ακάιεζα ζε 5 θςζθμνζηέξ μιάδεξ ηαζ 3 οδνμλοθμιάδεξ. Με ημκ ηνυπμ αοηυ ιπμνμφκ κα ζοκδεεμφκ ηιήιαηα DNA πμο έπμοκ πνμηφρεζ απυ εκγοιζηή πέρδ ηαζ θένμοκ ζοιπθδνςιαηζηά ή ηοθθά άηνα. ηζξ ακηζδνάζεζξ ζφκδεζδξ ζδιακηζηυ νυθμ ηαηέπεζ δ ακαθμβία ιμνίςκ πθαζιζδζαημφ θμνέα ηαζ εκεέιαημξ, ηα ιεβέεδ πθαζιζδζαημφ θμνέα ηαζ εκεέιαημξ ηαζ ημ είδμξ ηςκ άηνςκ. ηζξ πενζζζυηενεξ πενζπηχζεζξ πνδζζιμπμζήεδηε ακαθμβία 1:3. Αληηδξαζηήξηα 1x δζάθοια ζφκδεζδξ: 50 mm Tris-HCl, 10 mm MgCl 2, 1 mm ATP, 10 mm Dithiothreitol, ph 25 C Σ4 DNA θζβάζδ 20mM ATP Ακηίδναζδ ζφκδεζδξ: V1 ιl εκεέιαημξ, V2 ιl πθαζιζδζαημφ θμνέα, 1x δζάθοια ζφκδεζδξ, 1ιl Σ4 DNA θζβάζδ, 1mM ATP, dh 2 O. Γηαδηθαζία 1. Πνμεημζιάγμοιε ημ ιείβια ηδξ ακηίδναζδξ ζφκδεζδξ ηαζ επςάγμοιε βζα 16 χνεξ πενίπμο ζημοξ 18 μ C. 2. Απεκενβμπμζμφιε ηδ θζβάζδ ιε εένιακζδ ζημοξ 65 μ C βζα 20 θεπηά. 3. Με ηδκ ακηίδναζδ ιεηαζπδιαηίγμοιε δεηηζηά ηφηηανα E. Coli. ηδκ πενίπηςζδ πμο πνδζζιμπμζήζαιε ημκ πθαζιζδζαηυ θμνέα PCR II-TOPO (Invitrogen) βζα ηδ ζφκδεζδ ηιδιάηςκ DNA πμο έπμοκ πνμηφρεζ απυ PCR αημθμοεήζαιε ημ πνςηυημθθμ πμο ακαβνάθεηαζ ζημ εβπεζνίδζμ ηδξ εηαζνείαξ. 2.8 Αιπζηδσηή αληίδξαζε πνιπκεξάζεο (Polymerase Chain Reaction) Ζ αθοζζδςηή ακηίδναζδ πμθοιενάζδξ πνδζζιμπμζείηαζ βζα ημκ πμθθαπθαζζαζιυ ζοβηεηνζιέκςκ αθθδθμοπζχκ DNA ηαζ πανμοζζάγεζ πμζηίθεξ εθανιμβέξ, υπςξ είκαζ βζα πανάδεζβια δ δζάβκςζδ απμζηζχκ ιεηαζπδιαηζζιέκςκ 85

97 ααηηδνίςκ πμο έπμοκ πνμζθάαεζ ακαζοκδοαζιέκμ DNA, δ παναβςβή ηιδιάηςκ DNA πμο θένμοκ ζηα άηνα ημοξ αθθδθμοπίεξ οπμηζκδηχκ ηαζ ιπμνμφκ κα πνδζζιεφζμοκ ςξ ιήηνα βζα ηδκ in vitro ιεηαβναθή ηαζ άθθεξ. ηδνίγεηαζ ζηδκ εκαθθαζζυιεκδ εθανιμβή εφνμοξ εενιμηναζζχκ χζηε κα επζηνέπεηαζ δ δζαδμπζηή απμδζάηαλδ ηαζ εκγοιαηζηή ακηζβναθή εκυξ επζθεβιέκμο ηιήιαημξ DNA. Μζηνά ηιήιαηα DNA, πμο μκμιάγμκηαζ εηηζκδηέξ (primers) ηαζ είκαζ ζοιπθδνςιαηζηά ζηδκ αθθδθμοπία-ζηυπμ, ηαεχξ ηαζ δ πανμοζία ιίαξ DNA πμθοιενάζδξ είκαζ απαναίηδηα ζημζπεία βζα ηδκ εθανιμβή ηδξ ιεευδμο. Καηά ηδκ ελέθζλδ ηδξ ιεευδμο ημ παναβυιεκμ DNA πνδζζιμπμζείηαζ ςξ ιήηνα βζα ακηζβναθή ιε απμηέθεζια δ πμζυηδηα ημο επζεοιδημφ ηιήιαημξ DNA κα αολάκεηαζ εηεεηζηά. Αληηδξαζηήξηα Δηηζκδηέξ (primers) Πνυηεζηαζ βζα ιζηνέξ αθθδθμοπίεξ DNA πμο πνδζζιμπμζμφκηαζ ακα γέοβδ ηαζ είκαζ ζοιπθδνςιαηζηέξ ςξ πνμξ ηα 3 άηνα ηςκ κμδιαηζηχκ ηαζ ακηζ-κμδιαηζηχκ ηθχκςκ ημο ηιήιαημξ DNA πμο ιαξ εκδζαθένεζ κα πμθθαπθαζζάζμοιε. Ο επζηοπήξ ζπεδζαζιυξ ηςκ εηηζκδηχκ πνμτπμεέηεζ ηδκ ηήνδζδ ηάπμζςκ ααζζηχκ ηακυκςκ ηαζ είκαζ ζδζαίηενα ζδιακηζηυ κα ιδκ οπάνπμοκ ιεβάθεξ απμηθίζεζξ υζμκ αθμνά ζηδ εενιμηναζία απμδζάηαλδξ (Tm) ιεηαλφ ηςκ εηηζκδηχκ εκυξ γεφβμοξ. Οζ εηηζκδηέξ πμο πνδζζιμπμζήεδηακ ακαβνάθμκηαζ ζημ πανάνηδια Γ. DNA πμθοιενάζεξ 1. Taq DNA πμθοιενάζδ 5U/ιl: Πνυηεζηαζ βζα έκα έκγοιμ πμο έπεζ απμιμκςεεί απυ ημ ααηηδνζαηυ ζηέθεπμξ Thermus aquaticus, είκαζ ζηαεενυ ζε ορδθέξ εενιμηναζίεξ ηαζ έπεζ δναζηζηυηδηα 5 3 DNA πμθοιενάζδξ ηαζ 5 3 ελςκμοηθεάζδξ. Δπεζδή πανμοζζάγεζ ορδθή ζοπκυηδηα θαεχκ πνδζζιμπμζήεδηε ζε δζαδζηαζίεξ, βζα ηζξ μπμίεξ δεκ είκαζ ακαβηαία δ πζζηή ακηζβναθή ηιδιάηςκ DNA, υπςξ είκαζ δ δζάβκςζδ ιεηαζπδιαηζζιέκςκ απμζηζχκ ααηηδνίςκ. 2. Hot Star Taq DNA πμθοιενάζδ 5U/ιl: Πνυηεζηαζ βζα ιία εζδζηά ηνμπμπμζδιέκδ Taq DNA πμθοιενάζδ, δ μπμία επζηνέπεζ ημκ πμθθαπθαζζαζιυ πμθφπθμηςκ DNA οπμζηνςιάηςκ ηαζ πνδζζιμπμζήεδηε βζα ηδκ παναβςβή ηιδιάηςκ DNA πμο πνδζίιεοζακ ςξ ιήηνα ηαηά ηδκ in vitro ιεηαβναθή. 86

98 3. Pfu DNA πμθοιενάζδ 2,5U/ιl: Πνυηεζηαζ βζα έκα έκγοιμ πμο έπεζ απμιμκςεεί απυ ημ ανπαίμ ααηηήνζμ Pyrococcus furiosus, είκαζ ζηαεενυ ζε ορδθέξ εενιμηναζίεξ ηαζ έπεζ δναζηζηυηδηα 5 3 DNA πμθοιενάζδξ ηαζ 3 5 ελςκμοηθεάζδξ, πμο επζηνέπεζ ηδ δζάβκςζδ ηαζ επζδζυνεςζδ ηςκ θαεχκ ηαηά ηδκ ακηζβναθή ημο DNA. Χξ εη ημφημο, πανμοζζάγεζ ιζηνή ζοπκυηδηα θαεχκ ηαζ πνδζζιμπμζήεδηε ζε πενζπηχζεζξ, υπμο ήηακ ακαβηαία δ ορδθήξ πζζηυηδηαξ ακηζβναθή, υπςξ βζα ημκ πμθθαπθαζζαζιυ ηιδιάηςκ DNA ηα μπμία πνυηεζηαζ κα πνδζζιμπμζδεμφκ βζα ηδ δδιζμονβία βμκζδζαηχκ ηαηαζηεοχκ. 10x δζαθφιαηα πμθοιεναζχκ Γζάθοια Taq DNA πμθοιενάζδξ: 200mM Tris-HCl, 100mM (NH 4 ) 2 SO 4, 100mM KCl, 20mM MgSO 4, 0.1% Triton X-100 Γζάθοια Pfu DNA πμθοιενάζδξ: 200mM Tris-HCl, 100mM (NH 4 ) 2 SO 4, 100mM KCl, 1 mg/ml BSA, 1% (v/v) Triton X-100, 20mM MgSO 4. Γεμλονζαμκμοηθεμηίδζα (dntps): datp 100mM, dttp 100mM, dctp 100mM, dgtp 100mM MgSO 4 25mM Γηαδηθαζία 1. Παναζηεοάγμοιε ημ ιείβια ακηίδναζδξ, ημ μπμίμ απμηεθείηαζ απυ 1x δζάθοια πμθοιενάζδξ, ηαηάθθδθδ πμζυηδηα ημο γεφβμοξ εηηζκδηχκ (0,1-0,5ιg), 0,2-0,3mM dntps, ηαηάθθδθδ πμζυηδηα DNA πμθοιενάζδξ (0,1-1U), ημ δείβια DNA ηαζ ddh 2 O. ε πενζπηχζεζξ, υπμο απαζηήεδηε αφλδζδ ηδξ πμζυηδηαξ ημο πνμσυκημξ πνμζεέζαιε MgSO 4 ζε ηαηάθθδθεξ ζοβηεκηνχζεζξ. Σα Mg 2+ εκζζπφμοκ ηδ δνάζδ ηδξ DNA πμθοιενάζδξ. 2. Μεηαθένμοιε ηα δείβιαηα ζε εενιζηυ ηοηθμπμζδηή (Thermal Cycler) ηαζ εθανιυγμοιε πνυβναιια πμο πενζθαιαάκεζ ηα αηυθμοεα αήιαηα:α) ανπζηή απμδζάηαλδ ημο DNA ζε ορδθή εενιμηναζία (94-95 μ C) βζα 4-5 θεπηά, α) απμδζάηαλδ ζημοξ μ C βζα 30 δεοηενυθεπηα, β) οανζδμπμίδζδ ηςκ εηηζκδηχκ ιε ζοιπθδνςιαηζηέξ πενζμπέξ ημο DNA ζε παιδθυηενδ εενιμηναζία (50-65 μ C), ακάθμβα ιε ηζξ εενιμηναζίεξ απμδζάηαλδξ ηςκ εηηζκδηχκ, δ) επζιήηοκζδ, ηαηά ηδκ μπμία θαιαάκεζ πχνα δ ζφκεεζδ κέμο δίηθςκμο ιμνίμο DNA ιε ηδ δνάζδ ηδξ DNA πμθοιενάζδξ (72 μ C) βζα 1 θεπηυ, ε) επακάθδρδ ηςκ αδιάηςκ α-δ βζα 87

99 19-29 επζπθέμκ ηφηθμοξ ηαζ ζη) ηεθζηή επζιήηοκζδ βζα 5-10 θεπηά ζημοξ 72 μ C. ε ηάπμζεξ πενζπηχζεζξ αημθμοεήεδηε πνςηυημθθμ ζηαδζαηήξ ιείςζδξ ηδξ εενιμηναζίαξ οανζδμπμίδζδξ ηαηά 5 μ C ακά ηφηθμ ή αφλδζδξ ημο ανζειμφ ηςκ ηφηθςκ πνμηεζιέκμο κα παναπεεί πενζζζυηενμ πνμσυκ. Δπζπθέμκ, ζηζξ πενζπηχζεζξ, υπμο απαζηείηαζ ορδθήξ πζζηυηδηαξ ακηζβναθή πνδζζιμπμζήζαιε ιζηνυ ανζειυ ηφηθςκ. 3. Αημθμοεεί δθεηηνμθυνδζδ ηςκ δεζβιάηςκ ζε πήηηςια αβανυγδξ. 2.9 Μέζνδνη επαγσγήο δηαγνληδίσλ Ηζημ-εζδζηή οπενέηθναζδ δζαβμκζδίςκ Σα GAL4 ζηεθέπδ έπμοκ πνμηφρεζ ιε έκεεζδ ημο ιεηαβναθζημφ εκενβμπμζδηή GAL4 ημο γοιμιφηδηα ηαεμδζηά ηςκ νοειζζηζηχκ ζημζπείςκ ζοβηεηνζιέκςκ βμκζδίςκ. Υνδζζιμπμζμφκηαζ ζε ζοκδοαζιυ ιε ζηεθέπδ, ηα μπμία θένμοκ δζαβμκίδζα ηαεμδζηά UAS ζημζπείςκ βζα ηδκ ζζημεζδζηή έηθναζδ ηςκ δζαβμκζδίςκ αοηχκ (Δηθ.4). Δηθόλα 4: Αξρή ιεηηνπξγίαο ηνπ ζπζηήκαηνο UAS/GAL4, ηνμπμπμζδιέκδ απυ (Brand and Perrimon 1993) 88

100 2.9.2 Ηζημ-εζδζηή επαβςβή RNAi Γζα ηδκ ζζημ-εζδζηή επαβςβή RNAi πνδζζιμπμζήζαιε ημ ζφζηδια UAS/GAL4 (Brand and Perrimon 1993). Mζα ζεζνά Gal4s ζηεθεπχκ (Κεθ.3, ελόηεηα 3.1 Πίλ.1) δζαζηαονχεδηε ιε ημ w;;uas:ir-ilk (βι. ΠΑΡΑΡΣΗΜΑ Α). Με αοηυκ ημκ ηνυπμ απμζζςπήζαιε ηδκ έηθναζδ ηδξ ILK ζε ιζα ζεζνά απυ ζζημοξ ηαζ ακαπηολζαηά ζηάδζα (βι. Κεθ. ΑΠΟΣΔΛΔΜΑΣΑ, ελόη.3.1,πηλ.1). 89

101 ΠΑΡΑΡΣΗΜΑ Α-ηειέρε Drosophila w,f: Φένεζ οπμηεθείξ ιεηαθθάλεζξ ζε μιμγοβςηία ηςκ θοθμζφκδεηςκ βμκζδίςκ w (white) ηαζ f(forked). Ζ πνχηδ μδδβεί ζε θεοηυ πνχια ιαηζχκ ηαζ δ δεφηενδ ζε ηαραθζζιέκεξ ζιήνζββεξ. Υνδζζιμπμίδεδηε βζα ηδκ έκεεζδ δζαβμκζδίςκ ιε έκεζδ ηαζ ςξ ζηέθεπμξ ακαθμνάξ ζε πεζνάιαηα θακμηοπζηήξ ακάθοζδξ. (η) w - ;Bl 1 /CyO;TM2/TM6B,Tb 1 : Φένεζ οπμηεθή ιεηάθθαλδ ζε μιμγοβςηία ημο θοθμζφκδεημο βμκζδίμο w (white). Δπζπθέμκ, θένεζ ηνία πνςιμζχιαηα ελζζμννυπδζδξ (Balancer chromosomes). Πνυηεζηαζ βζα ηα CyO (In(2L)Cy:Cy 1,cn 2,dp lvl,pr 1 ), TM2 (In(3LR)Ubx 130 :Ubx 130,e s,emc 2 ) ηαζ TM6B (In(3LR)TM6B: Antp Hu, e 1 ). Ζ πανμοζία ηςκ πνςιμζςιάηςκ ελζζμννυπδζδξ ηαηαζηέθθεζ ημκ μιυθμβμ ακαζοκδοαζιυ ηαζ δδθχκεηαζ απυ μναηέξ θαζκμηοπζηέξ αθθαβέξ πμο επζθένμοκ μζ ζοκδευιεκεξ ιε αοηά επζηναηείξ εκδζζβυκεξ ιεηαθθάλεζξ, υπςξ είκαζ: Cy 1 : ηονηά θηενά, Ubx 130 : δζμβηςιέκμζ αθηήνεξ,e s,e 1 : ζημφνμ πνχια ζχιαημξ, Antp Hu : αολδιέκεξ ζιήνζββεξ ζηδ νάπδ. Σαοηυπνμκα, ημ πνςιυζςια ΣΜ6Β είκαζ ζοκδεδειέκμ ιε ηδκ επζηναηή ιεηαθθαβή Tb 1, δ μπμία εηδδθχκεηαζ ιε ηδ ιείςζδ ημο ιήημοξ ημο ζχιαημξ ηςκ αηυιςκ, εκχ ζημ δεφηενμ πνςιυζςια ημ ζηέθεπμξ θένεζ ηδκ επζηναηή ιεηαθθαβή Bl 1, δ μπμία πνμζδίδεζ ημ παναηηδνζζηζηυ ηςκ ημκηχκ ζιδνίββςκ ζημ ζηέθεπμξ. (ηη) w - ;;MKRS/TM6Β Tb 1 : Φένεζ δφμ πνςιμζχιαηα ελζζμννυπδζδξ ζημ 3 μ πνςιυζςια. Πνυηεζηαζ βζα ηα MKRS (Tp(3;3)MRS: M(3)76A 1 Sb 1 kar 1 ry 2 ) ηαζ ΣΜ6Β (In(3LR)TM6B: Antp Hu, e 1 ). Σμ MKRS ακζπκεφεηαζ απυ ηδ θαζκμηοπζηή αθθαβή πμο επζθένεζ δ ιεηάθθαλδ Sb 1 ηαζ παναηηδνίγεηαζ απυ ημκηέξ ζιήνζββεξ. (ηηη) p 251 /FM6;;MKRS/TM6B: Φένεζ δφμ πνςιμζχιαηα ελζζμννυπδζδξ ζημ 3 μ πνςιυζςια (υπςξ ημ ii) ηαζ έκα πνςιυζςια ελζζμννυπδζδξ ζημ Υ πνςιυζςια. Σμ FM6 ακζπκεφεηαζ απυ ηδn οπμθεζπυιεκδ ιεηαθθαβή ζημ βμκίδζμ yellow, y 1, δ μπμία πνμζδίδεζ ακμζπηυ πνχια ζχιαημξ ζηα εκήθζηα άημια ηαζ απυ ηδκ επζηναηή ιεηαθθαβή Bar-eyed, πμο πνμηαθεί κεθνμεζδμφξ ζπήιαημξ ιάηζ (Bar-eyed). Σα άημια μιυγοβα βζα ημ FM6 πνςιυζςια είκαζ αζχζζια αθθά ζηείνα. Σα ζηεθέπδ αοηά πνδζζιμπμζήεδηακ ηυζμ βζα ηδ πνςιμζςιζηή πανημβνάθδζδ ηςκ εκεέζεςκ ηςκ δζαβμκζδίςκ, υζμ ηαζ ζε δζαζηαονχζεζξ ζηεθεπχκ, χζηε κα ηαηαζηεοαζημφκ ηα ηαηάθθδθα βζα ηα πεζνάιαηα ζηεθέπδ. 90

102 Γζαβμκζδζαηά ζηεθέπδ οπενέηθναζδξ δζαθυνςκ ιμνθχκ ηδξ ILK w - ;UAS:mILK-eGFP w - ;; UAS:mILK-eGFP UAS:hILK w - ;; UAS:hILK w - ;UAS:ILK-S176G180G-GFP w - ;;UAS:ILK-S176G180G-GFP w - ;UAS:ILK-S176D180D-GFP w - ;;UAS:ILK-S176D180D-GFP w - ;UAS:ILK-F436A-GFP w-;;uas:ilk-f436a-gfp w-;uas:ilk-f436a w - ;;UAS:ILK-F436A w - ;UAS:ILK-F436;UAS:PARVIN-GFP UAS:hILK;;UAS:PARVIN-GFP w - ;;UAS:ILK-GFP-CAAX w - ;GAP-ILK-GFP w - ;UAS:GFP-CAAX w - ;UAS:ILK-GFP-HRas w - ;UAS:ILK-GFP w - ;;gilk-yfp w - ;;UAS:IR-ILK (ηζηνεηδηθή ζίγαζε ηεο ILK) w*;p{uas-gapgfp} (BL #4522)(ζήκαλζε ηεο πιαζκαηηθήο κεκβξάλεο) Γζαβμκδζαηά ζηεθέπδ δζαθυνςκ ιμνθχκ ηδξ ILK πμο πνδζζιμπμζήεδηακ ζε πεζνάιαηα ζοιπθδνςιαηζηυηδηαξ, ή ζζημεζδζηήξ επαβςβήξ ηςκ δζαβμκζδίςκ ζε ilk-/- βεκεηζηυ οπυααενμ w - ;UAS:mILK-eGFP;Df(3L)Pc-14d,e1/TM2 w - ;; UAS:mILK-eGFP,ilk54/TM6B-GFP UAS:hILK;; Df(3L)Pc-14d,e1/MKRS w - ;; UAS:hILK, Df(3L)Pc-14d,e1/TM3 w - ;; UAS:hILK,ilk 1 /TM3 w - ;UAS:ILK-F436A-GFP; Df(3L)Pc-14d,e1/TM2 w - ;UAS:ILK-F436A; Df(3L)Pc-14d,e1/TM2 91

103 w - ;UAS:ILK; Df(3L)Pc-14d,e1/TM6B w - ;GAP-GFP; Df(3L)Pc-14d,e1/TM2 w - ;UAS:ILK-GFP-CAAX; Df(3L)Pc-14d,e1/TM2 w - ;;UAS:ILK-GFP-CAAX, Df(3L)Pc-14d,e1/TM2 w - ;GAP-ILK-GFP; Df(3L)Pc-14d,e1/TM2 w - ;UAS:GFP-CAAX; Df(3L)Pc-14d,e1/TM2 ηεθέπδ πμο πνδζζιμπμζήεδηακ βζα κα ηαηαζηεοαζημφκ ιςζασηά βεκεηζηά βζα ilk w * ; Gl 1 th 1 st 1 P{FRT(w hs )}2A/TM3, Sb 1 Ser 1 (BL #5750) w[*]; ru[1] h[1] th[1] st[1] P{w[+mW.hs]=FRT(w[hs])}2A (BL #5760) w[1118];p{w[+mc]=ubi-gfp.nls}3l1p{ubi- GFP.nls}3L2P{w[+mW.hs]=FRT(w[hs])}2A (BL#5825) hsflp;;w[1118];p{w[+mc]=ubi-gfp.nls}3l1p{ubi- GFP.nls}3L2P{w[+mW.hs]=FRT(w[hs])}2A w - ;;ilk 54,FRT2A,e 11 /MKRS (μ ακαζοκδοαζιυξ ηςκ βεκεηζηχκ ηυπςκ ilk FRT2Aπναβιαημπμζήεδηε ζημ ενβαζηήνζμ ιαξ, ημ ακαζοκδοαζιέκμ πνςιυζςια πνμέηορε ιεηά ηδ ζάνςζδ πάκς απυ 2000 πνςιμζςιάηςκ) w - ;rho 72R,enGal4/CyO;ilk 54,FRT2A,e 11 /TM2 ηεθέπδ πμο πνδζζιμπμζήεδηακ βζα κα ηαηαζηεοαζημφκ ιςζασηά βεκεηζηά βζα ilk ιε ημ ζφζηδια UAS/GAL4 w - ;Cy2Gal4;FRT2A-GFP c355gal4;;frt2a-gfp w - ;UAS:FLP;ilk 54,FRT2A,e 11 /TM2 ηεθέπδ πμο πνδζζιμπμζήεδηακ βζα κα ηαηαζηεοαζημφκ ιςζασηά βεκεηζηά βζα pak y d2 w 1118 P{ey-FLP.N}2 P{GMR-lacZ.C(38.1)}TPN1; P{neoFRT}82B Pak 14 /TM6B, P{Car20y}TPN1, Tb 1 (BL #9123) hsflp;;frt82b-gfp/tm3-ser w - ;gilk-gfp;pak 14,FRT82B/TM2 ηειέρε παγίδεπζεο γνληδίσλ ή εληζρπηψλ 92

104 (i)ηεθέπδ GAL4: ημκ πίκαηα 1 ηδξ οπμεκυηδηαξ 3.1 ημο Κεθ. ΑΠΟΣΔΛΔΜΑΣΑ ακαθένεηαζ μ πθήνδξ ηαηάθμβμξ ηςκ GAL4 ζηεθεπχκ πμο πνδζζιμπμζήεδηακ ηαζ μζ ζζημί ζημοξ μπμίμοξ εηθνάγμκηαζ. (ii) ηεθέπδ παβίδεοζδξ εκζζποηχκ w - ;vkg-gfp/cyo;ilk 54,FRT2A,e 11 /TM2 w - ;prof-gfp/cyo;ilk 54,FRT2A,e 11 /TM2 w - ;prof-gfp/cyo;ilk 54,FRT2A,e 11 /TM2 w - ;tsr-gfp/cyo;ilk 54,FRT2A,e 11 /TM2 (iii) ηεθέπδ πμο θένμοκ ζοκδοαζιυ GAL4 πνςιυζςια ηαζ βμκζδζαηή ιεηάθθαλδ if B4 ;;mef2gal4 if SEF ;;mef2gal4 w - ;;24BGal4,ilk 1 /TM6B-GFP w - ;;24BGal4,ilk 54 /TM6B-GFP Υνδζζιμπμζήεδηακ βζα ηδκ επαβςβή ζζημεζδζηήξ έηθναζδξ δζαβμκζδίςκ ζε if-/- ή ilk-/- βεκεηζηυ οπυααενμ. 93

105 ΠΑΡΑΡΣΗΜΑ Β-Μνξηαθά Δξγαιεία Βαθηεξηαθά ζηειέρε DH5a: Γμκυηοπμξ: fhua2 Γ(argF-lacZ)U169 phoa glnv44 Φ80 Γ(lacZ)M15 gyra96 reca1 rela1 enda1 thi-1 hsdr17 Πνυηεζηαζ βζα έκα ζηέθεπμξ Δ.coli, ημ μπμίμ ειθακίγεζ ιεβάθδ ζηακυηδηα ιεηαζπδιαηζζιμφ. Υνδζζιμπμζήεδηε ζε υθεξ ηζξ πενζπηχζεζξ ιεηαζπδιαηζζιμφ ιε ακηζδνάζεζξ ζφκδεζδξ ηιήιαημξ DNA ζε πθαζιζδζαηυ θμνέα ηαζ βζα ημκ πμθθαπθαζιυ πθαζιζδζαηχκ ηαηαζηεοχκ, δεδμιέκμο υηζ δζαεέηεζ ιζα ζεζνά παναηηδνζζηζηχκ πμο ημ ηαεζζηά ζδζαίηενα πνήζζιμ ζηδκ ηεπκμθμβία ημο ακαζοκδοαζιέκμο DNA, υπςξ: 1. ηδ ιεηαθθαβή enda1, πμο απεκενβμπμζεί ιία εκδμβεκή εκδμκμοηθεάζδ, δ μπμία ηαηαζηνέθεζ ημ πθαζιζδζαηυ DNA, 2. ηδ ιεηαθθαβή hsdr17, πμο απεκενβμπμζεί ηδκ πενζμνζζηζηή εκδμκμοηθεάζδ, δ μπμία ηυαεζ ιδ ιεεοθζςιέκμ DNA, 3. ηδ ιεηαθθαβή Γ(lacZ)M15, πμο ηαεζζηά δοκαηυ ημ πνςιαηζηυ δζαπςνζζιυ ηςκ απμζηζχκ πμο θένμοκ ημ ακαζοκδοαζιέκμ DNA (δ δζαδζηαζία ακαθένεηαζ ζηδκ πανάβναθμ ιεηαζπδιαηζζιμφ δεηηζηχκ ααηηδνζαηχκ ηοηηάνςκ), 4. ηδ ιεηαθθαβή reca1, πμο ηαηαζηέθθεζ ημκ μιυθμβμ ακαζοκδοαζιυ. 94

106 Υάξηεο πιαζκηδηθώλ θνξέσλ 95

107 96

108 Πθαζιζδζαηή ηαηαζηεοή απυ Faasler Lab 97

109 puasp/t Οζ θμνείξ αοημί πνδζζιμπμζήεδηακ ζηα πεζνάιαηα ιεηαζπδιαηζζιμφ βζα ηδ δδιζμονβία δζαβμκζδζαηχκ αηυιςκ Drosophila. Φένμοκ ηα δφμ άηνα (5 ηαζ 3 ) ημο Ρ ζημζπείμο (απαναίηδηα βζα ηδ ιεηάεεζδ ηδξ ηαηαζηεοήξ) ηαζ ακάιεζά ημοξ ηα ελήξ: πενζμπέξ πνυζδεζδξ ημο πανάβμκηα GAL4 (UAS) βζα εκενβμπμίδζδ ηδξ ιεηαβναθήξ, ηδκ πενζμπή ΣΑΣΑ ηδξ hsp70, ηδκ πενζμπή εζζαβςβήξ ημο δζαβμκζδίμο (πμθοζοκδέηδξ), ηζξ αθθδθμοπίεξ SV40 polya ηαζ ηιήια ημο ηακμκζημφ 98

110 αθθδθμιυνθμο ημο βμκζδίμο-ιάνηονα white, βζα ηδκ επζθμβή ηςκ ιεηαζπδιαηζζιέκςκ αηυιςκ. 99

111 100

112 101

113 Πιαζκηδηαθέο θαηαζθεπέο puaspmilk-egfp (EP1): Απμιμκχζαιε απυ ημ πθαζιίδζμ pclmfgmilk-egfp ιε εκγοιζηή πέρδ πνδζζιμπμζχκηαξ ηα έκγοια πενζμνζζιμφ EcoRI ηαζ NotI ηιήια DNA πμο πενζέπεζ ηδκ ηςδζηή πενζμπή ηδξ ILK ημο πμκηζημφ ζογεοβιέκδ ιε ηδκ ηςδζηή πενζμπή ημο GFP ιέζς εκυξ ζοκδέηδ πθμφζζμο ζε ζενίκδ. Με ηα ίδζα έκγοια πενζμνζζιμφ πναβιαημπμζήεδηε εκγοιζηή πέρδ ημο πθαζιζδζαημφ θμνέα puasp-cterm. Αημθμφεδζε δθεηηνμθυνδζδ ηςκ ακηζδνάζεςκ πέρδξ, απμιυκςζδ ημο εκεέιαημξ ηαζ ημο πθαζιζδζαημφ θμνέα, ακηίδναζδ ζφκδεζδξ ηαζ ιεηαζπδιαηζζιυξ δεηηζηχκ ηοηηάνςκ DH5a ιε ηδκ ακηίδναζδ ζφκδεζδξ. Αημθμφεςξ, εθέβπεδηακ ααηηδνζαηέξ απμζηίεξ ςξ πνμξ ηδκ πνυζθδρδ ημο ακαζοκδοαζιέκμο DNA ιε PCR ηαζ εκγοιζηή πέρδ ηαζ επζθέπεδηε μ ηαηάθθδθμξ ηθχκμξ. DNA απυ αοηυκ απμιμκχεδηε ζε ιεβάθδ ηθίιαηα ηαζ πνδζζιμπμζήεδηε βζα ηδκ ηαηαζηεοή δζαβμκζδζαηχκ ιοβχκ. puasphilk (EP2): Απμιμκχζαιε απυ ημ πθαζιίδζμ psport6hilk ιε εκγοιζηή πέρδ πνδζζιμπμζχκηαξ ηα έκγοια πενζμνζζιμφ EcoRI ηαζ NotI ηιήια DNA πμο πενζέπεζ ηδκ ηςδζηή πενζμπή ηδξ ILK ημο ακενχπμο. Με ηα ίδζα έκγοια πενζμνζζιμφ πναβιαημπμζήεδηε εκγοιζηή πέρδ ημο πθαζιζδζαημφ θμνέα puasp-c-term. Αημθμφεδζε δθεηηνμθυνδζδ ηςκ ακηζδνάζεςκ πέρδξ, απμιυκςζδ ημο εκεέιαημξ ηαζ ημο πθαζιζδζαημφ θμνέα, ακηίδναζδ ζφκδεζδξ ηαζ ιεηαζπδιαηζζιυξ δεηηζηχκ ηοηηάνςκ DH5a ιε ηδκ ακηίδναζδ ζφκδεζδξ. Αημθμφεςξ, εθέβπεδηακ ααηηδνζαηέξ απμζηίεξ ςξ πνμξ ηδκ πνυζθδρδ ημο ακαζοκδοαζιέκμο DNA ιε PCR ηαζ εκγοιζηή πέρδ ηαζ επζθέπεδηε μ ηαηάθθδθμξ ηθχκμξ. DNA απυ αοηυκ απμιμκχεδηε ζε ιεβάθδ ηθίιαηα ηαζ πνδζζιμπμζήεδηε βζα ηδκ ηαηαζηεοή δζαβμκζδζαηχκ ιοβχκ. TOPO_exon4ILK_GFP_CAAX (EP3): Με PCR πμθθαπθαζζάζηδηε ιένμξ ημο ελςκίμο 4 ηδξ ILK ηδξ Drosophila ζογεοβιέκδ ιε ηδκ ηςδζηή πενζμπή ημο GFP ιέζς εκυξ ζοκδέηδ πθμφζζμο ζε ζενίκδ (FR1). ακ ιήηνα πνδζζιμπμζήεδηε δ πθαζιζδζαηή ηαηαζηεοή puast-ilk-gfp (Zervas, Gregory et al. 2001). Οζ εηηζκδηέξ πμο πνδζζιμπμζήεδηακ βζα ηδκ ακηίδναζδ ηδξ PCR ήηακ μζ FILK(1775) ηαζ RevCAAX- GFP. Δπίζδξ ιε PCR πμθθαπθαζζάζηδηε δ ηςδζηή πενζμπή ημο ιμηίαμο CAAX ηαζ ημ 3 UTR (FR2). ακ ιήηνα πνδζζιμπμζήεδηε δ πθαζιζδζαηή ηαηαζηεοή pκt (Boulter, Grall et al. 2006). Οζ εηηζκδηέξ πμο πνδζζιμπμζήεδηακ βζα ηδκ ακηίδναζδ 102

114 ηδξ PCR ήηακ μζ FwCAAX ηαζ RevCAAX-XbaI. ηδ ζοκέπεζα, πναβιαημπμζήζαιε SOE PCR πνδζζιμπμζχκηαξ ζακ ιήηνεξ ηα πνμσυκηα FR1 ηαζ FR2 ηςκ πνμδβμφιεκςκ PCR. Οζ εηηζκδηέξ πμο πνδζζιμπμζήεδηακ βζα ηδκ ακηίδναζδ ηδξ PCR ήηακ μζ FILK(1775) ηαζ RevCAAX-XbaI. Αημθμφεδζε δθεηηνμθυνδζδ ηδξ ακηίδναζδξ ζε πήηηςια αβανυγδξ ηαζ απμιυκςζδ ηδξ ηαηάθθδθδξ γχκδξ DNA. ημ απμιμκςιέκμ ηιήια DNA πνμζηέεδηακ άηνα αδεκίκδξ, αημθμφεδζε ακηίδναζδ ζφκδεζδξ ιε ημκ πθαζιζδζαηυ θμνέα PCR II-TOPO ηαζ ιεηαζπδιαηζζιυξ δεηηζηχκ ηοηηάνςκ ημο ζηεθέπμοξ DH5a ιε ηδκ ακηίδναζδ ηδξ ζφκδεζδξ. Οζ απμζηίεξ πμο έθενακ ημ ακαζοκδοαζιέκμ DNA ηαοημπμζήεδηακ ιε ζάνςζδ ιε PCR ηαζ ακηζδνάζεζξ εκγοιζηήξ πέρδξ, εκχ ημ έκεεια εθέβπεδηε ιε αθθδθμφπζζδ. puastilk-gfp-caax (EP4): Απμιμκχζαιε απυ ημ πθαζιίδζμ EP3 ιε εκγοιζηή πέρδ πνδζζιμπμζχκηαξ ηα έκγοια πενζμνζζιμφ BamHI ηαζ XbaI ηιήια DNA πμο πενζέπεζ ηδκ ηςδζηή πενζμπή ημο ελςκίμο 4 ηδξ ILK ηδξ Drosophila ζογεοβιέκδ ιε ηδκ ηςδζηή πενζμπή ημο GFP ιέζς εκυξ ζοκδέηδ πθμφζζμο ζε ζενίκδ. Με ηα ίδζα έκγοια πενζμνζζιμφ πναβιαημπμζήεδηε εκγοιζηή πέρδ ημο πθαζιζδζαημφ θμνέα puast-ηlk-gfp (Zervas, Gregory et al. 2001). Αημθμφεδζε δθεηηνμθυνδζδ ηςκ ακηζδνάζεςκ πέρδξ, απμιυκςζδ ημο εκεέιαημξ ηαζ ημο πθαζιζδζαημφ θμνέα, ακηίδναζδ ζφκδεζδξ ηαζ ιεηαζπδιαηζζιυξ δεηηζηχκ ηοηηάνςκ DH5a ιε ηδκ ακηίδναζδ ζφκδεζδξ. Αημθμφεςξ, εθέβπεδηακ ααηηδνζαηέξ απμζηίεξ ςξ πνμξ ηδκ πνυζθδρδ ημο ακαζοκδοαζιέκμο DNA ιε PCR ηαζ εκγοιζηή πέρδ ηαζ επζθέπεδηε μ ηαηάθθδθμξ ηθχκμξ. DNA απυ αοηυκ απμιμκχεδηε ζε ιεβάθδ ηθίιαηα ηαζ πνδζζιμπμζήεδηε βζα ηδκ ηαηαζηεοή δζαβμκζδζαηχκ ιοβχκ. TOPO_GFP_CAAX (EP5): Με PCR πμθθαπθαζζάζηδηε δ ηςδζηή πενζμπή ημο ιμηίαμο CAAX ιε ηδκ ηςδζηή πενζμπή ημο GFP ιέζς εκυξ ζοκδέηδ πθμφζζμο ζε ζενίκδ. ακ ιήηνα πνδζζιμπμζήεδηε δ πθαζιζδζαηή ηαηαζηεοή EP3. Οζ εηηζκδηέξ πμο πνδζζιμπμζήεδηακ βζα ηδκ ακηίδναζδ ηδξ PCR ήηακ μζ Fw-StuI-GFP ηαζ RevCAAX-XbaI. Αημθμφεδζε δθεηηνμθυνδζδ ηδξ ακηίδναζδξ ζε πήηηςια αβανυγδξ ηαζ απμιυκςζδ ηδξ ηαηάθθδθδξ γχκδξ DNA. ημ απμιμκςιέκμ ηιήια DNA πνμζηέεδηακ άηνα αδεκίκδξ, αημθμφεδζε ακηίδναζδ ζφκδεζδξ ιε ημκ πθαζιζδζαηυ θμνέα PCR II-TOPO ηαζ ιεηαζπδιαηζζιυξ δεηηζηχκ ηοηηάνςκ ημο ζηεθέπμοξ DH5a ιε ηδκ ακηίδναζδ ηδξ ζφκδεζδξ. Οζ απμζηίεξ πμο έθενακ ημ ακαζοκδοαζιέκμ 103

115 DNA ηαοημπμζήεδηακ ιε ζάνςζδ ιε PCR ηαζ ακηζδνάζεζξ εκγοιζηήξ πέρδξ, εκχ ημ έκεεια εθέβπεδηε ιε αθθδθμφπζζδ. puast_gfp_caax (EP6): Απμιμκχζαιε απυ ημ πθαζιίδζμ EP5 ιε εκγοιζηή πέρδ πνδζζιμπμζχκηαξ ηα έκγοια πενζμνζζιμφ StuI ηαζ XbaI ηιήια DNA πμο πενζέπεζ ηδκ ηςδζηή πενζμπή ημο GFP ζογεοβιέκδ ιε ηδκ ηςδζηή πενζμπή ημο ιμηίαμο (ΚRas). Με ηα ίδζα έκγοια πενζμνζζιμφ πναβιαημπμζήεδηε εκγοιζηή πέρδ ημο πθαζιζδζαημφ θμνέα puas-gfp (green rabbit). Αημθμφεδζε δθεηηνμθυνδζδ ηςκ ακηζδνάζεςκ πέρδξ, απμιυκςζδ ημο εκεέιαημξ ηαζ ημο πθαζιζδζαημφ θμνέα, ακηίδναζδ ζφκδεζδξ ηαζ ιεηαζπδιαηζζιυξ δεηηζηχκ ηοηηάνςκ DH5a ιε ηδκ ακηίδναζδ ζφκδεζδξ. Αημθμφεςξ, εθέβπεδηακ ααηηδνζαηέξ απμζηίεξ ςξ πνμξ ηδκ πνυζθδρδ ημο ακαζοκδοαζιέκμο DNA ιε PCR ηαζ εκγοιζηή πέρδ ηαζ επζθέπεδηε μ ηαηάθθδθμξ ηθχκμξ. DNA απυ αοηυκ απμιμκχεδηε ζε ιεβάθδ ηθίιαηα ηαζ πνδζζιμπμζήεδηε βζα ηδκ ηαηαζηεοή δζαβμκζδζαηχκ ιοβχκ. TOPO_GAP_ILKexon1 (EP7): Με PCR πμθθαπθαζζάζηδηε δ ηςδζηή πενζμπή ημο ιμηίαμο ιονζζηοθίςζδξ GAP (FR1). ακ ιήηνα πνδζζιμπμζήεδηε δ πθαζιζδζαηή ηαηαζηεοή puast-gap-gfp. Οζ εηηζκδηέξ πμο πνδζζιμπμζήεδηακ βζα ηδκ ακηίδναζδ ηδξ PCR ήηακ μζ Fw_GAP_MluI_EcoRI, (μπμίμξ θένεζ ηζξ αθθδθμοπίεξ ακαβκχνζζδξ βζα ηζξ πενζμνζζηζηέξ εκδμκμοηθεάζεξ MluI ηαζ EcoRI ηαζ ηδκ αθθδθμοπία Kozak), ηαζ Rev3'GAP-ILK. Δπίζδξ ιε PCR πμθθαπθαζζάζηδηε ημ ελχκζμ 1 ηαζ ιένμξ ημο εζςκίμο 1 ηδξ ILK ηδξ Drosophila (FR2). ακ ιήηνα πνδζζιμπμζήεδηε δ πθαζιζδζαηή ηαηαζηεοή puast-ilk-gfp. Οζ εηηζκδηέξ πμο πνδζζιμπμζήεδηακ βζα ηδκ ακηίδναζδ ηδξ PCR ήηακ μζ Fw3'GAP_ILK ηαζ RIN-738. ηδ ζοκέπεζα, πναβιαημπμζήζαιε SOE PCR πνδζζιμπμζχκηαξ ζακ ιήηνεξ ηα πνμσυκηα FR1 ηαζ FR2 ηςκ πνμδβμφιεκςκ PCR. Οζ εηηζκδηέξ πμο πνδζζιμπμζήεδηακ βζα ηδκ ακηίδναζδ ηδξ PCR ήηακ μζ Fw_GAP_MluI_EcoRI ηαζ RIN-738. Αημθμφεδζε δθεηηνμθυνδζδ ηδξ ακηίδναζδξ ζε πήηηςια αβανυγδξ ηαζ απμιυκςζδ ηδξ ηαηάθθδθδξ γχκδξ DNA. ημ απμιμκςιέκμ ηιήια DNA πνμζηέεδηακ άηνα αδεκίκδξ, αημθμφεδζε ακηίδναζδ ζφκδεζδξ ιε ημκ πθαζιζδζαηυ θμνέα PCR II- TOPO ηαζ ιεηαζπδιαηζζιυξ δεηηζηχκ ηοηηάνςκ ημο ζηεθέπμοξ DH5a ιε ηδκ ακηίδναζδ ηδξ ζφκδεζδξ. Οζ απμζηίεξ πμο έθενακ ημ ακαζοκδοαζιέκμ DNA ηαοημπμζήεδηακ ιε ζάνςζδ ιε PCR ηαζ ακηζδνάζεζξ εκγοιζηήξ πέρδξ, εκχ ημ έκεεια εθέβπεδηε ιε αθθδθμφπζζδ. 104

116 TOPO_ILKexon4GFP_HRAS_CAAX (EP8): Με PCR πμθθαπθαζζάζηδηε δ ηςδζηή πενζμπή ημο ιμηίαμο θανκεζοθίςζδξ CAAX (HRas) (FR1). ακ ιήηνα πνδζζιμπμζήεδηε δ πθαζιζδζαηή ηαηαζηεοή pgex-hras. Οζ εηηζκδηέξ πμο πνδζζιμπμζήεδηακ βζα ηδκ ακηίδναζδ ηδξ PCR ήηακ μζ FwHRas ηαζ Rev_HRas_XbaI (μπμίμξ θένεζ ηζξ αθθδθμοπίεξ ακαβκχνζζδξ βζα ηδκ πενζμνζζηζηή εκδμκμοηθεάζδ XbaI). Δπίζδξ ιε PCR πμθθαπθαζζάζηδηε ιένμξ ημο ελςκίμο 4 ηδξ ILK ηδξ Drosophila ζογεοβιέκδ ιε ηδκ ηςδζηή πενζμπή ημο GFP ιέζς εκυξ ζοκδέηδ πθμφζζμο ζε ζενίκδ (FR2). ακ ιήηνα πνδζζιμπμζήεδηε δ πθαζιζδζαηή ηαηαζηεοή puast-ilk-gfp (Zervas, Gregory et al. 2001). Οζ εηηζκδηέξ πμο πνδζζιμπμζήεδηακ βζα ηδκ ακηίδναζδ ηδξ PCR ήηακ μζ FILK(1775) ηαζ Rev_GFP_HRas. ηδ ζοκέπεζα, πναβιαημπμζήζαιε SOE PCR πνδζζιμπμζχκηαξ ζακ ιήηνεξ ηα πνμσυκηα FR1 ηαζ FR2 ηςκ πνμδβμφιεκςκ PCR. Οζ εηηζκδηέξ πμο πνδζζιμπμζήεδηακ βζα ηδκ ακηίδναζδ ηδξ PCR ήηακ μζ FwHRas ηαζ Rev_HRas_XbaI. Αημθμφεδζε δθεηηνμθυνδζδ ηδξ ακηίδναζδξ ζε πήηηςια αβανυγδξ ηαζ απμιυκςζδ ηδξ ηαηάθθδθδξ γχκδξ DNA. ημ απμιμκςιέκμ ηιήια DNA πνμζηέεδηακ άηνα αδεκίκδξ, αημθμφεδζε ακηίδναζδ ζφκδεζδξ ιε ημκ πθαζιζδζαηυ θμνέα PCR II- TOPO ηαζ ιεηαζπδιαηζζιυξ δεηηζηχκ ηοηηάνςκ ημο ζηεθέπμοξ DH5a ιε ηδκ ακηίδναζδ ηδξ ζφκδεζδξ. Οζ απμζηίεξ πμο έθενακ ημ ακαζοκδοαζιέκμ DNA ηαοημπμζήεδηακ ιε ζάνςζδ ιε PCR ηαζ ακηζδνάζεζξ εκγοιζηήξ πέρδξ, εκχ ημ έκεεια εθέβπεδηε ιε αθθδθμφπζζδ. puast_gap_ilk_gfp (EP9): Απμιμκχζαιε απυ ημ πθαζιίδζμ EP7 ιε εκγοιζηή πέρδ πνδζζιμπμζχκηαξ ηα έκγοια πενζμνζζιμφ MluI ηαζ AatII ηιήια DNA πμο πενζέπεζ ηδκ ηςδζηή πενζμπή ηδξ ILK ημο πμκηζημφ ζογεοβιέκδ ιε ηδκ ηςδζηή πενζμπή ημο GAP ιμηίαμο ηαζ ημο ελςκίμο 1 ηαζ ιένμξ ημο εζςκίμο1 ηδξ ILK ηδξ Drosophila. Με ηα ίδζα έκγοια πενζμνζζιμφ πναβιαημπμζήεδηε εκγοιζηή πέρδ ημο πθαζιζδζαημφ θμνέα puast-ilk-gfp (Zervas, Gregory et al. 2001). Αημθμφεδζε δθεηηνμθυνδζδ ηςκ ακηζδνάζεςκ πέρδξ, απμιυκςζδ ημο εκεέιαημξ ηαζ ημο πθαζιζδζαημφ θμνέα, ακηίδναζδ ζφκδεζδξ ηαζ ιεηαζπδιαηζζιυξ δεηηζηχκ ηοηηάνςκ DH5a ιε ηδκ ακηίδναζδ ζφκδεζδξ. Αημθμφεςξ, εθέβπεδηακ ααηηδνζαηέξ απμζηίεξ ςξ πνμξ ηδκ πνυζθδρδ ημο ακαζοκδοαζιέκμο DNA ιε PCR ηαζ εκγοιζηή πέρδ ηαζ επζθέπεδηε μ ηαηάθθδθμξ ηθχκμξ. DNA απυ αοηυκ απμιμκχεδηε ζε ιεβάθδ ηθίιαηα ηαζ πνδζζιμπμζήεδηε βζα ηδκ ηαηαζηεοή δζαβμκζδζαηχκ ιοβχκ. 105

117 pnebilkgfp_s176gt180g (EP10): Δζζαβάβαιε ιε PCR ηζξ ζδιεζαηέξ ιεηαθθάλεζξ S176G ηαζ T180G ζηδκ ηςδζηή αθθδθμοπία ηδξ ILK ηδξ Drosophila αημθμοεχκηαξ ζοβηεηνζιέκμ πνςηυημθθμ ζδιεζαηήξ ιεηαθθαλζβέκεζδ (Zheng, Baumann et al. 2004). ακ ιήηνα πνδζζιμπμζήεδηε δ πθαζιζδζαηή ηαηαζηεοή pneb-ilkwt(paci/bamhi). Οζ εηηζκδηέξ πμο πνδζζιμπμζήεδηακ βζα ηδκ ακηίδναζδ ηδξ PCR ήηακ μζ FwS176GT180G ηαζ RevS176GT180G (μπμίμξ εζζαβάβεζ ιζα ζζςπδθή ιεηάθθαλδ πμο δδιζμονβεί ιζα αθθδθμοπία ακαβκχνζζδξ βζα ηδκ πενζμνζζηζηή εκδμκμοηθεάζδ SmaI). ηδ ζοκέπεζα, πναβιαημπμζήζαιε πέρδ ημο πνμσυκημξ ημο PCR ιε ηδκ πενζμνζζηζηή εκδμκμοηθεάζδ DpnI. Αημθμφεδζε δθεηηνμθυνδζδ ηςκ ακηζδνάζεςκ πέρδξ, απμιυκςζδ ημο εκεέιαημξ ηαζ ημο πθαζιζδζαημφ θμνέα, ακηίδναζδ ζφκδεζδξ ηαζ ιεηαζπδιαηζζιυξ δεηηζηχκ ηοηηάνςκ DH5a ιε ηδκ ακηίδναζδ ζφκδεζδξ. Αημθμφεςξ, εθέβπεδηακ ααηηδνζαηέξ απμζηίεξ ιε εκγοιζηή πέρδ ιε ηδκ πενζμνζζηζηή εκδμκμοηθεάζδ SmaI ηαζ επζθέπεδηε μ ηαηάθθδθμξ ηθχκμξ. Σμ έκεεια εθέβπεδηε ιε αθθδθμφπζζδ. DNA απυ ημκ ηαηάθθδθμ ηθχκμ απμιμκχεδηε ζε ιεβάθδ ηθίιαηα ηαζ πνδζζιμπμζήεδηε βζα ηδκ ηαηαζηεοή δζαβμκζδζαηχκ ιοβχκ pnebilkgfp_s176dt180d (EP11): Δζζαβάβαιε ιε PCR ηζξ ζδιεζαηέξ ιεηαθθάλεζξ S176D ηαζ T180D ζηδκ ηςδζηή αθθδθμοπία ηδξ ILK ηδξ Drosophila αημθμοεχκηαξ ζοβηεηνζιέκμ πνςηυημθθμ ζδιεζαηήξ ιεηαθθαλζβέκεζδ (Zheng, Baumann et al. 2004). ακ ιήηνα πνδζζιμπμζήεδηε δ πθαζιζδζαηή ηαηαζηεοή pneb-ilkwt(paci/bamhi). Οζ εηηζκδηέξ πμο πνδζζιμπμζήεδηακ βζα ηδκ ακηίδναζδ ηδξ PCR ήηακ μζ FwS176DT180D (μπμίμξ εζζαβάβεζ ιζα ζζςπδθή ιεηάθθαλδ πμο δδιζμονβεί ιζα αθθδθμοπία ακαβκχνζζδξ βζα ηδκ πενζμνζζηζηή εκδμκμοηθεάζδ SmaI) ηαζ RevS176DT180D. ηδ ζοκέπεζα, πναβιαημπμζήζαιε πέρδ ημο πνμσυκημξ ημο PCR ιε ηδκ πενζμνζζηζηή εκδμκμοηθεάζδ DpnI. Αημθμφεδζε δθεηηνμθυνδζδ ηςκ ακηζδνάζεςκ πέρδξ, απμιυκςζδ ημο εκεέιαημξ ηαζ ημο πθαζιζδζαημφ θμνέα, ακηίδναζδ ζφκδεζδξ ηαζ ιεηαζπδιαηζζιυξ δεηηζηχκ ηοηηάνςκ DH5a ιε ηδκ ακηίδναζδ ζφκδεζδξ. Αημθμφεςξ, εθέβπεδηακ ααηηδνζαηέξ απμζηίεξ ιε εκγοιζηή πέρδ ιε ηδκ πενζμνζζηζηή εκδμκμοηθεάζδ SmaI ηαζ επζθέπεδηε μ ηαηάθθδθμξ ηθχκμξ. Σμ έκεεια εθέβπεδηε ιε αθθδθμφπζζδ. DNA απυ ημκ ηαηάθθδθμ ηθχκμ απμιμκχεδηε ζε ιεβάθδ ηθίιαηα ηαζ πνδζζιμπμζήεδηε βζα ηδκ ηαηαζηεοή δζαβμκζδζαηχκ ιοβχκ. 106

118 puastilkgfp_s176gt180g (EP12): Απμιμκχζαιε απυ ημ πθαζιίδζμ EP10 ιε εκγοιζηή πέρδ πνδζζιμπμζχκηαξ ηα έκγοια πενζμνζζιμφ AatII ηαζ BamHI ηιήια DNA πμο πενζέπεζ ηδκ ηςδζηή πενζμπή ηδξ ILK ηδξ Drosophila (ιένμξ ημο εζςκίμο 1 έςξ ιένμξ ημο ελςκίμο 4). Με ηα ίδζα έκγοια πενζμνζζιμφ πναβιαημπμζήεδηε εκγοιζηή πέρδ ημο πθαζιζδζαημφ θμνέα puast-ilk-gfp. Αημθμφεδζε δθεηηνμθυνδζδ ηςκ ακηζδνάζεςκ πέρδξ, απμιυκςζδ ημο εκεέιαημξ ηαζ ημο πθαζιζδζαημφ θμνέα, ακηίδναζδ ζφκδεζδξ ηαζ ιεηαζπδιαηζζιυξ δεηηζηχκ ηοηηάνςκ DH5a ιε ηδκ ακηίδναζδ ζφκδεζδξ. Αημθμφεςξ, εθέβπεδηακ ααηηδνζαηέξ απμζηίεξ ςξ πνμξ ηδκ πνυζθδρδ ημο ακαζοκδοαζιέκμο DNA ιε PCR ηαζ εκγοιζηή πέρδ ηαζ επζθέπεδηε μ ηαηάθθδθμξ ηθχκμξ. DNA απυ αοηυκ απμιμκχεδηε ζε ιεβάθδ ηθίιαηα ηαζ πνδζζιμπμζήεδηε βζα ηδκ ηαηαζηεοή δζαβμκζδζαηχκ ιοβχκ. puastilkgfp_s176dt180d (EP13): Απμιμκχζαιε απυ ημ πθαζιίδζμ EP11 ιε εκγοιζηή πέρδ πνδζζιμπμζχκηαξ ηα έκγοια πενζμνζζιμφ AatII ηαζ BamHI ηιήια DNA πμο πενζέπεζ ηδκ ηςδζηή πενζμπή ηδξ ILK, ηδξ Drosophila (ιένμξ ημο εζςκίμο 1 έςξ ιένμξ ημο ελςκίμο 4). Με ηα ίδζα έκγοια πενζμνζζιμφ πναβιαημπμζήεδηε εκγοιζηή πέρδ ημο πθαζιζδζαημφ θμνέα puast-ilk-gfp. Αημθμφεδζε δθεηηνμθυνδζδ ηςκ ακηζδνάζεςκ πέρδξ, απμιυκςζδ ημο εκεέιαημξ ηαζ ημο πθαζιζδζαημφ θμνέα, ακηίδναζδ ζφκδεζδξ ηαζ ιεηαζπδιαηζζιυξ δεηηζηχκ ηοηηάνςκ DH5a ιε ηδκ ακηίδναζδ ζφκδεζδξ. Αημθμφεςξ, εθέβπεδηακ ααηηδνζαηέξ απμζηίεξ ςξ πνμξ ηδκ πνυζθδρδ ημο ακαζοκδοαζιέκμο DNA ιε PCR ηαζ εκγοιζηή πέρδ ηαζ επζθέπεδηε μ ηαηάθθδθμξ ηθχκμξ. DNA απυ αοηυκ απμιμκχεδηε ζε ιεβάθδ ηθίιαηα ηαζ πνδζζιμπμζήεδηε βζα ηδκ ηαηαζηεοή δζαβμκζδζαηχκ ιοβχκ. TOPO_ILK_exon4_F436A_GFP (EP14): Δζζαβάβαιε ιε PCR ηδ ζδιεζαηή ιεηάθθαλδ F436A ζηδκ ηςδζηή αθθδθμοπία ηδξ ILK ηδξ Drosophila αημθμοεχκηαξ ζοβηεηνζιέκμ πνςηυημθθμ ζδιεζαηήξ ιεηαθθαλζβέκεζδ (Zheng, Baumann et al. 2004). ακ ιήηνα πνδζζιμπμζήεδηε δ πθαζιζδζαηή ηαηαζηεοή EP8. Οζ εηηζκδηέξ πμο πνδζζιμπμζήεδηακ βζα ηδκ ακηίδναζδ ηδξ PCR ήηακ μζ FwF436A (μπμίμξ εζζαβάβεζ ιζα ζζςπδθή ιεηάθθαλδ πμο δδιζμονβεί ιζα αθθδθμοπία ακαβκχνζζδξ βζα ηδκ πενζμνζζηζηή εκδμκμοηθεάζδ EagI) ηαζ RevF436A. ηδ ζοκέπεζα, πναβιαημπμζήζαιε πέρδ ημο πνμσυκημξ ημο PCR ιε ηδκ πενζμνζζηζηή εκδμκμοηθεάζδ DpnI. Αημθμφεδζε δθεηηνμθυνδζδ ηςκ ακηζδνάζεςκ πέρδξ, απμιυκςζδ ημο εκεέιαημξ ηαζ ημο πθαζιζδζαημφ θμνέα, ακηίδναζδ ζφκδεζδξ ηαζ ιεηαζπδιαηζζιυξ δεηηζηχκ ηοηηάνςκ 107

119 DH5a ιε ηδκ ακηίδναζδ ζφκδεζδξ. Αημθμφεςξ, εθέβπεδηακ ααηηδνζαηέξ απμζηίεξ ιε εκγοιζηή πέρδ ιε ηδκ πενζμνζζηζηή εκδμκμοηθεάζδ EagI ηαζ επζθέπεδηε μ ηαηάθθδθμξ ηθχκμξ. Σμ έκεεια εθέβπεδηε ιε αθθδθμφπζζδ. DNA απυ ημκ ηαηάθθδθμ ηθχκμ απμιμκχεδηε ζε ιεβάθδ ηθίιαηα ηαζ πνδζζιμπμζήεδηε βζα ηδκ ηαηαζηεοή δζαβμκζδζαηχκ ιοβχκ. TOPO_ILK_exon4_F436A (EP15): Δζζαβάβαιε ιε PCR ηδ ζδιεζαηή ιεηάθθαλδ F436A ζηδκ ηςδζηή αθθδθμοπία ηδξ ILK ηδξ Drosophila αημθμοεχκηαξ ζοβηεηνζιέκμ πνςηυημθθμ ζδιεζαηήξ ιεηαθθαλζβέκεζδ (Zheng, Baumann et al. 2004). ακ ιήηνα πνδζζιμπμζήεδηε δ πθαζιζδζαηή ηαηαζηεοή pgex_ilkwt (SmaI/EcoRI). Οζ εηηζκδηέξ πμο πνδζζιμπμζήεδηακ βζα ηδκ ακηίδναζδ ηδξ PCR ήηακ μζ FwF436A (μπμίμξ εζζαβάβεζ ιζα ζζςπδθή ιεηάθθαλδ πμο δδιζμονβεί ιζα αθθδθμοπία ακαβκχνζζδξ βζα ηδκ πενζμνζζηζηή εκδμκμοηθεάζδ EagI) ηαζ RevF436A. ηδ ζοκέπεζα, πναβιαημπμζήζαιε πέρδ ημο πνμσυκημξ ημο PCR ιε ηδκ πενζμνζζηζηή εκδμκμοηθεάζδ DpnI. Αημθμφεδζε δθεηηνμθυνδζδ ηςκ ακηζδνάζεςκ πέρδξ, απμιυκςζδ ημο εκεέιαημξ ηαζ ημο πθαζιζδζαημφ θμνέα, ακηίδναζδ ζφκδεζδξ ηαζ ιεηαζπδιαηζζιυξ δεηηζηχκ ηοηηάνςκ DH5a ιε ηδκ ακηίδναζδ ζφκδεζδξ. Αημθμφεςξ, εθέβπεδηακ ααηηδνζαηέξ απμζηίεξ ιε εκγοιζηή πέρδ ιε ηδκ πενζμνζζηζηή εκδμκμοηθεάζδ EagI ηαζ επζθέπεδηε μ ηαηάθθδθμξ ηθχκμξ. Σμ έκεεια εθέβπεδηε ιε αθθδθμφπζζδ. DNA απυ ημκ ηαηάθθδθμ ηθχκμ απμιμκχεδηε ζε ιεβάθδ ηθίιαηα ηαζ πνδζζιμπμζήεδηε βζα ηδκ ηαηαζηεοή δζαβμκζδζαηχκ ιοβχκ. puast_ilk_f436_gfp (EP16): Απμιμκχζαιε απυ ημ πθαζιίδζμ EP14 ιε εκγοιζηή πέρδ πνδζζιμπμζχκηαξ ηα έκγοια πενζμνζζιμφ BamHI ηαζ NdeI ηιήια DNA πμο πενζέπεζ ηδκ ηςδζηή πενζμπή ηδξ ILK ηδξ Drosophila (απυ ιένμξ ημο ελςκίμο 4, πμο θένεζ ηδ ιεηάθθαλδ F436A), ιε ηδκ ηςδζηή πενζμπή ημο GFP ιέζς εκυξ ζοκδέηδ πθμφζζμο ζε ζενίκδ. Με ηα ίδζα έκγοια πενζμνζζιμφ πναβιαημπμζήεδηε εκγοιζηή πέρδ ημο πθαζιζδζαημφ θμνέα puast-ilk-gfp. Αημθμφεδζε δθεηηνμθυνδζδ ηςκ ακηζδνάζεςκ πέρδξ, απμιυκςζδ ημο εκεέιαημξ ηαζ ημο πθαζιζδζαημφ θμνέα, ακηίδναζδ ζφκδεζδξ ηαζ ιεηαζπδιαηζζιυξ δεηηζηχκ ηοηηάνςκ DH5a ιε ηδκ ακηίδναζδ ζφκδεζδξ. Αημθμφεςξ, εθέβπεδηακ ααηηδνζαηέξ απμζηίεξ ςξ πνμξ ηδκ πνυζθδρδ ημο ακαζοκδοαζιέκμο DNA ιε PCR ηαζ εκγοιζηή πέρδ ηαζ επζθέπεδηε μ ηαηάθθδθμξ ηθχκμξ. DNA απυ αοηυκ απμιμκχεδηε ζε ιεβάθδ ηθίιαηα ηαζ πνδζζιμπμζήεδηε βζα ηδκ ηαηαζηεοή δζαβμκζδζαηχκ ιοβχκ. 108

120 puast_ilk_f436 (EP17): Απμιμκχζαιε απυ ημ πθαζιίδζμ pclmfgmilk-egfp ιε εκγοιζηή πέρδ πνδζζιμπμζχκηαξ ηα έκγοια πενζμνζζιμφ KpnI ηαζ XbaI ηιήια DNA πμο πενζέπεζ ηδκ ηςδζηή πενζμπή ηδξ ILK ηδξ Drosophila απυ ιένμξ ημο ελςκίμο 4, πμο θένεζ ηδ ιεηάθθαλδ F436A, ιε ηδκ ηςδζηή πενζμπή ημο GFP ιέζς εκυξ ζοκδέηδ πθμφζζμο ζε ζενίκδ. Με ηα ίδζα έκγοια πενζμνζζιμφ πναβιαημπμζήεδηε εκγοιζηή πέρδ ημο πθαζιζδζαημφ θμνέα puast-ilk. Αημθμφεδζε δθεηηνμθυνδζδ ηςκ ακηζδνάζεςκ πέρδξ, απμιυκςζδ ημο εκεέιαημξ ηαζ ημο πθαζιζδζαημφ θμνέα, ακηίδναζδ ζφκδεζδξ ηαζ ιεηαζπδιαηζζιυξ δεηηζηχκ ηοηηάνςκ DH5a ιε ηδκ ακηίδναζδ ζφκδεζδξ. Αημθμφεςξ, εθέβπεδηακ ααηηδνζαηέξ απμζηίεξ ςξ πνμξ ηδκ πνυζθδρδ ημο ακαζοκδοαζιέκμο DNA ιε PCR ηαζ εκγοιζηή πέρδ ηαζ επζθέπεδηε μ ηαηάθθδθμξ ηθχκμξ. DNA απυ αοηυκ απμιμκχεδηε ζε ιεβάθδ ηθίιαηα ηαζ πνδζζιμπμζήεδηε βζα ηδκ ηαηαζηεοή δζαβμκζδζαηχκ ιοβχκ. puast-ilk-gfp-hras-caax (EP18): Απμιμκχζαιε απυ ημ πθαζιίδζμ EP8 ιε εκγοιζηή πέρδ πνδζζιμπμζχκηαξ ηα έκγοια πενζμνζζιμφ BamHI ηαζ XbaI ηιήια DNA πμο πενζέπεζ ηδκ ηςδζηή πενζμπή ηδξ ILK ηδξ Drosophila απυ ιένμξ ημο ελςκίμο 4, ιε ηδκ ηςδζηή πενζμπή ημο GFP ιέζς εκυξ ζοκδέηδ πθμφζζμο ζε ζενίκδ. Με ηα ίδζα έκγοια πενζμνζζιμφ πναβιαημπμζήεδηε εκγοιζηή πέρδ ημο πθαζιζδζαημφ θμνέα puasp-c-term. Αημθμφεδζε δθεηηνμθυνδζδ ηςκ ακηζδνάζεςκ πέρδξ, απμιυκςζδ ημο εκεέιαημξ ηαζ ημο πθαζιζδζαημφ θμνέα, ακηίδναζδ ζφκδεζδξ ηαζ ιεηαζπδιαηζζιυξ δεηηζηχκ ηοηηάνςκ DH5a ιε ηδκ ακηίδναζδ ζφκδεζδξ. Αημθμφεςξ, εθέβπεδηακ ααηηδνζαηέξ απμζηίεξ ςξ πνμξ ηδκ πνυζθδρδ ημο ακαζοκδοαζιέκμο DNA ιε PCR ηαζ εκγοιζηή πέρδ ηαζ επζθέπεδηε μ ηαηάθθδθμξ ηθχκμξ. DNA απυ αοηυκ απμιμκχεδηε ζε ιεβάθδ ηθίιαηα ηαζ πνδζζιμπμζήεδηε βζα ηδκ ηαηαζηεοή δζαβμκζδζαηχκ ιοβχκ. 109

121 ΔΚΚΙΝΗΣΗ Αιιεινπρία Παξαγόκελν ηκήκα DNA Πιαζκηδηαθή θαηαζθεπή θσδηθόο FILK(1775) CTTATTTGGGAGCTGACTACG RevCAAX-GFP CTTCTTTTTACCATCAGCTTTGTATAGTTCATCC BamHI_exon4_mGFP TOPO_exon4ILK_GFP_CAAX EP3 FwCAAX GAACTATACAAAGCTGATGGTAAAAAGAAG RevCAAX-XbaI CCTCTAGAGTACTAGTATGCCTTAA CAAX_3UTR TOPO_exon4ILK_GFP_CAAX EP3 Fw-StuI-GFP AGGCCTATGAGTAAAGGAGAA RevCAAX-GFP CTTCTTTTTACCATCAGCTTTGTATAGTTCATCC GFP_CAAX TOPO_GFP_CAAX EP5 Fw_GAP_MluI_EcoRI ACGCGTGAATTCGCCACCATGCTGTGCTGTATGAGAAGAACC Rev3'GAP-ILK ATATGTCCTCGATCTTCTGGTCCTCATCGTTC MluI_GAP TOPO_GAP_ILKexon1 EP7 Fw3'GAP_ILK AGAAGATCGAGGACATATTCCACTGGTGCC RIN-738 ATAAACATGGCAAGCGGG Exon1_intron1_AatII TOPO_GAP_ILKexon1 EP7 FwHRas ACTATACAAAGCTCACAAGCTGCGGAAGCTG Rev_HRas_XbaI AACTCTAGATCAGGAGAGCACACACTTGCAGC HRAS_CAAX TOPO_ exon4ilk_mgfp EP8 FILK(1775) CTTATTTGGGAGCTGACTACG Rev_GFP_HRas TTGTGAGCTTTGTATAGTTCATCC BamHI_exon4_mGFP TOPO_ exon4ilk_mgfp EP8 FwILK-S176G/T180G ATTGAAGACGAGAGGCCGGGATGCTGGTTTGTCCCGTTTCAAGGG RevILK-T176G/T180G GACAAACCAGCATCCCGGCCTCTCGTCTTCAATCCCTGCCAGC pnebilkgfp_s176gt180g EP10 FwILK-S176D/T180D ATTGAAGACGAGAGACCGGGATGCTGATTTGTCCCGTTTCAAGGG RevILK-S176D/T180D GACAAATCAGCATCCCGGTCTCTCGTCTTCAATCCCTGCCAGC pnebilkgfp_s176dt180d EP11 FwF436A AAGCGGCCGAAGGCCGACATGGTGGTTCCC RevF436A TGTCGGCCTTCGGCCGCTTGCCGGGATCCTCG BamHI_exon4_F436_mGFP TOPO_ILK_exon4_F436A_GFP EP14 FwF436A AAGCGGCCGAAGGCCGACATGGTGGTTCCC RevF436A TGTCGGCCTTCGGCCGCTTGCCGGGATCCTCG BamHI_exon4_F436 TOPO_ILK_exon4_F436A EP15 Πίλαθαο 1: πγθεληξσηηθή απεηθόληζε ησλ δεπγώλ ησλ εθθηλεηώλ γηα ηελ θαηαζθεπή ησλ αληίζηνηρσλ πιαζκηδίσλ 110

122 ΠΑΡΑΡΣΗΜΑ Γ- Αληηδξαζηήξηα A Άβαν (Agar) (MERCK) Αβανυγδ (Agarose) Αβανυγδξ ζθαζνίδζα Ni-NTA (Qiagen) Αζεακυθδ (ethanol, EtOH) (Carlo Erba) Αζεοθεκμδζαιζκμηεηναμλζηυ μλφ (Ethylenediaminetetraacetic acid, EDTA) (Sigma- Aldrich) Αηνοθαιίδζμ/bis-Αηνοθαιίδζμ (37,5:1) (Bio-Rad) Αθαμοιίκδ μνμφ αμυξ (Bovine serum albumin, BSA) (Applichem) Αθαμοιίκδ μνμφ αμυξ ζε δζάθοια 10mg/ml (Bovine serum albumin, BSA) (ΝΔΒ) Αιπζηζθθίκδ (Ampicillin) (Sigma-Aldrich) B Βνςιζμφπμ αζείδζμ (ethidium bromide, EtBr) (Applichem) Γ Γθοηενυθδ (Glycerol) (Sigma-Aldrich) Γθοηίκδ (Glycin) (Applichem) D-βθοηυγδ (D-Glucose) (BDH) Γ Γευλονζαμκμοηθεμηίδζα (dntps) (Fermentas) δζιεεοθζηυ-ζμοθθμλείδζμ (dimethylsulfoxide, DMSO) δζιεεοθμ-θμνιαιίδζμ (dimethylformamide, DMF) (Sigma-Aldrich) D DAPI (4,6-diamidino-2-phenylindole) Δ Δπηάκζμ (Heptane) (ACROS) Θ Θεζσηυ ιαβκήζζμ 25mM (MgSO 4 ) (Fermentas) Θνεπηζηυ LB-άβαν (Sigma-Aldrich) Θνεπηζηυ LB (Sigma-Aldrich) Θνεπηζηυ Hanahan s (Sigma-Aldrich) H Halocarbon oil, series 700 (Arkema Group) 111

123 HEPES (Sigma-Aldrich) I Ηιζδαγυθζμ (Imidazole) (Sigma-Aldrich) Ηζμπνμπακυθδ (2-propanol) (Sharlau) IPTG (Sigma-Aldrich) K Κακαιοηίκδ (Kanamycin) (Invitrogen) Καοζηζηυ ηάθζμ (KOH) (Sigma Aldrich) Καοζηζηυ κάηνζμ (NaOH) (Sigma Aldrich) Κοακμφ ηδξ ανςιμ-θαζκυθδξ (Bromophenol blue) (Applichem) Λ Λζβάζδ DNA T4 (NEB) Λοζμγφιδ (Lysozyme) (Fluka) Μ Μεεακυθδ (MetOH) (Applichem) Μέεοθμ-4-οδνυλο-αεκγμσηυ (Methyl-4-hydroxybenzoate, Nipagin M) (Sigma- Aldrich) Ο Ολζηυ Kάθζμ (CH 3 COOK) (Fluka) Ολζηυ Νάηνζμ (CH 3 COONa) (Applichem) Ολζηυ Oλφ (CH 3 COOΖ) (Fluka) Οονία (Urea) (USB) Π Παναθμνιαθδεΰδδ (Sigma-Aldrich) Πενζμνζζηζηέξ εκδμκμοηθεάζεξ (NEB, Fermentas) Πμθο-αζεοθεκμ-βθοηυθδ (Polyethylene-glycol, PEG) (Sigma-Aldrich) Πμθοιενάζδ DNA Taq (NEB) Πμθοιενάζδ DNA Hot Star Taq (Qiagen) Πμθοιενάζδ DNA Pfu (Fermentas) Πνμπζμκζηυ μλφ (Sigma-Aldrich) Ρ Ρζαμκμοηθεάζδ Α (RNase A) (Amresco) T Triton X-100 (Applichem) 112

124 Τ Τδνμπθςνζηυ μλφ (hydrochloric acid, HCl) (Sigma-Aldrich) Φ Φαζκυθδ (ACROS) Φμνιαθδεΰδδ (Formaldehyde, FA) (Sigma-Aldrich) Φςζθμνζηυ ηάθζμ ιμκμααζζηυ (KH 2 PO 4 ) (Applichem) Φςζθμνζηυ κάηνζμ δζααζζηυ (Na 2 HPO 4 ) (Sigma-Aldrich) V Vectashield δζάθοια έβηθεζζδξ(vector) Υ Υθςνζμφπμ αζαέζηζμ (CaCl 2 ) (Applichem) Υθςνζμφπμ ηάθζμ (KCl) (Sigma-Aldrich) Υθςνζμφπμ ιαββάκζμ (MnCl 2 ) (Fluka) Υθςνζμφπμ ιαβκήζζμ (MgCl 2 ) (Sigma-Aldrich) Υθςνζμφπμ κάηνζμ (NaCl) (Sharlau) Υθςνμθυνιζμ (Chloroform) (Riedel-deHaën) X-GAL (Sigma-Aldrich) 113

125 ΠΑΡΑΡΣΗΜΑ Δ- Αληηζψκαηα Ολνκαζία πγθέληξσζε (IF) Πξνέιεπζε Πξσηνγελή αληηζώκαηα Rat a-chd 1/500 Mouratidou and Zervas Rabbit a-chd 1/500 Mouratidou and Zervas Mouse a-gfp 1/1000 ROCHE Rabbit a-gfp 1/1000 Invitrogen Mouse a-βps(cf.6g11) 1/20 DSHB Rat a-aps2 (PS2HC2) 1/10 DSHB Mouse a-talin (A22A) 1/15 DSHB Rabbit a-laminin A 1/250 (Fessler, Campbell et al. Mouse a-armadillo (Ν2 7Α1) 1987) 1/30 DSHB Mouse a-dlg (4F3) 1/30 DSHB Rat (DCAD2) a-de-cadherin 1/30 DSHB Mouse a-rho1 (p1d9) 1/50 DSHB Rabbit a-enabled (5G2) 1/50 DSHB Mouse a-profilin (chi 1J) 1/30 DSHB Rabbit a-zipper 1/500 (Jordan and Karess 1997) Rabbit a-pak 1/2000 (Harden, Lee et al. 1996) Rabbit a-parvin 1/500 Zervas Rabbit a-pinch 1/500 (Clark, McGrail et al. 2003) Rabbit a-hilk 1/500 SIGMA Rabbit a-diaphanous 1/100 (Afshar, Stuart et al. 2000) Mouse a-vasa 1/10 Cell Signaling Mouse a-fasciclin III 1/10 DSHB Mouse a-mhc 1/50 (Kiehart 1990) Γεπηεξνγελή αληηζώκαηα a-rabbit Cy2 1/500 Jackson Immunoresearch 114

126 a-rabbit Alexafluor-555 1/500 Invitrogen a-rabbit Cy5 1/500 Jackson Immunoresearch a-mouse Alexafluor-488 1/500 Invitrogen a-mouse Alexafluor-568 1/500 Invitrogen a-mouse Alexafluor-633 1/500 Invitrogen a-rat Alexafluor-488 1/500 Invitrogen a-rat Alexafluor-568 1/500 Invitrogen Φζνξίδνπζεο Υξσζηηθέο Rh/Ph 0,25 Units Invitrogen Ph633 0,25 Units Invitrogen DAPI 1/25000 Invitrogen ΠΑΡΑΡΣΗΜΑ Σ- Απεηθνληζηηθή αλάιπζε ηενεμζηυπζα: Nikon SM2800, Zeiss Stemi2000-C Μζηνμζηυπζμ θεμνζζιμφ: Leica DRMA2 οκεζηζαηυ Μζηνμζηυπζμ: Leica TCS SP5 Οζ θςημβναθίεξ θήθεδζακ ιε ημ Leica SP5 ζοκεζηζαηυ ιζηνμζηυπζμ, πνδζζιμπμζχκηαξ ημοξ 20Υ/0.7 NA λδνυ θαηυ ηαζ 63Υ/1.4 NA θαηυ θαδζμφ. 115

127 116

128 Αποηειέζκαηα 117

129 118

130 3.1 Μεραληζηηθέο ιεηηνπξγίεο ηεο ILK Ζ θεζημονβία ηδξ ILK είκαζ ζοκηδνδιέκδ ηαηά ηδκ ελέθζλδ Σμ βέκςια ηδξ Drosophila ηςδζημπμζεί έκα βμκίδζμ ηδξ ILK, υπςξ ζοιααίκεζ ηαζ ζηα εδθαζηζηά. Ζ ILK ζημ επίπεδμ ηδξ αιζκμλζηήξ αθθδθμοπίαξ πανμοζζάγεζ 65% ηαοηυηδηα ηαζ 75% μιμθμβία ιε ηδκ ακηίζημζπδ πνςηεΐκδ ηςκ εδθαζηζηχκ (Δηθ.1). Δηθόλα 1: ύγθξηζε ησλ ακηλνμηθώλ αιιεινπρηώλ ηεο πξσηεΐλεο ILK ζηε Drosophila, ηνλ πνληηθό θαη ηνλ άλζξσπν (ζε θόθθηλν πιαίζην πεξηθιείεηαη ε kinase-like επηθξάηεηα ηεο ILK, πεξηνρή όπνπ δεζκεύεηαη ε parvin). Με ημοηίδεξ επζζδιαίκμκηαζ ηα αιζκμλέα πμο δεκ είκαζ ζοκηδνδιέκα ιεηαλφ ηςκ εζδχκ (ιε ιαφνμ πνχια αιζκμλζηέξ αθθαβέξ αθθά απυ αιζκμλέα πμο ακήημοκ ζηδκ ίδζα ηαηδβμνία, π.π. οδνυθζθα, ιε ηυηηζκμ πνχια αιζκμλέα πμο ακήημοκ ζε δζαθμνεηζηέξ μιάδεξ αιζκμλέςκ, ππ. Τδνυθζθμ-οδνυθμαμ, ιε πνάζζκμ πνχια επζζδιαίκμκηαζ ηα αιζκμλέα Μ402 ηαζ Κ403, ηα μπμία παναιέκμοκ ζοκηδνδιέκα ιεηαλφ ηςκ εζδχκ ηαζ έπεζ δεζπεεί υηζ είκαζ απαναίηδηα βζα ηδκ αθθδθεπίδναζδ ηςκ ILK-parvin). Με αάζδ αοηή ηδκ μιμθμβία εεθήζαιε κα πνμπςνήζμοιε πεναζηένς ηαζ κα εθέβλμοιε ηδ δοκαηυηδηα ηδξ ILK ηςκ εδθαζηζηχκ κα οπμηαηαζηήζεζ ηδ θεζημονβία ηδξ ILK ηδξ ιφβαξ (dilk) ζημκ ακαπηοζζυιεκμ μνβακζζιυ. Γζα ημ ζημπυ αοηυ ηαηαζηεοάζηδηακ δζαβμκζδζαηά ζηεθέπδ πμο πενζείπακ ηδκ ηςδζηή πενζμπή ηδξ ILK ημο ακενχπμο (hilk) ηαζ ημο πμκηζημφ (milk) ακηίζημζπα (Δηθ.2). 119

131 Δηθόλα 2: Γηαγξακκαηηθή απεηθόληζε ησλ δηαγνληδηαθώλ θαηαζθεπώλ Α) δ ηςδζηή αθθδθμοπία ημο βμκζδίμο ηδξ ilk ζημκ άκενςπμ, Β) δ ηςδζηή αθθδθμοπία ηδξ ilk ημο πμκηζημφ ζογεοβιέκδ ζημ C άηνμ ηδξ ζημ ίδζμ ακμζπηυ πθαίζζμ ακάβκςζδξ ιε ηδκ ηςδζηή αθθδθμοπία ηδξ πνάζζκδξ θεμνίγμοζαξ πνςηεΐκδξ (GFP). Μεηαλφ ηςκ δομ ηςδζηχκ πενζμπχκ πανειαάθθεηαζ ιζ αθθδθμοπία πμο ηςδζημπμζεί ηέζζενζξ ζενίκεξ Αλάιπζε ηνπ ππνθπηηαξηθνχ εληνπηζκνχ ηεο ILK ησλ ζειαζηηθψλ ζηνπο κχεο ηεο Drosophila Ο ηφπμξ ζηεθεπχκ πμο ηαηαζηεοάζεδηακ βζα ηδ ιεθέηδ ηδξ δζαιενζζιαημπμίδζδξ ηδξ ILK ηςκ εδθαζηζηχκ αθμνμφζε δζαβμκίδζα, ηα μπμία εηθνάγμκηακ οπυ ημκ έθεβπμ ηςκ νοειζζηζηχκ αθθδθμοπζχκ UAS. Δηθνάζηδηε μθυηθδνδ δ ηςδζηή πενζμπή ηδξ πνςηεΐκδξ, ζημ ιοσηυ ζφζηδια ιε ηδ πνήζδ ημο mef2gal4, ημ μπμίμ έπεζ παναηηδνζζιέκμ πνυηοπμ έηθναζδξ ζημ ιεζυδενια (Ranganayakulu, Schulz et al. 1996). H milk εκημπίγεηαζ ζηζξ ιομηεκμκηζηέξ ζοκδέζεζξ (ΜΣ) ζηα ειανοσηά ιοσηά ηφηηανα υπςξ ηαζ δ dilk αθθά ζδιακηζηυ πμζυ ηδξ παναβυιεκδξ πνςηεΐκδξ παναιέκεζ ζημ ηοηηανυπθαζια (Δηθ.3Α & Δηθ.3Α ). Σμ ίδζμ πνυηοπμ οπμηοηηανζηήξ ηαηακμιήξ αημθμοεεί δ milk ηαζ ζηα ηνία πνμκοιθζηά ζηάδζα (Δηθ.3Β-Γ ). ηδ ζοκέπεζα, πμζμηζημπμζήζαιε ηδ δζαθμνά ηδξ ζπεηζηήξ οπμηοηηανζηήξ ηαηακμιήξ ηδξ ILK ηδξ ιφβαξ ηαζ ημο πμκηζημφ ακηίζημζπα. Μεηνήζαιε ηδκ έκηαζδ ημο θεμνζζιμφ (GFP) ζηα δζαθμνεηζηά οπμηοηηανζηά δζαιενίζιαηα (ζηζξ ΜΣ ηαζ ημ ηοηηανυπθαζια). Οζ ιεηνήζεζξ ιαξ έδεζλακ υηζ δ ILK ηςκ εδθαζηζηχκ ειθακίγεζ ιζηνυηενδ ζοκάθεζα βζα ηζξ εέζεζξ πνυζδεζδξ ηδξ πνςηεΐκδξ ζηζξ ΜΣ ζε ζπέζδ ιε ηδ dilk. H ζπεηζηή ηαηακμιή ηδξ πνςηεΐκδξ ζηα δομ δζαθμνεηζηά οπμηοηηανζηά δζαιενίζιαηα είκαζ 3:2 ΜΣ/ΚΤΣΣΑΡΟΠΛΑΜΑ ηαζ 7:2 ΜΣ/ΚΤΣΣΑΡΟΠΛΑΜΑ βζα ηδ milk ηαζ ηδ dilk ακηίζημζπα (Δηθ.3Δ). 120

132 Δηθόλα 3: Τπνθπηηαξηθόο εληνπηζκόο ησλ milk θαη dilk ζην κπτθό θύηηαξν θαηά ην εκβξπτθό θαη ηα πξνλπκθηθά ζηάδηα αλάπηπμεο ηεο Drosophila ππό ηνλ έιεγρν ηνπ mef2gal4. (Α,Α ) ειανοσηυ ιοσηυ ηφηηανμ αβνίμο ηφπμο, (μζ ΜΣ οπμδεζηκφμκηαζ ιε θεοηυ αέθμξ), (Β-Β ) ιοσηυ ηφηηανμ πνμκφιθδξ 1 μο ζηαδίμο αβνίμο ηφπμο, (Ε-γχκεξ ιε θεοηή ηεθαθή αέθμοξ, μζ ΜΣ ζε ηίηνζκδ 121

133 έθθεζρδ), (Γ, Γ ) ιοσηυ ηφηηανμ 2 μο πνμκοιθζημφ ζηαδίμο, (Γ-Γ ) ιοσηυ ηφηηανμ πνμκφιθδξ 3 μο ζηαδίμο αβνίμο ηφπμο, (Δ) Γζαβναιιαηζηή απεζηυκζζδ ηδξ ζπεηζηήξ ηαηακμιήξ ηςκ dilk ηαζ milkζηζξ ΜΣ ηαζ ημ ηοηηανυπθαζια. ηζξ θςημβναθίεξ ηαζ ηςκ ηνζχκ πνμκοιθζηχκ ζηαδίςκ απεζημκίγμκηαζ ναπζαίμζ θμλμί ιφεξ Η ILK ησλ ζειαζηηθψλ κπνξεί λα ππνθαηαζηήζεη ηελ νκφινγε πξσηεΐλε ζηε Drosophila Δίκαζ βκςζηυ υηζ μιμγοβχηεξ βζα ημ ιεηάθθαβια ηδξ ilk ειθακίγμοκ θαζκυηοπμ ζημ ειανοσηυ ιοσηυ ημοξ ζφζηδια ηαζ πεεαίκμοκ ηαηά ημ ηεθζηυ ζηάδζμ ηδξ ειανομβέκεζδξ (Zervas, Gregory et al. 2001). Ζ οπμηαηάζηαζδ ηδξ εκδμβεκμφξ θεζημονβίαξ ηδξ πνςηεΐκδξ επζηοβπάκεηαζ ακ ζοκεηθνάζμοιε ζζημεζδζηά ημ UAS δζαβμκίδζμ οπυ ημκ έθεβπμ ημο 24ΒGal4 (Reuveny, Elhanany et al. 2009) βζα ηδκ πνςηεΐκδ αβνίμο ηφπμο ηαοηυπνμκα ζημ ιοσηυ ζφζηδια, ηα βθμζαηά ηφηηανα ηδξ κςημπμνδήξ ηαζ ηα ηεκυκηζα ηφηηανα. Δκχ δ ζζημεζδζηή έηθναζδ ημο δζαβμκζδίμο ιυκμ ζημ ιοσηυ ζφζηδια δεκ είκαζ ζηακή κα οπμηαηαζηήζεζ ηδ γςηζηή εκδμβεκή θεζημονβία ηδξ ILK. Οζ παναηδνήζεζξ αοηέξ ζοκάδμοκ ιε ημ ζοιπέναζια υηζ δ ILK είκαζ απαναίηδηδ ηαηά ημ ειανοσηυ ζηάδζμ ηαζ ζε άθθμκ ζζηυ εηηυξ απυ ημ ιοσηυ ζφζηδια. Γζα ημ θυβμ αοηυ, εηθνάζαιε ηυζμ ηδ hilk υζμ ηαζ ηδ milk οπυ ημκ έθεβπμ ημο 24ΒGal4 ζε μιμγοβχηεξ βζα ilk. Συζμ δ hilk υζμ ηαζ milk οπμηαεζζημφκ πθήνςξ ηδ θεζημονβία ηδξ εκδμβεκμφξ πνςηεΐκδξ ηαηά ημ ειανοσηυ ζηάδζμ, υπςξ έδεζλακ ηα πεζνάιαηα εθέβπμο ηδξ ζοιπθδνςιαηζηυηδηαξ. Δκημπίγμκηαζ ηονίςξ ζηζξ ΜΣ (Δηθ.4Β & Δηθ.4Γ ) ηαζ δζαζχγμοκ ηδκ ειανοσηή εκδζζιυηδηα ζε ακηίζημζπα πμζμζηά ιε ηδ dilk (Δηθ.5Α-Γηαγ.1) ιε απμηέθεζια κα πνμηφπηεζ ζδιακηζηυξ ανζειυξ εκήθζηςκ αηυιςκ (Δηθ.5Β-Γηαγ.2). 122

134 Δηθόλα 4: Η ILK ησλ ζειαζηηθώλ δηαηεξεί ζηαζεξή ηε ζύλδεζε αθηίλεο θαη ηληεγθξηλώλ ζην εκβξπτθά κπτθά θύηηαξα κεηαιιαγκάησλ γηα ilk. (Α-Α ) ειανοσηά ιοσηά ηφηηανα αβνίμο ηφπμο, (Β-Β ) ειανοσηυ ιοσηυ ηφηηανμ ιεηαθθάβιαημξ βζα ilk πμο οπενεηθνάγεζ milk-egfp ηαζ hilk ακηίζημζπα, οπυ ημκ mef2gal4, (Α,Β,Γ ) ηοηηανμζηεθεηυξ ζδιαζιέκμξ βζα MHC, (Α,Β ) οπμηοηηανζηυξ εκημπζζιυξ ηςκ milk (egfp) ηαζ hilk (anti-hilk) ακηίζημζπα ζηζξ ΜΣ (αέθμξ) ηαζ ημ ηοηηανυπθαζια 123

135 (dilk) Δηθόλα 5: Γηαγξάκκαηα 1&3- Γηαγξακκαηηθή ζπγθξηηηθή απεηθόληζε ηεο ηθαλόηεηαο δηάζσζεο ηεο ελήιηθεο βησζηκόηεηαο ησλ κεηαιιαγκάησλ γηα ilk από ηηο δηάθνξεο ζεηξέο δηαγνληδίσλ milk θαη hilk. (Α) ζφβηνζζδ πμζμζημφ «δζαζςζιέκςκ» εκήθζηςκ αηυιςκ ιεηά απυ έθεβπμ ζοιπθδνςιαηζηυηδηαξ ηάκμκηαξ πνήζδ ηςκ δζαβμκζδίςκ dilk ηαζ milk ακηίζημζπα, (Β) απεζηυκζζδ ημο πμζμζημφ εκήθζηςκ αηυιςκ πμο πνμηφπημοκ απυ ημκ έθεβπμ ζοιπθδνςιαηζηυηδηαξ ηάκμκηαξ πνήζδ ηζξ δζάθμνεξ ζεζνέξ ηςκ δζαβμκζδίςκ ηδξ ILK ηςκ εδθαζηζηχκ πμο ηαηαζηεοάζηδηακ ζημ ενβαζηήνζμ Η hilk εκθαλίδεη κεησκέλε ζπλάθεηα κε ηελ parvin ηεο Drosophila Απυ πεζνάιαηα ζε ιμκηέθα ηοηηανζηχκ ζεζνχκ (Zhang, Chen et al. 2002), ηαεχξ ηαζ ζημ ιοσηυ ειανοσηυ ζφζηδια ηδξ Drosophila, ηα μπμία έβζκακ ζημ ενβαζηήνζμ (Vakaloglou and Zervas, αδδιμζίεοηα απμηεθέζιαηα) έπεζ δεζπεεί, υηζ δ δζαιενζζιαημπμίδζδ ηδξ parvin ελανηάηαζ απυ ηδκ πανμοζία ηδξ ILK. Δπίζδξ, πνμδβμφιεκεξ ιεθέηεξ ζημ ενβαζηήνζυ ιαξ (Chountala and Zervas, αδδιμζίεοηα 124

136 απμηεθέζιαηα), έδεζλακ υηζ δ έηθναζδ ηδξ parvin οπυ ημκ έθεβπμ ημο mef2gal4 μδδβεί ζε εάκαημ ηαηά ηα κοιθζηά ζηάδζα ηαζ ημκ εκημπζζιυ ηδξ πνςηεΐκδξ ηονίςξ ζημ ηοηηανυπθαζια (Δηθ.5Α). Χζηυζμ, δ ηαοηυπνμκδ οπενέηθναζδ ηδξ ILK ιεηαημπίγεζ ηδκ parvin απυ ημ ηοηηανυπθαζια ζηα άηνα ημο ιοσημφ ηοηηάνμο (Δηθ.5Α ). Σμ εφνδια αοηυ οπμδδθχκεζ υηζ ηα αολδιέκα επίπεδα ηδξ ILK είκαζ δ ανηεηή ηαζ ακαβηαία ζοκεήηδ πνμηεζιέκμο κα δζαιενζζιαημπμζδεμφκ ζηζξ ΜΣ ηα αολδιέκα επίπεδα ηδξ parvin. Έηζζ, ζηδ ζοκέπεζα δμηζιάζεδηε κα ζοκοπενεηθναζεεί δ parvin ιαγί ιε ηδκ ILK ηςκ εδθαζηζηχκ (hilk), πνμηεζιέκμο κα δζαπζζηςεεί ακ εα ιεηααάθθεζ ημ πνυηοπμ ηδξ οπμηοηηανζηήξ ημοξ ηαηακμιήξ. Ζ ζοκοπενέηθναζδ ηδξ hilk ιε ηδκ parvin, δεκ είπε ηάπμζα επίδναζδ ζηδ δζαιενζζιαημπμίδζδ ηδξ πνςηεΐκδξ, δ μπμία πανέιεζκε ζημ ηοηηανυπθαζια (Δηθ.6Α ). Καηά ζοκέπεζα, ζε ακηίεεζδ ιε ηδκ ILK ηδξ Drosophila, ηα αολδιέκα επίπεδα ηδξ hilk δεκ απμηεθμφκ ανηεηή ηαζ ακαβηαία ζοκεήηδ πνμηεζιέκμο κα δζαιενζζιαημπμζδεμφκ ζηζξ ΜΣ ηα αολδιέκα επίπεδα ηδξ parvin. Δπίζδξ, εεθήζαιε κα εθέβλμοιε ακ οπάνπεζ ιεζςιέκδ ζηακυηδηα αθθδθεπίδναζδξ ηδξ ILK ηςκ εδθαζηζηχκ ιε ημ ηνίημ ιέθμξ ημο ζοιπθυημο PIP, ηδκ PINCH. Ζ PINCH πνδζζιμπμζήεδηε, ςξ ιία πνςηεΐκδ ημο ζδίμο ζοιπθέβιαημξ ιε ηδκ parvin, πμο εκημπίγεηαζ ζηζξ ΜΣ (Clark, McGrail et al. 2003). Δίκαζ βκςζηυ υηζ δ ILK αθθδθεπζδνά ιε ηδκ PINCH ιέζς ηςκ ANKRs. Ζ ILK εοεφκεηαζ βζα ημκ εκημπζζιυ ηδξ PINCH ζηζξ ΜΣ, αθθά βζα ηδ δζαηήνδζδ ηδξ πνςηεΐκδξ ζηα ιοσηά ειανοσηά ηφηηανα (Zervas, Psarra et al. 2011). Πζμ ζοβηεηνζιέκα ζοκοπενεηθνάζεδηακ PINCH ιε ηδκ hilk. Ζ θεζημονβζηυηδηα ημο ζηεθέπμοξ πμο πνδζζιμπμζήεδηε βζα ηδκ οπενέηθναζδ ηδξ PINCH έπεζ εθεβπεεί ζε πεζνάιαηα ζοιπθδνςιαηζηυηδηαξ ηαζ έπεζ δεζπεεί υηζ είκαζ ζηακυ κα δζαζχζεζ ηδ εκδζζιυηδηα πμο πνμηαθείηαζ απυ ηδκ απχθεζα ηδξ εκδμβεκμφξ πνςηεΐκδξ. Γεκ παναηδνήεδηε ηάπμζα δζαθμνμπμίδζδ ζηδ δζαιενζζιαημπμίδζδ ή ζηδ ζηαεενυηδηα ηδξ πνςηεΐκδξ (Δηθ.6Β), αθθά δ εζηυκα ήηακ πανυιμζα ιε αοηήκ πμο οπάνπεζ, υηακ ημ δζαβμκίδζμ PINCH εηθνάγεηαζ ιυκμ ημο (Δηθ.6Β ). Δπμιέκςξ, ηα απμηεθέζιαηα ηδξ ζοκοπενέηθναζδξ parvin ιε ILK μθείθμκηαζ απμηθεζζηζηά ζηδκ αθθδθεπίδναζδ ιεηαλφ ημοξ ηαζ δεκ πνμηφπηεζ ημ ίδζμ απμηέθεζια ηαηά ηδκ ζοκοπενέηθναζδ parvin ιε μπμζαδήπμηε άθθδ πνςηεΐκδ, αηυια ηαζ ακ είκαζ ημο ζδίμο ζοιπθέβιαημξ. 125

137 Δηθόλα 6: Σαπηόρξνλε ππεξ-έθθξαζε hilk θαη PARVIN-GFP ζε κπτθά θύηηαξα ηξίηνπ πξνλπκθηθνύ ζηαδίνπ, ππό ηνλ έιεγρν ηνπ mef2gal4. (Α) H PARVIN-GFP GFP εκημπίγεηαζ απμηθεζζηζηά ζημ ηοηηανυπθαζια (Κ) (Α ) H PARVIN-GFP παναιέκεζ ηοηηανμπθαζιαηζηή (Κ) ιε ηαοηυπνμκδ οπεν-έηθναζδ ηδξ hilk, (Α ) H ηαοηυπνμκδ οπεν-έηθναζδ ηδξ dilk ζοβηεκηνχκεζ ηδκ PARVIN-GFP ζηζξ ΜΣ (ηίηνζκμ πθαίζζμ). (B) Τπμηοηηανζηυξ εκημπζζιυξ PINCH GFP. (Β ) δ ηαηακμιή ηδξ PINCH δεκ επδνεάγεηαζ απυ ηδκ ηαοηυπνμκδ οπενέηθναζδ ηδξ hilk. ηζξ θςημβναθίεξ απεζημκίγμκηαζ ναπζαίμζ θμλμί ιφεξ ηαζ (Γ) ζπδιαηζηή απεζηυκζζδ ηςκ ηνοζηαθθμβναθζηχκ απμηεθεζιάηςκ ηςκ πενζμπχκ ηςκ ILK ηαζ parvin πμο αθθδθεπζδνμφκ θοζζηά, ιε ηίηνζκμ πνχια ζδιεζχκμκηαζ ηα αιζκμλέα πμο είκαζ απαναίηδηα βζα ηδκ αθθδθεπίδναζδ ηςκ δομ πνςηεσκχκ, ηνμπμπμζδιέκδ απυ (Fukuda, Gupta et al. 2009). 126

138 ΤΝΟΦΗ ΑΠΟΣΔΛΔΜΑΣΧΝ ΔΝΟΣΗΣΑ Η ILK ηνπ πνληηθνχ θαη ηνπ αλζξψπνπ αθνινπζεί παξαπιήζην πξφηππν ππνθπηηαξηθήο θαηαλνκήο κε ηελ ελδνγελή πξσηεΐλε ζηα κπτθά θχηηαξα Drosophila. Η ILK ηνπ πνληηθνχ θαη ηνπ αλζξψπνπ κπνξνχλ λα ππνθαηαζηήζνπλ ηε ιεηηνπξγία ηεο ILK ζηε Drosophila. Η ILK ηνπ αλζξψπνπ παξνπζηάδεη κεησκέλε δπλαηφηεηα πξφζδεζεο κε ηελ parvin ηεο Drosophila Έθεβπμξ ημο θεζημονβζημφ νυθμο ηςκ ζοκηδνδιέκςκ αιζκμλέςκ S176, T180 F436 ηδξ ILK Πνμηεζιέκμο κα δζενεοκήζμοιε ημ ιμνζαηυ ιδπακζζιυ νφειζζδξ ηαζ δνάζδξ ηδξ ILK ηαηά ηδκ ακάπηολδ, εθέβλαιε πζεακέξ αθθαβέξ ζηδ θεζημονβία ηδξ πνςηεΐκδξ πμο έθενε ιεηαθθαβέξ ζε ζοβηεηνζιέκα αιζκμλέα ζζπονά ζοκηδνδιέκα ηαηά ηδκ ελέθζλδ. ε ηοηηανζηέξ ζεζνέξ εδθαζηζηχκ έπεζ δεζπεεί υηζ δ PAK1 ελανηχιεκδ θςζθμνοθίςζδ ηδξ ILK εκζζπφεζ ηδκ οπμηοηηανζηή ηδξ ηαηακμιή ζημ ηοηηανυπθαζια, εκχ δ βεκεηζηή αθαίνεζδ ηδξ PAK1 επάβεζ ηδ ιεηαηυπζζδ ηδξ ILK ζημκ πονήκα (Acconcia, Barnes et al. 2007). Βαζζγυιεκμζ ζηδκ ηνέπμοζα αζαθζμβναθία οπμηαηαζηήζαιε πζεακά αιζκμλζηά ηαηάθμζπα ή ιζηνά ηιήιαηα ηδξ αιζκμλζηήξ αθθδθμοπίαξ ηδξ ILK ζδιακηζηά βζα ημ ζςζηυ οπμηοηηανζηυ εκημπζζιυ ηδξ ζηζξ ΜΣ ημο ειανφμο ηαζ βζα ηδ θεζημονβία ηδξ. Αοηά ηα αιζκμλζηά ιμηίαα είκαζ πενζμπέξ αοζηδνά ζοκηδνδιέκεξ ηαηά ηδκ ελέθζλδ. Γζα ημ θυβμ αοηυ εζζαβάβαιε ηζξ ελήξ ζδιεζαηέξ ιεηαθθάλεζξ ζηδκ πνςηεσκζηή αθθδθμοπία ηδξ ILK: α) S176D T180D α) S176G T180G β) F436A 127

139 Ο ππνθπηηαξηθφο εληνπηζκφο θαη ε ιεηηνπξγία ηεο ILK δελ επεξεάδεηαη απφ πηζαλή θσζθνξπιίσζε ζηηο ζέζεηο S176 θαη T180. Δνεοκήζαιε ακ δ θςζθμνοθίςζδ, νοειίγεζ ημκ εκημπζζιυ ηδξ ILK ηαζ ηδ θεζημονβία ηδξ. Οζ εέζεζξ T180 ηαζ S176, πμο απμηεθμφκ επίζδξ πζεακέξ εέζεζξ θςζθμνοθίςζδξ βζα ηδ PAK1, είκαζ θςζθμνοθζςιέκεξ ζε ηφηηανα ηδξ ζεζνάξ Kc167 ζηδ Drosophila (Bodenmiller, Malmstrom et al. 2007). Ζ ILK ηςκ εδθαζηζηχκ έπεζ ηέζζενζξ πζεακέξ εέζεζξ θςζθμνοθίςζδξ βζα ηδκ p21- εκενβμπμζμφιεκδ ηζκάζδ (PAK 1), πμο πενζέπμοκ ημ ιμηίαμ K/RxxT/S (Acconcia, Barnes et al. 2007). Ζ Σ180 εέζδ είκαζ ηαθά ζοκηδνδιέκδ ζηδκ πνςηεσκζηή αθθδθμοπία ηδξ ILK ακάιεζα ζηα είδδ (Δηθ.7). Συζμ δ PAK1 υζμ ηαζ δ πνςηεσκζηή ηζκάζδ Β (PKB) (Δηθ.7) (Alessi, Caudwell et al. 1996) απμηεθμφκ πζεακέξ πνςηεΐκεξ πμο ιπμνμφκ κα θςζθμνοθζχκμοκ ημ ζοβηεηνζιέκμ ιμηίαμ. Αοηά ηα απμηεθέζιαηα οπμζηδνίγμοκ υηζ μζ εέζεζξ S176 ηαζ T180 θςζθμνοθζχκμκηαζ απυ ημ PAK, PKB ή ηάπμζα άθθδ ηζκάζδ. Δηθόλα 7: ύγθξηζε ησλ ακηλνμηθώλ αιιεινπρηώλ ηεο πξσηεΐλεο ILK ζηε Drosophila ζηα δηάθνξα είδε. Οζ εέζεζξ S176 ηαζ T180 είκαζ ζδιακηζηά ζοκηδνδιέκεξ ηαηά ηδκ ελέθζλδ. διεζχκμκηαζ ηα αιζκμλζηά ιμηίαα θςζθμνοθίςζδξ πμο ακαβκςνίγμκηαζ απυ ηδκ PAK1 (ιαφνμ πθαίζζμ) ηαζ ηδ PKB (ηυηηζκμ πθαίζζμ) ακηίζημζπα. 128

140 H PAK1 ηδξ Drosophila ζοβηεκηνχκεηαζ ζηζξ ΜΣ ιέζς εκυξ ιδπακζζιμφ ακελάνηδημο ηςκ ζκηεβηνζκχκ (Harden, Lee et al. 1996). Καηά ζοκέπεζα, δ dpak εα ιπμνμφζε κα επδνεάζεζ ηδκ οπμηοηηανζηή ηαηακμιή ηδξ ILK, θςζθμνοθζχκμκηαξ ηδκ ILK ηαζ κα πνμηαθέζεζ ηδ ιεηαηυπζζή ηδξ ζημκ πονήκα. Γζα ημ ζημπυ αοηυ, ηαηαζηεοάζαιε δομ ιεηαθθαβιέκεξ ιμνθέξ ηδξ ILK, ιζα ιυκζια ιδ θςζθμνοθζςιέκδ πνςηεΐκδ βζα ηζξ εέζεζξ S176 ηαζ T180 ηαζ ιζα ιυκζια θςζθμνοθζςιέκδ ζηζξ εέζεζξ S176 ηαζ T180. Τπμηαηαζηήζαιε ηα αιζκμλέα S176 ηαζ T180 είηε ιε α) βθοηίκδ (G), χζηε κα ιδκ είκαζ δοκαηή δ θςζθμνοθίςζδ (S176G, T180G) είηε ιε α) αζπανηζηυ μλφ (D), ημ μπμίμ θυβς ημο ανκδηζημφ θμνηίμο ημο ιπμνεί κα ιζιδεεί ημ ανκδηζηυ θμνηίμ ηδξ θςζθμνζηήξ μιάδαξ (S176D, T180D) Η πηζαλή θσζθνξπιίσζε ησλ ζέζεσλ S176 θαη Σ180 δελ επεξξεάδεη ηνλ ππνθπηηαξηθφ εληνπηζκφ ηεο ILK ζηηο ΜΣ Τπενεηθνάζαιε ηζξ δομ ιεηαθθαβιέκεξ πνςηεΐκεξ ζηα δζάθμνα ακαπηολζαηά ζηάδζα. Καηά ημ ειανοσηυ ακαπηολζαηυ ζηάδζμ, ηυζμ δ ILK-S176G180G υζμ ηαζ δ ILK-S176D180D εκημπίγμκηαζ ηονίςξ ζηζξ ΜΣ ηαζ ηζξ Ε γχκεξ (Δηθ.8Α&Δηθ.8Β) υπςξ ηαζ δ ILK αβνίμο ηφπμο, αθθά ιένμξ ηςκ πζιαζνζηχκ πνςηεσκχκ παναιέκεζ ηοηηανμπθαζιαηζηυ, ακηίεεηα ιε ηδκ αβνίμο ηφπμο πνςηεΐκδ πμο ζοζζςνεφεηαζ ζηζξ ΜΣ (Δηθ.8Γ). 129

141 Δηθόλα 8: Τπνθπηηαξηθόο εληνπηζκόο ησλ ηξνπνπνηεκέλσλ κνξθώλ ηεο ILK ζην εκβξπτθό κπτθό θύηηαξν ηειηθνύ ζηαδίνπ αλάπηπμεο. (Α) οπμηοηηανζηυξ εκημπζζιυξ ηδξ ILK S176G180G (GFP), (Β) οπμηοηηανζηυξ εκημπζζιυξ ηδξ ILK S176DT180D (GFP) ηαζ (Γ) ) Ζ ΗILK (GFP) εκημπίγεηαζ ζηζξ ΜΣ ηαζ ηζξ Ε-γχκεξ ζημ ειανοσηυ ιοσηυ ηφηηανμ αβνίμο ηφπμο. Δηθόλα 9: πγθέληξσζε ησλ κεηαιιαγκέλσλ κνξθώλ ηεο ILK ζηηο ΜΣ, ππεξεθθξαδόκελεο ππό ηνλ έιεγρν ηνπ mef2gal4. (Α -Γ ) οπμηοηηανζηή ηαηακμιή ηςκ δζάθμνςκ ιμνθχκ ζημ ιοσηυ ηφηηανμ πνμκφιιθδξ 1 μο ζηαδίμο, (Α -Γ ) οπμηοηηανζηυξ εκημπζζιυξ ηςκ δζάθμνςκ ιμνθχκ ζημ ιοσηυ ηφηηανμ πνμκφιιθδξ 2 μο (ηα ζοκεπή αέθδ οπμδεζηκφμοκ ηζξ ΜΣ ηαζ ηα δζαηεημιιέκα ηζξ Ε- γχκεξ). 130

142 ηα επυιεκα ακαπηολζαηά ζηάδζα, μζ ιεηαθθαβιέκεξ ιμνθέξ ηδξ ILK εκημπίγμκηαζ ηονίςξ ζηζξ ΜΣ ηαζ ηζξ Ε γχκεξ ηαηά ημ 1 μ ηαζ 2 μ πνμκοιθζηυ ακαπηολζαηά ζηάδζα (Δηθ.9Β &Δηθ.9Γ,Δηθ.10-Γηαγ.4&5). Ζ ζηακυηδηα ζοζζχνεοζδξ ζηζξ ΜΣ ειθάκζζε ήπζα ιείςζδ ηαζ ηαιία απυ ηζξ ιεηαθθαβιέκεξ πνςηεΐκεξ δεκ έδεζλακ ιεηαηυπζζδ ζημκ πονήκα. Δπμιέκςξ ζε ακηίεεζδ ιε ηα εονήιαηα ζηα ηφηηανα ηςκ εδθαζηζηχκ, δ θςζθμνοθίςζδ αοηχκ ηςκ αιζκμλέςκ δεκ νοειίγεζ ηδκ ηαηακμιή ηδξ ILK ζημοξ ιφεξ. 131

143 Δηθόλα 10: Γηαγξάκκαηα 4&5 - Πνζνηηθνπνίεζε ηεο θαηαλνκήο ηεο έληαζεο θζνξηζκνύ (GFP) ζηηο ΜΣ ζπγθξηηηθά κε απηή ζην θπηηαξόπιαζκα. (Α) 1 μ πνμκοιθζηυ ζηάδζμ ηαζ (Β) 2 μ πνμκοιθζηυ ζηάδζμ Οη κεηαιιαγκέλεο πξσηεΐλεο ππνθαζηζηνχλ πιήξσο ηε ιεηηνπξγία ηεο ελδνγελνχο πξσηεΐλεο Πναβιαημπμζήζαιε πεζνάιαηα εθέβπμο ηδξ ζοιπθδνςιαηζηυηδηαξ βζα ημοξ δομ ηφπμοξ ιεηαθθαβιέκδξ ILK. Οζ ιεηαθθαβιέκεξ πνςηεΐκεξ δζέζςζακ πθήνςξ ηδκ ειανοσηή εκδζζιυηδηα υηακ οπενεηθνάζηδηακ ζζημεζδζηά οπυ ημκ έθεβπμ ημο 24ΒGal4 ζε έιανοα μιμγοβχηεξ βζα ilk (Δηθ.11-Γηαγ.6). Καζ μζ δομ ιεηαθθαβιέκεξ ιμνθέξ βζα ILK οπμηαεζζημφκ πθήνςξ ηδκ εκδμβεκή πνςηεΐκδ ζε υθδ ηδ δζάνηεζα ηδξ ακάπηολδξ ηδξ ιφβαξ ιε απμηέθεζια κα πνμηφπημοκ εκήθζηα άημια (Δηθ.12-Γηαγ.7). 132

144 Δηθόλα 11: Γζάβναιια 6 - Έθεβπμξ ειανοσηήξ εκδζζιυηδηαξ ζε ιεηαθθάβιαηα βζα ilk ιε ηαοηυπνμκδ ζζημ-εζδζηή έηθναζδ ηςκ ιεηαθθαβιέκςκ ιμνθχκ ILK οπυ ημκ έθεβπμ ημο 24ΒGal4. Οζ ιεηαθθαβιέκεξ ιμνθέξ ILK οπμηαεζζημφκ πθήνςξ ηδκ εκδμβεκή ILK ηαηά ημ ειανοσηυ ζηάδζμ ακάπηολδξ ηδξ Drosophila, υπςξ πνμηφπηεζ απυ ημοξ εθέβπμοξ ζοιπθδνςιαηζηυηδηαξ. Δηθόλα 12: Γηάγξακκα7- Έιεγρνο ελήιηθεο βησζηκόηεηαο ζε κεηαιιάγκαηα γηα ilk κε ηαπηόρξνλε ηζην-εηδηθή έθθξαζε ησλ κεηαιιαγκέλσλ κνξθώλ ILK ππό ηνλ έιεγρν ηνπ 24ΒGal4. Οζ ιεηαθθαβιέκεξ ιμνθέξ ILK είκαζ ζε εέζδ κα οπμηαηαζηήζμοκ ηδκ εκδμβεκή ILK ζε ακηίζημζπμ ααειυ ιε ηδκ αβνίμο ηφπμο dilk-gfp. 133

145 Η ζεκεηαθή κεηάιιαμε F436A δελ επεξεάδεη ηνλ ππνθπηηαξηθφ εληνπηζκφ θαη ηε ιεηηνπξγία ηεο ILK Έκα άθθμ αιζκμλζηυ ηαηάθμζπμ πμο είκαζ απαναίηδημ βζα ημκ εκημπζζιυ ηδξ ILK ζηζξ εζηζαηέξ εέζεζξ πνμζηυθθδζδξ είκαζ ημ F436, ημ μπμίμ εδνάγεηαζ ζηδκ ηεθεοηαία α έθζηα ημο ηαναμλοηεθζημφ θμαμφ ηδξ πενζμπήξ ηζκάζδξ (Δηθ.13) (Fukuda, Gupta et al. 2009) (Zhang, Chen et al. 2002). Δηθόλα 13: ύγθξηζε ησλ ακηλνμηθώλ αιιεινπρηώλ ηεο πξσηεΐλεο ILK ζηε Drosophila θαη ζηα δηάθνξα είδε. Ζ εέζδ F436 είκαζ ζδιακηζηά ζοκηδνδιέκδ ηαηά ηδκ ελέθζλδ Η ζεκεηαθή κεηαιιαγή F436A δελ επεξεάδεη ην πξφηππν ηνπ ππνθπηηαξηθνχ εληνπηζκνχ ηεο ILK ζηα εκβξπτθά θαη πξνλπκθηθά κπτθά θχηηαξα. ηα ειανοσηά ιοσηά ηφηηανα δ ILK-F436A-GFP εκημπίγεηαζ ηονίςξ ζηζξ ΜΣ ηαζ ηζξ Ε γχκεξ υπςξ ηαζ δ ILK αβνίμο ηφπμο, αθθά ιένμξ ηδξ παναιέκεζ ζημ ηοηηανυπθαζια (Δηθ.14Α&Δηθ.14Β). Καηά ηα πνμκοιθζηά ακαπηολζαηά ζηάδζα δ ιεηάθθαλδ F436A ιείςζε ηδ ζοζζχνεοζδ ηδξ οπενεηθναγυιεκδξ ILK ζηζξ ΜΣ, ιε ζδιακηζηυ ιένμξ ηδξ κα είκαζ ηοηηανμπθαζιαηζηυ, οπμδδθχκμκηαξ υηζ ημ εκ θυβς αιζκμλφ ζοκεζζθένεζ ζηδ ζοζζχνεοζδ ηδξ πνςηεΐκδξ ζηζξ ΜΣ αθθά δεκ είκαζ απαναίηδημ (Δηθ.15Α &Δηθ.15Β ) ηαζ (Δηθ.16-Γηαγ.8&9). 134

146 Δηθόλα 14: Τπνθπηηαξηθόο εληνπηζκόο ησλ ηξνπνπνηεκέλσλ κνξθώλ ηεο ILK ζην εκβξπτθό κπτθό θύηηαξν ηειηθνύ ζηαδίνπ αλάπηπμεο. (Α) Ζ ΗILK (GFP) εκημπίγεηαζ ζηζξ ΜΣ ηαζ ηζξ Ε-γχκεξ ζημ ειανοσηυ ιοσηυ ηφηηανμ αβνίμο ηφπμο ηαζ (Β) οπμηοηηανζηυξ εκημπζζιυξ ηδξ ILK F436A (GFP). Δηθόλα 15: πγθέληξσζε ησλ κεηαιιαγκέλσλ κνξθώλ ηεο ILK ζηηο ΜΣ, ππεξεθθξαδόκελεο ππό ηνλ έιεγρν ηνπ mef2gal4. (Α-Β) οπμηοηηανζηή ηαηακμιή ηςκ δζάθμνςκ ιμνθχκ ζημ ιοσηυ ηφηηανμ πνμκφιιθδξ 1 μο ζηαδίμο, (Α -Β ) οπμηοηηανζηυξ εκημπζζιυξ ηςκ δζάθμνςκ ιμνθχκ ζημ ιοσηυ ηφηηανμ πνμκφιιθδξ 2 μο ( ηα ζοκεπή αέθδ οπμδεζηκφμοκ ηζξ ΜΣ ηαζ ηα δζαηεημιιέκα ηζξ Ε- γχκεξ). 135

147 Δηθόλα 16: Γηαγξάκκαηα 8&9- Πνζνηηθνπνίεζε ηεο θαηαλνκήο ηεο έληαζεο θζνξηζκνύ (GFP) ζηηο ΜΣ ζπγθξηηηθά κε απηή ζην θπηηαξόπιαζκα. (Α) 1 μ πνμκοιθζηυ ζηάδζμ ηαζ (Β) 2 μ πνμκοιθζηυ ζηάδζμ. 136

148 H ιεηηνπξγία ηεο ILK δελ επεξεάδεηαη απφ ηε ζεκεηαθή κεηαιιαγή F436A Δηθόλα 17: Λεηηνπξγηθή αλάιπζε ηεο ILKF436A (GFP) ζηε δηακεζνιάβεζε ηνπ ζπλδέζκνπ κεηαμύ ηληεγθξηλώλ θαη θπηηαξνζθειεηνύ αθηίλεο (θόθθηλν ρξώκα). Ζ ηνμπμπμζδιέκδ ιμνθή ηδξ ILK πμο ηαηαζηεοάζαιε ηαζ οπενεηθνάζηδηε οπυ ημκ έθεβπμ ημο 24BGal4 δζέζςζε πθήνςξ ηα ιεηαθθάβιαηα ηδξ ilk ζε ακηίζημζπμ ααειυ ιε ηδκ αβνίμο ηφπμο ILK-GFP (Δηθ.17, Δηθ.18- Γηαγ.10). 137

149 Δηθόλα 18: Γηάγξακκα 10- Έιεγρνο ελήιηθεο βησζηκόηεηαο ζε κεηαιιάγκαηα γηα ilk κε ηαπηόρξνλε ηζην-εηδηθή έθθξαζε ησλ κεηαιιαγκέλσλ κνξθώλ ILK ππό ηνλ έιεγρν ηνπ 24ΒGal4. Οζ ιεηαθθαβιέκεξ ιμνθέξ ILK είκαζ ζε εέζδ κα οπμηαηαζηήζμοκ ηδκ εκδμβεκή ILK ζε ακηίζημζπμ ααειυ ιε ηδκ αβνίμο ηφπμο dilk-gfp Η ζεκεηαθή κεηαιιαγή F436A κεηψλεη ηε ζπλάθεηα ηεο πξσηεΐλεο κε ηελ parvin Όπςξ ακαθένεδηε ηαζ ζηδκ εκυηδηα 3.1.2, δ δζαιενζζιαημπμίδζδ ηδξ parvin ελανηάηαζ απυ ηδκ πανμοζία ηδξ ILK. Γζα ημ θυβμ αοηυ εεθήζαιε κα εθέβλμοιε ηδκ οπυεεζδ ακ δ ηνμπμπμπμζδιέκδ ιμνθή ηδξ ILK πμο θένεζ ηδ ζδιεζαηή ιεηάθθαλδ F436A ιπμνεί κα ζοβηεκηνχζεζ ηα ορδθά πμζά parvin ζηζξ ΜΣ ηςκ ιοσηχκ ηοηηάνςκ 3 μο πνμκοιθζημφ ζηαδίμο. Αλίγεζ κα ζδιεζςεεί υηζ, ζφιθςκα ιε απμηεθέζιαηα δμιζηήξ ακάθοζδξ ηςκ δομ πνςηεσκχκ, δ αθθδθεπίδναζδ ιεηαλφ ILK ηαζ parvin δζαιεζμθααείηαζ ιέζς αοηήξ ηδξ επζηνάηεζαξ (Fukuda, Gupta et al. 2009). Χζηυζμ απμηεθέζιαηα ζε ηοηηανζηά ιμκηέθα, έδεζλακ υηζ δ ιεηάθθαλδ δεκ επδνεάγεζ ηδ θοζζηή αθθδθεπίδναζδ ηςκ ILK ηαζ parvin, ηαεχξ ηα αολδιέκα επίπεδα ηδξ parvin δζαιενζζιαημπμζμφκηαζ ιε επζηοπία ζηζξ ΜΣ.(Zhang, Chen et al. 2002). Έηζζ ζηδ ζοκέπεζα δμηζιάζεδηε κα ζοκοπενεηθναζεεί δ parvin ιαγί ιε ηδ ιεηαθθαβιέκδ ILK (ILK-F436A), πνμηεζιέκμο κα δζαπζζηςεεί ακ εα ιεηααάθεζ ημ πνυηοπμ ηδξ οπμηοηηανζηήξ ηαηακμιήξ ηδξ parvin. Ζ ζοκοπενέηθναζδ ηδξ ILK- 138

150 F436A ιε ηδκ parvin, δεκ είπε ηάπμζα επίδναζδ ζηδ δζαιενζζιαημπμίδζδ ηδξ parvin, δ μπμία πανέιεζκε ζημ ηοηηανυπθαζια (Δηθ19Β). Δηθόλα 19: Σαπηόρξνλε ππεξ-έθθξαζε ILK-F436A θαη PARVIN-GFP ζε κπτθό θύηηαξν ηξίηνπ πξνλπκθηθνύ ζηαδίνπ, ππό ηνλ έιεγρν ηνπ mef2gal4 (Α) H ηαοηυπνμκδ οπεν-έηθναζδ ηδξ dilk ζοβηεκηνχκεζ ηδκ PARVIN-GFP ζηζξ ΜΣ ηαζ (Β) H PARVIN-GFP παναιέκεζ ηοηηανμπθαζιαηζηή ιε ηαοηυπνμκδ οπεν-έηθναζδ ηδξ ILK-F436A. ηζξ θςημβναθίεξ απεζημκίγμκηαζ ναπζαίμζ θμλμί ιφεξ. ΤΝΟΦΗ ΑΠΟΣΔΛΔΜΑΣΧΝ ΔΝΟΣΗΣΑ Η πηζαλή θσζθνξπιίσζε ζηηο ηζρπξά ζπληεξεκέλεο ζέζεηο S176 θαη T180 δελ είλαη απαξαίηεηε γηα ηνλ εληνπηζκφ ηεο ILK ζηηο ΜΣ θαη ηε ιεηηνπξγία ηεο ILK. Ο ππνθπηηαξηθφο εληνπηζκφο ηεο ILK θαη ε ιεηηνπξγία ηεο δελ επεξεάδνληαη απφ ηε ζεκεηαθή κεηαιιαγή F436Α ζε αληίζεζε κε πεηξάκαηα ζε θπηηαξηθά κνληέια. Η ζεκεηαθή κεηαιιαγή F436A απνδπλακψλεη ηελ ηθαλφηεηα αιιειεπίδξαζεο ηεο ILK κε ηελ parvin Λεζημονβζηή ακάθοζδ ηδξ ιειανακμδεζιεουιεκδξ ILK Ζ ILK είκαζ ηοηηανμπθαζιαηζηή πνςηεΐκδ πμο εκημπίγεηαζ ζηζξ ζκηεβηνζκζηέξ ζοκδέζεζξ ζηζξ ΜΣ ςξ απμηέθεζια ηδξ αθθδθεπίδναζδξ ιε ηδκ πνςηεΐκδ Wech, δ μπμία ιε ηδ ζεζνά ηδξ αθθδθεπζδνά ιε ηδκ talin, πμο ζοκδέεηαζ άιεζα ιε ηζξ ζκηεβηνίκεξ. Θεθήζαιε κα ελεηάζμοιε ηδκ οπυεεζδ ενβαζίαξ υηζ δ θεζημονβία ηδξ ILK ζπεηίγεηαζ άιεζα ιε ηδ βεζηκίαζδ ηδξ ιε ηδκ πθαζιαηζηή ιειανάκδ ηαζ δ υπμζα πζεακή θεζημονβία ηδξ ζημ ηοηηανυπθαζια δεκ έπεζ γςηζηή ζδιαζία. 139

151 Καηαζθεπή ησλ δηάθνξσλ δηαγνληδίσλ ηεο κεβξαλνζπδεπγκέλεο ILK Γζα ημ ζημπυ αοηυ ηαηαζηεοάζαιε ιζα ζεζνά απυ πζιαζνζηά δζαβμκίδζα ILK πμο έθενακ είηε ζημ άιζκμ- ή ζημ ηαναυλο-ηεθζηυ άηνμ ζζκζάθμ αβηονμαυθδζδξ ζηδκ πθαζιαηζηή ιειανάκδ. ηδ ζοκέπεζα, ηαηαζηεοάζαιε ηνεζξ πζιαζνζηέξ πνςηεΐκεξ πμο έθενακ δζαθμνεηζηά ζζκζάθα βζα ημκ εκημπζζιυ ημοξ ζηδκ πθαζιαηζηή ιειανάκδ, ηζξ: (α) ILK-GFP-CAAX, (α) GAP-ILK-GFP ηαζ (β) ILK-GFP-HRAS (Δηθ.20Α, Δηθ20Γ & Δηθ.20Γ). Σμ ιμηίαμ CAAX (DGKKKKKKSKTKCVIM) πνμένπεηαζ απυ ηδκ K-Ras πνςηεΐκδ (Cox, Pai et al. 1999). Ζ ζηαεενή ζφκδεζδ ιε ηδ ιειανάκδ επζηοβπάκεηαζ ιέζς ιζαξ ιεηα-ιεηαθναζηζηήξ ηνμπμπμίδζδξ (θανκεζοθίςζδ) ζηδκ ηοζηεΐκδ ημο ιμηίαμο. Ζ αιζκμλζηή αθθδθμοπία ημο ιεανακμδεζιεουιεκμο ζζκζάθμο βζα ηδ GAP-ILK-GFP πνμένπεηαζ απυ ηδκ πνςηεΐκδ GAP43 ηςκ εδθαζηζηχκ. Έπεζ δεζπεεί υηζ ηα 14 πνχηα αιζκμλέα (MLCCMRRTKQVEKNDEDQKI) ιπμνμφκ κα δνάζμοκ ςξ πεπηίδζμ μδδβδηήξ βζα ηδ ζηαεενή ζφκδεζδ ηδξ πνςηεΐκδξ ζηδκ πθαζιαηζηή ιειανάκδ ιέζς παθιοηζθίςζδξ ηςκ ηοζηεΐκχκ 3 ηαζ 4 (Moriyoshi, Richards et al. 1996). Ζ πζιαζνζηή πνςηεΐκδ ILK-GFP-HRAS έθενε ζημ ηαναμλοηεθζηυ άηνμ ηδξ πνάζζκδξ θεμνίγμοζαξ πνςηεΐκδξ ζημ ίδζμ ακμζπηυ πθαίζζμ ακάβκςζδξ ηα δεηαπέκηε (15) ηεθεοηαία αιζκμλέα ηδξ πνςηεΐκδξ H-Ras (HKLRKLNPPDESGPGCMSCKCVLSH), ηα μπμία ηαη ακαθμβία ιε ημ ιμηίαμ CAAX θανκεζοθζχκμκηαζ ζηδκ ηεθεοηαία ηοζηεΐκδ (Boulter, Grall et al. 2006). Χξ πνςηεΐκδ εθέβπμο βζα ηα πεζνάιαηα πμο πναβιαημπμζήζαιε ιε ηδ GAP- ILK-GFP πνδζζιμπμζήζαιε ηδ GAP-GFP (Δηθ.20Δ), ιζα πζιαζνζηή πνςηεΐκδ πμο θένεζ ημ ζζκζάθμ βζα ημκ εκημπζζιυ ηδξ πνάζζκδξ θεμνίγμοζαξ πνςηεΐκδξ ζηδκ πθαζιαηζηή ιειανάκδ (Moriyoshi, Richards et al. 1996). Δκχ βζα ηα πεζνάιαηα πμο πναβιαημπμζήζαιε ιε ημ δζαβμκίδζμ ILK-GFP-CAAX ηαηαζηεοάζαιε ηδκ πνςηεΐκδ εθέβπμο, ηδ GFP-CAAX (Δηθ.20Β). 140

152 Δηθόλα 20: ρεκαηηθή απεηθόληζε ησλ δηαγνληδίσλ πνπ ρξεζηκνπνηήζεθαλ γηα λα πξνζδεζεί κόληκα ε ILK ζηελ πιαζκαηηθή κεκβξάλε θαη νη αληίζηνηρεο πξσηεΐλεο-κάξηπξεο. (Α) ILK-GFP- CAAX,CAAX = DGKKKKKKSKTKCVIM, (B) GFP-CAAX, (Γ) ILK-GFP-HRAS, HRAS = HKLRKLNPPDESGPGCMSCKCVLS, (Γ) GAP-ILK-GFP, GAP = MLCCMRRTKQVEKNDEDQKI ηαζ (Δ) GAP-GFP, BL# Τπνθπηηαξηθφο εληνπηζκφο θαη αλάιπζε ηεο ιεηηνπξγηθφηεηαο ησλ δηαγνληδίσλ ηεο κεκβξαλνδεζκεπφκελεο ILK Ζ ILK-GFP-CAAX εκημπίζηδηε ζηζξ ΜΣ ηαζ ζηζξ γχκεξ Ε, αθθά πνμξ ιεβάθδ ιαξ έηπθδλδ, δεκ εκημπίζηδηε ζηδκ πθαζιαηζηή ιειανάκδ (Δηθ.21Β ) υπςξ ακαιεκυηακ ζε ακηίεεζδ ιε ηδκ πνςηεΐκδ εθέβπμο (Δηθ.21Γ ). Πζεακά, ηα εκδμβεκή ζζκζάθα εκημπζζιμφ ηδξ πνςηεΐκδξ δνμοκ ακηαβςκζζηζηά απέκακηζ ζημ CAAX ιμηίαμ ηαζ είκαζ πζμ ζζπονά, ειπμδίγμκηαξ ηδ πζιαζνζηή πνςηεΐκδ κα ζοκδεεεί ζηαεενά ζηδκ πθαζιαηζηή ιειανάκδ. Δπίζδξ, δ ζηενεμδμιή ηδξ πζιαζνζηήξ πνςηεΐκδξ ιπμνεί κα ειπμδίγεζ ηδ ζφκδεζδ ημο ιμηίαμο ζηδκ πθαζιαηζηή ιειανάκδ. Χζηυζμ, δεκ ιπμνεί κα απμηθεζζηεί δ πζεακυηδηα δ πζιαζνζηή πνςηεΐκδ ILK-GFP-CAAX, κα ηνμπμπμζείηαζ ηαζ κα ιδκ ηαείζηαηαζ δοκαηή δ θανκεζοθίςζδ ηδξ. 141

153 Δηθόλα 21: Τπνθπηηαξηθή θαηαλνκή ησλ κεκβξαλν-ζπδεπγκέλσλ κνξθώλ ηεο ΙLK θαη ησλ πξσηετλώλ ειέγρνπ ζην κπνβιάζηε θαη ην εκβξπτθό κπτθό θύηηαξν ηειηθνύ αλαπηπμηαθνύ ζηαδίνπ. (A-A ) ILK-GFP, (B-B ) ILK-GFP-CAAX, (Γ-Γ ) GFP-CAAX (Γ-Γ ) ILK-GFP-HRAS, (Δ-Δ ) GAP-ILK-GFP ηαζ (Σ) GAP-GFP, μζ ιομαθάζηεξ επζζδιαίκμκηαζ ιε ηίηνζκμ ηφηθμ ηαζ μζ ΜΣ ιε ηίηνζκμ μνεμβχκζμ πθαίζζμ). Ακηίεεηα, ηυζμ δ GAP-ILK-GFP υζμ ηαζ δ ILK-GFP-HRAS, εκημπίγμκηαζ ηυζμ ζηζξ ΜΣ υζμ ηαζ ζηδ πθεονζηή ιειανάκδ, εκχ ζημ ηοηηανυπθαζια ανίζημκηαζ ζε ιζηνυ πμζμζηυ υηακ οπενεηθναζημφκ ζηα ειανοσηά ιοσηά ηφηηανα 142

154 (Δηθ.21Γ &Δηθ.21Δ ). Δπίζδξ δεκ πνμηαθμφκ ηακέκα ηονίανπμ ανκδηζηυ απμηέθεζια υηακ οπενεηθναζημφκ ζε ιζα ζεζνά απυ ζζημφξ: ημ ιοσηυ ζφζηδια, ημ κεονζηυ ζφζηδια, ηδκ επζδενιίδα, ηθπ. Χζηυζμ ιζα πνμζεηηζηυηενδ παναηήνδζδ ηδξ οπμηοηηανζηήξ ηαηακμιήξ αοηχκ ηςκ δομ πζιαζνζηχκ πνςηεσκχκ ιαξ μδήβδζε κα επζθέλμοιε ηδ GAP-ILK-GFP βζα κα ζοκεπίζμοιε ζηα θεζημονβζηά πεζνάιαηα. Ζ GAP-ILK-GFP εκημπίγεηαζ ηονίςξ ζηζξ ΜΣ ηαζ ηδκ πθαζιαηζηή ιειανάκδ ζε ακηίεεζδ ιε ηδκ ILK-GFP-HRAS πμο ηονίςξ παναιέκεζ ηοηηανμπθαζιαηζηή (Δηθ.21). Δπίζδξ, παναηδνήζαιε ημ πνυηοπμ εκημπζζιμφ ηςκ δζαθυνςκ δζαβμκζδίςκ βζα ηδ ιειανακμδεζιεουιεκδ ιμνθή ηδξ ILK ζηα ανπζηά ζηάδζα ηδξ ιομβέκεζδξ ζημ έιανομ ηδξ Drosophila. Οζ GAP-ILK-GFP, ILK-GFP-HRAS ηαζ μζ πνςηεΐκεξ εθέβπμο ζοβηεκηνχκμκηαζ ηονίςξ ζηδκ πενζθένεζα ηςκ ιομαθαζηχκ (Δηθ.21Γ, Δηθ.21Γ & Δηθ.21Δ), εκχ δ αβνίμο ηφπμο πνςηεΐκδ ηαζ δ ILK-GFP-CAAX ηαηακέιμκηαζ ζε μιμζυιμνθα ζημ εζςηενζηυ ημο ηοηηάνμο (Δηθ.21Α, Δηθ.21Β). Πνμδβμφιεκδ ενβαζία απυ ημ ενβαζηήνζυ ιαξ, έδεζλε υηζ μζ ζκηεβηνίκεξ είκαζ απαναίηδηεξ βζα ημκ εκημπζζιυ ηδξ ILK ζηζξ ΜΣ ηαζ απμοζία ημοξ έπεζ ςξ απμηέθεζια ηδκ παναιμκή ηδξ ILK ζημ ηοηηανυπθαζια (Zervas, Psarra et al. 2011). Καηά ζοκέπεζα, απμοζία ηςκ ζκηεβηνζκχκ δ ILK παναιέκεζ ζημ ηοηηανυπθαζια. Χζηυζμ, ακ ημ ιμηίαμ βζα ηδ ζηαεενή ζφκδεζδ ηδξ ILK είκαζ θεζημονβζηυ, ηυηε δ πζιαζνζηή πνςηεΐκδ εα εκημπίγεηαζ ζηδκ πθαζιαηζηή ιειανάκδ αηυιδ ηαζ ακ μζ ζκηεβηνίκεξ απμοζζάγμοκ. Με ημκ ηνυπμ αοηυ, εθέβλαιε ακ ηα εκαθθαηηζηά ιμηίαα πμο πνδζζιμπμζήζαιε ζοκδέμοκ ζηαεενά ηδκ ILK ζηδκ πθαζιαηζηή ιειανάκδ. Παναηδνήζαιε ημκ εκημπζζιυ ηςκ δζαβμκζδίςκ πμο ηαηαζηεοάζαιε ζε ιοσηά ηφηηανα ιεηαθθαβιάηςκ ηςκ ζκηεβηνζκχκ (if B4 ). Ανπζηά επζαεααζχζμοιε υηζ ημ CAAX ιμηίαμ δεκ είκαζ ζηακυ κα δεζιεφζεζ ηδκ πζιαζνζηή ILK-GFP-CAAX ζηδκ πθαζιαηζηή ιειανάκδ ηαεχξ δ ILK-GFP- CAAX πανέιεκε ζημ ηοηηανυπθαζια απμοζία ζκηεβηνζκχκ. Δπίζδξ επζαεααζχζαιε υηζ ημ GAP ιμηίαμ είκαζ θεζημονβζηυ ηαζ δ GAP-ILK-GFP δεζιεφεηαζ πνάβιαηζ ζηαεενά ζηδκ πθαζιαηζηή ιειανάκδ ηαζ δεκ εκημπίγεηαζ απθά ημκηά ζηδκ πθαζιαηζηή ιειανάκδ υπςξ ζοιααίκεζ ιε ηδκ εκδμβεκή πνςηεΐκδ. Πνάβιαηζ ηυζμ δ GAP-ILK-GFP υζμ ηαζ μζ πνςηεΐκεξ εθέβπμο GAP-GFP ηαζ GFP-CAAX εκημπίγμκηαζ ζηδ ιειανάκδ απμοζία ζκηεβηνζκχκ (Δηθ.22Β,Δηθ.22Γ&Δηθ.22Δ) ζε ακηίεεζδ ιε ηζξ ILK-GFP ηαζ ILK-GFP-CAAX πμο παναιέκμοκ ηοηηανμπθαζιαηζηέξ (Δηθ.22Α&Δηθ.22Γ). 143

155 Δηθόλα 22: Τπνθπηηαξηθή θαηαλνκή ησλ δηαγνληδίσλ πνπ θαηαζθεπάζηεθαλ απνπζία ηληεγθξηλώλ (if B4 -/- κπτθά εκβξπτθά θύηηαξα). (A) δ ILK-GFP είκαζ ηοηηανμπθαζιαηζηή, (B) δ GAP-ILK-GFP παναιέκεζ ζηαεενά ζηδκ πθαζιαηζηή ιειανάκδ, (Γ) δ GAP-GFP είκαζ ιειανακζηή, (Γ) δ ILK-CAAX-GFP ιέκεζ ζημ ηοηηανυπθαζια ηαζ (Γ) δ GFP-CAAX εκημπίγεηαζ ζηδκ πθαζιαηζηή ιειανάκδ. Δπζπθέμκ, δ GAP-ILK-GFP οπμηαεζζηά πθήνςξ ηδκ εκδμβεκή πνςηεΐκδ ζε υθδ ηδκ ακάπηολδ ηδξ ιφβαξ, υπςξ έδεζλακ πεζνάιαηα εθέβπμο ζοιπθδνςιαηζηυηδηαξ ηαηά ημ ειανοσηυ ζηάδζμ ακάπηολδξ δζαζχγμκηαξ ηδκ απμηυθθδζδ ηςκ ζκζδίςκ αηηίκδξ Η κεκβξαλνδεζκεπκέλε ILK είλαη ηθαλή λα ζπγθεληξψζεη κφξηα ηνπ ζπλδενζψκαηνο ζηηο ΜΣ απνπζία ηληεγθξηλψλ Ζ GAP-ILK-GFP είκαζ ζε εέζδ κα ζοζζςνεφεζ ηζξ parvin ηαζ PINCH ζηζξ ΜΣ, υηακ οπενεηθναζηεί ζε ειανοσηά ιοσηά ηφηηανα αβνίμο ηφπμο (Δηθ.23Α &Δηθ.23Β ). Πζμ ζοβηεηνζιέκα, δ πζιαζνζηή πνςηεΐκδ ηδξ ILK ειθακίγεζ ιεβαθφηενδ ζοκάθεζα ςξ πνμξ ηδκ αθθδθεπίδναζή ηδξ ιε ηδ parvin ηαεχξ ηδ ζοβηεκηνχκεζ ηυζμ ζηζξ ΜΣ πμο είκαζ δ εέζδ εκημπζζιμφ ηδξ πνςηεΐκδξ αβνίμο ηφπμο, αθθά ηαζ ζηδκ πθεονζηή ιειανάκδ, (Δηθ.23 &Δηθ.23Α ) ζε ακηίεεζδ ιε ηζξ PINCH ηαζ talin (Δηθ.23Β & Δηθ.23Β ). Γδθαδή δ φπανλδ ηδξ ILK ζηαεενά ζογεοβιέκδξ ζηδκ πθαζιαηζηή ιειανάκδ ηςκ ειανοσηχκ ιοσηχκ ηοηηάνςκ είκαζ ανηεηή ηαζ ζηακή βζα κα ηαεμνίζεζ ηζξ εέζεζξ εκημπζζιμφ ηδξ parvin ζηα ειανοσηά ιοσηά ηφηηανα. 144

156 Δηθόλα 23: Η GAP-ILK-GFP εληνπίδεηαη ζηελ πιαζκαηηθή κεκβξάλε θαη ε ύπαξμε ηεο ζηελ πιεπξηθή κεκβξάλε είλαη ηθαλή λα ζπγθεληξώζεη ηε parvin ζε έθηνπεο ζέζεηο εληνπηζκνύ. (Α- Β ) ειανοσημί ιφεξ αβνίμο ηφπμο ζη. 17, (Α, Β ) οπμηοηηανζηή ηαηακμιή ηδξ GAP-IlK-GFP (GFP), (A ) οπμηοηηανζηυξ εκημπζζιυξ ηδξ Parvin (anti-parvin), δ πνςηεΐκδ εκημπίγεηαζ ηυζμ ζηζξ ΜΣ υζμ ηαζ ζε έηημπεξ εέζεζξ ζηδκ πθεονζηή ιειανάκδ, υπμο ζοκεκημπίγεηαζ ιε ηδ GAP-ILK-GFP, ηαζ (Β ) οπμηοηηανζηυξ εκημπζζιυξ ηδξ PINCH (anti-pinch), δ πνςηεΐκδ εκημπίγεηαζ ιυκμ ζηζξ ΜΣ αθθά υπζ ζηζξ έηημπεξ εέζεζξ ζηδκ πθεονζηή ιειανάκδ. Δπζπθέμκ, βκςνίγμκηαξ απυ πνμδβμφιεκα πεζνάιαηα υηζ δ GAP-ILK-GFP εκημπίγεηαζ ηακμκζηά ζηδκ πθαζιαηζηή ιειανάκδ ηςκ ειανοσηχκ ιοσηχκ ηοηηάνςκ (Δηθ.21Δ ), εθέβλαιε ακ απμοζία ηςκ ζκηεβηνζκχκ, αοηή ηδ θμνά ζε μιμγοβχηεξ βζα ημ άιμνθμ αθθδθυιμνθμ ηδξ aps2 οπμιμκάδαξ (if B4 ), δ GAP-ILK-GFP είκαζ ζε εέζδ κα ζοβηεκηνχζεζ ηυζμ ηα άθθα δομ ιέθδ ημο IPP ζοιπθυημο ζηζξ ΜΣ, ακελάνηδηα απυ ηδκ εηδήθςζδ ηδξ απμηυθθδζδξ ηςκ ιοσηχκ ηοηηάνςκ απυ ημ ελςηοηηάνζμ οθζηυ υζμ ηαζ ηδκ talin. Πνμδβμφιεκεξ ιεθέηεξ ζηδ Drosophila έπμοκ δείλεζ υηζ δ talin είκαζ απαναίηδηδ βζα ημκ εκημπζζιυ ηδξ ILK ζηζξ ΜΣ (Zervas, Psarra et al. 2011) αθθά απαζηεί ηδκ πανμοζία ηςκ ζκηεβηνζκχκ βζα κα εκημπζζηεί ζςζηά δ ίδζα ζηζξ ΜΣ. Οπυηε μ εκημπζζιυξ ηδξ ζηζξ ΜΣ είκαζ ακελάνηδημξ απυ ηδκ ημπμεέηδζδ ηδξ ILK ζηζξ ΜΣ. 145

157 Σα πεζνάιαηά ιαξ απέδεζλακ υηζ δ πανμοζία ηδξ ILK ζηδ ιειανάκδ είκαζ ανηεηή χζηε κα πνμζεθηφζεζ ηζξ άθθεξ δομ πνςηεΐκεξ ημο ηνζιενμφξ ζοιπθυημο parvin (Δηθ.24Α &Δηθ.24Β ) ηαζ PINCH (Δηθ.24Α &Δηθ.24Β ). Δζηυκα 24: Η GAP-ILK-GFP ζπγθεληξώλεη ηε parvin ζηηο ΜΣ, απνπζία ηληεγθξηλώλ. (Α-Α ) ειανοσηυ ιοσηυ ηφηηανμ αβνίμο ηφπμο, (Β-Β ) ειανοσηυ ιοσηυ ηφηηανμ μιμγοβχηδ βζα if B4 -/-.(A,B ) GAP-ILK-GFP εκημπίγεηαζ ζηζξ ΜΣ (GFP), (Α,Β ) δ parvin εκημπίγεηαζ ζηζξ ΜΣ (anti-parvin) αθθά ηαζ ζε έηημπεξ εέζεζξ εκημπζζιμφ ζηδκ πθεονζηή πθαζιαηζηή ιειανάκδ, υπμο ζοκεκημπίγεηαζ ιε ηδ GAP-IlK-GFP. Δπίζδξ πνμξ έηπθδλδ ιαξ παναηδνήζαιε υηζ δ ζηαεενή δέζιεοζδ ηδξ ILK ζηδ ιειανάκδ είκαζ ζε εέζδ κα ζοβηεκηνχζεζ ηαζ ηδκ talin απμοζία ηςκ ζκηεβηνζκχκ (Δηθ.25Α &Δηθ.25Β ). Αοηυ είκαζ εκδζαθένμκ βζαηί μζ ιέπνζ ηχνα βεκεηζηέξ ιεθέηεξ έπμοκ δείλεζ υηζ δ talin εκημπίγεηαζ ζηζξ ΜΣ ακελάνηδηα απυ ηδκ ILK, εκχ βζα ημκ εκημπζζιυ ηδξ απαζημφκηαζ μζ ζκηεβηνίκεξ. Δηθόλα 25: Η κόληκα δεζκεπκέλε ζηελ πιαζκαηηθή κεκβξάλε GAP-ILK-GFP ζηξαηνινγεί ζηηο ΜΣ ζπζηαηηθά ηνπ ζπλδενζώκαηνο απνπζία ησλ ηληεγθξηλώλ. (Α-Α ) ειανοσηυ ιοσηυ ηφηηανμ αβνίμο ηφπμο, (Β-Β ) ειανοσηυ ιοσηυ ηφηηανμ μιμγοβχηδ βζα if B4 -/-.(A,B ) GAP-ILK-GFP εκημπίγεηαζ ζηζξ ΜΣ (GFP), (Α,Β ) δ PINCH ανίζηεηαζ ζηζξ ΜΣ (anti-pinch) ηαζ (Α,Β ) δ Talin εκημπίγεηαζ ζηζξ ΜΣ (anti-talin) Η κεκβξαλνδεζκεπκέλε ILK δελ ππνθαζηζηά ηηο ηληεγθξίλεο ζηε δηακεζνιάβεζε ηεο ζχλδεζεο ηνπ θπηηαξνζθειεηνχ αθηίλεο θαη ηεο πιαζκαηηθήο κεκβξάλεο 146

158 ηδ ζοκέπεζα εεθήζαιε κα εθέβλμοιε ηδκ οπυεεζδ ακ δ ζηαεενά δεζιεοιέκδ ζηδκ πθαζιαηζηή ιειανάκδ ILK είκαζ ζηακή κα δζαηδνήζεζ ακέπαθδ ηδ ζφκδεζδ ημο ηοηηανμζηεθεημφ αηηίκδξ ιε ηδκ πθαζιαηζηή ιειανάκδ. Γζα ημ θυβμ αοηυ πνδζζιμπμζήζαιε ιεηαθθάβιαηα βζα αps2 (if SEF -/- ) (Bloor and Brown 1998), ιζα ιεηάθθαλδ πμο ειθακίγεζ πζμ ήπζμ θαζκυηοπμ απυ ηδκ άιμνθδ ηαηάζηαζδ απμοζίαξ ηςκ ζκηεβηνζκχκ, ηαεχξ μζ μιμγοβχηεξ πανμοζζάγμοκ θαζκυηοπμ αηηίκδξ παναπθήζζμ αοημφ ηδξ ilk (Zervas, Gregory et al. 2001) ηαζ υπζ ηδκ απμηυθθδζδ ηδξ πθαζιαηζηήξ ιειανάκδξ απυ ημ ελςηοηηάνζμ οθζηυ, παναηηδνζζηζηυξ θαζκυηοπμξ ηςκ ιεηαθθαβιάηςκ βζα ζκηεβηνίκεξ (if B4 ) (Brown 1994). ε αοηυ ημ βεκεηζηυ οπυααενμ δ GAP-ILK-GFP εκημπίγεηαζ ηακμκζηά ζηδ ιειανάκδ ημο ιοσημφ ηοηηάνμο ημο μιμγοβχηδ βζα if (Δηθ.26Γ ). Χζηυζμ δ πανμοζία ηδξ ILK ζηδ ιειανάκδ δεκ είκαζ ζηακή κα δζαζχζεζ ηδκ ειθάκζζδ ημο θαζκμηφπμο, δδθαδή ηδκ απμηυθθδζδ ηςκ ζκζδίςκ αηηίκδξ απυ ηδκ πθαζιαηζηή ιειανάκδ (Δηθ.26Γ ). Δηθόλα 26: Η κόληκα δεζκεπκέλε ζηελ πιαζκαηηθή κεκβξάλε ILK δελ είλαη ηθαλή λα δηαζώζεη ηελ απνθόιιεζε ησλ ηληδίσλ αθηίλεο απνπζία ηληεγθξηλώλ. (Α-Α ) ειανοσηυ ιοσηυ ηφηηανμ αβνίμο ηφπμο (Zervas, Gregory et al. 2001), (Β-Β ) ειανοσηυ ιοσηυ ηφηηανμ μιμγοβχηδ βζα ilk 1 (Zervas, Gregory et al. 2001), (Γ-Γ ) ειανοσηυ ιοσηυ ηφηηανμ ιεηαθθάβιαημξ βζα if SEF, (Α, Β ) πθαζιαηζηή ιειανάκδ ζδιαζιέκδ ιε src-gfp(kaltschmidt, Davidson et al. 2000), (Γ ) GAP-ILK-GFP ηαζ (Α, Β, Γ ) ζκίδζα αηηίκαξ ζδιαζιέκα ιε πνχζδ νμδαιίκδξ-θαθθμσδίκδξ. 147

159 ΤΝΟΦΗ ΑΠΟΣΔΛΔΜΑΣΧΝ ΔΝΟΣΗΣΑ Σν CAAX κνηίβν δελ είλαη ιεηηνπξγηθφ φηαλ βξίζθεηαη ζπδεπγκέλν κε ηελ ILK- GFP αιιά κπνξεί λα ζπλδέζεη ζηαζεξά ζηελ πιαζκαηηθή κεκβξάλε ηελ πξάζηλε θζνξίδνπζα πξσηεΐλε (GFP). Οη GAP-ILK-GFP θαη ILK-GFP-HRAS εληνπίδνληαη κε επηηπρία ζηαζεξά ζηελ πιαζκαηηθή κεκβξάλε ησλ εκβξπτθψλ κπτθψλ θπηηάξσλ. Οη GAP-ILK-GFP θαη ILK-GFP-HRAS ππνθαζηζηνχλ πιήξσο ηελ ελδνγελή ILK ζε φια ηα αλαπηπμηαθά ζηάδηα ηεο δσήο ηεο κχγαο. Η GAP-ILK-GFP ζπγθεληξψλεη ζηηο ΜΣ ηα άιια δπν κέιε ηνπ IPP ζπκπιφθνπ αιιά θαη ηελ talin ζηηο ΜΣ εκβξχσλ ηειηθνχ ζηαδίνπ ηφζν αγξίνπ ηχπνπ φζν θαη νκνδπγψησλ γηα aps2. Η GAP-ILK-GFP δελ είλαη ζε ζέζε λα ππνθαηαζηήζεη ηηο ηληεγθξίλεο ζην ζχλδεζκν ηνπ θπηηαξνζθειεηνχ αθηίλεο κε ηελ πιαζκαηηθή κεκβξάλε. 148

160 3.2 Νένη ιεηηνπξγηθνί ξόινη ηεο ILK θαηά ηε δηάξθεηα ηεο αλάπηπμεο Λεζημονβζημί νυθμζ ηδξ ΗLK ζε άθθμοξ ζζημφξ εηηυξ ημο ιοσημφ ζζημφ ημ πθαίζζμ ηδξ δζδαηημνζηήξ ιμο δζαηνζαήξ αζπμθήεδηα ιε ηδ δζενεφκδζδ πζεακχκ κέςκ νυθςκ ηδξ ILK, εηηυξ ηδξ ηαθά ιεθεηδιέκδξ θεζημονβίαξ ηδξ ζημ ειανοσηυ ιοσηυ ζφζηδια. Μεθεηήζαιε ηδκ ILK ζε πμζηίθα ακαπηολζαηά ζηάδζα, ζζημφξ ηαζ θεζημονβίεξ. Γζα ημ θυβμ αοηυ πνδζζιμπμζήζαιε ημ ζφζηδια UAS/GAL4 ηαζ ημ δζαβμκζδζαηυ ζηέθεπμξ UAS:IRILK. Απμζζςπχκηαξ ζζημεζδζηά ηδκ ILK, ιπμνμφιε κα λεπενάζμοιε ηδ εκδζζιυηδηα ηςκ μιμγοβςηχκ ηαηά ημ ειανοσηυ ζηάδζμ ηαζ κα εθέβλμοιε ηδ δνάζδ ηδξ ILK ζε ιεηαβεκέζηενα ακαπηολζαηά ζηάδζα ηδξ ιφβαξ. Σα παναβυιεκα shrna εκακηίμκ ημο αββεθζμθυνμο RNA (mrna) ηδξ ilk μδδβμφκ ζε ζηακμπμζδηζηά επίπεδα απμζζχπδζδξ ημο βμκζδίμο, υπςξ δείπκμοκ πεζνάιαηα εθέβπμο ηδξ απμηεθεζιαηζηυηδηαξ ημο ζοζηήιαημξ απμζζχπδζδξ, ζημ ιοσηυ ζφζηδια (Δηθ.27). Ζ απμζζχπδζδ ηδξ ILK οπυ ημκ έθεβπμ ημο mef2gal4 μδδβεί ζε εάκαημ ηαηά ημ 1 μ πνμκοιθζηυ ζηάδζμ ηαζ απμηυθθδζδ ηςκ ζκζδίςκ αηηίκδξ. Σα παναπάκς απμηεθέζιαηα επζαεααζχκμοκ ηδκ ανπή θεζημονβίαξ ημο ζοζηήιαημξ πμο πνδζζιμπμζήζαιε χζηε κα απμηαθφρμοιε κέμοξ ζζημφξ ζημοξ μπμίμοξ είκαζ απαναίηδηδ δ θεζημονβία ηδξ ILK. Δηθόλα 27: Απνζηώπεζε ηεο ILK ππό ηνλ έιεγρν ηνπ mef2gal4. Σμ ζφζηδια απμζζχπδζδξ GAL4/UAS:IR ζημ ιοσηυ ζφζηδια μδδβεί ζηδκ απμηυθθδζδ ηδξ ιειανάκδξ απυ ημ ελςηοηηάνζμ οθζηυ (ηίηνζκδ ηεθαθή αέθμοξ) υπςξ ζοιααίκεζ ηαζ ζημοξ μιμγοβχηεξ βζα ilk ηαηά ημ ειανοσηυ ζηάδζμ. Σμ βεβμκυξ υηζ δ εκδζζιυηδηα επένπεηαζ ζημ αιέζςξ ιεηαβεκέζηενμ ακαπηολζαηυ ζηάδζμ ζε αοηυ ημ ζφζηδια ζε ζπέζδ ιε αοηυ ηςκ μιμγοβςηχκ βζα ilk 149

161 ιπμνεί κα απμδμεεί ζημ υηζ ηαηά ηδ πνήζδ ημο UAS:IR/Gal4 ζοζηήιαημξ, επζηοβπάκμοιε δναζηζηή ιείςζδ ηςκ επζπέδςκ ηδξ πνςηεΐκδξ ηαζ υπζ πθήνδξ ελάθεζρή αθθά ηαζ ζημ βεβμκυξ υηζ δ απμζζχπδζδ ημο mrna ημο βμκζδίμο λεηζκά ηαηά ηδκ έκανλδ ηδξ έηθναζδξ ημο Gal4 ηαζ υπζ απυ ημ ζπδιαηζζιυ ημο ειανφμο. Με άθθα θυβζα ημ UAS:IR/Gal4 ζφζηδια επζηοβπάκεζ ιζα οπυιμνθδ (hypomorphic) ηαηάζηαζδ απμοζίαξ ημο εκ θυβς βμκζδίμο ζε ακηίεεζδ ιε ημοξ μιμγοβχηεξ βζα ημ βμκίδζμ πμο πνυηεζηαζ βζα άιμνθδ ζοκεήηδ. Με απμηέθεζια, μζ θαζκυηοπμζ μζ μπμίμζ παναηδνμφκηαζ κα έπμοκ ιζηνυηενδ δζεζζδοηζηυηδηα (penetrance) ηαζ εηθναζηζηυηδηα (expressivity). ηδ ζοκέπεζα, πνδζζιμπμζήζαιε ιζα ζεζνά απυ Gal4 ζηεθέπδ ηαζ παναημθμοεήζαιε ακ ηαζ ζε πμζμ ζηάδζμ ηδξ ακάπηολδξ ηδξ Drosophila παναηδνείηαζ εάκαημξ ή ηάπμζμ άθθμ ιμνθμθμβζηυ εθάηηςια (π.π. θμφζηεξ ζηα θηενά ηςκ εκήθζηςκ αηυιςκ). Οζ πθδνμθμνίεξ βζα ημοξ ζζημφξ έηθναζδξ ημο ηάεε Gal4 πνμήθεακ απυ ηδ αάζδ δεδμιέκςκ ημο Bloomington Drosophila Stock Center ημο Πακεπζζηδιίμο ηδξ Ηκηζάκα ( ηαζ δδιμζζεοιέκεξ ιεθέηεξ. Χζηυζμ, πανάθθδθα ιε αοηέξ ηζξ πθδνμθμνίεξ, εθέβλαιε βζα ανηεημφξ απυ αοημφξ ημοξ Gal4s ιε πενζζζυηενδ θεπημιένεζα ημ πνυηοπμ έηθναζήξ ημοξ, εηθνάγμκηαξ οπυ ημκ έθεβπυ ημοξ ιζα πζιαζνζηή πνςηεΐκδ ζογεοβιέκδ ιε ηδκ πνάζζκδ θεμνίγμοζα πνςηεΐκδ. Ζ δζηή ιαξ ιεθέηδ απμηάθορε υηζ πμθθμί απυ ημοξ Gal4s, παναηηδνζζιέκμζ υηζ εηθνάγμκηαζ ζε ζζημφξ εκδμδενιζηήξ ή ελςδενιζηήξ πνμέθεοζδξ, εηθνάγμκηαζ ηαζ ζημ ιοσηυ ζφζηδια (π.π. stripegal4, patchedgal4) (Δηθ.29-Δηθ.31). ε αοηέξ ηζξ πενζπηχζεζξ δε ιπμνμφιε κα απμηθείζμοιε ημ βεβμκυξ υηζ δ εκδζζιυηδηα δεκ μθεζθυηακ ζηδκ απμζζχπδζδ ηδξ ilk ζηα ιοσηά ηφηηανα πμο εηθνάγεηαζ μ Gal4. 150

162 ΠΡΟΣΤΠΟ ΔΚΦΡΑΗ GAL4s ΜΔ ΓΙΑΦΤΓΟΤΑ ΔΚΦΡΑΗ ΣΟ ΜΤ Δηθόλα 28: Πξόηππν έθθξαζεο ηνπ 24ΒGal4 ζην έκβξπν. (A) έηθναζδ ζηα βθμζαηά ηφηηανα ηδξ κςημπμνδήξ (ηυηηζκδ ηεθαθή αέθμοξ), (Β) έηθναζδ ζημοξ ζζεθμβυκμοξ αδέκεξ (ηίηνζκδ ηεθαθή αέθμοξ). Δηθόλα 29: Πξόηππν έθθξαζεο ηνπ srgal4 ζην έκβξπν. (Α) έηθναζδ ζημ ειανοσηυ ΚΝ (θεοηή έθθεζρδ) ηαζ (Β) έηθναζδ ζημ ιο ( ηυηηζκμ πθαίζζμ) ηαζ ζημοξ ζζεθμβυκμοξ αδέκεξ (ηίηνζκδ ηεθαθή αέθμοξ). 151

163 Δηθόλα 30: Πξόηππν έθθξαζεο ηνπ 48ΥGal4 ζην έκβξπν θαη ην 1 ν πξνλπκθηθό ζηάδην. (Α) έηθναζδ ζε θςνίδεξ επζδενιζηχκ ηοηηάνςκ (ηεθαθή ηυηηζκμο αέθμοξ), (Β) έηθναζδ ζε ηφηηανα ζημ έκηενμ (ηυηηζκα αέθδ), (Γ, Ζ) ζζεθμβυκμζ αδέκεξ ( ηίηνζκδ ηεθαθή αέθμοξ), (Γ) ΚΝ, (Δ-Ε) ιοξ. Δηθόλα 31: Πξόηππν έθθξαζεο ηνπ ptcgal4 ζην έκβξπν. Έηθναζδ ζημ ιο (ηυηηζκμ αέθμξ) ηαζ ζημ ζζεθμβυκμ αδέκα (ηυηηζκδ ηεθαθή αέθμοξ). Δηθόλα 32: Πξόηππν έθθξαζεο ηνπ 69ΒGal4 ζην έκβξπν θαη ην 1 ν πξνλπκθηθό ζηάδην. Έηθναζδ ζημοξ ζζεθμβυκμοξ αδέκεξ (ηυηηζκμ αέθμξ) ηαζ ζημ ΚΝ (ηίηνζκδ ηεθαθή αέθμοξ). 152

164 Δζηυκα 33: Πξόηππν έθθξαζεο ηνπ elavgal4 ζην έκβξπν θαηά ην 1 ν πξνλπκθηθό ζηάδην. (Α) Έηθναζδ ζημ ΚΝ (ηίηνζκδ ηεθαθή αέθμοξ), ηαζ ζημοξ ζζεθμβυκμοξ αδέκεξ (ηυηηζκμ αέθμξ), (Α ) κεφνα. Δηθόλα 34: Πξόηππν έθθξαζεο ηνπ simgal4 ζην έκβξπν. (Α) έηθναζδ ζημοξ ζζεθμβυκμοξ αδέκεξ (ηίηνζκδ ηεθαθή αέθμοξ) ηαζ (Β) ζημ ειανοσηυ ΚΝ (θεοηυ πθαίζζμ). Δηθόλα 35: Πξόηππν έθθξαζεο ηνπ armgal4 ζην έκβξπν. Οιμζυιμνθδ έηθναζδ. ημκ Πζκ.1 παναηίεεκηαζ ζοβηεκηνςηζηά ηα Gal4 ζηεθέπδ πμο πνδζζιμπμζήεδηακ, ημ πνυηοπμ έηθναζδξ ημοξ ηαζ μζ θαζκυηοπμζ πμο 153

165 παναηδνήεδηακ. Σμοξ δζαπςνίγμοιε ζε ηέζζενζξ ηαηδβμνίεξ: ζε αοημφξ πμο εηθνάγμκηαζ ζημ ιοσηυ ζφζηδια, ζε αοημφξ πμο εηθνάγμκηαζ ζημ κεονζηυ ζφζηδια, αοημφξ πμο έπμοκ έηθναζδ ζηδκ ςμεήηδ ηαζ δ ηεθεοηαία ηαηδβμνία πενζέπεζ αοημφξ πμο δεκ ειπίπημοκ ζε ηαιζά απυ ηζξ πνμδβμφιεκεξ. Σα απμηεθέζιαηά ιαξ θακενχκμοκ, υηζ δ ILK έπεζ ηάπμζα πζεακή θεζημονβία ζημ κεονζηυ ζφζηδια βεβμκυξ πμο ζοκάδεζ ιε απμηεθέζιαηα πνυζθαηςκ ενβαζζχκ (Colognato and Tzvetanova 2011) ηαζ αλίγεζ κα ιεθεηδεεί πεναζηένς. Ζ απμζζχπδζδ ηδξ ilk ηυζμ οπυ ημκ έθεβπμ ημο elavgal4 υζμ ηαζ ημο slitgal4 μδήβδζε ζε εάκαημ ηςκ εκήθζηςκ αηυιςκ θίβμ ιεηά ηδκ εηηυθαρή ημοξ. Ζ πεζναιαηζηή αοηή πνμζέββζζδ μδήβδζε ζηδκ απμηάθορδ ιζαξ ζεζνάξ ζζηχκ ηαζ ζηαδίςκ υπμο δ ILK είκαζ απαναίηδηδ, π.π. ημ κεονζηυ, επζδενιίδα, ημοξ ζζεθμβυκμοξ αδέκεξ, ηδκ ςμεήηδ. 154

166 Πίλαθαο 1: Πξόηππν έθθξαζεο πνπ ρξεζηκνπνηήζεθαλ θαηά ηελ απνζηώπεζε ηεο ilk θαη νη θαηλόηππνη πνπ παξαηεξήζεθαλ # BL Gal4 Πξόηππν έθθξαζεο L/V αλαπηπμηαθό ζηάδην ζαλάηνπ mef2gal4 ιοξ, ναπζαίμ αββείμ L 1 o -2 o πνμκοιθζηυ 24BGal4 ιοξ, ναπζαίμ αββείμ, ζζεθμβυκμζ αδέκεξ, βθμζαηά ηφηηανα κςημπμνδήξ L 1 μ -2 μ πνμκοιθζηυ srgal4 ηεκυκηζα ηφηηανα, ΜΣ, επζδενιίδα L 1 μ -2 μ πνμκοιθζηυ DJ667Gal4 εκήθζημζ ιφεξ L ηονίςξ κοιθζηυ DJ757Gal4 εκήθζημζ ιφεξ L ηονίςξ κοιθζηυ AGal4 ειανοσημί επζιήηεζξ ιοξ, ηάπμζα ηφηηανα ημο εκηένμο V 8176 DJ694Gal4 εκήθζημζ ιφεξ, δ έκηαζδ ηδξ έηθναζδξ αολάκεηαζ ιε ηδκ δθζηία V εονεία θςνίδα επζδενιίδαξ ζημ ηέκηνμ ηάεε ιεηαιενμφξ ηαηά ημκ πνμζεζμ-μπίζεζμ άλμκα, ακαπηολζαηυξ δίζημξ θηενμφ, εονεία θςνίδα επζδενιίδαξ ζημ ηέκηνμ ηάεε L ptcgal4 ιεηαιενμφξ ηαηά ημκ πνμζεζμ-μπίζεζμ άλμκα, μιάδα ιοχκ κοιθζηυ YGal4 εκδυδενια, ειανοσηυ ΚΝ, μιάδα ιοχκ, ζζεθμβυκμζ αδέκεξ, έκηενμ L 1 μ -2 μ πνμκοιθζηυ elavgal4 κεονζηυ ζφζηδια L ιεηά ηδκ εηηυθαρδ L κοιθζηυ/ιεηά 9580 sligal4 βθμζαηά ηφηηανα ημζθζαηήξ κςημπμνδήξ, MP1κεονχκεξ ηδκ εηηυθαρδ εονεία θςνίδα επζδενιίδαξ ζημ ηέκηνμ ηάεε ιεηαιενμφξ ηαηά ημκ πνμζεζμ-μπίζεζμ L engal4 άλμκα, ακαπηολζαηυξ δίζημξ θηενμφ, μιάδεξ κεονχκςκ ζε υθα ηα ζηάδζα 155

167 BGal4 δαηηοθζμεζδήξ αδέκαξ, εβηέθαθμξ, ειανοσηή επζδενιίδα, ακαπηολζαημί δίζημζ, υνπεζξ L κοιθζηυ 9150 simgal4 ζζεθμβυκμζ αδέκεξ, ειανοσηυ ηεκηνζηυ κεονζηυ ζφζηδια V 7415 repogal4 Γθμία V Cy2Gal4 ακαπηολζαημί δίζημζ θηενμφ, εοθαηχδεξ επζεήθζμ ςμβμκίμο L κοιθζηυ/ιεηά ηδκ εηηυθαρδ 55BGal4 ζζεθμβυκμζ αδέκεξ, εοθαηχδεξ επζεήθζμ ςμβυκζμο V 198YGal4 εοθαηζμηφηηανα πμο εδνάγμκηαζ πάκς απυ ημ ςάνζμ, ζοκμνζαηά ηφηηανα L Νοιθζηυ/πνμηφπημοκ εκήθζηα άημια c355gal4 μιμζυιμνθδ έηθναζδ, εοθαηζμηφηηανα πμο εδνάγμκηαζ πάκς απυ ημ ςάνζμ, ιοξ L Νοιθζηυ/πνμηφπημοκ εκήθζηα άημια εοθαηζμηφηηανα πάκς απυ ημ ςάνζμ, ζηάδζμ 8-14, έκημκδ έηθναζδ, ζζεθμβυκμζ L Νοιθζηυ/πνμηφπημοκ c204gal4 αδέκεξ εκήθζηα άημια 7098 drmgal4 ιέζμ έκηενμ, ιαθπζββζακά ζςθδκάνζα, πνυζεζμ, μπίζεζμ έκηενμ V 1560 armgal4 Οιμζυιμνθδ έηθναζδ ζε υθμ ημ έιανομ L 1 μ -2 μ πνμκοιθζηυ Gal4 ειανοσηυξ θειθαδέκαξ, πνυζεζμ ναπζαίμ αββείμ V 7011 Cg-GAL4 Αζιμηφηηανα V V 7031 GII5Gal4 ειανοσηά πενζηναπεζαηά ηαζ πενζηανδζαηά ηφηηανα Οδδβμί εηθναγυιεκμζ ζημ ιο Οδδβμί εηθναγυιεκμζ ζημ κεονζηυ ζφζηδια L: εκδζζβυκμ V: ιδ εκδζζβυκμ Οδδβμί εηθναγυιεκμζ ζηδκ ςμεήηδ Άθθμζ 156

168 ηδ ζοκέπεζα πνμζπαεήζαιε κα δζενεοκήζμοιε πεναζηένς ζε πμζμοξ ζζημφξ είκαζ απαναίηδηδ δ ILK, ζοκδοάγμκηαξ ηζξ πθδνμθμνίεξ πμο απμηηήζαιε απυ ηα πεζνάιαηα ζζημεζδζηήξ απμζζχπδζδξ ηδξ ILK. Γζα ημ θυβμ αοηυ πναβιαημπμζήζαιε ημ ακηίζηνμθμ πείναια. Πνμζπαεήζαιε κα δζαζχζμοιε ημ θαζκυηοπμ ηδξ εκδζζιυηδηαξ ηςκ μιμγοβςηχκ βζα ilk ιε ζοκδοαζηζηή έηθναζδ ημο δζαβμκζδίμο ηδξ ILK οπυ ημκ έθεβπμ ηςκ Gal4s (i) 48Τ ηαζ mef2 (ιοσηυ ζφζηδια) ηαζ (ii) stripe ηαζ mef2 ακηίζημζπα. Χζηυζμ δ ζοκδοαζηζηή έηθναζδ ηδξ ilk οπυ ημκ έθεβπμ αοηχκ ηςκ Gal4s δεκ μδήβδζε ζηδ δζάζςζδ ηδξ εκδζζιυηδηαξ, βεβμκυξ πμο οπμδδθχκεζ υηζ δ ILK είκαζ απαναίηδηδ ζε επζπθέμκ ζζημφξ ή/ηαζ άθθα ακαπηολζαηά ζηάδζα πένακ αοηχκ πμο εηθνάγμκηαζ μζ εκ θυβς Gal4. ΤΝΟΦΗ ΑΠΟΣΔΛΔΜΑΣΧΝ ΔΝΟΣΗΣΑ Gal4s ραξαθηεξηζκέλνη λα εθθξάδνληαη ζε ηζηνχο ελδνδεξκηθήο θαη εμσδεξκηθήο πξνέιεπζεο εθθξάδνληαη θαη ζην κεζφδεξκα, π.ρ. ptcgal4 θαη srgal4. Η ILK είλαη απαξαίηεηε ζην λεπξηθφ ζχζηεκα, ηελ επηδεξκίδα, ηνπο ζηεινγφλνπο αδέλεο θαη ηελ σνζήθε Ζ ILK είκαζ απαναίηδηδ ηαηά ηδ δζάνηεζα ηδξ ςμβέκεζδξ ζηδ Drosophila Ζ πανμφζα ιεθέηδ ζημπεφεζ, ηυζμ ζε βεκεηζηυ υζμ ηαζ ζε ιμνζαηυ επίπεδμ, ζηδ ιεθέηδ ημο νυθμο ηδξ ILK ζηδ ιμνθμβέκεζδ ημο ςμεοθαηίμο, ηδκ μνβάκςζδ ηαζ μιμζυζηαζδ ημο εοθαηχδμοξ επζεδθίμο ηαηά ηδ δζάνηεζα ηδξ ςμβέκεζδξ ζηδ Drosophila. Με ζηυπμ ηδκ ακάθοζδ ημο πζεακμφ νυθμο ηδξ ILK ζημ εοθαηχδεξ επζεήθζμ: Πενζβνάραιε ημ πνυηοπμ έηθναζδξ ηδξ ILK ζηδκ ςμβέκεζδ. Μεθεηήζαιε ηδ θεζημονβία ηδξ ILK ζηα ανπζηά ακαπηολζαηά ζηάδζα ηδξ ςμβέκεζδξ. Ακαθφζαιε ηζξ θαζκμηοπζηέξ ζοκέπεζεξ ηδξ απμιάηνοκζδξ ηδξ ILK απυ ηα ηφηηανα ημο εοθαηχδμοξ επζεδθίμο. Μεθεηήζαιε ημ νυθμ ηδξ ILK ζηδκ εδναίςζδ ηαζ ηδ δζαηήνδζδ ηδξ αηναζμααζζηήξ πμθζηυηδηαξ ηςκ εοθαηςδχκ ηοηηάνςκ. 157

169 Γζενεοκήζαιε ηδ ζοιιεημπή ηδξ ILK ζημ ιδπακζζιυ νφειζζδξ ηδξ ζοζηαθηυηδηαξ ηςκ ζκζδίςκ αηημ-ιομζίκδξ. Δνεοκήζαιε ημ νυθμ ηδξ ILK ζηδκ μνβάκςζδ ηαζ δζαηήνδζδ ημο ηοηηανμζηεθεημφ ζημ εοθαηχδεξ επζεήθζμ. Γζενεοκήζαιε ημ νυθμ ηδξ ILK ζηδκ μιμζυζηαζδ ηςκ εοθαηςδχκ ηοηηάνςκ. Πνμζπαεήζαιε κα δζαθεοηάκμοιε ημοξ ιμνζαημφξ ιδπακζζιμφξ ιέζς ηςκ μπμίςκ δνα δ ILK ηαηά ηδ δζάνηεζα ηδξ ςμβέκεζδξ Πξφηππν έθθξαζεο ηεο ILK ζηελ αλαπηπζζφκελε σνζήθε Ζ ILK θαίκεηαζ κα εηθνάγεηαζ απυ πμθφ κςνίξ ηαηά ηδ δζαδζηαζία ηδξ ςμβέκεζδξ, ηαεχξ εκημπίγεηαζ ζηδκ ηοζημαθάζηδ. Δπίζδξ δ πνςηεΐκδ εηθνάγεηαζ ηαζ ζηα ιζζπμεζδή ηφηηανα (stalk cells) πμο ζπδιαηίγμοκ ημ δζαεοθαηζαηυ ιίζπμ (Δηθ.36Α &Δηθ.36Β ). Σα επίπεδα έηθναζήξ ηδξ θαίκεηαζ κα είκαζ παιδθά ζηα πνχηα ζηάδζα ηδξ ςμβέκεζδξ, ηαζ κα αολάκμκηαζ ζηα ςμεοθάηζα ιέζμο ζηαδίμο. ε αοηυ ημ ζηάδζμ δ ILK εκημπίγεηαζ ζημ ηοηηανυπθαζια υζμ ηαζ ζημ ααζζηυ άηνμ ηςκ εοθαηζμηοηηάνςκ, αημθμοεχκηαξ έκα πνυηοπμ εκημπζζιμφ πανυιμζμ ιε αοηυ ηδξ αρs οπμιμκάδαξ ηςκ ζκηεβηνζκχκ (Fernandez-Minan, Martin-Bermudo et al. 2007), (O'Reilly, Lee et al. 2008) (Δηθ.36Α ). ηα πνμαζηεθθμβεκζηά ακαπηολζαηά ζηάδζα ηδξ ςμβέκεζδξ δ ILK εκημπίγεηαζ ζημ ηοηηανυπθαζια ηαζ ζε ιεβαθφηενδ ζοβηέκηνςζδ πενζθενζηά, ημκηά ζηδ πθαζιαηζηή ιειανάκδ, ζε υθμ ημκ υβημ ημο ηοηηάνμο (Δηθ.37B ). 158

170 Δηθόλα 36: Η ILK εθθξάδεηαη ζην γεξκάξην, ηόζν ζηα ζσκαηηθά όζν θαη ζηα γακεηηθήο πξνέιεπζεο πξόδξνκα θαη δηαθνξνπνηεκέλα θύηηαξα. (Α-Α ) Ζ ΗLK εηθνάγεηαζ ζηα πνμεοθαηζαηά ηφηηανα (θεοηυ πθαίζζμ) ηα μπμία ζδιαίκμκηαζ εεηζηά βζα FasIII ηαζ ζηα πνυδνμια εοθαηζαηά ηφηηανα (ηίηνζκδ έθθεζρδ) ηαζ (Β-Β ) Ζ ILK είκαζ πανμφζα ζηα βαιεηζηά ηφηηανα (θεοηυ πθαίζζμ ηαζ ηίηνζκμ αέθμξ). ηα ιεζαία ακαπηολζαηά ζηάδζα ηςκ ςμεοθαηίςκ (ζη.10α/β), δ ILK, ακ ηαζ ζοκεπίγεζ κα παναιέκεζ ηοηηανμπθαζιαηζηή, πανμοζζάγεζ ιζα πνμηίιδζδ βζα ηδκ πθαζιαηζηή ιειανάκδ ηαζ βζα ζοκεκημπζζιυ ιε ηα ζκίδζα ηάζδξ, ιζα δμιή αηηίκδξ πμο εκημπίγεηαζ ζηδ ααζζηή πενζμπή ημο ηοηηάνμο ζε ηάεεημ πνμζακαημθζζιυ ςξ πνμξ ημκ ημνοθαζμ-ααζζηυ άλμκα ημο ηοηηάνμο. Πζμ ζοβηεηνζιέκα, δ ILK θαίκεηαζ κα ζοζζςνεφεηαζ πενζζζυηενμ ζηα άηνα ηςκ ζκζδίςκ ηάζδξ (Δηθ.38Α ). ηα ηεθεοηαία ζηάδζα ακάπηολδξ εκημπίγεηαζ ζηδκ πθεονζηή πθαζιαηζηή ιειανάκδ ηαηά ιήημξ ημο αηναζμ-ααζζημφ ηοηηανζημφ άλμκα (Δηθ.38Γ ), εκχ πενζμνίγεηαζ ζηα άηνα ηςκ ζκζδίςκ ηάζδξ ηδξ αηηίκδξ (Δηθ.38Γ ), υπμο έπεζ πενζβναθεί υηζ εκημπίγμκηαζ ηαζ ιζα ζεζνά άθθςκ πνςηεσκχκ υπςξ μζ ζκηεβηνίκεξ (Delon and Brown 2009), dlar (Bateman, Reddy et al. 2001), dρακ (p21 activated kinase) (Conder, Yu et al. 2007), ηαζ θαιζκίκδ Α (Laminin A) (Bateman, Reddy et al. 2001), πνςηεΐκεξ πμο θαίκεηαζ κα ειπθέημκηαζ ζηδκ πνμζηυθθδζδ ημο εοθαηχδμοξ επζεδθίμο ζημ ελςηοηηάνζμ οθζηυ. 159

171 Δηθόλα 37: Πξόηππν έθθξαζεο ηεο ILK ζην αλαπηπζζόκελν σνζπιάθην. (Α-Α ) Ζ ILK εκημπίγεηαζ ζηα ζοκμνζαηά ηφηηανα (ηίηνζκδ ηεθαθή αέθμοξ), ζηα ιζζπμεζδή ηφηηανα (ηεθαθή αέθμοξ) ηαζ ζηα εοθαηζμηφηηανα (θεοηυ πθαίζζμ) απυ ηα πνμαζηεθθζκζηά ζηάδζα ηςκ ςμεοθαηίςκ. 160

172 Δηθόλα 38: (Α-Α ) Ζ ILK ζοζζςνεφεηαζ ζηα άηνα ηςκ ζκζδίςκ αηηίκδξ (ηυηηζκδ ηεθαθή αέθμοξ) αθθά ηαζ ηοηηανμπθαζιαηζηά (ςμεοθάηζμ ζηαδίμο 10Β), (Β-Β ) Ζ ILK ζοζζςνεφεηαζ ζηδκ πενζθένεζα ηςκ ηοηηάνςκ αθθά ηαζ ηοηηανμπθαζιαηζηά (θεοηυ πθαίζζμ), (Γ-Γ ) ζηα ηεθζηά ζηάδζα ζοβηεκηνχκεηαζ ηονίςξ ζηα άηνα ηςκ ζκζδίςκ αηηίκδξ (ηίηνζκδ ηεθαθή αέθμοξ) ηαζ (Γ-Γ ) δ ILK εκημπίγεηαζ ηαζ ζηδκ πθεονζηή ιειανάκδ ηςκ ηοηηάνςκ (ηίηνζκμ εοεφβναιιμ ηιήια). Αοηή δ ηαηακμιή ηδξ πνςηεΐκδξ ζοιααδίγεζ ιε ηδκ ηαηακμιή ηδξ ILK ζηα ηφηηανα ηδξ ααζζηήξ ζημζαάδαξ ηδξ επζδενιίδαξ ημο πμκηζημφ, υπμο ζοβηεκηνχκμκηαζ ζε υθδ ηδκ ηοηηανζηή πενζθένεζα (Xie, Li et al. 1998). Δπίζδξ, έπεζ δεζπεεί υηζ δζάθμνα ιέθδ ηδξ μζημβέκεζαξ ηςκ ζκηεβηνζκχκ εκημπίγμκηαζ ηυζμ ζημ εοθαηχδεξ επζεήθζμ ηδξ ςμεήηδξ ζηδ Drosophila (Fernandez-Minan, Martin- Bermudo et al. 2007) υζμ ηαζ ζηα ηφηηανα ηδξ ααζζηήξ ζημζαάδαξ ηδξ επζδενιίδαξ ημο πμκηζημφ, πενζθενζηά ημο ηοηηάνμο (DiPersio, Hodivala-Dilke et al. 1997; Raghavan, Bauer et al. 2000; Watt 2002; Conti, Rudling et al. 2003; Parks 2007; Margadant, Charafeddine et al. 2010) πγθξηηηθή κειέηε ησλ δηαθνξεηηθψλ πεηξακαηηθψλ κεζφδσλ γηα ηε κειέηε ηνπ ξφινπ ηεο ILK ζηελ σνγέλεζε, Πιενλεθηήκαηα-Μεηνλεθηήκαηα Γζα κα επζηφπμοιε ηδ ζθαζνζηή ιεθέηδ ηδξ θεζημονβίαξ ηδξ ILK ζηδκ ςμβέκεζδ εηιεηαθθεοηήηαιε ιζα ζεζνά ζοιπθδνςιαηζηχκ πεζναιαηζηχκ πνμζεββίζεςκ. Ζ ηάεε πεζναιαηζηή ιέεμδμξ απμηάθορε ηδ ζοιιεημπή ηδξ ILK ζε δζαθμνεηζηέξ αζμθμβζηέξ δζαδζηαζίεξ: i. Μειέηε ησλ σνζεθψλ ησλ ηζηνεηδηθά δηαζσζκέλσλ ελήιηθσλ αηφκσλ κέζσ ηεο έθθξαζεο ηνπ δηαγνληδίνπ ηεο ilk ππφ ηνλ έιεγρν ηνπ 24ΒGal4. Ανπζηά ελεηάζαιε ηζξ ςμεήηεξ πμο πνμένπμκηαζ απυ εκήθζηεξ εδθοηέξ μιυγοβεξ βζα ηδ ιεηάθθαλδ ηδξ ilk, πμο «δζαζχεδηακ» βζαηί ελέθναγακ ζζημ-εζδζηά, ημ δζαβμκίδζμ ηδξ ILK. Χζηυζμ, μζ ςμεήηεξ ηςκ δζαζςζιέκςκ εδθοηχκ δεκ εηθνάγμοκ ημ δζαβμκίδζμ ηδξ ilk ζηδκ ςμεήηδ. Γζα ημ θυβμ αοηυ, μζ ςμεήηεξ αοηέξ ιπμνμφκ κα πνδζζιμπμζδεμφκ βζα ηδ ιεθέηδ ηςκ ζοκεπεζχκ ηδξ μιμζυιμνθδξ ελάθεζρδξ ή ζδιακηζηήξ μιμζυιμνθδξ ιείςζδξ ηςκ επζπέδςκ ηδξ ILK ζηδ δζαδζηαζία ηδξ ςμβέκεζδξ. Σα απμηεθέζιαηα ιαξ οπμζηδνίγμοκ υηζ δ απχθεζα ηδξ ILK απυ ηα πνυδνμια ηφηηανα ηυζμ ηδξ βαιεηζηήξ ζεζνάξ υζμ ηαζ απυ ηα πνυδνμια 161

173 εοθαηζμηφηηανα μδδβεί ζημκ ηενιαηζζιυ ηδξ δζαδζηαζίαξ ηδξ ςμβέκεζδξ. Σμ ιεζμκέηηδια αοηήξ ηδξ ιεευδμο έβηεζηαζ ζημ βεβμκυξ υηζ μ 24ΒGal4 έπεζ δζαθοβμφζα έηθναζδ ζηδκ ςμεήηδ. Φαίκεηαζ κα εηθνάγεηαζ ζε παιδθά επίπεδα ζηα ιζζπμεζδή ηφηηανα (Δηθ.39Α ), ζημκ ςαβςβυ ηαζ ημ ιοσηυ έθοηνμ (sheath) πμο πενζαάθθεζ ηα ακαπηοζζυιεκα ςμεοθάηζα (Δηθ.39Α ) ηαζ ζε ηάπμζα ηφηηανα ζηα ηεθζηά ακαπηολζαηά ζηάδζα ημο ςμεοθαηίμο ζημπαζηζηά (Δηθ.39Γ). Αοηυ έπεζ ςξ ζοκέπεζα μζ ζοκεήηεξ οπυ ηζξ μπμίεξ ιεθεημφιε ηδ θεζημονβία ηδξ ILK κα είκαζ οπυιμνθεξ (hypomorphic), ιε απμηέθεζια μζ θαζκυηοπμζ πμο παναηδνμφιε κα είκαζ δπζυηενμζ ηδξ άιμνθδξ (null) ηαηάζηαζδξ ηαζ πζεακά ηάπμζεξ θεζημονβίεξ ηδξ κα ιδκ απμηαθφπημκηαζ ιε αοηή ηδ ιέεμδμ. Χζηυζμ, ζοβηνζηζηά ιε ηδ ιέεμδμ ηαηαζηεοήξ ιςζασηχκ πμο αημθμοεεί, δ ιεθέηδ ηςκ ζζημεζδζηά δζαζςζιέκςκ εκήθζηςκ ςμεδηχκ απμηεθεί ζοκεήηδ μιμζυιμνθδξ έθθεζρδξ, ή έζης ζδιακηζηήξ ιείςζδξ ηςκ επζπέδςκ ηδξ ILK απυ μθυηθδνμ ημκ οπυ ιεθέηδ ζζηυ. Δηθόλα 39: Πξόηππν έθθξαζεο ηνπ 24ΒGal4 ζηελ αλαπηπζζόκελε σνζήθε. (Α-Α ) Ο 24ΒGal4 εηθνάγεηαζ ζηα ιζζπμεζδή ηφηηανα (ηίηνζκδ ηεθαθή αέθμοξ), (Β-Β ) ζημ ιοσηυ ζζηυ ημο ςαβςβμφ (θεοηυ πθαίζζμ) ηαζ ημ ιοσηυ έθοηνμ πμο πενζαάθθεζ ηα ςμεοθάηζα (θεοηή έθθεζρδ) ηαζ (Γ-Γ ) ιςζασηά ηαζ ζημπαζηζηά ζε ηάπμζα εοθαηζμηφηηανα (ηυηηζκδ ηεθαθή αέθμοξ) ζημ ζηάδζμ

174 ii. Καηαζθεπή γελεηηθψλ κσζατθψλ γηα ην γνλίδην ηεο ilk ζηελ ελήιηθε σνζήθε επαγφκελνη κέζσ ηνπ ζπζηήκαηνο hsflp/frt Ζ πνμδβμφιεκδ πεζναιαηζηή πνμζέββζζδ απμηάθορε υηζ δ ILK απαζηείηαζ ηαηά ηα πνχζια ζηάδζα ηδξ ςμβέκεζδξ, ηαζ δ απχθεζα ηδξ μδδβεί ηδκ παφζδ αοηήξ ηδξ αζμθμβζηήξ δζαδζηαζίαξ. Σμ βεβμκυξ αοηυ ιαξ ειπμδίγεζ κα ιεθεηήζμοιε ημκ πζεακυ νυθμ ηδξ ILK ζε ιεηαβεκέζηενα ζηάδζα ηδξ ςμβέκεζδξ ηαηά ηα μπμία ζπδιαηίγμκηαζ ηα ζκίδζα ηάζδξ, ηαζ ηαηά ηα μπμία πνμδβμφιεκεξ ιεθέηεξ έπμοκ δείλεζ υηζ ειπθέημκηαζ ιυνζα πμο ζοιιεηέπμοκ ζηδκ ηοηηανζηή πνμζηυθθδζδ. Γζα ημ θυβμ αοηυ εηιεηαθθεοηήηαιε ημ ζφζηδια hsflp/frt ηαζ ηαηαζηεοάζαιε βεκεηζηά ιςζασηά βζα ηδκ ilk ζηδκ εκήθζηδ ςμεήηδ. Οζ ηθχκμζ πμο πνμηφπημοκ βζα ηδκ ilk ζημ εοθαηχδεξ επζεήθζμ είκαζ ζημπαζηζημί ςξ πνμξ ηδ εέζδ ημοξ ηαζ ημ ιέβεεμξ ημοξ (Margolis and Spradling 1995). Αοηυ έπεζ ςξ απμηέθεζια κα ιαξ δίκεηαζ δ δοκαηυηδηα κα παναηδνήζμοιε ηδκ επίδναζδ ηδξ έθθεζρδξ ηδξ πνςηεΐκδξ ζε δζάθμνα ζηάδζα ςνίιακζδξ ημο ςμεοθαηίμο, ζε δζαθμνεηζηή ημπμθμβία πάκς ζημ επζεήθζμ ηαζ ζε δζάθμνα ιεβέεδ ημο ηθχκμο. Οζ ιφβεξ αοηέξ εκαπμεέημοκ ιζηνυηενμ ανζειυ αοβχκ απυ ηζξ ιφβεξ αβνίμο ηφπμο ηαζ ζε ιζηνυ πμζμζηυ πνμηφπημοκ χνζια ζηνμββοθειέκα αοβά (Δηθ.41Γ-Γ ). Οζ παναηδνήζεζξ αοηέξ, ένπμκηαζ ζε ζοιθςκία ιε ηα απμηεθέζιαηα ηςκ «δζαζςζιέκςκ» ιοβχκ, μζ μπμίεξ ειθακίγμοκ ιεζςιέκμ νοειυ εκαπυεεζδξ αοβχκ ηαηά 90% ηαζ ζδιακηζηυ πμζμζηυ ηςκ εκαπμηζεέιεκςκ αοβχκ είκαζ ζηνμββοθειέκα. Ζ ιέεμδμξ αοηή είκαζ δ πθέμκ ηαηάθθδθδ βζα κα ιεθεηήζμοιε ημ νυθμ ηδξ ILK ζηδκ μνβάκςζδ ηαζ ηδ δζαηήνδζδ ηςκ εοθαηζμηοηηάνςκ ιέζμο ηαζ ηεθζηχκ ζηαδίςκ, ηαεχξ μ ζημπαζηζηυξ ηνυπμξ πμο πνμηφπημοκ μζ ηθχκμζ επζηνέπεζ ζηα ςμεοθάηζα κα θηάζμοκ ιέπνζ αοηά ηα ζηάδζα. iii. Καηαζθεπή γελεηηθψλ κσζατθψλ γηα ην γνλίδην ηεο ilk ζηελ ελήιηθε σνζήθε επαγφκελνη κέζσ ηνπ ζπζηήκαηνο UAS:FLP/Gal4. Με αοηή ηδ ιέεμδμ, ηαηαζηεοάγμοιε πάθζ βεκεηζηά ιςζασηά, αθθά ημ ιέβεεμξ ηςκ ηθχκςκ ηαζ δ εέζδ ημοξ είκαζ πενζζζυηενμ εθεβπυιεκδ ηαζ επακαθήρζιδ ζε ζπέζδ ιε ηα βεκεηζηά ιςζασηά πμο πνμηφπημοκ ιε ηδ πνήζδ ηδξ ελανηχιεκδξ απυ ηδ εενιμηναζία θθζπάζδξ (hsflp). Καηαζηεοάγμοιε ηθχκμοξ ζφιθςκα ιε ημ πνυηοπμ έηθναζδξ ημο Gal4 πμο πνδζζιμπμζήζαιε. Σμ ιεζμκέηηδια αοηήξ ηδξ ιεευδμο είκαζ υηζ μζ ςμεοθαηζαημί Gal4ο πμο πνδζζιμπμζήζαιε εηθνάγμκηαζ ηαζ ζε άθθμοξ ζζημφξ εηηυξ απυ ηδκ ςμεήηδ (βι. Δλνη.3.2.1, Πηλ.1) ηαζ αοηυ έπεζ ςξ 163

175 απμηέθεζια δ δδιζμονβία ηθχκςκ κα πνμηαθεί εκδζζιυηδηα ζε πμθφ ιεβάθμ πμζμζηυ ηαζ κα πνμηφπηεζ πμθφ ιζηνυξ ανζειυξ εκήθζηςκ αηυιςκ πνμξ ακάθοζδ. Χζηυζμ, ηαζ αοηά ηα πεζνάιαηα επζαεααζχκμοκ ηδ ιεζςιέκδ βμκζιυηδηα ςξ θαζκυηοπμ απμοζίαξ ηδξ ILK ηαζ ημ ιεζςιέκμ ανζειυ ςμεοθαηίςκ ηαζ ηεθεοηαίςκ ζηαδίςκ. iv. Υξήζε ηνπ ζπζηήκαηνο απνζηψπεζεο UAS:IR/Gal4 Οζ ςμεήηεξ ηςκ απμβυκςκ αοηχκ ηςκ δζαζηαονχζεςκ ειθακίγμκηαζ αηνμθζηέξ ηαζ οπμπθαζιέκεξ, εκχ ιεβάθμξ ανζειυξ ακαπηοζζυιεκςκ ςμεοθαηίςκ πανμοζζάγμοκ ιμνθμθμβζηέξ ακςιαθίεξ. Πζμ ζοβηεηνζιέκα, ημ επζεήθζμ ημο ςμεοθαηίμο είκαζ δζμβηςιέκμ, πζεακά θυβς πμθθαπθαζζαζιμφ ηοηηάνςκ ή αφλδζδ ημο υβημο ηςκ εοθαηζμηοηηάνςκ, εηημπίγεζ ηαζ «ζοννζηκχκεζ» ημ ςμηφηηανμ ηαηά ηφνζμ θυβμ αθθά ηαζ ηα ηνμθζηά ηφηηανα (Δηθ.40Α ). Ο θαζκυηοπμξ αοηυξ παναηδνήεδηε ηάκμκηαξ πνήζδ ιζα ζεζνά απυ Gal4ο πμο ειθακίγμοκ δζαθμνεηζηυ πνυηοπμ έηθναζδξ ζημ επζεήθζμ είηε πνμκζηά είηε ημπμθμβζηά (βι. Δλνη.3.2.1, Πηλ.1). Χζηυζμ, θυβς ημο ζζπονμφ θαζκμηφπμο αθθά ηαζ ημο βεβμκυημξ υηζ δ πνμζέββζζδ αοηή μδδβεί ζε εκδζζιυηδηα ηαηά ημ κοιθζηυ ζηάδζμ είκαζ ελαζνεηζηά δφζημθμ κα ιεθεηδεεί ιεβάθμξ ανζειυξ αηυιςκ. Δηθόλα 40: H απνζηώπεζε ηεο ILK ηζηνεηδηθά ζην αλαπηπζζόκελν σνζπιάθην πξνθαιεί εθηεηακέλεο κνξθνινγηθέο δηαηαξαρέο. (Α ) παναημθμφεδζδ ηςκ ηοηηάνςκ πμο βίκεηαζ δ απμζζχπδζδ ηδξ ILK ιε ηαοηυπνμκδ έηθναζδ ημο GFP-CAAX, ζήιακζδ ηδξ πθαζιαηζηήξ ιειανάκδξ, (Α ) ιμνθμθμβία ημο ςμεοθαηίμο ζη.7 ιε πνχζδ νμδαιίκδξ-θαθθμσδίκδξ (Α ) πονήκεξ ηςκ εοθαηζμηοηηάνςκ ηαζ ηςκ ηοηηάνςκ βαιεηζηήξ ζεζνάξ, (B ) παναημθμφεδζδ ημπμθμβζηήξ έηθναζδξ ημο 55BGal4, ιε ηαοηυπνμκδ έηθναζδ ημο GFP-CAAX, ζήιακζδ ηδξ πθαζιαηζηήξ ιειανάκδξ, (Α ) ιμνθμθμβία ςμεοθαηίμο αβνίμο ηφπμο ζη.7 ιε πνχζδ νμδαιίκδξ-θαθθμσδίκδξ (Α ) πονήκεξ ηςκ εοθαηζμηοηηάνςκ ηαζ ηςκ ηοηηάνςκ βαιεηζηήξ ζεζνάξ. 164

176 Πανυθα αοηά, μζ παναηδνήζεζξ αοηέξ ζε ζοκδοαζιυ ιε ημ βεβμκυξ υηζ δ ILK εηθνάγεηαζ απυ πμθφ κςνίξ ζηδκ ακάπηολδ ηςκ ςμεοθαηίςκ, ιαξ μδδβμφκ ζημ ζοιπέναζια υηζ δ ILK ζοιιεηέπεζ ζηδ ιμνθμβέκεζδ ημο επζεδθίμο. Χζηυζμ, δ ηαηαζηεοή βεκεηζηχκ ιςζασηχκ δεκ μδδβεί ζηδκ ειθάκζζδ ηυζμ δναιαηζηχκ ιμνθμθμβζηχκ ακςιαθζχκ ζημ επζεήθζμ ημο ςμεοθαηίμο. Αοηυ πζεακά μθείθεηαζ ζημ βεβμκυξ υηζ δ ηαηαζηεοή βεκεηζηχκ ιςζασηχκ δεκ είκαζ δυηζιδ πνμζέββζζδ βζα κα απμηαθοθεεί μ ζοβηεηνζιέκμξ νυθμξ ηδξ πνςηεΐκδξ, είηε θυβς ιεβέεμοξ ηςκ ηθχκςκ είηε θυβς ημο ακαπηολζαημφ ζηαδίμο ηαηά ημ μπμίμ επάβμκηαζ μζ ηθχκμζ. οβηεκηνςηζηά θμζπυκ, ακελάνηδηα ηδξ ιεευδμο ιε ηδκ μπμία πνμηαθέζαιε ελάθεζρδ ηδξ ilk ή ζδιακηζηή ιείςζδ ηςκ επζπέδςκ ηδξ ILΚ, δ πνςηεΐκδ είκαζ απαναίηδηδ βζα ηδκ ςμβέκεζδ ηαζ δ απμοζία ηδξ πνμηαθεί ζδιακηζηή οπμβμκζιυηδηα (Δηθ.42-Γηαγ. 11). Δπίζδξ, δ απμοζία ηδξ ILK ηαηά ηα πνχηα ζηάδζα ηδξ ακάπηολδξ ημο ςμεοθαηίμο μδδβεί ζηδκ «ελαθάκζζδ» ςμεοθαηίςκ ιέζμο ηαζ ηεθεοηαίςκ ζηαδίςκ (Δηθ.43-Γηαγ.12-15). Σέθμξ, δ ακάπηολδ ηςκ ςμεοθαηίςκ ζε ζοκεήηεξ ιεζςιέκςκ επζπέδςκ ILK μιμζυιμνθα ζε υθα ηα εοθαηζμηφηηανα μδδβεί ζημ ζπδιαηζζιυ ζηνμββοθειέκςκ χνζιςκ αοβχκ (Δηθ.41Γ). Δπζπθέμκ, ημ ιήημξ ηςκ ςμεοθαηίςκ (πνμζεζμ-μπίζεζμξ άλμκαξ) ζηαδίμο 10Α ηςκ ζζημεζδζηά δζαζςζιέκςκ ιεζχκεηαζ ηαηά 21% (ιε ιέζμ ιήημξ 363ιm ζε ζπέζδ ιε ημο αβνίμο ηφπμο ιε ιήημξ 457ιm) (Δηθ.41Γ-Γ ). Πανυιμζμξ θαζκυηοπμξ ζοκακηάηαζ ηαζ ζε άθθα ιεηαθθάβιαηα ηςκ μπμίςκ δ δνάζδ ζοκδέεηαζ ιε ηδκ ηοηηανζηή πνυζθοζδ ζημ ελςηοηηάνζμ οθζηυ, υπςξ μζ ζκηεβηνίvεξ, δ dlar (Bateman, Reddy et al. 2001),ηαζ δ dpακ (Conder, Yu et al. 2007). 165

177 Δηθόλα 41: Μαθξνζθνπηθνί θαηλόηππνη ιόγσ ηεο απνπζίαο ηεο ILK από ηελ αλαπηπζζόκελε σνζήθε ηνπ ελήιηθνπ αηόκνπ. (Α-Α ) εκήθζηα εδθοηά άημια, δ ημζθζά ημο δζαζςζιέκμο αηυιμο είκαζ ζαθχξ ζοννζηκςιέκδ, δείβια ιζηνμφ υβημο ηςκ ςμεδηχκ ημο, (Β-Β ) ςμεήηεξ εκήθζηςκ αηυιςκ, ηυζμ δ ςμεήηδ ημο δζαζςζιέκμο εδθοημφ (Β ) υζμ ηαζ αοημφ πμο θένεζ ηθχκμοξ βζα ηδκ ilk θένμοκ ςμεοθάηζα υθςκ ηςκ ζηαδίςκ, αθθά ιεζςιέκμο ανζειμφ ζε ζπέζδ ιε ηδκ αβνίμο ηφπμο ςμεήηδ (Β), (Γ-Γ ) ημ χνζιμ αοβυ ημο δζαζςζιέκμο αηυιμο είκαζ ειθακχξ πζμ ζηνμββοθειέκμ ( Γ ) ζε ζπέζδ ιε ημ ακηίζημζπμ ημο αβνίμο ηφπμο (Γ), (Γ-Γ ) ςμεοθάηζα ακαπηολζαημφ ζηαδίμο 10Α, ημ ςμεοθάηζμ ημο δζαζςζιέκμο αηυιμο (Γ ) είκαζ ζδιακηζηά πζμ ημκηυ ηαηά ημκ πνμζεζμ-μπίζεζμ άλμκα ηαζ (Δ-Δ ) δζαβναιιαηζηή απεζηυκζζδ ηδξ δζαθμνάξ ημο ιήημοξ ηςκ ςμεοθαηίςκ ζηαδίμο 10Α αβνίμο ηφπμο- ηθχκςκ (E) (ιδ ζηαηζζηζηά ζδιακηζηή) ηαζ αβνίμο ηφπμο- δζαζςζιέκςκ αηυιςκ (ζηαηζζηζηά ζδιακηζηή δζαθμνά P<0,001). 166

178 Δηθόλα 42: Γηάγξακκα11- Απεηθόληζε ηεο ηθαλόηεηαο ελαπόζεζεο απγώλ ζηηο δηάθνξεο ζπλζήθεο έιιεηςεο ILK. Ζ απμοζία ηδξ ILK πνμηαθεί ιείςζδ ηδξ βμκζιυηδηαξ ζηδ Drosophila, ζημ δζάβναιια ειθακίγεηαζ δ επί ημζξ εηαηυ (%) ιείςζδ ημο ανζειμφ εκαπυεεζδξ ηςκ αοβχκ ζε ηάεε ηαηάζηαζδ. 167

179 Δηθόλα 43: Γηαγξάκκαηα Απεηθόληζε ηεο ζρεηηθήο θαηαλνκήο ησλ σνζπιαθίσλ ζηα δηάθνξα αλαπηπμηαθά ζηάδηα. (A, B) επαβςβή ηθχκςκ ιέζς ημο ζοζηήιαημξ UAS:FLP/Gal4 βζα δομ δζαθμνεηζημφξ Gal4s(Α) c355gal4 επαβυιεκα βεκεηζηά ιςζασηά, (Β) Cy2Gal4 επαβυιεκα 168

180 βεκεηζηά ιςζασηά, (Γ) ςμεήηεξ ζζημεζδζηά δζαζςζιέκςκ εδθοηχκ ηαζ (Γ) ηα ακηίζημζπα εδθοηά εθέβπμο Αλάιπζε ηνπ ξφινπ ηεο ILK ζηα αξρηθά ζηάδηα ηεο σνγέλεζεο Οζ παναπάκς παναηδνήζεζξ, έδεζλακ υηζ δ ILK είκαζ απαναίηδηδ ζηα πνχηα ζηάδζα ηδξ ςμβέκεζδξ ηαζ δ απμοζία ηδξ μδδβεί ζε παφζδ αοηήξ ηδξ δζαδζηαζίαξ. Συζμ ηα ζζημεζδζηά δζαζςζιέκα άημια υζμ ηαζ ηα άημια πμο θένμοκ ηθχκμοξ βζα ilk ζηα ακαπηοζζυιεκα ςμεοθάηζά ημοξ, ειθακίγμοκ ιεζςιέκδ βμκζιυηδηα ηαζ δ ακάπηολδ ηςκ ςμεοθαηίςκ ζηαιαηά ηαηά ηα πνμαζηεθθμβεκζηά ακαπηολζαηά ζηάδζα. Πνυζθαηδ ιεθέηδ, ειπθέηεζ ηζξ ζκηεβηνίκεξ ιε ηδ νφειζζδ ημο πμθθαπθαζζαζιμφ ηςκ αθαζηζηχκ εοθαηζαηχκ ηοηηάνςκ. Πζμ ζοβηεηνζιέκα, μζ ζκηεβηνίκεξ ζοιιεηέπμοκ ζημκ εκημπζζιυ ηςκ πνυδνμιςκ εοθαηζμηοηηάνςκ ζηδκ πενζθένεζα ημο βενιάνζμο, απαναίηδηδ πνμτπυεεζδ (germarium) χζηε κα ιπμνμφκ κα δζαζνμφκηαζ ηακμκζηά (O'Reilly, Lee et al. 2008). Γζα ημ θυβμ αοηυ ιεηνήζαιε ημκ ανζειυ ηςκ ηθχκςκ πμο πνμηφπημοκ ζηα βενιάνζα αηυιςκ ζηα μπμία ηαηαζηεοάγαιε ηθχκμοξ βζα ilk ηαζ ζημ ζηέθεπμξ εθέβπμο πμο ηαηαζηεοάγαιε ηθχκμοξ ιυκμ βζα ηδκ GFP πνςηεΐκδ ιάνηονα. Καηαζηεοάζαιε ηθχκμοξ, ηαζ ιεηνήζαιε ηδ ζοπκυηδηα ειθάκζζδξ ημοξ ζηζξ δομ ζοκεήηεξ ζε ηνία δζαθμνεηζηά πνμκζηά ζδιεία, ζε 2 ιένεξ, 7 ιένεξ ηαζ 14 ιένεξ ιεηά ηδκ επαβςβή ηςκ ηθχκςκ ιε εενιμηναζζαηυ ζμη. Σα απμηεθέζιαηά ιαξ έδεζλακ υηζ δ ILK δε ζοιιεηέπεζ ζημκ έθεβπμ ηδξ εέζδξ ηαζ ημο μιαθμφ πμθθαπθαζζαζιμφ ηςκ πνυδνμιςκ εοθαηζμηοηηάνςκ ηαεχξ δ ζοπκυηδηα ζπδιαηζζιμφ ηςκ ηθχκςκ ήηακ ακηίζημζπδ ηαζ ζηα δομ ζηεθέπδ (Δηθ.44Γ). 169

181 (66) (36) Δηθόλα 44 : Σα βιαζηηθά θύηηαξα απνπζία ilk δηαηεξνύλ ηελ ηθαλόηεηα ηνπο λα πνιιαπιαζηάδνληαη θαη λα παξακέλνπλ ζηελ πεξηθέξεηα ηνπ γεξκάξηνπ (FSFCs). (Α) ηαηαζηεοή ηθχκςκ ζημ ζηέθεπμξ εθέβπμο, (Β) ηθχκμζ ζηα αθαζηζηά εοθαηζμηφηηανα (FSFCs, ζδιεζχκμκηαζ ιε ηίηνζκδ ηεθαθή αέθμοξ) ηαζ ηα πνυδνμια εοθαηζμηφηηανα (precursor FCs) απμοζία ηδξ ilk, 7 διένεξ ιεηά ημ εενιμηναζζαηυ ζμη ηαζ (Γ) ηθχκμζ ζηα αθαζηζηά εοθαηζμηφηηανα (FSFCs) ηαζ ηα πνυδνμια εοθαηζμηφηηανα (precursor FCs) απμοζία ηδξ ilk, 14 διένεξ ιεηά ημ εενιμηναζζαηυ ζμη (ιε ηίηνζκμ πενίβναιια πενζβνάθμκηαζ μζ ηθχκμζ ηςκ ζςιαηζηχκ ηοηηάνςκ, εκχ ιε ηυηηζκμ πενίβναιια πενζβνάθμκηαζ μζ ηθχκμζ ηςκ βαιεηζηχκ ηοηηάνςκ). Δπίζδξ ηα επίπεδα ηςκ ζκηεβηνζκχκ υζμ ηαζ μ εκημπζζιυξ ημοξ ζηα βενιάνζα ηςκ δζαζςζιέκςκ αηυιςκ παναιέκμοκ ακεπδνέαζηα (Δηθ.45Β) απυ ηδκ έθθεζρδ ηδξ ILK, έκδεζλδ πμο εκζζπφεζ ηδκ οπυεεζδ υηζ δ απμοζία ηδξ ILK πνμηαθεί παφζδ ζηδ δζαδζηαζία ηδξ ςμβέκεζδξ ιέζς εκυξ άθθμο ιμνζαημφ ιδπακζζιμφ ηαζ υπζ ιέζς ηςκ ζκηεβηνζκχκ. Δηθόλα 45: Ο εληνπηζκόο θαη ηα επίπεδα ησλ ηληεγθξηλώλ ζην γεξκάξην δελ επεξεάδνληαη από ηελ απνπζία ηεο ILK. Οζ ζκηεβηνίκεξ εκημπίγμκηαζ ζηδ ααζζηή πθεονά ηςκ εοθαηζμηοηηάνςκ 170

182 (ηυηηζκα αέθδ) ηυζμ ζημ βενιάνζμ αβνίμο ηφπμο (Α) υζμ ηαζ ζε αοηυ ημο δζαζςζιέκμο εδθοημφ (Β) αθθά ηαζ ζηα ιζζπμεζδή ηφηηανα (ηίηνζκεξ ηεθαθέξ αέθμοξ). ηδ ζοκέπεζα ακαθφζαιε ηδ ιμνθμθμβία ηςκ ςμεοθαηίςκ ηςκ πνχηςκ ακαπηολζαηχκ ζηαδίςκ. Υνδζζιμπμζήζαιε ςξ πνςηεΐκεξ ιάνηονεξ ηζξ dpak, δ μπμία εηθνάγεηαζ ηονίςξ ζηα ηφηηανα βαιεηζηήξ πνμέθεοζδξ ηαζ αζεεκέζηενα ζηα εοθαηζμηφηηανα, ηδ Fasciclin III ηαζ ηδκ πνςηεΐκδ chd64 (Mouratidou and Zervas, αδδιμζίεοηα απμηεθέζιαηα) πμο εηθνάγμκηαζ ηονίςξ ζηα ιζζπμεζδή ηφηηανα, ηα πνμεοθαηζαηά ηφηηανα ηαζ αζεεκέζηενα ζηα εοθαηζμηφηηανα. Ζ απμοζία ηδξ ILK μδδβεί ζε δζαηαναπή ζημκ μιαθυ ζπδιαηζζιυ ηςκ ιζζπμεζδχκ ηοηηάνςκ. Παναηδνήζαιε υηζ ειθακίγμκηαζ δζαεοθζαημί ιίζπμζ πμο απμηεθμφκηαζ απυ ιδ βναιιζηήξ δζεοεέηδζδξ ιζζπμεζδή ηφηηανα (Δηθ.46Γ ). Δπίζδξ ζημ βενιάνζμ εκημπίγμκηαζ πενζζζυηενα απυ έκα κεμζπδιαηζζεέκηα ςμεοθάηζα, ςμεοθάηζα ιε αηεθή εβηφηηςζδ ηαζ «ζζαιαία ςμεοθάηζα» (Δηθ.46Β & Δηθ.46Γ). Σέθμξ, υθα ηα «ημιπμθυβζα» (ovarioles), πμο απμηεθμφκηαζ απυ ηα ανπζηά ζηάδζα ηςκ ςμεοθαηίςκ, θαίκεηαζ κα ηαηαθήβμοκ ζε ςμεοθάηζα ζηαδίςκ 5-7 ακχιαθδξ ιμνθμθμβίαξ ιε ζδιάδζα απμδζμνβάκςζδξ. Οζ πονήκεξ ηςκ ηνμθζηχκ ηοηηάνςκ αοηχκ ηςκ ςμεοθαηίςκ είκαζ ζοιποηκςιέκμζ, ιζηνμί (Δηθ.47Β ), παναηηδνζζηζηυ ηοηηανζημφ εακάημο. Πζεακά θμζπυκ, δ απμοζία ηδξ ILK πνμηαθεί ακχιαθδ μνβάκςζδ ζηζξ παναπάκς μιάδεξ ηοηηάνςκ δζαηανάζζμκηαξ έηζζ ηαίνζα ζδιαημδμηζηά ιμκμπάηζα βζα ηδκ μιαθή ελέθζλδ ηδξ δζαδζηαζίαξ ηδξ ςμβέκεζδξ. 171

183 Δηθόλα 46: Η απνπζία ηεο ILK ζην γεξκάξην Οδεγεί ζε αλώκαιε εγθύηησζε ησλ θπζηώλ θαη ζε πνιύζηνηβν δηαζπιαθηαθό κίζρν. (Α) βενιάνζμ ηαζ ανπζηά ακαπηολζαηά ζηάδζα ςμεοθαηίςκ αβνίμο ηφπμ, ιμκυζημζαμξ δζαεοθζαηυξ ιίζπμξ (ηίηνζκδ ηεθαθή αέθμοξ), (Β-Γ) βενιάνζμ ηαζ ανπζηά ακαπηολζαηά ζηάδζα ςμεοθαηίςκ δζαζςζιέκμο αηυιμο, ηα ιζζπμεζδή ηφηηανα παφμοκ κα δζαηάζζμκηαζ βναιιζηά (ηίηνζκδ ηεθαθή αέθμοξ). (Γ-Δ) βενιάνζμ ηαζ ανπζηά ακαπηολζαηά ζηάδζα ςμεοθαηίςκ δζαζςζιέκμο αηυιμο, ζοζζχνεοζδ κεμζπδιαηζζεέκηςκ ςμεοθαηίςκ ιέζα ζηδ πενζμπή ημο βενιάνζμο. (Σ) ζπδιαηζηή απεζηυκζζδ ηδξ ζπεηζηήξ εέζδξ ηςκ δζάθμνςκ οπμμιάδςκ ηοηηάνςκ ζημ βενιάνζμ ηαζ δ μιαθή δζαδμπή ηςκ ακαπηολζαηχκ ζηαδίςκ ηςκ ςμεοθαηίςκ ζηδκ έκανλδ ηδξ ςμβέκεζδξ (O'Reilly, Lee et al. 2008). Δηθόλα 47: Σα σνζπιάθηα ησλ δηαζσζκέλσλ αηόκσλ εκθαλίδνπλ ζεκάδηα θπηηαξηθνύ ζαλάηνπ θαη απνδηνξγάλσζεο θαηά ηα ζηάδηα 5/7. (A-A ) ςμεοθάηζμ αβνίμο ηφπμο ζηαδίμο 7, (Β-Β ) ςμεοθάηζμ δζαζςζιέκμο εδθοημφ ζηαδίμο 7, μζ πονήκεξ ειθακίγμκηαζ ζοιποηκςιέκμζ (Β ) (ηυηηζκδ ηεθαθή αέθμοξ) ζε ζπέζδ ιε ημοξ πονήκεξ ημο ςμεοθαηίμο αβνίμο ηφπμο (Α ) (ηυηηζκδ ηεθαθή αέθμοξ). 172

184 Πεξηγξαθή ησλ ελδηάκεζσλ δπλακηθψλ θαηαζηάζεσλ ηεο νξγάλσζεο ησλ ηληδίσλ ηάζεο ηεο αθηίλεο ζε άγξηνπ ηχπνπ σνζπιάθην. Ζ ςμβέκεζδ ζηδ Drosophila είκαζ έκα ελαζνεηζηυ ιμκηέθμ ζφζηδια βζα ηδ ιεθέηδ ηςκ θαζκμιέκςκ πμο δζέπμοκ ηδκ μνβάκςζδ ηαζ μιμζυζηαζδ αηηίκδξ ηαζ ηδξ ηοηηανζηήξ πνμζηυθθδζδξ (Conder, Yu et al. 2007; Delon and Brown 2009). Καηά ηδκ δ ακάπηολδ ημο ςμεοθαηίμο, ημ εοθαηχδεξ επζεήθζμ ακαδζμνβακχκεηαζ ηαζ απμηηά πθαηχδδ ιμνθή πάκς απυ ηα ηνμθζηά ηφηηανα ηαζ ηοθζκδνζηή πάκς απυ ημ ςμηφηηανμ. Σμ εοθαηχδεξ επζεήθζμ ειθακίγεζ επίπεδδ μνβάκςζδ ηςκ δεζιίδςκ αηηίκδξ (basal F- actin bundles) ζηδ ααζζηή πενζμπή ημο ηοηηάνμο. Σα ζκίδζα αηηίκδξ δζεοεεημφκηαζ ηάεεηα ςξ πνμξ ημ πνυζεζμ-μπίζεζμ άλμκα ημο ςμεοθαηίμο. Πνυζθαηεξ ενβαζίεξ έπμοκ δείλεζ υηζ ιζα ζεζνά απυ πνςηεΐκεξ υπςξ δ θςζθαηάζδ ηδξ ηονμζίκδξ Dlar, μζ ζκηεβηνίκεξ ηαζ δ ηζκάζδ ζενίκδξ/ενεμκίκδξ dpak είκαζ απαναίηδηεξ βζα ημκ πνμζακαημθζζιυ ηςκ ααζζηχκ ζκζδίςκ αηηίκδξ. Σα ζκίδζα ηάζδξ ηδξ αηηίκδξ ζηδ ααζζηή πθεονά ημο εοθαηζμηοηηάνμο απμηεθμφκ ελαζνεηζηά δοκαιζηέξ δμιέξ, ακαδζμνβακχκμκηαζ αημθμοεχκηαξ ηαζ δζεοημθφκμκηαξ ηδκ επζιήηοκζδ ημο ςμεοθαηίμο (Gutzeit 1990). Ακ ηαζ ηυζμ δ δζεοεέηδζδ υζμ ηαζ δ ιμνθμθμβία ηςκ ζκζδίςκ έπεζ πενζβναθεί ανηεηά ακαθοηζηά απυ ημοξ (Delon and Brown 2009), ςζηυζμ δ ιμνθμθμβία ηςκ δμιχκ αοηχκ ειθακίγεζ ζδιακηζηή πμζηζθμιμνθία ακάιεζα ζε ςμεοθάηζα ίδζμο ζηαδίμο αθθά ηαζ ακάιεζα ζε εοθαηζμηφηηανα ημο ίδζμο ςμεοθαηίμο. Καηά ημ ακαπηολζαηυ ζηάδζμ 10Α, έπεζ πενζβναθεί υηζ ηα ζκίδζα ηάζδξ ζπδιαηίγμοκ θεπηέξ δεζιίδεξ πμο δζαηάζζμκηαζ ηάεεηα ζημκ πνμζεζμ-μπίζεζμ άλμκα ημο ςμεοθαηίμο (Delon and Brown 2009). Χζηυζμ, δζαπζζηχζαιε υηζ αοηυ ημ πνυηοπμ μνβάκςζδξ ηςκ ζκζδίςκ ηάζδξ δεκ είκαζ μιμζυιμνθμ ηαζ είιαζηε ζε εέζδ κα πενζβνάρμοιε ηαζ ηζξ εκδζάιεζεξ ηαηαζηάζεζξ μνβάκςζδξ ηςκ ζκζδίςκ αηηίκδξ. Παναηδνήζαιε υηζ ζηδκ πθεζμκυηδηα ηςκ πενζπηχζεςκ, ηα ςμεοθάηζα ειθακίγμοκ ιεβάθδ πμζηζθμιμνθία ςξ πνμξ ημκ πνμζακαημθζζιυ ηςκ ζκζδίςκ αηηίκδξ. Ο πνμζακαημθζζιυξ ηςκ ζκζδίςκ δεκ είκαζ μιμζυιμνθμξ ζε υθα ηα ηφηηανα ηάεε ςμεοθαηίμο. Μάθζζηα, ειθακίγμκηαζ ςμεοθάηζα υπμο ηάπμζεξ μιάδεξ ηοηηάνςκ έπμοκ πάζεζ ηδκ πανάθθδθδ δζεοεέηδζή ημοξ. Δπίζδξ εκημπίζαιε ηαζ εκδζάιεζεξ ηαηαζηάζεζξ ζηδκ πενζζηνμθή ηςκ ζκζδίςκ υπμο ηα ζκίδζα αηηίκδξ ειθακίγμοκ δζεοεέηδζδ αηηζκμεζδή. Πζεακά πνυηεζηαζ βζα ημ ζηάδζμ υπμο ηα παθζά ζκίδζα απμζοβηνμημφκηαζ ηαζ ζοβηνμημφκηαζ κέα. Ζ πανάθθδθδ δζεοεέηδζδ ηςκ ζκζδίςκ 173

185 απμδζμνβακχκεηαζ ηαζ δ ζκχδδξ αηηίκδ ζπδιαηίγεζ έκα δίηηομ ζκζδίςκ πςνίξ ζοβηεηνζιέκμ πνμζακαημθζζιυ (Δηθ.48Α ). ε ηάπμζεξ εέζεζξ ανπίγεζ ζοζζχνεοζδ ζκχδμοξ αηηίκδξ ιε αηηζκμεζδείξ πνμεηαμθέξ ηαζ ηα ζκίδζα αηηίκδξ ανπίγμοκ κα δζεοεεημφκηαζ ζε ποηκέξ δεζιίδεξ (Δηθ.48Β ) ζηα άηνα ηςκ μπμίςκ ζοζζςνεφεηαζ δ ILK (Δηθ.48Γ &Δηθ.48Γ ). Δηθόλα 48: Δλδηάκεζεο δπλακηθέο θαηαζηάζεηο θαηά ηελ αλαδηνξγάλσζε ησλ ηληδίσλ ηάζεο ηεο ηλώδνπο αθηίλεο θαηά ην ζηάδην 10Α. (Α-Α ) Σα ζκίδζα ηάζδξ ζπδιαηίγμοκ θεπηέξ δεζιίδεξ πμο δζαηάζζμκηαζ ηάεεηα ζημκ πνμζεζμ-μπίζεζμ άλμκα ημο ςμεοθαηίμο. (Β-Β ) Ζ πανάθθδθδ δζεοεέηδζδ ηςκ ζκζδίςκ απμδζμνβακχκεηαζ ηαζ δ F-actin ζπδιαηίγεζ έκα δίηηομ ζκζδίςκ πςνίξ ζοβηεηνζιέκμ πνμζακαημθζζιυ, ζε ηάπμζεξ εέζεζξ ανπίγεζ ζοζζχνεοζδ ζκχδμοξ αηηίκδξ ιε αηηζκμεζδείξ πνμεηαμθέξ (ηίηνζκδ ηεθαθή αέθμοξ) ηαζ (Γ-Γ ) Σα ζκίδζα αηηίκδξ ανπίγμοκ κα δζεοεεημφκηαζ ζε ποηκέξ δεζιίδεξ ζηα άηνα ηςκ μπμίςκ ζοζζςνεφεηαζ δ ILK (ηίηνζκδ ηεθαθή αέθμοξ). ηδ ζοκέπεζα, ηαηά ημ ζηάδζμ 10Β, ηα ζκίδζα ηάζδξ ζπδιαηίγμοκ δεζιίδεξ ημπμεεηδιέκεξ αοζηδνά ζε πανάθθδθδ δζάηαλδ (Δηθ.49Α ). Σα ζκίδζα αηηίκδξ ανπίγμοκ κα ημπμεεημφκηαζ ζε μιμζυιμνθεξ δεζιίδεξ, εκχ δ ILK ημπμεεηείηαζ ηονίςξ ζηζξ απμθήλεζξ αοηχκ ηςκ δεζιίδςκ (Δηθ.49Β ). Έπεζηα, αθθάγεζ μ πνμζακαημθζζιυξ ηςκ ζκζδίςκ αηηίκδξ ανπίγμοκ κα πνμαάθθμοκ πνμεηαμθέξ, ζηνέθμκηαξ ηδ βςκία ςξ πνμξ ημκ πνμζεζμ-μπίζεζμ άλμκα (Δηθ.49Γ ) ηαζ δ ΗLK ζοζζςνεφεηαζ ζηζξ άηνεξ ηςκ ζκζδίςκ (Δηθ.49Γ ). 174

186 Ζ πνμζεηηζηή ακάθοζδ ηαζ πενζβναθή ηςκ εκδζάιεζςκ δοκαιζηχκ ηαηαζηάζεςκ ηςκ ζκζδίςκ ηάζδξ ηδξ αηηίκδξ ηαηά ηα ιεζαία ακαπηολζαηά ζηάδζα ιαξ επέηνερακ κα παναηδνήζμοιε ηαζ κα πενζβνάρμοιε ιε πενζζζυηενδ θεπημιένεζα ημ θαζκυηοπμ ηδξ αηηίκδξ πμο εκημπίζαιε ζηα ilk-/- ηφηηανα ζε ςμεοθάηζα ζηαδίςκ 10Α/Β (βι. ππνελνη.ii1α). Δηθόλα 49: Δλδηάκεζεο δπλακηθέο θαηαζηάζεηο θαηά ηελ αλαδηνξγάλσζε ησλ ηληδίσλ ηάζεο ηεο ηλώδνπο αθηίλεο θαηά ηα ζηάδηα 10Β/11. (Α-Α ) Σα ζκίδζα ηάζδξ ζπδιαηίγμοκ δεζιίδεξ ζθζηηά παηεηανζζιέκεξ δ ιζα ημκηά ζηδκ άθθδ, (Β-Β )Σα ζκίδζα αηηίκδξ ειθακίγμκηαζ μιμζυιμνθα παηεηανζζιέκα ζε δεζιίδεξ, δ ILK ημπμεεηείηαζ ηονίςξ ζηζξ απμθήλεζξ αοηχκ ηςκ δεζιίδςκ (ηίηνζκδ ηεθαθή αέθμοξ) ηαζ (Γ-Γ ) ηα ζκίδζα αηηίκδξ ανπίγμοκ κα αθθάγμοκ πνμζακαημθζζιυ πνμαάθθμκηαξ πνμεηαμθέξ, ζηνέθμκηαξ ηδ βςκία ςξ πνμξ ημκ πνμζεζμ-μπίζεζμ άλμκα, δ ΗLK ζοζζςνεφεηαζ ζηζξ άηνεξ ηςκ ζκζδίςκ (ηίηνζκδ ηεθαθή αέθμοξ). i. Φαηλφηππνη αθηίλεο απνπζία ilk Ζ απμοζία ηδξ ILK απυ ηα ακαπηοζζυιεκα εοθαηζμηφηηανα πνμηαθεί ιζα ζεζνά απυ δζαηαναπέξ ζημκ ηοηηανμζηεθεηυ αηηίκδξ. Σζξ ακςιαθίεξ αοηέξ ιπμνμφιε κα ηζξ ηαηδβμνζμπμζήζμοιε ζφιθςκα ιε ημ ακαπηολζαηυ ζηάδζμ ημο ςμεοθαηίμο πμο ειθακίγμκηαζ αθθά ηαζ ηδ εέζδ ιέζα ζηα επζεδθζαηά ηφηηανα ηαηά ημκ αηναζμααζζηυ ημοξ άλμκα. 175

187 (α) ααζζηή ηοηηανζηή πθεονά (1) Γζαηαναπή αηηίκδξ ζε ςμεοθάηζα ιέζμο ακαπηολζαημφ ζηαδίμο (ζη.10) Σμ πνχημ ακαπηολζαηυ ζηάδζμ ηαηά ημ μπμίμ ηα ilk-/- ηφηηανα ειθακίγμοκ δζαηαναπή ζημκ ηοηηανμζηεθεηυ αηηίκδξ είκαζ ημ ζηάδζμ 10. Οζ ακςιαθίεξ αοηέξ παναηδνήεδηακ ηυζμ ζε ilk-/- ηφηηανα βεκεηζηχκ ιςζασηχκ υζμ ηαζ ζε ςμεοθάηζα 24ΒGal4 δζαζςζιέκςκ αηυιςκ (Δηθ.50Γ ). Ζ ειθάκζζδ ημο θαζκμηφπμο ήηακ ηαεμθζηή ζηα ςμεοθάηζα ηςκ δζαζςζιέκςκ αηυιςκ, πζεακά βζαηί μ 24ΒGal4 δεκ εηθνάγεηαζ ζε αοηυ ημ ζηάδζμ, (βι. Δλνη i). ηα ιεηαθθάβιαηα βζα ilk ηα ζκίδζα ηδξ αηηίκδξ πάκμοκ ημκ πνμζακαημθζζιυ ημοξ (ηάεεηα ςξ πνμξ ημκ πνμζεζμμπίζεζμ άλμκα), ειθακίγμκηαζ ζακ έκα «ιπενδειέκμ δίηηομ» ζκζδίςκ, δζαηθαδζγυιεκμ ηαζ πμθθέξ θμνέξ ζπδιαηίγμοκ δμιέξ πμο ιμζάγμοκ ιε «θςθζέξ» βφνς απυ ημκ πονήκα ημο ηοηηάνμο (Δηθ.50Β ). Οζ δμιέξ πμο ζπδιαηίγμοκ ηα ζκίδζα ηάζδξ ηδξ αηηίκδξ ζηα ilk-/- ηφηηανα αοημφ ημο ζηαδίμο ιμζάγμοκ ιε ηζξ εκδζάιεζεξ, πμθφ δοκαιζηέξ ηαηαζηάζεζξ ηςκ ζκζδίςκ ηάζδξ ηδξ αηηίκδξ ζηα ηφηηανα αβνίμο ηφπμο ημο ίδζμο ζηαδίμο. Χζηυζμ, ζοκήεςξ ζημ ίδζμ ςμεοθάηζμ ηα ilk-/- ηφηηανα ανίζημκηαζ ζε άθθμ ζηάδζμ ηδξ δζαδζηαζίαξ ηδξ ακαδζμνβάκςζδξ ζε ζπέζδ ιε ηα οπυθμζπα ηφηηανα αβνίμο ηφπμο. Πζεακά, δ απμοζία ηδξ ILK πνμηαθεί ιζα «ηαεοζηένδζδ» ζηα ζκίδζα ηάζδξ ςξ πνμξ ηδκ ακαδζμνβάκςζή ημοξ απυ ηδ ιζα ηαηάζηαζδ ζηδκ άθθδ. 176

188 Δηθόλα 50: Η ILK είλαη απαξαίηεηε γηα ηελ νξγάλσζε ησ ηληδίσλ ηάζεο ηεο αθηίλεο θαηά ην ζηάδην 10Α/Β. (Α-Α ) ςμεοθάηζμ ζηαδίμο 10 αβνίμο ηφπμο, (Α ) πονήκεξ εοθαηζμηοηηάνςκ, (Α ) ηα ζκίδζα αηηίκδξ δζαηάζζμκηαζ πανάθθδθα ζημκ πνμζεζμ-μπίζεζμ άλμκα), (Β-Β ) ςμεοθάηζμ ζηαδίμο 10, (Β ) ηα ilk-/- ηφηηανα, GFP-, ανζζηενά ηδξ ηίηνζκδξ δζαηεημιιέκδξ βναιιήξ, (Β ) ηα ζκίδζα αηηίκδξ ζηα ηφηηανα πμο απμοζζάγεζ δ ILK (GFP-) πάκμοκ ηδκ πανάθθδθδ δζεοεέηδζδ ηαζ ειθακίγμκηαζ «ιπενδειέκα» ζπδιαηίγμκηαξ «θςθζέξ» (ηίηνζκδ ηεθαθή αέθμοξ), (Γ-Γ ) ςμεοθάηζμ ζηαδίμο 10 «δζαζςζιέκμο» εδθοημφ, (Γ) πονήκεξ εοθαηζμηοηηάνςκ ηαζ (Γ ) ηα ζκίδζα αηηίκδξ ειθακίγμκηαζ «ιπενδειέκα» ζπδιαηίγμκηαξ «θςθζέξ». (2) δζαηαναπή αηηίκδξ ζε ςμεοθάηζα ηεθζηχκ ακαπηολζαηχκ ζηαδίςκ (ζη.11-13) ηα ηεθεοηαία ζηάδζα ηδξ ςμβέκεζδξ, δ απμοζία ηδξ ILK πνμηαθεί δζαηαναπή ζηα ζκίδζα ηάζδξ ηδξ αηηίκδξ. Σα ζκίδζα ζπδιαηίγμκηαζ ηαζ πνμζακαημθίγμκηαζ ζηδκ πθεζμκυηδηα ηςκ πενζπηχζεςκ ηάεεηα ςξ πνμξ ημκ πνμζεζμ-μπίζεζμ άλμκα υπςξ ηαζ ηα ζκίδζα ηςκ εοθαηζμηοηηάνςκ αβνίμο ηφπμο, ζε ακηίεεζδ ιε ηα ιεηαθθάβιαηα βζα ηζξ ζκηεβηνίκεξ (Delon and Brown 2009). Χζηυζμ παναηδνήζαιε έηημπδ εκαπυεεζδ αηηίκδξ ηαηά ιήημξ ηςκ ζκζδίςκ, ιε απμηέθεζια αοηυ κα μδδβεί ζε ζδιακηζηή 177

189 ζοκμθζηή αφλδζδ (22%) ηςκ επζπέδςκ αηηίκδξ ζηδ ααζζηή πθεονά ημο εοθαηζμηοηηάνμο (Δηθ.51Γ). Δπίζδξ, μζ απμζηάζεζξ ιεηαλφ ηςκ βεζημκζηχκ δεζιίδςκ ζκζδίςκ αηηίκδξ είκαζ ιεβαθφηενεξ ζε ζπέζδ ιε αοηέξ ηςκ αβνίμο ηφπμο (Δηθ.51Α ). ηδκ (Δηθ.51Β) απεζημκίγμκηαζ ζπδιαηζηά ηα ζκίδζα ηάζδξ ηδξ αηηίκδξ ηςκ ηεθεοηαίςκ ακαπηολζαηχκ ζηαδίςκ ζε εοθαηζμηφηηανα αβνίμο ηφπμο ηαζ ilk-/- ηφηηανα ακηίζημζπα. Οζ ιέπνζ ηχνα παναηδνήζεζξ δείπκμοκ υηζ δ ILK είκαζ απαναίηδηδ βζα ηδκ μνβάκςζδ ηςκ ζκζδίςκ ηάζδξ ηδξ αηηίκδξ ζηδ ααζζηή πενζμπή ημο επζεδθζαημφ ηοηηάνμο. Δπίζδξ, δ ηαηάζηαζδ ημο ηοηηανμζηεθεημφ αηηίκδξ ζε έκα ηφηηανμ θυβς έθθεζρδξ ηδξ ILK ιπμνεί κα επδνεάζεζ ηδκ μνβάκςζδ ημο ηοηηανμζηεθεημφ ζηα βεζημκζηά ηφηηανα (ιδ αοηυκμιδ ηοηηανζηή δνάζδ), πζεακά θυβς ακάπηολδξ ιδπακζηήξ ηάζδξ ιεηαλφ ηςκ βεζημκζηχκ ηοηηάνςκ ζε έκα ηαπέςξ ακαδζμνβακςκυιεκμ ζζηυ (Conder, Yu et al. 2007). Δηθόλα 51: Η ILK είλαη απαξαίηεηε γηα ηελ νξγάλσζε ησ ηληδίσλ ηάζεο ηεο αθηίλεο θαηά ηα ηειηθά ζηάδηα ηεο σνγέλεζεο. (Α-Α ) ςμεοθάηζμ ζηαδίμο 12, (Α) ηα ilk-/- ηφηηανα, GFP-, ανζζηενά ηδξ ηίηνζκδξ δζαηεημιιέκδξ βναιιήξ, (Α ) ηα ζκίδζα αηηίκδξ ζηα ηφηηανα πμο απμοζζάγεζ δ ILK (GFP) ειθακίγμοκ έηημπδ ζοζζχνεοζδ αηηίκδξ ηαηά ιήημοξ ημο ζκζδίμο (ηίηνζκδ ηεθαθή αέθμοξ), (Α ) πονήκεξ εοθαηζμηοηηάνςκ, (Β) ζπδιαηζηή απεζηυκζζδ ηδξ δζαηαναπήξ ηδξ ζκχδμοξ αηηίκδξ θυβς απμοζίαξ ηδξ ILK ζε ζπέζδ ιε ηα ζκίδζα ηάζδξ αβνίμο ηφπμο, ζηα ilk-/- ηφηηανα ηα ζκίδζα αηηίκδξ θαίκμκηαζ πζμ ποηκά ιε έηημπδ απυεεζδ αηηίκδξ ηαηά ιήημξ ημο ζκζδίμο, ιεβαθφηενεξ απμζηάζεζξ ακάιεζα ζηζξ βεζημκζηέξ δεζιίδεξ ζκζδίςκ ηαζ πενζθενζηά ημο ηθχκμο ζοζζχνεοζδ αηηίκδξ, (Γ) 178

190 Πμζμηζημπμίδζδ ηδξ αηηίκδξ ηςκ ζκζδίςκ ηάζδξ ηςκ ilk-/- ηοηηάνςκ ζε ζπέζδ ιε ηφηηανα αβνίμο ηφπμο, 22% αφλδζδ ηςκ ζοκμθζηχκ επζπέδςκ ηδξ ααζζηήξ αηηίκδξ ζηα ilk-/- ηφηηανα, P=1,1*10-2 (<0,05) (Student s t-test, δομ μιάδςκ, ζοιπεναίκμκηαξ ίζδ δζαηφιακζδ). ηδ ζοκέπεζα, ακαθφζαιε ημ θαζκυηοπμ ηδξ αηηίκδξ ζε ςμεοθάηζα ηεθεοηαίςκ ζηαδίςκ δζαζςζιέκςκ αηυιςκ. Σα ανπζηά πεζνάιαηά ιαξ έδεζπκακ δναιαηζηή ιείςζδ ηςκ επζπέδςκ αηηίκδξ ζηδ ααζζηή πθεονά ηςκ ηοηηάνςκ (Δηθ.52Β). Χζηυζμ, υηακ αθθάλαιε ηζξ ζοκεήηεξ ιμκζιμπμίδζδξ ημο ζζημφ, πνδζζιμπμζχκηαξ 8% παναθμθιαδετδδ, ηαηαθέναιε ιε αοηυκ ημκ ηνυπμ κα δζαηδνήζμοιε ηα ζκίδζα αηηίκδξ. Αοηυ ημ απμηέθεζια οπμδδθχκεζ υηζ μζ δμιέξ αοηέξ βίκμκηαζ πζμ αζηαεείξ ηαζ πζμ εοαίζεδηεξ απμοζία ηδξ ΗLK, παναηήνδζδ πμο ένπεηαζ ζε ζοιθςκία ιε ακηίζημζπδ ιεθέηδ βζα ημοξ ιζηνμζςθδκίζημοξ ζηα εοθαηζμηφηηανα. Ζ απμοζία ηδξ πνςηεΐκδξ PAR-1 μδδβεί ζε πζμ αζηαεέξ δίηηομ ιζηνμζςθδκίζηςκ (Doerflinger, Benton et al. 2003). ε αοηέξ ηζξ ζοκεήηεξ ιμκζιμπμίδζδξ παναηδνήζαιε υηζ ειθακίγμκηαζ πενζμπέξ επζεδθζαηχκ ηοηηάνςκ ιε θαζκυηοπμ αηηίκδξ υιμζμ ιε αοηυ ηςκ ηοηηάνςκ ηθχκςκ βζα ilk (Δηθ.52Γ&Δηθ.52Δ). Σμ βεβμκυξ υηζ δ δζαηαναπή αοηή ηςκ ζκζδίςκ αηηίκδξ δεκ είκαζ ηαεμθζηή πζεακά είκαζ ζοκέπεζα ηδξ δζαθοβμφζαξ έηθναζδξ ημο 24ΒGal4 ζε αοηά ηα ακαπηολζαηά ζηάδζα (βι. Δλνη i, Δηθ.39Γ ). Δηθόλα 52: Σα ηλίδηα ηάζεο αθηίλεο ησλ δηαζσζκέλσλ αηόκσλ εκθαλίδνπλ ηελ ίδηα δηαηαξαρή κε ηα ilk-/- θύηηαξα θιώλνπο. (Α) ζκίδζα ηάζδξ ςμεοθαηίμο ζηαδίμο 12 αβνίμο ηφπμο, (Β) ζκίδζα αηηίκδξ ςμεοθαηίμο ζηαδίμο 12 δζαζςζιέκμο άημια, ζδιακηζηά ιεζςιέκα επίπεδα αηηίκδξ ηαζ ζοζζχνεοζδ 179

191 πενζθενζηά ηδξ αηηίκδξ (ιμκζιμπμίδζδ ιε 4% παναθμθιαδετδδ), (Γ) ζκίδζα αηηίκδξ ςμεοθαηίμο ζηαδίμο 12 δζαζςζιέκμο άημια, δ αηηίκδ ειθακίγεηαζ θοζζμθμβζηή (ιμκζιμπμίδζδ ιε 8% παναθμθιαδετδδ), (Γ) ζκίδζα αηηίκδξ ςμεοθαηίμο ζηαδίμο 12 δζαζςζιέκμο άημια, ηα ζκίδζα αηηίκδξ ειθακίγμκηαζ αζοκεπή (ιμκζιμπμίδζδ ιε 8% παναθμθιαδετδδ) ηαζ (Δ) ζκίδζα αηηίκδξ ςμεοθαηίμο ζηαδίμο 12, (ilk-/- ηφηηανα δελζά ηαζ πάκς απυ ηδκ ηίηνζκδ δζαηεημιιέκδξ βναιιή) ηα ζκίδζα αηηίκδξ είκαζ αζοκεπή ιε έηημπδ εκαπυεεζδ αηηίκδξ ηαηά ιήημξ ημοξ (ιμκζιμπμίδζδ ιε 4% παναθμθιαδετδδ). (α) πθεονζηή πενζμπή ημο ηοηηάνμο Δπίζδξ, ιεθεηήζαιε ημκ ηοηηανμζηεθεηυ αηηίκδξ ηαηά ημκ αηναζμ-ααζζηυ άλμκα ηςκ ηοηηάνςκ. Σα επίπεδα αηηίκδξ είκαζ δναιαηζηά ιεζςιέκα έςξ ιδ ακζπκεφζζια (Δηθ.53Α&Δηθ.53Β), εκχ ζηδκ αηναία πενζμπή ηςκ ηοηηάνςκ παναηδνήζαιε άκανπδ δζεοεέηδζδ ηδξ αηηίκδξ. ηζξ πενζζζυηενεξ πενζπηχζεζξ μ ηθχκμξ ηςκ ηοηηάνςκ πενζαάθθεηαζ ζηδκ αηναία πενζμπή απυ έκα «ζηεθάκζ» πθμφζζμ ζε αηηίκδ (Δηθ.53Γ). ηδκ (Δηθ.53Β) απεζημκίγμκηαζ ζπδιαηζηά ημ πενζθενζηυ δίηηομ αηηίκδξ ηςκ ηεθεοηαίςκ ακαπηολζαηχκ ζηαδίςκ ζε εοθαηζμηφηηανα αβνίμο ηφπμο ηαζ ilk-/- ηφηηανα ακηίζημζπα. Δηθόλα 53: Γηαηαξαρή ηνπ θπηηαξνζθειεηνύ αθηίλεο θαηά ηνλ αθξαην-βαζηθό άμνλα ηνπ θπηηάξνπ απνπζία ILK. (A-Γ) δναιαηζηή ιείςζδ ηςκ επζπέδςκ ηδξ αηηίκδξ ζηδκ πενζθένεζα ημο ηοηηάνμο (ilk-/- ηφηηανα ανζζηενά ηδξ ηίηνζκδξ δζαηεημιιέκδξ βναιιήξ), (Γ) ακχιαθδ δζεοεέηδζδ ημο δζηηφμο αηηίκδξ ζηδκ ημνοθαία πθεονά ημο ηοηηάνμο ηαζ (Γ) ζπδιαηζηή απεζηυκζζδ ηδξ δζαηαναπήξ ηδξ πενζθενζηήξ αηηίκδξ θυβς απμοζίαξ ηδξ ILK ζε ζπέζδ ιε ηα ζκίδζα ηάζδξ αβνίμο ηφπμο, δ 180

192 πενζθενζηή αηηίκδ ιεζχκεηαζ δναιαηζηά ηαζ ζε ηάπμζεξ πενζπηχζεζξ μ ηθχκμξ πενζαάθθεηαζ απυ έκα «ζηεθάκζ» αηηίκδξ. ii. Φαηλφηππνη κηθξνζσιελίζθσλ απνπζία ilk ηδ ζοκέπεζα, εεθήζαιε κα ενεοκήζμοιε ηδκ οπυεεζδ ακ δ ILK έπεζ επίδναζδ πένα απυ ημκ ηοηηανμζηεθεηυ αηηίκδξ ηαζ ζημ δίηηομ ηςκ ιζηνμζςθδκίζηςκ ημο ηοηηάνμο. Γζα ημ ζημπυ αοηυ πνδζζιμπμζήζαιε δομ ακηζζχιαηα. Σμ έκα ακζπκεφεζ ηδκ αηεηοθζςιέκδ ιμνθή ηδξ α-ημοιπμοθίκδξ ηαζ ημ άθθμ ηδ α-ημοιπμοθίκδ. Υνδζζιμπμζχκηαξ ηαζ ηα δομ αοηά ακηζζχιαηα έπμοιε ηδ δοκαηυηδηα κα εθέβλμοιε ηδκ δζαηαναπή πμο πνμηαθεί δ απμοζία ηδξ ILK ηυζμ ζηα ζηαεενά ζκίδζα ηςκ ιζηνμζςθδκίζηςκ (αηεηοθζςιέκδ α-ημοιπμοθίκδ), υζμ ηαζ ηδ δζαηαναπή ζημ ζφκμθμ ημο δζηηφμο ηςκ ιζηνμζςθδκίζηςκ ηα δοκαιζηά ηαζ ζηαεενά ζκίδζα ηςκ ιζηνμζςθδκίζηςκ (α-ημοιπμοθίκδ). Πνάβιαηζ ζηζξ πενζζζυηενεξ πενζπηχζεζξ ηςκ ηθχκςκ, πνδζζιμπμζχκηαξ ηαζ ηα δφμ ακηζζχιαηα βζα ημοιπμοθίκδ, ημ πμζυ ηςκ ιζηνμζςθδκίζηςκ είκαζ ζαθχξ ιεζςιέκμ έςξ ηαζ ιδ ακζπκεφζζιμ (Δηθ.54Β). Μάθζζηα, ζηα ςμεοθάηζα ηεθεοηαίμο ζηαδίμο ημ θαζκυιεκμ είκαζ πζμ έκημκμ ζε ζπέζδ ιε ςμεοθάηζα ιέζμο ζηαδίμο. ηδκ πθεζμκυηδηα ηςκ πενζπηχζεςκ μζ ιζηνμζςθδκίζημζ είκαζ ιδ ακζπκεφζζιμζ ζηα ηεθεοηαία ακαπηολζαηά ζηάδζα, εκχ ζηα εοθαηζμηφηηανα ιέζμο ζηαδίμο ηα επίπεδα ηδξ ημοιπμοθίκδξ είκαζ ζαθχξ ιεζςιέκα αθθά αηυιδ ημ δίηηομ ηςκ ιζηνμζςθδκίζηςκ δεκ έπεζ ηαηαννεφζεζ. Αοηυ πζεακά οπμδδθχκεζ υηζ δ ILK ζοιιεηέπεζ ιάθθμκ ζηδ δζαηήνδζδ ημο δζηηφμο ηςκ ιζηνμζςθδκίζηςκ ηαζ υπζ ζηδκ μνβάκςζή ημο. Δηθόλα 54: Σν δίθηπν κηθξνζσιελίζθσλ κεηώλεηαη δξακαηηθά ιόγσ απνπζίαο ηεο ILK. (B) ημ δίηηομ ηςκ ιζηνμζςθδκίζηςκ ζπεδυκ απμοζζάγεζ απυ ηα ilk-/- ηφηηανα, (Γ) δ dpak είκαζ ιεζςιέκδ ζηα ηφηηανα ηθχκμοξ ηαζ (Γ) πονήκεξ εοθαηζμηοηηάνςκ ζηαδίμο 12, (ilk-/- ηφηηανα ανζζηενά ηδξ ηίηνζκδξ δζαηεημιιέκδξ βναιιήξ). Σα απμηεθέζιαηά ιαξ, πνμηείκμοκ υηζ δ ILK είκαζ έκα ζοζηαηζηυ-ηθεζδί βζα ηδ νφειζζδ ηδξ μνβάκςζδξ ηαζ ηδξ μιμζυζηαζδξ ηδξ αηηίκδξ. Γζα ημ θυβμ αοηυ ημ ηεθεοηαίμ ιένμξ ηδξ δζδαηημνζηήξ ιμο δζαηνζαήξ επζηεκηνχεδηε ζηδκ εηηέθεζδ 181

193 πεζναιάηςκ ακμζμθεμνζζιμφ ηαζ βεκεηζηχκ πεζναιάηςκ ηα μπμία ακέδεζλακ ημ ιδπακζζιυ ιέζς ημο μπμίμο δ ILK νοειίγεζ ηδκ μνβάκςζδ ηα ηδκ αηεναζυηδηα ηδξ δμιήξ ηςκ ζκζδίςκ ηάζδξ ηδξ αηηίκδξ Η ILK είλαη απαξαίηεηε γηα ηε δηαηήξεζε ηεο νκνηφζηαζεο ηνπ ηληεγθξηλνεμαξηψκελνπ κεραληζκνχ θπηηαξηθήο πξνζθφιιεζεο Ανπζηά, εθέβλαιε ημκ εκημπζζιυ ηδξ οπμιμκάδαξ αps ηςκ ζκηεβηνζκχκ ζε ιεηαθθαβιέκα ηφηηανα βζα ηδκ ILK. Ζ αps είκαζ δ ιμκαδζηή α οπμιμκάδα πμο εηθνάγεηαζ ζημ ςμεοθάηζμ ιε απμηέθεζια κα απμηεθεί ηαζ απαναίηδηδ δμιζηή ιμκάδα βζα ηδ δδιζμονβία ημο εηενμδζιενμφξ ηςκ ζκηεβηνζκχκ ζηα ςμεοθάηζα (Dinkins, Fratto et al. 2008). Οζ ζκηεβηνίκεξ είκαζ βκςζηυ υηζ εκημπίγμκηαζ ζηζξ ζοκδέζεζξ ηδξ ααζζηήξ πενζμπήξ ημο ηοηηάνμο ιε ημκ ελςηοηηάνζμ πχνμ, αθθά ηαζ ζηζξ πθεονζηέξ ζοκδέζεζξ ηςκ ηοηηάνςκ ημο εοθαηχδμοξ επζεδθίμο (Fernandez- Minan, Martin-Bermudo et al. 2007). Οζ ζκηεβηνίκεξ δεκ επδνεάγμκηαζ απυ ηδκ έθθεζρδ ILK ζημ ηφηηανμ ζηα ςμεοθάηζα ακαπηολζαηχκ ζηαδίςκ ιέπνζ ηαζ ζηαδίμο 9, ηυζμ ηα επίπεδα έηθναζδξ υζμ ηαζ μ οπμηοηηανζηυξ εκημπζζιυξ ημοξ είκαζ ακάθμβμξ ημο αβνίμο ηφπμο. ηα ςμεοθάηζα, ςζηυζμ ηεθεοηαίςκ ζηαδίςκ (ζη.11-13) μζ ζκηεβηνίκεξ, παναιέκμοκ ζημ ηοηηανυπθαζια ηαζ δεκ εκημπίγμκηαζ ζηα άηνα ηςκ ζκζδίςκ (Δηθ.55Α ). Ζ παναπάκς παναηήνδζδ επζαεααζχεδηε υηακ εθέβλαιε ηαζ ηςκ εκημπζζιυ ηδξ aps2 οπμιμκάδαξ ζκηεβηνζκχκ, ηδξ ηονίανπδξ α οπμιμκάδαξ ζηα εοθαηζμηφηηανα ηςκ ηεθζηχκ ακαπηολζαηχκ ζηαδίςκ (Delon and Brown 2009). Πνάβιαηζ, δ aps2 ιέκεζ ζημ ηοηηανυπθαζια ζε ακηίεεζδ ιε ηα εοθαηζμηφηηανα αβνίμο ηφπμο πμο ημπμεεηείηαζ ζηα άηνα ηςκ ζκζδίςκ ηάζδξ (Δηθ.55Β ). Πζμ ζοβηεηνζιέκα, υζμ πζμ ζζπονυξ είκαζ μ θαζκυηοπμξ ηδξ αηηίκδξ (ζε ιεηαθθάβιαηα ηζ αβνίμο ηφπμο ηφηηανα) ηυζμ ιεβαθφηενδ είκαζ ηαζ δ ιείςζδ ημο πμζμφ ηδξ αps οπμιμκάδαξ πμο ακζπκεφμοιε ζηα άηνα ηςκ ζκζδίςκ ηάζδξ ηδξ αηηίκδξ. Δπμιέκςξ ιπμνμφιε κα μδδβδεμφιε ζηδκ οπυεεζδ υηζ δ επίδναζδ ηδξ ILK είκαζ ιδ-αοηυκμιδ ηυζμ ζηδκ μνβάκςζδ ημο ηοηηανμζηεθεημφ ηδξ αηηίκδξ υζμ ηαζ ζηδκ πενίπηςζδ ηςκ ζκηεβηνζκχκ. 182

194 Δηθόλα 55: Η απνπζία ηεο ILK απνδπλακώλεη ηελ ηθαλόηεηα εληνπηζκνύ ησλ ηληεγθξηλώλ ζηα άθξα ησλ ηληδίσλ ηάζεο. (Α ) δ αps οπμιμκάδα ηςκ ζκηεβηνζκχκ παναιέκεζ ηοηηανμπθαζιαηζηή, (Α ) (ηα GFP- ηφηηανα είκαζ ilk-/- ηφηηανα ανζζηενά ηδξ ηίηνζκδξ δζαηεημιιέκδξ βναιιήξ, ηυζμ δ aps2 (Β ) υζμ ηαζ αps (Β ) οπμιμκάδεξ ηςκ ζκηεβηνζκχκ παναιέκμοκ ζημ ηοηηανυπθαζια ηαζ (Β ) πονήκεξ ηοηηάνςκ, (ηα GFP- ηφηηανα είκαζ ηα ilk-/- ηφηηανα δελζά ηδξ ηίηνζκδξ δζαηεημιιέκδξ βναιιήξ). Ζ επίδναζδ ηδξ ILK ζημκ εκημπζζιυ ηςκ ζκηεβηνζκχκ εκζζπφεδηε απυ ηα ακηίζημζπα πεζνάιαηα πμο έβζκακ ζε εοθαηζμηφηηανα ηεθεοηαίςκ ζηαδίςκ δζαζςζιέκςκ εδθοηχκ ιε μδδβυ ημ 24ΒGal4. ηζξ πενζπηχζεζξ πμο ηα εοθαηζμηφηηανα ειθάκζγακ ημ παναηηδνζζηζηυ θαζκυηοπμ ηδξ αηηίκδξ θυβς ηδξ απμοζίαξ ηδξ ILK, πάκηα μζ ζκηεβηνίκεξ είπακ πάζεζ ηδκ ημπμεέηδζή ημοξ ηαζ ζοζζςνεφμκηακ ζημ ηοηηανυπθαζια (Δηθ.56Β). Χζηυζμ, ζδιεζχεδηακ ηαζ πενζπηχζεζξ εοθαηζμηοηηάνςκ, ζηα μπμία ηυζμ ηα ζκίδζα αηηίκδξ υζμ ηαζ μ εκημπζζιυξ ηςκ ζκηεβηνζκχκ ήηακ θοζζμθμβζηά (Δηθ.56Γ &Δηθ.56Γ ). Αοηυ πζεακά, μθείθεηαζ ζημ βεβμκυξ υηζ μ 24ΒGal4 έπεζ δζαθοβμφζα έηθναζδ ημο ςμεοθαηζαηυ επζεήθζμ ηαηά ηα ηεθεοηαία ακαπηολζαηά ζηάδζα (βι. Δλνη i, Δηθ.39Γ ). 183

195 Δηθόλα 56: Η απνπζία ηεο ILK απνδπλακώλεη ηελ ηθαλόηεηα εληνπηζκνύ ησλ ηληεγθξηλώλ ζηα άθξα ησλ ηληδίσλ ηάζεο θαη ζηα ζπιαθηνθύηηαξα ησλ δηαζσζκέλσλ αηόκσλ. (Α) ηα GFPηφηηανα είκαζ ηα ilk-/- ηφηηανα, (Α ) δ αps οπμιμκάδα ηςκ ζκηεβηνζκχκ παναιέκεζ ηοηηανμπθαζιαηζηή, (Α ) ζκίδζα ηάζδξ ζηα ηφηηανα ilk-/- (GFP-) δζαηαναβιέκα (Β-Β ) ςμεοθάηζμ ζηαδίμο 13 δζαζςζιέκμο αηυιμο (Β ) μζ ζκηεβηνίκεξ παναιέκμοκ ηοηηανμπθαζιαηζηέξ, (Β ) ζκίδζα αηηίκδξ δζαηαναβιέκα, (Β) πονήκεξ ηοηηάνςκ (Γ-Γ ) ςμεοθάηζμ ζηαδίμο 13 δζαζςζιέκμο αηυιμο, (Γ ) μζ ζκηεβηνίκεξ εκημπίγμκηαζ ζηα άηνα ηςκ ζκζδίςκ ηάζδξ, (Γ ) ζκίδζα αηηίκδξ θοζζμθμβζηά, ηαζ (Γ ) πονήκεξ ηοηηάνςκ. Έηζζ, αθμφ δζαπζζηχζαιε υηζ δ απμοζία ηδξ ILK έπεζ επίδναζδ ζημκ εκημπζζιυ ηςκ ζκηεβηνζκχκ ηαζ ηαη επέηηαζδ ζηδ δζαηήνδζδ ηςκ ζκηεβηνζκζηχκ ζοκδέζεςκ, εεθήζαιε κα ενεοκήζμοιε ακ επδνεάγεηαζ ηαζ δ talin απυ ηδκ απμοζία ηδξ ILK. Πνάβιαηζ, δ απμοζία ηδξ ILK έπεζ ακηίζημζπμ απμηέθεζια ιε αοηυ ηςκ ζκηεβηνζκχκ, ηδ ιεζςιέκδ ζηακυηδηα ηδξ talin κα ανίζηεηαζ ζηα άηνα ηςκ ζκζδίςκ ηάζδξ (Δηθ.57). Δηθόλα 57: Η ILK είλαη απαξαίηεηε γηα ηνλ εληνπηζκό ηεο talin ζηα άθξα ησλ ηληδίσλ ηάζεο. ηα ilk-/- θύηηαξα πεξηθιείνληαη κέζα ζηηο δηαθεθνκκέλεο γξακκέο, (Β) δ Talin δεκ εκημπίγεηαζ 184

196 απμηεθεζιαηζηά ζηα άηνα ηςκ ζκζδίςκ αηηίκδξ, (Γ) ζκίδζα ηάζδξ ζηα ηφηηανα ilk-/- δζαηαναβιέκα ηαζ (Γ) πονήκεξ ηοηηάνςκ. Δπίζδξ, εεθήζαιε κα εθέβλμοιε ακ δ ILK επδνεάγεζ ημκ εκημπζζιυ ηαζ ηα επίπεδα πνςηεσκχκ ηυζμ ημο ελςηοηηάνζμο οθζημφ υζμ ηαζ ζοζηαηζηχκ ηδξ ααζζηήξ ιειανάκδξ. Ζ θαιζκίκδ Α είκαζ ζοζηαηζηυ ημο ελςηοηηάνζμο οθζημφ ηαζ πνμζδέηδξ ηδξ aps2 οπμιμκάδαξ ηςκ ζκηεβηνζκχκ. Δπίζδξ είκαζ βκςζηυ υηζ ζε άθθα ιεηαθθάβιαηα πμο ημ ιμνζαηυ ιμκμπάηζ ηδξ ηοηηανζηήξ πνμζηυθθδζδξ ζηδ ααζζηή πθεονά ημο εοθαηζμηοηηάνμο είκαζ δζαηαναβιέκμ ηυζμ δ θαιζκίκδ Α (Bateman, Reddy et al. 2001) υζμ ηαζ ημ ημθθαβυκμ δζαηανάζζμκηαζ. Αηυιδ πνυζθαηδ ενβαζία ζοκδέεζ ημ ζηνμββοθειέκμ ιμνθμθμβζηά χνζιμ αοβυ ιε δζαηάναλδ ημο ζκηεβηνζκμελανηχιεκμ ιμνζαημφ ιδπακζζιμφ (Haigo and Bilder 2011). Γζα ημ θυβμ αοηυ παναηδνήζαιε ιε εκδζαθένμκ υηζ ημ ελςηοηηάνζμ οθζηυ είκαζ δζαηαναβιέκμ ιυκμ υηακ μζ ζκηεβηνίκεξ έπμοκ πάζεζ ηδ ζςζηή ημπμεέηδζή ημοξ ζηα άηνα ηςκ ζκζδίςκ ηάζδξ ηδξ αηηίκδξ. Πζμ ζοβηεηνζιέκα δ θαιζκίκδ Α ειθακίγεηαζ κα ηαθφπηεζ υθδ ηδκ ααζζηή επζθάκεζα ημο ηοηηάνμο ηαζ ηα επίπεδά ηδξ κα είκαζ ακεααζιέκα (Δηθ.58Α ). Ακηίεεηα δ ααζζηή ιειανάκδ δε θαίκεηαζ κα επδνεάγεηαζ απυ ηδ θακεαζιέκδ ημπμεέηδζδ ηςκ ζκηεβηνζκχκ θυβς απμοζίαξ ηδξ ILK. To ημθθαβυκμ ζπδιαηίγεζ ηζξ παναηηδνζζηζηέξ ζκχδεζξ νάβεξ πμο πενζαάθθμοκ ημ ακαπηοζζυιεκμ ςμεοθάηζμ (Δηθ.58Β ) (Haigo and Bilder 2011). 185

197 Δηθόλα 58: Η απνπζία ησλ ηληεγθξηλώλ από ηηο ζσζηέο ζέζεηο εληνπηζκνύ νδεγεί ζε δηαηάξαμε ηεο νκνηόζηαζεο ηνπ εμσθπηηάξηνπ πιηθνύ αιιά όρη ηεο βαζηθήο κεκβξάλεο. (Α ) δ θαιζκίκδ εκημπίγεηαζ ζε υθδ ηδκ επζθάκεζα ηδξ ααζζηήξ πθεονάξ ημο ηοηηάνμο, (Α ) μζ ζκηεβηνίκεξ παναιέκμοκ ζημ ηοηηανυπθαζια, (Α ) πονήκεξ εοθαηζμηοηηάνςκ ζηαδίμο 12, (ilk-/- ηφηηανα δελζά ηδξ ηίηνζκδξ δζαηεημιιέκδξ βναιιήξ), (Β) πονήκεξ εοθαηζμηοηηάνςκ ζηαδίμο 12 (DAPI), (ilk-/- ηφηηανα ανζζηενά ηδξ ηίηνζκδξ δζαηεημιιέκδξ βναιιήξ, GFP-), (Β ) ημ ημθθαβυκμ ( ζοζηαηζηυ ηδξ ααζζηήξ ιειανάκδξ) εκημπίγεηαζ ζηζξ ζςζηέξ εέζεζξ, ιε ζκχδδ ιμνθή (ηεθαθή ηυηηζκμο αέθμοξ) (Β ) ηα ζκίδζα ηδξ αηηίκδξ είκαζ δζαηαναβιέκα ηαζ (Β ) μζ ζκηεβηνίκεξ παναιέκμοκ ζημ ηοηηανυπθαζια Δπίδξαζε ηεο απνπζίαο ilk ζηε δηαηήξεζε ησλ θπηηαξηθψλ ζπλδέζεσλ θαηά ηνλ αθξαην-βαζηθν άμνλα ηνπ ζπιαθηνθπηηάξνπ Πανάθθδθα, εθέβλαιε ηζξ πζεακέξ επζπηχζεζξ πμο ιπμνεί κα έπεζ δ απμοζία ηδξ ILK ηαζ ζημοξ οπυθμζπμοξ ηφπμοξ ηοηηανζηχκ ζοκδέζεςκ: ζημοξ δζαθναβιαημζφκδεζιμοξ (septate junctions) ηαζ ηζξ ζοκδέζεζξ γχκδξ (jonula junctions) πνδζζιμπμζχκηαξ ςξ δείηηεξ ημ Discs large (Dlg) ηαζ ηδ ηαδενίκδ (DEcadherin) ακηίζημζπα. Σα απμηεθέζιαηά ιαξ οπμδδθχκμοκ, υηζ μζ δζαθναβιαηζηέξ ζοκδέζεζξ (septate junctions) δζαηανάζζμκηαζ απμοζία ηδξ ILK, ζε ακηίεεζδ ιε ηζξ ζοκδέζεζξ γχκδξ πμο 186

198 δεκ επδνεάγμκηαζ απυ ηδκ απμοζία ηδξ ILK. Πζμ ζοβηεηνζιέκα, ζε ilk-/- ηφηηανα ηα επίπεδα ημο Dlg είκαζ δναζηζηά ιεζςιέκα έςξ ιδ ακζπκεφζζια, αηυιδ ηαζ ζε ηθχκμοξ ημο εκυξ ηοηηάνμο (Δηθ.59Α ). Ακηίεεηα, μ εκημπζζιυξ ηαζ ηα επίπεδα ηδξ ηαδενίκδξ είκαζ ακηίζημζπα ιε ηα ηφηηανα αβνίμο ηφπμο (Δηθ.60Β). Δηθόλα 59: H ILK είλαη απαξαίηεηε γηα ηε δηαηήξεζε ηεο νκνηόζηαζεο ησλ δηαθξαγκαηηθώλ ζπλδέζεσλ. (Α ) ηα επίπεδα ηδξ πνςηεΐκδξ Dlg είκαζ δναιαηζηά ιεζςιέκα ςξ ιδ ακζπκεφζζια (ιςα εοεφβναιιμ ηιήια) ζηα ilk-/- ηφηηανα (πενζηθείμκηαζ ζηα ηίηνζκα πθαίζζα), (A ) πονήκεξ εοθαηζμηοηηάνςκ ζηαδίμο 11. Δηθόλα 60: Η ILK δελ επεξξεάδεη ηελ νξγάλσζε/δηαηήξεζε ησλ θπηηαξηθώλ ζπλδέζεσλ δώλεο. (Β) ηα επίπεδα ηδξ πνςηεΐκδξ ηαδενίκδξ είκαζ ακεπδνέαζηα ζηα ilk-/- ηφηηανα (ηίηνζκμ πθαίζζμ), (Γ) πονήκεξ εοθαηζμηοηηάνςκ ζηαδίμο 12. ηδκ αηναία υζμ ηαζ ηδ ααζμπθεονζηή ηοηηανζηή πενζμπή ηδξ ιειανάκδξ δ ηαδενίκδ είκαζ θοζζμθμβζηή (Δηθ.61Α ), εκχ ζηζξ ίδζεξ εέζεζξ μζ ζκηεβηνίκεξ είκαζ δζαηαναβιέκεξ (Δηθ.61Β ). Αοηυ οπμδδθχκεζ υηζ δ απμοζία ηδξ ILK δεκ πνμηαθεί ηάπμζα ακςιαθία ζημ ζοβηεηνζιέκμ δζαιένζζια ηδξ ιειανάκδξ αθθά είκαζ άιεζα οπεφεοκδ βζα ημκ εκημπζζιυ ηςκ ζκηεβηνζκχκ ηαζ ημο Dlg αθθά υπζ βζα ηδξ ηαδενίκδξ. 187

199 Δηθόλα 61: Η ILK δελ επεξξεάδεη ηελ νξγάλσζε/δηαηήξεζε ησλ θπηηαξηθώλ ζπλδέζεσλ δώλεο. (Α ) νη ηληεγθξίλεο παξακέλνπλ ζην θπηηαξόπιαζκα, (Α ) δ ηαδενίκδ ( πνςηεΐκδ ιάνηοναξ βζα ηζξ ζοκδέζεζξ γχκδξ) πμο εκημπίγεηαζ ζηδ ααζζηή πθεονά ημο ηοηηάνμο ειθακίγμκηαζ εθαθνχξ δζαηαναβιέκεξ, (Α ) GFP-, ilk-/- ηφηηανα δελζά ηδξ ηίηνζκδξ δζαηεημιιέκδξ βναιιήξ), (Β ) μζ ζκηεβηνίκεξ δεκ εκημπίγμκηαζ ζε αοηυ ημ ιειανακζηυ δζαιένζζια, (Β ) δ ηαδενίκδ εκημπίγεηαζ ζηδκ αηναία πθεονά ημο ηοηηάνμο, ηαζ (Β ) GFP-, ilk-/- ηφηηανα δελζά ηδξ ηίηνζκδξ δζαηεημιιέκδξ βναιιήξ. Σέθμξ, παναηδνήζαιε υηζ δ δζαηάναλδ ζηζξ πνςηεΐκεξ ιάνηονεξ βζα ηδκ μιμζυζηαζδ ηςκ ααζμπθεονζηχκ ηοηηανζηχκ ζοκδέζεςκ ζοκμδεφεηαζ απυ δζαηάναλδ ημο ηοηηανμζηεθεημφ αηηίκδξ. Σα επίπεδα ημο Dlg ειθακίγμκηαζ ζαθχξ ιεζςιέκα ή δεκ είκαζ δοκαηυξ μ εκημπζζιυξ ημο (Δηθ.62Γ &Δηθ.62Γ ) ζε ιεηαθθαβιέκα ηφηηανα, υπμο ημ πενζθενζηυ δίηηομ αηηίκδξ είκαζ δναιαηζηά ιεζςιέκμ ηαηά ιήημξ ημο αηναζμ-ααζζημφ ηοηηανζημφ άλμκα ηςκ εοθαηζμηοηηάνςκ (Δηθ.62Γ & Δηθ.62Γ ). Ακηίζημζπα πάκηα μ θαζκυηοπμξ ηςκ ζκηεβηνζκχκ (Δηθ.62Α & Δηθ.62Β ) ζοκμδεφεηαζ ηαζ ιε δζαηαναπή ηδξ πενζθενζηήξ αηηίκδξ (Δηθ.62Α & Δηθ.62Β ). 188

200 Δηθόλα 62: Η δηαηαξαρή ηνπ θπηηαξνζθειεηνύ αθηίλεο ζρεηίδεηαη κε ηελ αλώκαιε νξγάλσζε ησλ βαζνπιεπξηθώλ θπηηαξηθώλ ζπλδέζεσλ. (Α ) πονήκεξ εοθαηζμηοηηάνςκ ζηαδίμο 13 (ilk-/- ηφηηανα, GFP-, ανζζηενά ηδξ ηίηνζκδξ βναιιήξ), (Α ) ζκίδζα ηάζδξ δζαηαναβιέκα ζημκ ηθχκμ, (Α ) μζ ζκηεβηνίκεξ ηοηηανμπθαζιαηζηέξ, (B ) πονήκεξ εοθαηζμηοηηάνςκ ζηαδίμο 13 (ilk-/- ηφηηανα, GFP-, ανζζηενά ηδξ ηίηνζκδξ βναιιήξ), (B ) πενζθενζηή αηηίκδ δζαηαναβιέκδ, (Β ) μζ ζκηεβηνίκεξ ηοηηανμπθαζιαηζηέξ, (Γ ) πονήκεξ εοθαηζμηοηηάνςκ ζηαδίμο 13 (ilk-/- ηφηηανα, GFP-, ανζζηενά ηδξ ηίηνζκδξ βναιιήξ), (Γ ) ζκίδζα ηάζδξ δζαηαναβιέκα ζημκ ηθχκμ, (Γ ) Dlg δναιαηζηά ιεζςιέκα επίπεδα, (Γ ) πονήκεξ εοθαηζμηοηηάνςκ ζηαδίμο 13 (ilk-/- ηφηηανα, GFP-, ανζζηενά ηδξ ηίηνζκδξ βναιιήξ, (Γ ) πενζθενζηή αηηίκδ δζαηαναβιέκδ, (Γ ) Dlg δναιαηζηά ιεζςιέκα επίπεδα Η ILK ζπκκεηέρεη ζηε ξχζκηζε ηεο νκνηφζηαζεο ηεο αθηίλεο Υαναηηδνζζηζηυ ημο θαζκμηφπμο ηδξ αηηίκδξ απμοζία ilk είκαζ δ έηημπδ ζοζζχνεοζδ αηηίκδξ ζε δζάθμνεξ εέζεζξ ηαηά ιήημξ ημο ζκζδίμο αηηίκδξ, ιε απμηέθεζια αοηυ κα μδδβεί ζε ζοκμθζηή αφλδζδ ηςκ επζπέδςκ ηδξ αηηίκδξ πμο εκζςιαηχκμκηαζ ζηα ζκίδζα ηάζδξ ηαηά ηα ηεθεοηαία ζηάδζα ηδξ ςμβέκεζδξ. Δπίζδξ ζηα ηφηηανα ηθχκμοξ βζα ilk είκαζ δζαηαναβιέκμ ηαζ ημ δίηηομ ηδξ πενζθενζηήξ αηηίκδξ. Σα επίπεδα ηδξ αηηίκδξ είκαζ δναιαηζηά ιεζςιέκα ηαζ παναηδνμφιε ζε πμθθέξ πενζπηχζεζξ έηημπδ ζοβηέκηνςζδ αηηίκδξ ζηδκ αηναία πθεονά ημο ηοηηάνμο, ζε ιμνθή «ζηεθακζμφ». Όθα αοηά ηα απμηεθέζιαηα ιαξ μδήβδζακ κα ιεθεηήζμοιε 189

201 ηδκ πζεακή ειπθμηή ηδξ ILK ζημ ιδπακζζιυ πμθοιενζζιμφ/απμπμθοιενζζιμφ ηδξ αηηίκδξ. Γζα ημ θυβμ αοηυ εθέβλαιε ηα επίπεδα ηνζχκ ααζζηχκ νοειζζηχκ ηδξ αηηίκδξ, ηςκ profilin, enabled (Ena) ηαζ diaphanous (Dia). Πνμδβμφιεκεξ ιεθέηεξ ζε ιεηαθθάβιαηα βζα ζκηεβηνίκεξ ζημ εοθαηχδεξ επζεήθζμ πνμηείκμοκ υηζ μζ ζκηεβηνίκεξ εθέβπμοκ ηα επίπεδα αηηίκδξ ζηα εοθαηζμηφηηανα ιεζμννοειίγμκηαξ ηδκ έηθναζδ αοηχκ ηςκ πνςηεσκχκ (Delon and Brown 2009). Με έηπθδλδ δζαπζζηχζαιε υηζ δ απμοζία ηδξ ILK έπεζ δζαθμνεηζηή επίδναζδ ζε αοηέξ ηζξ πνςηεΐκεξ. Ζ απμοζία ηδξ ILK ιεζμννοειίγεζ ηα επίπεδα ηδξ profilin (Δηθ.63Α ). Ακηίεεηα, ηα επίπεδα ημο Diaphanous αολάκμκηαζ, δ πνςηεΐκδ παφεζ κα ζοζζςνεφεηαζ ημκηά ζηδκ πθαζιαηζηή ιειανάκδ ηςκ ηοηηάνςκ ηαζ εκημπίγεηαζ ζε ιεβάθεξ πμζυηδηεξ ζημ ηοηηανυπθαζια (Δηθ.63Β ). Ο ηνίημξ νοειζζηήξ ημο πμθοιενζζιμφ ηδξ αηηίκδξ, ημ Enabled παναιέκεζ αιεηάαθδημ απμοζία ηδξ ILK ηυζμ ςξ πνμξ ηα επίπεδα πμο ακζπκεφμκηαζ ζηα ηφηηανα υζμ ηαζ ςξ πνμξ ημκ οπμηοηηανζηυ ημο εκημπζζιυ, δεδμιέκμο υηζ παναιέκεζ ζηα άηνα ηςκ ζκζδίςκ ηάζδξ ηδξ αηηίκδξ (Δηθ.63Γ ). Δηθόλα 63: Η ILK έρεη αληίζεηε επίδξαζε πάλσ ζε δπν από ηνπο βαζηθνύο ξπζκηζηέο ηεο αθηίλεο. (Α ) ηα επίπεδα ηεο profilin είλαη ζεκαληηθά κεησκέλα, (Α ) ζκίδζα ηάζδξ δζαηαναβιέκα, (Α ) πονήκεξ εοθαηζμηοηηάνςκ ζηαδίμο 12 (ilk-/- ηφηηανα, GFP-, πενζηθείμκηαζ ζηδκ ηίηνζκδ βναιιή), (Β ) ηα επίπεδα ηδξ Diaphanous είκαζ αολδιέκα, (Β ) ζκίδζα ηάζδξ δζαηαναβιέκα, (Β ) πονήκεξ εοθαηζμηοηηάνςκ ζηαδίμο 12 (ilk-/- ηφηηανα, GFP-, ανζζηενά ηδξ ηίηνζκδξ βναιιήξ), (Γ ) ζκίδζα ηάζδξ δζαηαναβιέκα, (Γ ) ηα επίπεδα ημο Ena είκαζ αβνίμο ηφπμο, (Γ ) πονήκεξ εοθαηζμηοηηάνςκ ζηαδίμο 12 (ilk-/- ηφηηανα, GFP-, ανζζηενά ηδξ ηίηνζκδξ βναιιήξ). 190

202 Δπίζδξ εεθήζαιε κα εθέβλμοιε ακ δ ILK νοειίγεζ ηα επίπεδα ηδξ profilin ζημ ιεηαβναθζηυ επίπεδμ. Γζα ημ θυβμ αοηυ, πνδζζιμπμζήζαιε δομ δζαβμκζδζαηά ζηεθέπδ πμο είκαζ δζαεέζζια ζημ Κέκηνμ ηεθεπχκ ημο Bloomington, ημο Πακεπζζηδιίμο ηδξ Ηκηζάκαξ, ηα μπμία θένμοκ ημ ηαεέκα έκεεζδ ηδξ ηςδζηήξ πενζμπήξ ηδξ πνάζζκδξ θεμνίγμοζαξ πνςηεΐκδξ ζε έκακ εκζζποηή πμο εθέβπεζ ηδκ έηθναζδ ημο βμκζδίμο ηδξ profilin. Ανπζηά εθέβλαιε υηζ μζ ζοβηεηνζιέκμζ εκζζποηέξ εηθνάγμκηαζ ζηα εοθαηζμηφηηανα, παναημθμοεχκηαξ ηδκ έηθναζδ ηδξ πνάζζκδξ θεμνίγμοζαξ πνςηεΐκδξ ζε εοθαηζμηφηηανα ηςκ εκ θυβς ζηεθεπχκ. ηδ ζοκέπεζα παναημθμοεήζαιε ηα επίπεδα έηθναζδξ ημοξ ζε ηφηηανα ηθχκμοξ βζα ilk. Σα επίπεδα ημο GFP ήηακ ζδιακηζηά ιεζςιέκα (Δηθ.64Β), μπυηε μδδβδεήηαιε ζημ ζοιπέναζια υηζ πζεακά δ ILK εθέβπεζ ηα επίπεδα έηθναζδξ ημο βμκζδίμο ηδξ profilin. Δηθόλα 64: H ILK επεξεάδεη ηελ έθθξαζε ηεο profilin ζην ζπιαθώδεο επηζήιην. (Β) ηαοηυπνμκδ ζήιακζδ ιε GFP βζα ηφηηανα αβνίμο ηφπμο ηαζ βζα ημκ εκζζποηή ημο βμκζδίμο ηδξ profilin (ηαζ μζ δομ πνςηεΐκεξ είκαζ πονδκζηέξ), (Γ) ηα ζκίδζα ηάζδξ ηδξ αηηίκδξ είκαζ δζαηαναβιέκα ηαζ (Γ) πονήκεξ εοθαηζμηοηηάνςκ ζηαδίμο 12 (ilk-/- ηφηηανα, GFP-, ανζζηενά ηδξ ηίηνζκδξ βναιιήξ). Ακηίζημζπα, εεθήζαιε κα εθέβλμοιε ακ ηα αολδιέκα επίπεδα αηηίκδξ ζηα ηφηηανα ηθχκμοξ βζα ilk μθείθμκηακ ζε ιεζςιέκμ νοειυ απμπμθοιενζζιμφ ηδξ αηηίκδξ. Γζα ημ θυβμ αοηυ, εθέβλαιε ηα επίπεδα έηθναζδξ ημο βμκζδίμο ηδξ cofilin πνδζζιμπμζχκηαξ έκα ακηίζημζπμ δζαβμκζδζαηυ ζηέθεπμξ, υπςξ αοηά πμο πενζβνάθδηακ ζηδκ πνμδβμφιεκδ πανάβναθμ. Ζ cofilin είκαζ ιζα πνςηεΐκδ πμο ζοιιεηέπεζ ζημ «ενοιιαηζζιυ» (shivering) ηδξ ζκχδμοξ αηηίκδξ ζε ιμκμιενή αηηίκδξ (G-actin) (Maciver and Hussey 2002). Σα πεζνάιαηά ιαξ έδεζλακ υηζ δ ILK επδνεάγεζ ηα επίπεδα ηδξ βμκζδζαηήξ έηθναζδξ ηδξ cofilin ζημ επζεδθζαηυ ηφηηανμ ημ ςμεοθαηίμο (Δηθ.65Α &Δηθ.65Β ). Χζηυζμ, ζηα πεζνάιαηα ακμζμθεμνζζιμφ πμο πναβιαημπμζήζαιε, ιεθεηήζαιε ηδκ επίδναζδ ηδξ απχθεζαξ ηδξ ilk ζηα επίπεδα έηθναζδξ ηάπμζςκ εκζζποηχκ (δομ εκζζποηχκ βζα ηδ profilin ηαζ εκυξ εκζζποηή βζα ηδ cofilin) ηςκ 191

203 βμκζδίςκ ηςκ profiln ηαζ cofilin, ηαζ υπζ ζηδ ζοκμθζηή έηθναζδ ηςκ βμκζδίςκ ηςκ profilin ηαζ cofilin. H ιείςζδ ηδξ έηθναζδξ ηςκ εκζζποηχκ δεκ είκαζ απαναίηδημ κα ακηακαηθάηαζ ζηδ ιεζμννφειζζδ ηςκ δομ βμκζδίςκ ηαεχξ είκαζ πζεακυ ηάπμζμζ άθθμζ εκζζποηέξ κα ζοκεπίγμοκ κα είκαζ εκενβμί μδδβχκηαξ επανηχξ ηδ βμκζδζαηή έηθναζδ ηςκ profilin ηαζ cofilin. Δπμιέκςξ, αοηυ απμηεθεί ιζα έκδεζλδ ιυκμ ηαζ πνμηεζιέκμο δ παναπάκς παναηήνδζδ κα επζαεααζςεεί εα ήηακ εκδζαθένμκ κα βίκμοκ πεζνάιαηα FISH. Με αοηή ηδκ πεζναιαηζηή πνμζέββζζδ, εα ιπμνέζμοιε κα πμζμηζημπμζήζμοιε ηδ ζπεηζηή παναβςβή ηςκ ιεηάβναθςκ βζα cofilin ζηα ilk-/- ηφηηανα ηαζ ηα ηφηηανα αβνίμο ηφπμο, ηαεχξ ιέπνζ ζηζβιήξ δεκ οπάνπεζ δζαεέζζιμ ακηίζςια βζα ηδκ ακίπκεοζδ ηδξ πνςηεΐκδξ ζηδ ιφβα. Δηθόλα 65: H ILK επεξξεάδεη ηελ έθθξαζε ηεο cofilin ζην ζπιαθώδεο επηζήιην. (Α ) ηαοηυπνμκδ ζήιακζδ ιε GFP βζα ηφηηανα αβνίμο ηφπμο ηαζ βζα ημκ εκζζποηή ημο βμκζδίμο ηδξ cofilin (ηαζ μζ δομ πνςηεΐκεξ είκαζ πονδκζηέξ), (Α ) ηα επίπεδμ ημο zipper είκαζ αολδιέκα ηαζ δ πνςηεΐκδ εκημπίγεηαζ έηημπα ζηδκ αηναία πενζμπή ημο εοθαηζμηοηηάνμο, (Α ) πονήκεξ εοθαηζμηοηηάνςκ ζηαδίμο 10 (ilk- /- ηφηηανα, GFP-, πενζηθείμκηαζ ζηα ηίηνζκα πθαίζζα), (Β ) ηαοηυπνμκδ ζήιακζδ ιε GFP βζα ηφηηανα αβνίμο ηφπμο ηαζ βζα ημκ εκζζποηή ημο βμκζδίμο ηδξ cofilin (ηαζ μζ δομ πνςηεΐκεξ είκαζ πονδκζηέξ), (Β ) ηα ζκίδζα ηάζδξ ηδξ αηηίκδξ είκαζ δζαηαναβιέκα ηαζ (Β ) πονήκεξ εοθαηζμηοηηάνςκ ζηαδίμο 11 (ilk-/- ηφηηανα, GFP-, πενζηθείμκηαζ ζηα ηίηνζκα πθαίζζα) Η ILK επεξεάδεη ηελ νκνηφζηαζε ηνπ κεραληζκνχ ηεο αθην-κπνζίλεο ζην επηζήιην ηνπ σνζπιαθίνπ Πνμδβμφιεκεξ ενβαζίεξ ζοκδέμοκ ηδ δνάζδ ηδξ ΗLK ιε ημ ιδπακζζιυ ηδξ ζοζηαθηυηδηαξ ηςκ ζκζδίςκ αηημ-ιομζίκδξ (Khyrul, LaLonde et al. 2004; Montanez, Wickstrom et al. 2009). Πζμ ζοβηεηνζιέκα πνμηείκμοκ υηζ δ ILK εθέβπεζ ηα επίπεδα 192

204 ηδξ RhoA-GTPάζδξ ζε θεία ιοσηά ηφηηανα. Δπίζδξ, πνυζθαηεξ ενβαζίεξ απμδίδμοκ ημ ζηνμββοθειέκμ θαζκυηοπμ ηςκ ςμεοθαηίςκ πμο πανμοζζάγμοκ ζε ζδιακηζηυ πμζμζηυ ηαζ ηα ιεηαθθάβιαηα βζα ilk ζε δζαηαναπέξ ζημ ιδπακζζιυ νφειζζδξ ηδξ αηημ-ιομζίκδξ ιέζς ημο μνευθμβμο ηδξ RhoA-GTPάζδξ ζηδ Drosophila ηδξ Rho1- GTPάζδξ (He, Wang et al. 2010; Vlachos and Harden 2010). Γζα ημ ζημπυ αοηυ, εθέβλαιε ηα επίπεδα ηαζ ημκ οπμηοηηανζηυ εκημπζζιυ ηδξ Rho1-GTPάζδξ ζε ςμεοθάηζα πμο έθενακ ηθχκμοξ βζα ilk-/-. Ζ απμοζία ηδξ ILK δζαηανάζζεζ ηυζμ ηα επίπεδα ηδξ πνςηεΐκδξ Rho1 υζμ ηαζ ημκ οπμηοηηανζηυ ηδξ εκημπζζιυ. Σα επίπεδα ηδξ Rho1 αολάκμκηαζ ζδιακηζηά (30%) ζηα εοθαηζμηφηηανα ηςκ ηεθεοηαίςκ ακαπηολζαηχκ ζηαδίςκ. Δπίζδξ δ πνςηεΐκδ παφεζ κα ζοβηεκηχκεηαζ ηονίςξ ζηδκ πενζθένεζα ηδξ ααζζηήξ πθεονάξ ηςκ εοθαηζμηοηηάνςκ αθθά εκημπίγεηαζ ηαζ ζημ ηοηηανυπθαζια (Δηθ.66Α ). ηδ ζοκέπεζα εθέβλαιε ηδκ ιομζίκδ ΗΗ ηαζ πζμ ζοβηεηνζιέκα πναβιαημπμζήζαιε πνχζδ ιε ακηίζςια έκακηζ ηδξ αανζάξ αθοζίδαξ ηδξ ιδ ιοσηήξ ιομζίκδξ ΗΗ (MHC), zipper. Παναηδνήζαιε υηζ ηα επίπεδα ημο zipper είκαζ αολδιέκα. Δπίζδξ, παναηδνήζαιε υηζ εκχ ζηδ ααζζηή πθεονά ηςκ ηοηηάνςκ αβνίμο ηφπμο δ ιομζίκδ ΗΗ ζπδιαηίγεζ ζκχδεζξ δμιέξ πμο δζεοεεημφκηαζ πανάθθδθα ιεηαλφ ημοξ, δ απμοζία ηδξ ILK επδννεάγεζ αοηή ηδ δζάηαλδ ηαζ δ ιομζίκδ ΗΗ ζπδιαηίγεζ ζοζζςιαηχιαηα (Δηθ.66Β ). Δπζπθέμκ, δ απμοζία ηδξ ILK ζε εοθαηζμηφηηανα ιέζμο ακαπηολζαημφ ζηαδίμο πνμηαθεί εηηυξ απυ αολδιέκα επίπεδα ιομζίκδξ ΗΗ ηαζ αθθαβή ζηδκ οπμηοηηανζηή ηαηακμιή ηδξ ιομζίκδξ ΗΗ. ηα αβνίμο ηφπμο ηφηηανα ημ zipper θαίκεηαζ κα εκημπίγεηαζ ηονίςξ ηυζμ ζηδ ααζζηή πενζμπή ηςκ ηοηηάνςκ υζμ ηαζ ζηζξ πθεονζηέξ εέζεζξ αθθά κα απμοζζάγεζ απυ ηδκ αηναία πενζμπή ηςκ εοθαηζμηοηηάνςκ (Δηθ.66Α ). Χζηυζμ, ζηα ilk-/- ηφηηανα ημ zipper θαίκεηαζ κα ζοβηεκηνχκεηαζ έηημπα ηαζ ζηδκ αηναία πενζμπή ηςκ ηοηηάνςκ (Δηθ.65Α ), (βι. ππνελόηεηα ). 193

205 Δηθόλα 66: Η ΙLK είλαη ζεηηθόο ξπζκηζηήο ηεο έθθξαζεο ησλ Rho1 ηεο κπνζίλεο ησλ επηζειηαθώλ θπηηάξσλ. (Α) GFP-, ilk-/- ηφηηανα ζηαδίμο 11, (Α) αολδιέκα επίπεδα ηδξ πνςηεΐκδξ Rho1 ηαζ (Β) GFP-, ilk-/- ηφηηανα ζηαδίμο 11, (Β) αολδιέκα επίπεδα ηδξ ιομζίκδξ (Zipper), δ ζκχδδξ δζεοεέηδζδ είκαζ δζαηαναβιέκδ ηαζ ζπδιαηίγεζ ζοζζςιαηχιαηα. Πνυζθαηδ ιεθέηδ πνμηείκεζ υηζ ηα ιεζςιέκα επίπεδα ηδξ Rho1 ζε ιεηαθθάβιαηα βζα dpak ζε εοθαηζμηφηηανα είκαζ ζηακά κα ζχζμοκ ημκ παναηδνμφιεκμ θαζκυηοπμ ηςκ ζκζδίςκ αηηίκδξ (Vlachos and Harden 2010). Καεχξ μ θαζκυηοπμξ ηδξ αηηίκδξ ζε αοηά ηα ιεηαθθάβιαηα ιμζάγεζ ιε ημκ θαζκυηοπμ αηηίκδξ πμο πενζβνάραιε ζηα ιεηαθθάβιαηα ηδξ ILK, εεθήζαιε κα εθέβλμοιε ακ ιεζχκμκηαξ ηα επίπεδα ηδξ Rho1ζηα εοθαηζμηφηηανα εα ιπμνμφζαιε κα ακαζηνέρμοιε ημ θαζκυηοπμ ηςκ ζκζδίςκ αηηίκδξ. Γζα ημ ζημπυ αοηυ ηαηαζηεοάζαιε βεκεηζηά ιςζασηά βζα ilk ζε έκα ζηέθεπμξ πμο έθενε in trans ηδ rho 72R ιεηαθθαβή βζα ηδ Rho1 (Strutt, Weber et al. 1997). Χζηυζμ, παναηδνήζαιε υηζ δ ιείςζδ ηςκ επζπέδςκ ηδξ Rho1 ζε ilk-/- ηφηηανα δεκ ακαζηνέθεζ ημ θαζκυηοπμ αηηίκδξ υπςξ ζοιααίκεζ ζηα ιεηαθθάβιαηα βζα dpak. Σα ζκίδζα ηδξ αηηίκδξ ζοκεπίγμοκ κα πανμοζζάγμοκ έηημπδ εκαπυεεζδ αηηίκδξ ηαηά ιήημξ ημοξ, αολδιέκα ζοκμθζηά επίπεδα αηηίκδξ ηαζ «ζηεθάκζ» αηηίκδξ πενζιεηνζηά ημο ηθχκμο ζηδκ αηναία πενζμπή ηςκ εοθαηζμηοηηάνςκ (Δηθ.67Β). 194

206 Δηθόλα 67: Μείσζε ησλ επηπέδσλ ηεο Rho1 ζηα ilk-/- θύηηαξα δελ αληηζηξέθεη ην θαηλόηππν ηεο αθηίλεο θαη ησλ ηληεγθξηλώλ. (Β) ηα ζκίδζα ηδξ αηηίκδξ είκαζ δζαηαναβιέκα ιε έηημπδ ζοβηέκηνςζδ αηηίκδξ ηαηά ιήημξ ημοξ, ζηεθάκζ αηηίκδξ πενζιεηνζηά ημο ηθχκμο, (Γ) μζ ζκηεβηνίκεξ δεκ εκημπίγμκηαζ ζηα άηνα ηςκ ζκζδίςκ αηηίκδξ (Γ) πονήκεξ ηςκ εοθαηζμηοηηάνςκ (GFP-, ilk-/- ηφηηανα ζηαδίμο 13, ανζζηενά ηδξ ηίηνζκδξ δζαηεημιιέκδξ βναιιήξ) Η ilk αιιειεπηδξά γελεηηθά κε ηε dpak ζην επηζήιην ηνπ σνζπιαθίνπ Σα πεζνάιαηα ιαξ ζε ςμεοθάηζα ηεθζηχκ ζηαδίςκ υπμο ηαηαζηεοάζαιε ηθχκμοξ βζα pak, απμηάθορακ υηζ δ απμοζία ημο μδδβεί ζε θαζκμηφπμο αηηίκδξ υιμζμ ηδξ ilk. Σα ζκίδζα ηδξ αηηίκδξ ζπδιαηίγμκηαζ, ηαζ πνμζακαημθίγμκηαζ ζηακμπμζδηζηά, ςζηυζμ δ αηηίκδ εκαπμηίεεηαζ ζε έηημπεξ εέζεζξ ηαηά ιήημξ ημο ζκζδίμο, ζοπκά ηα επίπεδα αηηίκδξ ζημκ ηθχκμ είκαζ ορδθυηενα αοηχκ ηςκ αβνίμο ηφπμο ηοηηάνςκ ηαζ μζ ηθχκμζ πενζαάθθμκηαζ πενζθενζηά απυ «ζηεθάκζ» πθμφζζμ ζε αηηίκδ (Δηθ.68Α &Δηθ.68Β ). Δηθόλα 68: : Η απνπζία ηεο ILK ζην επηζήιην ηνπ σνζπιαθίνπ πξνθαιεί δηαηαξαρή ζηα επίπεδα ηεο dpak. (A) ilk-/- ηφηηανα, (ilk-/- ηφηηανα GFP-, ανζζηενά ηδξ ηίηνζκδξ βναιιήξ), (Α ) ηα επίπεδα ηδξ dpak είκαζ ζδιακηζηά ιεζςιέκα, (Α ) ζκίδζα ηάζδξ είκαζ δζαηαναβιέκα ηαζ (Α ) πονήκεξ εοθαηζμηοηηάνςκ ζηαδίμο 12. Σα απμηεθέζιαηα αοηά ιαξ μδήβδζακ κα εθέβλμοιε ηδκ ζηακυηδηα εκημπζζιμφ ηςκ ζκηεβηνζκχκ ζε ηφηηανα μιμγοβχηεξ βζα pak. Πνμδβμφιεκδ ιεθέηδ 195

207 ζημ ιοσηυ ζφζηδια δείπκεζ υηζ δ δνάζδ ηδξ PAK είκαζ ακελάνηδηδ ηςκ ζκηεβηνζκχκ, αθθά πνυζθαηδ ιεθέηδ ζηα επζεδθζαηά ηφηηανα ηδξ ναπαίαξ αικζαηήξ ζημζαάδαξ (amnioserosa) ζε έιανοα ηδξ Drosophila πνμηείκμοκ υηζ δ θεζημονβία ηδξ pak εθέβπεηαζ απυ ηζξ ζκηεβηνίκεξ. Δίκαζ εκδζαθένμκ υηζ ηα δζηά ιαξ απμηεθέζιαηα οπμδεζηκφμοκ υηζ δ pak είκαζ απαναίηδημ βζα ηδκ ημπμεέηδζδ ηςκ ζκηεβηνζκχκ ζηα άηνα ηςκ ζκζδίςκ αηηίκδξ (Δηθ.69Α ). Σα απμηεθέζιαηα αοηά οπμδδθχκμοκ ιζα δζαθμνεηζηή βεκεηζηή ζενανπία βζα ηα ιυνζα ηςκ ζκηεβηνζκχκ ηαζ ηδξ ΡΑΚ ζηα εοθαηζμηφηηανα. ηδ ζοκέπεζα εθέβλαιε ηαζ ηδκ ζηακυηδηα εκημπζζιμφ ηδξ ILK ζηα pak-/- ηφηηανα ηθχκμοξ βζα pak ηαζ δζαπζζηχζαιε υηζ δ ILK παναιέκεζ ζημ ηοηηανυπθαζια ηαζ υηζ πνεζάγεηαζ ηδκ dpak βζα ημκ εκημπζζιυ ηδξ (Δηθ.69Β ). Ακηίζημζπα, ηα πεζνάιαηά ιαξ ζε ilk-/- ηφηηανα έδεζλακ υηζ ηαζ δ ILK είκαζ απαναίηδηδ βζα ημκ εκημπζζιυ ηδξ dpak ζηδ ααζζηή πενζμπή ηςκ εοθαηζμηοηηάνςκ (Δζη.68Α ) (Conder, Yu et al. 2007). Δηθόλα 69: Η dpak είλαη απαξαίηεηε γηα ηνλ εληνπηζκό ησλ ηληεγθξηλώλ θαη ηεο ILK ζηα άθξα ησλ ηληδίσλ αθηίλεο ζηα σνζπιάθηα ηειηθώλ ζηαδίσλ ηεο σνγέλεζεο. (Α) 12 dpak-/- ηφηηανα, GFP-, ανζζηενά ηδξ ηίηνζκδξ βναιιήξ, (Α ) μζ ζκηεβηνίκεξ δεκ εκημπίγμκηαζ ζηα άηνα ηςκ ζκζδίςκ ηάζδξ, (Α ) ζκίδζα αηηίκδξ δζαηαναβιέκα, (Α) πονήκεξ εοθαηζμηοηηάνςκ ζηαδίμο, (Β ) δ ILK δεκ εκημπίγεηαζ ζηα άηνα ηςκ ζκζδίςκ ηάζδξ, παιδθά επίπεδα ηδξ πνςηεΐκδξ, (Β) dpak-/- ηφηηανα, GFP-, ανζζηενά ηδξ ηίηνζκδξ βναιιήξ, (Β ) ζκίδζα αηηίκδξ δζαηαναβιέκα ηαζ (Β ) πονήκεξ εοθαηζμηοηηάνςκ ζηαδίμο 12. Αοηή δ ακάθοζδ απμηάθορε υηζ δ ILK νοειίγεζ ηδκ μνβάκςζδ ηαζ ηδ ζηαεενυηδηα ηςκ ζκζδίςκ ηάζδξ ηδξ αηηίκδξ ζηα ηεθζηά ζηάδζα ηδξ ςμβέκεζδξ ηαζ υηζ απαζηείηαζ επίζδξ βζα ημκ οπμηοηηανζηυ εκημπζζιυ ηςκ ζκηεβηνζκχκ ηαζ ηδξ dpak. 196

208 Σμ εφνδια αοηυ οπμδδθχκεζ δ ζοκενβαζία αοηχκ ηςκ ιμνίςκ ζηδ πναβιαημπμίδζδ, εδναίςζδ ηαζ ηδ δζαηήνδζδ ηδξ πμθζηυηδηαξ ζηδ δζεοεέηδζδ ζκζδίςκ αηηίκδξ. Δπίζδξ, ακαηαθφραιε υηζ δ απχθεζα ηδξ ILK απμδζμνβακχκεζ ημκ ηοηηανμζηεθεηυ αηηίκδξ ηαηά ημκ αηναζμ-ααζζηυ άλμκα ηςκ ηοηηάνςκ, ημ μπμίμ έπεζ ςξ απμηέθεζια, ηδ δζαηάναλδ ηςκ δζαθναβιαηζηχκ ζοκδέζιςκ ηαζ ηςκ ζοκδέζιςκ ιε ημ ελςηοηηάνζμ οθζηυ. ΤΝΟΦΗ ΑΠΟΣΔΛΔΜΑΣΧΝ ΔΝΟΣΗΣΑ Η ILK είλαη απαξαίηεηε γηα ηε δηαδηθαζία ηεο σνγέλεζεο ζηε κχγα. Απνπζία ηεο ILK πξνθαιεί δηαηαξαρέο ζην ζρεκαηηζκφ ησλ δηαζπιηαθψλ κίζρσλ θαη αλσκαιία ζην δηαρσξηζκφ ησλ λενζρεκαηηδφκελσλ δηαδνρηθψλ σνζπιαθίσλ (ζηακαία σνζπιάθηα). Η ILK είλαη απαξαίηεηε γηα ηελ νξγάλσζε ησλ ηληδίσλ αθηίλεο θαηά ηα ηειεπηαία ζηάδηα ηεο σνγέλεζεο. Η νκνηφζηαζε ηνπ θπηηαξνζθειεηνχ αθηηλήο θαη ησλ κηθξνζσιελίζθσλ δηαηαξάζζεηαη απφ ηελ απνπζία ηεο ILK απφ ηα ζπιαθηνθχηηαξα. Η ILK είλαη απαξαίηεηε γηα ηελ νξγάλσζε θαη δηαηήξεζε ησλ βαζν-πιεπξηθψλ θπηηαξηθψλ ζπλδέζεσλ ζηα ζπιαθηνθχηηαξα, αιιά φρη ησλ ζπλδέζεσλ δψλεο. Η απνπζία ηεο ILK δηαηαξάζζεη ηνλ εληνπηζκφ ησλ ηληεγθξηλψλ ζηα άθξα ησλ ηληδίσλ ηάζεο ηεο αθηίλεο ζηα ζπιαθηνθχηηαξα ησλ ηειεπηαίσλ ζηαδίσλ. Η ILK ζπκκεηέρεη ζηε ξχζκηζε ηεο δπλακηθήο ηεο αθηίλεο κεηνξξπζκίδνληαο ην Dia θαη απμνξξπζκίδνληαο ηελ profilin. H ΙILK εκπιέθεηαη ζηνλ έιεγρν ηεο ζπζηαιηφηεηαο ησλ ηληδίσλ αθην-κπνζίλεο ζηα ζπιαθηνθχηηαξα ησλ ηειεπηαίσλ ζηαδίσλ. 197

209 Η ilk αιιειεπηδξά γελεηηθά κε ηε dpak ζην επηζήιην ηνπ σνζπιαθίνπ. Η ΙLK επεξεάδεη ηνλ εληνπηζκφ ηεο dpak ζηα ζπιαθηνθχηηαξα ηειεπηαίσλ ζηαδίσλ. Η dpak είλαη απαξαίηεηε γηα ηνλ εληνπηζκφ ησλ ηληεγθξηλψλ θαη ηεο ILK ζηα άθξα ησλ ηληδίσλ ηάζεο ηεο αθηίλεο. Η απνπζία ηεο dpak, φπσο θαη ηεο ilk, δηαηαξάζζνπλ ηελ νξγάλσζε θαη ησλ ηληδίσλ ηάζεο ηεο αθηίλεο ζε ζπιαθηνθχηηαξα ηειεπηαίσλ ζηαδίσλ. 198

210 Συδήηεζε 199