1. indirektno,metode kvantitativne genetike. 2. mapiranjem genoma otkrivanjem relevantnih lokusa

Transcript

1 Pristupi utvrdjivanja genetičke osnove složenih fenotipova 1. indirektno,metode kvantitativne genetike 2. mapiranjem genoma otkrivanjem relevantnih lokusa Porodične studije vezanosti Populacione studije asocijacije association preko kandidat gena Asocijacije variranja odreñenih lokusa za koje se zna da imaju ulogu u nastanku i razvoju fenotipa

2

3 podsećanje mejoza nezavisno rasporeñivanje hromozoma (alela) set lokusa (sekvenci)na istom hromozomu - haplotip vezano nasledjivanje alela, segregacija hromozoma rekombinacija (krosing over) rekombinantni potomci nerekombinantni potomci

4 rekombinaciono mapiranje otkriva redosled gena na hromozomima, ali daje samo grubu sliku pravog rastojanja izmeñu njih. Genetičke mape se baziraju na učestalosti c.o. Razmak oslikava vezanost lokusa (verovatnoću zajedničke segregacije). jedinica razdaljine izmeñu lokusa je cm (centi Morgan) ili m.u (map unit), 1cM = 1m.u. =1% rekombinacije. neki regioni hromozoma su podložniji rekombinacijama, pa razdaljine na genetičkom mapama ne odgovaraju u potpunosti stvarnim rastojanjima mapama. regioni u kojima je c.o. češći su izduženi na genetičkim mapama.

5

6 Razlika je izmeñu učestalosti rekombinacija i stvarne razdaljine izmeñu gena. Ne uočavaju se sve rekombinacije. Multipli c.o. se mogu desiti izmeñu jako udaljenih gena, i neki od njih ne vode pojavi rekombinantnih hromozoma. U slučaju jako udaljenih lokusa prava genetička distanca, koja zavisi od prosečnog broja c.o. na hromozomu, može biti veća nego uočena učestalost rekombinacije. Za gene udaljenije od 20cM sve je veće odstupanje jer je sve veća verovatnoća multiplih c.o. Odnos izmeñu učestalosti rekombinacija i razdaljine izmeñu gena. Za mala rastojanja postoji linearni odnos. Za veća rastojanja procenat rekombinacija potcenjuje pravu razdaljinu.

7 Fizičko mapiranje predstavlja potpunu sekvencu DNK hromozoma sa razdaljinama i lokacijama gena merena brojem nukleotida (bp) 1 m.u.= 1cM = 10 6 bp = 1Mb otisak restrikcionim fragmentima, hromozomsko šetanje, in situ hibridizacija, itd..

8

9 genetički markeri Genetički markeri su mesta u genomu pomoću čijih alela možemo pratiti nasledjivanje odreñenog hromozoma ili regiona hromozoma kroz generacije Genetički marker mora biti polimorfan da se nalazi u više varijanti alelskih, u populacijama fenotipski ograničen broj i polimorfnost citogenetički posebne tehnike (npr. bojenja hromozoma), hibridizacija biohemijski malobrojni..izoenzimi, posebne tehnike molekularni RFLP, AFLP, RAPD, STS, SNP

10 Genetička vezanost markera i lokusa (linkage) Ako je na primer, A lokus uzročno vezan sa osobinom, a B i C su markeri pomoću kojih odredjujemo A:.veća je verovatnoća da će se rekombinacija desiti izmedju A i C nego A i B, pa marker B češće segregira zajedno sa A na osnovu učestalosti pojave rekombinanata odredjuje se razdaljina lokusa

11 mapiranje lokusa za složene (kvantitativne) osobine - QTL Genomske sekvence koje označavaju lokacije i funkcije gena odreñuju gene kandidate, čiji aleli mogu doprinositi genetičkoj varijabilnosti. Svaki gen kandidat mora se testirati pojedinačno jer neki doprinose malo ili nimalo nekom tipu varijabilnosti, a mogu imati i plejotropni efekat itd., što je ograničavajuće. Polimorfizmi pojedinačnih nukleotida (SNP) ili kratkih ponovaka - mikrosatelita mogu poslužiti kao genetički markeri u ukrštanjima i omogućiti genetičko mapiranje lokusa čiji aleli utiču na neku kvantitativnu osobinu. Ovako identifikovani regioni genoma se zovu lokusi kvantitativnih osobina (eng. Quantiative Trait Loci - QTL). Geni nije prikladan izraz jer se najčešće ne radi o pojedinačnim genima, pa je bolje koristiti lokus, ili region

12 U genetici čoveka koriste se rodoslovi i polimorfizmi DNK kao markeri za odredjivanje pozicije QTL Sa životinjama i biljkama, npr. u poljoprivredi, linije koje se razlikuju u fenotipskoj vrednosti osobine se koriste u ukrštanjima, prati se segregacij marker lokusa i fenotipskih vrednosti u F2 ili povratnom ukršzanju i identifikuju se QTL. Ukrste se linije koje se razlikuju u prisustvu markera i QTL, Ako je QTL blisko vezan za marker gen, različiti marker genotipovi i QTLovi će se nasledjivati zajedno,a različiti marker genotipovi u F2 će imati različite srednje fenotipove Ako je marker blizu QTL, dobiće se razlika u srednjim vrednostima fenotipova medju marker genotipovima

13

14 Primer: dve selekcionisane linije se razlikuju prema nekoj osobini, prema QTL i marker lokusu Linija sa najvećom fenotipskom vrednošću je homozigot +/+ za odreñeni QTL i marker M/M udaljen 10 krosing-over jedinica. Linija sa najmanjom fenotipskom vrednošću je homozigot / za QTL i m/m za marker lokus. ukrste se Svaki alel na ovom QTL odreñuje 5 jedinica ukupne razlike izmeñu linija. Izmeñu prosečnog gameta koji nosi alel M i koji nosi m alel razlika je 4 jedinice u segregirajućoj F2. Razlika izmeñu proseka F2 M/M homozigota i proseka F2 m/m homozigota je prema tome 8. Tako je nañena prosečna razlika izmeñu početnih selektovanih linija 8, a u stvari QTL nosi 10% različitosti, pošto razlika dolazi iz rekombinacije izmeñu marker lokusa i QTL. Proces se može ponoviti uzimanjem marker lokusa na drugim pozicijama duž hromozoma i na različitim hromozomima da bi se odredili i ostali činioci diferencijacije izmeñu linija. Prosečan fenotipski efekat M =5(0,9)+0(0,1) = 4,5 Prosečan fenotipski efekat m =5(0,1)+0(0,9) = 0,5 Razlika izmeñu gameta koji nose M i gameta koji nose m = 4,5-0,5 = 4 Razlika izmeñu proseka F2 M/M homozigota i proseka F2 m/m homozigota = 8

15

16 Genetička epidemiologija Složene osobine (oboljenja, poremećaji) pokazuju varijabilnost meñu jedinkama (u odgovoru na terapiju, na agense, na ispoljavanje osobine...) Pitanje: da li je variranje složenog fenotipa pod genetičkom kontrolom? Primer: identifikovati genetičke faktore kod domaćina koji doprinose riziku za infektivno oboljenje Populaciono pitanje: Ima li asocijacije izmedju varijabilnosti u DNK sekvencama (učestalosti) i fenotipa oboljenja?

17

18 napraviti najbolji dizajn studije ispitati uzročnu medjusobnu vezu više gena, gena i sredinskih faktora, sa fenotipom

19 studije familija / studije populacija Ima li značajne porodične agregacije fenotipa ako ima značajne asocijacije medju rodjacima za neko oboljenje, a ne javlja se medju supružnicima, znači visoka je Vg (npr. za infekciju nekim patogenom) i ne može se pripisati zajedničkoj sredini kojom se prenosi infekcija

20 Da li je marker na hromozomu vezan za nepoznati region koji kontroliše fenotip? Linkage studije, upotrebom molekularnih markera Otkrivanje lokusa za kvantitativne osobine (QTL) obično brojne sekvence (na primer STR) asocirane sa fenotipom i imaju plejotropni efekat, uz epistaze, uticaj pola, populaciono specifični su itd. WGAS (whole genome association studies)-veze polimorfizama - SNPs i fenotipa GEIs (gene-environment interactions) kako genotipovi u specifičnoj sredini menjaju fenotip GWIS (genome-wide interaction studies)

21 Porodične studije vezanosti (linkage) mere ko-segregaciju u familijama, malim rodoslovima ne treba kontrolna grupa jer testiraju specifični model mendelovske segregacije unutar familije Populacione studije asocijacija mere ko-segregaciju u populacijama koriste neravnotežu vezanosti (LD) koja se meñu populacijama razlikuje

22 Porodične studije vezanosti parametarske analize vezanosti podrazumeva se da je poznat tip nasledjivanja, učestalost alela, penetrabilnost pogodno za kvalitativne, mendelovske osobine, dobre za mapiranje gena, ali zavise od informativnih rodoslova koriste rekombinacione učestalosti, LOD skor metod teže primeniti na složene osobine neparametarske analize vezanosti za nespecifične genetičke modele (tipove nasledjivanja) ne računa se rekombinaciona frakcija nego komponente varijanse statističkim testovima se utvrdjuje posledica vezanosti koriste se parovi srodnika istog fenotipa i računa distribucija IBD (identical by decent) alela, koja bi se očekivala ako nema vezanosti izmedju markera i alela (nulta hipoteza) Koristi se Allele sharing metod Moguće za studije složenih osobina

23 za utvrdjivanje vezanosti potrebne "informativne mejoze : veliki rodoslovi i potomstvo kod koga možemo, praćenjem pojave dve osobine za koje pretpostavljamo da se zajedno - vezano nasledjuju, prepoznati rekombinaciju, tj pojavu nastanka osobina odvojeno "NEINFORMATIVNA MEJOZA i rekombinantni i nerekombinantni gameti su isti A1 B1 A1 B1 ili A2 B1 A2 B1 "INFORMATIVNA MEJOZA A1 B2 A1 B1 rekombinantni gameti su: A2 B1 A2 B2 nerekombinanti gameti su: A1 B1 A2 B2

24 DNK polimorfizam - RFLP i rekombinaciono mapiranje Jedinka A je heterozigot za odredjeno restrikciono mesto: Jedinka B je homozigot za dugi fragment: Jedinke A i B mogu u medjusobnom ukrštanju dati polovinu potomstva sa 3 fragmenta, a drugu samo sa jednim

25 Ako je neko heterozigotno restrikciono mesto vezano za neki gen D u heterozigotnom stanju, u spregnutoj konformaciji, krosing-over izmedju ova dva mesta daće rekombinantne gamete kao D-3 i d-2-1. RF je moguće izračunati izmedju različitih marker lokusa i izmedju marker lokusa i gena sa poznatim fenotipskim efektom.

26 Primer: Muškarac koji ima neko oboljenje, heterozigot za lokus D/d i za molekularni marker M1/M2, žena homozigot za oba. Pedigre na slici daje genotipove dece u odnosu na gamete koji dolaze od oca. Dvoje su rekombinanti, RF = 33%

27 parametarski -"LOD skor" metod logaritam odnosa ishoda izražava vezanost 2 lokusa poredi verovatnoću da će odredjeni rezultati rodoslova da se dobiju ukoliko su 2 lokusa vezana (L) i ukoliko nisu vezana (NL) LOD = log 10 L/NL= (1- θ) NR x θ R 0,5 NR+R (θ) je rekombionaciona frakcija=r/nr+r θ = 0,5 se očekuje ako je nazavisno rasporedjivanje - potpuna nevezanost LOD scor 3, ukazuje na vezanost log =3, znači da je šansa 1000:1 da dobijena vezanost nije nastala slučajno

28 Procenjivanje rekombinacione frakcije Direktan metod: prebrojavanje rekombinanata poznavanjem gametske faze Metod maksimalne verovatnoće: Kada je nepoznata gametska faza Kada je nekompletna penetrabilnost Kada postoji heterogenost lokusa

29 Rodoslov poznate gametske faze (poznatog haplotipa) BE AF AB CD AC BC AD AD BD BC Zna se koja je kombinacija alela nasleñena od kog roditelja i svaka mejoza se može označiti kao rekombinantna Ili nerekombinantna L(θ) = (θ/2) r ((1-θ)/2) n-r r: broj rekombinanata n: sve mejoze

30 Rodoslov nepoznate gametske faze alel kod obolelog je mogao poticati od bilo kog hromozoma roditelja-nepoznat je genotip praroditelja AB CD AC BC AD AD BD BC L(θ) = 1/2 (θ/2) r [(1-θ)/2] n-r + 1/2 (θ/2) n-r [(1-θ)/2] r r: broj rekombinanata n: sve mejoze Imamo dvosmisleno rešenje kod potomaka što se tiče odnosa R:NR...zato je Lod skor sa obe mogućnosti

31 Ako je nadjeno da je jedinka heterozigot za dva vezana SNP mesta A/a i B/b, zašto na osnovu samo ove informacije nije poznata gametska faza vezanosti SNP alela? Hint: koji su mogući genotipovi ove jedinke? AB/ab ili Ab/aB

32 Razdaljina medju lokusima se računa iz rekombinacionih učestalosti koje daju najviši LOD prednosti LOD skor analize: statistički je jači metod od neparametarskih koristi sve genotipske i fenotipske informacije dostupnih članova porodica pruža statistički test vezanosti i uvid u lokusne heterogenosti ograničenja: mora biti poznat tip nasledjivanja rekombinaciona frakcija poznata učestalosti alela za osobinu poznate poznata penetrabilnost poznate učestalosti marker alela teško primenljivo za složene fenotipove

33 neparametarska analiza vezanosti pogodna u analizi složenih osobina Q: koliko često se odredjena kopija hromozomskog regiona javlja medju srodnicima, a nasledjena je od zajedničkog pretka? (IBD). A: dokazati da srodnici istog fenotipa nasledjuju identične kopije nekog regiona češće nego što se očekuje sib analiza (Allele Sharing Method - ASM) Neke studije: dijabetes tip I, HLA, angiotenzin, gustina kostiju, IgE nivo u serumu

34 ASM - metod šerovanja alela aleli dentični po stanju (identity by state -IBS) dva alela su ista po strukturi ali su potomci različitih predačkih alela aleli identični po poreklu (identity by decent -IBD) dva alela su potomci istog predačkog alela Testira se da li oboleli srodnici nasledjuju neki region IBD (ili IBS) češće nego što se očekuje po mendelovskoj slučajnoj segregaciji

35 metod sib-parova (ASM) sib-par sa istom osobinom može deliti 0,1, 2 IBD alela sa verovatnoćom 0.25, 0.5, 0.25, na bilo kom marker lokusu Ako je marker locus nezavisan od lokusa za osobinu, verovatnoće šerovanja medju sibparovima 0,1, 2, IBD alela će ostati 0.25, 0.50, Ako je marker lokus vezan (linked, blizak), sa lokusom za datu osobinu, očekuje se višak sibparova sa datom osobinom koji dele dva IBD alela. Poredjenje dobijenog broja sib-parova koji dele 0, 1, 2 IBD alela sa očekivanim pod nultom hipotezom. Koristi se Pearson ova χ 2 statistika Alternativna hipoteza: IBD koji se šeruju: dobijeni n 0 n 1 n 2 N = n 0 + n 1 + n 2 Nulta hipoteza: IBD koji se šeruju: očekivani N/4 N/2 N/4

36 Prednosti i nedostaci ASM Nema potrebe za definisanjem tipa nasledjivanja ili genetičkih parametara Slabiji da detektuje linkage u poredjenju sa lod skor metodom Teško pruža preciznu lokaciju gena povezanim sa oboljenjem

37 Relativni rizik- najbitniji parametar genetičke epidemiologije (λr) Rizik ponavljanja medju srodnicima (λ) učestalost medju rodjacima obolelog λr = populaciona učestalost r je tip srodstva - stoji u odnosu na konkordantno nasledjivanje kod parova srodnika koji su sa datom osobinom - analogno koeficijentu heritabilnosti Genetičko mapiranje je lakše za osobine sa visokom vrednošću λ, (λ > 10) nego sa niskom (λ < 2). oboljenje λ r cistična fibroza 500 dijabetes tip I 15 šizofrenija 8.6 dijabetes tip II 3.5

38 Generalno...porodične studije vezanosti Parametarske analize idealne na razdaljini 5-10 cm (1cM = 1 Mb) markera za detekciju vezanosti sa nekim lokusom multialelni STR, mikrosateliti bialelni SNP, ali gušće rasporedjeni u genomu ( SNP u ~ 3cM) bolje pokrivaju kraće regione haplotipovi, pogodni za studije slučajeva snaga linkage studija vezanosti zavisi od: polimorfnosti markera veličine porodice srodnosti jedinki ponovljivost studija vezanosti teška sa složenim fenotipovima (infektivna oboljenja, npr) variranje uzorka, porodica, dijagnostički kriterijumi, statistika različite istorije populacija, različiti patogeni, rezultuju u identifikaciji različitih gena koji utiču na rizik u različitim populacijama