Transkripcija u eukariota

Transcript

1 Transkripcija u eukariota 1

2 Transkripcija u eukariota osnovni principi isti kao kod prokariota razlika: veći broj RNA-polimeraza relativno složene kontrolne sekvence Primarni transkript: - u prokariota je većinom produkt nekoliko susjednih gena - u sisavaca je produkt jednog gena 2

3 Eukariotske RNA-polimeraze Jezgra eukariota sadrži 3 vrste RNA-polimeraza: Osim ovih jezgrinih enzima, stanica eukariota sadrži i odvojene mitohondrijalne i kloroplasne (u biljaka) RNA-polimeraze. 3

4 Sve su tri jezgrine RNA-polimeraze složeni enzimi koji se sastoje od 12 do 17 različitih podjedinica Struktura kvaščeve RNA-polimeraze II. Podjedinice su prikazane u različitim bojama. (Od P.D. Kramer i sur., Science 292: 1863.) 4

5 Eukariotske RNA-polimeraze Mr = kd Svaki tip enzima se sastoji od "velikih" podjedinica ( 100kD) i skupine "malih" podjedinica ( 50kD). Velike su podjedinice homolozi, ß i ß` podjedinica bakterijskih RNApoli, te strukturno i funkcionalno čine jezgru enzima. 5

6 Podjedinice eukariotskih (S. cerevisiae) RNA-polimeraza 6

7 7

8 Važna uloga RNA-polimeraza čini ih esencijalnim kao mete za napad od strane antibiotika i drugih lijekova. 8

9 Inhibitori RNA-polimeraza Rifampicin (Rifampicin is made by the soil bacterium Amycolatopsis rifamycinica) inhibira prokariotsku RNA-poly -Amanitin eukariotsku RNA-poly II 9

10 -Amanitin Otrovna gljiva Amanitia phalloides Odgovorna za većinu trovanja gljivama Toksin, biciklički amatoksin Čvrsti 1:1 kompleks s RNA-poly, K=10-8 M Djeluje polagano, smrt nakon nekoliko dana 10

11 Eukariotski promotori Signali u DNA koji kontroliraju transkripciju u stanicama eukariota su različiti. Dvije vrste elemenata sekvence, bliže promotoru: jedan od elemenata definira gdje će započeti transkripcija uzduž DNA drugi pridonosi mehanizmima koji kontroliraju koliko često se transkripcija dogaďa 11

12 U genu timidin-kinaze kod herpex-simplex virusa koji se koristi transkripcijskim faktorima svog domaćina za gensku ekspresiju postoji jedinstveno polazište transkripcije i točna transkripcija od ovog polazišta ovisi o slijedu nukleotida smještenih 32 nukleotida ispred startnog mjesta. Transkripcijski elementi i vezujući faktori u genu za timidin-kinazu (tk) herpex simplex virusa. RNA-polimeraza II (nije prikazana) vezuje se za regiju TATA sloga (koji je povezan pomoću TFIID) kako bi se stvorio višekomponentni preinicijacijski kompleks koji može započeti transkripciju u jednom nukleotidu (+1). Učestalost ovog dogaďaja povećava se s prisutnošću uzvodnog cis-djelujućeg elementa (GC i CAAT slogovi) smještenog ili u blizini promotora (proksimalno od promotora) ili udaljenog od promotora (distalno). Ovi elementi vezuju transdjelujuće transkripcijske faktore, (Sp1 i CTF). Ovi cis-elementi mogu djelovati neovisno o 12 usmjerenosti (strjelice!).

13 13

14 Promotori eukariotskih RNA-polimeraza species specifični kompleksniji i različiti od prokariotskih prepoznaje samo vlastiti promotor i one sličnih vrsta 14

15 TATA box, pb uzvodno od mjesta početka transkripcije Promotorske sekvence odabranih eukariotskih strukturnih gena. Homologni segment, TATA box, je osjenčen u crveno s podcrtanom bazom na poziciji -27. Početni nukleotid koji će biti prepisan (+1) je osjenčen u zeleno. Zapis na dnu označava usaglašenu sekvencu, s donjim indeksom koji označava % pojavljivanja navedene 15 baze.

16 Usuglašena sekvenca TATA sloga je TATAAA, a opisane su brojne varijante. 16

17 bazni promotorski elementi: -31 do +6 uzvodni promotorski elementi: -187 do do -25 od start mjesta TATA slog CAAT i GC slogovi 17

18 Na TATA slog se veže TBP (TATA-binding protein) TBP je podjedinica najmanje dva kompleksa koji se sastoje od više podjedinica. Ostale se podjedinice nazivaju TAF podjedinice (engl. TBP-associated factors, TBP-veznim faktorima). Kompleks TBP-a i TAF-a naziva se TFIID. Smatra se da je vezivanje TBP-TAF (TFIID) na TATA slog prvi korak u 18 stvaranju transkripcijskog kompleksa na promotoru.

19 OdreĎeni broj kodirajućih gena za mrna nemaju TATA slog 2 dodatna cis-elementa usmjeravaju RNA-polimerazu prema promotoru: Sekvenca inicijatora (Inr) i/ili tkz. donji element promotora (DPE) 19

20 TCA+1 G/T T T/C TCA+1 G/T T T/C A/G G A/T CGTG Inr obuhvaća startno mjesto (-3 do +5) i sadržava sekvencu TCA+1 G/T T T/C (A+1 označava 1. prepisani nukleotid) Proteini vezuju za Inr kako bi usmjerili vezanje Pol II uključuju TFIID Promotori koji uključuju i TATA slog i Inr mogu biti snažniji od onih koji imaju samo jedan od ovih elemenata. DPE sadržava sekvencu A/G G A/T CGTG i nalazi se na oko +25 mjestu. I DPE, poput Inr, su povezane s TAF-podjedinicama TFIID. 20

21 Sekvence još udaljenije od start mjesta određuju koliko se često obavlja transkripcija GC i CAAT slogovi svaki od ovih slogova vezuje specifičan protein Sp1 na GC slog CTF na CAAT slog Promjene pojedinačnih baza u bilo kojem od cis-elemenata imaju snažan učinak na funkciju, smanjujući vezivanje poznatih trans-faktora 21

22 Treća klasa elemenata sekvence također može povećati ili smanjiti brzinu transkripcije eukariotskih gena Pojačivači (engl. enhancers) Prigušivači (engl. silencers) PronaĎeni na cijelom nizu mjesta ispred i iza mjesta početka transkripcije i čak unutar prepisanih dijelova nekih gena. Mogu pokazati svoje djelovanje i kad su smješteni tisućama ili desetke tisuća pb dalje od transkripcijskih jedinica Mogu djelovati i neovisno o usmjerenju Opisane stotine ovih elemenata Neke sekvence vežu samo pojedinačni protein, a neke više različitih proteina 22

23 Eukariotski transkripcijski kompleks Složeni aparat koji se sastoji od najmanje 50 jedinstvenih proteina omogućuje pouzdanu i reguliranu transkripciju eukariotskih gena. Za razliku od prokariota, RNA-polimeraze (RNAP) kod eukariota (poly I, poly II, poly III) ne mogu razlikovati promotorske sekvence od drugih DNA regija. Drugi proteini, opći transkripcijski faktori (engl. general transcription factors, GTF) olakšavaju vezivanje RNAP na promotor i stvaranje preinicijacijskog kompleksa (PIC). Treća skupina proteina, koaktivatori ili koregulatori djeluje zajedno s GTF 23

24 Transkripcijski faktori Kod eukariota, najmanje 6 osnovnih transkripcijskih faktora (GTF, general transcription factors) djeluju kao ekvivalent faktora kod prokariota 6 GTF visoko očuvani, od kvasca do čovjeka GTF osiguravaju bazalnu transkripciju Transkripcija može biti potpomognuta dodatnim gen specifičnim faktorima. 24

25 TFIIB: veza izmeďu RNA-poli II i TFIID TFIID: veže se na TATA box preko TBP (sadrži i TAFs) TFIIH: kinaza koja fosforilira CTD (carboxy-terminal domain) domenu RNA-poli II, nakon čega PIC disocira i inicijacija započinje TFIIA je poput koaktivatora, stabilizira vezivanje TFIID (TBP + TAF) 25

26 Skupina GTF potrebna je za inicijaciju transkripcije u eukariota (RNAP II) U prvom koraku, TFIID se specifično veže za TATA slog. Nadalje, TFIIB dolazi na kompleks, slijedi RNA-poli u pratnji s TFIIF. TFIIE i TFIIH se potom udružuju u kompleks. Uz ATP, TFIIH fosforilira RNA-poli II i inicijacija može započeti. Mjesto fosforilacije je dug polipeptidni rep koji se proteže od najveće podjedinice RNA-poli II. Opći transkripcijski faktori su tijekom evolucije visoko očuvani: neki od njih izolirani iz humanih stanica mogu se za potrebe eksperimenta npr. zamijeniti onima iz kvasca 26

27 27

28 28

29 Preinicijacijski kompleks (PIC) PIC, multiproteinski kompleks sposoban započeti transkripciju veže se na TATA-slog promotora (dio TFIID) 29

30 Pojačivači aktivatori gena na daljinu 30

31 Pojačivači Regulatorni proteini kod eukariota Pojačivač je slijed koji se može nalaziti i vrlo daleko od gena, ali će utjecati na pojačanje njegove ekspresije Energija od hidrolize ATP-a Typical structure of a eukaryotic mrna gene 31

32 Interakcijom pojačivača i RNA-poli, DNA načini omču 32

33 33

34 Transkripcijski faktori RNA-poly I i III Formiranje preinicijalnog kompleksa na promotorima RNA- poly I i III slično je kao i na promotorima RNA-poly II Razlika je u tome što se poslije vezivanja TBP (TATA binding protein) za DNA ne vezuju isti proteini kao na promotorima RNA-poly II. Na promotorima RNA-poly I za TBP se vezuje protein SL1, a na promotorima RNA-poly III, protein TFIIIB. 34

35 RNA-polimeraza I posvećena je isključivo transkripciji gena za ribosomne RNA, prisutnih u uzastopnim ponavljanjima Geni za ribosomnu RNA. Ribosomna DNA se prepisuje dajući velike molekule RNA (45S pre-r RNA koje se naknadno kidaju na 28S, 18S i 5,8S rrna. 35

36 Promotor gena za ribosomne RNA obuhvaća oko 150 pb neposredno uzvodno od inicijacijskoga mjesta transkripcije. Te promotorske sljedove prepoznaju dva transkripcijska faktora, UBF (faktor koji se veže uzvodno, engl. upstream binding factor) i SL1 (faktor selekcije 1, engl. selectivity factor 1), koji se kooperativno vežu na promotor a potom im se pridružuje polimeraza I te time nastaje inicijacijski kompleks Inicijacija transkripcije rdna. Dva transkripcijska faktora, UBF i SL1, kooperativno se vežu na promotor rdna i pridružuju RNA-polimerazu I stvarajući tako inicijacijski kompleks. Jedna podjedinica SL1 je TBP, protein koji se veže na TATA-slog. 36

37 Transkripcija gena polimerazom III Promotori gena za 5S rrna i trna nalaze se nizvodno od mjesta inicijacije transkripcije. Transkripcija gena za 5S rrna je inicirana vezanjem TFIIIA nakon čega slijedi vezanje TFIIIC, TFIIIB i polimeraze. Promotori za trna ne sadržavaju vezno mjesto za TFIIIA, a on nije ni potreban za njihovu transkripciju. Umjesto toga, TFIIIC inicira transkripciju trna gena vezanjem na promotorski slijed, a potom se združuju TFIIIB i polimeraza. 37

38 38

39 39

40 Procesiranje RNA 40

41 Transkripcija u prokariota se zaustavlja terminacijskim signalom, a dio tog signala završava ukosnicom i i poli-u repom Transkripciju u eukariota prekida posebna RNA-endonukleaza koja prepoznaje poliadenilacijski slijed i prekida lanac nizvodno od signala Poliadenilacija doprinosi stabilnosti molekule, pomaže u transportu iz jezgre u citoplazmu i uključena je u translaciju 41

42 Transkripcijom RNA-polimeraze II nastaje hnrna (heterogena nuklearna RNA) iz koje strukturnim promjenama nastaje zrela mrna koja izlazi iz jezgre i služi kao kalup za povezivanje AK kod sinteze proteina. STRUKTURNE PROMJENE: 1. Izrezivanje introna 2. Dodavanje kape na 5 kraj 3. Dodavanje polia repa na 3 kraj 42

43 43

44 44

45 Krajeve introna obilježavaju specifični slijedovi Intron u pravilu počinje s GU, a završava sa slijedom AG. Mjesto grananja sadrži sačuvani adenilatni ostatak (A) važan za prekrajanje, nakon kojeg ide polipirimidinski slijed, pa bilo koja baza, zatim C i sačuvani slijed AG. Mjesto grananja je važan unutarnji slijed između 20. i 50. nukleotida uzvodno od mjesta prekrajanja na 3'-strani. U sisavaca su pronađene različite sekvence na tom mjestu, dok kod kvasaca mjesto grananja gotovo uvijek ima 45 slijed UACUAAC. (Prilagođeno prema Berg i dr., 2013).

46 46

47 47

48 48

49 Introni se uklanjaju prekrajanjem mrna U proces prekrajanja uključene su male nuklearne ribonukleoproteinske čestice (čestice graďene od proteina i male rrna - snrnp) snrnp se udružuju s drugim proteinima i čine kompleks spliceosom 49

50 Izrezivanje introna 50

51 6 razina kontrole ekspresije gena u eukariota 1. Transkripcija 2. Obrada pre-mrna 3. Prijenos mrna iz jezgre u citoplazmu 4. Razgradnja mrna u citoplazmi 5. Translacijska kontrola 6. Posttranslacijske modifikacije proteina

52 Transkripcijski regulatorni proteini Interakcije DNA-protein se zasnivaju na slabim kemijskim vezama, istim onim koje su odgovorne za održavanje konformacije NK i proteina. One se mogu ostvariti na mnogo različitih načina i mogu biti manje ili više specifične. Interakcija DNA i proteina je veoma važna za ekspresiju genoma. 52

53 Veliki broj transkripcijskih faktora u eukariotskoj stanici TF sadrže više različitih tipova veznih domena 53

54 Struktura proteina koji su u interakciji sa DNA: Uzvojnica-okret-uzvojnica Heliks-zavoj-heliks (HTH) proteini imaju dva α-heliksa odvojena zavojem Zavoj ima specifičnu strukturu nazvanu β zavoj izgraďen od četiri AK. Ovaj zavoj u interakciji sa prvim α-heliksom pozicionira drugi α-heliks na površinu proteina što omogućava da doďe do velikog utora DNA molekula. Drugi heliks je odgovoran za prepoznavanje sekvence DNA. Ovi HTH proteini obuhvaćaju oko dvadesetak AK što predstavlja mali dio proteina. Neki od drugih dijelova proteina objese se za površinu DNA molekula da bi točno pozicionirali protein u veliki utor. Mnogi prokariotski i eukariotski gen regulatorni proteini imaju heliks-zavoj-heliks dio. 54

55 Struktura proteina koji su u interakciji sa DNA: Zn-finger proteini 1% od svih gena sisavaca kodiraju Znfinger proteini. Oni imaju domene koji se ponavljaju i sadrže po dva Cys i dva His u regularnim razmacima; Njih povezuje atom Zn koji je neophodan za aktivnost. Preko ta dva Cys povezuju se sa β pločom, a preko His sa α-heliksom. Zbog prstolikog izgleda su i dobili ime. α-helix je dio koji se povezuje sa velikim utorom DNA. 55

56 Struktura proteina koji su u interakciji sa DNA: Leucin - zipper proteini dimerni proteini blizu N-terminalnog kraja imaju baznu regiju, bogatu bazičnim AK, kojima se protein vezuje za DNA. bliže C-kraju heliks je bogat sa Leu koji mu daje hidrofoban karakter. Ti Leu se svojim bočnim lancima vezuju meďusobno hidrofobnim vezama slično patent zatvaraču (engl. zipper) povezujući na taj način jedinice dimera. 56

57 Struktura proteina koji su u interakciji sa DNA: Heliks petlja - heliks proteini su po strukturi slični zipper proteinima ali u hidrofobnom heliksu imaju još i petlje. Ovi proteini lako formiraju heterodimere tako da različite kombinacije izmeďu podjedinica mogu dati mnogu veću grupu različitih proteina. 57

58 58