:. :

Transcript

1 :.:

2 :.:

3 2

4 .!.!.!.!.!.!.!.!".!.! 3

5 4

6 5

7 6

8 ,,, 7

9 8

10 ΠΕΡΙΕΧΟΜΕΝΑ Πρόλογος...13 ΓΕΝΙΚΟ ΜΕΡΟΣ...17 Ι. ΦΥΣΙΟΛΟΓΙΑ ΤΗΣ ΑΙΜΟΣΤΑΣΗΣ...19 Α. AΡΧΙΚΗ ΑΙΜΟΣΤΑΣΗ...19 Α1. Αιμοπετάλια...19 α) Παραγωγή των αιμοπεταλίων:...19 β) Κυκλοφορία των αιμοπεταλίων:...20 γ) Δομή των αιμοπεταλίων:...20 δ) Λειτουργία των αιμοπεταλίων...21 Φάση της πυροδότησης...22 Η μεταβολή του σχήματος των αιμοπεταλίων Προσκόλληση των αιμοπεταλίων...23 Αντίδραση απελευθέρωσης των αιμοπεταλίων:...24 Συσσώρευση των αιμοπεταλίων:...25 Φάση μεγιστοποίησης...25 Φάση ολοκλήρωσης της διέγερσης των αιμοπεταλίων Η αντίδραση flip-flop. Προπηκτική δραστηριότητα των αιμοπεταλίων:...26 ε) Έλεγχος της λειτουργικότητας των αιμοπεταλίων...26 Α2. Ενδοθήλιο...27 Β. ΠΗΞΗ...28 Β1. Αναλυτική μελέτη των συστατικών της πήξης...28 Το μόριο του ινωδογόνου...34 Καρβοξυλίωση των παραγόντων της πήξεως:...36 Β2. Συνθετική Μελέτη...36 Β2. α. Ενζυμικά συμπλέγματα...37 Β2. β. Συνοπτική σύνθεση των ενζυμικών συμπλεγμάτων...39 Δεκάση Ι ή εξωγενής δεκάση (TF/VIIa/Ca ++ /φωσφολιπίδια)...39 Η δεκάση ΙΙ ή ενδογενής δεκάση (ΙΧa/VIIIa/ Ca++/φωσφολιπίδια)...40 Η προθρομβινάση (Xa/Va/Ca++/φωσφολιπίδια)...40 Β2. γ. Το σύστημα επαφής...41 Β2. δ. Φυσιολογικοί ανασταλτές του πηκτικού δρόμου PC, ΤΜ, PS και EPCR Ανασταλτής του δρόμου του ιστικού παράγοντα (Tissue factor pathway inhibitor- TFPI) Το σύστημα της Αντιθρομβίνης...49 Β2. ε. Ο ρόλος της θρομβίνης...51 B3. Δυναμική μελέτη...52 Συμπεράσματα από τις μελέτες δυναμικής της πήξης...53 B4. In vivo ενεργοποίηση της πήξης...55 Γ. ΙΝΩΔΟΛΥΣΗ...57 Γ1. Εισαγωγή...58 Γ2. Συστατικά του ινωδολυτικού δρόμου...58 Γ3. Μοριακός μηχανισμός ινωδόλυσης...58 Γ4. Ο TAFI (Thrombin activatabe fibrinolysis inhibitor) και ο ρόλος του στην ινωδόλυση...60 Ο ρόλος του TAFI στην ινωδόλυση...61 Ο ρόλος του ενδογενούς συστήματος στην ενεργοποίηση του TAFI...61 O ρόλος του TAFI στις αιμορραγικές διαταραχές...62 ΙΙ. ΑΙΜΟΡΡΑΓΙΚΕΣ ΣΥΓΓΕΝΕΙΣ ΔΙΑΤΑΡΑΧΕΣ...64 ΜΟΡΙΑΚΗ ΓΕΝΕΤΙΚΗ ΤΩΝ ΑΙΜΟΡΡΟΦΙΛΙΚΩΝ ΣΥΝΔΡΟΜΩΝ...64 Οι παράγοντες VIII και ΙΧ στην πηκτική διαδικασία...64 Αιμορροφιλικά σύνδρομα...65 Τα γονίδια και οι πρωτεΐνες των παραγόντων VIII και IX...66 Factor VIII...66 Factor IX...70 Η μοριακή βάση των αιμορροφιλικών συνδρόμων...71 Τύποι μεταλλάξεων...72 Αναστροφή στο ιντρόνιο 22 του παράγοντα VIII...73 Μοριακή παθολογία- Σχέσεις αιτίων- αποτελέσματος...75 Μη νοηματικές μεταλλάξεις στα κωδικόνια CGA (αργινίνης)...75 Δυσνοηματικές μεταλλάξεις στις θέσεις ενεργοποίησης των VIII και ΙΧ...75 Μεταλλάξεις που επηρεάζουν τη θέση σύνδεσης του παράγοντα VIII με τον παράγοντα von Willebrand...75 Μεταλλάξεις που επηρεάζουν την έκκριση του παράγοντα VIII...75 Μεταλλάξεις που επηρεάζουν τη σύνδεση του παράγοντα ΙΧ με τον VIII

11 Μεταλλάξεις που προκαλούν ανεπάρκεια του παράγοντα ΙΧ κατά τη διάρκεια της αντιπηκτικής θεραπείας...76 Μεταλλάξεις στην περιοχή του προαγωγέα (promoter) του παράγοντα IX και η αιμορροφιλία B Leyden...76 Κλινική εικόνα αιμορροφιλίας...77 Γιατί οι αιμορροφιλικοί αιμορραγούν, κυρίως, στις αρθρώσεις...78 Δυνητικοί ρυθμιστές της σοβαρότητας της αιμορροφιλίας...79 Οι μεταλλάξεις και ο κίνδυνος ανάπτυξης αναστολέων...79 Κλινικές εφαρμογές της μοριακής διάγνωσης της αιμορροφιλίας Α...81 Κλινική διάγνωση βασιζόμενη στο DNA- προγεννητικός έλεγχος...81 Άλλες γενετικές βλάβες που σχετίζονται με ελαττωμένα επίπεδα παράγοντα VIII...82 Νόσος Willebrand (vwd)...82 Συνδυασμένη ανεπάρκεια των παραγόντων V και VIII...83 ΙΙΙ. ΣΥΓΓΕΝΕΙΣ ΘΡΟΜΒΟΦΙΛΙΚΕΣ ΔΙΑΤΑΡΑΧΕΣ...84 ΘΡΟΜΒΟΦΙΛΙΑ- ΟΡΙΣΜΟΣ...84 Σχετικός...86 ΟΛΙΓΟΓΟΝΙΔΙΑΚΗ ΚΛΗΡΟΝΟΜΙΚΟΤΗΤΑ ΤΗΣ ΦΛΕΒΙΚΗΣ ΘΡΟΜΒΩΣΗΣ...86 ΥΠΟΨΗΦΙΑ ΓΟΝΙΔΙΑ...87 ΤΑΥΤΟΠΟΙΗΣΗ ΠΡΟΘΡΟΜΒΩΤΙΚΩΝ ΜΕΤΑΛΛΑΞΕΩΝ ΜΕ ΕΡΕΥΝΑ ΑΛΛΗΛΟΥΧΙΑΣ (SEQUENCING)...88 ΠΟΛΥΜΟΡΦΙΣΜΟΙ ΚΑΙ ΚΙΝΔΥΝΟΣ ΘΡΟΜΒΩΣΕΩΝ...89 ΜΕΛΕΤΕΣ ΣΕ ΟΙΚΟΓΕΝΕΙΕΣ...94 Activated Protein C resistance (apc-r) ή και παρουσία μετάλλαξης FV Leiden...95 Μετάλλαξη της προθρομβίνης ΙΙ G20210A...99 Έλλειψη Πρωτεΐνης C (PC) Ανεπάρκεια πρωτεΐνης S (PS) Ανεπάρκεια Αντιθρομβίνης (ΑΤ) Υπερομοκυστεϊναιμία/MTHFR C677T Αύξηση των επιπέδων του παράγοντα V Αυξημένα επίπεδα παράγοντα VII Αυξημένα επίπεδα παράγοντα VIII Αυξημένα επίπεδα παράγοντα ΙΧ και θρομβοφιλικός κίνδυνος Υψηλά επίπεδα παράγοντα ΧΙ και κίνδυνος θρόμβωσης Υψηλά επίπεδα παράγοντα von Willebrand και κίνδυνος θρόμβωσης Ανεπάρκεια του παράγοντα ΧΙΙ και θρομβωτικός κίνδυνος Ο ρόλος της ινωδόλυσης στη θρόμβωση Αύξηση των επιπέδων του ΡΑΙ Ανεπάρκεια του πλασμινογόνου Aύξηση της α2-αντιπλασμίνης (α2-αρ) Αύξηση των αιμοστατικών παραγόντων και θρομβοφιλική διάθεση- ελληνική μελέτη ΕΙΔΙΚΟ ΜΕΡΟΣ Ι. ΥΛΙΚΟ Αιμορραγικοί ασθενείς Φυσιολογικά άτομα (ομάδα ελέγχου) Θρομβοφιλικοί ασθενείς ΙΙ. ΜΕΘΟΔΟΙ ΜΟΡΙΑΚΗΣ ΒΙΟΛΟΓΙΑΣ Δομή του DNA Μέθοδοι ανάλυσης και τεχνικές μοριακής βιολογίας Απομόνωση γονιδιακού (genomic) DNA Αλυσιδωτή αντίδραση πολυμεράσης (Polymerase Chain Reaction- PCR) Αρχή της μεθόδου PCR θερμής έναρξης (Hot start PCR) Ανάλυση πολυμορφισμών μήκους θραύσματος από ένζυμα περιορισμού (Restriction Fragment Length Polymorphism- RFLP analysis) PCR- RFLP ανάλυση Ανίχνευση του παράγοντα V Leiden Ανίχνευση του αλληλίου 20210Α του γονιδίου της προθρομβίνης PCR μακράς ακολουθίας (Long PCR) για την αποκάλυψη της αναστροφής του ιντρονίου 22 στο γονίδιο του παράγοντα FVIII PCR μακράς ακολουθίας (Long PCR) για την αποκάλυψη της αναστροφής του ιντρονίου 22 στο γονίδιο του παράγοντα FVIII Ανίχνευση της μετάλλαξης C677T του γονιδίου της μεθυλενοτετραϋδροφολικής ρεδουκτάσης (MTHFR C677T) ΙΙΙ. ΜΕΘΟΔΟΙ ΠΡΟΣΔΙΟΡΙΣΜΟΥ ΤΩΝ ΠΑΡΑΓΟΝΤΩΝ ΠΗΞΕΩΣ Γενικές αρχές Προετοιμασία του ασθενούς Τρόπος αιμοληψίας

12 Συλλογή δείγματος Βαθμονομήσεις καμπυλών Ειδικό μέρος Πηκτική μέθοδος για τον προσδιορισμό του παράγοντα ΙΙ Πηκτική μέθοδος για τον προσδιορισμό του παράγοντα V Πηκτική μέθοδος για τον προσδιορισμό του παράγοντα X Πηκτική μέθοδος για τον προσδιορισμό του παράγοντα VII Πηκτική μέθοδος για τον προσδιορισμό του παράγοντα VIII Πηκτική μέθοδος για τον προσδιορισμό του παράγοντα IX Πηκτική μέθοδος για τον προσδιορισμό του παράγοντα XI Πηκτική μέθοδος για τον προσδιορισμό του παράγοντα XIΙ Μέθοδος για τον προσδιορισμό της Αντιθρομβίνης με τη χρήση χρωμογόνων υποστρωμάτων Μέθοδος για τον προσδιορισμό της πρωτεΐνης C (PC) με τη χρήση χρωμογόνων υποστρωμάτων Μέθοδος για τον προσδιορισμό της ελεύθερης πρωτεΐνης S (free PS) με τη χρήση ανοσοενζυμικής μεθόδου ΕΙΑ Μέθοδος για τον προσδιορισμό της α2- αντιπλασμίνης με τη χρήση χρωμογόνων υποστρωμάτων Μέθοδος για τον προσδιορισμό του πλασμινογόνου με τη χρήση χρωμογόνων υποστρωμάτων Μέθοδος για τον προσδιορισμό του αναστολέα του ενεργοποιητή του πλασμινογόνου (Plasminogen Activator Inhibitor- PAI) με τη χρήση χρωμογόνων υποστρωμάτων Ανοσο-θολοσιμετρική μέθοδος για τον ποσοτικό προσδιορισμό του αντιγόνου του παράγοντα Willebrand (vwf:ag) Μέθοδος για τον ποσοτικό προσδιορισμό της δραστικότητας συμπαράγοντα της ριστοσετίνης παράγοντα Willebrand (vwf:ricof) IV. ΣΤΑΤΙΣΤΙΚΕΣ ΜΕΘΟΔΟΙ V. ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ Α. Έλεγχος μεταλλάξεων (γονιδιακός έλεγχος) Α1. Ομάδα ελέγχου (φυσιολογικά άτομα) Α2. Ομάδα αιμορραγικών ασθενών Α3. Ομάδα θρομβοφιλικών Α4. Σύγκριση συχνότητας θρομβοφιλικών μεταλλάξεων μεταξύ αιμορραγικών ασθενών και ομάδας ελέγχου Α5. Σύγκριση συχνότητας θρομβοφιλικών μεταλλάξεων μεταξύ θρομβοφιλικών ασθενών και ομάδας ελέγχου Α6. Σύγκριση συχνότητας θρομβοφιλικών μεταλλάξεων μεταξύ αιμορραγικών ασθενών και θρομβοφιλικών Β. Επίπεδα αιμοστατικών παραγόντων (πηξιολογικός έλεγχος) Β1. Ομάδα ελέγχου (φυσιολογικά άτομα) Β2. Ομάδα αιμορραγικών ασθενών Β3. Ανεύρεση αιμορραγικών ασθενών με παθολογικά επίπεδα αιμοστατικών παραγόντων που μετατοπίζουν την αιμοστατική τους ισορροπία προς την πλευρά της θρόμβωσης Β4. Σύγκριση μέσων τιμών των παραγόντων μεταξύ αιμορροφιλικών ασθενών και ομάδας μαρτύρων Γ. Εμφάνιση θρομβωτικών επεισοδίων σε αιμορροφιλικούς ασθενείς VI. ΣΥΖΗΤΗΣΗ- ΣΥΜΠΕΡΑΣΜΑΤΑ Ανασκόπηση της βιβλιογραφίας Α. Συνύπαρξη αιμορροφιλίας και προθρομβωτικών μεταλλάξεων Β. Η μετάλλαξη του παράγοντα V Leiden ως πιθανός εξελικτικός μηχανισμός επιλογής Β. Η μετάλλαξη του παράγοντα V Leiden ως πιθανός εξελικτικός μηχανισμός επιλογής Γ. Θρομβοεμβολικά επεισόδια σε αιμορροφιλικούς Δ. Αθηρωμάτωση και αρτηριακή θρόμβωση σε αιμορραγικούς ασθενείς Συζήτηση των αποτελεσμάτων της παρούσας μελέτης Α. Γονιδιακοί θρομβοφιλικοί παράγοντες B. Επίπεδα αιμοστατικών παραγόντων- σύγκριση μεταξύ αιμορροφιλικών και ομάδας ελέγχου..188 Γ. Θρομβωτικά επεισόδια σε αιμορροφιλικούς VII. ΒΙΒΛΙΟΓΡΑΦΙΑ VIII. Περίληψη ΙΧ. Summary ΠΑΡΑΡΤΗΜΑ

13 12

14 6. + * (), * ) -0*, + + 0). ) ) )< ) + - /. 0. ( *,, ) 0 */ , -. ),, )7, ) /*, )-, , - - )7 --- /*. ' , (feedback), - /,,. /. ( /*, 0 4,. / - /*. 0. ( 4 / 0, ). & ) - * 4 ) -), --. / +0, -. ) /*. & - - ) + 0, ) /* (&'), )7 C S (PC, PS), - (tissue factor pathway inhibitor- TFPI), 2-+, 4- ) /*. -., /*, / ) - /*, - 0 /*. '0, ) /* 4, * + - / / 0 4 ) / /*, / +. 1 ) + ) / * / 0.,.,. 4 ) 0;, * ) /, ) 0; ), ) ) /*). E, ) / - -., / / 0. & / -/ / 0 13

15 - / 0 /.. ( - ) ) ** / ) - 0; * + /. -/ ) / ; ( 0 0/ -*. ( - - ) ) ) ) / 0.. /*)-/., - 4 ).. /*) - ), / - ) ) ) 0 /*). ( ( / 40 -) ) ) 4 ( - / )0) ) ) 0 4 / / - 0 / ) -/,. ) /. 0 ) -0 /, - ) /*), / - /*) -.?),., 4 - * ) ) + / (. + ) /, HIV), - ) / / 0 + 4) /*+ (, / )), ) /*) / /*+ ) +, / -, /,. 0 / / / /*) -. ( , 0,. /) 0., / / - /*+.!, ), + )0 /*+,,., , -, / &/ 0, 0. **+ ;. ( / - : ( 0 ) 4) / 2. & 9, -/ /. &04-. /. &04- % (0 * *0). (*. 0 ) ) /!- & & - & 9. /.! (0 * ). (!- & / ) / ( /*+), / 0-0. (0-0. / DNA 2 ). 9 /.) / ) /. &04- % 0-) ) -*, /. 4 14

16 .. *0, ,. +0) ) *) 0 --, -./ / ) /. 9 /,,.) / /. &04-, -/ 2. &..9. / , / 0*. '.!, /!- &,/ /.) /,. 4 /-.- -*,, ), ) &, +.. *0 ) 0, */ 0 &, 0; ) -. &. 9 /,,.). Michael Makris, -/ & Royal Hallamshire Hospital Sheffield, ) Daly Martina / */ *. * ) ) 4. ( + 4, - &, +,. / /. /. '0,/ /.) +. ', */ 0 -, ). / $.!0 &04, -/) 0 ) ). 15

17 16

18 17

19 18

20 .?) / ), + * ) -) -. ) ). ( *. * +0 )- ( )7 ) ( ) /*, 0 -. ( ) 4. -, , ), -., 4 )-. / A ( , 0., ), -/ ) ). (.. * , ) -/. ) ). ' -/.. -0, - -.) ) ) (- -- -/ - ) 4 ). & * / ) **, / */0-0 *.0 *0, /0 ) ) -: ) ' - «flip flop» *, +)+-, +)+ - *, 0 ), 0+ 4) * ) 0) ), Va VIIIa. ( -. ) ) «-» «/*». *) ' - /0) (release reaction), -- 0 ) ) - )- ) () ) -)- )) * 4. + ) ) (! 1994). 1. )!: ' ). ) ). ' - ) ), *, , * )

21 4. - 4, /) - ). ), -- 4, ). & - /. * ) ) /)/ + ( ) ) ) * 0.., ) /*., -6 (IL-6), ) ) ), ) IL-3 GM-CSF (Colony Stimulating Factor). ( ) ) ),, 4 4 / ) ) (! 1994, Hoffbrand, Petit, 1993). ") #$%!!:. ) ) + ) , 0 36 /0). ' - / - +,.), /), ** m, / x 103/ l (!,- -* 1978). ) &!: ( - ) ) (. 1) 0 ) )<,. 0 ) & *,,, - ;,. ( *.) ). 0., 0. +, 0 )7 +/. ( * *-, - +)+-0 )<, )7, ) ' +)+ - * ( - PF3) O )7, *.- 4, ) *. ) ) ). - )< -. -,. ( - )7 (GP) Ia. )7 Ib ()0 - Bernard Soulier), IIb IIIa ()0 /*/0) - - ) ) von Willebrand (vwf) -/ ) ). )7 IIb- IIIa,, )-, -. ) ) ) ) ).( - ) ) - ) ) ) ) 20

22 (. - /0)), ) ) ) ( ), - * ) ), - - +,, 0 0 )7 (-, /. ) ;--)). ( + -0 ) ) ) 7-20 ),. ) *. ' ) ) ), * *, + ) ) 0 ). ' ) ) ) - 0. ), < - ), -. * 0. ' ) - : ) (--)-) 0. *0, - () ADP). *)' ) (4 - PF4), 4 (PDGF), *- /*, )-, vwf 4), +. ) ), ) 4), 0.. -) ', 0 / ) ). - - /0), + ),. ) ) /.. ( ) +)+ ).-, / * ) ).' ) ) ), / - -, 0. * /0 / ) - /*4 &2 (! 1994, Hoffbrand, Petit, 1993). ') #!!. ( ) ). /*) , 0, 4, / -,--. 21

23 - : 4,)-, FV, vwf, #, *-/*, - (PF4), 9*-. : - (ADP), Ca 2+, & *.- $*- )7 ). 1: '!. ()* * #'*)*. ( -. + ) ) **. ) +,. (-0), - ) ). '0 : ADP 0 -/ 0 4). /.. '&DP 0; 0; -4. ( **, ) ), )0.. (/* ) **,. -. 0; ) ). PAF (Platelet activating factor), / - 0 ) ** 0 -/ (, ) ),. -. (! 1994). " # )+!. 1 / + ) ) + - * ( * 4) **. ( *.. - ) + -, / * + * /., * 0. * -- (* ;--)),, 0, -0., - 22

24 + 0 0/ + + 0/ (! 1994). )$*)*!. 6 (. 2) /)0.) ) ) +, * + *.,, * ;-- ) + **, () in vivo ** in vitro). H ) + - ) 0 -/ *- 0+ ) vwf, + *, */ ).)., --, 4. - ). (-. +/ **) *) * ) ) (-. +/ *. + **). ' - - -/ - von Willebrand (vwf) 0) -0 )7 GPIb-IX ) ). ' ) )< GPIIb-IIIa /. - /0-0) 0) vwf. ( - )7 GBIa. '0, 0 / )< 0 - )-. ) ) 4. ( ) ) * -) - - /0) ) ),.. ) ): ( ) 0+). 0. (platelet rich plasma- PRP), - -/ *-. & )./. ( ), /. ) / + 0, 4)/., ), ) 0/, +0. $. /.0 ) ((t). ( ) ) / + ) *. ()... * - ) 4 ) ). ' ) )., ) 0 */, ) ): /. (>1300cm/sec), 0, -./. ) *. ) vwf. &/, /. (300cm/sec), 0, */ vwf, ) -,. + - (! 1994, Hoffbrand, Petit, 1993). 23

25 GPIb GPIIb GPIIIa GPIa $ "(* ( von Willebrand ', - $#. 2: )$*)*! ) # ', '.)# # ( von Willebrand.!')* #,.)*!: ( 0/ ) ) - /* 0. ) ) ) ) ), -- 0 ADP,, )-, ) ), *- /** - (PF4).' /* / -.,. /0) - ( )< +)+ ) -0 )< C) +)+ ( /0) ) ) - * ). 0, *.- 4, ' /*4 &2, - camp ) ) - - /0). ( 9*4 & ) ), ) ) ) ) , ( - /0) camp.! 0 (PGI2), / -/. 0. ) ), / - / + -/ (Hoffbrand Petit, 1993,! 1994). 24

26 %)%!' -/ %)%!' +)+ +)+ +'$ 01 +'$ '2 0!' PGG2, PGH2 )$#$!* '2 0!' PGG2, PGH2 /"0(* 2 / /* camp +)+- MP Ca : / /*4. / - ) ) 0 0) camp, ' camp 0. 0) ) /) ) *, --. $; - camp - ) ) /) ) * -. #))3 #)*!: ) -- 4)- *, *, / -0 4 */ )- Ca++, 0+. ( - - : ) ) - )<, *) 0.0 ) )- ) ) ) ), ) -4 ) +)+- ) ) )- * «flip-flop - -) 4)). -. ) ), )- 0+, ) Ca++, * )7 GPIIb-IIIa (Hoffbrand Petit, 1993,! 1994). ()* )!*)*. + *, ) - 0 ) ), ), ),. **. 6-0 ) ) /) / -0 : ' ADP, /*4 &2 (TXA2), PAF,, 5-HT +)+ (IP3).. -. /0) ) - * -- ) (ATP, ADP, Ca++),. -0 ) ) ), / ; , -/ 4 (GPIIb-IIIa) -Ca++-- Ca++- (GPIIb-IIIa). 25

27 -,. 0;, - ) - 4 ) -. ' 0- * +./ ) --0) ) / 4)).0 ) - )- ). &. -0 ) ) (... /* ), -0 0; / -. 0; (Hoffbrand Petit, 1993,! 1994). ()* $)* * '. )*! ) )- ),. <- ) +0, - -, ) ) -, 4)), 0 -- ) - (TXA2, ADP, PAF, PF4, PF3, FXII, FV, FI, FVIII, FXIII, *-TG). 0 ) ) ).. /*. &/ ), ) PF4 ( ) 0 )7 C, #,. /* -. /0) ** 0 -/ + + FVII (! 1994, Hoffbrand, Petit, 1993).!')* flip-flop. *$$ ')**!: ' +)+ - - *- * ) ) ) «+» 4) 0 *, / ) + +)+-.. ' +) ) * ) +)+- ( / ). - flip-flop ( * +)+ - * ) )- )) +) / 4) + *. 1 -/ ) *. (-) IXa, VIII X / Xa. - (/*). /* - ) ) Xa, V II. &./* +- flip-flop - V VIII. & ) /* * / (! 1994, Hoffbrand, Petit, 1993). ) 4 + * #$*!.. 0. / /.,.. & ) 0) ),, / )+-- * +)+ &2 * * () 4 - /*4 &2) - () ADP ) -)., ), ADP 0 0) -, 0. ) ), ) ) 26

28 ,. 0 -/ ) ) ** - / -. / + ) -/ ) - /* - **,. -. ( 4 ) /0) 0/ /* - -/ 4 - ) - -=4- ) - ),. ) ). ( ) 0) ).- 4 * () 4 - /*4 &2) / - () ADP ) -) 0. / /.,.., ), ADP 0 0) -, 0. ) ), ) ) ,. ( -0 /*, 4 ) /0) 0/ /* - -/ 4 - ) - -=4- ) - ),. ) ). ' +,., +0, - - / +)..0 (!, 1994) / ) ) - - ) -/ ), &/, -/. 1 -/ : ) %. & / ( 0) -/ :, + * ) -/ ) /*).'0 : ) ( *). 0. -/ 27

29 (endothelial derived relaxing factor, EDRF) 4 - ( ) ) /< (heparan sulfate, HS). & + 4, ) /*. & /* /* (&'), * +. ' + / in vitro. In vivo, ), /. -. /,.. ) ) + ) -/ )., ) - /, -/ +0 /<0. ) ) (! 1994). *)%.. & + /* - 0 -/. ' -/ / **, ) -/, - ) ),., ) vwf, +, *,, PAF ADP, -,, ) (Tissue factor, TF), 4. ' -/ 0 -/ -. ) - ) RGD, * GPIIb-IIIa ) -/ ). ** -/ *-, - - ) ), ) -+ +0, * * < - (Hoffbrand Petit, 1993,! 1994) ( 4 --,., ). /* 0 )-, - )7,. (. - ) ) ) /0 0 0 / /* / /* (!, + ). (*. 0 * /. ' + ) 0 --, - -.0) 4 ) (/ 0) ) ( 0 ) , ) ) Alexander Schmidt Paul Morawitz, 0/ / * /* /* /* )- /*. - 20, 0 4),., -/ */ ) /. &0 0 / - ) 28

30 : ) / / *) *. 1 / / ): + & ( VIII), + 2. Christmas ( ),. Stuart ( ), VII SPCA (serum prothrombin conversion accelerator), + C ( ), + ( 4 V). O Paul Owren, 0; +, 0 V, ( /*, *0, /* )-) 0; ). /*. 1,, / /0 / ) ) 4 (!ann, 1999). )0 - Smith owa Armand J. Quick ) -). ( *. - + /* (11-12sec) 0. /* (Quick time) - - *).) - - /. /- +. /* ( - + /- ) --. ) + / +0 0; / 0. -) *0. ) II, V, VII, IX X ) ) ). 1, -. /* +/ ) *- 40) ) () II, VII, IX, X) ). 0, 4, *// 4. /* Langdell. ( -, + /-, - ) ( Hageman), <, ; *, ) ) ), ) ) ; ) ) VIII, IX XI, -- + &, 2 C. ( ) +/ /*, /* -/ - 6 ( - /*, / --0, -). & +/ 0 / - /*0, ) &/* &/* + // &/* (&'). 0 - (TFPI). ;,. ( ; -*4 ) + - ).) ) ) (-, /*), +0 - ; ) 40) ) *- 40) ). '0 0 )7 C, S > (PC, PS PZ.), (- PC - ; /* ('!) /* - PC 0) 29

31 - -. "> / 0 4/ , /, / -. ) (! 1994, Mann 1999). ( 0) ) ) /0 **.? - 4) * ) +: -/ *-, +)+ - * ) ).? 4, 4 )-, 0 +0 ) (-0) ( ).? 0, 4, -), Ser, Asp, His 0 (. 4)., 4) - - (Mann, 1999,! 1994). 30

32 !$ 1: 4.,- ) (Kb) mrna (Kb) $ &! (nm) /* FV 1q FVIII Xq FVII FIX X FX 13q32-qter FXI 4q FXII 5q33-qter HMWK 3q26-qter Prekallikrein 4q34-q Na 450 FXIIIa 6p > FXIIIb 1q31-q Na TF PC 2q PS '! 20p12-cen )- 4q23-q &' 1q (co-ii 22q TFPI 2q31-32, Na 2.5 TAFI Na 73 * TF= (Tissue factor), '!= /*, Hco-II=, TFPI= 0 - (tissue factor pathway inhibitor), TAFI= /* 0 )- (thrombin activated fibrinolysis inhibitor), Na= -. -/0 + (!ann, 1999). / )7 4) & (domains) )- 4.) 4.,. - ). -+ )<,..0 0 / ) )< */, - - *. )< ) 0 (. 5). 31

33 . Ser a / - + S-S S-S * Se + a Se + 4: & Xa, IXa. &0.0 : 1. - ) (signal peptide): - ) 0) )< 0.. (25-30 ) 40)) ? 0 )7 / ), )7-0/ Carboxyglutaminic Acid- Rich Domain (Gla domain): ' - (25 40)) 0. /0 - - *4 / + *4 /0 - ) ) *- 40) ) 0 -*4- ) - *4)0 ). &0) *4 ) ) )< -.). &* - - * Glu domain (40 40)). ) ) - *4. ( *4 ). 0 glu. gla, *- 4 - ) )< *. ( *4 ) ) 40 - * ) ) (4- / *4), + 0, ) ),... * ) Epidermal Growth Factor Domain (EGF domain): (. ( )),. - -, )7 * - 0 EGF EGF-like )7, ), 0.. )< ). 4. Kringle domain: (. (100 40)) ; ) / 4 32

34 )... - )< 5..: (.. /;./; 0. *: )!. / ii) 1. / - ) -. iii) 90 ) ). iv) )<. 8.0 ) )< - 0. aromatic amino acid stack domain +. )7 0 -, & )<:, ( V VIII), * 0; + * ( - TF /* - '!). - V VIII /)!! 2 (!!2) - )7 +, V ) -, VIII ) - ) von Willebrand (vwf). )7 30%. ) 40) - + & - C & - 0 ) () /* - V a) - 0 (activated V-Va, activated VIII VIIIa) Va VIIIa. 0 * + -. TF '! 0 )7 *. - ). & 0/ *. ' ) 40). ( -0 * ). 0,.0,, -* 4) TF +0 /, - * + -/ ) ), ) 4), -/ +.0 ( ), ( '! * + ) -/ ) ) ) ) -/ ) ). % '! *, 4, 0 0. '! ) -/ ) ) ) 0 ) ((Mann, 1999,! 1994, Hoffbrand, Petit, 1993). (- ) ) )<

35 S i g n a l P e p t id e P r o p e p ti d e G la d o m a i n K r i n g le d o m a in A r o m a t ic A m in o a c i d s t a c k d o m a i n E G F d o m a i n P r o e n z y m e a c ti v a t i o n r e g i o n C a ta ly t i c d o m a i n R e p e a t - s e q u e n c e d o m a in A D o m a i n B D o m a in C D o m a in.7# FVII FXI FIX FX FII )#( FVIII FV. 5: ( - ) ) 4). # '# ' )- - ( D -), 0. * * - -, / -0 - (&, 2* ), (. 6). (/* * -& ) (, * ). ' ),.! - +) /. 0 /* / - ) ) )<, ) 5!. H -.) 4 D. (. 6 7) (Mann, 1999,! 1994, Hoffbrand, Petit, 1993). 34

36 ,/*,, a + # -& # - 2 2* D + D + & + 6: & )-.! -, * -) ' *4 ) -) D.. 0, *4-04). D. 9* a D-D D-D + 7: ' )-, ) )7 -, - D (.) 0 (.).( 4. ) +0) -- ) & 2 )- - /*. ). & ). D ) ) ) *4 ) ) -) ) D. -. ( * *4 ) -)-.) D -. 35

37 "0#!)* * 0 : (- ) ), VII, IX, X, PC PS 4 *, / -*) *4 ) ) 40 (glu) gla. H *4 ) - -0 ) ) ) * / -/ (4) +)+ -. ) (. 8). & * () 0;... *+ ), *4 ) ) ) 4) -./, * )+ - * ) ).,- - /0 0. 4, + -*4 ) <. 1,. / ) /* /* (Mann, 1999,! 1994, Hoffbrand, Petit, 1993). NH 3 ' %., VII, IX, X, PC $PS (PIVKA) CH CH 2 CH 2 COOH Vit K COOH Glu HCO 3 O 2 *4 Vit K epoxide NH 3 COOH 8 %., VII, IX, X, PC $PS CH CH 2 CH 2 Ca #)+ - ) COOH COOH Gla + 8: ( - * 40 (glu) ) ) 4 -*4)0 4 (gla), -/ * / +)+ - + ) ). 2. & */ / +0 4 / ' ) -+0., +) 0 (McFarland, 1964).. 0 *, -/ * - 0,. - 4) - 4), - -. /*, - - 4) , 0 ;. 4, -0.. ). & - (4) -), - (--), /* )7 C-. ( ;./ ) /* a. ' /), 36

38 , -, +... /* ) ) ), Xa - /* ('m) )7 C 0 /* '!. &, ; ) ). ) -) ) ) VII IX, / ) X, VII, IX, -+, *4 ) ) *- 4) ) 4, ) ) ) ) +)+- ) 4 (Hemker et al 1984, Hemker et al, 1983). ' ) ;. 9. XII 7 ' ' XIIa 7 0 ' XI 9* HMWK XIa Ca++ a Josso Loop VIIa TF VII V Va Ca ++ X Ca ++ Xa Ca ++ Va V ' /* 9* )-! + )- - A, B XIII XIIIa / + 9:. - 4) #$( )#. ' ) ) 4 -/, -/ *-. ' 0.,. / 0-0 0, / ) ) ) - ) ; 0) ( 4 / ) /* -.). -- * / ) /* 0 4). 37

39 & / 0 * ) ), 0..' / 0 *- 4 (0 )< ), +)+ - + ) * *. ( - / / )! *- 4 ), *) ) - + V VIII 0+ * «*» + /*. ) * + ( )// - -0 ) )<) */ + ) ). ' 0 -. / ) - 4 ( ).. ( - ) 0) *- 4) ) 4. /&/*, ). VIIa - 0 * TF, Xa, +)+ -, Ca++ 4) - (TFPI), - 0 Xa VIIa. 0 4, -- Va VIIIa, - 0 )7 C (activated Protein C, apc). o Seegers ) +)+- ). -, - /* (0 * / VIIIa Va) 0. 4) +)+- ).. &/, - )7 C-, ('F) /* ('!)., )+ - *. ' * +)+ - * 0, /.?, ), 0.. ** ) ) ) ( 0. ), / /0), -- 4) - * ) -) 4) * 0. / 0 0/. + ) *. 0+ ) * + ) *. 4 - ). 0. / )+- ), 4. ). 0, - ) ) - /0 - ) ) / *. 0 0 *, ), 0 + /0-0 ) ) IXa- VIIIa Xa-Va. 1, /*. -/, ) - 0+ ) /0) )0 0 ), ) * - Scott. 8 38

40 0 / / +, ) + ) 0) ), -/ 0. / (Cytokine Growth factors) (Mann, 1999,! 1994, Hoffbrand, Petit, 1993). 52. ". #$ )1, )* 7#$3 )# ( (TF/VIIa/Ca ++ /!) &. TF, VIIa, Ca++ +) Xa a (- Josso). TF, -- 4, -* )7, + * *0 + ) ) ) ). 0. ) 0 0/ TF, -0 VII/VIIa , / 0. +/ TF * ), TF 0. + ) - (microparticles), 0 0, - - 4, ) - )/ - 0 (.... ) (Giesen and Nemerson, 1999)., 0. */ ) 0., ), + TF (Mann, 1999,! 1994). ( - TF VII ) 1965 (Josso et al, 1965). A- 0 ) - VII TF. a a, - - VII VIIa, 0 0 VII 0 VII/TF ( ) VIIa 0 0 VIIa/TF ( ; -). ' +)+ - 4) - * 0. /* (!,1994). & 0 VII + +, 0 (1%) + 0, ) VIIa (Morrissey et al, 1993).? -/ TF, VII - VIIa TF/VIIa: ) &/ -0 VIIa TF *) - VII TF VII VIIa (Nemerson and Repke, 1985). In vitro 0. -./ 0 ) VII, ) IXa, Xa, XIIa, /*, TF/VIIa, --0 TF, VII., 4/ ) 0 TF/VII - 4, 0 /) a ) / ;+ ( Morrissey, 2001).,. + 2 (-- 0; ), 0. 0) VIIa. & -., ) IXa, 0.. VIIa (Wildgoose et al, 1992). / ) +. 0 TF/VIIa

41 VIIa - ), ) -/, , 0 TF/VIIa + 0 ) -, )+ -, ) +)+- ( Morrissey, 2001). & /. TF/VIIa, - - 4) ) IX IXa 0 ) (- Josso). IXa + ) +)+- ),, VIIIa, a. 2) ' TF/VIIa / a. -/ in vivo ). In vitro + ) TF/VIIa ( Morrissey, 2001) TF/VIIa, -- // 0+ ), -, /* 0 TFPI. ' ). 10. VII ~99% VIIa ~1% TF/VII +TF Xa, TF/VIIa, IIa, IXa, XIIa, TF/VIIa +TF B TF/VIIa IX X TF/VIIa IXa VIIIa Xa Va II IIa. 10: + VII VIIa. 2., 0 TF/VIIa. " (#a/viiia/ Ca++/!) &. a, VIIIa, Ca++ +)+ -. *. /*. ( - - / Michaelis, ) ) 0. VIIIa.. / kcat. - +,, ), */. " $$% (Xa/Va/Ca++/!) '. Xa, Va, Ca++ +)+ -. A - /* /*./ 40

42 , )- - -/ -/ /*. (/* 0 0! , - -, *, ) ( - /0 Arg271 / F1,2 /* /* 2. (- /* 2 /0 Arg * - /*, /*. &/, /* - /* /0 Arg322,. meizothrombin ) - ). ( meizothrombin, PC., - - 4, ) ) ) V -. )-, - 0 //*. '0, - /* - /* /0./ F1 /* )1)* % ( , ),,, 0. ) ). )7 0-7 ("),, ; * (HMWK HK). ( 0) ) ) 0 0) -- in vitro. * VII, )- -,. ). ' * , / - ) ( ) 7., / XIIa 0. /. (. 0, 7 () * (" -0 (. ' ( , * " +. 0 ) XIIa 0 ". ( -/ , (. ' ( , a *. H - 0) ( / * 0-4) (... ) ) -0, ) &"''.!. 7/ in vivo, / /0 +, ) 0. 0 * - 4)., ), ) ), (. &"'', - - -/, / Hageman ( 0; 41

43 0. - 0; ) 0/ /*) -. &, / 0;, / * Ashkenazi, */ * -, ) ; )- - (...,,, -0). ' + -4, /*,.) * +0) +, / )- / +/ )-., +, /. ' /0 +* + in vivo. 1, / / 04 ) )< 7/, * / 0., 4 )< / (. 11). 0, + ) ) )< ". -/, =/0 ", - ". * -/ /. ". ( 0 " - (. *- (2). ( 2 )/ /0) t-pa -/ (. 12). '0, 7/ - 4 ) ), / : ) )7 7/ +0 )- 0) ScuPA / (. 13) *) ' < / ) ) /* (. 14) (Schmaier et al, 1999). ' ). 11, 12,

44 11: + ) < PK ) ( -0.& + (, 12:. " + ).( * (. ' (CK1), upar - / gc1qr. gc1qr., " - / -0 ) < ).( - / ) < * - (!") - - a..) 0 ) < (2 ) , -0 - / - / 0 - ) < " -.0 ( -.0, " ) < (.'. -.0 / *

45 13:!. + )- ( 0 ) 0 ) ( /0 ) (!") ) * ( 0 ) (2 ). ( 2 -.(", - / t-pa. ( (Single chain urokinase plasminogen activatorscupa) ( * (PLG) 0 14!. calpain -. 2) ' ( ) / ) * ) - / (two chain urokinase plasminogen activator- TcuPA). ( TcuPA - + UPAR ) 0 ("), /. - - * - -0 PAR1, 0 0*-. 1) ' ( 4 ) / / - * * * / (PAR1 b*3 GP Ib-IX-V) ( a) ) ' ( + -,. 44

46 52. '. #)$! ). # *$$1 '# 1. PC,, PS $ EPCR ( )7 C (PC) 0 *- 4,! d ) +0 + / 4, 0) ) ) Va VIIIa., ), / * + -, ) ! , ) 0 - PC /* ('!), -0 /*, , -+) 0 *. /* PC, 0, 0 PC (apc). PS + ) +)+- ) Va VIIIa (Esmon 1989). - )0 0 / - 4. & --0, + 0; PC /*), -/)/ 0. PC. &, - 0 PC (apc), ) + - V,. /*+ /. '0 0; '! 0 - /*+, ; - '! +0 / (Ohlin et al, 1995, Healy et al, 1995). ' '!//* - PC, «/* )-» (thrombin activatable fibrinolysis inhibitor- TAFI), 0. ) 0 - (Bajzar, et al, 1996)., ) / -/ -.0 PC (endothelial cell protein C receptor- EPCR), -* )7-0 PC apc * + PC. ( )7 * 4 /CD1 0 (Esmon et al, 1997). ( - EPCR PC *-4., ), *. Gla PC., +) PC -/ (Esmon et al, 1997). ( - apc 0 / /* +, /* /'!, */ - apc/epcr (Esmon et al, 1997). 0 PC

47 + 15: - PC. O EPCR - PC, '!. - /* /'! 0 PC. (./ apc EPCR 0. -.) - PS + ) +)+- ) Va VIIIa. VIIIa - ) V.?- apc EPCR, - Va, / ), ),. 8, EPCR PC -/,. 0 - apc (Esmon et al, 1997). H 0 / EPCR -/ / 4-4 PC -/ ) ). 0 ) - * ) PC.! + 4 EPCR +, ), &.- 0 -/,. 0+ EPCR /. -4 PC. ( ) 4 0; PC /*,, ), 0 (Esmon et al, 1997). "/ 0+ EPCR: In vivo, - 0+ EPCR 4-4 TNFa, * /*., 0 + /* 4 0+ EPCR,.-. ', ),, ). /0) TNFa, - EPCR ; ( 0 TNFa ) /* 4 0+ EPCR PC 0. /* 0) ) 0+ EPCR. + EPCR - /. /*, - / /* (Esmon et al, 1997). H )7 S (PS) *-K 4 )7 / ) PC. ( PS, ),, 46

48 0. */, -/, 0+ Leydic (Goodwin et al, 2002). 1. / - -.)) 3 PS, 0-0 ;--, PROS1 PROS2. (Schmidel et al, 1990). ' PROS 1 80 * ' 4 I ) VIII *-K 4 )7, 4 IX ) XV )-. «+ - +0» (sex hormone-binding globulin- SHBG),.. - ) * *- 4 )7 (Goodwin et al, 2002). (.0 4 PS +* /*) (Comp PC et al, 1984, Schwartz et al, 1984). ( PS - ) APC ) ) ) Va VIIIa. ( PS - 4 APC 0 /* - - Va, VIIIa, and Xa (van Wijnen et al, 1996, Koppelman S et al, 1995). 60% - 70% PS * --0 0, - )7 4 (C4 binding protein- C4BP) / )7 (Dahlback et al, 1990). & 0 - -/0 /0 - C4BP PS / -0. 0, - / - 0 ) ) PS. ( C4BP ) / 6 ) 7 -.) * -. - * - 0. /0 - PS, C4BP*+ C4BP* / / PS. (.0 C4BP PS 0 C4BP )7 4 +).., 0 de Frutos et al 0 / - / PS (free PS, C4BP). - ) -) 4 +) 4 ) -+ / ) * -) C4 *) 4 PS - 4 C4BP*+. ( --0, ), PS , / 0. - APC (de Frutos et al, 1994). 2. ) # '# # )$1 ( (Tissue factor pathway inhibitor- TFPI) O TFPI 0 0 ) Kunitz 0) ) ) +0 ) - (Tissue factor pathway inhibitor-tfpi exogenous pathway inhibitor- EPI, -/ - Rappaport Lipoprotein associated coagulation inhibitor- LACI, -/ - ) Broze Miletich). ' / 3.0 Kunitz 0 * *4-. VIIa Xa ) Kunitz... TFPI 0 Xa, VIIa. Xa. ( 0 VIIa/TF. - -:. TFPI/Xa TFPI/Xa/VIIa/TF (Broze et al, 1988, Warn-Cramer et al, 1988).! / o TFPI -0 / 47

49 VIIa/TF/Xa. + TFPI 4- VIIa/TF a (Callander et al, 1992). O TFPI. /.! 0-4 TFPI 0. 0 VIIa/TF,. TF + ) -/ *- ( Sandset Bentz, 1997). $ TFPI TF ; E. coli * /*) /*). /* /*) ( Sandset Bentz, 1997). ) ) ) 0/ TF + 0. TFPI / --. ( - TFPI. ( -4 TFPI ( 50-80%) * --0.), /)/ 0..! -4 (10-50%) + 0) ng/ml. 80% TFPI * )7.!0,, TFPI *, - /.. ( TFPI / 0/- / 0././ -40 TFPI ( Sandset Bentz, 1997). O TFPI / / (40.) 0/- TFPI - 0 )0 /0 VIIa TF a) /- 0., ), --0 ), ) /. ( 0/- - / 0. -, /)/ / +. * --0 )7 *- in vivo.! 0. /)/ - ) 0-) TFPI --0.) ( Sandset Bentz, 1997). & - ) -+) + TFPI:. - in vivo ) -+) + TFPI.! 4 ) / 0; LDL 0. 10% TFPI, + 0 / 0. ) / TFPI. - ) / /*), + / TFPI - + in vivo. 0, + )., TFPI --0 )7, TFPI 0. ( Sandset Bentz, 1997). 0 TFPI:! TFPI + /*+., TFPI / 0..? (,)

50 ( -- 4 TFPI, ).), ), ) )) ( Sandset Bentz, 1997). TFPI + : $ TFPI +. # 0. 4) TFPI. -0 /* + + & 2, -0 TFPI in vitro. )). +, + (Erhardtsen et al, 1995, Welsch et al, 1991). ' ) **/ + 0./ - ) - TFPI. # -0 TFPI - ).. /* (Nordfang et al, 1991). ' ). /. - TFPI.. 0) ) + / - (! et al, 1990). H / * TFPI -, ) VIII. 3. )1)* *,"!* ( &/* (&') 0 0 ). ) ) (Serine Proteinase Inhibitors). - 0 (HcoII) 2 +,. ) ) /,.- + ( *-0).( /* ) - 4) / 0 /* - 4, I 0) IV , &/*, &' - - ISTH ( &' + + ) /* Egeberg ( Kottke-Marchand, Duncan, 2002). ' &' 0. * d ' - &'*.)) (&' / ), - )7 4 +) ( Kottke-Marchant, Duncan, 2002). ( AT : ) + (-- XIIa, XIa, 7,!!2)*) - (IXa) ) /* (Xa) -) /* ) ) ) ) ) + +/ 0 VIIa,. in vitro (Lawson et al, 1993, Rao et al, 1993). (- /*,. + -, / - 4 ).. 49

51 P1 - P1 P1 - P1 P14 Xa P1 - P1 -. P14 P1 P Sheet A Helix D *!* P1 +$ % &)$ 1' )* a '.)1 /a + 16: '-. /* (&') a. ( &', ), Xa. 0 1:1 ). (--. ( - &' * *- (* sheet) 5 0 (1, 2, 3, 5 6), D / ("1-"17, ) &'). - / "1- "1@ (Arg393- Ser394). ),. + &' - a, - "1- "1@ - -/0 ) -+) ( )). ( / Arg D 0. ' -+) -. / - P1- P1@ ( )).! Xa - - P1- P1@ ) -0 "1 - /. ' ) * sheet ! Xa ) &' ) 0 ).. ( - /* H, GAG, ,. 0, (-.) (.).0, 0 -, +. * 5 0) 57 kd.. / /* 0 (-- 0. ) (Lindahl et al, 1980)., ),.. Xa /*, /*. 18. (Olson et al, 1991).! ) ). - ) 4 &' ) ), -0 -/ &'. ( + - &/* * -/ ) ), -0 - /<. ( - /< */ 50

52 /) + /* -/ ) ),./0 /*. ( +. - AT 0../ /0 ) (. * * ) 0.., 0. * 7000 ) 25000d,. * 30%. &0!2 0 a /*, /, &/,.!2 (!2~ 5000d),. -, 0, ), a. (& Kottke-Marchand, Duncan, 2002). (. 17) Xa Xa IIa + 17:. --0 &' 0 Xa, , &', 0 0 /*. ) /./. /* ,, ), 0 ** 52.. *,"!* ( /* ,.) -, 0,.. 1 /*, ) , : ' - ' VIII VIIIa, ' V Va, 0.. /*. & /* -: ' )- - ' XIIIa, -. ' a. 51

53 (/*, ), * ('!/') 0 * + )7 C aprc, +0 TAFI TAFIa PC apc, 0 - VIIIa Va.! /* * - 4, 0+ 4, / 0, -. - /*. & * / + - /* *. (-0 '!, 0+ EPCR) $- /*, 0 F1 ( ) F1,2) /* 1, , /*., + - /* +0 0, 0.! - - /* (/*, -, , -.. B3. ) +0 /.+ - -, 4, - 0 /* 0 /* -.!, ) +0 /,. */ ** ) ). ( /, /*), * 0..) 0+ ) ( /. -+) ). ( 0 4 / 0) ; / +0-0 )7,./ 0 /*, ) /. ' < - 0,.0.) / ) <. ( - 0. /) (/) 0 )0 0 ) -) / 0 0. & / 0,., -., ), / ) -. ( 0 4 in vitro / + * 4). &0 para vivo - - / -0 ). ;, ( )0, 37C.) / (Mann, 1999). 52

54 ( 4 ) ) / para vivo + -.? ; 0) -- /. # (). '#$ * 0* 1).? 0 / - )< 0 / +) /* -.)/ - +.! / VIIa-TF *. + 0) 0 VIIa-TF. - +).. /* (<50 pmol/l), -,.-, V VIII -. ) Xa Ia., ) 0), / + 0/ -, /* 0 /* / 4. 0) TF-VIIa (Lawson et al, 1994). & + 0/ - ) - X Xa - ) ) IXa VIIIa.? )- * / 4 *.. + 0/. /*. 2). / ) /* - 0, /*, / , VIII V, ) -). /*. -, Xa, +)+- ) ) *, /* /. &/, Va,, ). ) 2 + ) ) 4.!$ 2: ) ) 4. "/ ) a - (Hemker et al, 1980) (activateur) ) '. Km/kcat VIIa Ca++ X /0.32 VIIa TF Ca++ X /38 VIIa PCPS Ca++ X /3.9x10 4 VIIa/TF PCPS/Ca++ X 2700x - "/ ) a - I (Hemker et al, 1980) (activateur) ) '. Km/kcat IXa IXa/Ca++ X 1 299/ IXa PCPS Ca++ X /0.008 IXa VIIIa Ca++ X /0.018 Xa/VIIIa/PCPS/Ca++ X x 0.06/500 53

55 "/ ) /* /* (Mann et al, 1987) (activateur) ) '. Km/kcat Xa Xa/Ca++ Xa/PCPS /* Xa/PCPS/Ca++ /* Xa/Va/Ca++ Xa/V/PCPS/Ca++ /* Xa/Va/Ca++/PCPS /* x * PCPS= +)+ -., + /*. 4 1min, 0 Xa 2 *-- (!, 1994) 3). ( - ) / 4 0. / )0-0 / TFPI, AT - PC (PC, PS /* ) /. ' PC &' /. /* - + 0/, TFPI ) +. TFPI &' ) 0), ), Xa.? ) / - PC Va. 0 0 ) ) 0+ /0 - ) ). - 0) 0. -, - TFPI &', 0. - / ). ( 0 0 ) 0) /. Xa -0 / Xa 0 VIIa-TF-Xa TFPI, 0 Xa, /* IXa &'.!, TFPI PC +0. ), VIIa-TF-Xa TFPI - ) / 0 Xa, PC /* - /* / - Va - APC, -. Xa Va. / Xa 0 &'. - ) ) 0) / (Van t Veer et al, 1997, Van t Veer and Mann, 1997). 4). - - TFPI PC. /* 0 /0 : ( / TFPI +0 0 (2,5 nm) 0 0. PC, /*, - 4/0 0+ /*, - ) ) TFPI V Leiden (Arg506Gln), * /*. +.? TFPI 0) (1,25nM), /*, V +.?), V Leiden, TFPI, 0, - 0 /. /* (Van t Veer et al, 1997). 5). ( / / + /*+.?), + /*+ 5% ) - 54

56 ) / /. (. ) -0 /*+, V Leiden, 5% ) ) +.?), + / / ) / 4 /*. / )< )< /*) (Mann, 1999). n vitro /, 0) )< 04) ) /*, /. -, - * 150% 50%, /* +0 ) 100%. & +, 50% 150%, /* )0 25% 100%. ' * + /* &/* (Mann, 1999). B4. In vivo $!? - / / - 4) 0. in vitro / + - ) -., - 0 ) -) ;) ) ), < ; * - HMWK, - ). Xa - /0 -- *.. ( )) - * *. / ).. /* in vivo. &/, / 0; ) VIII - * -, 0 -., ).0) 4 ) ) VIII, +. 4) - 4 (TF)- VIIa /*. A Josso et al -) 0 ;. 4. +) TF/VII in vivo /. & 0 (by pass) - Josso. 1, + 0, VII ( - --) / + ) 0. /*, ) in vivo IXa VIIIa (-- - ) (Josso et al, 1979). 0. Hemker et al (1987) )) - Josso /) ) ). 0) 0. ;

57 1, 0. 4 / 0. 4 in vivo: '. < - VIIa-TF a, IXa. + a 0../ / +0. Xa. 0 /* -0 * / /*, , 0 ) ) V VII Va VIIIa. ( ) -). ) )-, - - ( IXa-VIIIa) Xa, /* ( a-va), /* /*. & ). - IXa- VIIIa VIIa-. /0), 0 - (TFPI) *, Xa- -VIIa 0) ) Xa Ia -. + * Xa 0 IXa-VIIIa. 1 4 ) - / 4. ( /*, / )- - & 2 )-. (/* -0 /* + -/. & - 0 /* 0 0 0, )7 C )7 C (apc) ) ) Va. 0 --) Va ( /0 Arg 506 Arg 306), /*.?) / / ), /+ V Leiden, o Va - /0 Arg506 Arg306, - /0 Arg (- /0 Arg ) 0 - Va, / - /0 Arg Va. (Kalafatis et al, 1994). 1 ) apc VIIIa. - ) / -.) *. ( PS --.?), 0 0. /, * -./ PS -., + /0 - ; PS, 4 / (&/* (&' &'). / 0. (- &'- (Mann, 1999). ' ) ). 18: 56

58 XII HMWK + XI IIa XIa XIa HMWKi #)+ - Ca++, Zn++ IX IXa VII IIa VIIa VIIa TF #)+ - Ca++ IX IXa IXa VIIIa #)+ - Ca++ IIa VIII X Xa IIa Xa X Xa V Va #)+- Ca++ II IIa 9* /* #)+ - Ca++ PC TAFI APC TAFIa + 18:. - ) + 0) 4.. 9& )- ) -), ) ) ) + ( 0 ) -) - / + )/ 0 ) ) / -- /*) * ) ) 0) ) )-.. ( )- ). 0 ) -, ) /0) +., +, ), ) ). 1, ) ) 0* /* 0 )-, / + ) 4)0). ) ) /0) - +. ( )- 0 + * ( ),. ( - 4 0, +, , &2- &2-+, &. )- 0. ) 0-0 ). ( / * -)), * ;. 57

59 &1. ' ) ,, ( - )< (MMPs), - 4). 1. +/ (plasminogen activators- PA): 0 (tissue-type plasminogen activator- t-pa) 0 (urokinase type- u- PA), o (u-par). H )- * - ) PA - (Plasminogen Activation Inhibitors- PAIs), -, ), 2-, - ) MMPs ) MMPs (TIMPs) *4- TAFI (thrombin activatable fibrinolysis inhibitor), - -, - /0 -, / + ) (Collen, 1999, Bouma and Meijers, 2003).?) +0/, )- -: - t-pa 0, ),, - u-pa (remodelling). ) / +/, ), - t-pa +, - u-pa 0. +/ + +. &2. ' $ ' 0 )- - ). ' 0 ) ) - 40, 4 -. (. *4, 0.0 /. )- - ( TAFI) 0 ). * (Arg -X Lys-X), - 0-., O TAFI 0 ) *4-, +0 ) - *4- B, U R. *4-0 - *4 - -.( 0 *4-, 7 -*4-. -*4-, TAFI, +0 0 ;-, *4-: TAFI *4- (CPN). ( CPN -, TAFI /* ( /* - /* ) --. H CPN - / - - ) )<, ), +4 (C3a, C4a, C5a), )- -& 2. TAFI (TAFIa) - * 40. ( )- TAFI. ( ) * *4, t-pa. &3. $ ( ( 0. /*, ) V, VIII, ), )-.?), , 58

60 ) - ) ) ), < - )-, 0. - ) ) ). In vivo, < + +) +. ( + )- + / - 4 ) )-, ;. / /: (t-pa) 0 (KM= 65!), (KM !). & ) , ) , /0 -. )- +,. t-pa. ( 4 2- (o. ) / ) 0.1 sec) / & -. ) / 2-. & +. ) ( ), ) - /0), 2-. (, ), / 2-,. ) ) / ("&")., t-pa. 0 )0 (t-pa/"&) + ).!, ), (. 0, +0)., - ) 0 0, 0) ) t-pa.. ( + t-pa - ) t-pa, ) () ). ' )

61 + 19:. ) -) / )-. ' 0 ) 0 t-pa, - * +, 0. ( / + 2-,. ) +. -0/0 (. - ) - 4 ( ), 4 (Carmeliet and Collen, 1996). 1,, )- ) -) ) ). ) t-pa//, -). ) / - t-pa. (- 4-0 *0 +0, t-pa. 1, - ) t-pa + 0 ) ) t-pa. ' - *, glu- 0 lys-, ) +. &4. ) TAFI (Thrombin activatabe fibrinolysis inhibitor) $ TAFI )7, / (!2 ~ 55 kd). TAFI *4-0. ;-. TAFI + --0, 0. 0 Glu Lys. ( TAFI, ), /* - /0 Arg92. ( /* TAFI, )

62 /*., /* 4 / TAFI, &, TAFI ( - /0 ARG92),., ),. -, + 1/10 /* //*, - TAFI in vivo., - TAFI /0,, ), , - TAFI TAFIa, - 0). TAFIa. (Bouma, Meijers, 2003). ) $ TAFI?) /, -- )-. 0)., t-pa -0. ( ) ) *4 ) Lys ) - /0) lys t-pa.! -. 0 / t-pa /... ' --0 ) t-pa, /. 0, ( -, - 0, *4 lys, - 0).. TAFIa 0 )- - *4 lys,.. 0, 0. -./ TAFI 0 )- / -, -. * TAFI, 0 0 )-. '0, TAFI -, -, 0 Glu Lys (Bouma, Meijers, 2003). ) $ ' $! TAFI ( TAFI /*. / )- / -.. /* / 0. ) 0 40 / /*.( / / +., / 0. ; )- - (,,, -0). /+. ) 0 +. $0/ /* / - -- (Naito, Fujikawa, 1991, Gailani, Broze, 1991) / - /*,. / )-.. /* /* (von dem Borne et al, 1995). O. /* 0, - 4 TAFI (von dem Borne et al, 1997). TAFI ;0 /* (Boffa et al, 1998),, /,.. /*. ) ).. 0 )- ), -. /* TAFI, 61

63 . /*, /* (von dem Borne et al, 1995, von dem Borne et al, 1997). 1, , ). - 4 ) O $ TAFI $$ $( ' ) -) /. /, ) - /, ; )- - (Asakai et al, 1991, Berliner et al, 1992) 0 /0-0 )- ). /* -0 / TAFI. ( ) TAFI. * ) -) / ) ) VIII IX,. + & 2. & / /0 )0 ) () /), 0. )0 ) /* - 0 4), - ) /* ) /*, TAFI, 0 ) ' 0. ) 0,.,, - / /*. )0 / TAFI, ). - TAFI +, /. 40 * * -) + (Broze, Higushi, 1996, Mosnier et al, 2001). 62

64 IIa + 20:!0 4. *)/ /. 0. +/ 0 +.!. -, -0. (-0 4 TFPI TF-VIIa TFPI 0. a, TF/VIIa (Bouma et al, 1998). 63

65 . & 9 9 &9 ( VIII,,.), + & *.)), - +- /.!4 4) - +, /0 - - ) 0-) ) /) ).,..).,. ) ) - ) ) ) ) 0. */, 0. / 0 ) 4) - VIII +.!$ 3:. ) -. ) ) 4) -.!#"$ %& ' () *+,!) -)./ 0' ) & $687:9$;$<$5$9 B+CEDF9:G6IH$J:DLK MNOCEP29$Q,REKP< H:H$RS5T U2V%9W V%9 H:X =:= B+CEDF9:G6IH$J:DLK MNOCEP29$Q,REKP< H:H$RS5T U[JV%\:;$9$5DFJ ]+^ B+CEDF9:G6IH$J:DLK MNOCEP29$Q,REKP< H:H$RS5T U[JV%\:;$9$5DFJ ]+^`_ =Eb B+CEDF9:G6IH$J:DLK MNOCEP29$Q,REKP< H:H$RS5T U[JV%\:;$9$5DFJ ]+^` c=$> e#ceq$9:gfe5$7%rsd/t#cp29$q,rekp2< HH,R 5T U[JV%\:;$9$5DFJ ]g_ e#ceq$9:gfe5$7%rsd/t#cp29$q,rek KP2< H:H,R 5T U[JV%\:;$9$5DFJ ]+h =Eb B+CEDF9:G6IH$J:DLK MNOCEP29$Q,REKP< H:H$RS5T U[JV%\:;$9$5DFJ ]+h`_ B+CEDF9:G6IH$J:DLK MNOCEP29$Q,REKP< H:H$RS5T U[JV%\:;$9$5DFJ ]+h` ijcep299 H$\ 7:JOB =ICEP299 H$\ 7:Jlk B+CEDF9:G6IH$J:DLK MNOCEP29$Q,REKP< H:H$RS5T monep8q[rst uv:w/x ygz {3{}{~,q[n ƒw :vjpg ~Ew n ~: nq! n ~,q! +ˆq + ) - * --, -0-4) -. VIII 0 )<,.) - -/0 - ) 0-0 0, +)+ - ( 0 ) * «--». IX (activated FIX,a) 0 ) ) 4 0 VIII ). -- () +0/ 0)). - ( , ). 0. a 0 64

66 . a /*, Va, * +)+ -. 4, /*, /* ( ) /* 0 )-.! - VIII IX -. X, ) / /*. 1, /- ** ) + -). 0 -, ) VIII (+ A) IX (+ B). 0, ) (DJ Bowen, 2002,!, 1996). %$( )1' ( + & + ) ) 0-) - VIII, + 2 ) 4 4). -. -/, ) 0 -) + & (+- ) ** - )0 - VIII.. / + 0; ) (--.) / * (Hedner et al, 2000,!, 1996). (. + 1:5000 -, + & 6 +0 (Hedner et al, 2000, Mannucci et al, 2001,!, 1996). ( +, - - ) ) VIII, - * ( - / ) 1% +), 0 ( - / 4 1% 5% +) + ( - / 4 5% 25% +) / - VIII 0) 45%. 70% ) + 0. * +, / +, + * ). */.!, (..&. 43% ) +. *, 26% 0 31% + (Hedner et al, 2000,!, 1996). 65

67 qšt uvˆ nq ~,q[n,unepgrœ w/x( Žvx ygw/œ vjp8q[rqt v:w/œ v z {3{}{ ~,q[n { - - * X.)): - VIII * 0 0.),. Xq28 - IX *,, 0, -,. Xq27. $. 4 ) - - ) (0.5 cm) ,. /0 ) -.0 (-; ); ) ) -. - Wiskott Aldrich (Bowen 2002, Orstavik et al, 2000,!, 1996) & 2 0 ( 46:XhY), / 0 ) + + ( 46:XhX) /, - ) - ) VIII IX (hh) X.) (+ Lyon, ( 46:XhX). ( ) /) ) )) ) + +, ' h0. (Bowen 2002, Orstavik et al, 2000,!, 1996)?) - /,. + & 1: ) 1: ). 2. -, 1: ) 1: / ) - VIII (Hedner et al, 2000,!, 1996) Factor VIII ' - VIII * (180 kb) (26 4. / )) (. 21A). ' CpG, - ) )0 (promoter) - /) - -, F8A F8B (. 21B). ( - CpG F8A 0.. DNA 9.5 kb, * X.)), - - VIII (. 21C). 0.0 )0 ) int22h-1 (--) int22h-2 and int22h-3 (4)-0) (2owen 2002, Naylor et al 1995). ' - F8A kb 0 22.!+ / / VIII. ' - + ),, /, 0. (Bowen DJ, 2002). ' F8B * 0 4 5` VIII. ' 4 5`)- 8 40, - ) VIII ' 0 )7, VIII *. - +)+ - (Bowen DJ, 2002). ' mrna - VIII *) * 5` +0. (150 *)), 0 ) 0 )- (7056*)), / 3` +0. (1806*)) (. 22A). ' ) )- 0 - ) 19 40), 66

68 / 0 VIII -0, ) ), - * + (. 22B ).& )7 )0-0-0 (Bowen, 2002). VIII () V ), : ' A.0 (domains), - * VIII ( V) - +.! -., 2., )- 4 14, -.) - &. VIII. ( 2. - ) - + * - VIII (Hoyer, 1994), / 4 VIII ( 4/ /, /., 0. +/ 2.). & VIII / -, ) - )7 0) /, 0 VIII ( + 80-kd 0-4 * 0. 2.) -0 Willebrand:. ( VIII /* Xa /0 Arg 372 Arg 1689 VIII (Hoyer, 1994). Hill-Eubanks and Lollar VIII /0 Arg 372., * - VIII Willebrand /* - +, - * - * /0 Arg (Hill-Eubanks et al 1990). + 21: (A) ) - VIII. (B)!0/ 22 - VIII -. /0 / - CG, -- F8A, 4 5` /0 - F8B,. int22h-1, * - Xq. (C) / + - VIII 0 Xq28, / ) ). int22h (Bowen DJ, 2002). 67

69 + 22: (A)' mrna VIII (B)' /0 )< VIII * ) ) (, )). A1 3, B, C1, C2.0. ' 4 -. /0 ) /*. (C) ' 0 VIII N- * C- + */ ) * (Ca2+) (Bowen DJ, 2002). (. - VIII /. Xa ( VIIa). '. 4 /* - 40 ) Xa. /* ( +0 0). /* ) () 0 Hemker 1980)., ) ** -/. -, ) /, )7 C, ( 0 VIII V), ( /* ( 0 /* /*, VII, / ), 0, - (tissuefactor-pathway inhibitor, TFPI- 0 - ). 0 VIII, VIIIa, 0 /0. ). ( ), ) /* Xa ) ) - -). ( ) &2. 0 VIIIa, VIIIa ) - 0 )7 C /0 Arg 336 and Arg 562 ((oyer, 1994). 68

70 , ) ) FVIII in vivo, 0 0 ( + & -/. ). 1.,, */ 0+ -.) ) ) (-/ - - /, + / /) 0. (Hedner et al, 2000,!, 1996). ( )7 VIII + 0 ( 100 mg/ml). 0 VIII (0.2 µg ml ) 4, ) - -/ ((oyer, 1994,!, 1996). O VIII / )7,. /. +0 Willebrand (VWF) , - )7 + ). ( * / VIII VWF /. - FVIII * VW ) ** 2N VWD.!0. VIII -. - ( *- 4 VIIIa, IXa, ) +)+- )) )+ - (Hoyer, 1994,!, 1996). 0,. 0 Willebrand. 0) VIII /0 **, 4 - Willebrand -/0 )7 ) ) /0 **..) Willebrand - + VIII /* Xa 1 Willebrand / +, VIII +0 -/ +)+ - (Hoyer, 1994). 69

71 + 23: ' )7 VIII ) ) (a1, a2, a3) - ) ) ( ) - Willebrand. ( 2. 0 )0 ) 0.. ' ). -. /0 ) - * - ) 0, 4) ) /*, IX (IXa) X (Xa) 0 )7 C (APC). (Lenting et al 1998). Factor IX ' - IX -, VIII. ' 34 kb , ) ) 1935 bp (. 24A). ' *, * 5` +0. (29 *)), 0. ) 0 )- ( 1383 *)), 3` +0. (1390 *)) (. 24B). '. ) )- --)7,. ( - -) / 0 IX,. 0.. GLA, /0 - *4 * (*- 40) +0 0 *4 40 (glu) 0. GLA.! + «-» - +. ', 0. + ).) ) ) - ) (Bowen, 2002) ( C-, 0 & 145, (. 24C)

72 0 XI, , -0 0 /0 VII 4) - (Osterud and Rapaport, 1977). ( --, + * XI - -., * VII. * -.. ( - N- + C- *, ) ) 7 (. 24D) (Bowen, 2002). A (~34 kb) B 5 UTR (29nt) FIX coding sequence + stop codon (1383nt) 3 UTR (29nt) C p N r e pro GLA EGF EGF act catalytic C Arg145 Arg180 D S S GLA EGF EGF catalytic Light chain Heavy chain + 24: (A) ) - IX. (B) mrna IX +. 0/ /0. ). (C) ' /0 )< IX * - -. ( ),.) ) (, ). (D) 0 IX * N- + - C- * ) ) ) < / "GLA"., *4 ) *- 4 *4 /0-0 0 *4 ; EGF, epidermal growth factor-like domain; act, activation peptide / ) /0 arg 145 arg 180; catalytic,. ) (Bowen DJ, 2002). $ "()* %$3 )#' 4 + & 20. /. 0 - /., 0. */ 0 / 4) +0 * ) + -) 4. 71

73 !,, /, /. + **.,. 0../ 4 ) ) 0 +0, - - -, + - ), )7 -, / (splicing) mrna. ;+ ) 4) , 0 / -+ 4, ) / )7, ) - ), -... ( -4 ) /0) -, + 0. *// +. ) ) + «0» *; )< - (Bowen 2002).? * ) * --0): B+K H%9 V V%9: 2KQ:Y JO > E > } :š} :œ? žÿž:? #š}ž:? :ž:? : L Ž $Ÿ$š :! : : :Ÿ Ž œ? ªœš gœ? E B+KH%9 V V%9: 2KQ:YJl«[> E > + + g? : gª:ÿ:? :ž:? : L Ž g : E JK 9K 7C,9> E > 3 š}ž% :œ $?, ±ž$? :ž:? : L Ž ±ž$ I Ž g $ ², E Ž 1 (0 4 - ) ) VIII IX 0, ;, / 0/ /0 90% ) ) (missense- )- 0. ) 0 ) -+ 40), 0 4 (nonsense ) 0 ) )- stop ) +), 4 /0 -/ mrna (mrna splice site) (- /0-/ mrna - )., *, -0 * 40 ( , -+*,.). 4 /0 -/ mrna - *. 0 4 / 0.0 CG..0 CG /) / * C T G A (Duncan, Miller, 1980).. ) /0) 0. /) 4) (Duncan, Miller, 1980). 30% ) 4) + * 0 /0 CG. ' 79% - *.0 CG ; ) 0.0 )) - + DNA (Bowen, 2002). 72

74 0 4 4,,.. 4 * + & 2 *, ),.0 CG. ' ) 4) * 4. $., 4 - * /0 CG. & (founder effect) -/ , 0 )+0.0. & 4 + 0, + 4 * ( )0 - * )) 0. / / 0 (Green et al, 1992, Thompson et al, 1990, Bowen et al, 2002). ; % ) /. ; - ) ) VIII IX + -, - ; 0) *)., ).0 ) - ) 0..! 0; 0. / -4 -, + 0 )7, ). 1, ; - * (Antonarakis, 1995, Bowen et al, 2002). / 0/+0 4 +, 4 +. / * + & (+ 22). / (Antonarakis, 1995, Bowen et al, 2002). )% ) 22 # ( VIII ( VIII * + & * 40 50% ) /. (Lakich et al, 1993, Naylor et al, 1993). ( + 22 ) 0-4 int22h- 1 int22h-2 (- proximal) int22h-3 (0- distal) - ) (Lakich et al, 1993, Naylor et al, 1993) (. 25).! / (alignment) ) - ).) * -, 0. ) 0 5` - VIII 0/ -, 4)- 0/ (. 25B). /0 0.)) int22h-1 int22h-2 int22h-3, 4)- + / 0 -- (. 25C). (. - VIII - : 1 0) 22 / + /0, * + & (Bowen, 2002). 73

75 + 25: ( VIII. (A)' + - VIII int22h. (B)' 0 int22h (- 0) int22h. * -. (C)( / X.) 0. ) VIII -:' 4 10) 22 / - + / / VIII, ) 26, * + (Bowen DJ,2002). ( DNA * - 0. )0 (Antonarakis et al, 1995):, -.) - - ) / -.)) -, -. 1, 0 + &, ** + 22, -./ ** /, **0, 0 / 0 (Antonarakis et al, 1995). ( + 0 4)-.,,, 4/ VIII 0 int22h-3, -. / 0/ (Antonarakis et al, 1995). ( )/.*. Southern blot ( DNA /, ),, ) (Lakich et al, 1993, Naylor et al, 1993). +, ), +/.. PCR (Long distance PCR- LD-PCR), +/ + ) /-) (Liu et al, 1998). & ) ,-, ),

76 $,!- +.)!-.) ) / +/ / , - 0. )<, ; -/ 0. CGA ($!)!/0 /0 CG 0. ) , )- * C 0. / T G A. ( C T )- CGA: ' 0 - )- TGA ( 4) *. '0 )-. 12 VIII 6 0. / 4 (Bowen, 2002). $! VIII # ( ) - ) ) VIII IX *. / VIII (. 2), / IX (. 4). ' ) CG; & * C T G A )- + & 2. ( 0. ) 0-4, /0 / 4 0. ) 0 )0 - ) ) VIII. -/ ) ) (Bowen, 2002). $* ' $ VIII $ von Willebrand?) / ), VIII von Willebrand - / VIII.?) VIII 0 - +)0 ), ) 1680 &3.., ) 0 )0 - VIII von Willebrand. -. * ) (Bowen, 2002). 4 - VIII - von Willebrand,. 4 - von Willebrand 0 von Willebrand VIII ( von Willebrand 2N) (Nishino et al, 1989). 2N Von Willebrand. )0 - VIII, ) ( - von Willebrand *.)) 12 /0 12p12 12pter). 2 von Willebrand +0 );-+ & (Bowen, 2002). $* $ $ VIII 75

77 ,0 4 arg 593 asn 618 <. - 0) VIII 0 0. &0 4, ), ) ) 0-) - VIII + + & (Bowen, 2002). $* ' $ # VIII 0 VIII -0. ).!4., 0 40 * /0 245, 0. ) 0 0 )0 0 VIII,. -/ (Bowen, 2002). $ ' $ $ # $ $! &0 0 - /..0. / ) -, + - /., -0 4 /0 & */ / : ( * /. ( -10 *. -, /0 * - *4 0 glu gla ) 0 *. ' ) - * - ) - *4, / ) *4 ) GLA, )0 -. & ) + 0) * + - *4 (Oldenburg J et al, 1997, Bowen, 2002). $( $ (promoter) $ IX $$! B Leyden ) )- ) ) - ) ) ) VIII IX,,, +0 )7. $. 4. ) &0 4 *.0 - ) )< , - - )7- DNA 0 +.!0 4. )0 - * , / + + 2, ) ) + 2 Leyden,. * ) 0-) - +* ) (Crossley et al, 1992, Briet et al, 1982). ( / + B Leyden 0. /. (. ) )7 CCAAT/enhancer binding protein (C/EBP) LF-A1/HNF4,

78 /0-0 - )< ). $., ), /0 -. )0, / - ) -) (androgen response element -ARE),.. LF- A1/HNF4. & /0-0 4 )0-0+ (Briet et al, 1982, Bowen, 2002, Crossley et al, 1992). +* 0+ - / - /0 (C/EBP, LF-A1/HNF4, / ).! ).) )< & +*, / 4 + ) -),. 4 +, *. ARE. 1, + 4 -* /0 ARE, 0. *) + 2 +* (Briet et al, 1982, Bowen, 2002, Crossley et al, 1992). + A ) 4). )0 - VIII /. $ $ %! + + & 2, -/ /. - VIII, 0. 0 (1-4%) + (5-25%).(-, + 0 *, 0 - /.!, + + -)/. 0*. (Hoyer, 1994,! 1996). ( + * /, -.) 0.0 *,. *0 * -0.. * / ) ), ) ), ) +, ) ) ). ). -. ), - * -,. ' / -. /) *.. ' /), /, - /) / /. & / - ) - /).,., / --., / + 0 -/0 + ) / + ) ) + //. &. 0) / - 4.-, - ) (!, 1996) & - * /0, ) 0, 0 * * ) ), ), ). ( - 25% ) /) ) + AIDS (Hoyer, 1994,!, 1996). ( ; + / + /, / ). /*, 77

79 .. /*., - ) ) 4), 0 -+-) + & 2 ( ). &/ Willebrand, VIII. /, ),. - VIII **, 0 -. Willebrand. ( -+ -) 4 Willebrand + & /) 0 ) 0-) Willebrand, ), - +, 4 Willebrand ). ( - (,., - Willebrand) )0 / Willebrand, /, + 40 / + &. ' + ) - ) +0 */ -+ -)., / + Willebrand ( ), Willebrand - -0 VIII, - / -) ) 0 - VIII Willebrand (Hoyer, 1994). 8. /* / 0 * ;. -) +. 1) H 0 VIII *, /. ), ), + - -/ *, ) * VIII. 2) H,,, ) -., ). /*. 3) 8 *, ), -, 0 ) ) + ( XII, ;- -* 7),,. /*,.), ), -/.! %$!1, $#!, ),3) - ) + ; (+ ) )). &/,.0 - * / / * ) Josso Prou -Wartelle (Josso F, Prou-Wartelle O. 1965) / )0 /* ( ) +0) /*,. /*, / ! Josso ( /0 ) -, )0 +. Josso et al (1979) -) ; TF/VII in vivo - / (Gouault-Helimann M, Josso F. 1979). & 0 (by pass) - Josso. / ) + / 78

80 VIII - 4. &. / TF, in vitro, V a -/0 Va. /*, - +. /* () +). &/, TF / +. /* ()0/* ). /*. & +,. 0, / */, +. /*, */ 0; VIII IX, Xa 10%.0. +., + / ) 0 4 -,. /0 + *), / +, +- - by pass, + VIII (!, 1996). &#*$! #,). * )"* * %!?) +0/ ), * + + & 2., ), - VIII.. & +/, ), ; +0, / 4 *. 1, 0. +/ / VIII, + -+ */ *. -., 7 / / /, * (Hedner et al, 2000) / * ** VIII, / 0 +/ ;., /*)0 4, ) V Leiden (FVL) / IIG20210A, + +, (Tizzano et al 2002, Escuriola et al 2001, Lee et al 2000, Nichols et al 1996), van t Veer et al 0-4 FVL 4. /* in vitro, / + (van t Veer et al 1997). 4 ;. 4 V Leiden / ( 5%), / *) 0 + / *) / +. 4 V Leiden (Arbini et al, 1995).? + 4 MTHFR C677T, / , /.0 /*) + *. (0 $ $!'# (#0* ). & ) + & , + &(+) + &(-). &+ &(-) + 79

81 VIII,. 90% ) +. /) + - VIII. ( + &(+) +,, - (FVIII:Ag). H %. ( + VIII 4 0; - -+0*. )0) ). ' )- 0+ FVIII:C -0 () ), 0 / - 4-0) (neutralization of cross reacting material test). 8, &+ (! 1996). ( ) 4-) )). / VIII IX. - 0, ) / (Giannelli et al, 1996, Tuddenham et al, 1998)., - - / *)/ -/0 4 0). +, / + 4 (Goodeve et al, 2000, Schwaab et al 1995, Giannelli et al, 1996, Tuddenham et al, 1998, Tuddenham et al, 1999):!4 < -, ) ; 0 4, ; - ) 0. &/, < ( )7), 0, ) 0.?),., 4 / 4,,. (Goodeve et al, 2000, Vianello et al, 1997) ( / * * (MHC) 0. -/ / +,.) + (Hay et al, 1997, Oldenburg et al, 1997). 1. */ MHC (HLA) 4 II VIII; / +,.) +., 0 4/ ) )). -, / 0 / ;, 0., ), ) 0 ), / ).?), 0 * 0) 4 / + &. 0; / * - - (Oldenburg et al, 1997, Goodeve et al, 2000).! / «+». - -/) ) - VIII - 0 (Oldenburg et al, 1997, Goodeve et al, 2000, Young M et al, 1997). &/, / 0. 0; / *),. *) -) - ),.. 6 *; / / , ), 4 0) -. 4 ) / + ( / + 2, &). 20*,. / * + ( /. < - ), % ) ) (Bowen, 2002). 80

82 $. %. * $ '()* * %! 4 ) - * + & 10., 0. - /,,, - ) -0) ) VIII / ) ). 1 -, , -).?) /, * -)- / + &, * + 4, ), - - VIII, ) )0 40 /-. & 4 VIII 0 * / 0 ) +, - *+/ * **., / + VIII, **,. 4 ( 10-20%) 0 - / * + & (Antonarakis et al, 1995, Hedner et al, 2000). $ '()* ")7 * ) DNA- *$. + /0 40 -) + 22, +0 * -) 45% ) * + ). & - -/ 0 -) / 0 +,.) 0-) VIII / VIII. 0 ** 55% ) * + / / ) 26 4 ) ) /0) -- (splice junctions) VIII. / * 4 - -/, -)../ , VIII / / * ) -+ ) + - /0) 4 - +) -. -/0 0 / ) 90% ). -.) /,. / +, -- -.) &,.) ) - 4., - / - + VIII 0* 0 / 0* & (Hedner et al, 2000). 6 / 0 +/ *. 0 - ) + DNA. H 0 ) )- -, / - -/0 0. /. 0.,, )<, ))) -+., ). 1 / * - DNA, 81

83 ., ), ), + 2, + - (linkage disequilibrium), ) -, 0 ) + (RJ Trend, A. K, 1993). ( / ) 4) - DNA *;.., 10 *--. -/0-0., - ; FVIII. & 0/- *, / -, 0. - * (1%).,./ ** ) 0, - + / 0. ) 4) - -/0-) - - (Hedner et al, 2000). : $. "(" # )+!7.! ' ( VIII ) Willebrand (vwd) H vwd 4, ) 1% /.. -0 * (Fressinaud, Meyer,1995) : 1,. (70-80% ) )),. vwf, / ) vwf. ( **. - ), / ).. 3. vwf, -/0-40. ( / ),.!$ 4: ' vwd.... 2%. 2(. 2/. 3 vwf:ag *** 0*** vwf:rco 0 Ristocetin-induced aggregation* $; ** VIII * vwf:rco: -. ** (.0- + /.*** 0, +. 82

84 4 4 / VIII + - VW, )0 - VW / VW, - )0 - VIII., ) VW (-0 ) - ) +) - VIII % +. 1 Willebrand. 2 VW / )0 VIII, + VW. 2N VWD 4. - VIII VW, -. 2N VW - + ) ) -/ /. )0 - VIII. 4 2N VWD ) - - VWF, VIII. (. 4, Arg91Gln, ) - VIII. &/ ) VIII % ) - VIII VIII , 2N VWD. -+-) &. * +. (. 4 Arg91Gln 1% /0 -. ( 4 2 VWD, VWF - (null allele) 0. )0 - FVIII. ( ; -) 2N VWD / 0. /., *. / DNA 0-4) 2N VWD +, 0. / )0 VWF VIII (Hedner et al, 2000) #'#).* ($ V $ VIII H -0 ) ) V VIII ) ) 0-) ) - ) % +. ( )7 ERGIC- 53, + ) ) V VIII - - Golgi, 0 25% ) / ,, ), - 0. */.! */, *!0 &. ( -) / * 0 ) ), / DNA + - (Hedner et al, 2000). 83

85 . /5 & /5 - /*+. ; -/ /*) ) ) +*. ' +* /*) 0, -+ / ) (... 0, )0, +, /))).. + /* 4 + ) - ), - / * /*), / /) - 4.)0 0., -0., /*+. ) +* /*) ; - / : ) + /*) -, *) /*) -, ) /, -) / ) -, - - ) (Bertina, 2001, Lane et al, 1996). ( +* /*) - : To * / -)/, /*) «-» -, * ) ) / - (/ ) (Bertina, 2001, Rosendaal, 1999). * - +* /*) 0,.0 *,,. ),,., +)+- -, / / (Bertina, 2001). &, ) -/ +* /*) */ (0; AT, PC, PS, - 0 PC (activated protein C resistance- apc-r).) 4 V Leiden), /0 0 /-) (!4 - /* /0 G20210A ). 0 /*+ // : &. + 0., 0 /*+ 0.0 /*) + 0 * / -. / -, 0 /) /* / ) 0 (proband). + -./.0 4 /*) +,. ) 0 ) - ) &./. + ) ) 0) / - &', PC PS. A - */ - / + apc-r. ) ;+) - ) / -0) (linkage analysis) 0 - apc, 0-4 apc-r V /

86 10 V, + Arg506 Gln ( V Leiden) / apc, / V (R2- R485K) -) ) 0 (0) - - VIII).,. */ apc-r 4 */ /. +. +, / / /*), 0 ) * /0 0 case- control, ) 40-7, VIII, XI, IX / TAFI. ( ) - ) / + / - +.) 0. 0 /*+, ).0) + / * ),. * ;+ - -.! 0 0 */ ) 4) + +0 * /*) - 4 ) -+ ). ( -/ +0 /*) - ). - / 0 /*+ /) : ) --: -/ - 0, *) +-+ (phenocopy):.) -/ - (-- +), ) 0: / - 0. ) 0 + -) -- : +. 4) - (Bertina et al, 2001). &+ ) - /*). /, ) 4 4) , ) )< C, S &' */ )0-0 )7. (. ) ) 4. (0,3% / ) ). &, 4. /*) /. '0, /, 0 - (linkage analysis) 4 + ). 1-0 ) Zoller Dahlback + / - + apc-r - V Leiden. ( ) ) V Leiden )0-0, / 0 ;. - / (Zoller and Dahlback, 1994). 5 ; -/0 /*). 85

87 !$ 5: 0 ** /*+ (Press et al, 2002). AT= &/*, PC= )7 C, PS= )7 S, APC-r= - 0 )7 C, FVL= V Leiden, II= /*, VTE= venous thromboembolic disease ³-CE,5$<$D/TEDFJ GDS9$5 P[QT$W C$G!H$< ¹ V%9 H:X%9: 2KQK M,N X,Q$\X T Bƒ5,RSP2\VMLREK JO [» Bƒ5,RSP2\VMLREK Jl!Ä Bƒ5,RSP2\VMLREK Jl!Å +!ÄÁ1š ²Æ:^+Ç Ê8Z@%Z!=E@$ µ Q,R C%M 9 Y ºƒCE %JY 9 ^[»[¼ ½ƒP29$D/V%9%P K\ ¾/9$5 ^[»[¼ e#c,gk 9$Q$9$;K M <:] P[QT$W C,G!H%<:] ³ $RSD/K M <:] MEY5$7CE5$9:] ERS5,RSD/K MLÀ/] X,Q$\X$R/] a = @,A ÃDR V:9$;,RS5,R Y] Z:Áa Z:Á²@ i:áf=@ ÃDR V:9$;,RS5,R Y] = Á²b ÁF= ÃDR V:9$;,RS5,R Y] Z@ A@%Á²a@ b%á²è b%á²è RSDR V%9:Á a@%áf=e@@ 9 H$9:Á b%áë a:áf=@ = Á²b Z:ÁË#RSDR V%9:Á Å2É Å2É & 5 /59? + /*+, 0. ). * ,. ).. & **/ &', PC PS. # /*+ 0 ) ). + ; 4 -. /* / /*+0 0, - -0 ** /*) -., -.. &, Koeleman et al , V Leiden PC (linkage analysis) - - ) (Koeleman et al, 1994). & 4. V Leiden 4 ) probands PC ; / /*). 0 ) ) PC ( ) **), 4 ) V Leiden -0 (Miletich et al, 1987, Tait et al, 1995, Brenner et al, 1996). 86

88 $ V Leiden ** - PS (Zoller et al, 1995, Koeleman et al, 1995). 0 0, 40% ) ) probands PS +0 4 V Leiden., Castaman et al 0+ V Leiden PS (Castaman et al, 2000). 30% ) 20210& - /*. * 0 /*) -. &- 4 V Leiden 20210& /* 4 / --0 ;. (10%) 4 4 ) probands /*+ 4 V Leiden (2ertina, 2000, Ehrenforth, 1999). 0 /*) **. '0, 0. +/ - 4 V Leiden &' (van Boven et al, 1996). 4 ) - -0 ** * -.)) ) ) -. -, /* ** - PC (Bertina, 1998, Bovill, 2000, Bertina, 2000). $. - ) 0 4 V Leiden V R2 (Faioni, 1999) V null- allele (;-- ) apc) (Greengard et al, 1995, Simioni et al, 1996). ; & /),. *. / +0 /0. & / +* /*) ) *, )- - / 0) - ). - / )7 ). 0. (;+ -) 0 4) * /*). & ) ) (Single nucleotide polymorphisms- SNP) ;+ - -,./ 0. / 0 / ) )-0.0 (coding).0 )0) (promoter) ) - ) 0 0. SNP ) - ) )< 4 ) ) ) - (PCR) 0) ---0, 0. - ) SNP /*) - 0 case- control -+. 1, **+./ , ). ( ;. SNP + - ) /, - ) ) 0 ;- / 0,. ; / / 0. SNP (linkage disequilibrium) 0 SNP + -. & 87

89 , 0 0 SNP + (.. -) /0.! 0 SNP + -0 / SNP SNP + 0../ +* /*). / (>10%). + (SNP) case- control 0. &/, 04. SNP + (<5%) case- control ) - ) ) SNP +, * ;+ -., 0 0. ).. ) -, case- control 0./. ) - ( -)). / (SEQUENCING) 0-80, 0 - ) 0 ) - /*)- + ; / - 0+ (..., /*, TFPI). 6, /. ) /) - ) 0 /*) /. & 0./ 0 /*) 4) - / TFPI,, /* /*., *0/ ; ) / 0 4 /*+ ( 0 + / 0 0, «probands»). ' 1995 Ohlin Marlar /. 4 - /*. 2 0 / ;+ 4 (Asp468Tyr) (Ohlin and Marlar, 1985). & /* /. 8 0 ; /, ) ) Glu163Glu +. /*) 0 (Ohlin and Marlar, 1999). ( Asp468Tyr / 0 &, -*0/ 0 / 0 / (Faioni et al, 1997).,., ) 4) */, *-/ - )7., ** - /* /.. +* /*) SNP + - /* *0/ , ) - -, ) (Doggen et al, 1998)., /* /*). 4 0/ - '!, SNP SNP

90 ) - /*.. 0. ( 0. ) )- (coding), (flanking). - /* (probands) /*+ ; (20210G/A). ) 20210& *0/ 18% 0) / /*) 1% ) ). 0) case- control 0 / (Leiden Thrombophilia study) & *0/ 6,2% ) --. / 2,3% - 0. (Poort et al, 1996). & / - +* /*) 0 / /* ,+0 ) /, ), 4 ) Odds ratios +* /*) ( R 2,0-6,6) 0. +/ -+ 0 ( Bertina, 1998).! ** 20210& * /*) (Ridker et al, 1999). (. ) Poort et al, 20210&. 4 ) 0-) /* 30% 0. **)/ 0. ( - LETS 40 - /* (>115 U/lt) /*) , &. 4 /*) ) 0-) /* (- -, - +, + -). 0, ) +0) 20210& (linkage disequilibrium) (founder effect) (Zivelin et al, 1998).! /* 22 ) 20210& -+ 0.? 20210& (3728T-4125C-8845G-9832T-19911A-20210A) (Ceelie et al, 2001).?) * V Leiden & (Rosendaal et al, 1998) ;+ -, ) Merati et al. / - -/ -.0 )7 C (EPCR) (Merati et al, 1999). & -* )7 + -/ ) ) ) /* 0 )7 C. ) 4) ) EPCR -/*) / ; &+ / 23 - ) 4 ) )7 - / 0., -* 0 4), 4 / 0 0 EPCR null- allele.,.,., /, - 0. (1%), 0 - /.0 /*) - case- control / */ ; + 4. & /599 ( 0 - ) SNP ( +) SNP

91 . «**0» )7., - )/ (linkage disequilibrium) 4 (Gambaro et al, 2000)., , )0 promoter (Van t Hooft et al, 1999), )-. (coding domain) (Hunault et al, 1997) VII (Pinotti et al, 2000), + - VII ) 0. (association). & ) SNP. ) -. ) SNP 0 /.0 - ) - -), + /. - /) - 3 kb (Krugluak, 1999). O 6 ; SNP 0../ 0 /*+. V G1691A (V Leiden), II G20210A MTHFR C677T / +/.! MTHFR 677T -) +* /*), V Leiden (Cattaneo, 1999, Kluijtmans et al, 1998) * 0 0 /*+. 0, -+0 SNP - / VII, PAI-I, tpa ) /*+ 0 /*) (Lane and Grant, 2000).? SNP ) - + +* /*). $., ), ) /: -/ -, --. / / 0 /, ) *//*)/ /*) -. ' 0 ) ) */ +) )., * /*). -, V Leiden «) */» /*) (Rosendaal et al, 1995),. + - ) (Martinelli et al, 1996), /*) ) +* (Martinelli et al, 1999) /*) +0* (Amitrano et al, 2001),. ) )/ * (Martinelli et al, 1997) /*) +*- (Ma et al, 1998)., 0 + /*) *,. -), / 4 - /*) + V Leiden 20210& (Vandenbroucke et al, 1994, Martinelli et al, 1999), ) ). *) (Svensson et al, 1997). 6, V Leiden - -. /*) / 0. /., D / 0, (Philipp et al, 1998). & +. / - ) /*) - case- control 0 &+- &, - (Dilley et al, 1999). ' 0 / 4/ 90

92 .0 *. -0 /*) - -,.! 4./ * /*) (... XIII Val 34Leu). & /*) 4) + ) -. (Nichols et al, 1996, Lee et al 2000). 91

93 ''' QQ ff óó ää ää 6 ÌÍ ÎÏEÐ Í$ÑEÒÓ Ô Ð Õ,Ö Ø ÓÙ(Í$ÏEÑ ÚEÓ ÛSÕÖ[ÒÜ%ÓÝ Õ ÙÏ/Þ!ÍÖ ß Ï Ô$à áâùó Ô ã#ðlø ÒÎ Ø äó Û/å ææææ ÑEÕ$ÐEäEç Ô ã èèèè v:wenpg ~Ew n ~, y r é uy r é uylêë ß Ï Ô$à áâùó Ô ã`ðlø Ü%Ñ ÙãÑ,Ó Ü%Û/å ææææ ÑEÕ$ÐEä ç Ô ã ìeíƒî ï±ð/ñòðsóoô óõ ö± øñ8ïù ú û üƒý þ[ÿ ìeí!õ#" $ö% óõ ö!&øñ!')(õ ìeí!õ#" $ö% óõ ö!&øñ!')(õ üƒý þ[ÿ +*-,.* / :0 ìeí<; =$ú ö?>)=$ú ö óõ ö&øeñ8ïù@ üƒý þ[ÿ +*-,.* / :0 ìeí<;+abc( Dù FG ±üƒý þ[ÿ +*-,.* H 4 JI6K 'LM2ðONðP ' H 4 JI689 +*-,.* ' RQ Q&&,ï ó ó H 4 JI689 S H 4 JI6K TU)JAVBW& D" ú4x!" úg% Y =,úz& H 4 JI689 +*-,.* H 4 JI6K ]]] ] ï^b,ø B ð/ø ó [[[[ ~Ew n ~W\ ygpgrœ w/x( Žv x y ] ] ï^b,ø B ð/ø ó +-_:9 I)9a`cb b S ] d)e ù f fðj$ùù %,ù %%gä äe-( "ú ú g 5 6h6K JI)9-ihjk` l^b b S +*-,.* ] ïnnp ók" úd-ä ä +-_:9 I)9a`cb H 4 JI6K +*-,.* mn (õ (õ#&ð.beó!ù?" úz op3-5 rq s t u4u4iwv x y z{6k ` ^b b b S S í^] ] óõ ö& &,ïù úúúú g 5 6h6K JI)9-ihjk` l^b b H 4 JI6K }~ I6K OS í^] ] ;1 ;1 g 5 6h6K JI)9-ihjk` l^b b H 4 JI6K }~ I6K OS í^] ] ï & ó g 5 6h6K JI)9-ihjk` l^b b H 4 JI6K }~ I6K OS 92

94 ææ çç ææ ææ ææ ƒ^] ]]]] ] í1$ù & N:î-% +-_:9 I)9Z WI68 OS 68946K W }~ I6K OS }~ I6K OS ˆ 4 Š^ LŒL Ž G ) Œ )Œ+ c : š) œ- ž Ÿ ž# -? Z )œ 4ž Ÿ - Z c ª«1. - ±-²³ µ ¹ º µ» ¼½4µ ¾J²³K À+Á ˆ ÃWÄÄ Å^. W -.±- ² ºÆ ²) O ÜGÝßÞ ÞÞÞÞ ÞÞÞÞ ŸCà- á cýlâ aã~ýàä å âcà+ý äæ æ8ç-è é Ç È-É:Æ ²)Æ ÊLË Ì.ÍWÎ Ï+Ð-Ñ.Ð Ï+Ð-Ñ.Ð Ò WŒLÓCÔÕÖ K ~ ) Ø š) 4ÓØŽ ÙpÚ ) WŽ Š Ø ÕÖ Š^Ž )ŒLÓa 4 Š Û ÕÖ ³KêW²)ÆG 2µ- O -½ -«Æ ²)Æ ë ì íî Ï «º µ Ï+Ð-Ñ.Ð ÜGÝßÞ èpïð  ¼½4µ ¾J²³K ¼½4µ ¾J²³K Ï+Ð-Ñ.Ð ÜGÝßÞ è Ÿa ññò ä ¼½4µ ¾J²³K ¼½4µ ¾J²³K Ï µ4³8 ól ³8 O» ÜGÝ Þ Ÿ ô~þ Ÿ õ äjçã-öẅ 2³K Ð ø» 4 2µÆ Ñ Oó W²)Æ ¼½4µ ¾J²³K Ï µ4³8 ól ³8 O» ÞÞÞÞ Þ â ù4 Wú4ž âcý äâ1æ æ8ç ç4æ æwñò Ãcç û ûûû ÜGÝßÞ ÞÞÞÞ ÞÞÞÞ ŸCà- á ÝLâ aã~ýàä å âcà+ý äæ æ8ç-è é ¼½4µ ¾J²³K ¹ º µ üjë «²³K ³.±³8 O» ¼½4µ ¾J²³K ³KêW²)ÆG 2µ- O -½ -«Æ ²)Æ ë ì íî Ï «º µ W²³K Wº Ñ ë.è WÆ - ÜGÝßÞ èpïð  ¼½4µ ¾J²³K ¼½4µ ¾J²³K Ï+Ð-Ñ.Ð 93

95 0 */ / - / , -0+, 0 0, /*+,. 0, / 4, ) - /*) )/. /* «linkage» - - ))., /0 +, /. - -) /*) - ) ) ( ) ) ; 0) ;+) - ), ) ) 0 ) - / / / 0. ). - (linkage analysis), ) -+,, *0*, -+ * )+0.0 (Souto et al, 2000, de Lange et al, 2001, Kamphuisen et al, 2000, Tosetto et al, 2000). (- + - (linkage analysis), /) /*) ) / ) * /*+. 20* /*+0 0, ) /* / Soria et al (Soria et al, 2000) & /* /*) - /*. ( 0 -/ GAIT,, ), /) ) + /*). - (Almasy et al, 1998, Williams et al, 1999). ' 0 ), 0, +) 0. (genetic linkage &2 - vwf, VIII. &"'', Souto et al, 2000). +) +. 4 /*) - vwf/viii, IX, XI, 7 APC- SR.,. / 0 /:, * /*).,, + +. & + - +, 0 - ( , APC- SR -+0 /-). -, ; - VIII 0 ;- ;0 0 ) ) ** ) ) )

96 ?) +0/ ), / /*+ - + ). &. - 0 ** /. /* ** ), '0 0 // Bovill et al ** /*) 0-0 0; )7 C /*) (Bovill et al, 1989). & 0 +0/ , )7 C (His107Pro), 0 ) ** (Tomczak et al, 1994). & ; 20210& - /*. 0, - 0+ /*) - (Bovill et al, 2000). + -, ;+ - ) - /*) )7 C - 0.?), ) - +/ ( - - VIII), / - ) - /*) - 0 (Scott et al, 2001). # /*+ ** ( V Leiden, &' PS) Bertina. - / /*. )7 C (2q13-14) (Guasch et al, 1997). &. - / 0 0; )7 C, - / 0 )0 0 0; )7 C. / **.)) 2. ' 0 -. / / /*) 0 0 ( - V Leiden, PS &').&. * - / 1.?), 0. / ;+ ) - )., - ; * / 0. ** ) /./.. ) / +/. /*+, / / **+ + 4 ) ) ) /*+. Activated Protein C resistance (apc-r) $ #)! (0* FV Leiden 1) +!: - ) ) -0 apc-r ) ) ) / +* /*) /. 4 ) /. *. - +* /*) ) 4/ - + ) ) ) /*).'..// -.. /*) (Dahlback et al, 1993, Bertina et al, 1994). ( apc-r * - *

97 /.) - 4 Leiden - V (G1691A). '. 4 Leiden &', PC PS )0 - + /*) - ) (Martinelli et al, 1998). ( )7 C *- 4 )7 * /.!0 )<, 0 )7 C (apc), -/ + ) ). ( )7 C * ) -/ ) (endothelial C protein receptor -EPCR). 0. /* ) ** * ) ) /* (Tm). ('-'!) )7 C. ( apc, *- 4 )7,, )7 S (PS),. 0 * ) V (Va) VIII (VIIIa),. Va VIIIa - 0, /* -,.. 0, 0 V -- VIIIa (Dahlback, 2003). - )7 C Va - /0 Arg506 Arg306, - /0 Arg (- /0 Arg ) 0 - Va, / - /0 Arg Va (Kalafatis et al, 1994).! ;. - Va - 0 /0, 0 /0 Arg306 (Nicolaes et al, 1995). H PS - - /0 Arg306 (Rosing et al, 1995). H - VIIIa * /0 Arg335 Arg562 (Kottke-Marchant, Comp 2002). & * 4 /0 Arg506 V / Gln ( V Leiden), Va apc /, ,. 0 V, - ) 0 VIIIa apc PS (Shen et al, 1994). To 1993, - Dahlback (Dahlback et al, 1993) 0; + ) - 0 PC, -.) 0 /* (aptt).) / 4) (in vitro ) 0 )7 C (apc) + /.&"'', 4, ), - /. &, - Bertina Leiden ; ** / : /0 G V &, 0. ) 0 Arg506 Gln. & 4 V Leiden (Bertina RM et al, 1994). ' ) **/ 0 ) /* - Hemker (Hemker et al, 2000). 96

98 + 26: Va - / : /0 Arg-506, /, /0 306, / /* ) /*. ( - FVa Leiden - 40 ) /*,,, 40 - /* (Hemker et al, 2000) 2). V Leiden * /*). &., 0; 0 /*+ Leiden (Leiden Thrombophilia Study- LETS), - 0 /-) (case-control) (Koster et al, 1993), - 0 (US Physicians Health Study) (Ridker et al, 1995) / / **)0 0. $. ;. V Leiden + ( 5%), + 0; (founder effect) (Zivelin et al, 2000). H ;., 0 ) ( 8 +0), 0; 0 ) -. - () ) ) AT, PC PS) (Koeleman et al, 1994, Zoller et al, 1995, van Boven et al, 1996), *, ). (Vandenbroucke et al, 1994). O - -) /*) 4 apc-r/ V G1691A (Leiden) - /*) ) «) */» +* ) ) ). (/*) ) + ). + (Martinelli et al, 1996)., apc-r.) 4 Leiden - + ) - +* /** -, 97

99 . -., /-0.. /) - ;. /*).?) /*) + 4 (Ryan et al, 1998)., / )0 - * ) apc-r.) 4 V G1691A (Desmarais et al, 1996) / /*).0 *. /0., 4 V Leiden '0,. + - /*) 0 /*) - / +0 4 V Leiden, * / 0 /*) - (Lane and Grant, 2000).! / 0. / apc-r, V Leiden. - )., /.. 0. / / +0 4 /0 V Arg306 ( Thr Gln.) (Chan et al, 1998, Williamson et al, 1998) )0 +.. (. / apc-r V Leiden 4 - /- apc-r.!, / apc-r. - 4 Leiden - ) 0 - /*) (de Visser et al, 1999) Leiden apc-r 337 / +* /*) 455.! / */ apc-r /*) -, -+ 4 ) ;).) apc-r. ' ; - VIII ) apc-r, /) ) 0-).! 0 ) / ) apc-r 0 - HR2 (Bernardi et al, 1997). H / 4 Leiden. 0 / - apc-r, / ,. / apc-r. 0 + HR * /*) (Odds ratio 1,8) (Athenc- Gellas et al, 1999), - 0, - -) /*) - - /*) (Faioni et al, 1999). - HR2 AT, PC PS - - /*) -. &/, - Leiden 4. - ( 4,2 Leiden 10,9 - -). - 40), His1299Arg Met1736Val, +. ) / * 0 ) ) -+ ) + + V / 0 ) (Castoldi et al, 1999). H. + 8%- 10% /, -. 3) $': H - apc-r. -.) APTT,.) / 0 )7 C. # / 98

100 . ) apc (apc-r),. &"'' - / ( Leiden - ) ).,, ),. 0 0/-: / V 0 - ) ) ) )<, 4- /0 0 - ). 1, 0 0/ /. 4 Leiden, ) 4) - V, -. / apc V. 0 * ), /. -), - ; - VIII. - PS, 0 **, / VIII, ) PC., ) 0. +/. 4 - V - / - apc-r: ) 4 Cambridge Hong-Kong /0 Arg306, / + (R2 - V (Press et al, 2002). (0* *,"!* G20210A 1) +!: ( /* + Poort et al 1996, /*. - -) /*) * G A (UTR) - /*, /* ) +0) 4.!., ), 20210& 4 - ; )! &, / - /* & (Soria et al, 2000). *) ( & - / mrna /*, ) ), +. (Pollac et al, 2002). ) ' 40 - /* 0. ) 0 /* -, / / )- (Wolberg et al, 2003).?) V Leiden, ) ) / (Zivelin et al, 1998) 2) :?) + 1, ) * /*) 3 +0 ( Mc Glennen et al, 2002), *0 + +* /*) (Martinelli et al, 1998) - (... ) 4 - /*) (Rosendaal et al, 1997, Doggen et al, 1998). &,. - 8% +* /*) + (Eichinger et al, 1999). '0, 99

101 * /*), - -0 ** 4 - (De Stefano et al, 1999). 3) $$ $': - /* , 0 -/) / 0/- ; &. 1,. & * -) - (PCR), / /*, * , < - * 0; 0 (RFLP) / -* /- ) + -< (Mc Glennen et al, 2002). 4 <* =* C (PC) 1) +!: ( )7 C (PC),! D *- K 4 )7, -), + / 4. ), * + - ) , / -. (PROC) *.)) 2 (q13-14) (Kottke-Marchant, Comp, 2002). ( )7 C Griffin (Griffin et al, 1981) ) 160 4, - -). 4 / PC 4/ ) (75% ) )).. ), - PC, ) 0 )0 /. + / - ) PC, )0 -, + - )7 (Kottke-Marchant, Comp, 2002). 2) $$ $': & ),, -. PC 0 / 0/- ( */.)) ))), 0 0/- (ELISA, rocket electrophoresis),.. ) (Kottke- Marchant, Comp, 2002). 3) : & / 0 0 0; PC. - /*) ) -+) ) 0; PC ( ), 4 ) +) 4) (Reitsma et al, 1995).!0 0; PC /*), 0. ) 40 0; / /*) - (Bovill et al, 1989, Allart et al, 1993). / * /*), (Koster et al, 1995) / /*) %. / 0.2%, &0, 0. - (Heijboer et al, 1990, Koster et al, 1995,Tait et al, 1995). ($ =* S (PS) 1) #)!: ( )7 S (PS) *- 4 ) , - ) PC. ( PS ) 100

102 , 0../, -/, 0+ Leydig..)) 3 0../ - -, 0 (PROS1) 0 ;--- (PROS2). ' ' 4 I ) VIII *- 4 )7, 4 IX ) XV )-. sex hormone-binding globulin (SHBG). ' 60% ) 70% PS C4 binding protein (C4BP, )7 / ) , -/0 /0 - C4BP PS *. & * - C4BP PS - 0 ) ) PS. H C4BP 0 0 )<, &0 6 ) 7 -.) * -.(* - 0. /0 - PS, 0, C4BP*+ C4BP* / / PS. (.0 C4BP PS 0 0) C4BP )7 4 +).., 0. -./, , - / PS ( --0 C4BP) - *, 4 -+ / ) * -) C4BP 4 PS 4 C4BP*+. '0, ) / PS 0. -, PS --0 C4BP*+ - - apc (Goodwin et al, 2002) / PS ) apc: ) 0 / PS (a- VIIIa), /* (Xa-Va), C4BP (Heeb et al, 1993, Heeb et al, 1994, Koppelman et al, 1995). '0 PS , / ) ) <,. PS / (Dahlback, Stenflo, 1994). $. PS 0) PS, / PS, - ) 0 PC. ( I PS ( 2/3 ) /). )0 - / PS, ) -. ( II PS (4 ). + - / PS,. -. '0, III PS ( 1/3 ) /). + 0). - PS,. - / PS,.- PS (Goodwin et al, 2002).. +, Zoller et al (Zoller et al, 1995). 0 Duchemin et al 0; / ;. (22%) 4 /) 0 + (Duchemin et al, 1995). TC )- 460, ) ) PS Heerlen. H. PS Heerlen 0,5% / ) /*+ (0,7%) (Bertina et al, 1990). # /, Heerlen - Va Leiden. 101

103 ( - PROS1-0 4 ;--, % ) / 0; PS - * - ** (Borgel et al, 1995, Reitsma et al, 1994, Gomez et al, 1995) ) PS (Lane et al, 1996). 2) $$ $': ( PS -, + 4 / ) ) 4), ;--- (PROS2). 8, 4 0/- -) +. ' - PS /-. -: ) ( PS 0/- Laurell,. ),. ELISA. *) ( / PS + - / - PS 0 PEG, - PEG, 0 C4BP-PS / 0. / PS. H 0/- 0. ; 4.*. 0. / ELISAs. ) 0. ) ( - PS ) 0 PC / 0, 40 /-, *0.&"'' "'. 0/ ;- / PC,, ; ) VIII, VII. 4 ) ) *) ) -, / PS. ' 0 - / PS - 4 (Goodwin et al, 2002). 3) : & / 0 0 /*+ PS (Swhwartz et al, 1984, Broekmans et al, 1985)., ) -+ (, ) - /*). ), /*) PS ; PS /, *. -, * ;) , 0, 0 0 / apc-r.../ / PS (Lane et al, 1996).! / 0 /- ) +. + ) ;. - PS / - 0. (Koster et al, 1995). & ) - ** PS /*+, ) ;. PS 0 / /*+, --. / 0 -. & -/ PS 4 - /*), ) PC. #, --, -- (penetrance) PS 0 0, 4/ ).) ) -, ). Leiden. (Zoller et al, 1995). A - - / /*+ --. (Bovill EG et al, 1999). '0, PS 0. +, 4, * PC (Lane et al, 1996). 102

104 ($,"!* ( ) 1) +!: (&/* (&') ) (Serine Proteinase Inhibitors). ' &' 0. * 58,2 kd ' - &'*.)) (&' / ), - )7 4 +) (Kottke-Marchant, Duncan, 2002). ( AT -) + 0 ) -) /* a, 0 IXa, Xa, XIa, XIIa, 7, VIIa. (&', ), /*. 1:1, -- (Kottke-Marchant, Duncan, 2002).! &' )<. ( (, ) /<0 ). '. 0/ ) &'. -, a &', / /* 0., )/ &'.! /* Xa,.) &'/ -/ &', / ) (Kottke-Marchant, Duncan, 2002). ( AT 4 ) -..( 4 &' * ), 0 ) ). 1,. ), ) (+ 40% ) / +* /*) &'). & - 0) : a 4 /0 &', IIb 4 * /0 - &' IIc * ) (Kottke-Marchant, Duncan, 2002) , 4 IIb - (Lane et al, 1993). 2) $$ $': ' - &' / 0 /- (Laurell +, ELISA), 0 /- (0..)) ))). - - &',. - / -. ( 0) 0-0 * ) 4) (Kottke-Marchant, Duncan, 2002). / 0 / - 0; &', ) 0 - ) / )7 (/, ), -+, +- 0) 40 ) (, / +... /, 4 -, 40 /*) -, / L- asparaginase ). (, / &' (Kottke-Marchant, Duncan, 2002). 103

105 3) : H ) ) --0) 0 &', - 0 &' ; - ) )< C S. (/*) - / ) 16, / +0 /*) - ) 25 (Thaler et al, 1981, Hirsch et al, 1989). H &'. ; - /*) ) )< C S (Conard et al, 1990).?) + 1, &', 4 /, /*), ) ) (Kottke-Marchant, Duncan, 2002, Heijboer et al, 1990, Tait et al, 1991)., 4/ * + /*+ / &', - ; / (Rosendaal and Heijboer, 1991, De Stefano and Leone, 1991):, / ; ) +* /*) (Cosgriff et al, 1998),. (van Boven et al, 1994, Rosendaal et al, 1991). $#) >!/MTHFR C677T 1) +!: ( / ) / +. ( 7 /)/ / + / - ) /-=-+ 4 (MTHF), - / /, 0. ) 0 * *) *7 (). ' MTHF ) 5,10- /- =-+, */ /=-+ - (MTHFR).?. / / 7, ). -,. /, - / *- / (CBS), * 26 )., / - 7. ( / ), ), / / ) 0-) 7, -+ ) / ; 7, ) 0 + / (. 27) (Key et al, 2002). 104

106 + 27: * / *-/ (CBS), 2 0 /=-+ - (MTHFR). - / ) / *7 /=-+ 4 (MTHF). - + ), 26, ) CBS. To / ) (Key et al, 2002). ( < 4 -. (1/200000) + 4 CBS. H ) CBS ( % /) /,, ), / (Key et al, 2002). ' - MTHFR *.)) 1. & * MTHFR <, & // 46C + * C T / % / 4, 0 < ) - 7 * ; + (Key et al, 2002).! /0: - < /0 ) + -., / 0. /.., 0. / -+,.).. -+ /0 0. -)/ - -. )7 *. -, 0 /0 *- / Ross, /) ** -/ ). /0 (Ross, 1999). ), ;+. < - -/ /

107 /0 ) - -) (cardiovascular disease-cvd), +* /** (Venous thromboembolism-vte)., -/: &- 4 -) 7 ) /) 4, - 4 -) ) +) )<. ) -/ *. 0/ < / / 4 (Key, McGlennen, 2002)., 0/ 7, - V, ) 0+ /*, / ) /, ) / (Rodgers, Kane, 1986, Lentz, Sadler, 1991, Rodgers, Conn,, 1990, Hajjar et al, 1998, Nishinaga et al, 1993, Fryer et al, 1993) */ /, * (vascular adhesion molecule-1- VCAM-1) (Hofmann et al, 2001)., ) 0 /* 0 -/ 4 0 in vivo, 0. / +0 4 / 0). -, - 0 )7 C + 4 (. ) 0 0 in vitro) / < (Cattaneo et al, 1998)., <0 : ( 0/ ) ) < 7 in vitro 0. ) 0 40 ) (Tsai et al, 1996)., -: ( < /, /*).! - ) ) */ /*4 (Khazuria et al, 2000, Di Minno et al, 1993, Durand et al, 1997). 0, Va, / 0 PC (apc) (Undas et al, 2001). & / in vitro - * in vivo 0 -./. 2) : 40. ) < - 4. //*) (cardiovascular disease-cvd) +* /** (Venous thromboembolism-vte).!, 25% ) **0) ) / + /*) - 0. ) 16 50% 0. ) 29 (Mudd et al, 1995).!. + ) - ) ).* 26. ' 0 0 / 0 +) + < /0 VTE CVD. 1 < /) 4 -, CVD VTE, (Key, Mc Glennen, 2002).? + CVD, 0. - ) / ) (case-control) *.0 <.! ), , mol/l (odds ratios ORs) ,.. + / (Bourshey et al, 1995). 106

108 ? + VTE 0., (95% CI ) 3.0 (95% CI ) (den Heijer et al, 1998, Rey, 1998). -0 case-control 0, ), - - < 0 CVD VTE. 1. / ) /*) -.!, 0 -+,., / (Egerton et al, 1996, Lindgren et al, 1995)., ) + * VTE.! - 0) 40-7 ) 0 ) - ), ) +, 0; *,, 0; + -, 0 + ( 0 ) / 0 case-control 0* ; ; ,. /)) (ey, McGlennen, 2002). '0 / < VTE, - /)) - - VTE. 4 ), + 0. ) ) 4 - VTE, - < (ey, McGlennen, 2002) $ ) - CVD VTE.! + - ) 12 + < CVD, (pooled OR 1.3; 95% CI , Danesh, Lewington, 1998). & + ; - 7 ) - * ) -)0 + (Nygard et al, 1999). $ VTE. Ridker et al *.0 4 < -/ VTE,. VTE ) ) )(Ridker et al, 1997).,..0 4 VTE / ; - /-.. (Petri et al, 1996, Cattaneo et al, 1998). H 0 LITE < - VTE,..0 - (Tsai et al, 2003)., Eichinger et al VTE ; / < (OR 2.7; 95% CI ). (.0 - VTE < (Eichinger et al, 1998). -0 ) 0 0 * 7 -/0 ;! ) 4 MTHFR C677T CVD 0 4 <, (Brattsrom et al, 1998)., ;+ ) case-control, ) - 0 LITE, - *.0 4 ) 4 MTHFR ) VTE. (Tsai et al, 2003, Cattaneo et al, 1999). A 0. +/ - VTE

109 -0 **, ) ) 4 MTHFR C677T -, ) Leiden (Ridker et al, 2001, Cattaneo et al, 1997), ) **/ 0 (Kluijtmans et al, 1998) 3) $$ $': 70% *, 0 30% 4-) % /. ( 0 7 =/0 ) ) ) + 7. ( -; - : 1) '. ; 2) %;. 3 ) 6 + /. ( 0/- - / ; < +/ 100%.! ;, / ) -, /).)+ ; - (HPLC) 0 /- +/. '0, 4 MTHFR C677T./ 0 /- *0 - PCR (Key, McGlennen, 2002). 10*)*.' # ( V! ) 0-) V /*) -. Redondo et al 0+ ; - V V ( - - V 103% - 0., / 111% (p<0.001). 8 - V >109% (95% CI: ).0.- <109%. ( /).0, +, -*,--, 0 (Redondo et al, 1999). &/, Kamphuisen et al 0 - V 474 / +* /*),. /, ( 0 ) 0-) 134% / 132% - 0. ( -+)., ) 0-) V +* /*). ' - V VIII. 4, V - + /*) VIII (Kamphuisen et al, 2002). #0*.! ' ( VII VII -+0 ) /*+ 0 Northwick Park Heart (Meade et al, 1986). ' 40 - VII. / ) /. / ) ) - ) ; - VII ; (>120%) ** ) ; - VII 4 - (Folsom et al, 1997, Smith et al, 1997, Redondo et al, 1999), +* /*) (Koster et al, 1994). + - VII,. 40 -, (Iacoviello et al, 1998, Doggen et al, 1998). 108

110 #0*.! ' ( VIII ' ; - VIII 0../ - /*). Penick et al. 0 in vitro 0, VIII. - - (Penick et al, 1966). 0, - 0 VIII VIII., VIII ;,.. 4 ) )., - VIII.., ) - ABO. & %. - - & 2.! ; - VIII * /*). Koster et al VIII * /*) ; - ) - 4 +, / 4 /*) -., ) 150% / 25% / /*) -, 10% ) 40) 0-) VIII >150% , ) V Leiden., * - von Willebrand &/, von Willebrand 1.0.-O , VIII 4 - +* /*),.-O - 0 / -, 40 - von Willebrand - 0/ ) - (Koster et al, 1995) VIII. 40 /*) ) - (Kamphuisen et al, 1999, De Mitrio et al, 1999, O'Donnell et al, 2000, Kraaijenhagen et al, 2000)., 0 / - - ) - (De Mitrio et al, 1999, Lensen et al, 2001) /. -/ 40 - VIII (Kraaijenhagen et al, 2000, Kamphuisen et al, 2000, Schambeck et al, 2001). ' - von Willebrand - ABO +0 0 ) 0-) VIII / (Kamphuisen et al, 2001). 1, +. - VIII. & / * 0 - VIII --0, ) )0 - VIII ( 0. ) - 0-) (Mansvelt et al, 1998). ' - VIII 0 - ) ) )7 0-4 VIII (Thompson et al, 2002). Kyrle et al * - +* /*) & /. - - VIII;, ), - 109

111 - 0 ) 0-) VIII 0*, ) +- - (Kyrle et al, 2000). Kraaijenhagen et al +0 4 ) 0-) VIII.. +* /*) , 4. +* /*), - ) (Kraaijenhagen et al, 2000). 1, 4 ) 0-) VIII, ) - -, /*) -, /)/ 0 - +* /*). & / / - 4 VIII +0 /*) -, ) 0. +/ ) +* /*) 0 + / * / VIII (Ettingshausen et al, 1998). - /*) - )/ 4... ( * VIII /*), ) + / *). ( ) 0-) VIII /*) 0. )/ -0 0 (Rosendaal, 1992, Reiner et al, 2001, Meade et al, 1994) )0 / + - )0 1.4 ) 1.8 (Tracy et al, 1999) ) 0-) von Willebrand (Rumley et al, 1999) /*) -, // */ 4 ) 0-) VIII 4 - /*) (Lowe et al, 2001). #0*.! ' ( $,"%$ $!'#, ; * /*). 0 / - ELISA / - +* /*) 43, + (Vlieg et al, 2000).,0 ) 20% ) /. - ) 129%, (95% CI ).! -/) ) 0), +,., - VIII, XI, ) *-K 4) ),. - /*) ; - ) IX 2.0 (95% CI ). $; - ) VIII /*) / - IX 66 +* /*) 163 (Lowe et al, 2000). ( 0 - IX 150% +* /*) 138% (P =.07).? ; - 150%, ; - - IX. - +* /*) (95% CI ; P =.007). <*(! ' ( $ $!'#,")* ' - / 474 /, ) ) 70, - +* /*) / ) (Meijers et al, 2000) & - XI ) 90 /0 (>121%)

112 /*) (95% CI ).!, / ) 0-) /*) /) ) 0), ), +.. <*(! ' ( von Willebrand $ $!'#,")* '. - ** ;. ; * - von Willebrand, 4. +, /*) (Jansson et al, 1991) ; - von Willebrand , 0 ARIC (Folsom et al, 1997, 1999) ECAT Angina Pectoris (Thompson et al, 1995) ,.. 0 ARIC - von Willebrand factor.0 (P.05) / , -/) 0, + + (. - = 1.20; = 1.18). ( /) ) ) -, ), 0, -* ARIC, von Willebrand /), + + (P <.001), / -/) ) ) - (P.05;. - = 1.29;. - = 1.24). 0 ECAT - von Willebrand. (P =.05) / / /. -/) 0 (. - = 1.24) von Willebrand. - -/), + ) ) - (Rumley et al, 1999); (Thögersen et al, 1998), 0+ - (Wiman et al, 2000), + - (Qizilbash et al, 2000) + (Smith et al, 2000) -/) +,. -/) ) ) -;.0 /+. -,. +0 -/).0 - (Meade et al, 1994);.0 4 ) 0-) von Willebrand + - (Smith et al, 1997). &40 - von Willebrand * /*), VIII. (Koster et al, 1995). ' - von Willebrand. - VIII, -, )< 4 +), ) )-. 6, 4 ) 0-) von Willebrand )0, 4 / /*) -, 0 0, - +, /*). ($ # ( $,"$ $!'# / 0. +/ XII, HK, 0/ +* /**. Goodnough et al 1983 / 111

113 * Ratnoff 0 +* /** / " * (Goodnough et al, 1983).!, Harris et al 0; 1 / PK 0/ + /*) (Harris et al, 1985). ' 1991, * 0 0+ / ,, /, /** - ) 40 (Lammle et al, 1991)..., / /*) ; 0 0; - - (- ) +* /** + +4).! 0 / 4./ + * 0; (Zeerleder et al, 1999). Halbmayer et al /. /*) / * 15% ) /. 0; XII, - *0/ /. / /*) 67% ) / (Halbmayer et al, 1992). 0 LETS (Leiden Thrombophilia Study), / +*/*), - 0/ / / PK, HK, XII (van der Meer et al, 1997). & ) / /.0 4 ( / HK PK) 40. +* /** 40) + ) - ) ) )0 - ) ) +,, ),,. 0. Yamada et al 0 / 04 *0 * 7 (2.9%) XII 4 2% ) 46%., ), 0. +)+- - (Yamada et al, 2000). * '#)* )*,")* 9), * - 0 )- / - 0 /*)0-.0,.. -., 0. -./ PAI , ),.0 * (Schleef et al,1999). &/, 4 PAI-1 / +0 /*+-/. -., 4 - PAI-1.0 * 0. ) 0. ) )- -, +0.. ), - ) PAI-1 levels (Francis, 2002) 10*)*.' # )0 )- - ) 4 PAI / 0 0. ( ) 0-) PAI-1 * - (- X) 0,.,, ).0 112

114 )< ;. ) 4 PAI / ; - ) - ). ) 4 PAI-1 -/) -. ( ) )- -, + ) ), 0. - / ) */ +* /*) (DVT). 4.,. / 0 0 +* /*) -) DVT, / 40 - "& *. /*) (Schulman and Wiman). &/ / - +* /*) / 3.,-*0/ 4 ) 0-) "&-1 / (Crowther et al). - / 0 +/. - / ) - PAI-1 ) ) PAI /*), - )/ - 4 +). ($ # )# ' 1978, Aoki et al 0 / + 0. /*+ (Aoki et al, 1978). & 0. +/ 0 )0 0 - / (Dolan et al,1988, Girolami et al, 1986, Hach-Wunderle et al, 1988, Leebeek et al, 1989, Nilsson et al, 1985, Wiman et al, 1989) / / /*). 2 ) ) - ) 0-) +/ 0 0 Brandt * 0.5% ) 2.0% ) / /*+, --. 0; &' (Brandt, 2002) * /*) +* /*) 0 (Dolan et al, 1988,Tait et al, 1996, Shigekiyo et al, 1992, Sartori et al, 1994). & +. /) ) - /*), ) V Leiden. & 0, + 0, Sartori et al *.0 4 /*), /*). 7 (9.5%) 74 0 (.) * propositi) 0 (0%) 95.) (Sartori et al, 1994). ),. + /*) 0 6.8% (18/265) % (6/170) 0.). (-+ - / /*)

115 ! * /*) / ( Sakata et al, 2001, Tait et al, 1996, Ooe et al, 1999, Sakata et al, 1996)., /. ; / (4.2%), /*+ (2.8%) (Sakata et al, 2001). 0 ) ) - (n = 9611),. 0.3%, 0. 1 (Tait et al, 1996). &.. +0/ 0 /*+ /, ) - / + - /*) 0 ). 1. )/ 0 2 /*+ 4 - /*) (Lane et al, 1996). ' 0. 0; V Leiden 0. / / (McColl et al, 1997, Castaman et al, 1998, Sartori et al, 2000). ' /*) -0 4 V Leiden. &/. ligneous conjunctivitis, -... ;-* + * (Mingers et al 1999, Schuster et al, 1997, Schuster et al, 1999, Schott et al, 1998,Sartori et al, 2001). ;-* 0, 0. ), )4 + ) *)., ; + ) **. 9) ** + 0 ). ) ) ), / +. (Schott et al,1998). 4 ) / ligneous conjunctivitis /*) (Mingers et al, 1999, Schuster et al, 1999). A10*)* * 2- )!* (2- ) ( 2-&" + 0, ), 2 + (Collen, 1976). & 0 ) (serino proteases inhibitors) 0-0. ) 0. / 0 - & (Plasmin-Antiplasmin, PAP) (Wiman et al, 1979)., &" /* , 0; /*) - in vivo, 4 2-&" 4.. +* /*. 0 2-&" / 0 / +* /*) ; /*) (Matsuno et al, 2002). 114

116 10*)* )$3 $,"%$ '(, )*- *$.* 0 0./ 754 /, /*) - ( ) */ +* /*).) *,. * + -, , /*) +0* +*-). & ) / 310 (41%) *0/ ; -.. 0: (2.5%). ; - /*, 73 (10%). ; - VII, 39/754 (5%). ; - VIIa, 223/754 (30%). ; - VIII 171/754 (23%). ; -, 44/754(6%) % ) / ), 5% ), 0.3% ) ),. 4 0 ) 0 / ) VIII, / 70% ) /. 4 - ) / ) ) /. 4 ) 0-) ) F1+2 ) /*, /* (Girtovitis et al, 2004). 115

117 116

118 & 117

119 118

120 . ' ,. /*+ +. ( 0 -. $! ),! 4/ 103,. -., 0 - & 9*) &&,.) / 0. + & 4 * + & ( - FVIII<1%), 1 ) ) * + & ( - FVIII:1-5%), 1 ) ) * ( - FVIII>5%), (11. ) &, 0.) 2. -,, ) 0. -./, + 0 ). & / ( 1 * 1 + * ) 4. von Willebrand, ) 0 (2 *, 1 0 * 1 + * ) 1.. -, V. ( 0 ) / 34.46± ( 3-78 ) , + - 2,.), ),. / + /*)-., ) ) */ +* /*), ) +, / - /. -/ /: ' - (83 / ), V (83 / ), VII (83 / ), VIII (84 / ), (79 / - 0 ) ), (77 / ), (75 / ), (81 / ), von Willebrand: Ag (75 / ), vw:ricof (74 / ), 2 & (76 / ), (77 / ), "&-1 (29 / ), &' (80 / ), PC (76 / ) PS (66 / ). ' - ) ) 0./ 0 /-, ) AT, PC, 2 &",, PAI-1 0./.), PS (/ / PS, 0/-), vw:ag (-/ 0/-), vw: Ricof (0/-*0 / ). & /, 92 4/ 4 V Leiden, 92 4 G20210A - /*, 91 4!'HFR C677T. 119

121 ? * 0 * + A (22 ) 0./. 4 * + A, + - VIII. #)$( ( (('.+#)! ) (+, ) ( (33 ± 12). 4 /*+ -/. ( 4 V Leiden G20210A 0./ /, MTHFR C677T 0./ ) ), ( ),.) /*) -., 0./ - ) -+) ). ' - ) 0./ ) - +0, +./ - 0 ) ) ) stress,. /"%$! ),! '0, / 449 /*+ /, (53± 21), )+ /**,.) /*). / 4 V Leiden G20210A - /*, 4 MTHFR C677T / 118 /*+. ). ) + /.!$ 6: / / (&= + &, 2= + 2, Will=. von Willebrand V= V.) /*)., +0 ) ) ), /. 0 +.! #" +ÿ $ &%!!þ! #" +ÿ '! )(+*!,-!.,) /%0 12,31 ý ý+þ!ÿjÿ 4# ;:<>=2?@@ '. BAC Zÿ^ý 4 D 7E F G H B 4E ID 55 '. BAC Zÿ^ý 4J7 E27 H '. BAC Zÿ^ý 4 I E27 5KD G F!ÿ L Gý 4 6 5KF 5;MG I NL ( 4O DF 7.G F '. BAC Zÿ^ý 4 F 5K6 I '. BAC Zÿ^ý 4H O6 5KI P9Q R S0Q TBQ UWVX J '. BAC Zÿ^ý 4#5;M 7&I M " "/%0 Zÿ 4#55 ID E NL ( 120

122 I ' ý D I ' D ' E I ' F O ' ' H ' ý ' I ' I 6 ' * 5 F ' I I ' * F ' I I O ' H I E 1 ' H 7 F ' 6 ' ' O ' H 7 ' 4#5KD 7E 5KD B 4#5;E ID 5;E! LY0 Gý 4#57 IF 5KD 8;:<>=2?@@!ÿ L Gý 4#5KI DBH MG Z0 4#5K6 E05 5;OG B J 4#5;O DBH 5;M B J 4#5KF DF DI G. BAC Zÿ^ý 4#5;H IF \[BV&T]^-R_ `;a &b. BAC Zÿ^ý 4 DBM. BAC Zÿ^ý 4 D.5 EI!ÿ L Gý 4 DD 5;E. BAC Zÿ^ý 4 DBE ED 5;E. BAC Zÿ^ý 4 D7 EM Z0 4 DI 7&D 5KI. BAC Zÿ^ý 4 D6 DBM MG. BAC Zÿ^ý 4 DBO 5;O 5;OG!ÿ L Gý 4 DF D6 55G!ÿ L Gý 4 DBH 7&6 5;M Lc 4EM 7&F 57. BAC Zÿ^ý 4E05 7&6 P\[BV&T]^-R_ =2d&egfh<i?<kjK?fil! /. 4ED ID F G. BAC Zÿ^ý 4EE OF 5;MG 8;:<>=2?@@Jÿ þjÿ 4E BAC Zÿ^ý 4EI 7&D D7.m. BAC Zÿ^ý 4E6 I G "þ/!ÿ 4EO EF 5KF G. BAC Zÿ^ý 4EF!ÿ L Gý 4EH EO. BAC Zÿ^ý 4J7M 57 I G NL ( 4J75 DD */ J! ÿ 4J7&D 7&I DI G. BAC Zÿ^ý 4J7E ID DD G. BAC Zÿ^ý 4J77 EH 57. BAC Zÿ^ý 4J7&I 7&D 6 G. BAC Zÿ^ý 4J7&6 ID 57 B 4J7O. BAC Zÿ^ý 121

123 4J7&F DF 6 G 6 '. BAC Zÿ^ý 4J7H 5;E I * ^þ/ 4 IBM 66 E05 '. BAC Zÿ^ý 4 I.5 EH OG H '. BAC Zÿ^ý 4 ID 5;E 6 G D! /. 4 IBE H I G E 1., /1cÿ 4 I7 E 5KD '. BAC Zÿ^ý 4 II 6F DD G O '. BAC Zÿ^ý 4 I6 OM EMG 6 '. BAC Zÿ^ý 4 IBO IBO 5K6 '. BAC Zÿ^ý 4 IF H O ^þþÿ / /% ^ÿ 4 IBH 75 5;M '. BAC Zÿ^ý 4 6BM 75 HG F '. BAC Zÿ^ý ;M 5;M!ÿ L Gý 4 6D 5KD I Gh5 J L, ( ý 4 6BE I6 6!!þ!ÿ N#! I O!ÿ L Gý 4 6I DF HGh5 '. BAC Zÿ^ý 4 66 F 6 G I '. BAC Zÿ^ý 4 6BO DBH I '. BAC Zÿ^ý 4 6F EM I '. BAC Zÿ^ý 4 6BH E 5KD!!þ/c!ÿ! 4OM I I G FBE "þ/!ÿ 4O05 6BH 57.G E cj ^þ ÿ Naÿ^ý 4OD 67 5;M þÿ L"Jÿ 4OE 5;M 6 '. BAC Zÿ^ý 4O27 E 5K6!ÿ L Gý 4OI 5;M I N ÿ Gý 4O6 EM 5KF G D!ÿ L Gý 4OO H 5KI ^þj (nj Jÿ 4OF 7H HG 7!ÿ L Gý 4OH E6 6 G 6 B 4 FBM I6 O '. BAC Zÿ^ý 4 F.5 oqp rbr 7 '. BAC Zÿ^ý 4 FD E6 7.G I! )() #%^ý Gý 4 FBE 7&D 5KI '. BAC Zÿ^ý 4 F7 7&6 I '. BAC Zÿ^ý 4 FI E05 D7.G I '. BAC Zÿ^ý 122

124 4 F6 EE oqp rbr 5KD '. BAC Zÿ^ý 4 FBO 7M 55 B 4 FF D6 EGh5 '. BAC Zÿ^ý 4 FBH EE oqp rbr EE '. BAC Zÿ^ý 4HM D6 5K6 '. BAC Zÿ^ý 4H05 5;E F '. BAC Zÿ^ý 4HD DF OG 6 '. BAC Zÿ^ý 4HE E05 F '. BAC Zÿ^ý 4H27 E05 6 '. BAC Zÿ^ý 4HI ED I '. BAC Zÿ^ý 4H6 E F '. BAC Zÿ^ý 4HO DBH HG O '. BAC Zÿ^ý 4HF ED s I '. BAC Zÿ^ý 4HH 77 I '. BAC Zÿ^ý 4#5;MBM 7&F 5KI G D '. BAC Zÿ^ý 4#5;M.5 ID oqp rbr DBO '. BAC Zÿ^ý 4#5;MD 7&6 5KF '. BAC Zÿ^ý 4#5;MBE 7E DBMGh5 '. BAC Zÿ^ý. /& 5 123

125 & # DNA ' DNA / -4*- (3.109bp) /0 0, -4*, )0 +)+ - ). *.( ) 3-5 +) , )+ 40, * -0 ) ( 0). 0) +)+- -, C. -4* C.. ). * DNA 0:, ), - (&) (G) - ) -, / (') (C).(. ) *) / +. ( ; - 0 DNA, ), ; Watson Crick, 0 ), -) /) 0-0 DNA +0 - DNA.. +) 0 : ) / DNA , ) *)( / * +) * (.), )0 +) * 4). ) ). * * ) - 0, - ) *) 4, / *. 0, &- 0 9 (&-') (G-C), ' &-' G-C. '. - DNA + ) ) ) *) -. 0 /.. ( ) 0. - DNA, - / - * * +. -) , -- +)+- - /, 5 3, 3 5. ) (- 0 DNA

126 + 28:, ) DNA (a) '- 0 * 0 DNA,. + DNA. - ).) ) +)+ ( ). (.) ), * * 0-0 (major minor groove). &,, 0 *) ) *)* 0 -. (b), DNA, + -.) +)+ (.-0 - ), ) *) ( ) ) *) (-0 0) / /. ' 5 3 ) 5 3 ) / - ).). / *) 0. *, - (A) (G), * -, / (T) (C) connected by hydrogen bonds (Dickerson, 1983). ut;vœ0w Œ+ŽWŠ )Ú ) Gš) ß WŠ^Ž. yx) Ž 2t ß )Œ+ÔŽ Š^ z) V 1Ž ŒL )Œ{ Û Š /}$~& -ƒj - ~ & ˆ0 W~ŠŒ C Ž & n $ / ' DNA. )/ / 0/ ( 0/- 0. DNA 0/- -) - (Polymerase Chain Reaction- PCR), 0/

127 (Restriction Fragment Length Polymorphisms- RFLPs). H. ) DNA (extraction DNA) ( + ) +)0 ). - ) *. ) ) ()< ) - * )< (), 0. DNA.) (Maniatis et al, 1982). ) (+,.)+) - (6! NaCl) (Miller et al, 1988). '0, DNA - *- -,. &/ - DNA - DNA ++) 260nm 280nm, )- DNA (Sambrook et al, 1989). & (OD) 260nm 0) DNA g/ml.? 0-4 -,. 50 g/ml - ) DNA 40 g/ml ) DNA. OD 260/280 nm 4/ / DNA )< 4). % OD /,. 1.2 * 0 / (Sambrook et al, 1989). J B ƒ! Lšy 3ˆ š œ žˆ&ƒj -}$~ B 2ŸKžƒ 2 >. ŒŽ& Žª L«u /ŽB K / # # ( -) DNA, ! (Saiki et al, 1985). ( 0/ DNA +.! * ( PCR 0-) - *< 0 -), / ). DNA.! PCR /). DNA, * 0 +, ž & -š 2 -Ÿ± B ~ ( PCR * - ) ) + DNA, in vivo in vitro,. + ) / , ) ) DNA, ) DNA /0 --.) - 3. ) + (primer). ) (template). (. ) - ) / ) -. ' - 0 DNA 4. PCR,. + in vitro -. DNA. (Saiki et al, 1985, Mullis, Fallona, 1987). (. + /. DNA (Bell, 1989), 0. )/ *- Thermus aquaticus (Taq)..) (primers)- / ). DNA., /0. 0 DNA /. 0 / 0 126

128 +)+ -4*-) (deoxyribonucleotide triphosphates- dntps), -0 - DNA, / Mg. ( - PCR * 3 -: 1. &-4 (!)-denaturation) - 0 DNA - ) (annealing) ) - - /.. ( / ) - ) 0, ) / DNA.. & - / -,. 0; * 0/. 3. / (extention) 0) ) DNA, ) ) / ) ) - ) / 0 / / ; /0. 1 PCR ) -.! 0 / ) / 0. - ) -. * 0 +0 / + / 0 / DNA.! --, ) *) ), 4 / / ) +) DNA., -.. ) (Repley et al, 1992, Templeton 1992). / * 3 -+0/ -. 1, -4 DNA. ; / C, sec. / ) C sec. - ), C Taq /0 0 DNA. 0 0 / / 0 (thermocyclers). ' + DNA ) *). / - (ethidium bromide), * 4 ) - ) +/ ) - +) ) - ) - PCR, / &, < PCR +0 * (Southern blotting) 0. *-..0. '0, -./.)0 0/-. ) /0) <) PCR. ) - 0, 0. /, /.0, ) *

129 DNA 3.3x10 9 bp 600 bp : ( -) - (PCR). H. PCR 0 0/ / DNA-.., -/ 0 + /. ( 4- PCR / // / (. -.) DNA 0/ 600 bp ( DNA / / bp). 1. ' * /, / -. ) 600 bp ((, (). 0 ) / DNA )0 / ' - ) DNA 0 ) / / ) DNA 0; * * / 0 - ) - ) / 0., / 0. & ). ' < 0 - ) DNA 0.. / (template) 0; '* () -- (2)- (4) * 0 +0, 0 / +) DNA 2n ( n= / ) ) PCR) / - 0 / +) 1x106 (, 1993) # ²±ŸWž&B 2 L³ ˆ žµk 2 - k & K h & g.! - / PCR 0 *-.0 DNA. 0 - / DNA., - 0 * & + ) - Taq. /0 / 128

130 ºº -4 DNA. ) / -. + PCR / 04. 0, ) - / - Taq.! ) DNA (92-96 C), / / 72 C, / Taq. /, / *- ), **) 0 / *- DNA., % ), Taq / 4 / ) ) - <) DNA. 0. /.. / - < (%, 1993). (#)* #%)3 $#,1).7# )1 (Restriction Fragment Length Polymorphism- RFLP analysis) DNA 04 ; ) *-. ) DNA. ' 0 - * Eco R1 Escherichia coli, Hind III Haemophilus influenzae... ' 0 * DNA 0. ), - 2 +)+- - (0 / -). / 0 ) ' DNA * / -+ 0/ 0. (blunt ends) - (cohesive). ' 0. -) DNA. 0). *-..0 (Southern blotting), ) *-),.+ - ).,. ) ) 0.+ DNA, -+ ) ) ),. -+, ) 4 4).?- DNA 0. -/0-0 / /. ( ; /0-0 /0, / /. '/ ) ) + / 0 (Restriction Fragment Length Polymorphism- RFLP) (Maniatis et al, 1982, 2*- 1993). ' 0 4 / /, C. / /, /) - - / / -.!- 0 ) 1g DNA *0 / (/, ph.) $ +¹-º º#¹3»/¼0 Š cú ) Gš 129

131 PCR ) +, 4) -+ ). &.. -.,. 0, 0/- PCR. 0. < PCR ) 0 0 /. /. &/ + ) 0/ ) <).0 ) - DNA ) 0/ (Lungu et al, 1992). E E* E RFLP + 30: RFLP. 1 DNA 0. Southern../0 DNA, *- (B), PCR, / / -.. ' RFLP s 0 (0) /0 0 (*),.. 0. /0 -., 0 / ; DNA - /0, ). 0 / - /0 * (-4). RFLP s - (biallelic), ( ). & / 4/ /0 + (*).. DNA. 130

132 m!+ #)* # ( V Leiden O V Leiden 4 - V ( * - G / - - &). ( 4 0. ) 0 / 4 - Arg /0 506 V (/0 0 PC- apc Va - ) 4 - Gln. 1 Va PC (apc-r test /) /*+. V Leiden.. PCR,. 0 (primers) 'aq ' 0 Mnl - < - ) 0. *) GAGG. & < Leiden, 0. / AAGG, 0 - ) (Beauchamp et al, 1994). $$ 1) 0 (Primers) FV3: 5 - CAT GAG AGA CAT CGT CTC TG- 3 FV6: 5 - GAC CTA ACA TGT TCT AGC CAG AAG -3 2)! --) (dntps mix datp, dgtp, dctp, dttp) 3) PCR master mix: 83.6 l l / - PCR 3.0 l.). (MgCl2) 1.0 l F3 F6. 4) 'aq (Biotaq polymerase), /0-20 C -0 0) 1,5 u/2l. 5) Pre-mix 0; Mnl. 5.5 l l / - NE 0.5 l BSA (Bovine Serum Albumine) 6) 0 Mnl (/0-20 C). &*.- 1:5 0. 7) +0 (Sigma) 8) 10 x TBE (TrisBorateEDTA) / -, / -). 108 g Tris Base 55 g Boric Acid 9.3 g Na2EDTA, ml. 9) &, Metaphore 10) Ethidium Bromide: 10mg/ml C ), +) (Loading Buffer½ PCR 131

133 To master-mix PCR 98l, 4.).,. / DNA 40-0) 200ng../ 1l. 0 -.) DNA./.. / ) - PCR 95 C 7 /0 Taq polymerase ( PCR hot start- / )). - 4: 1) 95 C 7 (0 - DNA) 2) 72 C 1 (/ Taq ) 3) 94 C 1 (-) 4) 57 C 1 (*- ) 4) 72 C 1 (/ < PCR) 3, C 10 '0, C ). $. ( + -)/ ) - 0-) < 4 -., 1,5g & 100ml TBE (1x) + ) / 2l Ethidium Bromide. ' / + ;./. / 1x TBE buffer (- +) + - */ / - +) (loading buffer). + DNA (ladder), / DNA 147bp. + 90Volts 1 / - * (Transilluminator). & /- < 143 bp., , < -.) DNA -/- /. +, ).,- $$ * Mnl / ) Eppendorf / 8 l pre-mix 0; Mnl. /0 10 l PCR product / ),, 2 l Mnl. '. +0 (mineral oil) +./ 4. ' ) + -, 37 C.- 2 ) 15. " $ $ $* ' metaphore ( +. /0 - / DNA ) 500 bp. 100 ml '2 1x - 3,5 metaphore, ). & l. -,. +./ -, */ loading buffer., + DNA - (ladder) (/) 123 bp) Volts,

134 . $' : & Leiden:,, 25, *). ) Leiden:, 4, 25, 37, *). ) Leiden:, -, *). (#)+ 1). 133

135 !+ #)* # *!# # '!# *,"!* ' & - /*. -) - (PCR) 142 bp - /*, * ).- (primers): PT1: 5 - ATT GAT CAG TTT GGA GAG TAG GGG 3 PT2: 5 - AAT AGC ACT GGG AGC A GAA GCT /* 3 +0., / ) / ' downstream primer (PT2) / * & (0 ). ). 1,. & / , - /0 0 Hind III. 8,. 4 < (Makris et al, 1997). $$ 1) 0 (Primers) PT1: 5 - ATT GAT CAG TTT GGA GAG TAG GGG 3 PT2: 5 - AAT AGC ACT GGG AGC A GAA GCT 3 2)! --) (dntps mix datp, dgtp, dctp, dttp) 3) PCR master mix: 41,8 l 0 5,0 l / - PCR 3,0 l.). (MgCl2) 1,0 l 4) 'aq (Biotaq polymerase), /0-20 C -0 0) 1,5u/2l. 5) Pre-mix 0; Hind III 5,5 l 0 2,0 l / - NE 0,5 l BSA (Bovine Serum Albumine) 6) 0 Hind III (/0-20 C). &*.- 1:5 0. 7) +0 (Sigma) 8) 10 x TBE (TrisBorateEDTA) Buffer, / -). 108 g Tris Base 55 g Boric Acid 9.3 g Na2EDTA 134

136 , ml. 9) Agarose, Metaphore 10) Ethidium Bromide: 10mg/ml C ), +) (Loading Buffer) PCR To master-mix PCR 45l, 4.).,. / DNA 40-0) 150ng/2l../ 1l. 0 -.) DNA./.. / ) - PCR 95 C 7 /0 Taq polymerase ( PCR hot start- / )). - 4: 1) 95 C 7 (- DNA) 2) 72 C 1 (/ Taq ) 2) 94 C 20 sec (-) 3) 57 C 20 sec ($*- DNA-.) 4) 72 C 20 sec (/ < PCR) + 3, 4 5 * C 10. '0, C " $ $ $* ( + -)/ ) - 0-) < 4 -., 1,5g & 100ml TBE (1x) + ) / 10l Ethidium Bromide. ' / +. / TBE (1x) buffer + - */ - +). + DNA (ladder), / DNA 142bp. + 90Volts 1 / Transilluminator. & ; / - < 142 bp., , < -.) DNA - / - /. +, ).,!0!$ Hind III. / ) Eppendorf / 8 l pre-mix 0; Hind III. /0 10 l < PCR / ),, 2 l Hind III. '. +0 (mineral oil) +./ 4. ' ) + -, 37 C.- 2 ) 15. $ metaphore. 135

137 ( +. /0 -. DNA ) 500 bp. 100 ml '2 1x - 3,5, ). & l. -,. +./ -, */ - +)., + - DNA (ladder) (/) 123 bp) Volts, 2..! : & 20210&:, 142 *). ) 20210&:, 3, 24, *). ) 20210&:, -, *). (#)+ 1) %! 1: 0 +) FV Leiden, )+.. 4 IIG =/ 0 4, Het= 0 4 Hom= 4., 0 4 FV Leiden (4, 25, 37, *)), 0 4 (2, *)) 4 + (25, *)) IIG20210A (3, 24, *)), 3 + ) 4 ( 142 *)). 136

138 PCR $( $#,! (Long PCR) * $(#<* * )% #!# 22 )!' # ( FVIII $( ( - PCR / VIII./. 4.* 0/- Southern blotting, / & + / kb 22 (int22h1) ) - 4)- ). int22h2 and int22h3;.0 int22h2 int22h3 0. ) 99% )- / /.0 int22h1 (. 31) ( kb. PCR + - GC 3.5-kb, 0 * kb. GC ) 79%. 0, 0/- PCR (. PCR. + - (overlapping) PCR (long-distance) PCR (. 31). ( +. PCR / DNA (wild-type), +, +0., 0, P Q, *- -- /0 VIII / bp bp * 0)/ int22h1. 8-0, A B, / /0 167 bp +118 bp * 0)/ ). int22h2 int22h3. ' PQ (12 kb) AB (10 kb).) PB (11 kb) AQ (11 kb), / 10-kb AB -0 4)-. + PQ (12 kb), PB + AQ (11 kb), AB (12 kb). AB int22h2 int22h '.) 0.6% 0. (. - PCR 4 / ) /0 long-distance PCR: (1) ;0 dimethylsulfoxide (DMSO) (2) 40 Taq ; (3) 50% deaza-dgtp (Liu et al, 1999). 137

139 + 31: & - PCR. 0 0 (P, Q, A, B) 4 0 /0. ' ) int22h1, )/ (flanking).' ) int22h2 int22h3, )/ (flanking).0. &+0 * - 4 int22h1 ) - int22h2 int22h3 (0 0). ) + < - PCR.) + (wild-type), + + (inversion) + (carriers) (Liu et al, 1999). $$ Extensor Hi-Fidelity PCR Master Mix, Buffer 2 (Abgene AB-0795b) MWG Custom Oligo s (5-3 ): Primer P: GCC CTG CCT GTC CAT TAC ACT GAT GAC ATT ATG CTG AC Primer Q: GGC CCT ACA ACC ATT CTG CCT TTC ACT TTC AGT GCA ATA Primer A: CAC AAG GGG GAA GAG TGT GAG GGT GTG GGA TAA GAA Primer B: CCC CAA ACT ATA ACC AGC ACC TTG AAC TTC CCC TCT CAT A Dimethyl Sulfoxide 100ml Tris Base 5kg EDTA 500g 138