Encimi v zunajceličnem matriksu

Transcript

1 Encimi v zunajceličnem matriksu - Proteaze - metaloproteaze - serinske proteaze - cisteinske proteaze - aspartatne proteaze - Glikozidaze - Lizil-oksidaze - Superoksid dismutaza

2 Metaloproteaze Sterchi et al Mol Aspects Med. 29(5)

3 Metaloproteaze Glavno skupino metaloproteaz imenujemo tudi metcinkini (angl. metzincins). So endopeptidaze, izražajo se v vseh tkivih. motiv HExxHxxGxxH/D + 1,4 zavoj z ohranjenim Met pod Zn 2+ ionom PDB 3SHI

4 Klein & Bischoff Amino Acids. 41 Metaloproteaze Vsi metcinkini so večdomenski proteini. Sintetizirajo se kot proenzimi, aktivirajo pa jih druge zunajcelične proteaze (proprotein konvertaze). Osnovni tipi domenskih arhitektur: metaloproteaze matriksa (MMP) adamalizini A... signalni peptid B... prodomena C... katalitična domena D... hemopeksinska domena E... fibronektinska domena tipa 2 F... transmembranska regija G... citosolni rep H... disintegrinska domena I... s cisteini bogata domena J... EGF domena K... trombospondinska domena tipa 1 L... spacer

5 Metaloproteaze Inhibicija katalitične domene s prodomeno: prodomena cisteinsko stikalo katalitična domena PDB 1SU3

6 Metaloproteaze Aktivacija metaloproteaz: Visse & Nagase Circ Res. 92

7 MMP-ji

8 MMP-ji

9 Specifičnost MMP-jev Specifičnost MMP-jev je omejena zlasti na poziciji P1 in P3, ter P1. PDB 2CLT P4 P3 P2 P1 P1 P2 P3 P4 x Pro Gly Gly Ile Gly Gly x Ala Ala Ala Leu Ala Ala Gly Met Val

10 Substrati MMP-jev MMP-ji cepijo več vrst substratov: - Strukturni proteini preoblikovanje/ recikliranje ECM - Regulatorni proteini - Signalni proteini aktivacija/inaktivacija citokinov/kemokinov/rf s proteolitično cepitvijo - šedazna aktivnost odcepljanje zunajceličnih fragmentov proteinov z membrane (npr. aktivacija pro-oblik regulatornih molekul) Cauwe et al Crit Rev Biochem Mol Biol. 42(3)

11 Procesiranje pro-egf Le Gall et al Regulatory Peptides. 122

12 Substrati MMP-jev Visse & Nagase Circ Res. 92

13 Substrati MMP-jev Visse & Nagase Circ Res. 92

14 Nivoji regulacije MMP-jev Hua et al. Cell. Mol. Life Sci. (2011) 68

15 Kolagenaze Med kolagenaze spadajo trije MMP-ji. Vsi cepijo fibrilarne kolagene tipov I, II in III na značilne fragmente 3/4 in 1/4. Nekoliko se razlikujejo v preferencah: MMP-1 preferenčno cepi tip III. MMP-8 preferenčno cepi tip I. MMP-13 preferenčno cepi tip II. Posebnost kolagenaz je v tem, da so sposobne razviti trojni vijačnico kolagena. Pri tem procesu sodeluje tudi hemopeksinska domena. Poleg kolagena cepijo številne druge strukturne in regulatorne proteine sodelujejo pri obnavljanju zunajceličnega matriksa.

16 Struktura kolagenaz MMP-1: Katalitična domena Hemopeksinska domena PDB 2CLT Kompleks MMP-1 s kolagenom PDB 4AUO

17 Vloge kolagenaz MMP-1 Prva identificirana metaloproteaza (v 1960.) Splošna vloga v procesih obnove matriksa Procesira prekurzorje regulatornih proteinov odcep IGFBP-3 in -5 z membrane, sproščanje IL- 1b,... MMP-8 Kolagenaza iz nevtrofilcev pred izločanjem je shranjena v granulah Sodeluje pri vnetju lahko se avtoaktivira oksidativna avtooksidacija MMP-13 Izražanje je regulirano s citokini in hormoni (PTH metabolizem kosti, IGF-1 in 2, PDGF, FGF) Izraža se samo v rastočem kostnem tkivu Ima višjo želatinolitično aktivnost kot MMP-1 in -8 Lahko se aktivira avtoproteolitično

18 Želatinaze MMP-2 (želatinaza A) Cepi denaturiran, ne pa nativnega kolagena. tri fibronektinske domene tipa 2 Se konstitutivno izraža. Fibronektinske domene so nujne za cepitev kolagena in elastina. Struktura MMP-2 Cepi tudi kolagen tipa IV in vitronektin. Sodeluje pri angiogenezi. PDB 1CK7 Pospešuje migracijo celic razgrajuje ECM in odceplja kemoatraktante z membrane celic. Naj bi imela pomembno vlogo pri signalizaciji procesira citokine in kemokine.

19 Želatinaze MMP-9 (želatinaza B) Podobna aktivnost kot MMP-2. tri fibronektinske domene tipa 2 Lahko se aktivira avtokatalitično. Konstitutivno se izraža le v nevtrofilcih (shranjena v granulah). Struktura MMP-2 Sodeluje pri angiogenezi sprošča VEGF. Procesira kemokine in citokine. PDB 1CK7 Insercija v MMP-9

20 Stromelizini MMP-3, -10 in -11 Imajo podobno arhitekturo kot kolagenaze. MMP-3 (stromelizin 1) široka specifičnost (fibronektin, želatina, PG,kolagen tipa IV,...). Lahko aktivira ostale MMP-je (želatinaze, MMP-13). Izraže se zlasti v fibroblastih. MMP-10 (stromelizin 2) podobna specifičnost kot MMP-3. Ne izraža se v fibroblastih, ampak v keratinocitih (namesto MMP-3). Sodeluje pri migraciji epitelijskih celic kože in celjenju ran. MMP-11 (stromelizin 3) za propeptidom vsebuje cepitveno mesto za furin (aktivira se znotraj celice). Največ se ga izraža v fibroblastih. Sodeluje pri remodeliranju matriksa (embrionalni razvoj, celjenje ran). Fiziološka vloga ni jasna, se pa razlikuje od ostalih MMPjev. Ima zelo ozko specifičnost. Znan fiziološki substrat je kolagen tipa VI pri inhibiciji adipogeneze.

21 Matrilizini So najmanjši MMP-ji, zgrajeni le iz katalitične domene. MMP-7 razgrajuje številne komponente ECM želatina, elastin, fibronektin, laminin. Aktivira želatinaze. Deluje kot šedaza. Je pomembna komponenta prirojene imunosti konstitutivno se izraža v črevesnem epiteliju in odceplja peptide (a-defenzine) z antibakterijsko aktivnostjo. Je eden redkih MMP-jev, katerih izražanje je povišano v tumorskih celicah (sicer tumorske celice pritegnejo MMPje iz stromalnih celic). MMP-26 je malo poznan. Ima ožjo specifičnost kot MMP-7. Njegova posebnost je, da je edini MMP, ki nima cisteinskega stikala (Cys zamenjan s His).

22 Metaloelastaza makrofagov MMP-12 modra MMP-12 oranžna MMP-1 Izraža se v makrofagih. Razgrajuje elastin in druge EC substrate. Zrel encim se lahko avtokatalitično sprocesira z odcepom Hpx-domene. Pri miših je glavni elastinolitičen encim makrofagov in je ključna za migracijo preko bazalnih membran.

23 Membranski MMP-ji So integralni membranski proteini. Znanih je šest homologov. Struktura je podobna kolagenazam/stromelizinu, le da vsebuje še C-končno transmembransko vijačnico in citosolen rep. MT1-MMP = MMP-14 MT2-MMP = MMP-15 MT3-MMP = MMP-16 MT5-MMP = MMP-24 MT4-MMP = MMP-17 MT6-MMP = MMP-25 transmembranska vijačnica + citosolni rep GPI-sidro

24 Membranski MMP-ji So integralni membranski proteini. Znanih je šest homologov. Struktura je podobna kolagenazam/stromelizinu, le da vsebuje še C-končno transmembransko vijačnico in citosolen rep. MMP-14 (MT-MMP 1): ima široko specifičnost in tudi kolagenazno aktivnost (cepi tipe I, II in III). Lahko pride do avtokatalitičnega odcepa katalitične domene. Je pomembna pri migracijah celic (-/- miši umrejo v treh tednih). Možno je, da sodeluje tudi pri znotrajceličnih procesih (tvorba delitvenega vretena). Je aktivator MMP-2. MMP-15, -16 in -24 so podobni MMP-14, -17 in -25 pa namesto transmembranskega dela vsebujeta GPI sidro pripeto na Hpx domeno.

25 MMP-ji v raku

26 MMP-ji v raku Cauwe et al Crit Rev Biochem Mol Biol. 42(3)

27 Adamalizini Adamalizini so zgrajeni bolj kompleksno kot MMP-ji. Ločimo jih na membranske ADAM (A Disintegrin And Metalloprotease ) in topne ADAMTS ( A Disintegrin And Metalloprotease with Thrombospondin Motif ). I A... signalni peptid B... prodomena C... katalitična domena D... hemopeksinska domena E... fibronektinska domena tipa 2 F... transmembranska regija G... citosolni rep H... disintegrinska domena I... s cisteini bogata domena J... EGF domena K... trombospondinska domena tipa 1 L... spacer

28 Adamalizini Disintegrinska domena se povezuje z integrini (zlasti a9b1). PDB 2RJP Katalitična domena

29 Adamalizini Przemyslaw et al. BMB reports. 2013

30 Proteaze ADAM V genomu je vsaj 22 genov za proteine iz družine ADAM. Od teh je le 12 aktivnih proteaz. Poglavitna vloga proteaz ADAM je odcepljanje substratov s površine celic ( shedding oz sekretazna aktivnost). Njihova specifičnost je bolj raznolika od MMP-jev. Van der Vorst et al Atherosclerosis. 224

31 Proteaze ADAM cepitveno mesto za furin (opcionalno) Katalitična domena encimska aktivnost Disintegrinska domena veže integrine S cisteini bogata domena interagira s HSPG in Fn EGF domena (ni vedno prisotna) Variabilnih dolžin vsebuje poliprolinske ponovitve, ki lahko interagirajo z SH3 domenami (proteinske kinaze). Nekateri vsebujejo potencialna fosforilacijska mesta.

32 Proteaze ADAM Klein & Bischoff Journal of Proteome Research, 10

33 Weber & Saftig. Development 139, (2012) Proteaze ADAM TACE

34 Proteaze ADAM Nekatere proteaze ADAM so a-sekretaze. Najbolj znan primer razlik v procesiranju z različnimi protazami je amiloidni prekurzorski protein. Ab amiloid

35 Proteaze ADAM Nekatere proteaze ADAM so a-sekretaze. Najbolj znan primer razlik v procesiranju z različnimi protazami je amiloidni prekurzorski protein. Kot a-sekretaza lahko potencialno deluje več ADAM-ov. Vingtdeux et al. J. Neurochem. (2012) 120

36 Proteaze ADAM Van der Vorst et al Atherosclerosis. 224

37 Proteaze ADAMTS Przemyslaw et al. BMB reports. 2013

38 Proteaze ADAMTS Trombospondinska ponovitev Disintegrinska domena Spacer PDB 2RJP S cisteini bogata ponovitev (3 S-S vezi)

39 Proteaze ADAMTS proteoglikanaze Prokolagen C-peptidaza je BMP-1. vwf je velik oligomeren glikoprotein (> 20 MDa) v krvi, ki je ključen za hemostazo.

40 Meprini Meprina a in b spadata v skupino astacinov. V primerjavi z ostalimi metcinkini imata edinstveno arhitekturo. Nimata cisteinskega stikala aktivira ju tripsinu podobna peptidaza. TRAF... TNF receptor associated factor (sedaj MATH) MAM... meprin, A5 protein, receptor protein tyrosine phosphatase μ Obstajata lahko v različnih homoali heterooligomernih stanjih.

41 Meprini Meprina a in b spadata v skupino astacinov. V primerjavi z ostalimi metcinkini imata edinstveno arhitekturo. Nimata cisteinskega stikala aktivira ju tripsinu podobna peptidaza. katalitična domena MAM domena b dimer MATH domena ravnina membrane

42 Broder & Becker-Pauly. Biochem. J. (2013) 450 Meprini Specifičnost meprinov redka preferenca za kisle ostanke. Naravni substrati so slabo poznani. Meprina se najbolj izražata na epitelijskih celicah. a b Meprin b lahko deluje kot b sekretaza. KLK = kalikreini (serinske proteaze), aktivirajo meprin b

43 Tkivni inhibitorji metaloproteaz Štirje homologi endogenih inhibitorjev metaloproteaz. Izražajo se v številnih tkivih. Struktura iz dveh domen. Brew & Nagase. Biochimica et Biophysica Acta (2010) 55

44 Tkivni inhibitorji metaloproteaz TACE/N-TIMP-3 PDB 1UEA PDB 3CKI MMP-1/TIMP-1

45 Tkivni inhibitorji metaloproteaz Murphy Genome Biology 2011, 12:233

46 Tkivni inhibitorji metaloproteaz Pro-MMP-2/TIMP-2 PDB 1GXD C-konec TIMP-2 interagira s Hpx domeno pro-mmp-2