DNA-riadená RNA-polymeráza (EC ) alebo DNA-riadená RNAnukleotidyltransferáza,

Transcript

1 P5/1 Transkripcia bakteriálneho genómu prenos genetickej informácie z DNA (chromozómovej, plazmidovej) do RNA DNA-riadená RNA-polymeráza (EC ) alebo DNA-riadená RNAnukleotidyltransferáza, DNA-depententná RNA-polymeráza, transkriptáza RNA-polymeráza na rozdiel od DNA-primázy, ktorá katalyzuje pri replikácii syntézu krátkych reťazcov RNA v závislosti na primozóme, RNA-polymeráza katalyzuje syntézu dlhých primárnych reťazcov RNA (primárnych transkriptov vo forme transkripčných jednotiek) na matrici DNA a viaže sa na promótor v mediátorová ribonukleová kyselina (mrna): nesie prepis štrukturálnych génov a slúži ako matrica pre syntézu polypeptidového reťazca na ribozómoch (u baktérií primárny transkript nepodlieha posttranskripčnej modifikácii) v prekurzorová ribozómová ribonukleová kyselina (pre-rrna): primárny transkript génov pre rôzne typy rrna v prekurzorová transferová ribonukleová kyselina (pre-trna): primárny transkript génov pre rôzne typy trna RNA-polymeráza katalyzuje prepis všetkých primárnych transkriptov vo forme transkripčných jednotiek (operónová, neoperónová tj), ktoré sa skladajú z promótora, niekoľkých génov a terminátora. Transkripcia prebieha v troch fázach: iniciácia, elongácia (pripojovanie nukleozid - 5 -monofosfátov k 3 -koncu RNA-reťazca), terminácia. represor

2 P5/2 Bakteriálny promótor promótory jednotlivých transkripčných jednotiek sú dosť podobné (afinita k jednej RNA-polymeráze), sila promótora (tým silnejší, čím viac sa približuje ku konvenčným sekvenciám) holoenzým sa skladá: Bakteriálna RNA-polymeráza v 2 a podjednotky (m.h ) - udržujú stabilitu celej molekuly v 1 b podjednotka (m.h ) - podmieňuje väzbu ribonukleotidov na polymerázu v 1 b podjednotka (m.h )- podmieňuje spojenie RNA-polymerázy s matricovou DNA (negatívny reťazec) v 1 s podjednotka (m.h ) - sigma faktor - podmieňuje špecifickú väzbu RNApolymerázy k promótoru (sekvencia -35, -10) Bakteriálne terminátory terminátory nezávislé na ró-faktore terminátory závislé na ró-faktore ró-faktor je proteín, ktorý na terminátoroch na ňom závislých katalyzuje uvoľnenie dokončeného RNA-reťazca z matricového DNA-reťazca a tak zakončí transkripciu Štruktúra terminátora nezávislého na ró-faktore a jeho prepis do mrna Terminátory závislé na ró-faktore majú namiesto sekvencie AAAAAAAA, ktorá sa prepisuje do UUUUUUUU a predstavuje signál pre uvoľnenie RNApolymerázy a mrna z DNA-reťazca sekvenciu GTTAGAA, ktorá sa prepisuje do sekvencie CAAUCUU a preto potrebujú ró-faktor

3 P5/3 Iniciácia transkripcie sigma faktor sa viaže na promótor prostredníctvom AMK v a helixe (-35/2 AMK, -10/treo, arg) -35 rozpoznávacia funkcia -10 premieňa uzatvorený komplex na otvorený (uvoľní väzbu medzi pozitívnym a negatívnym reťazcom DNA od štartovacieho nukleotidu začína syntéza, vzniká prvý dinukleotid, otvorený úsek (11-17 bp) spôsobuje pnutie v mieste -35 a -10

4 P5/4 Elongácia RNA-reťazca Rýchlosť syntézy RNA je asi 40N/s, RNA-polymeráza sa pohybuje v smere od 3 - konca negatívneho reťazca DNA k jeho 5 - koncu. Syntéza RNA prebieha v smere 5-3 a v tomto smere sa aj RNA predlžuje záporné nadzávitnicové vinutie kladné nadzávitnicové vinutie RNA -polymeráza pri svojom posune dopredu mení topologický stav prepisovaného úseku DNA

5 P5/5 Výmena sigma faktora za proteín NusA pri transkripcii Terminácia nezávislá na Ró-faktore: zastavenie pohybu RNA-polymerázy, uvoľnenie hotovej RNA, uvoľnenie RNA-polymerázy z DNA (naviaže sa na vytvorenú vlásenkovú štruktúru a dosyntetizuje sekvenciu UUUUUUUU, hybrid DNA-RNA je v tomto useku nestabilný) Terminácia závislá na Ró-faktore: m.h , hexamér, viaže sa počas transkripcie na 5 - koniec mrna a posúva sa spolu s RNA-polymerázou smerom k terminátoru, kde po rozpoznaní s NusA proteínom katalyzuje odvíjanie mrna z reťazca DNA a uvoľnenie RNA-polymerázy (vyžaduje ATP)

6 P5/6 Transkripcia štrukturálnych génov bakteriálna transkripčná jednotka obsahujúca štrukturálne gény sa odlišuje od ostatných transkripčných jednotiek v tom, že medzi promótorom a prvým štrukturálnym génom za štartovacím nukleotidom obsahuje tzv. vedúcu sekvenciu, ktorej biologický význam spočíva v tom, že obsahuje Shineovu-Dalgarnovú sekvenciu, ktorá sa prepisuje z negatívneho DNA-reťazca do 5 -konca mrna ako 5 A G G A 3, touto sekvenciou sa potom mrna viaže k sekvencii 3 U C C U 5, ktorá sa nachádza na 3 konci 16S-rRNA ribozómovej podjednotky 30S a môže sa prepisovať do primárnej štruktúry proteínov (primárny transkript, ktorý neobsahuje SD sekvenciu sa neviaže na ribozóm a neprepisuje sa: rrna, trna). AUG iniciačný kodón UAG terminačný kodón v obsahuje na 5 - konci prepis vedúcej sekvencie, ktorá sa neprekladá v za vedúcou sekvenciou obsahuje prepisy štrukturálnych génov, ktoré sa prekladajú do primárnej štruktúry proteínov, pričom je každý vymedzený iniciačným a terminačným kodónom v na 3 - konci obsahuje prepis terminátora končiaceho koncovou sekvenciou UUUUUUUU, ktorá sa neprekladá v je multigénna, obsahuje prepis viacerých génov v bakteriálna mrna sa posttranskripčne neupravuje v jej životnosť je len niekoľko minút v z celkovej bunkovej RNA v reálnom čase predstavuje len 3%

7 P5/7 Súvislosť transkripcie do mrna s jej transláciou rýchlosť transkripcie pri 37 C je 40 N/s» 13 AMK, u niektorých transkripčných jednotiek pripadá až 15 iniciácií za minútu, pričom vznikne 15 mrna, z ktorých každá je pokrytá 30 ribozómami (polyribozóm), pričom vznikne až 30 polypeptidových reťazcov

8 P5/8 Transkripcia bakteriálnych génov pre rrna a trna E. coli K12 sedimentačná konštnata 30S 5-9 transkripčných jednotiek pre rrna na chromozóme pre rrna sa štiepi RNAázou III E.coli - dve multigénne transkripčné jednotky Pre trna - elongačný faktor EF-Tu má funkciu mrna lebo obsahuje na 5 konci Shineovu-Dalgarnovu sekvenciu, ktorou sa pripojuje k ribozómu

9 P5/9 Transkripcia eukaryotického genómu transkripcia jednolivých zložiek eukaryotického genómu: jadrová, mitochondriálna, chloroplastová prebieha oddelene Primárne transkripty jadrovej DNA: v heterogénna jadrová RNA (hnrna) - obsahuje štruktúrne gény v prekurzorová ribozómová RNA (pre-rrna) - obsahuje gény pre 5,8SrRNA, 18S-rRNA, 28S-rRNA u cicavcov a 5,8S-rRNA, 16S-rRNA a 25SrRNA u vyšších rastlín v prekurzorová transferová RNA (pre-trna) - obsahuje gény pre rôzne druhy trna v 5S-rRNA v malé RNA - stabilné N dlhé RNA (malé jadrové RNA - snrna, malé jadierkové RNA - snorna, malé cytoplazmatické RNA - scrna, ich funkcia je spojená s riadením zostrihu, posttraskripčnými úpravami, prípadne neznáma) Eukaryotické DNA-dependentné RNA-polymerázy v RNA-polymeráza I: katalyzuje syntézu pre-rrna (nachádza sa len v jadierku), prepisuje gény I. triedy, nie je citlivá k a-amanitínu v RNA-polymeráza II: katalyzuje syntézu hnrna a malých rrna (nachádza sa v karyoplazme), prepisuje gény II. triedy, je citlivá k a- amanitínu, je zložená z 10 protomérov (a, b, b sú podobné ako u prokaryotickej RNA-polymerázy) v RNA-polymeráza III: katalyzuje syntézu pre-trna, 5S-rRNA a niektorých malých RNA, (nachádza sa v karyoplazme), prepisuje gény III. triedy, citlivosť k a-amanitínu je druhovo špecifická každá z nich vyžaduje špecifický promótor na ktorý sa viaže Transkripčná aktivita eukaryotickej bunky v bazálna transkripcia: odpovedá minimálnym požiadavkám bunky (bazálne TF, sú vo všetkých bunkách - prevádzkové gény) v konštitutívna transkripcia: umožňuje rôznym génom rôznu rýchlosť transkripcie podľa požiadaviek bunky (bazálne a konštitutívne TF) v indukovateľná transkripcia: umožňuje reagovať pri transkripcii na vonkajšie prostredie bunky (indukovateľne TF, uplatňujú sa pri diferenciácii buniek) transkripčné faktory sú regulačné proteíny, ktoré sa viažu na regulačnú oblasť promótoróv alebo zosilovačov transkripcie a väčšinou pozitívne ovplyvňujú zahájenie transkripcie

10 P5/10 Transkripcia katalyzovaná RNA-polymerázou II katalyzuje syntézu hnrna a malých rrna rozoznáva RNA polymerázu II Protismerné elementy promótora Ďalšie majú význam pri diferenciacii niektorých typoch buniek TATA-box (-34 až -26) CAAT-box (-75 až -80) GC-box (-90) oktomér- ATTTGCAT štartovací nukleotid A iniciátor, Inr-element BTF: TFIID (obsahuje TBP proteín, ktorý sa vyskytuje vo všetkých EO), TFIIA, TFFIIB, TFIIF, TFIIE, TFIIH, TFIIJ Transkripčná jednotka riadená promótorom RNA-polymerázy II sekvencia eukaryotického terminátora nie je známa

11 P5/10-1 Väzba TBP na DNA TBP - proteín spôsobuje po naviazaní na DNA ohnutie v mieste TATA boxu, ktorý sa touto interakciou rozvinie (denaturuje), zaroveň pritom pravdepodobne dochádza aj k deštrukcii nukleozómu, lebo komplex ohnutej DNA s TFIID obsahuje osem histonóv nukleozómu. Jeden TAF faktor disponuje acetyltransferázovou aktivitou, takže možno predpokladať, že dochádza aj k acetylácii histónov. TBP - proteín môže interagovať aj s inými protenmi ako sú RNA-polymeráza II, TFIIA a TFIIB transkripčné faktory. Význam TAF faktorov spočíva: môžu rozoznať aj promótory bez TATA boxu a bez Inr-elementov pôsobia ako koaktivátory transkripcie

12 P5/11 Iniciácia transkripcie katalyzovanej RNA-polymerázou II z promótora obsahujúceho TATA-box a Inr-element TFIIA zabraňuje väzbe faktora DR1 na TFIID, ktorý by sa nemohol naviazať na TATA box a faktor TFIIB TFIIB je rozoznávaný komplexom RNA-polymerázaII a TFIIF TFIIF umožňuje väzbu polymerázy na promótor Iniciačný komplex je transkripčne neaktívny

13 P5/12 TFIIH aktivuje uzavrený iniciačný komplex prostredníctvom svojej helikázovej a fosforylačnej aktivity aktiváciou začína elongácia hnrna, pričom RNApolymeráza II už pôsobí bez transkripčného faktora transkripčné faktory umožňujú rozoznať miesta, na ktoré sa RNA-polymeráza II má naviazať a začať transkripciu, zároveň uvádzajú RNApolymerázu II do aktívnej konformácie, aby sa transkripcia mohla vôbec začať uvedené TF sú bazálne Iniciácia transkripcie katalyzovanej s RNA-polymerázou II z promótora s Inr-elementom a bez TATA-boxu

14 P5/13 Terminácia transkripcie katalyzovanej RNA-polymerázou II koniec transkripcie je u eukaryontov signalizovaný sekvenciou AATAAA-polyadenylačný signál (10-30 N za touto sekvenciou sa hnrna bude štiepiť), ktorý sa prepisuje do hnrna, po jeho odštiepení pomocou endonukleázy sa uvoľní 3 - koniec hnrna, ktorý sa polyadenyluje (postranskripčné úpravy) hnrna vznikajúca transkripciou génov kódujúcich prepis histónov nemá polyadenylačný signál, ale jej 3 -koniec je určený tvorbou vlásenkovej štruktúry a je rozoznávaný U7-snRNA, ktorá sa viaže k tejto hnrna prostredníctvom špecifickýck sekvencií

15 P5/14 Malé RNA syntetizované RNA-polymerázou II U1-snRNA, U2-snRNA, U4-snRNA, U5-snRNA, U7-snRNA, U11-snRNA, U12-snRNA, v jadierku U3-snRNA (len u rastlín), U8-snRNA a U13-snRNA sekundárna štruktúra U1-snRNA, U2-snRNA, U4-snRNA, U5-snRNA, U6-snRNA sa podieľajú na riadení zostrihu (splicing) hnrna

16 P5/15 Transkripcia katalyzovaná RNA-polymerázou I prepisuje gény pre 5, 8S-rRNA, 18S-rRNA, 28S-rRNA promótor sa skladá zo základnej časti (štartovací nukleotid, nezbytná) a regulačnej časti (mnohonásobne zvyšuje účinnosť transkripcie), neobsahuje TATA-box transkripčné faktory: UBF a SL1 (TBP, TAF1, TAF10, TAF63 - vytvorený komplex umožňuje väzbu TBP k promótoru bez TATA-boxu) Transkripčná jednotka riadená promótorom RNA-polymerázy I rdna-obsahuje repetície dvoch transkripčných jednotiek, ktoré sa prepisujú do 45S pre-rrna RNA-polymeráza I prepisuje aj medzerníky väzbou na ich promótory

17 P5/16 Priebeh transkripcie katalyzovanej RNA-polymerázou I medzerníkové promótory prevdepodobne uvádzajú voľné molekuly RNA-polymerázy I k promótoru transkripčnej jednotky, kde tieto molekuly zostanú tak dlho, pokiaľ sa promótor transkripčnej jednotky neuvoľní od predchádzajúcej RNA-polymerázy I

18 P5/17 Transkripcia katalyzovaná RNA-polymerázou III prepisuje 5S-rRNA, trna, 7SL-snRNA, U6 a U7SK-snRNA promótory: typ I (5S-rRNA), typ II (trna/7sl), typ III (U6/U7SK) RNA-polymeráza III je rozoznávaná transkripčným faktorom TFIIIB, ktorý je umiestnený prostredníctvom TBP proteínu ako zložky faktora TFIIIB na promótor Transkripčné jednotky riadené uvedenými promótormi končia sekvenciou TTTT, na rozdiel od transkripčných jednotiek riadených promótormi RNA-polymerázy I a II

19 P5/18 Priebeh transkripcie katalyzovanej RNA-polymerázou III promótor typi Komplex II môže byť stabilný aj niekoľko týždňov a umožňovať tak opätovnú väzbu RNA-polymerázy III na gén pre 5S-rRNA čím sa vytvára možnosť vzniku viacerých transkriptov z jedného génu

20 P5/18-1 Väzba TBP na dsdna denaturácia-rozvinutie dsdna TBP proteín sa vyskytuje vo všetkých eukaryotických organizmoch Funkcia TBP pri väzbe eukaryotických RNA-polymeráz na dsdna väzbou RNA-polymerázyI na SL1 sa zaháji transkripcia väzbou RNA-polymerázy III na TFIIIB sa zaháji transkripcia

21 P5/19 Transkripcia mitochondriového genoforu mtdna obsahuje tri transkripčné jednotky, dve prekrývajúce sa na H reťazci (riadené promótormi P1 a P2) a jednu na reťazci L (riadená promótorom P3), prepisom vznikajú tri molekuly primárneho transkriptu, ktoré podliehajú ďalšej úprave (RNA, trna)

22 Kontrolné otázky: 1. Mechanizmus transkripcie bakteriálneho genómu 2. Transkripcia bakteriálnych štrukturálnych génov, génov pre rrna a trna 3. Transkripcia eukaryotického genómu 4. Rozdiely v mechanizme transkripciea eukaryotického genómu pomocou RNApolymerázy I, II, a III.