Biochémia nukleových kyselín I

Transcript

1 Biochémia nukleových kyselín I Mechanizmus replikácie DNA P4 Peter Javorský javorsky@saske saske.sksk saske.sk/javorsky Ústav fyziológie hospodárskych zvierat SAV, Košice Replikácia prokaryotickej a eukaryotickej DNA je: s e m i k o n z e r v a t í v n a d v o j s m e r n á s e m i d i s k o n t i n u á l n a

2 v roku 1958 Replikácia bakteriálneho (prokaryotického) genómu jednosmerná - dvojsmerná replikácia

3 Replikácia prokaryotickej chromozomálnej DNA Iniciácia replikácie: rozoznanie vytvorenie replikačnej vidlice miesta ori replikačnými proteínmi a Elongácia (predlžovanie)) DNA reťazcov: pripájanie deoxyribonukleozid monofosfátov k 3 - koncu syntetizujúceho sa reťazca na matricovom reťazci Terminácia replikácie: zakončenie replikácie príslušného replikónu v mieste ter, väzbou špecifického proteínu Tus nastane inhibícia helikázy,, čím sa zastaví tvorba replikačnej vidlice Enzýmy podieľajúce sa na replikácií: DNA-primáza primáza,, DNA-helikáza helikáza,dna-polymerázy, DNA-ligáza ligáza,, DNA-gyráza DNA polymerázy: enzýmy katalyzujúce syntézu DNA z deoxyribonukleozidfosfátov za prítomnosti DNA- alebo RNA-priméru priméru, DNA-riadené riadené-dna-polymerázy (DNA-dependentné dependentné-dna-polymerázy), polymerizácia musí začať vždy od 3 -konca krátkeho oligonukleotidu DNA- alebo RNA - priméru. DNTPn + DNAn = 2 DNAn + nppan DNA-polymeráza I: (Kornbergov enzým): m.h , 600N/min., 400 molekúl v jednej bunke E.coli, DNA-primér primér,, obsahuje aj 5-3 a 3-5 exonukleázovú aktivitu, DNA-polymerázy A. Katalyzuje replikáciu DNA v medzerách, ktoré zostaly medzi Okazakiho fragmentami,, zároveň odstraňuje RNA-priméry svojou 5 -exonukleázovou aktivitou DNA-polymeráza II: m.h , okrem polymerizačnej aktivity má aj 5-3 a 3-5 exonukleázovú aktivitu, DNA-polymerázy B DNA-polymeráza III: m.h , je zložená z viacerých monomérov, komplexný enzým dosahuje rýchlosť polymerizácie 500 N/s, replikuje sa ním celá molekula bakteriálnej DNA

4 DNA-helikáza helikáza: katalyzuje odvíjanie komplementárnych reťazcov DNA v smere 5-3 kde prebieha syntéza Okazakiho fragmentov (ruší vodíkove väzby,, zároveň hydrolyzuje nukleozid trifosfáty), helikáza I, II, III, IV, Rep-proteín proteín,, n,-proteín proteín, DnaB- proteín, RecBCD-enzým enzým, UvrAB-komplex komplex DNA-primáza (DnaG - proteín,, DNA-riadená RNA-polymeráza polymeráza): katalyzuje v spojení s primozómom syntézu RNA-primérov (oligoribonukleotidov), od ktorých 3 - koncov začína syntéza krátkych polydeoxyribonukleotidov - Okazakiho fragmentov, katalytický účinok je aktivovaný DnaB - proteínom DNA-ligáza (polydeoxyribonukleotidsyntetáza): katalyzuje ligáciu polynukleotidov (vznik fosfodiesterovej väzby medzi 5 - koncom a 3 - koncom reťazcov alebo fragmentov), spája Okazakiho fragmenty do súvislého polynukleotidového reťazca DNA-gyráza gyráza: topoizomeráza II, počas semikonzervatívnej replikácii prevádza pred replikačnou vidlicou kladné nadzávitnice na záporné Rozpletanie DNA spoločnými účinkami proteínu Rep, helikázy II a proteínov SSB

5 DNA polymerázy: enzýmy katalyzujúce syntézu DNA z deoxyribonukleozidfosfátov za prítomnosti DNA- alebo RNA-priméru priméru, DNA-riadené riadené-dna-polymerázy (DNA-dependentné dependentné-dna-polymerázy), polymerizácia musí začať vždy od 3 -konca krátkeho oligonukleotidu DNA- alebo RNA - priméru. DNTPn + DNAn = 2 DNAn + nppan DNA-polymeráza I: (Kornbergov enzým): m.h , 600N/min., 400 molekúl v jednej bunke E.coli, DNA-primér primér,, obsahuje aj 5-3 a 3-5 exonukleázovú aktivitu, DNA-polymerázy A. Katalyzuje replikáciu DNA v medzerách, ktoré zostali medzi Okazakiho fragmentami,, zároveň odstraňuje RNA-priméry svojou 5 -exonukleázovou aktivitou. DNA-polymeráza II: m.h , okrem polymerizačnej aktivity má aj 5-3 a 3-5 exonukleázovú aktivitu, DNA-polymerázy B. DNA-polymeráza III: m.h , je zložená z viacerých monomérov, komplexný enzým dosahuje rýchlosť polymerizácie 500 N/s, replikuje sa ním celá molekula bakteriálnej DNA (vedúce vlákno, Okazakiho fragmety v opozdenom vlákne). DNA-primáza (DnaG - proteín,, DNA-riadená RNA-polymeráza polymeráza): katalyzuje v spojení s primozómom syntézu RNA-primérov (oligoribonukleotidov), od ktorých 3 - koncov začína syntéza krátkych polydeoxyribonukleotidov - Okazakiho fragmentov, katalytický účinok je aktivovaný DnaB proteínom. DNA-helikáza helikáza: katalyzuje odvíjanie komplementárnych reťazcov DNA v smere 5-3 kde prebieha syntéza Okazakiho fragmentov (ruší vodíkove väzby,, zároveň hydrolyzuje nukleozid trifosfáty), helikáza I, II, III, IV, Rep-proteín proteín,, n,-proteín proteín, DnaB-proteín proteín, RecBCD-enzým enzým, UvrAB-komplex. DNA-gyráza gyráza: topoizomeráza II, počas semikonzervatívnej replikácii prevádza pred replikačnou vidlicou kladné nadzávitnice na záporné. DNA polymerázy I a III: I: katalyzujú replikáciu DNA v medzerách, ktoré zostaly medzi Okazakiho fragmentami,, zároveň odstraňuje RNA-priméry svojou 5 - exonukleázovou aktivitou, enzýmy katalyzujúce syntézu vedúceho vlákna a Okazakiho fragmentov. DNA-ligáza (polydeoxyribonukleotidsyntetáza): katalyzuje ligáciu polynukleotidov (vznik fosfodiesterovej väzby medzi 5 - koncom a 3 -koncom reťazcov alebo fragmentov), spája Okazakiho fragmenty do súvislého polynukleotidového reťazca.

6 Replikácia prokaryotickej a eukaryotickej DNA je: semikonzervatívna dvojsmerná semidiskontinuálna Semidiskontinuálna syntéza dsdna pri replikácii...jeden reťazec sa syntetizuje na matrici kontinuálne až do konca (vedúci reťazec), druhý reťazec sa syntetizuje prerušovane cez Okazakiho fragmenty (O.f. krátky polydeoxyribonukleotid syntetizovaný na matricovom reťazci v smere 5-3 od 3 - konca RNA priméra,, N, opozdený reťazec), syntéza obidvoch reťazcov prebieha súčasne za katalytického účinku DNA-polymerázy III v smere pohybu replikačnej vidlice... ori každý O. f. vyžaduje vlastný RNA-primér, syntéza prebieha proti smeru replikačnej vidlice, RNA-priméry sa odbúrajú v smere 5-3 od 5 konca a vzniknuté medzery sa doplnia na matrici DNA tak, že O. f. sa predlžuje v medzere od 3 - konca

7 Dvojsmerná replikácia bakteriálneho chromozómu Iniciácia replikácie oric Schéma štruktúry oric u E. coli In prokaryotes DNA synthesis occurs at all times

8 Špecifický proces - jedno miesto oric - raz za generačnú dobu bp musí byť rozpoznané medzi 4, bp. DnaA proteíny rozpoznávajú oric a zároveň ho otvárajú väzbou na AT páry, čím dochádza k narušeniu vodíkových väzieb-denaturácii denaturácii. DnaB proteín v spoluúčasti DnaC proteínu sa naviaže na začiatok replikácie Odvíjanie reťaca DNA v smere 5-3 za vzniku replikačných vidlíc Väzba SSB proteínov na jednoreťazové DNA, udržujú matricové reťazce DNA v natiahnutom stave, bránia tvorbe vodíkových väzieb a vzniku dsdna Syntéza vedúceho reťazca DNA a Okazakiho fragmentov ( N 2000N) (11 N)

9 Replikácia eukaryotického genómu zvláštnosti replikácie chromozómovej (jadrovej) dsdna prebieha len v S-fáze bunkového cyklu, vo fáze G1 a G2 prebieha len transkripcia a translácia ndna predstavuje veľký súbor replikónov (každý má svoje ori), každý replikón sa replikuje len jedenkrát, nie súčasne ale v určitom poradí h G0 : kľudovýstav, rôznedlhý G1 : transkripcia a translácia a ďalšie aktivity bunky, gap-medzera, príprava k replikácii DNA (cca 10 h). S : syntéza - replikácia DNA, na rozdiel od prokaryontov len v tomto štádiu bunky dochádza k replikácii DNA (6-8h) G2 : príprava na mitózu (2-6 h) M : mitóza a delenie bunky (1 h) Bunkový cyklus v in vitro kultúre trvá h, bc buniek v organizme môže kolísať od 8 h-100dní, rozdiely sú hlavne vo fáze G1, nevratne diferencované bunky (neuróny, svalové bunky) sa nedelia vôbec, sú v kľudovom stave G0.

10 Replikačná vidlica Nukleozóm je základná jednotka chromatínu: oktamér histónov (H2A, H2B, H3, H4)2, jednu molekulu H1, 200 bp úsek DNA, ktorý tvorí dve otáčky okolo histonóveho oktaméru Replikačná vidlica! Nukleozóm je základná jednotka chromatínu: oktamér histónov (H2A, H2B, H3, H4)2, jednu molekulu H1, 200 bp úsek DNA, ktorý tvorí dve otáčky okolo histonóveho oktaméru!

11 Priebeh replikácie eukaryotickej jadrovej dsdna Aktivácia iniciácie replikácie viažu sa sem proteíny s helikázovou,, DNA-polymerázovou aktivitou Súbor proteínov zúčastňujúcich sa v mieste ori iniciácie replikácie sa označuje ako orizóm

12 S 6-88 hod. EM replikačnej bubliny eukaryotickej DNA Eukaryotický ký chromozóm je príliš veľký aby sa replikoval z jedného ori replikačného miesta (keby to tak bolo tak replikácia chromozómu by trvala 10 dní) Eukaryotické DNA-polymerázy polymerázy: DNA-polymeráza α - v komplexe s DNA-primázou katalyzuje syntézu Okazakiho fragmentov pri replikácii ndna,, nevyznačuje sa exonukleázovou aktivitou DNA-polymer polymeráza β - uplatňuje sa pri syntéze krátkych reťazcov pri reparácii DNA DNA-polymer polymeráza γ - katalyzuje syntézu mitochondriálnej DNA DNA-polymer polymeráza δ - syntéza vedúceho reťazca, dokončuje syntézu opozdeného reťazca, polymerázová a exonukleázová aktivita, väzba na proliferačný bunkový antigén (PCNA( PCNA-proteín) DNA-polymer polymeráza ε - neznáma funkcia

13 Biologický význam kružnicových molekúl dsdna,, spočíva v tom že sa zreplikujú celé, bez skracovania ako to môže byť u lineárnych molekúl dsdna Replikácia kružnicového bakteriálneho chromozómu končí v bode, kde sa konce replikačnej vidlice zídu

14 Teloméra: riadi pri riadi pri replikácii dokončenie syntézy dcérskych DNA reťazcov chromozómu- telomerické konce (len v niektorých bunkách); funkcia telomér spočíva v tom, že chránia konce chromozómu pred poškodením, pred spojením do kruhu, prípadne pred napojením sa na iné štruktúry DNA v jadre bp G- motívy bp

15 Teloméra: riadi pri riadi pri replikácii dokončenie syntézy dcérskych DNA reťazcov chromozómu- telomerické konce (len v niektorých bunkách); funkcia telomér spočíva v tom, že chránia konce chromozómu pred poškodením, pred spojením do kruhu, prípadne pred napojením sa na iné štruktúry DNA v jadre. Druh Opakujúce sekvencie bp G- motívy Arabidopsis TTTAGGG Human TTAGGG Oxytricha Slime Mold Tetrahymena bp Tetrahymena Trypanosome Yeast TTTTGGGG TAGGG TTGGGG TAGGG (TG) TG Teloméra obsahuje viac ako 1000 jednoduchých opakujúcich sa sekvencií bohatých na G, toto vlákno končí s prečnievajúcim úsekom bp.. Enzýmy, ktoré replikujú chromozóm nedokážu zreplikovať jeho prečnievajúce konce, pričom sa teloméry skracujú, bunky s kratšími telomérami nedokážu spoľahlivo transkribovat gény súvisiace s funkciami delenia bunky. Telomerické sekvencie Dolly...v somatických bunkách sa v závislosti na veku dľžka telomér skracuje...

16 Telomeráza pôsobí tak, že sa prostredníctvom svojej RNA-zložky komplementárne spojí s primérom na 3 - nedoreplikovanom konci. S RNA sa potom komplementárne spájajú ďalšie nukleotidy,, napr. vytvorením sekvencie TTGGGG (Tetrahymena( thermophila), ktorej tandemová repetícia sa potom vytvorí tak, že prichádza k niekoľkonásobnej tranlokácii telomerázy. Nie je jasný mechanizmus, ktorý zaisťuje to, že na 3 - konci zostane segment pôsobiace ako primér pre ďalšiu replikáciu Telomeráza pôsobí tak, že sa prostredníctvom svojej RNA-zložky komplementárne spojí s primérom na 3 - nedoreplikovanom konci. S RNA sa potom komplementárne spájajú ďalšie nukleotidy,, napr. vytvorením sekvencie TTGGGG (Tetrahymena( thermophila), ktorej tandemová repetícia sa potom vytvorí tak, že prichádza k niekoľkonásobnej tranlokácii telomerázy.

17 TTGGGG (Tetrahymena( thermophila) Telomerázy sú nukleoproteíny,ktorých RNA zožky obsahujú úsek, ktorý je komplementárny k opakujúcej sa telomerickej sekvencii Telomeráza sa vyskytuje v rýchle deliacich sa eukaryotických bunkách (prvoky, kvasinky), nevyskytuje sa v somatických bunkách cicavcov (gén je prítomný ale je neaktívny), vyskytuje sa však v pohlavných, embryonálnych a tiež v nádorových bunkách Táto sekvencia funguje ako matrica pre reverznú traskriptázu,, ktorá syntetizuje telomerickú sekvenciu,, premiestňuje sa k novému koncu 3 - koncu a opakuje celý proces 3 násobná translokácia Novo nahradené nukleotidy sú vyjadrené malými písmenami Telomerické sekvencie: : v somatických bunkách človeka sa v závislosti na veku dľžka telomér skracuje (neobsahujú telomerázu). Skracovaním dľžky telomerických sekvencií je indukovaný opravný mechanizmus DNA, ktorým sa zastavuje bunkový cyklus (hypotéza). Telomeráza je však potrebná, aby mohlo bunkové delenie prebehnúť. Prítomnosť telomerázy v rakovinových bunkách človeka túto hypotézu podporuje. Mohlo by zastavenie aktivity telomerázy rakovinových bunkách zapríčiniť tiež zastavenie ich delenia? v