Universaalsus vs selektiivsus. Fluorofoorid. Uuringud in situ ja/või in vivo. Fluorofoorid

Μέγεθος: px

Εμφάνιση ξεκινά από τη σελίδα:

Download "Universaalsus vs selektiivsus. Fluorofoorid. Uuringud in situ ja/või in vivo. Fluorofoorid"

Άφροδίτη Γεωργίου
5 χρόνια πριν
Προβολές:

1 Luminestsentsispektroskoopia II Uuemad võimalused, eritehnikad, bio-objektid Märgistamine Valguse Polarisatsioonitasandi pöördumise mõõtmine Ergastusenergia ülekanne () Fluorestsentsi eluea mõõtmine Üldistus: Universaalsus vs selektiivsus Mida laiemalt levinud on mingi fenomen, seda madalamat selektiivsust see pakub UV-Vis: madalal lainepikkusel neelavaid aineid on palju, pikal lainepikkusel neelavaid vähe Lühike lainepikkus: universaalne, pikk: selektiivne UV-Vis vs Fluorestsents: UV-neelajaid molekule palju universaalne Fluorestseerivaid molekule vähe selektiivne Uuringud in situ ja/või in vivo Kuna vaid vähesed ühendid fluorestseerivad, siis õnnestub sageli saavutada selektiivsust ka reaalsetes paljukomponentsetes objektides, mis annab võimaluse teha uuringuid in situ ( kohapeal ) ilma eraldamiseta in vivo ( elusa sees ) elusorganismis, häirides vähe või mõõdukalt organismi talitust Loomulikud Sisse viidud (markerid) Markerid seotakse uuritava süsteemiga (valk, rakk, viirus, ) enamasti mõne keemilise reaktsiooniga Neid on välja töötatud väga palju Loomulikud Looduslikes kudedes on põhilised fluorestseerivad ained sellised: aromaatsed aminohapped NADH flaviinid pyridoksüül-ühendid klorofüll Fluorescence Spectroscopy. 3 rd Edition. Springer,

Tavaliste valkude fluorestsents Erastusspektrid UV alas Emissioonispektrid UV või napilt nähtavas alas Trüptofaan domineerib Kui markerite ergastus- ja emissioonspektrid on pikematel lainepikkustel,

lagunevad Seda nimetatakse Fotolagunemiseks (photobleaching) 6.11.

2 Tavaliste valkude fluorestsents Erastusspektrid UV alas Emissioonispektrid UV või napilt nähtavas alas Trüptofaan domineerib Kui markerite ergastus- ja emissioonspektrid on pikematel lainepikkustel, siis valkude iseeneslik fluorestsents ei sega Sisse viidavad (markerid) 7 8 Fotolagunemine Kui fluorestseerivat ainet pidevalt kõrge intensiivsusega valgusega kiiritada, siis molekulid lõpuks lagunevad Seda nimetatakse Fotolagunemiseks (photobleaching) Siiani pole me üldse üritanud vaadelda konkreetse molekuli asendit kvandiga põrkumisel Igale ainele on omane teatav üleminekumomendi vektor See määrab, mil moel molekul ergastumiseks väliselt elektriväljalt energiat saab Aine molekul saab neelata kvandi, kui selle kvandi elektrivälja vektor on üleminekumomendiga samas suunas Sama kehtib ka kiirgumise kohta Ergastav kiirgus on polariseeritud Kui ergastunud olek seisab paigal siis on ka emiteeritav kiirgus polariseeritud Molekulide pöörlemine ja olekute eluead Ergastunud olekute eluead (fluorestsentsi karakteristlikud ajad) on tihti 1-10 ns ( s) Madalmolekulaarsete molekulide pöörlemise karakteristlikud ajad on ps ( s) Tulemus: Madalmolekulaarsete ühendite emissioonikiirgus on enam vähem täielikult depolariseeritud

Molekulide pöörlemine ja olekute eluead Makromolekulide pöörlemise karakteristlikud ajad on pikemad: mitukümmend ns Seondumata fluorestsents-marker: väike molekul Polarisatsioon kaob

3 Molekulide pöörlemine ja olekute eluead Makromolekulide pöörlemise karakteristlikud ajad on pikemad: mitukümmend ns Seondumata fluorestsents-marker: väike molekul Polarisatsioon kaob Makromolekuliga seondunud fluorestsents-marker: suur molekul Polarisatsioon säilib Tulemus: Makromolekulide emissioonikiirguse polarisatsioon säilib suurel määral Depolarisatsiooni saab mõõta kvantitatiivselt Saab võrrelda molekulide suurusi Saab määrata milline osa markerist on seondunud suure molekuliga Fluorescence Resonance Energy Transfer Förster Resonance Energy Transfer Ergastunud olekus fluorestseerimisvõimeline molekul (doonor) annab oma energia üle läheduses viibivale molekulile (aktseptor), mille neeldumisspekter kattub doonori emissioonspektriga Kiirgust emiteerib aktseptor on Mittekiirguslik protsess Dipool-dipoolvastasmõju kaudu kandub energia üle Energiaülekande kiirus k T sõltub molekulide vahelisest kaugusest ja spektrite kattumisest R 0 D ja A molekulide Förster i distants Iseloomustab kattumist, ca Å r molekulide vaheline kaugus τ D D ergastunud oleku keskmine eluiga 18 3

efektiivsus efektiivsus: milline osa neeldunud kvantidest antakse aktseptorile ära kt ( r) E = τ -1 D + kt ( r) 6 FDA R0 E = 1 = 6 6 FD R0 + r F D on palja doonori fluorestsentsi intensiivsus F DA on

6 Å Eelmise slaidi valemitest: D-A distants r = 24.4 Å Pildid: Joseph R.

4 efektiivsus efektiivsus: milline osa neeldunud kvantidest antakse aktseptorile ära kt ( r) E = τ -1 D + kt ( r) 6 FDA R0 E = 1 = 6 6 FD R0 + r F D on palja doonori fluorestsentsi intensiivsus F DA on doonori fluorestsentsi intensiivsus aktseptori juuresolekul Näide: fragmentide vahekauguse mõõtmine peptiidahelas Mellitiin Spektritest: R 0 = 23.6 Å Eelmise slaidi valemitest: D-A distants r = 24.4 Å Pildid: Joseph R. Lakowicz, Principles of 20 Fluorestsentsi eluea mõõtmised Aparatuur fluorestsentsi eluea mõõtmiseks Kogu jutt siiamaani on olnud nn statsionaarse fluorestsentsi kohta Lihtne aparatuur Tulemused on keskmistatud iga molekul ergastub ja relakseerub eri aegadel On kaks lähenemist: Time-domain Fluorestsents ergastatakse ülilühikese impulsiga Registreeritakse reaalne kustumiskõver Eluea mõõtmiseks (lifetime measurements) on vaja oluliselt keerukamat aparatuuri Frequency-domain Fluorestsentsi ergastatakse MHz moduleeritud allikaga Mõõdetakse faasinihet/faasinurka ergastuse ja emissiooni vahel Lahustunud hapniku sisalduse määramine fluorestsentsi eluea mõõtmise kaudu Hapnik difundeerub läbi membraani värvaineni Teiselt poolt ergastatakse värvaines fluorestsentsi moduleeritud kiirgusega Sinise värvuse lainepikkusega Detekteeritakse moduleeritud emissioonikiirgust Punase värvuse lainepikkusega kiirgus O 2 sisaldus leitakse faasinihke kaudu Fluorestsentsi eluea mõõtmised Konkreetse fluorofoori fluorestsentsiprotsessi kirjeldab eksponentsiaalse kustumise võrrand: I( t) = I e t /τ I(t) ja I 0 on intensiivsus ajal t ja intensiivsus ajahetkel 0 τ on fluorestsentsi keskmine eluiga Mitme fluorofooriga: I( t) = α e t / τ 1 + α e 1 t / τ 2 2 4

Fluorestseerivad valgud Rohelise fluorestseeriva valgu (GFP) avastamine ja arendamine 25 6.11.

peidus Mõjutuste eest kaitstud Pilt: Joseph R.

Springer, 2006 27 Fluorofoor tekib iseenesest, koos polümeeri struktuuri tekkega Selletõttu on

fluorestsentsmeetodite jaoks nähtavaks 6.11.

valkude rakendused Molekulaarsondid erinevates organismides geenide ekspresseerumise ja

5 Fluorestseerivad valgud Rohelise fluorestseeriva valgu (GFP) avastamine ja arendamine Fluorofoori teke GFP-s GFP omadused Struktuur: Max emissioon: 510 nm Fluorofoor on peidus Mõjutuste eest kaitstud Pilt: Joseph R. Lakowicz, Principles of Fluorescence Spectroscopy. 3 rd Edition. Springer, Fluorofoor tekib iseenesest, koos polümeeri struktuuri tekkega Selletõttu on võimalik seda fluorestseerivat fragmenti ekspresseerida muudesse valkudesse ja muuta nad fluorestsentsmeetodite jaoks nähtavaks On välja töötatud palju muid fluorestseeruvaid valke (üle 100) Fluorestseerivate valkude rakendused Molekulaarsondid erinevates organismides geenide ekspresseerumise ja valkude toimimise jälgimiseks Fluorestseeruvat märgist saab panna külge erinevatele valkudele Imetajate eluskoe visualiseerimine ja mitmevärviline märgistamine nt mikroskoopia jaoks Biosensorite valmistamine

Σχετικά έγγραφα

HAPE-ALUS TASAKAAL. Teema nr 2

HAPE-ALUS TASAKAAL. Teema nr 2 PE-LUS TSL Teema nr Tugevad happed Tugevad happed on lahuses täielikult dissotiseerunud + sisaldus lahuses on võrdne happe analüütilise kontsentratsiooniga Nt NO Cl SO 4 (esimeses astmes) p a väärtused