Σχολείο Ηπατολογίας Ελληνική Εταιρεία Μελέτης Ήπατος. Ηπατίτιδα δέλτα. Γεώργιος Ν. Νταλέκος & Νικόλαος Κ. Γατσέλης

Transcript

1 Σχολείο Ηπατολογίας Ελληνική Εταιρεία Μελέτης Ήπατος Ηπατίτιδα δέλτα Γεώργιος Ν. Νταλέκος & Νικόλαος Κ. Γατσέλης Παθολογική Κλινική & Οµώνυµο Ερευνητικό Εργαστήριο Πανεπιστηµίου Θεσσαλίας

2 Σύγκρουση συµφερόντων Για τη συγκεκριµένη παρουσίαση Ερευνητική χρηµατοδότηση την τελευταία διετία Καµία Υπο-ερευνητής σε διεθνή και ελληνικά πρωτόκολλα: ROCHE, GILEAD, JANSSEN, BAYERN

3 Discovered in 1977 among HBV pa/ents, with serious episodes of acute liver disease (Mario RizzeAo 1977, Turin, Italy)

4 Ο κύκλος ζωής του ιού στα ηπατοκύτταρα Ø Παρόµοιος µηχανισµός εισόδου στο κύτταρο µε τον HBV Ø Τα µόνα κύτταρα που προσβάλλονται από τον HDV in vivo είναι τα ηπατοκύτταρα Ø Εξάρτηση από τον HBV (HBsAg) για τη συναρµολόγηση, είσοδο και έξοδο του HDV από το ηπατοκύτταρο Dastgerdi, World J Virol 2012

5 Χαρακτηριστικά του ιού Ο µικρότερος γνωστός λοιµογόνος παράγοντας που προσβάλλει τον άνθρωπο (µήκος 1700 νουκλεοτίδια) Έχει µεγάλες οµοιότητες µε τα viroids και τα δορυφόρα RNA των φυτών Είναι λοιµογόνος σε αραιώσεις σε ορούς HBsAg+ RizzeAo et al, Gut 2000 & J Infect Dis Branch et al, Science 89. Wang et al, J Virol 91. Barrera et al, J Virol 2005.

6 Μεταγραφή & Πολλαπλασιασµός Κυλιόµενος-κυκλικός µηχανισµός αναπαραγωγής Ριβοένζυµα µε ιδιότητες αυτοδιαχωρισµού (selfcleaving) και αυτοσύνδεσης (self-ligation) Κωδικοποιεί το HD Ag Μόνο RNA κατευθυνόµενη RNA µεταγραφή χωρίς DNA διαµεσολάβηση Μεταγραφή εξαρτώµενη από πολυµεράση του ξενιστή Μεταγραφή: RNA Polymerase II ξενιστή

7 Ο ρόλος του HDAg Ø δag-s: απαραίτητο για την έναρξη της σύνθεσης του HDVRNA και τουλάχιστον in vitro συµµετοχή στη µεταγραφή του RNA A G ADAR-1 Ø δag-l: αναστολή της λειτουργίας του δag- S και εποµένως της RNA σύνθεσης, απαραίτητο για τη µορφογένεση του ιού 24kDa 27kDa Το HDAg µπορεί να ενορχηστρώνει τον κύκλο ζωής του ιού µε µετα- µεταγραφικές τροποποιήσεις όπως: φωσφορυλίωση/ ακετυλίωση/ µεθυλίωση/ πρενυλίωση Chao et al, J Virol 1990 Yamagushi et al, Science 2001 Taylor, Advances in Virus Research 2009

8 ΤΡΟΠΟΙ ΜΕΤΑΔΟΣΗΣ ΤΟΥ HDV o o ΠΑΡΕΝΤΕΡΙΚΑ όπως ο HBV Απαραίτητη προυπόθεση η ΣΥΝΥΠΑΡΞΗ ΜΕ ΤΟΝ HBV SEIEVA 1993 SEIEVA Mele et al, Clin Inf Dis 2007 Τουρκία: βασικός τρόπος µετάδοσης ενδοοικογενειακά (Yurdaydin, personal communication)

9 Επιδηµιολογία GENOTYPE 1 GENOTYPE 1 GENOTYPE 1,2,4 GENOTYPE 3 GENOTYPE 5-8 HDV- infec9on affects approximately Million people world- wide Radjef et al, JVirol 2004 Makuwa et al, J Clin Microbiol 2008

10 Μείωση Επιπολασµού HDV Λοίµωξης: Έλεγχος HBV ΒΕΛΤΙΩΣΗ ΤΩΝ ΚΟΙΝΩΝΙΚΟ- ΟΙΚΟΝΟΜΙΚΩΝ ΣΥΝΘΗΚΩΝ ΚΑΙ ΤΩΝ ΣΥΝΘΗΚΩΝ ΥΓΙΕΙΝΗΣ ΛΗΨΗ ΠΡΟΦΥΛΑΚΤΙΚΩΝ ΜΕΤΡΩΝ ΓΙΑ ΤΟΝ HIV ΚΑΘΟΛΙΚΟΣ ΕΜΒΟΛΙΑΣΜΟΣ ΓΙΑ HBV τουλάχιστον από 1992 (Ελλάδα από 11/1998) Mele et al, Clin Inf Dis 2007

11 Hepa99s Delta is s9ll here! 43.3% 31% Prevalence) (%)) 24.6% 23% 24% 18.6% 14% 8.1% 11% 8.5% 6.8% 14% 12.7% Italy% Turkey%% London% Hanover Greece 1995 Smedile et al, Am J Epidemiol Sagnelli et al, J Hepatol Sagnelli et al, J Hepatol Gaeta et al, Hepatology Degertekin, Turk J Gastroenterol Cross et al, J Med Virol Wedemeyer et al, Hepatology Gaeta et al, Hepatology Dalekos et al, EJGH 1995

12 Dalekos et al. Prevalence of viral markers among refugees from southern Albania. EJGH 1995.

13 Emerging HDV Epidemiology: Migra9on

14 Buti, J Viral Hepat 2011 Μεταβολές στην επιδηµιολογία της ηπατίτιδας δέλτα νεαροί, άρρενες, IVDU ^ηλικία, µετανάστες

15 10.0% anti-hdv prevalence in Greece 60% anti-hdv testing in Greece 57% 8.0% 50% 6.0% 4.0% 4.2% 4.1% 4.4% 40% 30% 20% 35.30% 2.0% 10% 0.0% overall %

16 anti-hdv prevalence in Greece (adults) anti-hdv prevalence in Greece (children) 7.5% 7.8% 6.5% 60.0% 2.8% Greek immigrants Balkan Eastern Europe, Central Asia, Africa 4.5% 15.6% Greek Balkan Eastern Europe, Central Asia, Africa

17 ΠΑΘΟΓΕΝΕΙΑ HDV ΛΟΙΜΩΞΗΣ εν πολλοίς άγνωστη!!! Άµεση HDV κυτταροτοξικότητα Ανοσολογικά επαγόµενη καταστροφή ηπατοκυττάρων Ενδείξεις από παρατηρήσεις σε κλινικές περιπτώσεις ασθενών µε σοβαρή κεραυνοβόλο ηπατίτιδα από γονότυπο 3 στη Νότια Αµερική Nakano et al, J Gen Virol 2001 Ενδείξεις κυτταρικής ανοσολογικής απάντησης από περιορισµένο αριθµό µελετών που υποδεικνύουν ότι η ποιότητα και η ποσότητα της Τ- ανοσολογικής απόκρισης µάλλον σχετίζεται µε το βαθµό ελέγχου της λοίµωξης Nisini et al, J Virol 2007 Aslan et al J Viral Hepat 2006 Huang et al, J Gen Virol 2004

18 Παθογένεια HCV λοίµωξης LHDAg (p27) Ενεργοποίηση του µηχανισµού οξειδωτικού stress Ενεργοποίηση STAT-3 & NF-κB Williams, J Viral Hepat 2012

19 ΠΑΘΟΓΕΝΕΙΑ HBV/HDV 175 million 70-90% καταστολή πολ/ σμού του HBV (Raimodo et al, Hepatology 2006; Wu et al, JV 1991; Williams et al J Gen Virol 2009) HCV HBV 375 million HCV HBV+HDV+HCV (1/3 Ευρωπαίων ασθενών με HDV λοίμωξη) Ο HDV μπορεί να καταστείλει και τον HCV σε τριπλή λοίμω- ξη (Wedemeyer, Hepatology 2001) million 15-30% πολ/σμός & HBV (Wedemeyer, Nat Rev Gastroenterol Hepatol 2010)

20 Fluctuating Patterns of Viral Dominance in Hepatitis D Follow-up: 5-8 έτη Schaper et al. J Hepatology 2010

21 Κλινική εικόνα - Πορεία

22 HBV- HDV συν- λοίμωξη Οξεία HBV Οξεία HDV 95% κάθαρση Συχνά σοβαρή/ κεραυνοβόλος HBV- HDV επι- λοίμωξη Οξεία HDV Χρόνια HΒV 90% χρόνια δέλτα Σοβαρότερη νόσος από τη χρόνια HBV Κίρρωση 60-70% ΗΚΚ 3x

23 Κλινική σημασία HDV λοίμωξης Η πιο σπάνια ΧΙΗ ΑΛΛΑ η πιο σοβαρή & ταχέως εξελισσόμενη Causes of Hepatocellular Carcinoma in Turkey Cryptogenic (16.3%) Uzunalimoğlu et al, Dig Dis Sci 2001 Alcohol (6.6%) HCV+Alcohol (3.1%) HCV (16.7%) HBV/HDV (48%) HBV+HCV (3.5%) HBV+Alcohol (6.2%)

24 Κλινική εικόνα - Πορεία % Bu9 et al J Viral Hepat 2010 follow- up period: % 3% 13% Σταθερή νόσος Ρήξη αντιρρόπησης ΗΚΚ Θάνατος

25 Κλινική εικόνα - Πορεία 28 ετών μελέτη της πορείας της χρόνιας HDV λοίμωξης: Παράγοντας κινδύνου για κίρρωση και ΗΚΚ Ασθενείς HBsAg+/ an9- HDV+ Ν=299 (13 HCV+/ 13 HIV+) Romeo et al, Gastroenterology 2009 Μη- κιρρωτικοί Ν=113 Κιρρωτικοί Ν=186 (62%) ΗΚΚ Ν=46 (24.7%) Κλινική ρήξη αντιρρόπησης Ν=54 (29%) Ζώντες Ν=75 Θανόντες Ν=9 Lost Ν=29 OLT Ν=10 Ζώντες Ν=25 Θανόντες Ν=21 OLT Ν=19 Ζώντες Ν=25 Θανόντες Ν=25 Lost Ν=4 Ζώντες Ν=60 Θανόντες Ν=8 OLT Ν=18

26 HBV/HDV HBV HBV/HDV HBV J Hepatol 2013

27 Κλινική εικόνα Πορεία ΣΥΝΟΨΗ Ο HDV προκαλεί την πιο σοβαρή µορφή χρόνιας ιογενούς ηπατίτιδας οδηγώντας σε κίρρωση το 80% των ασθενών σε 10 έτη Αφού εγκατασταθεί η HDV σχετιζόµενη κίρρωση µπορεί να µείνει σταθερή για πολλά χρόνια αν και σηµαντικό ποσοστό των ασθενών πεθαίνουν από ηπατική ανεπάρκεια αν δε µεταµοσχευθούν Αυτόµατη ίαση συµβαίνει σπάνια

28 Διάγνωση

29 HDV Markers HDV Ag HDV antibodies Total HDV antibodies HDV IgM HDV RNA +++ BuJ et al, Prog Clin Biol Res Negro et al, J Hepatol Huang et al, J Gastroenterol Hepatol Modahl et al, Crit Rev Clin Lab Sci Sakugawa et al, Am J Gastroenterol 1997.

30 Διαγνωστικός αλγόριθµος Wedemeyer Liver Int 2011 & Lancet 2012

31 Διαγνωστικές εξετάσεις για την εκτίµηση ασθενών µε HDV λοίµωξη Wedemeyer, Nat Rev Gastroenterol Hepatol 2010

32 HDV RNA Need for quan9fica9on Iden9fy individuals with ac9ve hepa99s D Decision for treatment ini9a9on Monitor efficiency of an9viral treatment Individualiza9on of treatment dura9on Gatselis & Pawlotsky, J Hepatol 2011 (EASL poster)

33 Technique A Lab A Wedemeyer Technique B Lab B Gordien LightMix kit HDV (Roche) Lab C - Pawlotsky Extrac9on of HDV RNA Reverse transcrip9on Total Nucleic Acid Isola/on kit,tnai (Roche) Cobas Ampliprep Instrument (Roche) one step QIAamp MinElute virus vacuum (QIAGEN) Random primes Rnasin (Promega) SuperScript Reverse Transcriptase (Life technologies) QIAamp Viral RNA (QIAGEN) Random Primers RnaseOUT (Invitrogen) SuperScript III Reverse Transcriptase Purifica9on Montage PCR centrifugal filter devices (Millipore) Amicon Ultra 0.5 (Millipore) Primers & Probe F1: TGGACGTKCGTCCTCCT ( ) F2: TGGACGTCTGTCCTCCTT ( ) R: TCTTCGGGTCGGCATGG ( ) P: FAM- ATGCCCAGGTCGGAC- MGB ( ) Delta- F: GCATGGTCCCAGCCTCC ( ) T3- Delta- F: GCATGGCCCCAGCCTCC ( ) Delta- R: TCTTCGGGTCGGCATGG ( ) Delta- P: FAM- ATGCCCAGGTCGGAC- MGB ( ) amplifica/on of a 113bp fragment of HDV cdna amplifica/on of a 143bp fragment of IPC (internal posi/ve control) hybridiza/on probes for HDV cdna: LightCycler Red 640 hybridiza/on probes for IPC: LightCycler Red 670 Standard cdna clone in a psvl expression vector pcrii- dfr45- R log 10 c/ml Reac9on Mix 10μl extracted RNA 15μl 5x virus master mix (Quan/Tect Virus kit, QIAGEN) 0.75μl virus RT mix (Quan/Tect Virus kit, QIAGEN) 0.4μM primers 0.2μM probe final volume: 75μl 10μl purified cdna 25μl TaqMan Universal master mix (ABI) 0.3μM primers 0.2μM probe final volume: 50μl 5μl cdna 2μl LightCycler FastStart DNA Master HypProbe (ROCHE) 2.4μl Mg 2+ solu/on 25mM 4μl reagent mix (HDV cdna primers and probes) 4μl IPC mix (IPC primers and probes) 1μl IPC DNA final volume: 20μl Pla orm TaqMan 48 (Roche) 7300 Real- Time PCR system (ABI) LightCycler 2.0 Instrument Cycling program LLD: 15 cp/ml LR: cp/ml 50 o C 20min 95 o C 5min 50cycles: 95 o C 15sec 60 o C 45sec LLD: 100 cp/ml LR: cp/ml 50oC 2min 95 o C 10min 45 cycles: 95 o C 15sec 60 o C 1min LLD: 1000 cp/ml LR: cp/ml 95 o C 10min 50 cycles: 95 o C 5sec 62 o C 5se 72 o C 15sec

34 50 Evalua9on of primers, master mixes, real- 9me PCR devices Ct values Lab A technique 4 10 Lab A technique with Lab B primers 10 Lab A technique with TaqMan Universal master mix (ABI) 5 Lab A technique on 7300 Real- Time PCR system (ABI) Gatselis & Pawlotsky, J Hepatol (EASL poster) Log10 copies/ml 6 8

35 LABORATORY & TECHNIQUE Lab A samples Lab B samples Samples Genotype LAB A LAB B LAB C Lab A technique Lab B technique Lab A technique Lab B technique Roche kit Neg Neg Neg Neg Neg Neg Low Pos Neg Neg Neg Neg Neg 2 Neg Neg Neg Neg Neg nega9ve Neg Neg Neg Neg Neg

36

37 Gatselis & Zachou 2012 Cobas TaqMan 48 (Roche) TaqMan probe

38 Χαρακτηριστικά απόδοσης της μεθόδου 1.Ευαισθησία: 10 copies / ml 2.Ειδικότητα: 100% 3.Δυναμικό εύρος ποσοτικοποίησης: copies / ml 4.Inter- assay variability: Log 10 % CV (διακύμανση μεταξύ διαφορετικών πειραμάτων) 5.Intra- assay variability: Log 10 % CV (διακύμανση εντός του ίδιου πειράματος) Gatselis & Zachou 2012

39 Διατήρηση σε θερμοκρασία περιβάλλοντος για 4-6 ημέρες Mederacke et al J Clin Microbiol 10, Zachou et al Liver Int 09, Gatselis & Zachou 2012 unpublished data

40 HDV RNA & Ενεργότητα της νόσου /85 100% 80% /85 7/85 16/85 16/85 10/85 No of patients 60% 40% 20% HBVDNA >10^5 HBVDNA >10^3-10^5 HBVDNA >10^2-10^3 HBVDNA >10-10^2 HBVDNA HDV-RNA <120 HDV-RNA ^4 HDV-RNA >10^4-10^5 HDV-RNA >10^5-10^6 HDV-RNA >10^6-10^7 HDV-RNA >10^7 0% HDVRNA <120-6x10^4 HDVRNA 6x10^4-1,6x10^6 HDVRNA >1,6x10^6 Καμία συσχέτιση δε βρέθηκε με δείκτες ενεργότητας της νόσου καθώς και το ιστολογικό στάδιο της νόσου Zachou et al, Liver Int 2009

41 Antivir Ther 2012 anti-hdv IgM levels correlated with: histological inflammatory activity ALT and γgt levels anti-hdv IgM levels declined in: patients responding to antiviral therapy

42 Θεραπεία

43 Σύνοψη θεραπευτικών µελετών για την ηπατίτιδα δ Nucleos(t)ide analogues = ineffective IFNα = sustained biochemical response 0-36% treatment > 12m required treatment high doses associate with better survival PegIFN = SVR 17-43%

44 Alpha- Interferon...the only available treatment HDV - RNA clearance (%) N = 7-38/ study 80 End of treatment End of follow- up alpha- interferon pegylated - IFNα

45 NEJM 2011

46 Combination Therapy shows more pronounced HBsAg decline! NEJM 2011

47 HiDiT-2 Study Results: ü prolonged administration of PEG-IFNα-2a±TDF is safe in HDV-infected patients ü similar efficacy concerning HDV RNA suppression, HBsAg reduction, ALT normalization ü more than one third of patients experience a post-treatment relapse EOT (wk96) HDV-RNA negativity 47% PEG-IFN+TDF PEG-IFN 33% NS Wedemeyer, AASLD 2013

48 Meta-analysis: Antiviral treatment for hepatitis D Long-term suppression of HDV RNA by IFNα is not maintained despite an EOT response Adding lamivudine is not beneficial PEG-IFNα is superior to other medications with respect to EOT and EOFUP New RCTs should test combinations of PEG-IFNα and newest antivirals Triantos, Aliment Pharmacol Ther 2012

49 Θετικοί προγνωστικοί δείκτες ανταπόκρισης στη θεραπεία 1. naïve ασθενείς 2. χαµηλές τιµές γgt 3. µικρή διάρκεια της νόσου 4. απουσία κίρρωσης 5. αυξηµένα επίπεδα HDV RNA (>2.2 x 10 7 c/ml) Baseline 6. anti-hdv IgM neg End of Treatment Yurdaydin, J Hepatol Marzano, Ital J Gastroenterol Hughes, Hepatology 2009 (abstract). Yurdaydin, Hepatology 2009 (abstract).

50 HDV-RNA Ασθενείς µε HDVRNA (-) στον 6ο µήνα θεραπείας συνέχιζαν να έχουν HDVRNA (-) 6 µήνες µετά το τέλος της θεραπείας Ασθενείς µε HDVRNA (+) στον 6ο µήνα θεραπείας είχαν ιολογική υποτροπή 6 µήνες µετά το τέλος της θεραπείας Ασθενείς µε HDVRNA (+) στον 6ο µήνα θεραπείας συνέχιζαν να είναι HDVRNA (+) στο τέλος και 6 µήνες µετά Yurdaydin et al, JVH 2008

51 Virologic Responses 19% 29% 23% 32% Δεν παρατηρήθηκε διαφορά στην ανταπόκριση, ωστόσο παρουσίασαν συχνότερα ανεπιθύµητες ενέργειες EOT EOFU non-cirrhotics cirrhotics Turk J Gastroenterol 2012

52 ADV-containing treatment is associated with a significant decrease in estimated GFR of patients with HBV/HDV coinfection Addition of PEG-IFN to ADV did not lead to any further renal impairment J Viral Hepat 2012

53 Liver transplantation Rates of recurrent HBV-HDV infection are lower than 5% using low dose HBIg and antiviral prophylaxis in combination Rapid and Parallel Decline of HDV RNA and HBsAg after Liver Transplantation. Mederacke, J Hepatol Samuel, Semin Liver Dis 2012.

54 Liver transplantation but prolonged intrahepatic resistance of HDAg! Mederacke, J Hepatol 2012

55 FUTURE THERAPIES u entry inhibitors (Myrcludex) Lutgehetmann M, 2012 u prenylation inhibitors (in-vitro and invivo) Glenn JS, 2006 u Integrity of critical regions of the HBsAg Vietheer PT, 2005 changes in SW 196 L/S (rtm204i) of the small HBsAg induced by Lamivudine

56 Ηπατίτιδα δέλτα Σύνοψη I 1. Πρόκειται για µία λοίµωξη που απαιτεί πάντοτε τη συνύπαρξη του ιού της ηπατίτιδας Β 2. Μεταδίδεται παρεντερικά 3. Ο επιπολασµός έχει µειωθεί σηµαντικά στην Ευρώπη, αλλά παραµένει σοβαρό πρόβληµα δηµόσιας υγείας στον αναπτυσσόµενο κόσµο 4. Πρόκειται συνήθως για µετανάστες από ενδηµικές χώρες 5. Είναι η πιο σπάνια αλλά και η πιο σοβαρή µορφή χρόνιας ιογενούς ηπατίτιδας (80% αναπτύσσουν κίρρωση, 3πλάσιος κίνδυνος ανάπτυξης ΗΚΚ)

57 Ηπατίτιδα δέλτα Σύνοψη II 6. Απαραίτητος ο έλεγχος για anti-hdv σε όλους τους ασθενείς µε ΧΗΒ 7. To HDV RNA είναι απαραίτητο στην εκτίµηση της ενεργότητας της νόσου και στην παρακολούθηση της ανταπόκρισης στη θεραπεία 8. Αποτελεί δύσκολο θεραπευτικό πρόβληµα Peg-IFNα: πρώτης γραµµής θεραπεία, αλλά δεν επιτυγχάνει µακροχρόνιες απαντήσεις Τα NUCs ως µονοθεραπεία δεν έχουν αποτέλεσµα Η µεταµόσχευση ήπατος αποτελεί σηµαντική αλλά τελευταία λύση 9. Έρευνα για την ανάπτυξη νεότερων θεραπειών (prenylation inhibitors)

58

59 Ευχαριστώ για την προσοχή σας!